JP2001512830A

JP2001512830A - 生物療法耐性および化学療法耐性を克服するための方法および組成物

Info

Publication number: JP2001512830A
Application number: JP2000506527A
Authority: JP
Inventors: エイチマイケルシェパード
Original assignee: ニューバイオティックスインコーポレイテッド
Priority date: 1997-08-08
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2001-08-28
Also published as: US6495553B1; CA2298681C; US20050123983A1; JP2002167337A; ATE413881T1; CA2298681A1; DE69840216D1; WO1999008110A1; JP2002223790A; CN1307421C; US7465734B2; AU9016998A; US20010016329A1; EP1004022A1; CN1265741A; EP1004022A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、標的細胞を、細胞内酵素の選択基質である治療薬候補薬剤に接触させることによって、治療薬としての可能性を有する薬剤を同定するための方法を提供する。また、本発明は、この細胞を、内因性の細胞内酵素の選択的基質であるプロドラッグと接触させることによって、異常細胞を選択的に死滅させるための方法と、それに用いる分子の実例を提供している。このプロドラッグは、引き続いて細胞毒に変換される。さらに、内因性に過剰表現された細胞内酵素に対する選択的基質で、この酵素により過剰増殖細胞内で細胞毒に変換されるプロドラッグを、被験者に投与することによって、被験者の病的過剰増殖細胞を特徴とする病変を治療するための方法が、本発明によって提供されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、薬剤発見の分野の中で、特に、病的細胞での癌治療への耐性に重要
な細胞内酵素の基質で、その細胞内酵素によって細胞毒に変換されるプロドラッ
グの構造に関係する。

【０００２】（背景技術）本発明の開示では、一貫して、第一著者と年、特許番号または公開番号によっ
て、多数の発表を参照できるようになっている。各文献に関する全目録の引用は
、本出願の末尾にみられる。これらの文献の開示内容は、本開示中に参考として
組み込まれて、本発明に関係する技術の状況をさらに十分に説明する。

【０００３】癌細胞は、無秩序な増殖、脱分化および遺伝的不安定性を特徴とする。その不
安定性は、染色体数の異常、染色体欠失、再配列、欠損、または正常なディポイ
ド（dipoid）を上回る重複として表れる。Wilson,J.D.ら（1991）。この遺伝的不安定性は、いくつかの要因によって起こる。最も特徴的なのは、腫瘍抑制遺伝
子機能消失の時に起こる遺伝子可塑性の増強である（例、Almasan,A.ら（1995）
）。この遺伝的可塑性は、腫瘍細胞がそれ自身の環境を変えていくのに役立って
おり、突然変異、遺伝子の増幅、染色体外因子の形成の頻度を高めることもある
（Smith,K.A.ら（1995）およびWilson, J.D.ら（1991））。このような特徴によ
って、化学療法に加えて、自然宿主の防御機構と、生物学的療法（Wilson,J.D. ら（1991）とShepard, H.M.ら（1988））に対しても、腫瘍は急速に耐性を強化させるため、ますます悪性度を高める機構を獲得するようになる。Almasan, A. ら（1995）およびWilson, J.D.ら（1991）。

【０００４】癌は、世界的に最も一般的な人の死病のひとつである。抗癌剤を用いた治療は
着実に重要性を高めている選択肢で、特に外科手術での根治可能状態を過ぎてし
まった全身性の悪性癌または転移性癌には重要度が高い。不幸なことだが、今日
根治可能な治療をもつヒトの癌のタイプの亜集団はむしろまだ小さい（Haskell,
C.M.ら編（1995）、p.32）。ヒトの癌を治すことのできる薬剤の開発の進展状況
は遅い。耐性がもともと存在していたか、または治療によって起こったかという
こと以外にも、悪性腫瘍の遺伝学的異質と、生物学的異質と、生化学的異質とが
、治療効果を弱めている。その上、多くの抗癌剤は低い選択性しか示さず、重篤
な副作用または生命を脅かすような副作用を引き起こす頻度も高いため、すべて
の癌細胞を殺すだけの用量を適用する妨げとなっている。そのため、治療に耐性
の病的悪性細胞への選択性について改善された抗腫瘍剤を突き止めることが、薬
剤開発の中心的な仕事になっている。それに加えて、抗生物質への耐性も、重要
で世界的な保健問題になってきている。Segovia, M.（1994）とSnydman,D.R.ら（1996）。

【０００５】化学療法剤の分類主な化学療法剤には、アルキル化剤と、抗腫瘍性抗生物質と、植物アルカロイ
ドと、代謝拮抗薬と、ホルモン療法薬および拮抗薬と、そのほか多種多様の薬剤
とがある。Haskel,C.M.編,（1995）およびDorr, R.T.とVon Hoff, D.D.ら編（19
94）を参照のこと。古典的なアルキル化剤というのは、ある有機化合物の水素原子をアルキル基に
置換することができる、高い反応性の化合物である。核酸のアルキル化の中でも
主にDNAのアルキル化が、この種のほとんどの薬剤の重要な細胞毒性作用である。これらの薬剤が引き起こす損傷によって、DNAの複製とRNAの転写が妨げられる
。この古典的なアルキル化剤には、メクロレタミン、クロラムブジル、メルファ
ラン、シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパオおよびブスルファン
がある。多くの非古典的アルキル化剤も、DNAと蛋白質に損傷を与えるが、こちらはメチル化またはクロロエチル化など、別の種類で複雑なメカニズムを介して
いる点が、古典的アルキル化剤とは異なる。非古典的アルキル化剤には、ダカル
バジン、カルムスチン、ロムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、プロカル
バジンおよびアルトレタミンが含まれる。

【０００６】土壌真菌であるStreptomycesに属する様々な株の天然産物が、臨床的に有用な
抗腫瘍薬となっている。この種の真菌類は、1種類以上のメカニズムを介して抗腫瘍性効果を生み出している。その抗生物質はすべてDNAに結合することができるが、挿入によって行うのが一般的で、その後でヘリックスの巻き戻しを行う。
これによって起こる歪みが、DNA合成、RNA合成、またはその両方のための鋳型と
して機能するＤＮＡの能力に損傷を与える。また、この種の薬剤は、フリーラジ
カルの生成と主要金属イオンのキレート化によってDNAに損傷を与えることもある。それらはまた、細胞分割に欠かすことのできない酵素であるトポイソメラー
ゼIIの阻害剤として作用することもある。この種の薬剤には、ドキソルビシン、
（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ブ
レオマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシンC、プリカマイシンおよびストレプトゾシンが含まれる。

【０００７】植物の中には、最も有用な抗腫瘍薬剤を提供するものがある。この種の薬剤の
３グループは、ビンカアルカロイド（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、エピポドフィロトキシン（エトポシドおよびテニポシド）およびパクリタキセ
ル（タキソール）である。ビンカアルカロイドは、分裂中の細胞と神経系に認め
られる微小器官の蛋白質に結合する。この結合によって、紡錘体の末端では、チ
ューブリンの追加と消失がみられるなど、その動態に変化が起こり、最終的には
核分裂の停止に至る。類似した蛋白質が神経組織の重要部分を作り、そのために
、このような薬剤は神経毒性を示す。エピポドフィロトキシンは、トポイソメラ
ーゼIIを阻害し、これによって細胞機能に大きな影響を与える。パクリタキセル
は微小管に複雑な影響を与える。

【０００８】代謝拮抗薬は、細胞機能および複製に必要とされる正常代謝産物の構造類似物
質である。それらは典型的には、細胞酵素と相互に作用することによって、機能
する。これまでに開発され、臨床試験が行われた数多くの代謝拮抗薬の中に、メ
ソトレキサート、フルオロウラシル（5-FU）、フロクスウリジン（FUDR）、シタ
ラビン、6-メルカプトプリン（6-MP）、6-チオグアニン、デオキシコフォルマイ
シン、フルダラビン、2-クロロデオキシアデノシンおよびヒドロキシウレアがあ
る。

【０００９】腫瘍性疾患のタイプによっては、内分泌操作が有効な治療法になる。腫瘍学へ
の応用の可能性を求めて、多様なホルモン剤およびホルモン拮抗薬の開発が進め
られてきた。有効なホルモン療法剤の例としては、ジエチルスチルベストロール
、タモキシフェン、酢酸メゲストロール、デキサメタゾン、プレトニゾン、アミ
ノグルテチミド、リュープロライド、ゴセレリン、フルタミドおよび酢酸オクト
レオチドがある。

【００１０】最近の化学療法剤の欠点癌治療の目的で化学療法剤を使用する際に伴う問題には、高用量の薬剤を必要
とすることと、正常細胞に対する毒性、すなわち選択性が欠如していることと、
免疫抑制と、二次的悪性化と、薬剤耐性とがある。

【００１１】現在、癌の化学療法に使用されている薬剤の大半は、増殖抑制のメカニズムに
より作用する。しかし、ヒトの固形癌は、ほとんどの場合、急速に増殖する細胞
の比率が高いとはいえず、特にこの種の薬剤への感受性が高いわけではない。し
かも、ほとんどの抗腫瘍薬は、急勾配の用量反応曲線を有する。宿主への毒性の
ため、生存する腫瘍細胞をすべて死滅させる用量をかなり下回る用量レベルで、
投与を中止しなければならない。

【００１２】今日の治療に伴う別の副作用には、骨髄、腸粘膜、リンパ系細胞のように、正
常時にきわめて早く分裂する宿主組織への化学療法剤の毒性作用が挙げられる。
また、その薬剤は様々な有害事象を及ぼし、これには、神経毒性；性的能力およ
び生殖機能への負の影響と；心臓、肺、膵臓および肝臓への毒性と；血管反応お
よび高血圧反応と、皮膚反応とがある。

【００１３】血液への毒性は、臨床現場で使われている多数の抗腫瘍薬における毒性の中で
も、最も危険性の高いパターンである。そのほとんどに共通してみられるのが好
中球減少症で、これに伴って感染の危険も高くなるが、血小板減少症と出血も起
きて、生命を脅かすことがある。また、化学療法剤は多形核白血球と血小板の両
方の機能に、質的な欠陥を招くこともある。このような重大な副作用に取り組む
ために、造血成長因子が開発されてきた。Wilson, J.D.ら（1991）と、Dorr,R.T
.およびVon Hoff, D.D.編（1994）

【００１４】一般的に用いられている抗腫瘍薬のほとんどは、細胞性免疫および体液性免疫
の両方を抑制することができる。感染は、一般に癌が進行した患者に死をもたら
し、免疫力の低下もこのような死をもたらす一因になっている。慢性的、遅延型
免疫抑制も、癌の化学療法の結果として起こることがある。

【００１５】神経毒性の主要タイプは、くも膜炎と；脊髄障害または脳脊髄障害と；慢性的
脳障害および傾眠症候群と；急性脳障害と；末梢神経障害と；急性小脳症候群ま
たは運動失調症である。

【００１６】一般的に用いられている抗腫瘍薬の多くは、催奇形性のみならず、変異原性も
もっている。プロカルバジンやアルキル化剤を含む何種類のものには、明らかな
発癌性を示すものもある。この発癌性の可能性が最初に示されたのは、エトポシ
ドおよびアントラサイクリン系抗生物質などの多機能アルキル化剤およびトポイ
ソメラーゼIIの阻害剤で治療した患者に、遅延急性白血病がみられたことであっ
た。また、化学療法は、遅延型非ホジキンリンパ腫および充実性腫瘍の場合にも
行われてきた。プロドラッグは腫瘍細胞内で活性化されるだけなので、本発明は
、このような影響を最小限にすることができるであろう。

