DE69828702T2

DE69828702T2 - Antitumorale uridinderivate

Info

Publication number: DE69828702T2
Application number: DE69828702T
Authority: DE
Inventors: W. Raymond KLECKER; Lawrence Anderson; G. Aspandiar KATKI; M. Jerry COLLINS
Original assignee: National Institutes of Health NIH
Current assignee: National Institutes of Health NIH
Priority date: 1997-10-30
Filing date: 1998-10-30
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2018-10-31
Also published as: CA2307002A1; ES2236962T3; EP1027365A2; WO1999023104A2; ATE287414T1; DE69828702D1; JP2009108108A; JP2001522034A; CA2307002C; EP1027365B1; AU758426B2; WO1999023104A3; DK1027365T3; AU1449599A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Diagnose und/oder zum Behandeln von Tumorzellen mit Antitumormitteln, die durch Thymidylatsynthase (TS) aktiviert werden. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung und Verwendung Positronen-emittierender Nukleosid-Analoga zur Verwendung bei Bildgebungsanwendungen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Diagnose und/oder zum Behandeln von Tumorzellen durch Verabreichen von Verbindungen wie z.B. Nukleosid-Analoga-Prodrugs und verwandten Verbindungen oder Zusammensetzungen, welche diese in einer Menge enthalten, die zur Identifizierung empfindlicher Tumoren in Biopsieproben oder mittels einer externen Bildgebung effektiv ist, und dann Vermindern oder Hemmen der Replikation oder Ausbreitung von Tumorzellen.
Thymidylatsynthase (TS) ist ein für die DNA-Synthese essentielles Enzym. Es liegt jedoch in Tumorzellen reichlicher vor als in normalen Geweben. Über Jahrzehnte waren die Forschung und klinische Studien auf die Hemmung von TS gerichtet, um Tumore zu schrumpfen. In manchen Fällen war diese Strategie mäßig erfolgreich. So werden z.B. Fluoruracil und Floxuridin bei der Behandlung von Brust-, Kolon-, Bauchspeicheldrüsen-, Magen-, Eierstock- und Kopf/Hals-Karzinomen verwendet, wie es von E. Chu und C. H. Takimoto, „Antimetabolites", in: V. T. DeVita Jr., S. Hellman, S. A. Rosenberg, Hrsg., Cancer: Principles and Practice of Oncology, Band 1, 4. Auflage, Philadelphia, Lippincott, 1993, 358–374, beschrieben worden ist.
Leider sind die meisten Tumore gegen diese Strategie inhärent resistent und selbst diejenigen Tumore, die zunächst empfindlich sind, entwickeln während des Behandlungsverlaufs eine Resistenz, wie es von S. M Swain, M. E. Lippman, E. F. Egan, J. C. Drake, S. M. Steinberg, C. J. Allegra in „Fluorouracil and High-Dose Leucovorin in Previously Treated Patients with Metastatic Breast Cancer", J. Clin. Oncol. 7, 890–899, 1989, berichtet worden ist. Neuere Anwendungen molekularer Sonden für TS haben eine konsistente Beziehung zwischen der Resistenz und der starken Expression von TS gezeigt, wie es in den folgenden Artikeln beschrieben ist: P. G. Johnston, R. Mick, W. Recant, K. A. Behan, M. E. Dolan, M. J. Ratain et al., „Thymidylate Synthase Expression and Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Patients with Advanced Head and Neck Cancer", J. Natl. Cancer Inst. 89, 308–313, 1997; H. J. Lenz, C. G. Leichman, K. D. Danenberg, P. V. Danenberg, S. Groshen, H. Cohen, L. Laine, P. Crookes, H. Silberman, J. Baranda, Y. Garcia, J. Li, L. Leichman, "Thymidylate Synthase mRNA Level in Adenocarcinoma of the Stomach: A Predictor for Primary Tumor Response and Overall Survival", J. Clin. Oncol. 14, 176–182, 1996; P. G. Johnston, H. J. Lenz, C. G. Leichman, K. D. Danenberg, C. J. Allegra, P. V. Danenberg, L. Leichman, "Thymidylate Synthase Gene and Protein Expression Correlate and Are Associated with Response to 5-Fluorouracil in Human Colorectal and Gastric Tumors", Cancer Res. 55, 1407–1412, 1995; L. Leichman, H. J. Lenz, C. G. Leichman, S. Groshen, K. Danenberg, J. Baranda et al., "Quantitation of Intratumoral Thymidylate Synthase Expression predicts for Resistance to Protracted Infusion of 5-Fluorouracil and Weekly Leucovorin in Disseminated Colorectal Cancers: Preliminary Report from an Ongoing Trial", Eur. J. Cancer 31A, 1305–1310, 1995; M. Kornmann, K. H. Link, L. Staib., P. V. Danenberg, "Quantitation of Intratumoral Thymidylate Synthase Predicts Response and Resistance to Hepatic Artery Infusion with Fluoropyrimidines in Patients with Colorectal Metastases", Proc. AACR 38, 614,1997.
Über eine neue Generation von Arzneistoffen, die so gestaltet sind, dass sie TS hemmen, und die sich gegenwärtig in den letzten Stufen des klinischen Testens befinden, wird von N. Tourotoglou, R. Pazdur in „Thymidylate Synthase Inhibitors", Clin. Cancer Res. 2, 227–243, 1996 berichtet. Trotz der enormen Resourcen, die zur Verbesserung der Effektivität von TS-Hemmstoffen der ersten Generation aufgewandt werden, sind weder die vorhandenen Arzneistoffe, noch dieser neue Satz von Verbindungen in Tumoren effektiv, die ein hohes Maß an TS-Aktivität aufweisen. Gegenwärtig steht keine spezifische Therapie zur Verfügung, sobald ein Tumor aufgrund hoher TS-Konzentrationen resistent geworden ist.
In Cancer Chemother. Pharmacol. 29, 455–460, 1992, beschreiben Chandrasekoran et al., dass die Behandlung experimentell wachsender L1210-Leukämiezellen von Mäusen mit ara-U (Arabinosyluracil) (200 bis 1000 μM) für 48 Stunden eine dosisabhängige Akkumulierung von Zellen in der S-Phase verursachte. In Leukemia Research, Band 11, Nr. 11, Seiten 1031–1039, 1987, beschreiben Xiang-bin Kong et al. die Induktion einer -F-Differenzierung in HL-60-Zellen durch FAU (2'-Fluor-ara-U). Es ist jedoch gezeigt, dass FAC und Ara-C auf der Basis der ED₅₀-Werte etwa 10⁵ bzw. etwa 10⁶ Mal effektiver sind. In Cancer Chemother. Pharmacol 13, 195–199, 1984 beschreiben Novotny et al. dUrd (Desoxyuridin) als eines von vielen potenziellen, das Krebswachstum hemmenden Pyrimidinnukleosiden. Der Artikel beschreibt Details sowohl der Transport- als auch der Biotransformationsprozesse verschiedener Zusammensetzungen, die dUrd umfassen.
Anstelle der Hemmung von TS haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Hypothese aufgestellt, dass es möglich ist, dieses Enzym zur Aktivierung von Uridin-Analoga-Prodrugs zu toxischeren Thymidin-Analoga zu verwenden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bereits in Molecular Pharmacology 46, 1204–1209, 1994, in einem Artikel mit dem Titel „Toxicity, Metabolism, DNA Incorporation with Lack of Repair, and Lactate Production for 1-(2'Fluoro-2'deoxy-β-D-arabinofuranosyl)-5-iodouracil (FIAU) in U-937 and MOLT-4 Cells" gezeigt, dass 1-(2'-Fluor-2'-desoxy-β-D-arabinofuranosyl)-uracil (FAU) durch intakte U-937- und MOLT-4-Zellen intrazellulär zu FAU-Monophosphat (FAUMP) phosphoryliert, in dessen methylierte Form, 5-Methyl-FAUMP (FMAUMP) umgewandelt und in DNA eingebaut worden ist. Diese früheren Beobachtungen legten nahe, dass FAU ein geeigneter Prototyp zum Testen des cytotoxischen Potenzials TS-aktivierter Prodrugs ist. Es sollte beachtet werden, dass die letztgenannte Studie Daten für andere Zwecke geliefert hat und die vorliegende Erfindung nicht direkt betrifft. Um die Gültigkeit des vorliegenden Konzepts zu zeigen, haben die Erfinder (1) festgestellt, dass TS das Enzym ist; das die Methylierung katalysiert, (2) die Nettobildungsgeschwindigkeiten methylierter Spezies in verschiedenen Zellen untersucht und (3) die Nettobildungsgeschwindigkeiten methylierter Spezies mit cytotoxischen Effekten krreliert.
Von den Pyrimidinnukleosiden sind 2'-Desoxyuridin-Analoga (dUrd-Analoga) weniger toxisch als ihre entsprechenden Thymidin-Analoga (dThd-Analoga), wie es von X. B. Kong, M. Andreeff, M. P. Fanucchi, J. J. Fox, K. A. Watanabe, P. Vidal, T. C. Chou in „Cell Differentiation Effects of 2'-Fluoro-1-beta-D-arabinofuranosyl Pyrimidines in HL-60 Cells", Leuk. Res. 11, 1031–1039, 1987, beschrieben worden ist. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben angenommen, dass nach dem Eintritt in die Zelle und die Phosphorylierung ein Analogon von dUrd als selektives Prodrug dienen würde, wenn es von TS zur Erzeugung des entsprechenden dThd-Analogons methyliert werden kann. Folglich wären Tumoren, die aufgrund von hohen TS-Konzentrationen gegen TS-Hemmstoffe resistent sind, gegen diese Desoxyuridin-Analoga (dUrd-Analoga) besonders empfindlich, da sie bei der Erzeugung der toxischen Thymidinspezies (dThd-Spezies) effizienter sind. Diese Strategie ist vollständig neu, da sie sich von allen bisherigen Ansätzen bezüglich TS als Antitumormittel unterscheidet. Im Gegensatz zu bisherigen Forschungen und klinischen Studien, die auf die Hemmung von TS gerichtet sind, um Tumore zu schrumpfen, nutzen die Erfinder der vorliegenden Erfindung TS zum Aktivieren von Uridin-Analoga-Prodrugs zu den toxischeren Thymidin-Analoga, um Tumorzellen zu vermindern oder zu hemmen, insbesondere Tumorzellen, die inhärent resistent sind oder die gegen bestehende Therapien eine Resistenz entwickeln. Die vorliegende Erfindung wirkt zudem bezüglich aller bisherigen Ansätze in Richtung einer Hemmung von TS als Antitumorziel sehr gut ergänzend.
Da ferner der Erfolg einer Therapie mit Arzneistoffen wie z.B. FAU oder dessen Analoga mit dem Ausmaß des Einbaus in DNA zusammenhängt, kann die DNA-Analyse eine diagnostische Information bezüglich der optimalen Therapie für einen Tumor liefern. Folglich kann durch Untersuchen einer Biopsieprobe eines Tumors oder durch eine externe Bildgebung von Tumoren vorhergesagt werden, ob eine Therapie mit FAU oder verwandten Verbindungen erfolgreich ist, oder ob eine alternative Therapie verwendet werden sollte.
