PT96231B

PT96231B - Metodo para a producao de proteinas bcrf1 uteis com inibidores do interferao gama e metodo para a sua utilizacao

Info

Publication number: PT96231B
Application number: PT96231A
Authority: PT
Inventors: Kevin W Moore; Robert A Kastlein
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1989-12-20
Filing date: 1990-12-18
Publication date: 1998-09-30
Also published as: ZA9010188B; ATE112317T1; CN1052608A; ES2064082T3; FI104883B; NO305703B1; SK279830B6; JP2648236B2; HK185396A; CA2071907A1; CN1057012C; HU215909B; DE69013011D1; NO922456L; DE69013011T2; KR960015199B1; HU9202075D0; OA09703A; IL96715A0; NO922456D0

Description

invento está relacionado ds us modo geral com métodos e composições para o tratamento ds doenças associadas à produção excessiva de interferão gama CIFW gama) e mais particularmente com métodos e composições empregando a proteína BCRFí do vírus Epstein-Barr (EBV) para reduzir eficazmente os níveis de IFM-gaisa.

EWMBKIO sistema imune compreende um complexo de tecidos-, tipos celulares e factores solúveis altamente interactivos» Recentemente, foi sugerido que várias doenças e perturbações imunes podem estar associadas a desequilíbrios entre certos, componentes do sistema imune, particularmente citocinass s,g. Mosmann et al», Ann» Rev» Immunol», Vol» 7, pgs» 145-173 (1989)? Cher et al», J» Immunol. » Vol» 138, pgs» 3688-3694 (1987)? Mosmann st al», Immunol» Today, Vol» 8, pgs» 223-227 (1987)? e Heinzel st al», d» Exp» Med», Vol» 169, pgs» 59-72 (1989)»

Por exemplo, uma grande quantidade de dados sugerem que a produção excessiva de interferão gama (TFM gama) á responsável por doenças auto-imunes associadas ao complexo ds histocompatibilidatís major (MHC)s Hooks et al«, New Enqland 3. Med», Vol» 301, pgs» 5-8 (1979) (níveis elevados de ΪΠΜ-gama no soro estão directamente relacionados com auto-imunidade)? Basham et al», J, Immunol.» Vol» 130, pgs» 1492-1494 ,(1983) (IFN-gama pode aumentar a expressão do produto do gene MHC)? Battazo et al», Lancet, pgs» 1115-1119 (11/12/83) (expressão aberrante do produto do gene MHC correlacionado com algumas forosas de auto-imunidade)? Hooks et al», Ann» IM.Y» Acad. Sei», Vol» 301» pgs» 21-32 (1980) (niveis mais elevados ds IFN-gama correlacionados com uma maior gravidade — c»

anti-intsrfsrSo); Jacob st al., 3. Exp. Med», Vol. 186, pgs. 798-303 (1987) (melhoramento e retardamento do estabelecimento das condições da doençaem modelos ds murganhos do lupulus sistémico eritematoso através do bloqueio de anticorpos monoclonais anti-IFN-gama)? e Iwatani st al», 3. Clin» Enriocrin» and Netaboi ,, „ Vol» 63, pgs 695-708 C1986) (anticorpo monoclonal anti-IFN-gama eliminou a capacidade de. células T estimuladas por leucoaglutinina para induzir a expressão de HLA-DR). Foi colocada s hipótese ds que o excesso ds IFN-gama provoca a. expressão inadequada dos produtos do gene NHC que por sua vez provocam reacções auto-imunes contra, os tecidos cujas células estão a expressar inadequadamente os produtos MHC e apresentando auto-antigênios no contexto dos produtos» Assim, McDevit, CClin. Res», Vol» 34, pgs. 163-175 C 1985)3 sugeriu que a redução dos níveis de IFN-gama sm doentes auto-imunes, e.g» pela administração de antagonistas de IFN-gama, pudessem ter efeitos benéficos»

Para além da evidência referida atrás, IFN-gama .pode também desempenhar um papelna alergia pela sua capacidade para aumentar o número e densidade dos receptores Fc€ nos monócitoss ele foi também implicado na patogénese de sarcoidose e de psoríaseg e pensa-se que aumente a imunidade celular, a qual desempenha um papel importante na rejeição de tecidos em pacientes que foram sujeitos s transplante aloqénico»

Face ao que foi dito atrás, a disponibilidade de compostos capazes de reduzir os níveis de IFN-gama seria altamente vantajoso para o tratamento de doenças associadas a respostas imunes inadequadas, tais como algumas doenças causadas por parasitas, alergia s perturbações imunes associadas a NHC, incluindo artrite reumatóide, lupus eritematoso sistémico CSLE),

miastenia qravis, diabetes melitus dependertfce·'”' de insulina tiróidite e similares»

