JP2004250454A - 内毒素または超抗原に誘導された毒性を治療するインターロイキン−１０類似体またはアンタゴニストの使用 - Google Patents

内毒素または超抗原に誘導された毒性を治療するインターロイキン−１０類似体またはアンタゴニストの使用 Download PDF

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Abstract

【課題】 敗血症性又は毒素性ショックを治療する方法を提供する。
【解決手段】 インターロイキン−１０またはその類似体、アゴニスト若しくはアンタゴニストを有効成分として含んでなる、宿主における炎症を調節するための医薬組成物。
【選択図】 なし

Description

本発明は、敗血症性または毒素性ショック様症状、例えば、内毒素または超抗原に誘導された毒性および自己免疫状態の治療を含む、有効量のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）またはその類似体若しくはアンタゴニストを投与することによって免疫応答を調節する方法に関する。
苛酷な感染は、大きな生理学的および代謝の変化を引起こすことがある。症状は様々であるが、発熱、低血圧症、代謝性アシドーシス、組織壊死、広範囲にわたる器官機能不全および、正しく治療されない場合、最終的には致死を挙げることができる。例えば、それぞれ本明細書中に参考として包含されているバーコウ（Ｂｅｒｋｏｗ）（監修）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，ローウェー，ニュージャージー州；ウェザラル（Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ）ら（監修）Ｏｘｆｏｒｄ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，オクスフォード・ユニバーシティー・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク；ブラウンワルド（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ）ら（監修）Ｈａｒｒｉｓｏｎ′ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，マグロー・ヒル，ニューヨーク；またはワインガーデン（Ｗｙｎｇａａｒｄｅｎ）ら（監修）Ｃｅｃｉｌ′ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，サンダース・カンパニー（Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．），フィラデルフィアを参照されたい。敗血症性ショックおよび毒素性ショック症状は種々の感染応答に特有であり、しばしば、若干のまたは全てのこれらの症状を示す。
敗血症性ショックは内毒素に誘導された応答の典型である。敗血症性ショックは、内毒素、典型的には、グラム陰性細菌の細胞壁からのリポ多糖（ＬＰＳ）成分が免疫系に出現することによって引起こされる。毒素性ショックは超抗原に誘導された応答の典型であり、グラム陽性細菌の細胞膜からのタンパク質成分、例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）の放出によって引起こされる。応答は両方とも微生物感染によって最初に引起こされるが、免疫系は微生物産物に対して異なったように応答してそれらのそれぞれの応答を引起こす。
内毒素、例えば、ＬＰＳによって引起こされたショック応答において、宿主由来タンパク質である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）はグラム陰性敗血症の多数の有害な作用を引起こすことが最近実証された。ＴＮＦに対する抗血清による受動免疫は、グラム陰性菌血症または内毒素血症の多数の致命的作用を防止することができる。例えば、トレイシー（Ｔｒａｃｅｙ）ら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：４７０〜４７４；ビュートラー（Ｂｅｕｔｌｅｒ）ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５８４〜５８８；およびトレイシーら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３３０：６６２〜６６４を参照されたい。ＴＮＦの高血清濃度は、髄膜炎菌性髄膜炎、マラリアおよびリーシュマニア症を含むいくつかの他の感染症においても観察された。ＴＮＦの循環濃度が高い多数の患者の器官機能不全は更に高い死亡率とともに増大した。例えば、ワージ（Ｗａａｇｅ）ら（１９８７）Ｌａｎｃｅｔ ３５５〜３５７；ジラーディン（Ｇｉｒａｒｄｉｎ）ら（１９８８）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１９：３９７〜４００；スキュデリー（Ｓｃｕｄｅｒｉ）ら（１９８８）Ｌａｎｃｅｔ １３６４〜１３６５；およびカーン（Ｋｅｒｎ）ら（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，８７；１３９〜 を参照されたい。
動物かまたはヒト被験者に対するＴＮＦの投与により、２〜６時間後に検出可能なインターロイキン−６（ＩＬ−６）血清濃度を生じたことが報告された。マッキントッシュ（ＭｃＩｎｔｏｓｈ）ら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１６２〜１６７；ジャブロンズ（Ｊａｂｌｏｎｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２巻，１５４２頁（１９８９）；およびブロッカート（Ｂｒｏｕｃｋａｅｒｔ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９巻，２２５７頁（１９８９）。Ｂ細胞刺激因子２、インターフェロン−β２または肝細胞刺激因子としても知られているＩＬ−６は、Ｂ細胞成熟を引起こすＴ細胞由来の糖タンパク質として同定された。例えば、キシモト（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ）、Ｂｌｏｏｄ ７４：１〜１０を参照されたい。更に最近、ＩＬ−６は、肝細胞中の鋭敏タンパク質の誘導並びに造血系前駆細胞およびＴ細胞に対する作用を含む多面的生物活性を有することが実証された。例えば、ガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８巻，７１７頁（１９８８）；マリンジョビク（Ｍａｒｉｎｊｏｖｉｃ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１．４２巻，８０８頁（１９８９）；モロン（Ｍｏｒｒｏｎｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３巻，１２５５４頁（１９８８）；およびパールムッター（Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｒｓｔ．，８４巻，１３８頁（１９８９）を参照されたい。スターンズ（Ｓｔａｒｎｅｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５巻，４１８５〜４１９１頁（１９９０）には、敗血症性ショックのマウスモデルにおいてＩＬ−６に対する抗体アンタゴニストが生存を延長することが示された。
ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）は超抗原であり、毒素性ショック反応を引起こすことがある。これらの反応はＴ細胞の実質的なサブセットの活性化の結果として生じ、苛酷なＴ細胞媒介全身性免疫反応を導く。この応答は、ＩＬ−１０またはその類似体若しくはアンタゴニストが治療的処置に有用である点に関して、Ｔ細胞媒介応答に特有である。機械的には、超抗原はＴ細胞受容体のＶβ要素と直接的に相互作用し且つ比較的低いクラスＩＩ ＭＨＣ特異性でＴ細胞を活性化すると考えられる。ハーマン（Ｈｅｒｍａｎ）ら（１９９１）、Ａｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７４５〜７７２を参照されたい。
現在、敗血症、菌血症等のような敗血症症状は抗微生物性化合物によって治療されるのが典型的である。敗血症は、細菌感染がカテーテル挿入または外科的処置によってしばしば引起こされる病院環境において一般的である。しかしながら、このような症状がショックを伴う場合、感染に応答して誘導されたサイトカインによって部分的に引起こされるショック症候群を好転させる療法には有効な付加的手段が存在しない。例えば、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）（１９８５）「 」、マンデル（Ｍａｎｄｅｌｌ）ら（監修）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（第２版）ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ），ニューヨーク，４６８〜４７０頁を参照されたい。特に、抗生物質による治療は微生物の致死をもたらし、そしてショック応答を引起こす細菌生産物の放出をもたらす。
細菌性敗血症および関連の敗血症性ショックは、ある種の手術、腹部外傷および癌若しくは移植療法による免疫抑制または他の医学的症状の結果として生じた感染によって引起こされた致命的な症状であることが多い。米国において、毎年７００，０００人を越える患者が、敗血症性ショックを引起こす細菌感染に罹患している。これらの内約１６０，０００人は敗血症性ショック症状を示し、そして約５０，０００人はこのような結果として死に至っている。毒素性ショックに苦しむ患者は毎年少数であるが、典型的に、その応答の重大さはより一層生命を脅かすものである。
感染に対するこれらの苛酷な免疫学的応答の重大な結果のために、微生物によって引起こされたショックを予防的にまたは治療的に処置する有効な技術が急を用して必要とされている。本発明は、これらのおよび他の苛酷な免疫反応を処置する組成物および方法を提供する。
バーコウ（Ｂｅｒｋｏｗ）（監修）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，ローウェー，ニュージャージー州 ウェザラル（Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ）ら（監修）Ｏｘｆｏｒｄ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，オクスフォード・ユニバーシティー・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク ブラウンワルド（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ）ら（監修）Ｈａｒｒｉｓｏｎ′ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，マグロー・ヒル，ニューヨーク ワインガーデン（Ｗｙｎｇａａｒｄｅｎ）ら（監修）Ｃｅｃｉｌ′ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，サンダース・カンパニー（Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．），フィラデルフィア トレイシー（Ｔｒａｃｅｙ）ら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：４７０〜４７４ ビュートラー（Ｂｅｕｔｌｅｒ）ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５８４〜５８８ トレイシーら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３３０：６６２〜６６４ ワージ（Ｗａａｇｅ）ら（１９８７）Ｌａｎｃｅｔ ３５５〜３５７ ジラーディン（Ｇｉｒａｒｄｉｎ）ら（１９８８）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１９：３９７〜４００ スキュデリー（Ｓｃｕｄｅｒｉ）ら（１９８８）Ｌａｎｃｅｔ １３６４〜１３６５ カーン（Ｋｅｒｎ）ら（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，８７；１３９〜 マッキントッシュ（ＭｃＩｎｔｏｓｈ）ら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１６２〜１６７ ジャブロンズ（Ｊａｂｌｏｎｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２巻，１５４２頁（１９８９） ブロッカート（Ｂｒｏｕｃｋａｅｒｔ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９巻，２２５７頁（１９８９） キシモト（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ）、Ｂｌｏｏｄ ７４：１〜１０ ガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８巻，７１７頁（１９８８） マリンジョビク（Ｍａｒｉｎｊｏｖｉｃ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１．４２巻，８０８頁（１９８９） モロン（Ｍｏｒｒｏｎｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３巻，１２５５４頁（１９８８） パールムッター（Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｒｓｔ．，８４巻，１３８頁（１９８９） スターンズ（Ｓｔａｒｎｅｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５巻，４１８５〜４１９１頁（１９９０） ハーマン（Ｈｅｒｍａｎ）ら（１９９１）、Ａｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７４５〜７７２ マンデル（Ｍａｎｄｅｌｌ）ら（監修）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（第２版）ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ），ニューヨーク，４６８〜４７０頁
本発明は、有効量のインターロイキン−１０またはその類似体若しくはアンタゴニストを投与することにより、種々の微生物によって引起こされたショック症状を処置する方法を提供する。本発明は、更に、これらのインターロイキン−１０に関連の化合物を含む薬剤組成物を包含する。好ましくは、本発明のインターロイキン−１０は、以下のアミノ酸配列
および
（但し、標準的な三文字略語を用いてＬアミノ酸を示し、Ｎ末端から開始している）
によって定義された読取り枠の成熟ポリペプチドから成る群より選択される。これらの２種類の型のＩＬ−１０を、時にはそれぞれ、ヒトＩＬ−１０（またはヒトサイトカイン合成阻害因子）およびウイルスＩＬ−１０（またはＢＣＲＦ１）と称する。ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１２３０〜１２３４；ヴイエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１１７２〜１１７６；フィオレンチノ（Ｆｉｏｒｅｔｉｎｏ）ら（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：２０８１〜２０９５；およびシュー（Ｈｓｕ）ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：８３０〜８３２を参照されたい。天然のタンパク質配列の突然変異体、例えば、欠失および挿入変異型を含む対立遺伝子変異型および突然変異タンパク質は、本明細書中で用いられる代替組成物である。
更に好ましくは、本発明の方法で用いられる成熟ＩＬ−１０は、
および
から成る群より選択される。
本発明は、部分的に、望ましくない炎症性反応（例えば、敗血症性ショック）を媒介するいくつかのサイトカインの合成と、毒素性ショック様症候群をもたらす場合である超抗原によるＴ細胞の活性化の双方をＩＬ−１０が阻害するという発見に基づいている。逆に、ＩＬ−１０アンタゴニストはこれらの同一免疫応答を増大させるものであり、そしてこのような増大は他の臨床的環境、例えば、ある種の腫瘍および自己免疫モデルにおいて実際に望ましい。
発明の詳細な説明
本発明は、免疫機能を調節する、特に、微生物によって引起こされたショックまたは制御Ｂ細胞の分化若しくは発生の有害な作用を防止するおよび／または低減するためのＩＬ−１０またはその類似体若しくはアンタゴニストの使用法に関する。本発明は、更に、これらの方法を実施するためのＩＬ−１０またはその類似体若しくはアンタゴニストを含む薬剤組成物を含む。本発明において用いるためのＩＬ−１０は、好ましくは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、ロックビル、メリーランド州にそれぞれ受託番号６８１９１、６８１９２および６８１９３として寄託されているｐＨ５Ｃ、ｐＨ１５ＣおよびｐＢＣＲＦ１（ＳＲａ）のｃＤＮＡインサートによって定義される読取り枠によってコードされた成熟ポリペプチドの群より選択される。
ＩＬ−１０は、単球またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を加えた単球によるＴＮＦαおよびＩＦＮγ合成を阻害するが、ＮＫ細胞単独では阻害されない。ＩＬ−４は、ＩＬ−２で活性化されたＮＫ細胞からのサイトカイン分泌を直接的に阻害する。これは、ＩＬ−４およびＩＬ−１０がＮＫ細胞に対して独特な経路によって作用することを示唆し、例えば、ＩＬ−１０作用は単球の関与を必要とする。ＩＬ−１０はＩＬ−２で活性化されたＮＫ細胞からのサイトカイン分泌を直接的に阻害するが、ＬＡＫ活性を阻害しないし、ＩＬ−２に誘導されたサイトカイン合成およびリンパ球に活性化されたキラー（ＬＡＫ）活性が異なる機序によって調節されていることが示唆される。
ＩＬ−１０は、単球および／または活性マクロファージまたはＮＫ細胞による前炎症性サイトカインの産生を阻害するその能力の機序によって明らかに抗炎症活性を有することが実証されている。このサイトカイン生産の阻害は転写段階で生じる。
ＩＬ−１０は、更に、動物において超抗原に誘導された応答、例えば、Ｔ細胞に媒介された応答を調節することが本明細書中において実証された。ブドウ球菌性エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）は苛酷な毒素性ショック応答を引起こすことがあり、マウスでの実験はインビボでの効力を実証する。超抗原と同時のまたは超抗原に対する暴露後でも、ＩＬ−１０の投与は高ＳＥＢ暴露による致死を防止するのに有効である。
グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）は動物において敗血症性ショック応答を引起こす。この内毒素に誘導されたショック応答は、前記のように、刺激されたマクロファージ／単球からのＴＮＦα、ＩＬ−１および／またはＩＬ−６の放出の結果として生じる。しかしながら、ＩＬ−１０の投与は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＧＭ−ＣＳＦの誘導された発現を抑制する。データは、ＩＬ−１０がＬＰＳ出現後に投与されたとしても内毒素に誘導されたショックからマウスを防護することができると決定されることを示す。逆に、抗ＩＬ−１０抗体はその防御作用を阻止することができる。実験は、更に、抗ＩＬ−１０で処置されたマウスが実質的に高濃度の循環性腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）および循環性ＩＬ−６並びに内毒素に誘導されたショック（例えば、ＬＰＳに誘導された）に対する深い感受性も示すことを示している。
抗ＩＬ−１０抗体は他の免疫学的症状の処置においても有用である。データは、若いマウスに対する長期間の抗ＩＬ−１０抗体の投与がＢ細胞のＬｙ−１サブクラスを枯渇させることがあるということを示す。これは、ＩＬ−１０をＬｙ−１Ｂ細胞発生の調節剤として包含し、そしてＬｙ−１ Ｂ細胞を枯渇させる手段を提供する。この観察報告は自己免疫症状の処置の見通しをもたらす。
自己免疫応答の発生には複雑なＴ細胞相互作用が必要である。マウスのＮＺＢ／Ｗ種は狼瘡（全身性エリテマトーデス、ＳＬＥ）傾向があり且つ自己免疫症状の処置用の治療薬を検査するモデルを提供する。更に、これらのマウスは、他のＢ細胞種と比較して異常な割合のＬｙ−１ Ｂ細胞を示す。インビボでのマウスの実験を、ＮＺＢ／Ｗ種を用いて記載する。
これらのマウスの抗ＩＬ−１０処置は、全体の生存によってまたはタンパク尿症、腎炎若しくは自己抗体力価の発生によって監視される自己免疫応答の開始を実質的に遅らせた。この結果は、抗ＩＬ−１０処置が他の哺乳動物、例えば、ヒトを処置するのに当然有用であることを示している。
広範囲の単細胞および多細胞発現システム（すなわち、宿主−発現ベクター組合わせ）を用いて、本発明の方法で用いるためのポリペプチドを生産することができる。宿主細胞種としては、制限されないが、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物等がある。特異的発現システムの選択および／または修飾を行なうための指針を提供する多数の論評が入手可能である。例えば、いくつかの大腸菌発現システムを論評しているデ・ボーア（ｄｅ Ｂｏｅｒ）およびシェパード（Ｓｈｅｐａｒｄ）「大腸菌において異種遺伝子発現を最適にする方法（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」、２０５〜２４７頁、クルーン（Ｋｒｏｏｎ）（監修）Ｇｅｎｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、１９８３）；哺乳動物細胞をトランスフェクトし且つ形質転換する方法を論評しているクチャラパティ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）ら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６巻，４号，３４９〜３７９頁（１９８４）およびバネルジ（Ｂａｎｅｒｊｉ）ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，５巻，１９〜３１頁（１９８３）；大腸菌、酵母および哺乳動物細胞における遺伝子発現の抜粋記事を論評しているレツニコフ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ）およびゴールド（Ｇｏｌｄ）監修、Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（バターワース（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）、ボストン、１９８６）：並びに哺乳動物発現システムを論評しているスィリー（Ｔｈｉｌｌｙ）、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（バターワース、ボストン、１９８６）を参照されたい。これらはそれぞれ参考として本明細書中に包含される。同様に、特異的ｃＤＮＡおよび発現制御配列を結合しおよび／または操作して本発明によって用いるのに適当な発現ベクターを考案しおよび／または修飾する技術並びに条件を記載している多数の論評が入手可能であり、例えば、それぞれ参考として本明細書中に包含される、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版；１〜３巻），コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（１９８７年および定期補遺）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨークがある。
大腸菌発現システムは、リッグス（Ｒｉｇｇｓ）により、本明細書中に参考として包含されている米国特許第４，４３１，７３９号明細書に開示されている。大腸菌における高発現に特に有用な原核性プロモーターは、デ・ボーアにより、本明細書中に参考として包含されている米国特許第４，５５１，４３３号明細書に開示されたｔａｃプロモーターである。分泌発現ベクターは、更に、大腸菌宿主に利用可能である。特に有用なのは、グレイブ（Ｇｈｒａｙｅｂ）らによってＥＭＢＯ Ｊ．，３巻，２４３７〜２４４２頁（１９８４）に開示されたｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡベクターであり、そこにおいて転写されるｃＤＮＡは、ｏｍｐＡタンパク質のシグナルペプチドをコードしている大腸菌ＯｍｐＡ遺伝子の一部分に融合され、順に、成熟タンパク質を細菌の周辺腔中に分泌させる。米国特許第４，３３６，３３６号明細書および同第４，３３８，３９７号明細書は、更に、原核生物のための分泌発現ベクターを開示している。したがって、これらの参考文献は参考として本明細書中に包含される。
多数の細菌株が原核性発現ベクターに適当な宿主であり、大腸菌、例えば、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号２７３２５）、ＪＡ２２１、Ｃ６００、ＥＤ７６７、ＤＨ１、ＬＥ３９２、ＨＢ１０１、Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１２４４）、Ｘ２２８２、ＲＲ１（ＡＴＣＣ番号３１３４３） ＭＲＣＩ；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）株；並びに他の腸内細菌科、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）または霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）および各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）がある。真核性タンパク質の発現に有用な細菌株、例えば、大腸菌Ｋ１２ Ｘ１７７６を誘導する一般的な方法は、カーチス三世（Ｃｕｒｔｉｓ ＩＩＩ）によって米国特許第４，１９０，４９５号明細書に開示されている。
原核性および真核性微生物の他に、多細胞生物由来の細胞を含む発現システムを用いて本発明のタンパク質を生産してもよい。特に興味深いのは、その翻訳後プロセッシグ機構が生物学的に活性の哺乳動物タンパク質を生産するのに一層適当であるので、哺乳動物発現システムである。数種類のＤＮＡ腫瘍ウイルスは哺乳動物宿主のためのベクターとして用いられてきた。特に重要なのは、細菌の複製制御配列に結合したＳＶ４０複製、転写および／または翻訳制御配列を含む多数のベクターであり、例えば、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびベルグ（Ｂｅｒｇ）によって開発され、Ｍｏｌｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２巻，１６１〜１７０頁（１９８２）およびＭｏｌｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３巻，２８０〜２８９頁（１９８３）で開示され、そしてタケベ（Ｔａｋｅｂｅ）ら、Ｍｏｌｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８巻，４６６〜４７２頁（１９８８）によって改良されたｐｃＤベクターがある。したがって、これらの参考文献は本明細書中に参考として包含される。他のＳＶ４０基剤哺乳動物発現ベクターとしては、カオフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）によってＭｏｌｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２巻，１３０４〜１３１９頁（１９８２）に、およびクラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、米国特許第４，６７５，２８５号明細書に開示されたもののがあり、双方の文献とも本明細書中に参考として包含される。通常、サル細胞は上記ベクターに対して好ましい宿主である。ＳＶ４０ ｏｒｉ配列および完全なＡ遺伝子を含むこのようなベクターはサル細胞中で自律複製することができる（非自律複製プラスミドよりも高コピー数および／または安定コピー数を与える）。更に、ＳＶ４０ ｏｒｉ配列を含み完全なＡ遺伝子を含まないベクターは、グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）によってＣｅｌｌ，２３巻，１７５〜１８２頁（１９８１）に記載され且つＡＴＣＣ（受託番号ＣＲＬ１６５１）から入手可能なＣＯＳ７サル細胞中で高コピー数（安定ではない）に自律複製することができる。上記ＳＶ４０基剤ベクターは、更に、宿主細胞ＤＮＡ中への組込みによって他の哺乳動物細胞、例えば、マウスＬ細胞を形質転換しうる。
多細胞生物は、更に、本発明のポリペプチドの生産用宿主として役立つことができ、例えば、昆虫幼生、マエダ（Ｍａｅｄａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２〜５９４頁（１９８５）およびＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．，３５１〜３７２頁（１９８９）；並びに形質転換した動物、ジェニッシュ
（Ｊａｅｎｉｓｃｈ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０巻，１４６８〜１４７４頁（１９８８）である。これらの参考文献、類似の他のものも参考として本明細書中に包含される。
Ｉ． インターロイキン−１０および類似体の検定
ＩＬ−１０と集合的に称するＩＬ−１０関連タンパク質およびペプチドは、検定および単位の基準を形成することができるいくつかの生物活性を示す。特に、ＩＬ−１０は、ＩＦＮγ、リンホトキシン、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦから成る群において、同系の抗原提示細胞（ＡＰＣ）および抗原に対する暴露によって１種類またはそれ以上のこれらのサイトカインを合成するように誘導されたＴヘルパー細胞集団の少なくとも１種類のサイトカインの合成を阻害する性質を有する。この活性において、ＡＰＣは、それらが複製することはできないが、それらの抗原プロセッシング機構は機能する状態であるように処理される。これは、便宜上、ＡＰＣに、例えば、約１５００〜３０００Ｒ（ガンマまたはＸ線）をＴ細胞と混合する前に照射することによって達成される。マウスＩＬ−１０の検定に関して、表２も参照されたい。
或いは、サイトカイン阻害は、一次または、好ましくは、二次混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において検定することができ、その場合、同系ＡＰＣを用いる必要はない。ＭＬＲは当該技術分野において周知であり、例えば、本明細書中に参考として包含される、ブラドリー（Ｂｒａｄｌｅｙ）、ミシェル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）ら監修のＳｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）、サン・フランシスコ、１９８０）の１６２〜１６６頁；およびバチスト（Ｂａｔｔｉｓｔｏ）ら、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５０巻，８３〜９１頁（１９８７）を参照されたい。簡単には、同種リンパ系細胞の２集団を混合し、その一方の集団は、例えば、照射によって増殖を防止するように混合前に処理された。好ましくは、細胞集団は、補足培地、例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０中において細胞約２ｘ１０６個／ｍｌの濃度で調製される。対照および試験培養物双方に対して検定用に各集団０．５ｍｌを混合する。二次ＭＬＲ用に、一次ＭＬＲにおいて７日後に残っている細胞を、新たに調製され、照射された刺激剤細胞によって再刺激する。ＩＬ−１０を有すると疑われる試料は試験培養物に対して混合時に加えることができ、そして対照および試験培養物双方のサイトカイン生産は、混合して１〜３日後に検定することができる。
ＩＬ−１０検定用にＴ細胞集団および／またはＡＰＣ集団を得るには、例えば、本明細書中に参考として包含されている、ディサバト（ＤｉＳａｂａｔｏ）ら監修、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０８巻（１９８４）に充分に記載されている当該技術分野において周知の技術を用いる。好ましいＩＬ−１０検定用のＡＰＣは末梢血液単球または組織マクロファージである。これらは、例えば、本明細書中に参考文献として包含されている、ボイム（Ｂｏｙｕｍ）、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０８巻，８８〜１０２頁（１９８４）；メイジ（Ｍａｇｅ）、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０８巻，１１８〜１３２頁（１９８４）；リトヴィン（Ｌｉｔｖｉｎ）ら、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０８巻，２９８〜３０２頁（１９８４）；スティーブンソン（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ）、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０８巻，２４２〜２４９頁（１９８９）；およびロメイン（Ｒｏｍａｉｎ）ら、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０８巻，１４８〜１５３頁（１９８４）に記載の標準的な技法を用いて得られる。好ましくは、ヘルパーＴ細胞をＩＬ−１０検定において用い、それは末梢血液、脾臓またはリンパ節からリンパ球を最初に分離した後、商業的に入手可能な抗ＣＤ４抗体、例えば、米国特許第４，３８１，２９５号明細書に記載され且つオルト・ファーマソイティカル・コーポレーション（Ｏｒｔｈｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）から入手可能なＯＫＴ４を用いて、例えば、パニングまたは流動細胞計測法によってヘルパー細胞を選択することにより得られる。マウス抗ＣＤ４は、ベクトン・ディクソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ）またはファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）から入手可能である。必要な技術は、それぞれ参考として本明細書中に包含される、ボイム、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２１巻（補遺９７），７７頁（１９６８）；Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０８巻（上記に引用）およびブラム（Ｂｒａｍ）ら、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１巻，７３７〜７４８頁（１９８６）に十分に開示されている。概して、ＰＢＬは、新鮮な血液からフィコール・ハイパク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離によって得られる。
種々の抗原を検定において用いることができ、例えば、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、トリのγ−グロブリンまたは類似のものを用いることができる。更に好ましくは、抗原の代わりに、ヘルパーＴ細胞を検定において抗ＣＤ３単クローン性抗体、例えば、米国特許第４，３６１，５４９号明細書に開示されたＯＫＴ３で刺激する。
対照および試験試料中のサイトカイン濃度は、標準的な生物検定および／または免疫化学検定によって測定される。特異的サイトカインに関する免疫化学検定の構成は、精製サイトカインが入手可能である場合、当該技術分野において周知である。例えば、それぞれ本明細書中に参考として包含され、論題に対する典型的な広範囲の参考文献のである、カンプベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（エルセビア、アムステルダム、１９８４）；テュッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（エルセビア、アムステルダム、１９８５）；および米国特許第４，４８６，５３０号明細書を参照されたい。ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−３およびヒトＧＭ−ＣＳＦ用のエリザキットは、ジェンザイム・コーポレーション（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．）（ボストン、ＭＡ）から商業的に入手可能であり；そしてＩＦＮγ用のエリザキットはエンドジェン・インコーポレーテッド（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）（ボストン、ＭＡ）から商業的に入手可能である。ヒトリンホトキシンに特異的な多クローン性抗体はジェンザイム・コーポレーションから入手可能であり、それを、ヒトリンホトキシンのためのラジオイムノアッセイ、例えば、チャード（Ｃｈａｒｄ）、Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（エルセビア、アムステルダム、１９８２）で用いることができる。