Darüber hinaus gibt es zur Bewertung einer Tumortherapie viele verschiedene andere medizinische Umstände, bei denen es wichtig ist, die Proliferationsgeschwindigkeit (das Wachstum) von Zellen innerhalb eines bestimmten Gewebes im Körper zu bestimmen. Diese umfassen: Bewertung der Knochenmarksfunktion (z.B. nach der Transplantation und/oder Stimulation mit Wachstumsfaktoren), Regeneration der Leber nach einem chirurgischen Eingriff oder einer Verletzung, und Expression der Enzymfunktion nach einer Gentherapie.
Herkömmliche Ansätze zur Bestimmung der Wachstumsgeschwindigkeit waren invasiv, d.h. es war erforderlich, eine Biopsie von dem Patienten zu erhalten. Zusätzlich zu den Unannehmlichkeiten und den Risiken, die mit Biopsieverfahren verbunden sind, wird nur eine kleine Gewebeprobe erhalten. Folglich weist eine Biopsie das inhärente Risiko einer Fehldiagnose auf, da die kleine Probe gegebenenfalls nicht für den gesamten Bereich repräsentativ ist. Folglich gibt es im Stand der Technik einen Bedarf für andere Verfahren zur Bestimmung der Wachstumsgeschwindigkeit von Geweben.
Nicht-invasive, externe Bildgebungsverfahren vermeiden den Bedarf für Biopsien und weisen auch das Vermögen des Abtastens großer Bereiche des Körpers und gegebenenfalls des gesamten Körpers auf. Da das Wachstum (Proliferation) die Synthese von DNA aus Nukleosiden erfordert, stellt die Verabreichung von Nukleosiden, die mit einem Positronenemitter radiomarkiert worden sind, das Vermögen zur externen Überwachung von Ereignissen, die innerhalb des Körpers stattfinden, durch die Verwendung von Bildgebungstechnologien wie z.B. PET-Scannern (Positronenemissionstomographie-Scannern) oder anderen Photonendetektionsvorrichtungen wie z.B. SPECT (Einzelphotonenemissionscomputertomographie) oder Gamma-Kameras bereit.
Diese Bildgebungstechnologien sind nur durch die Verfügbarkeit von Sonden beschränkt, deren biologisches Schicksal Informationen bezüglich des Proliferationszustands des untersuchten Gewebes liefert. Thymidin ist eine besonders gut geeignete Sonde zur Überwachung des Wachstums/der DNA-Synthese, da es sich um das einzige Nukleosid handelt, bei dem der direkte Einbau exogen eingesetzter Nukleoside in DNA gewöhnlich durch „Salvage"-Wege stattfindet. Für den Einbau von Thymidin gibt es keine Abhängigkeit von Ribonukleotidwegen. Thymidin selbst ist als Sonde bei diesen Bildgebungstechnologien ungeeignet, da das Molekül im Körper schnell abgebaut wird. Thymidin-Analoga wie z.B. FMAU und FIAU sind hervorragende Bildgebungssonden, da sie 1) vollständig den Thymidinwegen zum Einbau in DNA folgen, 2) nicht durch katabolische Enzyme abgebaut werden und 3) mit ¹⁸F markiert werden können, bei dem es sich um das für die Positronenbildgebung am meisten bevorzugte Atom handelt.
Im Stand der Technik wurden Bildgebungssonden verwendet, die andere Positronenemittierende Reste aufweisen. Beispielsweise wurde über eine Synthese von ¹¹C-FMAU berichtet. Es gibt jedoch eine Anzahl praktischer Beschränkungen, die von der 20 min-Halbwertszeit von ¹¹C vorgegeben sind. Sondenmoleküle, die ¹¹C enthalten, müssen buchstäblich an Ort und Stelle hergestellt und innerhalb einer Stunde verwendet werden. Dieses Erfordernis macht es unmöglich, ein regionales Herstellungszentrum zu unterhalten und die Moleküle an umliegende medizinische Einrichtungen zu transportieren. Folglich muss jede Einrichtung, die Bildgebungsstudien unter Verwendung einer ¹¹C-markierten Sonde durchführen will, an Ort und Stelle die Cyclotroneinrichtungen zur Herstellung des Isotops aufweisen. Eine zusätzliche Beschränkung der ¹¹C-enthaltenden Marker entsteht, wenn die biologischen Phänomene zur vollen Ausprägung mehr als eine Stunde benötigen. Die kurze Halbwertszeit von ¹¹C bedeutet, dass nicht genügend ¹¹C verbleibt, um in diesen Situationen zur Bildgebung zu dienen.
Zusätzlich zu ¹¹C-enthaltenden Sonden sind im Stand der Technik Sonden bekannt, die mit ¹⁸F markiert sind. ¹⁸F-Fluordesoxyglucose (FDG), eine gegenwärtig verwendete Bildgebungssonde, wird in einer regionalen Einrichtung synthetisiert und von dieser verteilt, was sie für Bildgebungszwecke leichter verfügbar macht. Ferner wurde über Nukleosid-Analoga, die ¹⁸F in Positionen enthalten, die von denjenigen der vorliegenden Erfindung verschieden sind, wie z.B. ¹⁸F an der 5-Position von Uracil, berichtet.
Trotz der Existenz der vorstehend diskutierten Sondenmoleküle gibt es in dem Fachgebiet einen Bedarf für Sondenmoleküle zur Verwendung in externen Bildgebungstechnologien. Darüber hinaus gibt es in dem Fachgebiet einen Bedarf für zusätzliche therapeutische Verfahren zur Behandlung von Zellproliferationsstörungen. Dieses Bedürfnis und andere Bedürfnisse wurden durch die vorliegende Erfindung erfüllt.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose und/oder zum Behandeln von Tumoren. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen sind Uridin-Analoga, die durch Thymidylatsynthase in einer Menge aktiviert werden, die zur Diagnose oder zur Verminderung oder Hemmung der Replikation oder Ausbreitung von Tumorzellen effektiv ist. Diese Verbindungen und Zusammensetzungen, welche diese Verbindungen umfassen, kön nen einfach durch bekannte Modi verabreicht werden und sie können in Dosierungen verabreicht werden, die sicher sind und an den relevanten Stellen eine Tumorhemmung bereitstellen. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Auswählen eines Uridin-Analogons, das zur Verminderung oder Hemmung der Replikation oder Ausbreitung von Tumorzellen geeignet ist, bereit, umfassend die Schritte:
Bereitstellen eines Uridin-Analogons, das in der 5-Position unsubstituiert ist und bei dem an der Base ein Phospho-Zucker oder -Zucker-Analogon gebunden ist;
Testen des Uridin-Analogons bezüglich der Aktivierung durch Thymidylatsynthase, die mittels Methylierung an der 5-Position gemessen wird; und
Auswählen des Uridin-Analogons, wenn gefunden wird, dass es durch Thymidylatsynthase aktiviert wird.
In diesem Verfahren umfasst der Schritt des Testens typischerweise:
Messen der Cytotoxizität des Uridin-Analogons bezüglich mindestens einer Zelllinie mit einer starken Expression des Thymidylatsynthaseenzyms und mindestens einer Zelllinie mit einer schwachen Expression des Thymidylatsynthaseenzyms; und bei dem der Schritt des Auswählens umfasst:
Auswählen des Uridin-Analogons, wenn die bezüglich der mindestens einen Zelllinie mit einer starken Expression des Thymidylatsynthaseenzyms gemessene Cytotoxizität größer ist als die bezüglich der mindestens einen Zelllinie mit einer schwachen Expression des Thymidylatsynthaseenzyms gemessene Cytotoxizität.
Vorzugsweise ist die Zelllinie mit einer starken Expression des Thymidylatsynthaseenzyms eine U937-Zelllinie oder eine CEM-Zelllinie. Die Zelllinie mit einer schwachen Expression des Thymidylatsynthaseenzyms ist eine L1210-Zelllinie oder eine Raji-Zelllinie.
In dem vorstehend definierten erfindungsgemäßen Verfahren kann das Uridin-Analogon ein Radioisotop enthalten. Das Radioisotop ist z.B. ¹⁸F oder ¹¹C.
In anderen Ausführungsformen können die Analoga für Bildgebungsanwendungen verwendet werden, obwohl sie nicht in DNA eingebaut werden.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren zur Identifizierung empfindlicher Tumore in Biopsieproben oder über eine externe Bildgebung und/oder zur Hemmung oder Verminderung der Replikation oder Ausbreitung von Tumorzellen bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt daher die Verwendung eines Uridin-Analogons, das gemäß einem vorstehend definierten erfindungsgemäßen Verfahren auswählbar ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose von Tumoren im menschlichen oder tierischen Körper bereit.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Behandlung für Tumore und andere Erkrankungen bereitzustellen, die durch eine anomale Zellproliferation gekennzeichnet sind. Die Erfindung stellt daher ferner die Verwendung eines Uridin-Analogons, das gemäß dem vorstehend definierten erfindungsgemäßen Verfahren auswählbar ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Tumoren oder Krebs oder zum Lindern der zellschädigenden Effekte bereit, die mit Tumoren oder Krebs zusammenhängen, wobei das Verfahren das Verabreichen des Medikaments in einer Menge umfasst, die zur Verminderung oder Hemmung der Replikation oder Ausbreitung von Tumor- oder Krebszellen oder zur Linderung der zellschädigenden Effekte effektiv ist. In diesem Aspekt der Erfindung ist das Uridin-Analogon typischerweise FAU, d-Urd oder ara-U.
In den weiteren Aspekten stellt die vorliegende Erfindung bereit:
Die Verwendung eines Uridin-Analogons, das gemäß dem vorstehend definierten erfindungsgemäßen Verfahren auswählbar ist, zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Verwendung bei der Diagnose von Tumoren, die gegen Thymidylatsynthaseinhibitoren resistent sind.
Die Verwendung eines Uridin-Analogons, das gemäß dem vorstehend definierten erfindungsgemäßen Verfahren auswählbar ist, zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Verwendung bei der Bewertung der Angemessenheit der Behandlung eines Tumors mit einem Thymidylatsynthaseinhibitor.
Die Verwendung eines Uridin-Analogons, das gemäß dem vorstehend definierten erfindungsgemäßen Verfahren auswählbar ist, zur Herstellung eines Mittels zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose von Tumoren, die gegen Thymidylatsynthaseinhibitoren resistent sind, wobei das Verfahren zur Diagnose von Tumoren die Schritte umfasst:

(a) Verabreichen des Uridin-Analogons an die Tumoren, wobei das Analogon mit einem Positronenemitter markiert ist; und
(b) Messen des DNA-Einbaus durch externe Bildgebung.