【００１７】化学療法剤の治療の有用性は、その薬剤に耐性の腫瘍細胞の出現によって厳し
く制限されることになる。薬剤耐性には、薬剤の代謝の変化、その活性物質に関
する細胞の不透過性または細胞からの薬剤排泄の加速化、抑制酵素の特異性の変
化、標的分子の生成増加、細胞毒性病変の修復増強、または生化学経路の変化に
よる抑制反応の副経路化など、おそらくたくさんの細胞性メカニズムが関与して
いると思われる。場合によっては、ある薬剤への耐性が、生化学的に全く異なる
別の薬剤への耐性を付与することもある。ある遺伝子の増幅が、生物学的療法お
よび化学療法への耐性に関与している。ジヒドロ葉酸リダクターゼをコードする
遺伝子の増幅は、メトトレキセートへの耐性に関係している一方で、チミジル酸
合成酵素をコードする遺伝子の増幅は、5-フルオロピリミジンでの治療に対する
耐性に関係している。表1は、生物療法および化学療法において重要な酵素をまとめたものである。表1 化学療法において過剰発現している酵素 *CAD = カルバミルリン酸合成酵素、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒドロオロターゼ **PALA = N-(ホスホンアセチル)-L-アスパラギン酸

【００１８】化学療法剤の選択性を高める溶液としてのプロドラッグの使用長い間、抗癌剤の乏しい選択性が認識されていて、選択性を改善し、もっと高
い用量で投与できるようにするための試行が繰り返されてきた。その1つの試みがプロドラッグの開発ある。プロドラッグは毒性学的には不活性物質であるが、
in vivoにおいて活性化した毒性物質に変わる可能性をもつ化合物である。場合によっては、この活性化は、抗体（"ADEPT"または抗体依存性酵素-プロドラッグ
療法（米国特許第4,975,278号明細書）または遺伝子ターゲティング（"GDEPT"ま
たは遺伝子依存性酵素-プロドラッグ療法（Melton,R.G.とSherwood,R.F.（1996 ））によって、標的細胞に運ばれる非内因性酵素の作用を受けて起こる。このよ
うな技術は、血液を排出させ、腫瘍に浸透させる技量の点で、厳しい限界がある
。Connors,T.A.とKnox,R.J.（1995）

【００１９】従って、腫瘍に浸透し、細胞増殖を抑制し、及び／又は治療に対して耐性を獲
得してきた癌細胞を致死させることのできるような選択性のより高い薬剤を必要
としている。本発明は、この必要性を満たすと同時に、関連する利点も提供する
。

【００２０】（発明の開示）本発明は、標的細胞または試験細胞を、候補治療薬または細胞内標的酵素の選
択基質であるプロドラッグと接触させることによって、治療の可能性を有する薬
剤を同定するための方法を提供する。一実施態様では、標的酵素というのは、内
因性の細胞内酵素で、過剰発現し、生物製剤および化学療法剤に耐性を付与して
いる。別の具体例では、腫瘍細胞において、腫瘍抑制機能が消失した結果、及び
／または、以前に化学療法への暴露を受けたことによる選択の結果、この酵素の
活性が非常に増強されることになった（Smith,K.A.ら(1995）とLi,W.ら(1995)) 。別の実施態様では、標的酵素は、細胞内にある外来性遺伝子の発現による産物
で、その外来性遺伝子は標的酵素をコードしている。

【００２１】細胞をin vitroおよび／またはin vivoでプロドラッグ候補と接触させた後、プロドラッグ候補によって細胞増殖の低下が認められるか、または細胞が死滅す
るかどうかによって、その薬剤の有効性の分析を行う。本発明の1つの実施態様は、プロドラッグが細胞を殺すか、または標的酵素によって、プロドラッグから
毒性副産物が遊離し、細胞増殖が抑制される。本発明の更なる実施態様において
、単独または複数の「標的酵素」が使われてプロドラッグを活性化し、毒性副産
物を放出することができる。

【００２２】本発明の別の実施態様は、標的酵素に対してここに記載した特性をもつ新しい
プロドラッグを評価する時に使用するためのキットを含む。そのキットは、評価
を行い、その結果について解析するために必要な試薬類と説明書からなっている
。

【００２３】また、本発明は、前述した内因性の細胞内酵素のような標的酵素にとって特異
的な基質であるプロドラッグと細胞とを接触させることによって、病的細胞を選
択的に死滅させる方法と分子の実施態様を提供する。この基質は、細胞内の標的
酵素によって、特異的に細胞内毒素に変換される。本発明の別の実施態様は、最
初に起こるプレパトリー（prepatory）反応の生成物が、アシラーゼ、ホスファターゼ、またはその他の「ハウスキーピング」酵素のような一般的な細胞内酵素
によって活性化される。Voet,ら（1995）プロドラッグから毒性副産物を遊離すること。

【００２４】また、本発明は、標的酵素の選択的基質で、その酵素によって過増殖細胞内で
細胞毒素に変換されるプロドラッグを投与することによって、被験者の病的な過
剰増殖細胞を特徴とする病変を治療するための方法を提供する。本発明のプロド
ラッグは、単独か、または別の化学療法剤や放射線照射のような選択的抗癌療法
と併用して用いることができる。

【００２５】本発明のさらに別の実施態様は、被験者における病的過剰増殖細胞を特徴とす
る病変を、標的酵素の選択的基質であり、過剰増殖細胞内で、その酵素によって
選択的に細胞毒素に変換されるプロドラッグを、被験者に投与することによって
治療する時に用いる薬剤を提供する。

【００２６】（発明の詳細な説明）本発明は、癌細胞の生物療法および化学療法への耐性に、本質的に関係してい
る鍵遺伝子および表現型の変化を利用することによって達成できる。本発明は、
癌治療（腫瘍壊死因子（TNF）ような生物治療または化学療法を含む）に暴露されることによって選択を受けた細胞の増殖抑制および／または細胞致死を、in v
ivoで選択的に引き起こす方法を提供する。（表1参照）。結果的に、突然変異ま
たは遺伝子増幅によって活性化された酵素は、その薬剤による治療を続けても耐
性を示す。内因的な細胞内酵素に対して、より有力なインヒビターを作り出すこ
とを目的とした従来技術の治療とは異なり、本発明は、治療に耐性のある病的細
胞および組織に、正常細胞や組織よりも高い酵素活性が備わっていることを利用
するもので、その酵素を抑制するものではない。1つの態様は、本発明のプロドラッグによる処理が成功した腫瘍細胞は、増強した標的酵素の活性で特徴付けら
れ、それによって、標的酵素を過剰表現していない正常細胞に比較して、プロド
ラッグを毒性型に変換するはるかに高い可能性を有する。本明細書中では、「標
的酵素」という用語を、前記の顕著な特徴を1つ以上有する酵素に意味に用いる。

【００２７】ここで使用されている「宿主細胞」、「標的細胞」および「過剰増殖細胞」と
いう用語は、細胞内酵素の遺伝子突然変異または内因性過剰表現を特徴とする細
胞を包含する。幾つかの実施態様では、その酵素の過剰発現は、薬剤耐性、また
は表現型の異常を伴う遺伝的不安定性に関連している。薬剤耐性には、多くの細
胞メカニズムが関与しており、例えば、薬剤の代謝の変化、その活性物質に関す
る細胞の不透過性または細胞からの薬剤排泄の加速化、抑制酵素の特異性の変化
、標的分子の産生増加、細胞毒性病変の修復増強、または生化学経路の変化によ
る抑制反応の副経路化などがある。活性化または過剰表現され、薬剤耐性に関係
している酵素には、チミジル酸合成酵素（TS）（Lonn,U.ら（1996）と；Kobayas
hi,H.ら（1995)と；Jackman,A.L.ら（1995））と、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（
Banerjee,D.ら（1995）およびBertino,J.R.ら（1996））と、チロシンキナーゼ（TNF-α, Hudziak,R.M.ら（1988））および多剤耐性（Stuhlinger,M.ら（1994 ））；Akdas,A.ら（1996）；および Tannock,I.F.(1996)）；および蛋白質随伴性ATP-依存性多剤耐性（Simon,S.M.およびSchindler,M.（1994））があるが、こ
れに限られてはいない。このほかにも、ある薬剤に対する耐性が、生化学的に全
く別の薬剤への耐性を授与する場合もある。この応用は特に癌に向けられている
が、同様なアプローチは、ヒトや動物の病原体でコードされた酵素に適用するこ
とができ、この場合は、耐性が進んだために、その阻害剤は失敗の状態にある。

【００２８】ある遺伝子の増幅は、化学療法への耐性に関与している。ジヒドロ葉酸レダク
ターゼ（DHFR）の増幅は、メトトレキセートに対する耐性と関係がある一方、チ
ミジル酸合成酵素をコードしている遺伝子の増幅は、5-フルオロピリミジンでの
腫瘍の治療に対する耐性と関係がある。薬剤耐性に伴う遺伝子の増幅については
、このほかにも、Kashini-Sabetら（1988）または米国特許第5,085,983号明細書
に記載されているように、PCR変法で検出し、チェックを行うことができる。均一染色領域および二重微小染色体は、いずれも遺伝子増幅に伴って起こる細胞遺
伝学的異常であるが、これを検出することによって、耐性を獲得したかどうかを
、確認することができる。これに代わる分析方法として、直接的または間接的酵
素活性分析（例CarrerasとSanti（1995））があり、いずれも遺伝子増幅に結びついているが；そのほかの方法（例、PCR, Houze,T.A.ら（1997））または免疫組織化学（Johnson,P.G.ら（1997））もある。

【００２９】このほか、標的細胞は、腫瘍抑制機能が不活化されているのが特徴であり、網
膜芽細胞腫（RB）またはp53は、TS（Li,W.ら（1995））またはDHFR（Bertinoら（1996）とLi,W.ら（1995））の発現を増強することが知られているが、これらの消失または不活化がその例である。

【００３０】疾患に関連している酵素が化学療法への耐性と関係がある場合で、幾つかの具
体例には、例えばTS酵素のように、正常細胞よりも病的細胞において、その酵素
が過剰発現、過剰集積または活性化している場合、本発明のプロドラッグが任意
の疾病の治療または改善に役立つ。一部のヒトの腫瘍で、上昇することが分かっ
ていたグルタチオン-S-トランスフェラーゼという酵素は、とりわけ対象外となる。Morgan,A.S.ら（1998）。本発明のプロドラッグは、本発明の標的酵素が一般的に、正常細胞よりも病的細胞において、過剰表現、過剰集積、または活性化
されているということで区別できる。本発明を、ほかの方法と区別する最も重要
な原則を以下に記す：

【００３１】（1）本発明は、チミジル酸合成酵素のような酵素について、基質の合成について述べたものである。この過剰に表現された酵素は、病的細胞で選択的に毒素を
産生する。これまでの取り組みは、阻害剤に頼るものであった。阻害剤を用いる
ことによって、その酵素の表現が増幅され、続いて治療に対する耐性を示すよう
になる（例えば、Lonn, U.ら(1996)参照）。