SUMARIO DO 1NVEMTO

U invento está relacionado com métodos e composições para o tratamento ds doenças associadas a níveis elevados de produção de IFM-gama» 0 método do invento compreende o passo de administração ds uma quantidade controladora da doença de BCRFÍ» uma proteína derivada do vírus Epstein-Barr0 invento inclui ainda vectores de expressão para a produção de 8CRF1 recombinante, BCRFÍ purificada e composições farmacêuticas para usar com o método» De preferência, o BCRFÍ usado com o inventa é seleccionado do grupo de polipeptideos maduros da grelha ds leitura aberta definida pela sequência de aminoácidos que se seguem;

i

Met

Glu

Arg

Leu 5

Vai

Thr

Leu

Gin 10

Cys

Leu

Vai

Leu

Leu 15

Tyr

Leu

Ala

Pro

Glu 20

Cys

Gly

Thr

Asp 25

Gin

Cys

Asp

Asn

Phe 30

Pro

Gin

Met

Leu

Arg 35

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala 40

Phe

Ser

Arg

Vai

Lys 45

Thr

Phe

Gin

Thr 50

Lys

Asp

Glu

Vai

Asp 55

Asn

Leu

Lys 60

Glu

Ser

Leu

Glu 65

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr 70

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala 75

Leu

Ser

Glu

Met

Ile 80

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu 85

Glu

Vai

Met

Pro

Gin 90

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp 95

Pro

Glu

Ala

Lys

Asp 100

His

Vai

Asn

Ser

Leu 105

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys 110

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg 115

Leu

Arg

Cys

His 120

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys 125

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys 130

Ala

Vai

Glu

Gin

Ile 135

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn 140

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys 145

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala 150

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

155 160 165

Thr Ile Lys Ala Arg 170

Fórmula 1 sm que as abrev e os aminoácido turas atrás indicam as farma-estão apresentatíos começando dos aminoâcid ©xtr*®ínQ N_e

BREVE DESCRICSO DAS FISURAS press

Figura 1 ê uma ilustração esquemática o em mamíferos útil na produção ds BCRF1

Figura 2 é uma ilustração esquemática o bacteriano útil na. produção de BCFR1 tíe um vector de um vector pres

□ invento está relacionado com. métodos s composições ρ-ara o tratamento ds doenças -associadas â produção excessiva de IFW-gama» 0 invento baseia-se em parte na descoberta de que a sequênca de ácido nucleico codificadora de uma proteína recentemente descoberta, designada factor inibidor da síntese de citoci— nas (CSIF)₅possui um elevado grau de homologia com a grelha de leitura aberta de BCRFl de EBV. EBV é um herpevírus humano endémico em todas as populações humanas e tem sido associado a várias doenças; e»g« Dllner et al», Adv» Cancer Res-., Vol» 50, pgs» 95-158 (i988)s Thorléy-Lawson, iígcmuS-^_^ÍeeMã^_m_â£.ta, Vol„948, pgs» 263-286 (1988)? e Tasato» ftrfv» Câncer Res», Vol. 49, pgs» 75-125 (1987),, EBV tem como genoma um DMA de cadeia duplacom aproximadamente 172 kilob-ases CB-aer et al», Nature, Vol» 310, pgs» 2”@7-2íl (1984)3» 0 genoma contem muitas grelhas de leitura abertas aparentemente correspondendo a proteínas produzidas por EBV, uma das quais é BCRFi» invento inclui polipeptídeos- maduros ou proteínas da grelha de leitura aberta de BCRF1. Para as proteínas secretadas» invento inclui polipeptídeos ou proteínas maduros da grelha de leitura aberta de BCRF1» Para as proteínas secretadas uma grelha de leitura aberta geralmente codifica um polipeptídeo que consiste num produto maduro ou secretado ligado covalentemente no seu extremo N -a um peptídeo sinal» 0 peptídeo sinal ê clivada antes da secreção do polipeptídeo maduro ou activo» 0 sítio de clivagem pode ser previsto com um grande grau de precisão a partir de regras empíricas Ce»g=, von Heijne, Nucleic Acids Rggoarcb* Vol» 14, pgs» 4683-469© (1986)3, e acomposição precisa em aminoácidos do peptídeo sinal não parece ser crítica para a sua função Ce„g= Randall et al», Science» Vol» 243, pgs»í156-1159 (1989)= Kaiser st al», Science,

Consequentemente, as proteínas por vectores codificadores de dos codificados pela grelha

Fórmula 1»

maduras são facilmente expressas peptídeos sinal muito diferentes de leitura aberta definida pela

