MXPA00006993A - Agentes terapeuticos catalizados por enzimas - Google Patents

Abstract

Esta invención proporciona un método para identificar agentes terapéuticos potenciales contactando una célula objetivo con un agente terapéutico candidato el cual es un substrato selectivo para una enzima intracelular endógena en la célula la cual se mejora en su expresión como un resultado de la selección por terapia biológica o química. Esta invención también proporciona métodos y ejemplos de moléculas para destruir selectivamente una célula patológica contactando la célula con un profármaco que es un substrato selectivo para una enzima intracelular endógena. El profármaco se convierte subsecuentemente en una toxina celular. Además se proporciona por esta invención un método para tratar una patología caracterizada por células patológicas, hiperproliferativas en un sujeto administrando al sujeto un profármaco que es un sustrato selectivo para una enzima intracelular endógena sobre expresada, y convertido por la enzima en una toxina celular en la célula hiperproliferativa.

Description

AGENTES TERAPÉUTICOS CATALIZADOS POR ENZIMAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Esta solicitud reclama la prioridad bajo la 35. U.S.C § 119 (e) para las Solicitudes Provisionales Norteamericanas Números 60/072,264; 60/076,950; y 60/108,634 presentada el 23 de enero de 1998; el 5 de marzo de 1998; y el 16 de noviembre de 1998, respectivamente. Los contenidos de estas solicitudes se incorporan por este medio para referencia dentro de la presente descripción. La presente invención se refiere al campo del descubrimiento de fármacos y específicamente, al diseño de profármacos las cuales son sustratos para una enzima intracelular critica a la resistencia para la terapéutica en células patológicas y convertidas a una toxina celular por la enzima intracelular. A través y dentro de esta descripción, se hace referencia a diversas publicaciones por el primer autor y fecha, número de patente o número de publicación. La cita bibliográfica completa para cada referencia puede encontrarse dentro de la especificación o al final de esta solicitud, precediendo inmediatamente de las reivindicaciones. Las descripciones de estas publicaciones se incorporan en la presente para referencia dentro de esta descripción para describir más completamente el estado de la técnica a la cual pertenece esta invención.

Las células cancerosas se caracterizan por el crecimiento descontrolado, desdiferenciación e inestabilidad genética. La inestabilidad se expresa a si misma como un número aberrante de cromosomas, supresión de cromosomas, transposiciones, pérdida o duplicación más allá del número diploide normal. Wilson J. D. et al. (1991). Esta inestabilidad genómica puede ser causada por diversos factores. Una de las mejor caracterizadas es la plasticidad genómica mejorada la cual se presenta con la pérdida de la función supresora de tumor del gen (por ejemplo, Almasan, A. et al. (1995)) . La plasticidad geonómica conduce en si misma a la adaptabilidad de las células del tumor a su ambiente cambiante, y puede permitir la mutación más frecuente, amplificación de genes, y la formación de elementos extracromosómicos (Smith, K. A. et al. (1995) y Wilson, J. D. et al. (1991)) . Estas características proporcionan mecanismos que resultan en una malignidad más agresiva debido a que permite que los tumores rápidamente desarrollen resistencia a los mecanismos de defensa naturales del huésped, terapias biológicas ( ilson, J. D. et al. (1991) y Shepard, H. M. et al. (1998)), asi como a la quimioterapéuticas (Almasan, A. et al. (1995) y Wilson, J. D. et al. (1991)). El cáncer es una de las enfermedades humanas fatales más comunes mundialmente. El tratamiento con fármacos anticáncer es una opción de constante y creciente importancia, especialmente para malignidades sistémicas o para cánceres etastáticos los cuales han pasado el estado de curación quirúrgica. Desafortunadamente, el subconjunto de tipos de cáncer humano que están sujetos a tratamiento curativo hoy en dia es aún bastante pequeño (Haskell, C. M. eds. (1995), p. 32). El progreso en el desarrollo de fármacos que puedan curar el cáncer humano es lento. La heterogeneidad de los tumores malignos con respecto a su genética, biología y bioquímica asi como la resistencia a la terapia primaria o inducida por tratamiento atenúa en contra del tratamiento curativo. Además, muchos fármacos anticáncer exhiben solamente un bajo grado de selectividad, que causa efectos secundarios tóxicos frecuentemente severos o que amenazan la vida, previniendo asi la aplicación de dosis suficientemente altas para destruirr todas las células cancerosas. La búsqueda de agentes anti-neoplásticos con selectividad mejorada para células malignas patológicas resistentes al tratamiento, permanece por lo tanto como una tarea central para el desarrollo de fármacos. Además, la amplia resistencia a los antibióticos se esta volviendo un tema de salud mundial importante. (Segovia, M. (1994) y Snydman, D. R. et al. (1996) ) . Las Clases de Agentes uimioterapeúticos Las principales clases de agentes incluyen agentes alquilantes, antibióticos antitumor, alcaloides de plantas, antimetabolitos, antagonistas y agonistas hormonales, y una diversidad de agentes misceláneos. Ver Haskell, C. M., ed., (1995) y Dorr, R. T. y Von Hoff, D. D., eds. (1994). Los agentes alquilantes clásicos son compuestos altamente reactivos que tienen la capacidad de sustituir grupos alquilo por los átomos de hidrogeno de ciertos compuestos orgánicos. La alquilación de ácidos nucleicos, principalmente ADN, es la acción citotóxica critica para la mayoria de estos compuestos. El daño que causan interfiere con la replicación de ADN y la transcripción de ARN. Los agentes alquilantes clásicos incluyen mecloretamina, clorambucil, melfalan, ciclofosmamida, y fosfamida, tiotepa y busulfan. Un número de agentes alquilantes no clásicos también dañan el ADN y las proteinas, pero que a través de diversos y complejos mecanismos, tales como metilación o cloroetilación difieren de los alquiladores clásicos. Los agentes alquilantes no clásicos incluyen dacarbazina, carmustina, lomustina, cisplatina, carmoplatina, procarbazina y altretamina. Muchos fármacos antitumorales útiles clínicamente son productos naturales de diversas cepas del hongo del suelo Streptomyces. Producen sus efectos tumoricidas por uno o más mecanismos. Todos los antibióticos son capaces de enlazar ADN, usualmente por intercalación, con desenrrollamiento subsecuente de la hélice. Esta distorsión deteriora la capacidad del ADN de servir como una plantilla para la sintesis de ADN, la sintesis de ARN o ambas. Estos fármacos también pueden dañar el ADN por la formación de radicales libres y la quelación de importantes iones metálicos. También pueden actuar como inhibidores de topoisomerasa II, una enzima critica en la división celular. Los fármacos de esta clase incluyen doxorubicina (Adriamycina) , daunorubicina, idarubicina, mitoxantrona, bleomicina, dactinomicina, mitomicina C, plicamicina y streptososina . Las plantas han provisto algunos de los más útiles agentes antineoplásticos. Tres grupos de agentes de esta clase son los alcaloides Vinca (vincristina y vinblastina) , las epipodofilotoxinas (etoposido y teniposido) y paclitaxel (Taxol) . Los alcaloides Vinca se unen a las proteínas microtubulares encontradas en la células que se dividen y el sistema nervioso. Este enlanzamiento altera la dinámica de la adhisión y pérdida de tubulina en los extremos de los usos mitóticos, resultando finalmente en suspensión mitótica. Proteinas similares hacen una parte importante del tejido nervioso; por lo tanto, estos agentes son neurotóxicos . Las epipodofilotoxinas inhiben la topoisomerasa II y por lo tanto tiene efectos profundos sobre la función celular. El paclitaxel tiene efectos complejos en los microtúbulos. Los antimetabolitos son análogos estructurales de metabolitos normales que se requieren para la función celular y la replicación. Típicamente trabajan interactuando con enzimas celulares. Entre los muchos antimetabolitos que se han desarrollado y probado clínicamente están el metotrexato, 5-fluoruracilo (5 FU) , floxuridina (FUDR) , citarabina, 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina, desoxicoformicina, fludarabina, 2-clorodesoxiadenosina, e hidroxiurea. La manipulación endocrina es una terapia efectiva para diversas formas de enfermedad neoplástica. Una amplia variedad de hormonas y antagonistas de hormonas se han desarrollado para su uso potencial en oncología. Ejemplos de agentes hormonales disponibles son el dietilestilbestrol, tamoxifen, acetato de megestrol, dexametasona, prednisona, aminoglutetimida, leuprolida, goserelina, flutamida, y acetato de octreótida. Desventajas de los Agentes Quimioterapéuticos Comunes Entre los problemas comúnmente asociados con el uso de agentes quimioterapéuticos para tratar cánceres están las altas dosis requeridas de agente; la toxicidad hacia las células normales, es decir falta de selectividad; inmunosupresión; segundas malignidades; y resistencia al fármaco . La mayoria de los agentes que se usan ahora en la quimioterapia de cáncer actúan por un mecanismo antiproliferativo. La toxicidad resulta debido a que muchos tipos de células normales (por ejemplo, epitelio del colon, células hematopoyéticas) tienen una elevada tasa proliferativa. Debido a la toxicidad para el huésped, el tratamiento debe discontinuarse a niveles de dosis que están bastante por debajo de la dosis que se requiere para destruir todas las células de tumor viables. Otro efecto secundario asociado con las terapias de hoy en dia es el efecto tóxico de la quimioterapéutica sobre los tejidos normales del huésped que se dividen más rápidamente, tales como la médula del hueso, mucosa del intestino y células del sistema linfoide. Los agentes también ejercen una variedad de otros efectos adversos, que incluyen neurotoxicidad; efectos negativos sobre la sexualidad y función de las gonádas; y toxicidades cardiacas, pulmonares, pancreáticas y hepáticas; reacciones de hipersensibilidad y vasculares, y reacciones dermatológicas.

De Smith et al. JNC1 74:341-347 (1985) La toxicidad hematólogica es la forma más peligrosa de toxicidad de muchos de los fármacos antineoplásticos usados en la práctica clínica. Su forma más común es la neutropenia, con un auxiliar de alto riesgo de infección, aunque la trombocitopenia y el sangrando también puede presentarse y amenazar la vida. La quimioterapia también puede inducir defectos cualitativos en la función de leucocitos polimorfonucleares y plaquetas. Los factores de crecimiento hematopoyético se han desarrollado para aplicarse a estos importantes efectos secundarios. Wilson, J. D. et al. (1991) y Dorr, R.T. y Von Hoff, D. D., eds. (1994). La mayoria de los agentes antineoplásticos usados comúnmente son capaces de suprimir la inmunidad celular y humoral. Las infecciones comunmente conducen a la muerte de pacientes con cáncer avanzado, y la inmunidad deteriorada puede contribuir a tales muertes. También puede resultar de la quimioterapia de cáncer la inmunosupresion crónica, retrasada. Las principales formas de neurotoxicidad son aracnoiditis; mielopatia o encefalomelopatia; encefalopatías crónicas y el sindrome de somnolencia; encefalopatías agudas; neuropatías periféricas; y síndromes agudos del cerebelo o ataxia. Muchos de los agentes antineoplásticos comúnmente empleado son mutagénicos asi como teratogénicos . Algunos, incluyendo la procarbazina y los agentes alquilantes, son claramente carcinogénicos . Este potencial carcinogénico se ve principalmente como leucemia aguda retrasada en pacientes tratados con agentes de alquilantes polifuncionales e inhibidores de la topoisomerasa II, tales como el etoposido y los antibióticos de la antraciclina. La quimioterapia también ha sido asociada con casos de tumores sólidos y sin linfoma de Hodgkin retrasados. La presente invención minimizará estos efectos puesto que el profármaco solamente se activará dentro de las células del tumor. La utilidad clínica de un agente quimioterapéutico puede limitarse severamente por la emergencia de células malignas resistente a ese fármaco. Un número de mecanismos celulares están probablemente involucrados en la resistencia al fármaco, por ejemplo el metabolismo alterado de los fármacos, impermeabilidad de la célula al compuesto activo o eliminación acelerada del fármaco desde la célula, especificidad alterada de una enzima inhibitoria, producción aumentada de una molécula objetivo, reparación aumentada de lesiones citotóxicas, o la derivación de una reacción inhibida por rutas bioquímicas alternativas. En algunos casos, la resistencia a cualquier fármaco puede • conferir resistencia a otros fármacos bioquímicamente distintos . Un mecanismo alternativo de resistencia a la quimioterapéutica de cáncer se presenta via la pérdida funcional de los genes supresores del tumor, especialmente p53, RB y pl6. La pérdida de función de éstos productos del gen conduce a una expresión desreprimida de enzimas comúnmente seleccionadas por fármacos anticáncer (por ejemplo, 5FU/timidilato sintasa y metotrexato/dihidrofolato reductasa). (Lee, V. et. al (1997), Exp. Cell. Res. 234:270-6; Lenz, H. J. et al. (1998), Clinical Cáncer Res 4:1227-34 (1998), Fan, J. y Bertino, J., (1987), Oncogene 14:1191-200) . La amplificación de ciertos genes esta involucrada en la resistencia a la terapia biológica y química. La amplificación del gen que codifica la dihidrofolato reductasa está relacionada a la resistencia al metotrexato, mientras que la sobreexpresión/amplificación del gen que codifica la timidilato sintasa está relacionada a la resistencia al tratamiento con 5-fluoropirimidinas . Smith (1995) . La Tabla 2 resume algunas enzimas prominentes en la resistencia a la terapia biológica y química.

Dihidrofolato reductasa Basado en Folato Banerjee, D. et al. Acta Biochem Pol 42:457, 1995 Bertino, J. R. et al. Stem Cells 14:5,1996 Tirosinquinasas Resistencia a multifármaco Hudziak, R.M. et al. PNAS TNF-alfa 85:5102, 1988 Sühlinger, M. et al. J. Steroid biochem 49:39, 1994 Proteínas asociadas-MDR Resistencia a muitifármaco Simón, S.M. y Schindler, M. (ABC P-proteínas gp) PNAS 91.-3497, 1994 Gottesman, M.M.et al. Annu Rev. Genet. 29:607,1995 CAD* PALLA* Smith, K.A. et al. Philos. Trans R. Soc. Lon. B. Biol. Sci. 347:49, 1995 Dorr, RJ. y Von Hoff, D.D., eds. "Cáncer Chemotherapy Handbook" 2nd ed. (Appleton and Lange 1994) pp. 768-773 Topoisomerasa I (Canceres Camptotecina Husain et al. Cáncer Res. de Colon y Próstata) 54:539,1994 Rebunocleotido Reductasa Hidroxiurea Wettergren Y. et al. Mol Genet. 20:267-85, 1994 Yen, Y et al. Cáncer Res. 54:3686-91, 1994 * CAD = carbanil-P sintasa, aspartato transcarbamilasa, dihidroorotasa ** PALA = N-(fosfoacetil)-L-aspartato Uso de Profármacos como una Solución para Aumentar la Selectividad de un Agente Quimioterapéutico La deficiente selectividad de los agentes anticáncer ha sido reconocida durante largo tiempo y se han hecho numerosos intentos para mejorar la selectividad y permitir la administración de dosis mayores. Una propuesta ha sido el desarrollo de profármacos. Las profármacos son compuestos que son toxicológicamente benignas pero las cuales se convierten in vivo en productos terapéuticamente activos. En algunos casos, la activación se presenta a través de la acción de una enzima no-endógena suministrada a la célula objetivo por anticuerpo ("ADEPT" o terapia profármaco de enzima dependiente de gen (Melton, R.G. y Sherwood. R.F. (1996) ) . Estas tecnologias tienen limitaciones severas con respecto a su capacidad para hacer salir la sangre y penetrar tumores. Connors, T.A. y Knox, R.J. (1995) . En consecuencia, existe una necesidad de agentes más selectivos que puedan penetrar el tumor e inhibir la proliferación y/o destruir las células cancerosas que hayan desarrollado resistencia a la terapia. La presente invención satisface esta necesidad y asi mismo proporciona ventajas relacionadas . Esta invención proporciona un método para identificar agentes terapéuticos potenciales contactando una célula de prueba u objetivo con un agente terapéutico candidato o profármaco el cual es un sustrato selectivo para una enzima objetivo en la célula. Esta nueva propuesta se llama "ECTA", para Agentes Terapéuticos Catalizado por Enzimas. En una modalidad, la enzima objetivo es una enzima intracelular endógena la cual está sobreexpresada y confiere resistencia a los agentes terapéuticos biológicos y químicos . En una modalidad separada, la actividad de la enzima ha sido en gran medida mejorada en una célula de tumor como resultado de la pérdida de la función supresora de tumor (Smith, K.A. et al. (1995) y Li, W. et al. (1995)) y/o la selección resultante de exposición previa a quimioterapia, (Melton, R.G. y Sherwood, R.F. (1996) y Lonn, U., et al. (1996)). En una modalidad separada, la enzima objetivo es una expresión producto de un agente infeccioso en la célula. Después de que la célula hace contacto in vi tro y/o in vivo con el profármaco candidato, la célula se prueba para la eficacia del agente notando si el agente causa una reducción en la proliferación celular o si el agente destruye la célula. En un aspecto de esta invención, el profármaco destruye la célula o inhibe la proliferación celular por la liberación de un subproducto tóxico desde el profármaco por la enzima objetivo. En un aspecto adicional de esta invención, una o más "enzimas objetivo" pueden usarse para activar el profármaco de manera que libere el subproducto tóxico. Otro aspecto de esta invención incluye equipos para uso en la prueba de nuevos profármacos que tienen las características descritas en la presente en contra de las enzimas prueba. Los equipos comprenden los reactivos e instrucciones necesarios para completar la prueba y analizar los resultados . Esta invención también proporciona los métodos y ejemplos de moléculas para destruir selectivamente una célula patológica haciendo contactar la célula con un profármaco que es un sustrato selectivo para una enzima objetivo, por ejemplo, una enzima intracelular endógena como se define anteriormente . El sustrato se convierte específicamente en una toxina celular por la enzima objetivo intracelular. En otro aspecto de esta invención, el producto de una reacción inicial se activa en forma completa subsecuentemente por una enzima celular -común tal como una acilasa, fosfatasa u otra enzima casera (Voet, et al. (1995)) ó constituyente celular común (por ejemplo agua) para liberar el subproducto tóxico del profármaco . Se proporciona adicionalmente por esta invención un método para tratar una patología caracterizada por células hiperproliferativas patológicas en un sujeto administrando al sujeto un profármaco que es un sustrato selectivo para una enzima objetivo, y convertido selectivamente por la enzima en una toxina celular en la célula hiperproliferativa . Los profármacos de esta invención pueden usarse solos o en combinación con otros quimioterapéuticos o terapias alternativas anti-cáncer tal como la radiación. Un aspecto adicional de esta invención es la preparación de un fármaco para uso en el tratamiento de una patología caracterizada por células hiperproliferativas patológicas en sujeto administrando al sujeto un profármaco que es un sustrato selectivo para una enzima objetivo, y convertido selectivamente por la enzima en una toxina celular en la célula hiperproliferativa . Aun un aspecto adicional de esta invención es un método para identificar la terapéutica óptima para un sujeto, aislando células que sobreexpresan una enzima intracelular endógena y hacer contactar las células con al menos uno de los profármacos de esta invención, y entonces identificar cual de el o los profármacos inhibe la proliferación o destruye las células, indentificando con eso la terapéutica óptima para el sujeto. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el desarrollo de resistencia a las modalidades de anti-cáncer en células, y las consecuencias . La Figura 2 muestra esquemáticamente las rutas de activación de los profármacos de esta invención. La Figura 3 muestra esquemáticamente la Selección de Alto Rendimiento para profármacos activados por enzimas intracelulares importantes en la resistencia al fármaco. La Figura 4 muestra esquemáticamente cómo encontrar un profármaco protagonista timidilato sintasa (TS) humano usando E . coli TS negativo como la célula objetivo. La Figura 5 muestra un ejemplo de cómo usar esta selección para optimizar simultáneamente la reactividad de la profármaco en dos enzimas objetivo. La Figura 6 muestra una modalidad de un sustrato multidividido para la generación de una profármaco activable por timidilato sintasa (TS) . El recuadro 1 representa un grupo fosfato R7 enmascarado o ausente. Cuando está enmascarado, es un fosforamidato o derivado similar que facilita la entrada a la célula y se procesan intracelularmente en un monofosfato el cual puede enlazarse a TS. Véase Fries, K.M. et al. (1995) . Cuando está ausente, R7 es un átomo de hidrógeno y el profármaco es un sustrato para tidina quinasa celular (TK) , el cual genera el requisito monofosfato in vivo . El recuadro 2 es un grupo 2 ' -desoxiribofuranosa u otro grupo azúcar, tio-azúcar, grupo carbociclico o aciclico similar el cual conecta el monofosfato al anillo de pirimidina en una forma que soporta el enlace funcional del profármaco a TS y, cuando R7 es un átomo de hidrógeno, a TK. Este grupo no necesita utilizar un átomo de oxigeno para unirse al grupo R7 del recuadro 1. Asi, los fosfonatos análogos de azúcar fosfato son aceptables. El recuadro 3 representa un grupo de atadura, en donde n es un número entero de 0 hasta 10, esto es un conducto de electrones mono o poliinsaturado que actúa para conducir los electrones lejos del anillo de pirimidina y hacia el grupo saliente R4 cuando el profármaco se hace actuar por la TS. El grupo de atadura comprende de O hasta 10 porciones no saturadas como unidades de aciclico de vinilo, etinilo, imina, o azo ó cíclicos no saturados, aromático, o heteroaromaticos que pueden mezclarse e igualarse a voluntad siempre y cuando su conectividad proporcione el requisito del conducto que conduce electrones. El recuadro 4 representa una unidad X espaciadora, en donde M es un número entero de O hasta 1, que conecta la atadura al grupo R4 saliente. Si el recuadro 3, m igual a 0, entonces el recuadro 4, m igual a l. En la forma preferida, X es una unidad de metileno (CH2) , ya sea que lleve sustituyentes o no. Adicionalmente, sin embargo, X puede ser un oxigeno, azufre, nitrógeno, u otro átomo capaz de formar al menos dos enlaces covalentes. Cuando X está ausente (Recuadro 4, m igual a 0), la salida del grupo R4 saliente durante el procesamiento del profármaco por TS deja atrás una entidad alquilante basada en pirimidin nucleotido. Véase Barr, et al. (1983). Cuando X está presente (Recuadro 4, m igual a l), la salida del grupo saliente R4 se presenta con anticipación durante el procesamiento del profármaco por TS.