上記に記載したサイトカインの生物検定を用いてＩＬ−１０活性を決定することができる。ヒトリンホトキシンの生物検定は、それぞれ本明細書中に参考として包含されている、アガワール（Ａｇｇａｒｗａｌｌ）、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１６巻，４４１〜４４７頁（１９８５）およびマシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）ら、クレメンス（Ｃｌｅｍｅｎｓ）ら監修のＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、ワシントン、Ｄ．Ｃ．、１９８７）の２２１〜２２５頁に開示されている。ヒトＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦは、ＡＴＣＣからそれぞれ受託番号ＴＩＢ２１４およびＣＣＬ２４６として入手可能な因子依存細胞系ＣＴＬＬ−２およびＫＧ−１を用いて検定することができる。ヒトＩＬ−３は、例えば、メトカーフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）、Ｔｈｅ Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ（エルセビア、アムステルダム、１９８４）に記載されたように、軟質寒天培地において広範囲の造血細胞コロニーの形成を刺激するその能力によって検定することができる。ＩＦＮγは抗ウイルス検定、例えば、ミージャー（Ｍｅａｇｅｒ）、クレメンスら監修（上記に引用）の１２９〜１４７頁を用いて定量することができる。マウス同等物は、適当な細胞系を用いて同様に検定することができる。
サイトカイン生産は、更に、ｍＲＮＡ分析によって決定することができる。サイトカインｍＲＮＡは、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７巻，８５６９〜８５７２頁（１９８２）およびジレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）ら、米国特許第４，４８３，９２０号明細書に記載の細胞質ドットハイブリダイセーションによって測定することができる。したがって、これらの参考文献は本明細書中に参考として包含される。他の方法としては、精製ＲＮＡを用いるドットブロッティング、例えば、ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）ら監修のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬプレス、ワシントン、Ｄ．Ｃ．、１９８５）の第６章がある。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いることもでき、本明細書中に参考として包含されているイニス（Ｉｎｎｉｓ）ら（監修）（１９９０）のＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，アカデミック・プレス・インコーポレーテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨークを参照されたい。
いくつかの場合において、ＩＬ−１０活性の検査をするための試料を前処理して、検定の妨げとなるかもしれない予め決定されたサイトカインを除去する。例えば、ＩＬ−２は、若干の細胞においてＩＦＮγの生産を増大させる。したがって、検定で用いられるヘルパーＴ細胞に応じて、ＩＬ−２を試験される試料から除去すべきことがある。このような除去は、便宜上、試料を標準的な抗サイトカイン親和性カラムに通過させることによって達成される。
便宜上、ＩＬ−１０活性の単位は、米国特許第４，５５９，３１０号明細書に記載され且つＡＴＣＣから受託番号ＣＲＬ８３０６として入手可能なＭＣ／９細胞のＩＬ−４に誘導された増殖を増大させるＩＬ−１０の能力に関して定義される。１単位／ｍｌは、以下の検定においてＩＬ−４の水準を上記ＭＣ／９増殖の最大刺激の５０％にするＩＬ−１０の濃度として定義される。ＩＬ−４およびＩＬ−１０の二重反復試験または三重反復試験用希釈液を標準的な微量滴定プレートにおいて培地５０ｕｌ／ウェルに調製する。培地はＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血清、５０ｕＭ２メルカプトエタノール、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／Ｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）から成る。培地で希釈した１６００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４、２５μｌ／ウェル（最終４００Ｕ／ｍｌ）を加え、そして一晩中、例えば、２０〜２４時間インキュベートする。
3Ｈ−チミジン（例えば、培地中５０ｍＣｉ／ｍｌ）を０．５〜１．０ｍＣｉ／ウェルで加え、そして細胞を再度一晩中インキュベートした後、細胞を採集し且つ取込まれた放射能を測定する。
サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１０の製法の一般的な説明に関しては、それぞれ本明細書中に参考として包含されている米国特許第５，０１７，６９１号明細書およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／４５３，９５１号明細書を参照されたい。
ＩＩ． アゴニストおよびアンタゴニスト ＩＬ−１０アゴニストは、ＩＬ−１０とその受容体との相互作用を模擬する分子であってよい。このようなものは、ＩＬ−１０の類似体若しくはフラグメントまたはＩＬ−１０受容体のリガンド結合性部位エピトープに対する抗体、或いはＩＬ−１０の受容体相互作用性部分に対して結合する特定の抗体に対する抗イディオタイプ抗体であってよい。
アンタゴニストは、受容体結合に関して競合するタンパク質の形をとることができ、例えば、それは受容体を活性化する能力を欠き、同時にＩＬ−１０結合またはＩＬ−１０結合性分子、例えば、抗体を阻止する。
抗体は、天然に存在する形でもそれらの組換体でも、ＩＬ−１０サイトカイン、フラグメントおよび類似体に対して生じることがある。更に、抗体はＩＬ−１０に対してその活性型かまたは不活性型でも生じることができ、その相違は、活性サイトカインに対する抗体が、活性コンホメーションでしか存在しないエピトープを認識すると考えられることである。抗イディオタイプ抗体もこれらの方法で考えられ、潜在的なＩＬ−１０アゴニストでありうる。
望ましい抗原、例えば、サイトカインの予め決定されたフラグメントに対する結合性フラグメントおよび一本鎖変型を含む抗体は、フラグメントと免疫原性タンパク質との結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）で動物を免疫感作することによって生じることができる。単クローン性抗体は望ましい抗体を分泌する細胞から製造される。これらの抗体は、正常若しくは不活性類似体に対する結合性に関してスクリーンすることができるしまたはアゴニスト若しくはアンタゴニスト活性に関してスクリーンすることができる。通常、これらの単クローン性抗体は、少なくとも約１ｍＭ、更に一般的には、少なくとも約３００μＭ，典型的には少なくとも約１０μＭ、更に典型的には、少なくとも約３０μＭ、好ましくは、少なくとも約１０μＭ、そして更に好ましくは、少なくとも約３μＭまたはそれ以上のＫＤと結合する。前記はＩＬ−１０に関するが、同様の抗体が他の類似体、その受容体およびアンタゴニストに対して生じる。
本発明の、抗原結合性フラグメントを含む抗体は、有意に、診断または治療的に有効でありうる。それらは、ＩＬ−１０受容体に対して結合し且つ該受容体に対するリガンド結合を阻害しまたは生物学的応答を引き出すＩＬ−１０の能力を阻害する強力なアンタゴニストでありうる。
ＩＬ−１０またはフラグメントは、他の物質、特に、免疫原として用いられる融合したまたは共有結合したポリペプチドのようなポリペプチドに対して結合しうる。サイトカインおよびそのフラグメントは、種々の免疫原、例えば、スカシガイのヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風トキソイド等に対して融合または共有結合しうる。多クローン性抗血清を製造する方法の説明に関しては、それぞれ本明細書中に参考として包含されている、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ホーバー・メディカル・ディビジョン（Ｈｏｅｂｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、ハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）およびロウ（Ｒｏｗ）、１９６９年；ランドスタイナー（Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ）（１９６２）Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，ドーバー・パブリケーションズ（Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ），ニューヨーク、およびウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら（１９６７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１巻，アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークを参照されたい。典型的な方法は、抗原による動物の超免疫感作を行なう。次に、被験動物の血液を反復免疫感作直後に集め、そしてガンマグロブリンを単離する。
いくつかの場合、種々の哺乳動物宿主、例えば、マウス、齧歯類動物、霊長類、ヒト等から単クローン性抗体を製造するのが望ましい。このような単クローン性抗体を製造する技術の説明は、例えば、スタイツ（Ｓｔｉｔｅｓ）ら（監修）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）、ランジ・メディカル・パブリケーションズ（Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロス・アルトス、ＣＡおよびそこにおいて引用された参考文献；ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨプレス；ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）、アカデミック・プレス、ニューヨーク；コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら（監修；１９９１年および定期補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ウィリー・アンド・サンズ・ニューヨーク；そして特に、単クローン性抗体を生成する一つの方法を論及しているコーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７において見出すことができる。これらの参考文献はそれぞれ本明細書中において参考として包含される。簡単に要約すると、この方法は、動物に免疫原を注射することを含む。次に、被験動物を屠殺し、そしてその脾臓から細胞を取りだした後、それを骨髄腫細胞と融合させる。その結果は、骨髄腫親細胞とは異なる、インビトロの選択的条件下において再現することができるハイブリッド細胞すなわち「ハイブリドーマ」である。次に、ハイブリドーマ集団をスクリーンして個々のクローンを単離し、そのそれぞれが単一抗体種を免疫原に対して分泌する。この方法において、得られた個々の抗体種は、免疫原性物質上で認識された特定部位に応答して生じた免疫動物からの不死化およびクローン化された単一Ｂ細胞の生産物である。
他の適当な技術は、抗原性ポリペプチドに対するリンパ球のインビトロでの暴露或いはファージまたは類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選択を伴う。それぞれ本明細書中に参考として包含されている、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９）「ファージラムダにおける免疫グロブリンレパートリーの大型組合わせライブリーの生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌａｒｇｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１；およびワード（Ｗａｒｄ）ら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６を参照されたい。本発明のポリペプチドおよび抗体は修飾を伴ってまたは伴うことなく用いることができ、キメラ抗体またはヒト様抗体がある。更に、組換え免疫グロブリンを製造することができ、カビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい。これらの特許は本明細書中に参考として包含される。
サイトカインまたはその受容体に対して生じた抗体は、更に、アゴニストまたはアンタゴニストの性質を示すことができる抗イディオタイプ抗体を生じるのに有用である。これらは本明細書中で論及したような種々の免疫学的応答を調節するのに有用である。
ＩＩＩ． 精製および薬剤組成物
本発明のポリペプチドが、例えば、形質転換した酵母または哺乳動物細胞の分泌生成物のような可溶性型で発現する場合、それらは、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーおよび／または類似のものを含む当該技術分野の標準法にしたがって精製することができ、例えば、本明細書中に参考として包含され、このような精製の指針を提供する「酵素精製および関連技術（Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２：２３３〜５７７（１９７７）およびスコープス（Ｓｃｏｒｐｅｓ），Ｒ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（スプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク、１９８２）を参照されたい。同様に、本発明のポリペプチドが、例えば、凝集体、封入体または類似のもののような不溶性型で発現する場合、それらは、遠心分離によって破裂した宿主細胞から封入体を分離し、封入体をカオトロピズム剤および還元剤で可溶化させ、可溶化した混合物を希釈し、そしてポリペプチドが生物学的に活性のコンホメーションをとるようにカオトロピズム剤および還元剤の濃度を低下させることを含む、当該技術分野における標準法によって精製することができる。後者の手順は、本明細書中にそれぞれ参考として包含されている以下の参考文献、すなわち、ウィンクラー（Ｗｉｎｋｌｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５：４０４１〜４０４５（１９８６）；ウィンクラー、Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ，３：９９２〜９９８（１９８５）；コス（Ｋｏｔｈｓ）ら、米国特許第４，５６９，７９０号明細書；並びに欧州特許出願第８６３０６９１７．５号明細書および同第８６３０６３５３．３号明細書に開示されている。
本明細書中で用いられる「有効量」とは、例えば、悪寒、血管収縮、精神的錯乱、灌流低下、超高熱等のような認識された症状によって決定されるショック症状を改善しまたは防止するのに十分な量を意味する。特定の患者に対する有効量は、治療される敗血症の状態および種類、患者の全身の健康状態、投与方法、副作用の苛酷さ等のような因子に応じて変更することができる。概して、ＩＬ−１０試薬は、有効量の試薬および薬剤担体を含む薬剤組成物として投与される。例えば、本明細書中に参考として包含される、カプラン（Ｋａｐｌａｎ）およびパセ（Ｐａｓｃｅ）（１９８４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅｏｒｙ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ、モスビー・アンド・カンパニー（Ｍｏｓｂｙ ａｎｄ Ｃｏ．）、セント・ルイス、ＭＯ；およびギルマン（Ｇｉｌｍａｎ）ら（１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第８版）、ペルガモン・プレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。ある種の用途において、ＩＬ−１０治療薬は、抗生物質組成物を含む別の薬学的活性成分と組合わせることができる。
薬剤担体は、患者に対して本発明の組成物を供給するのに適当な何等かの適合した無毒性物質でありうる。このような薬剤の非経口投与に有用な多数の組成物が知られている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１５版（マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン、ＰＡ １９８０）。或いは、本発明の組成物を植込み可能なまたは注射可能な薬剤供給システムによって患者の体内に導入することができる。例えば、本明細書中に参考として包含される、アーカート（Ｕｒｑｕｈａｒｔ）ら、
Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２４巻，１９９〜２３６頁（１９８４）；ルイス（Ｌｅｗｉｓ）監修、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８１）；米国特許第３，７７３，９１９号明細書；同第３，２７０，９６０号明細書等を参照されたい。
非経口によって投与される場合、ＩＬ−１０を薬剤担体と一緒に注射可能な状態の（溶液、懸濁液、エマルジョン）単位剤形中に配合する。このような担体の例は、正常食塩水、リンガー液、デキスロース溶液およびハンクス液である。非水性担体、例えば、固定油およびオレイン酸エチルを用いてもよい。好ましい担体は５％デキストロース／食塩水である。担体は、少量の添加剤、例えば、等張性および化学的安定性を増大させる物質、例えば、緩衝剤および保存剤を含むことができる。ＩＬ−１０試薬は、凝集体および他のタンパク質を実質的に含まない精製された状態において約５〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で配合されるのが好ましい。好ましくは、ＩＬ−１０は、約５０〜８００ｍｇ／日の範囲の量を供給するように（すなわち、約１〜１６ｍｇ／ｋｇ／日）、連続注入によって投与される。毎日の注入速度は副作用および血液細胞計数の監視に基づいて変更することができる。
有効量のＩＬ−１０アゴニストまたはアンタゴニストを決定する場合も同様に考えられるが、ある種のアンタゴニストは更に高い範囲などの一層広範囲の用量範囲が必要であると考えられる。
ＩＶ．生物学的観察および機序
以下に提唱した機序によって制限されないが、以下の論及により、ＩＬ−１０類似体、アゴニストおよびアンタゴニストの使用法および用途が洞察される。免疫システム機能、発生および分化に対する有用な背景を提供する。例えば、本明細書中に参考として包含される、ポール（Ｐａｕｌ）（監修）（１９８９）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２版）ラヴェン・プレス（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク。特に、炎症に関する第２６章、遅延型過敏症に関する第２８章および自己免疫に関する第３１章は、本明細書中に記載した使用法に関連する。
ヒトＰＢＭＣおよび精製ＮＫ細胞においてＩＬ−２によって引起こされたサイトカイン合成およびＬＡＫ活性に対するＩＬ−４およびＩＬ−１０の作用は、例えば、実験Ａにおいて研究された。ＩＬ−４およびＩＬ−１０双方がＰＢＭＣにおいてＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγおよびＴＮＦα合成を阻害し、ＩＬ−４だけが精製ＮＫ細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ合成を阻害する。したがって、ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、異なる機序によってＮＫ細胞サイトカイン合成を阻害している。
ＴＮＦα生産を研究する実験結果により同様の結論が示唆された。しかしながら、この場合、単球もこのサイトカインを生産する。ＩＬ−１０はＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導ＴＮＦα合成に対して直接作用しなかったが、単球によるＴＮＦα生産を阻止することができた。ＮＫ細胞およびＣＤ１４＋細胞双方を含む培養物のＩＬ−２による刺激は、生産を大きく増大させ、そしてＩＬ−１０はこの増大を完全に阻止した。ＩＬ−２は、ＴＮＦαを更に生産するようにＣＤ１４＋細胞を活性化しなかったので、相乗作用の増大はおそらくＮＫ細胞ＴＮＦα合成の増加を示している。したがって、ＩＬ−１０は単球による双方のＴＮＦα生産を阻害し、更に、それらの同時刺激がＮＫ細胞ＴＮＦα合成に対して作用すると考えられる。
ＩＬ−４およびｈＩＬ−１０／ｖＩＬ−１０双方は、ＩＬ−２に刺激されたＰＢＭＣによるＩＦＮγおよびＴＮＦα合成を抑制するが、ＩＬ−４だけはＩＬ−２に誘導されたＬＡＫ活性を阻害する。これらの観察は、ＰＢＭＣにおけるＩＬ−２に誘導されたサイトカイン生産および細胞毒性が異なる経路によって調節されていることを示す。これらの観察報告は、ＩＬ−２およびＬＡＫ細胞の臨床的使用において重要である。ＩＬ−２療法に関係した問題としては、心臓血管作用および毛細管漏出症候群があった。これらの副作用の原因は不明であるが、癌患者においては、ＩＬ−２によって生じたＴＮＦαなどのサイトカインの放出が関与していることがある。ＩＬ−１０が、ＩＬ−２に誘導されたサイトカイン合成を阻害するがＬＡＫ活性を阻害しないということは、このサイトカインが、このような患者を治療するのにＩＬ−２と組合わせて有用でありうるということを示唆する。更に、ＴＮＦαが、感染したＴ細胞においてヒト免疫欠乏ウイルスの発現を引起こすことができるということを示唆するデータを考慮すると、ＴＮＦαの合成を阻害するＩＬ−１０の能力はこれに関連してかなり興味深いものである。
これらの研究は、更に、ヒトＩＬ−１０が、活性化後の単球によって比較的多量に生産されることを実証する。速度論研究により、低濃度のＩＬ−１０は単球を活性化して７時間後に検出され、そして最大のＩＬ−１０生産は活性化の２４〜４８時間後に生じうることが分かった。これは、活性化後４〜８時間に高濃度で分泌されたＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦαの生産と比較して相対的に遅いものであった。更に、ヒトＩＬ−１０は、ＩＦＮγ、ＬＰＳまたはＩＦＮγおよびＬＰＳの組合わせによる活性化後の単球によるサイトカイン生産に対して強力な阻害作用を有することが分かった。これらの阻害作用は、ＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０活性双方を阻害するｍＡｂ １９Ｆ１によってそれらを完全に中和することができるので、ＩＬ−１０に特異的である。濃度１００Ｕ／ｍｌで加えられたＩＬ−１０は、ＩＬ−１α、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ合成を、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）およびＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）の組合わせによる単球の最適の活性化後に９０％より大まで減少させた。ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８生産に対する阻害作用は、特に、単球がＩＦＮγおよびＬＰＳの組合わせによって活性化された場合、あまり明白ではなかった。単球によるサイトカイン生産をＩＬ−１０が阻害する機序、例えば、ＩＬ−１０のこれらの副作用が他の因子によって直接的に媒介されるのが間接的に媒介されるのかということは不明である。ＩＬ−１は繊維芽細胞、胸腺細胞および単球においてＩＬ−６生産を引起こすことができるので、例えば、ＩＬ−６生産の不完全な阻害は、減少したＩＬ−１生産の結果であるという可能性がある。 ヒト細胞に対して生物活性を有することが分かっているウイルス−ＩＬ−１０を、あまり広範囲にではなく検査した。しかしながら、ｖ−ＩＬ−１０は、ＬＰＳで活性化された単球によるＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦ生産を、ヒトＩＬ−１０が阻害したのと同程度まで阻害した。ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦ生産に対するｖ−ＩＬ−１０のこれらの阻害作用はｍＡｂ １９Ｆ１によって中和され、ｖ−ＩＬ−１０作用の特異性を例証した。
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ分泌の阻害は転写段階で生じた。ＩＬ−１０は、ノーザン分析およびＰＣＲ分析によって確認されるように、ＬＰＳによって引起こされたサイトカイン特異的ｍＲＮＡ合成を強く阻害した。ＰＣＲ分析は、個々の試料の反応生成物を半定量的方法で比較可能な条件下において実施した。これは、試料と定量的に比較しうる結果との間に等量の反応生成物を生じたβ−アクチンに特異的なプライマーによるｃＤＮＡの増幅が、ＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現を同一試料においてノーザン分析およびＰＣＲ分析双方によって確認した場合に得られたという事実によって確認された。更に、サイトカインｍＲＮＡ発現濃度はこれらの培養物の上澄み中のタンパク質量と相関した。ＩＬ−１０は、活性化された単球においてＴＧＦβ ｍＲＮＡ発現に影響を与えることができなかった。しかしながら、ＴＧＦβが非活性単球において構成要素として発現され且つＬＰＳによる単球の活性化がＴＧＦβ ｍＲＮＡ濃度に影響を与えなかったということは留意されるべきである。アソイアン（Ａｓｓｏｉａｎ）ら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６０２０〜６０２４は、単球がＴＧＦβ ｍＲＮＡを構成要素として発現し且つＴＧＦβ分泌が単球活性化を必要とするということを実証した。しかしながら、ＩＬ−１０がＴＧＦβの潜伏型から活性型への変換に対する作用を有するかどうかは不明である。
ＩＬ−１０の生産はＩＬ−４によって転写段階で阻害されることが分かった。ＩＬ−１０生産に対するＩＬ−４の阻害作用は顕著であったが、ＩＬ−４はＩＬ−１０の生産を完全に阻止することはできなかった。ＩＬ−４は、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαの生産を完全に阻害するのに十分であった高ＩＬ−４濃度（４００Ｕ／ｍｌ）を用いた場合でさえも、ＩＬ−１０の生産を最大７０％までしか阻害しなかった。ＩＬ−４が、ヒト単球によるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦαの生産を阻害することができることは既に実証されている。これらの知見は、ＩＬ−４が、更に、ＬＰＳで活性化されたヒト単球によるＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産を阻害することを実証することにより確証され且つ拡大された。この阻害は転写段階で生じた。更に、データは、ＩＬ−４およびＩＬ−１０がヒト単球によるサイトカイン発現に対して同様の作用を有するということを例証し、免疫系におけるサイトカインの多面的作用および重複性が強調される。
興味深いことに、ＩＬ−１０は、２４時間活性化された単球においてＩＬ−１０ ＭＲＮＡ合成を強く阻害したので、それは自己調節サイトカインである。更に、中和性抗ＩＬ−１０ ｍＡｂの存在下におけるＬＰＲによる単球の活性化は、ＩＬ−１０ ｍＲＮＡの発現を２４時間で増大させ、内因的に生じたＩＬ−１０もＩＬ−１０ ｍＲＮＡ合成を阻害することが示された。ＩＬ−１０が、ヒト単球によるそれ自体の生産をダウンレギュレートすることができるということにより、これは負のフィードバック機序によって調節される最初のサイトカインとなる。内因的に生じたＩＬ−１０の自己調節作用は、更に、ＬＰＳで活性化された単球によるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産に関して、抗ＩＬ−１０抗体の存在下でＬＰＳを用いて観察された。しかしながら、これらのサイトカインの生産に対する内因性ＩＬ−１０の阻害作用は、培養開始時に加えられた内因性ＩＬ−１０の場合よりも顕著ではなかった。これは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦが活性化の４〜８時間後に高濃度で既に生じているが、最大の内因性ＩＬ−１０生産は活性化後２４〜４８時間ではるかに遅く生じるという事実に関係している。この見解は、内因的に生じたＩＬ−１０の最も強い阻害作用が、単球の活性化後に遅れて生じることが分かったＧＭ−ＣＳＦ分泌において見られたという観察報告によって支持される。ＩＬ−１０ ｍＲＮＡ合成はＩＬ−１０タンパク質分泌に反映され且つそれに先行する、およびＩＬ−１０は細胞表面上のその受容体と単に相互作用することができるだけであると仮定すると、これらの結果により、内因的に生じたＩＬ−１０の阻害作用は比較的遅く起こり、したがって、免疫応答の後期において特に重要でありうるということが示唆される。
最初に、ＩＬ−１０をマウスにおいて、Ｔｈ１細胞によるサイトカイン生産（主としてＩＦＮγ）を阻害したＴｈ２細胞によって生じたサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）として記載した。Ｔｈ１細胞によるサイトカイン生産に対するｍ−ＩＬ−１０のこの阻害作用はマクロファージの存在を必要とし、例えば、それぞれ本明細書中に参考として包含される、フィオレンチノ（Ｆｉｏｒｅｎｉｎｏ）ら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３４４４〜３４５１；トローブリッジ（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ）ら（１９８１）Ｊ．Ｅｐｔ′ｌ Ｍｅｄ．１５４：１５１７〜１５２４；ランバート（Ｌａｍｂｅｒｔ）ら（１９８９）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：４０１〜４１８；およびヒルシュ（Ｈｉｒｓｃｈ）ら（１９８１）Ｊ．Ｅｐｔ′ｌ Ｍｅｄ．１５４：７１３〜７２５を参照されたい。ここにおいて、ＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０は、単球をＡＰＣとして用いる場合、抗原特異的Ｔ細胞増殖を強く阻害する。更に、抗原特異的増殖性Ｔ細胞応答の減少は、主として、これらの細胞でのクラスＩＩ ＭＨＣ抗原発現に対するＩＬ−１０の強力なダウンレギュレートリー作用によって引起こされた単球の減少した抗原提示能力に依る。これらのデータは、ＩＬ−１０が単球によって遅れて生産され且つこれらの細胞によるＩＬ−１０分泌に対する自己調節作用を有するという本知見と共に、ＩＬ−１０が抗原特異的Ｔ細胞応答の進行に対して強力なダウンレギュレートリー作用を有することを示す。したがって、ＩＬ−１０は、抗原に駆動された増殖性Ｔ細胞応答を抑制するのに主要な役割を果たすことができる。単球によって生産されたＩＬ−１０が、Ｔ細胞活性化に対する強力な自己調節フィードバック活性を有することもできるという見解は、ＬＰＳ刺激が中和性抗ＩＬ−１０ ｍＡｂの存在下で実施された場合にクラスＩＩ ＭＨＣ発現を低下させなかったし、そして強くさえ増大させたので、ＬＰＳによる活性化後の単球によって生産されたＩＬ−１０が、これらの細胞でのクラスＩＩ ＭＨＣ抗原のダウンレギュレーションに対して応答性であるという観察によって支持される。
前炎症性サイトカインであるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦαは、急性および慢性の炎症性過程、並びに慢性関節リウマチを含む多数の自己免疫疾患に関与する。これらのサイトカインは、免疫システムの細胞の活性化および機能を調節するが、内皮細胞、ケラチノサイトおよび肝細胞のそれらも調節する。ＩＬ−１０がこれらのサイトカインの分泌に対して強いダウンレギュレートリー作用を有するという知見は、ＩＬ−１０が炎症の強力な阻害剤であることを示唆する。これらの細胞でのクラスＩＩ ＭＨＣ抗原のダウンレギュレーションによって単球のＡＰＣ能力を低下させることによる抗原特異的Ｔ細胞増殖の阻害および単球による前炎症性サイトカイン分泌に対する阻害作用を含む、これまでに記載されたその性質に基づいて、ＩＬ−１０は免疫および炎症性応答のサプレッサーとして主要な役割を果たすと考えられる。この役割は、更に別のインビトロの研究において並びに内毒素およびエンテロトキシン双方の超抗原応答のインビボ模型において確証される。
本研究は、ＩＬ−１０が、マクロファージ細胞系および腹膜マクロファージによるＬＰＳに誘導されたサイトカイン生産に対して阻害作用することを実証する。例えば、ＩＬ−１０はＴ細胞応答の調節において重要な役割を有するのみならず、感染または損傷の際に引出された炎症性応答に対しても重要な役割を有する。
マクロファージ細胞系に対するＩＬ−１０の作用は、ネズミおよびヒト双方のマクロファージおよび単球によるサイトカイン生産を阻害することが予め分かっている同様の量のＩＬ−４によって引出される作用よりも顕著である。これらの結果は、ＬＰＳに誘導されたＴＮＦαタンパク質生産のＩＬ−４による有意の阻害を示すが、これらの細胞系においてＩＬ−６合成の阻害はあまり顕著ではない。しかしながら、ＩＬ−４によるＴＮＦαの阻害は、ヒト単球に関して従来報告されたほど大きくはない。この相違は、種の相違、単球よりもむしろ分化したマクロファージ細胞系を用いることにより、またはこれらの研究が、ヒト単球システムの一つにおいて用いられた１００ｎｇ／ｍｌ用量に対立するものとしてＬＰＳ１０μｇ／ｍｌを用いたことから説明することができる。ＩＬ−４とは対照的に、ＩＬ−１０は、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＬ−１タンパク質生産をこの高濃度のＬＰＳで有意に阻害した。マクロファージ細胞系のＬＰＳおよびＩＦＮγによる刺激は、はるかに高濃度のＴＮＦαおよびＩＬ−６を誘導し、ある場合において、これはＩＬ−４作用に対して不応性であって、ＩＬ−４およびＩＦＮγがマクロファージ活性化のある種の態様に対して反対のおよび相殺作用を有することができることを示唆した。更に、これは、一層低量のＬＰＳを用いて実施されたヒト単球での研究とは対照的である。更に、ＬＰＳを加えたＩＦＮγに誘導されたＩＬ−６およびＴＮＦαタンパク質の生産のＩＬ−１０に媒介された阻害は、ＩＬ−４を用いて見られる阻害よりも有意であった。ＩＬ−６およびＴＮＦαをコードしているＲＮＡの、ＬＰＳまたはＬＰＳを加えたＩＦＮγに誘導された発現の阻害は、更に、逆転写ＲＮＡに関する半定量的ＰＣＲ増幅法を用いて観察された。若干の場合、ＩＬ−４はＩＬ−１０と同程度に発現を阻害し、ＩＬ−１０が、翻訳されたタンパク質の分泌または安定性に対する作用を有することが示唆された。しかしながら、ＩＬ−１０はその作用を達成し、マクロファージによるサイトカイン生産に対するその最終の阻害作用は、ＩＬ−４によって見られる作用よりも強力であると考えられる。モノカイン生産に対するＩＬ−１０の作用は、この強力な阻害剤がおそらく広範囲の臨床的発現において抗炎症薬としての可能性を有することができるということを示唆する。
腹膜マクロファージは、刺激性Ｔ細胞からのＩＬ−１０によって阻害されたことが更に分かったので、ＩＬ−１０がこの精製細胞集団によってサイトカイン分泌を阻害したかどうかを検査した。ＬＰＳによって刺激されたＢＡＬＢ／ｃまたはＣＢＡ／Ｊマウスから得られたＦＡＣＳ精製腹膜マクロファージは、ＩＬ−１０の存在下において僅かだけ減少した有意の量のＩＬ−６タンパク質を生産した。予備的ＰＣＲデータは、精製されたマクロファージがＩＬ−１０を生産したことを示唆したので、ある種のＬＰＳ刺激には、ＩＬ−１０に対して向けられた抗体が含まれていた。双方の系統のマウスにおけるＬＰＳ刺激に対してこの抗体を加えることにより、ＩＬ−６タンパク質の生産ははるかに高濃度まで増大した（２０時間以内に３０〜３５ｎｇ／ｍｌ／細胞７ｘ１０５個／ｍｌ）。これは、タイトオートクリン制御下にあるマクロファージによるサイトカイン生産と一致し、すなわち２集団以上のマクロファージが腹膜マクロファージＭａｃ−１+,鮮明 中に含まれ、その一つがＩＬ−１０のその生産によって他にまさる制御を有することと一致する。更に、ヒト単球システムにおいて平行して得られたデータは、ＩＬ−１０が、水簸によって精製されたヒト単球によるＩＬ−１０それ自体の生産を含むＬＰＳに誘導されたサイトカイン生産を阻害することを示す。ＩＬ−４およびＩＬ−１０などのＴヘルパー細胞由来のサイトカインの作用をＩＦＮγなどのＴｈ１ Ｔヘルパー細胞サイトカインと対比した従来の報告により、これらのサイトカインが互いに相殺作用を有することがあるという確証が得られる。ＩＦＮγは、同一マクロファージによるＩＬ−１０の生産を表面上阻害することにより、ＬＰＳに応答して生じたＩＬ−６濃度を、抗ＩＬ−１０によって達成されたのとほぼ同程度の高濃度まで増大させた。これらのデータは、ＩＬ−６およびＴＮＦαなどのサイトカイン生産が、ＩＬ−１０によって調節され、引続き、活性Ｔ細胞およびＮＫ細胞によって生産されたＩＦＮγの制御下にあることを示唆する。ＩＦＮγのこの作用は、腹膜マクロファージとＩＦＮγとの２４時間のインキュベーションが、Ｔｈ１細胞を刺激するそれらの能力を改良したことを示す従来の観察報告を説明することができる。
