JP2648236B2 - インターフェロン―γ阻害剤としてのＢＣＲＦ１蛋白質 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は一般に、インターフェロン−γ（IFN−γ）
の過剰な産生に関連する疾患を治療するための方法およ
び組成物に関し、より特定的には、IFN−γのレベルを
効果的に減じるためのエプスタイン−バーウイルス（EB
V）蛋白質を用いた方法および組成物に関する。

背景 免疫系は組織、細胞の型、および可溶性因子の高度に
相互作用的な複合体から成る。最近、いくつかの疾患や
免疫障害が免疫系、特にサイトカインのある種の構成成
分間の不均衡と関係があるかもしれないということが示
唆された：例えばモスマンら（Mosmann et al.）,An
n.Rev.Immunol.,7巻、145−173ページ（1989）；チャー
ら（Cher et al.），J.Immunol.138巻、3688−3694ペ
ージ；モスマンら（Mosmann et al.），Immunol．Tod
ay,8巻、223−227ページ（1987）；およびハインツェル
ら（Heinzel et al.），J.Exp.Med.,169巻、59−72ペ
ージ（1989）。

例えば、多数の一連の証拠が、ガンマインターフェロ
ン（IFN−γ）の過剰な産生が主要組織適合抗原遺伝子
複合体（MHC）に関連する自己免疫疾患の原因となると
いうことを示唆している：フックスら（Hooks et a
l.），New England J.Med.,301巻、５−８ページ（19
79）（自己免疫疾患と関連のあるIFN−γの上昇した血
清レベル）；バシャムら（Basham et al.），J.Immun
ol.,130巻、1492−1494ページ（1983）（IFN−γはMHC
遺伝子産生発現を増大させることができる）；バタッツ
ォら（Battazzo et al.），Lancet,1115−1119ページ
（11/12/83）（自己免疾患のいくつかの型と関連性のあ
る異常なMHC遺伝子産生発現）；フックスら（Hooks et
al.），Ann.N.Y.Acad.Sci.,301巻、21−32ページ（19
80）（SLE患者の疾患の重篤化と関連する、より高いIFN
−γレベルと、インターフェロンのヒスタミン−放出亢
進活性が、抗−インターフェロン血清によって阻害され
得る）；ジャコブら（Jacob et al.），J.Exp.Med.,1
66巻、798−803ページ（1987）（抗−IFN−γモノクロ
ーナル抗体を遮断することによる全身性エリテマトーデ
スのマウスモデルにおける疾患状態の兆候の改善もしく
は遅延）；およびイワタニら（Iwatani et al.），J.
Clin.and Metabol.,63巻、695−708ページ（1986）
（抗−IFN−γモノクローナル抗体が、白血球凝集素−
刺激Ｔ細胞がHLA−DR発現を誘導する能力を取り去っ
た）。過剰なIFN−γがMHC遺伝子産物の不適当な発現を
引き起こし、次にそれがMHC産物を不適当に発現し、そ
してその産物との関連で自己抗原を示す細胞をもつ組織
に対して自己免疫反応を引き起こすという仮説が立てら
れてきた。こうして、マックデービット（McDevit）〔C
lin．Res.,34巻、163−175ページ（1985）〕は、自己免
疫疾患のIFN−γレベルを減らすこと（例えばIFN−γア
ンタゴニスト投与によって）は有益な効果をもち得るで
あろうということを示唆した。

上記の証拠に加えて、IFN−γは単球上のFcεレセプ
ターの数と密度を増大させる能力によってアレルギーに
おいても役目を果たすであろう；そのことはサイコイド
ーシスおよび乾癬の病原学において暗に示されていた；
そして細胞性免疫を増大し、それが同種移植患者におけ
る組織拒否反応での主要な役割を演じると信じられてい
た。

上記の観点から、IFN−γのレベルを減じることがで
きる化合物の有用性は、例えばいくつかの寄生虫病、ア
レルギー、および関節リウマチ、全身性エリテマトーデ
ス（SLE）、重症筋無力症。インスリン−依存真性糖尿
病、甲状腺炎等を含むMHC−関連性免疫疾患などといっ
た不適当な免疫反応と関連のある疾患の治療に大いに有
利となるだろう。