Para produzir as proteínas do invento pode ser usada uma larga gania ds sistemas de expressão Ci»e» combinações de hospedeiro-vector de expressão)» Tipos posssíveis de células hospedeiras incluem mas não estão limitados a bactérias, leveduras, células de insecto, células de mamífero e similares» Existem muitas revisões que proporcionam um guia para se fazer escolhas e/ou modificações de sistemas de expressão específicoss e»g» (para nomear alguns), de Boer e Shepard, Strategies for Qptimizing Foreign Seno Exorassion in Escherichia coli”, pgs» 205-247, em Kroon, ed» Seriess Structure and Expression (John Wiley & Sons, New York, 198-3), revê vários sistemas de expressão sm E» col.1¾ Kucherlapati et al», Criticai Reviews in Biochemistry·, Vol» 16, Fascículo 4, pgs» 349-379 (1984) e Banerji et al», Senetíc Engineering, Vol» 5, pgs» 19-31 C1983) revê métodos para trans™ fecção e transformação de células de mamífero? Reznxkoff e Gol d» eds», Maximizing Sena Expression íButterworths, Boston, 193ó) revê tópicos seleccionados na expressão de genes em células de E» coli, levedura e mamíferos? e Thilly, Mammalian Cell Technology (Butterworths, Boston, 1986) revê sistemas de expressão de mamífero» Iguaimente, existem muitas revisões gue descrevem técnicas e condiçSes para a ligação s/ou manipulação de cDNAs específicos a expressão de sequências testemunha para criar e/ou modificar vectores de expressão adequados à utilização no presente invento, e=g» Sambrook et al», Molecular Clonings A Laboratory Manual, 2nd Ed» (Cold Spring Harbor Laboratory, M»Y», 1989)»

na Patente U»S» 4,431,739, o qual é aqui incluído como rferência» São promotores procariófcicos particularmente úteis para uma expressão elevada em E» coli o promotor tac, descrito por de Soer na Patente U»S = 4,551 ,433, que é aqui incluído como referência, e o promotor ρ, , descrito por Remaut et al», Bene» Vol» 15, pgs» 81-93 (1981), que έ incluído como referência.» Existem também vectores de expressão e secreção para hospedeiros E. coli» São particularmente úteis os vectores pIN~lI1-ompA, descritos por Ghrayeb et al,, em EMBO -3, Vol» 3» pgs» 2437-2442 (1984), em que o cDNA a ser transcrito ê fundido com a fracção do gene OmpA de E» coli codificadora do peptídeo sinal da proteína ompA que por sua vez, provoca a secreção da proteína madura para o espaço periplasmãtico da bactéria» As patentes U=S» 4,336,33ó, 4,411,994, 4,332,892 e 4,338=397 também descrevem vectores de expressão e secreção para procariotas» Assim estas referências são aqui incluídas como referência» Numerosas estirpes ds bactérias são hospedeiros adequados para vectores de expressão procarióticos, incluindos estirpes ds- E . coli, tais como W31Í® (ATCC N8 27325), JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HBIOI, XÍ776 (ATCC N33Í244), X22B2, RRI (ATCC N23Í343) MRCI§estirpes de Bacillus subtilis; e outras enterobactereéceas tais como Salmonella tvphimurium ou Serratia marcescens e várias espécies de Pseudomonas» Na Patente U«S» 4,190,495 Curtis III descreve métodos gerais para a derivação de estirpes bacterianas, tais como E» coli K12 X177á!, útil na expressão de proteínas eucarióticas» Assim esta patente é incorporada como referência» Além de microorganismos procarióticos e eucarióticos, sistemas de expressão compreendendo células derivadas de organismo multicelulsr podem também ser usadas para produzir proteínas do invento» São de particular interesse os sis temias de expressão em mamíferos devido ã sua de processsffisnto pós—traduciona1 produzir com maioer probabilidade proteínas de mamífero biologicamente activas»

Vários vírus ds DNA de tumores têm sido usados como vectores para mamíferos hospedeiros» São particularmente importantes os numerosos vectores que compreendem sequências da controle da replicação, transcrição e/ou tradução acoplado a sequências de controle da replicação bacterianas, e.g» os vectores pcD desenvolvidos por Okayama e Berg, descrito em Mol» Cell. Bioh, Vol» 2, pgs. 161-170 ¢1982) e em «akfelLJiSk, Vol. 3, pgs. 280-289 (1983) e melhorado por Takefae et al», Mo1. Ce11» Biol,» Vol» 8, pgs» 466-472 ¢1988). Assim» estas referências são aqui incluídas como referência» Outros vectores de expressão de mamíferos baseados no SV40 incluem os que contêm elementos reguladores de adenovirus, descritos por Kâufman e Sharp, em Mol» VCell» Biol»» Vol» 2, pgs» 1304-1319 ¢1982) e por Clark et al = , na Patente U.S» 4,675,235, sendo ambos aqui incluidos como referência» As células de macaco são geralmente os hospedeiros preferidos para os vectores atrás citados» Tais vectores contendo as sequências ori de 6V4© e um gene A intacta podem replicar-se autonomamente em células de macaco Cpara dar números de cópias mais elevadas e/ou números de cópias mais estáveis do que os plasmídeos de replicação não autónoma)» Ainda, os vectores contendo as sequências ori da SV40 sem um gene A intacta podem replicar-se autonomamente para dar um número ds cópias elevado (mas não estável) em células de macaco CQS7, descritos por Sluzman, Cel1, Vol» 23, pos» 175-182 (1981) e disponível bna ATCC (NS de acesso CRL 1651). Os vectores atrás baseados em SV40 são também capazes de transformar outras células de mamífero.! tais como células L, através da integração no DNA da célula hospedeira »

