KR20020059340A - 효소 촉매 항-감염 치료제 - Google Patents

효소 촉매 항-감염 치료제 Download PDF

Info

Publication number
KR20020059340A
KR20020059340A KR1020027000936A KR20027000936A KR20020059340A KR 20020059340 A KR20020059340 A KR 20020059340A KR 1020027000936 A KR1020027000936 A KR 1020027000936A KR 20027000936 A KR20027000936 A KR 20027000936A KR 20020059340 A KR20020059340 A KR 20020059340A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
group
infectious agent
cells
active enzyme
enzyme
Prior art date
Application number
KR1020027000936A
Other languages
English (en)
Inventor
에이취. 마이클 쉐파르드
Original Assignee
뉴바이오틱스 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 뉴바이오틱스 인코퍼레이티드 filed Critical 뉴바이오틱스 인코퍼레이티드
Publication of KR20020059340A publication Critical patent/KR20020059340A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A61K47/556—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells enzyme catalyzed therapeutic agent [ECTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 감염제 또는 감염제로 감염된 세포를 감염제에 의해서 발현된 활성 효소에 의해서 선택적으로 독소로 전환된 프로드러그와 접촉시킴으로써 감염제 또는 감염제로 감염된 세포를 선택적으로 억제하는 방법을 제공한다. 활성 효소는 숙주 세포 또는 다른 감염제에 의해서 발현된 동일하거나 유사한 효소에 비하여 감염제에 의해서 발현된 효소에 대하여 선택적이다. 활성제는 프로드러그에 의해서 억제되거나 불활성화되지 않는다. 또한 프로드러그를 확인하기 위한 스크린이 본원에서 제공된다.

Description

효소 촉매 항-감염 치료제{ENZYME CATALYZED ANTI-INFECTIVE THERAPEUTIC AGENTS}
관련 출원의 상호-참고문헌
본 출원은 35 U.S.C §119(e) 하에 각각 1999년 9월 9일 및 1999년 7월 22일에 제출된 다음의 미국 가출원 일련 번호: 60/153,101 및 60/145,364에 대한 우선권을 주장하며, 이것들의 내용은 본 명세서에 참고문헌으로서 포함된다.
본 명세서 전체를 통하여, 다양한 공보가 우선 저자 및 일자, 특허 번호 또는 공보 번호에 의해 참조된다. 각 참고자료에 대한 완전한 서지사항은 명세서 내에서 알 수 있다. 이 공보들의 명세서는 본 발명이 속하는 분야를 더욱 충분히 설명하기 위해 본원에 참고자료로서 포함된다.
감염성 질환의 화학치료법적 및 항생제 치료에 대한 내성은 주요한 건강 관리 문제이다. 감염성 질환에서, 대부분의 약물 내성은 효소 매개된다. 전형적으로, 감염성 제제에 의해 발현된 효소는 화학치료제 또는 항생제를 빠르게 변형시킴으로써, 치료 활성을 없앤다. 감염성 질환에서, β-락타마제의 증폭된 발현은 대다수의 내성 헤모필리스(Hemophilis) 인플루엔자(upper respiratory 감염) 및 모락셀라 카타르할리스(otitis 배지)를 포함하는 모든 β-락탐 항생제 내성 분리균의 1/3 이상을 설명한다(Felmingham and Washington(1999) J.Chemother.11Suppl 1:5-21). 게다가, 항생제의 다양한 택일적인 형태에 내성을 부여하는 유전자는 자연적으로 발생하고, 감염 생물군에서 증가일로로 일반화되었다. 최근에, 다수의 항생제에 동시에 내성을 부여하는 유전자 셋트를 운반하는 감염제가 종래의 항생 치료법에 의한 치료를 어렵게 만드는 것이 문제되었다. 본 출원인은 감염제에 의해 발현된 매우 특징된 효소를 표적으로 하는 치료법의 개발에 대한 신규 접근법을 개발했다. 이 기법은 감염 질환 치료법에 대한 선행하는 접근법과는 구별되며, 효소 촉매 치료제, 즉 "ECTA"로 언급된다.
본 발명은 감염성 질환의 치료법 분야, 특히 치료법-내성 감염성 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
도 1 은 본 발명의 ECTA 프로드러그의 작용 메카니즘을 도시한다.
도 2 는 재조합 사람의 티미딜레이트 신타제(rHUTS)와 함께 브로모비닐 2'-디옥시우리딘 모노포스페이트(BVdUMP)의 인큐베이션으로부터의 형광 생성물을 도시하는 그래프이다. 티미딜레이트 신타제와 함께 BVdUMP 의 인큐베이션은 형광 생성물의 시간 및 효소 의존적인 발생을 초래한다. BVdUMP 는 N5, N10-메틸렌테트라히드로폴레이트가 반응에서 제외되었다는 것을 제외하고는, 30 ℃, 표준 반응 혼합물에서 지시된 양의 rHuTS 와 함께 인큐베이션되었다(하기의 물질 및 방법 참조). 각 데이타 곡선에 인접한 숫자는 TS 효소 단위를 언급한다.
도 3 은 BVdUMP 가 rHuTS 에서 디옥시우리딘 모노포스페이트(dUMP)와 경쟁한다는 것을 도시한다. dUMP 를 dTMP 로 전환하는 티미딜레이트 신타제 촉매 반응을 20 μM BVdUMP의 부재(삼각형) 및 존재(정사각형)로 시험관내에서 행했다. dUMP 농도는 10 내지 100 μM 으로 다양했고, N5, N10-메틸렌 테트라히드로폴레이트 농도는 140 μM 이었고, 효소 농도는 0.1μM 이었다. 효소 활성은 A340에서의 증가를 측정함으로써 결정되었다.
도 4 는 rHuTS 로 촉매된 BVdUMP 의 시험관내 반응 생성물의 구조이다. 구조I 및 II 는 무세포 반응 혼합물에서 확인된 질량 이온과 일치한다.
도 5 는 NB1011 활성의 제안된 메카니즘이다. NB1011 은 세포로 들어가서 TS 와 상호작용하기 전에 BVdUMP 로 전환될 수 있어야만 한다. TS 로의 형질전환다음에 발생된 구조는 환외 피리미딘 뉴클레오티드 모노포스페이트로 제안된다. 이러한 화합물은 뉴클레오티드 및 핵산 메카니즘과의 간섭을 포함하는 다양한 메카니즘에 의하여 세포에 세포독성일 수 있다.
도 6 은 NB1011 로 처리된 H630R10 세포에서 BVdUMP 의 검출을 도시한다. H630R10 세포는 5 일동안 100 μM NB1011 로 처리되었고, 그 다음 하기의 물질 및 방법에 개시된대로 액체 크로마토그래피/질량 분광계로 분석되었다.
도 7 은 NB1011 은 생체내에서 TS 를 불가역적으로 불활성화시킬 수 없다는 것을 증명한다. 본래 세포에서 TS 활성에 대한 NB1011 의 효과는 완전히 가역적이다. TS 활성은 물질 및 방법에 개시된 대로 5-[3H]디옥시우리딘으로부터 [3H]2O 의 해리에 의해서 본래의 RKO 세포에서 측정했다. NB1011 을 신선한 배지로 교환하고, 37 ℃ 에서 60 분동안 인큐베이션한 다음, 이 과정을 반복함으로써 세포외로 세척했다. 대조 및 비처리 세포를 같은 세척 과정에 놓았다.
도 8 은 티미딜레이트 신타제 및 튜비린(tubilin)에 대한 항체로 개발된 SDS PAGE 웨스턴 블럿으로 측정될 때, 토뮤덱스(Tomudex) 또는 NB1011 로 선택된 세포에서 TS 발현 수준을 도시한다. 레인 1 은 약물로 무선택인 MCF7 세포를 도시한다; 레인 2 는 2 μM 토뮤덱스로 선택된 MCF7 세포를 도시한다; 레인 3 는 선택제로서 NB1011 을 사용하여 연이은 선택후이지만, 레인 2 에서와 같은 MCF7 세포를 도시하고; 레인 4 는 토뮤덱스 없이 연속적인 통과후에 레인 2 에서와 같은 MCF7 세포를 도시한다.
본 발명을 수행하는 방법
본 발명의 실행은 달리 나타내지 않았다면, 본 분야의 범위내에 있는 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA 에 대한 종래의 기법을 사용할 것이다. 예를 들어, Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ndedition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds., (1987)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)) and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))참조.
명세서 및 청구항에 사용된 바와 같은, 단수형 "한" 및 "그"는 문맥상에 분명히 다르게 규정하지 않는다면, 복수의 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "한 세포"는 그것의 혼합물을 포함하여, 복수의 세포를 포함한다.
용어 "포함하는"은 기재된 요소들을 포함하고, 다른 것도 배제하지 않는 조성물 및 방법을 의미하도록 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는데 사용될 때, "로 본질적으로 구성된"은 그 조합에 있어 어떤 본질적인 중요성을 갖는 다른 요소를 배제함을 의미할 것이다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로구성된 조성물은 분리 및 정제 방법, 그리고 포스페이트 완충 식염수, 보존제 등과 같은 제약학적으로 허용되는 담체로부터의 미량 오염물질을 배제하지 않을 것이다. "로 구성된"은 다른 성분 및 본 발명의 조성물을 투여하는 실질적인 방법 단계의 미량 이상의 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 각각의 과도적 용어에 의해 정의된 구체예는 본 발명의 범위내이다.
"감염제" 또는 "병원균"은 감염시킨 세포 또는 유기물에 대한 병리상의 유기물이다. 병원성 유기물의 예는 박테리아, 기생충, 바이러스 또는 효모를 제한없이 포함한다. 바이러스의 예는 Herpes, Varicella zoster, Hepatitis C 및 Epstein Barr 바이러스를 제한없이 포함한다. 기생충의 예는 T.brucei, T.cruzi, 및 Plasmodium falcipurum 을 제한없이 포함한다. 박테리아의 예는 모든 그람 양성 및 그람 음성 박테리아, 특히 Staphylococcus, sp., Enterococcus sp., Myoplasma sp., E.coli sp., Psudomonas sp., Nisseria sp. 를 제한없이 포함한다. 그리고, 이러한 것들로부터, 바람직한 병원균은 일반적인 항생제에 대한 내성이 되는 것이다(Murray, BE "Antibiotic Resistance"(1197) Adv. Int. Med. 42:339-367 에 의한 개관 참조).
"조성물"은 활성제와 불활성(예를 들어, 검출가능한 감염제 또는 표지, 또는 제약학적으로 허용되는 담체) 또는 활성인 다른 화합물 또는 조성물, 예컨대 애쥬번트의 조합을 의미하도록 의도된다.
"제약학적 조성물"은 활성제와 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 진단적 또는 치료적 사용에 적합한 조성물을 만드는 불활성 또는 활성인 담체의 조합을 포함하도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "제약학적으로 허용되는 담체"는 포스페이트 완충 식염수 용액, 물, 및 오일/물 또는 물/오일 에멀전과 같은 에멀전, 및 다양한 종류의 습윤제와 같은 표준 제약학적 담체 중 어느 것을 포함한다. 또한, 조성물은 안정제 및 보존제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 담체, 안정제 및 애쥬번트에 대해 Martin, REMINGTON'S PHARM. SCI., 15th Ed(Mack Publ. Co. Easton (1975)) 참조.
"유효량"은 유익한 또는 바람직한 결과를 행하기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여, 도포 또는 투약으로 투여될 수 있다.
"피험자", "개체" 또는 "환자"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 이것은 척추동물, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 사람으로 간주된다. 포유류는 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 뮤린, 유인원, 사람, 농장 동물, 변종 동물, 및 애완 동물을 포함한다.
"대조표준"은 비교 목적을 위해서 실험에 사용된 택일적인 피험자 또는 샘플이다. 대조표준은 "양성" 또는 "음성"일 수 있다. 예를 들어, 실험 목적이 특정 형태의 병원성 약제와 유전자의 변형된 발현 수준의 상관관계를 결정하는 것인 경우에, 일반적으로 양성 대조표준(이러한 변형을 갖고 감염의 특징적인 증후를 나타내는, 피험자 또는 피험자로부터의 샘플), 및 음성 대조표준(변형된 발현 및 그 질환의 임상적 증후가 결여된, 피험자 또는 피험자로부터의 샘플)을 사용하는 것이 바람직하다.
본원에 사용될 때, 용어 "활성 효소"는 그것의 천연 또는 자연 환경에서 병원균에 의해서 발현된 효소를 의미한다. 프로드러그를 활성화하기 위해 투여된 효소 또는 다른 약제와 구별하고자 하는 의도이다.
본원에 사용될 때, 용어 "병적 세포", "표적 세포", 및 "시험 세포"는 활성 효소의 존재를 특징으로 하는 세포를 포함한다. 활성 효소의 발현은 상기에 정의된 병원성 유기물에 의한 감염의 결과로서 발생한다. 병원균 또는 본 치료법에 대한 표적을 제공하는 감염 세포내에서 발현된 효소는 티미딜레이트 신타제 및 디히드로폴레이트 환원효소를 제한없이 포함한다. 추가적인 예는 하기에 목록화된다.
치료 방법
한 양태에서, 본 발명은 감염제에 의해서 발현된 활성 효소로 세포에서 선택적으로 독소로 전환된 기질 프로드러그를 감염제 또는 감염 세포와 접촉시킴으로써 감염제 또는 약제로 감염된 세포의 증식 또는 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법 및 조성물은 예를 들어, 미생물 세포, 바이러스 감염 세포 또는 다른 병원균으로 감염된 세포와 같은 활성 효소를 발현 또는 함유하는 세포의 성장 또는 증식을 우선적으로 억제한다. 효소의 과발현은 특이성이 병원균에 의하여 발현된 활성 효소에 대한 프로드러그의 종-특이적에 관여된 경우에는 요구되지 않는다. 활성 효소는 숙주 세포에 의해서 발현될 수 있거나 발현되지 않을 수 있다. 그러나, 세포가 효소 자신의 버젼을 발현하지 않을 지라도, 프로드러그는 숙주 세포에 의해서 발현된 효소 버젼에 비교하여 감염제로 발현된 효소의 버젼에 의해서 우선적으로 활성화된다는 것에 기초하여 선택된다. 활성 효소는 야생형 또는종래 기술 치료에 대한 개발된 내성을 가지는 돌연변이된 버젼일 수 있다(Hooker, et al.(1996) J.Virol.70(11):8010-8018).
본 발명의 프로드러그 및 방법에 대하여 선택적인 활성 효소의 예는 티미딜레이트 신타제(TS), 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 및 β-락타마제 활성 효소를 제한없이 포함한다.
본 발명의 개념은 활성 효소 티미딜레이트 신타제 및 사람 종양 세포에서 그것의 발현을 사용하여 예시된다. 그러나, TS 의 사용은 단지 예시적이고, 청구항은 TS 를 표적화하는 시스템에 제한될 의도는 아니다. 티미딜레이트 신타제는 본원에서 유전자 부류가 아닌(글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)로서 표시된 효소 부류의 예와 비교), 단일 유전자로 코딩된 높은 정도의 구조 및 기능상의 특징때문에 표적, 활성 효소로서 사용되었다. 게다가, TS 과발현은 화학치료에 대한 획득된 내성의 결과이다. 유사하게, 한 구체예에서 활성 효소는 종래의 치료법에 대한 내성의 결과로서 발현될 수 있다.
다른 표적 활성 효소는 바이러스 역전사효소 및 프로테아제를 제한없이 포함한다. 효소를 코딩하는 바이러스의 예는 레트로바이러스(HIV-1, 양 효소, Turner B.G. 및 Summers M.F.(1999)J.Mol.BioL 285:1-32), 피코르나바이러스(예를 들어, Hepatitis A 바이러스, Wang Q.M.(1999)Prog. Drug Res. 52:197-219), 및 Hepatitis C 바이러스(Kwong A.D. et al.(1999) Antiviral Res.41:67-84)를 포함한다. 항-HIV1 역전사효소 및 프로테아제 억제제로 관찰된 초기 임상 성공(Shafer R.W. 및 Vritton D.A.(1999) Biomed. Pharamcother. 53:73-86 에 개관)은 대부분바이러스-코딩 효소에서의 돌연변이에 기인한 내성의 발생으로 약화되었다(Catucci M. et al.(1999) J.Acquir. Immune Defic. Syndr. 21:203-208; Mahalingam B.et al.(1999) Eur. J. Biochem. 263:238-44; 및 Palmer,S. et al.(1999) AIDS 13(6):661-667. 고 약제-내성 HIV-1 임상 분리균은 통상의 임상 개발에서 많은 항-레트로바이러스 화합물에 대한 상호-내성이다. Hooker 등(1996) 상기 참조. 내성의 경우에서, 바이러스 효소는 효소의 돌연변이된 버젼이 효소의 야생형 활성 부위의 구조를 보유하기 때문에 촉매 활성을 보유한다. 본 발명의 프로드러그는 독소로의 상호작용에 의해서 활성 부위와 상호작용하고 전환되도록 특이적으로 설계된다. 따라서, 약제 내성 바이러스 감염은 ECTA 화합물로 언급된 기질 프로드러그에 대하여 민감하고, 이것은 감염 세포에서 활성 효소가 독소를 일으키는 것을 요구한다. NB1011 은 포유동물 및 사람 세포뿐만 아니라 병원균에 의해서 발현된 TS 에 대하여 특이적인 이러한 화합물의 예이다.
한 구체예에서, 프로드러그는 본원에 더욱 상세히 정의된 바와 같은 구조를 갖는 화합물이다. 용어 "프로드러그"는 활성 치료제의 선구물질로 간주된다. 이상적인 프로드러그는 의도된 메카니즘에 의해 활성화될 때까지 제약학적으로 불활성인 것이다. 프로드러그 전략은 잠재적으로 독성인 치료법을 질환 부위에 표적화함으로써, 전신적 독성을 피하도록 의도된다. 다수의 접근법이 이 목표를 위해 만들어져 왔다. 암 치료법을 위한 프로드러그에 있어 첫번째 시도는 Mead 등. (1996) Cancer Res. 26:2374-2379 및 Nichol and Hakala (1996) Biochem. Pharmacol. 15:1621-1623에 의해 보고되었다. 이 노력의 지도적 이론은 메토트렉세이트-내성 백혈병에서 과발현된 디히드로폴레이트 환원효소를 표적화하는 것이었다. 메토트렉세이트-내성 종양 세포에서 상승된 디히드로폴레이트 환원효소가 티미딜레이트 생성효소로 지정된 대사 독성물질로 호모폴레이트를 전환시킨다고 가정됨에 따라, 종양 세포의 자가 중독이 기대되었다. 호모폴레이트의 크지 않은 항종양 효과는 대사 활성화가 아니라, 아마 세포로의 폴레이트 운반의 억제에 기인한다는 것이 이후 발견되었다(Livingston, et al. (1968) Biochem 7(8):2814-2818). 이것과, 이어진 치료법 개발을 위한 종양 선택적 표적 수단에 대한 프로드러그형 시도가 하기 표 1에 요약된다. 다음의 쟁점 중 하나 이상이 이들 접근법을 곤란하게 한다: a) 활성화 효소를 적합하게 위치시키는 것 및/또는 표적 효소의 종양 선택성 결여; b) 활성화된 프로드러그의 전신적 분포 및 결과적 독성; 및 c) 표적 효소 이외의 효소에 의한 활성화를 방지하기 위한 필요한 기질 효소 특이성의 달성. 예를 들어, Morgan, et al. (1998) Cancer Res. 58:2568-2575에 의해 설명된, GST에 대해 특이적인 글루타티온-s-트랜스페라제(GST) 프로드러그는 종양 과발현 GST-P1-1에 대해 특이적일 뿐만 아니라, GST-A1-1에 의해 활성화될 수도 있다. 이것은 부적합한 약물 활성화 및 잠재적 독성을 초래한다. 이들 쟁점 중 대부분이 하기 표 1에 제공된 인용 공보에 더욱 상세히 논의된다. 본 발명의 방법 및 조성물은 활성 효소의 선행 투여에 의해서 세포를 프라이밍하지 않고, 적당한 표적 세포에서만 프로드러그를 특이적으로 활성화하는 적당한 성질을 가지는 효소를 표적화하는 프로드러그를 개발함으로써 선행 프로드러그의 기능부전을 피한다.