Die Verwendung eines Uridin-Analogons, das gemäß dem vorstehend definierten erfindungsgemäßen Verfahren auswählbar ist, zur Herstellung eines Mittels zur Verwendung in einem Bewertungsverfahren zur Bewertung der Angemessenheit der Behandlung eines Tumors mit einem Thymidylatsynthaseinhibitor, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Verabreichen des Uridin-Analogons an die Tumoren, wobei das Analogon mit einem Positronenemitter markiert ist; und
(b) Bestimmen des Ausmaßes der maximalen Thymidylatsynthaseinhibierung und des Fortdauerns der Thymidylatsynthaseinhibierung im Zeitverlauf zwischen Dosierungen durch externe Bildgebung.

Die Verwendung eines Uridin-Analogons, das gemäß dem vorstehend definierten erfindungsgemäßen Verfahren auswählbar ist, zur Herstellung eines Mittels zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose von Tumoren, die gegen Thymidylatsynthaseinhibitoren resistent sind, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Verabreichen des Mittels vor dem Entnehmen von Biopsieproben;
(b) Entnehmen der Biopsieproben; und
(c) Analysieren von DNA von den Biopsieproben bezüglich des Ausmaßes des Einbaus des Analogons.

Bei diesen Aspekten der Erfindung ist der Positronenemitter typischerweise ¹⁸F oder ¹¹C. Die externe Bildgebung wird typischerweise unter Verwendung einer Positronenemissionstomographie erreicht.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen. Diese und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach dem Studieren der folgenden detaillierten Beschreibung und den Patentansprüchen deutlich.
Die 1 zeigt die allgemeine Struktur für viele TS-Substrate. Für das endogene Nukleosid dUrd ist W = X = Y = H und Z = OH. FAU weist nur eine einzelne Substitution auf, W = F. Es ist auch eine Phosphatgruppe erforderlich, die an der 5'-Position an den Zucker gebunden ist. Die entsprechenden Thymidin-Analoga weisen an der 5-Position der Uracilbase eine Methylgruppe (-CH₃) auf.
Die 2 zeigt graphisch den Effekt auf das Zellwachstum eines kontinuierlichen 72-stündigen Aussetzens gegenüber: (A) FAU oder (B) FMAU.
Zellbezeichnungen: CEM = •; MOLT-4 = O; RAJI =
; U-937 = ∇; K-562 =
; L1210 = ☐.
Die 3 zeigt graphisch den Zusammenhang zwischen dem DNA-Einbau und dem Effekt auf das Zellwachstum. (A) FAU oder (B) FMAU. CEM = •; MOLT-4 = O; RAJI =
; U-937 = ∇; K-562 =
; L1210 = ☐.
Die 4 zeigt graphisch die relative Empfindlichkeit von Zelllinien auf die Wachstumshemmung durch FAU verglichen mit dem Aktivierungspotenzial für TS, und zwar unabhängig gemessen als relative Enthalogenierung von IdUrd. Die empfindlichsten Zelllinien (U-937, CEM, MOLT-4) weisen eine Enthalogenierung von 50% oder mehr auf. Die am wenigsten empfindlichen Linien (Raji, L1210) weisen 15% oder weniger auf. CEM = •; MOLT-4 = O; RAJI =
; U-937 = ∇; K-562 =
; L1210 = ☐.
Die 5 zeigt graphisch die FAUMP-Umwandlung zu FMAUMP durch TS in U-937-Zellextrakten, wie sie sich durch die Ansammlung von tritiiertem Wasser zeigt. Die Umwandlungsgeschwindigkeit zu FMAUMP betrug etwa 1% der Geschwindigkeit der dTMP-Bildung aus dUMP. Ähnliche Ergebnisse wurden für die anderen Zelllinien in einem Bereich von 0,97 bis 1,5% erhalten.
Die 6 zeigt graphisch den Effekt auf das Zellwachstum eines kontinuierlichen 72-stündigen Aussetzens gegenüber: (A) ara-U oder (B) ara-T. Zellbezeichnungen: CEM = •; MOLT-4 = O; RAJI =
; U-937 = ∇; K-562 =
; L1210 = ☐.
Die 7 zeigt graphisch den Effekt auf das Zellwachstum eines kontinuierlichen 72-stündigen Aussetzens gegenüber: (A) dUrd oder (B) dThd.
Zellbezeichnungen: CEM = •; MOLT-4 = O; RAJI =
; U-937 = ∇; K-562 =
; L1210 = ☐.
Tumorzellen mit hohen Konzentrationen an Thymidylatsynthase (TS) stellen eine bekannte therapeutische Herausforderung dar, für die gegenwärtig keine Behandlungsstrategie erhältlich ist. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das Wachstum von Tumorzellen mit einem hohen TS-Wert vorzugsweise mit einem Uridin- und/oder einem Desoxyuridin-Analogon (dUrd-Analogon) gehemmt werden kann. Der Begriff Uridin-Analogon, wie er nachstehend verwendet wird, soll Uridin und Desoxyuridin und Derivate von beiden umfassen. Da ferner Tumore stark variieren können, stellt die Identifizierung von Tumorzellen mit einer hohen TS-Konzentration diagnostische Informationen zum Auswählen einer geeigneten Therapie für einzelne Tumore bereit. Unter Verwendung von FAU als Prototyp wurde dieses Konzept erfolgreich gezeigt.
Das folgende Schema I veranschaulicht die verallgemeinerte Struktur für dUrd-Analoga und deren intrazelluläre Aktivierungswege. Für das endogene Nukleosid dUrd ist W = H. FAU weist die Substitution W = F auf. Durch Thymidinkinase (TK) wird an den Zucker an der 5'-Position eine Phosphatgruppe gebunden, um dUMP oder dessen Analogon, FAUMP, zu bilden. Folglich bindet TS eine Methylgruppe an die 5-Position der Base zur Erzeugung von Thymidylat, dTMP oder dessen Analogon, FMAUMP.
Schema I
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, dass FAU in FMAU-Nukleotide umgewandelt und als FMAU in zelluläre DNA eingebaut wurde. Insbesondere wurde das Monophosphat von FAU, FAUMP, durch TS in Zellextrakten in die entsprechende dThd-Form, FMAUMP, umgewandelt. Die Inkubierung von FAU mit Tumorzelllinien in einer Kultur hemmte deren Wachstum in einem variablen Ausmaß, und zwar abhängig von der Effizienz der Aktivierung über TS. Dies ist der erste Beweis dafür, dass Zellen mit einem hohen Niveau an TS-Aktivität für eine Therapie empfänglicher sind als Zellen mit einer niedrigen TS-Aktivität.
Bei der Wachstumshemmung wurden eine breite Variation zwischen Zelllinien und auch relativ schwache Anstiege für die Reaktion gegen die extrazellulären Konzentrationskurven festgestellt (2A, 2B). Als Folge war die extrazelluläre Konzentration von FMAU oder insbesondere FAU ein schwaches Vorhersageinstrument der Cytotoxizität. Im Gegensatz dazu war die Variation zwischen Zelllinien bei der IC50 bezogen auf den prozentualen Ersatz von dThd in DNA durch FMAU ziemlich klein (3). Ferner gab es steile Reaktionskurven für die Wachstumshemmung gegen den Einbau eines Arzneistoffs (als FMAU) in DNA. Ferner gab es bezüglich der Toxizität eine Ähnlichkeit zwischen den Zelllinien bei ähnlichen Werten für einen prozentualen Ersatz von dThd in DNA durch FMAU. Folglich konnte bei einem gleichen Aussetzen gegenüber dem Prodrug eine selektive Toxizität mit Unterschieden bei der Umwandlungsgeschwindigkeit zu dThd-Analoga durch TS in Zusammenhang gebracht werden. Obwohl die Umwandlung durch TS eine notwendige Bedingung für die Toxizität ist, ist sie nicht ausreichend. Die opportunistische Nutzung einer erhöhten TS-Aktivität beruht auch auf anderen Schritten, insbesondere auf Kinasen und Polymerasen, sowie auf eine Konkurrenz mit einer endogenen Synthese. Die Wachstumshemmung hängt schließlich von der Nettowirkung aller Pyrimidinreaktionswege ab.
Diese Daten in der 3 zeigen auch eine Verwendung von Desoxyuridin-Analoga für diagnostische Anwendungen. Tumore mit einer hohen FAU-Aufnahme und einem starken Einbau in DNA nach der Methylierung über Thymidylatsynthase könnten einer externen Bildgebung unterworfen werden, z.B. unter Verwendung von ¹⁸F-markiertem FAU mit einer Positronenemissionstomographie (PET). Alternativ könnte eine Dosis von FAU vor einer Tumorbiopsie verabreicht werden und der Einbau in DNA, der mit den gleichen Techniken bestimmt wird, könnte für die Zellkulturproben in der 3 verwendet werden. Bei jedem Modus wären Tumore mit einem hohen DNA-Einbau hervorragende Kandidaten für eine Therapie mit FAU oder verwandten Analoga, und Tumore mit einem niedrigen DNA-Einbau sollten mit einer anderen Therapie behandelt werden.
Es ist möglich, dass FAU autonome biologische Effekte getrennt von FMAU-Nukleotiden aufweist. Es gab jedoch mehrere Hinweise, dass die Bildung von FMAU durch TS ausreichend ist, um den größten Teil der festgestellten Effekte zu erklären. In der vorliegenden Erfindung zeigte ein Vergleich mit der direkten Verwendung von FMAU, dass die toxischen Effekte von den FMAU-Nukleotiden dominiert wurden, insbesondere mit einer Ähnlichkeit bei den DNA-Beziehungen. Darüber hinaus wurde die relative Empfindlichkeit von Zelllinien bezüglich einer Wachstumshemmung durch FAU mit dem Aktivierungspotenzial für TS verglichen, das unabhängig als relative Enthalogenierung von IdUrd gemessen worden ist (4). Die empfindlichsten Zelllinien (U-937, CEM, MOLT-4) weisen eine Enthalogenierung von 50% oder mehr auf. Die am wenigsten empfindlichen Zelllinien (Raji, L1210) weisen eine Enthalogenierung von 15% oder weniger auf.
Dennoch können unter anderen experimentellen Bedingungen, wenn Unterschiede zwischen den Zellen bezüglich des Transports, der Phosphorylierung oder verwandter Wege vorliegen, diese Faktoren zusätzlich zu der TS-Aktivität die Reaktion ebenfalls beeinflussen. Ein Hauptvorteil der Bildgebung von Tumoren mit markiertem FAU besteht darin, dass sie das Endprodukt aller dieser Prozesse erfasst, was sich in einen prognostischen Wert umsetzen lassen sollte.