A actividade biológica dos BCRFs do invento é facilmente determinada por ensaios de inibição de IFN-gama» Tais ensaias requere® uma linha celular ou uma população de células que sintetize IFN-gama, Por conveniência, as linfócitos do sangue

periférico	( PHL
tal como fi	to— hi
de células»	De
es t i mu1ados	com

ito— hemaglutinina (PHA) podem servir como tal população De um modo geral o ensaio funciona assim? Os PLBs ^:’HA são dividos em duas partes .iguais» A uma parte, adiciona-se uma amostra contendo BCRF1» A outra parte serve como testemunha» Após vários dias os sobrenadantes de ambas as culturas são testados relativamente a IFN-gama, Por conveniência isto é feito com um ensaio rfe ELISA convencional usando anticorpos monoclonais e policlonais para IFÍM-gam-a, e,g, Senziiss, Inc, (Boston, MA)· Como alternativa, a leitura do ensaio pode ser a quantidade de mRMA de IFN-gama transcrito, por exemplo medindo por blotting” de RNA, PCR ou. metodologias semelhantes. Os PBLs são obtidos usando técnicas convencionais, e.g, Mishell et al» , eds», Selected Methods in Cellular Immunology (Freeman, New York, 1980),

Quando os polipeptídeos do presente invento são expressos na forma solúvel, por exemplo como um produto secretado de células de levedura, ou de mamífero transformadas, elas podem ser purificadas de acordo com processos convencionais, incluindo passos de precipitação com sulfato de amónio, cromatografia de permuta iónica, filtração em gel, electroforese,’ cromatografia de afinidade e/ou similares? e,g, Enzyme Purification and Related Techniqu.es, Methods in Enzymoloqy, 22 8 233-577 (1977) e Scopes, Protein Purifications Principies and Practíce CSpringer-Verlag, New York, 1982) proporcionam orientação em tais purificaçSes» De modo semelhante, quando os polipeptídeos do invento são expressos na forma insolúvel, por exemplo como agregados, os corpos de inclusão ou similares podem ser purificados- por processos conven— Cionais, incluindo separação dos corpos de inclusão das células hospedeiras rebentadas por centrifugação, solubilização dos corpos ds inclusão com agentes caotrópicos e com agentes redutores, diluição da mistura solubilizada. e redução da concentração

ίί conformação biológicamente activa, Estes últimos processos estão descritos nas referências que se seguem, as· quais são aqui incluídas como referências Winkler et al», Biochemistry» 25s 4041-4045 (1986)? Winkler et al», 8iotechno1oqy,, 3; 992-998 (1985)5 Koths et al,, Patente U.S» 4,569,790; e Pedidos de Patente Europeia Q63©6917»5 e 86306353,3»

Conforma aqui è usado, “quantidade eficaz significai uma quantidade suficiente para melhorar um sintoma de uma doença mediada por IFN-gama excessivo» A quantidade eficaz para um doente particular pode variar dependendo de factores tais como o estado da doença a ser tratada, o estado geral de saúde do doente, o método de administração, a gravidade dos efeitos secundários e similares» De um modo gerai, BCRFÍ é- administrado como uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de BCRFÍ e um veiculo ou excipiente farmacêutico, Um veiculo farmacêutico pode ser qualquer substância não tóxica compatível adequada á libertação de composiçSes do invento a um doente» De um modo geral, as composiçSes úteis para administração parenteral de tais drogas são bem conhecidas, e»g» Remington⁵s Pharmaceutical Science, 15th Ed» (Mack Publishing Company, Easton, PA 198©, Como alterniva, as composiçSes do invento podem podem ser introduzidas no corpo do doente por um sistema de de libertação de droga implantáveis e.g» Urquhart et al», Ann»__Rev»

Pharmaçpl. Toxicai», Vol» 24, pgs» 199-236 (1984)5 Lewis, ed» Contrailed Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, New York, 1981)^ Patente U.S, 3,773,9195 Patente U.S» 3,270,96©~ s s im iIarss,

Quando administrado parenteralments, o BCRFÍ é formulado numa, forma de dosagem unitária injectável (e.g», uma solução, suspensão ou emulsão) sm associação com um veículo farmacêutico»