【００３２】（2）また、本アプローチは、例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ酵素
（例、Morgan,A.S.ら(1998)参照）などの「基質-プロドラッグ」法とも異なる（
Morgan.A.S.ら（1988））。GSTファミリーの酵素は、細胞への毒性的損傷に反応
して上昇したレベルで発現する。GSTファミリーの酵素は特異基質が重複しているため、癌細胞において過剰に表現されている酵素の単独の種類とのみ反応する
基質を設計するのは不可能である（Morgan,A.S.ら（1998））。本発明の酵素（例、チミジル酸合成酵素、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジンキナーゼ）
は、構造および基質の特異性はそれぞれに特有のものであることから、独自の基
質を設計することはたやすい。本出願の明細書中、チミジル酸合成酵素について
の基質の幾つかの具体例が提供される。

【００３３】（3）標的酵素（例、チミジル酸合成酵素）をコードしている遺伝子が、突然変異を起こして阻害剤への耐性を得ることもあるが、まだ非阻害基質との反応を行
うことは可能である。Barbour, K.W.ら（1992）及びDicken,A.P.ら（1993）。

【００３４】薬剤分析本発明は、例えば癌のような過増殖性または腫瘍性異常に対する治療の可能性
を有する薬剤を同定するための方法を提供するものである。また、その方法は、
癌細胞のような過増殖細胞の増殖または周期を抑制する薬剤を同定するものでも
ある。ほかの細胞としては、患者において不適切な増殖の結果、疾病を引き起こ
す細菌、酵母および寄生虫細胞が含まれる。細胞の増殖、複製、または周期が対
照細胞に比べて抑制されている場合、その薬剤は治療薬としての可能性があると
みなされる。最も望ましいのは、その薬剤によって、細胞が死亡することである
。その細胞は、原核性（E.coliのような細菌）または真核性のものであってもよ
い。細胞は、哺乳類または非哺乳類の細胞のいずれも該当することから、マウス
細胞、ラット細胞、ヒト細胞、真菌（例、酵母）または疾病を引き起こす寄生虫
（例、PneumocystisまたはLeishmania）が挙げられる。

【００３５】ここで用いられているように、「過増殖細胞」というのは、分化型、不滅化、
、腫瘍性、悪性、転移性、変換型の細胞を含むこととする。このような細胞の例
としては、肉腫細胞、白血病細胞、癌細胞、または腺癌細胞があるが、これに限
られているわけではない。さらに具体的には、その細胞は、乳癌細胞、肝細胞癌
細胞、結腸直腸癌細胞、膵臓癌細胞、食道癌細胞、膀胱癌細胞、卵巣癌細胞、皮
膚癌細胞、肝癌細胞、または胃癌細胞をあげることができる。これに代わる具体
例としては、標的細胞が、慣用の抗体には耐性のある感染因子に感染した細胞を
抑制または殺すために使われる薬剤または化合物に、耐性をもっている場合であ
る。感染因子には、細菌、酵母及びトレパノゾーマのような寄生虫が含まれる。

【００３６】本発明の主題である標的酵素の具体的な例を、表1（上記）または表2（下記）
に示す。このような酵素は、化学療法への耐性に関与するもので、癌治療への耐
性を特徴とする細胞において、内因的に活性化、過剰発現、または過剰集積され
、疾病に関与しており、チロシンキナーゼスーパーファミリーのメンバー、ATP 依存性MDR随伴蛋白質、CAD、チミジル酸合成酵素、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、
リボヌクレオチドレダクターゼなどの酵素が含まれるが、これに限られているわ
けではない。表2は、感染症の場合、この方法の目標とする酵素のリストである。

【００３７】表2 感染症において過剰発現している酵素で薬剤耐性に寄与するもの参照： Mechanisms of Microbial Disease, 2^nd Ed., M.Schaechter, G. Medlo
ff, B.I. Eisenstein, Editor TS Satterfield. Publ. Williams and Wilkins,
pp. 973 (1973)

【００３８】本発明の方法によって同定された治療薬の可能性を有する薬剤とは、その酵素
の基質で、細胞内で細胞毒素に変換されるプロドラッグのことを指す。ここで使
われている「プロドラッグ」は、製剤学的に活性な剤又は物質の前駆体または誘
導体であって、それは、その薬物の代謝産物に比べて、標的細胞または過増殖細
胞に対して細胞毒性が低く、酵素的に活性化されるか、またはより活性の高い型
に変換される（Connors,T.A.（1986）と、Connors,T.A.（1996）参照）。この薬
剤の毒性を、異常細胞で治療濃度の細胞毒を産生するのに有効な変換酵素を生成
している細胞に向ける。

【００３９】また、この発明では、求められた特性について、少なくともその一部を有する
化合物を最初に識別することができる、迅速で単純な選別方法を提供している。
本発明のために図3に、本発明の全体像を具体的に示す。この図では、この分析がどのような順序で行われるのかということと、その過程で必要となる材料を示
してある。図3に示されているように、この分析方法には、2種類の細胞が必要で
、1つは、標的酵素が表現されていないか、または低いレベルで表現されている対照細胞である。2つ目の細胞は試験細胞で、この細胞では標的酵素が検出可能レベル、例えば高レベルで発現されている。例えば、内因的に標的酵素を発現し
ていない原核細胞のE.coliは、好適な宿主細胞または標的細胞である。この細胞
は対照となるもの（標的酵素を欠いている）を有し、又は、別の実施態様では、
差別的に標的酵素または酵素類（標的酵素にの適切な種類を含む）を発現するよ
うに遺伝子学的に修飾した対照物を有することができる。2種類以上の酵素を使用して別の宿主細胞に別々に導入することができ、ある標的酵素に関する候補薬
剤の効果を、別の酵素または別の種から取り出した同一酵素と同時に比較するこ
ともできる。

【００４０】別の実施態様では、ras-形質変換型 NIH 3T3細胞（ATCC, 10801 University B
lvd., Manassas, VA 20110-2209, U.S.A.）のような形質転換細胞系が、その酵素をコードするクローン化cDNAから、対象となる標的酵素の量を変え、増加させ
て発現するように操作されている。形質移入は、当技術分野でよく知られた手法
を用いて行い、一過性または永続的なものであり、これについてはChen, L.ら（
1996）、Hudziak, R.M.ら（1988）、またはCarter, P.ら（1992）の記述がある。cDNAの挿入に適するベクターは、Stratagene, La Jolla, CAやその他の業者か
ら購入することができる。各形質移入細胞系における酵素の発現レベルは、酵素
に対して免疫検出用に予め産生させたモノクローナル抗体またはポリクローナル
抗体を使って、免疫ブロットおよび細胞溶解産物の酵素分析法によって測定する
ことができる。例えば、Chen, L.ら（1996）参照。発現量は、細胞に挿入された
発現カセットのコピー数または使用したプロモータの違いによって調節すること
ができる。また、酵素分析法については、Carreras,C.W.およびSanti,D.V.（199
5）が概説している。

【００４１】前記のように、希望する遺伝子欠損細胞は、Cold Spring Harbor、Agricultur
al Research Service Culture Collection、またはAmerican Type Culture Coll
ectionから入手することができる。適切な株は、Miller（1992）と、Sambrookら
（1989）と、Spectorら（1997）とが報告しているような標準的な手法を用いて、標的酵素をコードしている遺伝子を、その細胞に挿入することによって調製す
ることができる。増殖度の評価は、Miller（1992）とSpectorら（1997）が報告している標準的な方法によって実施することができる。

【００４２】当業者によれば、図3に示した選別法が、抗生物質の発見に広く応用できることが理解される。例えば、酵母由来のチミジル酸合成酵素は、図4ではE.coliの酵素に置き換えれている。これによって病原性と関連のある酵母を標的としてい
る特異的抗真菌性抗生物質の開発を行うことが可能となる。さらに、別の酵素も
、この治療に取って代わる可能性もある。例えば、Pneumocystis carniiのような感染因子のジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を特異的に標的としているプロドラ
ッグを選択することができる。このような薬剤は、標的酵素に関する特異性で選
択され、図3に述べてあるようなスクリーニング方法を使って、自然宿主の酵素を活性化しないことを示すことができる。正常なヒト由来酵素のみが存在する時
は毒性がないことを示すために、対照の細胞には、対応するヒト由来の正常な酵
素を含むようにする。

【００４３】実例と図4に示したように、TSをコードしているヒトの遺伝子などの外来性遺伝子を、ヒト由来のTSを発現させるために、宿主細胞に挿入することができる。
このように遺伝的に操作された細胞は、図3では「試験細胞」と表わされている。「対照細胞」は、その標的酵素を発現しない。幾つかの実施態様では、標的酵
素の蛋白質産物を培地に補う必要があることもある。

【００４４】別の実施態様では、野生型宿主細胞は、対象とする1種類以上の酵素を欠損するか、または発現していない。図4に示したように、宿主細胞は、チミジンキナーゼを内因的に産生しないか（TK^-）またはチミジル酸合成酵素を内因性に産生しない（TS^-）。発現に望ましいレベルを獲得するために、ヒトの両酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入する。各形質移入細胞系における酵素の表現レベ
ルは、酵素に対して免疫検出用に産生させたモノクローナル抗体またはポリクロ
ーナル抗体を用いて、免疫ブロットおよび細胞溶解産物の酵素分析法によって測
定することができる。例えば、Chen, L.ら（1996）の記載があるので、参照のこ
と。また、酵素分析法については、Carreras,C.W.およびSanti,D.V.（1995）が概説しているように、トリチウム標識置換基のように、標識された置換基を使っ
て検出できるようにする。

【００４５】試験細胞は、小さいウェルのたくさんあるプレートに増殖させ、試験プロドラ
ッグの生物学的活性を検出するために使用される。本発明の意図するところは、
候補薬剤が成功した場合は、試験細胞の増殖抑制または細胞致死を起こさせるが
、対照細胞には損傷を与えない。

【００４６】候補プロドラッグは細胞の培地に直接加えるか、または細胞表面のレセプター
に特異的なリガンドにあらかじめ結合させ、後で培地に加えることができる。細
胞に特異的に運搬させる方法は、技術的には広く知られているが、米国特許第5,
459,127号及び第5,264,618号明細書と、公開特許公報 WO91/17424 （1991年11月
14日公開）を参照のこと。候補薬剤の分離する基は、検出できるようにするため
に、例えばトリチウムで標識する。次に、標的細胞または培地を用いて候補薬剤
から分離された標識の量を測定する。これに代わる方法として、Lasic,D.D.（19
96）に記載されている方法を使って、プロドラッグをリポゾームに詰め込むこと
によって、細胞の取込みを増強させるか、またはLewis,J.G.ら（1996）に記載さ
れているようにcytofectinと結合したものを用いてもよい。

【００４７】別の実施態様で、対象とする酵素、すなわち標的酵素を過剰発現しているヒト
腫瘍由来の培養細胞が、前記のように同定される。該細胞を、その細胞内区画へ
治療薬の可能性を有する薬剤が組み込まれやすい条件下で、該薬剤と接触させる
。その後、細胞を、細胞増殖抑制または細胞致死に関して分析する。