본 발명의 추가적 양태에서, 프로드러그는 정상, 비감염 세포에 대하여 본질적으로 비독성이다. 본 양태는 프로드러그의 선택성을 더 향상시키고 치료법의 전체적인 안정성을 증가시킨다. 감염된 세포만이 병원균 또는 병원균으로 감염된 세포의 증식을 억제하는 프로드러그의 독성 대사물질의 유효량을 제공하기 때문에 프로드러그는 선택적으로 세포를 죽일 수 있다. 즉, 본 발명의 프로드러그의 최종적인 효험은 활성 효소의 기원에 관한 것이다. 예를 들어, NB1011 의 효험은 공개된 문헌에서 기대된 바와 같이, 미생물 TS 보다 사람 TS 에 대한 기질로서 기대이상으로 더욱 효능이 있다(Barr(1983) J.Biol.Chem.258(22):13637-13631). 하기의 표 2에 요약된다.
다양한 방법이 치료 방법의 피험자로 적합하지를 결정하기 위해서 이용된다. 이것은 RT-PCR 분석법, 성장 억제 연구(alamar blue 분석법) 및 플라크 분석법을 제한없이 포함한다. 본 방법은 당업계에 잘 알려지고 본원에 개시된다.
출원인은 또한 기질 프로드러그로 치료된 세포는 종래의 치료법으로 적당하게 치료된 선행 표현형으로 복귀할 수 있다는 것을 발견했다. 예로서, TS 를 사용하여, 출원인은 5-FU 로 치료된 종양세포가 약물에 내성인 것을 밝혔다. 동시에, 세포를 NB1011 로 치료했다. 아군이 생존했고, NB1011 에 대하여 내성이 되었지만 5-FU 에 대하여 민감성을 다시 회복했다(표 9 및 도 8 참조). 그러므로, 본 발명은 다른 항-감염제의 유효량이 본 발명의 기질 프로드러그와 공동-투여된 상기에 개시된 방법을 제공한다. 한 양태에서, 제2의 또는 제3의 약제는 병원균이 이미 내성으로 개발된 약물이다. 추가적인 약제는 기질 프로드러그의 동시발생적 또는 연속적인 투여로 투여될 수 있다.
본 발명은 예를 들어, 동물 세포, 포유동물 세포, 또는 사람 세포와 같은 비감염 세포에 비하여 감염제 또는 병원균에 의해서 생산되거나 발현된 활성 효소에 의해서 선택적으로 전환된 프로드러그를 더 제공한다. 출원인은 본 발명의 실행을 위해서 몇 개의 우선적인 프로드러그를 발견했다. 화합물에 대한 구조 및 합성 방법은 하기의 물질 및 방법에 제공된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "접촉시키는"은 시험관내, 생체외 및 생체내에서 프로드러그의 투여를 포함한다. 생체내에서 행해질 때, 프로드러그는 유효량으로 피험자에게 투여된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "피험자"는 어떤 적합한 동물 모델, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 유인원을 포함하도록 의도된다. 또한, 사람 환자에게 투여하는 것도 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 정의된 활성 효소에 의해서 세포에서 선택적으로 독소로 전환된 프로드러그의 치료적 유효량을 대상에 투여함으로써, 병원균으로 감염된 대상을 치료하는 방법이다. 효소는 반드시 과발현될 필요가 없다. 더이상의 양태에서, 적어도 하나의 추가적인 치료제의 유효량은 지질 프로드러그의 투여를 위해서 동시발생적으로, 미리 또는 이이서 공동-투여된다.
프로드러그가 마우스, 래트 또는 사람 환자와 같은 대상에 투여된 경우에, 약제는 제약학적으로 허용가능한 담체에 첨가될 수 있고, 전신 또는 국부적으로 피험자에게 투여된다.
생체내 투여는 치료 과정 동안 내내 1회 용량으로, 연속 또는 단속적으로 행해질 수 있다. 가장 효과적인 투여 수단 및 용량을 결정하는 방법은 당업자에게잘 알려져 있으며, 치료법에 사용되는 조성물, 치료법의 목적, 치료될 표적 세포, 및 치료될 환자에 따라 변할 것이다. 단일 또는 다수 투여가 주치의에 의해 선택되는 용량 레벨 및 패턴에 따라 실시될 수 있다. 적합한 용량 감염제 및 프로드러그의 투여 방법은 하기에서 알 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 경구, 비강내, 비경구 또는 흡입 치료법에 의해 투여될 수 있으며, 정제, 마름모꼴 정제, 과립, 캡슐, 알약, 앰플, 좌약 또는 에어로졸형의 형태를 취할 수 있다. 또한, 그것들은 수성 또는 비수성 희석제, 시럽, 과립 또는 분말중의 활성 성분의 현탁액, 용액 및 에멀젼의 형태를 취할 수 있다. 본 발명의 화합물에 더하여, 제약학적 조성물은 다른 제약학적 활성 화합물, 또는 복수의 본 발명의 화합물을 함유할 수 있다.
더욱 특별하게는, 본 발명의 화학식의 화합물이 또한 본원에서 활성 성분으로 간주되며, 경구, 직장, 비강, 국부(경피, 에어로졸, 구강 및 설하를 포함), 질, 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내를 포함) 및 폐를 포함하는, 어떤 적합한 경로에 의해 치료법을 위해 투여될 수 있다. 또한, 바람직한 경로가 수용자의 상태 및 나이, 그리고 치료될 질환에 따라 변할 것이라는 것이 인정될 것이다.
일반적으로, 상기 화합물 각각의 적합한 용량은 수용자의 kg 체중 당 일일 약 1 내지 약 100mg의 범위, 바람직하게는 kg 체중 당 일일 약 1 내지 약 50mg의 범위, 가장 바람직하게는 kg 체중 당 일일 약 1 내지 약 25mg의 범위내이다. 달리 나타내지 않았다면, 활성 성분의 모든 중량은 그것들의 염 또는 에스테르에 대해 본 발명의 화학식의 모화합물로 계산되며, 이 중량은 비례적으로 증가될 것이다.바람직한 용량은 하루 동안 내내 적합한 간격으로 투여되는 2, 3, 4, 5, 6 이상의 하위-용량으로 바람직하게 제시된다. 이들 하위-용량은, 예를 들어 단위 용량 형태 당 약 1 내지 약 100mg, 바람직하게는 약 1 내지 약 25mg, 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 25mg의 활성 성분을 함유하는 단위 용량 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 조성물의 적합한 용량이 질환의 종류 및 심각성 및 단계에 좌우될 수 있으며, 환자에 따라 변할 수 있음이 인정될 것이다. 최적 용량의 결정은 일반적으로 본 발명의 치료의 어떤 위험 또는 해로운 부작용에 대한 치료적 유익함의 레벨을 조화시키는 것을 포함한다.
이상적으로, 프로드러그는 질환 부위에서 활성 화합물의 최고 농도를 달성하도록 투여되어야 한다. 이것은, 예를 들어 선택적으로 식염수중의 프로드러그의 정맥주사에 의해, 또는 예를 들어 활성 성분을 함유하는 정제, 캡슐 또는 시럽으로서 경구 투여됨에 의해 달성될 수 있다. 프로드러그의 바람직한 혈중 레벨은 질환 조직 내에 활성 성분의 치료량을 제공하기 위한 연속적 주입에 의해 유지될 수 있다. 각각의 치료적 화합물 또는 방법이 단독으로 사용될 때 요구될 수 있는 약물의 총용량을 저하시키고, 이로써 부작용을 감소시키는 치료적 조합을 제공하는, 효험 있는 조합의 사용이 고려된다.
본 발명의 더이상의 양태는 상기에 개시된 추가적인 치료법과 본원에 개시된 프로드러그를 조합하는 것이다. 예를 들어, 본원에 개시된 프로드러그는 본 발명의 프로드러그의 그것을 제외한 방법으로 독성 효과를 발휘하는 약제와 우호적으로 조합된다.
프로드러그 성분이 단독으로 투여되는 것이 가능하지만, 상기에 정의된 대로, 그것의 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 담체 및 선택적으로 다른 치료제와 함께 적어도 하나의 활성 성분을 포함하는 제약학적 조성물로서 제공되는 것이 바람직하다. 각 담체는 다른 조성물의 다른 성분과 허용가능하고 환자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용가능할 수 있어야" 만 한다.
조성물은 경구, 직장, 비강, 국부(경피, 협측 및 설하를 포함), 질, 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내를 포함), 질, 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내를 포함) 및 폐 투여에 적합한 것을 포함한다. 조성물은 종래의 단위 투여 형태로 제공될 수 있고, 의약 분야에 알려진 어느 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 성분과 하나 이상의 보조 성분으로 구성되는 담체를 결합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 활성 성분과 액체 담체 또는 미세하게 분해된 고체 담체 또는 모두를 균일하고 조밀하게 결합시킴으로써 제조되고, 그 다음 필요한 경우 형상화한다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 조성물은 캡슐, 캐세이(cachet) 또는 정제와 같은 별개의 단위로서 제공될 수 있고, 각각은 분말 또는 과립으로; 수성 또는 비수성 액체로서 용액 또는 현탁액으로; 또는 수중 오일 액체 에멀젼 또는 오일 중 물 에멀젼으로 활성 성분의 이미 결정된 양을 함유한다. 활성 성분은 큰 알약, 연약 또는 페이스트를 제공할 수 있다.
정제는 선택적으로 보제 성분과의 압축 또는 몰딩으로 제조될 수 있다. 압축된 정제는 분말 또는 과립과 같은 유동성 결여 형태로, 선택적으로 바인더(예를들어, 프로비돈, 젤라틴, 히드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 붕괴제(예를 들어, 나트륨 전분 글리코레이트, 교차결합 프로비돈, 교차결합 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스), 표면-활성 또는 분산제와 혼합하여 활성 성분을 적당한 기계에서 압축시킴으로써 제조된다. 몰딩된 정제는 불활성 액제 희석제로 수분이 가해진 분말 화합물의 혼합물을 적당한 기계에서 몰딩함으로써 제조될 수 있다. 정제는 선택적으로 코팅 또는 스코어될 수 있고, 바람직한 해리 프로파일을 제공하기 위해서 다양한 비율로 예를 들어, 히드록시프로필메틸 셀룰로스를 사용하여 그 안의 활성 성분의 느리거나 조절된 해리를 제공하도록 제조될 수 있다.
구강에의 국부 투여에 적합한 조성물은 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔스와 같은 맛을 낸 베이스 내의 활성 성분을 포함하는 정제; 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아와 같은 불활성 베이스 내의 활성 성분을 포함하는 알약; 및 적당한 액체 담체내의 활성 성분을 포함하는 치약을 포함한다.
본 발명에 따르는 국부 투여에 적합한 제약학적 조성물은 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일로 제조될 수 있다. 또한 달리, 조성물은 활성 성분 및 택일적으로 하나 이상의 부형제 또는 희석제와 함께 주입된 밴드 또는 점착 분말 석고와 같은 패치 또는 드레싱을 포함할 수 있다.
눈 또는 예를 들어, 구강 및 피부와 같은 다른 외부 조직의 질환의 경우에, 조성물은 예를 들어, 약 0.075 내지 약 20%w/w, 바람직하게는 약 0.2 내지 약 25%w/w 및 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 약 10% w/w 의 양으로 활성 성분을 함유하는 국부 연고 또는 크림으로 바람직하게 적용된다. 연고로 제조된 경우에, 프로드러그는 파라핀 또는 물과 혼화되기 쉬운 연고 베이스로 사용될 수 있다. 택일적으로, 프로드러그 성분은 수중 오일 크림 베이스를 가지는 크림으로 제조될 수 있다.
바람직하게는 크림 베이스의 수성상은 예를 들어, 적어도 약 30% w/w 의 폴리히드로 알콜, 즉 프로필렌 글리콜, 부탄-1,3-디올, 만니톨, 솔비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜 및 그것의 혼합물과 같은 2 이상의 히드록시기를 가지는 알콜을 포함할 수 있다. 국부 조성물은 피부 또는 다른 상처받은 영역을 통해 프로드러그 성분의 흡수 또는 침투를 향상시키는 성분을 포함한다. 이러한 피내 침투 향상제의 예는 디메틸술폭시드 및 관련 유사체를 포함한다.
본 발명의 에멀젼의 오일상은 당업계에 공지된 성분으로부터 구성될 수 있다. 상은 단지 유화제 (달리 에뮬젠트로 알려짐)를 포함하는 반면에, 바람직하게는 지방 또는 오일을 가지거나, 지방 및 오일 모두를 가지는 적어도 하나의 유화제의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 친수성 유화제는 안정제로 작용하는 친지질 유화제와 함께 포함된다. 오일 및 지방 모두를 포함하는 것이 바람직하다. 안정제를 가지거나 가지지 않는 유화제는 소위 유화 왁스를 구성하고, 오일 및/또는 지방을 함께 가지는 왁스는 크림 조성물의 오일 분산상을 형성하는 소위 유화 연고 베이스를 구성한다.
본 발명의 조성물에 적합한 에멀젼트 및 에멀젼 안정제는 Tween60, Span80, 케토스테아릴 알코올, 미리스틸 알코올, 글리세릴 모노스테아레이트 및 나트륨 라우릴 술페이트를 포함한다.
조성물용의 적합한 오일 또는 지방의 선택은 바람직한 코스메틱 성질을 얻는 것에 기초하므로, 제약학적 에멀젼 조성물내에 사용될 대부분의 오일내의 활성 화합물의 용해도는 매우 낮아야한다. 그러므로, 크림은 바람직하게는 튜브 또는 다른 용기로부터의 누출을 피하기 위해서 적당한 일관성으로 비오일, 비오염 및 씻겨나갈 수 있는 생성물일 수 있어야만 한다. 직쇄 또는 분쇄, 모노 또는 디베이스 알킬 에스테르 예컨데, 디-이소아디페이트, 이소세틸 스테아레이트, 코코넛 지방산의 프로필렌 글리콜 디에스테를, 이소프로필 미리스테이트, 데실 올레이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트, 2-에틸헥실 팔미테이트 또는 Crodamol CAP 로 알려진 분쇄의 혼합물이 사용될 수 있고, 마지막에 언급된 3 개가 바람직한 에스테르이다. 이것들은 요구되는 성질에 기초하여 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 택일적으로, 화이트 소프트 파라핀 및/또는 액체 파라핀 또는 다른 미네랄 오일과 같은 높은 녹는 점 액체가 사용될 수 있다.
눈에의 국부 투여에 적합한 조성물은 또한 활성 성분이 적당한 담체, 특히 프로드러그 성분용 수성 용매에 용해되거나 현탁된 눈물을 포함한다. 프로드러그 성분은 바람직하게는 약 0.5 내지 약 20%, 유리하게는 약 0.5 내지 약 10%, 특히 약 1.5% w/w 의 농도로 이러한 조성물에 존재한다.
직장 투여용 조성물은 예를 들어, 코코아 버터 또는 살리실레이트를 포함하는 적당한 염기를 가지는 좌약으로 제공될 수 있다.
질 투여에 적합한 조성물은 좌약, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 프로드러그 성분을 추가적으로 함유하는 거품 또는 스프레이 조성물로서 제공될 수 있고, 이러한 담체는 당업계에서 적당한 것으로 알려진다.
담체가 고체인, 비강 투여에 적합한 조성물은 코로 들이쉬는 방식으로 투여되며, 즉 코 가까이에 있는 분말 용기로부터 비강 경로를 통해서 빠른 흡입에 의해서 약 20 내지 약 500 마이크론의 범위의 입자 크기를 가지는 성긴 분말을 포함한다. 담체가 예를 들어, 비강 스프레이, 비강 드롭과 같은 투여용 액체이거나, 분무제에 의한 에어로졸 투여에 적합한 조성물은 프로드러그 성분의 수성 또는 오일 용액을 포함한다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 조성물을 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 항-산화제, 완충액, 세균발육 저지제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 무균 주입 용액; 및 현탁제 및 증감제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 무균 현탁액, 및 화합물을 혈액 성분 또는 하나 이상의 기관에 표적화하도록 설계된 리포솜 또는 다른 미세입자 시스템을 포함한다. 조성물은 예를 들어, 앰플 및 물약과 같은 단위-용량 또는 다회-용량 봉입된 용기로서 제공될 수 있고, 예를 들어, 사용 직전에 주입을 위해 물과 같은 무균 액체 담체의 첨가만을 요구하는 냉동-동결건조(냉동건조)상태로 저장될 수 있다. 1 회 주입 용액 및 현탁액은 이미 개시된 종류의 무균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
바람직한 단위 용량 조성물은 본원의 상기에 언급된 프로드러그 성분의 일일 용량 또는 단위, 일일 하위용량, 또는 그것의 적당한 분획을 함유하는 것이다.
상기에 특히 언급된 성분에 추가적으로, 본 발명의 조성물은 예를 들어, 감미료, 점증제, 및 방향제와 같은 더이상의 약제를 포함할 수 있는 경구 투여에 적합한 것으로 여겨지는 종래의 다른 감염제를 문제의 조성물의 형태에 포함할 수 있다.
본 발명의 화학식의 프로드러그 및 조성물은 또한 수의 조성물의 형태로 사용하기 위하여 제공될 수 있고, 이것은 예를 들어, 종래 기술의 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 감염제 및 조성물은 의약의 제조, 및 제약학적 조성물로의 활성 성분과 같은 종래의 과정에 따른 투여에 의해서 사람 및 다른 동물의 치료에 사용될 수 있다.
스크리닝 분석
본 발명은 활성화 효소를 발현하는 세포를 제공하고 후보 프로드러그와 세포를 접촉시킴에 의하여, 활성 효소에 의해서 독소로 선택적으로 전환된 프로드러그를 스크리닝 하는 방법을 더 제공한다. 적어도 하나의 시험 세포는 효소의 병원균버젼(야생형 또는 돌연변이)를 발현하고, 다른 시험 세포는 그 자신의 효소 버젼을 발현할 수 있거나 발현하지 않을 수 있는 숙주 생물로부터의 세포 샘플이다. 다음에, 병원균에 의해 생성된 활성 효소에 의한 독성 감염제로의 프로드러그의 전환에 대해 분석한다. 본원에 사용될 때, 시험 세포는 병원균으로 감염되거나 택일적으로 활성 효소를 발현하도록 형질전환된 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 활성 효소 TS 를 내인성으로 발현하지 않는 원핵생물 E.coli가 적당한 숙주 세포 또는 표적 세포이다. 택일적으로, 시험 세포는 대상으로부터 분리된 감염세포일수 있거나, 병원균으로 감염된 배양 세포일 수 있다. 세포는 대조 상응물(표적 효소 결여)을 가질 수 있거나, 별개의 구체예에서, 상응물은 유전적으로 변형되어서 표적 효소, 또는 (표적 효소의 적당한 종을 함유하는)효소를 서로 다르게 발현한다. 1 종이상의 효소는 별개의 숙주 세포를 개별적으로 형질전환하는데 사용될 수 있으며, 이로써 표적 효소에 대한 후보 약물의 효과가 다른 효소 또는 다른 종으로부터의 상응하는 효소에 대한 그것의 효과와 동시에 비교될 수 있다.