Tais veiculos são inerentemente não tóMxsos^é^não terapêuticos» SSo exemplos ds tais veiculos soro fisiológico normal, soluçSo de Ringer, solução da dextrose s solução ds Hanks Podem também ser usados veiculos não aquosos tais como óleos e oleato de etilo» Um veículo preferido é 5% de dextrose/soro fisiológico,. 0 veiculo pode conter quantidades muito pequenas de aditivos tais como substâncias que aumentam a isotonicidade ε estabilidade química, e.g. tampões e preservativos» BCRFí é de preferência formulado na forma purificada substancialmente livre de agregados e ds outras proteínas numa concentração na gama entre 5 e 20 ug/ml» De preferência, BCRFÍ é administradopor infusão continua de tal forma que uma quantidade na gama de 50-80® Bg ê libertada por dia (i.e,. cerca ds l-ló Gg/Kg/dia)» A velocidade de infusão diária pode variar com base no controle dos efeitos secundários, contagens das células do sangue e similares.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Expressão de BCRFÍ em uél.ulas_C0§7_^g_maçavo

Um gene codificador da grelha de leitura aberta de BCRFí foi amplificado pela reacção em cadeia com polímeras® usando iniciadores que permitiram mais tarde a inserção do fragmento amplificado no vector pcDCSRd) digerido com EcoRI (Figura 1). A cadeia codificadora do fragmento inserido está apresentada abaixo Ca grelha de leixura aberta sendo cada eist letras maiúsculas)s aattc ATG GAG CGA AGG TTA GTG GTC ACT CTG CAG TGC CTG GTG CTG 47

CTT TAC CTG GCA CCT GAG TGT GGA GGT ACA GAC CAA TGT GAC AAT 92

TTT

CCC

CAG

ACC

TAA

GAG

ATG

CCT

TCA

GTC

GTG

TTA

AAA

CCT

TTT 137

TCC

AGA

CAA

AGG

ACG

AGG

TAG

ATA

ACC

TTT

TGC

TCA

AGG

AGT

CTC 182

TGC

TAG

AGG

ACT

TTA

AGG

ATG

CCA

GGC

CCT

GTC

AGA

AAT

GAT

CCA 227

ATT

CTA

CCT

GGA

AGT

CAT

GCC

ACA

GGC

TGA

AAC

CAG

GAC

CCT 272

GAA

GCC

AAA

GAC

CAT

GTC

AAT

TCT

TTG

GGT

GAA

AAT

CTA

AAG

ACC 317

CTA

CGG

CTC

CGC

CTG

CGC

AGG

TGC

CAC

AGG

TTC

CTG

CCG

TGT

GAG 362

AAC

AAG

AGT

AAA

GCT

GTG

GAA

CAG

ATA

AAA

AAT

GCC

TTT

AAC

AAG 407

CTG

CAG

GAA

AAA

GGA

ATT

TAC

AAA

GCC

ATG

AGT

GAA

TTT

GAC

ATT 452

TTT

ATT

AAC

TAC

ATA

GAA

GCA

TAC

ATG

ACA

ATT

AAA

GCC

AGG

TGA g

498

Clones portadores da inserção na orientação correcta foram identificados por expressão de BCRFÍ e/ou pelo padrão electroforético das digestões ds restricç-ão» Um desses vectores

portadores do gene BCRF1 foi designado pBCRFlCSRsú e foi depositado na ATCC oom o número ds acesso 68193» pBCRFlíSRát) foi amplificadfo em E» ca 1 i MCÍ©6Í, isolado por técnicas convencionais e usado para transfectar células de macaco C0S7 como se segues Um dia antes da transfecção, aproximadamente 1,5 x células C0S7 de macaco foram semeadas em placas individuais de 100 mm em meio de Eagle modificação de Dulbecco (DME) contendo 57 de soro fetal de vitela (FCS) e glutamina 2 mM» Para realizar a transfecção, as células COS7 foram remividas das placas por incubação com tripsina, lavadas duas vezes em DME sem soro e ressuspensas para í©' células/ml sm DME sem soro» Uma amostra de de ô,75 ml foi misturada com 20 pg de DNA e transferida para uma cuvete de electroporação de 0,4 cm estéril, Após 10 minutos as células foram sujeitas a um pulso de volts, 960 pF numa unidade- BioRad Bene Pulser» Após mais 10 minutos as células foram retiradas da cuvete e adicionadas a 2® ml ds DME contendo 57 FCS» glutamina 2 mM, penicilina, estreptomicina e gentamicina» A mistura distribuída por quatro placas de cultura de tecidos de 10© mm» Após 12-24 horas a 37^OC, 5-7 ds CO-^, o meio foi substituido por meio semelhante contendo apenas 17 FCS e a incubação continuou durante mais 72 horas a 37°C_S 57 CCU,, após o que o meio foi colhido e testado quanto á sus capacidade para inibir a síntese de IFN-gama»