【００４８】次に、本発明のプロドラッグを活性化させるのに有用な細胞と標的酵素につい
て簡単にまとめる。

【００４９】チミジル酸合成酵素チミジル酸合成酵素の過剰発現は、結腸癌、乳癌、胃癌、頭部および頚部の癌
、肝臓癌及び膵臓癌にみられる。このような疾患には、最近は、代謝拮抗薬（ウ
ラシル、葉酸、またはキナゾリンを有する（表1参照））による治療が行われている。このような各症例では、5-フルオロウラシル療法によって、TSの活性の増
大を招くか、またはその酵素の薬剤耐性型が選択されるため、薬剤耐性になり、
病気が再発する。Lonn,U.ら（1996）は、術後、補助化学療法（シクロフォスファミド、メトトレキセート、5-フルオロウラシル [CMF] ）を受けたことのある乳癌患者に、TS遺伝子の増幅が起こることを報告した。TSによって起こる正常な
反応は、デオキシウリジン1リン酸（dUMP）とN(5),N(10)-メチレン-テトラヒドロ葉酸（THF）から、デオキシチミジン1リン酸（dTMP）とジヒド葉酸（DHF）とを合成することである。一実施態様では、ウラシルまたはTHFの誘導体が、TSを発現している細胞に提供される。本発明には、反応が起こるためには、「ウラシ
ル」（塩基のみ）と「ウリジン」（塩基と糖）が、入れ代わって同義に使われる
。

【００５０】その誘導体または「プロドラッグ」は、その酵素によって、非常に細胞毒性の
強い代謝産物に変換される。正常細胞において発現するTSの低レベルは、毒性量
の変換毒素を産生しない。病的組織では、TSの発現レベルが高いために毒素が多
くなり、そのために細胞の増殖抑制及び／または細胞致死を招く。例えば、現行
の治療法では、TS活性を抑制するために、5-フルオロデオキシウリジレートを用
いる。基質との反応の間、フッ素原子が不可逆的にTS酵素に結合し、これを阻害
する。本発明の1実施態様とは対照的に、プロドラッグは、TSにその反応を起こさせ、修飾された生成物を作り、これがDNAと結合すると、毒性作用を引き起こす。その酵素の生成物は、ほかの重要な細胞機能を障害することもある（例、蛋
白質合成またはエネルギー代謝）。また、プロドラッグの転換は、細胞に毒性の
あるBr^-、I^-、CN^-などの代謝産物を遊離することもある。Uracil/dUMPとN(5)(10
)-THFの誘導体が合成されるが、このような物質はいずれもTSによって酵素的に触媒作用を受けた後、遺伝的毒性物質になる可能性を有する。

【００５１】 5位で置換されたピリミジンヌクレオシドと5位で置換されたピリミジンヌク
レオシドモノホスフェイトの合成は、技術的によく知られた手法によって達成す
ることができる。例えば、Li₂PdCl₄の存在下で、ハロアルキル化合物、ハロ酢酸
塩、またはハロアルケンで5-クロロメルクリ-2'-デオキシウリジンを処置すると
、有機パラジウム中間産物を経て、それぞれ5-アルキル、5-アセチル、または5-
アルケン誘導体を形成する。Wataya,ら（1979）とBergstrom,ら（1981）。このほかのピリミジンヌクレオシドおよびヌクレオシドのC5-修飾の例としては、、L
i₂PdCl₄の存在下で、酢酸第2水銀による無保護ヌクレオチドの処置に続いてスチ
レンまたは環置換スチレンを加えることで、C5-トランス-スチリル誘導体が形成
される。Biggeら（1980）。ピリミジンデオキシリボヌクレオシド3リン酸は、酢
酸緩衝液中の酢酸第二水銀と50°で3時間処理することによって、ピリミジン環の第5位に、水銀が誘導された。Daleら（1973）。このような処置は、1リン酸を
修飾する際にも有効であり；修飾3リン酸を、酵素の働きで、修飾1リン酸に変換
することも可能であり、例えばアルカリホスホターゼを用いた制御された処置に
続いて、1リン酸の精製を行うことができる。そのほかの基は、有機または非有機で、水銀に似た分子性状をもっているが、好ましい薬理学的性状をもっており
、置換されることがある。置換されるピリミジンを合成するための一般的な方法
に関しては、例えば米国特許第4,247,544号、第4,267,171号及び第4,948,882号明細書とBergstromら（1981）とがある。また、前記の方法は、5位で置換された
ピリミジンヌクレオシドと、リボースまたは2'-デオキシリボース以外の糖で、
例えば2'-3'-ジデオキシリボース、アラビノース、フラノース、リキソース、ペ
ントース、ヘキソース、ヘプトースおよびピラノースなどを有するヌクレオチド
の誘導体の合成にも応用できる。このような置換基の例としては、ハロビニル基
があり、例えばE-5-（2-ブロモビニル）-2'デオキシウリジレートを挙げることができる。Barr,P.J.ら（1983）。この参考文献では、著者らは、普通、5位（ブ
ロモビニル）で不活性置換基が、ウリジン複素環の6位で酵素を介した求核性の攻撃の結果、化学的に活性のある基に変換することができ、反応性アルキル化剤
の生成物になることを示した。この化合物は、内因性のチミジル酸合成酵素はで
は活性化されないということと、チミジル酸合成酵素による変換はチミジル酸合
成酵素の不活化に繋がるということから、本出願の見地からは有用性はない（Ba
lzariniら、1987）。しかし、改良された置換基が合成されて、TSとの反応性、及びTSを過剰産生する腫瘍細胞への特異的な細胞毒性について、比較することに
なるであろう。

【００５２】これに代わるものとして、5-ブロモデオキシウリジンと、5-イオドデオキシウ
リジンと、それぞれの1リン酸誘導体は、Glen Research, Stering, VA (USA)と、Sigma-Aldrich Corporation, St Louis, MO (USA)と、Moravek Biochemicals,
Inc., Brea, CA (USA)と、ICN,Costa Mesa, CA (USA)と、New England Nuclear
, Boston, MA (USA)から購入することができる。Gen Research, Sterling, VA (
USA)とICN, Costa Mesa, CA (USA)から購入した試薬を使うと、キナーゼ酵素の作用にも関わらず、市販の5-ブロモデオキシウリジンと、5-イオドデオキシウリ
ジンを、化学的手法または酵素的手法のいずれの方法によっても、1リン酸誘導体に変換することができる。このようなハロゲン誘導体は、他の置換基と結合さ
せて新規でより可能性の高い代謝拮抗剤を作ることができる。

【００５３】 TSの1次構造は、TSが非常に保存性の高い酵素であることを示している。Perry
, K.ら（1990）。Lactobacillus casei（Hardy, L.W.ら（1987）とFiner-Moord,
J.S.ら（1993））と、Escherichia coli（Perry K.ら（1990））の原核生物種と；真核生物Leishmania majpr （Kinghton,E.R.ら（1994））と；T4ファージ（
Finer-Moore, J.S.,ら（1994））由来のTSの結晶構造が決定され、3次構造も非常によく保存されることを示している。TSの3次構造がすでに決定されている種の配列は、Schiffer,C.A.ら（1995）に示されている。このようなアミノ酸配列から、DNA配列の推論を行ってもいいし、または当業者によく知られた手法を用いて分離することもできる。Sambrook,ら（1989）。Carreras, C.WとSanti, D.V
.（1995）に記述されているように、異なる生物からの29TS配列がクローン化され、DNAデータベースに寄託された。Takeishi, K.ら（1985）と、Davissin,V.J.
ら（1989）と、Davisson, V.J.ら（1994）には、ヒトのチミジル酸合成酵素遺伝
子の配列と、そのクローン化と、発現および精製とが示されている。当業者によ
く知られている手法を用いて、TS蛋白をコードし、必要な調節配列を含む遺伝子
の構成が判明した。TSをコードしている遺伝子は、電気穿孔、形質転換、または
形質移入の手法によって、標的細胞に導入される。Sambrookら（1989）。ほかに
も、Carreras, CW.とSanti,D.V.（1995）と、Miller（1992）と、Spectorら（19
97）に記述があるように、技術的によく知られている手法を用いて、遺伝子を適
当な発現ベクターに挿入する方法がある。その発現ベクターが、細胞にTS遺伝子
を挿入する。その細胞は、その後、TS蛋白の発現と産生が起こりやすい条件下で
培養される。

【００５４】ヒト胃癌細胞系のMKN-74、MKN-45、MKN-28およびKATO-IIIは、TSの選択基質で
、治療薬としての可能性を有する薬剤を同定するために、前記分析方法において
使用できる。MKN-74とMKN-45は、それぞれ分化型腺癌と未分化型腺癌から確立さ
れたものである。このような細胞系とその培養条件については、Osaki,M.ら（19
97）に記載があり、そこに文献が引用してある。そのほかにもCopur,S.ら（1995
）によって記載されているような腫瘍細胞系があるが、チミジル酸合成酵素を過
剰発現させるために、5-FUによって選択されたものを使用してもよい。

【００５５】 TSの定量は、当業者に良く知られている酵素的生化学分析を用いて行うことが
できる。ヒト腫瘍組織由来のTS蛋白とTS遺伝子発現のレベルを測るには、Johnst
on,P.G.ら（1991）とHorikoshi, T.ら（1992）によって報告されている方法で、
鋭敏な分析を行うことができる。そのほかには、Lonn, U.ら（1996）のPCR法を使用してTS遺伝子の増幅を評価し、ここに記載している治療薬剤の同定方法に役
立つ細胞を同定するために使われる。

【００５６】この分野に精通した人には明らかなように、薬剤を与えなかった対照の細胞と
、これとは別に、後で例証する参照薬剤に関して行った対照の細胞についても、
分析を行う。プロドラッグとして好ましい具体例は、正常細胞よりも約2倍、できれば約3倍、またはそれ以上の活性で、標的細胞を優先的に死に到らしめるものである。

【００５７】別の実施態様では、本発明は前記方法を最初に行うことによって、過剰増殖細
胞の増殖を抑制するための方法を提供するものである。この方法によって同定さ
れるプロドラッグは、細胞と接触した後、細胞内で上記の内因性の細胞内酵素に
よって毒性代謝産物に変換される。

【００５８】一つの実施態様では、内因性の細胞内酵素というのはチミジル酸合成酵素をさ
し、細胞は、結腸細胞、頭部および頚部の癌細胞、乳癌細胞、または胃癌細胞か
らなる群から選択される。

【００５９】さらに別の実施態様では、チミジル酸合成酵素を過剰発現している細胞と接触
させるプロドラッグは、式のL型化合物またはD型化合物で；鏡像異性体、ジアステレオマー型、または立体
異性型のいずれであってもよく、例えばD-形またはL-形と、α-またはβ-アノマ
ー型などがある。

【００６０】前記式で、R₁（5位）は、チミジル酸合成酵素によってピリミジン環からの抽出に適合する分子の大きさと求電子性を有する化学物質である遊離基そのもの、
またはこれを含むものであり、チミジル酸合成酵素によるピリミジン環からの遊
離に際し、細胞の増殖を抑制するか、または致死させる能力を有する。

【００６１】一実施態様では、R₁は、-Br、-I、-O-アルキル、-O-アリール、O-ヘテロアリール、-S-アルキル、-S-アリール、-S-ヘテロアリール、-CN、-OCN、-SCN、-NH₂ 、-NH-アルキル、-N(アルキル)₂、-NHCHO、-NHOH、-NHO-アルキル、NH₂CONHO-、
NHNH₂および-N₃からなる群から選択される化学物であるか、又はそれらを含む。
R₁の別の例は、式のシスプラチンから誘導される。