Ferner wird ein alternativer oder zusätzlicher Ansatz zur Diagnose durch die Interpretation der Daten in der 4 nahegelegt. Vor der Biopsie kann einem Patienten eine Dosis von markiertem IdUrd, das entweder radiomarkiert oder mehr bevorzugt mit stabilen Isotopen markiert ist, verabreicht werden. Die Enthalogenierung kann aus der DNA in der Tumorbiopsie bestimmt und zur Führung der Therapie verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt einen vielversprechenden Weg zum Angriff auf verbreitete Tumore des Menschen dar, die bisher gegen therapeutische Ansätze resistent waren. Obwohl FAU zur Demonstration des Prinzips verwendet wurde, war FAU nicht sehr wirksam und ist nicht zwangsläufig die optimale Verbindung in seiner Klasse. Die Methylierungsgeschwindigkeit durch TS war ziemlich niedrig und betrug verglichen mit dem endogenen Substrat dUMP nur 1%. Trotz dieser niedrigen Geschwindigkeit wurden wesentliche FMAU-Mengen in DNA eingebaut und es wurde eine Toxizität festgestellt.
Wenn FAU nicht ideal ist, gibt es viele andere synthetische Modifizierungen von dUrd, die auch als TS-Substrate dienen können. Beispielsweise wurden Zellkulturdaten für Uracilarabinosid (ara-U) und dessen methyliertes Analogon, Thyminarabinosid (ara-T) erhalten. Gemäß der 6 sind die Toxizitätsmuster für ara-U und ara-T denjenigen für FAU und FMAU in der 2 sehr ähnlich, was einen ähnlichen Mechanismus, d.h. eine Methylierung, nahelegt. Ferner zeigen auch die endogenen Verbindungen Desoxyuridin (dUrd) und Thymidin (dThd) das gleiche Muster der Zellkulturtoxizität (7).
Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren zur Diagnose und Behandlung von Tumoren. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Uridin-Analoga oder verwandten Verbindungen, die hier beschrieben sind, zur Hemmung der Tumorbildung. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verbindungen mit einer Antitumoraktivität. Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Behandlung der Tumorbildung in Menschen oder Tieren, das den Schritt des Verabreichens einer Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Uridin-Analogons umfasst, welches das Tumorwachstum hemmen kann, an einen Menschen oder ein Tier, der bzw. das Tumore aufweist, umfasst.
Es ist gebräuchliche Praxis, Tumore empirisch ohne diagnostische Informationen bezüglich der Empfindlichkeit des spezifischen Tumors für einen bestimmten Arzneistoff zu behandeln. Folglich könnten FAU oder verwandte Verbindungen direkt zur Behandlung von Tumoren einer Klasse verwendet werden, von der bekannt ist, dass sie eine hohe TS-Konzentration aufweist. Alternativ könnte eine Therapie mit FAU oder verwandten Verbindungen nach dem Versagen herkömmlicher TS-Hemmstoffe mit der Störung, dass die TS-Konzentrationen erhöht sind, begonnen werden. Ein bevorzugter Ansatz würde eine Biopsie oder eine externe Bildgebungsinformation zur Führung einer Therapieauswahl nutzen, und zwar durch Diag nostizieren, welche Tumore für FAU oder verwandte Verbindungen empfindlich sind, und für welche alternative Ansätze verwendet werden sollten.
Tumorhemmungs- und/oder -diagnostizierverbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen diejenigen der allgemeinen Formel (I)
worin: A = N, CH;
B = H, Hydroxy, Halogen, Acyl (C₁-C₆), Alkyl (C₁-C₆), Alkoxy (C₁-C₆);
D = O, S, NH; und
G = ein substituierter oder unsubstituierter cyclischer Zucker, ein substituierter oder unsubstituierter acyclischer Zucker, ein substituiertes oder unsubstituiertes cyclisches Mono-, Di- oder Triphosphozuckerphosphat; ein substituiertes oder unsubstituiertes acyclisches Mono-, Di- oder Triphosphozuckerphosphat; substituierte oder unsubstituierte cyclische Mono-, Di- oder Triphosphozucker-Analoga oder substituierte oder unsubstituierte acyclische Mono-, Di- oder Triphosphozucker-Analoga, wobei die Substituenten Alkyl (C₁-C₆), Alkoxy (C₁-C₆), Halogen sind.
Bevorzugte Verbindungen der Formel (I) sind Uridin-Analoga der Formel (II)
worin: A = N, CH;
B = H, Hydroxy, Halogen, Acyl (C₁-C₆), Alkyl (C₁-C₆), Alkoxy (C₁-C₆);
D = O, S, NH;
W, X, Y, Z = H, Hydroxy, Halogen, Alkyl (C₁-C₆), Alkoxy (C₁-C₆), ein Markerenthaltender Rest oder ein Marker;
J = C, S; und
K = O, CH₂.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Formel (I) oder (II) ist W ein Halogen. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform ist W Fluor. Es liegen jedoch auch andere Ausführungsformen im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.
Es sollte beachtet werden, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen als Enantiomere vorliegen können und dass das racemische Gemisch von Enantiomeren oder die isolierten Enantiomere alle innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung liegen.
Die Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können als pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen oder Formulierungen unter Verwendung von Formulierungsverfahren bereitgestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Zusammensetzungen oder Formulierungen können durch Standardwege verabreicht werden. Im Allgemeinen wird die Dosierung der Verbindungen, wenn diese zur Behandlung von Zellproliferationsstörungen verwendet werden, von der Art des Tumors, dem behandelten Zustand, der jeweils verwendeten Verbindung und anderen klinischen Faktoren wie z.B. dem Gewicht, dem Zustand des Menschen oder des Tiers und dem Verabreichungsweg abhängen. Es sollte beachtet werden, dass die vorliegende Erfindung sowohl für den Menschen als auch für tierärztliche Zwecke angewandt werden kann.
Jegliche dieser Verbindungen kann auch zur Bereitstellung diagnostischer Informationen bezüglich des Tumors verwendet werden. Wenn beispielsweise bei einem Patienten eine Biopsie seines/ihres Tumors vorgenommen wird, kann eine Dosis von FAU oder einer verwandten Verbindung mit oder ohne die Verwendung eines radiomarkierten Atoms oder vorzugsweise eines stabilen Isotops des natürlich vorkommenden Atoms verabreicht und die DNA von den Biopsien wie bei den Zellkulturexperimenten behandelt werden.
Jegliche bekannten und verträglichen Radioisotope oder stabilen Isotope eines natürlich vorkommenden Atoms können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. ¹⁴C und ³H sind jedoch bevorzugte Radioisotope und stabile Isotopenmarker wie ¹³C, ²H oder ¹⁵N sind am meisten bevorzugt.
Entsprechend kann eine externe Bildgebung, z.B. mittels Positronenemissionstomographie (PET) insbesondere zum Nachweis bzw. zur Erfassung von FAU oder verwandten Verbindungen, die mit ¹¹C und/oder ¹⁸F markiert sind, verwendet werden. Die Erweiterung der Arbeit, die mit der Zellkultur erhalten worden ist, verspricht hohe Niveaus des Einbaus von FAU in DNA eine erfolgreiche Therapie mit FAU oder verwandten Verbindungen. Niedrige FAU-Niveaus in DNA legen nahe, dass eine alternative Therapie verwendet werden sollte. Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bewertung der Angemessenheit der Behandlung eines Tumors mit verschiedenen Modalitäten bereit, einschließlich Thymidylatsynthasehemmstoffe, welches das Verabreichen eines Uridin-Analogons, das mit einem Positronenemitter wie z.B. ¹¹C oder mehr bevorzugt ¹⁸F markiert ist, und das Bestimmen des Ausmaßes der maximalen TS-Hemmung und der Persistenz der TS-Hemmung im Zeitverlauf zwischen Dosierungen durch eine externe Bildgebung, vorzugsweise mit einer Positronenemissionstomographie umfasst. Diese Parameter können zum Bestimmen der zeitlichen Abstimmung anschließender Dosierungen oder zur Bestimmung, wann die gegenwärtige Therapie nicht länger erfolgreich ist und es erforderlich ist, zu einer alternativen Therapie zu wechseln, verwendet werden.
In bevorzugten Ausführungsformen für Bildgebungsanwendungen kann W ein Markerenthaltender Rest oder ein Marker sein. Der Marker kann ein beliebiger Rest sein, der den Nachweis bzw. die Erfassung des Nukleosid-Analogons ermöglicht. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Marker ein Positronen-emittierendes Atom und in der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist W ¹⁸F. In einer bevorzugten Ausführungsform für die Bildgebung ist W ¹⁸F. Es liegen jedoch auch andere Ausführungsformen innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung.
In bevorzugten Ausführungsformen kann das Nukleosid als Substrat für die Enzyme dienen, die zum Einbau des Nukleosids in DNA erforderlich sind, und folglich wird das Nukleosid eine 5'-Hydroxylgruppe aufweisen, die zu dem Nukleosidtriphosphat phosphoryliert werden kann und das resultierende Triphosphat kann als Substrat für die zellulären DNA-Polymeraseenzyme dienen.
Auch im Fall von Biopsieproben kann markiertes IdUrd verabreicht und bezüglich der Zellkulturdaten interpretiert werden: Ein hohes Enthalogenierungsniveau verspricht eine erfolgreiche Therapie mit FAU oder verwandten Verbindungen; eine geringe Enthalogenierung legt nahe, dass eine alternative Therapie verwendet werden sollte. Folglich stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Diagnose von Tumoren bereit, die gegen Thymidylatsynthasehemmstoffe resistent sind, und zwar durch Verabreichen von IdUrd, das entweder mit einem Radioisotop wie z.B. ¹⁴C oder ³H oder mehr bevorzugt mit einem stabilen Isotopenmarker wie ¹³C, ²H oder ¹⁵N markiert worden ist, Herstellen von Biopsieproben des Tumors und Bestimmen des Ausmaßes der Enthalogenierung von IdUrd durch Thymidylatsynthaseenzyme durch Untersuchung der DNA der Tumorproben. Auf der Basis dieser Ergebnisse kann ein Therapieschema vorgeschlagen werden.
Zur oralen Verabreichung ist eine Dosierung zwischen etwa 0,1 bis 300 mg/kg/Tag und vorzugsweise zwischen etwa 0,5 und 50 mg/kg/Tag im Allgemeinen ausreichend. Die Formulierung kann in einer Einheitsdosierungsform verabreicht und mit herkömmlichen pharmazeutischen Techniken hergestellt werden. Solche Techniken umfassen den Schritt des Zusammenbringens des Wirkstoffs und des bzw. der pharmazeutischen Träger(s) oder Vehikel(s). Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch einheitliches und inniges Zusammenbringen des Wirkstoffs mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beidem, gegebenenfalls mit einem oder mehreren zusätzlichen Bestandteilen, und dann gegebenenfalls Formen des Produkts hergestellt.
Bevorzugte Einheitsdosierungsformen sind diejenigen, die eine Tagesdosis oder -einheit, eine Teiltagesdosis oder einen geeigneten Bruchteil davon, des verabreichten Bestandteils enthalten. Es sollte beachtet werden, dass die Formulierungen der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu den Bestandteilen, die hier speziell genannt sind, andere herkömmliche Mittel enthalten können. Es sollte ebenfalls beachtet werden, dass die Verbindungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch topisch, transdermal, oral, rektal oder parenteral (z.B. intravenös, subkutan oder intramuskulär) verabreicht werden können oder in biologisch abbaubare Polymere eingebracht werden können, die eine verzögerte Freisetzung der Verbindung ermöglichen, wobei die Polymere in der Nähe des Tumors oder dort implantiert werden, wo die Arzneistoffabgabe gewünscht ist.