発明の要約 本発明は、インターフェロン−γの合成を阻害しうる
蛋白質を提供する。この蛋白質は、エプスタインバー−
ウイルスのゲノム中のオープンリーディングフレーム中
のヌクレオチド配列によりコードされ、次のアミノ酸配
列： Met−His−Ser−Ser−Ala−Leu−Leu−Cys−Cys−Leu−
Val−Leu−Leu−Thr−Gly−Val−Arg−Ala−Ser−Pro−
Gly−Gln−Gly−Thr−Gln−Ser−Glu−Asn−Ser−Cys−
Thr−His−Phe−Pro−Gly−Asn−Leu−Pro−Asn−Met−
Leu−Arg−Asp−Leu−Arg−Asp−Ala−Phe−Ser−Arg−
Val−Lys−Thr−Phe−Phe−Gln−Met−Lys−Asp−Gln−
Leu−Asp−Asn−Leu−Leu−Leu−Lys−Glu−Ser−Leu−
Leu−Glu−Asp−Phe−Lys−Gly−Tyr−Leu−Gly−Cys−
Gln−Ala−Leu−Ser−Glu−Met−Ile−Gln−Phe−Tyr−
Leu−Glu−Glu−Val−Met−Pro−Gln−Ala−Glu−Asn−
Gln−Asp−Pro−Asp−Ile−Lys−Ala−His−Val−Asn−
Ser−Leu−Gly−Glu−Asn−Leu−Lys−Thr−Leu−Arg−
Leu−Arg−Leu−Arg−Arg−Cys−His−Arg−Phe−Leu−
Pro−Cys−Glu−Asn−Lys−Ser−Lys−Ala−Val−Glu−
Gln−Val−Lys−Asn−Ala−Phe−Asn−Lys−Leu−Gln−
Glu−Lys−Gly−Ile−Tyr−Lys−Ala−Met−Ser−Glu−
Phe−Asp−Ile−Phe−Ile−Asn−Tyr−Ile−Glu−Ala−
Tyr−Met−Thr−Met−Lys−Ile−Arg−Asn で表されるヒトサイトカイン合成阻害因子（CSIF）と少
なくとも78％のホモロジーを有することを特徴とする。

本発明はまた、配列番号３に示されるアミノ酸配列を
含む精製成熟蛋白質ならびに配列番号３に示されるアミ
ノ酸配列およびシグナルペプチドを含む蛋白質を提供す
る。

本発明はさらに、本発明の蛋白質をコードするヌクレ
オチド配列を含むことを特徴とする、宿主中でBCRF1蛋
白質の発現を指示しうる組換え発現ベクターを提供す
る。

本発明はさらに、本発明の蛋白質を含有する、過剰な
インターフェロン−γ産生に関連する疾患を治療しうる
組成物を提供する。

本発明はIFN−γの高レベルと関連のある疾患を治療
するための方法および組成物に関する。本発明の方法
は、疾患−制御量のBCRF1、エプスタイン−バーウイル
ス由来の蛋白質を投与する段階から成る。本発明はさら
に、組み換えBCRF1を産生するための発現ベクター、精
製BCRF1、および該方法とともに使用するための医薬組
成物を含む。好適には、本発明で用いられるBCRF1は配
列番号１（SEQ ID NO:1）で示されるアミノ酸配列に
よって定義づけられるオープン・リーディングフレーム
（読み取り枠）の成熟ポリペプチドの群から選択される
が、ここで略号はアミノ酸のＬ型を示し、そしてアミノ
酸はＮ−末端から始まって表中に配列されている。

図の簡単な説明 図１は、BCRF1の産生に用いられる哺乳動物の発現ベ
クターの模式的概略図である。

図２は、BCRF1の産生に用いられる細菌の発現ベクタ
ーの模式的概略図である。

発明の詳細な説明 本発明は、IFN−γの過剰な産生に関連する疾患を治
療するための方法および組成物に関する。本発明は部分
的には、サイトカイン合成阻害因子（CSIF）と称される
最近発見された蛋白質をコードしている核酸配列が、EB
V BCR F1 オープン・リーディングフレームと高い程
度のホモロジーを有しているという発見に基づく。EBV
は全ヒト集団に特有のヒトヘルペスで、いくつかの疾患
と関連性がある：例えば、ディルナーら（Dillner et
al,），Adv.Cancer Res.,50巻、95−158ページ（198
8）；ソーレイ−ローソン（Thorley−Lawson），Biochi
m.Biophys,Acta,948巻、263−286ページ（1988）；およ
びタサト（Tasato），Adv.Cancer Res.,49巻、75−125
P（1987）。EBVは約172キロベースの二本鎖DNAゲノムを
もっている〔Bear et al.,Nature,30巻、207−211ペ
ージ（1984）〕。該ゲノムは、EBV（そのうちの一つがB
CFR1である）によって産生される蛋白質に明らかに対応
するオープン・リーディングフレームを含む。