ＩＬ−１０が、刺激性細胞からのマクロファージのサイトカイン合成をどのように阻害するかという機序はまだ解明されていない。マクロフアージがＩＬ−１０の存在下で刺激された場合に観察されるサイトカイン合成における有意の減少を考慮すると、ＩＬ−１０は、マクロファージおよび抗原に応答した最適サイトカイン分泌に必要とされる同時刺激活性をダウンレギュレートすることができる。刺激された１Ｇ１８．ＬＡマクロファージ細胞から得られた上澄みを用いて、Ｔｈ１細胞のマクロファージおよび抗原依存刺激に対するＩＬ−１０の阻害作用を克服することは不可能であった。これは、ＩＬ−１０が、可溶性同時刺激剤のダウンレギュレーションによってサイトカイン合成に対するその作用を媒介しない場合の機序と一致する。疑わしいが、ＩＬ−１０はこの種の因子の生産よりもむしろその作用を妨害すること、またはこのような同時刺激剤が極めて不安定であり若しくは吸収され、したがって、これらの上澄み調製試料中に存在しないことが考えられる。或いは、ＩＬ−１０は膜に結合した同時刺激剤の発現を阻害することができ、更に、これは、可溶性同時刺激剤で置き換えることができないＡＰＣ／補助細胞を細胞の刺激に必要とすることを示唆する従来の報告を説明するであろう。サイトカイン合成のＩＬ−１０阻害機序に対する別の説明は、ＩＬ−１０が、マクロファージによる１種類または複数の阻害因子の生産を誘導した後、Ｔ細胞に対して作用してサイトカイン分泌を阻害するということがありうる。Ｔ細胞の刺激に関する抗原特異的システムにおけるマクロファージおよびＢ細胞ＡＰＣの混合は、それぞれの個々のＡＰＣによる刺激に匹敵するＴ細胞の追加の刺激をもたらす。ＩＬ−１０の存在は、細胞によるサイトカイン合成を、Ｂ細胞ＡＰＣがそれ自体で達成する程度まで阻害する。これは、マクロファージが、Ｔ細胞に直接的に作用する阻害剤またはＢ細胞ＡＰＣの生産を引起こさないことを示唆する。疑わしいが、このような阻害剤がマクロファージ−Ｔ細胞相互作用に特異的でありうるかまたはＢ細胞ＡＰＣがこのような活性作用を何とか克服し若しくは回避することが考えられる。ヒトシステムにおいて得られたデータにより、ＩＬ−１０は、単球によって生産された可溶性阻害因子または同時刺激因子によるＴヘルパー細胞増殖のその阻害を達成しないことが示唆される。しかしながら、それらの作用は、ヒト単球でのＩＬ−１０によるＭＨＣ−クラスＩＩ抗原のダウンレギュレーションによって説明することができ、これはマウスシステムにおいてはまだ観察されていない。
エフェクター機能の調節に加えて、ＩＬ−１０は、更に、種々のパターンのサイトカインを生産するＣＤ４ Ｔヘルパー細胞の種々のサブセットの活性化により、抗体生産に対する免疫応答または遅延型過敏症（ＤＴＨ）の開始においてある役割を果たすことがある。Ｂ細胞およびマクロファージ双方がＩＬ−１０を生産し且つＡＰＣとしても機能し、同時に、種々のサイトカインモジュレーターに対して感受性である（ＩＦＮγは多数のＢ細胞機能を阻害し；ＩＬ−１０はマクロファージを阻害するがＢ細胞ＡＰＣ機能を阻害しない）ということは、この理論に対する支持を与える。更に、これらの研究は、ＩＬ−１０がマクロファージによるサイトカイン合成に対して有意の阻害作用を有し、更には、腹膜マクロファージの顕著な形態学的変化を引起こすことを示唆する。総合すると、これらの観察報告は、Ｔ細胞応答の調節においてのみならず、感染または損傷によって引出された急性炎症応答の重要なモジュレーターとしても、ＩＬ−１０の重要な役割を示唆する。
実験Ｄにおいて、インビボでの超抗原に媒介された毒性を阻害するＩＬ−１０の能力を検査した。ＩＬ−１０は、部分的にはＴ細胞を活性化するマクロファージの能力を阻害することによって、Ｔ細胞によるサイトカイン生産を阻害することができる。超抗原は、ＴＣＲのＶβ鎖およびＡＰＣ上に存在するクラスＩＩ ＭＨＣ分子間に「橋」を形成することによってＴ細胞を活性化する分子として定義された。これらの結果は、ＩＬ−１０が、マクロファージによって与えられた超抗原によって活性化されたＴ細胞によるサイトカイン生産を阻害しうることを示唆した。この作用はインビトロで観察された。超抗原は、例えば、ウイルスによってコードされた内因性でありうるしまたは外因性、例えば、微生物エンテロトキシンでありうる。後者の群の最も研究された超抗原としてはブドウ球菌性エンテロトキシンがある。現在、これらの毒素によって示された毒性は、インビボでＴ細胞を活性化するそれらの能力に依ることが知られている。これらの観察報告は、Ｔ細胞活性化を阻害する物質が、超抗原によって示された毒性を妨げることを示唆する。これは、シクロスポリンが、ＳＥＢに媒介された毒性を妨げるという観察報告と一致する。この模型により、ＴＮＦαは毒性の主要な媒介物質である。ここで示された結果は、ＩＬ−１０が、おそらくはＴ細胞によるＴＮＦ生産を阻害するその能力によってＳＥＢの毒性を防止することができることを示す。
これらの観察報告は、インビボでのＩＬ−１０の作用機序に興味深く関係している。ＩＬ−１０はマクロファージ機能、例えば、サイトカイン生産、Ｔ細胞を活性化する能力を阻害することが分かっているし、そしてＢ細胞においてＩａ抗原発現を引起こす。しかしながら、ＳＥＢの毒性はＡＰＣによるＩａ抗原の発現に依存するので、これらのインビボでの実験の成果は不明確であった。ＩＬ−１０がＳＥＢに誘導された毒性を防止するということは、インビボでの主ＡＰＣはマクロファージであってＢ細胞ではないということを示唆する。
これらの結果は、ＩＬ−１０の治療的使用に関して重要な意味を持つ。ブドウ球菌性エンテロトキシンによって引起こされる食中毒の他に、近年、多数の疾患が超抗原によって引起こされることが報告されており、例えば、毒素性ショック症候群、川崎病、ブドウ球菌性毒素によって引起こされた疾患および自己免疫疾患様慢性関節リウマチである。
ＩＬ−１０は、致命的な内毒素血症からマウスを防護するのに極めて有効であり、その知見は、ＩＬ−１０が細菌性敗血症の治療に有用でありうることを示唆する。多数の他の試薬、例えば、ＴＮＦαまたは内毒素に対する抗体およびＩＬ−１Ｒａは、細菌性敗血症の治療のための臨床試験において一般的であるが、これらの大部分は、最適の防御のためには、動物モデル実験において敗血症誘導前に与えられることが要求された。これに対する一つの例外であるＩＬ−１Ｒａは、動物モデル実験において敗血症誘導時に投与された場合に有効であるが、内因性ＩＬ−１受容体全部を阻止するのに十分に多量に投与する必要がある。更に、薬理学的用量のＩＬ−１０は、おそらくは受容体飽和量よりも少量で、致命的な内毒素血症からの防護に寄与すべきであるマクロファージ／単球機能に対する一連の作用を生じる。
前述の論及は、免疫系の種々の態様の調節および分化におけるＩＬ−１０投与の効果に関するが、抗ＩＬ−１０抗体を用いてＩＬ−１０サイトカインの作用を遮断することによって更に別の見通しが達成される。
ここで示されたデータは、マウスの誕生から成体までの抗ＩＬ−１０抗体による連続処置が、これらの同一被験動物の脾臓に位置した通常のＢ細胞の数、表現型または免疫担当を変更することなく全Ｌｙ−１ Ｂ細胞の数および機能を激しく低減させることを示す。いくつかの観察報告は、抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ−１ Ｂ細胞の提案された枯渇を支持する。すなわち、（ａ）抗ＩＬ−１０処置マウスは、正常マウスにおいてはＬｙ−１ Ｂ細胞に富む部位であるそれらの腹膜腔中にＢ細胞をほとんどまたは全く含まない（ＤＮＡＸ実験動物施設の８週令のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜洗浄細胞は、表現型分析により、５％未満の通常のＢ細胞を含む）；（ｂ）抗ＩＬ−１０処置マウスは、Ｌｙ−１ Ｂ細胞を循環性ＩｇＭの主要源として識別する従来の再構成実験と一致する、正常血清ＩｇＭ濃度の０〜１０％を含み；そして（ｃ）抗ＩＬ−１０処置マウスは、特異的Ｂ細胞がＬｙ−１ Ｂ細胞サブセットにあるための抗原であるホスホリルコリンおよびα１，３−デキストランの注射に応答してほとんどまたは全く抗体を生じない。抗ＩＬ−１０処置マウスにおいて通常のＢ細胞区分が変更されていないことを示唆するデータは同様に強制的であり、変化していない脾臓Ｂ細胞数は正常細胞表面の遺伝標識表現型を示し、そして胸腺依存抗原およびＢ細胞マイトジェンに対して正常に応答することを示唆する。抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ−１Ｂ細胞の選択的枯渇は、これらの被験動物の腹膜腔において抗ＩＬ−１０処置の数週間後に再現されるＬｙ−１ Ｂ細胞が中断したように、一時的であることが分かった。
抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ−１ Ｂ細胞の選択的枯渇に対する説明として、いくつかの可能な機序が考えられた。示されたデータは、中和性抗ＩＬ−１０および抗ＩＦＮγ抗体の同時投与が、これらの実験において腹膜Ｂ細胞の枯渇を実質的に防止したので、少なくとも部分的には、これが抗ＩＬ−１０処置後のＩＦＮγ上昇の結果であることを示す。ＩＦＮγが直接的にかまたは間接的にＬｙ−１ Ｂ細胞発生を阻害するという関係は、Ｌｙ−１＋ Ｂリンパ腫ＢＣＬ１のＩＬ−５に誘導されたインビトロ増殖をＩＦＮγが僅かに抑制させるという従来の観察報告を暗示させる。これらの実験を続けて、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓細胞以外の、腹膜細胞のＬＰＳに誘導された増殖のＩＦＮγに媒介された抑制が観察された。抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＩＦＮγの上昇がＬｙ−１ Ｂ細胞枯渇を完全に説明するかどうか、およびこれがＬｙ−１ Ｂ細胞のＩＦＮγの直接作用または若干のＩＦＮγに媒介された間接作用に反映されるかどうかは十分に理解されていない。おそらく、抗ＩＬ−１０処置マウスにおける他の変化が、Ｌｙ−１ Ｂ細胞の枯渇に対して更に寄与している。おそらく、抗ＩＬ−１０処置が内因性モノカイン濃度の上昇をもたらしている。抗ＩＬ−１０処置マウスは、ＬＰＳに誘導されたショックによる致死に対して５０倍を越えて感受性であり、その結果はモノカインによって媒介されることが知られており、そして個々の抗ＩＬ−１０処置マウス３２匹の内の５匹は実質的な濃度の血清ＩＬ−６を含み、モノカインは正常な動物の循環において見出されないのが一般的であり、これらの実験による１０匹の対照マウスのいずれの血清中でも検出されなかった。しかしながら、ＬＰＳのインビボ投与によって血清モノカイン濃度が大きく上昇したＩＬ−６形質転換マウスまたは動物は正常血清ＩｇＭ濃度を有すると考えられ、Ｌｙ−１ Ｂ細胞数が変化していないことが示唆される。通常のＢ細胞以外のＬｙ−１ Ｂ細胞は構成的および誘導性ＩＬ−１０を生じるという初期の知見は、ＩＬ−１０がオートクリン成長因子として作用するという示唆をもたらす。現在のところ、これは、抗ＩＬ−１０および抗ＩＦＮγ抗体で処置したマウスから回収された腹膜Ｌｙ−１ Ｂ細胞の実質的な数を考慮すると、疑わしいと考えられる。
連続の抗ＩＬ−１０処置によってつくられたＬｙ−１ Ｂ細胞枯渇マウスは、Ｌｙ−１ Ｂ細胞を欠失し且つ胸腺非依存抗原のサブセットに対して非応答性であるＣＢＡ／ＣａＨマウス由来の自然突然変異系統である免疫欠乏ｘｉｄマウスに対してかなりの類似点を有する。これらの類似点にもかかわらず、本発明者の予備研究は、ｘｉｄマウスがＩＬ−１０を正常に生産し、そして機能的ＩＬ−１０受容体を有し、したがって、ｘｉｄマウスおよび抗ＩＬ−１０処置マウスが機械的に区別されることを示した。更に、抗ＩＬ−１０処置マウスをｘｉｄマウスと区別した一つの性質は、前者によって示されるが後者の動物では示されない抗ＩｇＭ刺激に対する脾臓細胞のインビトロの応答性である。
ＩＬ−１０の生理学的役割は、マウスに誕生から成体まで、ＩＬ−１０を特異的に中和する単クローン性抗体を注射することによって研究された。このような処置は、これらの被験動物の免疫状態に多数の独特な変化をもたらす。被験動物は、循環性ＴＮＦα、ＩＦＮ−γ、そして多くの場合、ＩＬ−６の増加を特徴とする。これらの作用は、従来報告されたＩＬ−１０のインビトロの性質である、細胞培養実験におけるＩＦＮγおよびモノカイン生産の強力な抑制と一致する。内因性ＩＦＮγの増加は、抗ＩＬ−１０処置によって得られた他の結果のいくつかの原因であると考えられる。例えば、それは、Ｌｙ−１ Ｂ細胞の枯渇をもたらし、続いて、これは、循環性ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体の減少、並びにホスホリルコリンおよびα１，３デキストランに対する特異的抗体応答の要因となる。上昇したＩＦＮ−γ濃度は、ＩＦＮ−γによってこのイソタイプが明確に調節される循環性ＩｇＧ2aの増加の原因でもあると考えられる。腹膜Ｔ細胞、顆粒球および循環性ＩｇＧ2aの増加の残りの変化は機械的に理解されないが、これらは、二次サイトカイン摂動の結果でありうる。概して健康であるが、抗ＩＬ−１０処置マウスは、内毒素に誘導されたショックの結果としての致死に対して極めて感受性であることが分かった。この致命的な炎症反応は、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６かまたは内毒素に特異的な抗体の受身伝達によって防止することができるモノカインに媒介された結果である。したがって、内因性モノカインのアップレギュレーションを示し、そして抗内毒素抗体を生じると考えられるＢ細胞集団（すなわち、Ｌｙ−１ Ｂ細胞）を欠いている抗ＩＬ−１０処置マウスが、この炎症性反応に対して一層感受性であるということは驚くべきことではない。これらのデータは、抗炎症薬としてのＩＬ−１０の臨床的役割を示唆する。この概念と一致して、実験は、薬理学的用量のＩＬ−１０が、内毒素に誘導されたショックによる致死からマウスを防護することを示す。
抗ＩＬ−１０処置マウスの概説された表現型は、ＩＬ−１０の既知のインビトロの性質と明らかに一致するが、それにもかかわらず、それは、遺伝子を標的とすることによってＩＬ−１０欠乏にされたマウスについての予備報告のそれとは対照的である。これらの突然変異体は、検出不能な濃度の循環性ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６、腹膜腔中の正常な数のＬｙ１ Ｂ細胞、並びに一次近似において正常の血清Ｉｇ濃度を有する。この相違の解釈は明らかではないが、同様の相違する状態は、ＩＬ−２ノックアウトマウスと、誕生から成体まで抗ＩＬ−２受容体抗体で処置されたマウスの少なくとも若干の報告との間に存在する。一つの解釈は、サイトカイン系中に存在する十分に認識された重複性に関係する。発育するマウス胚は、密接に関係した機能を有するサイトカインをコードしている遺伝子の発現を増幅することによって臨界的サイトカイン遺伝子の損失を補うことが可能である。例えば、ＩＬ−４はＩＬ−１０と多数の性質を分担しているので、このサイトカインは、ＩＬ−１０の全損失を補うのに優れた候補であり、したがって、その発現はＩＬ−１０ノックアウトマウスにおいてアップレギュレートされるようになりうる。これに対して、マウスの誕生からの抗体治療による内因性ＩＬ−１０の中和は、サイトカインの「漏出」脱離を最もよく表わし、そして残留する痕跡の内因性ＩＬ−１０は、深刻な免疫不全および補償サイトカイン経路の調節活性化を避けるのに十分でありうる。抗体で処置された動物は、投与された異種抗体および／または結果として得られた免疫複合体に対する人為的免疫応答を増大させるという別の解釈を全く排除することはできない。それにもかかわらず、この解釈は、イソタイプ対照抗体および、インビボで免疫複合体を更に生じると考えられる他のサイトカインに対する抗体が、抗ＩＬ−１０処置マウスに起因する免疫調節を生じないので疑わしいと考えられる。
抗ＩＬ−１０処置マウスにおいて観察された免疫調節のパターンは、既知のヒト免疫不全症のいずれとも全く相関しないので、ヴィスコット・オールドリッチ患者およびＩｇＡ欠乏症候群患者双方にある種の類似点が存在する。これらのヒト免疫欠乏は、それぞれ循環性ＩｇＭまたはＩｇＡの欠失、抗細菌性抗体応答を生じる低下した能力、および循環性ＩｇＧ１の頻繁な増加、おそらくはネズミＩｇＧ２ａと相関する主な補体結合性ヒト抗体イソタイプを特徴とする。このような患者が減少したＩＬ−１０生産または応答性を示すかどうか、そうである場合に、続いてこれがそれらの免疫欠乏の一因となるかどうかは確証を待っている。ＩｇＡ欠乏症候群におけるＩＬ−１０の可能な役割は、無経験（ｎａｉｖｅ）ヒトＢ細胞を、架橋した抗ＣＤ４０抗体およびＴＧＦβによる活性化後にＩｇＡ分泌細胞に分化させるのに必要とされる重要な補助因子としてＩＬ−１０が明らかに関係している最近の研究を考慮すると、特に興味をそそる。抗ＩＬ−１０処置マウスが、２種類の細菌性抗原に対する特異的抗体応答を生じることができないことは、ＩＬ−１０が、上記に記載したように、抗細菌性免疫において有効なアジュバントであるという主張を更に支持する。
ＩＬ−１０の生理学的役割および臨床的可能性についての情報の提供に加えて、抗ＩＬ−１０処置マウスは、免疫系に対するＬｙ−１ Ｂ細胞の寄与を評価する新たな機会を提供する。前記のように、抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ−１ Ｂ細胞枯渇によって生じた二次的結果は、この少数のＢ細胞亜集団に予め起因する多数の性質を確証する。しかしながら、これらのデータにより、更に、免疫系に対するＬｙ−１ Ｂ細胞の寄与を考える新しい見通しが得られる。特に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＥの応答の発生に関して、これらのイソタイプの血清濃度はＬｙ−１ Ｂ細胞が枯渇した抗ＩＬ−１０処置マウスにおいて減少しないので、Ｌｙ−１ Ｂ細胞は必要とされないと結論することは適当である。同様に、Ｌｙ−１ Ｂ細胞は若干の胸腺非依存性ＩＩ型抗原、例えば、ホスホリルコリンおよびα１，３デキストランに対する応答性に本質的であるので、明らかに、それらは他の、例えば、ＴＮＰ−フィコールおよび抗ＩｇＭに必要とされない。実際に、多糖抗原に対するＢ細胞応答性に独自に関係したイソタイプである循環性ＩｇＧ３の不変のまたは僅かに上昇した濃度は、Ｌｙ−１ Ｂ細胞欠乏マウスが、大部分の胸腺非依存性ＩＩ型抗原に対しておそらく応答することができるということを示唆する。抗ＩＬ−１０処置マウスのこの態様は、Ｌｙ−１ Ｂ細胞を欠失しているが、胸腺非依存性ＩＩ型抗原全部に対して応答しない自然発生免疫欠乏マウス系統であるｘｉｄマウスとそれらとを容易に区別する。
免疫系に対するＬｙ−１ Ｂ細胞の寄与についての情報の提供に加えて、抗ＩＬ−１０処置マウスは、本発明者がインビボでのＴＮＦα上昇の結果を評価することを可能にする。本発明者のデータは、ＩＬ−１０のインビボでの拮抗作用が血清ＴＮＦα濃度の実質的な上昇をもたらすことを明らかに例証する。ＴＮＦα上昇の好ましくない結果は上記（例えば、敗血症性ショック、大脳マラリア等）で詳細に考察されたが、ＴＮＦα上昇の多数の好ましい結果も考慮すべきである。これらには、直接的抗腫瘍作用、顆粒球−単球造血系の拡大、若干の自己免疫疾患および感染症に対する放射線防御および防御の動物モデルにおける実証がある。したがって、これらの考察は、ＩＬ−１０アンタゴニストをこれらの種類の疾患の処置において治療的に介入するための候補として暗示する。実際に、本発明者は、抗ＩＬ−１０抗体が、狼瘡傾向のあるＮＺＢ／Ｗマウスにおいて自己免疫の発生を実質的に遅らせることができるということを実証する程度までこの提案を確証した。
要約すると、本発明は、多数の疾患状態の主要な媒介物質であるモノカインの生産を調節するためのＩＬ−１０またはＩＬ−１０アンタゴニストの使用に関する。ＩＬ−１０およびそのアゴニストは、ＴＮＦαなどのモノカインの顕著な抑制を引起こし、この方法において、望ましくない炎症性反応、例えば、細菌性敗血症、毒素性ショック、慢性関節リウマチおよびプソナシス（ｐｓｏｎａｓｉｓ）に対する防御を提供する。同様に、ＩＬ−１０アンタゴニストは、ＴＮＦαなどのモノカインの濃度を増大させ、引続き、抗腫瘍薬として、並びにある種の自己免疫疾患および感染症に対する放射線防御および防御の提供において作用することができる。
以下の実施例は、本発明を例証するのに役立つ。ベクターおよび宿主の選択並びに試薬の濃度、温度および他の可変パラメーターの値は、本発明の適用を例示するためのものであり、それを制限するものと考えるべきではない。
実例１
細菌宿主におけるヒトＩＬ−１０の発現
合成ヒトＩＬ−１０遺伝子を多数の化学的に合成された二本鎖ＤＮＡフラグメントから組立てて、ＴＡＣ−ＲＢＳ−ｈＩＬ−１０と称する発現ベクターを生成した。クローニングおよび発現は、標準的な細菌の系、例えば、ビエラ（Ｖｉｅｒａ）およびメシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）によってＧｅｎｅ，１９巻，２５９〜２６８頁（１９８２）に記載された大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１、ＪＭ１０３または類似のものにおいて実施した。制限エンドヌクレアーゼ消化およびリパーゼ反応は、典型的に、標準的なプロトコル、例えば、本明細書中に参考として包含される、マニアティスら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク、１９８２）；サムブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク）；およびオースベルら（１９８７年および定期補遺）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨークを用いて実施した。
アルカリ法を小規模なプラスミド調製試料に用いた。大規模な調製試料に対しては、等量のイソプロパノールを用いて核酸を透明な溶菌液から沈殿させるアルカリ法の変法を用いた。冷２．５Ｍ酢酸アンモニウムによる沈殿を用いてＲＮＡを除去した後に、塩化セシウム平衡密度遠心分離および臭化エチジウムによる検出を行なった。
フィルターハイブリダイセーションに関して、ワットマン５４０円形フィルターを用いてコロニーを取り上げた後、それを、０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ；１ＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．０、１．５Ｍ ＮａＣｌ（それぞれ２分間）による連続処理によって溶解させ且つ固定し；そして８０℃で（３０分間）加熱した。ハイブリダイセーションは、６ｘＳＳＰＥ、２０％ホルムアミド、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、大腸菌ｔＲＮＡ１００μｇ／ｍｌおよびクマシーブリリアントブルーＧ−２５０（バイオ・ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））１００μｇ／ｍｌ中において３２Ｐ標識（キナーゼ処理）合成ＤＮＡを用いて４２℃で６時間であった。（２０ｘＳＳＰＥは、ＮａＣｌを１７４ｇ、ＮａＨ2ＰＯ4９Ｈ2Ｏを２７．６ｇおよびＥＤＴＡ７．４ｇをＨ2Ｏ８００ｍｌ中に溶解することによって製造された。ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整した。容量を１リットルに調整し、そしてオートクレーブによって滅菌した）。フィルターを１ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄した（室温、１５分間）。オートラジオグラフィー（フジ（Ｆｕｊｉ）ＲＸフィルム）後、陽性コロニーは、フィルター上において再増殖コロニーを青色に染色されたコロニーと一緒に整列させることによって位置が示された。ＤＮＡは、ジデオキシ法、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４巻，５４６３頁（１９７７）によって配列決定された。ジデオキシ反応用の鋳型は、Ｍ１３ｍｐベクターで再クローン化された適当な領域の一本鎖ＤＮＡ、例えば、メシングら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９巻，３０９頁（１９８１）かまたはミニアルカリ法によって製造し且つ０．２Ｍ ＮａＯＨで変性し（室温、５分間）、そして２容量のエタノールを加えることによって０．２Ｍ ＮａＯＨ、１．４３Ｍ酢酸アンモニウムから沈殿させた二本鎖ＤＮＡであった。ＤＮＡは、ホスホルアミダイト化学によりアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ａ合成機を用いて合成された。合成、脱保護、開裂および精製（７Ｍ尿素ＰＡＧＥ、溶離、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー）は、３８０Ａ合成機マニュアルに記載されたように実施した。
クローン化される合成ＤＮＡの相補鎖（それぞれ４００ｎｇ）を混合し、そして反応容量５０ｍｌ中においてポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。このＤＮＡをベクターＤＮＡ１ｍｇと連結し、適当な制限酵素で消化し、そして連結反応は容量５０ｕｌ中において室温で４〜１２時間行なった。リン酸化、制限酵素消化、ポリメラーゼ反応および連結反応の条件は記載されている（マニアティスら、上記に引用）。コロニーは、アンピシリン、イソプロリル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（０．４ｍＭ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）（４０μｇ／ｍｌ）を補足したＬ寒天上に平板培養することによって（望ましい場合）ｌａｃＺ＋の評点をした。
ＴＡＣ−ＲＢＳベクターは、ｔａｃＰ含有プラスミドｐＤＲ５４０（ファーマシア（Ｐｈａｒｍｃｉａ））の単一ＢａｍＨＩ部位を、ＤＮＡポリメラーゼを用いる充填によって構築された。次に、これを、共通リボソーム結合性部位（ＲＢＳ、ＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＣ）をコードしている二本鎖フラグメントを形成する非リン酸化合成オリゴヌクレオチド（ファーマシア）に対して連結した。連結反応後、混合物をリン酸化し、そしてＳｓｔＩリンカーＡＴＧＡＧＣＴＣＡＴと再連結した。次に、この複合体をＳｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで開裂させ、そして１７３ｂｐのフラグメントをポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって単離し、そしてＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ制限ｐＵＣ１９（ファーマシア）（下記に記載の）でクローン化した。最終構築物（ＴＡＣ−ＲＢＳと称する）のＲＢＳ−ＡＴＧ−ポリリンカー領域の配列は、本明細書中に参考として包含される米国特許第５，０１７，６９１号明細書に開示されている。
合成ＩＬ−１０遺伝子を８工程においてｐＵＣ１９プラスミドで組立てた。各工程で、欠失および／またはインサートを含まないインサートは、工程１で挿入されたＡＴＧ開始コドンを含む枠においてｐＵＣ１９のｌａｃＺ（ａ）遺伝子を維持することによってクローニング後に検出することができた。欠失および／または挿入変化を含むクローンは、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含むＬ−アンピシリンプレート上の青色コロニーの評点によって濾去することができた。或いは、各工程で、小規模のプラスミドＤＮＡ調製試料に普遍的配列決定プライマーを用いてインサートの配列を容易に確証することができる。
工程１において、ＴＡＣ−ＲＢＳベクターをＳｓｔＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（その３′エキソヌクレアーゼ活性はＳｓｔＩカットの３′突出鎖を消化してブラント末端フラグメントを生成する）で処理し、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの失活後にＥｃｏＲＩで処理して１７３塩基対（ｂｐ）フラグメントを生成する。このフラグメントはＴＡＣ−ＲＢＳ領域を含み且つＡＴＧ開始コドンのところにブラント末端および反対側の末端にＥｃｏＲＩカットを有する。最後に、１７３ｂｐのＴＡＣ−ＲＢＳフラグメントを単離した。
工程２において、工程１の単離されたＴＡＣ−ＲＢＳフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで消化したプラスミドｐＵＣ１９と、下記に示したように、上流末端にブラント末端および下流末端にＫｐｎＩカットに対応するスタッガー末端を有する合成フラグメント１Ａ／Ｂと一緒に混合した。このＫｐｎＩ末端はＢｓｔＥＩＩ部位に対しておよびその下流に隣接している。フラグメントを連結して工程２のｐＵＣ１９を生成する。
工程３において、合成フラグメント２Ａ／Ｂおよび３Ａ／Ｂ（下記に示した）を、ＢｓｔＥＩＩ／ＳｍａＩで消化した工程２のｐＵＣ１９と混合し（増幅および精製後）且つ連結して工程３のｐＵＣ１９を生成した。フラグメント３Ａ／Ｂの下流末端が、ＳｍａＩブラント末端を生成する余分の塩基を含むことに留意されたい。これらの余分の塩基は工程４において開裂した。更に、フラグメント２Ａ／Ｂおよび３Ａ／Ｂは、混合によってアニールする相補的９残基一本鎖末端を有し、２Ａ／Ｂの上流ＢｓｔＥＩＩカットと、ｐＵＣ１９に対して連結する３Ａ／Ｂの下流ブラント末端を残している。
工程４において、ＡｆｌＩＩ／ＸｂａＩで消化した工程３のｐＵＣ１９（増幅および精製後）を再精製し、合成フラグメント４Ａ／Ｂ（下記に示した）と混合し、そして連結して工程４のｐＵＣ１９を生成する。
工程５において、ＸｂａＩ／ＳａｌＩで消化した工程４のｐＵＣ１９（増幅および精製後）を合成フラグメント５Ａ／Ｂ（下記に示した）と混合し且つ連結して工程５のｐＵＣ１９を生成する。フラグメント５Ａ／ＢのＳａｌＩスタッガー末端が工程６においてＨｐａＩによる消化によって除去されることに留意されたい。
工程６において、ＨｐａＩ／ＰｓｔＩで消化した工程５のｐＵＣ１９（増幅および精製後）を合成フラグメント６Ａ／Ｂ（下記に示した）と混合し且つ連結して工程６のｐＵＣ１９を生成する。
工程７において、ＣｌａＩ／ＳｐｈＩで消化した工程６のｐＵＣ１９（増幅および精製後）を合成フラグメント７Ａ／Ｂ（下記に示した）と混合し且つ連結して工程７のｐＵＣ１９を生成する。
工程８において、ＭｌｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した工程７のｐＵＣ１９（増幅および精製後）を合成フラグメント８Ａ／Ｂおよび９Ａ／Ｂと混合し且つ連結して最終構築物を生成する。最終構築物を標準的な技法によって、例えば、ＡＴＣＣから受託番号３３８７６として入手可能な大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１に挿入した。培養後、タンパク質をＪＭ１０１細胞から抽出し、そしてその抽出物の希釈液の生物活性を検査した。フラグメントと称する配列を表１に示す。
実施例２
ＣＯＳ７サル細胞におけるｖＩＬ−１０の発現
ｖＩＬ−１０の読取り枠をコードしている遺伝子を、タケベ（Ｔａｋｅｂｅ）ら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６〜４７２に記載された、増幅フラグメントをＥｃｏＲＩ消化ｐｃＤ（ＳＲａ）ベクター中に後で挿入することが可能なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させた。挿入されたフラグメントのコーディング鎖を以下に示す（読取り枠を大文字で与える）。
適当な配向のインサートを有するクローンを、ｖＩＬ−１０の発現および／または制限消化の電気泳動パターンによって識別した。ｖＩＬ−１０遺伝子を有する一つのこのようなベクターはｐＢＣＲＦ１（ＳＲａ）と称され且つＡＴＣＣに受託番号６８１９３として寄託された。ｐＢＣＲＦ１（ＳＲａ）を大腸菌ＭＣ１０６１において増幅させ、標準的な技法によって単離し、そしてＣＯＳ７サル細胞を以下のようにトランスフェクトするのに用いた。すなわち、トランスフェクションの前日に、ＣＯＳ７サル細胞約１．５ｘ１０6個を、１００ｍｍプレートそれぞれの５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および２ｍＭグルタミンを含むダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥ）中に播種した。トランスフェクションを実施するために、ＣＯＳ７細胞をトリプシンとのインキュベーションによる皿から取出し、血清不含ＤＭＥ中で２回洗浄し、そして血清不含ＤＭＥ中において細胞１０7個／ｍｌに懸濁させた。アリコート０．７５ｍｌをＤＮＡ２０μｇと混合し、そして滅菌０．４ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。１０分後、細胞にバイオラド・ジーン・パルサー（ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）装置において２００ボルト、９６０ｍＦでパルスした。更に１０分後、細胞をキュベットから取出し、そして５％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンを含むＤＭＥ２０ｍｌを加えた。混合物を１００ｍｍ組織培養皿４個に分別した。３７℃、５％ＣＯ2で１２〜２４時間後、培地を同様の１％ＦＣＳのみを含む培地と取り換え、そしてインキュベーションを３７℃、５％ＣＯ2で更に７２時間続けた後、培地を集め、そしてＩＦＮγ合成を阻害するその能力を検定した。
新たに単離した末梢血液白血球（ＰＢＬ）のアリコート１０ｍｌ（細胞約２ｘ１０6個／ｍｌ）を、（ｉ）５％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを補足した９０％ＤＭＥと、（ｉｉ）ｐＢＣＲＦ１（ＳＲａ）で予めトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞からの１０％上澄みとから成る培地中においてフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（１００ｎｇ／ｍｌ）と一緒に３７℃でインキュベートした。２４時間後、細胞および上澄みを採集して、ＩＦＮγ ｍＲＮＡかまたはＩＦＮγタンパク質の存在をそれぞれ検定した。対照は、１０％上澄みが、無関係のｃＤＮＡインサートを有するプラスミドで予めトランスフェクトされたＣＯＳ７培養物からであることを除き、同様に処理された。ｖＩＬ−１０処置試料は、対照に相対して約５０％のＩＦＮγ合成阻害を示した。
実施例３
大腸菌におけるｖＩＬ−１０の発現
下記のｖＩＬ−１０をコードしている遺伝子は大腸菌において発現することができる。
ｐＢＣＲＦ１（ＳＲａ）のｃＤＮＡインサートをＭ１３プラスミドで再クローン化し、そこにおいて、それは特定部位の突然変異誘発によって２回変更された。すなわち、最初に、成熟ｖＩＬ−１０ポリペプチドのコーディング領域の５′末端にＣｌａＩ部位を形成し、そして第二に、成熟ｖＩＬ−１０ポリペプチドのコーディング領域の３′末端にＢａｍＨＩ部位を形成した。次に、突然変異配列を、以下に記載したＴＲＰＣ１１発現ベクター中に容易に挿入した。
ＴＲＰＣ１１ベクターを、合成した共通ＲＢＳフラグメントをＣｌａＩリンカー（ＡＴＧＣＡＴ）に対して連結することによっておよびその結果得られたフラグメントをＣｌａＩ制限ｐＭＴ１１ｈｃ（ＣｌａＩ部位を含むように予め修飾された）でクローニングすることによって構築した。ｐＭＴ１１ｈｃは、ｐＶＸプラスミドＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩポリリンカー領域を有するｐＢＲ３２２のＴＥＴＳ誘導体である小型の（２．３キロベース）高コピーＡＭＰRである。ｐＶＸは、マニアティスら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバーに記載されている。これを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでｐＭＴ１１ｈｃを制限することによってＣｌａＩ部位を含むように修飾し、得られた５′付着端をフィルインし、そしてＣｌａＩリンカー（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）と連結し、それによってＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を復元し且つＳｍａＩ部位をＣｌａＩ部位で置き換えた。ＴＲＰＣ１１構築による一つの形質転換体は、ＣｌａＩ部位に隣接してタンデムにＲＢＳ配列を有した。ＣｌａＩ部位の一つおよびＲＢＳ配列の第二コピーの一部分を、このプラスミドをＰｓｔＩで消化し、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼで処理し、ＥｃｏＲＩで制限し、そして４種類全部のデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下においてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって除去した。得られた３０〜４０ｂｐのフラグメントをＰＡＧＥによって回収し且つＳｍａＩ制限ｐＵＣ１２中にクローン化した。次に、ｐＫＣ１０１由来の２４８ｂｐの大腸菌ｔｒｐｐ含有ＥｃｏＲＩフラグメント（ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ）ら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：１５５〜１６４，アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨークに記載された）をＥｃｏＲＩ部位でクローン化してＴＲＰＣ１１構築を完成した。これを図１に図示する。ＴＲＰＣ１１は、最初にそれをＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、それを精製した後、それを標準的な連結反応溶液中において、成熟ＢＣＲＦ１をコードするヌクレオチド配列を有するＭ１３のＣｌａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントと混合することによってｖＩＬ−１０のためのベクターとして用いられた。ＴＲＰＣ１１−ＢＣＲＦ１と称するインサート含有ＴＲＰＣ１１を、例えば、ＡＴＣＣから受託番号３３８７６として入手可能な大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０１において増殖させた。
実験Ａ
インターロイキン−２に誘導されたインターフェロン−γ合成およびリンホカインに活性化されたキラー活性に対するインターロイキン−４およびインターロイキン−１０の示差効果
この項で示したデータは、本明細書中にその全部が参考として包含されているシューら（１９９２）Ｉｎｔ′ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４：５６３〜５６９、においてその優先日後に公開された。
概要
ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）とインターロイキン−２（ＩＬ−２）との培養は、サイトカインの合成およびリンホカインに活性化されたキラー（ＬＡＫ）活性の発生を刺激する。インターロイキン−４およびインターロイキン−１０（ＩＬ−１０；サイトカイン合成阻害因子、ＣＳＩＦ）双方は、ＩＬ−２に誘導されたヒトＰＢＭＣによるＩＦＮγおよびＴＮＦαの合成を阻害する。しかしながら、ＩＬ−４とは異なり、ＩＬ−１０は、ＰＢＭＣおよび活発なナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＩＬ−２に誘導された増殖も、ＩＬ−２に誘導されたＬＡＫ活性も阻害しない。更に、ＩＬ−４は、精製された活発なＮＫ細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ合成を阻害するが、対照的に、ＩＬ−１０の阻害作用はＣＤ１４＋細胞（単球／マクロファージ）によって媒介される。ＩＬ−１０は単球またはＮＫ細胞を加えた単球によるＴＮＦα合成を阻害するが、ＮＫ細胞単独による場合は阻害しない。これらの結果は、ＩＬ−４およびＩＬ−１０が異なる経路によってＮＫ細胞に作用することおよびＩＬ−２に誘導されたサイトカイン合成およびＬＡＫ活性は異なる機序によって調節されることを示す。
インターロイキン−１０（サイトカイン合成阻害因子、ＣＳＩＦ）は、マウスおよびヒトＴリンパ球および単球／マクロファージによるＩＦＮγなどのサイトカインの合成を阻害する。Ｔ細胞サイトカイン合成に対する阻害作用は間接的であり、単球／マクロファージによってそれらの抗原提示細胞としての能力において媒介される。マウスおよびヒト双方のＩＬ−１０（ｍＩＬ−１０；ｈＩＬ−１０）は、マウスおよびヒト細胞に対してＩＬ−１０活性を示すエプスタイン・バールウイルス読取り枠ＢＣＲＦ１（ウイルスＩＬ−１０；ｖＩＬ−１０）に対して相同である。ｖＩＬ−１０が、ヒトＰＢＭＣによるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ合成を阻害することは初期に観察された。ＮＫ細胞はＩＬ−２に刺激されたＰＢＭＣ中の主要なＩＦＮγ源であることが報告されているので、ＩＬ−２に誘導されたサイトカイン合成およびＬＡＫ活性に対するｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０の作用は、これらのサイトカインとＬＡＫ活性の既知の阻害剤であるＩＬ−４とを比較することと一緒に研究された。データは、ＩＬ−４、ｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０が、ＩＬ−２に刺激されたＰＢＭＣによるＩＦＮγおよびＴＮＦαの合成を阻害するが、ＩＬ−４だけが精製ＮＫ細胞によるＩＦＮγ合成を阻害するということを示す。更に、ＩＬ−４とは異なり、ＩＬ−１０はＩＬ−２に誘導されたＬＡＫ活性を阻害しない。これらの結果は、ＩＬ−４およびＩＬ−１０が異なる機序によってＮＫ細胞に作用し且つＩＬ−２に誘導されたサイトカイン合成およびＬＡＫ活性が異なる経路によって調節されるという模型を支持する。
実施例Ａ１
ＩＬ−２に誘導されたサイトカイン合成およびＬＡＫ活性に対するＩＬ−４およびＩＬ−１０の作用
サイトカイン
ヒト組換体ＩＬ−２（ｒＩＬ−２）は、Ｓ．ズラウスキー（Ｚｕｒａｗｓｋｉ）による標準的な方法（ＤＮＡＸ）を用いて好ましく製造するかまたは購入した（シータス（Ｃｅｔｕｓ）、エメリービル、ＣＡ）。ヒトｒＩＬ−４はシェリング・プラウ・リサーチ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）からであった。ヒトｒＩＬ−１βはバイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（カマリロ、ＣＡ）から購入した。組換体ｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０をＣＯＳ７トランスフェクション上澄みとして用い、不適当なｃＤＮＡを含むかまたはｃＤＮＡ不含のトランスフェクションからの上澄みを対照として用いた。本明細書中に参考として包含され且つ上記のビエラら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８８：１１７２〜１１７６およびシューら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：８３０〜８３２を参照されたい。ＩＦＮγおよびＴＮＦα（エンドジェン（Ｅｎｄｏｇｅｎ）、ボストン、ＭＡ）をエリザによって測定した。ＩＬ−２不存在下のサイトカイン生産は、ＩＦＮγおよびＴＮＦαエリザ検定の感度限界未満であり、それぞれ０．３ｎｇ／ｍｌおよび１２ｐｇ／ｍｌであった。
細胞系
ダウディ（バーキットリンパ腫）細胞はシェリング・プラウ（リヨン、フランス）によって提供された。ルイス・ラニア博士（Ｄｒ．Ｌｅｗｉｓ Ｌａｎｉｅｒ）によって提供されたＣＯＬＯ（結腸癌）細胞を、５％ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ１６４０中において培養した。
抗体
白血球細胞表面抗原に対する単クローン性抗体（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６）をベクトン・ディキンソン（サン・ホセ、ＣＡ）から購入した。マグネチックビーズ枯渇実験用の抗体（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１４、ＣＤ１９）は、適当な細胞系を注射したＳＣＩＤマウスの腹水から製造した。抗ＩＬ−４および抗ＩＬ−１０中和抗体は、例えば、本明細書中に参考として包含される、クレティアン（Ｃｈｒｅｔｉｅｎ）ら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１７：６７〜８１；およびイセル（Ｙｓｓｅｌ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．７２：２１９〜２２７に記載されている。
ＰＢＭＣの調製および培養
ヒトＰＢＭＣを、健康なドナーからのバフィーコートからフィコール・ハイパクでの遠心分離によって単離し、そして１％ヒトＡｂ＋血清を有するイセル（Ｙｓｓｅｌ′ｓ）培地中において他のサイトカインを含むかまたは含まない１０６／ｍｌ ｕｂ ｒＩＬ−２（２００単位／ｍｌ）で培養した。培養は２４（または９６）ウェルプレート中において５日間実施し、そして上澄みを採集した。異なるドナーからのＰＢＭＣは、ＩＬ−２によって刺激された場合、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを生産するそれらの能力が異なった。
細胞精製
ＰＢＭＣを洗浄し且つ組織培養皿中において３７℃で４０分間インキュベートした。付着細胞をラバーポリスマンで掻取ることによって集めた。非付着細胞を除去し、ペレットにし、そしてナイロンウールカラムに入れ且つ３７℃で４０分間インキュベートした。カラムから溶離後、細胞をペレットにし、１０％ＦＣＳ／ＰＢＳを含む３０％パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）中に再懸濁させ、そして４０％パーコール上に重層した。室温で３０分間遠心分離後、界面の大型顆粒リンパ球を回収し且つ２回洗浄した。これらの細胞を抗ＣＤ５６抗体（ベクトン・ディキンソン、サン・ホセ、ＣＡ）と一緒に４℃で３０分間インキュベートし、洗浄した後、ＦＡＣＳ選別の前に、ヤギ抗マウスＦＩＴＣ（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、エーボンデール、ＰＡ）で染色した。ＣＤ５６＋細胞は、選別を行なった細胞の約３５〜５０％であった。選別された細胞は、再分析により、９９．５％より大のＣＤ５６＋であった。精製ＮＫ細胞９ｘ１０４個を、最終容量１００ｍｌ中において付着細胞またはＴ細胞３ｘ１０４個と混合し、そして他のサイトカインを含むかまたは含まないＩＬ−２と一緒に培養した。
同一ドナーからの精製ＮＫ細胞および単球を以下のように得た。すなわち、ＰＢＭＣをヒツジ赤血球と一緒に一晩中インキュベートし；ロゼット形成「Ｅ＋」（ＣＤ２＋）および非ロゼット形成「Ｅ−」細胞をフィコール・ハイパク勾配での遠心分離によって分離した。Ｅ＋細胞に、ＰＢＭＣに関して記載したのと同様の精製操作（前記を参照されたい）を施して精製ＮＫ細胞を得た。引続き、Ｅ−細胞を抗ＣＤ１４ ｍＡｂ（ＬｅｕＭ３）およびＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と一緒にインキュベートし、そしてＣＤ１４＋細胞をファクスタープラス（ＦＡＣＳｔａｒ ｐｌｕｓ）で選別した。これらの細胞純度は９８％より大であった。精製ＮＫ細胞１０５個を１００ｍｌ中において純粋な単球１０4個と一緒にインキュベートし且つ単独でかまたはＩＬ−２および前記に記載の他の添加物と一緒に培養した。
或いは、ＮＫ細胞および単球をマグネチックビーズ選択によって豊富にした後、以下のように選別した。すなわち、ＰＢＭＣを最初に単クローン性抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ５および抗ＣＤ１９抗体と一緒にインキュベートしてＴ細胞およびＢ細胞を染色した。ＰＢＳで２回洗浄後、ヤギ抗マウスＩｇＧ被覆マグネチックビーズ（ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）Ｍ−４５０、ダイナル・インコーポレーテッド（Ｄｙｎａｌ Ｉｎｃ．）、グレート・ネック、ＮＹ）を加えて、抗体被覆Ｔ細胞およびＢ細胞をマグネチック選択によって除去した。得られた豊富なＮＫ細胞および単球を抗ＣＤ５６−ＰＥおよび抗ＣＤ１４−ＦＩＴＣで染色し、そしてＣＤ５６＋およびＣＤ１４＋細胞を細胞ソーターで単離した。２種類の選別された細胞集団の純度は９８．５％より大であった。
細胞毒性検定
ＰＢＭＣを、１％ヒトＡＢ＋血清を含むイセル培地中においてＩＬ−２を２００Ｕ／ｍｌと一緒に細胞１０６個／ｍｌで３日間インキュベートした。培養は、リンブロ（Ｌｉｎｂｒｏ）２４ウェルプレート（フロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マクリーン、ＶＡ）の１−ｍｌウェル中で実施した。培養期間後に細胞を採集し、２回洗浄し、そして５１Ｃｒ放出検定においてエフェクター細胞として用いた。本明細書中に参考として包含される、スピッツ（Ｓｐｉｔｓ）ら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：２９〜 を参照されたい。５１Ｃｒで標識された標的細胞（ＣＯＬＯまたはダウディ）１０００個を、Ｕ字型の９６ウェルプレート中の０．２５％ＢＳＡ含有イスコヴ（Ｉｓｃｏｖ′ｓ）培地（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、セント・ルイス、ＭＯ）中において種々の数のエフェクター細胞と混合した。プレートを５０ｘｇで５分間遠心分離した後に、給湿した５％ＣＯ２雰囲気中において３７℃で４時間インキュベーションした。試料を採集し且つガンマカウンター（ＬＡＢ、ブロンマ、スウェーデン）で計数した。
組換体ｈＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０およびｈＩＬ−４を、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）中においてＩＬ−２によって引起こされたＩＦＮγおよびＴＮＦαの合成並びにＬＡＫ活性に対するそれらの作用に関して検査した。ＰＢＭＣをｒＩＬ−２の２００Ｕ／ｍｌ中においてｒＩＬ−４（２００Ｕ／ｍｌ）と一緒にかまたはｈＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０含有若しくはサイトカイン不含（模擬）のＣＯＳ７上澄みと一緒に５日間培養した後、サイトカイン合成を測定した。ｈＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０またはＩＬ−４を含む培養物中においてＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγおよびＴＮＦαの合成は実質的に阻害された（図２Ａ、２Ｂ）。
ＩＬ−４によって得られた結果は、ＩＬ−４が、ＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を阻害するという観察報告を確証する。ＩＬ−４およびＩＬ−１０双方によるサイトカイン合成の阻害は用量依存性であり、抗ｈＩＬ−４および抗ｈＩＬ−１０単クローン性抗体をそれぞれ阻止することによって逆行するが、イソタイプ対照免疫グロブリンでは逆行しない（図２Ｃ、２Ｄ）。
ＬＡＫ活性を、更に、ＬＡＫ細胞によって効率よく死滅するが活発なＮＫ細胞によっては死滅しないバーキットリンパ腫細胞系ダウディおよび結腸癌系ＣＯＬＯに対して評価した。ダウディおよびＣＯＬＯ細胞に対するＩＬ−２に誘導されたＬＡＫ活性は、ＩＬ−４を含む培養物においてのみ阻害され、ｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０培養物中においては変化しないかまたは僅かに増大さえした（図３Ａ）。ＩＬ−２に誘導されたＬＡＫ活性は、主としてＣＤ５６（Ｌｅｕ１９）＋ＮＫ細胞によって媒介される。ＣＯＬＯ細胞に対するＬＡＫ活性がＩＬ−１０によって阻害されなかったということは、活性ＮＫ細胞によって媒介された細胞毒性がこのサイトカインによって影響されないことを示した。しかしながら、活性ＣＤ３＋ ｇｄ＋ Ｔ細胞はダウディ細胞を死滅させることができるので、ダウディに対するＩＬ−２に誘導されたｇｄ＋ Ｔ細胞の細胞毒性をＩＬ−１０が刺激し、同時に、この標的細胞に対するＩＬ−２に誘導されたＮＫ活性を阻止することは可能であった。
ＩＬ−２およびｈＩＬ−１０で培養されたＰＢＭＣ中において誘導された抗ダウディＬＡＫ細胞の表現型を決定するために、ＣＤ５６＋およびＣＤ５６−集団をＦＡＣＳによって選別し且つそのダウディ細胞に対する細胞毒性を検査した。図３Ｂは、ＩＬ−２単独の場合と同様に、有意のＬＡＫ活性がＣＤ５６＋集団においてのみ観察されたことを示す。したがって、ＩＬ−４およびＩＬ−１０双方がＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγおよびＴＮＦαの合成を阻害し、ＩＬ−４だけが、ＰＢＭＣ中に存在する活性ＮＫ細胞によるＩＬ−２に誘導された細胞毒性を阻害する。
実施例Ａ２
ＩＬ−１０は、ＩＬ−２に刺激された精製ＮＫ細胞によるＩＦＮγ合成またはその増殖を阻害しない。
増殖検定
細胞を９６ウェル丸底プレート中において細胞１０５個／ウェルで分配し、そして最終容量２００μｌ／ｍｌ中においてサイトカイン存在下または不存在下で４日間インキュベートした。次に、１０μｌ中の３Ｈ−チミジン１ｍＣｉを各ウェルに加えた。６時間後に培養物を採集し、そして取込まれた放射能をシンチレーション計数によって評価した。
ＰＢＭＣにおけるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ合成の大部分は、Ｔ細胞よりもむしろＮＫ細胞由来であるらしい。したがって、ＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ合成に対するｈＩＬ−１０、ｖＩＬ−１０およびＩＬ−４の作用は、ＦＡＣＳで精製されたＮＫ細胞（純度＞９９．５％）によって検査された。ＩＬ−４は、これらの細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ分泌を阻害したが；対照的に、ｈＩＬ−１０もｖＩＬ−１０も、精製された活発なＮＫ細胞によるＩＦＮγ合成を抑制しなかった（図４Ａ）。更に、ＩＬ−４は、ＰＢＭＣまたは精製ＮＫ細胞によるＩＬ−２に誘導された増殖を有意に阻害したが、ＩＬ−１０は、ＩＬ−２に媒介された増殖に対して作用しなかった（図４Ｂ）。
ＩＬ−４とは対照的に、ＩＬ−１０はＮＫ細胞に直接的に作用しないが、同時刺激シグナルを与える単球の能力を阻害する。この結論は、ＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ生産に対するＩＬ−１０の作用によって最も明確に支持される。前記のように、補助細胞調製試料はＩＦＮγを生産しなかった。ＩＬ−２に刺激されたＮＫ細胞は、補助細胞を用いることなく有意の濃度のＩＦＮγを生産したが（図４Ａ、５Ａおよび５Ｂ）、プラスチック付着細胞および精製ＣＤ１４＋細胞双方を精製ＮＫ細胞に加えることにより、ＩＦＮγ合成は大きく増大した。ＮＫ細胞に対するＩＬ−１０の直接作用の不存在（図４Ａおよび４Ｂ）は、ＩＬ−１０が、単球に対して作用することによってＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ生産を阻害していることを示唆する。同様に、ＩＬ−１０によるＴ細胞サイトカイン合成阻害は、単球／マクロファージ補助細胞によって媒介される。
実施例Ａ３
単球は、ＮＫ細胞によるＩＬ−２に刺激されたＩＦＮγおよびＴＮＦα合成のＩＬ−１０による阻害を媒介する。
ＩＦＮγ合成が、ＰＭＢＣの培養物中においてＩＬ−１０によって阻害されたが純粋なＮＫ細胞では阻害されなかったということは、ＩＬ−１０のこの作用が補助細胞によって媒介されたことを示唆した。これらの補助細胞の性質を研究するために、パーコール勾配遠心分離によって得られた低密度細胞画分から、またはＴ細胞、Ｂ細胞および単球を枯渇したＰＢＭＣからＣＤ５６＋細胞を選別することによってＮＫ細胞を精製し、そしてプラスチック付着細胞とまたはパーコール勾配からの高密度細胞集団（Ｔ細胞９８％）と混合した。付着細胞をＮＫ細胞に加えることにより、ＮＫ細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ生産は激しく増大し；付着細胞のこの刺激作用はＩＬ−１０によって阻止された（図５Ａ）。付着細胞集団自体は、ＩＬ−２に応答して検出可能な濃度のＩＦＮγを生産しなかった。対照的に、Ｔ細胞含有画分は、ＮＫ細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ生産に対して作用しなかったし、ＩＬ−１０によるＩＦＮγ生産の阻害を媒介しなかった（図５Ａ）。
プラスチック付着細胞は単球に富むが、他の細胞集団を含むことができる。単球が、ＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ生産を増大させたし、ＩＬ−１０によるその阻害も媒介したことを確証するために、ＮＫ細胞およびＣＤ１４＋単球を選別によって精製し且つＩＬ−２およびＩＬ−１０存在下で培養した。図５Ｂは、ＮＫ細胞に対して精製された単球を加えることにより、ＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ生産が増大したことおよびＩＬ−１０がこの増大を阻害したことを示す。
ＴＮＦα合成に関して、定性的に同様の結果が観察された。図５Ｃは、予想されるように、ＮＫ細胞がＩＬ−２に応答して検出可能なＴＮＦαを生産したことを示す。ＣＤ１４＋細胞は、ＩＬ−２とは無関係にＴＮＦαを生産する。ＩＬ−１０は、ＩＬ−２の存在下（図５Ｃ）および不存在下双方において単球によるＴＮＦα生産を阻害する。対照的に、ＮＫ細胞によるＴＮＦα合成はＩＬ−１０によって阻害されなかった。ＮＫおよびＣＤ１４＋細胞の同時の刺激により、どちらかの細胞だけで観察されるよりも実質的に高いＴＮＦα生産濃度が得られ、この増加はＩＬ−１０によって阻止された。
単球およびそれらの生産物は、ＮＫ細胞を休止させることにより、ＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ生産を実質的に増加させることが分かった（図５Ｂ）。いくつかのモノカイン、例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦαは、種々の条件下においてヒトおよびマウスＮＫ細胞によるＩＦＮγ合成の同時刺激剤として包含された。ＬＰＳまたはＩＦＮγに刺激された単球／マクロファージによるＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαなどのモノカインの合成をＩＬ−１０が阻害するということは、ここで報告されたＩＬ−１０の作用が、補助細胞による同時刺激分子の生産をＩＬ−１０が阻害することに基づいていたことを示唆する。付着細胞の上澄み（主として単球を含む）は、ＩＬ−２に刺激された精製ＮＫ細胞によるＩＦＮγ生産を増大させることが観察されたが、ＩＬ−１０存在下で培養された付着細胞の上澄みは、ＩＬ−１０を枯渇した場合でさえもこの能力を欠いている。この上澄みの活性が補助細胞の完全な同時刺激作用の要因であるかどうかは不明である。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βはＮＫ細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ生産を同時刺激するが、ＩＬ−６またはＴＮＦαは刺激しないということが観察されたが；しかしながら、ＩＬ−１を最大１０００Ｕ／ｍｌまで加えることは、未分別のＰＢＭＣによるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ合成に対するＩＬ−１０の阻害作用を逆行させない。したがって、１種類若しくはそれ以上の追加の活性がこの系において機能し、またはＩＬ−１０が、ＮＫ細胞によるサイトカイン合成を阻害する第二の因子の合成をもたらすという可能性が存在する。
実験Ｂ
ＩＬ−１０はヒト単球によるサイトカイン合成を阻害する：単球によって生産されたＩＬ−１０の自己調節の役割。
この項において示したテータは、本明細書中に参考として完全に包含されている、デ・ワール・マレフィト（ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔ）ら（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．１７４：１２０９〜１２２０に、その優先日後に公開された。
概要
この項は、ＬＰＳによって活性化されたヒト単球が、従来、サイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）と称されるインターロイキン（ＩＬ−１０）を用量依存形式において高濃度で生産することができるということを実証する。ＩＬ−１０は、単球の活性化の７時間後に検出可能であり、ＩＬ−１０生産の最大濃度は２４〜４８時間後に観察された。これらの速度論は、ヒト単球によるＩＬ−１０の生産が、活性化の４〜８時間後にいずれも高濃度で分泌されたＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦαおよびＧ−ＣＳＦの生産と比較して相対的に遅いことを示した。ＬＰＳで活性化した単球によるＩＬ−１０の生産は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの場合と同様に、ＩＬ−４によって阻害された。更に、培養の開始時に、ＩＦＮγ、ＬＰＳまたはＬＰＳおよびＩＦＮγの組合わせによって活性化された単球に対して加えられたＩＬ−１０は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産を転写段階で強く阻害した。ウイルスＩＬ−１０はヒト細胞に対する同様の生物活性を有するが、更に、ＬＰＳ活性化後の単球によるＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦの生産を阻害した。中和性抗ＩＬ−１０ ｍＡｂの存在下におけるＬＰＳによる単球の活性化は、ＬＰＳ処理のみの場合と比較して多量のサイトカイン生産を引起こし、内因的に生じたＩＬ−１０はＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産を阻害することが示唆された。更に、ＩＬ−１０は、ＬＰＳに活性化された単球においてＩＬ−１０ ｍＲＮＡ合成を強く阻害したので、その作用は自己調節的であった。更に、内因的に生じたＩＬ−１０は、ＬＰＳによる単球の活性化後のクラスＩＩ ＭＨＣ発現の減少の原因であることが分かった。総合すると、これらの結果により、ＩＬ−１０は、クラスＩＩ ＭＨＣ発現をダウンレギュレートし且つ単球による前炎症性サイトカインの生産を阻害するその能力ゆえに、免疫学的応答および炎症性応答に対して重要な調節作用を有するということが示される。
最近、ネズミ−インターロイキン１０（ＩＬ−１０）が同定され、その遺伝子はそのサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）活性に基づいてクローン化された。ネズミの系において、ＩＬ−１０はＣＤ４＋ Ｔｈ２サブセットによって生産されており、しかも、Ｔｈ１クローンによるサイトカイン生産、特に、ＩＦＮγを阻害する。ＩＬ−１０によるサイトカイン生産の阻害は、Ｂ細胞ではなくマクロファージを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いた場合にのみ観察された。そのＣＳＩＦ活性に加えて、ＩＬ−１０は多面的であり且つ胸腺細胞、細胞毒性Ｔ細胞、マスト細胞、Ｂ細胞およびマクロファージを含む種々の細胞種に対して作用することが分かった。
更に、ヒトＩＬ−１０はＣＳＩＦ活性を示す。ＰＨＡまたは抗ＣＤ３ ｍＡｂによって活性化したＰＢＭＣによるＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦの生産はＩＬ−１０によって強く阻害され、そしてこの阻害は転写段階で生じた。ヒトおよびネズミ双方のＩＬ−１０は、エプスタイン・バールウイルスゲノムの従来特性決定されていない読取り枠ＢＣＲＦ−１に対して広範囲の配列相同関係を有する。この読取り枠の発現は、マウスおよびヒトＴ細胞でのＣＳＩＦ活性を含む大部分の性質をヒトおよびネズミＩＬ−１０と共有するウイルスＩＬ−１０（ｖ−ＩＬ−１０）と称する活性タンパク質を生成させた。
ヒトＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０は、クラスＩＩ ＭＨＣ分子のダウンレギュレーションによってヒト単球の抗原提示能力を減少させることにより、抗原特異的増殖性Ｔ細胞応答を阻害することができる。ここで示された結果は、ヒト単球が、ＬＰＳによる活性化後に高濃度のＩＬ−１０を生産することができること、およびこの生産が他のモノカインの場合と比較して相対的に遅いということを示す。更に、ＩＬ−１０は、ＬＰＳ、ＩＦＮγまたはＬＰＳおよびＩＦＮγによって活性化された単球による前炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦα並びに造血系成長因子であるＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産を強く阻害することをここで報告する。内因的に生じたＩＬ−１０は、単球によるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産に対して自己調節的作用を有するのみならず、それ自体の生産および単球でのクラスＩＩ ＭＨＣ発現を自己調節的にダウンレギュレートする。これらの結果は、ＩＬ−１０が免疫学的応答および炎症性応答に対して重要な調節作用を有することを示す。
実施例Ｂ１
ＩＬ−１０はヒト単球によって生産される。
ヒト単球の単離および培養
ヒト末梢血液単球を正常ドナーの血液５００ｍｌから単離した。単核細胞を血液成分分離器での密度遠心分離によって単離した後、遠心水簸によってリンパ球および単球に分別した。単球調製試料は、非特異的エステラーゼ染色によって判定したところ＞９５％純度であり、生存しうる細胞を９８％を越えて含んでいた。単球は、１％のプールされた熱失活ヒトＡＢ＋血清を補足したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）含有イセル培地中で培養された。この培地は、リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）アメーバ様細胞溶解検定によって確認したところ、内毒素を含んでいなかった（内毒素＜０．２ｎｇ／ｍｌ）。単球は、これらの細胞の付着を防止するテフロンバッグ（ヤンセン（Ｊａｎｓｅｎ）ＭＮＬ、セント・ニクラース、ベルギー）中において細胞濃度４ｘ１０6個／ｍｌで培養された。指定した時間培養後に単球を集め、そして間接免疫蛍光法によってその細胞表面発現を分析するかまたはノーザン分析およびＰＣＲ分析によってそのリンホカイン遺伝子発現を分析した。更に、単球培養上澄みを、これらの細胞の活性化後のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産を決定するために集めた。培養後の細胞の生存率は、トリパンブルー排除によって決定したところ９５％を越えていた。
試薬
組換体ヒトＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０を大腸菌においてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として発現させ、精製し、そしてトロンビンで消化してＮ末端融合部分を除去し、活性ヒトおよびウイルスＩＬ−１０を得た。精製ヒトｒ−ＩＬ−４およびｒ−ＩＦＮγは、シェリング・プラウ・リサーチ（ブルームフイールド、ＮＪ）によって提供された。ＬＰＳ（大腸菌０１２７：Ｂ８）は、ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（デトロイト、ＭＩ）から得られた。中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂ １９Ｆ１は、ｖ−ＩＬ−１０に対して生じたものであり、ヒトおよびウイルスＩＬ−１０双方を効率よく中和した。
リンホカイン決定
単球によるＩＬ−１αおよびＴＮＦαの生産は、エンドジェン（ボストン、ＭＡ）から入手したリンホカイン特異的エリザによって測定された。これらのエリザの下方検出限界は、それぞれ５０ｐｇ／ｍｌおよび１０ｐｇ／ｍｌであった。ＩＬ−１βの生産は、シストロン（Ｃｉｓｔｒｏｎ）（パイン・ブルック、ＮＪ）から入手したリンホカイン特異的エリザによって決定された。このエリザの感度は２０ｐｇ／ｍｌであった。ＩＬ−６濃度は、ジェンザイム（ボストン、ＭＡ）から購入したリンホカイン特異的エリザによって決定された。この検定の感度は０．３１３ｎｇ／ｍｌであった。ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦ特異的エリザをＲ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ミネアポリス、ＭＮ）から入手し、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦの生産を定量するのに用いた。これらのエリザの感度は、それぞれ４．７ｐｇ／ｍｌおよび７．２ｐｇ／ｍｌであった。ＧＭ−ＣＳＦ生産は、リンホカイン特異的エリザによって決定された。このエリザの感度は５０ｐｇ／ｍｌであった。ＩＬ−１０生産は、抗ＩＬ−１０ ｍＡｂ（ＪＥＳ ９Ｄ７）を被覆抗体として、および別の抗ＩＬ−１０ ｍＡｂ（ＪＥＳ３−１２Ｇ８）をトレーサー抗体として用いる特異的エリザによって決定された。このエリザの感度は５０ｐｇ／ｍｌであった。
ＩＬ−１０は、活性ヒトＴ細胞クローン、活性末梢血液ＴおよびＢ細胞、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系および単球によって生産される。遠心水簸によって単離された、高度に精製されたヒト単球は、ＬＰＳによる活性化後にＩＬ−１０を生産した。更に、これらのヒト単球は、高濃度のＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦを生産しうることが分かった（図６）。ＬＰＳで活性化された単球によるサイトカイン生産の速度論は、ＬＰＳで活性化された単球によるＩＬ−１０生産が比較的遅いことを示した。それは７．５時間で採集された上澄み中において最初に検出されたが、最大生産は活性化の２０〜４８時間後に観察された。対照的に、ＴＮＦαおよびＩＬ−６は、活性化によって速やかに生産され、そしてそれぞれ活性化後３．５時間および７．５時間で最大生産濃度に達した（図６）。しかしながら、ＧＭ−ＣＳＦ生産は、更に、ＬＰＳによる活性化の７．５時間後に最初に検出されたが、この場合、最大生産濃度は２０時間で達せられた。用量応答実験により、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳによる単球の活性化は既に有意の濃度のＩＬ−１０生産を引起こすことが示されたが、最大ＩＬ−１０合成はＬＰＳ濃度１μｇ／ｍｌで観察された（図７）。
実施例Ｂ２
ＩＬ−１０はヒト単球によるサイトカイン生産を阻害する。
ＩＬ−１０は、活性ＰＢＭＣによるＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦ生産を阻害することが分かった。単球によるサイトカインの生産に対するＩＬ−１０の作用を決定するために、高度に精製された単球を、ＩＬ−１０の不存在下または存在下でＬＰＳにより２４時間活性化した。更に、単球を、ＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）または、ｖ−ＩＬ−１０に対して生じたものであるがヒトＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０双方を効率よく中和する中和性抗ＩＬ−１０ ｍＡｂ １９Ｆ１の存在下においてＬＰＳを用いて２４時間活性化した。サイトカイン生産は、活性化して２４時間後に採集されたこれらの培養物の上澄みにおいて、サイトカイン特異的エリザによって決定された。表Ｂ１に示したように、培地のみにおいて３７℃でインキュベートされた単球は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦを生産しなかった。これらの条件下では、有意の濃度のＩＬ−８のみが合成された。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）による単球の活性化は、高濃度のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦを生産した。興味深いことに、ＩＬ−１０は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産を様々な程度まで阻害した（表Ｂ１）。ＩＬ−１０の最も強い阻害作用は、８０〜１００％まで阻止されたＩＬ−１α、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産に対して観察された。ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の生産阻害はあまり顕著ではなかったし、ＩＬ−８の合成はＩＬ−１０によって僅かしか影響されなかった。
実施例Ｂ３
ＩＬ−１０は、更に、ＩＦＮγによって活性化された単球のサイトカイン生産を阻害する。
ＩＬ−１０は、更に、ＩＦＮγまたはＩＦＮγおよびＬＰＳの組合わせによって活性化された単球によるサイトカイン生産を阻害する。図８は、最適濃度１００Ｕ／ｍｌでのＩＦＮγが、概して、最適濃度１μｇ／ｍｌでのＬＰＳの場合よりもあまり強力でないサイトカイン分泌誘導物質であったことを示す。更に、単球によるサイトカイン生産に対するＩＦＮγおよびＬＰＳの組合わせの作用は、概して付加的であったことが実証される。ＩＬ−１０の最も強い阻害作用は、ＩＬ−１α、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦ生産に対して観察された。ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦ分泌は、最適ＬＰＳおよびＩＦＮγ濃度によって単球を活性化した後でさえも、９０％を越えて抑制された。ＩＬ−１βおよびＩＬ−６分泌に対するかなりの阻害作用が最適刺激条件で観察されたが、それらの阻害は、単球が準最適濃度のＬＰＳによって、最適濃度のＩＦＮγ不存在下または存在下で刺激された場合に一層顕著であった。
実施例Ｂ４
ウイルスＩＬ−１０は単球によるサイトカイン生産を阻害する。
ウイルスＩＬ−１０およびヒトＩＬ−１０は、ヒト細胞に対して同様に作用する。図９は、ＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０双方が、単球によるＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦ生産を同様に阻害したことを示す。濃度１００Ｕ／ｍｌで加えられたＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０は、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）による活性化後の単球によるＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦ生産に対して有意の阻害作用を有する。ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦ分泌に対するＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０のこれらの阻害作用は、インキュベーションをｍＡｂ １９Ｆ１の存在下で実施した場合に逆行し（図９）、ｖ−ＩＬ−１０の阻害作用の特異性が実証された。実際に、ＩＬ−１０またはｖ−ＩＬ−１０および中和性抗ＩＬ−１０ ｍＡｂの存在下でのＬＰＳによる単球の活性化は、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦの増大した生産さえも引起こし、内因的に生じたＩＬ−１０はこれらのサイトカインの生産を抑制することが示された。
単球によるサイトカイン生産に対する内因的に生じたＩＬ−１０の阻害作用は、中和性抗ＩＬ−１０ ｍＡｂの存在下においてＬＰＳで活性化された単球によって生産されたサイトカイン濃度を定量することによって更に評価された。表Ｂ１において、単球の、抗ＩＬ−１０を加えたＬＰＳ処理は、ＬＰＳ単独による活性化と比較して一層高濃度のサイトカイン生産を引起こしたことが示され、内因的に生じたＩＬ−１０は、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦ生産に対するその阻害作用に加えて、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦの生産を阻止することが示された。最も有意の阻害作用は、ＩＬ−１α、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαの生産に対して見出されたが、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦの発現に対する阻害作用はかなりではあるがあまり顕著ではなかった。総合すると、これらの結果は、内因性ＩＬ−１０および内因的に生じたＩＬ−１０双方が、ＬＰＳで活性化した単球によるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産を阻害することを示す。