Amostras ds 10 ml de PBLs isolados de fresco (csrca de 2x1©^ células/ml) foram incubados a 37*8 com PHA CIO® ng/ml) sm meio consistindo em íi) 9®7 de DME suplementado com 57 FCS e glutamina 2 mM e íii) 107 de sobrenadante das células COS7 préviamente transfectadas com pBCRF1(8R«)» Após 24 horas as células e os sobrenadantes foram colhidos para testar quanto à presença de mRIMA de IFM-gama ou proteína de IFM-gama, respectivamente» As testemunhas forma tratadas ds forma semelhante, excepto os 1©7 de sobrsnante serem de culturas COS/ préviamente transfectadas com u/π plasmídeo portador ds unia inserção de cDiMA não relacionada« As amostras tratadas com BCRF-Í .apresentaram cerca de 50% de inibição da síntese tíe IFN-gama relativamente às testemunhas»

Exeinol	. X t	, Expressão	de B	CRF1	em	Escheri c hia	coli
		Um gene	codific	ador	de	um bcrF í da	sequênc.	ia aprese
da abaixo	pode ser ex	pres	ro-3. ©01 Η κ	col i s
Thr	Asp	Gin Cys	Asp	Asn	Phe	Pro	Gin Met Leu	Arg Asp	Leu Arg
			5				10		15
Asp	Ala	Phe Ser	Arg	Vai	Lys	Thr	Phe Phe Gin	Thr Lys	Asp Glu
			20				25		30
Vai	Asp	Asn Leu	Leu	Leu	Lys	Glu	Ser Leu Leu	Glu Asp	Phe Lys
			35				40		45
Gly	Tyr	Leu Gly	Cys	Gin	Ala	Leu	Ser Glu Met	Ile Gin	Phe Tyr
			50				55		60
Leu	Glu	Glu Vai	Met	Pro	Gin	Ala	Glu Asn Gin	Asp Pro	Glu Ala
			65				70		75
Lys	Asp	His Vai	Asn	Ser	Leu	Gly	Glu Asn Leu	Lys Thr	Leu Arg
			80				85		90
Leu	Arg	Leu Arg	Arg	Cys	His	Arg	Phe Leu Pro	Cys Glu	Asn Lys
			95				100		105
Ser	Lys	Ala Vai	Glu	Gin	Ile	Lys	Asn Ala Phe	Asn Lys	Leu Gin
			110				115		120
Glu	Lys	Gly Ile	Tyr	Lys	Ala	Met	Ser Glu Phe	Asp Ile	Phe Ile
			125				130		135
Asn	Tyr	Ile Glu	Ala	Tyr	Met	Thr	Ile Lys Ala	Arg.
			140				145
		A inser	ção	de	c.DN;-	í do pBCRFICSRu	) foi r	bc1onada
plasm.	ídeo	Ml3 ond	e foi al	. terada duas vezes por mutagénese di
GS 5 íJ:	rimelro para	formar	um	sítio Ciai no	extremo	5^? da r

codificadora do polipeptídeo BChFí maduro e segund num o Dar •formar um sítio Bam Hl no extremo 3^? da região codificadora do polipeptídeo BCRFí maduro» A sequência mutagenizada é então facilmente inserida no vector de expressão TRPC11 descrito abaixo»

vector TRPCÍÍ foi construído por ligação da um fragmento consensos RBS sintético aos adaptadores Ciai (ATBCAT) e por clonagem dos fragmentos resultantes em pMTllhc cortado cot» Ciai (o qual foi prévimente modificado para conter o sítio Ciai) » pMTllhc é um derivado pequeno (2,3 kilobases) de elevado número

do pt#R322 que έ portador da região do poliadaptador EcoRI-HindI 11 do plasmídeo nVX » (k.VX está descrito por Maniatis et al,, Molecular Xlonings A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982») Este foi modificado para conter o sítio Ciai cortando pMTllbc com EcoRI e BamHI, preenchendo os extremos coesivos 5^? resultantes e ligando com o adaptador Ciai (CATCBATG), restaurando assim os sítios EcoRI e BamHI e substituindo o sítio Smal com um sítio CiaI. Um transformante da construção TRPCÍÍ tem uma sequência RBS tandem delimitada por sítios Ciai» Um dos sítios Ciai e parta da segunda cópia da sequência da sequência RBS foram removidos por digestão deste plasmídeo com Ps11, tratando com nucleass BalSÍcortando com EcoRI e tratando com DNA-polimerase na presença dos quatro trifosfatos ds desoxinucleótidos» Os fragmentos resultantes de 3O---40 pb foram recuperados por ΡΑΒΕ e clonados em pUC12 cortado com SmaI. Um fragmento EcoRI de 248 pb portador de trP de Eco 1 i derivado ds pKClOí (descrito por Nichols et al» em Methods in &Lg.yffioloqy·, Vol» 101, pg» 155 CAcademic Press, NY, pg» 155 CAcademic Press, N.Y» 1983)) foi então cionado no sitio EcoRI para completar a construção TRPClí, a qual está ilustrada na Figura 2» TRPCíí foi empregue como um vector para BCRFÍ digerindo-o primeiro com Ciai e BamHI = purificando-o e depois misturando-o numa solução de ligação convencional com o fragmento Clal—BamHI do M13 contendo a sequência de nucleótidos codificadora do BCRFÍ maduro» TRPCÍÍ contendo a inserção, referido como TRPC11•-BCRFí, foi propagado em E» coli KÍZestirpe JM10Í, e.g. disponível na ATCC com o número de acesso 33376»