本発明は、BCRF1オープン・リーディングフレームの
成熟ポリペプチド、または蛋白質を含む。分泌性蛋白質
のために、オープン・リーディングフレームは通常、Ｎ
−末端でシグナルペプチドに共有的に結合される成熟し
た、あるいは分泌性産物から成るポリペプチドをコード
する。シグナルペプチドは成熟、または活性のポリペプ
チドの分泌に先立って切断される。切断部位は経験則か
ら高い正確度でもって予見され〔例えば、フォン・ハイ
ジネ（von Heijne），Nucleic Acids Research,14
巻、4638−4690ページ（1986）〕、シグナルペプチドの
正確なアミノ酸組成物はその機能にとって重大なように
はみえない〔例えば、ランダルら（Randall et a
l,），Science,243巻、1156−1159ページ（1989）；カ
イザーら（Kaiser et al.），Science,235巻、312−3
17ページ（1987）〕。従って、成熟ペプチドは、式１で
定義されるオープン・リーディングフレームによってコ
ードされているものと極めて異なるシグナルペプチドを
コードするベクターによっても容易に発現される。

発現系の広範囲さ（すなわち、宿主−発現ベクター組
み合わせ）は、本発明の蛋白質を生産するのに用いるこ
とができる。宿主細胞の可能な型（しかしそれに限定さ
れるものではない）は、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物等
のものを含む。特異的発現系の選択および／または変形
のための指針を与える多くの研究が利用できる：例えば
（二、三名前をあげると）、デュボアとシェパード（de
Boer and Shepard），“Strategies for Optimiz
ing Foreign Gene Expression in Escherichia c
oli",205−247ページでは、クルーン（Kroon）編.Gene
s:Structure and Expression（ジョン・ウィリー ア
ンド サンズ、ニュー・ヨーク、1983）のなかで、いく
つかの大腸菌（E.coli）発現系を論評している；クチャ
ーラパチら（Kucherlapati et al.），Critical Rev
iews in Biochemistry,16巻、４刷、349−379P（198
4）、およびバナージら（Banerji et al.），Genetic
Engineering,5巻、19−31ページ（1983）は、哺乳動
物細胞のトランスフェクションと形質転換の方法を論評
している；レツニコフとゴールド（Reznikoff and Go
ld）編、Maxmizing Gene Expression（バターワー
ス、ボストン、1986）では、大腸菌、酵母、および哺乳
動物細胞における遺伝子発現から選び出したトピックに
ついて論評している；およびスィリー（Thilly）,Mamma
lian Cell Technology（バターワース、ボストン、19
86）は、哺乳動物発現系を論評している。同様に、本発
明と共に使用するのに適した発現ベクターを創製および
／または変形するための特異的cDNAおよび発現制御配列
を結合および／または操作するための技法と条件を記述
した論評が利用できる、例えば、サムブルックら（Samb
rook et al.）,Molecular Cloning:A Laboratory
Manual,2版（ゴールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー、ニューヨーク、1989）。

大腸菌発現系はリッグス（Riggs）によって米国特許
第44,431,739号に開示されており、それは参考文献とし
て組み込まれる。特に、大腸菌における高い発現のため
に有用な原核生物プロモーターは、デュボア（de Boe
r）によって米国特許第4,551,433号に開示され、参考文
献としてここに組み込まれるtacプロモーターと、ルモ
ーら（Remaut et al.）、Gene,15巻、81−93ページ
（1981）によって開示され参考文献として組み込まれる
PLプロモーターである。分泌性発現ベクターもまた大腸
菌宿主に利用できる。特に利用できるのはpIN−III−om
pAベクターで、これはグレイブら（Ghrayeb et al.）
によって，EMBO Ｊ.,3巻、2437−2442ページ（1984）
に開示されており、このなかで、転写されるcDNAがompA
蛋白質のシグナルペプチドをコードしている大腸菌OmpA
遺伝子の部分に融合され、そしてそれが細菌のペリプラ
スミック空隙内に成熟蛋白質の分泌を促すこととなる。
米国特許第4,336,336、4,411,994、4,332,892および4,3
38,397号もまた、原核生物のための発現ベクターの分泌
を開示している。従って、これらの文献は、参考文献と
して組み込まれる。細菌の数多くの株が原核生物の発現
ベクターとして好適な宿主であり、以下のものが含まれ
る:W3110（ATCC No.27325）,JA221,C660,ED767,DH1,LE
392,HB101,X1776（ATCC No.31244）,X2282,RR1（ATCC
No.31343）MRCI等の大腸菌株；バチルス・サチリス
（Bacillus subtilis）株；およびサルモネラ・ティフ
ィムリウム（Salmonella typhimurium）またはセラッ
チア・マルセセンス（Serratia marcescens）、および
シュードモナス（Pseudmonas）属の数多くの種等の他の
腸内細菌類（enterobaceriaceae）。細菌株誘導の一般
的方法、例えば真核生物蛋白質の発現において有用であ
る大腸菌K12×1776など、が米国特許第4,190,495号にカ
ーティスIII（Curtis III）によって開示されている。
従って、この特許は参考文献によって組み込まれる。原
核・真核微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞を含む
発現系もまた本発明の蛋白質を生成するのに用いること
ができる。とりわけ興味のあるのは哺乳動物の発現系で
あるが、それは、それらの翻訳後のプロセシング機構が
生物的活性のある哺乳動物蛋白質を生成するらしいから
である。