実施例Ｂ５
ＩＬ−４は、活性化した単球によるＩＬ−１０生産を阻害する。
ＩＬ−４は、ＬＰＳで活性化した単球によるＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦαの生産を阻害する。ＩＬ−４がＩＬ−１０生産も阻害したかどうかを決定するために、単球をＬＰＳで２４時間活性化し、そしてＩＬ−１０分泌を測定した。表Ｂ１は、ＩＬ−４が、ＬＰＳで活性化した単球によるＩＬ−１０生産を強く阻害したことを示す。更に、ＩＬ−４は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦα分泌に対するその阻害作用に加えて、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの生産を効率よく阻止する。しかしながら、ＩＬ−１０に関して観察されたように、ＩＬ−８の生産はＩＬ−４によって僅かしか影響されなかった。集合的に、これらのデータは、ＩＬ−４およびＩＬ−１０が、活性化された単球によるサイトカイン生産に対して同等の阻害作用を有することを示す。
実施例Ｂ６
モノカイン生産の阻害は転写段階で起こる。
プローブ
下記のプローブをノーザン分析に関して用いた。すなわち、
ｐＣＤ−ｈＴＧＦβの６００ｂｐのＳｍａ Ｉフラグメント（ｎｔ１２９９〜１８９９）、ヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）ら（１９８７）、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ １３巻，ゲデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）およびウェブ（Ｗｅｂｂ）（監修）、アカデミック・プレス、ニューヨークを参照されたい；
ｐＡＬ（ｂ−アクチン）の１２００ｂｐのＰｓｔＩフラグメント、ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１７２〜１１７６を参照されたい；
ｐＣＤ−ｈＩＬ−６の５６７ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｘｂａ Ｉフラグメント（ｎｔ１〜５６７）、ヨコタら（１９８７）を参照されたい；
ＳＰ６４−３−１０ｃ（ＩＬ−８）の２６８ｂｐのＨｉｎｄ ＩＩＩフラグメント（ｎｔ２９〜２９７）、シュミド（Ｓｃｈｍｉｄ）ら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２５０〜 を参照されたい；
ｐＣＤ−ＳＲａ−ｈＩＬ−１０の７６０ｂｐのＢｇｌ ＩＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメント（ｎｔ１５９〜９１９）、ビエリア（Ｖｉｅｒｅａ）ら（１９９１）を参照されたい。下記のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ生成物のサザン分析に用いた。すなわち、
ＩＬ−１α：5′-CATGGGTGCTTATAAGTCATC-3′ （ｎｔ５００〜５２１）、マーチ（Ｍａｒｃｈ）ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６４１〜 を参照されたい；
ＩＬ−１β：5′-CGATCACTGAACTGCACGCTCCGGG-3′ （ｎｔ４４４〜４６９）、マーチら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅを参照されたい；
ＩＬ−６：5′-GAGGTATACCTAGAGTACCTC-3′ （ｎｔ５１０〜５３１）、ヒラノ（Ｈｉｒａｎｏ）ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：７３〜 を参照されたい；
ＩＬ−８：5′-TAAAGACATACTCCAAACCTT-3′ （ｎｔ２００〜２２１）、シュミドら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．を参照されたい；
ＩＬ−１０：5′-CAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGA-GTGAGTTTGACATC-3′ （ｎｔ４２９〜４９８）、ビエリアら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；
ＴＮＦα：5′-GGCGTGGAGCTGAGAGATAAC-3′ （ｎｔ５００〜５２１）、ペニカ（Ｐｅｎｎｉｃａ）ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７２４〜 を参照されたい；
ＧＭ−ＣＳＦ：5′-CCGGCGTCTCCTGAACCT-3′（ｎｔ１５０〜１６８）、リー（Ｌｅｅ）ら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ′ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４３６０〜４３６４を参照されたい；
アクチン：5′-CTGAACCCTAAGGCCAACCGTG-3′（ｎｔ２５０〜２７２）、アロンソ（Ａｌｏｎｓｏ）ら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．２３：１１〜 を参照されたい；および
Ｇ−ＣＳＦ：5′-GCCCTGG-AAGGGATCTCCCCC-3′（ｎｔ４００〜４２１）、ナガタ（Ｎａｇａｔａ）ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３１９：４１５〜 を参照されたい。更に、ヌクレオチド配列は、ジェンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）、ｃ／ｏ インテリジェネティクス・インコーポレーテッド（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、メンロー・パーク、ＣＡ並びにＢＣＣＧデータベースおよびウィスコンシン・バイオテクノロジー・センター大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ）、マディソン、ウィスコンシンから入手可能である。合成ヌクレオチド生合成は、本明細書中に参考として包含されている、ゲイト（Ｇａｉｔ）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬプレス、オクスフォードに記載されている。
ｍＲＮＡ単離およびノーザン分析
全ＲＮＡを、チオシアン酸グアニジニウム−ＣｓＣｌ法によって単球２０ｘ１０6個から単離した。ノーザン分析に関して、全ＲＮＡ１０μｇ／試料を、６．６％ホルムアルデヒド含有１％アガロースゲル上の寸法によって分離し、ナイトラン（Ｎｙｔｒａｎ）ナイロン膜（シュライヒャー・アンド・シューエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）、キーン、ＮＨ）に移し且つプローブとハイブリッド形成させ、高比活性（＞１０8ｃｐｍ／ｍｇ）に標識された。フィルターをハイブリッド形成し、緊縮条件下で洗浄し、そして展開させた。
ＰＣＲ分析
全ＲＮＡの１マイクログラムを、オリゴ（ｄＴ）１２−１８をプライマーとしておよびＡＭＶ逆転写酵素（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ｍａｎｎｈｅｉｍ））を反応２０μｌ中で用いて逆転写させた。逆転写物２マイクロリットル（全ＲＮＡ１００ｎｇに等しい）を各増幅反応に直接的に用いた。ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、反応５０μｌ中において、各プライマー２５ナノモル、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ（ファーマシア、ウプサラ、スウェーデン）をそれぞれ１２５μＭ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、ゼラチン１ｍｇ／ｍｌ、非アセチル化ＢＳＡ１００μｇ／ｍｌおよびヴェント（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー、ＭＡ）１単位。用いたプライマーは以下の通りであった。すなわち、
ＩＬ−１αセンスプライマー 5′-CATCGCCAATGACTCAGAGGAAG-3′ （ｎｔ３０２〜３２５）；
ＩＬ−１αアンチセンスプライマー 5′-TGCCAAGCACACCCAGTAGTCTTGCTT-3′ （ｎｔ７７０〜７４３）；
ＩＬ−１βセンスプライマー 5′-CCAGCTACGAATCTCGGACCACC-3′ （ｎｔ２３０〜２５３）；
ＩＬ−１βアンチセンスプライマー 5′-TTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAAGTCAGT-3′（ｎｔ８９６〜８６３）；
ＩＬ−６センスプライマー 5′-ATGAACTCCTTCTCCACAAGC-3′ （ｎｔ１〜２１）；
ＩＬ−６アンチセンスプライマー 5′-CTACATTTGCCGAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3′ （ｎｔ８１０〜７７７）；
ＩＬ−８センスプライマー 5′-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTG-3′ （ｎｔ１〜２１）；
ＩＬ−８アンチセンスプライマー 5′-TTATGAATTCTCAGCCCTCTTCAAAAA-CTTCTC-3′（ｎｔ３０２〜２６９）；
ＩＬ−１０センスプライマー 5′-ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA-3′ （ｎｔ３２３〜３４９）；
ＩＬ−１０アンチセンスプライマー 5′-TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA-3′ （ｎｔ６７４〜６４８）；
ＴＮＦαセンスプライマー 5′-AGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGAC-3′ （ｎｔ３１０〜３３３）；
ＴＮＦαアンチセンスプライマー 5′-TGAGTCGGTCACCCTTCTCCAG-3′（ｎｔ７８２〜７６０）；
ＧＭ−ＣＳＦセンスプライマー 5′-GCATCTCTGCACCCGCCC-GCTCGCC-3′（ｎｔ７６〜１００）；
ＧＭ−ＣＳＦアンチセンスプライマー 5′-CCTGCTTGTACAGCTCCAGGCGGGT-3′ （ｎｔ２７６〜２５０）；
Ｇ−ＣＳＦセンスプライマー 5′-GAGTGTGCCACCTACAAGCTGTGCC-3′ （ｎｔ２３３〜２５８）；
Ｇ−ＣＳＦアンチセンスプライマー 5′-CCTGGGTGGGCTGCAGGGCAGGGGC-3′ （ｎｔ５３３〜５０８）；
β−アクチンセンスプライマー 5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′（ｎｔ１〜２０）；
β−アクチンアンチセンスプライマー 5′-GTCCTTAA-TGTCACGCACGATTTC-3′ （ｎｔ５４８〜５３０）。
反応をパーキン・エルマー／シータスＤＮＡ熱サークラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）中において２０サイクル（９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間伸長）インキュベートした。反応物をＣＨＣｌ３で抽出し、４０μｌ／試料をＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲルに加えた。生成物を臭化エチジウム染色によって可視化した。次に、ゲルを０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ中で変性させ、１０Ｍ酢酸アンモニウム中で中和し、そしてナイトランナイロン膜に移した。膜は、６ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１０ｘデンハート溶液（０．２％フィコール、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％ＢＳＡ、ペンタクスフラクションＶ）および大腸菌ｔＲＮＡ（ベーリンガー、マンハイム、ＦＲＧ）２００μｇ／ｍｌ中において５５℃で４時間予備ハイブリッド形成された。増幅において用いたプライマーに対して内部の配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（２００ｎｇ）の５′末端に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）およびγ−32Ｐ−ＡＴＰ（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、アーリントン・ハイツ、ＩＬ）で標識した。プローブをニック（Ｎｉｃｋ）カラム（ファーマシア、ウプサラ、スウェーデン）に通すことにより、取込まれなかったヌクレオチドから分離し、そしてハイブリダイセーション配合物に加えた。５５℃で１２時間のハイブリダイセーション後、フィルターを０．１ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸Ｎａ ｐＨ＝７．０）および１％ＳＤＳ中において室温で洗浄し、そしてコダック（Ｋｏｄａｋ）ＸＡＲ−５フィルムに１〜２時間暴露した。
ＩＬ−１０が単球によるサイトカインの生産を阻害した濃度を決定するために、比較ＰＣＲ分析を、ＩＬ−１０、ＩＬ−４または中和性抗ＩＬ−１０ ｍＡｂの不存在下または存在下においてＬＰＳで２４時間活性化された単球から単離したＲＮＡで実施した。この実験のサイトカイン測定値を表Ｂ１に示す。これらの試料から単離したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後、サイトカイン特異的プライマーを用いて増幅させた。比較的少数のサイクルを増幅に用いて、増幅したＤＮＡ量がサイクル数に比例し且つ元の試料中の特異的ｍＲＮＡ量と相関することを確証した。図１０は、これらの条件下において等量のβ−アクチン特異的ｃＤＮＡが増幅したことを示す。培地のみにおいて４℃で２４時間インキュベートした単球は、極めて低濃度のＩＬ−８ ｍＲＮＡを発現した。これらの細胞の３７℃でのインキュベーションはＩＬ−８ ｍＲＮＡの発現を増大させたが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ ｍＲＮＡの発現を引起こさなかった。ＬＰＳ活性化はＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＧ−ＣＳＦ ｍＲＮＡの強い発現を引起こしたが、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦ ｍＲＮＡは適度に誘導された。更に、図１０は、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ発現が、ＩＬ−１０およびＩＬ−４によってｍＲＮＡ段階で強く阻害され、ＩＬ−１βおよびＩＬ−８発現はＩＬ−１０によって僅かしか影響されなかったことを示す。抗ＩＬ−１０ ｍＡｂの存在下でのＬＰＳによる単球の活性化は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦ ｍＲＮＡの発現を適度に増加させ且つＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦ ｍＲＮＡ合成を強く増大させた。サイトカイン特異的ｍＲＮＡの発現濃度およびそれらの内因性および外因性ＩＬ−１０またはＩＬ−４によるモジュレーションは、表Ｂ１に示される対応するタンパク質の分泌と十分に相関しており、ＩＬ−１０およびＩＬ−４が、ＬＰＳで活性化された単球によるサイトカイン発現を転写段階で阻害したことを示す。
実施例Ｂ７
ＩＬ−１０は、活性化された単球においてＩＬ−１０ ｍＲＮＡを調節するが、ＴＧＦβ ｍＲＮＡ発現を調節しない。
ヒト単球が、ＬＰＳによる活性化後に比較的遅くＩＬ−１０を生産したことを実証して、ＩＬ−１０が内因性ＩＬ−１０ ｍＲＮＡ合成に影響を与えうるかどうかを決定した。ヒト単球を、ＩＬ−１０の存在下または不存在下においてＬＰＳで７時間活性化し、そしてｍＲＮＡ発現をノーザンブロッティングによって分析した。図１１は、ＩＬ−１０ ｍＲＮＡがＬＰＳによる活性化の７時間後に検出されたことおよびＩＬ−１０はＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現に対してこの時点では阻害作用しないかまたは最小の阻害作用のみを有したことを示す。対照的に、ＩＬ−６およびＩＬ−８ ｍＲＮＡの発現はＩＬ−１０によって強く阻害された。しかしながら、単球をＬＰＳによって２４時間活性化させた別の実験系において、ＩＬ−１０は、図１２のノーザン分析によって示されたように、ＩＬ−１０ ｍＲＮＡの発現を強く減少させた。更に、図１２は、中和性抗ｖ−ＩＬ−１０ ｍＡｂの存在下でのＬＰＳによる単球の活性化が、ＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現のアップレギュレーションを２４時間で生じたことを示す。これらの結果は、この後者の実験において用いたＲＮＡを、図１０で示したＰＣＲ分析にも用いたので、ＩＬ−１０特異的プライマーを用いるＰＣＲ分析によって確証された。図１２Ｂにおいて、ノーザン分析によりＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現で観察された定量的相違は、比較ＰＣＲ分析によって観察されたものと相関したことが分かる。更に、より感受性のＰＣＲ分析により、培地のみにおいて３７℃で単球を培養して２４時間後に誘導された低濃度ＩＬ−１０ ｍＲＮＡの検出が可能になった。これらの結果は、ＩＬ−１０がＩＬ−１０ ｍＲＮＡ合成に対しておよび、ｍＲＮＡ濃度がＩＬ−１０タンパク質生産に正確に反映する場合はおそらくヒト単球によるＩＬ−１０生産に対しても自己調節作用を有することを示す。しかしながら、ＩＬ−１０生産のダウンレギュレーションは、活性化過程においてかなり遅れて生じた。ＴＧＦβ ｍＲＮＡは、新たに単離された活性化されていない単球において構成的に発現されたものであり、７〜２４時間のＬＰＳ活性化によって増大しなかった（図１１および図１２）。更に、図１１および図１２は、ＴＧＦβ ｍＲＮＡの濃度が、ＩＬ−４、ＩＬ−１０または中和性抗ＩＬ−１０ ｍＡｂの存在下で活性化を実施した場合に影響を受けなかったことを示す。
実施例Ｂ８
ＩＬ−１０は、単球によるクラスＩＩ ＭＨＣ発現に対して自己調節作用を有する。
免疫蛍光法分析
細胞（１０５個）を、Ｖ字型底微量滴定プレート（フロー・ラボラトリーズ、マクリーン、ＶＡ）中において精製ｍＡｂ（１ｍｇ／ｍｌ）１０μｌと一緒に４℃で３０分間インキュベートした。０．０２ｍＭアジ化ナトリウムおよび１％ＢＳＡ（シグマ、セント・ルイス、ＭＯ）含有ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、ヤギ抗マウス抗体（ＴＡＧＯインコーポレーテッド、バーリンゲーム、ＣＡ）のＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ′）２フラグメントの１／４０希釈液と一緒に４℃で３０分間インキュベートした。更に３回洗浄後、標識された細胞試料をファクスカン（ＦＡＣＳｃａｎ）（ベクトン・ディキンソン、サニーベール、ＣＡ）でのフローミクロフルオメトリーによって分析した。抗ＭＨＣクラスＩＩ ｍＡｂ ＰｄＶ５．２（ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ／ＤＱ）、Ｑ５／１３ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰおよびＬ２４３（ＨＬＡ−ＤＲ）は前に記載されており、コーニング（Ｋｏｎｉｎｇ）ら（１９８４）Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２２１〜 ；クォランタ（Ｑｕａｒａｎｔａ）ら（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：１４２１〜１４２５；およびランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：２９３〜 を参照されたい。
ＩＬ−１０は、ヒト単球の細胞表面上でのクラスＩＩ ＭＨＣ分子の発現をダウンレギュレートする。ＩＬ−１０は、構成的ＩＬ−４またはＩＦＮγに誘導されたＭＨＣクラスＩＩ発現をダウンレギュレートすることが分かった。単球はＬＰＳによる活性化後に高濃度のＩＬ−１０を生産するので、内因性ＩＬ−１０が、ＬＰＳで活性化された単球によるクラスＩＩ ＭＨＣ発現を阻害しうるかどうかを研究した。単球を、中和性抗ＩＬ−１０ ｍＡｂの存在下または不存在下において種々の濃度のＬＰＳで活性化させた。図１３は、ＬＰＳによる単球の活性化が、これらの細胞での構成的ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ発現を用量依存形式で減少させたことを示す。しかしながら、中和性抗ＩＬ−１０ ｍＡｂ １９Ｆ１の存在下において、ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ発現の強い誘導が観察された。同一の結果がいくつかのＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ特異的ｍＡｂによって観察された。これらの結果により、内因的に生じたＩＬ−１０は、自己調節的に、ＬＰＳ活性化後のヒト単球でのクラスＩＩ ＭＨＣ発現のダウンレギュレーションの原因となることが示される。
実験Ｃ
ＩＬ−１０は、活性化されたマクロファージによるサイトカイン生産を阻害する。 この項で示したデータは、本明細書中に参考として完全に包含される、フィオレンチノら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４７：３８１５〜３８２２において、その優先日後に公開された。
概要
ＩＬ−１０は、Ｂ細胞抗原提示細胞（ＡＰＣ）以外のマクロファージの、Ｔｈ１ Ｔ細胞クローンによるサイトカイン合成を刺激する能力を阻害する。マクロファージ細胞系および正常な腹膜マクロファージ双方に対するＩＬ−１０の直接作用を研究した。ＬＰＳ（またはＬＰＳおよびＩＦＮγ）で誘導されたＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαタンパク質の生産は、２種類のマクロファージ細胞系においてＩＬ−１０によって有意に阻害された。更に、ＩＬ−１０は、同様の濃度で加えられた場合のＩＬ−４よりも強力なモノカイン合成阻害剤であると考えられる。更に、ＬＰＳまたはＬＰＳおよびＩＦＮγで誘導されたＩＬ−１α、ＩＬ−６またはＴＮＦα ｍＲＮＡの発現は、半定量的ＰＣＲまたはノーザンブロット分析によって示されたように、ＩＬ−１０によって阻害された。ＬＰＳで誘導されたＩＬ−６分泌のＩＬ−１０による阻害は、ＦＡＣＳ精製腹膜マクロファージにおいて、マクロファージ細胞系の場合よりもあまり顕著ではなかった。しかしながら、腹膜マクロファージによるＩＬ−６生産は、抗ＩＬ−１０抗体の添加によって増加し、ＬＰＳ活性化後のモノカイン合成の内因的減少を引起こす内因性ＩＬ−１０がこれらの培養物中に存在することを意味した。更に、ＬＰＳに刺激された腹膜マクロファージは、エリザによって検出可能なＩＬ−１０を直接的に生産することが分かった。ＩＦＮγは、ＬＰＳに刺激された腹膜マクロファージによるＩＬ−６生産を増加させることが見出され、そしてこれはこの同一細胞集団によるＩＬ−１０生産のその抑制の結果であると考えられる。モノカイン合成に対するその作用に加えて、ＩＬ−１０は、更に、ＩＦＮγに刺激された腹膜マクロファージにおける有意の形態変化を引起こす。マクロファージに対する、特に、モノカイン生産段階でのＩＬ−１０の強力な作用は、Ｔ細胞応答の調節においてのみならず急性炎症性応答においても、このサイトカインに関する重要な役割を示している。
ＩＬ−１０は、Ｔｈ１ Ｔヘルパー細胞によるマクロファージＡＰＣ依存サイトカイン合成を阻害し、種々の他の細胞に対して多面的作用を示し、そして他の細胞によって生産されるＴｈ２ Ｔヘルパー細胞クローンによって生産されたサイトカインとして最初に記載された。Ｔｈ１細胞はＩＬ−２およびＩＦＮγを分泌し且つマクロファージ活性化および遅延型過敏症（ＤＴＨ）を優先的に引起こし、Ｔｈ２細胞はＩＬ−４およびＩＬ−５を生産し且つＢ細胞応答を助ける。いったん活性化すると、それぞれの種類のＴｈ細胞は、他方の増殖および／または機能を調節することができる。このような交差調節は種々のサイトカインによって媒介され、そしてある種の抗体およびＤＴＨ応答が相互に排他的でありうるという観察報告に対する説明を与える。ＩＬ−１０は、Ｂ細胞以外のマクロファージに作用して、Ｔｈ１クローンによるサイトカイン合成を阻害し、しかもＩＬ−１０はマクロファージに対して直接作用を及ぼす。
マクロファージ生産物、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαは、感染または組織損傷の際に引出された多数の炎症性応答および免疫学的応答に関係していた。ＴＮＦαおよびＩＬ−１は、様々な細胞種において多数の代謝変化を更に引起こす内因性発熱物質である。更に、ＩＬ−１およびＩＬ−６は、肝急性期タンパク質の合成の主要な誘導物質である。以下の実施例は、ＩＬ−１０が、ＬＰＳで活性化されたマクロファージによるＩＬ−１、ＴＮＦαおよびＩＬ−６などのサイトカインの生産を阻害することを示す。したがって、ＩＬ−１０は、Ｔ細胞活性化におけるその役割に加えて、マクロファージ機能を調節することによって炎症性応答においても重要な役割果たしている。
実施例Ｃ１
ＩＬ−１０は、種々のマクロファージ系のＡＰＣ機能を阻害する。
サイトカイン
精製した組換体ｍＩＬ−１αは、Ｐ．ロメディコ（Ｌｏｍｅｄｉｃｏ）、ホフマン・ラ・ロッシュ（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）、ナットリー、ＮＪから惜しみなく贈与された。組換体ｍＩＬ−２およびｍＩＦＮγは、シェリング・リサーチ、ブルームフィールド、ＮＪから入手した。Ｍ．ピアス（Ｐｅａｒｃｅ）、ＤＮＡＸにより快く提供された組換体精製マウスＩＬ−６をＣｏｓ７細胞において発現させ且つイムノアフィニティー精製した。マウスＴＮＦαはジェンザイム・コーポレーション（ボストン、ＭＡ）から入手した。前記に記載のＦ１１５ｃＤＮＡクローンおよび模擬トランスフェクトした細胞からの対照上澄みを用いてＣＯＳ７細胞をトランスフェクトすることによって得られた組換体マウスＩＬ−１０（ＣＳＩＦ）を、特に断らない限り最終濃度２％で用いた。或いは、ウォーレン・ダング（Ｗａｒｒｅｎ Ｄａｎｇ）により快く提供された組換体マウスＩＬ−１０を大腸菌において発現させ、そしてＳＸＣ２抗ＩＬ−１０抗体を用いてアフィニティー精製した。
抗体
ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）に対する中和性単クローン性抗体（ｍＡｂ）およびＩＬ−１０（ＳＸＣ１）を用いた。チェルヴィンスキー（Ｃｈｅｒｗｉｎｓｋｉ）ら（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐｔ′ｌ Ｍｅｄ．１６６：１２２９〜１２４４；およびモスマン（Ｍｏｓｍａｎｎ）ら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：２９３８〜２９４５を参照されたい。ＳＸＣ−１に関するイソタイプ適合対照であるＪ５は、ロバート・コフマン（Ｒｏｂｅｒｔ Ｃｏｆｆｍａｎ）（ＤＮＡＸ）により快く提供された。ＩＬ−６に対する単クローン性抗体（２０Ｆ３および３２Ｃ１１）（スターンズ（Ｓｔａｒｎｅｓ）ら（１９９０）Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：４１８５〜４１９１を参照されたい）およびＴＮＦαに対する単クローン性抗体（ＭＰ６．ＸＴ３．１１およびＸＴ２２．１１）は、ジョーン・エイブラムズ（Ｊｏｈｎ Ａｂｒａｍｓ）（ＤＮＡＸ）によって精製され且つ豊富に提供された。ＦＡＣＳ選別用に用いた抗体としてはラット抗マウスＢ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）（コフマンら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２８９：６８１〜６８３を参照されたい）およびラット抗マウスＭａｃ−１（Ｍ１／７０）（スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）ら（１９７８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：５３９〜５４２を参照されたい）があった。Ｆｃ−ｇＲに対するラット抗マウス単クローン性抗体は２．４Ｇ２であった。アンケレス（Ｕｎｋｅｌｅｓｓ）（１９７９）Ｊ．Ｅｘｐｔ′ｌ Ｍｅｄ．１５０：５８０〜５９６を参照されたい。
培地
検定用培地（ｃＲＰＭＩ）は、１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｊ．Ｒ．サイエンティフック・インコーポレーテッド（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．））含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｊ．Ｒ．サイエンティフック・インコーポレーテッド、ウッドランド、ＣＡ）、０．０５ｍＭ ２−ＭＥ（シグマ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス、ＭＯ）および１０ｍＭヘペス緩衝液（ギブコ・ラボラトリーズ（Ｇｉｂｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、グランド・アイランド、ＮＹ）から成った。Ｔ細胞増殖用に、組換体ｍＩＬ−２（３３０Ｕ／ｍｌ）をｃＲＰＭＯＩに対して加えた。
抗原
パシフィック・バイオ・マリン・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏ−Ｍａｒｉｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（ベニス、ＣＡ）またはカルビオケム・ラブズ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｌａｂｓ）（ラ・ホヤ、ＣＡ）から入手したスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）を最終濃度１００〜５００μｇ／ｍｌで用い且つシグマからのオボアルブミンを最終濃度１ｍｇ／ｍｌで用いた。
細胞系
Ｔｈ１クローンＨＤＫ１（Ｉ−Ａd／ＫＬＨに特異的）（チェルヴィンスキーら（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐｔ′ｌ Ｍｅｄ．を参照されたい）およびＴ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０（Ｉ−Ａd／オボアルブミンに特異的）（カプラー（Ｋａｐｐｌｅｒ）ら（１９８１）Ｊ．Ｅｘｐｔ′ｌ Ｍｅｄ．１５３：１１９８〜 を参照されたい）をサイトカイン合成（ＣＳＩＦ）阻害検定に用いた。Ｃ．ジェンウェイ（Ｊａｎｅｗａｙ）（エール大学、ニューヘブン、ＣＴ）から入手したＴｈ２クローンＤ１０．Ｇ４．１（Ｄ１０）、ＡＫＲ／Ｊ抗コンアルブミン（ケイ（Ｋａｙｅ）ら（１９８３）Ｊ．Ｅｘｐｔ′ｌ Ｍｅｄ．１５３：８３６〜８５６を参照されたい）をＩＬ−１検定に用いた。スダ（Ｓｕｄａ）ら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２０：１７３〜１７８を参照されたい。全クローンを、抗原（Ａｇ）および照射されたＡＰＣを用いる周期的刺激によって維持した後、ＩＬ−２含有培地において増殖させた。チェルヴィンスキーら（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐｔ′ｌ Ｍｅｄ．を参照されたい。クローン化ＩＧ．１８．ＬＡマクロファージ細胞系（Ｈ−２ｄ）は胸腺支質細胞培養物由来であって、２０％Ｌ細胞上澄み中で維持された。ＰＵ５．１マクロファージ細胞系（Ｈ−２ｄ）（ラルフ（Ｒａｌｐｈ）ら（１９７７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１９：９５０〜９５４を参照されたい）を、１０％ＦＣＳ含有ｃＲＰＭＩ中で維持した。ＡＰＣとして用いるのに、細胞系１Ｇ．１８．ＬＡおよびＰＵ５．１をＩＦＮγ（０．５〜２ｎｇ／ｍｌ）と一緒に２０〜２４時間活性化させた。ＴＮＦαおよびＴＮＦβに対して応答性であるＷＥＨＩ．１６４．１３細胞系（エスペビク（Ｅｓｐｅｖｉｋ）ら（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５〜６３を参照されたい）をｃＲＰＭＩ／５％ＦＣＳ中で維持した。
サイトカインの免疫定量検定
サイトカイン濃度（ＩＬ−６、ＩＦＮγおよびＣＳＩＦ／ＩＬ−１０）を、二層サンドウィッチエリザ形式で測定した。
生物検定
比色定量ＭＴＴ増殖検定を、ＴＮＦα（ＷＥＨＩ １６４．１３細胞）、ＩＬ−２（ＨＴ−２細胞）およびＩＬ−１（Ｄ１０細胞）（全検定に細胞１０４個／ウェル）の生物検定に用いた。活性は、既知の標準に相対する単位／ｍｌかまたはｐｇ若しくはｎｇ／ｍｌとして表わされる。それぞれの場合において、単位／ｍｌは、その生物検定の最大応答の５０％を生じる具体的なサイトカインの量を表わす。
Ｔｈ１サイトカイン合成の誘導および測定
Ｔｈ１、ＨＤＫ．１細胞またはＤＯ−１１．１０ Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞１〜５ｘ１０4個を、９６ウェル平底微量滴定トレー中の全容量２００μｌ／ウェル中において抗原存在下または不存在下で種々の数の生存ＡＰＣと混合した。サイトカイン濃度を２０時間または４８時間の上澄み中において測定した。
マクロファージ細胞系の刺激
マクロファージ細胞系１Ｇ．１８．ＬＡおよびＰＵ５．１を静かに掻取ることによって採集し、洗浄し、そして９．５ｃｍ組織培養皿（ベクトン・ディキンソン、ＮＪ）中のｃＲＰＭＩ／５％ＦＣＳ中に細胞１０6個／ｍｌで，５％ＣＯ2／９５％空気中において３７℃でＲＮＡ発現用に６時間または上澄み中のサイトカイン検出用に２４時間再懸濁させた。ＬＰＳによる刺激は、ＩＬ−１０（２００単位／ｍｌ）またはＩＬ−４（２００単位／ｍｌ）の存在下または不存在下において１０μｇ／ｍｌ、または若干の場合、ＬＰＳおよびＩＦＮγを１００単位／ｍｌであった。上澄みを集め、遠心分離し（８００ｘｇ）、そして−８０℃で貯蔵した後、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαの濃度を検定するのに用いた。更に、マクロファージ細胞系をＩＦＮγで上記のように２４時間刺激し、若干の場合は更に、Ｔｈ１クローン、ＨＤＫ．１およびその特異的抗原ＫＬＨの存在下において２４時間刺激した。この場合、上澄みを、１０，０００ＭＷカットオフの膜を有するアミコン（ＡＭＩＣＯＮ）フィルターを用いて更に濃縮し、そしてイムノアフィニティーカラムを用いてＩＬ−２およびＩＦＮγを除去した。次に、これらの上澄みおよび濃縮工程からのフロースルーの、抗原特異的およびＡＰＣ依存性Ｔｈ１サイトカイン合成を同時刺激する能力を検査した。更に、ＡＰＣとして用いるために、マクロファージ細胞系１Ｇ１８．ＬＡおよびＰＵ５．１を最初にＩＦＮγ（０．５〜２ｎｇ／ｍｌ）で２０〜２４時間活性化した。
ＩＬ−１０は、正常な腹膜若しくは脾臓マクロファージまたはマクロファージ細胞系１Ｇ１８．ＬＡをＡＰＣとして用いた場合、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮγ生産を刺激するＡＰＣの能力を阻害する。ＩＬ−１０は、１Ｇ１８．ＬＡとは由来が異なるＰＵ５．１マクロファージ系に対しても有効であるが（図１４）、Ｔｈ１細胞に関してＡＰＣとしてＰＵ５．１細胞系を用いて達成された刺激は、１Ｇ１８．ＬＡマクロファージ細胞系で観察されたほど大きくはなかった。図１４Ｂは、１Ｇ１８．ＬＡ細胞系が、Ｔｈ１クローンおよびオボアルブミン特異的Ｔ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０双方によるＩＬ−２生産の抗原特異的誘導を媒介することもできるということを示す。双方の刺激はＩＬ−１０によって有意に阻害された。
実施例Ｃ２
ＩＬ−１０はＩＦＮγに刺激された腹膜マクロファージにおける形態学的変化を誘導する。
腹膜マクロファージの精製および刺激
腹膜細胞は、冷ｃＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ７ｍｌを注射し且つ抜取ることによって得られ、マクロファージをＭａｃ−１およびＢ２２０基準（マクロファージはＭａｃ−１+鮮明；Ｂ２２０−）で選別した。細胞を、ＩＬ−１０、抗ＩＬ−１０単クローン性抗体またはＩＦＮγの存在下または不存在下においてＬＰＳ１０μｇ／ｍｌで刺激した。細胞８ｘ１０5個／ｍｌで、５％ＣＯ2の給湿雰囲気中において３７℃で２０時間のインキュベーション後に上澄みを集めた。上澄みのＴＮＦαおよびＩＬ−６を、エンザイムリンクドイムノアッセイを用いて検定した。
ＦＡＣＳ精製腹膜マクロファージを、ＩＬ−１０の存在下または不存在下においてＩＦＮγと一緒に種々の時間インキュベートした。次に、上澄みを除去し、細胞を自然乾燥させ、固定し、そしてライト・ギムザで染色した。図１５に示したように、ＩＬ−１０は細胞の成熟および脱付着性を引起こし、それはマクロファージＡＰＣ機能の阻害に関して重要でありうる。
実施例Ｃ３
ＩＬ−１０は、活性化されたマクロファージ細胞系による生物学的に活性のまたは分泌されたサイトカインの生産をダウンレギュレートする。