【００６２】前記式のL形化合物またはD形化合物において、Qは、糖類と、チオ糖類、炭素環類及びその誘導体からなる群から選択される化学物質である。糖類の例として
は、オキセタン（4員環糖）から誘導された物質のような環状単糖類、フラノース（5員環糖）及びピラノース（6員環糖）があるが、これに限られてはいない。
フラノースの例では、トレオ-フラノシル（トレオースから、5炭糖）、エリスロ
-フラノシル（エリスロースから、4炭糖）、リボ-フラノシル（リボースから、5
炭糖）、アラ-フラノシル（アラビノース-フラノシルと呼称されることが多く、
アラビノースから、5炭糖）、キシロ-フラノシル（キシロースから、5炭糖）及びリキソ-フラノシル（リキソースから、5炭糖）がある。糖類誘導体の例には、
置換基誘導体と同じように、「デオキシ」と、「ケト」と、「ジヒドロ」誘導体
がある。チオ糖類の例としては、前記の糖類の硫黄類似体（sulfur analogs）が
含まれ、環の酸素が硫黄原子に置換されたものである。炭環類の例としては、C₄ 炭環類と、C₅炭環類と、C₆炭環類とが含まれ、いずれも更に-OH基のような置換基を少なくとも1つは持っていてもよい。

【００６３】一実施態様では、Qは、式で表されるフラノシル基で、R₂とR₃は同一でも異なっていてもよく、各々独立し
てHまたは-OHである。具体例の1つは、R₂とR₃がHである。具体例の1つは、R₂がO
Hで、R₃がHである。具体例の1つは、R₂がHで、R₃がOHである。具体例の1つは、R ₂ とR₃がOHである。

【００６４】一実施態様では、Qは、式で表されるβ-D-リボフラノシル基で、R₂とR₃は同一でも異なっていてもよく、各々独立してHまたは-OHである。

【００６５】具体的には、ヒドロキシメチル基（例えば、β-D-リボフラノシルの4'-ヒドロ
キシメチル基）をリン酸化してもよい。

【００６６】ピリミジンの5位に付着し、前記の位置的制限に適合するアルキル化剤を修飾したものを、用いることができる（Haskell, C.M.ら編（1995）,pp.55-58）。遊
離したウラシルの5位の成分を検出するための方法として、細胞を用いないスクリーニング方法または細胞を用いるスクリーニング方法が、Roberts,D.（1966）
とHashimoto,Yらによって記載されている。

【００６７】 R₁がCN^-を含む場合、非常に毒性の強いCN^-の部分が、治療の上で活性を示す。
本来CN^-の毒性は非特異的であるため、通常、治療に用いることはできない。この問題は、その毒素を、チミジル酸合成酵素を過剰に発現している細胞において
のみ著しく活性を示すプロドラッグの様式で与えることによって、解決すること
ができる。

【００６８】さらに、プロドラッグは、細胞内酵素で、具体的には、「ハウスキーピング」
酵素によってさらに修飾されるものによって、毒性代謝産物に変換される。以下
に1例を示す

【００６９】 dUMPとTSの部分的な反応についての記述は、関係のある分析方法と合わせ
て、Garrett,C.ら（1979）に記載されている。そのほかの生成物、すなわち最終
的な反応生成物が、dUMPのブロモビニル誘導体の抗代謝産物である場合、これに
関する分析方法はBarr,P.J.らに記載されている（1983）。本発明のプロドラッグの塩は、無機または有機の酸と塩基から誘導される。酸の具体例は、塩酸、臭
化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール
酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ネフ
タレン-2-スルホン酸、ベンゼンスルホン酸が含まれる。そのほかにも、シュウ酸のように、薬剤学的にそれ自体は容認されなくても、本発明の化合物を得る時
に、中間産物として有用な塩の生成に使われる酸や、薬剤学的に容認される酸付
加塩がある。塩基の例には、アルカリ金属（例、ナトリウム）水酸化物、アルカ
リ土類金属(例えばマグネシウム)水酸化物、アンモニア、NW₄ ⁺の式（式中WはC_1- ₄ アルキルである）の化合物が含まれる。

【００７０】塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、
安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノ
ウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、グルコン酸
塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、
グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩化水素酸塩、
臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレ
イン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シ
ュウ酸塩、パルモエート（palmoate）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルオウ
ロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石
酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカンサン酸塩がある。塩のその他の
例としては、本発明の化合物をNa⁺、NH₄ ⁺、NW₄ ⁺（式中WはC_1-4アルキル基である
）などの適切なカチオンと混合してできた化合物のアニオンが挙げられる。

【００７１】本発明の化合物の塩は、治療に使用するための製剤学的に許容できるものであ
る。しかし、製剤学的に許容されない酸と塩基からなる塩も、例えば、製剤学的
に許容できる化合物の調製や精製における使用が見つかるかもしれない。

【００７２】本発明の方法によって同定されたプロドラッグまたは化合物のエステルには、
2'-,3'-及び／又は5'-ヒドロキシ類のエステル化によって得られたカルボン酸エ
ステル（すなわち、-O-C(=O)R）があり、式中、Rは（1）直鎖または分岐のアルキル（例、n-プロピル、t-ブチル、またはn-ブチル）、アルコキシアルキル（例
、メトキシメチル）、アラキル（例、ベンゾール）、アリールオキシアルキル（
例、フェノキシメチル）、アリール（例、例えばハロゲン、C_1-4アルキル、C_1-4 アルコキシまたはアミノで置換されていてもよいフェニル）；（2）アルキルスルホニルなどのスルホン酸エステル（例、メタンスルホニル）またはアラキルス
ルホニル；（3）アミノ酸エステル（例、L-バリルまたはL-イソロイシル）；（4
）ホスホン酸エステルと（5）モノ-、ジ-、またはトリリン酸塩エステルが含まれる。リン酸塩エステルは、例えばC_1-20アルコールまたはその反応性誘導体によって、または2、3-ジ-（C_6-24）アシルグリセロールによって、さらにエステル化されていていてもよい。このようなエステルにおいて、ほかに指定がなけれ
ば、存在する任意のアルキル基は有利には炭素原子1-18個、特に1-6個、さらに好ましくは1-4個を含む。このようなエステルにおける任意のシクロアルキル成分は、3-6個の炭素原子からなるものが都合がよい。このようなエステルにおける任意のアリール成分は、フェニル基を含んでいるのが有利である。本発明のリ
キソ-フラノシルプロドラッグ誘導体の例としては、2'-O-アセチル-リキソ-フラ
ノシル；3’-O-アセチル-リキソ-フラノシル；5’-O-アセチル-リキソ-フラノシ
ル；2',3'-ジ-O-アセチル-リキソ-フラノシルおよび2',3',5'-トリ-O-アセチル-
リキソ-フラノシルのように化学的に保護されたヒドロキシ基（例、O-アセチル基）がある。

【００７３】本発明の化合物のエーテル類には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソ
ブチル及びsec-ブチルエーテルがある。

【００７４】更なる具体例では、その基質は、化学的にピリミジンまたは葉酸には関係して
いないこともあるが、論理的なドラッグデザインの公知のパラメーターに基づい
てを合成される。Dunn,W.J.ら参照（1996）。

【００７５】当業者には明らかなように、薬剤を与えなかった対照の細胞と、これとは別に
、以下に例証する参照薬剤に関して行った対照の細胞についても、分析を行う。
正常細胞の約2倍、できれば3倍またはそれ以上の活性で、標的細胞を優先的に殺
す化合物であることが望ましい。本発明は、ここで記述した方法によって同定さ
れた薬剤を提供するものである。

【００７６】チロシンキナーゼチロシンキナーゼスーパーファミリーは、EGF受容体（EGFR）、マクロファージコロニー刺激因子（CSF-1）受容体（V-Fms）、及びインスリン受容体を含んで
おり、これはros 癌遺伝子の産物と30-40％の同一性を示している。さらに詳しくは、このスーパーファミリーのメンバーには、v-src、c-src、EGFR、HER2、CS
F-1受容体、c-fms、v-ros、インシュリン受容体及びc-mosが含まれる。Burck,K.
B.ら編（1988）の図8.5参照。タイプ1受容体チロシンキナーゼスーパーファミリ
ーのメンバーの過剰発現は、多くの種類の癌で報告されてきた（Eccles, S.A.ら
（1994-95））。チロシンキナーゼの過剰発現は、α-癌生物因子TNF-α（Hudzia
k,R.M.ら（1988）とHudziak,R.M.ら（1990））と、化学療法（Stuhlingerら（19
94））への暴露に関係している。

【００７７】ラウス肉腫ウイルスの形質転換遺伝子であるv-srcは、蛋白質のチロシン残基のリン酸化を触媒する酵素をコードしている。C-src 癌原遺伝子は、第20染色体
に認められる。神経外胚葉由来で神経表現型を有する腫瘍から得られた組織およ
び細胞系では、特殊キナーゼの高い活性を伴うc-srsが高レベルで発現する。

【００７８】いくつかの研究グループは、癌細胞のc-erbB-2/neu（"HER2"）癌遺伝子の過剰
発現を報告した。Brison（1993）は、ヒトの腫瘍では、erbB癌原遺伝子が増幅し
た結果、ほとんどの症例で過剰発現になっていると記載した。C-erbB-2/neu癌遺
伝子の増幅は、ヒトの乳腺腫瘍（Slamonら（1987）、van de Vijverら（1987）、Pupaら（1993）およびAndersenら（1995））と、膀胱腫瘍（Sauterら（1993）
）で報告され、すべての症例で、増幅に過剰発現が伴っていた。C-erbB-2/neuの
過剰発現は、卵巣癌の組織サンプルと、末梢神経系由来腫瘍でも報告された（Sl
amonら（1989）、Medenら（1994）およびFelipら（1995））。SukumarとBarbaci
d（1990）。

【００７９】薬剤のスクリーニングを行うために、腫瘍細胞系を、癌遺伝子の発現について
評価するか、またはチロシンキナーゼのレベルを変えて発現するように処理する
。選択された細胞系を培養し、各種濃度の候補薬剤をこれに加える。Hudziak, R
.M.ら(1988)及びHudziak, R.M.ら(1990)に記載されているように、細胞致死また
は増殖抑制について、その細胞を評価する。

【００８０】ジヒドロ葉酸レダクターゼメトレキサレートは、細胞内の葉酸代謝に必要な酵素であるジヒドロ葉酸レダ
クターゼの阻害剤である可能性を有している。ジヒドロ葉酸レダクターゼは、ジ
ヒドロ葉酸から、チミジル酸合成反応の生成物の1つであるテトラヒドロ葉酸を再生する働きをしている（Voetら編集(1995)、p.813）。細胞のメトレキサレートへの耐性の重要なメカニズムとなっているのが、DHFR遺伝子の増幅によるDHFR
の活性の増加であることが十分に確立している。Banerjee,D.ら（1995）、Schim
ke, R.T.ら（1988）。Lonn,U.ら（1966）は、DHFR遺伝子の増幅が、以前、術後に補助的な化学療法（シクロフォスファミド、メトレキサレート、5-フルオロウ
ラシル[CMF]）を受けていた乳癌患者で起こったことを報告した。網膜芽細胞腫（Rb）が欠損している場合も、DHFRmRNA発現活性が上昇するため、遺伝子の増幅
を伴うことなくMTX耐性が増強されることがある。Li,W.W.ら（1995）。p53が突然変異を起こした細胞系では、遺伝子の増幅が起こることがわかっていて、耐性
細胞は、化学療法によって選択される。Banerjee,D.ら（1995）、Yin,Y.ら（199
2）およびLivingston,L.R.ら（1992）。本発明の分析を行うためにSchimke,R.T.
ら（1988）はマウスと、ハムスターと、ヒトの細胞系について記載している。あ
るいは、Lonn,U.ら（1996）のPCR法を使用して、DHFR遺伝子の増幅を評価し、こ
こに述べられているように、治療薬の同定に有用な細胞を見極める。ヒトのジヒ
ドロ葉酸レダクターゼをコードしているcDNAのヌクレオチド配列はMasters,J.N.
とAttardi,G.（1983）にあり、ここに記載されているように、酵素の発現レベル
が変動するように、細胞を操作することができる。Dicken,A.P.ら（1993）は、化学療法によって選択した突然変異DHFR遺伝子について述べている。DHFRの精製
と酵素機能に関する分析方法については、Nakano,Tら（1994）に記載がある。こ
のほか、DHFRをコードしているcDNAは、NIH3T3細胞系に形質移入されている。候
補薬剤を濃度を変えて加えた後、細胞致死と増殖抑制を評価する。