いくつかのDNA腫瘍ウイルスが哺乳動物宿主のための
ベクターとして用いられてきた。とりわけ重要なのは、
細菌の複製制御配列にカップリングしているSV40複製、
転写、および／または翻訳を制御する配列である。例え
ば、Mol.Cell.Biol.2巻、161−170ページ（1982）およ
びMol.Cell.Biol.3巻、280−289ページ（1983）に開示
されているようにオカヤマとバーグ（Okayama and Be
rg）によって発展され、タケベら（Takebe et a
l.），Mol.Cell.Biol.8巻、466−472ページ（1988）に
よって改良されたpcDベクター。従って、これらの文献
はここに参考文献として組み込まれる。他のSV40−ベー
スの哺乳動物発現ベクターはアデノウイルス調節要素を
有するものを含み、それらはカウフマンとシャープ（Ka
ufman and Sharp）によりMol.Cell.Biol.,2巻、1304
−1319ページ（1982）に、またクラークら（Clark et
al.）により米国特許第4,675,285号に開示されてお
り、それらは両者ともここに参考文献として組み入れら
れる。サル細胞は一般に上記ベクターにとって好適な宿
主である。SV40 ori配列およびintact Ａ遺伝子を含
んでいるベクターは、（非自律的に複製するプラスミド
よりも高いコピー数および／またはより安定したコピー
数を与えるために）、サル細胞内で自律的に複製するこ
とができる。さらに、SV40 ori配列を含みintact Ａ
遺伝子を含まないベクターは、COS7サル細胞内において
高い（しかし安定ではない）コピー数を与えるために自
律的に複製することができるが、このことはグルツマン
（Gluzman），Cell,23巻、175−182ページ（1981）によ
って開示され、ATCC（受託番号CRL1651）から入手可能
である。上記のSV−40ベースのベクターはまた、宿主細
胞DNA内への組み込みによって、マウスＬ細胞等の他の
哺乳動物細胞を形質転換することができる。

本発明のBCRF1の生物活性はIFN−γ阻害アッセイにお
いて容易に決定される。かかるアッセイはIFN−γを合
成する細胞株または細胞集団を必要とする。好都合なこ
とに、フィトヘマグルチニン（PHA）等のマイトジェン
で刺激される末梢血リンパ球（PBL）がそのような細胞
集団として働くことができる。概略的に言えば、該アッ
セイは以下のように働く:PHA−刺激PBLが二つの等しい
部分に分割される。その一方の部分にBCRF1を含む試料
が加えられる。もう一方の部分はコントロールとして働
く。数日後、両方の培養の上清がIFN−γ試験された。
これは好都合なことに、商業的に入手可能な（例えばゲ
ンザイム社（ボストン、マサチューセッツ）等から）IF
N−ｇに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗
体を用いた標準的ELISAアッセイで行われる。あるい
は、該アッセイの解読を、例えばRNA−ブロッティン
グ、PCR、または一連の方法によって測られる、転写さ
れたIFN−γmRNAの量とすることもできる。PBLは標準的
な手法、例えばミシェルら（Mishell et al.）編,Sel
ected Methods in Cellular Immunology（フリーマ
ン、ニューヨーク、1980）を用いて得られる。

本発明のポリペプチドが可溶性形態、例えば形質転換
された酵母または哺乳動物の細胞の分泌産物として発現
される時、それらは硫酸アンモニウム沈降、イオン交換
クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、および／またはそれに類する
ステップを含んだ、当業分野における標準的な手法に従
って精製することができる；例えばEnzyme Purificati
on and Related Techniques,Methods in Enzymolo
gy,22:233−577（1977）、およびScopes,Protein Puri
fication:Principles and Practice（スプリンガー−
ファーラク、ニューヨーク、1982）はそのような精製の
指針を与える。同様に、本発明のポリペプチドが不溶性
形態、例えば凝集塊、細胞封入またはそれらの類として
発現される時、それらは遠心分離によって粉砕された宿
主細胞から細胞封入体を分離し、カオトロピック剤や還
元剤で細胞封入体を可溶化し、可溶化された混合物を希
釈し、そしてポリペプチドが生物的に活性なコンホーメ
ーションをとるようにカオトロピック剤と管絃剤の濃度
を低下させる、等を含む当業分野における標準的な手法
に従って精製することができる。これらの最後の手法
は、以下の文献に開示されているが、これら文献は参考
文献として組み入れられる：ウィンクラーら（Winkler
et al.），Biochemistry,25:4041−4045（1986）；
ウィンクラーら（Winkler et al.），Biotechnology,
3:992−998（1985）；コスら（Koths et al.），米国
特許第4,569,790号；およびヨーロッパ特許出願8630691
7.5号および86306353.3号。