初期の知見は、ＩＬ−１０が、ＡＰＣとして機能し且つＴｈ１サイトカイン合成を活性化するマクロファージの能力に対して直接的に作用することを示唆している。これらのマクロファージ細胞系によるモノカイン生産に対するＩＬ−１０の直接作用を検査した。ＩＬ−１０の存在下または不存在下においてＩＦＮγ、ＬＰＳまたはＩＦＮγおよびＬＰＳで刺激されたマクロファージ細胞系から集められた上澄みの、１種類または複数のサイトカインの濃度を検査した。可能な場合、ＩＬ−４を対照として用いたが、それはこの因子が活性マクロファージによるサイトカイン生産を阻害することが分かっていたからである。ＩＦＮγ単独によるマクロファージ細胞系の刺激は、上澄み中のモノカイン、ＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＮＦαの検出可能な濃度をもたらさなかった。対照的に、ＬＰＳまたはＬＰＳおよびＩＦＮγは、有意の濃度のこれらのサイトカインをもたらした（図１６）。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）不存在下で実施した、ＩＬ−１を検出するのに用いられるＤ１０．Ｇ４．１検定では、マクロファージによって発現される他のサイトカインは検出されない。マクロファージ細胞系１Ｇ．１８．ＬＡおよびＰＵ５．１は、ＬＰＳによる誘導後にＩＬ−１生物活性を生じるそれらの能力が双方とも有意に阻害された（図１６）。更に、ＩＬ−１０は、ＷＥＨＩ．１６４．１３．生物検定において実証されたように（これらのマクロファージ上澄み中の活性は全て、特異的阻止抗体を用いるＴＮＦαに起因することが分かった）、双方のマクロファージ細胞系の上澄み中においてＬＰＳまたはＩＦＮγおよびＬＰＳに誘導されたＴＮＦαの生産に対して極めて有意の阻害作用を有する。同様に、ＩＬ−１０は、ＩＬ−６に関するエンザイムリンクドイムノアッセイにおいて測定されたように誘導されるＬＰＳを加えたＩＦＮγおよび／またはＬＰＳによって刺激されたマクロファージ細胞系によるＩＬ−６タンパク質の生産を阻害する。全実験において、検査されたＩＬ−１０は、ＬＰＳまたはＩＦＮγおよびＬＰＳに誘導されたモノカイン生産に対して（タンパク質濃度で）ＩＬ−４よりもはるかに有意の阻害作用を有した。
実施例Ｃ４
ＩＬ−１０は、活性化されたマクロファージによるサイトカインｍＲＮＡ発現をダウンレギュレートする。
ＲＮＡ発現およびＲＮＡの分析
全細胞ＲＮＡを、イソチオシアン酸グアニジニウム法を用いてマクロファージ細胞系から抽出した。ＲＮＡ濃度を２６０ｎｍでの吸収によって測定した。ＲＮＡブロット分析は、ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１２３０〜１２３４に記載されたように、または逆転写されたＲＮＡのＰＣＲであった。オーガラ（Ｏ′Ｇａｒｒａ）ら（１９９０）Ｉｎｔｎ′ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：８２１〜８３２を参照されたい。具体的な量の各ｃＤＮＡ試料（２０分の１の希釈度のｃＤＮＡ）をサーマラーゼ（サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ）（ＩＢＩ）２．５単位およびシータス／パーキン・エルマーサーモサイクラーを用いて以下、すなわち、９４℃で３０秒間の融解；５５℃で３０秒間のアニーリング；および７２℃で１分間の伸長の条件下において、以下に示したようなＨＰＲＴ（ハウスキーピング酵素）、ＴＮＦαおよびＩＬ−６に特異的なプライマーを用いて増幅させた。すなわち、ＨＰＲＴセンス：5′-GTA ATG ATC AGT CAA CGG GGG AC-3′（ｎｔ４２２〜４４４）；ＨＰＲＴアンチセンス：5′-CCA GCA AGC TTG CAA CTT TAA CCA-3′ （ｎｔ５９８〜５７５）；ＨＰＲＴプローブ：5′-GCT TTC CCT GGT TAA GCA GTA CAG CCC C-3′ （ｎｔ５４３〜５７０）；ＴＮＦαセンス：5′-GCG ACG TGG AAC TGG CAG AAG-3′ （ｎｔ４４９９〜４５１９）；ＴＮＦαアンチセンス：5′-GGT ACA ACC CAT CGG CTG GCA-3′ （ｎｔ５８６５〜５８４５）；ＴＮＦαプローブ：5′-CAG TTC TAT GGC CCA GAC CCT C-3′ （ｎｔ５８０１〜５８２１）；ＩＬ−６センス：5′-CCA GTT GCC TTC TTG GGA CTG-3′ （ｎｔ１５２０〜１５４０）；ＩＬ−６アンチセンス：5′-GGT AGC TAT GGT ACT CCA-3′ （ｎｔ６０９３〜６０７５）；ＩＬ−６プローブ：5′-GTG ACA ACC ACG GCC TTC CCT ACT-3′ （ｎｔ１５４７〜１５７０）。
プライマーはいずれも、遺伝子中の介在配列を伸長させた。感受性および特異性は、増幅した生成物のドットブロットを、増幅した生成物に対して内在する放射性標識（32−Ｐ、γ−ＡＴＰ）オリゴヌクレオチドでプローブすることによって更に増大した。放射能ブロットを、アンビス・イメージ・スキャナー（Ａｍｂｉｓ Ｉｍａｇｅ Ｓｃａｎｎｅｒ）を用いて定量し、そしてＸ線フィルムに暴露することによって可視化した。それぞれの場合において、Ｐ３８８Ｄ１ ＲＮＡの標準曲線は、検定の再現性を確実にするように包含され、そして最終ドットブロットにおける導入ＲＮＡのｐｇに相対する任意の単位をそれから得た。更に、ハウスキーピング酵素ＨＰＲＴの内部標準を用いて、正確に同量のＲＮＡを用いることおよび全試料を逆転写し且つＰＣＲによって同じ効率で増幅させることを確実にした。
ＲＮＡは、マクロファージ細胞系１Ｇ１８．ＬＡおよびＰＵ５．１から、ＩＬ−１０またはＩＬ−４の存在下または不存在下でのＬＰＳまたはＬＰＳおよびＩＦＮγによる刺激後に抽出された。全ＲＮＡ１０μｇのＲＮＡブロット分析は、ＩＬ−１０が、双方の細胞系において、後者の場合ある程度少ないが、ＬＰＳまたはＩＦＮγおよびＬＰＳによって誘導されたＴＮＦα ＲＮＡの発現をダウンレギュレートしたことを示した（図１７）。これは、双方の細胞系からの逆転写ＲＮＡを分析するのに半定量的ＰＣＲ法を用いることを確立した。表Ｃ１に記載の各サイトカインの標準曲線を含むことにより、各ドットに示された全標準ＲＮＡのｐｇに相対する任意の単位を得て、それによって数字によるデータを示すことが可能であった。表Ｃ１は、ＩＬ−１０およびＩＬ−４が、マクロファージ細胞系１Ｇ１８．ＬＡにおけるＬＰＳで並びにＩＦＮγおよびＬＰＳで誘導したＴＮＦαの発現を阻害することを示す。これは、標準曲線の直線部分から得られた値によって最もよく図示され、そして表Ｃ１の説明文は、数的データを誘導するのに用いられた方法を説明する。同様の方法を用いる、ＬＰＳ並びにＩＦＮγおよびＬＰＳに応答したマクロファージ細胞系ＰＵ５．１によるＲＮＡ発現の分析は、更に、ＩＬ−６およびＴＮＦαの発現もＩＬ−１０によって阻害されたことを示した（表Ｃ２）。
実施例Ｃ５
ＩＬ−１０は、ＬＰＳに活性化された腹膜マクロファージによるＩＬ−６タンパク質の生産をダウンレギュレートする。
Ｔｈ１細胞に対するＡＰＣ機能に関してＩＬ−１０によって阻害されることが既に分かっている腹膜マクロファージ（Ｍａｃ−１およびＢ２２０基準で選別された）（Ｍａｃ−１+(鮮明)；Ｂ２２０-）を、ＬＰＳに応答したＴＮＦαおよびＩＬ−６の生産に関して更に検査した。ＴＮＦαは、ＬＰＳに刺激されたＦＡＣＳ選別マクロファージの上澄み（細胞密度、細胞７ｘ１０5個／ｍｌ）中において検出することができなかった。対照的に、有意の濃度のＩＬ−６が、上記のようにＬＰＳに刺激されたマウスＢＡＬＢ／ｃまたはＣＢＡ／Ｊからの腹膜マクロファージから得られた上澄み中において検出可能であった（図１８）。細胞をＩＬ−１０の存在下においてＬＰＳによって刺激した場合、ＩＬ−６濃度は減少したが、意外にも、その阻害の程度は、マクロファージ細胞系（図１６）で観察されたよりもあまり顕著ではなかった（図１８）。しかしながら、ＬＰＳによって誘導されたＩＬ−６生産濃度は、ＬＰＳ刺激においてＩＬ−１０に対して向けられた単クローン性抗体を包含することによって増加させることができた（図１８）。マクロファージがＬＰＳに応答してＩＬ−１０を生産したことは、ＩＬ−１０に特異的なエリザで確証された（上記のようにＬＰＳに刺激されたＣＢＡ／ＪまたはＢＡＬＢ／ｃ腹膜マクロファージは、ＩＬ−１０をそれぞれ２単位／ｍｌまたは４．５単位／ｍｌ生産した）。
図１８は、更に、精製されたＢＡＬＢ／ｃ腹膜マクロファージが、ＬＰＳ単独で刺激された場合に対立するものとしてＩＦＮγの存在下でＬＰＳに刺激された場合に高濃度のＩＬ−６を生産することを示す。これは、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの腹膜マクロファージによるＩＬ−１０生産についての更に別の実験の結果によって説明することができる。この場合、ＬＰＳに刺激されたマクロファージはＩＬ−１０を１２単位／ｍｌ生産し、そしてこれは、細胞をＩＦＮγの存在下でＬＰＳによって刺激した場合、３単位／ｍｌ未満まで減少した。
実施例Ｃ６
マクロファージＡＰＣ機能のＩＬ−１０阻害に関する可溶性同時刺激剤の機序試験
ＩＬ−１０は、生存抗原提示細胞（ＡＰＣ）（マクロファージ）の存在下においてＴｈ１サイトカイン合成を阻害するだけである。ＩＬ−１０作用の一つの可能な機序は、Ｔｈ１細胞からの最適サイトカイン放出に必要とされる可溶性補助因子の生産の抑制である。上澄みは、Ｔｈ１細胞および特異的抗原の存在下または不存在下においてＩＦＮγに刺激されたマクロファージから得られた。このような上澄み（図１９Ａ）またはそれらの濃縮の際に生じたフロースルーは、Ｔｈ１細胞に対するマクロファージＡＰＣ機能のＩＬ−１０に媒介された阻害を逆行させることができなかった。これらのデータは、ＩＬ−１０が、Ｔｈ１サイトカイン合成に必要な可溶性同時刺激剤をダウンレギュレートするという証拠を与えない。同様の実験は、ＩＬ−１０が、Ｔ細胞に対して直接的に作用する可溶性阻害因子をマクロファージに生じさせるという証拠を与えないが、このような阻害剤は不安定でありまたは膜に結合していることがある。これを検査するために、細胞混合実験を以下のように実施した。脾臓Ｂ細胞およびマクロファージをＦＡＣＳ選別した（Ｂ２２０およびＭａｃ−１基準で）。勾配用量のマクロファージを、Ｂ細胞の存在下または不存在下、更にはＩＬ−１０の存在下または不存在下においてＨＤＫ．１細胞の抗原特異的刺激のためのＡＰＣとして用いた。Ｔｈ１サイトカイン合成のＢ細胞以外のマクロファージ刺激は、ＩＬ−１０によって阻害された（図１９Ｂ）。勾配用量のマクロファージと一定数のＢ細胞との混合により、Ｔｈ１サイトカイン合成の追加の刺激が得られた（図１９Ｂ）。しかしながら、ＡＰＣのこの混合物に対するＩＬ−１０の添加は、Ｔｈ１サイトカイン合成濃度をＢ細胞ＡＰＣ単独で達成された濃度まで低下させただけであって、その観察報告は、Ｔｈ１細胞に対して直接的に作用する近距離若しくは不安定な阻害剤、またはＢ細胞ＡＰＣの存在に反論するものである。
実験Ｄ
ＩＬ−１０は、超抗原に誘導された致命的なショックからマウスを防護する。
概要
マウスモデルにおいてブドウ球菌性エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）によって誘導された致命的なショックに対する保護におけるＩＬ−１０の役割を研究した。ＩＬ−１０によるマウスの予備処置は、ＳＥＢおよびＤ−ガラクトサミンを注射した後のマウスの致死を防止した（後者は、ＳＥＢに対するマウスの自然の抵抗性を克服するのに必要であった）。この効果は、ＩＬ−１０が、好ましくは、Ｔ細胞を活性化するマクロファージの能力を阻害するその能力によって、インビボでの細胞活性化を阻害することができるということを示す。
超抗原は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖβに特異的な方法で、Ｔｃｒ Ｖβ鎖とクラスＩＩ ＭＨＣ分子のＢ鎖とを結合することによってＴ細胞を活性化するＴ細胞マイトジェンである。超抗原には、ネズミ乳がんウイルスによって生産された内因性分子と、黄色ブドウ球菌によって生産されたもののようなエンテロトキンシンを含む外因性超抗原とがある。超抗原の毒性作用は抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在に依る。近年、これらの毒素の毒性作用は、それらのＴ細胞マイトジェン活性ゆえに、インビボで実証されてきた結論であると認識されている。
ＩＬ−１０は、種々の細胞系において多面的な活性を示すサイトカインである。これらには、ネズミＴ細胞およびマスト細胞に対する成長補助因子、Ｂ細胞中のＩａ誘導およびＴ細胞活性化を阻害するその能力がある。後者の作用は、ＡＰＣとして作用するマクロファージの能力を阻害することにより、間接的であることが実証されている。この作用は、ＩＬ−１、ＴＮＦαおよびＩＬ６のようなサイトカインを生産するそれらの能力を含むマクロファージ機能に対するＩＬ−１０の一般的な阻害作用の一部分であると考えられる。
本実験では、Ｔ細胞に媒介された致命的なショックのインビボモデルとして、マウスにおいてブドウ球菌性エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）に誘導されたショックを用いた。このモデルにおいて、マウスは、Ｄ−ガラクトサミンによる予備処置によってＳＥＢの毒性作用に対して感受性にされた。この処置は、おそらくは肝臓クリアランス機序に影響を与えることによって、エンテロトキシンに対してマウスが有している自然の抵抗性を低下させる。引続き少用量のＳＥＢを投与すると２日以内に致死する。このモデルにおいて、毒性は、ＴＮＦα生産を生じたＴ細胞が重要な役割を果たしていることが分かっている大型のＴ細胞活性化によることが分かる。ＩＬ−１０によるマウスの処置は、おそらくはマクロファージ依存Ｔ細胞活性化を阻害するその能力により、ＳＥＢに媒介された毒性を阻害する。
実施例Ｄ１
ＩＬ−１０は、インビボでのＳＥＢ媒介毒性を防止する。
マウス
４〜５週令の雄のＢＡＬＢ／ｃ Ｈ−２dマウスを、シモンソン・ラボラトリーズ（Ｓｉｍｏｎｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ギルロイ、カリフォルニアから購入した。
試薬
用いた材料は以下であった。ネズミインターロイキン１０（ｍＩＬ−１０）は、ＤＮＡＸリサーチ・インスティテュート（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（パロ・アルト、ＣＡ）のサティシュ・メノン（Ｓａｔｉｓｈ Ｍｅｎｏｎ）による標準的な操作によって製造した。Ｄ（＋）−ガラクトサミン（Ｇ−０５００）は、シグマ、セント・ルイス、ＭＯから購入した。最初の実験で用いたブドウ球菌性エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）もシグマから購入した。次の実験で用いたＳＥＢは、トキシン・テクノロジー（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マディソン、ＷＩＳから、Ｐ．ヒューゴー（Ｈｕｇｏ）（Ｎａｔｉｎａｌ Ｊｅｗｉｓｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，デンバー、Ｃｏ．）によって快く提供された。材料は全て平衡塩溶液中で希釈した。
処置
４〜５週令の雄マウスに、種々の濃度のｍＩＬ−１０を注射した（腹腔内）。３〜４時間後、同マウスにＤ−ガラクトサミンを注射した（腹腔内）。２回目の注射の１時間後、マウスにＳＥＢを数種類の濃度で注射した。注射後２４時間、３６時間および４８時間にマウスを観察した。
最初の実験により、ＩＬ−１０はインビボでのマウスモデルにおいてＳＥＢの毒性を変化させることが確証された。予備実験は、このモデルにおいて高死亡率を観察するのに必要とされるＳＥＢの最小用量を決定することに向けて計画された。この用量は、ＳＥＢの由来（供給者）およびロットに応じて変化した。この用量をある与えられたロットのＳＥＢに関していったん決定したら、ＩＬ−１０（１０μｇ／マウス）による予備処置を検査した。図２０は、ＩＬ−１０による予備処置の結果として、ＳＥＢ１０μｇ／マウスを注射された全マウスが生き残ったことを実証する。ＩＬ−１０による予備処置は、ＳＥＢ２０μｇ／マウスを注射された被験動物の最終の致死を防止しなかったが、それらの生存を延長させた。
実験Ｅ
インターロイキン１０は、致命的な内毒素血症からマウスを防護する。
概要
ＩＬ−１０は、インビトロでのＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαの生産を減少させ、そしてマウスにおけるＩＬ−１０の中和は、同サイトカインの増加をもたらす。本実験は、ＩＬ−１０のこのモノカイン抑制性が、ＬＰＳに誘導されたショックであるモノカインに媒介された炎症性反応からマウスを防護する能力を与えるかどうかを検査する。組換体ネズミＩＬ−１０の０．５〜１μｇを１回注射することにより、再現性をもってＢＡＬＢ／ｃマウスを内毒素の致命的な腹腔内注射から防護した。この結果は、ＩＬ−１０を内毒素の注射と同時に投与しても、または３０分後に投与しても得られた。ＩＬ−１０の防護作用は、中和性抗ＩＬ−１０抗体の先行注射によって逆行し且つ内毒素に誘導されたＴＮＦα放出の実質的な減少と相関した。これらのデータは、ＩＬ−１０を細菌性敗血症の治療のための候補として、更に一般的には有効な抗炎症薬として暗示する。
いくつかの細菌感染は、低血圧症、発熱、組織壊死、広範囲にわたる器官機能不全および最終的な致死を含む大きな生理学的変化を引起こすことがある。グラム陰性細菌の場合、この毒性は、細菌の細胞壁のリポ多糖（ＬＰＳ）成分である内毒素による。実際に、適当な用量のＬＰＳをウサギ、マウスおよび他の動物に注射すると、敗血症性ショック症候群に典型的な変化が生じ、したがって、この炎症性反応の簡単な動物モデルが得られる。単クローン性抗体かまたはＩＬ−１Ｒａと称する生理学的ＩＬ−１アンタゴニストを用いてこれらのモノカインを中和することによって動物を細菌および内毒素に誘導されたショックから防護することができるので、内毒素に誘導された毒性は、内毒素に刺激されたマクロファージ／単球からのＴＮＦα、ＩＬ−１および／またはＩＬ−６の放出によると考えられる。
インターロイキン１０（ＩＬ−１０）は、ヘルパーＴ細胞およびＮＫ細胞によるＩＦＮγ生産の抑制；胸腺細胞、マスト細胞およびＢ細胞の成長同時刺激；並びにモノカイン生産の抑制を含む多数のインビトロの性質を有する。後者の性質に関して、ＩＬ−１０は、ヒト単球およびマウス腹膜マクロファージによるＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＧＭ−ＣＳＦの誘導された生産を大きく抑制する。対照的に、ＩＬ−１０は、単球によるＴＧＦβの構成的発現に対して作用しないし、事実上、ＩＬ−１Ｒａの単球生産をアプレギュレートする。これらのインビトロのデータは、特異的単クローン性抗体を用いるＩＬ−１０の中和が、マウスにおける循環性ＴＮＦαおよびＩＬ−６の濃度を増大させることを示すインビボの実験によって支持される。ＩＬ−１Ｒａを増加させる能力と組み合わされたＴＮＦα、ＩＬ−１およびＩＬ−６の生産を抑制するＩＬ−１０の能力が、内毒素に誘導されたショックに対してマウスを防護しうるこのサイトカインを与えるかどうかを検査した。
実施例Ｅ１
マウスにおける致命的な内毒素血症に対するＩＬ−１０の作用
マウス
８週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを、シモンセン・ラボラトリーズ
（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ギルロイ、ＣＡ）から入手した。
試薬
大腸菌血清型０１１１：Ｂ４ からのリポ多糖（ＬＰＳ）は、シグマ・ケミカル・カンパニーから購入した。組換体ネズミＩＬ−１０を大腸菌において発現させ、そしてアフィニティー精製およびイオン交換クロマトグラフィーによって高比活性に精製した。この材料は最小の内毒素を含み且つ４℃で少くとも４か月間安定した状態のままであった。ネズミＩＬ−１０の非活性は、サイトカイン合成阻害検定（フィオレンチノら（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐｔ′ｌ．Ｍｅｄ．１７０：２０８１〜２０９５を参照されたい）およびＭＣ／９マスト細胞同時刺激検定（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）−スナイプス（Ｓｎｉｐｅｓ）ら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：５０７〜５１０を参照されたい）双方で評価された。中和抗体実験には、２Ａ５、ラットＩｇＧ１抗マウスＩＬ−１０単クローン性抗体またはＧＬ１１３と称するイソタイプ対照抗体を用いた。
ＴＮＦα検定
ＴＮＦαの血清濃度は、サイトカイン特異的エリザを用いて評価された。
ＢＡＬＢ／ｃマウス２０匹の群に、致死用量のＬＰＳ単独かまたは同量のＬＰＳを種々の量の組換体ネズミＩＬ−１０と一緒に腹腔内に注射した。この種類のいくつかの実験において、ＩＬ−１０の０．５μｇか、１．０μｇかまたは１０μｇを被験動物に対してＬＰＳと同時に投与した場合、マウスはＬＰＳに誘導されたショックの結果として生じる致死から完全に防護された（図２１）。これらの実験のいくつかにおいて、ＬＰＳ投与時にＩＬ−１０を０．１μｇまたは０．０５μｇ与えられたマウスでは、更に、部分的な防護が観察された（図２１）。
実施例Ｅ２
抗ＩＬ−１０抗体による防護の中和
致命的な内毒素血症からのＩＬ−１０に媒介された防護は、中和性抗ＩＬ−１０抗体の先行投与によって阻止することができたがイソタイプ対照抗体によって阻止されず（図２２）、この作用の特異性が確証された。
実施例Ｅ３
ＩＬ−１０の遅れた投与は、防護を有効に存続させる。
速度論研究は、致命的な内毒素血症からのＩＬ−１０に媒介された防護が、ＩＬ−１０をＬＰＳ注射の３０分後に投与した場合でさえも達成されたことを示した。しかしながら、ＩＬ−１０投与が更に遅れると、防護は実質的に減少し、そしてＩＬ−１０をＬＰＳ注射の５時間後に投与した場合、防護は観察されなかった（図２３）。
実施例Ｅ４
ＩＬ−１０のＴＮＦαに対する作用
致命的な内毒素血症は、望ましくないモノカイン媒介炎症性反応である。ＩＬ−１０は、インビトロでの活性マクロファージおよび単球によるモノカイン生産を抑制することが示されており、上記ＩＬ−１０に媒介された防護は、内毒素に誘導された応答でのモノカイン生産の抑制を反映したことが示唆される。実際に、ＬＰＳ±ＩＬ−１０注射後１時間、２時間および３時間に集められた血清は、ＩＬ−１０によって防護された被験動物における循環性ＴＮＦα濃度の大きな減少を示した。抗ＴＮＦ抗体はマウスを致命的な内毒素血症から同様に防護するので、ＩＬ−１０に誘導されたＴＮＦαの抑制は少くとも防護に寄与し、このサイトカインが致命的な内毒素血症に備えると考えられる。マクロファージ／単球機能に対するＩＬ−１０の他の作用も、致命的な内毒素血症を防護するその能力に寄与することができる。インビトロの実験は、ＩＬ−１０が、ＩＬ−１およびＩＬ−６を抑制するのみならずＩＬ−１Ｒａをアップレギュレートすることを示しており、この結論は、中和性抗サイトカイン抗体を用いる報告によって示唆されたように、致命的な内毒素血症を防止し、またはＩＬ−１Ｒａの投与を指示するものである。
実験Ｆ
継続的抗インターロイキン１０抗体投与は、通常のＢ細胞以外のＬｙ−１Ｂ細胞のマウスを枯渇させる。
概要
Ｌｙ−１Ｂ細胞は、継続的自己補充の顕著な性質を有し、そして最近記載されたサイトカインインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の大きく増加した構成的および誘導性の生産の基準で通常のＢ細胞と更に区別することができる。ＩＬ−１０がＬｙ−１ Ｂ細胞に対するオートクリンかまたはパラクリン成長因子として作用するかどうかは、マウスを誕生から８週令まで継続的に、マウスＩＬ−１０を特異的に中和する単クローン性ラットＩｇＭ抗体で処置することによって検査された。この方法で処置されたマウスは、腹膜内在Ｌｙ−１Ｂ細胞を欠失し、大きく減少した血清免疫グロブリンＭ濃度を含み、そして特異的Ｂ細胞がＬｙ−１Ｂ細胞サブセット中に存在するための抗原であるα１，３−デキストランまたはホスホリルコリンの腹腔内注射に対する有意のインビボ抗体応答を生じることができなかった。対照的に、抗ＩＬ−１０で処置されたマウスの通常の脾臓Ｂ細胞は、全数、表現型並びにＢ細胞マイトジェンおよび胸腺依存抗原トリニトフェニル−スカシガイのヘモシアニン（ＴＮＰ−ＫＬＨ）に対するインビボ応答に関して正常であった。Ｌｙ−１Ｂ細胞枯渇の機序は、中和性抗ＩＦＮγ抗体の同時投与がこれらのマウスにおいて腹膜内在Ｌｙ−１Ｂ細胞の数を実質的に回復させたことから、抗ＩＬ−１０処置マウスにおける内因性インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）濃度の増大に関係していると考えられた。これらの結果は、ＩＬ−１０をＬｙ−１Ｂ細胞発生の調節剤として暗示させ、そしてＬｙ−１Ｂ細胞を特異的に枯渇させる方法を規定することによって免疫系におけるこれらの細胞の役割を更に評価することを可能にする。
Ｌｙ−１Ｂ細胞は、成体マウスの全Ｂ細胞の〜２％を含み且つ通常のＢ細胞とそれらを区別するいくつかの興味ある性質を示す。すなわち、（ａ）大部分の一次および二次リンパ系組織中でかろうじて検出可能であるが、腸に関係したリンパ系組織中のそれらの子孫と同様に、それらは腹膜腔および胸膜腔において極めて豊富であり；（ｂ）それらは初期の個体発生において発生し且つ優勢であった後、動物の生存に関して自己補充性であり；（ｃ）それらは、自己決定因子と極めて交差反応性である限られたレパートリーの低親和性抗体を生じ、体細胞突然変異によって成熟するとは考えられないし；そして（ｄ）それらは血清中に見出される大部分のＩｇＭ抗体を生じ、そしてホスホリルコリンおよびα１，３−デキストランなどのいくつかの細菌決定因子によって引出される完全な抗体応答を生じない。免疫系機能におけるそれらの正確な役割は不明であるが、Ｌｙ−１Ｂ細胞によって生じた抗体の特異性に基づいて進められた様々なモデルは、抗細菌性免疫における；老化赤血球などの宿主細胞破片のクリアランスにおける；および発生の際の抗体レパートリーの調節における役割を含む。Ｌｙ−１Ｂ細胞は、ＩＬ−１０、いくつかのモノカインの生産をダウンレギュレートする免疫抑制サイトカインおよびＴ細胞誘導サイトカインの有力な生産者であるという本発明者の最近の知見により、Ｌｙ−１Ｂ細胞の一層広範な免疫調節の役割の可能性が高くなっている。多数のこれらの顕著な特徴をヒトにおいて評価することはむずかしいが、関連した性質を有するＬｙ−１含有ヒトＢリンパ球の集団は識別された。
実施例Ｆ１
継続的ＩＬ−１０中和は、Ｌｙ−１Ｂ細胞のマウスを枯渇させる。
マウス
妊娠中期のＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣＨ３／ＨｅＪマウスをシモンセン・ラボラトリー（ギルロイ、ＣＡ）から入手した。
抗ＩＬ−１０処置
令のそろったＢＡＬＢ／ｃマウス５〜１０匹に、ＳＸＣ．１と称する中和性ラットＩｇＭ抗マウスＩＬ−１０抗体（第１週に０．２ｍｇ／注射、第２週に０．５ｍｇ／注射、第３〜第８週に１．０ｍｇ／注射）、等量のＪ５／Ｄと称するイソタイプ対照または等量（１００または２００μｌ）のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を誕生から８週令まで週に３回腹腔内注射した。全部の実験において未処置の令のそろったＢＡＬＢ／ｃマウスを比較のために含んだ。抗体ＳＸＣ．１およびＪ５／Ｄは、血清不含ハイブリドーマ上澄みから得られ且つ２回連続した３５％硫酸アンモニウム沈殿工程によって精製された。若干の実験において、マウスは、同量の２Ａ５と称する別個のラットＩｇＧ１抗マウスＩＬ−１０個体またはそのイソタイプ対照ＧＬ１１３を与えられた。これらの後者の抗体は、第１週に０．５ｍｇ／注射、第２週に１ｍｇ／注射、第３〜第８週に２ｍｇ／注射で腹腔内に投与された。
免疫蛍光法
洗浄した細胞を、以下の試薬の組合わせで染色した。すなわち、フルオレセイン処理した抗マウスＩｇＭ抗体（ＤＳ−１；ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、サン・ディエゴ、ＣＡ）；ビオチニル化ラット抗マウスＩｇＤ抗体（１１−２６ｃ、Ｊ．カーニー（Ｋｅａｒｎｅｙ）によって製造された）；フルオレセイン処理した抗マウスＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１、ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、ＩＮ）；カルタグ・ラブズ（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｓ．）、サウス・サンフランシスコ、ＣＡ）。細胞はファクスカン（ＦＡＣＳｃａｎ）を用いて分析し、死滅した細胞は先の観点および横のばらつきの基準で排除された。結果は、各実験群から計数された生存細胞５，０００個の蛍光強度を示す。
抗体エリザ
処置の８時間後に集められた血清試料を、マウスＩｇＭの存在に関して、ラット抗マウスＩｇＭ（Ｒ８−１０３、ファーミンジェン）をＰＶＣ微量滴定プレート上に５μｇ／ｍｌで塗布したサンドウィッチエリザを用いて検定し、血清試料の希釈液または標準としての数種類の精製骨髄腫マウスＩｇＭタンパク質の混合物を加えた後、免疫複合体を、ビオチニル化ラット抗マウスＩｇＭ（Ｒ１９−１５、ファーミンジェン）と、アビジンを結合した西洋ワサビ大根のペルオキシダーゼ（カルビオケム・コーポレーション（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．）、ラ・ホヤ、ＣＡ）と、基質（２，２′−アジノビス［３−エチルベンズチアゾリン硫酸；シグマ・ケミカル・コーポレーション）１ｍｇ／ｍｌとを用いて検出した。
ホスホリルコリンおよびα１，３−デキストランに対する特異的抗体応答は、抗ＩＬ−１０または対照マウスの腹腔内に、食塩水０．５ｍｌ、スロドキー博士（Ｄｒ．Ｓｌｏｄｋｉ）（米国農務省農業研究事業団）によって提供されたロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ Ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のα１，３−デキストラン５０μｇまたは、ホスホリルコリンの源としての加熱殺菌された肺炎連鎖球菌２ｘ１０８個を試験投与した後に決定された。血清を全マウスから７日後に集め、そしてエリザを用いてα１，３−デキストランまたはホスホリルコリンに対する特異的抗体の分析をした。ＴＮＰ−ＫＬＨに対する特異的抗体応答は、マウスの腹腔内にＴＮＰ−ＫＬＨを１０μｇ試験投与した後に決定され、ＩｇＭ分析用の血清を７日後に集め、ＩｇＧ分析用には１０日および１４日後に集めた。ＴＮＰ特異的抗体はエリザを用いて定量した。いずれの場合にも、抗ＩＬ−１０処置は抗原の試験投与と血清採集との間継続された。
ＩＦＮγエリザ
抗ＩＬ−１０処置または対照マウスから集められた血清試料のネズミＩＦＮγをサイトカイン特異的エリザを用いて検定した。
雄および雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに、勾配用量のＳＸＣ．１と称する中和性ラットＩｇＭ抗マウスＩＬ−１０ ｍＡｂを誕生から８週令まで週に３回注射した後、Ｌｙ−１ Ｂ細胞の数および機能の分析をした。処置されない或いはＰＢＳかまたは関係のないラットＩｇＭイソタイプ対照（Ｊ５／Ｄと称する）を同様に注射された令のそろったＢＡＬＢ／ｃマウスの対照群を比較用に含んだ。抗体は、成果を有意に変更することなく腹腔内にかまたは皮下に投与された。用いた抗体注射計画は、抗体ＳＸＣ．１およびＪ５／Ｄ両方の場合においてラットＩｇＭ特異的エリザによって測定したところ、５０ｍｇ／ｍｌの８週目に平均血清ラットＩｇＭ濃度を生じた。処置の８週間後、抗ＩＬ−１０処置マウスは以下の判定基準、すなわち、全体重；肝臓、脾臓、胸腺、リンパ節、腸および肺の全体的組織学的検査；ヘマトクリット；脾臓、胸腺、リンパ節および腹膜中の全白血球数；並びに脾臓、リンパ節および胸腺中のＢ細胞、Ｔ細胞および非Ｂ／非Ｔ細胞の比率に関して３種類の対照群マウスと区別がつかなかった。対照的に、記載された４種類の実験群それぞれを含むマウス５〜１０匹から集められてプールされた腹膜洗液中で得られた細胞の免疫蛍光法表現型決定により、抗ＩＬ−１０（ＳＸＣ．１）処置マウスにおいてＩｇＭ+およびＩｇＤ+細胞の著しい枯渇が示されたが、対照動物のいずれにおいてもそれは示されなかった（図２４）。同一のデータが、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスを用いる２種類と別個のラットＩｇＧ１抗ＩＬ−１０中和抗体を用いる数種類を含む２４種類の独立した実験において得られた。抗ＩＬ−１０処置した被験動物は、更に、免疫蛍光法によって評価されるＢ２２０含有腹膜細胞を枯渇し且つＬＰＳ５０μｇ／ｍｌと同時培養して３日後に［3Ｈ］−チミジンを取込むこれらの細胞の能力によって評価されるＬＰＳ応答性腹膜細胞を枯渇した。これらの知見は、抗ＩＬ−１０処置ＢＡＬＢ／ｃマウスがそれらの腹膜腔中にＢ細胞が含まれなかったことを示唆し、この部位から通常回収することができるＢ細胞１〜５ｘ１０６個とは対照的である。３色免疫蛍光法によって本発明者の動物施設の８週令のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜腔が通常のＢ細胞を僅かしか含まない（＜５％）ということは重要である。したがって、図２４で示された結果は、主としてＬｙ−１Ｂ細胞の枯渇を示す。腹膜Ｂ細胞のこの著しい枯渇にもかかわらず、抗ＩＬ−１０処置マウスの腹膜腔の全細胞性は、対照群のそれと有意に異なることはなかった。更に別の免疫蛍光分析は、示差造血系細胞計数と一緒に、Ｂ細胞の損失が、抗ＩＬ−１０処置動物における腹膜ＣＤ４＋Ｔ細胞および顆粒球の増大によって補われることを示した。二つの他の観察報告により、抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ−１Ｂ細胞の枯渇は免疫系の至る所で起こり且つ腹膜腔に限定されなかったことが示された。第一に、抗ＩＬ−１０処置マウスは、マウスＩｇＭ特異的エリザによって監視したところ、３種類の対照と比較された血清ＩｇＭ濃度の著しい９０〜１００％の減少を示した（図２５）。第二に、抗ＩＬ−１０処置マウスは、それに対する機能的に応答性のＢ細胞がＬｙ−１Ｂ細胞サブセット中に完全に存在する２種類の胸腺依存抗原であるα１，３０−デキストランまたはホスホリルコリンに対するインビボ抗体応答を生じるそれらの能力が全く不十分であった（図２６）。
実施例Ｆ２
抗ＩＬ−１０処置マウスは、表現型的におよび機能的に正常な通常のＢ細胞を含む。
Ｌｙ−１Ｂ細胞の抗ＩＬ−１０処置の著しい作用に関して、これらの動物における通常のＢ細胞の状態を慎重に評価することは重要であった。上述のように、抗ＩＬ−１０処置または対照の動物の脾臓中の白血球は、２４種類の独立した実験において有意の差がなかった。図２７は、Ｂ２２０＋ Ｂ細胞、ＣＤ３＋ Ｔ細胞および非Ｂ／Ｔ細胞（Ｂ２２０-ＣＤ３-）の比率がマウスの４種類の実験群のいずれにおいても差がなかったことを示す。同等のデータは、Ｉｇ+ Ｂ細胞またはＣＤ４+Ｔ細胞を比較した場合に得られた。これらのデータは、抗ＩＬ−１０処置マウスの脾臓Ｂ細胞の全表現型数がそれぞれの対照群のそれと同じであることを示す。抗ＩＬ−１０処置マウスの通常のＢ細胞の免疫担当は２種類の方法で検査された。第一に、抗ＩＬ−１０処置マウスは、胸腺依存ＴＮＰ−ＫＬＨの注射に応答して正常のＩｇＭおよびＩｇＧ抗体を生じた（図２８）。ＴＮＰ−ＫＬＨに対する二次応答も、抗ＩＬ−１０処置マウスにおいては正常である。第二に、抗ＩＬ−１０処置マウスからの脾臓Ｂ細胞は、ＬＰＳまたは抗ＩｇＭ抗体５０μｇ／ｍｌに対する正常なインビトロ増殖応答を生じた（表Ｆ１）。抗ＩＬ−１０処置マウスに関する脾臓細胞のバックグラウンド増殖応答は、しばしば、対照のそれより３〜５倍高い（表Ｆ１）。集合的に、これらのデータは、抗ＩＬ−１０処置マウスにおける通常のＢ細胞が、対照マウスでのそれらと定量的にも機能的にも区別できないことを示唆する。
被験動物は、図１に記載のように、誕生から８週令まで処置された。各群のマウス３匹から得られた２ｘ１０6個／ｍｌのプールした脾臓細胞を培地のみにおいて、またはＬＰＳ（５０ｍｇ／ｍｌ）、ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（５０ｍｇ／ｍｌ）若しくはハムスター抗マウスＣＤ３抗体（５ｍｇ／ｍｌ）を補足した培地において３日間培養した。抗ＣＤ３刺激に関して、脾臓細胞を加える前に抗体を微量滴定プレート上に塗布した。増殖は、［3Ｈ］チミジン（ＮＥＴ ０２７；ニュー・イングランド・ヌクレアー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）、ボストン、ＭＡ）１ｍＣ／ウェルによる１６時間のパルスの後、［3Ｈ］チミジンの取込みによって評価された。
実施例Ｆ３
Ｌｙ−１Ｂ細胞枯渇の機序
増殖検定
各群のマウス３匹から得られたプールした脾臓細胞２ｘ１０6個／ｍｌを、培地のみまたは、ＬＰＳ（５０μｇ／ｍｌ）、ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（０６１１−０２０１；カッペル・ラボラトリーズ（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、コクランビル、ＰＡ）（５０μｇ／ｍｌ）若しくはハムスター抗マウスＣＤ３抗体（Ｄ．Ｊ．ブルーストーン、シカゴ大学、シカゴ、ＩＬから）（５μｇ／ｍｌ）を補足した培地において３日間培養した。抗ＣＤ３刺激に関して、脾臓細胞を加える前に抗体を微量滴定プレート上に塗布した。増殖は、［３Ｈ］チミジン（ＮＥＴ ０２７；ニュー・イングランド・ヌクレアー、ボストン、ＭＡ）１ｍＣｉ／ウェルによる１６時間のパルスの後、［3Ｈ］チミジンの取込みによって評価された。
いくつかの可能な機序が、抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ−１Ｂ細胞の枯渇に対する説明として考えられた。この作用は、抗ＩＬ−１０処置抗体を成体マウスに注射しても、１日、２日または３日後の全腹膜洗浄細胞または全腹膜Ｂ細胞の回収には影響がなかったので（図２９）、同抗体によるＬｙ−１Ｂ細胞の選択的細胞毒性に関与しているとは考えられなかった。別の説明として、本発明者は、Ｌｙ−１Ｂ細胞枯渇が、若干の他の内因性サイトカイン摂動の二次的結果に反映された可能性を考えた。実際に、抗ＩＬ−１０処置マウスは、概して、血清ＩＦＮγ濃度を増加させたことが分かっており（図３０）、その観察報告は、インビトロでのＴｈ１およびＮＫ細胞によるＩＦＮγ生産を抑制する従来報告されたＩＬ−１０の能力と一致する。この抗ＩＬ−１０に誘導されたＩＦＮγの増加が、Ｌｙ−１Ｂ細胞の枯渇に直接的かまたは間接的に関与していた可能性を検査するために、マウスに、抗ＩＬ−１０および抗ＩＦＮγ−中和抗体、または抗ＩＬ−１０および適当なイソタイプ対照抗体の組合わせを誕生から成体まで注射した。結果は、抗ＩＦＮγ抗体は腹膜Ｌｙ−１Ｂ細胞のマウスを枯渇させる抗ＩＬ−１０処置の能力を実質的に減少させたがそのイソタイプ対照では減少させなかったことを示した。抗ＩＦＮγ抗体単独、または抗ＩＬ−１０および抗ＩＦＮγ抗体の組合わせの継続投与が、適正な抗ＩＬ−１０またはそのイソタイプ抗体で処置されたマウスからの全腹膜洗浄細胞の回収率を変更しなかったことに留意することは重要である。これらのデータは、Ｌｙ−１Ｂ細胞枯渇が、少くとも部分的には抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＩＦＮγ増加の結果であるという概念を支持する。