다른 구체예에서, 제 3의 표적 세포가, 하기 나타낸 화합물과 같은 강력한 프로드러그로 나타난 화합물의 유효량을 받을 수 있기 때문에, 양성 대조표준으로 사용된다.
다른 구체예에서, Ras-형질전환 NIH 3T3 세포(ATCC 10801 University Blvd., Manassas, VA 201 10-2209, U.S.A.)와 같은 형질전환된 세포라인이 효소를 코딩하는 클론된 cDNA로부터 관심의 표적 효소의 양을 가변적으로 증가시키면서 발현하도록 유전자 조작된다. 트랜스펙션은 본 분야에 잘 공지되고, Sambrook 등(상기와 같음)에 설명된 과정을 사용하는 일시적 또는 영구적 트랜스펙션이다. cDNA의 삽입을 위한 적합한 벡터는 Stratagene, La Jolla, CA 및 다른 판매자로부터 상업적으로 입수가능하다. 각각의 트랜스펙션된 셀라인에서 효소의 발현 레벨이, 면역-검출용 효소에 대해 이미 발생된 단일클론 또는 다중클론 항체를 사용하는, 세포 여액의 면역블롯 및 효소 분석법에 의해 모니터될 수 있다. 발현량은 세포로 도입된 발현 카세트의 카피수에 의해, 또는 프로모터 용법을 변화시킴에 의해 조절될 수 있다. 또한, 발현된 효소의 양을 검츨하기 위한 효소 분석법이 Carreras andSanti (1995)(상기와 같음)에 의해 검토된 바와 같이, 또는 하기 설명된 방법에 의해 수행될 수 있다.
시험 세포는 작은 멀티-웰 플레이트에서 성장될 수 있으며, 시험 프로드러그의 생물학적 활성을 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 성공적인 후보 약물은 병원균 세포의 성장을 억제하거나, 또는 그것을 죽이지만, 대조표준 세포 종류는 손상되지 않고 남아있을 것이다.
후보 프로드러그는 세포 배양 배지에 직접적으로 첨가되거나, 또는 세포 표면 리셉터에 대한 특이적 리간드에 미리 콘쥬게이션된 후 배지에 첨가될 수 있다. 세포 특이적 운반을 위한 콘쥬게이트 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,459,127, 5,264,618, 및 공개 특허 명세서 WO 91/17424 (1991년, 11월 14일 공개) 참조. 후보 프로드러그의 이탈기는, 예를 들어 트리튬을 사용하여 검출가능하게 표지될 수 있다. 다음에, 표적 세포 또는 배양 배지가 후보 프로드러그로부터 유리된 표지량에 대해 분석된다. 또는 달리, 세포 흡수가 Lasic, D.D.(1996)Nature 380:561-562 에 개시된 방법을 사용하여 리포솜으로 프로드러그를 포장함에 의해 증진되거나, 또는 Lewis, J.G. 등(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3176-3181 에 개시된 시토펙틴과 조합될 수 있다.
항상 명백한 바는 아니지만, 각각의 구체예가 하기 나타낸 화합물과 같은, 강력한 프로드러그로 나타난 화합물의 유효량을 받음으로써 대조표준으로서 작용하는 별개의 표적 세포를 제공함에 의해 더 변형될 수 있음이 이해되어야 한다.
본 방법에 의해 확인된 감염제들이 본원에서 더 제공된다.
한 구체예에서, 프로드러그 효과의 분석법은 하기의 물질 및 방법 및 실험 단락에 개시된대로, 프로드러그의 세포내 대사물질의 분석으로 제공된다; 그 결과는 도 4 에 도시된다. 한 구체예에서, 프로드러그는 활성 효소에 의한 독성 감염제로의 프로드러그의 전환동안 모니터된 검출가능한 표지를 함유한다. 한 택일적일 구체예에서, 후보 기질 프로드러그는 예를 들어, 형광 마커, 또는 방사성 동위원소로 검출가능하도록 표지된다. 더이상의 양태에서, 검출가능한 표지는 예를 들어, 브롬과 같은 같은 원자의 2 이상의 가변 동위원소를 포함한다. 본 구체예에서, 반응 생성물의 질량 분광계로 프로드러그의 독성 부산물로의 변형을 분석할 수 있다. 분석법은 하기에 더욱 상세하게 개시된 질량 분광계의 사용으로 이루어지고, 이것의 결과는 도 6 에 나타난다.
상기 스크리닝을 사용하여, 또한 사람 환자와 같은 피험자로부터 취해진 샘플에 대한 몇개의 프로드러그를 예비-스크리닝할 수 있다. 각 병원균 및 환자에 대한 가장 효과적인 기질 프로드러그 및 치료법을 결정하기 위해 스크리닝을 사용할 수 있다.
I. 물질 및 방법
A. 합성 방법
(E)-5-(2-브로모비닐)-2'-디옥시우리딘(BVdU)을 Dyer 등(Dyer, et al. (199 1) Nucleic Acid Chemistry: Improved and New Synthetic Procedures, Methods and Techniques, Townsend, et al. (eds) John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 79-83)의 방법에 의해 제조했다. 이것 및 상업적(Fisher/Acros) 5-플루오로-2'-디옥시우리딘(5FdU)을 각각 사용하기 바로 전에 P2O4에 인접한 75℃에서 진공하에 건조시켰다. 흡착제로서 형광 지시약을 사용하는 Merck 실리카겔-60을 사용하여, 방사상 크로마토그래피를 크로마트론(Chromatotron) 장치(Harrison Research, Palo Alto, CA)에서 수행했다. (E)-5-(2-브로모비닐)-2'-디옥시우리딘 5'-모노포스페이트("BVdUMP")를 BVdU의 표준 화학적 인산화에 의해 제조했다.
NMR: 1H NMR 스펙트럼을 헥사듀테리오-디메틸 술폭시드(C2H3)2SO 용액을 사용하여, 300MHz Varian Associates Gemini 분광계에서 기록했다. 화학적 이동을 d= 0.0ppm의 내부 테트라메틸실란 기준에 상대적으로 기록했다.13C NMR 스펙트럼을 75MHz에서 기록하고, 화학적 이동을 d=39.5ppm의 내부 펜타듀테리오-디메틸 술폭시드에 상대적으로 기록했다.31P NMR 스펙트럼을 202MHz Bruker 분광계에서 기록하고, 화학적 이동을 d=0.0ppm의 외부 85% H2O/15% H3PO4vol/vol에 상대적으로 기록했다.
NB1011: ((E)-5-(2-브로모비닐)-2'-디옥시-5'-우리딜 페닐 L-알라닌일포스포르아미데이트(BVdU-PA, "NB1011"))을 다음과 같이 제조했다. 아르곤하의 무수 DMF 2mL 중의 BVdU(420mg, 1.26mmol) 및 이미다졸(103mg, 1.51mmol) 용액을 페닐-L-메톡시알라닌일포스포로클로리데이트(McGuigan, et al. (1996) J. Med. Chem. 39:17 49-1753)로 적하처리(15방울, 350mg, 1.26mmol)하고, 반응 혼합물을 24시간 동안 아르곤하에 23℃에서 교반했다. 용리액으로서 10% MeOH/90% CH2Cl2vol/vol를 사용하는 실리카겔 TLC에 의해, 출발 물질(Rf=0.53)로부터 전환 생성물(Rf=0.07)의 생성이 발생했지만 부분적(약 15%)이었고, 그래서 추가의 이미다졸(52mg, 0.75mmol) 및 포스포로클로리데이트 시약(8방울, 175mg, 0.63mmol)을 가하고, 혼합물을 다시 24시간 동안 아르곤하에 23℃에서 교반했다. TLC에 의해, 전환이 약 30% 정도로 증가되었다. 포스포로클로리데이트 및 이미다졸을 사용한 이어지는 처리는 반응의 진행을 거의 촉진시키지 않았다. 용액을 ~40℃에서 진공하에 회전식 증발에 의해 0.75mL로 부피를 감소시키고, 다음에, 같은 부피의 CH2Cl2를 가하고, 용액을 건조 4mm 실리카겔 크로마토트론 플레이트에 직접 적용시켰다. 이 시점에서, 30분간 진공 데시케이터에 플레이트를 둠으로써 벌크한 잔류 DMF를 제거하여, 이어지는 분리를 용이하게 했다. CH2Cl2(잔류 시약 및 DMF를 용리하기 위해) 250mL, 이어서 10% MeOH/90% CH2Cl2vol/vol(생성물 및 이어서 출발 물질을 용리하기 위해)를 사용하는 방사상 크로마토그래피로 전환 생성물 144mg(20%) 및 출발 물질 294mg를 얻었으며, 미전환 출발 물질을 기초로 한 전환 생성물의 수율은 67%이다. 오염된 이미다졸(d=7.65 및 7.01) 또는 DMF(d=7.95, 2.89, 및 2.73)의 존재가1H NMR에 의해 검출되었다면, 추가의 방사상 크로마토그래피 정제를 수행했다. 이 방식으로, TLC 및1H NMR에 의한 순도 98%의 전환 생성물을 오일/검 또는 거품이 이는 분말 형태로 거의 등몰랄 혼합물의 인중심-기제 부분입체이성질체로서 얻었다.1HNMR((C2H3)2SO) d=11.4(bs,2H2O로 교환, 1, N3H), 8.28(위-t, 1, H6), 7.35(위-t, 2, o-Ph), 7.31(d, 1, 비닐1H), 7.20 (위-t, 3, m 및 p-Ph), 6.89(d, 1, 비닐2H), 6.19(t, 1, H1'), 6.08(t,2H2O로 교환, 1, 알라닌일 NH), 5.45(bs,2H2O로 교환, 1, O3'H), 4.32(m, 1, H3'), 4.22(m, 2, 5'CH2), 3.97(m, 1, H4'), 3.86 (t, 1, 알라닌일 CH), 3.58(2s, 3, CO2Me), 2.15 (m, 2, 2'CH2), 1.23(위-t, 3, 알라닌일 CH3). J비닐CH-비닐CH=13.5, JH1'-H2'~ 6.8, JH2'-H3'~5, JH3'-H4'~0, J알라닌일CH-알라닌일NH~6Hz. 스펙트럼 지정은 1H/1H COSY 2D NMR 분석에 의해 확인했다.13C NMR((C2H3)2SO)) d=173.7 및 173.6(알라닌일 CO2), 162.1 및 161.6(C2), 150.6, 150.5(입소-Ph), 149.2(C4), 139.4 및 139.2(C6), 129.8 및 129.6(m-Ph), 124.7(p-Ph), 120.3, 120.2(o-Ph), 107.1(비닐 C1), 87.5(비닐 C2), 84.8(C4'), 83.8(C1'), 70.1(C3'), 66.1(C5'), 51.9(알라닌일 OMe), 49.7(알라닌일 a-H), 29.5(C2'), 19.6(알라닌일 a-Me). 3JP-C4'=7.8, 2JP-C5'=4.4, 2JP-입소-Ph=6.5 Hz. 31P NMR d=3.99, 3.69. 저분해능 DCI(NH3) 질량: 593/591(MNH4 +), 576/574 (MH+).
단지 편의를 위해서, 본 발명의 방법에 유용한 표본 프로드러그의 공통된 구조를 I형 및 II형으로 분류했다.
I형 화합물의 일반적 합성
I형 화합물의 L 및 D 이성질체는 다음 구조식을 갖는다:
상기 구조식에서, R1(5-위치)은 예를 들어, 티미딜레이트 신타제와 같은 활성 효소에 의한 피리미딘 고리로부터의 추출과 양립할 수 있는 분자 치수 및 친전자성을 갖는 화학적 실체인, 활성 효소에 의한 피리미딘 고리로부터의 유리시에 감염제 또는 세포의 증식을 억제할 수 있는 능력을 가지는 이탈기이거나 또는 그러한 이탈기를 함유한다.
상기 구조식에서, Q는 당, 탄소환식 또는 비환식 화합물, 또는 당기, 티오-당기, 탄소환식기, 및 그것의 유도체로 구성되는 군으로터 선택된 화학적 실체를 함유하는 차폐된 포스페이트 또는 포스포르아미데이트 유도체이다. 당기의 예는 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 옥세탄(4-원고리당), 푸라노스(5-원고리당), 및 피라노스 (6-원고리당)로부터 유도된 것들과 같은 일당류 환식당기를 포함한다. 푸라노스의 예는 트레오-푸라노실(트레오스로부터, 4-탄당); 에리트로-푸라노실(에리트로스로부터, 4-탄당); 리보-푸라노실(리보스로부터, 5-탄당); 아라-푸라노실(또한 주로 아리비노-푸라노실로 간주됨; 아라비노스로부터, 5-탄당); 크실로-푸라노실(크실로스로부터, 5-탄당); 및 리소-푸라노실(리소스로부터, 5-탄당)을 포함한다. 당기 유도체의 예는 "디옥시", "케토", 및 "디히드로" 유도체 뿐만 아니라,치환된 유도체도 포함한다. 티오-당기의 예는 고리 산소가 황 원자로 대체된 상기 당기의 황 유사체를 포함한다. 탄소환식기의 예는 C4탄소환기, C5탄소환기, 및 C6탄소환기를 포함하며, 이것은 -OH 기와 같은 하나 이상의 치환기를 더 가질 수 있다.
한 구체예에서, Q는 다음 구조식의 β-D-리보푸라노실기이다.
상기 식에서, R7은 H, 차폐된 포스페이트 또는 포스포르아미데이트 및 그것들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되고, R2및 R3은 동일하거나 또는 상이하며, 독립적으로 -H 또는 -OH이다.
상기 구조식의 어떤 구체예에서, R1은 알킬렌기, 즉 (-CH=CH)n-R4이며, 여기에서 n은 0 또는 1 내지 10의 정수이고, R4는 I-, Br-, CN-과 같은 할로겐, 또는 수은이다. R2는 H이고 R3은 -OH이거나, R2는 OH이고 R3은 H이고, R2및 R3은 H이거나, 또는 R2및 R3은 OH이다. 다른 양태로서, R4는 H, 할로겐, 알킬, 알켄, 알킨, 히드록시, -O-알킬, -O-아릴, O-헤테로아릴, -S-알킬, -S-아릴, 시아나이드, 시아네이트및 티오시아네이트 할로비닐기, 할로수은기, -S-헤테로아릴, -NH2, -NH-알킬, -N(알킬)2, -NHCHO, -NHOH, -NHO-알킬, NH2CONHO-, 및 NHNH2로 구성된 군으로부터 선택된 기이거나 또는 함유한다. 이들 구체예에서, 더 이상의 양태는 R2및 R3이 H이거나; R2가 OH이고 R3이 H이거나; R2가 H이고 R3이 OH이거나; 또는 R2및 R3이 OH인 것을 포함한다.
R1위치의 치환기에 대한 바람직한 구체예는 알릴 상호교환을 당할 수 있는 것이다.
다른 양태로서, 후보 치료제는 다음 구조식의 화합물이다.
상기 식에서, n은 0 또는 1 내지 10의 정수이고, A는 인 유도체이거나, 또는 구조식
의 화합물이며,
상기 식에서, Q는 상기 정의된 바와 같다.
추가적으로, 더이상의 양태에서, 후보 치료제는 다음 구조식의 화합물이다.
여기에서, R은 2'-디옥시-5-우리딜이고, m은 0 또는 1이고, n은 0 내지 10의 정수이다.
적합한 경우, 화합물은, 예를 들어 D- 또는 L-형을 포함하는 그것들의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 또는 입체이성질체 형태 중 어느 것 일 수 있으며, 예를 들어 α- 또는 β-아노머형을 포함하는 어떤 입체화학 구조일 수 있다.
상기 기재된 5-치환 피리미딘 뉴클레오시드 및 5-치환 피리미딘 뉴클레오시드 모노포스페이트의 합성은 본 분야에 잘 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, Li2PdCl4의 존재하에 할로알킬 화합물, 할로아세테이트 또는 할로알켄을 사용한 5-클로로머큐리-2'디옥시우리딘의 처리는 유기팔라듐 중간체를 거쳐 각각 5-알킬, 5-아세틸 또는 5-알켄 유도체의 형성을 가져온다. 피리미딘 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드의 C5-변형의 다른 예는, Li2PdCl4의 존재하에 아세트산수은을 사용하여 비보호 뉴클레오티드를 처리하고, 이어서 스티렌 또는 고리-치환 스티렌을 첨가함에 의한 C5-트랜스-스티릴 유도체의 형성이다. Bigge, et al. (1980) J. Am. Chem. Soc. 102(6):2033-2038. 3시간 동안 50℃에서 아세테이트 완충액중의 아세트산수은을 사용한 처리에 의해 피리미딘 고리의 5-위치에 수은을 갖는 피리미딘디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트가 유도되었다. Dale, et al. (1973) PNAS 70(8):238-2242. 그러한 처리는 또한 모노포스페이트의 변형을 위해 효과적일 것으로 기대된다. 또는 달리, 변형된 트리포스페이트는, 예를 들어 알칼리성 포스파타제를 사용한 조정된 처리와, 이어서 모노포스페이트의 정제에 의해 변형된 모노포스페이트로 효소적으로 전환될 수 있다. 수은과 유사한 분자 특성을 갖지만, 제약학적 특성이 바람직한 유기 또는 비유기인 다른 부분으로 치환될 수 있다. 치환된 피리미딘의 합성을 위한 일반적 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 4,247,544; 4,267,171 및 4,948,882, 및 Bergstrom, et al. (1981) J. Org. Chem. 46(7):1432-1441 참조. 상기 방법은 또한 리보스 또는 2'-디옥시리보스 이외의 당, 예를 들어 2',3'-디디옥시리보스, 아라비노스, 푸라노스, 리소스, 펜토스, 헥소스, 헵토스 및 피라노스를 함유하는 5-치환 피리미딘 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유도체의 합성에 적용될 수 있다. 5-위치 치환의 예는 할로비닐기, 예를 들어, E-5-(2-브로모비닐)-2'-디옥시우리딜레이트이다. Barr, et al. (1983) J.Biol.Chem.258(22):1367-13631 및 Biochem.22:1696-1703
또는 달리, 5-브로모디옥시우리딘, 5-요도디옥시우리딘, 및 그것들의 모노포스페이트 유도체가 Glen Research, Sterling, VA(USA), Sigma-Aldrich Corporati-on, St. Louis, MO(USA), Moravek Biochemicals, Inc., Brea, CA(USA), ICN, Costa Mesa, CA(USA) 및 New England Nuclear, Boston, MA(USA)로부터 상업적을 입수가능하다. 상업적으로 입수가능한 5-브로모디옥시우리딘 및 5-요도디옥시우리딘은 Glen Research, Sterling, VA(USA) 및 ICN, Costa Mesa, CA(USA)로부터 상업적으로입수가능한 시약을 사용한 키나제 효소의 작용을 통해, 화학적 또는 효소적으로 그것의 모노포스페이트로 전환될 수 있다. 이들 할로겐 유도체는 다른 치환기와 조합되어 신규의 더욱 강력한 항대사물질을 만들 수 있다.