【００８１】ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性に依存している代謝拮抗薬は、例えば、ジヒド
ロ葉酸のN5またはC６のいずれかにアルキル基を付加することによって合成することができる。DHFRによるN5-C6結合の還元作用によって、アルキル基の遊離が起こる。アルキル基のほかに、DHFRによるその遊離が、毒素又は代謝拮抗薬の産
生となる何れの基も、本発明の実施に有用である。

【００８２】多剤耐性腫瘍多剤耐性（MDR）とは、抗癌剤の細胞毒性から逃れるために腫瘍細胞使う多様な戦略についての遺伝学的用語である。MDRは、化学療法で使われる薬剤のみならず、広域スペクトルをもっているが自明な構造的な相同性も共通のターゲット
も持たない薬剤に対する、腫瘍細胞の低下した感受性を特徴とする。この多面発
現的耐性は、腫瘍の治療の成功を妨げる大きな障害の１つとなっている。MDRは、原形質膜での、又は細胞質、細胞内区画又は核内での構造又は機能の変化から
生ずることがある。分子レベルでのMDRの機構は、解毒およびDNA修復経路におけ
る修飾、細胞の薬剤分離部位の変化、薬剤-ターゲット親和性の低下、薬剤に特異的な阻害剤の細胞内合成、標的蛋白の変化または不適化、及び薬剤の排出また
は分泌の加速化の点に関して論じられている。

【００８３】 MDRに関係する機構には、薬剤選択細胞系において、ATP依存性多剤耐性随伴蛋
白質（MRP）として知られている遺伝子の増幅および過剰発現が原因となっているものがある。ＭＤＲのメカニズムの概説については、Gottesmann,M.M.ら(1995
)及びNoderら(1996)を参照。

【００８４】 Gottesman,M.M.ら（1995）、Simon,S.M.とSshindler,M.（1994）、及びその中に
引用されている参考文献に記載があるように、MDR細胞系を確立するために、薬剤の選択は、単一または複数のステップで行われる。各種哺乳類のMDRをコードしているDNA配列の分離については、Gros,P.ら（1986）、Gudkov, A.V.ら（1987
）及びRoninson,I.B.ら（1984）に記載され、Gottesman,M.M.ら（1995）で概説されているが、前記のように、酵素の発現レベルに違いが出るように、細胞を操
作することができる。MDRをターゲットにしているプロドラッグは、この輸送の際のATPアーゼの活性に基づいている。

【００８５】リボヌクレオチドレダクターゼリボヌクレオチドレダクターゼは、リボヌクレオチド2リン酸を還元し、対応するデオキシリボヌクレオシド2リン酸にする。この酵素は、2つのα-サブユニットと、2つのβ-サブユニットとから成るテトラマーである。ヒドロキシ尿素は
、β₂-基質複合体のチロシルフリーラジカル（Tyr-122）との相互作用によって、この反応を特異的に遮断する。Voetら（1995）。この反応をターゲットにする
場合の目標は、フリーラジカルの1種で、細胞毒性の高いO₂ ^-を集積させることで
ある。

【００８６】そのほかの疾患への技術の応用本出願の第一の主眼は、癌に向けられているが、その技術は、幅広くそれ以外
の疾患、特に抗生物質耐性の細菌性感染症に、適用できることを認めるべきであ
る。β-ラクタム系抗生物質では、β-ラクタマーゼを過剰発現することによって
、細菌への耐性をもつようになる。Hamilton-Miller,J.M.T.とSmith,J.T.ら編（
1979）p.443。アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼタイプIIIのような他の酵素も、カナマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質での処置を続け
るために、導入され、選択される。McKay,G.A.ら（1994）。本用途のためには、
すでに判明している基質から誘導されたプロドラッグ基質は、酵素活性を抑制す
るのではなく、その代わりに、高い酵素活性を利用して、感染因子において細胞
毒素を産生するように調製される。

【００８７】 In Vivoでの投与 in vivoでの有効性を決定するために、in vitroで行った評価を、ヒト腫瘍をもっているモデル動物、または抗生物質に耐性のある細菌で感染させたモデル動
物で確認する。

【００８８】本発明の別の態様は、被験者で過増殖細胞を特徴とする病変を処置するための
方法であって、被験者に、ここで記載した内因性の細胞内酵素によって過増殖細
胞で毒素に変わるプロドラッグの治療用量を投与することを含む方法である。

【００８９】マウス、ラット、またはヒトのような被験者にプロドラッグを投与する時、そ
の薬剤は、製薬学的に許容できるような担体に加え、全身性または局所的に、被
験者に投与することができる。治療の上がっている患者を見極めるために、腫瘍
サンプルを患者から摘出し、対象としている酵素の発現レベルについて、その細
胞を評価する。発現レベルが正常細胞を上回り、細胞を殺したり、抑制したりす
るのに有効な量の該プロドラックが、望ましくない副作用を伴わずに投与できれ
ば、そのプロドラッグは好ましい例となる。治療用量は、経験的に設定すること
ができ、治療の対象となる病変、被験者、及び変換されるプロドラッグの毒性ま
たは細胞毒素とによって変動する。動物に投与する時、プロドラッグの有効性を
確認するために、その方法が有効である。動物モデルの例として、本文章中に記
述したように、ヌードマウス（Balb/cNCR nu/nu female,Simonsen, Gilroy,CA）
に、約10⁵〜約10⁹の過増殖細胞、癌細胞、または標的細胞を、皮下接種した。、
腫瘍が形成されるのは、そのプロドラッグを、例えば腫瘍の周囲に皮下接種によ
って投与した時である。腫瘍のサイズの縮小を確認するための測定は、1週間に2
回、ベニヤのノギス（venier caliper）を使って、2次元で行う。また、そのほかの動物モデルも適宜使用してよい。Lovejoyら（1997）およびClarke,R.（1996
）。

【００９０】 in vivoで投与を行う場合は、１用量で行い、投与期間を通して連続的または断続的であってもよい。最も有効な投与方法と投与量をきめる方法は当業者に十
分に知られており、治療に使われる組成物、治療の目的、処置を受ける細胞、及
び治療を受ける被験者によって異なる。単回又は反復投与を、治療を行う医師に
より選択された用量レベルおよびパターンで実施することができる。適切な薬剤
の投薬処方及び薬剤の投与方法を、以下に示す。

【００９１】本発明の薬剤と組成物は、医薬組成物の活性成分といった慣用の手段にしたが
って、薬剤の製造、並びにヒト及び他の動物の治療に使用することができる。

【００９２】その医薬組成物は、経口、経鼻、注射、または吸入療法などの方法で投与する
ことができ、錠剤、トローチ、顆粒、カプセル、丸薬、アンプル、またはエアゾ
ールの形をとる。また、それらは、水性または非水性希釈剤中の該活性成分の懸
濁液、溶液またはエマルジョン、シロップ、顆粒または粉末の形をとる。本発明
の化合物のほかにも、医薬組成物は薬学的に活性のある化合物、または本発明の
複数の化合物を含むこともある。

【００９３】さらに具体的には、活性成分としてここに引用されている本発明の式の化合物
は、口、直腸、鼻、局所（経皮、エアロゾール、頬、及び舌下を含む）と、膣、
非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）及び肺を含む任意の適切な
経路で、治療において投与してもよい。より好ましい経路というのは、レシピエ
ントの状態と年齢と、治療される疾患に伴って異なると理解される。

【００９４】一般的には、先に名称をあげた各化合物の適量というのは、約1〜約100mg／レ
ピシエント体重kg／日の範囲であり、好ましいのは約1〜約50mg／レピシエント体重kg／日、最も好ましいのは約1〜約25mg／レピシエント体重kg／日である。ほかに指示がなければ、活性成分のすべての重量は、塩又はエステルにおいては
本発明の式の親薬物として計算され、その重量は比例して増えていくことになる
。望ましい用量は、2、3、4、6、またはそれ以上のサブ容量（sub-doses）として、１日を通して、適当な間隔で投与される。このようなサブ容量は、例えば、
1つの単位剤形につき活性成分を約1〜約100mg、望ましいのは約1〜約25mg、最も
望ましいのは約5〜約25mgを含んでいる単位剤形で投与されてもよい。本発明の化合物及び組成物の適切な用量は、その疾患の種類と重篤度とステージに依存し
、患者ごとに変えることができることが認められるであろう。一般に、至適用量
を決めるには、本発明の治療のリスクまたは有害な副作用に対して、治療による
利益の程度とのバランスを必要とする。

【００９５】理想としては、プロドラッグは、疾患のある部位で、活性型化合物の濃度がピ
ークに達するように投与されるべきである。これを達成するために、例えば、必
要に応じて生食で溶解したプロドラッグを静脈内投与するか、または、活性成分
を含む錠剤、カプセルまたはシロップを経口投与してもよい。治療用量の活性成
分を病的組織内へ与えるために、継続的に輸液を行うことによって、プロドラッ
グの望ましい血中濃度を維持してもよい。手術と組み合わせて用いる時は、構成
している各抗ウイルス剤を、単独で用いる時に必要とされる用量よりも低い用量
で組み合わせるように、十分に考慮するが、これによって有害事象を抑えること
になる。

【００９６】プロドラッグの成分を単独で投与することもできるが、前記したような１種類
以上の活性成分を、１種類以上の製薬学的に許容できるキャリアー及び任意の他
の治療薬とともに含む医薬的処方として示すことが望ましい。各キャリアーは、
その処方にある他の成分に融和できるという意味で「容認できる」ものでなけれ
ばならず、患者に有害なものであってはならない。

【００９７】製剤は、経口と、経直腸と、経鼻と、局所（経皮、頬、及び舌下を含む）と、
経膣と、注射（皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内を含む）と、肺からの投与に適
するものを含む。その製剤は、単位剤形でわかりやすく示し、薬剤学において十
分に知られている方法で調製することができる。そのような方法には、有効成分
を、1種類以上の副成分を構成するキャリアーとを合わせる段階も含まれている。一般に、製剤は、有効成分と、液体キャリアー又は最終的に分割される固形キ
ャリアー、またはその両方とを、均質かつ密接に合わせることによって調製され
る。

【００９８】本発明の経口投与にふさわしい製剤には、カプセル、カシェ剤(cachets)または錠剤のように、それぞれが有効成分を既定量を含んでいるここの単位で示され
ることと、粉末または顆粒として、水性または非水性液体において溶液または懸
濁液として、水中油型液体乳剤、油中水型液体乳剤として示されることとがある
。活性成分はまた、ボーラス、舐剤又はペーストとして示すことができる。