El recuadro 5 representa un grupo R4 saliente que se libera por la acción de TS en el profármaco. Es en si mismo un antimetabolito tóxico o un agente alquilante o es una entidad que fácilmente produce un antimetabolito tóxico o agente alquilante in vivo . Por ejemplo, el grupo saliente R4 puede salir como un metabolito activo de los agentes anticáncer Tepa o Tiotepa, una fosforamida mostaza, N-Acetilesfingosina de N (ceramida de C2, un lipido supresor de tumor) o hidroxiurea (un inhibidor de ribonucleotido reductasa) al liberarse por TS . El grupo saliente Ri también puede ser un éter a,a-dihalogenado, en cuyo caso proporciona un grupo ácido carboxilico cuando el alcohol a, -dialogenado liberado por TS sufre hidrólisis. Asi, el grupo R4 saliente puede salir como un progenitor para fluoroacetato, fluorocitrato, ácido malónico, ácido metilmalónico, o ácido 3-nitropropiónico, todos potentes inhibidores de la fosforilación oxidativa. La Figura 7 muestra la tinción Western TS de lineas de células transfectadas por plásmido que codifica resistencia a la neomicina, con o sin el protooncógeno HER-2. Banda (1) MCF7/HER2; (2) MCF7/neo; (3) MDA-MB-435/HER2; (4) MDA-NM-435/neo; (5) BT-20/HER2; (6) BT-20/neo. La Figura 8 muestra los productos de reacción de los compuestos profármaco con la enzima timidilato sintasa. La invención se logra sacando provecho de algunos de los cambios genómico y fenotipico claves intimamente ligados a la resistencia a la terapia biológica y química de células cancerosas. La invención proporciona un medio para inhibir selectivamente in vivo el crecimiento y/o destrucción de las células que han sufrido selección por exposición a terapia de cáncer (incluyendo terapia biológica tal como factor de necrosis del tumor (TNF) o quimioterapia) . (Referirse a la Tabla 2) . Como resultado, ciertas enzimas que han sido activadas por mutación o amplificación "del gen son resistentes a terapia inicial o adicional por el agente. A diferencia de las terapias de la técnica anterior dirigidas a la creación de inhibidores más potentes de enzimas intracelulares endógenas, esta invención saca provecho de la alta actividad enzimática asociada con tejidos y células enfermas resistentes a la terapia versus células y tejidos normales y no cuenta con la inhibición la enzima. En uno aspecto, las células del tumor exitosamente tratadas con los profármacos de esta invención se caracterizan por el aumento de la actividad de enzima objetivo y por lo tanto tiene un potencial mucho más alto para convertir el profármaco a su forma tóxica que el de las células normales que no sobreexpresan la enzima objetivo. El término "enzima objetivo" se usa en la presente para definir enzimas que tienen una o más de las características señaladas anteriormente . La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, biología celular y ADN recombinante, las cuales están dentro de la experiencia de la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd edición (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds., (1987)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.) : PCR 2:A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)) y ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)). Como se usa en la especificación y reivindicaciones, la forma singular "un", "una" y "el/la" incluye referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, que incluyen mezclas de las mismas . Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para efectuar resultados beneficios o deseados. Una cantidad efectiva puede administrarse en una o más administraciones, aplicaciones o dosis.

Como se usa en la presente, los términos "las células huésped", "células objetivo" y "células hiperproliferativas" abarcan células caracterizadas por la activación de mutación genética o la sobreexpresión endógena de una enzima intracelular. En algunas modalidades, la sobreexpresión de la enzima se relaciona a la pérdida de resistencia al fármaco producto de la función del gen supresor del tumor o a la inestabilidad genética asociada con un fenotipo patológico. Un número de mecanismos celulares están involucrados en la resistencia al fármaco, por ejemplo, metabolismo alterado del fármaco, impermeabilidad de la célula en relación al compuesto activo o eliminación acelerada del fármaco desde la célula, especificidad alterada de una enzima inhibida, producción aumentada de una molécula objetivo, reparación aumentada de lesiones citotóxicas, o la derivación de una reacción inhibida por rutas bioquímicas alternativas. Las enzimas activadas ó sobreexpresadas y relacionadas a resistencia al fármaco incluye, pero no se limitadan a la timidilato sintasa (TS) (Lónn, U. et al. (1996); Kobayashi, H., et al. (1995); Jackman, A. L. et al. (1995)), dihidrofolato reductasa (Banerjee, D., et al. (1995) y Bertino, J. R. et al. (1996)), tirosina kinasas (TNF a, Hudziak, R. M. et al. (1988)) y resistencia a multifármacos (Stühlinger, M., et al. (1994)); Akdas, A. et al. (1996); y (Tannock, I. F. (1996)); y proteinas asociadas a la resistencia a multifármacos dependiente de ATP (Simón, S. M. y Schindler, M. (1994)) y en algunas enfermedades que incluye el cáncer del colón y próstata, topoisomerasa I (Husain et al. (1994)). Alternativamente, la resistencia a un fármaco puede conferir resistencia a otros fármacos bioquímicamente distintos. Mientras que esta solicitud está dirigida específicamente a cáncer, puede aplicarse una propuesta similar a enzimas codificadas por patógenos humanos y animales, y en los cuales los inhibidores han fallado debido al desarrollo de resistencia. La amplificación de ciertos genes está involucrada en la resistencia a la quimioterapia. La amplificación de la dihidrofolato reductasa (DHFR) está relacionada a la resistencia al metotrexato ya que la amplificación del gene codifica timidilato sintasa que está relacionada a la resistencia al tratamiento del tumor con 5-fluoropirimidinas . La amplificación de los genes asociados con la resistencia a los fármacos puede detectarse y monitorearse por una reacción en cadena de polimerasa modificada (PCR) como se describe en Kashini-Sabet, et al. (1988), Patente Norteamericana No. 5,085,983, ó el método descrito en la presente. La resistencia al fármaco adquirida puede monitorearse por la detección de anormalidades citogenéticas, tales como regiones homogéneas de manchado de cromosoma y cromosomas dobles diminutas ambas de las cuales están asociadas con la amplificación del gen. Las pruebas alternativas incluyen ensayos y actividad enzimática directa o indirecta ambos de los cuales están asociados con la amplificación del gen (por ejemplo, Carreras & Santi (1995)); otras metodologías (por ejemplo reacción en cadena de polimerasa, Houze, T. A. et al. (1997) o inmunohistoquimica Johnson, P.G. et al. (1997)). Alternativamente, la célula objetivo se caracteriza por tener la función supresora del tumor inactivada, por ejemplo, pérdida de la inactivación de retinoblastoma (RB) o p53, conocido por mejorar la expresión de TS (Li, W., et al. (1995)) o DHFR (Bertino, et al. (1996) y Li, W., et al (1995) ) . Los profármacos de esta invención son útiles para tratar o mejorar cualquier enfermedad en donde la enzima asociada a la enfermedad está asociada con resistencia al fármaco a un quimioterapéutico ya sea debido a la pérdida de la funcionalidad supresora del tumor, selección in vivo por quimioterapia o una combinación. Esto incluye modalidades, en donde la enzima esta sobreexpresada, sobreacumulada o activada en células patológicas versus células normales, por ejemplo, la enzima TS . Se excluye particularmente la enzima glutation-S-transferasa la cual se ha mostrado que ocasionalmente está elevada en algunos tumores humanos.

Morgan, A. S. et al. (1998) . Los profármacos de la invención objeto se pueden distingir sobre la base de que las enzimas objetivo de esta invención se sobreexpresan comúnmente, sobreacumulan o activan en células patológicas versus células normales. Los principios más importante los cuales distinguen la presente invención de otras propuestas son: (1) Esta invención describe la sintesis de sustratos para enzimas como timidilato sintasas. La enzima sobreexpresada generará toxina, de preferencia en células enfermas . Las propuestas previas han confiado en un inhibidor. Los inhibidores conduce a la expresión amplificada de la enzima, y a la subsecuente resistencia al tratamiento (Véase. Por ejemplo, Lónn, U., et al. (1996) . (2) El enfoque actual se distingue también de otros enfoques "profármaco-sustrato", por ejemplo, las enzimas glutatión-S-transferasa (Ver, por ejemplo., Morgan, A. S. et al. (1998) . Las enzimas de la familia GST se expresan en niveles aumentados en respuesta al agravio tóxico de la célula. La familia de enzimas GST tienen especificidades de sustrato que se traslapan, lo cual dificulta diseñar un sustrato reactivo con sólo una sola especie sencilla de enzima con expresión elevada en una célula cancerosa (Morgan, A. S. et al. (1998)) . Debido a que cada una de las enzimas de la presente invención (por ejemplo, timidilato sintasa, dihidrofolato reductasa y timidin quinasa) es única con respecto a su estructura y especificidad del sustrato, es fácil diseñar sustratos únicos. Se proporcionan diversos ejemplos de sustratos para la timidilato sintasa en las especificaciones de esta solicitud. (3) En algunos casos el gen que codifica la enzima objetivo (por ejemplo, timidilato sintasa) puede haber sufrido mutación para dar resistencia a los inhibidores, (Barbour, K. W. et al. (1992) y Dicken, A. P .- et al. (1993)) pero será aún capaz de llevar a cabo la reacción con profármacos de sustrato no inhibidores. (4) Una ventaja adicional de esta propuesta es que la pérdida de función supresora del tumor es critica al desarrollo de malignidad. La mayoria de las células de tumor han perdido una de los funciones supresoras de tumor p53, RB o pld. Tal pérdida resulta en una expresión aumentada de enzimas resistentes (por ejemplo, Timidilato sintasa) , independiente de la exposición previa a la quimioterapia. Los profármacos descritos en la presente serán útiles para tratar las etapas tempranas de la malignidad, asi como la enfermedad previamente tratada con quimioterapia. Los sustratos para las enzimas como GST requieren de la exposición previa del tumor a la quimioterapia para lograr suficiente sobreexpresión para ofrecer aún la posibilidad de un Índice terapéutico modesto. Prueba de Fármaco Esta invención proporciona un método para identificar agentes que tienen potencial terapéutico para el tratamiento de desódenes hiperproliferativos o neoplásticos, por ejemplo cáncer. El método también identifica agentes que inhiben el crecimiento de células o el ciclo de las células hiperproliferativas, tales como células cancerosas. Otras células que están incluidas son las células bacterianas, levaduras y parasíticas las cuales causan enfermedad como un resultado de la proliferación inapropiada en el paciente. El agente se considera un agente terapéutico potencial sin la proliferación celular, replicación o ciclo celular se reduce en relación a las células en una muestra control. De mayor preferencia, las células son destruidas por el agente. Las células pueden ser procarióticas (bacterias tales como E. coli) o eucarióticas. Las célula pueden ser células de mamífero o de no mamífero, por ejemplo células de ratón r células de rata, células humanas, hongos (por ejemplo levadura) o parásitos (por ejemplo Pneumocystis o Leishmania ) que causan enfermedad. Como se usa en la presente, "una célula hiperproliferativa" intenta incluir células que son desdiferenciadas inmortalizadas, neoplásticas, malignas, metastáticas o transformadas. Los ejemplos de tales células incluyen, pero no se limitan a una célula de sarcoma, una célula de leucemia, una célula de carcinoma, o una célula de adenocarcinoma. Más específicamente, la célula puede ser una célula de cáncer de mama, una célula de epatoma, una célula de cáncer detectable, célula de carcinoma pancreático, una célula de carcinoma esofágico, una célula de cáncer de vejiga, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer de piel, una célula de carcinoma de higado, o una célula de cáncer gástrico. En una modalidad alternativa, la célula objetivo puede ser resistente a un fármaco o compuesto usando para prevenir o destruir una célula infectada con un agente infeccioso el cual es resistente a los antibióticos convencionales. Los agentes infecciosos incluyen bacterias, levaduras y parásitos tales como tripanosomas . Ejemplos específicos de enzimas objetivo que son la materia objeto de esta invención se enlistan en la Tabla 2 (anterior) o la Tabla 3 (posterior) . Estas enzimas están involucradas en la resistencia a la quimioterapia, y son endógenamente activadas, sobre-expresadas o sobre-acumuladas en un célula caracterizada por la resistencia a la terapia de cáncer y asociadas con un patológico o enfermedad incluyen, pero no se limitan a las enzimas tales como un miembro de la superfamilia tirosinquinasa o una proteina asociada a MDR dependiente de ATP, CAD, timidilato sintasa, dihidrofolato reductasa, y ribonucleótido reductasa. La Tabla 3 proporciona una lista de enzimas que pueden señalarse por este enfoque en enfermedades infecciosas .

El agente terapéutico potencial identificado por el método de esta invención es un profármaco que es un sustrato para la enzima y es convertido intracelularmente en una toxina intracelular. Como se usa en la presente, un "profármaco" es un precursor o forma derivada de un agente o sustancia farmacéuticamente activo que es menos citotóxico para células hiperproliferativas u objetivo comparado con el metabolito del fármaco y es capaz de ser activado o convertido enzimáticamente en la forma más activa (véase Connors, T. A. (1986) y Connors, T. A. (1996)). La toxicidad del agente se dirige a las células que producen la enzima convertidora en una cantidad efectiva para producir una concentración terapéutica de la toxina celular en la célula enferma . Esta invención tambié proporciona una prueba de selección rápida y simple que permitirá la identificación inicial de los compuestos con al menos algunas de las características deseadas. Para los propósitos de esta invención actual, el esquema general de una modalidad se muestra en la Figura 3. Este dibujo describe cómo se arregla la prueba y los materiales necesarios para su proceso. Como se muestra en la Figura 3, la prueba requiere dos tipos de célula, el primero es una célula control en la cual la enzima objetivo no está expresada, o está expresada en un bajo nivel. El segundo tipo de célula es la célula prueba, en la cual la enzima objetivo está expresada a un nivel detectable, por ejemplo, un alto nivel. Por ejemplo, un procariótico E. coli el cual no expresa endógenamente la enzima objetivo TS es una célula huésped adecuada o célula objetivo. La célula puede tener una contraparte control (que le falta a la enzima objetivo), o en una modalidad separada, una contraparte genéticamente modificada para expresar diferencialmente la enzima objetivo, o enzimas (que contienen las especies apropiadas de enzima objetivo) . Puede usarse más de una especie de enzima para translucir separadamente las células huésped separadas, de manera que el efecto del fármaco candidato sobre una enzima objetivo puede compararse simultáneamente a su efecto sobre otra enzima o una enzima correspondiente de otra especie. En otra modalidad, una tercera célula objetivo se usa como control debido a que recibe una cantidad efectiva de un compuesto, tal como, por ejemplo, los compuestos mostrados posteriormente, los cuales han demostrado ser potentes profármacos. Esta modalidad es particularmente útil para seleccionar nuevos agentes que son activados por timidilato sintasa . En otra modalidad, las lineas de células transformadas, tales como las células ras-transformadas NIH 3T3 (ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 U.S.A.) se diseñan para expresar cantidades variables y aumentadas de la enzima objetivo de interés del ANDc codificado para la enzima. La transfección es transiente o permanente usando los procedimientos bien conocidos en la técnica y descritos en Chen, L. et al. (1996), Hudziak, R. M. et al. (1988), o Cárter. P. et al. (1992), y en la sección experimental posterior. Los vectores adecuados para la inserción del ADNc se obtienen comercialmente de Stratagene, La Jolla, CA y otros vendedores. El nivel de expresión de la enzima en cada línea de células transfectadas puede monitorearse por prueba de inmunotinción y enzima en lisatos de célula usando anticuerpos monoclonales o policlonales previamente cultivados en contra de la enzima para la inmunodetección. Ver, por ejemplo, como se describe por Chen, L. et al., (1996) . La cantidad de expresión puede regularse por el número de copias del cásete de expresión introducido dentro de las célula o variando el uso del cebador. Las pruebas enzimáticas para detectar la cantidad de enzima expresada también puede realizarse como se revisó por Carreras, C. W. y Santi, D. V. (1995), o el método descrito en la sección experimental posterior. Las lineas de células de tumor pueden seleccionarse para expresar los niveles mejorados de timidilato sintasa (por ejemplo células de tumor de colón, como se describe por Copur et al. (1995) . Como se observó anteriormente, las células que contienen las deficiencias genéticas deseadas pueden obtenerse de Cold Spring Harbor, The Agricultural Research Service Culture Collection, o la American Type Culture Collection. Las cepas apropiadas también pueden prepararse insertando dentro de la célula un gen que codifica para la enzima objetivo usando técnicas estándar como se describe en Miller (1992), Sambrook, et al. (1989) y Spector et al. (1998). Los ensayos de crecimiento pueden realizarse por métodos estándar como se describe por Miller (1992), Sugarman et al. (1985) y Spector et al. (1998) . Debe entenderse por aquellos expertos en la técnica que la selección mostrada en la Figura 3 puede aplicarse ampliamente para el descubrimiento de antibióticos. Por ejemplo, la timidilato sintasa de levadura puede sustituirse por aquella de E. coli en la Figura 4. Esto permitirla el descubrimiento de antibióticos antifúngicos específicos que señalan levaduras relacionadas con patógenos. Además, otras enzimas pueden ser sometidas a este tratamiento. Por ejemplo, podrían seleccionarse los profármacos que señalan específicamente la actividad de dihidrofolato reductasa de agentes infecciosos, como Pneumocystis carnii . Estos agentes se seleccionarán por especificidad para la enzima objetivo, y puede mostrarse que no activan la enzima del huésped natural empleando la prueba de selección descrita en la Figura 3. La construcción del control celular contiene la correspondiente enzima normal humana, para mostrar la falta de toxicidad cuando está presente solamente la enzima normal humana. Por ejemplo y como se muestra en la Figura 4, un gen extraño, por ejemplo, un gen humano que codifica TS, puede insertarse dentro de la célula huésped de tal forma que el TS humano se exprese. Esta célula diseñada genéticamente se muestra como la "célula prueba" en la Figura 3. La "célula control" no expresa la enzima objetivo. En algunas modalidades puede ser necesario complementar el medio de cultivo con el producto de proteina de la enzima objetivo. En una modalidad separada, la célula huésped tipo salvaje es deficiente o no expresa más de una enzima de interés. Como se muestra en la Figura 4, la célula huésped no produce endógenamente timidinquinasa (TK) o timidilato sintasa (TS) . Los genes que codifican la cotraparte humana de estas enzimas se introducen dentro de la célula huésped para obtener el nivel deseado de expresión. El nivel de expresión de la enzima en cada linea de células transfectadas puede monitorearse por los métodos descritos en la presente, por ejemplo por prueba de inmunotinción y enzima en lisatos celulares, usando anticuerpos monoclonales o policlonales previamente cultivados en contra de la enzima para inmunodetección. Ver, por ejemplo, como se describe por Chen L. et al (1996) . La prueba enzimática también puede realizarse como se revisa por Carreras, C. W. y Santi, D. N. (1995) usando sustituyentes etiquetados detectables, por ejemplo sustituyentes etiquetados con tritio. Una posible ventaja del sistema de "dos enzimas" es que el requerimiento para la activación por dos enzimas preferentemente sobre expresadas en células de tumor proporcionará seguridad incrementada para las células normales. La célula prueba se cultiva en pequeñas placas multipozo y se usan para detectar la actividad biológica de los profármacos de prueba. Para los propósitos de esta invención, el fármaco candidato exitoso bloqueará el crecimiento o destruirá el tipo de célula prueba, pero dejará el tipo de célula control ilesa. El profármaco candidato puede añadirse directamente al medio de cultivo celular o conjugado previamente a un lingando especifico para un receptor de superficie celular y después agregado al medio. Los métodos de conjugación para el suministro celular especifico son bien conocidos en la técnica, véase por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 5,459,127; 5,264,618; y la especificación de patente publicada W091/17424 (publicada el 14 de noviembre de 1991) . El grupo saliente del profármaco candidato puede etiquetarse directamente, por ejemplo con tritio. La célula objetivo o el medio de cultivo se prueba después para la cantidad de etiqueta liberada del profármaco candidato. Alternativamente, la toma celular puede mejorarse empacando el profármaco dentro de los liposomas usando el método descrito en Lasic, D.D. (1996) o combinado con citofectinas como se describe en Lewis, J. G. et al (1996) . En una modalidad separada, células de tumor humano cultivadas que sobre expresan la enzima de interés, es decir la enzima objetivo, se identifican como se describió anteriormente. Las células se hacen contactar con el agente terapéutico potencial bajo condiciones que favorecen la incorporación del agente dentro del compartimento intracelular de las célula. Las células se prueban después por inhibición de proliferación celular o destrucción de células . Debe entenderse, aunque no se declara explícitamente siempre, que cada modalidad puede modificarse adicisnalmente para proporcionar una célula objetivo separada para actuar como un control que recibe una cantidad efectiva de un compuesto, tal como, por ejemplo, los compuestos mostrados en lo siguiente, han demostrado ser profármacos potentes . Una selección de alto rendimiento para identificar compuestos biológicamente activos se esboza en las Figuras 3, 4 y 5. La base de la prueba es la facilidad de la manipulación genética y el crecimiento de E. coli, y organismos unicelulares similares (por ejemplo levaduras) ver Miller (1992) y Spector et al. (1998) . La etapa clave es la eliminación de la actividad enzimática endógena que corresponde a una enzima objetivo para el diseño del profármaco. Esto puede hacerse por cualquiera de los métodos descritos por Miller (1992), Sambrook, et al. (1989) o Spector et al. (1998) . Estos métodos incluyen mutagénesis química y biológica (por ejemplo inserción viral o transponson) , seguida por un procedimiento de selección apropiado. La célula TS negativa (TS) se vuelve un control negativo para la identificación de profármacos que, cuando actúan sobre la timidilato sintasa, se vuelven toxinas celulares. Un enfoque similar puede hacerse con otros tipos de células, por ejemplo, otras bacterias, levaduras u otros organismos unicelulares seleccionables. En la prueba, los organismos control y recombinantes se comparan por sensibilidad a los compuestos prueba. Como se entenderá por aquellos expertos en la técnica, los profármacos que distinguen entre especies de enzima también pueden derivarse de este procedimiento. Por ejemplo, pueden usarse células de otra forma idénticas que expresan enzimas humanas y de levadura para detectar profármacos antibióticos que son preferentemente tóxicos solamente a las células que expresan la enzima de la levadura. De esta manera, puede descubrirse antibióticos novedosos y específicos. Ejemplos de líneas de células son las células ras-transformadas NIH 3T3 (obtenidas de ATCC) y se diseñan para expresar cantidades aumentadas de timidilato sintasa humana (Hu TS) del ADNc clonado. La transfección se hace en una base transiente o permanente (véase Chen, L. et al. (1996), Hudziak, R. M. et al (1988), y Cárter. P. et al (1992). NIH-000 (linea celular de origen ras-transformada) ; NIH-001 (expresor bajo de HuTS) ; NIH-002 (expresor intermediario de HuTS) ; MHI-003 (expresor alto de HuTS) . El nivel de expresión de TS en cada linea celular se monitorea por prueba de inmunotinción y enzima en lisatos celulares, usando anticuerpos dirigidos versus proteína de HuTS para inmunodetección (por ejemplo como se describe en Chen, L. et al. (1996)). Las pruebas enzimáticas se realizan como se revisa por Carreras and Santi (1995) .

Se seleccionan las líneas celulares de tumor de mama y colón recto humano para la expresión de la enzima HuTS. Las lineas celulares que expresan niveles bajos, moderados y altos de HuTS se expondrán a los candidatos de fármaco como se describe anteriormente para las líneas de células NIH 3T3. La inhibición del crecimiento y la citotoxicidad se monitorean como se describe anteriormente. Puede llevarse a cabo pruebas similares para cada una de las enzimas listadas en la Tabla 1. Una modalidad alternativa para tomar ventaja del profármaco para sobre expresión de TS en células de tumor es un desoxiuridina fosforamidato u otras modificaciones (citadas en la presente) conjugadas con un radionuclido terapéutico. Un ejemplo de un radionuclido terapéutico es renio 188. El isótopo puede sintetizarse esencialmente como se describe por Callahan, et al. (1989). Alternativamente, puede obtenerse comercialmente, por ejemplo de Mallicrodt Medical BV, los Paises Bajos. El radionuclido terapéutico puede conjugarse con desoxiuridina, o desoxiuridina 5'-fosforamidato, u otro derivado, por métodos estándar (por ejemplo, como se describe por Lin, W-Y., et al (1997)) . El radionúclido que contiene desoxiuridina fosforamidato se ocupará preferentemente dentro del ADN de las células de tumor que sobreexpresan timidilato sintasa, y que provocan su destrucción mediante la emisión concentrada de radiación beta y gamma. Los radionúclidos alternativos incluyen el renio 186, y otros (Troutner, D.A. (1987)). Administración In Vivo Las pruebas in vi tro se confirman en modelos animales que llevan tumores humanos o es"t;án infectados con un microorganismos resistente a antibióticos para determinar la eficiencia in vivo . Otro aspecto de esta invención es un método para tratar una patología caracterizada por células hiperproliferativas en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéutica de un profármaco que se convierte en una toxina en una célula hiperproliferativa por una enzima intracelular endógena como se define en la presente. En una modalidad preferida, el compuesto se selecciona de los compuestos definidos en la sección "profármacos" Infra. Cuando se administra el profármaco a un sujeto tal como un ratón, una rata o un paciente humano, el agente puede añadirse a un portador farmacéuticamente aceptable y administrado sistémicamente o localmente al sujeto. Para determinar los pacientes que pueden tratarse beneficiosamente, se elimina una muestra de tumor del paciente y las células se prueban para el nivel de expresión de la enzima de interés. Si la expresión está arriba de lo expresado en células normales de manera que una cantidad tóxica de profármaco causaría la administración sin efectos secundarios indeseables, entonces se determina que el tumor o las células serán tratadas benéficamente y así, el paciente es adecuado para la terapia de esta invención. Por ejemplo, si la enzima objetivo se expresa al menos aproximadamente dos veces y de preferencia aproximadamente 3 veces mayor que las células normales, el paciente es un sujeto adecuado para el método de terapia de esta invención. Las cantidades terapéuticas pueden determinarse empíricamente y variarán con la patología siendo tratadas, el sujeto tratado y la toxicidad del profármaco convertido o toxina celular. Cuando se administra a un animal, el método es útil para confirmar adicionalmente la eficiencia del profármaco. Como un ejemplo de un modelo animal, grupos de ratones desnudos (Balb/c NCR un/un hembra, Simonsen Gilroy, CA) se inoculan cada uno subcutáneamente con aproximadamente 105 hasta aproximadamente 109 células objetivo o cancerosas hiperproliferativas como se definió en la presente. Cuando se establece el tumor, se administra el profármaco, por ejemplo, por inyección subcutánea alrededor del tumor. Las mediciones del tumor para determinar la reducción del tamaño de tumor se hacen en dos dimensiones usando calibradores vernier dos veces a la semana. Otros modelos animales también pueden emplearse como sea apropiado. Lovejoy et al. (1997) y Clarke, R. (1996) .

La administración in vivo puede efectuarse en una dosis, continua o intermitentemente a través del curso de tratamiento. Los métodos para determinar los medios más efectivos y la administración de la dosis son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y variarán con la composición usada para terapia, el propósito de la terapia, la célula objetivo a ser tratada, y el sujeto a ser tratado. Las administraciones sencillas o múltiples pueden llevarse a cabo con el nivel de dosis y el patrón seleccionado por el médico tratante. Las formulaciones de las dosis y métodos adecuados para la administración de los agentes puede encontrarse posteriormente. Los agentes y las composiciones de la presente invención pueden usarse en la fabricación de medicamentos y para el tratamiento de humanos y otros animales por la administración de acuerdo con los procedimientos convencionales, tales como un ingrediente activo en las composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse oralmente, intranasalmente, parenteralmente o por terapia de inhalación,. y puede tomar la forma de tabletas, grageas, granulos, cápsulas, pildoras, ámpulas, supositorios o en forma de aerosol. También pueden tomar la forma de suspensiones, soluciones y emulsiones del ingrediente activo en diluyentes acuosos o no acuosos, jarabes, granulados o polvos. Además de un compuesto de la presente invención, las composiciones farmacéuticas también pueden contener otros compuestos farmacéuticamente activos o una pluralidad de compuestos de la invención. Más particularmente, un compuesto de la fórmula de la presente invención también referido en la presente como el ingrediente activo, puede administrarse para terapia por cualquier ruta adecuada incluyendo oral, rectal, nasal, local (incluyendo transdérmica, aerosol, bucal y sublingual), vaginal, parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica) y pulmonar. También se apreciará que la ruta preferida variará con la condición y edad del recipiente, y la enfermedad que se está tratando. En general, una dosis adecuada para cada uno de los compuestos anteriormente nombrados, está en el rango de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal del recipiente por dia, preferentemente en el rango de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal por dia y más preferentemente en el rango de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 25 mg por kilogramo de peso corporal por dia. A menos que se indique lo contrario, todos los pesos del ingrediente activo se calculan como el compuesto de origen de la fórmula de la presente invención para sales o esteres del mismo, los pesos se incrementan proporcionalmente. La dosis deseada se presenta de preferencia como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas a intervalos apropiados a través del día. Estas subdosis pueden administrarse en formas de dosis unitarias, por ejemplo, que contienen aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg, de preferencia aproximadamente 1 a por arriba de aproximadamente 25 mg, y de mayor preferencia aproximadamente 5 a por arriba de aproximadamente 25 mg de ingrediente activo por forma de unidad de dosis. Se apreciará que las dosis apropiadas de los compuestos y las composiciones de la invención pueden depender del tipo y severidad y etapa de la enfermedad y puede variar de paciente a paciente. La determinación de la dosis óptima involucra generalmente el equilibrio del nivel del beneficio terapéutico contra cualquier riesgo o efectos secundarios perjudiciales de los tratamientos de la presente invención. Idealmente el profármaco debe administrarse para lograr concentraciones pico del compuesto activo en los sitios de la enfermedad. Esto puede lograrse, por ejemplo, por la inyección intravenosa del profármaco, opcionalmente en solución salina, u oralmente administrado, por ejemplo, como una tableta, cápsula o jarabe que contiene el ingrediente activo. Los niveles deseables en sangre del profármaco puede determinarse por una infusión continua para proporcionar una cantidad terapéutica del ingrediente activo dentro del tejido enfermo. Se contempla el uso de combinaciones operativas para proporcionar combinaciones terapéuticas que requieren una dosis total más baja de cada componente del agente antiviral que puede requerirse cuando se usa solo cada compuesto terapéutico o fármaco individual, con lo cual se reducen los efectos adversos . Mientras que es posible administrar solo el ingrediente profármaco, es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica que comprende al menos un ingrediente activo, junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables y opcionalmente otros agentes terapéuticos . Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con otros ingredientes de la formulación y no dañinos al paciente. Las formulaciones incluyen aquellas que son adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, local (incluyendo transdérmica, bucal y sublingual) , vaginal, parenteral, (que incluye subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica) y pulmonar. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosis unitaria y pueden prepararse por cualquier método bien conocido en la técnica de la farmacia. Tales métodos incluyen la etapa de traer en asociación el ingrediente activo con el portador el cual constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan poniendo uniforme e íntimamente en asociación el ingrediente activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario darle forma al producto. Las formulaciones de la presente invención adecuadas para la administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, sellos o tabletas; cada una contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como un polvo o granulos; como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión liquida de aceite en agua o una emulsión liquida de agua en aceite. Los ingredientes activos también pueden presentarse como un bolo de remedio o pasta. Una tableta puede hacerse por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas pueden prepararse comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente activo en la forma de flujo libre tal como un polvo o granulos, opcionalmente mezclados con un enlazante (por ejemplo povidona, gelatina, hidroxipropilmetilcelulosa) , lubricante, diluyente inerte, conservador, desintegrante (por ejemplo glicolato de almidón sódico, povidona reticulada, carboximetilcelulosa sódica reticulada) agente tensioactivo o dispersante. Las tabletas moldeadas pueden hacerse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Las tabletas pueden opcionalmente recubrirse o registrarse y pueden formularse para proporcionar la liberación lenta o controlada del ingrediente activo usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberación deseado. Las tabletas pueden opcionalmente proporcionarse con un recubrimiento entérico, para proporcionar la liberación en parte de las entrañas distintas al estómago. Las formulaciones adecuadas para la administración local en la boca incluyen grageas que comprenden el ingrediente activo en una base saborizada, usualmente sacarosa o acasia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo' en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acasia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un portador liquido adecuado. Las composiciones farmacéuticas para la administración local de acuerdo con la presente invención pueden formularse como ungüento, crema, suspensión, loción, polvo, solución, pasta, gel, bronceador, aerosol o aceite. Alternativamente, una formulación puede comprender un parche o un vendaje tal como un emplasto adhesivo o vendaje impregnado con los ingredientes activos y opcionalmente uno o más excipientes o . diluyentes . Para enfermedades del ojo u otros tejidos externos como por ejemplo, la boca y la piel, las formulaciones se aplican preferentemente como un ungüento local o crema que contiene el ingrediente activo en una cantidad de, por ejemplo, aproximadamente 0.075 hasta aproximadamente 20% p/p, de preferencia aproximadamente 0.2 hasta aproximadamente 25% p/p y de mayor preferencia aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 10% p/p. Cuando se formula en un ungüento, el profármaco puede emplearse con una base de ungüento parafínica o visible en agua. Alternativamente, los ingredientes profármaco pueden formularse en una crema con una base cremosa de aceite en agua. Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, al menos aproximadamente 30% p/p de un alcohol polihidrico, es decir un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo tales como propilenglicol, 1,3-butandiol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol y mezclas de los mismos. Las formulaciones locales pueden incluir deseablemente un compuesto que aumenta la absorción o penetración del ingrediente del profármaco a través de la piel y otras áreas afectadas. Los ejemplos de tales mejoradores de la penetración dérmica incluyen el dimetiisulfóxido y análogos relacionados. La fase aceitosa de las emulsiones de esta invención pueden constituirse de ingredientes conocidos en una forma conocida. Mientras que esta fase puede comprender meramente un emulsificador (de otra forma conocido como un emulgente) . Comprende deseablemente una mezcla de al menos un emulsificador con una grasa o un aceite o con ambos, grasa y aceite. Preferentemente, se incluye un emulsificador hidrofílico junto con un emulsificador litofílico el cual actúa como un estabilizador. También se prefiere incluir ambos, un aceite y una grasa. Juntos, el emulsificador (ES) con o sin estabilizador (ES) producen la asi llamada cera emulsificante, y la cera junto con el aceite y/o grasa producen la así llamada base de ungüento emulsificante la cual forma la fase dispersa aceitosa de las formulaciones de crema . Los emulgentes y los estabilizadores de emulsión adecuados para el uso en la formulación de la presente invención incluyen Tween 60, Span 80, alcohol cetoestearílico, alcohol miristílico, monoestearato de glicerilo y laurilsulfato sódico. La selección de los aceites o grasas adecuados para la formulación se basa en el logro de las propiedades cosméticas deseadas, puesto que la solubilidad del compuesto activo en la mayoría de los aceites de uso probable en formulaciones farmacéuticas de emulsión es muy baja. Así la crema preferentemente debe ser no grasosa, no manchar y ser producto lavable con consistencia adecuada para evitar fugas de los tubos u otros recipientes. Alquilésteres mono o dibásicos de cadena lineal o ramificada tales como diisoadipato, isocetilestearato, diésterpropilenglicol de ácidos grasos de coco, isopropilmiristato, deciloleato, isopropilpalmitato, butilestearato, 2-etilhexilpalmitato o una mezcla de esteres de cadena ramificada conocidos como Crodamol CAP puede usarse, siendo los últimos tres los esteres preferidos. Estos pueden usarse solos o en combinación dependiendo de las propiedades requeridas. Alternativamente, los lípidos de alto punto de fusión tales como parafina blanda blanca y/o parafina líquida u otros aceites minerales pueden usarse. Las formulaciones adecuadas para la administración local en el ojo incluye también gotas para los ojos en donde el ingrediente activo se disuelve o suspende en un portador adecuado, especialmente un solvente acuoso para el ingrediente profármaco. El ingrediente profármaco está preferiblemente presente en la formulación en una concentración de aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 20%, ventajosamente aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 10% particularmente aproximadamente 1.5% p/p. ~ Las formulaciones para la administración rectal pueden presentarse como un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato. Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal pueden presentarse como formulaciones para supositorios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o por aspersión además del ingrediente profármaco, tales portadores son apropiados según se conoce en la técnica. Las formulaciones adecuadas para administración nasal, en donde el portador es un sólido, incluye un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el rango de aproximadamente 20 a aproximadamente 500 micrones el cual se administra en la forma en la cual se toma la aspiración, es decir, por la inhalación rápida a través del pasaje nasal desde un recipiente del polvo mantenido cerca de la nariz. Las formulaciones adecuadas en donde el portador es un líquido para la administración como, por ejemplo, aspersor nasal, gotas nasales, o por administración en aerosol por nebulizador, incluye soluciones acuosas o aceitosas del ingrediente profármaco. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles isotónicas acuosas y no acuosas las cuales pueden contener antioxidantes, reguladores, bacteriostáticos y solutos que producen la formulación isotónica con la sangre del recipiente; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes en suspensión y agentes espesantes, y liposomas u otros sistemas microparticulados que están diseñados para señalar el compuesto a los componentes de la sangre o uno o más órganos. Las formulaciones pueden estar presentes en recipientes sellados de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ámpulas y en frascos, y pueden almacenarse en una condición de secado por congelación (liofilizado) requiriendo solamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo agua para las inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea pueden prepararse de polvos estériles, granulos y tabletas del tipo previamente descrito. Las formulaciones preferidas de unidad de dosificación son aquellas que contienen una dosis diaria o unitaria, subdosis diaria, como se cito anteriormente en la presente, o una fracción apropiada del mismo, de un ingrediente profármaco. Debe entenderse que además de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica respecto al tipo de formulación en cuestión, por ejemplo, aquellos que son adecuados para la administración oral pueden incluir agentes adicionales tales como agentes edulcorantes, espesantes y saborizantes. Los profármacos y las composiciones de la fórmula de la presente invención también pueden estar presentes para uso en la forma de formulaciones veterinarias, las cuales pueden prepararse, por ejemplo, por métodos que son convencionales en la técnica. Lo que se proporciona posteriormente es un breve resumen de las células y enzimas netas que son útiles para activar los profármacos de esta invención. Tirosinquinasas La superfamilia de tirosinquinasa comprende el receptor EGF (EGFR) , el receptor (v-fms) del factor estimulante de la colonia de macrófagos (CSF-1) , y el receptor de insulina, el cual muestra 30 hasta 40% de identidad con el producto del oncógeno ros . Más específicamente, los miembros de esta superfamilia incluyen v-src, c-src, EGFR, HER2, receptor CSF-1, c-fms, v-ros, receptor de insulina, y c-mos . Ver la Figura 8.5 de Burck, K.B. et al., eds. (1988). Los miembros de sobreexpresión del receptor tipo 1 de la superfamilia de tirosinquinasa han sido documentada en muchos tipos de cáncer (Eccles, S. A. et al. (1994-95)). La sobreexpresión de la tirosinquinasa está unida a la exposición del agente biológico -cáncer TNF-a (Hudziak, R. M. et al. (1988) y Hudziak, R. M. et al. (1990)) y a la quimioterapia (Stühlinger et al. (1994)). El gen de transformación del virus de sarcoma Rous, v-src, codifica una enzima que fosforiza los residuos de tirosina en las proteínas. El proto-oncogen c-src se encuentra en el cromosoma 20. Los tejidos y las lineas de células derivadas de los tumores de origen neuroectodérmico que tienen fenotipo neural expresan altos niveles de c-src acompañados por alta actividad específica de quinasa.

Diversos grupos de investigadores han reportado la sobreexpresión del oncogen c-erbB-2/neu ("HER2") en células cancerosas. Brison (1993) observó que el proto-oncogen erbB se amplifica en los tumores humanos con sobreexpresión resultante en la mayoría de los casos. La amplificación del oncogen erbB- 2/neu ha sido reportado en tumores mamarios de humanos (Slamon, et al. (1987), van de Vijver et al. (1987), Pupa et al. (1993), y Andersen et al. (1995) y en tumores de vejiga (Sauter et al. (1993)), y en cada caso la amplificación se acompañó de la sobreexpresión. La sobreexpresión de c-erbB-2/neu también se ha reportado en muestras de tejido de cáncer del cáncer del ovario (Slamon, et al. (1989), Meden et al. (1994), y Felip et al. (1995)), y en los tumores derivados del sistema nervioso periférico. Sukumar y Barbacid, (1990) . Para realizar la prueba de selección del fármaco, las líneas de células de tumor se probaran para la expresión del oncogen o se diseñarán para expresar diversos niveles de tirosinquinasa. Las lineas de células seleccionadas se cultivan y los fármacos candidatos se agregan en diversas concentraciones. Las células se prueban para la destrucción o inhibición de las células de la proliferación celular, como se describe en Hudziak, R. M. et al. (1988) y Hudziak. R. M. et al. (1990) . Dihidrofolato Reductasa El metotrexato es un potente inhibidor de dihidrofolato reductasa, una enzima necesaria para el metabolismo intracelular de folato. La dihidrofolato reductasa funciona para regenerar el tetrahidrofolato del dihidrofolato, un producto de la reacción de timidilato sintasa (Voet, et al. eds. (1995), p. 813). Esta bien establecido que un mecanismo importante para la resistencia de las células al metotrexato es un aumento en la actividad de DHFR debido a la amplificación del gen de DHFR. Banerjee, D., et al. (1995), Schimke, R. T. et al. (1988). Lónn, U., et al. (1996) reportó que la amplificación del gen DHFR se presentó en pacientes con cáncer de mama quienes previamente recibieron quimioterapia adyuvante (ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo [CMF]) después de cirugia. La falta del retinoblastoma (Rb) también puede conducir a la resistencia aumentada de MTX como una consecuencia de una mejora en la actividad de expresión DHFR ARNm sin la amplificación del gen. Li, W. W. et al. (1995) . La lineas de células que mutaron p53 han demostrado sufrir la amplificación del gen, y las células resistentes se seleccionan por quimioterapia. Banerjee, D. et al. (1995), Yin, Y. et al. (1992) y Livingston. L.R. et al. (1992) . Para los propósitos de realizar la prueba de esta invención, Schimke, R. T. et al. (1988) describe diversas líneas de células de ratón, hámster, humanas. Alternativamente, el método PCR de Lónn U. et al. (1996) se usa para probar la amplificación del gen DHFR e identificar las células que son útiles en el método para identificar agentes terapéuticos como se describe en la presente. La secuencia de nucleotido del ADNc que codifica para la dihidrofolato reductasa humana se proporciona en Masters, J. N. y Attardi, G. (1983) y las células puede diseñarse para expresar diversos niveles de la enzima como se nota en la presente. Dicken, A. P. et al. (1993) describe un gen mutante DHFR seleccionado por quimioterapia. La purificación del DHFR y las pruebas relacionadas a la función enzimática se describe en Nakano, T., et al. (1994). Alternativamente, ADNc que codifica el DHFR se transfecta dentro de las células NIH 3T3. Los fármacos candidato se agregan en diversas concentraciones y se prueba la destrucción e inhibición de las células de proliferación. Los antimetabolitos dependientes de la actividad en dihidrofolato reductasa puede sintetizarse por la unión de, por ejemplo, un grupo aquilante ya sea a la posición N5 o la C6 de dihidrofolato. La reducción del enlace N5-C6 por DHFR resultará en la liberación del agente alquilante. Además de los grupos alquilantes, cualquier porción cuya liberación por DHFR resulta en la producción de una toxina o un antimetabolito será útil en la práctica de la invención. Estos compuestos pueden ser adicionalmente modificados por la visión de una porción de fosfatase o fosforamidato.

Tumores Resistentes a Multifármacos La resistencia a multifármacos (MDR) es un término genérico para la diversidad de estrategias que usan las células de tumor para evadir los efectos citotóxicos de los fármacos anticancer. Los MDR se caracterizan por una sensibilidad disminuida de las células del tumor no solamente al fármaco empleado para la quimioterapia sino también a un amplio espectro de fármacos sin homología estructural obvia ni metas comunes. Esta resistencia pleyotrópica es uno de los principales obstáculos al tratamiento exitoso de tumores. Los MDR pueden resultar de cambios estructurales o funcionales en la membrana plasmática o dentro del citoplasma, compartimientos celulares, o núcleo. Los mecanismos moleculares de los MDR se discuten en términos de modificaciones en el desenvenenamiento y rutas de reparación ADN, cambios en los sitios celulares de secuestro de fármaco, disminución en la afinidad del fármaco objetivo, sintesis de inhibidores específicos de fármaco dentro de las células, selección alterada o inapropioda de proteínas, y eliminación acelerada o secreción de fármacos. Uno de los mecanismos implicados en los MDR resulta de la amplificación y sobreexpresión de un gen conocido como la proteína asociada resistente a multifármaco dependiente de ATP (MRP) en líneas de células seleccionadas de fármaco. Para una revisión de los mecanismos de MDR, véase Gottesman, M.M. et al. (1995) y Noder et al. (1996) . Para establecer líneas de célula de MDR, las selecciones de los fármacos se conducen en una etapa sencilla o en etapas múltiples como se describe en Gottesman, M.M. et al. (1995) y Simón, S.M. y Schindler, M. (1994), y las referencias citadas en las mismas. El aislamiento de las secuencias de ADN que codifican para los MDR de diversas especies de mamíferos se describe en Gros, P. et al. (1986), Gudkov, A. V. et al. (1987), y Roninson, I. B. et al. (1984), y se revisó en Gottesman, M. M. et al. (1995), y las células pueden diseñarse para expresar diversos niveles de esta enzima como se describe anteriormente. La señalización del profármaco para los MDR se basará en la actividad de ATPasa de este transportador. Ribonucleotido Reductasa La enzima ribonucleotido reductasa reduce ribuneoclosido difosfatos al correspondiente dexoribonucleosido difosfato. La enzima es un tetrámero producido de dos a-subunidades y dos ß-subunidades . La hidroxiurea específicamente bloquea esta reacción por la interacción con el radical libre tirosil (Tyr 122) del sustrato complejo ß2 Voet et al. (1995) . La meta al seleccionar esta reacción es permitir la acumulación del producto radical libre 02, el cual es altamente citotóxicos.

Aplicación de la Tecnología a Otras Enfermedades Mientras que el enfoque primario de esta aplicación se dirige al cáncer, debe reconocerse que la tecnología es ampliamente aplicable a otras enfermedades, especialmente infecciones bacterianas resistentes a los antibióticos. Los antibióticos ß-lactama encuentran resistencia en las bacterias como resultado de las sobreexpresión de ß-lactamasas . Hamilton-Miller, J. M. T. y Smith, J. T. eds. (1979) p. 443. Otras enzimas, tales como la aminoglicosido fosfotranferasa tipo III, se inducen y seleccionan para seguir el tratamiento con antibióticos de aminoglicosido, tales como kanamicina. McKay, G. A. et al. (1994). Para el propósito de esta aplicación, se prepararán sustratos profármaco derivados de sustratos conocidos que no bloquearán la actividad enzimática, pero que en su lugar tomaran ventaja de la alta actividad enzimática para generar toxinas intracelulares de los agentes infecciosos . Timidilato Sintasa La sobreexpresión de timidilato sintasa está asociada con cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de higado y cáncer pancreático. Estas enfermedades se tratan corrientemente con fármacos antimetabolito (basados en uracilo, basados en folato, o basados en quinazolina, (ver Tabla 1)) . En cada uno de estos casos es probable que la pérdida del supresor del tumor y/o terapia de 5-fluorouracilo pueda conducir a la actividad amplificada de TS, o seleccionar formas de la enzima resistentes al fármaco, con lo cual conducir a la resistencia al fármaco de la enfermedad reincidente. Lonn . U. et al. (1996) reportó que la amplificación del gen TS se presentó en pacientes con cáncer de mama que previamente recibieron quimioterapia adyuvante (ciclofosfamida, metotrexato, 5- fluorouracilo [CMF]) después de cirugía. Esta expresión mejorada de TS es además del incremento básico de TS que resulta de la pérdida de la función supresora de tumor. La reacción principal normalmente realizada por TS es la síntesis de desoxitimidinmonofosfato (dTMP) y dihidrofolato (DHF) de desoxiuridinmonofosfato y N(5), N (10) -metilen-tetrahidrofolato (THF) . En una modalidad, un derivado de uracilo o THF se proporciona a las células que expresan TS . Para los propósitos de esta invención, "uracilo" (solamente base) y "uridina" (base y azúcar) se usan intercambiablemente y como sinónimos. La Tabla 4 (posterior) resume los muchos tipos de cáncer impactados por la expresión elevada de TS.

Veces de diferencia entre promedio > 2.5 El derivado o "profármaco" se convierte por la enzima en metabolitos altamente citotóxicos. El nivel bajo de TS expresado en células normales no producirá una cantidad tóxica de la toxina convertida. Los altos niveles de TS expresados en tejidos enfermos generan más toxinas y por eso conducen a una inhibición de la proliferación celular y/o destrucción celular. Por ejemplo, la terapia corriente utiliza 5-fluorodesoxiuridilato para inhibir la actividad de TS. Durante la reacción con sustrato, el átomo de flúor se une irreversiblemente a la enzima TS y la inhibe. En una modalidad, la nueva propuesta terapéutica permite que la TS complete la reacción pero genera un producto modificado que, cuando se incorpora dentro del ADN, causa un efecto tóxico. El producto enzimático también puede bloquear otras funciones celulares críticas (por ejemplo la síntesis de proteina o metabolismo de energía) . La conversión del profármaco también puede liberar un metabolito, tal como CN el cual es tóxico para la célula. Los derivado de uracilo/dUMP y N(5) (10)-THF pueden sintetizarse, todos los cuales tienen el potencial de generar producto tóxico después de la transformación metabólica por TS . Las secuencias primarias muestran que TS es una de las enzimas más altamente conservadas. Perry, K. et al. (1990) . Las estructuras cristalinas de TS de diversa especies procarioticas, Lactobacillus casei (Hardy, L. . et al. (1987); Finer-Moore, J. et al. (1993)) y Escherichia coli (Perry, K. et al. (1990)); un eukariote Leishmania major (Knighton, E. R. et al. (1994)); y T4 fag (Finer-Moore, J. S. et al., (1994)) ha sido determinado e indican que la estructura terciaria también está muy bien conservada. La secuencia de alineación de las especies de TS cuyas estructuras tridimensionales han sido determinadas se muestran en Schiffer, C. A. et al. (1995) . De estas secuencias de aminoácidos, las secuencias de ADN pueden deducirse o aislarse usando métodos bien conocidos para aquéllos expertos en la técnica. Sambrook, et al. (1989) . Alternativamente, algunas secuencias 29 TS de diferentes organismos han sido clonadas y depositadas dentro de las bases de datos de ADN como se describe en Carreras, C. . y Santi, D. V. (1995) . La secuencia del gen de timidilato sintasa humano, su clonación, expresión y purificación se proporciona en Takeishi, K. et al. (1985), Davisson, V. J. et al. (1989) y Davisson, V. J. et al. (1994) . Los genes que codifican la proteina TS y que contienen las secuencias regulatorias necesarias, se construyen usando métodos bien conocidos para aquéllos experto en la técnica. El gen que codifica TS se introduce a las células objetivo por procedimientos de electroporación, transformación o transfección. Sambrook, et al. (1989). Alternativamente, el gen se inserta dentro de un vector de expresión apropiado por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo como se describe en Carreras, C. W. y Santi, D. V. (1995), Miller (1992) y Spector et al. (1998) . El vector de expresión inserta el gen TS dentro de las células. Entonces las células se cultivan bajo condiciones que favorecen la expresión y producción de la proteína de TS . Líneas de células de cáncer gástrico humana, MKN 74, MKN 45, MKN 28 y KATO-III pueden usarse en la prueba descrita anteriormente para identificar los agentes terapéuticos potenciales que son sustratos selectivos para TS. MKN-74 y MKN-45 se establecen de adenocarcinomas bien y deficientemente diferenciadas, respectivamente. Estas lineas de células y las condiciones de cultivo se describen en Osaki, M. et al. (1997) y las referencias citadas en la misma. Alternativamente, las lineas de célula de tumor tales como aquellas descritas por Copur, S et al. (1995), las cuales han sido seleccionadas por 5-FU para sobreexpresar la timidilato sintasa pueden usarse.

La cuantificación de TS puede realizarse usando pruebas bioquímicas enzimáticas que son bien conocidas por aquéllos expertos en la técnica. Para cuantificar el nivel de la proteína TS y la expresión del gen TS de muestras de tejido de tumor humano, los métodos según reportados por Johnston, P.G. et al. (1991) y Horikoshi, T., et al. (1992) proporciona pruebas sensibles. Alternativamente, el método PCR de Lónn, U. et al. (1996) se usa para probar la amplificación del gen PS e identificar células que son útiles en el método para identificar agentes terapéuticos como se describe en la presente. Como es aparente al experto en la técnica, también se prueban sistemas de cultivo de células control sin fármaco y separadamente con un fármaco de referencia tal como los compuestos ejemplificados posteriormente. Un compuesto protagonista es uno que preferentemente destruye células objetivo con aproximadamente 2 veces y preferentemente aproximadamente 3 veces de mayor actividad que las células normales. Esta invención también proporciona los agentes identificados por los métodos descritos en la presente. En otro aspecto, esta invención proporciona un método para inhibir la proliferación de una célula hiperproliferativa, conduciendo primeramente la prueba anterior. Un profármaco identificado por esta prueba se contacta coh la célula y se convierte en metabolito tóxico en la célula por una enzima intracelular endógena como describe anteriormente. El crecimiento o citotoxicidad de la bacteria, levadura y otros tipos de célula pueden monitorearse como se describe por Miller et al. (1992), Sugarman et al. (1985) y Spector et al. (1998) . TS Profármacos En una modalidad preferida, la presente invención involucra dos clases de compuestos activados por TS, cada derivado de monofosfato desoxiuridina 5-sustituido o un monofosfato de uracil o desoxiuridina 5-sustituido . Los derivados de monofosfato desoxiuridina 5-sustuido protegidos son aquellos en los cuales la porción fosfato ha sido bloqueada a través de la unión de grupos químicos protectores adecuados. La protección de los derivados de monofosfato desoxiuridina 5-sustituidos pueden mejorar la solubilidad, facilitar la penetración celular, facilitar el paso a través de la barrera hemoencefálica, y prevenir la acción de fosfatasas celulares o extracelulares, lo cual pudiera resultar de otra forma en la pérdida del grupo fosfato. En otra modalidad, los derivados de uracilo o uridina 5-sustituidos se administran a las células que contienen actividad de quinasa de nucleosido, en donde derivado uracilo/uridina 5-sustituido se convierte en un derivado monofosfato de uridina 5-sustituido. Los derivados de uridina también pueden modificarse para aumentar su solubilidad, penetración celular, y/o la capacidad para atravezar la barrera hemoencefálica . La acción de la timidilato sintasa sobre derivados de monofosfato de uridina 5 sustituidos puede liberar el sustituyente unido en la posición 5 ("grupo saliente") del anillo de pirimidina. El sustituyente liberado es capaz entonces, ya sea inherentemente o siguiendo la reacción con otro componente celular, de actuar como una toxina o un inhibidor de la proliferación celular. Síntesis General de Compuestos de Clase I Los isómeros de L y D de los compuestos de Clase I tiene la estructura: En la fórmula anterior, Ri (en la posición 5) es o contiene un grupo saliente que es una entidad química que tiene una dimensión molecular y electrofilicidad compatible con la extracción del anillo de pirimidina por timidilato sintasa, y el cual se libera desde el anillo pirimidina mediante timidilato sintasa, tiene la capacidad de inhibir la proliferación de la célula o destruir la célula. En la fórmula anterior, Q es derivado de fosfato o fosforamidato que contiene una entidad química seleccionada del grupo que consiste de grupos de azúcar, grupos de tio-azúcar, grupos carbocíclico, y derivados de los mismos. Los ejemplos de los grupos de azúcar incluyen, pero no se limitan a grupos de azúcar cíclicos monosacáridos tales como aquellos derivados de oxetanos (azúcares de anillo de 4 miembros) , furanosas (azúcares de anillo de 5 miembros), y piranosas (azúcares de anillo de 6 miembros) . Los ejemplos de las furanosas incluyen treo-furanosilo (de treosa, una azúcar de cuatro carbonos) ; eritro-furanosilo (de eritrosa, un azúcar de cuatro carbonos); ribo-furanosilo (de ribosa, una azúcar de cinco carbonos); ara-furanosilo (también algunas veces referida cómo arabino-furanosilo; de arabinosa, un azúcar de cinco carbonos) ; xilo-furanosilo (de xilosa, un azúcar de cinco carbonos) ; y lixo-furanosilo (de lixosa, un azúcar de cinco carbonos) . Los ejemplos de los derivados del grupo de azúcar incluyen derivados de "desoxi", "ceto", y "dehidro" así como derivados sustituidos. Los ejemplos de los grupos de azúcar tio incluyen los análogos de azufre de los grupos de azúcar anterior en los cuales el anillo de oxigeno está siendo reemplazado con un átomo de azufre. Los ejemplos de los grupos carbocíclicos incluyen grupos carbociclicos C , grupos carbociclicos C5, y grupos carbocíclicos Cd los cuales pueden además tener uno o más sustituyentes, tales como grupos -OH. En una modalidad, Q es un grupo ß-D-ribofuranosilo de la fórmula: en donde R se selecciona del grupo que consiste de fosforilo, fosforamidato y derivados de los mismos, y en donde R2 y R3 son los mismos o diferentes y son independientemente -H o -OH. En algunas modalidades, Ri es un grupo alquenilo, es decir, (-CH=CH) n-R4, en donde n es un entero de 0 a 10, y R4 es un halógeno tal como es 1 o Br", CN" o mercurio; en donde R2 es H y R3 es -OH; en donde R2 es OH y R3 es H; en donde R y R3 son H; o en donde R2 y R3 son OH. En otro aspecto, Ri es un grupo alquenilo, es decir, (-CH=CH) n-R4, en donde n es un entero de 0 a 10, y R4 es o contienen un grupo seleccionado del grupo que consiste de H, un grupo halógeno, alquilo, alqueno, alquino, hidroxi, -O-alquilo, -O-arilo, O-héteroarilo, -S-alquilo, -S-arilo, un cianuro, cianato y halovinilo de tiocianato, un grupo halomercúrico, -S-héteroarilo, -NH2, -NH-alquilo, -N (alquilo) 2 NHCHO, -NHOH, -NHO-alquilo, NH2C0NH0, y NHNH2. En estas modalidades, los aspectos adicionales incluyen: en donde R2 y R3 son H; en donde R2 es OH y R3 es H; en la presente R2 es H y R3 es OH; o en donde R2 y R3 son OH.

Una modalidad preferida del sustituyente en la posición Ri es una que puede experimentar un intercambio alílico como se muestra en la Figura 8. En un aspecto aún adicional, el agente terapéutico candidato es un compuesto de la fórmula: en donde n es un entero de 0 a 10; en donde A es un derivado fosforamida, o un compuesto de la fórmula: O II P — N(CH2CH2CI)2 NH2 y en donde Q se selecciona del grupo que consiste de H, un azúcar no sustituida o sustituida como se define en lo anterior y un carbocíclico sustituido o no sustituido como se define en lo anterior. En una modalidad adicional, los compuestos descritos en lo anterior se modifican mediante Q que tiene la estructura : en donde R7 se selecciona del grupo que consiste de H, fosforilo, fosforamidato y derivados de los mismos, y en donde R2 y R3 son los mismos o diferentes y son independientemente -H o -OH. En una modalidad, R7 no es H. Para estas modalidades, R también pueda tener la estructura - (CH=CH) n~R.. en donde n es un entero de 0 a 10, y R4 se selecciona del grupo que consiste del compuesto H, un halógeno, alquilo, alqueno, alquino, hidroxi, -O-alquilo; -O-arilo, O-héteroarilo, -S-alquilo, -S-arilo, -S-heteroarilo, -NH2, -NH-alquilo, -N (alquilo) 2, -NHCHO, un cianamido, cianamato y halovinilo de tiocianato, un compuesto halomercúrico -NHOH, -NHO-alquilo, NHNH2, y NH2C0NH0- . Adicionalmente, en un aspecto adicional, el agente terapéutico candidato es un compuesto de la fórmula: en donde R=2 ' -desoxi-5-uridilo, m es 0 ó 1, y n es un entero de 0 a 10. Hacia donde lo apropiado, los compuestos pueden estar en cualquiera de sus formas enantioméricas, diasterioméricas, o éstereoisoméricas, incluyendo, por ejemplo, las formas D- o L-, y pueden estar en cualquier configuración estereoquímica incluyendo, por ejemplo, la forma a- o ß- anomérica.

La sintesis de lo anterior observó los nucleosidos de pirimidina 5-sustituidos y monofosfatos nucleosidos de pirimidina 5-sustituidos que pueden ser logrados por métodos que son bien conocido en la técnica. Por ejemplo, el tratamiento de 5-cloromercurio-2 ' -desoxiuridina, con los compuestos haloalquilo, haloacetatos o haloalquenos en presencia de Li2PdCl resulta en la formulación, a través de un organopaladio intermedio, del derivado 5-alquilo, 5-acetilo o 5-alqueno, respectivamente. Wataya, et al. (1979) y Bergstrom, et al. (1981) . Otro ejemplo de la modificación C5 de los nucleosidos de pirimidina y nucleótidos es la formación de los derivados C5-trans-estirilo mediante tratamiento de un nucleótido no protegido con acetato de mercurio por la adición de estireno o estírenos de anillos sustituidos en presencia de Li2PdCl4. Bigge, et al. (1980). Los trifosfatos desoxiribonucleosidos de pirimidina se derivaron con mercurio en la posición 5 del anillo de pirimidina mediante el tratamiento con acetato de mercurio en amortiguados de acetato a 50° durante 3 horas. Dale, et al. (1973) . Tal tratamiento también debe ser previsto para ser efectivo mediante la modificación de monofosfatos; alternativamente un trifosfato modificado puede ser enzimáticamente convertido a un monofosfato modificado, por ejemplo, mediante el tratamiento controlado con fosfatasa alcalina seguida por la purificación de monofosfato. Otras porciones, orgánicas o no orgánicas con propiedades moleculares similares a mercurio pero con propiedades farmacológicas preferidas pueden ser sustituidas. Por métodos generales por síntesis de pirimidinas sustituidas, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,247,544; 4,267,171; y 4,948,882; y Bergstrom et al. (1981). Los métodos anteriores también pueden ser aplicados a la sintesis de derivado de nucleosidos de pirimidina 5-sustituida y nucleótidos que contienen azúcares diferentes a ribosa o 2 ' -desoxiribosa, por ejemplo, 2 ' -3 ' -didesoxiribosa, arabinosa, furanosa, lixosa, pentosa, hexosa, heptosa y piranosa. Un ejemplo de un sustituyente de posición 5 es el grupo halovinilo, por ejemplo, -5- (2-bromovinil) -2 ' -desoxiuridilato. Barr, P. J. et al. (1983) . Este compuesto está sintetizado como se describe en lo siguiente en la sección experimental. Alternativamente, 5-bromodesoxiuridina, 5-yododesoxiuridina, y sus derivado monofosfatos están disponibles comercialmente de Glen Research, Sterling, VA (USA), Sigma-Aldrich Corporation, St., Louis. MO (USA), Moravek Biochemicals, Inc., Brea. CA (USA), ICN, Costa Mesa, CA (USA) y New England Nuclear, Boston, MA (USA) . Comercialmente disponible 5-bromodesoxiuridina y 5-yododesoxiuridina pueden convertirse en su monofosfato ya sea química o enzimáticamente, aunque la acción de una enzima quinasa utilizando reactivos comerciales disponibles de Glen Research, Sterling, VA (USA) e ICN, Costa Mesa, CA (USA) .

Estos derivados de halógeno pueden estar commbinados con otros sustituyentes para crear antimetabolitos novedosos y más potentes . Síntesis General de Compuestos de Clase II En un aspecto adicional, el profármaco contactado con la célula de sobre expresión de timidilato sintasa es un isómero L o D de un compuesto de la fórmula: En la fórmula anterior, R1 es una porción de la fórmula: En la fórmula anterior, R es o contiene una porción conductora de electrón divalente. En una modalidad, R2 es o contiene un conducto de electrón mono- o poli insaturado que actúa para conducir electrones fuera del anillo de pirimidina y hacia el grupo R1 saliente. En una modalidad, R2 se selecciona del grupo que consiste de: un grupo hidrocarbilo insaturado; un grupo hidrocarbilo aromático que comprende uno o más grupos hidrocarbilo insaturados; y un grupo héteroaromático que comprende uno o más grupos hidrocarbilo insaturados. En una modalidad, R2 es un grupo hidrocarbilo insaturado que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste de: En una modalidad, R2 y R3, tomadas juntas forman una estructura seleccionada del grupo que consiste de: En una modalidad, R es un grupo hidrocarbilo aromático que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste de: En una modalidad, R es un grupo héteroaromático que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste de: en donde J es un héteroátomo, tal como -O-, -S-, •Se-, o un grupo héteroátomo, tal como -NH- o -NR'ALQ en donde NRALQ es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, o un grupo cicloalquilo que tienen de 3 a 10 átomos de carbono. En la fórmula anterior, R3 es una porción espaciadora divalente, también referida como una unidad espaciadora. En una modalidad, R3 es una porción espaciadora divalente que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste de: I—CH2 1 \ —CHR5— I l—C(R5)2 O— ^ ^ S ^ i NH í y í NR5— í en donde R5 es la misma o diferente y es independientemente un grupo lineal o ramificado, que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, o un grupo cicloalquilo que tiene de 3 a 10 átomos de carbono. En una modalidad, R3 es una porción espaciadora divalente que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste de: -O— \ —S- -NH- -NRÜ En la fórmula anterior, n es un entero de 0 a 10 y, m es 0 ó 1. En una modalidad, n es un entero de 0 a 10 y, m es 1. En una modalidad, n es 0 y m es 0. En una modalidad, cuando R7 es H, entonces n no es cero. En una modalidad, cuando R7 es -H, entonces m no es cero. En una modalidad, cuando R7 es -H, entonces n no es cero y m no es cero. En una modalidad, cuando R7 es -H, entonces R4 no es un halógeno (es decir, -F, -Cl, -Br, I) . En una modalidad, cuando R7 es -H, y m es cero, entonces R4 no es un halógeno (es decir, -F, -Cl, -Br, -I) . Én una modalidad, cuando R7 es -H, y m es cero y n es cero, entonces R no es un halógeno (es decir, -F, -Cl, -Br, -I) . En la fórmula anterior, R4 es una porción de toxóforo. Como se utiliza en la presente, el término "toxóforo" significa una porción que es o contiene un grupo saliente que es una entidad química que tiene una dimensión molecular y electrofilicidad compatible con extracción del anillo pirimidina mediante timidilato sintasa, y el cual en liberación del anillo de pirimidina por timidilato sintasa, tiene la capacidad de inhibir la proliferación de la célula o destruir la célula. En una modalidad, el toxóforo es o contiene un grupo saliente que está activado o liberado mediante una enzima intracelular sobreexpresada en la célula. En una modalidad, R4 es o contiene un grupo que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste de: O— NH— C— H2 O Z— CF2 — CH2 — CHF— C— OH O l Z— CF2— CHF— CH2— C ll— OH O í; II Z— CF2 — CH2 C— OH CH, O I 3 II \ Z — CF2 — CH C— OH Y I ! Z— CF, — C— Y -Z — CF2 — CH, — CH2 — NO, en donde X es -Cl, -Br, -I, u otro grupo saliente potente (incluyendo, pero no limitado a, -CN, -OCN, y -SCN) ; Y es el mismo o diferente, y es independientemente -H o -F; y Z es el mismo o diferente y es independientemente -O- o -S-. En una modalidad, R4 es o contiene un grupo que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste de: En una modalidad, R4 es o contiene un grupo que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste de: En una modalidad, R es o contiene un grupo que tiene la estructura: O— H—C—NH2 En una modalidad, R4 es o contiene un grupo que tiene la estructura: En una modalidad, R4 es o contiene un grupo que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste de: 0 Z—CF2—CH2—CHF—C—OH 0 > Z__C 2__CHF_CH2 C—OH -Z—CF2—CH2—C—OH CH3 O I II -Z—CF2—CH C—OH En una modalidad, R es o contiene un grupo que tiene la estructura: En una modalidad, R es o contiene un grupo que tiene la estructura: \ Z—CF2—CH2—CH2—N02 En una modalidad, R4 es o contiene un grupo que tiene la estructura: En una modalidad, R es o contiene una entidad química, seleccionada del grupo que consiste de: -Br, -I, -O-alquilo, -O-arilo, O-héteroarilo, -S-alquilo, -S-arilo, -S-héteroarilo, -CN, -OCN, -SCN, -NH2, -NH-alquilo, (alquilo) 2, -NHCHO, -NHOH, -NHO-alquilo, NH2CONHO-, NHNH2, -N3, y un derivado de cis-platina, tal como: En la fórmula anterior, Q es o contiene una porción de azúcar o una porción similar la cual soporta la unión funcional del profármaco a la enzima, por ejemplo, TS o TK. En una modalidad, Q se selecciona del grupo que consiste de: en donde R es el mismo o diferente y es independientemente -H, -OH, -0C(=0)CH3, u otros grupo hidroxilo protegido (incluyendo, pero no limitado a, benzoilo, -COC6H5, y toluoilo, -COC6H4CH3) ; y R7 es hidrógeno, un grupo fosfato, un grupo fosforamidato u otro grupo que contiene fósforo. En una modalidad, Q es: En una modalidad, Q es: En una modalidad, R7 es hidrógeno. En una modalidad, R7 no es hidrógeno. En una modalidad, R7 es un grupo fosfato o un grupo fosforamidato. En una modalidad, R7 es un grupo fosfato o un grupo fosforamidato . En una modalidad, R7 es un grupo fosforamidato . En una modalidad, R7 es un grupo fosforamidato derivado de un aminoácido, incluyendo, por ejemplo, los veinte aminoácidos que se presentan naturalmente. En una modalidad, R7 es un grupo fosforamidato derivado de alanina. En una modalidad, R7 es o contiene un grupo que tiene la estructura : El grupo anterior, y los métodos para su preparación, se describe en McGuigan et al. (1993), y McGuigan et al. (1996). En una modalidad, R7 es un grupo fosforamidato derivado de triptófano. En una modalidad R7 es o contiene un grupo que tiene la estructura: El grupo anterior, y los métodos para su preparación, se describen en Abraham et al., (1996) . En una modalidad, R7 es un grupo fosfato. En una modalidad, R7 es o contiene un grupo que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste de: El primero de los dos grupos anteriores, y los métodos para su preparación, se describe en Freed et al. (1989); Sastry et al., (1992); Farquhar et al. (1994), y Farquhar et al. (1995) . El segundo de los dos grupos anteriores, y los métodos para su preparación, se describe en Valette et al. (1996); y Benzaria et al. (1996). En una modalidad, R7 es o contienen un grupo que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste de (donde R es un sustituyente aromático) : El primero de los dos grupos anteriores, y los métodos para su preparación, se describe en Meier et al. (1997); Meier et al., (1997); y Meier et al., (1997). El segundo de los dos grupos anteriores, y los métodos para su preparación, se describe en Hostetler et al. (1997); y Hostetler et al., Solicitud de Patente Internacional publicada No. WO 96/40088 (1996). En una modalidad, R7 forma un grupo cíclico dentro de Q. Una de tal modalidad, y un método para su preparación, se muestra en lo siguiente (en donde DMTr es 4,4'-dimetoxitritilo, Boc es t-butiloxicarbonilo, DCC es 1,3-diciclohexilcarbodiimida y 4 DMAP es 4-dimetilaminopiridina) : En una modalidad, el compuesto puede estar en cualquier forma enantiomérica, diasteriomérica, o estereoisomérica incluyendo, forma D, forma L, forma a-anomérica, y forma ß-anomérica. En una modalidad, el compuesto puede estar en una forma de sal, o en una forma protegida o de profármaco, o una combinación de los mismos, por ejemplo, como una sal, un éter o un éster. En una modalidad, el profármaco es un compuesto de la fórmula ; En una modalidad , el profármaco es un compuesto de la fórmula: En una modalidad, el profármaco es un compuesto de la fórmula: En una modalidad, el profármaco es un compuesto de la fórmula: En una modalidad, el profármaco es un compuesto de la fórmula: En una modalidad separada, las estructuras anteriores son además modificadas para poseer tiofosfodiaziridina en vez de grupos fosfodiaziridina, utilizando los métodos descritos en lo siguiente. Estra tegia de Síntesis General para los Compuestos de Clase II Las estructuras en la posición 5 de uracilo están referidas como las ataduras debido a que se conectan al grupo saliente propuesto (toxóforo) al héterociclo. En la activación del héterociclo mediante la reacción con cis-195 en TS humano, una carga negativa es conducida desde la posición 6 de uracilo en la atadura. Este mecanismo ha sido descrito por las versiones 5 ' -monofosforilatadas de (E) -5- (bromovinil) -2 ' -desoxiuridina (BVDU) por Barr et al. (1983) y ( E) -5- (3,3, 3-trifluoro-1-propenil) -2 ' -desoxiuridina (TFPe-dUrd) por Wataya et al. (1979), Santi (1980), y Bergstrom et al. (1984) . El "espaciador" de atadura entre la toxina y dNMP deben ser insaturadas de tal forma que pueden conducir la carga negativa de toxina-etiquetada suministrada por el ataque de TS-cis-sulfhidrilo. De las diferentes funcionalidades orgánicas insaturadas disponibles por este propósito, las unidades de vinilo, alilo, y propargilo son simples, pequeñas y son sintéticamente fácilmente accesibles. La unidades de vinilo y alilo tienen la ventaja de que pueden ser preparadas en cualquiera de las dos formas isoméricas geométricas no interconvertibles. De esta manera, pueden ser utilizadas como "sondas" de acomodación de profármaco mediante el sitio activo TS. En otra manera, la unidad de propargilo tiene la ventaja de estar - simétricamente cilindrica, de tal forma que la toxina TS catalizada liberada de este tipo de atadura no depende en su orientación con respecto al anillo uracilo de dUMP, como es el caso con las moléculas vinilo y alilo. Se han tomado dos enfoques distintos para diseñar los profármacos basado en nucleótido de esta invención. Uno está basado en la estructura del monofosfato BVDU y las características de un grupo saliente/toxina directamente unidos a los términos de un sustituyente (poli) vinilo en C5 de dUMP. Este es el enfoque de atadura de vinilo. Estos compuestos se definen en parte como los compuestos "Clase I".

Los otros se basan en la estructura de TFPe-dUMP y es similar al primero pero tiene una unidad metileno que separa el grupo saliente/toxina y la unidad no saturada y así contiene una unidad alilo o propargilo, como se describe en lo siguiente como "Clase II". Este es el método de atadura de alilo. Las estructuras para las versiones de 5'-fosforamidato de cada tipo como se muestra en lo siguiente: Structures for 5'-phosphoramidate versions ofeach type are shown below: El nucleósido activado para dar el producto tóxico (por ejemplo, Toxofuro liberado ataca el dN P modificado) objetivo intracelular Acido nucleico Otro objetivo celular Mitocondria otro objetivo celular pleiotrópico El mecanismo de activación de una versión propargilo de un método de atadura de alilo tiene un precedente en la interacción de 5 ' -monofosfato de 5-etinil-2 ' -desoxiuridina (EdUMP) y 5 ' -monofosfato de 5- (3-hidroxi-l-propinil) -2 'desoxiuridina (HOPdUMP) con TS (Barr et al. 1981, Barr and Robins 1983) . EdUMP es un inhibidor potente de TS (Ki=0.1µM), y probablemente forma unas especies a base de aleño en el sitio activo. HOPdUMP (Ki=3.0µM) muestra cinéticos de inhibición usuales, cuya fuerza es debida a la formación de unas especies a base de cumuleno en el sitio activo. 5, 6-dihidrouracilos de 5-alquilidenatado similares en la estructura al intermedio común para el mecanismo del método de atadura de vinilo y alilo han sido recientemente sintetizadas (Anglada et al. 1996) . Esto muestra ser electrofílicamente elevado. Su reacción disponible con etanol para generar 5- (etoximetil) uracilos es un precedente para la adición de agua que regenera competente TS catalíticamente en el mecanismo mostrado en la Figura 8. Aún más recientemente, la existencia del metileno C5 largo exclusivo intermedio producido por TS se demostró por estudios de atrapado (Barrett et al. (1998)). La síntesis de C5 alcohol propargilico y alílico 2 ' -desoxiuridinas equipadas es directo. Muchos de éstos y sus derivados cercanos se reportan en la literatura y algunos han sido estudiados en relación con TS. Por ejemplo, 5-alquinil-dUMPs que incluye el 5- (3-metoxi-l-propinil) y 5- (3-hidroxi-1-propinil) han sido examinados como inhibidores TS (Barr et al. (1981)) y algunos de éstos han sido mostrados para ser incorporados en el ADN de las células de cáncer de TS deficientes (Balzarini et al. (1985)). Ambos de 5-mercuri- (Ruth et al. (1978)) y 5-yodouridinas (Robins et al. (1981)) fácilmente condensadas con alquenos y alquinos en presencia de un catalizador de paladio para dar C5 de uridinas equipadas con atadura. La ruta mas reciente es la más frecuentemente empleada (Robins et al. (1982)), Asakura y Robins (1988) y (1990)). La condensación de rendimiento elevado de 5-yodo-2'-desoxiuridinas protegidas con éter de propargilo t-butiidimetilsililo (Graham et al. (1998) De Clercq et al. (1983), éter de propargil-metilo (Tolstikov et al. (1997)) y aún el mismo alcohol de propargilo (Chaudhuri et al. (1995) Goodwin et al. (1993)) ha sido lograda. El sustituyente de 3-hidroxi-1-propinilo introducido por la reacción más reciente puede también ser accesada por la reducción DIBAL-H de un grupo metacrilato (Cho et al. (1994)), por sí misma elevada de la reacción Heck utilizada en la síntesis de BVDU . Estas reacciones de paladio catalizadas son tan versátiles que pueden ser utilizadas para condensar ataduras más largas y elaboradamente funcionalizadas a base de propargilo a 5-yodo-2'-desoxiuridinas (Livak et al. (1992) Hobbs (1989)). Las ataduras a base de (Z) -Alilo están generadas por la hidrogenación de un precursor de propargilico sobre catálisis Undiar (Robins y Barr (1983)) mientras que las ataduras a base de (E) alilo son mejor preparadas por el acoplamiento Heck de un etileno ( E) tributilestanilado (Crisp (1989)). Siguiendo con detalle los procedimientos de la literatura, una 2 ' -desoxiuridina 3 ' , 5 ' -di-O-protegida de t-butildimetilsilil propargilo éter equipado (Graham et al. (1998), De Clercq et al. (1983)) se preparó y una porción de esto se convirtió al (Z)-alil éter correspondiente (Robins y Barr (1983) ) . Debido al TBAF medio eliminado de un grupo TBDMS genera un oxianion que corrió para ser funcionalizado in si tu, estos nucleosidos TBDMS-protegidos propargil- y (Z)-alitic-atados servirán como precursores convenientes para algunos de los objetivos toxóforo equipados. Para el nucleósido equipado de alcohol (E) -alílico, el derivado éter O-tetrahidropiranilo conocido se prepara por la literatura del acoplamiento Heck de un etileno (E) -tributilestanilado (Crisp (1989) ) .

Usando un protocolo de literatura de dos pasos (Phelps et al. (1980) Hsiao y Bardos (1981)), se convierten el propargilíco y los alcoholes (E) y (Z) alilicos a sus correspondientes fosforamidatos o tiofosforamidatos de bis-aziridinilo para que el procesamiento de TS de las versiones de 5' -mononucleotidas liberen un metabolito activo de los fármacos TEPA o TioTEPA citostáticos (Dirven et al. (1995)), respectivamente .

Para evitar la inestabilidad hidrolitica potencial de los esteres derivados de los alcoholes propargílicos o alílicos, la porción de ácido carboxilico de toxóforos como ácido 3-nitropropiónico está "enmascarada" mediante la unión de los mismos al alcohol como esteres a, a-difluoro . Para hacer esto, una atadura tioéster de propargilo o alilo es primero preparada mediante el tratamiento del éster normal con el reactivo de Lawesson (Cava and Levinson (1985) ) , y entonces convierte el tioéster al éter a, a-difluoro en una forma estblecida con dihidrogentrifluoruro de tetrabutilamonio (Kuroboshi y Hiya a (1991) y (1994)). La atadura a base de éter a, a-difluoro está entonces condensada con un 5-yodo-2 ' -desoxiuridina protegida como lo usual. Como un éter a,a, -difluoro, el toxóforo enmascarado será estable hasta liberar TS como un fluoruro de acilo reactivo latente. La hidrólisis resultante rápida generará el toxóforo a base de ácido carboxílico in si tu . propargílico propargílico (E)- alílico, o (E)- alílico, o (Z)- alílico (Z)~ alílico Los derivados de éter p-nitrofenilo del CS propargílico y 2 ' -desoxiuridinas equipadas de alcohol (E) y (Z) -alílico proporcionan buenos reactivos para los ensayos de enzima TS in vitro, debido a que la determinación espectrofotométrica, cinética del p-nitrofenol liberado identificará aquellas plataformas dUMP atadas para unir un TS en una forma que permita la fácil liberación catalítica de un grupo saliente del extremo de la atadura. Los éteres p-nitrofenilo necesarios se obtendrán ya sea directamente de los alcoholes por una condensación catalizada base con 4-fluoronitrobenceno o de novo por un acoplamiento Heck de un propargilo p-nitrofenilo apropiado o éter alilo. Los monofosfatos 5' necesarios para el ensayo TS son generados de los nucleosidos ya sea enzimática o químicamente de acuerdo al protocolo 5 ' -monofosforilación regioselectivo bien establecido (Imai et al. (1969)).

Muchas 2 ' -desoxiuridinas 5-sustituidas no son sustratos para TK humano, aunque interesantemente se encontró que 5- (4-hidroxi-l-butinil) -2 ' -desoxiuridina son una excepción (Barr et al. (1981)) . De esta manera, se prevee que alguno de los nucleosidos de toxóforo equipados también poseerán actividad de sustrato TK propicio, y de esta manera serán examinados por actividad contra el crecimiento de célula tumoral. Aún, la preparación de 5 ' -fosforamidas es ahora una materia simple de acuerdo a este procedimiento regioselectivo recientemente desarrollado, y de esta manera las versiones profármaco se preparan y prueban también. Síntesis Combina torial Una forma rápida para lograr un compuesto dirigido es a través del uso de metodologías químicas combinatorias. Debido a que un gran convenio es conocido sobre del mecanismo de acción de la enzima de timidilato sintasa (Schiffer, et al. (1995)), las siguientes publicaciones fueron anticipadas: la entrada celular por el profármaco, la fosforilación del profármaco por la quinasa timidina y la conversión del profármaco (derivado de uridina) para el profármaco activo mediante la timidilato sintasa. Con respecto a la entrada celular, las modificaciones de un nucleótido fosforilado pueden emplearse (véase, por ejemplo, Patentes Norteamericanas No. 5,233,031 y 5,627,165). Además, la fosforilación preferencial del profármaco en las células tumorales se facilita como resultado de la sobre expresión de quinasa timidina en más células tumorales como resultado de la pérdida del gen supresor tumoral (Hengstschlager et al. (1996)). Similarmente, la activación preferencial del profármaco fosforilado o el derivado del fosforamidato ocurrirá en las células tumorales debido a la sobre expresión del timidilato sintasa que acompaña la pérdida supresora tumoral (Li, W., et al. (1995)) y la quimioterapia (Péters, G. J. et al. (1995)). La química combinatorial que señala la posición 5 del anillo uridina (del cual la toxina celular puede ser generada), o la posición 5' del azúcar pentosa (facilita la unión a la timidilato sintasa), acelerará ampliamente el descubrimiento de los compuestos dirigidos por la optimización de la estructura del grupo saliente (toxina celular) del anillo de uridina, así como la facilitación de optimización de un grupo competente de fosforilación en la posición 5' del azúcar pentosa. Para propósitos de filtrado mostrado en las Figuras 3, 4 y 5, la entidad química que está siendo probada será generada por ya sea un químico dirigido de sitio sencillo (Figura 4), o simultáneamente en dos sitios en la molécula (Figura 5) . Junto con el filtrado mostrado en la Figura 3, un sistema potente para el descubrimiento de profármacos que señalan la timidilato sintasa han sido desarrollados. El método químico combinatorial utilizado será similar a aquel descrito en Lam, K. S. (1997) . En una modalidad, los profármacos que proporcionan grupos salientes tóxicos se muestran en la Figura 6. Los sustratos de uridina mostrados en la Figura 6 toman ventaja de la fosforamidasa (presentes en las células) y la timidilato sintasa elevada (TS) en las células tumorales. Como se entiende por aquellos expertos en la técnica, este diseño de fármaco racionalizado puede ser ampliamente aplicado a la síntesis de otros fármacos como se definen la presente. Debe entenderse por aquellos expertos en la técnica que el filtrado mostrado en la Figura 3 puede ser aplicado ampliamente por el descubrimiento de antibióticos. Por ejemplo, la timidilato sintasa de levadura se sustituye por aquel de E. coli en la Figura 4. Esto permitirá que el descubrimiento de los anticuerpos antifúngicos específicos señale los patógenos relacionados de levadura. Además, otras enzimas pueden ser sometidas a este tratamiento. Por ejemplo, los profármacos que señalan específicamente la actividad de reductasa de dihidrofolato de los agentes infecciosos, como Pneumocystis carnii, pueden ser seleccionados. Estos agentes serán seleccionados para especificidad por la enzima objetivo y puede demostrarse no activar la enzima del huésped natural mediante el empleo natural del ensayo de filtrado descrito en la Figura 3. Las construcciones celulares de control contendrán la enzima humana correspondientemente normal para mostrar la falta de toxicidad cuando está presente sólo la enzima humana normal . Los fármacos o agentes de la invención o como se describe en la presente pueden ser producidos más permeables, por ejemplo a través de las membranas celulares y a través de la barrera hemoencefálica, por medio de varias modificaciones químicas. Esto incluiría unir, a su porción de fosfato, de varios grupos funcionales que mejoran la permeabilidad de membrana. Tales grupos funcionales incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,233,031 y 5,627,165; Fries, K.M., et al. (1995) y McGuigan. C, et al. (1984). Ciertos derivado de fosforamidato de disdesoxiuridina (ddU) son activos contra VIH y exitosamente desvían la timidina sinasa. McGuigan, C, et al. (1984). Tales modificaciones químicas también sirven para proteger los derivado de monofosfato de pirimidina sustituida de la acción de fosfatasas celulares y extracelulares. Mientras los derivados de mercurio o halógeno pueden ser efectivos, se esperará que las modificaciones que liberen los compuestos de alquilación o antimetabólicos serán preferidos. Una modalidad preferida se muestra en la Figura Derivado de los Compuestos de la Clase I y II Sales, esteres, y éteres de los compuestos anteriores descritos en la presente también están dentro del alcance de esta invención. Las sales de los profármacos de la presente invención pueden derivarse de bases y ácidos orgánicos o inorgánicos. Los ejemplos de ácidos incluyen ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicíclico, succínico, toluen-p-sulfónico, tartárico, acético, cítrico, metansulfónico, etansulfónico, fórmico, benzoico, malónico, naftalen-2-sulfónico y benzensulfónico. Otros ácidos tales como el oxálico, mientras no son ellos mismos farmacéuticamente aceptables, pueden ser empleados en la preparación de sales útiles como intermediatos en la obtención de los compuestos de la invención y sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de bases incluyen hidroxilato de metal álcali (por ejemplo, sodio), hidroxilato de metal alcalinotérreo (e.g., magnesio), amoníaco, y compuestos de la fórmula NW+, en donde W es C, 4 es alquilo de C?_4. Los ejemplos de sales incluyen: el acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzensulfonato, bisulfato, butirato, citrato, camforato, camforsulfonato, ciclopentanpropionato, digluconato, dodeciisulfato, etansulfonato, fumarato, flucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, 2-hidroxietansulfonato, lactato, maleato, metansulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Otros ejemplos de sales incluyen aniones de los compuestos de la presente invención compuestos con un catión adecuado tal como Na+, NH+, y NW4~ (en donde es un grupo alquilo de C?_ ) . Para el uso terapéutico, las sales de los compuestos de la presente invención serán farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, las sales de los ácidos y bases los cuales no son farmacéuticamente aceptables pueden también encontrar uso, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable. Los esteres de los profármacos o compuestos identificados por el método de esta invención incluyen esteres de ácido carboxilico (es decir, -0-C(=0)R) obtenido por esterificación de los grupos 2'-, 3'- y/o 5 '-hidroxi, en el cual R se selecciona de (1) alquilo de cadena lineal o ramificada (por ejemplo, n-propilo, t-butilo, o n-butilo), alcoxialquilo (por ejemplo, metoximetilo) , aralquilo (por ejemplo, bencilo), ariloxialquilo (por ejemplo, fenoximetilo), arilo (por ejemplo, fenilo opcionalmente sustituido por, por ejemplo, halógeno, alquilo de C?_4, o alcoxi de C?_ o amino) ; (2) esteres de sulfonato, tales como alquilosulfonilo (por ejemplo, metansulfonilo) o aralquilsulfonilo; (3) esteres de aminoácido (por ejemplo, L-valilo o L-isoleucilo) ; (4) esteres de fosfonato y (5) esteres de mono, di o trifosfato. Los esteres de fosfato pueden ser además esterificados por, por ejemplo, un alcohol de C?_2o o derivado reactivo del mismo, o mediante un glicerol 2, 3-di- (C6_2 ) acilo. En tales esteres, a menos que se especifique de otra manera, cualquier porción alquilo presente contiene ventajosamente de 1 a 18 átomos de carbono, particularmente de 1 a 6 átomos de carbono, más particularmente de 1 a 4 átomos de carbono. Cualquier porción de cicloalquilo presente en tales esteres ventajosamente contienen de 3 a 6 átomos de carbono. Cualquier porción de arilo presente en tales esteres ventajosamente comprende un grupo fenilo. Los ejemplos de los derivados de profármaco de lixo-furanosilo de la presente invención incluyen, por ejemplo, aquellos con grupos hidroxilo químicamente protegidos (por ejemplo, grupos con O-acetilo) , tales como 2 ' -O-acetil-lixo-furanosilo; 3 ' -0-acetil-lixo-furanosilo; 5'-O-acetil-lixo-furanosilo; 2 ', 3 ' -di-O-acetil-lixo-furanosilo y 2 ' , 3 ' , 5 ' -tri-O-acetil-lixo-furanosilo. Los éteres de los compuestos de la presente invención incluyen esteres de metilo, etilo, propilo, butilo, isobutilo, y c-butilo. En una modalidad adicional, el sustrato no puede ser químicamente relacionado a pirimidinas o folatos, sino sintetizados basados en los parámetros conocidos del diseño de fármaco racional. Véase Dunn, W. J. et al. (1996) . Los ensayos químicos para los productos, por ejemplo, donde un de reacción es un anti-metabolito de los derivados de bromovinilo de dUMP, se describen en los Ejemplos proporcionados siguientes o por Barr, P. J. et al. (1983) . Aplicación de Diagnóstico Otro aspecto de la presente invención concierne a los métodos para filtrado por un agente terapéutico, que comprende contactar una célula objetivo con un compuesto profármaco de esta invención.

En la modalidad, el profármaco es un compuesto del grupo de la Clase II, como se describe en lo siguiente, en donde R4 es: cuya célula objetivo favorece la incorporación del compuesto en la célula objetivo, para el propósito de diagnóstico de los niveles intracelulares de detección de la timidilato sintasa . EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se dirijen específicamente a la enzima objetivo TS . Es aparente para aquellos expertos en la técnica que los siguientes métodos pueden ser modificados por la descripción de otros profármacos a las enzimas objetivo como se define en la presente, o utilizadas como un control en el descubrimiento de otros profármacos para TS y otras enzimas intracelulares. Síntesis de Piro fármacos Un derivado de fosforamidato de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (5-FUdR) , y (E) -5- (2-bromovinil) -2 ' -desoxiuridina (BVDU) y un derivado de fosforamidato de BVDU se sintetizaron. BVDU se preparó de 2 ' -desoxiuridina de acuerdo a un procedimiento literario (Dyer, et al. (1991)). De acuerdo a los métodos estándares, esto primero fue protegido en la posición 05' con un grupo dimetoxitritilo (DMTr) y entonces en la posición 03' con un grupo ter-butildimetilsililo (TBDMS), y entonces el grupo 5 ' -O-DMTr se eliminó por tratamiento con ácido, (véase lo siguiente) .

Los nucleosidos 3 ' -O-TBDMS-protegidos de esta manera obtenidos se hacen reaccionar con fosforoclorhidato de L-metoxialaninilo de fenilo (PMPC) McGuigan, et al. (1992)) para dar el BVDU-PA 3 ' -O-TBDMS-protegido. Sin embargo, inesperadamente, la funcionalidad de fosforamidato se encontró para ser inestable a las condiciones de desililación muy suave del fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF) en gel de sílice, por la espectroscopia (RMN) resonancia magnética nuclear 1H . Esta observación de una sensitividad a las condiciones suavemente básicas proporcionan una explicación posible que, excepto por un arabinonucleosido (McGuigan. et al. (1998)), todos los derivados 5 ' -fosforamidato de nucleosidos reportados a la fecha tienen carencias de una funcionalidad del grupo 3 '-hidroxi (véase por ejemplo, McGuigan, et al. (1996); McGuigan, et al. (1993); McGuigan, et al. (1994), Balzarini, et al. (1997), Balzarini, et al. (1996)). ün método sintético novedoso se desarrolló para resolver este problema. Para sintetizar (E) -5- (Bromovinilo) -2 ' -desoxi-5 ' -uridil fenil L-alaninilfosforamidato (BVDU-PA) , una solución de BVDU (420 mg, 1.26 mmoles) en 2 mL de DMF anhidro bajo argón se trató con imidazol (103 mg, 1.51 mmoles) y después por goteo con fosforoclorhidrato de L-metoxialaninilo de fenilo (350 mg, 1.26 mmoles (McGuigan. et al. (1992)). La mezcla de reacción se agitó a 23°C bajo argón durante 24 horas. Por TLC en un gel de sílice utilizando 10% de metanol en diclorometano como eluyente, la generación de BVDU-PA (Rf 0.70) de BVDU (Rf 0.53) ha ocurrido, pero sólo a un grado parcial (ca. 15%), asi imidazol adicional (52 mg, 0.75 mmol) y reactivo PMPC (175 mg, 0.63 mmol) se agrega y la mezcla agitada nuevamente a 23 °C bajo argón durante 12 horas. Por TLC, el progreso de la reacción estuvo aún incrementado (ca. 30% completo) . La solución se redujo en volumen a 0.75 mL por evaporación giratoria y entonces se diluyó con un volumen igual de diclorometano y se aplicó directamente a la placa de Cromatroton de gel de sílice de 4 mm. La cromatografía radial utilizando 250 mL de diclorometano a DMF residual eluyente seguido por 10% de metanol en diclorometano para el producto eluyente y el material inicial da 144 mg (20%) de BVDU-PA y 294 mg de BVDU sin reaccionar, durante un rendimiento al 67% de BVDU-PA basado en el material inicial no recubierto. Si el espectro de 1H RMN del producto reveló la presencia de imidazol (d 7.65 y 7.01) o DMF (d 7.95, 2.89, y 2.73), se realizó una purificación de cromatigrafía radial inicial. En esta forma, BVDU-PA con una pureza de por lo menos 98% por TLC y 1H RMN se obtuvo como un aceite o un polvo espumoso. 1H RMN ((CD3)2SO) d 11.4 (s amplio, intercambio con D20, 1, 3'0H). 8.28 (t, 1, H6), 7.35 (m, 2, Ph) , 7.31 (d, 1, vinilo ÍH) , 7.20 (m, 3, Ph) , 6.89 (d, 1, vinilo 2H) , 6.19 (pseudo-t, 1, Hl ' ) , 6.08 (t, intercambio con D20, 1, alaninilo NH) . 5.45 (s amplio, intercambio con D20, 1.3 OH), 4.32 ( , 1, H4 ' ) , 4.22 (m, 2, 5'CH2), 3.97 (m, 1, H3 ' ) . 3.86 (t, 1, alaninilo CH) , 3.58 (s, 3, C02Me) , 2.15 (m, 2, 2'CH2), 1.23 (t, 3, alaninilo CH3) , JVinii CH-VÍ?ÍICH = 13.5, JHI'-H2'~6.8 , J H2'-H3'~5, J H3--H4'~0, alaCH-Ala-NH3 NH~6Hz. ^/^ COSY 2D RMN confirmación de espectroscopia proporcionada de las asignaciones espectrales . En una forma similar, se obtuvo, 5-Fluoro-2 ' -desoxi- 5 ' -uridil fenil L-a.laninilf osforamidato (5FUdR-PA) , se obtuvo en una pureza de por lo menos 98%, por TLC y 1H RMN. 1H RMN ( (CD3)2SO) d 11.9 (s amplio, intercambio con D20, 1, N3H) , 7.88 (t, 1, H6) , 7.36 (m, 2, Ph) , 7.19 (m, 3, Ph) , 6.15 (pseudp-t, 1, Hl ' ) , 6.07 (t, intercambio con D20, 1, alaninilo NH) , 5.42 (s amplio, intercambio con D20, 1, 3 'OH) , 4.21 (m, 3, H4' y 5'CH2), 3.98 (m, 1, H3 ' ) , 3.84 (t, 1, alaninilo CH) , 3.58 (s, 3, C02Me) , 2.08 (m, 2, 2'CH2) , 1.22 (t, 3, alaninilo CH3) , JH6-5F=7.1, JHI?-H2'~5.2, JH2'-H3'~2, JH3'-H4'~0, Jalaninilo CH-alaninilo NH~ß HZ. ^ ^H COSY 2D RMN confirmación de espectroscopia proporcionada de las asignaciones espectrales. Espectro de masa de baja resolución (DCI-NH3), m/z 505 (MNH4+) , 488 (MH+) . Se razonó que la condensación directa de un 2 ' -desoxiribonucleosido no protegido con poder de PMPC muy bien provenido para dar el fosforamidato deseado y en una forma de 5 ' -O-regioselectivo si se condujo en ausencia de base pero la presencia de un trapero para el HCl. Sino BVDU y 5FUdR condensados con el reactivo McGuigan en presencia de imidazol en solución de DMF anhídrida para dar el BVDU-PA deseado y 5FUdR-PA, respectivamente (véase lo siguiente) . Las condiciones de reacción no han sido optimizadas, y aunque las reacciones no proceden al complemento, la mezcla del producto fácilmente separable en ambos casos consiste ampliamente en únicamente el producto deseado y el material inicial, mediante cromatografía de capa delgada (TLC) . El esquema sintético se resumen en lo siguiente. imidazol „ DMF, 23°C BVDU BVDU-PA imidazol DMF, 23°C 5FUdR 5FUdR-PA (E) -5- (Bromovinil) -2 ' -desoxi-5 ' -uridil fenil L-alaninilfosforamidato (BVDU-PA) . Monitorear TLC (10% de metanol en diclorometano como eluyente) reveló la producción de BVDU-PA (Rf 0.70) de BVDU (Rf 0.53). En esta forma, el BVDU-PA se obtuvo en una pureza de por lo menos 98%, por TLC y XH RMN. XH RMN ((CD3)2SO). Un espectro ^?/3!. COSY 2D RMN confirmó las asignaciones espectrales. El espectro de masa de baja resolución mediante ionización química directa (DCI) utilizando NH3, m/z 593/591 (M-NH4+), 576/574 (M-H+). 5-Fluoro-2 ' -desoxi-5 ' -uridil fenil L-alaninil fosforamidato (5FudR-PA) . En una forma similar, 5FudR-PA se obtuvo en una pureza de por lo menos 98%, por TLC y 1H RMN. Espectro de 1H RMN ((CD3)2SO). Un espectro 1H/1H COSY 2D RMN confirmó las asignaciones espectrales. El espectro de masa de baja resolución (DC1-NH3) , m/z 505 (M-NH4+), 488 (M-H+). De esta manera, un aspecto de la invención pertenece a los métodos de preparación de un 2'-desoxi, 3'-hidroxi, 5 ' -fosforamidato de un nucleosido de furanosilo, cuyos métodos involucran hacer reaccionar un nucleosido furanosilo no protegido que es 2'-desoxi, 3 '-hidroxi, y 5'-hidroxi, con un fosforoclorhidrato en presencia de un trapero HCl. En una modalidad, el fosforoclorhidrato comprende un fósforo sustituyente que se deriva de un aminoácido tal como alanina. En una modalidad, el fosforoclorhidrato es L-metoxialanina fosforoclorhidrato. De esta manera, en una modalidad adicional, la presente invención pertenece a un método de formación de un compuesto de la fórmula: en donde "Base" indica una base de ácido nucleico (tal como uracilo, timina, citosina, adenina, o guanina, pero de manera preferible uracilo, o un derivado del mismo) ; cuyo método comprende la etapa de hacer reaccionar un compuesto de la fórmula : con un compuesto de la fórmula: en la presencia de un trapero de HCl . En una modalidad, el nucleosido de furanosilo es un nucleosido de uridina. En otra modalidad, el nucleosido de furanosilo es un nucleosido de ribofuranosilo de uridina. En otra modalidad, el nucleosido del furanosilo es un nucleosido de ß-D-ribofuranosilo de uridina. De esta manera, en una modalidad, la presente invención pertenece a un método de formación de un compuesto de la fórmula: en donde R1 es un sustituyente (incluyendo, por ejemplo, aquellos descritos en lo anterior por R1) ; cuyo método comprende la etapa de hacer reaccionar un compuesto de la fórmula: con un compuesto de la fórmula: CH3 en la presencia de un trapero HCl. En una modalidad, la reacción se realizó en ausencia de la base, pero en presencia de un trapero HCl, tal como imidazol. En una modalidad alternativa, la reacción se lleva a cabo en un medio no acuoso. En otra modalidad, la reacción se llevo a cabo en un medio no acuoso que comprende dimetilformamida anhidrida (DMF) . Ensayo Químico y Base Celular Dos líneas celulares H630R10 (Copur, et al. (1995)) y células epiteliales de colon normal. CCD18co (ATCC) se utilizaron en estos ensayos. La linea celular H630P (Copur et al. (1995)) se seleccionó por resistencia a lOµM 5-FU para dar elevación a H630R10. La caracterización de estas lineas celulares que expresan un nivel elevado de una enzima TS . Un tipo de célula epitelial de colon normal CCD1 8co (disponible de ATCC) se utilizó para la comparación con H630R10 por sensibilidad a los compuestos de prueba. Las lineas celulares expresan pl85-HER2 o solo el marcador de neomicina se preparó como se describe por Pegram et al. (1997) muestra que H630R y H630R10 expresa 10 veces la enzima de timidilato sintasa incrementada como se comparó con CCD ldco como se determinó por análisis de tinción Western. La capacidad de los compuestos de prueba para bloquear la proliferación de células se determinó por el procedimiento violeta de cristal (Sugarman et al. (1985) y Antelman et al. (1995)). Los compuestos se disolvieron en sulfóxido de dimetilo a una concentración de ÍM. Además se dilyeron como fue necesario en un medio de cultivo de célula DMEM y subsecuentemente en los primeros pozos de la placa de macrotitulo de 96 pozos. Cada concentración se probó en triplicado en la línea celular objeto. Las concentraciones del compuesto de 1 µM a 3000 µM se probaron. Las células se incubaron con el compuesto durante 72 horas, las placas se lavaron, y las células fijadas con metanol y manchadas con violeta de metilo como se describe en Sugarman et al. (1995) y Antelman, et al. (1995) . Análisis de Tinción Western de Niveles TS en Líneas Celulares Los experimentos de tinción Western se realizaron con un tipo de célula epitelial de colon normal humano CCD 18co (obtenida de ATCC, Manassas, VA) , línea celular de adenocarcinoma de colon H630R10 (obtenida de Dr. S. Copur, Yale University) , y líneas celulares de cáncer de mama HER2-transfectadas (Pegram et al. (1997)) . Las células se lisaron en amortiguador RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5% Tritón X 100, 0.1% SDS y ácido desoxiclórico a 10.5%, sal de sodio e inhibidores de proteasa) . Las concentraciones de proteína se determinan mediante la utilización del equipo de ensayo de proteína BCA 200 (obtenida de Pierce, Rockford, IL) . Se resolvieron 10 µg de proteina de cada linea celular por 12% SDS-PAGE. Las proteínas separadas se transfirieron en membrana de PVDF (obtenidas de Amersham, England) , seguidas por inmunotinción con anticuerpo primario monoclonal de timidilato sintasa humano y anticuerpo monoclonal de antitubulina (fabricada por NeoMarkers, Fremont, CA) . La peroxidasa de rábano picante unidos a antiratón de oveja Ig se usó como anticuerpo secundario (Amersham) . El ECL más equipo (Amersham) se utilizó para la detección de la inmunoreactividad. Las bases correspondientes a la timidilato sintasa se calificaron y normalizaron para aquella de tubulina mediante análisis de imagen (Tormenta de la Dinámica Molecular) . Análisis de RT-PCR de ARNm de TS en Líneas Cel ulares El nivel de expresión de los transcriptores de timidilato sintasa humano en diferentes líneas celulares se cuantificaron mediante la utilizanción de RT-PCR. Los cebadores de oligonucleótido para la amplificación de la timidilato sintasa humana y B-actina se diseñaron como sigue: cebador 5 ' -GGGCAGATCCAACACATCC-3 ' de sentido de timidilato sintasa (correspondiente a las bases 208-226 dé la secuencia de ADNc de timidilato sintasa, Genbank Accession No. X02308), el cebador de antisentido 5 ' -GGTCAACTCCCTGTCCTGAA-3 ' (correspondiente a las bases 564-583), el cebador 5'- GCCAACACAGTGCTGTCTG-3 ' de sentido de ß-actina (correspondiente a las bases 2643-2661 de la secuencia de gen ß-actina, Genbank no. M10277) y cebador 5'- CTCCTGCTTGCTGATCCAC-3 ' de antisentido (correspondiente a las bases 2937-2955) . Los ARN totales se aislaron de las células CCD 18co y H630R10 utilizando el miniequipo Rneasy (obtenido de Qiagen, Valencia, CA) . Para monitorear la posible contaminación de ADN, los cebadores para la amplificación de ß-actina se diseñaron a intervalo de la unión de exon4/intron5/exon5. La plantilla ADN genómica dirije a 313 pb de fragmentos de ß-actina, y plantilla de ADNc generó un producto de 210 pb. Las reacciones de transcripción inversas se realizaron, utilizando el sistema de preamplificación SuperScript (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) . Se aplicó 3µg total de ARN en un volumen de amortiguador de 20 µL para conducir la reacción de transcripción inversa, seguido por el protocolo del fabricante. Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 48 µL que contienen 3 µL de la mezcla de ADNc a aprtir de la reacción de transcripción inversa, 3 mM MgCl2, 50 mM KCl, 20 mM Tris Cl, pH 8.4 , 0.2 M de cada uno de dNTP, 0.4 µM cebadores de sentido y antisentido de timidilato sintasa y 3 unidades de polimerasa de ADN Tag (obtenidas de Promega, Madison, Wl) . La mezcla de reacción se incubó a 94°C durante 3 minutos, seguidos por 10 ciclos de 1 minuto de incubación a 9 °C, un minuto de incubación a 58 °C, y después 1 minuto de incubación a 72 °C. Después de 10 ciclos, los cebadores de ß-actina humana en 2 µL se agregaron para lograr una concentración final de 0.2 µM, llevando el volumen de reacción final a 50 µL. Se continuó la reacción de PCR a un total de 28 ciclos, seguidos por una incubación de 7 minutos a 72°C. 5µl de productos de PCR se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa al 2%, seguida por tinción con tinción en gel de ácido nucleico SYBR Gold (obtenido de Molecular Probes, Eugene, OR) . Las bandas de ADN que corresponden a la timidilato sintasa se cuantificaron y normalizaron para aquellas de ß-actina por Molecular Dynamic Storm.

Análisis de Tinción Northern Se obtuvieron tinciones Northern de Invitrogen (Carlsbad, CA) e hibridizado a un sonda clonada de TS con ADNc. Las señales de hibrididización se normalizaron vs . Proteína ribosomal S9 como un transcriptor casero. Se considero un tumor para sobreexpresar el TS ARNm si la señal normalizada se mejoraba al menos 2 veces comparada con el control de tejido normal. Clonación, Expresión y Purificación de la Timidilato Sintasa Humana Se construyó un vector de expresión plásmido de E. coli para la timidilato sintasa humana (TS) usando un TS ADNc en pGCHTS humano modificado. Este clon, obtenido del Dr., Dan Santi, contiene la estructura de lectura abierta completa para la TS humana. Para la expresión en E. coli frío el TS ORF humano completo se subclonó dentro del T7 promotor del vector de expresión pET28a (Novagen Inc.) . El vector plásmido resultante codifica la síntesis de TS humana como una proteína de fusión recombinante con un sitio de desdoblamiento de seis histidinas seguido por una trombina. Esta proteina de fusión agrega un total de 20 aminoácidos extras al término amino de TS humana. Para producir la proteína recombinante, el vector de expresión TS humano se introdujo dentro de la cepa BL21(DE3), de E. Coli , una cepa con el gen polimerasa T7 ARN insertado dentro del cromosoma bajo el control del operador lac. La proteína de fusión TS-poli-His humana se purificó usando uan resina de afinidad quelante de metal (Novagen Inc.) . La purificación de la proteína fue seguida por electroforesis sobre geles de poliacrilamida al 10% de SDS. Las concentraciones de la proteína se determinaron usando la prueba de proteína Pierce BCA. Aproximadamente se recuperaron 10 mg de proteína de fusión TS humana de 500 ml de un cultivo de E. coli . Cuando se visualizó con tinción de plata solamente la banda que corresponde a la TS humana fue aparente. La identidad de la banda de TS humana se confirmó realizando una tinción Western con el anticuerpo monoclonal anti TS TS106 (NeoMarkers) . Prueba de la Actividad Enzimática de Timidilato Sintasa La actividad de TS se midió usando la prueba espectrofoto étrica de Wahba y Friedkin (1961) . En esta prueba, la actividad de TS se monitoreo midiendo el aumento en la absorbencia a 340 nm que se presenta cuando el co-factor 5, 10 metilen tetrahidrofolato se oxida a dihidrofolato a medida que dUTP se convierte en dTTP. La enzima preparada por este método tiene una actividad específica de 0.5-0.65 unidades/mg de proteína. Una unidad se define como la producción de un micromol de dTNP por minuto. Este valor es similar al reportado por Pedersen-Lane et al (1997) . Resultados experimentales Estos resultados establecen la factibilidad de utilizar timidilato sintasa como un generador de citotoxina en células de tumor. En esta prueba se emplearon, células CCDldco (epitelio normal de colon) , y H630R10, un derivado de H630P el cual expresa varias veces más timidilato sintasa.

(Copur et al. (1995)) se realizó y normalizó entre muestras un análisis de tinción western de los niveles de proteína TS en cada tipo de célula por comparación con el anticuerpo dirigido vs . tubulina humana (Tabla 5) . Se obtuvo un orden de clasificación de H630R10 (13x) y CCDldco (lx) . También se realizó la comparación de los niveles ARNm entre líneas celulares según se determinado por RT PCR. Ver Tabla 5. Similarmente al análisis de tinción western, el orden de clasificación fue H630R10 (24x) y CCD18co (lx), cuando se normalizó vs . una ß-actina RT-PCR estándar.

La Expresión del Protooncógeno HER2 Aumenta los Niveles de TS en las Células de Tumor Los niveles de expresión TS en células de neomicina y carcinoma de mama humano HER2/neu transfectado se valoró usando técnicas de inmunotinción. Los resultados (ver Figura 7) demostraron un aumento en la expresión de TS después de la transfección y sobreexpresión del HER2/neu ADNC humanos. Se obtuvieron resultados similares con células de carcinoma de ovario humano HER-2/neu-transfectado. Las líneas celulares MCF7/HER2 y MCF7/neo son células objetivo para las pruebas de esta invención debido a que la inducción de TS es más pronunciada (aproximadamente 20 veces) en éstos tipos de célula . La fluoropirimidina, 5 FUdR, inhibe el crecimiento celular por medios de mecanismos similares al 5-FU. Esto incluye efectos citotóxicos que resultan de la incorporación dentro del ácido nucleico, así como la inhibición de la actividad enzimática de TS (Goodman y Gilman (1996)). Se espera por lo tanto que las células que expresan niveles más altos de TS serán frecuentemente más resistentes (tiene un mayor IC50) que las células que expresan cantidades menores de la enzima. La Tabla 6 (Línea 1) demuestra que éste es el resultado obtenido. Además, como se esperaba de un trabajo anterior, BVDU tiene poca actividad en la prueba (Tabla 6; línea 2) . Esto resulta presumiblemente de la inhabilidad de BVDU a ser monofosforilado por la timidin quinasa humana, un requerimiento para el enlace a la timidilato sintasa (Balzarini et al. (1967), Balzarini et al. (1993), Carreras y Santi (1995)) . No existe diferencia significativa en sensibilidad de la dos líneas celulares al BVDU. La activación del BVDU se presenta con la fosforamidación del 5 '-hidroxilo de la porción de ribosa. BVDU-PA (Tabla 6, linea 3) tiene más de 10 veces mayor actividad sobre la expresión más alta de la línea celulares H630R10 que sobre las células CCDldco. 1 Error estándar menor del 20% Estas dos líneas celulares se compararon entonces con respecto a la sensibilidad al 5FUdR, y el derivado fosforamidato de BVDU. Debido a que BVDU (BVDU-PA) inhibe el crecimiento celular por medio del mismo mecanismo de 5FU, se espera que CCDldco será más sensibles (tiene un IC-50 más bajo) que H630R10, puesto que la última línea de células tiene un nivel intracelular más alto de timidilato sintasa. Los datos presentados en la Tabla 7 demuestran que éste es el resultado obtenido, usando la prueba de violeta de metilo, descrito anteriormente. Este resultado también ilustra uno de los problemas clave con la quimioterapéutica de cáncer actual, es decir que frecuentemente son más tóxicos a las células normales que a las células cancerosas. Los datos que se muestran en la Tabla 7 muestran que las células de epitelio de colon normal (CCD18co; IC-50=9.5 µM) son aproximadamente 18 veces más sensibles al 5FUdR que es lo que son las células de tumor de colon H630-R10 (IC-50 = 169.8). El sustrato profármaco, BVDU-PA, sin embargo, revierte esta relación. En el BVDU-PA el cual se convierte por la TS en porciones citotóxicas, es aproximadamente 13 veces más potente sobre la alta expresión de TS de célula H630R10 (IC50 = 216.7) que sobre el tipo de células de colon normal (IC50 = 2810.2) . 1. Datos representativos de varios pruebas. 2. Prueba realizada con pozos por triplicado a cada concentración. El error estándar es menor del 20%.

Este resultado se confirma usando la prueba de Alamar Blue Assay (comercialmente disponible de ACCUMED Int., West Lake OH) . Los datos de la Tabla 8, posterior muestran que aún 5-FU no tiene propiedades selectivas que lo hacen tóxico a las células de tumor y normales.

X=0 .57 µM X=4.10 µM Un prueba adicional de esta invención requiere que los fármacos candidatos al ser selecionados en las mezclas de reacción que contienen timidilato sintasa humana con y sin N5N10 metilentetrahidrofolato, y el profármaco candidato. El grupo saliente del profáramaco del candidato (por ejemplo en la posición 5 pirimidina) se marca, por ejemplo, con tritio usando métodos bien conocidos en la técnica. El sustrato control- se marca similarmente (por ejemplo 5~3H) dUMP . Bajo las mismas condiciones de reacción. Las pruebas se hacen similarmente a la descripción provista en Carreras, C.W. y Santi, D.V. (1995), y las referencias citadas en la presente. La timidin sintasa humana puede purificarse de E. coli que contiene la timidilato sintasa humana expresada. Ver Davisson, V. J. et al., (1989) y Davisson. V. J. et al. (1994). Esta enfoque proporciona una prueba escalable capaz de seleccionar grandes números de compuestos candidato. Determinación de los Productos Intracelulares de Metabolismo de Profármaco por TS Es importante determinar los productos intracelulares del metabolismo de proflármaco por TS para sustanciar los mecanismos propuesto de activación y acción y para definir agentes que son candidatos terapéuticos . Una vista aceptable del metabolismo intracelular de arilfosfodiéster arilatos involucra la conversión enzimática en un ácido carboxilico, transposición intramolecular del fosfomonoéster amidato en un 5 ' -monofosforil nucleosido (Valette et al. (1996)). Sin embargo, es improbable que este mecanismo describa el procesamiento intracélular de todos los pronucleotidos a base de fosforoamidato. Por ejemplo, se propuso un mecanismo diferente para el procesamiento de aril fosfomonoéster amidato, que involucra la conversión directa simple del fosforamidato a las especies de monofosfato por un fosforamidato hidrólato (Mclntee et al. (1997) y Fries et al. (1995)) . Independientemente del mecanismo para enmascarar el nucleosido monofosfatado, esta prueba detecta los productos de la conversión TS del monofosfato intracelular en los compuestos citotóxicos dentro de la célula. Los productos propuestos de la reacción de los compuestos profármaco con TS se muestran en la Figura 8. Para lograr esta tarea, las células se incuban con una cantidad de compuesto profármaco que induce 50% de inhibición del crecimiento de lineas celulares que expresan alto TS (en la prueba .72H supra) . Se usan células expresoras de alto y bajo TS (por ejemplo, CCDldco vs . H630R10) . Se realizan estudios de curso de tiempo en los cuales las células tratadas se procesan de acuerdo al método descrito por Mclntee et al. (1997) . Las células se lisan con 60% de metanol en agua a -20°C, y el residuo particulado se elimina por centrifugación. Los sobrenadantes se secan y almacenan a -20°C. Las alícuotas se evalúan inicialmente por RP-HPLC y después por LC-EMS para documentar la conversión intracelular del fosforamidato en el monofosfato y también asegurar la transformación del monofosfato por la timidilato sintasa. Documentación de la Actividad de Sustrato Utilizando Timidilato Sintasa Purificada Esta prueba determina las actividades especificas de las futuras preparaciones de enzima TS, para asegurar la actividad de tales preparaciones durante el tiempo, y para determinar si los compuestos seleccionados para actividad adecuada inactivan la enzima TS bajo condiciones de reacción in vitro . Para determinar qué productos de reacción se producen cuando los compuestos profármaco se incuban junto con la enzima TS recombinante purificada, se usan condiciones similares a aquéllas empleadas con la prueba de actividad TS para generar los productos de reacción in vi tro . Estos productos de reacción se analizan después por espectrometría de masas-GC para identificar las moléculas actuales formadas. Estudios de Eficiencia In Vivo 1. Líneas celulares y cultivo celular. Se obtuvieron líneas celulares de mama MCF7/NE0 y MCF7/HER-2 transfectadas del Dr. Dennis Slamon (UCLA) .• Las células de carcinoma de mama humana MCF7/HER-2-transfectado así como otras líneas celulares HER-2/neu-transfectado demostraron un aumento en la expresión de TS (Pegram et al. (1997)). Así, además de CCDldco y H630R10, estas líneas son adecuadas para probar la respuesta diferencial al profármaco. Las respuestas diferenciales se confirman primero in vitro por células MCF7/NE0 y MCF7/HER-2 para 5-FUdR y BVDU-PA usando la misma propuesta experimental in vi tro descrita anteriormente. La líneas celulares de tumor HT1080 del Dr. Bertino (Banerjee et al. (1998)) se caracterizan similarmente . 2. Modelo de Xenoinjerto para Prueba de los Compuestos Profármaco Las células de mama KMCF7/HER-2 forman xenoinjertos en ratones atimicos con alta eficiencia y sus propiedades de crecimiento han sido completamente caracterizadas (Pegram et al. (1997) ) . Las propiedades de crecimiento de este modelo de xenoinjerto son tan uniformes que se ha desarrollado un modelo por computadora, qué puede predecir la trayectoria de crecimiento de estos tumores después del tratamiento con diferentes combinaciones de fármacos, por la Dr. Angela López y Dr. Elliot Landau en el Departamento de Biomatemáticas en la Escuela de Medicina de UCLA (López, et al. emisión pendiente) . Debido a la uniformidad y reproducibilidad de este modelo, se ha vuelto muy útil en la prueba preclinica de terapéuticos experimentales novedosos. Por ejemplo, este modelo forma la base del análisis preliminar in vivo del fármaco Herceptin® el cual ha sido recientemente aprobado por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos para el tratamiento del cáncer de mama metastásico (Pegram, et al. (1998)) . La lineas celulares de tumor de colon (HT1080/NEO y HT1080/E2F1.1) han demostrado tumorigenicidad (Banerjee et al. (1998)). Las líneas celulares transformadas Ras NIH 3T3 se transplantan sucutáneamente dentro del ratón immunodeficiente . La terapia inicial puede ser inyección intratumorál directa. El resultado esperado es que el nivel aumentado de expresión de TS humana o una enzima objetivo conduzca a la actividad antitumor mejorada por los fármacos candidatos. Estudios similares se realizan con tumores humanos que expresan niveles aumentados de TS humana o una enzima objetivo, y demuestran que la eficacia en la respuesta al fármaco se correlaciona con su nivel de expresión de TS humana o enzima objetivo. Opcionalmente, se realizan experimentos como los anteriormente excepto que el fármaco se administra intravenosamente dentro de los animales para tratar temas relacionados con la eficacia, toxicidad y farmacobiología de los fármacos candidatos. En una modalidad adicional, los animales control reciben una cantidad efectiva de un compuesto identificado anteriormente bajo la sección intitulada "Profármacos" supra . Más específicamente, en los estudios in vivo pueden conducirse usando dos diferentes modelos de xenoinjerto (Ver Tabla 9) .

Las células prueba con expresión definida de TS (indicada en la Tabla 9) se inyectan subcutáneamente a 5 X 106/sitio en la región del flanco de ratones atimicos de 4-6 semana de edad (20-25 gramos) CD-1 (nu/nu) (Charles River Laboratories, Wilmington. MA) como se describe (Pegram, et al. (1997)) . Ocho ratones (cuatro animales por caja) se usan para cada grupo de tratamiento (solución vehículo de control o compuestos profármaco) . Se establecen dos xenoinjertos por ratón ambos reducen el número de animales necesitados para cada experimento y mejoran el poder estadístico para detectar diferencias en la respuesta entre grupos. Los ratones individuales se identifican marcando las orejas mientras que se calculan las trayectorias de xenoinjerto para los ratones individuales además del análisis de las medias de grupo. Todos los ratones usados en el modelo de xenoinjerto de mama MCF-7 son hembras y, antes de la inyección celular, se seban con estradiol-17B (Innovative Research of América, Toledo, OH) aplicados sucutáneamente en un portador enlazante biodegradable (1.7 mg estradiol/pella) para promover el crecimiento de la célula de tumor. Los volúmenes de tumor prospectivo, calculados como (ancho2 X largo) /2 se monitorean dos veces por semana por mediciones micrométricas en serie por un observador de ciego sencillo. Los animales se asignan a cada grupo de tratamiento de manera que la media de los volúmenes iniciales de tumor será la misma para cada grupo. Las pruebas estadísticas se realizan (factor ANOVA-sencillo) para asegurar la uniformidad en los volúmenes iniciales de tumor entre los grupos de tratamiento. Los profármacos o la solución de control de vehículo isovolumetrica se administran por inyección sencilla I.P. en el primer conjunto de experimentos. Si se identifica eficacia en los experimentos iniciales, se realizan estudios adicionales usando un programa de dosificación subcutánea diaria X 5 días con una dosis de profármaco total igual al IC?o definido en los estudios de dosificación simple I.P. estudios. Para éstos experimentos de eficiencia la dosificación profármaco comenzará cuando las medias de los volúmenes de xenoinjerto en cada grupo alcanza 50MM3. La media de volúmenes de tumor de animales tratados con profármaco relativa a los tratados control se gráfica usando estadísticas descriptivas con análisis gráfico. Las pruebas estadísticas (factor ANOVA sencillo) se aplican para comparar las diferencias en volumen de xenoinjerto entre los grupos de tratamiento. Se aplica transformación Log para los cálculos ANOVA, cuando se indique, para estabilizar la variación en los conjuntos de datos de volumen de xenoinjerto. Pueden aplicarse si es necesario pruebas estadísticas no paramétrícas dependiendo de la distribución de datos del volumen del xenoinjerto. Las diferencias en la eficacia entre xenoinjerto con alta expresión de TS se compara con aquellas con baja expresión de TS usando las relaciones de volumen de tumor tratado con profármaco/tratado-control (relaciones T/C) usando estadísticas como se describe por (Pegram, et al. (1997)). Esta metodología puede acomodar las diferencias en relaciones intrínsecas de crecimiento entre xenoinjerto que expresa alto TS y xenoinjertos que expresan bajo TS . Los estudios in vivo también pueden conducirse como se describe por Harris, MP et al. (1996) y Antelman, D., et al. (1995) . 3. Estudios de Descubrimiento de Dosis en Ratones Atimicos que no Padecen Tumor para Definir la Dosis Máxima Tolerada (MTD) Grupos de 6 ratones atimicos CD-1 nu/nu (Charles River Laboratories) (3 machos, 3 hembras) se inyectan con una dosis única de profármaco por medio de la ruta intraperitonial (I.P.). La dosificación comienza empíricamente con la dosis inicial definida por la cantidad de un profármaco para lograr una concentración en suero igual a la IC50 in vi tro, suponiendo que el volumen de distribución del profármaco se restringe al compartimento total de agua corporal (TBW) de ratón (0.6 X de masa corporal en gramos TBWratón) . Si no se observa toxicidad en este nivel, entonces procecie la escalación de la dosis en grupos de 6 ratones a intervalos log medios. Si se encuentra toxicidad al nivel de la dosis empírica, entonces procederán de la misma manera los experimentos repetidos de dosis comenzando al 10% de la dosis tóxica. Los ratones observan diariamente por movilidad, comportamiento de aseo, y habilidad para tomar alimento y agua. Los pesos del ratón se valoran semanalmente. El MTD se define como la dosis que resulta en 10% o menos de pérdida de peso corporal durante el periodo de observación, o una dosis = 90% de la LD10. Si se encuentra letalidad al nivel de dosis particular entonces se repite el experimento (suponiendo que no observa toxicidad en este nivel) . El periodo de observación es aproximadamente 60 días. La escalación de la dosis procederá en cohortes en perspectiva a intervalos de 3 semanas si no encuentra toxicidad en un nivel de dosis particular. Mientras que la invención ha sido descrita en detalle y con referencia a modalidades especificas de la misma, será evidente a un experto en la técnica que pueden hacerse diversos cambios y modificaciones en la presente sin apartarse del espíritu y alcance de los mismos.

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Claims (55)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar agentes terapéuticos potenciales, caracterizado porque comprende: (a) hacer contactar una célula objetivo con un candidato terapéutico o fosforamidato profármaco que es un sustrato selectivo para una enzima objetivo, bajo condiciones que favorecen la incorporación del agente dentro del compartimento intracelular de la célula objetivo; (b) probar la célula objetivo por inhibición de proliferación celular o destrucción celular.
2. 2. El método de conformidad con reivindicación 1, caracterizado porque el profármaco es un derivado de fosforamidato de 2 ' -desoxiuridina .
3. 3. Un método para identificar agentes terapéuticos potenciales, caracterizado porque comprende: (a) hacer contactar una célula objetivo con un candidato terapéutico fosforil o fosforamidato profármaco que tiene un grupo saliente tóxico etiquetado detectablemente y que es un sustrato selectivo para una enzima objetivo, bajo condiciones que favorecen la incorporación del agente dentro del compartimento intracelular de la célula objetivo; (b) probar el medio de cultivo por la cantidad de etiquta liberada y compararla a la cantidad de etiqueta liberada.
4. 4. El método de confromidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el profármaco es un derivado fosforoamidato de 2 ' -desoxiuridina .
5. 5. El método de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, en donde la célula objetivo está caracterizada como resistente a un fármaco quimioterapéutico.
6. 6. El método de de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizado porque la enzima objetivo está amplificada como resultado de la selección in vivo por quimioterapia.
7. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la enzima objetivo es una enzima intracelular endógena que esta sobreexpresada en la célula objetivo.
8. 8. El método de de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la enzima objetivo es timidilato sintasa.
9. 9. Un método para inhibir la proliferación de una célula hiperproliferativa, caracetrizado porque comprende hacer contactar la célula con un profármaco fosforil o fosforamidato que se convierte selectivamente en una toxina en la célula por una enzima intracelular endógena.
10. 10. Un método para tratar una patología caracterizada por células hiperproliferativas en un sujeto que comprende la administración al sujeto de un profármaco fosforil o fosforamidato que se convierte en una toxina en una célula hiperproliferativa por una enzima intracelular que esta sobreexpresada o sobreacumulada endógenadamente en la célula .
11. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque el agente candidato terapéutico es un compuesto L- o D- de la fórmula: en donde Ri es o contiene una entidad química que tiene una dimensión molecular y electrofilicidad compatible con la extracción desde el anillo pirimidina por timidilato sintasa, y el cual a su liberación desde el anillo pirimidina por timidilato sintasa tiene la capacidad de inhibir la proliferación de la célula o destruir la célula; o un compuesto de la fórmula: en donde n es un número entero de 0 hasta 10; en donde A es un derivado de fosforil o fosforarmida, o un compuesto de la fórmula: en donde Q es un derivado fosforil o fosforamidato que contiene una entidad química seleccionada del grupo que consiste de grupos de azúcar, grupos tio-azúcar, grupos carbocíclicos, y derivados de los mismos.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque Q tiene la fórmula: en donde R . se selecciona del grupo que consiste de fosforil, fosforamidato y derivado del mismo, y en R2 y R3 son los mismos o diferentes y son independientemente -H o -OH.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque Ri es un halógeno.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque Ri es un grupo alquilo, es decir, (-CH=CH)n R . en donde n es un número entero de 0 hasta 10, y R4 se selecciona del grupo que consiste de H, un halógeno, alquilo, alqueno, alquino, hidroxi, -O-alquilo, -O-arilo, 0-heteroarilo, -S-alquilo, -S-arilo -S-heteroarilo, -NH2, -NH-alquilo, -N (alquilo) 2, -NHCHO, un cianuro, cianato y tiosianato cianuro, compuesto de halovinil cianato y tisioanato, un compuesto halomercúrico, -NHOH, -NHO-alquilo, y NHNH2
15. 15. Un compuesto de la fórmula: caracterizado porque: R1 es una porción de la fórmula: R es una porción divalente conductora de electrones seleccionada del grupo que consiste de: un grupo hidrocarbilo no saturado; un hidrocarbilo aromático que comprende uno o más grupos hidrocarbilos no saturados; y un grupo heteroaromático que comprende uno o más grupos hidrocarbilo no saturados; R3 es una porción divalente espaciadora seleccionada del grupo que consiste de: -CH, "CHR5— -C(R5)2 -O- :—NH- -NR5— R puede ser el mismo o diferente y es independientemente un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 hasta 10 átomos de carbono, o un grupo cicloalquilo que tiene de 3 hasta 10 átomos de carbono; n es un número entero de 0 a 10; m es 0 ó 1; R4 es una porción toxófora seleccionada del grupo que consiste de: -O— H— C— NH2 O II Z—CF2—CHF—CH2—C—OH Z—CF2—CH2—CH2—NO; X es -Cl, Br, -1, u otro grupo saliente potente, con la condición de que cuando R7 es -H, y M es cero, entonces R4 no es un halógeno o cuando m es cero y n es cero, entonces R4 no es un halógeno; Y es independientemente -H o -F; Z es independientemente -0- o -S-; Q es una porción de azúcar seleccionada del grupo que consiste de : R es independientemente -H, -OH, -OC(=0)CH3, u otro grupo hidróxilo protegido; y, R7 es hidrógeno, un grupo fosfato, o un grupo fosforamidato; y en donde el compuesto puede estar en cualquier forma enantiomérica, diasteriomérica, o estereoisomérica, incluyendo, la forma D-, L- y forma a-anomérica, y forma ß-anomérica .
16. 16. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque Q es:
17. 17. Un compuesto de conformidad con la 15, caracterizado porque Q es:
18. 18. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque R3 es una porción divalente espaciadora del grupo que consiste de: — o- — s- -N y í —NR*—:
19. 19. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque R2 es un grupo hidrocarbilo no saturado seleccionado del grupo que consiste de:
20. 20. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque R2 y R3, tomados juntos forman una estructura seleccionada del grupo que consiste de:
21. 21. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque R2 es un grupo hidrocarbilo aromático seleccionado del grupo que consiste de:
22. 22. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque R2 es un grupo heteroaromático seleccionado del grupo que consiste de: en donde J es -O-, S, -Se-, -NH-, o -NR?JjU en donde
23. R Q es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o un grupo cicloalquilo que tiene de 3 a 10 átomos de carbono. 23. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, caracterizado porque R7 se selecciona del grupo que consiste de
24. 24. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, caracterizado porque R7 se selecciona del grupo que consiste de:
25. 25. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, caracterizado porque R7 se selecciona del grupo que consiste de:
26. 26. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, caracterizado porque R7 se selecciona del grupo que consiste de:
27. 27. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, caracterizado porque R4 se selecciona del grupo que consiste de:
28. 28. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27, caracterizado porque R4 se selecciona del grupo que consiste de:
29. 29. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27, caracterizado porque R es: O —O—NH—C—NH2
30. 30. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27, caracterizado porque R4 es: CH2 I C=0 I NH OH \ Z— CH2— CH— CH— CH=CH— (CH2)12CH3
31. 31. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27, caracterizado porque R4 es:
32. 32. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27, caracterizado porque R4 es:
33. 33. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27, caracterizado porque R4 es: Z—CF2—CH2—CH?—NO,
34. 34. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27, caracterizado porque R4 es:
35. 35. Un compuesto de la fórmula:
36. 36. Un compuesto de la fórmula:
37. 37. Un compuesto de la fórmula:
38. 38. Un compuesto de la fórmula
39. 39. Un compuesto de la fórmula:
40. 40. Un método para formar un compuesto de la fórmula : caracterizado porque "Base" denota una base de ácido nucleico; método el cual comprende la etapa de hacer reaccionar un compuesto de la fórmula: con un compuesto de la fórmula en la presencia de un depurador HCl.
41. 41. Un método para formar un compuesto de la fórmula : caracterizado porque R1 es un sustituyente; método el cual comprende la etapa de hacer reaccionar un compuesto de la fórmula: con un compuesto de la fórmula en la presencia de un depurador HCl.
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 40 ó 41, caracterizado porque el depurador HCl es imidazol.
43. 43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42, caracterizado porque la reacción se realiza en un solvente no acuoso que comprende dimetil formamida.
44. 44. Un método para seleccionar un agente terapéutico que comprende: (a) hacer contactar una primera célula objeto con un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 37 a 39, bajo condiciones que favorecen la incorporación del compuesto dentro del compartimento intracelular de la célula objetivo y una segunda célula objetivo con un agente terapéutico potencial, bajo condiciones que favorecen la incorporación del compuesto dentro del compartimento intracelular de la célula objetivo; y (b) probar la segunda célula objetivo por la inhibición de la proliferación celular o destrucción celular.
45. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde la célula objetivo está caracterizada como resistente a un fármaco quimioterapéutico.
46. 46. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde la célula objetivo está caracteriza como según se expresa una enzima objetivo que está amplificada como resultado de la selección in vivo por quimioterapia.
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la enzima objetivo es una enzima intracelular endógena que se sobreexpresa en la célula objetivo . •
48. 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la sobreexpresión endógena de una enzima intracelular es el resultado de la amplificación del gen que codifica la enzima.
49. 49. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la enzima es timidilatosintasa .
50. 50. El uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 37 a 39, para la preparación de un medicamento para tratar la inhibición de la proliferación de una célula.
51. 51. El método para inhibir la proliferación de una célula hiperfroliferativa, caracterizado porque comprende hacer contactar la célula con una cantidad efectiva de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 37 a 39.
52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la célula hiperproliferativa se caracteriza por la sobreexpresión endógena de una enzima intracelular.
53. 53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la enzima es timidilato sintasa.
54. 54. El método para tratar una patología caracterizada por células hiperproliferativas en un sujeto que comprende la administración al sujeto de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 37 a 39.
55. 55. El método para seleccionar un agente terapéutico, caracterizado porque comprende hacer contactar una célula objetivo con un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 37 a 39, en donde R4 es: cuya célula objetivo favorece la incorporación del compuesto dentro de la célula objetivo, con el propósito de diagnosticar o detectar los niveles intracelulares de timidilato sintasa.