II형 화합물의 일반적 합성
본 구체예에서, 본 발명은 TS 와 같은 효소로 활성화된 II형 화합물을 4가지 부류의 화합물을 포함한다. 각 부류는 우라실 염기 , 또는 변형된 우라실 염기 의 구조에 의해 정의된다. 이들 부류는 I) 염기는 우라실의 푸라노-피리미디논 유도체이고, II) 염기는 6-푸라노 우라실이고, III) 염기는 4-히드라존 치환 우라실 유도체이고, IV) 염기는 우라실인, ECTA 화합물이다. 우라실 또는 변형된 우라실 유도 염기는 5-위치에서 독성 이탈기로 치환되고, 이 5-위치에서 전자 콘딧 테더에 의해 부착되고, 전자 콘딧과 독성 이탈기 사이의 적합한 스페이서 부분을 포함하는 화합물을 합성하는데 사용된다. ECTA 화합물은 인산화되지 않은, 5'-모노포스페이트, 5'-포스포디에스테르, 또는 5'-보호된("차폐된") 디옥시우리딘 또는 다른 탄화수소 부분을 갖는 비교가능한 유도체일 수 있으며, 하기 설명된 바와 같다. 보호된 5-치환 디옥시우리딘 모노포스페이트 유도체는 포스페이트 부분이 적합한 화학적 보호기의 부착을 통해 차단된 것들이다. 5-치환 디옥시우리딘 모노포스페이트 유도체의 보호는 용해성을 개선시키고, 세포 침투를 용이하게 하고, 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 통과를 용이하게 하고, 세포 또는 세포외 포스페이트의 작용을 방지할 수 있으며, 다르게는 포스페이트기의 상실을 가져올 수 있다. 다른 구체예에서, 5-치환 우라실 또는 우리딘 유도체는 뉴클레오시드 키나제 활성을 함유하는 세포에투여되며, 여기에서 5-치환 우라실/우리딘 유도체는 5-치환 우리딘 모노포스페이트 유도체로 전환된다. 또한, 우리딘 유도체는 그것들의 용해성, 세포 침투, 및/또는 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 능력이 증가되도록 변형될 수 있다.
5-치환 우리딘 모노포스페이트 유도체에 대한 티미딜레이트 신타제의 작용은 피리미딘 고리의 5-위치에 부착된 치환기("이탈기")를 유리할 수 있다. 다음에, 유리된 치환기는, 본래 또는 다른 세포 성분과의 반응 후, 세포 증식의 독소 또는 억제제로 작용할 수 있다.
본 발명의 화합물의 L 및 D 이성질체는 하기 나타낸 구조식을 갖는 화합물로 구성된 군으로부터 선택된다:
상기 구조식에서, R1은 구조식
을 가진다.
상기 식에서, R2는 2가 전자 콘딧 부분이거나 또는 함유한다. 한 구체예에서, R2는 피리미딘 고리로부터 떨어져서 그리고 이탈기 R1을 향해 전자를 콘덕트하도록 작용하는 모노- 또는 폴리불포화 전자 콘딧이거나 또는 함유한다. 단, I형 화합물에서 n은 0일 수 있다. 한 구체예에서, R2는 불포화 히드로카르빌기, 하나 이상의 불포화 히드로카르빌기를 포함하는 방향족 히드로카르빌기, 및 하나 이상의 불포화 히드로카르빌기를 포함하는 헤테로방향족기로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서, R2는
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 불포화 히드로카르빌기이다.
한 구체예에서, R2및 R3은 함께
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 형성한다.
한 구체예에서, R2는
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 방향족 히드로카르빌기이다.
한 구체예에서, R2는
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 헤테로방향족기이다.
여기에서, J는 -O-, -S- 또는 -Se-와 같은 헤테로 원자, 또는 -NH- 또는 -NRALK-와 같은 헤테로 원자기이며, 여기에서 RALK는 1 내지 10 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지 알킬 또는 3 내지 10 탄소 원자를 갖는 시클로알킬기이다.
상기 구조식에서, R3은 2가 스페이서 부분이며, 또한 스페이서 단위로서 간주된다. 한 구체예에서, R3은
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 2가 스페이서 부분이다.
여기에서, R5동일하거나 상이하고, 독립적으로 1 내지 10 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지 알킬기, 또는 3 내지 10 탄소 원자를 갖는 시클로알킬기이거나, 또는 R5는 할로겐(F, Cl, Br, I)이다.
한 구체예에서, R3은
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 2가 스페이서 부분이다.
한 구체예에서, R3은
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 2가 스페이서 부분이다.
상기 구조식에서, n은 0 내지 10의 정수이고, m은 0 또는 1이다. 한 구체예에서, n은 0 또는 0 내지 10의 정수이고, m은 1이다. 한 구체예에서, n은 0이고, m도 0이다. 한 구체예에서, R7이 -H일 때, n은 0이 아니다. 한 구체예에서, R7이 -H일 때, m은 0이 아니다. 한 구체예에서, R7이 -H일 때, n은 0이 아니고 m도 0이아니다. 한 구체예에서, R7이 -H일 때, R4는 할로겐(즉, -F, -Cl, -Br, -I)이 아니다. 한 구체예에서, R7이 -H일 때, m은 0이고, R4는 할로겐(즉, -F, -Cl, -Br, -I)이 아니다. 한 구체예에서, R7이 -H일 때, m은 0이고 n도 0이며, R4는 할로겐(즉, -F, -Cl, -Br, -I)이 아니다.
상기 구조식에서, R4는 톡소포어 부분이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "톡소포어 "는 티미딜레이트 신타제에 의한 피리미딘 고리로부터의 추출과 양립가능한 분자 치수 및 친전자성을 갖는 화학적 실체인, 티미딜레이트 신타제에 의해 피리미딘 고리로부터의 유리시에 세포의 증식을 억제하거나 또는 세포를 죽이는 능력을 가지는 이탈기이거나 또는 그러한 이탈기를 함유한다.
한 구체예에서, 톡소포어는 세포에서 과발현된 세포내 효소에 의해 활성화되거나 또는 유리되는 이탈기이거나 또는 함유한다. 한 구체예에서, R4는
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 기이거나 또는 함유한다.
여기에서, X는 -Cl, -Br, -I, 또는 다른 강력한 이탈기(이것들에 제한되는것은 아니나 -CN, -OCN, 및 -SCN 포함함)이고; Y는 각 위치에서 동일하거나 상이하며, 독립적으로 -H 또는 -F이고; Z는 동일하거나 상이하며, 독립적으로 -O- 또는 -S-이고, R8및 R9는 저급 알킬이고, R10은 H 또는 CH3이다.
한 구체예에서, R4는 -Br, -I, -O-알킬, -O-아릴, O-헤테로아릴, -S-알킬, -S-아릴, -S-헤테로아릴, -CN, -OCN, -SCN, -NH2, -NH-알킬, -N(알킬)2, -NHCHO, -NHOH, -NHO-알킬, NH2CONHO-, NHNH2, -N3, 및
와 같은 시스-플라틴의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 화학적 실체이거나 또는 포함한다.
상기 구조식에서, Q는 프로드러그와 효소, 예를 들어 TS 또는 TK의 기능적 결합을 지지하는 부분이거나 함유한다. 한 구체예에서, Q는
로 구성된 군으로부터 선택된다.
여기에서, R6은 각 위치에서 동일하거나 상이하며, 독립적으로 -H, F, OH, -OC(=O)CH3, 또는 보호된 히드록실기(이것들에 제한되는 것은 아니지만, 벤조일 -COC6H5, 및 톨루오일 -COC6H4CH3을 포함함)이고; R7은 5'-위치에서 Q에 부착되며, 수소, 포스페이트기, 포스포디에스테르기, 포스포르아미데이트기, 또는 다른 인함유기이다.
한 구체예에서, R7은, 예를 들어 20개의 천연 아미노산을 포함하는 아미노산으로부터 유도된 포스포르아미데이트기이다.
한 구체예에서, R7은 구조
를 갖는 기이거나 또는 함유한다.
상기 기 및 그것의 제조 방법은 McGuigan, et al. (1993) J. Med. Chem. 36: 1048-1052 및 McGuigan, et al. (1996) J. Med. Chem. 39: 1748-1753에 설명된다.
한 구체예에서, R7은 트립토판으로부터 유도된 포스포르아미데이트기이다.한 구체예에서, R7은 구조
를 갖는 기이거나 또는 함유한다.
상기 기 및 그것의 제조 방법은 Abraham, et al. (1996) J. Med. Chem. 39: 4569-4575에 설명된다.
한 구체예에서, R7은 포스페이트기이다. 한 구체예에서, R7은
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 기이거나 또는 함유한다.
2개 기들 중 첫번째 및 그것의 제조 방법은 Freed, et al. (1989) Biochem. Pharmacol. 38:3193-3198; Sastry, et al. (1992) Mol. Pharmacol. 41:441-445; Arquhar, et al. (1994) J. Med. Chem. 37:3902-3909 및 Farquhar, et al. (1995) J. Med. Chem. 38:448-495에 설명된다. 2개 기들 중 두번째 및 그것의 제조 방법은 Valette, et al. (1996) J. Med. Chem. 39:1981 및 Benzaria, et al. (1996) J. Med. Chem. 39, p. 4958에 설명된다.
한 구체예에서, R7은
(여기에서, R은 방향족 치환기이다)
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 기이거나 또는 함유한다.
2개 기들 중 첫번째 및 그것의 제조 방법은 Meier, et al. (1997) Bioorg. Med. Chem. Lett. 7:1577; Meier, et al. (1997) Bioorg. Med. Chem. Lett 7:99; 및 Meier, et al., (1997) International Antiviral News. 5:183에 설명된다. 2개 기들 중 두번째 및 그것의 제조 방법은 Hostetler, et al. (1997) Biochem. Pharmacol. 53:1815; 및 Hostetler 등의 공개된 국제 특허 출원 No. WO 96/40088 (1996)에 설명된다.
한 구체예에서, R7은 Q 내에 고리기를 형성한다. 한 그러한 구체예 및 그것의 제조 방법을 하기 나타낸다(여기에서, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸이고, Boc는 t-부틸옥시카르보닐이고, DCC는 1,3-디시클로헥실카르보디이미드이고, 4-DMAP는4-디메틸아미노피리딘이다).
한 구체예에서, 화합물은 D-형, L-형, α-아노머형, 및 β-아노머형을 포함하는 어떤 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 또는 입체이성질체 형태일 수 있다.
한 구체예에서, 화합물은 염 형태, 또는 보호된 또는 프로드러그 형태, 또는 그것들의 조합, 예를 들어 염, 에테르, 또는 에스테르일 수 있다.
별개의 구체예에서, 상기 구조들은 하기 방법을 사용하여, 포스포디아지리딘기 대신에 트리포스포디아지리딘으로 진행하도록 더 변형될 수 있다.
상기 언급된 5-치환 피리미딘 유도체의 합성은 당업계에 잘 알려지고, 상기에 개시된 방법에 의해서 이루어질 수 있다.
택일적으로, 5-브로모디옥시우리딘, 5-요도디옥시우리딘, 및 그들의 모노포스페이트 유도체는 Glen Research, Sterling, VA(USA), Sigma-Aldrich Corporation, St.Louis, MO(USA), Moravek Biochemicals, Inc.,Brea, CA(USA), ICN, Costa Mesa, CA(USA) 및 New England Nuclear, Boston, MA(USA) 로부터 상업적으로 입수가능하다. 상업적으로 입수가능한 5-브로모디옥시우리딘 및 5-요도디옥시우리딘은 Glen Research, Sterling, VA(USA) 및 ICN, Costa Mesa, CA(USA)로부터 상업적으로 입수가능한 시약을 사용한 키나제 효소의 작용을 통해, 화학적 또는 효소적으로 그것의 모노포스페이트로 전환될 수 있다. 이들 할로겐 유도체는 다른 치환기와 조합되어 신규의 더욱 강력한 항대사물질을 만들 수 있다.
우라실의 5-위치에 있는 구조들은, 그것들이 제안된 이탈기(톡소포어 )와 헤테로고리를 연결하기 때문에, 테더로서 간주된다. 예를 들어 사람 TS의 활성 부위에 있는 Cys 잔기와의 반응에 의한 헤테로고리의 활성화에 의하여, 음전하가 우라실의 6-위치로부터 테더로 이동된다. 이 메카니즘은 Barr, et al. (1983) Biochemistry 22:1696-1703에 의한 (E)-5-(브로모비닐)-2'-디옥시우리딘(BVDU) 및 Wataya, et al. (1979) J. Med. Chem. 22: 339-340; Santi (1980) J. Med. Chem. 23:103-111; 및 Bergstrom, et al. (1984) J. Med. Chem. 27:279-284 에 의한 (E)-5-(3,3,3-트리플루오로-1-프로페닐)-2'-디옥시우리딘(TFPe-dUrD)의 5'-일인산화 버전에 대해 설명되었다.
독소와 dNMP 사이의 테더 "스페이서"는 불포화되어야 하며, 이로써 TS-시스테인-술프히드릴 어택에 의해 공급된 독소-불안정화 음전하를 이동시킬 수 있다. 이런 목적을 위해 이용할 수 있는 많은 불포화 유기 부분 중, 비닐, 알릴 및 프로파르길 단위가 간단하고, 작고, 쉽게 합성적으로 접근가능하다. 비닐 및 알릴 단위가 그것들이 2개의 비-내부전향성 기하 이성질체 형태 중 어느 것으로 제조될 수 있기 때문에 유리하다. 따라서, 그것들은 TS 활성 부위에 의한 프로드러그 적응의"프로브"로서 사용될 수 있다. 한편, 프로파르길는 원통형 대칭의 잇점을 가지며, 이로써 이 종류의 테더로부터 TS-촉매 독소 유리는, 비닐 및 알릴 분자를 사용한 경우에서처럼, dUMP의 우라실 고리에 있어서 그것의 배향에 좌우되지 않는다.
본 발명의 뉴클레오티드-기제 프로드러그를 디자인하기 위해 2가지의 별개의 접근법을 취하였다. 한가지는 BVDU 모노포스페이트의 구조를 기초로 하며, dUMP의 C5에서 (폴리)비닐 치환기의 말단에 직접 부착된 이탈기/독소를 특징으로 한다. 이것은 비닐 테더 접근법이다. 다른 한가지는 TFPe-dUMP의 구조를 기초로 하며, 첫번째와 유사하지만 이탈기/독소를 분리하는 메틸렌 단위 및 불포화 단위를 가지고, 따라서 알릴 또는 프로파르길 단위를 함유한다. 이것은 알릴 테더 접근법이다.
알릴 테더 접근법의 프로파르길 버전의 활성화 메카니즘은 5-에티닐-2'-디옥시우리딘 5'-모노포스페이트(EdUMP) 및 5-(3-히드록실-1-프로피닐)-2'-디옥시우리딘 5'-모노포스페이트(HOPdUMP)와 TS의 상호작용의 전례를 가진다(Barr et al. (1981) J. Med. Chem. 24:1385-1388 및 Barr et al. (1983) 위와 동일). EdUMP는 TS(Ki=0.1μM )의 효능 있는 억제제이며, 활성 부위에서 알렌-기제 종을 형성하기 쉽다. HOPdUM P(Ki=3.0μM)은 보기 드문 억제 키네틱을 나타내며, 이것은 활성 부위에서 쿠물렌-기제 종의 형성에 기인할 수 있다.
비닐 및 알릴테더 접근법 메커니즘 모두에 공통적인 중간체와 구조상 유사한 5-알킬변성 5,6-디히드로우라실이 최근 합성되었다(Anglada et al. (1996) J. Het-erocycl. Chem. 33:1259-1270). 이들은 고도의 친전자성을 나타냈다. 5-(에톡시메틸)우라실을 생성하기 위한, 이들의 에탄올과의 준비된 반응은 컴패턴트 TS를 촉매적으로 재생성하는 물 첨가를 전례로 한다. 훨씬 최근에, 길게 포착하기 어려운 TS에 의해 생성된 C5 메틸렌 중간체가 트랩핑 연구에 의해 증명되었다(Barrett et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:449-450).
프로파르길 테더를 사용한 ECTA 화합물의 합성
프로파르길 및 알릴 알콜-장착 2'-디옥시우리딘의 합성은 간단하다. 이들의 다수 및 가까운 유도체가 문헌에 보고되며, 일부는 TS와 관련하여 연구되고 있다. 예를 들어, 5-(3-메톡시-1-프로피닐) 및 5-(3-히드록시-1-프로피닐)을 포함하는 5-알키닐-dUMP가 TS 억제제로서 시험되었으며(Barr et al. (1981) J. Med. Chem. 24: 1385-1388), 이들 중 일부는 TS-결손 암세포의 DNA에 결합되는 것으로 나타났다 (Balzarini et al. (1985) FEBS Lett 373(1):41-4).
5-머큐리-(Ruth et al. (1978) J. Org. Chem. 43:2870-2876) 및 5-요도우리딘(Robins et al. (1981) Tetrahedron Lett 22:421-424) 모두는 팔라듐 촉매의 존재하에 알켄 및 알킨과 쉽게 축합되어 C5 테더-장착 우리딘을 제공한다. 후자의 경로가 더욱 자주 사용된다(Robins et al. (1982) Can. J. Chem. 60:554-557; Asakura (1988) Tetrahedron Lett. 29:2855-2858; 및 Asakura (1990) J. Org. Chem. 55:4928-4933). 보호된 5-요도2'-디옥시우리딘과 t-부틸디메틸실릴 프로파르길 에테르(Graham et al. (1998) J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1:1131-1138 및 De Clercq et al. (1983) J. Med. Chem. 26:661-666), 메틸 프로파르길 에테르 (Tolstikov et al. (1997) Nucleosides Nucleotides 16:215-225), 및 심지어 프로파르길 알콜 자체(Chaudhuri et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:10434-10442 및Goodwin et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34:5549-5552)의 고수율 축합이 달성되었다. 또한, 후자의 반응에 의해 도입된 3-히드록시-1-프로피닐 치환기는, BVDU의 합성에 사용된 동일한 Heck 반응으로부터 생기는 메타크릴레이트기의 DIBAL-H 환원 (Cho et al. (1994) Tetrahedron Lett. 25:1149-1152)에 의해 접근될 수 있다. 이들 팔라듐-촉매 반응은 만능이라서 5-요오도-2'-디옥시우리딘에 오래 공들여 작용기화된 프로파르길-기제 테더를 축합시키는데 사용될 수 있다(Livak et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:4831-4837 및 Hobbs (1989) J. Org. Chem. 54:3420-3422). (Z)-알릴-기제 테더는 Undiar 촉매에 우선하여 프로파르길 전구물질의 부분 수소화에 의해 생성되며(Robins (1983) J. Org. Chem 5(11):3546-3548 및 Barr (1983) J. Biol. Chem. 258(22):13627-13631 및 Biochem. 22:1696-1703), (E)-알릴-기제 테더는 (E)-트리부틸스탄닐화 에틸렌의 Heck 커플링에 의해 가장 잘 제조된다(Crisp (1989) Synth. Commun. 19:2117-2123).