本明細書中で用いられる“有効量”というのは、過剰
なIFN−γによって仲介される疾患状態の症状を改善す
るのに十分な量を意味する。ある特定の患者にとっての
有効量は、治療される疾患状態の程度、患者の総合的な
健康状態、投与方法、副作用の重大さ等の因子に大いに
依存するであろう。一般に、BCRF1は有効量のBCRF1と医
薬的担体または賦形剤を含む医薬組成物として投与され
る。医薬的担体は、本発明の組成物を患者に送達するの
に適した、相溶性かつ非毒性な物質ならいかなるもので
もよい。一般に、かかる薬物の非経口投与に適した組成
物はよく知られている、例えばRemington's Phrmaceut
ical Science,15版（マック・パブリッシング・カンパ
ニー、イーストン、ペンシルベニア1980）。あるいは、
本発明の組成物は移植可能な薬物送達システムによって
患者の体内に導入されてもよい：例えばアークハートら
（Urquhart et al.），Ann,Rev.Pharmacol.Toxicol.,
24巻、199−236ページ（1984）；ルイス（Lewis）編,Co
ntrolled Release of Pesticides and Pharmaceut
icals（プレナム・プレス、ニューヨーク、1981）；米
国特許第3,773,919号；米国特許第3,270,960号；等。

非経口的に投与される場合、BCRF1は医薬的担体と組
合わさって注射可能な単一投与形態で調整される（例え
ば、溶液、験濁液、またはエマルジョン）。かかる担体
は本来非毒性で非治療的である。そのような担体の例は
通常の生理的食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶
液、およびハンク溶液である。固定オイルやオレイン酸
エチルなどの非水性担体もまた使用できる。好適な担体
は５％デキストロース／生理的食塩水である。担体は等
張性や化学的安定性を高めるような物質、例えば緩衝剤
や保存剤等の添加剤を少量含んでもよい。BCRF1は、好
ましくは約５から20μg/mlの範囲の濃度で凝集塊や他の
蛋白質を実質的に含まない純粋な形で調製される。好適
には、BCRF1は１日あたり約50−800μｇ（すなわち約１
−16μg/kg/日）の範囲の量が送達されるように継続的
に注入投与される。一日あたりの注入量は、副作用、血
球数等の観察に基づいて変えてもよい。

実施例 実施例1.COSサル細胞におけるBCRF1の発現 BCRF1の配列番号１（SEQ ID NO.1）のオープンリー
ディングフレームをコードしている遺伝子が、増幅され
たフラグメントをその後EcoR I−消化pcD（SRα）ベク
ター内に挿入することを可能にするようなプライマーを
用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅された（図
１）。

適当な位置に挿入されたものを運搬するクローンはBC
RF1の発現によって、および／または制限消化物の電気
泳動パターンによって同定された。BCRF1を運搬するそ
のようなベクターの一つはpBCRF1（SRα）と名付けら
れ、ATCCに受託番号68193として寄託された。pBCRF1（S
Rα）は大腸菌MC1061中で増幅され、標準的技法によっ
て単離され、そして以下のようにしてCOS7サル細胞にト
ランスフェクトするのに用いた：トランスフェクション
の１日前、約1.5×10⁶COSサル細胞を、５％ウシ胎児血
清（FCS）と2mMグルタミンを含むダルベッコ変法イーグ
ル培地（DEM）で個々の100mmプレート上に播種した。ト
ランスフェクションを行うために、COS7細胞はトリプシ
ンでインキュベートすることによって皿から取り去ら
れ、血清フリーのDME中で２回洗浄され、血清フリーのD
ME中で10⁷細胞/mlに懸濁された。0.75mlのアリコートが
20μｇのDNAと混合され、無菌の0.4cmエレクトロポレー
ション キュベット（electoroporation cuvette）に
移された。10分後、細胞をバイオラド・ジーン・パルサ
ー・ユニット（BioRad Gene Pulser unit）内で200
ボルト、960μＦでパルスをかけた。さらに10分後、細
胞をキュベットから取り去り、５％FCS、2mMグルタミ
ン、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびゲンタミ
シンを含む20mlDMEを加えた。その混合物を４つの100mm
組織培養皿にアリコートした。37℃、５％CO₂で12−24
時間後、該培地を１％のFCSのみを含む類似の培地に取
り換え、37度、５％CO₂でインキュベーションをさらに7
2時間続け、その後その培地を集めてIFN−γ合成阻害力
をアッセイした。