実験Ｇ
抗ＩＬ−１０処置マウスの変更された免疫学的状態
概要
中和性抗ＩＬ−１０抗体による誕生から成体までの継続した処置は、Ｌｙ１Ｂ細胞の特異的枯渇をもたらすが、通常のＢ細胞は、数、表現型および機能に関して正常のままであるということを上記で示した。実験Ｆを参照されたい。これらの被験動物の特性決定を延長すると、このデータは、抗ＩＬ−１０処置マウスをいくつかの他の判定基準によって未処置またはイソタイプ対照処置マウスと区別することができることを示している。抗ＩＬ−１０処置マウスは実質的に高濃度の循環性ＴＮＦαおよび多くの場合循環性ＩＬ−６を含み、そしてＬＰＳに誘導されたショックすなわちモノカインに媒介された炎症性反応による致死に対して大いに感受性であった。抗ＩＬ−１０処置マウスにおける血清免疫グロブリン濃度の分析は、血清ＩｇＡ濃度の減少が、血清ＩｇＭの従来報告された減少と、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの著しい増加とを伴うことを示した。抗ＩＬ−１０処置マウスのＬｙ−１Ｂ細胞枯渇の更に別の研究は、抗ＩＬ−１０処置を中断して８週間後にＬｙ−１Ｂ細胞が正常の数に戻ることによって実証されたように、この作用が一時的であったことを示した。抗ＩＬ−１０処置の際に起こったＬｙ１Ｂ細胞枯渇は、腹膜Ｔ細胞および顆粒球の増加によって補われることが分かった。最後に、抗ＩＬ−１０処置マウスはホスホリルコリンおよびα１，３−デキストランに対して抗体を生産することができなかったので、それらはＴＮＰ−フィコールの腹腔内注射後に正常の抗体応答を生じた。この結果は、胸腺非依存ＩＩ型多糖抗原の系列中の亜類の存在を示唆する。これらのデータを、免疫系におけるＩＬ−１０およびＬｙ１Ｂ細胞の役割に関するそれらの意味との関係において論及する。
免疫系は、種々の造血系および非造血系細胞によって生産されるサイトカインと称する一群の可溶性糖タンパク質によって調節される。この５年間にわたるこれらの免疫調節物質の広範囲のインビトロ特性決定は、サイトカイン系内の広範囲の機能的多面性および重複性の概念をもたらす。現在、免疫学者は、この概念がインビボでのサイトカインの生理学的役割を正確に反映しているかどうかを評価する課題に直面している。最近発見されたサイトカインＩＬ−１０の生理学的役割が、研究の主題となっている。インビトロの性質の広範囲のリストは、若干のモノカインおよびサイトカインの生産をダウンレギュレートし且つ全部ではないが若干の抗原提示細胞による抗原提示を阻害することができる強力な免疫抑制剤としてＩＬ−１０を特性決定した。刺激性についての同様に項目の多いリストは、胸腺細胞、末梢Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマスト細胞の成長同時刺激剤；細胞毒性Ｔ細胞の発生および機能のアンプリファイア；並びにＢ細胞の生存可能性および分化の誘導物質と同一のサイトカインを表わしている。インビボでのＩＬ−１０の生理学的役割を評価するために、マウスに中和性抗ＩＬ−１０単クローン性抗体を誕生から成体まで週に２〜３回注射した。初期の分析は、この処置が、Ｌｙ−１またはＢ−１ Ｂ細胞と称するＢリンパ球の少数のサブセットの著しい枯渇をもたらし、それによってＩＬ−１０はＬｙ−１／Ｂ−１ Ｂ細胞発生の調節剤として暗示されることを示した。
Ｌｙ−１ Ｂ細胞は、ヒトおよびマウスの胎児および新生児のリンパ系組織において極めて支配的であるが、成体免疫系においては少数しか見出されないＢリンパ球の亜集団である。成体の一次および二次リンパ系組織においてはかろうじて検出可能なＬｙ−１Ｂ細胞は、成体マウスの腹膜および胸膜腔においては極めて豊富であるが、成人の循環中においては低数で見出される。ネズミの系におけるそれらの広範な特性決定は、体細胞突然変異を容易に受けないし、しかも自己抗原および細菌の細胞壁成分と極めて交差反応性である限られたレパートリーの低親和性抗体を含む多数の興味ある性質を示した。更に、ネズミ再構成実験は、通常のＢ細胞とは対照的に、Ｌｙ−１ Ｂ細胞は宿主の全寿命の間自己補充することができること、並びにそれらは大部分の血清ＩｇＭ並びにホスホリルコリンおよびα１，３−デキストランなどのいくつかの細菌決定因子に対する完全な抗体応答を生じることを示した。Ｌｙ−１ Ｂ細胞の従来の特性決定は、ＩＬ−１０の大きく増加した且つ誘導しうる生産の基準でそれらを通常のＢ細胞と更に区別することができることを示しており、これらの細胞に関するより広範な免疫調節の役割の可能性を高めた。これらの興味ある性質にもかかわらず、免疫系におけるＬｙ−１ Ｂ細胞の正確な役割は不明のままである。
中和性抗ＩＬ−１０抗体で誕生から成体まで継続的に処置されてきたマウスは、それらの腹膜Ｂ細胞の欠失によって並びにそれらが血清ＩｇＭ濃度と、α１，３−デキストランおよびホスホリルコリンに対するインビボ抗体応答とを激しく減少させたことによって実証されたように、Ｌｙ−１ Ｂ細胞を枯渇した状態になる。Ｌｙ−１ Ｂ細胞の枯渇は、内因性ＩＦＮγの増加の二次的な結果であることが分かっており、抗ＩＦＮγ抗体の同時投与によって防止することができた。これらのマウスの引続きの免疫状態においてＬｙ−１Ｂ細胞および内因性ＩＬ−１０両方を特異的に枯渇した結果をここで報告する。
実施例Ｇ１
内因性サイトカイン濃度に対するマウスの抗ＩＬ−１０処置の効果
マウス
妊娠中期のＢＡＬＢ／ｃマウスをシモンセン・ラボラトリー（ギルロイ、ＣＡ）から入手した。
抗ＩＬ−１０処置
令のそろったＢＡＬＢ／ｃマウス５〜１０匹に、以下のプロトコルにしたがって、２種類の抗ＩＬ−１０抗体のどちらかを誕生から８週令まで腹腔内注射した。若干の実験において、マウスに、ＳＸＣ．１ラットＩｇＭ抗マウスＩＬ−１０抗体（モスマン（Ｍｏｓｍａｎｎ）ら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：２９３８〜２９４５を参照されたい）（第１週に０．２ｍｇ／注射、第２週に０．５ｍｇ／注射、第３〜８週に１．０ｍｇ／注射）、等量のＪ５／Ｄと称するイソタイプ対照または等容量（１００または２００μｌ）のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を１週間に３回注射した。他の実験においては、マウスに、２Ａ５、ラットＩｇＧ１抗マウスＩＬ−１０抗体（第１週に０．２ｍｇ／注射、第２週に０．５ｍｇ／注射、第３〜８週に１ｍｇ／注射）、等量のＧＬ１１３と称するイソタイプ対照または等容量の（１００または２００μｌ）のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を１週間に２回注射した。未処置の令のそろったＢＡＬＢ／ｃマウスを、全部の実験において比較用に含んだ。抗体は全て、血清不含ハイブリドーマ上澄みから得られ、硫酸アンモニウム沈殿によって精製された。この処置計画の後、プールされた脾臓、胸腺、リンパ節または腹膜洗浄細胞を４種類の群のマウスそれぞれから集められ且つ流動血球計算法および機能検定によって分析された。
サイトカインエリザ
抗ＩＬ−１０処置または対照マウスから集められた血清試料のネズミＴＮＦαまたはネズミＩＬ−６を、サイトカイン特異的エリザを用いて検定した。
マウスの誕生から成体までの継続した抗ＩＬ−１０処置は、双方ともそれらの血清中の検出可能なＩＦＮγを欠失している未処置またはイソタイプ対照処置マウスとは対照的に、８週目に集められた血清中の実質的な量のＩＦＮγの存在をもたらす。抗ＩＬ−１０処置から得られた内因性サイトカイン摂動を更に探求するために、処置の８週間後に集められた血清のＴＮＦαおよびＩＬ−６の存在を、サイトカイン特異的エリザを用いて評価した。抗ＩＬ−１０処置マウスからの血清は、極めて高いＴＮＦα濃度を含み（図３２）、しばしば高いＩＬ−６濃度を含んだ（図３３）。抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＴＮＦαおよびＩＬ−６の増加は、インビトロでのモノカイン生産を抑制する報告されたＩＬ−１０の能力と一致している。
実施例Ｇ２
マウス血清Ｉｇ濃度に対する抗ＩＬ−１０処置の効果
内毒素に誘導されたショック
マウスに、１μｇ〜５００μｇの範囲の用量の内毒素（大腸菌血清型０１１１：Ｂ４、シグマ・ケミカル・カンパニーからのリポ多糖）を腹腔内注射した。その後１〜６日間にわたって生存を監視した。
内因性モノカイン濃度に対する抗ＩＬ−１０の作用を、ＬＰＳに誘導されたショックすなわちモノカインに媒介された炎症性反応に対するこれらの被験動物の感受性を評価することによって更に分析した。初期に示されたデータは、ＴＮＦα、ＩＬ−１またはＩＬ−６に対する中和性単クローン性抗体およびＩＬ−１Ｒａと称する生理学的ＩＬ−１アンタゴニストが、ＬＰＳに誘導されたショックからマウスを効果的に防護することを示した。このような実験は、ＳＸＣ．１（ラットＩｇＭ）かまたは２Ａ５（ラットＩｇＧ１）抗ＩＬ−１０抗体を誕生から８週目まで注射されたマウスが、ＬＰＳに誘導されたショックによる致死に対して著しく感受性であったことを示す（図３４）。ＤＮＡＸ動物施設の８週令のＢＡＬＢ／ｃマウスに関するＬＰＳ ＬＤ１００は、大部分の抗ＩＬ−１０処置マウスを死滅させた内毒素１μｇと同程度に少量の＞３８０μｇ／マウス（腹腔内）であることが分かった。この増大した感受性の正確な機序はまだ決定されていないが、これらのデータは、抗ＩＬ−１０処置マウスのおける炎症性モノカインの一般化されたアップレギュレーションと一致している。
抗体エリザ
処置の８週間後に集められた血清試料の、全イソタイプのマウス免疫グロブリンの存在を、イソタイプ特異的サンドウィッチエリザを用いて検定した。この目的に用いられたプレート結合性抗体は以下の通りであった。すなわち、ラット抗マウスＩｇＧ１（３０９６、Ｒ．コフマン（Ｃｏｆｆｍａｎ）、ＤＮＡＸによって豊富に提供された）；ラット抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｒ８−１０３；ファーミンジェン、サン・ディエゴ、ＣＡ）；ラット抗マウスＩｇＧ２ｂ（Ｒ９−９１、ファーミンジェン）；ラット抗マウスＩｇＧ３（Ｒ２−３８、ファーミンジェン）；ラット抗マウスＩｇＡ（Ｒ５−１４０、ファーミンジェン）；ラット抗マウスＩｇＥ（ＥＭ９５、Ｒ．コフマンによって豊富に提供された）。プレート被覆抗体を１〜５μｇ／ｍｌで用いた。これらのエリザで用いたサンドウィッチ抗体は、ビオチニル化ラット抗マウスＩｇＧ１（３０９８Ｂ、Ｒ．コフマンによって豊富に提供された）；ビオチニル化ラット抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｒ１９−１５；ファーミンジェン）；ビオチニル化ラット抗マウスＩｇＧ２ｂ（Ｒ１２−３、ファーミンジェン）；ビオチニル化ラット抗マウスＩｇＧ３（Ｒ４０−８２、ファーミンジェン）；ビオチニル化ラット抗マウスＩｇＡ（２７４０Ｂ、Ｒ．コフマンによって豊富に提供された）；ビオチニル化ラット抗マウスＩｇＥ（Ｒ３５−１１８、ファーミンジェン）であった。これらのサンドウィッチ抗体を、ストレプトアビジンを結合した西洋ワサビ大根のペルオキシダーゼ（カルビオケム、ラ・ホヤ、ＣＡ）および基質［２，２−アジノビス（３−エチルベンズチアソリン硫酸）；シグマ］と一緒に１〜３μｇ／ｍｌで用いた。エリザは、精製マウス骨髄腫免疫グロブリンを標準として用いて定量した。
マウスの誕生から成体までの継続した抗ＩＬ−１０処置は、イソタイプ対照処置マウスにおいて観察された正常血清ＩｇＭ濃度と比較して顕著な血清ＩｇＭ濃度の枯渇をもたらす。処置の８週間後に集められた血清中の他の免疫グロブリンイソタイプの測定値を図３５に示す。３種類の対照群マウス（すなわち、未処置、ＰＢＳ処置またはイソタイプ対照抗体で処置された）における各免疫グロブリンイソタイプの濃度は、正常マウスにおける血清Ｉｇ濃度の以前に実証された範囲とほとんど変わらなかった。しかしながら、抗ＩＬ−１０処置マウスにおける血清Ｉｇ濃度においては多数の変化が観察された。これらのマウスは、従来報告された血清ＩｇＭの減少並びにＩｇＧ２αおよびＩｇＧ２βの著しい増加を伴う血清ＩｇＡ濃度の顕著な減少を示した（図３５）。残りのイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＥ）は変化しないかまたは若干の実験において２〜４倍に増加した。
実施例Ｇ３
抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ−１Ｂ細胞の枯渇は一時的である。
免疫蛍光法
洗浄した細胞を、以下の試薬の組合わせで染色した。すなわち、フルオレセイン処理抗マウスＩｇＭ抗体（ＤＳ−１、ファーミンジェン、サン・ディエゴ、ＣＡ）；ビオチニル化ラット抗マウスＩｇＤ抗体（１１−２６ｃ、Ｊ．カーニー、Ｕ．バーミンガム、Ａｌａ．によって製造された）；フルオレセイン処理抗マウスＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１、ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）；ビオチニル化抗マウスＢ２２０抗体（ＲＡ３−６Ｂ２；カルタグ、Ｓ．Ｆ．）；およびビオチニル化ラット抗マウス顆粒球／好酸球抗体（８Ｃ５；Ｒ．コフマン、ＤＮＡＸによって製造された）。ビオチニル化試薬は、フィコエリトリン結合ストレプトアビジン（ベクトン・ディキンソン、マウンテン・ヴュー、ＣＡ）と一緒に用いられた。細胞はファクスカンを用いて分析され、そして死滅細胞は先の観点および横のばらつきの基準で排除された。結果は、各実験群から計数された生存細胞５，０００個の蛍光強度を示す。
抗ＩＬ−１０処置マウスは、抗ＩＬ−１０処置を中断した後に評価され、これらの被験動物におけるＬｙ−１Ｂ細胞の枯渇が不可逆的であるかどうかを決定した。いくつかの群のマウスに、抗ＩＬ−１０抗体を誕生から８週間まで注射した後、処置を中断した。次に、各群を、腹膜Ｌｙ１ Ｂ細胞の存在に関して、処置の終了直後かまたはその後８週間の間の種々の時点で分析した。重要なことに、種々の時点で集められた全腹膜洗浄細胞の収量には有意の差が見られなかった。この性質を有するいくつかの実験において、抗ＩＬ−１０処置後に最初の３週間、マウスは腹膜Ｌｙ１Ｂ細胞を欠いたままであった。その時間間隔の後、Ｌｙ１Ｂ細胞は腹膜腔中に再度現れ始め、Ｌｙ１Ｂ細胞の正常な全数は、抗ＩＬ−１０処置の終了後８週間目に観察された（図３６）。腹膜Ｂ細胞区分の再構成は、抗ＩＬ−１０処置を中断後約４週間目にＢ２２０鮮明ＩｇＭ不鮮明Ｂ細胞が最初に現れ、その後数週間後にＢ２２０不鮮明ＩｇＭ鮮明Ｂ細胞が現れることを特徴とした（図３６）。
実施例Ｇ４
抗ＩＬ−１０処置マウスにおける腹膜Ｔ細胞および顆粒球の増大した数
示差造血系細胞計数
脾臓および腹膜洗液からの細胞懸濁液を用いて、細胞形態学分析用のサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎｓ）を製造した。試料をライト・ギムザ（シグマ、セント・ルイス）で染色し且つそのリンパ球、マクロファージ、顆粒球、好酸球およびマスト細胞を検鏡によって分析した。
誕生から８週令まで継続的に処置されたマウスは腹膜Ｂ細胞を枯渇した状態になったが、このようなマウスから得ることができる腹膜洗液細胞の全数は、対照マウスのそれとほとんど変わらなかった。抗ＩＬ−１０処置マウスから集められた腹膜洗液細胞で実施された示差造血系細胞計数は、これが腹膜顆粒球／好酸球および見掛け上の非Ｂ細胞リンパ球の増大を反映していることを示した（表Ｇ１）。抗ＩＬ−１０処置マウスからの腹膜洗液細胞の表面遺伝標識表現型決定により、Ｌｙ１鮮明Ｉｇ陰性細胞（図３７）、ＣＤ３陽性Ｉｇ陰性細胞、Ｍａｃ１鮮明Ｉｇ陰性細胞（図３８）および８Ｃ５鮮明Ｉｇ陰性細胞の増加が示された。これらの分析は、Ｌｙ１陽性、ＣＤ３陽性のＴリンパ球の増加を示し、そしてＭａｃ１および８Ｃ５表面遺伝標識を発現する顆粒球の増加を確証する（表Ｇ１）。
実施例Ｇ５
抗ＩＬ−１０処置マウスは胸腺非依存性抗原ＴＮＰ−フィコールに対して応答する。
特異的抗体応答
ＴＮＰ−フィコールに対する特異的抗体応答は、ＴＮＰ−フィコール（ジェームズ・モンド博士、ＵＳＵＨＳによって提供された）１０μｇをマウスの腹腔内に試験投与し且つ５日または１０日後に血清を集めた後に決定された。抗ＩＬ−１０または対照抗体の注射は、抗原の試験投与と血清採集との間継続された。ＴＮＰ特異的抗体はエリザを用いて定量された。
抗ＩＬ−１０処置マウスは、２種類の胸腺非依存ＩＩ型抗原であるホスホリルコリンおよびα１，３デキストランに対するインビボ抗体応答を引出すそれらの能力を欠失している。図３９は、抗ＩＬ−１０処置マウスが、第三の胸腺非依存ＩＩ型抗原であるＴＮＰ−フィコールに対して正常なインビボ抗体応答を生じることを示す。この応答性は、抗ＩＬ−１０処置マウスからの脾臓Ｂ細胞が、胸腺非依存ＩＩ型抗原の推定上の多クローン性類似体である抗ＩｇＭ抗体による刺激後に正常の増殖応答を生じるという本発明者の従来の観察報告と一致する。
実験Ｈ
抗ＩＬ−１０抗体の継続した投与は、ＮＺＢ／Ｗマウスにおける自己免疫の開始を遅らせる。
概要
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対する抗ＩＬ−１０抗体の継続した投与は、「狼瘡傾向のある」ＮＺＢ／Ｗマウスにおいて自己免疫の発生をもたらすことが知られている３種類の免疫媒介物質である自己抗体、プレクス（ｐｌｅｘ）ＴＮＦαおよびＩＦＮγの内因性濃度を変更する。ＮＺＢ／ＷマウスにおけるＩＬ−１０中和の結果を探求するために、被験動物に抗ＩＬ−１０抗体またはイソタイプ対照抗体を誕生から８〜１０か月まで週に２〜３回注射した。抗ＩＬ−１０処置は、全体の生存率によってかまたは、タンパク尿、腎炎若しくは自己抗体の発生によって監視されるＮＺＢ／Ｗマウスにおける自己免疫の開始を実質的に遅らせた。９か月目の生存率は、被処置マウスにおいては対照に相対して１０％〜８０％増加した。自己免疫に対するこの防護は、中和性抗ＴＮＦα抗体を、長期間抗ＩＬ−１０処置されたマウス中に３０週目に導入した場合に、防護されたＮＺＢ／Ｗマウスが速やかに自己免疫を生じたことから、内因性ＴＮＦαの抗ＩＬ−１０に誘導されたアップレギュレーションに依ると考えられた。これらのデータは、ＩＬ−１０アンタゴニストがヒト全身性エリテマトーデスの治療において有益であることを示す。
（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１ハイブリッドマウスは、ヒトの全身性エリテマトーデスによく似た苛酷な自己免疫疾患を発症する。ＮＺＢ／Ｗマウスは、致命的な免疫複合体に媒介された糸球体腎炎を、雌では約６〜９か月目に、そして雄では１２〜１８か月目に自発的に発症する。ＮＺＢ／Ｗマウスにおける自己免疫の根本的な原因を定義するための従来の試みは、ＭＨＣ遺伝子に可能な役割に対して集中していた。実際に、様々な細胞種におけるＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現をアップレギュレートするサイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）は、ＮＺＢ／Ｗマウスにおいて自己免疫の発生を促進する。いくつかの最近の研究は、ＭＨＣ複合体中に位置するＴＮＦα遺伝子が、ＮＺＢ／Ｗマウスの狼瘡腎炎の発病に関与していることがあるということを示唆した。これらの研究は、ＮＺＢ／Ｗマウスが例外的に低濃度のＴＮＦαを生産すること並びにこれはＴＮＦα遺伝子ｊの制限断片長多型およびＴＮＦα遺伝子の５′調節領域の単純なジヌクレオチドタンデム反復の多型性と相関することを示す。これらの観察報告の原因となる役割は、組換体ＴＮＦαによる置換療法がＮＺＢ／Ｗマウスの腎炎の発症を有意に遅らせるという事実によって暗示される。
ＩＬ−１０は、インビトロ検定においてマウスおよびヒトの種々の免疫刺激および免疫抑制性双方を媒介する活性Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージのサブセットによって生産されるサイトカインである。ＩＬ−１０の生理学的役割を評価する最近の研究において、ＢＡＬＢ／ｃマウスを中和性抗ＩＬ−１０抗体で誕生から８週令まで継続して処置した。ＩＬ−１０の既知のインビトロの性質と一致して、抗ＩＬ−１０処置マウスは、高濃度の内因性ＩＦＮγおよびＴＮＦαを特徴とする。高濃度のＩＦＮγは、引続き、大部分のネズミ自己抗体が由来する集団であるＬｙ１またはＣＤ５またはＢ−１ Ｂ細胞と称するＢリンパ球の数的に少数のサブセットの枯渇をもたらす。正常マウスでのこれらの研究は、ＩＬ−１０の中和が、ＮＺＢ／Ｗマウスにおいて若干の望ましい結果、すなわち、内因性ＴＮＦαの増加および自己抗体生産の減少並びに若干の望ましくない結果、すなわち、内因性ＩＦＮγの増加を生じることがあるということを示唆した。ＮＺＢ／Ｗ雌マウスにおける自己免疫の発生に対する継続した抗ＩＬ−１０処置の全作用をここで実験する。ＩＬ−１０の中和がこれらのマウスでの自己免疫の開始を有意に遅らせるというデータは、内因性ＴＮＦαのアップレギュレーションに依る。
マウス
ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウスをＤＮＡＸリサーチ・インスティトゥートの動物集団中において、ジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（バー・ハーバー、ＭＥ）から購入したＮＺＢの雌およびシモンセン・ラボラトリーズ（ギルロイ、ＣＡ）から購入したＮＺＷの雄を用いて繁殖させた。自己免疫のより速い開始ゆえに、雌のＦ１マウスのみを用いた。
抗ＩＬ−１０処置
Ｂ／Ｗ Ｆ１雌マウス１７〜２３匹の群を、ＳＸＣ．１またはＪＥＳ ２Ａ５と称するＩＬ−１０に対するラットＩｇＭ ｍＡｂまたはＩｇＧ ｍＡｂで処置した。令のそろったＢ／Ｗ Ｆ１雌マウス２１〜２３匹／群を、Ｊ５／Ｄ（ＩｇＭ）またはＧＬ１１３（ＩｇＧ）と称するイソタイプ適合対照ｍＡｂで処置した。抗ＩＬ−１０ｍＡｂおよびイソタイプ対照ｍＡｂは、ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスから腹水として採集し、２連続硫酸アンモニウム沈殿によって精製し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に対して透析し、そしてタンパク質電気泳動および光学濃度の測定によって定量した。処置は３部分から成り、すなわち、（ａ）誕生から第１週までｍＡｂ０．２ｍｇ／マウスを、ＩｇＭで４回／週またはＩｇＧで２回／週腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、（ｂ）第２週に、ｍＡｂ０．５ｍｇ／マウスをＩｇＭで３回／週またはＩｇＧで２回／週腹腔内注射し、そして（ｃ）第３週から成体まで、ｍＡｂ１ｍｇ／マウスをＩｇＭで３回／週またはＩｇＧで２回／週腹腔内注射した。予備実験により、この計画はマウス血清中のラットＩｇＭ濃度を約５０μｇ／ｍｌに維持することができることが示された。
腎臓疾患の評価
タンパク尿は、アルブスティクス（Ａｌｂｕｓｔｉｘ）ディップスティック（マイルス・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、エルクハート、ＩＮ）を用いて比色定量的に測定し、そして以下のコードにしたがって等級を付けた。すなわち、痕跡＝１０ｍｇ／ｄｌ；１＋＝３０ｍｇ／ｄｌ；２＋＝１００ｍｇ／ｄｌ；３＋＝３００ｍｇ／ｄｌ；４＋＝１，０００ｍｇ／ｄｌ。糸球体腎炎の組織学的苛酷さは、組織病理学的変化の強さおよび範囲に基づく０〜２＋のスケールで等級を付け、０＝糸球体病変のない腎臓；１＋＝軽い病変、例えば、増大したメサンギウム基質、メサンギウム／糸球体細胞性、半月形成、または炎症性滲出液および被膜癒着の存在；顕著な腎円柱なし；２＋＝苛酷な病変、例えば、広範囲の腎円柱形成によって７０％を越える糸球体が閉塞した糸球体構造であった。
自己抗体エリザ
二本鎖または一本鎖ＤＮＡに特異的な血清抗体（ｄｓ−またはｓｓ−ＤＮＡ）をエリザによって定量した。簡単にいえば、ｄｓ−またはｓｓ−ＤＮＡ５ｍｇ／ｍｌを４℃で一晩中のインキュベーションにおいて用いてエリザプレート（フロー・ラボラトリーズ、マクリーン、ＶＡ）を切断した。次に、抗原で被覆されたプレートを、０．０５％トゥイーン２０，０．０２％ＮａＮ3含有ＰＢＳで１時間ブロックした後、１：１００に希釈した被験または標準血清と一緒に室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ−０．０５％トゥイーン２０で洗浄し、そして西洋ワサビ大根のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）１μｇ／ｍｌを結合した抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ（ザイムド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド（Ｚｙｍｅｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）Ｓ．サン・フランシスコ、ＣＡ）と一緒に１時間インキュベートした。Ｖｍａｘマイクロプレートリーダー（モレキュラー・ディバイシズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、メンロ・パーク、ＣＡ）を用いて、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンチアゾリン−６−スルホン酸）；ＡＢＴＳ（シグマ。ケミカルズ、セント・ルイス、ＭＯ）１ｍｇ／ｍｌを加えて３０分後に吸光度を測定した。抗ＤＮＡ力価は、シェリング・プラウ・コーポレーションのシェルビー・ウムランド博士（Ｄｒ．Ｓｈｅｌｂｙ Ｕｍｌａｎｄ）によって提供された４月令のＭＲＬ／ＭｐＪ−ｌｐｒマウスからプールされた血清の対照標準を用いる単位として表わされた。この標準血清の１：１００希釈液を、便宜上、１００単位であると仮定した。
ＩｇおよびＴＮＦαの血清濃度
Ｉｇエリザに関して、ヤギ抗マウスＩｇＧ（キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ゲイサーズバーグ、ＭＤ）で被覆されたプレートを、１：１０００または１：５０００希釈の被験血清と一緒に、続いてＨＲＰ結合ヤギ抗ＩｇＧまたは抗ＩｇＭ（ザイムド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド）と一緒にインキュベートし、そして発色させた。ＩｇＧおよびＩｇＭ濃度は、骨髄腫タンパク質の混合物である既知の濃度の本発明者の原液と一緒にインキュベートすることによって作成された標準曲線から決定された。
ＴＮＦαエリザに関して、ラット抗マウスＴＮＦα ｍＡｂ（ＭＰ６−ＸＴ３．１１）で被覆されたプレートを、１：１０希釈の被験血清と一緒に、続いてＨＲＰ結合ラット抗マウスＴＮＦα ｍＡｂ（ＭＰ６−ＸＴ２２）と一緒にインキュベートし、そして発色させた。
本出願人は、ｐＨ５Ｃ、ｐＨ１５ＣおよびｐＢＣＲＦ１（ＳＲａ）を有する大腸菌ＭＣ１０６１の別個の培養物を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル、ＭＤ、米国（ＡＴＣＣ）にそれぞれ受託番号６８１９１、６８１９２および６８１９３として寄託した。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託に関するＡＴＣＣの承認に基づいて与えられる条件に基づいて行なったものであり、それによって、その寄託は、米国成文法３５条１２２および米国規制基準３７条１．１４に従って米国特許商標局長に対して利用可能にさせるものであることおよび米国特許証の公的発行に対して利用可能にさせるものであることが補償され、それによって寄託が維持されることが必要とされる。寄託された菌株の入手可能性は、いかなる政府のその特許法による代理権に基づいて付与された権利に違反して本発明を実施する許可として解釈するべきではない。
寄託は、１９８９年１２月２０日に行なわれ、そしてブダペスト条約の要件を満たすように修正された。
ＴＲＰＣ１１プラスミドの図。［実施例３を参照されたい］ ＩＬ−４、ｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０は、ＩＬ−２で活性化された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）による（Ａ）ＩＦＮγおよび（Ｂ）ＴＮＦα合成を阻害する。ＮＤは測定されなかった。エラーバーは一つの実験での二重反復試験試料の範囲を示す。異なるドナーからのＰＭＢＣは、ＩＬ−２によって刺激された場合、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを生産する能力が異なった。ＩＬ−４およびＩＬ−１０の阻害作用は、それぞれ（ｃ）抗ＩＬ−４および（ｄ）抗ＩＬ−１０中和抗体によって逆行する。ＰＢＭＣを、実験の項に記載したように、組換体ＩＬ−２（ｒＩＬ−２）２００Ｕ／ｍｌおよび種々の量のｒＩＬ−４かまたはＣＯＳ細胞で生産されたヒトＩＬ−１０（ＣＯＳ−ｈＩＬ−１０）と一緒に中和性抗サイトカイン１０μｇ／ｍｌまたはイソタイプ対照免疫グロブリンの存在下で培養した。抗体およびサイトカインを、ＰＢＭＣを加える前に３０分間インキュベートした。 （Ａ）ＩＬ−４は、ＰＢＭＣ中のＩＬ−２によって誘導されたリンパ球活性化キル（ＬＡＫ）活性を阻害するが、ヒトＩＬ−１０（ｈＩＬ−１０）またはウイルスＩＬ−１０（ｖＩＬ−１０）はこれを阻害しない。図２の場合と同様の実験によるＰＢＭＣを上澄みと一緒に採集し、そして５１Ｃｒ標識ＣＯＬＯ（結腸癌、図３Ａ１）およびダウディ（バーキットリンパ腫、図３Ａ２）細胞に対するその細胞毒性を検査した。 （Ｂ）ＬＡＫ活性は、ＩＬ−２およびＩＬ−１０と一緒に培養されたＰＢＭＣ中のＣＤ５６＋細胞によって発現される。ＰＢＭＣを、ＦＩＴＣに結合した抗ＣＤ−５６抗体で染色し、そしてファクスター・プラス（ＦａｃＳｔａｒ Ｐｌｕｓ）（ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、サン・ホセ、ＣＡ）で選別した。ＣＤ５６＋およびＣＤ５６−（純度９９．７％）部分の細胞毒活性を検査した。ＩＬ−２のみを有するＰＢＭＣの培養物由来の細胞と同様の結果が得られた。 （Ａ）精製ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導ＩＦＮγ合成はＩＬ−４によって直接的に阻害されるが、ｈＩＬ−１０によってもｖＩＬ−１０によっても阻害されない。ＦＡＣＳで精製したＮＫ細胞（純度＞９９．５％）を細胞１０6個／ｍｌで、２００単位／ｍｌのｒＩＬ−２と、５００単位／ｍｌのｒＩＬ４かまたはイセル（Ｙｓｓｅｌ′ｓ）培地中のＣＯＳ−ｈＩＬ−１０、ＣＯＳ−ｖＩＬ−１０か若しくはＣＯＳ−模擬上澄み（１０％）と一緒に４〜５日間培養した後、二重反復試験培養物からの上澄みを集め且つエリザによるＩＦＮγの測定用に混合した。 （Ｂ）精製ＮＫ細胞およびＰＢＭＣによるＩＬ−２誘導増殖はＩＬ−４によって阻害されるが、ｈＩＬ−１０／ｖＩＬ−１０によって阻害されない（図４Ｂ１：選別されたＮＫ；図４Ｂ２：ＰＢＬ）。 （Ａ）Ｔ細胞ではない付着細胞の添加は、精製ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導ＩＦＮγ合成のＩＬ−１０に媒介された阻害を回復した。 （Ｂ）精製された単球の添加は、精製ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導ＩＦＮγ合成のＩＬ−１０に媒介された阻害を回復した。単球単独では、検出可能な量より少ないＩＦＮγを生じた。エラーバーは一つの実験の二重反復試験試料の範囲を示す。ＩＬ−２不存在下のＩＦＮγ生産は検出限界未満であった（図２）。異なるドナーからのＮＫ細胞は、ＩＦＮγを生産する能力が異なった。 （Ｃ）ＮＫ細胞、ＣＤ１４＋細胞および両方の細胞種並存によるＩＬ−２誘導ＴＮＦα合成に対するＩＬ−１０の効果。ＮＫ細胞（細胞１０6個／ｍｌ）および／またはＣＤ１４＋細胞（細胞３ｘ１０５個／ｍｌ）を、４００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２および１０％ＣＯＳ−ｈＩＬ−１０上澄みの存在下または不存在下で５日間培養した。 ＬＰＳによって活性化されたヒト単球によるＩＬ−１０生産の速度論。遠心水簸によって単離されたヒト単球をテフロンバッグ中において（細胞４ｘ１０6個／ｍｌ）ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下で培養し、そして（Ａ）ＩＬ−１０の生産を、サイトカイン特異的エリザによって指示された時間に採集された培養物上澄み中で決定した。 ＬＰＳによって活性化されたヒト単球によるＩＬ−６生産の速度論。遠心水簸によって単離されたヒト単球をテフロンバッグ中において（細胞４ｘ１０6個／ｍｌ）ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下で培養し、そして（Ｂ）ＩＬ−６の生産を、サイトカイン特異的エリザによって指示された時間に採集された培養物上澄み中で決定した。 ＬＰＳによって活性化されたヒト単球によるＴＮＦα生産の速度論。遠心水簸によって単離されたヒト単球をテフロンバッグ中において（細胞４ｘ１０6個／ｍｌ）ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下で培養し、そして（Ｃ）ＴＮＦαの生産を、サイトカイン特異的エリザによって指示された時間に採集された培養物上澄み中で決定した。 ＬＰＳによって活性化されたヒト単球によるＧＭ−ＣＳＦ生産の速度論。遠心水簸によって単離されたヒト単球をテフロンバッグ中において（細胞４ｘ１０6個／ｍｌ）ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下で培養し、そして（Ｄ）ＧＭ−ＣＳＦの生産を、サイトカイン特異的エリザによって指示された時間に採集された培養物上澄み中で決定した。 ＬＰＳの増大する濃度に応答したヒト単球によるＩＬ−１０の生産。ヒト単球（細胞４ｘ１０6個／ｍｌ）をテフロンバッグ中において増大する濃度のＬＰＳと一緒に２４時間培養し、そしてＩＬ−１０の生産をエリザによって決定した。 ＩＦＮγ、ＬＰＳまたはＬＰＳおよびＩＦＮγによって活性化された単球によるサイトカインの生産に対するＩＬ−１０の効果。ヒト単球（細胞４ｘ１０6個／ｍｌ）を、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）、１、１０、１００または１０００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ並びにＬＰＳ（１、１０、１００または１０００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）の組合わせと一緒に、ＩＬ−１０（１００Ｕ／ｍｌ）の不存在下（中抜き棒）かまたは存在下（斜線棒）で２４時間培養し、そして（Ａ）ＩＬ−１αの生産をサイトカイン特異的エリザによって上澄み中において決定した。 ＩＦＮγ、ＬＰＳまたはＬＰＳおよびＩＦＮγによって活性化された単球によるサイトカインの生産に対するＩＬ−１０の効果。ヒト単球（細胞４ｘ１０6個／ｍｌ）を、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）、１、１０、１００または１０００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ並びにＬＰＳ（１、１０、１００または１０００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）の組合わせと一緒に、ＩＬ−１０（１００Ｕ／ｍｌ）の不存在下（中抜き棒）かまたは存在下（斜線棒）で２４時間培養し、そして（Ｂ）ＩＬ−１βの生産をサイトカイン特異的エリザによって上澄み中において決定した。 ＩＦＮγ、ＬＰＳまたはＬＰＳおよびＩＦＮγによって活性化された単球によるサイトカインの生産に対するＩＬ−１０の効果。ヒト単球（細胞４ｘ１０6個／ｍｌ）を、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）、１、１０、１００または１０００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ並びにＬＰＳ（１、１０、１００または１０００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）の組合わせと一緒に、ＩＬ−１０（１００Ｕ／ｍｌ）の不存在下（中抜き棒）かまたは存在下（斜線棒）で２４時間培養し、そして（Ｃ）ＩＬ−６の生産をサイトカイン特異的エリザによって上澄み中において決定した。 ＩＦＮγ、ＬＰＳまたはＬＰＳおよびＩＦＮγによって活性化された単球によるサイトカインの生産に対するＩＬ−１０の効果。ヒト単球（細胞４ｘ１０6個／ｍｌ）を、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）、１、１０、１００または１０００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ並びにＬＰＳ（１、１０、１００または１０００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）の組合わせと一緒に、ＩＬ−１０（１００Ｕ／ｍｌ）の不存在下（中抜き棒）かまたは存在下（斜線棒）で２４時間培養し、そして（Ｄ）ＴＮＦαの生産をサイトカイン特異的エリザによって上澄み中において決定した。 ＩＦＮγ、ＬＰＳまたはＬＰＳおよびＩＦＮγによって活性化された単球によるサイトカインの生産に対するＩＬ−１０の効果。ヒト単球（細胞４ｘ１０6個／ｍｌ）を、ＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）、１、１０、１００または１０００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ並びにＬＰＳ（１、１０、１００または１０００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）の組合わせと一緒に、ＩＬ−１０（１００Ｕ／ｍｌ）の不存在下（中抜き棒）かまたは存在下（斜線棒）で２４時間培養し、そして（Ｅ）ＧＭ−ＣＳＦの生産をサイトカイン特異的エリザによって上澄み中において決定した。 ＬＰＳによって活性化した単球によるＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦの生産に対するヒトＩＬ−１０またはウイルスＩＬ−１０の効果。