문헌의 과정에 따라 면밀히, t-부틸디메틸실릴 프로파르길 에테르-장착 3', 5'-디-O-보호 2'-디옥시우리딘(Graham et al. (1998) 위와 동일; De Clercq et al. (1983) J. Med. Chem. 26:661-666)을 제조하고, 상응하는 (Z)-알릴 에테르로 전환된 그것의 일부(Barr et al. (1983) 위와 동일)를 환원시킨다. TBDMS 기의 TBAF-매개 제거가 제자리 작용기화될 수 있는 산소음이온을 생성하기 때문에, 이들 TBDMS-보호 프로파르길- 및 (Z)-알릴-테더 뉴클레오시드는 어떤 독성포르-장착 표적에 대한 편리한 전구물질로서 사용할 수 있을 것이다. (E)-알릴 알콜-장착 뉴클레오시드에 대해서, 공지의 O-테트라히드로피라닐 에테르 유도체가 문헌상의 (E)-트리부틸스탄닐화 에틸렌의 Heck 커플링(Crisp (1989) 위와 동일)에 의해 제조된다.
문헌상의 2 단계 프로토콜(Phelps et al. (1980) J. Med. Chem. 23:1229-1232; 및 Hsiao and Bardos (1981) J. Med. Chem. 24:887-889)을 사용하여, 5'-모노뉴클레오티드 버전에 대한 TS 프로세싱이 각각 세포증식억제 약물 TEPA 또는 ThioTEPA(Dirven et al. (1995) Cancer Res. 55:1701-1706)의 활성 대사물질을 방출하도록, 프로파르길 및 (E) 및 (Z)-알릴 알콜을 그것들의 상응하는 비스-아지리디닐 포스포르아미데이트 또는 티오포스포르아미데이트로 전환시킨다.
비스-아지리딘-1-일-포스핀산 3-[2-디옥시우리딘-5-일]-프로프-2-인일 에스테르(TEPA)를 합성했고,1H NMR로 분석하여 다음의 결과를 얻었다:1H NMR((CD3)2S O)은 노이즈로 인해 분석하기 어려웠다. 현저한 특징: δ 8.28(d, 1, H6), 6.10(위-t, 1, H1'), 5.26(m, D20로 교환, 1,3'-OH), 5.13(m, D20로 교환, 1,5'-OH), 4.81(q 또는 dd, 2, 프로파르길-CH2), 4.24(m, 1, H3'), 3.57(m, 2, 5'-CH2), 2.15-2.0(m, 8, 아지리딘-CH2).
비스-아지리딘-1-일-포스피노티오산 3-[2-디옥시우리딘-5-일]-프로프-2-인일 에스테르(ThioTEPA)를 또한 합성했고,1H NMR로 분석하여 다음의 결과를 얻었다:1H NMR((CD3)2SO)은 노이즈로 인해 분석하기 어려웠다. 현저한 특징: δ 8.29(d, 1, H6), 6.10(위-t, 1, H1'), 5.22(m, D20로 교환, 1,3'-OH), 5.10(m, D20로 교환, 1,5'-OH), 4.88(q 또는 dd, 2, 프로파르길-CH2), 4.31(m, 1, H3'), 3.52 (m, 2, 5'-CH2), 2.15-2.0(m, 8, 아지리딘-CH2).
푸라노-피리미디논의 합성
푸라노-피리미디논의 합성을 C5 프로파르길 알콜-장착 2'-디옥시우리딘의 합성으로 시작했다. 다음에, 푸라노-피리미디논 화합물을 상술된 O-테트라히드로피라닐 에테르 유도체로부터 형성한다. 프로파르길 결합의 제 2 탄소와 피리미딘 고리의 C4 위치에 부착된 산소의 반응에 의해 합성을 진행하여, 반응 혼합물로부터 쉽게 분리될 수 있는 형광 푸라노-피리미디논을 얻었다. 그러한 화합물은 특이적전자 콘딧, 스페이서 및 독성 이탈기의 다양한 조합을 통한 ECTA 화합물의 합성에 대한 추가적인 근거를 제공한다.
푸로[2,3-d]피리미디논 뉴클레오시드를 이들 형광성 화합물의 형성을 촉진하는 것으로 공지된 조건(Barr et al. (1983) 위와 동일) 하에서, 2',3'-디-O-p-톨루오일 또는 2',3'-디-O-아세틸-5-요도-2'-디옥시우리딘과 1-(테트라히드로피라닐옥시)-2-프로핀을 축합하여 제조했다(Jones and Mann (1953) J. Am. Chem. Soc. 75: 4048-4052). 탄수화물 보호기의 염기-촉매 제거로 6-(테드라히드로피란-2-일옥시메틸)-치환 이중고리 뉴클레오시드를 얻었고, 이것을 표준 산성 THP기 가수분해 (CH2C12중의 TFA)하거나, 또는 BvdU-PA 및 5FUdR-PA를 제조하는데 사용된 동일한 과정에 의해 위치선택적으로 5'-포스포르아미데이트화했다.
3-(2-디옥시-β-D-리보푸라노실)-6-(테트라히드로피란-2-일옥시메틸)푸로[2,3- d ]피리미딘-2(3H)-온. 1H NMR((CD3)2SO) δ 8.80(s, 1, H4), 6.74(s, 1, H5), 6.16(위-t, 1, H1'), 5.27(d, D2O로 교환, 1,3'-OH), 5.12(t, D2O로 교환, 1, 5'-OH), 4.72(m, 1, THP-H2), 4.56(q, 2, CH2OTHP), 3.92(m, 1, H4'), 3.64(m, 2,5'-CH2), 2.40(m, 1, H2'a), 2.03(m, 1, H2'b), 1.68 및 1.50(m, 8, THP). 비스-TMS 유도체에 대한 저분해능 질량 스펙트럼(DCI-NH3),m/z323(B+TMS+H+), 511(MH+), 583(M+TMS+).
3-(2-디옥시-β-D-리보푸라노실)-6-(히드록시메틸)푸로[2,3- d ]피리미딘-2(3H)-온. 1H NMR((CD3)2SO) δ 12.0(bs, 1, OH), 8.24(s, 1, H4), 6.53(s, 1, H5), 5.51(위-t, 1, H1'), 4.42(m, 2, CH2OH). 저분해능 질량 스펙트럼(DCI-NH3), m/z 167(B+2H+), 184(B+NH4+).
1-[6-(테트라히드로피란-2-일옥시메틸)푸로[2,3-d]피리미딘-2(3H)-온-3-일]-2-디옥시-β-D-리보푸라노스-5-일 페닐 메톡시-L-알라닌일포스포르아미데이트.1H NMR((CD3)2SO)는 부분입체이성질체의 존재로 인해 분석하기 어려웠다. 현저한 특징: δ 8.62 및 8.59(각각 s, 각각 1, H4), 7.4-7.1(m, 5, PhO), 6.61 및 6.60(각각 s, 각각 1, H5), 6.25(m, 1, H1'), 4.56(q, 2, 프로파르길-CH2), 3.56 및 3.54(각각 s, 각각 3, C02Me), 2.0(m, 1, H2'b), 1.22(m, 3, 알라닌일-α-Me). 저분해능 질량 스펙트럼(DCI-NH3), m/z 167(B+2H+), 184(B+H++NH4+-THP).
1-[6-(히드록시메틸)푸로[2,3- d ]피리미딘-2(3H)-온-3-일]-2-디옥시-β-D-리보푸라노스-5-일 페닐 메톡시-L-알라닌일포스포르아미데이트. 1H NMR(CDCl3)은 부분입체이성질체의 존재로 인해 분석하기 어려웠다. 현저한 특징: δ 8.5(s, 1, H4), 7.4 7.1(m, 5, PhO), 6.36 및 6.30(각각 s, 각각 1, H5), 6.23(m, 1, H1'), 3.67 및 3.65(각각 s, 각각 3, CO2Me), 2.69(m, 1, H2'a), 2.10 (m, 1, H2'b), 1.35(m, 3, 알라닌일-α-Me). 저분해능 질량 스펙트럼(DCI-NH3),m/z525(MH+), 595(MNH4+).
5-(3-히드록시-1-프로피닐)-2'-디옥시우리딘의 4-니트로페닐 에테르 유도체를 하기에 나타낸 바와 같이 표준 에테르 합성에 따라 제조했다.
5-[3-(4-니트로페녹시)-1-프로피닐]-2'-디옥시우리딘.40mL의 무수 THF 중의 미리 건조된 5-(3-히드록시-1-프로피닐)-2'-디옥시우리딘("Nucleic Acid Compo-unds. 39. Efficient Conversion of 5-Iodo to 5-Alkynyl and Derived 5-Substituted Uracil Bases and Nucleosides" Robins and Barr, (1983) 위와 동일)(565mg, 2mmol) 용액을 아르곤하에서 4-니트로페닐(696mg, 5mmol), 트리페닐포스핀(787mg, 3mmol), 및 디이소프로필 아조디카르복실레이트(590L, 3mmol)로 처리하고, 반응 혼합물을 용액이 투명해질 때까지 60℃에서 가열한 후, 1시간 더 가열한다. 혼합물을 23℃로 냉각한 후 Si02위에서 증발시키고 용리액으로서 MeOH/CH2Cl2를 사용하는 크로마토그래피로정제하여 원하는 에테르 생성물 107mg(13% )을 얻었다: mp 112-118℃.1H NMR((CD2)2SO) δ 11.65(s, D20로 교환, 1, NH), 8.29 (s, 1, H6), 8.24(d, J=9.3Hz, 2,m-ArH), 7.23(d, J=9.3Hz, 2,o-ArH), 6.09(위-t, 1, H1'), 5.17(s, 2, 프로파르길-CH2), 4.22(m, 1, H3'), 3.80(m, 1, H4'), 3.59(m, 2,5'-CH2), 2.13(위-t, 2,2'CH2).per-트리메틸실릴화 물질에 대한 저분해능 질량 스펙트럼(DCI-NH3),m/z547[M(TMS)2H+], 565[M(TMS)2NH4 +], 620[M(TMS)3H+].
푸라노-피리미디논을 기제로 한 TS ECTA 화합물. 상술된 TEPA 및 ThioTEPA의 합성에서 설명된 바와 같이, C5 프로파르길 우리딘 화합물상의 히드록실에 독성 이탈기를 부착하는데 사용된 것과 유사한 방법을 사용하여, 독성 R4 이탈기를 푸란-2-메틸 알콜에 부착할 수 있다. 당업자에게 명백한 여러가지의 다른 독성 이탈기가 고려된다. 여기에 더하여, R2전자 콘딧 성분의 길이 및 조성에 대한변형, 및 R3스페이서 요소의 조성 변형 또한 고려될 수 있다.
푸라노-피리미디논을 기제로 한 TS ECTA 화합물은 또한 다양하게 변형된 "Q" 작용기로 구성될 수 있다. 많은 5-치환 2'-디옥시우리딘은 사람 TK에 대한 기질이 아니지만, 흥미롭게도 5-(4-히드록시-l-부티닐)-2'-디옥시우리딘은 예외로 밝혀졌다(Barr et al. (1981) 위와 동일). 따라서, 일부의 독성포르 장착 뉴클레오시드가 또한 좋은 TK 기질 활성을 가질 것이라고 기대된다. 따라서, ECTA 화합물은 다른 탄수화물기에 부착된 자유 5'-히드록실, 5'-모노포스페이트, 또는 5'-포스포르아미데이트기를 가질 수 있다. 그러한 포스포르아미데이트 화합물의 합성을 위한 신규 방법은, HCl 스캐빈저의 존재하에 2-디옥시 3'-히드록시, 5'-히드록시 미보호 뉴클레오티드와 포스포클로리데이트를 반응시킴에 의해 달성된다. 바람직한 구체예에서, 포스포클로리데이트는 알라닌과 같은 아미노산으로부터 유도된 인치환기를 포함한다. 예를 들어, 포스포클로리데이트는 페닐-L-메톡시알라닌 포스포로클로리데이트일 수 있다.
C6 플루오로 우리딘 및 C4 히도존 기제 화합물. dUMP와 정상 TS 반응에서, 피리미딘 C5-C6 이중결합에 중성 티올 첨가는 발열 반응(몰당 3-9kcal; Les et al (1998) Biomolecular Structure and Dynamics 15 (4):703-715)으로서 진행한다. 활성 사람 TS 시스테인(L. casei의 시스-1998과 상동성)에 의하여, 효소와 술피드릴 결합의 형성을 용이하게 할 수 있는 6 위치의 TS 반응성 수소에 대한 다른 치환기는 불소를 포함한다. 또한, 피리미딘 고리의 다른 위치에 있는 그러한 치환기가기질과 TS 사이의 반응을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 우라실상의 4-히드라존 치환(Les et. al(1998)에 기술된 바와 같은, 위와 동일)은 TS를 갖는 티올의 형성을 용이하게 한다. 결과의 뉴클레오티드-티올(TS) 중간체가 가수분해에 의하여 피동적으로 달성될 수 있는 변경된 뉴클레오티드를 방출하는 방식으로 재배열하는 것이 중요하다.
C6 위치에서 플루오린의 도입은 이전에 보고되지 않았지만, 이것은 다수의 6-치환 우라실 및 우리딘 유사체의 합성을 설명한, Krajewskas and Shugar (1982) Biochem. Pharmacol. 31(6):1097-102의 합성 설명에 따라 합성될 수 있다.
피리미딘 염기의 C4 위치에서의 치환을 용이하게 하는 화학은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 문헌상의 설명의 예는 Wallis et al. (1999) Farmaco. 54(1-2): 83-89; Negishi et al. (1996) Nucleic Acids Symp. Ser.35(Twentythird Symposium on Nucleic Acids Chemistry) 137-138; Barbato et al. (1991) Nucleosides Nucleotides 10(4):853-66; Barbato et al. (1989) Nucleosides Nucleotides 8(4): 515-528; 및 Holy et al. (1999) J. Med. Chem. 42(12):2064-2086를 포함한다. 이들 합성 기법 또한, 예를 들어 피리미딘 고리의 C4 및 C5 위치(Pluta et al. (1999) Boll. Chim. Farm. 138(1):30-33), 또는 피리미딘 고리의 C2 및 C4 위치 (Zeid et al. (1999) Nucleosides Nucleotides 18(1):95-111)에서의 치환의 조합을가능하게 한다.
본 발명의 다른 구체예에서, ECTA 화합물은 다른 전자 콘딧, 스페이서 부분 및 독성 이탈기를 C6 플루오로-우리딘 염기 또는 C4 히드라존 변형된 피리미딘에 첨가함으로써 합성된다. 2'-디옥시우리딘 기제의 ECTA 화합물의 합성을 위한 상술된 방법은 그이러한 분자의 합성을 위해 다시 사용될 수 있다.
B. I형 및 II형 화합물의 유도체
본원에 개시된 상기 화합물의 염, 및 에테르가 또한 본 발명의 범위내이다. 발명의 프로드러그의 염은 무기 또는 유기 산 및 염기로부터 유도될 수 있다. 산의 예는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-술폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-술폰산 및 벤젠술폰산을 포함한다. 옥살산과 같은 다른 산들은 그 자체가 제약학적으로 허용되는 것은 아니지만, 본 발명의 화합물 및 그것들의 제학적으로 허용되는 산부가염을 얻는데 있어서 중간체로서 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다. 염기의 예는 알칼리금속(예를 들어, 나트륨) 수산화물, 알칼리토금속(예를 들어, 마그네슘) 수산화물, 암모니아, 및 NW4+(여기에서, W는 C1-4알킬이다)의 화합물을 포함한다.
염의 예는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 비술페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 푸마레이트, 플루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 염산염, 브롬산염, 요오드산염, 2-히드록시에탄술포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트 및 운데카노에이트를 포함한다. 염의 다른 예는 Na+, NH4 +, 및 NW4 +(여기에서, W는 C1-4알킬이다)와 같은 적합한 양이온과 화합된 본 발명의 화합물의 음이온을 포함한다.
치료적 사용을 위해, 본 발명 화합물의 염은 제약학적으로 허용될 수 있을 것이다. 그러나, 제약학적으로 허용되지 않는 산 및 염기의 염은 또한, 예를 들어 제약학적으로 허용되는 화합물의 제조 또는 정제에 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 확인된 프로드러그 또는 화합물의 에스테르는 2'-, 3'- 및/또는 5'-히드록시기의 에스테르화에 의해 얻어진 카르복실산 에스테르(즉, -O-C(=O)R)를 포함하며, 여기에서 R은 (1) 직쇄 또는 분지쇄 알킬(예를 들어, n-프로필, t-부틸, 또는 n-부틸), 알콕시알킬(예를 들어, 메톡시메틸), 아랄킬(예를 들어, 벤질), 아릴옥시알킬(예를 들어, 페녹시메틸), 아릴(예를 들어, 할로겐, C1-4알킬 또는 C1-4알콕시 또는 아미노에 의해 선택적으로 치환된 페닐); (2) 알킬술포닐 (예를 들어, 메탄술포닐) 또는 아랄킬술포닐과 같은 술포네이트 에스테르; (3) 아미노산 에스테르(예를 들어, L-발릴 또는 L-이소로이실); (4) 포스포네이트 에스테르 및 (5) 모노-, 디- 또는 트리포스페이트 에스테르로부터 선택된다. 포스페이트 에스테르는, 예를 들어 C1-20알콜 또는 그것의 반응성 유도체에 의해, 또는 2,3-디-(C6-24)아실 글리세롤에 의해 더 에스테르화 될 수 있다. 그러한 에스테르에서, 달리 명시되지 않는다면, 존재하는 어떤 알킬 작용기는 1 내지 18 탄소 원자, 특히 1 내지 6 탄소 원자, 더욱 특히 1 내지 4 탄소 원자를 함유하는 것이 유리하다. 그러한 에스테르에 존재하는 어떤 시클로알킬 작용기는 3 내지 6 탄소 원자를 함유하는 것이 유리하다. 그러한 에스테르에 존재하는 어떤 아릴 작용기는 페닐기를 포함하는 것이 유리하다. 본 발명의 릭소-푸라노실 프로드러그 유도체의 예는, 예를 들어 2'-O-아세틸-릭소-푸라노실; 3'-O-아세틸-릭소-푸라노실; 5'-O-아세틸-릭소-푸라노실; 2',3'-디-O-아세틸-릭소-푸라노실 및 2',3',5'-트리-O-아세틸-릭소-푸라노실과 같은, 화학적으로 보호된 히드록실기를 갖는 것들을 포함한다.
본 발명의 화합물의 에테르는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소부틸, 및 sec-부틸 에테르를 포함한다.
더 이상의 구체예에서, 기질은 피리미딘 또는 폴레이트와 화학적으로 관련이없어도, 합리적인 약물 디자인의 공지된 파라미터를 토대로 합성될 수 있다(Dunn et al. (1996) J. Med. Chem. 39:4825 참조).
생성물에 대한 화학적 분석은, 예를 들어 반응 생성물이 dUMP의 브로모비닐-유도체의 항-대사물질인 경우, 하기 제공된 실시예에 (Barr et al. (1983) 위와 동일)에 의해 기술된다.
C. 매치된 정상 및 종양 조직의 RT-PCR 분석
결장암 조직 및 매치된 정상 결장 조직에서 사람 티미딜레이트 신타제의 전사 레벨을 역 RT-PCR 증폭을 사용하여 정량했다. 사람 티미딜레이트 신타제 및 β-액틴의 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 다음과 같이 디자인했다: 티미딜레이트 신타제 센스 프라이머 5'-GGGCAGATCCAACACATCC-3'(Genbank 기탁번호 X02308의 티미딜레이트 신타제 cDNA 서열의 염기 208에서 226에 상응), 안티센스 프라이머 5'-GGTCAACTCCCTGTCCTGAA-3'(염기 564에서 583에 상응), β-액틴 센스 프라이머 5'-GCCAACACAGTGCTGTCTG-3'(Genbank 기탁번호 M10277의 β-액틴 유전자 서열의 염기 2643에서 2661에 상응) 및 안티센스 프라이머 5'-CTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'(염기 2937에서 2955에 상응).