Os requerentes depositaram E» coli MC1®61 jsortadora de pBCRFlíSRct) ns American Type Culturé Collection, Rockville, MD, USA (ATCO, com o número de acesso 6-3193» Este depósito foi feito em 2® ds Dezembro de 19S9 nas condiçSes do acordo da ATCC para o depósito de culturas para fins de patentes, o qual assegura que o depósito fique disponível ao US Commissioner of Patente and Trade Marks em conformidade com 35 USC 122 e 37 CFR 1.14 ε ficará disponível ao público quando da publicação da Patente U»3» que requere que o depósito seja mantido» A disponibilidade da estirpe depositada não deve ser considerada como uma licença para a realização do invento em contravenção com os direitos pagos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis sobre patentes»

Depósito foi modificado para estar de acordo com o-s requesitos do Tratado de Budapeste sobre o depósito de MicroorgaΠ15ÍBO5 »

As descrições das realizações precedentes· tio invento foram apresentadas com fins ilustrativos e descritivos» Elas não se destinam a ser exaustivas ou limitantes do invento às formas precisas divulgadas e óbviamente muitas modificações e variações são possíveis à luz dos ensinamentos fornecidos» As realizações foram escolhidas e descritas para explicar melhor os princípios do invento para assim permitir que outros utilizem da melhor forma o invento em várias realizaçSsse com várias modificações conforme adequado ao uso particular contemplado» Pretende-se que o âmbito do invento seja definido pelas reivindicações que lhes estão apensas»

Claims

- Método para controlar uma interferão gama uma quantidade na gama de cerc mento de uai paciente doença associada a uma produç caracterizado por compreender a terapêuticamente eficaz ds BCRF1 a de 50-8Θ0 uq por dia»

So de de forma a istração ds preferência rizado por o ref proteínas madura sequência ds aminoácidos-s lôtodo de acordo com a reivindicação í, caracte— rido BCRF1 ser seleccionado a partir do grupo de da grelha de leitura aberta definida pela

Met Glu Arg Arg Leu 5 Vai Vai Thr Tyr Leu Ala Pro Glu 20 Cys Gly Gly Pro Gin Met Leu Arg 35 Asp Leu Arg Thr Phe Phe Gin Thr 50 Lys Asp Glu Glu Ser Leu Leu Glu 65 Asp Phe Lys Leu Ser Glu Met Ile 80 Gin Phe Tyr Ala Glu Asn Gin Asp 95 Pro Glu Ala Gly Glu Asn Leu Lys 110 Thr Leu Arg Arg Phe Leu Pro Cys 125 Glu Asn Lys Lys Asn Ala Phe Asn 140 Lys Leu Gin Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile

155

Leu Gin 10 Cys Leu Vai Leu Leu 15 Thr Asp 25 Gin Cys Asp Asn Phe 30 Asp Ala 40 Phe Ser Arg Vai Lys 45 Vai Asp 55 Asn Leu Leu Leu Lys 60 Gly Tyr 70 Leu Gly Cys Gin Ala 75 Leu Glu 85 Glu Vai Met Pro Gin 90 Lys Asp 100 His Vai Asn Ser Leu 105 Leu Arg 115 Leu Arg Arg Cys His 120 Ser Lys 130 Ala Vai Glu Gin Ile 135 Glu Lys 145 Gly Ile Tyr Lys Ala 150 Asn Tyr 160 Ile Glu Ala Tyr Met 165

Thr Ile Lys Ala Arg.