【００９９】錠剤は、圧縮または鋳造によって作られ、1種類以上の副成分を伴うこともある。圧縮錠剤は、粉末または顆粒など自由に流動するタイプの活性成分に、結合
剤（例、ポビドン、ゲラチン、ヒドロキプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、
不活性希釈剤、保存剤、disintegrant（例、澱粉グリコール酸ナトリウム、架橋
カルボキシメチルセルロースナトリウム）界面活性剤、または分散剤を、任意に
混合して、適切な機械で圧縮することによって作られる。鋳造錠剤は、不活性液
状希釈剤で湿らせた粉末状の化合物の混合物を、適切な機械で鋳造することによ
って作られる。錠剤は、任意で被膜または印をつけてもよく、及び、活性成分の
ゆっくりとした又は制御された放出を提供するように、その中に例えば、ヒドロ
キプロピルメチルセルロースをの比率を変えて使用して、望ましい放出を提供す
るように処方してもよい。錠剤は、任意で腸溶コーティングが施されることがあ
り、胃よりも腸管で成分を放出することができる。

【０１００】口腔内に局所投与するのにふさわしい調剤法には、通常、ショ糖と、アカシアま
たはトラガカントの芳香基剤に活性成分を含んでいるトローチ剤、ゲラチンとグ
リセリン、またはショ糖とアカシアのような不活性基剤に活性成分を含んでいる
香錠、適切な液状キャリアーに活性成分を含んでいる口内洗剤がある。

【０１０１】本発明の、局所投与のための医薬組成物は、軟膏、クリーム、浮遊液、ローシ
ョン、粉末、溶液、泥膏、ゲル、スプレー、エアゾール、またはオイルとして調
剤できるある。あるいは処方は、活性成分及び任意に１種類以上の添加剤または
希釈剤を含浸させたパッチ、または包帯及び絆創膏といった包帯剤を含む。

【０１０２】眼、またはそれ以外の外部組織で、例えば口と皮膚などの疾患に関する調剤は
望ましくは、約0.075〜約20% w/w、望ましいのは0.2〜25% w/w、最も望ましいの
は0.5〜10% w/wの量で、活性成分を含む局所性軟膏またはクリームとして適用す
る。軟膏で調剤する時は、プロドラッグ成分は、パラフィン、または水混和性ク
リーム基剤と使用してもよい。または、プロドラッグ成分は、水中油型クリーム
基剤とともにクリームとして処方してもよい。

【０１０３】要望がある場合は、クリーム基剤の水相には、例えば少なくとも約30%w/wの多
価アルコール、すなわち、プロピレングリコール、ブタン-1,3ジオール、マンニ
トール、ソルビトール、グリセロールとポリエチレングリコールとその混合物の
ように、2つ以上の水酸基をもつアルコールがある。局所的な調剤には、皮膚または他の適用部位を通して、プロドラッグの吸収または浸透を高める化合物を含
むことが望ましい。このような皮膚の浸透性に関する増強剤の例としては、ジメ
チルスルホキシドおよび関連誘導体がある。

【０１０４】本発明の乳剤の油相は、よく知られた方法で、よく知られた成分から構成され
ている。この相は、乳化剤（emulgentとしても知られている）のみを含んでもよ
いが、脂または油、または油脂と少なくとも1種の乳化剤の混合物であることが望ましい。親水性乳化剤が、安定剤として作用する親油性の乳化剤と共に含まれ
ている方が好ましい。また、油脂の両方を含んでいる方がよい。全体としては、
安定剤のあるなしに関わらず、乳化剤は、いわゆる乳化ろうを作り、ろうが、油
および／または脂と一緒になって、クリーム製剤の油性分散相を形成する、いわ
ゆる軟膏基剤を作る。

【０１０５】本発明の調剤で使用するのにふさわしい乳化剤と乳化安定剤には、Tween 60と、
Span 80と、セトステアリールアルコールと、ミリシルアルコールと、モノステアリン酸グリセリンと、ラウリル硫酸ナトリウムとがある。

【０１０６】薬剤の乳濁液の調剤に用いられることが予想されるほとんどの油における活性
成分の安定性は非常に低いので、その調剤にふさわしい油脂の選択は、所望する
化粧品の性状に到達するのを基本にする。このように、クリームは好ましくは、
チューブまたはそれ以外の容器から漏れることのないように適当な濃度をもち、
非油脂性で、非染色性で、可洗性製品でなければならない。ジイソアジペート、
イソセチルステアリン酸、ココナッツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル
、イソプロピルミリスチン酸、デシルオレイン酸、イソプロピルパルミチン酸、
ブチルステアリン酸、2-エチルヘキシルパルミチン酸、またはCrodamol CAPとし
て知られている分岐エステルの混合物などのように、直鎖状または分岐状で、1 塩基または2塩基のアルキルエステル類が使われ、最後に挙げた3例が好ましいエ
ステルである。ここに挙げたものは、必要とされる特性に応じて、単独で、また
は組み合わせで用いられる。白色軟質パラフィンおよび／または液状パラフィン
、またはそのほかのミネラルオイルのように、高い融点をもつ液体が用いられる
。

【０１０７】眼球への投与にふさわしい調剤に点眼薬も含まれるが、そこでは有効成分は適
切なキャリアーに溶解または懸濁されており、特にプロドラッグ成分に関しては
水性溶媒である。プロドラッグの成分は、このような製剤では、約0.5〜約20%の
濃度であるのが望ましく、約0.5〜約10%になると有利となり、1.5%w/wは特によい。

【０１０８】直腸投与のための製剤は、例えばココアバターまたはサリチル酸塩を含む、適
切な基剤を含む座薬として提供される。

【０１０９】膣に投与するのにふさわしい製剤は、プロドラッグ成分に加えて、当技術分野
で適切であることがよく知られているキャリアーを含む膣座薬、タンポン、クリ
ーム、ゲル、ペースト、泡沫、またはスプレー製剤として提供される。

【０１１０】キャリアーが固形の場合、経鼻投与にふさわしい製剤には、例えば、吸入剤を
取り込む方法で投与される約20〜約500μの範囲の粒子サイズの粗末があり、これは、閉じた状態になっていた粉末の容器から鼻への鼻腔通過によって急速吸入
することによって行う。投与のためのキャリアーが液状の場合、例えば、鼻内噴
霧、点鼻薬、またはネブライザーでのエアゾール投与による時、これにふさわし
い製剤には、プロドラッグの水性または油性溶液がある。

【０１１１】注射による投与に適する製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤をレ
シピエント予定者の血液と等張にする溶質を含んでいてもよい水性および非水性
の等張性無菌の注射溶液；及び懸濁剤と増粘剤、及びその化合物のターゲットが
血液成分または1つ以上の臓器になるように設計されているリポゾームまたは微細粒子系を含む水性および非水性無菌懸濁液がある。その製剤は、例えば、アン
プルとバイアルのように、単位用量またはマルチ用量を密封容器に入れて用意し
、注射用の水などの無菌の液状キャリアーを、使用直前に加えるだけでよいよう
に、凍結乾燥状態で保存するとよい。即時調合性の接種溶液および懸濁液は、前
記の種類の滅菌済み粉末、顆粒、及び錠剤とから調製される。

【０１１２】好ましい単位用量製剤とは、ここで上記したように、プロドラッグ成分の1日の用量または単位、1日の分用量、またはその適切な画分を含んでいるものである。

【０１１３】特に前記の成分に加えて、本発明の製剤には、当該の製剤の種類に関係のある
技術で慣用となっている他の薬剤も含んでいてもよく、例えば、経口投与に適し
たものには、甘味料、増粘剤、着香剤といった更なる剤を含む。

【０１１４】本発明の処方のプロドラッグおよび組成物は、獣医学的製剤の様式でも使用に
供され、これは、例えば、その分野で慣用の方法で製造される。

【０１１５】（実施例）以下の例は、標的酵素TSに特に向けられた。標的酵素に対して別のプロドラッ
グの発見するために、以下の方法を変更できることは、当業者には明らかである
。

【０１１６】化学分析および有細胞分析細胞内のチミジル酸合成酵素と反応し、その酵素を不活化せずに培地に毒素を
遊離する力に基づいて、ピリミジンを有するプロドラッグが選ばれる。N5N10-メ
チレンテトラヒドロ葉酸を含むか又は含まない、ヒトのチミジル酸合成酵素と候
補プロドラッグを含む反応混合物で、候補薬剤が選別される。候補プロドラッグ
の遊離基（例、ピリミジン5位にて）は、例えば、その技術ではよく知られている方法を用いて、トリチウムで標識される。コントロールの基質も、同じ条件の
反応で、同様に標識し、（例、5-³H）dUMPとなる。その分析は、Carreras, C.W とSanti,D.V.（1995）と、そこに引用された文献に記載されているものと同じよ
うに行う。ヒトのチミジル酸合成酵素は、発現しているヒトのチミジル酸合成酵
素を有するE.coliから、精製することができる。Davisson,V.J.ら（1989）と、D
avisson,V.J.ら（1994）を参照のこと。このアプローチによって、大量の候補薬
剤をスクリーニングすることが可能になる。

【０１１７】生化学的に活性をもつ化合物を同定するための高処理選別法の概要は、図面3 と、4と、5に示されている。そのテストの基本は、遺伝学的手技と、E.coliの増
殖および類似の単細胞微生物（例、酵母）の増殖の容易さにあるが、Miller（19
92）とSpectorら（1997）を参照の事。鍵となるステップは、プロドラッグに計画されている標的酵素に対応する、内因性酵素活性を取り除くことである。Mull
er（1992）、Sambrook（1989）またはSpectorら（1997）によって記載されている方法のいずれかを用いるとよい。この方法には、化学的および生物学的（例え
ばウイルス性またはトランスポンゾン（transponson）遺伝子挿入）突然変異誘発が含まれており、適切な選択をする方法が後に続く。この場合、TS陰性（TS^- ）細胞が、チミジル酸合成酵素の作用を受ける時、細胞毒素になるプロドラッグ
を同定するための陰性対照になる。同様なアプローチは、ほかの細胞でも行うこ
とができ、例えば、酵母または選択された単細胞微生物がある。その分析におい
ては、対照微生物と組換え微生物に両方について、試験化合物に対する感受性を
比較する。当業者には理解されると思われるが、酵素の種類を区別するプロドラ
ッグが、この手法から取り出されることもある。例えば、ヒト由来酵素と酵母由
来酵素を発現していること以外には全く同じ細胞が、酵母由来酵素を発現してい
る細胞に対してのみ優先的に毒性を示す抗生物質性プロドラッグを検出するため
に使われている。

【０１１８】細胞系の例としてはras-形質転換型のNIH 3T3細胞（ATCCから入手）があり、クローン化されたcDNAからヒトチミジル酸合成酵素（HuTS）の量を増やして発現
するように操作されている。形質移入は一過性または永久的に行われる（Chen,L
.ら（1996）、Hudziak,R.M.ら（1988）およびCarter, P.ら（1992）を参照）。N
IH-000（ras-形質転換型親細胞系）と、NIH-001（HuTSの低発現型）と、NIH-00 （HuTSの中程度発現型）と、NIH-003（HuTS高発現型）。各細胞系におけるTSの発現レベルは、細胞溶解産物における免疫ブロットおよび酵素分析によって、免
疫検出用のHuTSタンパク抗体を用いて測定する。酵素分析は、Carreras,C.W.とS
anti,D.N.（1995）が概説しているように行う。

【０１１９】 HuTS酵素の発現には、ヒト結腸直腸および乳腺腫瘍細胞系が選別される。NIH
3T3細胞系について前述したように、低レベルHuTS発現細胞系と、中程度レベルH
uTS発現細胞系と、高レベルHuTS発現細胞系とを、候補薬剤に暴露する。増殖抑制および細胞毒性を、前記のとおり、測定する。同様な試験を、表1にあげた各酵素について行うことができる。

【０１２０】 In Vivo 試験 Res-形質転換型NIH 3T3細胞を、免疫不全マウスの皮下に移植する。最初に行う治療は、直接的腫瘍内接種である。期待できる結果は、候補薬剤によって、Hu
TSまたは標的酵素の発現レベルの増加が、抗腫瘍活性を増強に導くということで
ある。同じような研究は、HuTSまたは標的酵素の発現レベルが増加しているヒト
の腫瘍で行われており、候補薬剤に応じた有効性が、TSまたは標的酵素の発現レ
ベルに関係しているということを示している。任意で、その候補薬剤の有効性、
毒性および薬理生物学に関する問題に取り組むには、その薬剤以外のものについ
ても、動物に静脈内投与をする実験を行う。

【０１２１】 in vivoの試験は、Harris,M.P.（1996）と、Antelman,D.ら（1995）によって記載されている通りに行う。

【０１２２】ここに本発明の詳細について記述し、及びこれについての特定の実施態様を引
用してきたが、前記のように、本発明の精神及び範囲から逸脱することがなく、
本発明への各種の変更および修正を行うことができるのは、当業者にとっては明
白である。

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es in Combination with Prodrugs for the Delivery of Cytotoxic Agents to
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【図面の簡単な説明】

【図１】細胞における抗癌療法への耐性の進展とその結果を概略的に示す図である。

【図２】本発明のプロドラッグの活性経路を概略的に示す図である。

【図３】薬剤耐性に重要な細胞内酵素によって活性化されるプロドラッグの高処理選別
法を概略的に示す図である。

【図４】ヒトのチミジル酸合成酵素（TS）をもたないE.coli、TS-negativeE.coliを細胞標的に用いて、主要なヒト由来チミジル酸合成酵素（TS）プロドラッグを分析
する方法を概略的に示す図である。

【図５】 2種類の標的酵素に対するプロドラッグの反応を同時に最適化するには、この選別法をどのように使用するかということの実施例を示す図である。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年２月２９日（２０００．２．２９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ // Ｃ０７Ｈ 19/06 Ｃ０７Ｈ 19/06 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA24 AA35 CB01 DA20 DA78 FB01 FB03 4B063 QA05 QA18 QQ62 QQ91 QQ98 QR20 QR77 4C057 BB02 DD01 LL11 LL13 LL14 4C084 AA19 CA62 NA14 ZB262 4C086 AA01 AA03 EA17 MA05 NA14 NA15 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】治療薬の可能性を有する薬剤を同定する方法であって、（a）標的細胞の細胞内区画に該薬剤を結合しやすい条件下で、該標的細胞を、標的酵素の選択的基質である候補薬剤と、接触させること；及び（b）該標的細胞を、細胞増殖抑制または細胞致死について評価することを含む方法。
【請求項２】治療薬の可能性を有する薬剤を同定する方法であって、（a）標的細胞の細胞内区画に該薬剤を結合しやすい条件下で、標的細胞を、検出可能な標識毒性遊離基をもち、標的酵素の選択的基質である候補薬剤と、接触
させること；及び（b）遊離した標識の量について、その培地を分析すること、を含む方法。
【請求項３】標的細胞が化学療法剤に耐性であることを特徴とする請求項
1または2に記載の方法。
【請求項４】 in vivoにおける選択の結果、化学療法によって標的酵素が増幅されることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】標的酵素が内因性の細胞内酵素で、標的細胞において過剰発
現していることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】細胞内酵素の内因性過剰発現は、該酵素をコードしている遺
伝子の増幅に原因があることを特徴とする請求項5に記載の方法。
【請求項７】標的酵素がチミジル酸合成酵素であることを特徴とする請求
項1または2に記載の方法。
【請求項８】候補となる治療薬が、式（式中R₁は、チミジル酸合成酵素によってピリミジン環からの抽出に適合するこ
とができる分子の大きさと求電子性を有し、チミジル酸合成酵素によってピリミ
ジン環から遊離する化学物質そのもの、またはそれを含むものであり、チミジル
酸合成酵素によるピリジン環からの遊離に際し、細胞の増殖を抑制または致死さ
せる能力を有し、 Qは、糖類、チオ糖類、炭素還化合物類及びその誘導体からなる群から選択される。）のL形またはD形化合物であることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
【請求項９】 Qが、式（式中R₂とR₃は同一でも異なっていてもよく、各々独立してHまたは-OHである。
）のフラノシル基であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】 Qが、式 (式中R₂とR₃は同一でも異なっていてもよく、各々独立してHまたは-OHである。)
のβ-Dリボフラノシル基であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】 R₁は、-Br、-I、-O-アルキル、-O-アリール、O-ヘテロアリール、-S-アルキル、-S-アリール、-S-ヘテロアリール、-CN、-OCN、-SCN、-N
H₂、-NH-アルキル、-N(アルキル)₂、-NHCHO、-NHOH、-NHO-アルキル、NH₂CONHO-
、NHNH₂および-N₃からなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の
方法。
【請求項１２】 R₁が、-Br、-I、-O-アルキル、-O-アリール、O-ヘテロアリール、-S-アルキル、-S-アリール、-S-ヘテロアリール、-CN、-OCN、-SCN、
-NH₂、-NH-アルキル、-N(アルキル)₂、-NHCHO、-NHOH、-NHO-アルキル、NH₂CONH
O-、NHNH₂および-N₃からなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載
の方法。
【請求項１３】 R₁が、-Br、-I、-O-アルキル、-O-アリール、O-ヘテロアリール、-S-アルキル、-S-アリール、-S-ヘテロアリール、-CN、-OCN、-SCN、
-NH₂、-NH-アルキル、-N(アルキル)₂、-NHCHO、-NHOH、-NHO-アルキル、NH₂CONH
O-、NHNH₂および-N₃からなる群から選択されることを特徴とする請求項10に記載
の方法。
【請求項１４】請求項1または2に記載の方法によって同定された薬剤。
【請求項１５】過剰増殖細胞の増殖を抑制する方法であって、内因性の細
胞内酵素によって細胞内で選択的に毒素に変換されるプロドラッグと、該細胞と
を接触させることを特徴とする方法。
【請求項１６】過剰増殖細胞が細胞内酵素の内因性過剰発現を特徴付けら
れる請求項15に記載の方法。
【請求項１７】過剰増殖細胞が化学療法剤に耐性であることを特徴とする
請求項15に記載の方法。
【請求項１８】細胞内酵素の内因性過剰表現が、該酵素をコードしている
遺伝子の増幅によるものであることを特徴とする請求項16に記載の方法。
【請求項１９】該酵素が、化学療法によってin vivoでの選択の結果、増幅されることを特徴とする請求項15に記載の方法。
【請求項２０】該酵素がチミジル酸合成酵素であることを特徴とする請求
項15に記載の方法。
【請求項２１】プロドラッグが、式（式中R₁は、チミジル酸合成酵素による、ピリミジン環からの抽出と適合する分
子の大きさおよび求電子性を有し、チミジル酸合成酵素によって、ピリミジン環
から遊離する化学物質そのものであるか、またはこれを含むものであり、チミジ
ル酸合成酵素によるピリジン環からの遊離に際し、細胞の増殖を抑制または致死
させる能力を有し、 Qは、糖類、チオ糖類、炭素還元化合物およびその誘導体を含む群から選択される。）のL形またはD形化合物であることを特徴とする請求項15に記載の方法。
【請求項２２】 Qが、式（式中R₂とR₃は同一でも異なっていてもよく、各々独立してHまたは-OHである。
）のフラノシル基である特徴とする請求項21に記載の方法。
【請求項２３】 Qは式（式中R₂とR₃は同一でも異なっていてもよく、各々独立してHまたは-OHである。
）のβ-D-リボフラノシル基であることを特徴とする請求項21に記載の方法。
【請求項２４】 R₁が-、Br、-I、-O-アルキル、-O-アリール、O-ヘテロアリール、-S-アルキル、-S-アリール、-S-ヘテロアリール、-CN、-OCN、-SCN、-N
H₂、-NH-アルキル、-N(アルキル)₂、-NHCHO、-NHOH、-NHO-アルキル、NH₂CONHO-
、NHNH₂および-N₃からなる群から選択されることを特徴とする請求項21に記載の
方法。
【請求項２５】 R₁が、-Br、-I、-O-アルキル、-O-アリール、O-ヘテロアリール、-S-アルキル、-S-アリール、-S-ヘテロアリール、-CN、-OCN、-SCN、-N
H₂、-NH-アルキル、-N(アルキル)₂、-NHCHO、-NHOH、-NHO-アルキル、NH₂CONHO-
、NHNH₂および-N₃からなる群から選択されることを特徴とする請求項22に記載の
方法。方法。
【請求項２６】 R₁が、-Br、-I、-O-アルキル、-O-アリール、O-ヘテロアリール、-S-アルキル、-S-アリール、-S-ヘテロアリール、-CN、-OCN、-SCN、-N
H₂、-NH-アルキル、-N(アルキル)₂、-NHCHO、-NHOH、-NHO-アルキル、NH₂CONHO-
、NHNH₂および-N₃からなる群から選択されることを特徴とする請求項23に記載の
方法。
【請求項２７】被験者における過剰増殖細胞を特徴とする病変を治療する
方法であって、内因的に細胞内に過剰表現または過剰蓄積された細胞内酵素によ
って、該過剰増殖細胞の中で毒素に変換されるプロドラッグを、被験者に投与す
ることを特徴とする方法。
【請求項２８】標的細胞が、化学療法への耐性に関連する上記細胞内酵素
の内因的過剰表現によって特徴づけられることを特徴とする請求項27に記載の方
法。
【請求項２９】標的細胞が、化学療法剤に対して耐性があるとみなされる
ことを特徴とする請求項27に記載の方法。
【請求項３０】標的細胞が、不活性化された腫瘍抑制機能を有しているこ
とを特徴とする請求項27に記載の方法。
【請求項３１】細胞内酵素の内因性過剰発現が、該酵素をコードしている
遺伝子の増幅によるものであることを特徴とする請求項27に記載の方法。
【請求項３２】該酵素が化学療法によるin vivoでの選択の結果、増幅されることを特徴とする請求項27に記載の方法。
【請求項３３】酵素がチミジル酸合成酵素であることを特徴とする請求項
27に記載の方法。
【請求項３４】標的細胞が、標的酵素をコードしている外来性遺伝子を発
現していることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
【請求項３５】さらに、候補薬剤が細胞内区画に結合しやすい条件下で、
対照細胞を該候補薬剤と接触させることを含む請求項1または2に記載の方法。
【請求項３６】標的細胞は2種類以上の外来性遺伝子を発現し、それぞれの外来性遺伝子が標的酵素をコードしていることを特徴とする請求項1または2に
記載の方法。