単離したばかりのPBL（約２×10⁶細胞/ml）10mlアリ
コートを、（ｉ）５％FCSおよび2mMグルタミンを加えた
90％DME、および（ii）あらかじめpBCRF1（SRα）でト
ランスフェクトしたCOS7細胞からの10％上清から成る培
地中で、37℃、PHA（100ng/ml）でインキュベートし
た。24時間後、該細胞と上清を集め、それぞれIFN−γm
RNAまたはIFN−γ蛋白質の存在をアッセイした。コント
ロールは、10％上清が無関係のcDNA挿入を運搬するプラ
スミドであらかじめトランスフェクトしたCOS7培養物か
らのものであるという点を除き、同様に処理した。BCRF
−１処理試料は、コントロールに比べて約50％のIFN−
γ合成阻害を示した。

実施例2.大腸菌内におけるBCRF1の発現 配列番号３（SEQ ID NO.3）に示される配列の成熟B
CRF1をコードする遺伝子が大腸菌中で発現されるだろ
う。

pBCRF1（SRα）のcDNA挿入はM13プラスミド内に再び
クローン化されたが、そこでは部位特異的突然変異によ
って２回変異された：まず初めに成熟BCRF1ポリペプチ
ドのためのコード領域の５′−末端でCla I部位を形成
する、そして次に成熟BCRF1ポリペプチドのためのコー
ド領域の３′−末端でBamH Iを形成する。突然変異され
た配列はその後下記に述べるTRPC11発現ベクター内に容
易に挿入される。

TRPC11ベクターは、合成コンセンサスRBSフラグメン
トをCla Iリンカー（ATGCAT）へ結合させ、そして得ら
れたフラグメントをCla I−制限pMT11hc（Cla I部位を
含むようにあらかじめ変形されている）内にクローン化
することによって構築された。pMT11hcはpBR322の小さ
な（2.3キロベース）高いコピー、AMP^R、TET^S誘導体で
は、それはπVXプラスミドEcoR I−Hind IIIポリリンカ
ー領域を生成する（πVXはマニアティスら（Maniatis
et al.）によってMolecular Cloning:A Laboratory
Manual,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー、1982、に記載されている）。これは、EcoR Iおよ
びBamH IでpMT11hcを制限することによってCla Iを含む
よう変形されたが、得られた５−突出末端が塞がれCla
Iリンカー（CATCGATG）で結合され、それによってEcoR
IおよびBamH I部位が修復され、Smal I部位がCal I部位
に取って代わられた。TRPC11構築からの一つの形質転換
体がCla I部位の横に位置するランダムRBS配列を有し
た。Cla I部位のうちの一つおよびRBS配列の第二のコピ
ーの部分が、このプラスミドをPst Iで消化し、Bal31ヌ
クレアーゼで処理し、EcoR Iで制限し、そして４つのす
べてのデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下でT4DNA
ポリメラーゼで処理することによって単離された。得ら
れた30−40bpフラグメントがPAGEによって回復され、そ
してSma I−制限pUC12内にクローン化された。pKC101
（ニコルスら（Nichols et al.），Methods in Enz
ymology,101巻、155ページ（アカデミック・プレス、ニ
ューヨーク、1983）記載）由来の248bpの大腸菌trpP−
産生EcoR Iフラグメントがその後EcoR I部位内にクロー
ン化され、TRPC11の構築を完成させたが、それは図２に
示されている。TRPC11は、まずCla IおよびBamH Iで消
化、精製された後、標準的リゲーション溶液中で成熟BC
RF1をコードするヌクレオチド配列を含むM13のCla I−B
amH Iフラグメントと混合されることによって、BCRF1の
ベクターとして用いられる。挿入−含有TRPC11（TRPC11
−BCRF1といわれる）は、例えばATCCから受託番号33876
で入手可能な大腸菌K12株JM101中で伸長する。

本出願人は、pBCRF1（SRα）を運搬する大腸菌MC1061
をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロ
ックビル、メリーランド，アメリカ（ATCC）へ受託番号
68193で寄託した。この寄託は1989年12月20日に、特許
手続上の培養菌の寄託のためのATCCの承認という条件の
下でなされたが、それは35USC122および37CFR1.14に従
って該寄託がアメリカ特許商標局長によって入手可能と
され、米国特許発行時に公にされて入手可能となること
が保証され、該寄託が維持されることが必要とされる。
寄託された菌株の入手可能性は、その特許法に従って、
いかなる政府の権限の下においても容認された権利に違
反した発明を実施するための認可と解釈されてはならな
い。