Die 1 zeigt die allgemeine Struktur vieler Uridin-Analoga. Die Base besteht aus Uracil oder verschiedenen Modifizierungen davon. Die Wechselwirkung mit TS findet an der 5'-Position statt, wo das Wasserstoffatom durch eine Methylgruppe ersetzt wird. Das endogene Substrat für TS, 2'-Desoxyuridin-5'-monophosphat (dUMP), wird in Thymidinmonophosphat (dTMP) umgewandelt. Die ursprüngliche Klasse der TS-Hemmstoffe, 5-Fluoruracil (FUra) und 5-Fluordesoxyuridin (Floxuridin, FdUrd), bildet nach der intrazellulären Umwandlung in FdUMP einen ternären Komplex mit TS und blockiert die endogene Umwandlung von dUMP zu dTMP. Anstelle des Versuchs einer Blockierung der 5-Position, wie dies bei FUra und FdUrd der Fall ist, bewahrt die vorliegende Erfindung den Wasserstoff an der 5'-Position, wodurch das Akzeptorvermögen für die Methylabgabe gefördert wird. Folglich kann TS für diejenigen Desoxyuridin-Analoga, die weniger toxisch sind als die entsprechenden Thymidin-Analoga, die Cytotoxizität erhöhen. Analoga können aus Modifizierungen der Base, des Zuckers oder beider bestehen. Die Phosphatgruppe an der 5'-Position des Zuckers wird gewöhnlich intrazellulär hinzugefügt (z.B. mittels Thymidinkinase), jedoch können im Vorhinein modifizierte Phosphatgruppen gebildet werden und intakt in die Zelle eintreten (z.B. Phosphorothioate oder HPMPC).
Es sind verschiedene Modifizierungen der Basen möglich. Das Wasserstoffatom an der Position 5 und die Doppelbindung, welche die Kohlenstoffatome 5 und 6 verbindet, sind die wichtigsten Anforderungen an die Base für das am meisten bevorzugte TS-Substrat. Das Stickstoffatom an der Position 1 ist ebenfalls eine bevorzugte Ausführungsform. Es könnte jedoch durch ein Kohlenstoffatom ersetzt werden, z.B. in einem Versuch, eine stabilere Verknüpfung mit dem Zucker zu bewirken. Das an N3 gebundene Wasserstoffatom kann ebenfalls durch verschiedene funktionelle Gruppen ersetzt werden, einschließlich einen Hydroxy-, Halogen-, Acyl-(C₁-C₆), Alkyl-(C₁-C₆), oder Alkoxy-(C₁-C₆) Substituenten. Die Carboxylgruppe an C2 oder C4 kann durch ein Schwefelatom, wie z.B. in 4-Thiodesoxyuridin, oder eine NH-Gruppe ersetzt werden.
Ein Phosphozucker (oder Zuckeranalogon) muss an die Base gebunden sein, um eine Wechselwirkung mit TS zu ermöglichen. Es sind viele Veränderungen am Zucker möglich, während der Zucker nach wie vor ein Substrat für TS bleibt. In unserer prototypischen Verbindung ersetzt F das Wasserstoffatom an der 2'-Position "über" der Ebene des Zuckers (2'-F-arabino), d.h. W = F. Es wurde gezeigt, dass die resultierende Verbindung, FAU, phosphoryliert und in deren methylierte Form, FMAUMP, umgewandelt wird. F kann auch unterhalb des Rings an der 2'-Position platziert werden, X = F. Substituenten mit einer größeren Raumerfüllung an der 2'-Position sind synthetisch möglich, wie es z.B. von J. P. H. Verheyden, D. Wagner und J. G. Moffatt in "Synthesis of Some Pyrimidine 2'-Amino-2'-deoxynucleosides" in J. Org. Chem. 36, 250–254, 1971, berichtet worden ist. W = OH führt zu Uracilarabinosid, bei dem es sich um den zirkulierenden Hauptmetaboliten von ara-C handelt. Verbindungen, die in der 3'-Position über dem Ring, Y, substituiert sind, wurden synthetisiert, wie es z.B. von K. A. Watanabe, U. Reichman, C. K. Chu, D. H. Hollenberg, J. J. Fox in "Nucleosides. 116. 1-(beta-D-Xylofuranosyl)-5-fluorocytosines with a leaving group on the 3' position. Potential double-barreled masked precursors of anticancer nucleosides" in J. Med. Chem. 23(10), 1088–1094, Oktober 1980, berichtet worden ist. Unter dem Ring an der 3'-Position erzeugt Z = F ein Analogon von Fluorthymidin, ein antiretrovirales Mittel. Ein erfolgreicher antiviraler Arzneistoff, 3'-Thiacytidin (3TC), basiert auf dem Ersetzen des 3'-Kohlenstoffatoms durch ein Schwefelatom, ohne dass über oder unter dem Ring Substituen ten gebunden sind. Eine weitere berichtete Veränderung in dem Zucker ist der Ersatz des Sauerstoffatoms durch Kohlenstoff zur Bildung einer carbocyclischen Struktur, z.B. T. S. Lin, X. H. Zhang, Z. H. Wang, W. H. Prusoff, "Synthesis and Antiviral Evaluation of Carbocyclic Analogues of 2'-Azido- and 2'-Amino-2'-deoxyuridine", J. Med. Chem. 31, 484–486, 1988.
Zusätzlich zu dem Satz von Einzelsubstitutionen liegen auch Mehrfachsubstitutionen im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. Wenn beide Wasserstoffatome an der 2'-Position durch F ersetzt werden, handelt es sich bei dem resultierenden Molekül um 2',2'-Difluordesoxyuridin, bei dem es sich um den zirkulierenden Hauptmetaboliten von Gemcitabin, 2',2'-Difluordesoxycytidin, handelt.
Anschließend an die Methylierung durch TS können Analoga mit Modifizierungen des Zuckers an der 2'-Position durch DNA-Polymerasen erkannt werden und mit Thymidintriphosphat (dTTP) um den Einbau in DNA konkurrieren. Wenn die 3'-OH-Gruppe beibehalten wird (Z = OH), können anschließend zusätzliche Basen hinzugefügt werden. Wenn Z jedoch nicht -OH ist, dann wird das Analogon als Terminator des Kettenwachstums dienen. Sowohl Kettenterminatoren (z.B. AZT) als auch nicht-Terminatoren (z.B. IdUrd) weisen eine biologische Aktivität auf, jedoch kann das Wirkungsspektrum ziemlich unterschiedlich sein.
Acyclische Zuckeranaloga wie z.B. Acyclovir oder Cidofovir (HPMPC) weisen eine biologische Aktivität auf. Im Fall von Acyclovir und verwandten Molekülen (wie z.B. Ganciclovir) kann eine virale Form der Thymidinkinase den Arzneistoff trotz der geänderten Geometrie phosphorylieren. Bei HPMPC liegt die Phosphatgruppe bereits vor.
Beispiele
Materialien und Verfahren
Falls sie nicht anders definiert sind, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, gewöhnlich verstanden wird. Obwohl bei der Durchführung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung beliebige Verfahren und Materialien, die den hier beschriebenen Verfahren und Materialien ähnlich sind oder zu diesen Äquivalent sind, verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben.
Chemikalien
Nicht-markiertes und markiertes FAU, FMAU, FAUMP und dUMP wurden von Moravek Biochemicals, Brea, CA, erhalten. Radiomarkiertes [2-¹⁴C]FAU, [³H-CH₃]FMAU, [5-³H]FAUMP und [5-³H]dUMP wiesen spezifische Aktivitäten von 0,056, 0,33, 11 bzw. 2 Ci/mmol auf. Desoxyribonuklease I (DNase I) aus Rinderpankreas, Typ II, und Phosphodiesterase I aus Crotalus atrox, Typ VI, Formaldehyd, Tetrahydrofolat, 2'-Desoxyuridin (dUrd), Thymidin (dThd), Uracilarabinosid (ara-U) und Thyminarabinosid (ara-T) wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhalten. Alle anderen Reagenzien waren analysenrein.
Zellen
Die vom Menschen abgeleiteten Zelllinien CEM, MOLT-4, RAJI, U-937, K-562 und die von Mäusen abgeleitete Zelllinie L1210 wurden von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, erworben. Zellen wurden gezüchtet und als Suspensionskultur in RPMI 1640-Medium gehalten, das L-Glutamin und 10% (v/v) wärmeinaktiviertes fetales Kälberserum (BRL-GIBCO, Rockville, MD) enthielt. Eine Penicillin-Streptomycin-Lösung (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde zugesetzt, um eine Endkonzentration von 100 Einheiten/ml bzw. 100 μg/ml zu erreichen.
Methylierung von FAUMP durch Thymidylatsynthase in Zellextrakten
Wenn TS an der 5-Position von dUMP zur Erzeugung von dTMP eine Methylgruppe hinzufügt, wird das Proton an dieser Stelle freigesetzt. Wenn [5-³H]dUMP das Substrat ist, kann die TS-Aktivität in Zellextrakten durch Überwachen der Akkumulationsgeschwindigkeit von tritiiertem Wasser bewertet werden. Dabei wurde [5-³H]FAUMP als Substrat für die Methylierung durch TS verwendet und die Erzeugung von FMAUMP wurde aus der Freisetzung von tritiiertem Wasser bestimmt. Zellextrakte wurden aus jeder Zelllinie durch Sonifizieren intakter Zellen hergestellt (vgl.: R. D. Armstrong, R. B. Diasio, "Improved Measurement of Thymidylate Synthetase Activity by a modified Tritium-Release Assay", J. Biochem. Biophys. Methods, 6, 141–147, 1982, und P. A. J. Speth, T. J. Kinsella, A. E. Chang, R. W. Klecker, K. Belanger, J. M. Collins, "Incorporation of Iododeoxyuridin into DNA of Hepatic Metastases Versus Normal Human Liver", Clin. Pharmacol. Ther. 44, 369–375, 1988). Der Methyldonor wurde durch 5,10-Methylentetrahydrofolat bereitgestellt, das in situ durch die Zugabe von Formaldehyd zu Tetrahydrofolat erzeugt wurde. Zu verschiedenen Zeiten nach der Zugabe des Substrats (20 μM entweder von [5-³H]dUMP oder [5-³H]FAUMP) wurde die Reaktion durch die Zugabe von HCl gestoppt. Nicht umgesetztes Substrat wurde durch Adsorption auf Aktivkohle von tritiiertem Wasser getrennt. Nach der Zentrifugation wurde ein Aliquot des Überstands bezüglich tritiierten Wassers gezählt. Gemäß der 5 kann TS in Zellextrak ten FAUMP methylieren und tritiiertes Wasser freisetzen, jedoch mit einer geringeren Geschwindigkeit als für dUMP.
Wachstumshemmstudien
Alle Zelllinien mit Ausnahme von L1210 wurden in frischen Medien mit 30000 Zellen/ml suspendiert. L1210-Zellen wurden mit 10000 Zellen/ml suspendiert. 2 ml Zellen wurden jedem Well von 24 Well-Platten zugesetzt und entweder mit 0 bis 1000 μM FAU oder 0 bis 300 μM FMAU inkubiert. Die Inkubation wurde bei 37°C in einer angefeuchteten 5% CO₂-Atmosphäre für 72 Stunden durchgeführt. Die Hemmung des Zellwachstums wurde durch eine Zellzählung bewertet (Elzone 180, Particle Data, Inc., Elmhurst, IL). Unter diesen Bedingungen betrugen die Verdopplungszeiten der Kontrolle für CEM-, MOLT-4-, RAJI-, U-937- und K-562-Zellen 21 bis 22 Stunden, während die Verdopplungszeiten für L1210 8 bis 10 Stunden betrugen.
Intrazelluläre Nukleotidbildung und Einbau in DNA
Alle Zelllinien mit Ausnahme von L1210 wurden in frischen Medien bei 300000 Zellen/ml mit einer geeigneten Menge eines radioaktiven Arzneistoffs resuspendiert. L1210-Zellen wurden bei 150000 Zellen/ml resuspendiert. Nach 24 Stunden bei 37°C in einer angefeuchteten 5% CO₂-Atmosphäre wurden Zellen für eine Nukleotidmessung und einen DNA-Einbau geerntet. Lösliche Nukleotide wurden für jede Zelllinie nach dem Aussetzen gegenüber 10 μM FAU bestimmt. Der Einbau von FAU in DNA (als FMAU) wurde über einen Bereich von FAU-Konzentrationen von 1 μM bis 1 mM bestimmt. Wie es bereits von R. W. Klecker, A. G. Katki, J. M. Collins in „Toxicity, Metabolism, DNA Incorporation with Lack of Repair, and Lactate Production for 1-(2'-Fluoro-2'-deoxy-β-D-arabinofuranosyl)-5-iodouracil in U-937 and MOLT-4 Cells", Mol. Pharmacol. 46, 1204–1209, 1994, und P. A. J. Speth, T. J. Kinsella, A. E. Chang, R. W. Klecker, K. Belanger, J. M. Collins in „Incorporation of Iododeoxyuridine into DNA of Hepatic Metastases Versus Normal Human Liver", Clin. Pharmacol. Ther. 44, 369–375, 1988, beschrieben worden ist, wurden DNase I und Phosphodiesterase I zur Freisetzung der Basen aus DNA verwendet. Diese Basen und löslichen Nukleotide wurden durch bereits beschriebene Verfahren auf HPLC-Basis gemäß Klecker et al. in der vorstehend genannten Veröffentlichung, „Toxicity, Metabolism, DNA Incorporation with Lack of Repair, and Lactate Production for 1-2'Fluoro-2'deoxy-β-D-arabinofuranosyl)-5-iodouracil in U-937 and MOLT-4 Cells", bestimmt. Der Arzneistoffeinbau in zelluläre DNA wurde unter Verwendung der Gleichung: Prozentualer Einbau = 100 × ([Arzneistoff]/([dThd] + [Arzneistoff]) bestimmt.
Enthalogenierung als Sonde für die Thymidylatsynthaseaktivität in situ
Die relative Aktivität von Thymidylatsynthase wurde nach der Inkubation von Zellen mit 3 μM [3H]-IdUrd für 24 Stunden bestimmt. DNA wurde gewonnen, abgebaut und in der vorstehend beschriebenen Weise chromatographiert. Etwas IdUrd wurde in DNA eingebaut, wobei das Iod an dem Pyrimidinring intakt blieb. Nach der Umwandlung in IdUMP wurde ein Teil des IdUrd durch TS zu dUMP enthalogeniert, das dann durch TS in dTMP umgewandelt und anschließend in DNA eingebaut und beim DNA-Abbau als [³H-dThd] wiedergewonnen wurde. Die relative TS-Aktivität in situ wurde als der Anteil des von IdUrd abgeleiteten Materials in DNA, das enthalogeniert worden ist, definiert, d.h. ([³H]-dThd)/([³H]-dThd + [³H]-IdUrd). Diese Verfahren könnten auch mit nicht-radioaktivem IdUrd verwendet werden, wenn ein stabiler Isotopenmarker wie z. B. ¹³C, ¹⁵N oder ²H verwendet wird. Der Radioaktivitätsdetektor bei der HPLC-Analyse würde durch einen massenspektrometrischen Detektor ersetzt werden. Unmarkiertes IdUrd kann nicht verwendet werden, da dessen Enthalogenierung unmarkiertes dThd erzeugt, das von dem endogenen Pool von dThd in DNA nicht unterschieden werden könnte.
Beispiel 1
FAUMP wurde in Zellextrakten durch TS in FMAUMP umgewandelt, wie es sich durch die Ansammlung von tritiiertem Wasser zeigt. Die Umwandlungsgeschwindigkeit zu FMAUMP betrug etwa 1% der Geschwindigkeit der dTMP-Bildung aus dUMP (5). Eine kontinuierliche Inkubation von Zellen mit dem dUrd-Analogon, FAU, für 72 Stunden erzeugte verschiedene Grade der Wachstumshemmung (2A). Bei 100 μM wurden CEM- und U-937-Zellen zu mehr als 50% gehemmt, MOLT-4 und K-562 wurden etwas weniger gehemmt, jedoch wurden Raji- und L1210-Zellen überhaupt nicht gehemmt.
Beispiel 2
Nach einer kontinuierlichen Inkubation von Zellen für 72 Stunden mit dem Thymidin-Analogon war FMAU wirksamer und einheitlich toxisch. FMAU erzeugte eine konzentrationsabhängige Hemmung des Wachstums für alle Zelllinien (2B). Bei der niedrigsten verwendeten Konzentration (0,3 μM) lag ein wesentlicher Effekt auf das Zellwachstum von CEM und K-562 vor. Bei 100 μM wurden alle untersuchten Zelllinien vollständig gehemmt (> 80%). Das entsprechende Desoxyuridin-Analogon, FAU, war in allen Zelllinien weniger toxisch und wies IC₅₀-Werte auf, die 10-fach höher waren als mit FMAU (2A). Es war beson ders überraschend, dass das Wachstum von L1210-Zellen, die gegen FMAU sehr empfindlich waren, selbst bei 1 mM nicht durch FAU gehemmt wurde.
Sowohl FMAU als auch FAU wurden intrazellulär in FMAU-Nukleotide umgewandelt und anschließend als FMAU(MP) in zelluläre DNA eingebaut. Wie es in der nachstehenden Tabelle I beschrieben ist, waren die CEM- und U-937-Zelllinien die effizientesten Zelllinien bei der Bildung von FMAUTP aus FAU und somit wurde FMAU in einem höheren Maß in die Zelllinien dieser DNA eingebaut. Tabelle I Gebildete intrazelluläre Nukleotide und Einbau in DNA durch Inkubation jeder Zelllinie mit 10 μM FAU für 24 Stunden

n.d.: = nicht nachweisbar

Dieser stärkere DNA-Einbau spiegelte sich als erhöhte Toxizität wieder, die für CEM und U-937 in der 2A festgestellt wurde. Im Gegensatz dazu erzeugte FAU einen geringeren Einbau von FMAU in die zelluläre DNA der L1210-Zelllinie. Dies zeigte sich als eine Abnahme des Zellwachstums von weniger als 10%, und zwar selbst bei 1 mM. K-562-Zellen wiesen einen beträchtlich höheren intrazellulären FAUMP-Pool auf. Es wurden nur Spurenmengen von FMAUMP oder FMAUDP gefunden.
Wenn das Zellwachstum gegen den prozentualen Einbau von FMAU in DNA aufgetragen wurde (3), war in dem gleichen Maßstab, der für die extrazelluläre Konzentration verwendet wurde, die Reaktionskurve viel steiler. Ferner war die Variation der Toxizität zwischen Zelllinien bei der IC50 für die Wachstumshemmung bezogen auf den prozentualen Einbau in DNA viel geringer als dann, wenn sie auf die extrazelluläre Konzentration bezogen wurde. In allen 6 Zelllinien wurden für FMAU vollständige Kurven erhalten. Für FAU wurden aufgrund der größeren Mengen an Arzneistoffsubstanz, die erforderlich waren, vollständige Kurven nur für 2 Zelllinien erhalten, und für die anderen Zelllinien wurden einzelne Punkte erhalten.
Beispiel 3
Die 4 zeigt die relative Empfindlichkeit von Zelllinien für die Wachstumshemmung durch FAU verglichen mit dem Aktivierungspotenzial für TS, die unabhängig als relative Enthalogenierung von IdUrd gemessen worden ist. Die empfindlichsten Zelllinien (U-937, CEM, MOLT-4) weisen eine Enthalogenierung von 50% oder mehr auf. Die am wenigsten empfindlichen Zelllinien (RAJI, L1210) weisen eine Enthalogenierung von 15% oder weniger auf.
Die Toxizität der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurde in einem Tiermodellsystem bewertet. FAU wurde in einer Dosis von 5 g/kg einmal pro Tag für 14 aufeinander folgende Tage oral an Mäuse verabreicht. Nach zusätzlichen 14 Tagen Beobachtung nach diesem Dosierungszeitraum wurden die Tiere getötet. Eine histopathologische Untersuchung der Mäusegewebe ergab keine Toxizität, die auf die Arzneistoffbehandlung zurückzuführen gewesen wäre. Blutproben wurden an verschiedenen Zeitpunkten während dieser Behandlung entnommen, um zu bestätigen, dass der Arzneistoff angemessen absorbiert worden ist. Eine HPLC-Analyse dieser Proben zeigte, dass die FAU-Konzentrationen im Plasma Maximalwerte von 750 μM und Minimalwerte von 50 μM erreichten.
Beispiel 4
Die vorliegende Erfindung umfasst neue Nukleosid-Analoga, die in Bildgebungstechnologien geeignet sind, sowie Verfahren zur Synthese solcher Analoga. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Nukleosid-Analogon einen Positronen-emittierenden Rest enthalten. Ein solcher Rest kann ein einzelnes Atom oder ein kleines Molekül sein, das ein Positronen-emittierendes Atom enthält. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform wird der Positronen-emittierende Rest ein ¹⁸F-Atom sein.
Die neuen Nukleosid-Analoga der vorliegenden Erfindung können durch eine Modifizierung des von C. H. Tann et al., „Fluorocarbohydrates in synthesis. An efficient synthesis of 1-(2-deoxy-2-fluoro-alpha-D-arabinofuranosyl)-5-iodouracil (beta-FIAU) and 1-(2-deoxy-2-fluoro-alpha-D-arabinofuranosyl)thymine (beta-FMAU)", J. Org. Chem. 50, 3644–3647, 1985, und von der gleichen Gruppe im US-Patent 4,879,377 (Brundidge et al.) beschriebenen Verfahrens hergestellt werden.