170

FÓRMULA

3o» - Método ds aoordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido passo ds administração incluir a administração intravenosa de uma quantidade do referido BCRFÍ na gama de aproximadamente 1-i© pg/kg de peso de corpo do referido doente por dia»
4ã„ - Método de acordo com a reivindicação 2, rizado por a referida protéina madura ser definida pela ds aminoácidoss tóUU£! .L-s

Thr Asp

Asp Ala

Vai Asp

Gly Tyr

Leu Glu

Lys Asp

Leu Arg

Ser Lys

Glu Lys

Asn Tyr

Gin Cys Asp 5

Phe Ser Arg 20

Asn Leu Leu 35

Leu Gly Cys 50

Glu Vai Met 65

His Vai Asn 80

Leu Arg Arg 95

Ala Vai Glu 110

Gly Ile Tyr 125

Ile Glu Ala 140

Asn Phe

Vai Lys

Leu Lys

Gin Ala

Pro Gin

Ser Leu

Cys His

Gin Ile

Lys Ala

Tyr Met

Pro Gin

Thr Phe

Glu Ser

Leu Ser

Ala Glu

Gly Glu

Arg Phe

Lys Asn

Met Ser

Thr Ile

VL·?

Phe Gin Thr 25

Leu Leu Glu 40

Glu Met Ile 55

Asn Gin Asp 70

Asn Leu Lys 85

Leu Pro Cys 100

Ala Phe Asn 115

Glu Phe Asp 130

Lys Ala Arg 145

Lys Asp Glu 30

Asp Phe Lys 45

Gin Phe Tyr 60

Pro Glu Ala 75

Thr Leu Arg 90

Glu Asn Lys 105

Lys Leu Gin 120

Ile Phe Ile 135

1ΠΙΟ1Γ
5ã« -· Método para a produção de um-a proteína capaz de síntese de interferão gama seleccionada a partir do grupo de proteínas maduras d pela sequência de a grelha de leitura aberta definida aminoácidos da Fórmula 1 estabelecida na

Reivindicação 1, carac ter izado ρο-r compreender os passos des construção de uír vector que compreende unta sequência de nucleotideos codificadora do referido polipeptídeo, era que a sequência de nucleotideos ê capaz de ser expressa por um hospedeiro contendo o vector e em que a sequência de nucleotideos é seleccionada a partir de um grupo codificador de polipeptídeos maduros da grelha de leitura aberta definida pela sequência de aminoácidoss

Met Glu

Tyr Leu

Pro Gin

Thr Phe

Glu Ser

Leu Ser

Ala Glu

Gly Glu

Arg Phe

Lys Asn

Met Ser

Arg Arg

Ala Pro

Met Leu

Phe Gin

Leu Leu

Glu Met

Asn Gin

Asn Leu

Leu Pro

Ala Phe

Glu Phe

Leu Vai Vai 5

Glu Cys Gly 20

Arg Asp Leu 35

Thr Lys Asp 50

Glu Asp Phe 65

Ile Gin Phe 80

Asp Pro Glu 95

Lys Thr Leu 110

Cys Glu Asn 125

Asn Lys Leu 140

Asp Ile Phe

Thr Leu

Gly Thr

Arg AspGlu Vai

Lys Gly

Tyr Leu

Ala Lys

Arg Leu

Lys Ser

Gin Glu

Asp Gin Cys Asp Asn 25

Ala Phe Ser Arg Vai 40

Asp Asn Leu Leu Leu 55

Tyr Leu Gly Cys Gin 70

Glu Glu Vai Met Pro 85

Asp His Vai Asn Ser 100

Arg Leu Arg Arg Cys 115

Lys Ala Vai Glu Gin 130

Lys Glv Ile Tyr Lys 145

Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr 160

- Ol

Leu

Phe

Lys

Lys

Ala

Gin

Leu

105

His

120

Ile

135

Ala

150

Met

165

Thr Ile Lys Ala

Arg. 170 cl inCOr“*pOi“ctÇe.O tía VcdCt-Or ΠΟ ΓΌ η a manutenção do hospedeiro num meio de cultura sob condições adequadas para a expressão da sequência ds nucleotídeos no referido polipeptídeo» óã» - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida proteína ser definida pela sequência de aminoácidos estabelecida na Reivindicação 4»
7ã» ~ Método de acordo com a reivindicação 5 ou com a reivindicação 6, caracterizado por incluir ainda o passo de isolamento do referido polipeptídeo quaisquer outras proteínas» livre de .□.bs tan<_ xa 1 men te

-ΪΟΛ .. — V vsutor de expressão» uaraui»er.5.zado por ser uapâí de expressar uma proteína BCRhl num hospedeiro»

91-» - Veotor ds expressão de aoordo com a reivindicação i, caracterizado por a referida proteína BCRFÍ ser seleccionada io grupo de proteínas maduras da grelha de leitura aberta definida pela sequência· de aminoácidos da fórmula Rexvxndxcação 1 = ©© il tó. υ© X =tóC 2. £3 tó. Π tó.
10ã» - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referida hospedeira ser aiaraífero.

ilã» — Vector de expressão de acordo com a reivindicação 1©₅ cracterizado por consistir em pBCRFKSRa).
12â» - Vector de expressão de acordo com a reivindicação li, caracterizado por o referido hospedeiro ser uma bactéria.

Í3S» - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por consistir em TRPCÍ1-BCRFí»