사람 결장 종양 조직 및 매치된 정상 조직을 Cooperative Human Tissue Network(CHTN, Western Division, Cleveland, OH)로부터 입수했다. 총 RNA를 제조 프로토콜에 따라서, Tripure 분리 시약(Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN로부터 입수)을 사용하여 분리했다. 가능한 DNA 오염을 모니터하기 위해서, β-액틴 증폭용 프라이머를 엑손4/인트론5/엑손5 접합부에 걸쳐지도록 디자인했다.게놈 DNA 템플레이트는 313bp β-액틴 단편을 가져오고, cDNA 템플레이트는 210bp 생성물을 생성한다.
SuperScript 예비증폭 시스템(Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)을 사용하여 역전사를 수행했다. 제조 프로토콜에 따라서, 3μg의 총 RNA를 부피 20㎕의 완충액에 적용하여 역전사 반응을 행했다.
PCR 반응을 역전사 반응으로부터의 cDNA 혼합물 5㎕, 3mM MgCl2, 50mM KCl, 20mM 트리스-Cl pH 8.4, 0.2mM 각 dNTP, 0.3μM 티미딜레이트 신타제 센스 및 안티센스 프라이머, 및 Taq DNA 중합효소(Promega, Madison, WI에서 입수) 5 유니트를 함유하는 부피 96㎕에서 수행했다. 반응 혼합물을 94℃에서 3분간 인큐베이션한 후, 94℃에서 1분 인큐베이션, 58℃에서 1분 인큐베이션, 다음에 72℃에서 1분 인큐베이션의 9 사이클을 행했다. 9 사이클 후, 4㎕ 중 사람 β-액틴 프라이머를 가하여 최종 농도 0.2μM를 달성하고, 최종 반응 부피를 100㎕로 했다. PCR 반응을 총 30, 32 또는 34 사이클로 계속한 후, 72℃에서 7분 인큐베이션했다.
10㎕의 PCR 생성물을 2%의 아가로스겔 전기영동에 의해 분해하고, 이어서 SYBR Gold 핵산 겔 염료(Molecular probes, Eugene, OR에서 입수)로 염색했다. 정량 결과는 티미딜레이트 신타제 및 β-액틴의 증폭이 사이클 30과 34 사이에서 선형이라는 것을 나타냈다. 티미딜레이트 신타제에 상응하는 DNA 밴드를 정량하고 Molecular Dynamics Storm에 의해 β-액틴의 DNA 밴드에 대해 정규화했다. 정량된 발현 레벨을 TS와 β-액틴간 비율의 값으로 표현했다. 이 분석은 또한 Nagata etal. (1999) J. Hepatol-30:965-969에 기술된 바와 같이, 포유동물 세포중의 파토젠을 검출하는데 효과적이다.
D. 셀라인 및 트랜스팩션
HT1080 세포를 10% 태아소혈청으로 보충된 RPMI1640 배지중에서 성장시켰고, GFP-TS 발현 벡터로 트랜스펙션했다. 48시간 후, 트랜스펙션 세포를 트립신화하고, 750μg/ml G418을 함유하는 배양 배지에서 다시 플레이팅했다. 2주간 G418을 사용하여 선택한 후, 생존 세포를 형광 발현을 기초로 분류했다. 높은 형광 발현이 있는 1개 클론(TSH/HT1080로 명명) 및 낮은 형광 발현이 있는 1개 클론(TSL/HT1080로 명명)을 선택하고 셀라인으로 확장시켰다. pEGFP-C3으로 트랜스펙션된 안정한 HT1080 세포를 대조표준으로서 사용했다.
E. GFP-TS 발현 벡터의 구성
사람 티미딜레이트 신타제의 보존 영역(아미노산 23에서 313)을 코드화하는 cDNA 단편을 다음의 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 얻었다: 센스 프라이머 5'-CGGAAGCTTGAGCCGCGTCCGCCGCA-3' 및 안티센스 프라이머 5'-GAAGGTACCCTAAACAGCCA TTTCCA-3'. cDNA를 GFP 서열을 갖는 프레임내에서, 포유류 발현 벡터 pEGFP-C3 (Clontech Laboratories. Inc., Palo Alto, CA)의 HindIII 및 KpnI 부위로 클론했다. cDNA 삽입을 DNA 서열화에 의해 확인했다.
F. 웨스턴 블롯 분석
사람 정상 및 암세포를 10% 태아소혈청으로 보충된 RPMI1640 배지중에서 성장시켰다. 세포를 100mm 배양 접시에서 합류까지 성장시켰고, 0.5ml의 RIPA 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.5% 트리톤 X-100, 0.1% SDS, 0.5% 디옥시콜산, 나트륨염 및 프로테아제 억제제) 중에 용해했다. 단백질 농도를 BCA-200 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL에서 입수)를 사용하여 측정했다. 각 세포주/셀라인으로부터의 총 단백질 15μg을 12% SDS-PAGE에 의해 분해했다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인 위로 옮기고, 이어서 사람 티미딜레이트 신타제 단일클론 1차 항체(NeoMarkers제, Fremont, CA) 및 양 항-마우스 Ig 2차 항체(Amersham, England에서 입수)에 연결된 양고추냉이 퍼옥시다제로 면역블롯했다. ECL 플러스 키트(Amersham)를 면역반응성의 검출을 위해 사용했다. 티미딜레이트 신타제에 상응하는 밴드를 정량하고 Molecular Dynamics Storm에 의해 투불린의 밴드에 대해 정규화했다. 정량된 발현 레벨을 세포주 CCD 18co의 발현 레벨에 대한 상대값으로서 표현했다.
G. dUMP- 3 H으로부터 트리튬 유리에 의한 TS 활성 분석
세포를 24-웰 플레이트에서 30,000세포/플레이트의 밀도로 플레이팅했고, 16시간 동안 인큐베이션하여 플레이트의 플라스틱 표면에 부착시켰다.
티미딜레이트 신타제 분석 바로 전에, 배지를 RPMI+10% 투석된 태아소혈청으로 교환하였다. 0.5μCi의 5-[3H] 디옥시우리딘을 각 웰에 가하고, 플레이트를 CO2첨가 없이 37℃에서 60분간 인큐베이션했다. [3H] 유리를 실온에서 5분간 5-[3H] 디옥시우리딘을 활성탄(1xPBS 중 10%)에 흡착시킴에 의해 측정했다. 13,000RPM으로 5분간 원심분리한 후, 상청액 중의 [3H] 양을 액체 섬광 계수하여 측정했다.
H. 성장 억제 연구
지수적으로 증가하는 세포를 384-웰 평바닥 조직 배양 플레이트로 옮겼다. 모든 세포 종류를 25㎕의 완전 배지(RPMI1640+10% 태아소혈청+항생제/항진균제) 중에 웰 당 500세포 밀도로 플레이팅했다. 24시간 후(0일), 10ʼn3내지 10ʼn10M 용량 범위에 대한 실험 화합물을 함유하는 완전 배지 25㎕를 3번 가했다. 약물 노출 시간은 120시간(5일)이었고, 이후 성장 억제를 분석했다. 산화환원 지시제인 알라마르 블루 5㎕를 각 웰(10%v/v)에 가했다. 37℃에서 4시간 인큐베이션한 후, 형광을 여기 535nm 및 방출 595nm에서 모니터했다.
농도 대 상대 형광 단위(RFU)를 도시하고, s자형 곡선을 Hill 방정식을 사용하여 피팅했다. 곡선의 굴곡점으로 표시된 IC50은 성장이 50%까지 억제되는 농도이다.
성장억제/세포독성 분석을 사용하여 본 특허에 기술된 바와 같이 감염제에 의해 코드화된 효소를 활성화 함으로써 ECTA 화합물로부터 방출된 톡신의 세포독성을 측정할 수 있다. 상기한 바와 같이, 이 부류의 감염제는, Mycobacterium sp., Chlamydia sp., Rickettsia sp. And Pheumocystis sp. pathogenic Enterococcus sp., Moraxella sp., aemophilis sp., and Staphylococcus sp.를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 콜로니 형성분석은 사용하여 플레이트 또는 액상 배지에서 세포외 병원성 박테리아상의 대사된 ECTA 화합물의 세포독성을 측정할 수있다(Miller, J. H. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Hardbook for E. Coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Press (1992)).
I. NB1O11 세포독성의 토뮤덱스 억제
MCF7-TDX를 웰 당 25㎕의 완전 배지중에 500세포로 384-웰 분석 플레이트로 옮겼다. 24시간 후(0일), 1mM로부터 이중으로 연속 희석한 NB1011과 불연속적 농도(0, 1, 10, 100, 1000nM)의 토뮤덱스의 조합을 함유하는 완전 배지 25㎕를 2번 가하였다. 약물 노출 시간은 120시간(5일)이었고, 이후 성장 억제를 성장 억제 연구에 상술된 바와 같이 알라마르 블루를 사용하여 측정했다.
J. 효소제조
아미노 말단 His 태그를 첨가하기 위해서, 클론된 사람 티미딜레이트 신타제 플라스미드 pBCHTS를 NdeI nSacI 삽입 부위를 사용하여 대장균 BL21(DE3)/pET-28a (+)(Novagen)로 서브클론했다. 효소를 IPTG를 사용한 유도에 의해 대장균에서 발현했고, Ni2+His Bind 금속 킬레이션 수지(Novagen)의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제했다. Ni2+His Bind 금속 킬레이션 칼럼을 20mM 트리스 pH 7.9, 5mM 이미다졸, 0.5M NaCl로 세척하고, 티미딜레이트 신타제 활성을 20mM 트리스 pH 7.9, 60mM 이미다졸, 0.5M NaCl로 용리했다.
K. 효소 분석 및 키네틱 측정
티미딜레이트 신타제 분석을 400mM 트리스 pH 7.5, 25mM MgCl2, 1mM EDTA,25mM 메르캅토에탄올, 125M dUMP, 및 65μM N5,N10-메틸렌히드로폴레이트로 구성된 반응 부피 200㎕로 96-웰 Costar UV 투명 플레이트에서 행했다. 테트라히드로폴레이트 스톡 용액을 테트라히드로폴산(Sigma)을 0.2M 트리스 pH 7.5, 0.5M 메르캅토에탄올에 직접 용해하여 제조했고, 스톡 용액은 -80℃에 저장했다. N5,N10-메틸렌 히드로폴레이트를 3.8% 포름알데히드 12㎕를 0.65mM 테트라히드로폴레이트 용액 1ml에 첨가하고, 37℃에서 5분간 인큐베이션함에 의해 제조했다. N5,N10-메틸렌 히드로폴레이트는 얼음상에 보관했고, 제조 후 2시간내에 사용했다.
티미딜레이트 신타제에 의한 BVdUMP의 형광 생성물로의 전환을 96-웰 Dynex Microfluor Black "U" 바닥 마이크로타이터 플레이트에서 125M BVdUMP를 함유하는 200mul 티미딜레이트 신타제 반응에서, 여기 파장 340nm 및 방출 파장 595nm를 사용하여 측정했다. 형광은 Tecan Spectrafluor Plus fluorimeter를 사용하여 측정하였다.
효소 반응속도 상수(Km및 Vmax)를 상술된 효소 분석 조건을 사용하여 사람 티미딜레이트 신타제 기질 dUMP 및 BVdUMP에 대해 측정했다. 효소 반응의 초기 속도를, dUMP와의 반응에서 A340의 증가 및 BVdUMP와의 반응에서 A294의 감소를 측정함에 의해 측정했다. 효소의 촉매 효능(Kcar/Km)을 반응속도 상수 Km및 Vmax로부터 계산했다.
L. 액체 크로마토그래피/질량 분광법
세포를 실온에서 PBS로 3회 세척한 후, 5ml PBS 중에서 냉동/해동 용해했다.세포 추출물을 10K RPM으로 10분간 원심분리한 후, Sep-Pak C18에 흡착시키고 10ml PBS로 세척했다. BVdUMP를 증류수 1ml로 용리했다. 선형 구배의 0.1% 포름산-0.1% 포름산/95% 아세토니트릴을 사용하여 C18칼럼 역상 크로마토그래피로 LC/MS 샘플을 분석했다.
M. 내성의 반전
사람 유방암 MCF7 TDX 셀라인의 기원 및 특징은 이미 설명되었다(Drake et al. (1996) Biochem. Pharmcol. 51(10):1349-1355). 간단히 말해서, TCF7 유방암 세포를 2.0μM까지 단계적으로 증가하는 TDX 농도에 연속 노출함에 의해 토뮤덱스에 대한 내성에 대해 시험관내 선택했다. 내성 서브라인을 TDX 없이 모 MCF7 TDX 셀라인의 NB1011에 대한 IC50보다 약 16배 높은 농도인 50μM NB1011로 보충된 배지에 모 MCF7 TDX 셀라인의 연속 노출에 의해 NB1011에 대한 내성에 대해 선택했다. 극적인 초기의 세포 살해 효과 후, 내성 콜로니가 출현했고, 활발하게 성장하는 단일층이 형성되었다. 5-FU, TDX, 및 NB1011에 대한 TS 단백질 레벨 및 IC50을 각각 웨스턴 블롯 및 알라마르 블루 세포독성 분석에 의해, "물질 및 방법"에 설명된 바와 같은 결과의 MCF7 TDX/1011 셀라인에 대해 측정했다.
II. 실험
A. BVdUMP와 사람 티미딜레이트 신타제의 체외 반응
1. rHuTS에 의한 BVdUMP의 무세포 진행은 형광생성물을 생성한다.
L. caseiTS에 의한 BVdUMP의 무세포진행은 잠재적인 반응성인 중간체를 만드는 것으로 나타났다(Barr et al. (1983) 위와 동일). 이러한 이유로, TS에 의한 BVdUMP의 처리는 사람 TS의 비가역적인 불활성을 유도하는 것으로 생각되었다(Balzarini (1987) Mol. Pharmacol. 32 (3): 410-6). DeClercq, Balzarini 및 동료들에 의한 세포-기제의 실험 (Balzarini (1987) 위와 동일; Balzarini (1993) J. Biol. Chem. 268 (a): 6332-7; Balzarini (1995) FEBS Lett 373 (1): 41-4)은 BVDU가 일단 세포중에서 모노포스페이트로 전환(예를 들어, 포진바이러스 티미딘 키나제의 의하여)된 후, 이것이 처리중 tHuTS 효소에 결합하여 불활성화시킨다는 개념을 지지하고 있다. 그러나, 사람 TS와 BVdUMP의 실제 반응은 적절하게 특성화되지 않았었다. Santi와 동료들(Barr et al. (1983) 위와 동일)은 그들의 연구를 위하여 박테리아성 TS를 이용했고, BVdUMP + TS 반응으로부터의 생성물의 생성을 보여주려는, DeClercq와 동료들은 정제된 사람 TS가 아니라 세포 및 세포 여액을 이용하였다(Balzarini (1987) 위와 동일); Balzarini (1993) 위와 동일; Balzarini (1995) 위와 동일).
출원인은 TS에 의해 특이적으로 활성화될 수 있는 치료기질을 생성하는데 관심이 있기 때문에, BVdUMP와 정제된 재조합 사람 TS (rHuTS)의 상호작용을 다시 하였다. BVdUMP를 표준 반응혼합물중에서 rHuTS와 배양할 경우, 반응으로 형광생성물이 형성된다(도 2). 형과의 시간 의존 증가는 초기 BVdUMP 농도의 감소에 의해 달성된다. 생성된 생성물은 부분적으로 특성화되며, 엑소시클릭 피리미딘 뉴클레오티드 유도체인 것으로 간주된다(하기 참조).
이 결과는 이전의 결과가 BVdUMP와 TS 반응이 인간 TS 효소를 불활성화 해야한다는 아이디어(Balzarini et al. (1987), (1993) 위와 동일 and Balzarini et al. (1995) 위와 동일)를 뒷받침하기 때문에 놀라운 것이다. 상기 반응이 정제된 성분을 가지는 무세포 시스템에서 행해지기 때문에, 세포내 환경이 세포내에서 NB1011의 유리 뉴클레오티드 모노포스페이트로의 전환후 TS 불활성이 될 성분을 제공할 수 있을 가망성이 있다. 이 문제를 아래에서 더욱 상세하게 설명한다.
2. dUMP 및 BVdUMP와 rHuTS의 비교반응 키네틱.
세포 및 세포 여액을 사용하는L. caseiTS (Balzarini (1995) 위와 동일; Balzarini (1987) 위와 동일; and Balzarini (1993) 위와 동일)를 이용한 Barr 등이 이전에 보고한 연구는 BVdUMP와 사람 TS의 반응이 효소의 비가역적 불활성이 될 것인지의 여부가 불분명하다. 이 문제를 설명하기 위해, dUMP의 존재 또는 부재상태에서, BVdUMP와 rHuTS의 상호작용의 키네틱을 측정하였다.
경쟁적 억제는 BVdUMP가 TS 효소를 불활성화시키지 않는 반응과 가장 일치하였다. 이 상황을 더욱 명확하게 하는 것을 돕기 위해, BVdUMP와 함께 rHuTS의 연장된 인큐베이션을 행하여 키네틱이 수행되는 시간보다 긴 시간의 주기에 걸쳐 발생할 수 있는 어떠한 불활성화를 측정하였다(도 4).
이들 데이타는, 심지어 20시간의 BVdUMP와의 rHuTS의 인큐베이션 후에도, 기질로서 THF DHP dUMP의 전환속도을 측정했을 때 효소 불활성이 거의 없거나 전혀 없다는 것을 보여준다. 이 결과는, 세포내에서, 우선적으로 TS를 과발현하는 세포내에서, 그리고 최종적으로 효소를 불활성화하지 않고 BVdUMP를 세포독성 대사물질로 전환시키는 과발현된 TS의 능력에 대한 바램과 일관된다.
3. BVdUMP와 TS의 반응 특성화: 보조인자 및 억제제
가장 특성화된 TS의 반응은 dUMP의 dTMP로의 전환이다. 이 반응은 N5, N10-메틸렌 테트라히드로폴레이트(THF)로부터 dUMP의 C-5 위치까지 메틸렌기으 수송을 포함한다(Carreras CW (1995) 위와 동일). 이 반응은 보조인자(THF)에 의존하며, 효소와의 반응시에 안정한 착물의 형성 및 효소활성의 손실을 유발하는 우리딜레이트 의태, 5F-dUMP에 의해 억제된다. 두번째로 잘 특징화된 TS 활성 억제제는 토뮤덱스이며, 이것은 TS 호모다이머의 폴레이트 결합자리를 차지하며, THF의 결합을 방지하며, 세포내에서 TS활성을 차단한다(Drake et al. (1996) Biochem. Pharmacol. 51 (10): 1349-1355; Touroutoglou 및 Pazdur (1996) Clin. Cancer Res. 2 (2): 227-243). rHuTS와 BVdUMP의 반응을 특징화하려는 이전 노력의 일부로서, 5F-dUMP, 토뮤덱스 및 보조인자의 효과를 효소와 dUMP 및 BVdUMP의 반응에 대하여 비교하였다. 이들 실험(표 1)은, dUMP의 경우와 유사하게 5F-dUMP는 BVdUMP의 형광생성물로의 전환을 방지할 수 있다는 것을 보여준다. 게다가, 토뮤덱스는 또한 dUMP 및 BVdUMP 모두로부터의 생성물 형성을 방지할 수 있다. 그러나, L. casei TS (Barr et al. (1983) 위와 동일)를 사용한 이전에 보고된 결과와 일관하여, THF는 BVdUMP의 형광생성물로의 전환이 요구되지 않는다. 게다가, 표 1에 나타낸 자료는 또한 THF가 BVdUMP와 rHuTS의 반응에서 형광생성물의 생성을 자극한다는 것을 나타낸다. 이 결과는 THF가 이 반응에 효과가 없다고 보고하고 있는 이전의 자료(Barr et al. (1983) 위와 동일)로부터는 예상되지 않으며, 보조인자, 또는 류코보린과 같은 보조인자 아고니스트가 BVdUMP와 사람 TS의 반응을 조절할 잠제적으로 중요한 가능성을 나타낸다.