Das vorliegende Verfahren zur Synthese einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das In-Kontakt-Bringen eines ersten Moleküls der Formel
worin R₁, R₂ und R₅ gleich oder verschieden sein können und Schutzgruppen sind, R₃ eine Abgangsgruppe ist, wobei es sich in bevorzugten Ausführungsformen um Triflat, Mesylat, Tosylat oder Imidazolsulfonyl handelt, und R₄ ein Wasserstoffatom ist, mit einem zweiten Molekül, das einen Marker enthält, unter Bedingungen umfasst, welche die Übertragung des Markers auf die von R₄ eingenommene Position verursachen. Die resultierende markierte Verbindung wird an der 1-Position bromiert und dann mit einem Molekül der Formel
kondensiert, worin:
A = N, C;
B = H, Hydroxy, Halogen, Acyl (C₁-C₆), Alkyl (C₁-C₆), Alkoxy (C₁-C₆);
D = O, S, NH₂; und
E = H.
Die Synthese kann mit 1,3,5-Tri-O-benzoyl-alpha-D-ribofuranosid, das z.B. von Aldrich Chemical Company erworben werden kann, gestartet werden. Dieses Material wird durch Hinzufügen eines Imidazosulfonylrests an der 2-Position in der Riboposition („unten") so modifiziert, dass es die Vorstufe für die Fluorierung erzeugt.
187 mg 1,3,5-Tri-O-benzoyl-alpha-D-ribofuranosid wurden mit 1,54 ml trockenem Methylenchlorid gemischt. Das Gemisch wird mit einem Calciumchlorid- oder Calciumsulfat-Trockenrohr vor Feuchtigkeit geschützt, während in einem Salz-Eis-Bad auf –20°C gekühlt wird. Über einen Tropftrichter werden langsam 70 μl (110 mg) Sulfurylchlorid während 20 min zugesetzt. Um Feststoffe abzuwaschen, werden 0,44 ml trockenes Methylenchlorid zugesetzt. Imidazol wird in fünf gleichen Portionen zugesetzt, die insgesamt 10 Äquivalenten (270 mg) entsprechen. Das Reaktionsgemisch wird aus dem Eisbad entfernt und die Reaktion wird weitere 2 Stunden ablaufen gelassen. Mit fortschreitender Reaktion wird das Gemisch leuchtend gelb.
Nach dem Waschen mit Wasser und Trocknen mit Natriumsulfat wird für 16 Stunden bei 0 bis 5°C aus Hexan kristallisiert. Die kleinen weißen Kristalle werden gesammelt, in siedendem Aceton gelöst und heiß filtriert. Es wird siedendes Wasser zugesetzt und dann wird 16 Stunden bei 4°C kristallisiert und die Kristalle werden durch Zentrifugation gesammelt.
Es wurde gezeigt, dass die resultierende Verbindung bei Raumtemperatur mindestens mehrere Monate stabil ist und zu der Klinik oder dem regionalen Radiosynthesezentrum transportiert werden kann, wo sie bis zur Verwendung gelagert werden kann.
Fluorierungsverfahren
Aufgrund der kurzen Halbwertszeit von ¹⁸F (110 min) muss das fluorierte Nukleosid am Tag von dessen klinischem Einsatz hergestellt werden. Unter diesen Umständen werden die Reaktionsschritte auf kurze Zeiten optimiert, wobei die Ausbeute nur eine sekundäre Rolle spielt.
Am Tag des Gebrauchs wurden 10 mg des Imidazosulfonylzuckers in 200 μl Acetonitril gelöst. ¹⁸F wird in einem Cyclotron in Form von KHF₂ hergestellt und 300 mCi (z.B. kombiniert mit 1,32 mg unmarkiertem KHF₂) werden in 50 μl einer 1:100-Verdünnung von Essigsäure gelöst. In der Gegenwart verschiedener organischer Lösungsmittel wie z.B. Diethylenglykol oder Butandiol ersetzt ¹⁸F von KHF₂ den Imidazosulfonylrest an dem Arabinosering und nimmt die ara-Position („oben") ein. Das bevorzugte Reaktionslösungsmittel ist 200 μl 2,3-Butandiol. Wenn ein kleineres Lösungsmittelvolumen verwendet wird (eine konzentriertere Lösung der Reaktanten) ist die Essigsäure nicht erforderlich. Die bevorzugten Inkubationsbedingungen sind 15 min bei 170°C. Dieses Reaktionsprodukt kann mit authentischem Material verifiziert werden, das in der nicht-radioaktiven Form von Sigma Chemical Co. erworben werden kann. Auf der Basis des ¹⁸F-Einbaus ergibt sich eine minimale Ausbeute von 8%.
Obwohl Imidazosulfonyl die bevorzugte Austauschgruppe zur Fluorierung ist, sind für diesen Zweck auch andere geeignete Abgangsgruppen äquivalent. Beispiele für andere geeignete Gruppen umfassen unter anderem Triflat, Mesylat und Tosylat, die anstelle des Imidazolsulfonylrests verwendet werden können. Die Triflat- und Mesylatversionen werden leicht fluoriert, jedoch ist die Reaktion der Tosylatform weniger zufrieden stellend. Dem. Fachmann ist klar, dass für die Zwecke der vorliegenden Erfindung andere Austauschgruppen äquivalent sind. Solange die Austauschgruppenreaktion mit dem Fluorierungsreagenz schnell und effizient ist und nur minimale Nebenprodukte erzeugt, ist jede Austauschgruppe äquivalent, die dem Fachmann bekannt ist. Andere geeignete Austauschgruppen sind von Berridge et al., Int. J. Rad. Appl. Inst., Teil A, 37(8), 685–693, 1986, beschrieben worden.
Alternativ wurde gezeigt, dass 2-Fluor-2-desoxy-1,3,5-tri-O-benzoyl-alpha-D-arabinofuranose durch eine direkte Reaktion von underivatisierter 1,3,5-Tri-O-benzoyl-alpha-D-arabinofuranose mit DAST, Diethylaminoschwefeltrifluorid, das leicht mit ¹⁸F erzeugt werden kann, gebildet werden kann. Die Synthese von ¹⁸F-DAST wurde von Straatmann et al., J. Nucl. Med. 18, 151–158, 1977, beschrieben.
Am Ende des Reaktionszeitraums werden 2 ml Methylenchlorid und dann 2 ml Wasser zugesetzt. Die Methylenchloridschicht wird in ein Röhrchen überführt, das 2 ml Wasser enthält. Dann wird die Methylenchloridschicht in ein anderes Röhrchen überführt und unter einem Luft- oder Inertgasstrom getrocknet. Dann werden 400 μl Acetonitril, 100 μl Essigsäure und 30 μl HBr (30% w/w in Essigsäure) zugesetzt. Die Reaktion wird 5 min bei 125°C durchgeführt, wobei 1-Br-2-F-3,5-Di-O-benzoyl-alpha-D-arabinofuranose in einer minimalen Ausbeute von 50% erzeugt wird.
Am Ende dieses Reaktionsschritts werden 1 ml Toluol und 0,5 ml Wasser zugesetzt. Die Toluolschicht wird in ein anderes Röhrchen überführt und unter einem Luftstrom oder einem Inertgasstrom getrocknet. Es werden zusätzlich 0,5 ml Toluol zugesetzt und getrocknet. Der Brom-Fluor-Zucker wird mit einer Pyrimidinbase (z.B. Uracil, Thymin, Ioduracil), bei der die 2- und 4-Position silyliert worden sind (z.B. mit Hexamethyldisilazan), „kondensiert", um Bistrimethylsilylderivate (TMS-Derivate) zu bilden. TMS-Ura ist von Aldrich erhältlich. Andere TMS-geschützte Pyrimidinbasen (z.B. TMS-Thy oder TMS-IUra) können vor dem Tag der Anwendung hergestellt und an den entsprechenden Ort transportiert werden, wie dies bei dem Imidazosulfonylzucker der Fall ist. Die Herstellung von TMS-geschützten Basen wurde von White et al., J. Org. Chem. 37, 430, 1972, beschrieben. Andere geeignete Schutzgruppen, die nach der Reaktion unter Bedingungen entfernt werden können, die keine wesentliche Zersetzung des Produkts verursachen, können anstelle von TMS verwendet werden. Die Auswahl geeigneter Schutzgruppen und der Bedingungen für ihre Anwendung sind dem Fachmann bekannt.
200 μl einer Lösung von TMS-Ura (oder einer anderen Base) werden getrocknet und 1 ml Methylenchlorid wird zugesetzt. Das Gemisch wird in das Röhrchen überführt, das den Fluor-Brom-Zucker enthält. Das Röhrchen wird 15 min bei 170°C erhitzt und dann getrocknet, wo bei eine Ausbeute an 2,4-Di-TMS-3',5'-di-O-benzoyl-2'-arabino-F-2'-desoxyuridin, wenn TMS-Ura verwendet wird, von mindestens 25% erhalten wird.
Zur Entfernung der Schutzgruppen von der 3'- und 5'-Position des Zuckers und der 2- und 4-Position der Base werden 0,3 ml 2 M Ammoniak in Methanol zugesetzt. Das Gemisch wird 30 min bei 130°C erwärmt. Das Endprodukt, z.B. ¹⁸F-FAU, wird gereinigt (z.B. unter Verwendung einer Festphasen- oder Flüssigextraktionskartusche oder mittels Hochleistungsflüssigchromatographie) und zur Verabreichung in einem beliebigen pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel hergestellt. Es kann ein beliebiges Lösungsmittel verwendet werden, das sicher ist, wenn es an ein Lebewesen verabreicht wird, so lange die Verbindung in dem Lösungsmittel löslich ist. Eine Verifizierung der Produktidentität wird durch einen Vergleich mit authentischem nicht-radioaktivem Referenzmaterial unter Verwendung einer beliebigen Standardtechnik für die chemische Identifizierung erhalten. Beispielsweise sind FAU und FIAU von Moravek Biochemicals (Brea, CA) erhältlich. FMAU ist auch von Moravek durch eine Sonderbestellung erhältlich (nicht im Katalog angeführt).
Beispiel 5
Die markierten Nukleoside der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die Auswirkung verschiedener Behandlungen auf Tumore zu bewerten. Herkömmlich waren die meisten Therapien (Arzneistoffe und/oder Bestrahlung) in einer relativ unspezifischen Weise auf die Verminderung des Tumorwachstums gerichtet. In neuerer Zeit wurden Ansätze wie z.B. die Differenzierung des Tumors zu einer langsamer wachsenden Form und auch die Verhinderung von Metastasen des Tumors stärker beachtet. Sowohl für den traditionellen Ansatz als auch für die neueren Ansätze ist eine Schlüsselerwägung eine frühe Bestimmung des Erfolgs oder des Versagens der anfänglichen Behandlungsmodalität, wobei gegebenenfalls anschließend eine Behandlungsmodifizierung durchgeführt wird. Da alle Therapien (wesentliche) Nebenwirkungen aufweisen, ist die Bestrafung für eine unrichtige Bewertung zweifach: Zusätzlich zu dem Verlust von wertvoller Zeit zum Auffinden einer alternativen Behandlung muss eine nutzlose Toxizität ertragen werden.
Die Standardwerkzeuge zur Bewertung sind zur Bereitstellung einer zeitigen Information häufig unzureichend. Ein Tumor kann zu wachsen aufhören und die aktive Masse kann schrumpfen, jedoch wird dieser Erfolg durch die fortdauernde Anwesenheit nicht-lebensfähiger Bereiche, wie z.B. nekrotischer oder verkalkter Gewebe überdeckt. Folglich wird der Erfolg der Behandlung überdeckt, da sich die Größe des Tumors durch Bewertungen auf der Basis der Anatomie wie z.B. mittels Röntgen- oder CAT-Abtastungen nicht än dert. Entsprechend wird dann, wenn der Tumor nicht mehr auf die Therapie anspricht und zu wachsen beginnt, das Versagen anfänglich überdeckt, da das lebensfähige Gewebe nur einen kleinen Teil der anatomisch bestimmten Läsion bildet.
Diese Probleme können durch eine funktionelle Bildgebung mit den markierten Nukleosiden der vorliegenden Erfindung gelöst werden. Bildgebungsverfahren unter Verwendung von Verbindungen dieses Typs sind informativer, da sie den Vorteil aufweisen, dass sie nur auf das lebensfähige Gewebe gerichtet sind. Dies ermöglicht die Bestimmung des Behandlungserfolgs oder -versagens selbst in der Gegenwart des „Rauschens" von nicht-lebensfähigem Gewebe.
Um Tumore abzubilden werden markierte Nukleoside, die vorzugsweise mit ¹⁸F markiert sind, in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt. Die Verbindungen können an ein Lebewesen, bei dem eine Bildgebung durchgeführt werden soll, im Allgemeinen in einer Dosierung von etwa 1 mCi bis etwa 60 mCi verabreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden die markierten Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Dosierungen von etwa 1 mCi bis etwa 20 mCi verabreicht. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Dosierungen von etwa 10 mCi bis etwa 20 mCi verabreicht. Die Untergrenze des Dosierungsbereichs wird durch das Vermögen bestimmt, geeignete Bilder zu erhalten. In manchen Fällen können Dosierungen von weniger als 1 mCi angezeigt sein. Die Obergrenze des Dosierungsbereichs wird von der Abwägung des Potenzials für eine strahlungsinduzierte Schädigung des Lebewesens gegen den potenziellen Wert der zu ermittelnden Informationen bestimmt. In bestimmten Fällen kann es erforderlich sein, eine Dosis von mehr als etwa 60 mCi zu verabreichen.
Die radiomarkierten Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in einem beliebigen pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel, in dem sie löslich sind, verabreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Verbindungen in normaler Kochsalzlösung oder gepufferter Kochsalzlösung gelöst. Die Verbindungen der Erfindung können auf einem beliebigen, dem Fachmann bekannten Weg verabreicht werden. Beispielsweise kann die Verabreichung oral, rektal, topisch, mucosal, nasal, ophthalmisch, subkutan, intravenös, intraarteriell, parenteral, intramuskulär oder über einen beliebigen anderen Weg erfolgen, bei dem die Verbindung an das Gewebe, mit dem eine Bildgebung durchgeführt werden soll, abgegeben wird. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Verbindungen durch einen intravenösen Bolus verabreicht.
Bilder können etwa 5 min nach der Verabreichung bis etwa 8 Stunden nach der Verabreichung aufgenommen werden. Der maximale Zeitraum, in dem Bilder aufgenommen werden können, wird durch drei Faktoren bestimmt: Der physikalischen Halbwertszeit von ¹⁸F (110 min), der Empfindlichkeit der Detektoren in der Bildgebungsvorrichtung und der Höhe der verabreichten Dosis. Der Fachmann kann diese Faktoren so einstellen, dass die Aufnahme von Bildern an einem gegebenen Zeitpunkt möglich ist. Im Allgemeinen werden auch Blutproben entnommen, um die angemessene Abgabe der verabreichten Dosis zu bestätigen.
Der Fachmann kann die markierten Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwenden, um nützliche Bildgebungsdaten zu erhalten. Details bezüglich der Bildgebungsverfahren sind bekannt und können zahlreichen Veröffentlichungen entnommen werden. Beispielsweise zeigen Lowe et al. die Verwendung einer Positronenemissionstomographie zur Analyse von Lungenknötchen (J. Clin. Oncology 16, 1075–1088, 1998), während Rinne et al. die Verwendung einer ¹⁸F-markierten Sonde in Bildgebungsverfahren zur Analyse der Behandlungseffizienz von Melanompatienten mit hohem Risiko unter Verwendung einer ¹⁸F-Fluordesoxyglukose-Ganzkörper-Positronenemissionstomographie zeigen (Cancer 82, 1664–1671, 1998).

Claims

Ein Verfahren zum Auswählen eines Uridin-Analogons, das zur Verminderung oder Hemmung der Replikation oder Ausbreitung von Tumorzellen geeignet ist, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines Uridin-Analogons, das in der 5-Position unsubstituiert ist und bei dem an der Base ein Phospho-Zucker oder -Zucker-Analogon gebunden ist; Testen des Uridin-Analogons bezüglich der Aktivierung durch Thymidylatsynthase, die mittels Methylierung an der 5-Position gemessen wird; und Auswählen des Uridin-Analogons, wenn gefunden wird, dass es durch Thymidylatsynthase aktiviert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Schritt des Testens umfasst: Messen der Cytotoxizität des Uridin-Analogons bezüglich mindestens einer Zelllinie mit einer starken Expression des Thymidylatsynthaseenzyms und mindestens einer Zelllinie mit einer schwachen Expression des Thymidylatsynthaseenzyms; und bei dem der Schritt des Auswählens umfasst: Auswählen des Uridin-Analogons, wenn die bezüglich der mindestens einen Zelllinie mit einer starken Expression des Thymidylatsynthaseenzyms gemessene Cytotoxizität größer ist als die bezüglich der mindestens einen Zelllinie mit einer schwachen Expression des Thymidylatsynthaseenzyms gemessene Cytotoxizität.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die mindestens eine Zelllinie mit einer starken Expression des Thymidylatsynthaseenzyms eine U937-Zelllinie oder eine CEM-Zelllinie ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei dem die mindestens eine Zelllinie mit einer schwachen Expression des Thymidylatsynthaseenzyms eine L1210-Zelllinie oder eine Raji-Zelllinie ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Uridin-Analogon ein Radioisotop, gegebenenfalls ¹⁸F oder ¹¹C, enthält.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Uridin-Analogon eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel
ist, worin: A = N, CH; B = H, Hydroxy, Halogen, Acyl (C₁-C₆), Alkyl (C₁-C₆), Alkoxy (C₁-C₆); D = O, S, NH; und G = ein substituierter oder unsubstituierter cyclischer Zucker, ein substituierter oder unsubstituierter acyclischer Zucker, ein substituiertes oder unsubstituiertes cyclisches Mono-, Di- oder Triphosphozuckerphosphat; ein substituiertes oder unsubstituiertes acyclisches Mono-, Di- oder Triphosphozuckerphosphat; substituierte oder unsubstituierte cyclische Mono-, Di- oder Triphosphozucker-Analoga oder substituierte oder unsubstituierte acyclische Mono-, Di- oder Triphosphozucker-Analoga, wobei die Substituenten Alkyl (C₁-C₆), Alkoxy (C₁-C₆), Halogen sind.
Verwendung eines Uridin-Analogons, das gemäß eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 auswählbar ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose von Tumoren im menschlichen oder tierischen Körper.
Verwendung eines Uridin-Analogons, das gemäß eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 auswählbar ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Tumoren oder Krebs oder zum Lindern der zellschädigenden Effekte, die mit Tumoren oder Krebs zusammenhängen, wobei das Verfahren das Verabreichen des Medikaments in einer Menge umfasst, die zur Verminderung oder Hemmung der Replikation oder Verbreitung von Tumor- oder Krebszellen oder zur Linderung der zellschädigenden Effekte effektiv ist.
Verwendung nach Anspruch 8, bei der das Uridin-Analogon FAU, d-Urd oder ara-U ist.
Verwendung eines Uridin-Analogons, das gemäß eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 auswählbar ist, zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Verwendung bei der Diagnose von Tumoren, die gegen Thymidylatsynthaseinhibitoren resistent sind.
Verwendung eines Uridin-Analogons, das gemäß eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 auswählbar ist, zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Verwendung bei der Bewertung der Angemessenheit der Behandlung eines Tumors mit einem Thymidylatsynthaseinhibitor.
Verwendung eines Uridin-Analogons, das gemäß eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 auswählbar ist, zur Herstellung eines Mittels zur Verwendung bei der Diagnose von Tumoren, die gegen Thymidylatsynthaseinhibitoren resistent sind, wobei das Verfahren zur Diagnose von Tumoren die Schritte umfasst: (a) Verabreichen des Uridin-Analogons an die Tumoren, wobei das Analogon mit einem Positronenemitter markiert ist; und (b) Messen des DNA-Einbaus durch externe Bildgebung.
Verwendung eines Uridin-Analogons, das gemäß eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 auswählbar ist, zur Herstellung eines Mittels zur Verwendung in einem Bewertungsverfahren zur Bewertung der Angemessenheit der Behandlung eines Tumors mit einem Thymidylatsynthaseinhibitor, wobei das Bewertungsverfahren die Schritte umfasst: (a) Verabreichen des Uridin-Analogons an die Tumoren, wobei das Analogon mit einem Positronenemitter markiert ist; und (b) Bestimmen des Ausmaßes der maximalen Thymidylatsynthaseinhibierung und des Fortdauerns der Thymidylatsynthaseinhibierung im Zeitverlauf zwischen Dosierungen durch externe Bildgebung.
Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, bei welcher der Positronenemitter ¹⁸F oder ¹¹C ist.
Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, bei welcher die externe Bildgebung unter Verwendung einer Positronenemissionstomographie durchgeführt wird.
Verwendung eines Uridin-Analogons, das gemäß eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 auswählbar ist, zur Herstellung eines Mittels zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose von Tumoren, die gegen Thymidylatsynthaseinhibitoren resistent sind, wobei das Verfahren zur Diagnose von Tumoren die Schritte umfasst: (a) Verabreichen des Mittels an einen Patienten vor dem Entnehmen von Biopsieproben; (b) Entnehmen der Biopsieproben; und (c) Analysieren von DNA von den Biopsieproben bezüglich des Ausmaßes des Einbaus des Uridin-Analogons.