該寄託は、微生物の寄託に関するブタペスト条約の要
求に合わせて修正された。

本発明の上記の態様の記載は例示および記述を目的と
して示されたものである。それらは、本発明を完全に網
羅したり、あるいは開示されたそのままの形に正確に本
発明を限定することを意図するものではなく、明らかに
上記の教示に鑑みて多くの修正や変異が可能である。実
施態様は、他の当業者が本発明を種々の態様で最も良く
利用することができるよう、そして特定の利用に適した
種々の修正を加えて本発明を最も良く利用することがで
きるよう、本発明の精神を最も良く説明するために選択
され、記載された。本発明の範囲は、ここに添付された
請求の範囲によって定義づけられるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．147，Ｎ ｏ．１（1985）Ｐ．81−98

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】インターフェロン−γの合成を阻害しうる
   蛋白質であって、エプスタインバー−ウイルスのゲノム
   中のオープンリーディングフレーム中のヌクレオチド配
   列によりコードされ、次のアミノ酸配列： Met−His−Ser−Ser−Ala−Leu−Leu−Cys−Cys−Leu−
   Val−Leu−Leu−Thr−Gly−Val−Arg−Ala−Ser−Pro−
   Gly−Gln−Gly−Thr−Gln−Ser−Glu−Asn−Ser−Cys−
   Thr−His−Phe−Pro−Gly−Asn−Leu−Pro−Asn−Met−
   Leu−Arg−Asp−Leu−Arg−Asp−Ala−Phe−Ser−Arg−
   Val−Lys−Thr−Phe−Phe−Gln−Met−Lys−Asp−Gln−
   Leu−Asp−Asn−Leu−Leu−Leu−Lys−Glu−Ser−Leu−
   Leu−Glu−Asp−Phe−Lys−Gly−Tyr−Leu−Gly−Cys−
   Gln−Ala−Leu−Ser−Glu−Met−Ile−Gln−Phe−Tyr−
   Leu−Glu−Glu−Val−Met−Pro−Gln−Ala−Glu−Asn−
   Gln−Asp−Pro−Asp−Ile−Lys−Ala−His−Val−Asn−
   Ser−Leu−Gly−Glu−Asn−Leu−Lys−Thr−Leu−Arg−
   Leu−Arg−Leu−Arg−Arg−Cys−His−Arg−Phe−Leu−
   Pro−Cys−Glu−Asn−Lys−Ser−Lys−Ala−Val−Glu−
   Gln−Val−Lys−Asn−Ala−Phe−Asn−Lys−Leu−Gln−
   Glu−Lys−Gly−Ile−Tyr−Lys−Ala−Met−Ser−Glu−
   Phe−Asp−Ile−Phe−Ile−Asn−Tyr−Ile−Glu−Ala−
   Tyr−Met−Thr−Met−Lys−Ile−Arg−Asn で表されるヒトサイトカイン合成阻害因子（CSIF）と少
   なくとも78％のホモロジーを有する蛋白質。
2. 【請求項２】配列番号３に示されるアミノ酸配列を含
   む、精製成熟蛋白質。
3. 【請求項３】配列番号３に示されるアミノ酸配列および
   シグナルペプチドを含む蛋白質。
4. 【請求項４】シグナルペプチドが配列番号１に示される
   アミノ酸配列に含まれる、請求項３記載の蛋白質。
5. 【請求項５】宿主中でエプスタインバー−ウイルス蛋白
   質の発現を指示しうる組換え発現ベクターであって、該
   ベクターは、エプスタインバー−ウイルスのゲノム中の
   オープンリーディングフレーム中のヌクレオチド配列を
   含み、該ヌクレオチド配列は、次のアミノ酸配列： Met−His−Ser−Ser−Ala−Leu−Leu−Cys−Cys−Leu−
   Val−Leu−Leu−Thr−Gly−Val−Arg−Ala−Ser−Pro−
   Gly−Gln−Gly−Thr−Gln−Ser−Glu−Asn−Ser−Cys−
   Thr−His−Phe−Pro−Gly−Asn−Leu−Pro−Asn−Met−
   Leu−Arg−Asp−Leu−Arg−Asp−Ala−Phe−Ser−Arg−
   Val−Lys−Thr−Phe−Phe−Gln−Met−Lys−Asp−Gln−
   Leu−Asp−Asn−Leu−Leu−Leu−Lys−Glu−Ser−Leu−
   Leu−Glu−Asp−Phe−Lys−Gly−Tyr−Leu−Gly−Cys−
   Gln−Ala−Leu−Ser−Glu−Met−Ile−Gln−Phe−Tyr−
   Leu−Glu−Glu−Val−Met−Pro−Gln−Ala−Glu−Asn−
   Gln−Asp−Pro−Asp−Ile−Lys−Ala−His−Val−Asn−
   Ser−Leu−Gly−Glu−Asn−Leu−Lys−Thr−Leu−Arg−
   Leu−Arg−Leu−Arg−Arg−Cys−His−Arg−Phe−Leu−
   Pro−Cys−Glu−Asn−Lys−Ser−Lys−Ala−Val−Glu−
   Gln−Val−Lys−Asn−Ala−Phe−Asn−Lys−Leu−Gln−
   Glu−Lys−Gly−Ile−Tyr−Lys−Ala−Met−Ser−Glu−
   Phe−Asp−Ile−Phe−Ile−Asn−Tyr−Ile−Glu−Ala−
   Tyr−Met−Thr−Met−Lys−Ile−Arg−Asn で表されるヒトサイトカイン合成阻害因子（CSIF）と少
   なくとも78％のホモロジーを有する蛋白質をコードする
   ことを特徴とするベクター。
6. 【請求項６】宿主中でBCRF1蛋白質の発現を指示しうる
   組換え発現ベクターであって、該ベクターは、配列番号
   ３に示されるアミノ酸配列によって定義される蛋白質を
   コードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするベ
   クター。
7. 【請求項７】宿主中でBCRF1蛋白質の発現を指示しうる
   組換え発現ベクターであって、該ベクターは、配列番号
   ３に示されるアミノ酸配列によって定義される蛋白質お
   よびシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を
   含むことを特徴とするベクター。
8. 【請求項８】配列番号１に示されるアミノ酸配列によっ
   て定義される蛋白質をコードする、請求項７記載の組換
   え発現ベクター。
9. 【請求項９】インターフェロン−γの合成を阻害しうる
   蛋白質を薬学的に許容される担体または賦形剤とともに
   含有する、過剰なインターフェロン−γ産生に関連する
   疾患を治療しうる組成物であって、前記蛋白質はエプス
   タインバー−ウイルスのゲノム中のオープンリーディン
   グフレーム中のヌクレオチド配列によりコードされ、次
   のアミノ酸配列： Met−His−Ser−Ser−Ala−Leu−Leu−Cys−Cys−Leu−
   Val−Leu−Leu−Thr−Gly−Val−Arg−Ala−Ser−Pro−
   Gly−Gln−Gly−Thr−Gln−Ser−Glu−Asn−Ser−Cys−
   Thr−His−Phe−Pro−Gly−Asn−Leu−Pro−Asn−Met−
   Leu−Arg−Asp−Leu−Arg−Asp−Ala−Phe−Ser−Arg−
   Val−Lys−Thr−Phe−Phe−Gln−Met−Lys−Asp−Gln−
   Leu−Asp−Asn−Leu−Leu−Leu−Lys−Glu−Ser−Leu−
   Leu−Glu−Asp−Phe−Lys−Gly−Tyr−Leu−Gly−Cys−
   Gln−Ala−Leu−Ser−Glu−Met−Ile−Gln−Phe−Tyr−
   Leu−Glu−Glu−Val−Met−Pro−Gln−Ala−Glu−Asn−
   Gln−Asp−Pro−Asp−Ile−Lys−Ala−His−Val−Asn−
   Ser−Leu−Gly−Glu−Asn−Leu−Lys−Thr−Leu−Arg−
   Leu−Arg−Leu−Arg−Arg−Cys−His−Arg−Phe−Leu−
   Pro−Cys−Glu−Asn−Lys−Ser−Lys−Ala−Val−Glu−
   Gln−Val−Lys−Asn−Ala−Phe−Asn−Lys−Leu−Gln−
   Glu−Lys−Gly−Ile−Tyr−Lys−Ala−Met−Ser−Glu−
   Phe−Asp−Ile−Phe−Ile−Asn−Tyr−Ile−Glu−Ala−
   Tyr−Met−Thr−Met−Lys−Ile−Arg−Asn で表されるヒトサイトカイン合成阻害因子（CSIF）と少
   なくとも78％のホモロジーを有することを特徴とする組
   成物。
10. 【請求項１０】過剰なインターフェロン−γ産生に関連
    する疾患を治療しうる組成物であって、配列番号３に示
    されるアミノ酸配列によって定義される蛋白質を、薬学
    的に許容される担体または賦形剤とともに含有する組成
    物。
11. 【請求項１１】過剰な免疫応答異常に関連し、過剰なイ
    ンターフェロン−γレベルに起因する疾患を治療するた
    めの、請求項９または10に記載の組成物。