이 반응의 Michaelis-Menton 키네틱의 분석은 dUMP에 의한 BVdUMP의 억제가 rHuTS에 대한 기질로서 거동하는 2개 뉴클레오티드와 일관된 경쟁억제에 대한 예상된 형태에 부합한다는 것을 나타낸다.
하기 표 2에 나타낸 바와 같이,L. caseiTS에 대한 이전에 보고된 자료는 BVdUMP가 dUMP로서 385배 덜 효과적인 기질이라는 것을 나타낸다(Barr et al. (1983) 위와 동일 and Santi (1980) 위와 동일). 여기에 보고된 실험은 이 상황이 사람효소와 상당히 다르다는 것을 나타냈다. rHuTS에 대한 BVdUMP와 비교된 dUMP의 상대 촉매 효율은 60x이다. 이것은 내생기질에 비해 촉매효율의 a > 6.4 배 증가를 나타낸다.L. caseiTS에 대한 이전의 결과로 세포내에서의 효소반응의 효율은, 이것이 다량의 내생 dUMP와 경쟁해야 하기 때문에, NB1011에 대해 너무 낮아 유효한 치료기질이 되지 못할 것이라는 것을 예측할 수 있다. 여기에서 보고된 발견, 즉 사람 효소는 BVdUMP 전환의 6.4 배 개선된 효율을 가진다는 것은 NB1011을 선택성 항감염제로서 사용할 수 있는 중요한 보조인자이다. 또한L. casei효소에 비교하여 사람효소에 의한 BVdUMP 이용도의 증가된 효능은 종 특이적 기질이 가능하게 디자인될 수 있음을 성립한다. 이들 기질은 감염(바이러스성이거나 세포-매개된)치료에 적용되며, 여기에서 감염물질은 숙주에 의해 인코딩된 것과는 별개의 TS 효소를 발현한다. 이러한 방법을 사용하여 치료할 수 있는 바이러스성 감염의 예는 간염 바이러스, 포진바이러스, 또는 그들 자신의 TS 효소를 발현하는 다른 바이러스; 세균성 감염, 특히 다중 내성 포도상구균 오레우스와 같은 약물내성 박테리아, 및 다른 감염성 물질 예를 들어 Pneumocystis carnii 및 Plasmodium falciparum를 포함한다.L. casei대 사람 TS 표면상의 종특이성 영역에의 결합을 통해 이종성효소를 특이적으로 억제하는 능력은 최근 보고되었다(Stout (1999) Biochemistry 38 (5): 1607-17 및 Costi et al. (1999) J. Med. Chem. 42 (12): 2112-2124). 단백질의 가장 고도로 보존된 영역(Carreras (1995) 위와 동일)으로 구성된 TS의 활성자리와 관련된 특이성의 차이는 놀라우며 이전에 보고된 적이 없다.
rHuTS와 BVdUMP의 무세포 효소반응 생성물을 질량 분광법으로 분석하였다. 도 5에 나타낸 분자구조 I 및 II는, 정제된 rHuTS와 BVdUMP의 인큐베이션후에 TS 반응혼합물에서 검출되는 분자이온의 질량과 양립하는 질량을 가진다. 이 반응생성물에 대한 지식은 NB1011 작용에 대한 최종메커니즘을 이해하는데 사용될 수 있다. 게다가, 이 정보는 TS-BVdUMP 반응의 생성물 그 자체가 화학요법으로서 장차 사용될 수 있기 때문에, 신규한 화학요법제를 설계하는데 사용될 수 있다.
4. NB1011은 종양세포내에서 모노포스페이트로 전환된다.
NB1011은, TS에의 결합을 위한 선행요건으로서, 세포내에서 포스포르아미데이트로부터 모노포스페이트로 전환된다. NB1011 포스페이트의 미차페, 그것의 TS와의 결합 및 독성 대사물질로의 전환에 대한 제안된 경로는 도 5에 도시되어 있다.
전환에서의 이 중요한 단계가 유리하게 일어나고 있었는지의 여부를 결정하기 위해 브롬원자의 비정상적 특성을 관측하였으며, 즉 브롬원자는 자연상태에서 2개의 동일하게 풍부한 동위체 형태로 존재한다. 이 상황은 BVdUMP (411 and 413 daltons)의 예측 질량 이온에 대해 질량스펙트로스코피 분석을 함으로써 브롬함유 모노포스페이트를 검출하게 한다. H630 R10 종양세포(고수준의 TS를 발현함)를 100uM NB 1011로 인큐베이션하였다. 처리된 세포여액의 추출물을 상기 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 제조하였다. 액상크로마토그래피에 의한 초기 정제 이후 질량스펙트로스코피를 사용한 검출은 역상 크로마토크래피상의 보유시간과 동일한 BVdUMP의 보호되지 않은 뉴클레오티드 질량이온의 형성에 의존하였다.
이들 결과(도 6)는 활성방법의 제 1 단계 이후의 NB1011과 일치하였다.
B. NB1011의 세포독성 활성의 특징화.
1. 종양/정상 세포 스크린
NB10111의 생물학적 활성을 특징화하는 초기단계로서, 많은 일련의 정상 및 종양세포 종류를 NB1011 및 5-플루오로우라실 모두에 대한 감도에 대하여 알라마 블루 분석으로 시험하였다.
상기 방법에 기술된 바와 같이 분석을 수행하였다. 치료지수를 종양세포의 평균 IC50에 대한 정상세포의 평균 IC50의 비로서 계산한다. 모든 분석을 적어도 3회 수행하였다.
이들 자료는 NB1011이 TS ECTA 화합물에 대한 1차 설계 목적, 즉 종양세포 대 정상세포 종류의 증가된 효험을 충족한다는 것을 보여주고 있다. 전반적으로, NB1011은 정상세포에 대해서 보다 종양세포에 대하여 세포독성이 약 2배 이상이고,한편 5FU는 종양세포에 대해서 보다 정상세포에 대해서 3 배이상 독성이다. 따라서 NB1011의 이점은 5FU에 비해 NB1011에 대한 치료지수에 있어서 (2)x(3)=6-배의 개선이다. 긍정적인 치료지수를 가지는 화학요법제를 선택할 수 있는 중대한 방책은 정상 및 종양 세포 종류 모두에서 황성을 스크리닝하는 것이다. 이 접근법은 새로운 암약물 발견 분야에서 지속적으로 사용되고 있지 않다. 예를 들어, 새로운 후보 화합물을 정상세포 종류에 대해 스크리닝하는 것은 National Cancer Institute의 스크리닝 절차(Curt (1996) Oncologist 1 (3): II-III)의 일부는 아니다.
2. NB1011는 체내에서 TS를 불활성화 시키지 않는다.
상기 결과는 NB1011롤 부터 세포내 생성된 BVdUMP가 이것의 생성물로의 변형동안 TS를 불활성화하지 않을 것이라는 것을 나타낸다. 그러나, 무세포 시스템은 세포내 환경과는 다르다. 이 문제를 더 탐구하기 위해, TS 활성에 대한 세포-기제 분석을 수행하였다. 이들 실험에서 외성 5-(3H) 데옥시우리딘을 세포배양 배지에 가하고 3수소수의 방출을 감시한다(Carreras et al. (1995) 위와 동일, and Roberts (1966) Biochem. 5 (11) 3546-3548). 도 7은 세포 배양 배지내에서 NB1011의 존재가 [3H]2O가 5-[3H]로 부터 방출되는 속도를 감소시킨다는 것을 보여준다. 이것이 TS의 비가역적 억제 결과인지를 결정하기 위해, NB1011-처리 세포를 신선한 배양배지에서 간단히 회복시킨후, TS 활성에 대해 분석하였다. NB1011이 결여된 배양배지에서 회복시킨 세포는 처리되지 않은 세포와 동일한 TS 활성수준을가졌다. 이 결과는 NB1011이 세포내 프로세싱에 TS 효소를 비가역적으로 불활성화시키지 않는다는 제안을 뒷받침하고 있다.
NB1011이 주로 TS를 불활성화함으로써 세포성장을 방해할 것인지를 이해하기 위해 추가적인 접근법을 취하였다. 이 접근법은 TS-차단된 세포의 티미딘 구제를 근거로 하고 있다. 토뮤덱스 또는 5FdUMP(5FdUrd에 의한 처리후)에 의해 차단된 세포는 데 노보 합성에 의한 dTMP를 만들지 않는다. 이러한 이유로, 이들은 오로지 스캐빈저 메커니즘에 의해서만 생존한다. 중요한 스캐빈저 메커니즘의 하나는 세포외 티미딘의 활용이다. 표적세포에 의해 결합된 티미딘은 항상 티미딘 키나제에 의해 dTMP로 변형되어 DNA 합성을 지속시킬 수 있다. 외생 티미딘의 사용을 위한 다른 방법은, 만일 NB1011 활성에 대한 중요한 메카니즘이 외생 TS의 억제를 통한 것이라면, 세포독성은 티미딘이 세포배양 배지에 가해질 때 완화되어야 한다는 것을 기술하였다. 이 실험을 위해, 다수의 종양셀라인을 토뮤덱스 및 5FdUrd에 대한 그들의 민감도, 및 티미딘 보강을 통해 이들 제제로부터 레스큐되는 능력에 대해 스크리닝하였다. 정상클론 상피세포 CCD 18co는, NB 1011, 5FUdR 및 토뮤덱스에 대한 이들의 측정가능한 민감도 때문에 사용되었다. 실험은 lOuM의 티미딘이 있거나 없이(Patterson et al. (1998) Cancer Res. 58: 2737-2740)에 기술된 바와 같이 수행되었으며, 단 세포독성을 측정하기 위해 알라마 블루 분석(재료 및 방법 참조)를 사용하였다. 결과는 토뮤덱스로 부터의 15-배 레스큐(6.5nM 에서 95 nM까지 IC50변화), 5FudR로 부터의 590-배 이상의 큰 레스큐(0.01 μM 미만의 IC50에서5.9 μM 이상까지), 및 10μM 티미딘 존재하에서 티미딘의 223μM로의 약간의 감소를 보여주었다.
3. 종양 셀라인에 대한 TS 레벨과 NB1011-매개 세포독성 사이의 관계
TS가 NB1011-매개 세포독성에 참여한다는 확증을 몇가지의 접근법을 사용하여 성립했다; 1) NB1011의 활성을 정상 세포 대 높은 TS 발현 5FU-내성 종양 세포에 대해 시험; 2) 종양 세포 백그라운드로 TS의 트랜스펙션, 및 TS 발현 레벨에 의해 주로 차이가 있지만, 다른 점에서는 매우 유사한 클론 유도체의 생성; 및 3) 세포내 TS 활성을 감소시키기 위한 TS의 특이적 억제제인 토뮤덱스의 사용.
초기 분석에서, NB1011 및 5FUdR-매개 세포독성을 CCD18co 정상 결장 상피 세포 종류 및 H630R10, 5FU-내성 결장 종양 셀라인에 대해 비교했다(Copur S. et al. (1995) Biochem Pharm. 49(10):1419-1426). 이것은 TS를 과발현하는 약물-내성 종양 세포(H630R10)에 대한 세포독성의 측정 뿐만 아니라, 정상 세포(CCD18co)에 대한 세포독성의 측정을 허용한다. 이것은 현재의 화학요법에 있어 의미 있는 제한이 정상 조직에 대한 그것들의 독성이기 때문에 중요하다. 결과를 표 4에 나타낸다.
이 실험은 5FUdR이 5FU-내성 H630R10 종양 세포에서 보다 정상 결장 세포 (CCD18co)에서 약 18배 더 독성이라는 것을 나타낸다. 이 음의 치료 지수는 현재의 화학요법의 주요한 제한, 즉 정상 조직에 대한 그것의 독성을 특성화한다. 그러한 음의 치료 지수는 또한 독소루비신에 대해서도 보고되었다(Smith et al. (1985) J. Natl. Cancer Inst. 74(2):341-7 및 Smith et al. (1990) Cancer Res.50 (10): 2943-2948). 그러나, 5FUdR과는 반대로, NB1011은 정상 결장 상피 세포 (2500μM 이상의 IC50)에 비해서 약물-내성 H630R10 세포(IC50=216.7μM)에 대해 11배 개선된 활성을 갖는다. 이 결과는 1) NB1011의 활성은 높은 TS 발현 종양 세포에서 더욱 명백하고; 2) 5FUdR에 비해서 치료 지수에 (18)x(11)=198배의 총 개선이 TS ECTA를 사용하여 달성가능하다.
4. HT1080 종양 세포에서 TS의 과발현은 NB1011에 대한 그것들의 민감성을 증진시킨다
NB1011의 활성화는 여러 단계를 필요로 한다. 이들은 뉴클레오티드 모노포스페이트로의 세포 침투 전환, TS와 결합, 및 이어지는 독성 대사를 포함한다. 세포 침투 및 전환의 정확한 메카니즘은 완전히 정의되지 않고 있다. 세포 침입은 뉴클레오시드 수송 메카니즘에 일부 좌우될 수 있다(Cass et al. (1998) Biochem. Cell Biol. 76(5):761-70). 유사하게, 포스포르아미데이트로부터 모노포스페이트로의 진행은 불충분하게 정의된 메카니즘(Abraham et al. (1996) J. Med. Chem. 8: 39(23):4589-4575)을 사용한다.
이들 결과는 그것들이 균일한 유전적 백그라운드에서, 증가한 TS 레벨이 NB1011에 대한 증진된 민감성을 예언한다는 것을 증명하기 때문에 특히 의미 있다. 여기에 더하여, 데이터는 증가한 TS 레벨이 플루오로피리미딘에 대한 내성을 예언한다는 것을 또한 나타내며, 이는 문헌에 보고된 바와 일관된 결과이다(Copur et al. (1995) Bioche. Pharm. 49(10):1419-1426 및 Banerjee et al. (1998) CancerRes. 58:4292-4296).
5. NB1011-매개 세포독성의 억제제
토뮤덱스는 주로 TS의 억제제에 의하여 작용하는 화학요법이다. NB1011이 TS 효소에 의하여 세포독성을 발휘한다면, 토뮤덱스를 사용한 TS의 억제는 NB1011-매개 세포독성을 증가시켜야 한다. 이런 가설을 직접적으로 시험하기 위해서, 모 MCF7 셀라인과 비교하여 TS를 11배 과발현하는 토뮤덱스-내성 MCF7 세포를 증가한 농도의 TDX 존재하에 NB1011에 노출시켰다.
세포를 상기 물질 및 방법에 설명된 바와 같이, 플레이팅하고 나타낸 농도의 화합물(들)에 노출시켰다.
데이터는 특이적 억제제 토뮤덱스를 사용한 TS의 봉쇄가 약 25배까지의 NB1011-매개 세포독성의 억제를 가져온다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 NB1011의 활성이 TS에 의한 그것의 대사에 기인한다는 개념을 뒷받침한다.
NB1011의 세포내 대사를 더 이상 특성화하기 위해서, 류코보린(LV; 5-포르밀테트라히드로폴레이트)과의 조합 실험을 수행했다. 이 실험은 우리가 THF가 BVdUMP 및 rHuTS의 세포가 없는 반응에서 형광 생성물(들)의 생성을 자극한다는 것을 관찰했기 때문에 시작되었다. 형광 물질이 NB1011의 세포독성 효과에 관련된다면, 배양 배지에 LV를 제공함에 의한 THF의 증진된 세포내 레벨이 또한 NB1011-매개 세포독성 효과를 증진시킬 것이라는 가설을 세웠다. 놀랍게도, 3μM LV의 존재하에, H630R10 셀라인에 대한 NB1011 활성은, 알라마르 블루 분석법에서 측정된 바, NB1011 단독과 비교하여 90% 이상까지 감소되었다. NB1011 활성이 세포내 감소된 폴레이트 풀을 보충하는 LV에 의해 없어진다는 사실은 NB1011이 이들 풀을 감소시킴에 의해 일부 작용할 수 있다는 것을 뒷받침한다. 또는 달리, LV(또는 대사물질)는 TS와의 상호작용을 방해함에 의해 BVdUMP의 대사를 직접적으로 임팩트할 수 있다.
LV가 BVdUMP와 TS의 반응을 직접적으로 임팩트할 수 있는지의 여부를 탐구하기 위해서, 반응을 BVdUMP, 또는 THF+dUMP와 함께 +/-THF, 및 LV 또는 토뮤덱스 (TDX)와 함께 +/-메토트랙세이트(MTX)로 실시했다.
결과(표 6)는 2가지 면에서 놀랍다: 1) 형광 생성물의 증가가 THF의 존재하에 BVdUMP로부터 기록되었지만, 감소된 기질 소모(BVdUMP) 비율이 공동인자의 존재하에 발생했고, 2) 공동인자의 존재하에, 시험된 3개 화합물 모두(MTX, TDX 및 LV)가 BVdUMP + rHuTS 반응을 극적으로 억제했다. 각 경우에서, 억제는 dUMP + rHuTS 반응, 또는 THF의 부재하에 BVdUMP와의 반응에서 보여진 것 보다 더 명백했다.
LV, MTX 및 TDX에 의한 BVdUMP + TS 반응의 억제를 증명하고, 더 이상으로 이 효과가 공동인자(THF)의 존재하에 더 명백하다는 것을 증명하는 상술된 결과는 NB1011 활성이 다른 화학요법에 의해 조절될 수 있음을 시사한다. 중요하게, NB1011-처리 세포의 레스큐는 LV를 제공함에 의해 가능하며, 이는 MTX로부터의 LV 레스큐와 유사하다. MLX의 경우에, LV 레스큐는 디히드로폴레이트 환원효소 및 TS의 MTX 억제에 의하여 감소되는 세포내 폴레이트 풀의 보충에 의하여 발생한다. 환원된 폴레이트가 TS와 BVdUMP 반응 동안 세포내에서 감소된다면, 별개의 메카니즘에 의해 세포내 티미딘 또는 푸린 뉴클레오티드 풀을 감소시키는 다른 성분은NB1011과 함께 사용된 때 추가적 또는 상승적인 항-세포 효과를 제공할 수 있다. 그러한 성분(Dorr and Von Hoff (1994) 상기와 같음)의 예는 6-메르캅토푸린, 티오구아닌 및 2'-디옥시코포르마이신을 포함하며, 이것들 모두는 푸린 대사를 방해한다. 오로티딜레이트 디카르복실라제의 아자시티딘-매개 억제는 피리미딘 생합성을 차단하고, 이로써 NB1011과는 별개의 메카니즘에 의해 세포에서 세포내 티미딘 레벨을 저하시킬 수 있다.