ヒト単球（細胞４ｘ１０6個／ｍｌ）をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）によって活性化し且つヒトＩＬ−１０（１００Ｕ／ｍｌ）またはウイルスＩＬ−１０と一緒に中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂ １９Ｆ１（１０μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下で２４時間培養し、そして（Ａ）ＴＮＦαまたは（Ｂ）ＧＭ−ＣＳＦの生産をサイトカイン特異的エリザによって決定した。 ＬＰＳによって活性化したヒト単球によるサイトカイン特異的ｍＲＮＡレベルの発現に対する外因性ＩＬ−１０、内因的に生じたＩＬ−１０およびＩＬ−４の効果。ヒト単球（細胞４ｘ１０6個／ｍｌ）を培地中において４℃および３７℃で培養しまたはＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（１００Ｕ／ｍｌ）および中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂ １９Ｆ１（１０μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下においてＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）によって活性化し、そしてｍＲＮＡを２４時間後に単離した。β−アクチン、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの発現を、サイトカイン特異的プライマーを用いるＰＣＲ分析に続いて内部プローブを用いる反応生成物のサザンブロッティングにより、逆転写されたｍＲＮＡで決定した。ＣＤ４+Ｔ細胞クローンから得られたｃＤＮＡは、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦの発現に関する対照として包含された。 ＬＰＳによって活性化したヒト単球によるサイトカイン特異的ｍＲＮＡレベルの発現に対するＩＬ−１０の効果。ｍＲＮＡをヒト単球（細胞４ｘ１０6個／ｍｌ）から単離し、ＩＬ−１０（１００Ｕ／ｍｌ）の不存在下または存在下においてＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）によって７時間活性化し、そしてＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＧＦβおよびβ−アクチンの発現をノザン分析によって決定した。 ＬＰＳによって活性化したヒト単球によるＩＬ−１０およびＴＧＦβ特異的ｍＲＮＡレベルの発現に対する外因性ＩＬ−１０、内因的に生じたＩＬ−１０およびＩＬ−４の効果。ヒト単球（細胞４ｘ１０6個／ｍｌ）を培地中において４℃および３７℃で培養しまたはＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（１００Ｕ／ｍｌ）および中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂ １９Ｆ１（１０μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下においてＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）によって活性化した。ｍＲＮＡを２４時間後に単離した。（Ａ）ＩＬ−１０、（Ｂ）ＴＧＦβおよびβ−アクチンの発現をノザン分析によって決定し、そして（Ｂ）ＩＬ−１０の発現を、サイトカイン特異的プライマーを用いるＰＣＲ分析に続いて内部プローブを用いる反応生成物のサザンブロッティングにより、逆転写されたｍＲＮＡで決定した。 ＬＰＳによって活性化したヒト単球によるクラスＩＩ ＭＨＣ発現に対する内因的に生じたＩＬ−１０の効果。ヒト単球を（Ａ）０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと一緒に中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂ １９Ｆ１（１０μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下において４０時間培養した。ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ（Ｑ５／１３）の発現を間接免疫蛍光法によって決定した。 ＬＰＳによって活性化したヒト単球によるクラスＩＩ ＭＨＣ発現に対する内因的に生じたＩＬ−１０の効果。ヒト単球を（Ｂ）０．１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと一緒に中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂ １９Ｆ１（１０μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下において４０時間培養した。ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ（Ｑ５／１３）の発現を間接免疫蛍光法によって決定した。 ＬＰＳによって活性化したヒト単球によるクラスＩＩ ＭＨＣ発現に対する内因的に生じたＩＬ−１０の効果。ヒト単球を（Ｃ）１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと一緒に中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂ １９Ｆ１（１０μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下において４０時間培養した。ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ（Ｑ５／１３）の発現を間接免疫蛍光法によって決定した。 ＬＰＳによって活性化したヒト単球によるクラスＩＩ ＭＨＣ発現に対する内因的に生じたＩＬ−１０の効果。ヒト単球を（Ｄ）１０００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと一緒に中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂ １９Ｆ１（１０μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下において４０時間培養した。ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ（Ｑ５／１３）の発現を間接免疫蛍光法によって決定した。 マクロァージ細胞系のＡＰＣ機能に対するＩＬ−１０の効果。上段（図１４Ａ）：マクロファージ細胞系１Ｇ１８．ＬＡまたはＰＵ５．１（細胞１０6個／ｍｌ）をＩＦＮγ（２ｎｇ／ｍｌ）で活性化させた。次に、これらのＡＰＣを洗浄し且つＨＤＫ．１ Ｔｈ１細胞（細胞５ｘ１０4個／ウェル）および抗原（ＴＮＰ−ＫＬＨ、１０μｇ／ｍｌ）と一緒に、精製ＩＬ−１０（２００単位／ｍｌ）の存在下（□）または不存在下（■）でインキューベートした（細胞１０5個／ウェル）。上澄みを４８時間後に集め、そしてＩＦＮγの検査をした。下段（図１４Ｂ）：マクロファージ１Ｇ１８．ＬＡを上記のように活性化させた後、ＴＮＰ−ＫＬＨ（１０μｇ／ｍｌ）を加えたＨＤＫ．１ Ｔｈ１細胞（細胞５ｘ１０4個／ウェル）；かまたはオボアルブミン（２．５ｍｇ／ｍｌ）を加えたＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマ（細胞５ｘ１０4個／ウェル）と一緒に、精製ＩＬ−１０（下段）（２００単位／ｍｌ）の存在下（□）または不存在下（■）でインキューベートした（細胞１０5個／ウェル）。上澄みを２０時間後に集め、そしてＩＬ−２の検査をした。全パネルにおいて、三重反復試験培養物の平均値およびＳＤを示す。 ＩＬ−１０は、精製された腹膜マクロファージにおいて形態学的変化を引起こす。腹膜マクロファージ（Ｍａｃ−１＋、鮮明、Ｂ２２０−）をＦＡＣＳで精製した後、ＩＦＮγ（２ｎｇ／ｍｌ）（上段、図１５Ａ）またはＩＬ−１０（２００単位／ｍｌ）を加えたＩＦＮγ（２ｎｇ／ｍｌ）（下段、図１５Ｂ）の存在下で７２時間インキュベートした。上澄みを除去し、細胞を自然乾燥させ、固定し、そしてライト・ギムザで染色し、乾燥させた後、写真をとった。 ＩＬ−１０は、マクロファージ細胞系によるＬＰＳに誘導されたＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６タンパク質の生産を阻害する。マクロファージ細胞系１Ｇ１８．ＬＡ（図１６Ａ、ＢおよびＣ）を、示されたように、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）；またはＩＦＮγ（２ｎｇ／ｍｌ）を加えたＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）と一緒に；ＩＬ−１０またはＩＬ−４（若干の場合）を双方とも２００単位／ｍｌでの存在下または不存在下でインキュベートした（細胞１０6個／ｍｌ）。上澄みを集め、そしてそれらのＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＮＦ−α濃度を検査した。 ＩＬ−１０は、マクロファージ細胞系によるＬＰＳに誘導されたＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６タンパク質の生産を阻害する。マクロファージ細胞系ＰＵ５．１（図１６Ｄ、ＥおよびＦ）を、示されたように、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）；またはＩＦＮγ（２ｎｇ／ｍｌ）を加えたＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）と一緒に；ＩＬ−１０またはＩＬ−４（若干の場合）を双方とも２００単位／ｍｌでの存在下または不存在下でインキュベートした（細胞１０6個／ｍｌ）。上澄みを集め、そしてそれらのＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＮＦ−α濃度を検査した。 （Ａ）。ＩＬ−１０は、マクロファージ細胞系におけるＬＰＳに誘導されたＴＮＦ−αＲＮＡの発現を阻害する。マクロファージ細胞系１Ｇ１８．ＬＡを図１６の場合と同様に刺激した。上澄みを６時間後に除去し、そしてＲＮＡ調製用に細胞を採集する際にイソチオシアン酸グアニジウム溶液を加えた。適宜に刺激された細胞系１Ｇ１８．ＬＡの試料の全ＲＮＡの１０μｇをゲルに充填し、ブロットした後、ＴＮＦαおよびアクチンをプローブした。 （Ｂ１）。ＩＬ−１０は、マクロファージ細胞系におけるＬＰＳに誘導されたＴＮＦ−αＲＮＡの発現を阻害する。マクロファージ細胞系１Ｇ１８．ＬＡを図１６の場合と同様に刺激した。上澄みを６時間後に除去し、そしてＲＮＡ調製用に細胞を採集する際にイソチオシアン酸グアニジウム溶液を加えた。適宜に刺激された細胞系１Ｇ１８．ＬＡの試料の全ＲＮＡの１０μｇをゲルに充填し、ブロットした後、ＴＮＦαおよびアクチンをプローブした。 （Ｂ２）。ＩＬ−１０は、マクロファージ細胞系におけるＬＰＳに誘導されたＴＮＦ−αＲＮＡの発現を阻害する。マクロファージ細胞系１Ｇ１８．ＬＡを図１６の場合と同様に刺激した。上澄みを６時間後に除去し、そしてＲＮＡ調製用に細胞を採集する際にイソチオシアン酸グアニジウム溶液を加えた。適宜に刺激された細胞系１Ｇ１８．ＬＡの試料の全ＲＮＡの１０μｇをゲルに充填し、ブロットした後、ＴＮＦαおよびアクチンをプローブした。 （Ｃ）。ＩＬ−１０は、マクロファージ細胞系におけるＬＰＳに誘導されたＴＮＦ−αＲＮＡの発現を阻害する。マクロファージ細胞系１Ｇ１８．ＬＡを図１６の場合と同様に刺激した。上澄みを６時間後に除去し、そしてＲＮＡ調製用に細胞を採集する際にイソチオシアン酸グアニジウム溶液を加えた。適宜に刺激された細胞系１Ｇ１８．ＬＡの試料の全ＲＮＡの１０μｇをゲルに充填し、ブロットした後、ＴＮＦαおよびアクチンをプローブした。 腹膜マクロファージの刺激。ＩＬ−１０は、腹膜マクロファージによるＬＰＳに誘導されたＩＬ−６タンパク質の合成を阻害する。腹膜マクロファージ（Ｍａｃ−１+,鮮明、Ｂ２２０-）をＦＡＣＳで精製した後、単独でまたは、ＩＬ−１０（２００単位／ｍｌ）、抗ＩＬ−１０（１０μｇ／ｍｌ）若しくはＩＦＮγ（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下においてＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）と一緒に、細胞７ｘ１０5個／ｍｌでインキュベートした。上澄みを採集し、そして特異的免疫検定（エリザ）を用いる既知の標準に相対するそのＩＬ−６濃度を検査した。 ＩＬ−１０は、マクロファージからの可溶性同時刺激剤をダウンレギュレートしないしまたは可溶性阻害剤を誘導しない。（Ａ）上澄みは、ＩＦＮγで２４時間刺激後にＴｈ１細胞（ＨＤＫ−１、細胞２ｘ１０5個／ｍｌ）および抗原（ＫＬＨ、５００μｇ／ｍｌ）で２４時間更に刺激後のマクロファージ細胞系１Ｇ１８．ＬＡから得た。上澄みを濃縮しそしてＩＦＮγおよびＩＬ−２を枯渇させた後にＣＳＩＦ検定において用いた。これらの上澄み単独には、それ自体で検出可能な濃度のＩＦＮγが含まれていなかった。ＩＦＮγで活性化した１Ｇ１８．ＬＡマクロファージＡＰＣ（細胞１０5個／ウェル）を細胞ＨＤＫ−１（細胞５ｘ１０4個／ウェル）および抗原（ＴＮＰ−ＫＬＨ、１０μｇ／ｍｌ）のみと一緒に（△）または上記上澄み（最終濃度２５％）を加えた（□）か若しくは除いた（▲）種々の用量のＩＬ−１０の存在下でインキュベートした。ＣＳＩＦ検定からの上澄みを４８時間後に集め、そしてそのＩＦＮγ濃度を検定した。一つの実験での三重反復試験培養物の平均値およびＳＤを示す。（Ｂ）勾配用量の精製した脾臓マクロファージをＩＬ−１０の不存在下（■）若しくは存在下（□）（２００単位／ｍｌ）において；または勾配用量の精製マクロファージとＢ細胞（細胞２．５ｘ１０3個／ウェル）との混合物をＩＬ−１０の不存在下（●）若しくは存在下（○）（２００単位／ｍｌ）において；またはＢ細胞のみをＩＬ−１０の不存在下（ ）若しくは存在下（ ）（２００単位／ｍｌ）において、ＴＮＰ−ＫＬＨ（１０μｇ／ｍｌ）を用いるＨＤＫ−１ Ｔｈ１クローン（細胞１０4個／ウェル）のためのＡＰＣとして用いた。４８時間後に上澄みを集め、そしてそのＩＦＮγを検定した。三重反復試験培養物の平均値およびＳＤを示す。 ＩＬ−１０は、Ｂａｌｂ／ＣマウスにおいてＳＥＢに誘導された毒性を防止する。図２０Ａ：ＳＥＢ２０μｇ／ｄ−Ｇａｌ３０ｍｇ；図２０Ｂ：ＩＬ−１０／ＳＥＢ２０μｇ／ｄ−Ｇａｌ３０ｍｇ；図２０Ｃ：ＳＥＢ１０μｇ／ｄ−Ｇａｌ３０ｍｇ；図２０Ｄ：ＩＬ−１０／ＳＥＢ１０μｇ／ｄ−Ｇａｌ３０ｍｇ；図２０Ｅ：ガラクトサミン３０ｍｇ；図２０Ｆ：ＩＬ−１０ １０μｇ。 ＩＬ−１０はマウスを致命的な内毒素血症から防護する。Ｂａｌｂ／ｃマウス２０匹の群に、ＬＰＳ３５０μｇを、またはＬＰＳ３５０μｇと種々の用量の精製組換体ネズミＩＬ−１０とを同時に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。引続き６日間にわたって致死を監視した。 抗ＩＬ−１０抗体は、致命的な内毒素血症からマウスを防護するＩＬ−１０の能力を中和する。ＬＰＳを投与する１時間前に、Ｂａｌｂ／ｃマウス２０匹の群に、抗ＩＬ−１０抗体２Ａ５を１ｍｇ（図２２Ａ）またはイソタイプ対照抗体ＧＬ１１３を１ｍｇ（図２２Ｂ）腹腔内に与えた。次に、図２１の説明に記載したように、マウスにＬＰＳ３５０μｇを単独でかまたは種々の用量のＩＬ−１０と同時に腹腔内注射した。 ＩＬ−１０は、ＬＰＳ注射の３０分後に投与された場合、致命的な内毒素血症からマウスを防護する。Ｂａｌｂ／ｃマウス２０匹の群に、ＬＰＳ３５０μｇを時間０において腹腔内に、そして組換体ＩＬ−１０の１．０μｇをＬＰＳ注射後の時間０、０．５時間、１時間、２時間または５時間に腹腔内に与えた。ＩＬ−１０不存在下でＬＰＳを３５０μｇ腹腔内に与えられた対照マウスはこの実験において全て死亡した。 抗ＩＬ−１０処置および対照マウスから得られた全生存腹膜洗浄細胞による表面ＩｇＭおよびＩｇＤ発現の免疫蛍光法分析。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、誕生から８週間まで、実験の項に記載したように、何もしなかった（図２４Ａ）。結果は、各実験群から計数された５，０００個の生存細胞の蛍光強度を示す。 抗ＩＬ−１０処置および対照マウスから得られた全生存腹膜洗浄細胞による表面ＩｇＭおよびＩｇＤ発現の免疫蛍光法分析。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、誕生から８週間まで、実験の項に記載したように、イソタイプ対照抗体Ｊ５／Ｄを注射した（図２４Ｂ）。結果は、各実験群から計数された５，０００個の生存細胞の蛍光強度を示す。 抗ＩＬ−１０処置および対照マウスから得られた全生存腹膜洗浄細胞による表面ＩｇＭおよびＩｇＤ発現の免疫蛍光法分析。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、誕生から８週間まで、実験の項に記載したように、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を注射した（図２４Ｃ）。結果は、各実験群から計数された５，０００個の生存細胞の蛍光強度を示す。 抗ＩＬ−１０処置および対照マウスから得られた全生存腹膜洗浄細胞による表面ＩｇＭおよびＩｇＤ発現の免疫蛍光法分析。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、誕生から８週間まで抗ＩＬ−１０抗体ＳＸＣ−１を注射した（図２４Ｄ）。結果は、各実験群から計数された５，０００個の生存細胞の蛍光強度を示す。 処置の８週間後に検査された抗ＩＬ−１０処置および対照マウスの血清ＩｇＭ濃度。結果は、各群における５個体の血清の幾何平均±ＳＥＭを示し、２種類の異なる実験からのデータがある。３種類の追加の実験により、同一結果が得られた。 α１，３−デキストラン（図２６Ｂ）またはホスホリルコリン（図２６Ａ）に対する抗ＩＬ−１０処置および対照マウスのインビボでの抗体応答。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、誕生から９週間まで抗ＩＬ−１０抗体ＳＸＣ．１、イソタイプ対照抗体Ｊ５／Ｄ、ＰＢＳを注射するかまたは未処置のままにした。８週目に、実験の項に記載したように、マウスにα１，３−デキストランまたは加熱殺菌した肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を試験投与した。結果は、５個体血清中で検出された特異的抗体濃度の幾何平均±ＳＥＭを示す。 ＳＸＣ．１抗ＩＬ−１０処置および対照マウスから得られた生存脾臓リンパ系細胞の表面Ｂ２２０およびＣＤ３発現の免疫蛍光法分析。更に詳細に関して、図２４の説明〜図２４Ａに対応する図２７Ａを参照されたい。 ＳＸＣ．１抗ＩＬ−１０処置および対照マウスから得られた生存脾臓リンパ系細胞の表面Ｂ２２０およびＣＤ３発現の免疫蛍光法分析。更に詳細に関して、図２４の説明〜図２４Ｂに対応する図２７Ｂを参照されたい。 ＳＸＣ．１抗ＩＬ−１０処置および対照マウスから得られた生存脾臓リンパ系細胞の表面Ｂ２２０およびＣＤ３発現の免疫蛍光法分析。更に詳細に関して、図２４の説明〜図２４Ｃに対応する図２７Ｃを参照されたい。 ＳＸＣ．１抗ＩＬ−１０処置および対照マウスから得られた生存脾臓リンパ系細胞の表面Ｂ２２０およびＣＤ３発現の免疫蛍光法分析。更に詳細に関して、図２４の説明〜図２４Ｄに対応する図２７Ｄを参照されたい。 抗ＩＬ−１０処置または対照マウスのＴＮＰ−ＫＬＨに対するインビボ応答。マウスに誕生から１０週令まで抗ＩＬ−１０抗体（●）またはイソタイプ対照（○）を注射した。８週目に、被験動物にＴＮＰ−ＫＬＨを１０μｇ腹腔内に試験投与した。ＴＮＰ特異的ＩｇＭ（図２８Ａ）およびＩｇＧ（図２８Ｂ）の血清濃度をそれぞれ免疫感作して７日および１４日後に決定した。結果は３種類の別個の実験を示し、各円は個々のマウスを示す。 抗ＩＬ−１０抗体は腹膜洗浄Ｂ細胞に対して直接的に細胞毒性ではない。非感作の８週令Ｂａｌｂ／ｃマウスに、抗ＩＬ−１０抗体１ｍｇ（ＳＸＣ．１−図２９、Ａ、ＢおよびＣ部分）またはイソタイプ対照１ｍｇ（Ｊ５／Ｄ−図２９、Ｄ、ＥおよびＦ部分）を腹腔内に注射した。腹膜洗浄細胞を別個の被験動物から１日、２日または３日後に集め、そして表面ＩｇＤおよびＩｇＭの同時発現を分析した。結果は、各実験群から計数された５，０００個の生存細胞の蛍光強度を示す。 抗ＩＬ−１０処置または対照マウスにおける血清ＩＦＮγ濃度。Ｂａｌｂ／ｃマウスに誕生から８週間まで抗ＩＬ−１０抗体（●）またはイソタイプ対照（○）を注射した。８週目に集められた血清のＩＦＮγを免疫検定によって分析した。結果は、５種類の別個の実験を示し、各円は個々のマウスを示す。 抗ＩＦＮγ抗体の同時投与は、マウスの腹膜Ｂ細胞を枯渇させる抗ＩＬ−１０処置の能力を低下させる。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、誕生から８週間まで抗ＩＬ−１０抗体（図３１Ｃ）；抗ＩＦＮγ抗体を加えた抗ＩＬ−１０（図３１Ｂ）で処置するか；または処置しなかった（図３１Ａ）。次に、腹膜洗浄細胞のＢ２２０およびＩｇＭの同時発現を分析した。結果は、各実験群から計数された５，０００個の生存細胞の蛍光強度を示す。 抗ＩＬ−１０処置マウスにおける８週目の血清ＴＮＦα濃度。マウスを、実験の項に記載したように、誕生から８週間まで抗ＩＬ−１０抗体ＳＸＣ．１（●）またはイソタイプに適合した対照抗体（○）で処置した。８週目に集められた血清のＴＦＮα含量をエリザによって検定した。結果は、５種類の別個の実験を示し、各円は個々のマウスを示す。 抗ＩＬ−１０処置マウスにおける血清ＩＬ−６濃度。誕生から８週間まで抗ＩＬ−１０抗体ＳＣＸ．１（●）またはイソタイプに適合した対照抗体（○）で処置したマウスから集められた血清のＩＬ−６含量をエリザによって検定した。結果は、５種類の別個の実験を示し、各円は個々のマウスを示す。 抗ＩＬ−１０処置マウスは、ＬＰＳに誘導されたショックの結果としての致死に対する増大した感受性を示す（ＡにおいてＬＰＳ５００μｇ）。マウスを誕生から８週令までＳＸＣ．１ラットＩｇＭ抗ＩＬ−１０抗体（●）、２Ａ５ラットＩｇＧ１抗ＩＬ−１０抗体（▲）または適当なイソタイプ対照抗体（○）（△）で処置した。８週目に、マウス（マウス５匹／群）に種々の用量のＬＰＳを腹腔内注射した。引続き４日間にわたって致死を監視した。 抗ＩＬ−１０処置マウスは、ＬＰＳに誘導されたショックの結果としての致死に対する増大した感受性を示す（ＢにおいてＬＰＳ４００μｇ）。マウスを誕生から８週令までＳＸＣ．１ラットＩｇＭ抗ＩＬ−１０抗体（●）、２Ａ５ラットＩｇＧ１抗ＩＬ−１０抗体（▲）または適当なイソタイプ対照抗体（○）（△）で処置した。８週目に、マウス（マウス５匹／群）に種々の用量のＬＰＳを腹腔内注射した。引続き４日間にわたって致死を監視した。 抗ＩＬ−１０処置マウスは、ＬＰＳに誘導されたショックの結果としての致死に対する増大した感受性を示す（ＣにおいてＬＰＳ１００μｇ）。マウスを誕生から８週令までＳＸＣ．１ラットＩｇＭ抗ＩＬ−１０抗体（●）、２Ａ５ラットＩｇＧ１抗ＩＬ−１０抗体（▲）または適当なイソタイプ対照抗体（○）（△）で処置した。８週目に、マウス（マウス５匹／群）に種々の用量のＬＰＳを腹腔内注射した。引続き４日間にわたって致死を監視した。 抗ＩＬ−１０処置マウスは、ＬＰＳに誘導されたショックの結果としての致死に対する増大した感受性を示す（ＤにおいてＬＰＳ５０μｇ）。マウスを誕生から８週令までＳＸＣ．１ラットＩｇＭ抗ＩＬ−１０抗体（●）、２Ａ５ラットＩｇＧ１抗ＩＬ−１０抗体（▲）または適当なイソタイプ対照抗体（○）（△）で処置した。８週目に、マウス（マウス５匹／群）に種々の用量のＬＰＳを腹腔内注射した。引続き４日間にわたって致死を監視した。 抗ＩＬ−１０処置マウスは、ＬＰＳに誘導されたショックの結果としての致死に対する増大した感受性を示す（ＥにおいてＬＰＳ５０μｇ）。マウスを誕生から８週令までＳＸＣ．１ラットＩｇＭ抗ＩＬ−１０抗体（●）、２Ａ５ラットＩｇＧ１抗ＩＬ−１０抗体（▲）または適当なイソタイプ対照抗体（○）（△）で処置した。８週目に、マウス（マウス５匹／群）に種々の用量のＬＰＳを腹腔内注射した。引続き４日間にわたって致死を監視した。 抗ＩＬ−１０処置マウスは、ＬＰＳに誘導されたショックの結果としての致死に対する増大した感受性を示す（ＦにおいてＬＰＳ１μｇ）。マウスを誕生から８週令までＳＸＣ．１ラットＩｇＭ抗ＩＬ−１０抗体（●）、２Ａ５ラットＩｇＧ１抗ＩＬ−１０抗体（▲）または適当なイソタイプ対照抗体（○）（△）で処置した。８週目に、マウス（マウス５匹／群）に種々の用量のＬＰＳを腹腔内注射した。引続き４日間にわたって致死を監視した。 抗ＩＬ−１０処置マウスにおける免疫グロブリンイソタイプの血清濃度。マウスを誕生から８週間までＳＸＣ．１若しくは２Ａ５抗ＩＬ−１０ラット抗体、適当なイソタイプ対照抗体またはＰＢＳで処置した。８週目に集められた血清の全ネズミＩｇＧ１の含量を、イソタイプ特異的免疫グロブリンエリザを用いて検定した。結果は、各免疫グロブリンイソタイプ分析に関する４種類の別個の実験を示す。各実験中のデータを、５個体の血清中で検出された免疫グロブリン濃度の幾何平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。 抗ＩＬ−１０処置マウスにおける免疫グロブリンイソタイプの血清濃度。マウスを誕生から８週間までＳＸＣ．１若しくは２Ａ５抗ＩＬ−１０ラット抗体、適当なイソタイプ対照抗体またはＰＢＳで処置した。８週目に集められた血清の全ネズミＩｇＧ３の含量を、イソタイプ特異的免疫グロブリンエリザを用いて検定した。結果は、各免疫グロブリンイソタイプ分析に関する４種類の別個の実験を示す。各実験中のデータを、５個体の血清中で検出された免疫グロブリン濃度の幾何平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。 抗ＩＬ−１０処置マウスにおける免疫グロブリンイソタイプの血清濃度。マウスを誕生から８週間までＳＸＣ．１若しくは２Ａ５抗ＩＬ−１０ラット抗体、適当なイソタイプ対照抗体またはＰＢＳで処置した。８週目に集められた血清の全ネズミＩｇＧ２ａの含量を、イソタイプ特異的免疫グロブリンエリザを用いて検定した。結果は、各免疫グロブリンイソタイプ分析に関する４種類の別個の実験を示す。各実験中のデータを、５個体の血清中で検出された免疫グロブリン濃度の幾何平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。 抗ＩＬ−１０処置マウスにおける免疫グロブリンイソタイプの血清濃度。マウスを誕生から８週間までＳＸＣ．１若しくは２Ａ５抗ＩＬ−１０ラット抗体、適当なイソタイプ対照抗体またはＰＢＳで処置した。８週目に集められた血清の全ネズミＩｇＥの含量を、イソタイプ特異的免疫グロブリンエリザを用いて検定した。結果は、各免疫グロブリンイソタイプ分析に関する４種類の別個の実験を示す。各実験中のデータを、５個体の血清中で検出された免疫グロブリン濃度の幾何平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。 抗ＩＬ−１０処置マウスにおける免疫グロブリンイソタイプの血清濃度。マウスを誕生から８週間までＳＸＣ．１若しくは２Ａ５抗ＩＬ−１０ラット抗体、適当なイソタイプ対照抗体またはＰＢＳで処置した。８週目に集められた血清の全ネズミＩｇＧ２ｂの含量を、イソタイプ特異的免疫グロブリンエリザを用いて検定した。結果は、各免疫グロブリンイソタイプ分析に関する４種類の別個の実験を示す。各実験中のデータを、５個体の血清中で検出された免疫グロブリン濃度の幾何平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。 抗ＩＬ−１０処置マウスにおける免疫グロブリンイソタイプの血清濃度。マウスを誕生から８週間までＳＸＣ．１若しくは２Ａ５抗ＩＬ−１０ラット抗体、適当なイソタイプ対照抗体またはＰＢＳで処置した。８週目に集められた血清の全ネズミＩｇＡの含量を、イソタイプ特異的免疫グロブリンエリザを用いて検定した。結果は、各免疫グロブリンイソタイプ分析に関する４種類の別個の実験を示す。各実験中のデータを、５個体の血清中で検出された免疫グロブリン濃度の幾何平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。 抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ１ Ｂ細胞枯渇は一時的である。マウスを誕生から８週令まで抗ＩＬ−１０抗体ＳＸＣ．１で処置した後、処置を中止した。腹膜洗浄細胞をこのようなマウスの種々の群（マウス３匹／群）から８週目に集めた。結果は、各実験群から５０００個の生存細胞が計数される全生存腹膜洗浄細胞による表面ＩｇＭおよび表面Ｂ２２０発現の免疫蛍光法分析を示す。 抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ１ Ｂ細胞枯渇は一時的である。マウスを誕生から８週令まで抗ＩＬ−１０抗体ＳＸＣ．１で処置した後、処置を中止した。腹膜洗浄細胞をこのようなマウスの種々の群（マウス３匹／群）から１２週目に集めた。結果は、各実験群から５０００個の生存細胞が計数される全生存腹膜洗浄細胞による表面ＩｇＭおよび表面Ｂ２２０発現の免疫蛍光法分析を示す。 抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ１ Ｂ細胞枯渇は一時的である。マウスを誕生から８週令まで抗ＩＬ−１０抗体ＳＸＣ．１で処置した後、処置を中止した。腹膜洗浄細胞をこのようなマウスの種々の群（マウス３匹／群）から８週目１６週目に集めた。結果は、各実験群から５０００個の生存細胞が計数される全生存腹膜洗浄細胞による表面ＩｇＭおよび表面Ｂ２２０発現の免疫蛍光法分析を示す。 抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ１ Ｂ細胞枯渇は一時的である。マウスを誕生から８週令まで抗ＩＬ−１０抗体ＳＸＣ．１で処置した後、処置を中止した。腹膜洗浄細胞をこのようなマウスの種々の群（マウス３匹／群）から８週目に集めた。結果は、各実験群から５０００個の生存細胞が計数される全生存腹膜洗浄細胞による表面ＩｇＭおよび表面Ｂ２２０発現の免疫蛍光法分析を示す。 抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ１ Ｂ細胞枯渇は一時的である。マウスを誕生から８週令まで抗ＩＬ−１０抗体ＳＸＣ．１で処置した後、処置を中止した。腹膜洗浄細胞をこのようなマウスの種々の群（マウス３匹／群）から１２週目に集めた。結果は、各実験群から５０００個の生存細胞が計数される全生存腹膜洗浄細胞による表面ＩｇＭおよび表面Ｂ２２０発現の免疫蛍光法分析を示す。 抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ１ Ｂ細胞枯渇は一時的である。マウスを誕生から８週令まで抗ＩＬ−１０抗体ＳＸＣ．１で処置した後、処置を中止した。腹膜洗浄細胞をこのようなマウスの種々の群（マウス３匹／群）から１６週目に集めた。結果は、各実験群から５０００個の生存細胞が計数される全生存腹膜洗浄細胞による表面ＩｇＭおよび表面Ｂ２２０発現の免疫蛍光法分析を示す。 ＳＸＣ．１抗ＩＬ−１０処置マウス（図３７Ｄ）または対照マウス（図３７Ｃではイソタイプ対照抗体Ｊ５／Ｄ、図３７Ｂではリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で処置し、または図３７Ａでは何もしなかった）から得られた生存腹膜洗浄リンパ系細胞による表面Ｌｙ１および表面ＩｇＭ発現の免疫蛍光法分析。結果は、各実験群から計数された５０００個の生存細胞の蛍光強度を示す。 ＳＸＣ．１抗ＩＬ−１０処置または対照マウス（図３７と同様）から得られた全生存腹膜洗浄細胞による表面Ｍａｃ−１および表面ＩｇＭ発現の免疫蛍光法分析。結果は、各実験群から計数された５０００個の生存細胞の蛍光強度を示す。 抗ＩＬ−１０処置または対照マウスのＴＮＰ−フィコールに対するインビボでの抗体応答。マウスに誕生から９週令まで抗ＩＬ−１０抗体ＳＸＣ．１（○）またはイソタイプ対照抗体（●）を注射した。８週目に、被験動物にＴＮＰ−フィコール１０μｇを腹腔内に試験投与した。ＴＮＰ特異的ＩｇＭまたはＩｇＧの血清濃度を、エリザによってそれぞれ５日後または１０日後に決定した。各データの円は個々のマウスを示す。 抗ＩＬ−１０抗体処置はＮＺＢ／Ｗマウスにおける自己免疫の開始を遅らせる。雌のＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウス２０匹の群に、ＳＸＣ−１ラットＩｇＭ抗マウスＩＬ−１０抗体（●）かまたはＪ５／Ｄと称するイソタイプ対照抗体（○）を誕生から全実験の間中１週間に３回注射した。引続き４２週間にわたって被験動物の生存を監視した。 抗ＩＬ−１０抗体で処置されたＮＺＢ／Ｗ雌マウスにおけるタンパク尿（＞３＋）の発生。雌のＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウス２０匹の群に、ＳＸＣ−１抗ＩＬ−１０抗体（●）かまたはイソタイプ対照抗体（○）を誕生から全実験の間中１週間に３回注射した。腎臓病の発症は、アルブスティクスディップスティックを用いて１２週間から４２週間までタンパク尿を測定することによって決定された。データは、尿中のタンパク質が３００ｍｇ／ｄｌを越えるマウスの割合を示す。 抗ＩＬ−１０処置ＮＺＢ／Ｗマウスからの腎臓の組織学的検査。図４２Ａは、対照ＮＺＢ／ＷＦ１腎臓（ＰＡＳ染色）を示す。細管中に免疫複合体およびタンパク質円柱の均一な沈着を伴う苛酷な糸球体腎炎が存在し、細管に対するタンパク質の漏出を示す。図４２Ｂは、抗ＩＬ−１０処置したＮＺＢ／ＷＦ１腎臓（ＰＡＳ染色）を示す。 抗ＩＬ−１０処置ＮＺＢ／Ｗマウスにおける自己抗体産生。ＮＺＢ／Ｗ雌マウスに、ＳＸＣ−１抗ＩＬ−１０抗体（●）またはイソタイプ対照（○）を誕生から全実験の間中３日毎に注射した。５か月目または６か月目に集められた血清のＩｇＧ抗体結合性二本鎖ＤＮＡ含量をエリザを用いて評価した。各円は個々のマウスを示す。 抗ＩＬ−１０処置ＮＺＢ／ＷＦ１マウスにおける血清ＴＮＦα濃度。ＮＺＢ／Ｗ雌マウスに、ＳＸＣ−１抗ＩＬ−１０抗体（●）またはイソタイプ対照（○）を誕生から全実験の間中３日毎に注射した。５か月目、７か月目または８か月目に集められた血清のＴＮＦα含量をサイトカイン特異的エリザを用いて評価した。各円は個々のマウスを示す。 抗ＴＮＦα抗体は、ＮＺＢ／Ｗ Ｆ１マウスの抗ＩＬ−１０に誘導された防御を逆行させる。ＮＺＢ／Ｗ雌マウス３６匹および１８匹の群に、２Ａ５抗ＩＬ−＝１０抗体（■）（▲）またはＧＬ１１３と称するイソタイプ対照抗体（□）をそれぞれ誕生から全実験の間中１週間に２回注射した。抗ＩＬ−１０抗体を注射した被験動物の半数は更に、ＸＴ２２抗ＴＮＦα抗体を誕生後３０週目に開始して１週間に２回与えられた（▲）。被験動物の生存を３４週間にわたって監視した。

Claims (29)

  1. インターロイキン−１０またはその類似体、アゴニスト若しくはアンタゴニストを有効成分として含んでなる、宿主における炎症を調節するための医薬組成物。
  2. 炎症が腫瘍壊死因子アルファの異常濃度を伴う、請求項１に記載の組成物。
  3. 有効成分がインターロイキン−１０である、請求項２に記載の組成物。
  4. インターロイキン−１またはインターロイキン−６の濃度を更に調節する、請求項２に記載の組成物。
  5. 異常濃度を上昇させる、請求項２に記載の組成物。
  6. 異常濃度が微生物感染を伴う、請求項２に記載の組成物。
  7. 異常濃度が、発熱、低血圧症、組織壊死、代謝性アシドーシスまたは器官機能不全を伴う、請求項２に記載の組成物。
  8. 微生物感染が、敗血症性ショック、毒素性ショック、髄膜炎菌性髄膜炎またはマラリアの症状を引起こす、請求項６に記載の組成物。
  9. 宿主が細菌に感染している、請求項２に記載の組成物。
  10. 細菌感染がグラム陰性細菌による、請求項９に記載の組成物。
  11. 細菌感染が敗血症性ショックの症状を示す、請求項１０に記載の組成物。
  12. 細菌感染がグラム陽性細菌による、請求項９に記載の組成物。
  13. 細菌感染が敗血症性ショックの症状を示す、請求項１２に記載の組成物。
  14. インターロイキン−１０またはその類似体、アゴニスト若しくはアンタゴニストを有効成分として含んでなる、宿主におけるＴ細胞媒介免疫機能を調節するための医薬組成物。
  15. Ｔ細胞媒介免疫が腫瘍壊死因子アルファの異常濃度を伴う、請求項１４に記載の組成物。
  16. 有効成分がインターロイキン−１０である、請求項１５に記載の組成物。
  17. インターロイキン−１０を有効成分として含んでなる、宿主における敗血症性ショックを治療するための医薬組成物。
  18. インターロイキン−１０を有効成分として含んでなる、宿主における毒素性ショックを治療するための医薬組成物。
  19. インターロイキン−１０アンタゴニストを有効成分として含んでなる、宿主における自己免疫疾患を治療するための医薬組成物。
  20. 自己免疫疾患がＢ細胞に媒介される、請求項１９に記載の組成物。
  21. 自己免疫疾患が腫瘍壊死因子アルファに媒介される、請求項１９に記載の組成物。
  22. インターロイキン−１０アンタゴニストが抗体分子である、請求項１９に記載の組成物。
  23. 抗体分子がインターロイキン−１０に対して結合しうる、請求項２２に記載の組成物。
  24. 腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン−６またはインターロイキン−１の少なくとも１種類を調節する、請求項１９に記載の組成物。
  25. ヒトを除く宿主における炎症を調節する方法であって、前記宿主に対して有効量のインターロイキン−１０またはその類似体、アゴニスト若しくはアンタゴニストを投与する工程を含む方法。
  26. ヒトを除く宿主におけるＴ細胞媒介免疫機能を調節する方法であって、前記宿主に対して有効量のインターロイキン−１０またはその類似体、アゴニスト若しくはアンタゴニストを投与する工程を含む方法。
  27. ヒトを除く宿主における敗血症性ショックを治療する方法であって、前記宿主に対して有効量のインターロイキン−１０を投与することを含む方法。
  28. ヒトを除く宿主における毒素性ショックを治療する方法であって、前記宿主に対して有効量のインターロイキン−１０を投与することを含む方法。
  29. ヒトを除く宿主における自己免疫疾患を治療する方法であって、前記宿主に対して有効量のインターロイキン−１０アンタゴニストを投与することを含む方法。
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