DE69013011T2 - Bcrf1-proteine als inhibitoren von interferon-g(g). - Google Patents
Bcrf1-proteine als inhibitoren von interferon-g(g).Info
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Description
- Die Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf Verfahren und Zusammensetzungen zum Behandeln von Krankheiten, die mit einer übermäßigen Produktion von Interferon-γ (IFN-γ) verbunden sind und genauer auf Verfahren und Zusammensetzungen, die das Epstein-Barr-Virus(EBV)-Protein BCRF1 zum wirksamen Verringern der IFN-γ-Werte einsetzen.
- Das Immunsystem umfaßt einen stark wechselwirkenden Komplex aus Geweben, Zelltypen und löslichen Faktoren. Kürzlich ist vorgeschlagen worden, daß mehrere Erkrankungen und Immunstörungen mit Unausgewogenheiten zwischen gewissen Bestandteilen des Immunsystems, insbesondere Cytokinen verbunden sind: z.B. Mosmann et al., Ann. Rev. Immunol., Bd. 7, S. 145-173 (1989); Cher et al., J. Immunol., Bd. 138, S. 3688-3694 (1987); Mosmann et al., Immunol. Today, Bd. 8, S. 223-227 (1987) und Heinzel et al., J. Exp. Med., Bd. 169, S. 59-72 (1989).
- Zum Beispiel legt eine große Menge Beweismaterial nahe, daß die übermäßige Produktion von gamma-Interferon (IFN-γ) für Autoimmunerkrankungen verantwortlich ist, die mit dem Histokompatibiltätshauptkomplex (MHC) verbunden sind: Hooks et al., New England J. Med., Bd. 301, S. 5-8 (1979) (erhöhte Serumwerte für IFN-γ korrelierten mit der Autoimmunität); Basham et al., J. Immunol., Bd. 130, S. 1492-1494 (1983) (IFN-γ kann die MHC- Genproduktexpression erhöhen); Battazzo et al., Lancet, S. 1115-1119 (11/12/83) (eine abweichende MHC-Genproduktexpression korrelierte mit einigen Formen von Autoimmunität); Hooks et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., Bd. 301, S. 21-32 (1980) (höhere IFN-γ- Werte korrelierten mit einer größeren Schwere der Erkrankung bei SLE-Patienten und eine die Histaminfreisetzung verstärkende Aktivität von Interferon kann durch anti-Interferonseren gehemmt werden); Jacob et al., J. Exp. Med., Bd. 166, S. 798-803 (1987) (Verbesserung und Verzögerung des Beginns der Krankheitszustände in Mausmodellen von systemischem Lupus erythematosus durch Blockieren monoklonaler anti-IFN-γ-Antikörper) und Iwatani et al., J. Clin. Endocrin. and Metabol., Bd. 63, S. 695-708 (1986) (ein monoklonaler anti-IFN-γ-Antikörper beseitigte die Fähigkeit Leukoagglutinin-stimulierter T-Zellen zum Induzieren der HLA-DR- Expression). Es ist vermutet worden, das überschüssiges IFN-γ die unangebrachte Expression von MHC-Genprodukten verursacht, was wiederum Autoimmunreaktionen gegen die Gewebe hervorruft, deren Zellen unangebrachterweise die MHC-Produkte exprimieren und Autoantigene im Zusammenhang mit den Produkten zeigen. So hat McDevit [Clin. Res., Bd. 34, S. 163-175 (1985)] vorgeschlagen, daß das Verringern der IFN-γ-Werte in Autoimmunpatienten, z.B. durch Verabreichen von IFN-γ-Antagonisten, vorteilhafte Wirkungen haben könnte.
- Außer dem vorstehenden Beweis kann IFN-γ durch seine Fähigkeit, die Zahl und Dichte von Fc -Rezeptoren auf Monocyten zu erhöhen, auch eine Rolle bei Allergie spielen; es ist mit der Pathogenese von Sarkoidose und Psoriasis in Zusammenhang gebracht worden und von ihm wird angenommen, daß es die zellvermittelte Immunität erhöht, die eine Hauptrolle bei der Gewebeabstoßung bei Patienten mit allogenen Transplantationen spielt.
- Mit Hinsicht auf das Vorstehende wäre die Verfügbarkeit von Verbindungen, die zum Verringern der IFN-γ-Werte fähig sind, zur Behandlung von Krankheiten äußerst vorteilhaft, die mit unangebrachten Immunantworten verbunden sind, wie etwa einige parasitäre Krankheiten, Allergie und mit MHC verbundene Immunstörungen einschließlich rheumatoider Arthritis, systemischem Lupus erythematosus (SLE), Myasthenia gravis, Insulin-abhängigem Diabetes mellitus, Thyroiditis und dergleichen.
- Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen zum Behandeln von Krankheiten, die mit hohen Werten der IFN-γ- Produktion verbunden sind. Das Verfahren der Erfindung umfaßt den Schritt des Verabreichens einer die Krankheit kontrollierenden Menge BCRFI, ein von dem Epstein-Barr-Virus stammendes Protein. Die Erfindung schließt weiter Expressionsvektoren zum Herstellen von rekombinantem BCRF1, gereinigtes BCRF1 und pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung durch das Verfahren ein. Vorzugsweise wird das in der Erfindung verwendete BCRF1 aus der Gruppe reifer Polypeptide mit dem offenen Leserahmen ausgewählt, der durch die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Aminosäuresequenz definiert ist, wobei die Abkürzungen die L-Formen der Aminosäuren anzeigen und die Aminosäuren ausgehend vom N-Terminus aufgeführt sind.
- Figur 1 ist eine diagrammartige Veranschaulichung eines bei der Herstellung von BCRF1 brauchbaren Säuger-Expressionsvektors.
- Figur 2 ist eine diagrammartige Veranschaulichung eines bei der Herstellung von BCRF1 brauchbaren bakteriellen Expressionsvektors.
- Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen zum Behandeln von Erkrankungen, die mit übermäßiger IFN-γ-Produktion verbunden sind. Die Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung, daß die Nukleinsäuresequenz, die ein kürzlich entdecktes Protein kodiert, das als Cytokinsynthese-Hemmfaktor (CSIF) bezeichnet wird, einen hohen Grad von Homologie mit dem offenen Leserahmen von EBV-BCRF1 besitzt. EBV ist ein menschlicher Herpesvirus, der in allen menschlichen Populationen endemisch ist, und mit mehreren Krankheiten in Verbindung gebracht worden ist: z.B. Dillner et al., Adv. Cancer Res., Bd. 50, S. 95-158 (1988); Thorley-Lawson, Biochim. Biophys. Acta, Bd. 948, S. 263-286 (1988), und Tasato, Adv. Cancer Res., Bd. 49, S. 75-125 (1987). EBV besitzt ein doppelsträngiges DNA-Genom mit etwa 172 Kilobasen [Baer et al., Nature, Bd. 310, S. 207-211 (1984)]. Das Genom enthält viele offene Leserahmen, die offensichtlich durch EBV produzierten Proteinen entsprechen, wovon eines BCRF1 ist.
- Die Erfindung schließt reife Polypeptide oder proteine mit dem offenen Leserahmen von BCRFI ein. Bei ausgeschiedenen Proteinen kodiert ein offener Leserahmen üblicherweise ein Polypeptid, das aus einem reifen oder ausgeschiedenen Produkt besteht, das an seinem N-Terminus kovalent mit einem Signalpeptid verknüpft ist. Das Signalpeptid wird vor der Ausscheidung des reifen oder aktiven Polypeptids abgespalten. Die Spaltungsstelle kann mit einem hohen Genauigkeitsgrad aus empirischen Regeln vorhergesagt werden [z.B. von Heijne, Nucleic Acids Research, Bd. 14, S. 4683-4690 (1986)] und die genaue Aminosäurezusammensetzung des Signalpeptids scheint in Bezug auf seine Funktion nicht kritisch zu sein [z.B. Randall et al., Science, Bd. 243, S. 1156-1159 (1989); Kaiser et al., Science, Bd. 235, S. 312-317 (1987)]. Folglich werden reife proteine leicht durch Vektoren exprimiert, die Signalpeptide kodieren, welche von denjenigen, die durch den durch Formel I definierten offenen Leserahmen kodiert werden, gänzlich verschieden sind.
- Ein breiter Bereich Expressionssysteme (d.h. Wirt-Expressionsvektor-Kombinationen) können zum Herstellen der Proteine der Erfindung verwendet werden. Mögliche Typen von Wirtszellen schließen Bakterien, Hefe, Insekten, Säuger und dergleichen ein, sind aber nicht darauf begrenzt. Viele Übersichten stehen zur Verfügung, die eine Richtschnur zum Treffen einer Auswahl und/oder von Abänderungen spezifischer Expressionssysteme liefern: z.B. (um einige zu nennen) geben de Boer und Shepard, "Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli", S. 205-247, in Kroon, Hrsg., "Genes: Structure and Expression" (John Wiley & Sons, New York, 1983), einen Überblick über mehrere E. coli-Expressionssysteme; Kucherlapati et al., Critical Reviews in Biochemistry, Bd. 16, Ausgabe 4, S. 349-379 (1984) und Banerji et al., Genetic Enqineerinq, Bd. 5, S. 19-31 (1983) geben einen Überblick über Verfahren zum Transfizieren und Transformieren von Säugerzellen; Reznikoff und Gold, Hrsg., "Maximizing Gene Expression" (Butterworths, Boston, 1986) geben einen Überblick über ausgewählte Themen der Genexpression in E. coli, Hefe und Säugerzellen und Thilly, "Mammalian Cell Technology" (Butterworths, Boston, 1986) gibt einen Überblick über Säugerexpressionssysteme. Desgleichen stehen viele Übersichten zur Verfügung, die Techniken und Bedingungen zum Verknüpfen und/oder Manipulieren spezifischer cDNA und Expressionskontrollsequenzen zum Erzeugen und/oder Abändern von Expressionsvektoren beschreiben, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, z.B. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausg. (Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1989).
- Ein E. coli-Expressionssystem wird von Riggs im US-Patent 4 431 739 offenbart, das durch Verweis inbegriffen ist. Besonders brauchbare prokaryontische Promotoren für eine hohe Expression in E. coli sind der von de Boer im US-Patent 4 551 433, das durch Verweis inbegriffen ist, offenbarte tac-Promotor und der durch Remaut et al., Gene, Bd. 15, S. 81-93 (1981), das durch Verweis hierin inbegriffen ist, offenbarte pL-Promotor. Sekretionsexpressionsvektoren sind ferner für E. coli-Wirte verfügbar. Besonders brauchbar sind die von Ghrayeb et al. in EMBO J., Bd. 3, S. 2437-2442 (1984), offenbarten pIN-III-ompA-Vektoren, in denen die zu transkribierende cDNA mit dem Teil des E. coli- OmpA-Gens fusioniert ist, welcher das Signalpeptid des ompA- Proteins kodiert, das wiederum bewirkt, daß das reife Protein in den periplasmatischen Raum des Bakteriums ausgeschieden wird. Die US-Patente 4 336 336, 4 411 994, 4 332 892 und 4 338 397 offenbaren ebenfalls sekretionsexpressionsvektoren für Prokaryonten. Dementsprechend sind diese Zitate durch Verweis inbegriffen. Zahlreiche Bakterienstämme sind für prokaryontische Expressionsvektoren geeignete Wirte einschließlich E. coli-Stämmen, wie etwa W3110 (ATCC Nr. 27325), JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HB101, X1776 (ATCC Nr. 31244), X2282, RR1 (ATCC Nr. 31343) MRCI; Bacillus subtilis-Stämme und andere Endobacteriaceae, wie etwa Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens, und verschiedene Pseudomonas-Arten. Allgemeine Verfahren zum Ableiten von Bakterienstämmen wie etwa E. coli K12X1776, die bei der Expression eukaryontischer Proteine nützlich sind, werden von Curtis III im US-Patent 4 190 495 offenbart. Dementsprechend ist dieses Patent durch Verweis inbegriffen. Außer prokaryontischen und eukaryontischen Mikroorganismen können Expressionssysteme, die von multizellulären Organismen stammende Zellen umfassen, ebenfalls zum Herstellen von Proteinen der Erfindung verwendet werden. Von besonderem Interesse sind Säugerexpressionssysteme, weil es aussichtsreicher ist, daß ihr posttranslationaler Verarbeitungsmechanismus biologisch aktive Säugerproteine produziert.
- Mehrere DNA-Tumorviren sind als Vektoren für Säugerwirte verwendet worden. Besonders wichtig sind die zahlreichen Vektoren, welche die SV40-Replikation, Transkription und/oder Translationskontrollsequenzen umfassen, die an Kontrollsequenzen der Bakterienreplikation gekuppelt sind, z.B. die durch Okayama und Berg entwickelten, in Mol. Cell. Biol., Bd. 2, S. 161-170 (1982) und Mol. Cell. Biol., Bd. 3, S. 280-289 (1983) offenbarten und durch Takebe et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 8, S. 466-472 (1988) verbesserten pcD-Vektoren. Dementsprechend sind diese Zitate durch Verweis hierin inbegriffen. Andere Säugerexpressionsvektoren auf SV40-Grundlage schließen diejenigen ein, die Adenovirus-Steuerelemente enthalten und durch Kaufinan und Sharp in Mol. Cell. Biol., Bd. 2, S. 1304-1319 (1982) und durch Clark et al. im US-Patent 4 675 285 offenbart wurden, welche beide durch Verweis hierin inbegriffen sind. Affenzellen sind für die vorstehenden Vektoren üblicherweise die bevorzugten Wirte. Derartige Vektoren, welche die SV40-ori-Sequenzen und ein intaktes A-Gen enthalten, können sich in Affenzellen autonom replizieren (um höhere Kopienzahlen und/oder stabilere Ropienzahlen als sich nicht autonom replizierende Plasmide zu ergeben). Weiter können sich Vektoren, welche die SV40-ori-Sequenzen ohne ein intaktes A-Gen enthalten, in COS7-Affenzellen, die durch Gluzman, Cell, Bd. 23, S. 175-182 (1981) beschrieben und von der ATCC (Zugangs- Nr. CRL 1651) erhältlich sind, autonom zu hohen Kopienzahlen (aber nicht stabil) replizieren. Die vorstehend beschriebenen Vektoren auf SV40-Grundlage können auch andere Säugerzellen wie etwa Maus-L-Zellen durch Einbau in die Wirtszellen-DNA transformieren.
- Die biologische Aktivität der BCRF1 der Erfindung wird leicht in IFN-γ-Hemmtests bestimmt. Derartige Tests erfordern eine Zelllinie oder Zellpopulation, die IFN-γ synthetisiert. Lymphozyten aus peripherem Blut (PBL), die mit einem Mitogen wie etwa Phytohämagglutinin (pHA) stimuliert worden sind, können bequem als derartige Zellpopulation dienen. Der Test läuft grob wie folgt ab: die PHA-stimulierten PBL werden in zwei gleiche Teile geteilt. Einem Teil wird eine BCRF1 enthaltende Probe zugesetzt. Der andere Teil dient als Kontrolle. Nach mehreren Tagen werden die Überstände beider Kulturen auf IFN-γ getestet. Dies wird bequemerweise mit einem Standard-ELISA-Test mittels im Handel erhältlicher monoklonaler und polyklonaler Antikörper für IFN-γ, z.B. Genzyme, Inc. (Boston, MA), ausgeführt. Wahlweise kann die Ablesung bei dem Test die Menge transkribierter IFN-γ-mRNA sein, wie sie zum Beispiel durch RNA-Blotting, PCR oder eine ähnliche Methodik gemessen wird. PBL werden mittels Standardtechniken, z.B. Mishell et al., Hrsg., "Selected Methods in Cellular Immunology" (Freeman, New York, 1980) erhalten.
- Wenn Polypeptide der vorliegenden Erfindung in löslicher Form zum Beispiel als ein Ausscheidungsprodukt transformierter Hefeoder Säugerzellen exprimiert werden, können sie gemäß Standardverfahren der Technik einschließlich Schritten der Ammoniumsulfatfällung, ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Elektrophorese, Affinitätschromatographie und/oder dergleichen gereinigt werden; z.E. geben "Enzyme Purification and Related Techniques", Methods in Enzymology, 22:233-577 (1977), und Scopes, "Protein Purification: Principles and Practise" (Springer- Verlag, New York, 1982) eine Anleitung für derartige Reinigungen. Desgleichen wenn Polypeptide der Erfindung in unlöslicher Form zum Beispiel als Aggregate, Einschlußkörper oder dergleichen exprimiert werden, können sie durch Standardverfahren in der Technik einschließlich Abtrennen der Einschlußkörper aus aufgebrochenen wirtszellen durch Zentrifugieren, Löslichmachen der Einschlußkörper mit chaotropen Mitteln und mit Reduktionsmitteln, Verdünnen des löslich gemachten Gemisches und Erniedrigen der Konzentration des chaotropen Mittels und Reduktionsmittel gereinigt werden, so daß das Polypeptid eine biologisch aktive Konformation einnimmt. Diese letzten Verfahren werden in den folgenden Literaturstellen offenbart, die durch Verweis inbegriffen sind: Winkler et al., Biochemistry, 25: 4041-4045 (1986); Winkler et al., Biotechnology, 3: 992-998 (1985); Koths et al., US-Patent 4 569 790 und europäische Patentanmeldungen 86 306 917.5 und 86 306 353.3.
- Wenn "wirksame Menge" hier verwendet wird, bedeutet dies eine zum Bessern der Symptome eines Krankheitszustandes ausreichende Menge, welcher durch übermäßiges IFN-γ vermittelt wird. Die wirksame Menge für einen besonderen Patienten kann in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie dem Stand des zu behandelnden Krankheitszustandes, der Gesamtgesundheit des Patienten, dem Verabreichungsverfahren, der Schwere der Nebenwirkungen und dergleichen schwanken. Im allgemeinen wird BCRF1 als Pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die eine wirksame Menge BCRF1 und einen pharmazeutischen Träger oder Arzneihilfsmittel umfaßt. Ein pharmazeutischer Träger kann jede verträgliche, nicht-toxische Substanz sein, die zum Zuführen der Zusammensetzungen der Erfindung an einen Patienten geeignet ist. Im allgemeinen sind zur parenteralen Verabreichung derartiger Wirkstoffe brauchbare Zusammensetzungen gut bekannt, z.B. Remington's Pharmaceutical Science, 15. Ausg. (Mack Publishing Company, Easton, PA 1980). Wahlweise können Zusammensetzungen der Erfindung in den Körper eines Patienten durch ein implantierbares Wirkstoff zufuhrsystem eingeführt werden: z.B. Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Bd. 24, S. 199-236 (1984); Lewis, Hrsg., "Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals" (Plenum Press, New York, 1981); US-Patent 3 773 919, US-Patent 3 270 960 und dergleichen.
- Wenn BCRF1 parenteral formuliert wird, wird es in injizierbarer Einheitsdosisform (z.B. eine Lösung, Suspension oder Emulsion) in Verbindung mit einem Pharmazeutischen Träger formuliert. Derartige Träger sind an sich nicht-toxisch und nicht-therapeutisch. Beispiele derartiger Träger sind normale Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextroselösung und Hank-Lösung. Nichtwäßrige Träger, wie etwa fette Öle und Ölsäureethylester, können ebenfalls verwendet werden. Ein bevorzugter Träger ist 5% Dextrose/Kochsalzlösung. Der Träger kann geringfügige Mengen Zusatzstoffe enthalten, wie etwa Substanzen, welche die Isotonie und chemische Stabilität erhöhen, z.B. Puffer und Konservierungsstoffe. BCRF1 wird vorzugsweise in gereinigter Form im wesentlichen frei von Aggregaten und anderen Proteinen in einer Konzentration im Bereich von etwa 5 bis 20 ug/ml formuliert. Vorzugsweise wird BCRF1 durch ununterbrochene Infusion verabreicht, so daß eine Menge im Bereich von etwa 50-800 ug je Tag (d.h. etwa 1-16 ug/kg/Tag) zugeführt wird. Die tägliche Infusionsrate kann auf der Grundlage des Beobachtens von Nebenwirkungen, Blutzellenzählungen und dergleichen verändert werden.
- Ein den offenen Leserahmen für BCRF1 kodierendes Gen wurde durch eine Polymerase-Kettenreaktion mittels Startern verstärkt, die eine spätere Tnserierung des verstärkten Fragments in einen EcoRI-verdauten pcD(SRα)-Vektor (Figur 1) erlaubt. Der Kodierungsstrang des inserierten Fragments wird in SEQ ID Nr. 2 dargestellt.
- Das Insert in der richtigen Richtung tragende Klone wurden durch Expression von BCRF1 und/oder dem Elektrophoresemuster von Restriktionsverdautem nachgewiesen. Ein derartiger, das BCRF1- Gen tragender Vektor wurde pBCRF1(SRα) bezeichnet und wurde bei der ATCC unter der Zugangsnummer 68193 hinterlegt. pBCRF1(SRα) wurde in E. coli M01061 verstärkt, durch Standardtechniken isoliert und zum Transfizieren von COS7-Affenzellen wie folgt verwendet: einen Tag vor der Transfizierung wurde Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DME), das 5% fetales Kälberserum (FCS) und 2 mM Glutamin enthielt, auf einzelnen 100 mm-Platten mit ungefähr 1,5 x 10&sup6; COS7-Affenzellen beimpft. Zum Ausführen der Transfizierung wurden COS7-Zellen aus den Schaden durch Inkubation mit Trypsin entnommen, zwei Mal in serumfreiem DME gewaschen und in serumfreiem DME zu 10&sup7; Zellen/ml suspendiert. Eine aliquote Menge von 0,75 ml wurde mit 20 ug DNA gemischt und auf eine sterile Elektroporationsküvette von 0,4 cm überführt. Nach 10 Minuten wurden die Zellen bei 200 Volt, 960 uF in einer BioRad Gene Pulser-Einheit gepulst. Nach weiteren 10 Minuten wurden die Zellen aus der Küvette entnommen und 20 ml DME zugesetzt, das 5% FCS, 2 mM Glutamin, Penicillin, Streptomycin und Gentamycin enthielt. Das Gemisch wurde in aliquoten Mengen auf vier 100 mm-Gewebekulturschalen verteilt. Nach 12-24 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;, wurde das Medium durch ein ähnliches Medium ersetzt, das nur 1% FCS enthielt, und die Inkubation wurde weitere 72 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;, fortgesetzt, wonach das Medium gesammelt und auf seine Fähigkeit, die IFN-γ-Synthese zu hemmen, getestet wurde.
- Aliquote Mengen von 10 ml frisch isolierten PBL (etwa 2 x 10&sup6; Zellen/ml) wurden bei 37ºC mit PHA (100 ng/ml) in einem Medium inkubiert, das aus (i) 90% mit 5% FCS und 2 mM Glutamin ergänztem DME und (ii) 10% Überstand aus COS7-Zellen bestand, die zuvor mit pBCRF1(SRα) transfiziert wurden. Nach 24 Stunden wurden die Zellen und Überstände zum Testen auf die Anwesenheit entweder von 1FN-γ-mRNA oder IFN-γ-Protein geerntet. Die Kontrollen wurden identisch behandelt, außer daß die 10% Überstand von. COS7-Kulturen herrührten, die zuvor mit einem Plasmid transfiziert wurden, das ein nichtverwandtes cDNA-Insert trug. Diese BCRF1-behandelten Proben zeigten etwa 50% Hemmung der IFN-γ- Synthese bezogen auf die Kontrollen.
- Ein Gen, das ein reifes BCRF1 der in SEQ ID Nr. 3 angegebenen Sequenz kodiert, kann in E. coli exprimiert werden.
- Das cDNA-Insert von pBCRF1(SRα) wird erneut in einem M13-Plasmid kloniert, wo es zwei Mal durch ortsgerichtete Mutagenese verändert wird: erstens unter Bilden einer ClaI-Stelle am 5'-Ende der Kodierungsregion für das reife BCRF1-Polypeptid und zweitens unter Bilden einer BamHI-Stelle ain 3'-Ende der Kodierungsregion für das reife BCRF1-Polypeptid. Die mutierte Sequenz wird anschließend leicht in den nachstehend beschriebenen TRPC11-Expressionsvektor insertiert.
- Der TRPC11-Vektor wurde durch Ligieren eines synthetischen Consensus-RBS-Fragments an ClaI-Linker (ATGCAT) und durch Klonieren der sich daraus ergebenden Fragmente in ClaI-beschränktes pMT11hc (das zuvor zum Enthalten der ClaI-Stelle modifiziert worden war) aufgebaut. pMT11hc ist ein kleines (2,3 Kilobasen) AMPR,TETS-Derivat von pBR322 mit hoher Kopienzahl, welches die πVX-Plasmid-EcoRI-HindIII-Polylinker-Region trägt. (πVX wird von Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, beschrieben.) Dieses wurde zum Enthalten der ClaI-Stelle durch Einschränken von pMT11hc mit EcoRI und BamHI, Einfügen der sich daraus ergebenden klebrigen 5-Enden und Ligieren mit ClaI-Linker (CATCGATG) modifiziert, um dadurch die EcoRI- und BamHI-Stellen wiederherzustellen und die SmaI-Stelle durch die ClaI-Stelle zu ersetzen. Eine Transformante aus dem TRPC11-Aufbau besaß eine Tandem-RBS-Sequenz, an die ClaI-Stellen angrenzten. Eine der ClaI-Stellen und ein Teil der zweiten Kopie der RBS-Sequenz wurden durch Verdauen dieses Plasmids mit PstI, Behandeln mit Bal31-Nuklease, Einschränken mit EcoRI und Behandeln mit T4-DNA-Polymerase in Anwesenheit aller vier Deoxynukleotidtriphosphate entfernt. Die sich daraus ergebenden Fragmente mit 30-40 bp wurden durch PAGE gewonnen und in Sinal-eingeschränktes pUC12 kloniert. Ein von pKC101 (durch Nichols et al. in Methods in Enzymology, Bd. 101, S. 155 (Academic Press, N.Y., 1983) beschrieben) stammendes E. coli-trpP-tragendes EcoRI-Fragment mit 248 bp wurde anschließend zum Vervollständigen des TRPC11-Aufbaus in die EcoRI-Stelle kloniert, was in Figur 2 veranschaulicht wird. TRPC11 wird als Vektor für BCRF1 eingesetzt, indem es zuerst mit ClaI und BamHI verdaut, gereinigt und anschließend in einer Standard-Ligierungslösung mit dem ClaI-BamHI-Fragment des M13 gemischt wird, das die für das reife BCRF1 kodierende Nukleotidsequenz enthält. Das inserthaltige, als TRPC11-BCRF1 bezeichnete TRPC11 wird im E. coli-K12-Stamm JM101 vermehrt, der z.B. von der ATCC unter der Zugangsnummer 33876 erhältlich ist.
- Die Anmelder haben pBCRF1(SRα) tragendes E. coli MC1061 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC), unter der Zugangsnummer 68193 hinterlegt. Die Hinterlegung wurde am 20. Dezember 1989 unter Bedingungen getätigt, wie sie unter der Übereinkunft der ATCC zur Kulturhinterlegung für Patentzwecke vorgeschrieben sind, was sicherstellt, daß die Hinterlegung dem US Commissioner of Patents and Trademarks gemäß 35 USC 122 und 37 CFR 1.14 zugänglich gemacht wird und der Öffentlichkeit nach Erteilung eines US-Patents zugänglich gemacht wird, was erfordert, daß die Hinterlegung aufrecht erhalten wird. Die Zugänglichkeit des hinterlegten Stamms darf nicht als Lizenz zum Ausüben der Erfindung unter Verstoß gegen die mit Genehmigung einer Regierung entsprechend ihren Patentgesetzen gewährten Rechte aufgefaßt werden.
- Die Hinterlegung ist abgeändert worden, um den Erfordernissen des Budapester Vertrags über die Hinterlegung von Mikroorganismen zu entsprechen.
- Die Beschreibungen der vorangehenden Ausführungsformen der Erfindung sind zum Zweck der Veranschaulichung und Beschreibung vorgelegt worden. Sie sind nicht dazu bestimmt, erschöpfend zu sein oder die Erfindung auf die offenbarten, genauen Formen zu beschränken und offensichtlich sind im Lichte der vorstehenden Lehre viele Anderungen und Abweichungen möglich. Die Ausführungsformen wurden gewählt und beschrieben, um die Prinzipien der Erfindung am besten zu erklären und dadurch anderen Fachleuten zu ermöglichen, die Erfindung in verschiedenen Ausführungsformen und mit verschiedenen Anderungen, die für die besondere, beabsichtigte Verwendung geeignet sind, am besten zu verwenden.
- Der Umfang der Erfindung soll durch die hier angefügten Ansprüche definiert werden.
- SEQ ID Nr.: 1
- SEQUENZTYP: Aminosäure
- SEQUENZLÄNGE: 170 Aminosäurereste
- STRÄNGIGKEIT: einzel
- TOPOLOG E: gerade
- MOLEKÜLTYP: Protein/Polypeptid
- URSPRÜNGLICHER HERKUNFSTORGANISMUS: Epstein-Barr-Virus
- EIGENSCHAFTEN: BCRF-1
- SEQUENZTYP: Nucleotid
- SEQUENZLÄNGE: 498 Basen
- STRÄNGIGKEIT: einzel
- TOPOLOG E: gerade
- MOLEKÜLTYP: DNA-Sequenz
- URSPRÜNGLICHER HERKUNFSTORGANISMUS: Epstein-Barr-Virus
- EIGENSCHAFTEN: BCRF-1
- SEQ ID Nr.: 3
- SEQUENZTYP: Aminosäure
- SEQUENZLÄNGE: 147 Aminosäurereste
- STRANGIGKEIT: einzel
- TOPOLOGIE: gerade
- MOLEKÜLTYP: Protein/Polypeptld
- URSPRÜNGLICHER HERKUNFSTORGANISMUS: Epstein-Barr-Virus
- EIGENSCHAFTEN: BCRF-1
Claims (12)
1. Zum Hemmen der Synthese von Interferon-γ befähigtes
Epstein-Barr-Virus-BCRF1-Protein, das durch die in SEQ ID Nr. 3
dargestellte Aminosäurensequenz definiert ist.
2. Zum Exprimieren eines Epstein-Barr-Virus-BCRF1-Proteins in
einem Wirt befähigter, rekombinanter Expressionsvektor, wobei
das BCRF1-Protein zum Hemmen der Synthese von Interferon-γ
befähigt ist.
3. Expressionsvektor von Anspruch 2, wobei das BCRF1-Protein
durch die in SEQ ID Nr. 3 dargestellte Aminosäurensequenz
definiert ist.
4. Expressionsvektor von Anspruch 2 oder 3, wobei der Wirt ein
Säuger ist.
5. Expressionsvektor von Anspruch 4, der aus pBCRF1(SRα)
besteht, der bei der American Type Culture Collection,
Rockville, MD, USA, unter der Zugangsnummer ATCC 68193 hinterlegt ist.
6. Expressionsvektor von Anspruch 2, wobei der Wirt ein
Bakterium ist.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung zum Behandeln einer
Erkrankung, die mit überschüssiger Interferon-γ-Produktion
verbunden ist, welche ein Epstein-Barr-Virus-BCRF1-Protein zusammen
mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Vehikel umfaßt,
wobei das BCRF1-Protein zum Hemmen der Synthese von Interferon-γ
befähigt ist.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei das
BCRF1-Protein aus der Gruppe reifer Proteine mit dem offenen
Leserahmen ausgewählt ist, der durch die in SEQ ID Nr. 1
dargestellte Aminosäurensequenz definiert ist.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, wobei das
reife Protein durch die in SEQ ID Nr. 3 dargestellte
Aminosäurensequenz definiert ist.
10. Verfahren zu Herstellen einer pharmazeutischen
Zusammensetzung zum Behandeln einer Erkrankung, die mit übermäßiger
Interferon-γ-Produktion verbunden ist, welches das Vermischen
eines Epstein-Barr-Virus-BCRF1-Proteins mit einem pharmazeutisch
annehmbaren Träger oder Vehikel umfaßt, wobei das BCRF1-Protein
zum Hemmen der Synthese von Interferon-γ befähigt ist.
11. Verwendung eines Epstein-Barr-Virus-BCRF1-Proteins zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer mit
übermäßiger Interferon-γ-Produktion verbundenen Erkrankung.
12. Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei das Arzneimittel an die
intravenöse Abgabe einer Menge des BCRF1-Proteins im Bereich von
etwa 1-16 ug/kg Körpergewicht des Patienten je Tag angepaßt ist.
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