C. TS ECTA의 약물유전학
1. TS 및 HER2의 비교
신규 치료법의 발견 및 개발을 위한 현 접근법의 중요한 양태는 치료에 대해 가장 반응할 것 같은 환자를 확인하는 능력이다(양의 약물유전 선택). 이 분야의 선구적인 약물 중 하나가 현재 HER2 프로토암유전자를 과발현하는 유방암의 치료에 사용되는 Herceptin이다. 항-HER2 항체를 사용한 초기 데이터는 무작위적으로 선택된 종양 세포 및 정상 세포에 대한 활성이 최소였음을 나타냈다. 그러나, 적어도 4배 증가된 HER2의 발현을 갖는 종양 셀라인이 선택되었다면, 정상 세포 또는 더 낮은 양의 HER2 유전자 생성물을 발현하는 종양 세포와 비교하여, 의미 있는 활성 및 항-HER2 항체가 증명될 수 없었다(Shepard et al. (1991) J. Nat. Cancer Inst. 74(2):341-347 및 Lewis (1993) Cancer Immural. Immunother. 37(4):255-63).
도 2에 나타낸 셀라인 결과는 TS와 HER2/NEU 시스템 사이의 추가적 유사성을 시사할 수 있다. 이 유사성은 각각이 TS 및 HER2/NEU 과발현 환자 모두에 대해 더공격적인 질환을 예언하는 유사한 과발현 필요조건(약 4배)을 갖는다는 것이다 (John et al. (1994) J. Clin. Oncol. 12:2640-2647).
2. NB1011은 5FU 및 토뮤덱스-내성 결장 및 유방 종양 셀라인에 대해 활성이다.
NB1011이 유망한 항암 활성을 갖기 때문에, 그것을 안전성에 관해 다른 화학요법과 비교하는 것은 중요하다. 암치료에 NB1011의 효용은 5FU처럼, 다른 악성종양 중에서, 결장 및 유방암의 치료에 주로 사용되는 화학요법인 토뮤덱스와 비교했을 때 더 강화된다.
결과는 NB1011이 정상 세포에 대해 TDX 보다 대 10배 이상 독성이 낮은 반면, MCF7-TDX 내성 종양 세포에 대해서는 TDX 보다 30배 이상 효능 있다는 것을 나타낸다. 유사한 결과가 다른 TDX-내성 종양 셀라인에 대해서 얻어졌다. 정상 세포에 대한 낮은 레벨의 독성 및 TDXR 종양 세포에 대한 높은 활성은 TS를 과발현하는 약물 내성 암에 대한 NB1011의 사용을 지원한다.
3. NB1011은 dUMP-3H로부터의 트리튬 유리에 의해 측정된 바, TS 활성 보다 TS 단백질 레벨에 더 좌우된다.
4가지 종류의 분석법이 세포 및 조직에서 TS 레벨을 특성화하기 위해 사용되었다. 가장 통상적으로 사용된 것은 항체-기체 기법(Johnston (1994) J. Clin. Oncol. 12:2640-2647; Johnston and Allegra (1995) Cancer Res. 55: 1407-1412)이지만, RT-PCR, 5FdUMP-결합 및 트리튬 유리(van Laar (1996) Clin Cancer Res 2(8):1327-33; van Triest (1999) Clin. Cancer. Res. 5(3):643-54; Jackman(1995) Ann. Oncol. 6(9):817-81; Larsson (1996) Acta. Oncol. 35(4):469-72; Lomaki (1995) Breast Cancer Res. Treat. 35(2):157-62; 및 Mulder (1994) Anticancer Res. 14(6B):2677-80)가 또한 여러 가지 연구에서 측정되었다. 셀라인의 특성화를 위하여, 본 출원인은 웨스턴 블롯팅 및 3H-dUMP로부터의 트리튬 유리에 초점을 맞췄다. 항체-검출이 임상 샘플에 대해 통상적으로 사용되고, 표지된 디옥시우리딘으로부터의 트리튬 유리가 세포에서 TS 촉매 활성의 직접 측정이기 때문에, 이들 분석법을 선택했다.
세포를 방법에 설명된 바와 같이 성장시켜서 특성화했다. TS 발현 레벨은 정상 결장 상피 셀라인인 CCD18co에 상대적이다. 트리튬 유리는 방법에 설명된 바와 같이 substracted 백그라운드이다. ND=백그라운드 이상 검출가능하지 않음.
표 7에 제시된 데이터의 분석은 TS 활성(3H-dUMP로부터 트리튬 유리)와 NB1011 민감성 사이 보다 TS 단백질 레벨과 NB1011에 대한 민감성 사이의 관계가 더 밀접함을 나타낸다. 각 세트의 매치된 모 및 약물-내성 종양 세포 종류에서, 모세포 보다 각각 더 많은 TS 단백질을 갖는 약물-내성 유도체가 또한 NB1011에 대한 증가된 민감성을 갖는다. 그러나, 동일한 비교가 TS 활성에 관해 행해졌을 때, 모 셀라인은 주로 비슷하거나, 또는 더 큰 TS 활성을 가졌고, NB1011-매개 세포독성에 대한 민감성은 더 적었다.
이들 결과는 다수의 상이한 메카니즘, 또는 메카니즘들의 조합에 의하여 발생할 수 있지만, dTMP로의 3H-dUMP의 전환(및 수반하는 트리튬 유리)은 어떤 성분, 아마 공동인자 효용성에 의해 제한될 수 있다. 그러나, BVdUMP의 전환이 공동인자에 좌우되지 않으므로, 그것의 TS와의 반응은 공동인자가 제한하고 있는 세포 환경에서 조차 계속될 수 있다. 치료법으로서 TS 기질이 가장 공격적이고 약물-내성인 종양 세포가 그것들의 선구물질 보다 낮은 TS 활성을 갖는다고 관찰된 TS 활성에 대한 전형적인 트리튬 유리 분석의 결과를 토대로 시도될 수 없기 때문에, 이런 관찰이 중요하다. 이들 결과는 항체 염색에 의해 검출된 TS 레벨에 단순히 기초하여 TS ECTA 요법을 위한 환자를 선택한다는 제안을 추가적으로 뒷받침한다.
프로드러그 전략의 비교
기법 약자 설명 주 참조문헌
대사 활성화 없음 "치사성 합성'에 의한 폴레이트 유사체의 독소로의 전환. Mead et al. (1966) supra.
항체 지정 프로드러그 요법 ADEPT 항체-효소 복합체가 종양 선택성 항원에 결합한다.프로드러그가 투여되고 이것이 항체 결합된 효소와 만날때 활성화된다. Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Res.19 (1A): 605-13
유전자 지정 프로드러그 요법 ADEPT 활성효소를 코드화하는 유전자가 큰 t세포로 형질도입된다. Connors and Knox (1995) Stem Cells 13: 501-511
효소 지정 프로드러그 요법 EDEPT 종양 부위에서만 높은 레벨로 나타나는 세포외 효소에 의해 활성화되는 프로드러그가 투여된다. Breistol et al.(1998)Eur. J. Cancer 34 (19): 1602-1606 and Bossletet al. (1998)Cancer Res.58: 1195-1201.
종양 활성화된세포독성 'TAC' 글루타티온-S-트란스페라제에 의해 활성화된 프로드러그 Morgan et al.(1998)위와 동일
효소 촉매 치료 활성화 ECTA 프로드러그가 종양 억제 유전자 상실 및 화학 요법에 의한생체내 선택의 결과로서 과발현된 효소에 의해 활성화된다. 본 원에서 개시된 바와 같음
효소 키네틱을 방법에 설명된 바와 같이 행했다.Lactobacillus casei에 대한 데이타는 Barr 등(1983, 위와 동일)으로부터 유도한다. rHuTS는 상기 물질 및방법에 기술된 바와 같이 제조했다.
토뮤덱스 및 5-FdUMP에 의한 rHuTS 반응의 억제. 효소 억제제 또는 보조인자를 함유하는 티미딜레이트 신타제 반응물을 물질 및 방법에 설명된 바와 같이 30℃에서 인큐베이션하고, 효소 반응의 초기 속도를 BVdUMP 반응에 대한 여기 340nm, 방출 595nm에서 상대 형광 단위의 증가, 또는 dUMP 반응에 대한 A340에서의 증가를 측정함에 의해 측정했다.
세포는 알라마르 블루 분석으로 NB1011 또는 5FU에 대한 반응에 대해 분석했다(방법). 모든 분석은 적어도 3회 수행했다. 표준 편차는 20% 미만이었다. 치료 지수는 IC50(모든 세포 종류의 평균) 대 IC50(모든 종양 셀라인의 평균)의 비율로서 계산했다.
CTF를 갖는 프레임내에서, rHuTS를 코드화하는 cDNA를 벡터 pEGFP-C3로 서브클로닝했다. 이 구성물을 HT1080 세포로 트랜스펙션하고 G418(750ug/ml)로 선택하여, 융합 rHuTS를 안정하게 발현하는 클론을 얻었다. 개별 세포를 방법에 설명된 바와 같이 높거나 낮은 형광 발현을 기초로 클로닝했다. * TS 레벨을 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 측정했고, 정량된 발현 레벨을 세포주 CCDl8co의 레벨에 상대적인 값으로 나타냈다.
토뮤덱스 구조 분석(알라마르 블루)을 방법에 설명된 바와 같이 TDX-내성 MCF7 유방 종양 세포를 사용하여 행했다. "폴드 보호"를 TDX가 첨가된 IC50및 TDX가 첨가되지 않은 IC50의 비로서 계산했다.
rHuTS를 사용한 무세포 분석에서, 적합한 기질 및 다른 성분을 방법에 설명된 바와 같이 조합했다. MTX(140μM), LV(140μM) 또는 TDX(5μM)를 가하여 그것들의 억제성 활성을 평가했다. 기질(BVdUMP 또는 THF)의 활용성을 반응 속도의 측정으로 사용했다. 숫자는 남아 있는 활성을 나타낸다.
* = 물질 및 방법에 설명된 알라마르 블루 분석에 의해 측정
TDX = 토뮤덱스; 1011 = NB1011
상기 논의 및 실시예들은 본 발명의 청구범위를 단지 설명히고자 한 것이다. 당업자들에게는 자명하듯이, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 실시예 및 청구범위에 대한 다양한 변경이 이루어질 수 있다.
본 발명은 감염제의 증식을 선택적으로 억제하는 방법 및 감염제로 감염된 세포를 제공한다. 본 발명의 방법으로 적당히 치료된 감염제는 프로드러그를 선택적으로 활성화하거나 독소로 전환시키는 활성제를 발현한다. 효소는 기질 프로드러그 화합물에 의해 불활성화되거나 억제되지 않는다. 본 방법은 기질 화합물의 유효량을 세포 또는 감염제와 접촉시키는 것을 요구함으로써, 감염제, 세포 또는 세포내의 감염제의 증식을 선택적으로 억제한다.
본 발명은 또한 감염제에 의해서 발현된 활성 효소에 의해서 세포내에서 독소로 선택적으로 전환된 프로드러그를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 스크린은 감염제 또는 감염제로 감염된 세포를 후보 프로드러그와 접촉시키는 단계 및 활성 효소에 의한 프로드러그의 독소제로의 활성을 분석하는 단계를 요구한다. 택일적으로, 프로드러그의 활성은 감염제 또는 감염제로 감염된 세포의 증식 또는 성장의 주목할 만한 억제로 결정된다.

Claims (20)

  1. 감염제의 증식을 선택적으로 억제하는 방법으로서, 여기에서 감염제는 기질 프로드러그 화합물에 의해 불활성화되지 않는 활성 효소를 발현하며, 방법은 감염제 또는 감염제로 감염된 세포를 활성 효소에 의해서 선택적으로 독소로 전환된 기질 화합물의 유효량과 접촉시킴으로써, 감염제의 증식을 선택적으로 억제하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 기질 프로드러그는 다음 구조
    (상기 구조식에서, R1은 활성 효소에 의한 피리미딘 고리로부터의 추출과 양립할 수 있는 분자 치수 및 친전자성을 갖는 화학적 실체인, 활성 효소에 의한 피리미딘 고리로부터의 유리시에 감염제 또는 세포의 증식을 억제할 수 있는 능력을 가지는 이탈기이거나 또는 그러한 이탈기를 함유하며; 및
    Q는 당, 탄소환식 또는 비환식 화합물, 및 그것들의 차폐된 포스페이트 또는 포스포르아미데이트 유도체로 구성되는 군으로부터 선택된 부분임)의 L 또는 D 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 화합물은 하기의 구조식을 가지며,
    상기 구조식에서, R1은 구조식
    의 부분이고(단, 구조식 I 형에서 n 은 0 일수 있다),
    R2는 불포화 히드로카르빌기;
    하나 이상의 불포화 히드로카르빌기를 포함하는 방향족 히드로카르빌기;
    및 하나 이상의 불포화 히드로카르빌기를 포함하는 헤테로방향족기로 구성된 군으로부터 선택된 2 가 전자 콘딧 부분이고,
    R3은
    로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 2가 스페이서 부분이며,
    R5동일하거나 상이하고, 독립적으로 1 내지 10 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지 알킬기, 또는 3 내지 10 탄소 원자를 갖는 시클로알킬기이거나, 또는 할로겐(F, Cl, Br, I)이고,
    n은 0 내지 10의 정수이고, m은 0 또는 1이며,
    R4는
    로 구성된 군으로부터 선택된 톡소포어 부분이고,
    R8및 R9은 저급 알킬이고 R10은 H 또는 CH3이고,
    X는 -Cl, -Br, -I, 또는 다른 강력한 이탈기이며(단, R7은 -H 인 경우, m 은 0 이며, 그 다음, R4는 할로겐이 아니거나, m 은 0 이고 n 은 0 인경우에, R4는 할로겐이 아님);
    Y는 독립적으로 -H 또는 -F이고;
    Z는 독립적으로 -O- 또는 -S-이고,
    Q는
    로 구성된 군으로부터 선택된 부분이며;
    R6은 독립적으로 -H, OH, -OC(=O)CH3,F, 또는 다른 보호된 히드록실기이고;
    R7은 수소, 포스페이트기, 포스포디에스테르기, 포스포르아미데이트기이며,
    상기 화합물은 D-형, L-형, α-아노머형, 및 β-아노머 형을 포함하는 어느 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 또는 입체이성질체 형태 일 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 감염제는 박테리아, 기생충, 바이러스, 및 효모로 구성되는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 효소는 티미딜레이트 신타제인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 효소는 티미딜레이트신타제, β-락타마제, 바이러스 프로테아제, 디히드로폴레이트 환원효소 또는 바이러스 역전사효소로 구성되는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 시험관내, 생체외 및 생체내에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 접촉은 생체내에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 감염제 또는 세포를 감염제의 증식을 억제하는 제2의 감염제의 유효량과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 감염제에 의해서 발현된 활성 효소에 의해서 선택적으로 독소로 전환된 프로드러그를 스크리닝하는 방법으로서, 후보 프로드러그를 활성 효소를 발현하는 감염제 또는 감염제로 감염된 세포와 접촉시키는 단계 및 감염제 또는 감염제로 감염된 세포의 증식 억제를 분석하는 단계를 포함하며, 프로드러그는 프로드러그에 의해서 불활성화되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 후보 프로드러그와 정상의, 비감염 세포를 접촉시키는 단계 및 후보 프로드러그에 의한 정상 세포의 성장 또는 증식의 억제를 분석하는단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 활성 효소는 감염제로 발현된 티미딜레이트 신타제인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 효소는 티미딜레이트 신타제, β-락타마제, 바이러스 프로테아제, 디히드로폴레이트 환원효소 또는 바이러스 역전사효소로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 분석법은 질량 분광계로 후보 프로드러그의 세포내 대사물질의 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 감염제는 검출가능한 감염제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 검출가능한 감염제는 형광 마커인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 또는 제 10 항에 있어서, 활성 효소는 야생형 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 또는 제 10 항에 있어서, 활성 효소는 효소의 돌연변이된 버젼인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 활성 효소는 치료법에 대하여 내성인 돌연변이된 버젼인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 활성 효소는 3'-악시도-3'-디옥시티미딘(AZT)에 내성을 나타내는 HIV-1 역전사효소의 돌연변이된 버젼인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020027000936A 1999-07-22 2000-07-21 효소 촉매 항-감염 치료제 KR20020059340A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14536499P 1999-07-22 1999-07-22
US60/145,364 1999-07-22
US15310199P 1999-09-09 1999-09-09
US60/153,101 1999-09-09
PCT/US2000/019844 WO2001007087A2 (en) 1999-07-22 2000-07-21 Enzyme catalyzed anti-infective therapeutic agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20020059340A true KR20020059340A (ko) 2002-07-12

Family

ID=26842894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020027000936A KR20020059340A (ko) 1999-07-22 2000-07-21 효소 촉매 항-감염 치료제

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1202749A2 (ko)
JP (1) JP2003527317A (ko)
KR (1) KR20020059340A (ko)
CN (1) CN1391487A (ko)
AU (1) AU6358900A (ko)
CA (1) CA2379834A1 (ko)
IL (1) IL147747A0 (ko)
MX (1) MXPA02000761A (ko)
WO (1) WO2001007087A2 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9708611D0 (en) * 1997-04-28 1997-06-18 Univ Cardiff Chemical compounds
US6703374B1 (en) 1997-10-30 2004-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleosides for imaging and treatment applications
MXPA02000762A (es) * 1999-07-22 2002-08-20 Newbiotics Inc Metodos para tratar tumores resistentes a terapia.
GB0009486D0 (en) 2000-04-17 2000-06-07 Univ Cardiff Chemical compounds
WO2002007780A2 (en) * 2000-07-20 2002-01-31 Newbiotics, Inc. Methods for identifying therapeutic targets
US6987180B2 (en) 2002-02-07 2006-01-17 President And Fellows Of Harvard College Uridine analogs and techniques for making and using
GB0609178D0 (en) 2006-05-09 2006-06-21 Univ Cardiff Novel compounds
CN104497083B (zh) * 2014-05-12 2017-07-07 河南师范大学 具有抗寄生虫活性的核苷‑苯基丙烯酮杂化体及其制备方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9323008D0 (en) * 1993-11-05 1994-01-05 Connors Thomas Improvements relating to cancer therapy
WO1999006072A1 (en) * 1997-07-30 1999-02-11 Boehringer Mannheim Corporation Cyclized prodrugs
CA2317505C (en) * 1998-01-23 2011-01-04 Newbiotics, Inc. Enzyme catalyzed therapeutic agents
JP2003518000A (ja) * 1998-12-11 2003-06-03 コールター ファーマシューティカル，インコーポレイティド プロドラッグ化合物およびその調製方法
MXPA02000762A (es) * 1999-07-22 2002-08-20 Newbiotics Inc Metodos para tratar tumores resistentes a terapia.

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003527317A (ja) 2003-09-16
WO2001007087A8 (en) 2001-07-12
IL147747A0 (en) 2002-08-14
MXPA02000761A (es) 2002-08-12
EP1202749A2 (en) 2002-05-08
CN1391487A (zh) 2003-01-15
CA2379834A1 (en) 2001-02-01
WO2001007087A2 (en) 2001-02-01
AU6358900A (en) 2001-02-13
WO2001007087A3 (en) 2002-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7601703B2 (en) Enzyme catalyzed therapeutic agents
EP1200455B1 (en) Enzyme catalyzed therapeutic activation
US7465734B2 (en) Methods and compositions for overcoming resistance to biologic and chemotherapy
US7419968B1 (en) Methods for treating therapy-resistant tumors
KR20020059340A (ko) 효소 촉매 항-감염 치료제
US6683061B1 (en) Enzyme catalyzed therapeutic activation
EP1240922B1 (en) Methods and compositions for overcoming resistance to biologic and chemotherapy
MXPA00006993A (es) Agentes terapeuticos catalizados por enzimas

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid