JP2003525866A - 治療抵抗性腫瘍を処置するための方法 - Google Patents

治療抵抗性腫瘍を処置するための方法

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JP2003525866A
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エイチ． マイケル シェパード，
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、病理学的細胞を選択的に阻害するための方法を提供する。ここで、この細胞は、内在性の細胞内活性化酵素の発現により特徴付けられ、そしてここでこの酵素は、基質であるプロドラッグ化合物により不活性化されない。この方法は、細胞を有効量の基質化合物と接触させ、これにより病理学的細胞の増殖を選択的に阻害することを必要とする。本発明はまた、酵素により細胞中で毒物に選択的に変換されるプロドラッグについてスクリーニングするための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願への相互参照） 本出願は、以下の米国仮出願６０／１５３，８５５（１９９９年９月１４日出
願）および６０／１４５，３６４（１９９９年７月２２日出願）に対する、３５
Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下での優先権を主張する（これらの内容は、本明細
書中で参考として、本開示に援用される）。
【０００２】 （技術分野） 本発明は、癌治療の分野、特に治療耐性腫瘍の処置のための組成物および方法
に関する。
【０００３】 （背景） 本開示を通して、および本開示内で、種々の刊行物が、第一著者および日付、
特許番号または公開番号によって参照される。各々の参照文献に対する完全な図
書目録引用は、本明細書中で見出され得る。これらの刊行物の開示は、本発明が
属する技術水準をより完全に記載するために、本明細書中で、本開示に参考とし
て援用される。
【０００４】 癌に対する化学療法処置への耐性は、主要な保健医療の問題である。耐性機構
は、２つの型に分類される：内因性および後天性。癌において、ほとんどの薬物
耐性は、酵素媒介性である。標的酵素が、宿主に対する受容不可能な毒性を有す
ることなく、その活性をブロックするための化学治療剤に対して、高すぎるレベ
ルで発現されるか、または酵素は、化学治療剤を急速に改変する疾患状態の細胞
によって発現されるかのいずれかであり、それによってその治療活性を無効にす
る。化学療法に対する内因性耐性は、疾患状態の細胞が、腫瘍サプレッサー遺伝
子機能（ｐ５３、ＲＢ、ｐ１６）を失う場合、癌において生じ得る。これが起こ
る場合、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）およびジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ
）のような酵素は、細胞周期を通して恒常的に発現される（Ｙｅａｇｅｒおよび
Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９８）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５９（２）：５８１−５；ｅ
ｌ−Ｄｅｉｒｙ（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．９（１）：７９
−８７；Ｇｏｋｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８６（２）
：６７７−８４；Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｅｒｃｉｋａｎ−Ａｂａｌｉ，ら（１９９
５）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｏｌ．４２（４）：４５７−６４；Ｆａｎお
よびＢｅｒｔｉｎｏ（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４（１０）：１１９１−
１２００；ＳｌａｎｓｋｙおよびＦａｒｎｈａｍ （１９９６）Ｂｉｏｅｓｓａ
ｙｓ １８（１）：５５−６２；Ｌｅｎｚ，Ｄａｎｅｎｂｅｒｇ，ら（１９９８
）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４（５）：１２２７−３４；およびＬｅｅ
，ら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２３４（２）：２７０−６）。こ
の結果は、フルオロピリミジンに対する（ＴＳの上昇した発現を介して）、また
はメトトレキサート（ＤＨＦＲの上昇した発現を介して）に対する内因性の耐性
の増加を生じる。新規な治療剤へのアプローチは、より良好な酵素インヒビター
の開発、または阻害するための新規な酵素についての検索にかなり限られている
（Ｈｕ，ら（１９９８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７（７）：８８６−９０；
Ｄｒａｋｅ，ら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１（１０
）：１３４９−５５；Ｓｃｈｕｌｔｚ，ら（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．１９（１Ａ）：４３７−４３；ＴｏｕｒｏｕｔｏｇｌｏｕおよびＰａｚ
ｄｕｒ（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ ２（２）：２２７−４３
；およびＨａｎｄｆｉｅｌｄおよびＬｅｖｅｓｑｕｅ（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２３（１）：６９−９１）。出願人らは、十分に特
徴付けられた酵素を標的とする治療剤の開発への新規なアプローチを開発した。
この技術は、癌治療への先行アプローチおよび歴史的なアプローチから区別され
、そして「ＥＣＴＡ」（酵素触媒治療活性化（Ｅｎｚｙｍｅ Ｃａｔａｌｙｚｅ
ｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ））といわれる。
【０００５】 （発明の開示） 本発明は、病理学的な腫瘍性細胞（これは、内因性の、細胞内活性化酵素の発
現によって特徴付けされる）を選択的に阻害するための方法を提供する。この方
法は、細胞を有効量の基質化合物に接触させること、それによって、その細胞の
増殖を阻害することを必要とする。その酵素は、基質プロドラッグ化合物によっ
て不活性化されない。
【０００６】 本発明はまた、内因性の、細胞内酵素によって細胞中で毒素に選択的に変換さ
れるプロドラッグについて、少なくとも２つの試験細胞（内因性の、細胞内酵素
を発現する）を候補プロドラッグに接触させて、スクリーニングするための、お
よび内因性の、細胞内酵素によって、プロドラッグの毒性薬剤中への活性をアッ
セイするための方法を提供する。
【０００７】 （発明を実施する形態） 本発明の実施には、特にそうでないと示さない限り、分子生物学、医化学、有
機化学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来技術を利用し、これ
らは、当業者の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵ
ＬＡＲ ＣＬＯＩＮＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第２版
（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡ
Ｒ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７））；ＭＥＴＨＯ
ＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．
）シリーズ；ＰＣＲ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．
ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１
９９５））およびＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓ
ｈｎｅｙ編（１９８７））。
【０００８】 本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、特に文脈がそうでな
いと明らかに示さない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、
複数への参照を含む。例えば、用語「細胞」は、複数の細胞を、それらの混合物
を含めて、含む。
【０００９】 用語「を含む」は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが、その他の
ものを排除しないことを意味することが意図される。「から本質的になる」は、
組成物および方法を規定するために使用される場合、その組み合わせに対して任
意の本質的に有意な他の要素を排除することを意味する。したがって、本明細書
に規定される要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量の
汚染物、ならびに薬学的に受容可能なキャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩
水）、保存剤などを排除しない。「からなる」は、本発明の組成物の投与のため
の他の成分および実質的な方法の工程のわずかな要素をも排除することを意味す
る。これらのトランジッション用語の各々により規定される実施形態は、本発明
の範囲内にある。
【００１０】 「組成物」は、活性成分、および不活性（例えば、検出可能な薬剤または標識
または薬学的に受容可能なキャリア）または活性（例えば、アジュバント）の他
の化合物または組成物の組み合わせを意味することを意図される。
【００１１】 「薬学的組成物」は、活性因子と、その組成物をインビトロ、インビボ、また
はエキソビボで使用するための、診断または治療の用途に適切な組成物にするた
めのキャリア（不活性もしくは活性）との組み合わせを含むことを意図される。
【００１２】 本明細書で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意の
標準的な薬学的キャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、水、およびエ
マルジョン（例えば、油／水もしくは水／油エマルジョン）、および種々のタイ
プの湿潤化剤を含む。その組成物はまた、安定化剤および保存剤を含み得る。キ
ャリア、安定化剤、およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ，ＲＥＭ
ＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．，第１５版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃ
ｏ．Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照のこと。
【００１３】 「有効量」は、有益または所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量
は、１回以上の投与、適用、または投薬において投与され得る。
【００１４】 「被験体」、「個体」、または「患者」は、本明細書において互換的に使用さ
れ、これらは、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトのこと
をいう。哺乳動物には、ネズミ、サル、ヒト、家畜、スポーツ用動物、およびペ
ットが含まれるが、これらに限定されない。
【００１５】 本明細書で使用される場合、用語「接触する（させる）」は、インビトロ、エ
キソビボ、インビボでのプロドラッグの投与を含む。インビボで行われる場合、
プロドラッグは、有効量で被験体に投与される。本明細書で使用される場合、用
語「被験体」は、任意の適切な動物モデル（例えば、マウス、ラット、ウサギ、
サル）を含むことが意図される。ヒト患者への投与もまた含まれる。
【００１６】 「コントロール」は、比較の目的で実験において使用される代替の被験体また
はサンプルである。コントロールは、「ポジティブ」または「ネガティブ」であ
り得る。例えば、実験の目的が、遺伝子の発現レベルの変化と癌の特定の型との
相関を決定するためである場合、一般に、ポジティブコントロール（そのような
変化を有し、そしてその疾患に特徴的な症候群を示している被験体、または被験
体由来のサンプル）およびネガティブコントロール（発現の変化およびその疾患
の臨床的症候群を欠く被験体、または被験体由来のサンプル）使用することが好
ましい。
【００１７】 本明細書で使用される場合、用語「病理学的細胞」、「標的細胞」、「試験細
胞」、および「過剰増殖細胞」は、細胞内酵素の遺伝子変異または内因性の過剰
発現による活性化によって特徴づけられる細胞を包含する。いくつかの実施形態
において、酵素の過剰発現は、腫瘍抑制因子遺伝子産物機能薬物耐性の欠損また
は病理学的表現型と関連する遺伝的不安定性に関連している。多数の細胞機構が
、薬物耐性に関与し、例えば、薬物の代謝の変化、活性化合物についての細胞の
不透過性または細胞からの薬物排除の加速、阻害された酵素の特異性の変化、標
的分子の産生の増大、細胞傷害性病変の修復の増大、または代替の生化学的経路
により阻害された反応のバイパスが含まれる。活性化されたかまたは過剰発現さ
れた、そして薬物耐性に関連する酵素には、チミジル酸シンターゼ、ジヒドロホ
レートレダクターゼ、チロシンキナーゼ、および多重薬物耐性酵素；ならびにＡ
ＴＰ依存性多重耐性関連タンパク質、ならびに結腸癌および前立腺癌を含むいく
つかの疾患においては、トポイソメラーゼＩが含まれるが、これらに限定されな
い。あるいは、１つの薬物に対する耐性は、他の生化学的に異なる薬物に対する
耐性も与え得る。
【００１８】 特定の遺伝子の増幅は、化学療法に対する耐性に関与する。ジヒドロホレート
レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の増幅は、メトトレキサートに対する耐性に関連する
が、チミジル酸シンターゼをコードする遺伝子の増幅は、５−フルオロピリミジ
ンでの腫瘍の処置に対する耐性に関連する。薬物耐性と関連する遺伝子の増幅は
、Ｋａｓｈｉｎｉ−Ｓａｂｅｔら、（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：
５７７５−５７７８、米国特許第５，０８５，９８３号に記載される改良された
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって検出およびモニターされ得る。獲得さ
れた薬物耐性は、細胞発生異常（例えば、均質染色体染色領域および二重微小染
色体（いずれも、遺伝子増幅に関連する））の検出によってモニターされ得る。
代替のアッセイには、直接的または間接的酵素活性アッセイが含まれ、これらの
両方が、遺伝子増幅およびその他の方法論（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応また
は免疫組織化学）に関連する。
【００１９】 あるいは、病理学的細胞は、不活化された腫瘍抑制機能（例えば、網膜芽腫（
ＲＢ）または活性化酵素（例えば、ＴＳ）の発現を促進することが知られるｐ５
３の欠失または不活性化）を有するとして特徴付けられる。
【００２０】 （治療方法） １つの局面において、本発明は、病理学的細胞の増殖を、その細胞を、その細
胞内で内因性細胞内活性化酵素によって選択的に毒素へと変換される基質プロド
ラッグに接触させることによって、阻害するための方法に関する。本発明の方法
および組成物は、好ましくは、細胞内酵素を内因的に発現する（いくつかの過増
殖性または新生物細胞（例えば、胃癌細胞、結腸癌細胞および乳癌細胞）におい
て生じる）細胞の成長または増殖を阻害するために有用である。本発明のプロド
ラッグについての選択的標的および活性化酵素である内因性の細胞内酵素の例に
は、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）およびジヒドロホレートレダクターゼ（「Ｄ
ＨＦＲ」）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の概念は、活性化酵素
チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）を使用して例示される。しかし、ＴＳの使用は、
単に、例示的であり、そしてその請求項は、ＴＳを標的化するシステムに限定さ
れると解釈されない。チミジル酸シンターゼは、癌の処置のために十分に特徴づ
けされた標的であり、そして感染性疾患標的として利用されてきた。チミジル酸
シンターゼは、その構造および機能の高度の特徴づけ（Ｃａｒｒｅｒａｓおよび
Ｓａｎｔｉ（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７２１−７
２６）、単一の遺伝子（遺伝子ファミリーではない）（例えば、ＧＳＴ）によっ
てコードされるという事実、そして最後に、この酵素の過剰発現が、化学療法お
よびより攻撃的な疾患の経過に対する耐性を予測する（Ｊｏｈｎｓｔｏｎおよび
Ａｌｌｅｇｒａ（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（７）：１４０７−１
２）ことから、例示的な標的活性化酵素である。
【００２１】 １つの実施形態において、プロドラッグは、本明細書においてより詳細に規定
される構造を有する化合物である。用語プロドラッグは、活性な治療剤の前駆体
をいう。完全なプロドラッグは、意図された機構によって活性化されるまで、薬
学的に不活性であるものである。プロドラッグ戦略は、潜在的に毒性の治療を疾
患の部位に標的化し、それにより全身的な毒性を避けることを意味する。多数の
アプローチがこの目的のために成されてきた。癌治療のためのプロドラッグに対
する第１の試みは、Ｍｅａｄら（１９６６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２６：２３
７４−２３７９およびＮｉｃｈｏｌおよびＨａｋａｌａ（１９６６）Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ．１５：１６２１−１６２３によって報告された。
この試みの指針となる原理は、メトトレキサート耐性白血病において過剰発現さ
れたジヒドロホレートレダクターゼを標的化することであった。メトトレキサー
ト耐性腫瘍細胞におけるジヒドロホレートレダクターゼの上昇が、ホモホレート
をチミジル酸シンターゼに向けられた代謝毒へと変換すると予想されたので、腫
瘍細胞の自己毒性化が期待された。ホモホレートの最も穏やかな抗腫瘍効果が代
謝活性に起因しないが、細胞へのホレート移動の阻害に起因しているようである
ことが見出された（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍ ７（
８）：２８１４−２８１８）。治療薬開発のための腫瘍選択的標的を強化するた
めのこの試みおよびその後のプロドラッグ様の試みは、以下の表１に要約される
。
【００２２】
【表１】 １つ以上の以下の事項は、これらのアプローチを混乱させた：ａ）活性化酵素
を適切に配置すること、および／または標的化酵素の腫瘍選択性の欠損；ｂ）活
性化プロドラッグの全身的分布および得られる毒性；およびｃ）標的化された酵
素以外の酵素による活性化を防止するために必要な基質酵素特異性を達成するこ
と。例えば、Ｍｏｒｇａｎら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ５８：２５６８
−２５７５によって記載されているグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ
）プロドラッグ（ＧＳＴに特異的ではあるが）は、腫瘍過剰発現されたＧＳＴ−
Ｐ１−１のみに特異的ではないばかりか、ＧＳＴ−Ａ１−１によっても活性化さ
れ得る。これは、不適切な薬物活性化および毒性の可能性を導く。これらの事項
の多くは、前出の表１に提供する引用された文献に、より詳細に議論されている
。本発明の方法および組成物は、腫瘍抑制因子遺伝子の欠失に引き続いて生じる
転写活性化および／または遺伝子増幅のために、腫瘍細胞中で選択的に過剰発現
される酵素を標的化するプロドラッグを提供することによって、以前のプロドラ
ッグでの失敗を避ける。
【００２３】 本発明のさらなる局面において、活性化酵素は、大部分の癌（ｐ５３、ＲＢ、
またはｐ１６腫瘍抑制因子のいずれかの機能を失ったもの）において、そして特
にフルオロピリミジン治療薬（５−ＦＵ、５−ＦＵｄＲ、Ｘｅｌｏｄａ）または
その他のＴＳインヒビター（例えば、Ｔｏｍｕｄｅｘ）に曝露された癌において
過剰発現されるものとして特徴づけられる。本発明のプロドラッグは、正常細胞
に対して、本質的に非毒性であるとして、さらに特徴づけられる。この局面はさ
らに、プロドラッグの選択性を促進する。なぜなら、異常または疾患細胞のみが
、細胞増殖を阻害するため、または、より好ましくは、その細胞を選択的に死滅
させるために、プロドラッグの毒性代謝物の有効量を提供するからである。実際
に、活性化酵素を正常量より多く発現する細胞が、酵素の活性（例えば、Ｒｏｂ
ｅｒｔｓ（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．５（１１）：３５４６−３５４８の方法
によって測定されたＴＳ活性）に関わらず、本発明の方法およびプロドラッグに
よって選択的に死滅されることを示したのは、本出願人が初めてである。したが
って、用語「過剰発現された」は、ＴＳタンパク質の総量をいい、トリチウム放
出（Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９６６）前出）によって測定されるＴＳ酵素活性の総量
ではない。これは、以下の実験の節で実証される。
【００２４】 薬学的開発は、インヒビターに焦点を当ててきた。インヒビターのための根拠
は、ほとんどの細胞が、インビボで、ほとんどの正常な細胞よりも頻繁に分割す
ることであった。結果として、腫瘍細胞中のＴＳの平均の量は、それらの正常の
対応物よりも高い。限定された効力が、これらの化合物について、有意な用量限
定毒性を伴って、観察されている。これらの化合物のなかで最も使用されている
、フルオロピリミジンは、２０世紀の半ばに開発され、そして進行した胃腸癌の
処置における有用性が見出された（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒら（１９８３）Ａ
ｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５４：５
８−１１９）。５−フルオロウラシルの初期の開発は、細胞培養物中で、ウラシ
ルが、腫瘍細胞によって、正常細胞よりも迅速に代謝されるというＨｅｉｄｅｌ
ｂｅｒｇｅｒの観察（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒら（１９５７）Ｆｌｕｏｒｉｎ
ａｔｅｄ ｐｙｒｉｍｉｄｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ
ｓ ｉｎ 「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌｏｇｙ」１９３−２３１頁に対するさらなる支持および根拠を有する。
処置応答速度は、常に、約２５〜３０％のあたりをうろついている。処置してい
ない患者は、通常約６ヶ月生存し、そして、フルオロピリミジン処置をした患者
は、１年間まで生存する（ＭｉｄｇｌｅｙおよびＫｅｒｒ（１９９９）Ｌａｎｃ
ｅｔ３５３（９１５０）：３９１−９およびｖａｎ Ｌａａｒ、Ｒｕｓｔｕｒｎ
ら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３４（３）：２９６−３０６）。
【００２５】 生存がほとんどまたは全く増加しないということが、ＴＳ活性の阻害のための
代替の投与戦略または新たなアプローチの引き続く開発とともに生じた。例えば
、より完全なＴＳインヒビター（Ｔｏｍｕｄｅｘのような）の開発は、生存の有
意な改善をもたらさなかったが、Ｔｏｍｕｄｅｘの毒性プロフィールが、フルオ
ロピリミジンとは異なっている（Ｂｌａｃｋｌｅｄｇｅ（１９９８）Ｂｒ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ ７７（補遺２）：２９−３７）。最後に、フルオロピリミジン処
置およびＴｏｍｕｄｅｘ処置はいずれも、ＴＳのレベルの増大を生じるので、有
意な交差耐性が観察される。フルオロピリミジンの欠損は、Ｔｏｍｕｄｅｘに抵
抗性でもある（Ｆａｒｒｕｇｉａ（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３４（
７）：９８７−９１）。この現在の状況は、新規の機構によって５ＦＵ／Ｔｏｍ
ｕｄｅｘ耐性腫瘍細胞を攻撃する化学療法剤の開発によって取り組むことができ
る。
【００２６】 本発明の別の局面は、その被験体に、本明細書において規定される内因性細胞
内酵素によって、細胞内で毒素に変換される治療有効量のプロドラッグを投与す
ることによって、被験体において病理学的細胞を処置するための方法である。酵
素は、「過剰発現され」、そしてその処置されるべき細胞は、新生物または癌細
胞である。
【００２７】 プロドラッグが、マウス、ラット、またはヒト患者のような被験体に投与され
る場合、そのプロドラッグは、薬学的に受容可能なキャリアに添加され得、そし
て全身的にか、または局所的に投与される。
【００２８】 有益に処置され得る患者を決定するために、腫瘍サンプルが患者から除去され
、そしてその細胞が標的酵素の発現のレベルについてアッセイされる。発現が、
正常細胞において発現されたレベルよりも高く、そのプロドラッグの毒性量が所
望でない副作用を伴わずに投与される場合、腫瘍または細胞は、有益に処置され
たと決定され、したがって、その患者は、本発明の治療に対して適切であること
が決定される。例えば、もし標的酵素が、正常細胞よりも、少なくとも約２倍発
現され、そして好ましくは、約３倍高く、そしてより優先的には４倍高い場合、
その患者は、本発明の治療方法のために適切な患者である。治療量が、経験的に
決定され得、そして処置されるべき病理学、その処置される被験体および変換さ
れるプロドラッグまたは細胞トキシンの毒性に従って、変化する。
【００２９】 動物に送達される場合、その方法は、そのプロドラッグの効力をさらに確認す
るために有用である。動物モデルの例として、ヌードマウスのグループ（Ｂａｌ
ｂ／ｃ ＮＣＲ ｍ／ｎｕ雌、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）が、本
明細書に規定されるように、各々皮下に、約１０5〜約１０9の過剰増殖性の癌ま
たは標的細胞を接種される。腫瘍が確立される場合、そのプロドラッグが、例え
ば、腫瘍の近辺に、皮下注入により投与される。腫瘍のサイズの減少を決定する
ための腫瘍測定は、ｖｅｎｉｅｒキャピラリーを週に二回使用して、二次元でな
される。その他の動物モデルはまた、適切に利用され得る。この方法は、前述の
材料および方法の節において例示される。
【００３０】 インビボでの投与は、１用量において、処置の経過全体にわたって、連続的に
かまたは断続的に、効果がもたらされ得る。投薬の最も有効な手段および用量を
決定するための方法は、当業者に周知であり、治療に使用される組成物、治療の
目的、処置される標的細胞、および処置される被験体に使用される組成物により
変化する。単一または複数の投与は、処置をする主治医によて選択された用量レ
ベルおよびパターンで行われ得る。そのプロドラッグの適切な用量処方および投
与方法は、以下に見出されうる。
【００３１】 本発明のプロドラッグおよび組成物は、医薬の製造において、従来の手順（例
えば、薬学的組成物中の活性成分）に従う投与によるヒトまたはその他の動物の
処置のために、使用され得る。
【００３２】 薬学的組成物は、経口的に、経鼻的に、非経口的に、または吸入療法により投
与され得、そして錠剤、ロゼンジ、顆粒、カプセル、ピル、アンポール、坐剤、
またはエアロゾル形態で摂取され得る。それらはまた、水性または非水性の希釈
液、シロップ、顆粒、または粉末において、活性成分の懸濁液、溶液、およびエ
マルジョンの形態をとり得る。本発明の化合物に加えて、薬学的組成物は、その
他の薬学的に活性な化合物または本発明の複数の化合物を含有し得る。
【００３３】 より詳細には、本明細書において、活性成分として言及される本発明の処方の
化合物はまた、任意の適切な経路（経口、経結腸、経鼻、局所（経皮、エアロゾ
ル、経頬、舌下を含む）、経膣、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を
含む）、および経肺を含む）によって治療のために投与され得る。好ましい経路
は、レシピエントの状態および年齢、および処置される疾患によって変化するこ
とも理解される。
【００３４】 一般に、上記に挙げられた化合物の各々について適切な用量は、１日あたりレ
シピエントの体重１キログラムあたり約１〜約１００ｍｇの範囲、好ましくは、
１日あたり体重１キログラムあたり約１〜約５０ｍｇの範囲、そして最も好まし
くは、１日あたり体重１キログラムあたり約１〜約２５ｍｇの範囲である。そう
でないと示されない限り、活性成分の全ての重量は、塩またはそのエステルにつ
いての本発明の処方の親の化合物として計算され、その重量は比例して増大する
。その所望の用量は、１日を通して適切な間隔で投与される、２、３、４、５、
６以上のサブ用量として、表される。これらのサブ用量は、単位用量形態で投与
され得、例えば、単位用量形態あたり、約１〜約１００ｍｇ、好ましくは、約１
〜約２５ｍｇ、そして最も好ましくは、約５〜約２５ｍｇの活性成分を含有する
。本発明の化合物および組成物の適切な用量は、疾患のタイプおよび重篤度およ
び段階に依存し得、そして患者ごとに様々であり得ることが理解される。最適な
用量の決定には、一般に、本発明の処置のリスクまたは有害な副作用に対する治
療の利益のレベルのバランスが含まれる。
【００３５】 理想的には、プロドラッグは、疾患の部位での活性化合物のピーク濃度を達成
するために投与されるべきである。これは、例えば、プロドラッグの静脈内注射
（必要に応じて、生理食塩水中）、または例えば、活性成分を含有する錠剤、カ
プセル、シロップとしての経口投与によって達成され得る。プロドラッグの所望
の血液レベルは、疾患組織内に治療量の活性成分を提供する連続的な注入によっ
て維持され得る。作動可能な組み合わせの使用は、各個々の治療化合物または方
法が単独で使用される場合に必要とされ得るプロドラッグのより低い総用量を必
要とし、それにより有害な効果を減少させる治療的組み合わせを提供することが
意図される。
【００３６】 癌処置の性質および癌処置への基本的なアプローチは、絶えず変化している。
これらの変化の多くは、疾患の分子の基本のより良い理解の結果として生じる。
これら新規領域の各々における研究は、実験的適用に至っており、ある場合には
、非悪性疾患についての慣用的な適用に至っている。細胞障害性抗腫瘍治療につ
いて使用される同じ薬物は、慢性関節リウマチについての処置レジメンの重要な
成分（メトトレキセートおよびシクロホスファミド）、器官移殖についての処置
レジメンの重要な成分（メトトレキセートおよびアザチオプリン）、鎌状赤血球
貧血についての処置レジメンの重要な成分（ヒドロキシ尿素）、抗感染化学療法
についての処置レジメンの重要な成分（トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅ
ｘａｔｅ）およびロイコボリン）、および乾癬についての処置レジメンの重要な
成分（メトトレキセート）になっている。従って、広域の医学、外科および小児
の専門家は、新生物性疾患および非新生物性疾患の両方についてこれらの薬物を
使用する。疾患機構の理解はまた、癌を含む疾患の処置のための薬物の組み合わ
せを決定するより良い手段を生じる。例えば、異なる化学療法が異なる機構によ
り機能すること、および適切な組み合わせが相乗効果を生じ得ることは周知であ
る。ＮＢ１０１１は、チミジル酸シンターゼによる活性化を介して機能するよう
であり、そして生じる異常なヌクレオチドは、ヌクレオチド代謝における複数の
工程を妨げることが提唱されている（図６）。異なる機構により機能する化学療
法または生物製剤との組み合わせは、増強されたかまたは相乗活性を生じる。こ
のような化合物の例としては、以下が挙げられる：１）ＤＮＡインターカレーシ
ョンおよび遊離ラジカル形成を含む複数の機構により作用するドキソルビシン；
２）複製の間のＤＮＡにおいて単鎖破壊を誘導する、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅ
ｃａｎ）のようなトポイソメラーゼインヒビター；３）抗エストロゲン（例えば
、タモキシフェン）もしくは抗男性ホルモン（例えば、フルタミド）を含む抗ホ
ルモン、またはインターフェロンのような生物製剤（例えば、イントロンＡ）。
これらの後者の場合、抗ホルモンは、同種ホルモン（細胞内ヌクレアーゼの誘導
およびオンコジーン発現の抑制を含む、多数の経路を誘導するインターフェロン
）による増殖刺激を妨げる。ＮＢ１０１１との相乗効果はまた、多くの細胞成分
を修飾および不活性化するが、最も重要には、ＤＮＡ修復およびアポトーシスを
修飾する、ナイトロジェンマスタードのようなアルキル化剤の使用を介して見ら
れる。
【００３７】 上記のように、さらなる治療剤と本明細書中に記載されるプロドラッグとを組
み合わせることは、本発明のさらなる局面である。例えば、本明細書中に記載さ
れる生成物は、本発明のプロドラッグの手段とは異なる手段によりそれらの毒性
効果を発揮する薬物と優先的に組み合わされる。このようなさらなる治療化合物
としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない；アンギオスタチン、抗エ
ストロゲンおよびトポイソメラーゼインヒビター。さらに、本発明のプロドラッ
グおよび方法は、腫瘍の総合的根絶のための外科的治療または放射線治療と組み
合わされ得る。
【００３８】 種々の方法は、治療方法の目的が一致するか否かを決定するために利用可能で
ある。これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＲＴ−ＰＣＲ分
析、増殖阻害研究（ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイ）およびプラークアッセイ
。これらの方法は、当該分野で周知であり、そして本明細書中に記載される。
【００３９】 本出願人らはまた、基質プロドラッグで処置された細胞が従来の治療により適
切に処置される、前の表現型に戻り得ることを発見した。例としてＴＳを使用し
て、本出願人らは、５−ＦＵで処理した腫瘍細胞が薬物に対して耐性となること
を示した。同時に、細胞を、ＮＢ１０１１で処理した。部分集団が、生存しそし
てＮＢ１０１１に対して耐性になったが、５−ＦＵに対する感受性を回復した（
表９および図１４を参照のこと）。従って、本発明は、有効量の別の薬剤が、本
発明の基質プロドラッグと共に同時投与される、上記の方法を提供する。１つの
局面では、第２および第３の薬剤は、細胞が事前に生じた耐性を有した薬物であ
る。さらなる薬剤は、基質プロドラッグの投与と同時またはそれに引き続いて投
与され得る。
【００４０】 本発明は、対照の正常細胞（例えば、動物細胞、哺乳動物細胞またはヒト細胞
）に比較して、病理学的細胞により過剰産生されるかまたは過剰発現される活性
化酵素により選択的に変換されるプロドラッグをさらに提供する。本出願人は、
本発明の実施のためのいくつかの優先的なプロドラッグを開示している。これら
の化合物についての構造および合成方法は、下記の材料および方法において提供
される。
【００４１】 本発明のほかの局面は、被験体に、本明細書中で規定される場合の活性化酵素
により、細胞中で毒物に選択的に変換される治療有効量のプロドラッグを投与す
ることにより被験体を処置するための方法である。さらなる局面では、有効量の
少なくとも１つのさらなる治療剤は、基質プロドラッグの投与と同時にまたはそ
れに引き続いて同時投与される。
【００４２】 （スクリーニングアッセイ） 本発明はさらに、活性化酵素を発現する少なくとも２つの細胞を提供すること
、およびその細胞を候補薬剤と接触させることにより、病理学的細胞中で毒物へ
選択的に変換されるプロドラッグについてスクリーニングするための方法を提供
する。次いで、酵素による毒性薬剤へのプロドラッグの活性化についてアッセイ
する。１つの実施形態では、第１の試験細胞は、上記で規定されるような病理学
的細胞であり、そして他方の試験細胞は、正常レベルの酵素を発現する対照の正
常細胞である。さらなる局面では、候補プロドラッグは、検出可能に標識される
。１つの実施形態では、検出可能な標識は、蛍光マーカーである。さらなる実施
形態では、検出可能な標識は、同じ原子（例えば、臭素）の少なくとも２つ以上
の変更可能なアイソトープである。この実施形態では、反応生成物の質量分析に
より、毒性生成物へのプロドラッグの改変についてアッセイし得る。毒性代謝物
を生成した候補薬剤の治療的潜在能力は、毒性生成物を精製し次いで病理学的細
胞の増殖を選択的に阻害する能力および正常細胞に対する識別可能な毒性を生じ
ない能力について別々にアッセイすることにより確認される。さらなる組み合わ
せが、上記のような適切な動物モデルへのプロドラッグおよび毒性代謝産物の投
与により達成され得る。
【００４３】 本明細書中で使用される場合、試験細胞は、酵素を発現するかあるいは、細胞
内酵素を発現するように形質転換された、原核生物細胞または真核生物細胞であ
り得る。例えば、細胞内酵素ＴＳを内因的に発現しない原核生物Ｅ．ｃｏｌｉは
、適切な宿主細胞または標的細胞である。Ｅ．ｃｏｌｉのトランスフェクション
は、真核生物細胞について記載される（下記）トランスフェクションと同様に行
われる。あるいは、試験細胞は、被験体から単離された病理学的細胞または酵素
を発現する培養細胞であり得る。この細胞は、コントロール対照物（標的酵素を
欠く）を有し得るか、または別の実施形態では、標的酵素を差示的に発現するよ
うに遺伝的に改変された対照物（種々のレベルの標的酵素を発現する）であり得
る。１つ以上の種の酵素は、別の宿主細胞を別々に形質導入し、その結果、標的
細胞に対する候補薬物の影響を他の酵素または別の種由来の対応する酵素に対す
るその影響と同時に比較するために、使用され得る。
【００４４】 別の実施形態では、第３の標的細胞がポジティブコントロールとして使用され
る。なぜなら、これは、有効量の、潜在的なプロドラッグであることが示された
化合物（例えば、以下に示される化合物）を受けるからである。
【００４５】 Ｒａｓ形質転換されたＮＩＨ ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ，１０８０１ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９，
Ｕ．Ｓ．Ａ．）は、適切な真核生物細胞である。これらの細胞を、酵素について
コードするクローンｃＤＮＡから、可変かつ漸増する量の、目的の標的酵素を発
現するように操作される。当該分野で周知でありかつＳａｍｂｒｏｏｋら（前出
）に記載される手順を使用するトランスフェクションは、一過性または恒常性の
どちらかである。ｃＤＮＡの挿入に適切なベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡおよび他の供給業者から市販されている。各トランスフ
ェクトされた細胞における酵素の発現のレベルは、免疫検出のために、酵素に対
して事前に惹起されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して
、イムノブロットおよび細胞溶解産物における酵素アッセイによりモニターされ
得る。発現の量は、細胞中に導入された発現カセットのコピー数によるか、また
は種々のプロモーター用法により調節され得る。発現された酵素の量を検出する
ための酵素学的アッセイはまた、ＣａｒｒｅｒａｓおよびＳａｎｔｉ（１９９５
）（前出）または下記の方法により概説されるように実施され得る。
【００４６】 試験細胞は、小さな複数ウェルプレート中で増殖され得、そして試験プロドラ
ッグの生物学的活性を検出するために使用される。本発明の提唱について、成功
した候補薬物は、病理学的細胞の増殖を阻害するか、またはそれを殺傷するが、
無傷のコントロール細胞型はそのまま残す。
【００４７】 候補プロドラッグは、細胞概要培地に直接添加され得るか、または細胞表面レ
セプターに対して特異的なリガンドに事前に結合体化され、次いで培地に添加さ
れ得る。細胞特異的送達のための結合体化の方法は、当該分野で周知である（例
えば、米国特許第５，４５９，１２７号；同第５，２６４，６１８号および公開
された特許明細書ＷＯ ９１／１７４２４（１９９１年１１月１４日公開）を参
照のこと）。候補薬物の遊離基は、例えば、トリチウムで検出可能に標識され得
る。次いで、標的細胞または培養培地は、候補プロドラッグから放出された標識
の量についてアッセイされる。あるいは、細胞の取り込みは、当該分野で周知の
方法を使用するかまたはサイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）（これもま
た当該分野で周知である）と組み合わせて、プロドラッグをリポソームにパッケ
ージングすることにより増強され得る。
【００４８】 いつもはっきりと示されるわけではないが、各実施形態が、有効量の化合物（
例えば、潜在的なプロドラッグであることが示された、以下に示される化合物）
を受けることによりコントロールとして機能する別の標的細胞を提供することに
よりさらに改変され得ることは理解されるべきである。
【００４９】 この方法により同定された薬剤は、さらに本明細書中で提供される。
【００５０】 上記スクリーンを使用して、被験体（例えば、ヒト患者）から取り出されたサ
ンプルに対して、いくつかのプロドラッグについて前スクリーニングし得る。各
標的および被験体についての基最も効果的である基質プロドラッグおよび治療を
決定するためにこのスクリーンを使用し得る。この方法は、上記により詳細に記
載される。 （本発明のプロドラッグ） Ｉ．材料および方法 Ａ．合成方法論 （（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン（ＢＶｄＵ）を
、Ｄｙｅｒらの方法（Ｄｙｅｒら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐ
ｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｏｗ
ｎｓｅｎｄら（編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，７９−８３頁）により調製した。これと市販（Ｆｉｓｈｅｒ／Ａｃｒｏｓ
）の５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（５ＦｄＵ）とをそれぞれ減圧下で
７５℃にてＰ２Ｏ５に隣接させて使用の直前に乾燥した。ラジアル（ｒａｄｉａ
ｌ）クロマトグラフィーを、Ｃｈｒｏｍａｔｏｔｒｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
（Ｈａｒｒｉｓｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で、蛍光
指示剤を含むＭｅｒｃｋシリカゲル−６０を吸着剤として使用して行った。（Ｅ
）−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン５’モノホスフェート
（「ＢＶｄＵＭＰ」）をＢＶｄＵの標準的な化学的リン酸化により調製した。
【００５１】 ＮＭＲ 1Ｈ ＮＭＲスペクトルをＶａｒｉａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｇ
ｅｍｉｎｉ分光計で３００ＭＨｚにて、六重水素化−ジメチルスルホキシド（Ｃ
Ｈ3）2ＳＯ溶液を使用して記録した。化学シフトをテトラメチルシラン内部参照
ｄ＝０．０ｐｐｍに対して報告する。13Ｃ ＮＭＲスペクトルを、７５ＭＨｚで
記録し、化学シフトを内部五重水素化−ジメチルスルホキシド（ｄ＝３９．５ｐ
ｐｍ）に対して報告する。31Ｐ ＮＭＲスペクトルを、２０２ＭＨｚでＢｒｕｌ
ｅｒ分光計で記録し、化学シフトを外部８５％Ｈ2Ｏ／１５％Ｈ3ＰＯ4（ｖｏｌ
／ｖｏｌ）（ｄ＝０．０ｐｐｍ）に対して報告する。
【００５２】 ＮＢ１０１１（（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシ−５’−
ウリジル＝フェニル＝Ｌ−アラニルホスホラミデート（ＢＶｄＵ−ＰＡ，「ＮＢ
１０１１」））以下のように調製した。ＢＶｄＵ（４２０ｍｇ、１．２６ｍｍｏ
ｌ）およびイミダゾール（１０３ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（２ｍ
Ｌ）溶液をアルゴン下でＬ−メトキシアラニニルホスホロクロリデート（（Ｍｃ
Ｇｕｉｇａｎら（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：１７４８−１７５３
）（１５滴、３５０ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）の滴下により処理し、そしてこの
反応混合物を２３℃でアルゴン下にて２４時間攪拌した。溶離液として１０％Ｍ
ｅＯＨ／９０％ＣＨ2Ｃｌ2（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を使用するシリカゲルＴＬＣによ
り、出発生成物（Ｒf＝０．５３）からの変換生成物（Ｒf＝０．７０）の生成が
起こっていたが、部分的な程度（約１５％）のみであったので、さらなるイミダ
ゾール（５２ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）およびホスホロクロリデート試薬（８滴
、１７５ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの混合物を２３℃でアル
ゴン下にてさらに２４時間攪拌した。ＴＬＣでは、変換率は約３０％程度まで増
加した。その後のさらなるホスホロクロリデートおよびイミダゾールでの処理は
、ほとんどこの反応を促進しなかった。この溶液を≠４０℃にて減圧下でロータ
リーエバポレーションにより容積を０．７５ｍＬに減らし、次いで等容積のＣＨ 2 Ｃｌ2を添加し、そしてこの溶液を乾燥４ｍｍシリカゲルＣｈｒｏｍａｔｏｔｒ
ｏｎプレートに直接適用した。この時点で、残留ＤＭＦのバルクが、このプレー
ト減圧デシケーター中に３０分間置くことにより除去される場合、その後の分離
は容易になる。２５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2（残りの試薬およびＤＭＦを溶出するた
め）次いで１０％ＭｅＯＨ／９０％ＣＨ2Ｃｌ2（ｖｏｌ／ｖｏｌ）（生成物、次
いで出発物質を溶出するため）を使用するラジアルクロマトグラフィーにより、
１４４ｍｇ（２０％）の中間体（３）および２９４ｍｇの出発物質（未変換の出
発物質に基づいて６７％の収率の変換生成物）を得た。混入イミダゾール（ｄ＝
７．６５および７．０１）またはＤＭＦ（ｄ＝７．９５，２．８９および２．７
３）の存在が1Ｈ ＮＭＲで検出される場合、さらなるラジアルクロマトグラフ
ィー精製を行った。このようにして、ＴＬＣおよび１Ｈ ＮＭＲで９８％の純度
を有する変換生成物を、リン中心に基づくジアステレオマーとのほぼ等モルの混
合物として、油状物／ガムまたは泡状−粉末形態で得た：1Ｈ ＮＭＲ（（Ｃ2Ｈ 3 ）2ＳＯ）ｄ＝１１．４（ｂｓ，2Ｈ2Ｏと交換，１，Ｎ３Ｈ），８．２８（擬−
ｔ，１，Ｈ６），７．３５（擬−ｔ，２，ｏ−Ｐｈ），７．３１（ｄ，１，ビニ
ル1Ｈ），７．２０（擬−ｔ，３，ｍおよびｐ−Ｐｈ），６．８９（ｄ，１，ビ
ニル２Ｈ），６．１９（ｔ，１，Ｈ１’），６．０８（ｔ，2Ｈ2Ｏと交換，１，
アラニニルＮＨ），５．４５（ｂｓ，2Ｈ2Ｏと交換，１，Ｏ３’Ｈ），４．３２
（ｍ，１，Ｈ３’），４．２２（ｍ，２，５’ＣＨ２），３．９７（ｍ，１，Ｈ
４’），３．８６（ｔ，１，アラニニルＣＨ），３．５８（２ｓ，３，ＣＯ2Ｍ
ｅ），２．１５（ｍ，２，２’ＣＨ２），１．２３（擬−ｔ，３，アラニニルＣ
Ｈ３），Ｊビニル ＣＨ−ビニル ＣＨ＝１３．５，ＪＨ１’−Ｈ２’約６．８
，ＪＨ２’−Ｈ３’約５，ＪＨ３’−Ｈ４’約０，ＪアラニニルＣＨ−アラニニ
ルＮＨ 約６Ｈｚ。スペクトルの帰属を１Ｈ／１Ｈ ＣＯＳＹ ２Ｄ ＮＭＲ分
析により確認した．13Ｃ ＮＭＲ（（Ｃ2Ｈ3）2ＳＯ））ｄ＝１７３．７および
１７３．６（アラニニルＣＯ2），１６２．１および１６１．６（Ｃ２），１５
０．６，１５０．５（ｉｐｓｏ−Ｐｈ），１４９．２（Ｃ４），１３９．４およ
び１３９．２（Ｃ６），１２９．８および１２９．６（ｍ−Ｐｈ），１２４．７
（ｐ−Ｐｈ），１２０．３，１２０．２（ｏ−Ｐｈ），１０７．１（ビニルＣ１
），８７．５（ビニルＣ２），８４．８（Ｃ４’），８３．８（Ｃ１’），７０
．１（Ｃ３’），６６．１（Ｃ５’），５１．９（アラニニルＯＭｅ），４９．
７（アラニニルα−Ｈ），２９．５（Ｃ２’），１９．６（アラニニルα−Ｍｅ
）。３ＪＰ−Ｃ４’＝７．８，２ＪＰ−Ｃ５’＝４．４，２ＪＰ−ｉｐｓｏ−Ｐ
ｈ＝６．５Ｈｚ，３１Ｐ ＮＭＲ ｄ＝３．９９，３．６９．低分解能ＤＣＩ（
ＮＨ3）質量：５９３／５９１（ＭＮＨ4 +），５７６／５７４（ＭＨ+）。
【００５３】 簡便さのためにのみ、本発明の方法において有用なプロドラッグの構造は、ク
ラスＩおよびクラスＩＩに分類された。
【００５４】 （クラスＩの化合物の一般的合成） クラスＩの化合物のＬ異性体およびＤ異性体は、以下の構造：
【００５５】
【化７】 を有する。
【００５６】 上記式において、Ｒ1（５位）は、分子寸法およびピリミジン環からの引き抜
きと互換性のある求電子性を有する化学実体である遊離基であるか、その遊離基
を含み、そしてこれは、ピリミジン環からの放出に際して、細胞の増殖を阻害す
るか、または細胞を殺傷する能力を有する。
【００５７】 上記式において、Ｑは、糖、炭素環式化合物または非環式化合物であるか、ま
たはマスクされたホスフェートもしくはそのホスホラミデート誘導体である。化
学実体は、糖基、チオ−糖基、炭素環式基であるかまたはそれを含むＱ、および
それらの誘導体からなる群より選択される。糖基の例としては、単糖、環式糖（
例えば、オキセタン（ｏｘｅｔａｎｅｓ）（四員環糖）、フラノース（五員環糖
）およびピラノース（六員環糖）から誘導される環式糖）が挙げられるがこれら
に限定されない。フラノースの例としては、トレオ−フラノシル（トレオース由
来、四炭素糖）；エリトロフラノシル（エリトロース由来；四炭素糖）；リボ−
フラノシル（リボース由来、五炭素糖）；アラ−フラノシル（これもまたしばし
ばアラビオ−フラノシルであるといわれる；アラビノース由来、五炭素糖）；キ
シロール−フラノシル（キシロース由来、五炭素糖）；ならびにリキソ−フラノ
シル（リキソース由来、五炭素糖）が挙げられる。糖基誘導体の例としては、「
デオキシ」、「ケト」および「デヒドロ」誘導体ならびに置換誘導体が挙げられ
る。チオ糖基の例としては、上記糖基のイオウアナログが挙げられ、ここでは、
環酸素がイオウ原子で置換されている。環状炭素基の例としては、Ｃ4環状炭素
基、Ｃ5環状炭素基、およびＣ6環状炭素基が挙げられ、これらは、１つ以上の置
換基（例えば、−ＯＨ基）をさらに有し得る。
【００５８】 １つの実施形態では、Ｑは、以下の式：
【００５９】
【化８】 のβ−Ｄ−リボフラノシル基であり、 ここで、Ｒ7は、Ｈ、マスクされたホスフェートまたはホスホラミデートおよ
びそれらの誘導体からなる群より選択され、ここでＲ2およびＲ3は、同じである
かまたは異なりかつ独立して−Ｈまたは−ＯＨである。
【００６０】 上記の式のいくつかの実施形態では、Ｒ1は、アルキル基（すなわち、−（Ｃ
Ｈ＝ＣＨ）n−Ｒ4）であり、ここでｎは０または１〜１０の整数であり、そして
Ｒ4は、Ｉ、Ｂｒ、ＣｌのようなハロゲンもしくはＣＮ、または水銀である。Ｒ2 がＨでありそしてＲ3が−ＯＨであるか、またはＲ2が−ＯＨでありそしてＲ3が
Ｈであるか、またはＲ2およびＲ3がＨであり、ここでＲ2およびＲ3は、ＯＨであ
る。
【００６１】 別の局面において、Ｒ4は、以下からなる群より選択される基であるか、その
基を含む：Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、−Ｏ−アル
キル、−Ｏ−アリール、Ｏ−ヘテロアリール、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アリール
、シアン化物、シアネートおよびハロビニル基、ハロ水銀基、−Ｓ−ヘテロアリ
ール、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−Ｎ（アルキル）2、−ＮＨＣＨＯ、−Ｎ
ＨＯＨ、−ＮＨＯ−アルキル、ＮＨ2ＣＯＮＨＯ−ならびにＮＨＮＨ2。これらの
実施形態では、さらなる局面としては、以下が挙げられる：Ｒ2およびＲ3がＨで
ある場合；Ｒ2がＯＨでありかつＲ3がＨである場合；Ｒ2がＨでありかつＲ3がＯ
Ｈである場合；またはＲ2およびＲ3がＯＨである場合。
【００６２】 Ｒ1位における置換基についての好ましい実施形態は、アリル交換を受け得る
位置である。
【００６３】 なおさらなる局面では、候補治療剤は、以下の式：
【００６４】
【化９】 の化合物（ここでｎは、０〜１０の整数であり；ここでＡは、亜リン酸誘導体で
ある）であるか、または以下の式：
【００６５】
【化１０】 の化合物であり、そしてここでＱは、以下からなる群より選択される：Ｈ、上記
で規定されるような非置換または置換の糖、および上記で規定されるような置換
または非置換の炭素環式。
【００６６】
【化１１】 であって、 ここでＲ＝２’−デオキシ−５−ウリジル、ｍは０または１であり、そしてｎ
は、０〜１０の整数である。
【００６７】 適切な場合、この化合物は、例えば、Ｄ形態もしくはＬ形態を含む、それらの
エナンチオマー、ジアステレオマー、または立体異性体のいずれかであり得、そ
して任意の立体化学的配置（例えば、α−もしくはβ−アノマー形態を含む）で
あり得る。
【００６８】 上記の５−置換されたピリミジンヌクレオシドおよび５−置換されたピリミジ
ンヌクレオシドモノリン酸の合成は、当該分野で周知の方法により達成され得る
。例えば、５−クロロ水銀−２’−デオキシウリジンを、Ｌｉ2ＰｄＣｌ4の存在
下で、ハロアルキル化合物、ハロアセテートまたはアロアルケンで処理すること
により、有機パラジウム中間体を介して、それぞれ、５−アルキル、５−アセチ
ルまたは５−アルケンの誘導体の形成を生じる。ピリミジンのヌクレオシドおよ
びヌクレオチドのＣ５−修飾の別の例は、脱保護したヌクレオチドを酢酸水銀で
処理し、次いで、Ｌｉ2ＰｄＣｌ4の存在下でスチレンもしくは環置換スチレンを
付加することにより、Ｃ５−トランス−スチリル誘導体を形成することである。
Ｂｉｇｇｅら（１９８０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０２（６）：２０３
３−２０３８。ピリミジンデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、５０℃で３時
間、酢酸緩衝液中で酢酸水銀と処理することにより、ピリミジン環の５位で、水
銀で誘導体化した。Ｄａｌｅら（１９７３）ＰＮＡＳ ７０（８）：２３８−２
２４２。このような処理はまた、モノリン酸の修飾のために有効であると予測さ
れる；あるいは、修飾された三リン酸は、例えば、アルカリホスファターゼでの
制御された処理、次いでモノリン酸の精製により、修飾されたモノリン酸に酵素
的に転換され得る。水銀と類似の分子特性を有するが、好ましい薬理学的特性を
有する他の部分（有機部分または非有機部分）は、置換され得る。置換されたピ
リミジンを合成するための一般的方法については、例えば、米国特許第４，２４
７，５４４号、同第４，２６７，１７１号；および同第４，９４８，８８２号；
ならびにＢｅｒｇｓｔｒｏｍら（１９８１）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６（７）
：１４３２−１４４１を参照のこと。上記の方法はまた、リボースもしくは２’
−デオキシリボース以外の糖（例えば、２’−３’−ジデオキシリボース、アラ
ビノース、フラノース、リキソース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、お
よびピラノース）を含む５−置換ピリミジンのヌクレオシドおよびヌクレオチド
誘導体の合成に適用可能である。５位置換基の例は、ハロビニル基（例えば、Ｅ
−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジレート）である。Ｂａｒｒ
ら（１９８３）前出。本出願の目的に関しては、上記式の２つの実施形態の合成
は、以下に記載の通りに合成した。
【００６９】 あるいは、５−ブロモデオキシウリジン、５−ヨードデオキシウリジン、およ
びそれらのモノリン酸誘導体は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎ
ｇ，ＶＡ（ＵＳＡ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（ＵＳＡ）、Ｍｏｒａｖｅｋ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ（ＵＳＡ）、ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，Ｃ
Ａ（ＵＳＡ）およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，
ＭＡ（ＵＳＡ）から市販される。市販の５−ブロモデオキシウリジンおよび５−
ヨードデオキシウリジンを、化学的に、またはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓ
ｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ（ＵＳＡ）およびＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ（
ＵＳＡ）から市販される試薬を用いて、キナーゼ酵素の作用により酵素的にかの
いずれかで、それらのモノリン酸に転換し得る。これらのハロゲン誘導体を、他
の置換基と化合して、新規かつより強力な代謝拮抗物質を作製し得る。
【００７０】 （クラスＩＩの化合物の一般的合成） クラスＩＩの化合物は、４つのクラスの化合物を含む。各クラスは、ウラシル
（ｕｒｉｃｉｌ）塩基の構造（すなわち、修飾ウラシル塩基）により規定される
。これらのクラスは、以下のＥＣＴＡ化合物である：Ｉ）塩基が、ウラシルのフ
ラノ−ピリミジノン誘導体であるＥＣＴＡ化合物；ＩＩ）塩基が、６−フルオロ
ウラシルであるＥＣＴＡ化合物；およびＩＩＩ）塩基が、塩基が、４ーヒドラゾ
ン置換ウラシル誘導体であるＥＣＴＡ化合物、ならびにＩＶ）塩基がウラシルで
あるＥＣＴＡ化合物。このウラシルまたは修飾ウラシル誘導化塩基は、５位で毒
性脱離基で置換され、この５位で電子コンジット鎖（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｃｏｎ
ｄｕｉｔ ｔｅｔｈｅｒ）により結合され、そして電子コンジットと毒性脱離基
との間に適切なスペーサーを含む化合物を合成するために使用される。ＥＣＴＡ
化合物は、「Ｑ」を含み、この「Ｑ」は、非リン酸化、５’モノリン酸、５’リ
ン酸ジエステル、または５’保護（マスク）デオキシウリジンまたはＲ7位の別
の炭水化物部分の匹敵する誘導体であり得、そして以下に記載のとおりであり得
る。保護された５−置換デオキシウリジンモノリン酸誘導体は、リン酸部分が適
切な化学保護基の結合を介してブロックされている誘導体である。５−置換デオ
キシウリジンモノリン酸誘導体の保護は、可溶性を改善し、細胞浸透を促進し、
血液脳関門の通過を促進し、そして細胞性ホスファターゼまたは細胞外ホスファ
ターゼの作用を妨げ得る（他にはリン酸基の喪失を生じ得る）。別の実施形態に
おいて、５−置換ウラシルまたはウリジン誘導体は、ヌクレオシドキナーゼ活性
を有する細胞に投与され、ここで、５−置換ウラシル／ウリジン誘導体は、５−
置換ウリジンモノリン酸誘導体に転換される。ウリジン誘導体はまた、それらの
溶解性、細胞浸透、および／または血液脳関門を通過する能力を増大するように
修飾され得る。
【００７１】 チミジル酸シンターゼの５−置換ウリジンモノリン酸誘導体に対する作用は、
ピリミジン環の５位に結合した置換基（「脱離基」）を放出し得る。次いで、こ
の放出された置換基は、固有にまたは別の細胞成分との反応に従うかのいずれか
で、細胞増殖の毒素またはインヒビターとして作用し得る。
【００７２】 本発明の化合物のＬ異性体およびＤ異性体は、以下に示される構造：
【００７３】
【化１２】 を有する化合物からなる群から選択される。
【００７４】 上記の式において、Ｒ1は、以下の式：
【００７５】
【化１３】 の部分である。
【００７６】 上記の式において、Ｒ2は、二価の電子コンジット（ｃｏｎｄｕｉｔ）部分で
あるか、この部分を含む。１つの実施形態において、Ｒ2は、ピリミジン環から
脱離基Ｒ1に向って電子を伝導するように作用する、単不飽和電子コンジットも
しくは多不飽和電子コンジットであるか、この単不飽和電子コンジットもしくは
多不飽和電子コンジットを含むが、ただし、クラスＩの化合物において、ｎは０
であり得る。１つの実施形態において、Ｒ2は、以下からなる群から選択される
：不飽和ヒドロカルビル基；１つ以上の不飽和ヒドロカルビル基を含む芳香族ヒ
ドロカルビル基；および１つ以上の不飽和ヒドロカルビル基を含むヘテロ芳香族
基。
【００７７】 １つの実施形態において、ＭＩＳＯおよびＲ2は、以下：
【００７８】
【化１４】 からなる群から選択される構造を有する不飽和ヒドロカルビル基である。
【００７９】 １つの実施形態において、Ｒ2およびＲ3は、一緒になって、以下：
【００８０】
【化１５】 からなる群から選択される構造を形成する。
【００８１】 １つの実施形態において、Ｒ2は、以下：
【００８２】
【化１６】 からなる群から選択される構造を有する芳香族ヒドロカルビル基である。
【００８３】 １つの実施形態において、Ｒ2は、以下：
【００８４】
【化１７】 からなる群から選択される構造を有するヘテロ芳香族基であり、 ここでＪは、ヘテロ原子（例えば、−Ｏ−、−Ｓ−、または−Ｓｅ−）である
か、ヘテロ原子基（例えば、−ＮＨ−または−ＮＲALK（ここで−ＮＲALKは、１
〜１０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖のアルキルであるか、または３
〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル基である））である。
【００８５】 上記の式において、Ｒ3は、二価のスペーサー部分であり、これはスペーサー
単位ともいわれる。１つの実施形態において、Ｒ3は、以下：
【００８６】
【化１８】 からなる群から選択される構造を有する二価のスペーサー部分であり、 ここでＲ5は、同じであるかまたは異なり、そして独立して、１〜１０個の炭
素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基、または３〜１０個の炭素原子
を有するシクロアルキル基であるか、あるいはＲ5はハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ
、Ｉ）である。
【００８７】 １つの実施形態において、Ｒ3は、以下：
【００８８】
【化１９】 からなる群から選択される構造を有する二価のスペーサー部分である。
【００８９】 １つの実施形態において、Ｒ3は、以下：
【００９０】
【化２０】 からなる群から選択される構造を有する二価のスペーサー部分である。
【００９１】 上記の式において、ｎは０または１〜１０の整数であり、そしてｍは０または
１である。１つの実施形態において、ｎは０または１〜１０の整数であり、そし
てｍは１である。１つの実施形態において、ｎは０であり、そしてｍは０である
。１つの実施形態において、Ｒ7が−Ｈである場合、ｎは０ではない。１つの実
施形態において、Ｒ7が−Ｈである場合、ｍは０ではない。１つの実施形態にお
いて、Ｒ7が−Ｈである場合、ｎは０ではなくかつｍは０ではない。１つの実施
形態において、Ｒ7が−Ｈの場合、Ｒ4はハロゲン（すなわち、−Ｆ、−Ｃｌ、−
Ｂｒ、−Ｉ）ではない。１つの実施形態において、Ｒ7が−Ｈでありかつｍが０
でありかつｎが０である場合、Ｒ4はハロゲン（すなわち、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂ
ｒ、−Ｉ）ではない。
【００９２】 上記の式において、Ｒ4は、発毒団部分である。本明細書で使用される場合、
用語「発毒団」は、活性化酵素によるピリミジン環からの引抜き（ｅｘｔｒａｃ
ｔｉｏｎ）に適合性の分子寸法および求電子性を有する化学的実体であり、かつ
酵素によりピリミジン環から放出される際に、細胞の増殖を阻害するかもしくは
細胞を殺傷する能力を有する脱離基であるか、またはこの脱離基を含む部分を意
味する。
【００９３】 １つの実施形態において、発毒団は、細胞において過剰発現された細胞内酵素
により活性化されるかまたは放出される脱離基であるか、この脱離基を含む。１
つの実施形態において、Ｒ4は、以下：
【００９４】
【化２１】 からなる群から選択される構造を有する基であるか、この基を含み、 ここでＸは、各位置において同じかまたは異なり、そして−Ｃｌ、−Ｂｒ、−
Ｉまたは他の潜在的脱離基（−ＣＮ、−ＯＣＮ、および−ＳＣＮを含むがこれら
に限定されない）であり；Ｙは、各位置において同じかまたは異なり、そして独
立して−Ｈまたは−Ｆであり；そしてＺは、同じかまたは異なり、そして独立し
て−Ｏ−または−Ｓ−であり、Ｒ5およびＲ9は、低級アルキルであり、そしてＲ 10 は、ＨまたはＣＨ3である。
【００９５】 １つの実施形態において、Ｒ4は、以下からなる群から選択される化学的実体
であるか、この化学的実体を含む：−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アリ
ール、Ｏ−ヘテロアリール、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アリール、−Ｂｒ、−Ｓ−
ヘテロアリール、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＨ2、−ＮＨ−アルキル、
−Ｎ （アルキル）2、−ＮＨＣＨＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＯ−アルキル、ＮＨ2 ＣＯＮＨＯ−、ＮＨＮＨ2、−Ｎ3、およびｃｉｓ−プラチンの誘導体（例えば、
【００９６】
【化２２】 ）。
【００９７】 上記の式において、ＱはクラスＩの化合物について記載されるとおりであり、
従ってＱはプロドラッグの酵素（ＴＳまたはＴＫ）への機能的結合を支持する部
分であるかまたはこの部分を含む。１つの実施形態において、Ｑは、以下：
【００９８】
【化２３】 からなる群から選択され、 ここでＲ6は、各位置において同じかまたは異なり、そして独立して−Ｈ、Ｆ
、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ3、または他の保護されたヒドロキシル基（ベン
ゾイル、−ＣＯＣ6Ｈ5、およびトルオイル、−ＣＯＣ6Ｈ4ＣＨ3を含むが、これ
らに限定されない）であり；そしてＲ7は、５’位でＱに結合し、かつ水素、ホ
スフェート基、ホスホジエステル基、ホスホラミデート基、または他のリン含有
基である。
【００９９】 １つの実施形態において、Ｑは、
【０１００】
【化２４】 である。
【０１０１】 １つの実施形態において、Ｒ7は水素である。代替の実施形態において、Ｒ7は
ホスフェート基、マスクされたホスフェート基、ホスホジエステル基、またはホ
スホラミデート基である。好ましい実施形態において、Ｒ7はホスホラミデート
基である。
【０１０２】 １つの実施形態において、Ｒ7は、アミノ酸（例えば、２０種の天然に存在す
るアミノ酸）から誘導されるホスホラミデート基である。１つの実施形態におい
て、Ｒ7は、アラニンから誘導されるホスホラミデート基である。１つの実施形
態において、以下の構造：
【０１０３】
【化２５】 を有する基であるかまたはこの基を含む。
【０１０４】 上記の基、およびその調製方法は、（ＭｃＧｕｉｇａｎら（１９９３）Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１０４８−１０５２）、および（ＭｃＧｕｉｇａｎら（
１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：１７４８−１７５３）に記載される。
【０１０５】 １つの実施形態において、Ｒ7は、トリプトファンから誘導されるホスホラミ
デート基である。１つの実施形態において、Ｒ7は、以下の構造：
【０１０６】
【化２６】 を有する基であるかまたはこの基を含む。
【０１０７】 上記の基、およびその調製方法は、Ａｂｒａｈａｍら（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ
．Ｃｈｅｍ．３９：４５６９−４５７５に記載される。
【０１０８】 １つの実施形態において、Ｒ7は、ホスフェート基である。１つの実施形態に
おいて、Ｒ7は、以下：
【０１０９】
【化２７】 からなる群から選択される構造を有する基であるかまたはこの基を含む。
【０１１０】 上記の２つの基のうち１つ目の基、およびその調製方法は、Ｆｒｅｅｄら（１
９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３８：３１９３−３１９８；Ｓ
ａｓｔｒｙら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：４４１−４４５
；Ａｒｑｕｈａｒら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：３９０２−３９
０９およびＦａｒｑｕｈａｒら（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：４４
８−４９５に記載される。上記の２つの基のうち２つ目の基、およびその調製方
法は、Ｖａｌｅｔｔｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：１９８１お
よびＢｅｎｚａｒｉａら（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９，４９５８頁
に記載される。
【０１１１】 １つの実施形態において、Ｒ7は、以下：
【０１１２】
【化２８】 からなる群から選択される構造（ここでＲは芳香族置換基である）を有する基で
あるかまたはこの基を含む。
【０１１３】 上記の２つの基のうち１つ目の基、およびその調製方法は、Ｍｅｉｅｒら（１
９９７）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：１５７７；Ｍｅｉｅ
ｒら（１９９７）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ ７：９９；およ
びＭｅｉｅｒら（１９９７）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ
Ｎｅｗｓ．５：１８３に記載される。上記の２つの基のうち２つ目の基、およ
びその調製方法は、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ．５３：１８１５；およびＨｏｓｔｅｔｌｅｒら、国際公開特許出
願ＷＯ ９６／４００８８（１９９６）に記載される。
【０１１４】 １つの実施形態において、Ｒ7は、Ｑ内で環式基を形成する。このような１つ
の実施形態、およびその調製方法は、以下に示される：
【０１１５】
【化２９】 （ここでＤＭＴｒは、４，４’−ジメトキシトリチルであり、ＢＯＣは、ｔ−ブ
チルオキシカルボニルであり、ＤＣＣは、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミドであり、そして４−ＤＭＡＰは、４−ジメチルアミノピリジンである）。
【０１１６】 １つの実施形態において、化合物は、任意のエナンチオマー形態、ジアステレ
オマー（ｄｉａｓｔｅｒｉｏｍｅｒｉｃ）形態、または立体異性体形態であり得
、これらとしては、Ｄ体、Ｌ体、α−アノマー形態、およびβ−アノマー形態を
含む。
【０１１７】 １つの実施形態において、化合物は、塩形態または保護された形態かもしくは
プロドラッグの形態、またはこれらの組合わせであり得る（例えば、塩、エーテ
ル、またはエステル）。
【０１１８】 別の実施形態において、上記の構造は、以下に記載される方法を使用して、ホ
スホジアジリジン基に代えてチオホスホジアジリジンを有するようにさらに改変
される。
【０１１９】 ウラシルの５位における構造を、つなぎ鎖（ｔｅｔｈｅｒ）という。なぜなら
ば、この構造は、提案された脱離基（発毒団）を複素環に接続するからである。
例えば、ヒトＴＳの活性部位におけるＣｙｓ残基との反応による複素環の活性化
の際に、負電荷は、ウラシルの６位からつなぎ鎖に伝導される。この機構は、（
ＢＶＤＵ）の５’−モノホスホリル化バージョンについて（Ｂａｒｒら（１９８
３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２：１６９６−１７０３）により、そして（
Ｅ）−５−（３，３，３−トリフルオロ−１−プロペニル）−２’−デオキシウ
リジン（ＴＦＰｅ−ｄＵｒｄ）の５’−モノホスホリル化バージョンについてＷ
ａｔａｙａら（１９７９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２２：３３９−３４０；Ｓａ
ｎｔｉ（１９８０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１０３−１１１；およびＢｅ
ｒｇｓｔｒｏｍら（１９８４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：２７９−２８４に
より記載されている。
【０１２０】 毒素とｄＮＭＰとの間のつなぎ鎖「スペーサー」は、ＴＳ−Ｃｙｓ−スルフヒ
ドリルの攻撃により供給される、毒素を不安定化する負電荷を伝導し得るように
、不飽和でなければならない。この目的のために利用可能な多くの不飽和有機官
能基のうち、ビニル単位、アリル単位、およびプロパルギル単位は、単純で小さ
く、そして合成的に容易に入手可能である。ビニル単位およびアリル単位は、こ
れらが２つの相互転換不可能な幾何学的異性体形態のいずれかで調製され得ると
いう利点を有する。従って、これらはＴＳ活性部位によるプロドラッグ適応の「
プローブ」として使用され得る。他方では、プロパルギル単位は、円筒形対称で
あるという利点を有し、その結果、この型のつなぎ鎖からのＴＳ触媒毒素放出は
、ビニル分子およびアリル分子の場合には依存するようなｄＵＭＰウラシル環に
対する方向に依存しない。
【０１２１】 ２つの異なるアプローチが、本発明のヌクレオチドベースのプロドラッグを設
計するために考慮されてきた。１つはＢＶＤＵモノホスフェートの構造に基づき
、そしてｄＵＭＰのＣ５における（ポリ）ビニル置換基の末端に直接結合した脱
離基／毒素を特徴とする。これは、ビニルつなぎ鎖アプローチである。もう１つ
は、ＴＦＰｅ−ｄＵＭＰの構造に基づき、そして１つ目と同様であるが、脱離基
／毒素と不飽和単位を分離するメチレン単位を有し、従ってアリルまたはプロパ
ルギル単位を含む。これは、アリルつなぎ鎖アプローチである。
【０１２２】 アリルつなぎ鎖アプローチのプロパルギルバージョンの活性化の機構は、５−
エチニル−２’−デオキシウリジン５’−モノホスフェート（ＥｄＵＭＰ）およ
び５−（３−ヒドロキシ−１−プロピニル）−２’デオキシウリジン５’−モノ
ホスフェート（ＨＯＰｄＵＭＰ）の両方とＴＳとの相互作用に先行する（Ｂａｒ
ｒら（１９８１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：１３８５−１３８８およびＢａ
ｒｒら（１９８３）前出）。ＥｄＵＭＰは、ＴＳの強力なインヒビター（Ｋｉ＝
０．１ＴＭ）であり、そして活性部位においてアレンベースの種を形成するよう
である。ＨＯＰｄＵＭＰ（Ｋｉ＝３．０ＴＭ）は、異常な阻害速度論を示し、こ
れは、活性部位におけるクムレンベースの種の形成に起因し得る。
【０１２３】 ビニルおよびアリルつなぎ鎖アプローチ機構の両方に共通な中間体と構造が類
似した５−アルキリデン化５，６−ジヒドロウラシルは、最近合成されている（
Ａｎｇｌａｄａら（１９９６）Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．３３
（４）：１２５９）。これらは、高度に求電子性であることが示された。５−（
エトキシメチル）ウラシルを生成するためのエタノールとの準備の反応は、触媒
能力のあるＴＳを再生する水の添加に先行する。なおより最近では、ＴＳにより
生成される、長い間知られていなかったＣ５メチレン中間体の存在が、トラップ
研究によより実証された（Ｂａｒｒｅｔｔら（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．１２０：４４９−４５０）。
【０１２４】 （プロパルギルつなぎ鎖を有するＥＣＴＡ化合物の合成）プロパルギルアルコ
ールおよびアリルアルコールを備えた２’−デオキシウリジンの合成は、直接的
である。これらの多くおよびその近い誘導体が、文献に報告されており、そして
いくつかはＴＳを結び付けて研究されている。例えば、５−アルキニル−ｄＵＭ
Ｐ（５−（３−メトキシ−１−プロピニル）−ｄＵＭＰおよび５−（３−ヒドロ
キシ−１−プロピニル）−ｄＵＭＰを含む）は、ＴＳインヒビターとして調べら
れており（Ｂａｒｒら（１９８１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：１３８５−１
３８８）、これのいくつかは、ＴＳ欠損癌細胞のＤＮＡに組込まれることが示さ
れた（Ｂａｌｚａｒｉｎｉら（１９８５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３７３（１）：
４１−４）。
【０１２５】 ５−水銀ウリジン（Ｒｕｔｈら（１９７８）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３：２
８７０−２８７６）および５−ヨードウリジン（Ｒｏｂｉｎｓら（１９８１）Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２２：４２１−４２４）の両方は、パラジウ
ム触媒の存在下でアルケンおよびアルキンと容易に縮合して、Ｃ５につなぎ鎖を
備えたウリジンを与える。後者の経路がより頻繁に採用される（Ｒｏｂｉｎｓら
（１９８２）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６０：５５４−５５７；Ａｓａｋｕｒａ（
１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２９：２８５５−２８５８；お
よびＡｓａｋｕｒａ（１９９０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４９２８−４９
３３）。保護された５−ヨード−２’−デオキシウリジンの以下との高収率の縮
合が達成されている：ｔ−ブチルジメチルシリルプロパルギルエーテル（ｂｕｔ
ｙｉｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ ｐｒｏｐａｒｇｙｌ ｅｔｈｅｒ）（Ｇｒａ
ｈａｍら（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋ．Ｔｒａｎｓ．１：１１３
１−１１３８およびＤｅ Ｃｌｅｒｃｑら（１９８３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．
２６：６６１−６６６）、メチルプロパルギルエーテル（Ｔｏｌｓｔｉｋｏｖら
（１９９７）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １６：２１５
２２５およびプロパルギルアルコール自体（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉら（１９９５）
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ１１７：１０４３４−１０４４２およびＧｏｏｄｗ
ｉｎら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：５５４９−５５
５２）。後の反応により導入された３−ヒドロキシ−１−プロピニル置換基はま
た、メタクリレート基のＤＩＢＡＬ−Ｈ還元により入手され得（Ｃｈｏら（１９
９４）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２５：１１４９−１１５２）、これ
自身はＢＶＤＵの合成において使用される同じＨｅｃｋ反応から生じる。これら
のパラジウム触媒反応は、非常に容易であるので、非常に長く、かつ複雑に官能
化されたプロパルギルベースのつなぎ鎖を５−ヨード−２’−デオキシウリジン
に縮合させるためにこれらの反応が使用され得る（Ｌｉｖａｋら（１９９２）Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：４８３１−４８３７およびＨｏｂｂ
ｓ（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：３４２０−３４２２）。（Ｚ）−
アリルベースのつなぎ鎖は、Ｕｎｄｉａｒ触媒でのプロパルギル前駆体の部分水
素添加により生成され（Ｒｏｂｉｎｓ（１９８３）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ５（
１１）：３５４６−３５４８）および（Ｂａｒｒ（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５８（２２）：１３６２７−１３６３１およびＢｉｏｃｈｅｍ．２２
：１６９６−１７０３）、一方（Ｅ）−アリルベースのつなぎ鎖は、（Ｅ）−ト
リブチルスズ化エチレンのＨｅｃｋカップリングにより最良に調製される（Ｃｒ
ｉｓｐ（１９８９）Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９：２１１７−２１２３）。
【０１２６】 文献の手順に綿密に従って、ｔ−ブチルジメチルシリルプロパルギルエーテル
を備えた３’，５’−ジ−Ｏ保護２’デオキシウリジン（Ｇｒａｈａｍら（１９
９８）前出；（Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑら（１９８３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６
：６６１−６６６）は調製され、そして対応する（Ｚ）−アリルエーテルに変換
されたその一部（Ｂａｒｒら（１９８３）前出）が、還元される。ＴＢＡＦ媒介
のＴＢＤＭＳ基の除去は、インサイチュで官能化され得るオキシアニオンを生成
するので、これらのＴＢＤＭＳ保護プロパルギルつなぎ鎖ヌクレオシドおよび（
Ｚ）−アリル（ａｌｌｙｌｔｉｃ）つなぎ鎖ヌクレオシドは、発毒団を供えたい
くつかの標的に対する簡便な前駆体として役立つ。（Ｅ）−アリルアルコールを
備えたヌクレオシドについては、公知のＯ−テトラヒドロピラニルエーテル誘導
体が、（Ｅ）−トリブチルスズ化エチレンの文献のＨｅｃｋカップリングにより
調製される（Ｃｒｉｓｐ（１９８９）前出）。
【０１２７】
【化３０】 ２工程の文献のプロトコル（Ｐｈｅｌｐｓら（１９８０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅ
ｍ．２３：１２２９−１２３２ならびにＨｓｉａｏおよびＢａｒｄｏｓ（１９８
１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：８８７−８８９）を使用して、プロパルギル
アルコールならびに（Ｅ）および（Ｚ）アリルアルコールは、それらの対応する
ビス−アジリジニルホスホラミデートまたはチオホスホラミデートに変換され、
その結果、５’−モノヌクレオチドバージョンのＴＳ処理は、細胞増殖抑制薬Ｔ
ＥＰＡまたはチオＴＥＰＡの活性代謝物をそれぞれ放出する（Ｄｉｒｖｅｎら（
１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１７０１−１７０６）。
【０１２８】
【化３１】 ビス−アジリジン−１−イル−ホスフィン酸３−［２−デオキシウリジン５−
イル］プロパ−２−イニルエステル（「ＴＥＰＡ」）を合成し、そして1Ｈ Ｎ
ＭＲにより分析して、以下の結果を得た：1Ｈ ＮＭＲ（（ＣＤ3）2ＳＯ）ノイ
ズに起因して複雑化。顕著な特徴：δ ８．２８（ｄ，１，Ｈ６），６．１０（
擬−ｔ，１，Ｈ１’），５．２６（ｍ，Ｄ2Ｏと交換，１，３’−ＯＨ），５．
１３（ｍ，Ｄ2Ｏと交換，１，５’−ＯＨ），４．８１（ｑまたはｄｄ，２，プ
ロパルギル−ＣＨ2），４．２４（ｍ，１，Ｈ３’），３．５７（ｍ，２，５’
−ＣＨ2），２．１５−２．０（ｍ，８，アジリジン−ＣＨ2）。
【０１２９】 ビス−アジリジン−１−イル−ホスフィノチオ酸３−［２−デオキシウリジン
５−イル］−プロパ−２−イニルエステル（「チオＴＥＰＡ」）もまた、合成さ
れそして1Ｈ ＮＭＲにより分析されて以下の結果を与えた：1Ｈ ＮＭＲ（（Ｃ
Ｄ3）2ＳＯ）ノイズに起因して複雑化。顕著な特徴：δ ８．２９（ｄ，１，Ｈ
６），６．１０（擬−ｔ，１，Ｈ１’），５．２２（ｍ，Ｄ2Ｏと交換，１，３
’−ＯＨ），５．１０（ｍ，Ｄ2Ｏと交換，１，５’−ＯＨ），４．８８（ｑま
たはｄｄ，２，プロパルギル−ＣＨ2），４．３１（ｍ，１，Ｈ３’），３．５
２（ｍ，２，５’−ＣＨ2），２．１５−２．０（ｍ，８，アジリジン−ＣＨ2）
。
【０１３０】 （フラノ−ピリミジノンの合成）フラノ−ピリミジノンの合成は、Ｃ５プロパ
ルギル−アルコールを備えた２’−デオキシウリジンの合成で始まる。次いでフ
ラノ−ピリミジノン化合物は、上記のＯ−テトラヒドロピラニルエーテル誘導体
から形成される。合成は、プロパルギル結合の第２の炭素の、ピリミジン環のＣ
４位に結合した酸素との反応により進行して、蛍光性フラノピリミジノンを与え
、これは反応混合物から容易に分離され得る。このような化合物は、特定の電子
コンジット、スペーサーおよび毒素脱離基の種々の組合せによるＥＣＴＡ化合物
の合成のためのさらなる基礎を提供する。
【０１３１】
【化３２】 フロ［２，３−ｄ］ピリミジノンヌクレオシドを、２’，３’−ジ−Ｏ−ｐ−
トルオイル−５−ヨード−２’−デオキシウリジンまたは２’，３’−ジ−Ｏ−
アセチル −５−ヨード−２’−デオキシウリジンを１−（テトラヒドロピラニ
ルオキシ）−２−プロピン（ＪｏｎｅｓおよびＭａｎｎ（１９５３）Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７５：４０４８−４０５２）と、これらの蛍光性化合物の形
成を促進することが公知の条件下で（Ｂａｒｒら（１９８３）前出）縮合させる
ことにより調製した。炭水化物保護基の塩基触媒除去により、６−（テトラヒド
ロピラン−２−イルオキシメチル）置換二環式ヌクレオシドを得、このヌクレオ
シドは、標準的な酸性ＴＨＰ基加水分解（ＣＨ2Ｃｌ2中ＴＦＡ）に供されるか、
またはＢｖｄＵ−ＰＡおよび５ＦＵｄＲ−ＰＡを調製するために使用される同じ
手順により、位置選択的に５’−ホスホラミデート化されるかのいずれかであっ
た。ホスホラミデート化後に、ＴＨＰ基は、酸性加水分解により除去され得る。
【０１３２】
【化３３】 （３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−（テトラヒドロピラ
ン−２−イルオキシメチル）フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２（３Ｈ）−オン
）1Ｈ ＮＭＲ（（ＣＤ3）2ＳＯ）δ ８．８０（ｓ，１，Ｈ４），６．７４（
ｓ，１，Ｈ５），６．１６（擬−ｔ，１，Ｈ１’），５．２７（ｄ，Ｄ2Ｏと交
換，１，３’−ＯＨ），５．１２（ｔ，Ｄ2Ｏと交換，１，５’−ＯＨ），４．
７２（ｍ，１，ＴＨＰ−Ｈ２），４．５６（ｑ，２，ＣＨ2ＯＴＨＰ），３．９
２（ｍ，１，Ｈ４’），３．６４（ｍ，２，５’−ＣＨ2），２．４０（ｍ，１
，Ｈ２’ａ），２．０３（ｍ，１，Ｈ２’ｂ），１．６８および１．５０（ｍ，
８，ＴＨＰ）。ビス−ＴＭＳ誘導体に対する低分解能質量分析（ＤＣＩ−ＮＨ3
），ｍ／ｚ ３２３（Ｂ＋ＴＭＳ＋Ｈ+），５１１（ＭＨ+），５８３（Ｍ＋ＴＭ
Ｓ+）。
【０１３３】 （３−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−（ヒドロキシメチル
）フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２（３Ｈ）−オン）1Ｈ ＮＭＲ（（ＣＤ3） 2 ＳＯ）δ １２．０（ｂｓ，１，ＯＨ），８．２４（ｓ，１，Ｈ４），６．５
３（ｓ，１，Ｈ５），５．５１（擬−ｔ，１，Ｈ１’），４．４２（ｍ，２，Ｃ
Ｈ2ＯＨ）。低分解能質量分析（ＤＣＩ−ＮＨ3），ｍ／ｚ １６７（Ｂ＋２Ｈ+
），１８４（Ｂ＋ＮＨ4 +）。
【０１３４】 １−［６−（テトラヒドロピラン−２−イルオキシメチル）フロ［２，３−ｄ
］ピリミジン−２（３Ｈ）−オン−３−イル］−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフ
ラノース−５−イル＝フェニル＝メトキシ−Ｌ−アラニルホスホラミデート。1
Ｈ ＮＭＲ（（ＣＤ3）2ＳＯ）ジアステレオマーの存在に起因して複雑化。顕著
な特徴：δ ８．６２および８．５９（それぞれｓ，それぞれ１，Ｈ４），７．
４−７．１（ｍ，５，ＰｈＯ），６．６１および６．６０（それぞれｓ，それぞ
れ１，Ｈ５），６．２５（ｍ，１，Ｈ１’），４．５６（ｑ，２，プロパルギル
−ＣＨ2），３．５６および３．５４（それぞれｓ，それぞれ３，ＣＯ2Ｍｅ），
２．０（ｍ，１，Ｈ２’ｂ），１．２２（ｍ，３，アラニル−α−Ｍｅ）。低分
解能質量分析（ＤＣＩ−ＮＨ3），ｍ／ｚ １６７（Ｂ＋２Ｈ+），１８４（Ｂ＋
Ｈ+＋ＮＨ4 +−ＴＨＰ)。
【０１３５】 （１−［６−（ヒドロキシメチル）フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２（３Ｈ
）−オン−３−イル］−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース−５−イル＝フ
ェニル＝メトキシ−Ｌ−アラニルホスホラミデート）1Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ3 ）ジアステレオマーの存在に起因して複雑化。顕著な特徴δ ８．５（ｓ，１，
Ｈ４），７．４−７．１（ｍ，５，ＰｈＯ），６．３６および６．３０（それぞ
れｓ，それぞれ１，Ｈ５），６．２３（ｍ，１，Ｈ１’），３．６７および３．
６５（それぞれｓ，それぞれ３，ＣＯ2Ｍｅ），２．６９（ｍ，１，Ｈ２’ａ）
，２．１０（ｍ，１，Ｈ２’ｂ），１．３５（ｍ，３，アラニニル−α−Ｍｅ）
．低分解能質量分析（ＤＣＩ−ＮＨ3），ｍ／ｚ ５２５（ＭＨ+），５９５（Ｍ
ＮＨ4 +）。
【０１３６】 ５−（３−ヒドロキシ−１−プロピニル）−２’−デオキシウリジンの４−ニ
トロフェニルエーテル誘導体を、以下に示される標準のエーテル合成に従って調
製した。
【０１３７】
【化３４】 （５−［３−（４−ニトロフェノキシ）−１−プロピニル］−２’−デオキシ
ウリジン）予め乾燥した５−（３−ヒドロキシ−１−プロピニル）−２’−デオ
キシウリジン（「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．３９．Ｅｆ
ｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ５−Ｉｏｄｏ ｔｏ ５−Ａｌ
ｋｙｎｙｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖｅｄ ５−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｕｒａｃ
ｉｌ Ｂａｓｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ」ＲｏｂｉｎｓおよびＢａ
ｒｒ，（１９８３）前出）（５６５ｍｇ、２ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（４０ｍＬ
）溶液を、アルゴン下で４−ニトロフェノール（６９６ｍｇ、５ｍｍｏｌ）、ト
リフェニルホスフィン（７８７ｍｇ、３ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルアゾ
ジカルボキレート（５９０Ｌ、３ｍｍｏｌ）で処理し、そしてこの反応混合物を
溶液が透明になるまで６０℃で加熱し、次いでさらに１時間加熱した。この混合
物を、２３℃に冷却させ、次いでエバポレートして、ＳｉＯ２上に移し、ＭｅＯ
Ｈ／ＣＨ2Ｃｌ2を溶離液として使用してクロマトグラフィーにより精製し、１０
７ｍｇ（１３％）の所望のエーテル生成物を得た：ｍｐ １１２−１１８℃。1
Ｈ ＮＭＲ（（ＣＤ3）2ＳＯ）１１．６５（ｓ，Ｄ2Ｏと交換，１，ＮＨ），８
．２９（ｓ，１，Ｈ６），８．２４（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２，ｍ−ＡｒＨ），
７．２３（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２，ｏ−ＡｒＨ），６．０９（擬−ｔ，１，Ｈ
ｌ’），５．１７（ｓ，２，プロパルギル−ＣＨ2），４．２２（ｍ，１，Ｈ３
’），３．８０（ｍ，１，Ｈ４’），３．５９（ｍ，２，５’−ＣＨ2），２．
１３（擬−ｔ，２，２’−ＣＨ2）。ペル−トリメチルシリル化物質に対する低
分解能質量分析（ＤＣＩ−ＮＨ3）、ｍ／ｚ ５４７［Ｍ（ＴＭＳ）2Ｈ+］，５
６５［Ｍ（ＴＭＳ）2ＮＨ4 +］，６２０［Ｍ（ＴＭＳ）3Ｈ+］。
【０１３８】 （フラノ−ピリミジノンに基づくＴＳ ＥＣＴＡ化合物）毒性脱離基をＣ５プ
ロパルギルウリジン化合物上のヒドロキシに結合するために使用される方法（上
記のＴＥＰＡおよびチオＴＥＰＡ誘導体の合成で説明される）と類似の方法を使
用して、毒性Ｒ4脱離基は、フラン−２−メチルアルコールに結合され得る。種
々の代替の毒性脱離基（当業者に明らか）が、本発明の対象である。さらに、Ｒ 2 電子コンジット成分の長さおよび組成ならびにＲ3スペーサー要素の組成の改変
物もまた、特許請求の範囲に含まれる。
【０１３９】 フラノピリミジノンベースのＴＳ ＥＣＴＡ化合物はまた、種々に修飾された
「Ｑ」部分からなり得る。多くの５置換された２’−デオキシウリジンは、ヒト
ＴＫに対する基質ではないが、興味深いことに、５−（４−ヒドロキシ−１−ブ
チニル）−２’−デオキシウリジンは例外であることが見出された（Ｂａｒｒら
（１９８１）前出）。従って、毒素族を有したヌクレオシドのいくらかはまた、
好都合なＴＫ基質活性を有することが予測される。従って、ＥＣＴＡ化合物は、
フリーの５’ヒドロキシル基、５’一リン酸基、または別の炭水化物基に結合し
た５’ホスホルアミダイト基を有し得る。このようなホスホルアミダイト化合物
を合成するための新規な方法は、２−デオキシ３’−ヒドロキシ，５’ヒドロキ
シ脱保護ヌクレオチドとホスホクロリデートとを、ＨＣｌスカベンジャーの存在
下で反応させることにより達成される。好ましい実施形態において、ホスホクロ
リデートは、アラニンのようなアミノ酸に由来するリン酸置換基を含む。例えば
、ホスホクロリデートは、フェニル−Ｌ−メトキシアラニンホスホクロリデート
であり得る。
【０１４０】 （Ｃ６フルオロウリジンおよびＣ４ヒドラゾン（ｈｙｄｏｚｏｎｅ）ベースの
化合物） ピリミジンＣ５−Ｃ６二重結合への中性チオールの付加は、ｄＵＭＰとの正常
ＴＳ反応において発熱反応（３〜９ｋｃａｌ／ｍｏｌとして進行する；Ｌｅｓら
（１９９８）Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｙｎ
ａｍｉｃｓ １５（４）：７０３−７１５による総説を参照のこと。活性なヒト
ＴＳシステイン（Ｌ．ｃａｓｅｉのｃｙｓ−１９８と一致）を介した酵素とのス
ルフヒドリル結合の形成を容易にし得る６位のＴＳ反応性水素に対する別の置換
基としては、フッ素が挙げられる。ピリミジン環における他の位置のこのような
置換基はまた、基質とＴＳとの間の反応を容易にし得る。例えば、ウラシルに対
する４−ヒドラゾン置換（ＬｅｓおよびＲｈｏｄｅ（１９９８）Ｂｉｏｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ １５（４）：７
０３−７１５に記載される）は、ＴＳとのチオールの形成を容易にする。得られ
たヌクレオチド−チオール（ＴＳ）中間体が、加水分解を介して受動的に達成さ
れ得る改変ヌクレオチドを放出するような方法で転移することは重要である。
【０１４１】
【化３５】 Ｃ６位にフッ素を導入することは、これまでに報告されていないが、Ｋｒａｊ
ｅｗｓｋａｓおよびＳｈｕｇａｒ（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌ．３１（６）：１０９７−１０２（多くの６置換ウラシルおよびウリジンア
ナログの合成を記載する）の合成説明に従うことによって合成され得る。
【０１４２】 ピリミジン塩基の４位における化学反応しやすい（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆａ
ｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ）置換基は、当業者に周知である。文献説明の例としては
、以下が挙げられる：Ｗａｌｌｉｓら（１９９９）Ｆａｒｍａｃｏ ５４（１−
２）：８３−８９；Ｎｅｇｉｓｈｉら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３５（Ｔｗｅｎｔｙｔｈｉｒｄ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏ
ｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１３７−１３８；Ｂａ
ｒｂａｔｏら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
１０（４）：８５３−６６；Ｂａｒｂａｔｏら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄ
ｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ８（４）：５１５−５２８；ならびにＨｏｌｙ
ら（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２（１２）：２０６４−２０８６）。
これらの合成技術はまた、例えば、ピリミジン環のＣ４位およびＣ５位における
置換基の化合（Ｐｌｕｔａら（１９９９）Ｂｏｌｌ．Ｃｈｉｍ．Ｆａｒｍ．１３
８（１）：３０−３３）またはピリミジン環のＣ２位とＣ４位における置換基の
化合（Ｚｅｉｄら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓ １８（１）：９５−１１１）を可能にする。
【０１４３】
【化３６】 本発明の別の実施形態において、ＥＣＴＡ化合物は、別の電子コンジット（ｅ
ｌｅｃｔｒｏｎ ｃｏｎｄｕｉｔ）、スペーサー部分および毒性脱離基を、Ｃ６
フルオロウリジン塩基またはＣ４ヒドラゾン修飾ピリミジンいずれかに付加する
ことにより合成される。２，デオキシウリジンベースのＥＣＴＡ化合物を合成す
るための上記の方法は、このような分子を合成するために再び用いられ得る。
【０１４４】 （Ｂ．クラスＩおよびクラスＩＩの化合物の誘導体） 本明細書中に開示された上記化合物の塩、エステル、およびエーテルはまた、
本発明の範囲内である。本発明のプロドラッグの塩は、無機酸または有機酸およ
無機塩基または有機塩基から誘導され得る。酸の例としては、以下が挙げられる
：塩酸、シュウ酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グ
リコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸
、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マ
ロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸。他の酸（これ
ら自体が薬学的に受容可能ではないが）（例えば、シュウ酸）は、本発明の化合
物を得る際に中間体として有用な塩およびそれらの薬学的に受容可能な酸付加塩
の調製において使用され得る。塩基の例としては、以下が挙げられる：アルカリ
金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウ
ム）水酸化物、アンモニア、および式ＮＷ4 +（ここで、Ｗは、Ｃ1-4アルキルで
ある）の化合物。
【０１４５】 塩の例としては、以下が挙げられる：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、
アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、
クエン酸塩、樟脳酸、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグ
ルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタ
ン酸塩（ｆｌｕｃｏｈｅｐｔａｎｏａｔｅ）、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩（
ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅ）、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、シュウ酸塩
、ヨウ素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メ
タンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、
パルモエート（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピ
オン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩
、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩。塩の他の例としては、本
発明の化合物のアニオンと適切なカチオンと（例えば、Ｎａ+、ＮＨ4 +およびＮ
Ｗ4 +（ここでＷは、Ｃ1-4アルキル基））が化合したものが挙げられる。
【０１４６】 治療的使用に関して、本発明の化合物の塩は、薬学的に受容可能である。しか
し、薬学的に受容可能でない酸および塩基の塩もまた、例えば、薬学的に受容可
能な化合物の調製または精製における使用が見出され得る。
【０１４７】 本発明の方法により同定されるプロドラッグまたは化合物のエステルとしては
、２’−、３’−および／または５’−ヒドロキシ基のエステル化により得られ
たカルボン酸エステル（すなわち、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ）が挙げられる。ここで
、Ｒは、（１）直鎖または分枝鎖のアルキル（例えば、ｎ−プロピル、ｔ−ブチ
ル、またはｎ−ブチル）、アルコキシアルキル（例えば、メトキシメチル）、ア
ラルキル（例えば、ベンジル）、アリールオキシアルキル（例えば、フェノキシ
メチル）、アリール（例えば、フェニル（必要に応じて、例えばハロゲン、Ｃ1- 4 アルキルまたはＣ1-4アルコキシまたはアミノにより置換されている））；（２
）スルホン酸エステル（例えば、アルキルスルホニル（例えば、メタンスルホニ
ル）またはアラルキルスルホニル）；（３）アミノ酸エステル（例えば、Ｌ−バ
リルまたはＬ−イソロイシル）；（４）リン酸エステルおよび（５）モノリン酸
エステル、二リン酸エステル、三リン酸エステルから選択される。リン酸エステ
ルは、さらに、例えば、Ｃ1-20アルコールもしくはそれらの反応性誘導体により
、または２，３−ジ−（Ｃ6-24）アシルグリセロールによりエステル化され得る
。このようなエステルにおいて、他に特定されなければ、存在する任意のアルキ
ル部分は、有利には、１〜１８の炭素原子、特に１〜６の炭素原子、より特に１
〜４の炭素原子を含む。このようなエステルに存在する任意のシクロアルキル部
分は、有利には、３〜６の炭素原子を含む。このようなエステルに存在する任意
のアリール部分は、有利には、フェニル基を含む。本発明のリキソ−フラノシル
プロドラッグ誘導体の例としては、化学的に保護されたヒドロキシル基を有する
（例えば、Ｏ−アセチル基を有する）リキソ−フラノシルプロドラッグ誘導体（
例えば、２’−Ｏ−アセチル−リキソ−フラノシル；３’−Ｏ−アセチル−リキ
ソ−フラノシル；５’−Ｏ−アセチル−リキソ−フラノシル；２’，３’−ジ−
Ｏ−アセチル−リキソ−フラノシルおよび２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチ
ル−リキソ−フラノシル）が挙げられる。
【０１４８】 本発明の化合物のエーテルとしては、メチルエーテル、エチルエーテル、プロ
ピルエーテル、ブチルエーテル、イソブチルエーテル、およびｓｅｃ−ブチルエ
ーテルが挙げられる。
【０１４９】 さらなる実施形態において、基質は、ピリミジンまたは葉酸に化学的に関連し
ていなくてもよいが、むしろ合理的な薬物設計の公知のパラメーターに基づいて
合成され得る（Ｄｕｒｍら（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：４８２５
）。
【０１５０】 例えば、反応生成物がｄＵＤＰのブロモビニル誘導体の代謝拮抗物質である、
生成物の化学的アッセイは、以下に提供される実施例またはＢａｒｒら（１９８
３）前出により記載される。
【０１５１】 （Ｃ．処方物） 処方物は、経口、直腸、鼻、局所的（経皮的、口内および舌下を含む）、腟、
非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）および肺投与に適切な処方物
を含む。この処方物は、単位投薬形態で従来通り提示され得、そして薬学分野で
周知の任意の方法により調製され得る。このような方法としては、活性成分を、
１つ以上の補助成分を構成するキャリアと会合させる工程を包含する。一般に、
この処方物は、均質かつ完全に、活性成分と液体キャリアまたは微細に分割した
固体キャリアまたはその両方と会合させ、次いで、必要であれば生成物を成形す
ることにより調製される。
【０１５２】 経口投与に適切な本発明の処方物は、カプセル剤、カシェまたは錠剤のような
別々のユニットとして提示され得、各々は所定の量の活性成分を、粉剤または顆
粒として；水性液体もしくは非水性液体中の溶液または懸濁液として；あるいは
水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型液体エマルジョンとして含む。活性
成分はまた、ボーラス、舐剤またはパスタ剤として提示され得る。
【０１５３】 錠剤は、圧縮または成形（必要に応じて１つ以上の補助成分とともに）によっ
て作製され得る。圧縮された錠剤は、適切な機械において自由に流動する形態（
例えば、粉剤または顆粒）の活性成分を、必要に応じて結合剤（例えば、ポビド
ン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤
、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋化ポビドン
、架橋化カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤もしくは分散剤
と混合して圧縮することにより調製され得る。成形された錠剤は、適切な機械に
おいて、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を成形することによ
り作製され得る。この錠剤は、必要に応じて、コーティングされてもよいし、刻
み目をつけられて（ｓｃｏｒｅｄ）もよい。そして錠剤は、例えば、ヒドロキシ
プロピルメチルセルロースを用いて所望の放出プロフィールを提供するように割
合を変化させて、錠剤中の活性成分の遅延型放出または徐放を提供するように処
方され得る。錠剤は、必要に応じて腸溶性コーティングが提供されて、胃以外の
消化管の一部において放出を提供し得る。
【０１５４】 口内の局所的投与に適切な処方物としては、矯味矯臭剤を加えた基剤（通常は
、スクロースおよびアカシアまたはトラガカント）中に活性成分を含むロゼンジ
；不活性基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはセルロースおよびア
カシア）中に活性成分を含むトローチ剤；および適切な液体キャリア中に活性成
分を含むうがい薬が挙げられる。
【０１５５】 本発明に従う局所的投与のための薬学的組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、
ローション、粉剤、溶液、パスタ剤（ｐａｓｔ）、ゲル、噴霧剤、エアロゾルま
たは油として処方され得る。あるいは、処方物は、パッチまたは包帯（例えば、
活性成分を含浸させた包帯（ｂａｎｄａｇｅ）もしくは接着性硬膏剤（ａｄｈｅ
ｓｉｖｅ ｐｌａｓｔｅｒ））および必要に応じて、１つ以上の賦形剤または希
釈剤を含み得る。
【０１５６】 目または他の外部組織（例えば、口および皮膚）の疾患に関して、この処方物
は、好ましくは、例えば、約０．０７５〜約２０％ ｗ／ｗ、好ましくは約０．
２〜約２５％ ｗ／ｗ、および最も好ましくは約０．５〜約１０％ ｗ／ｗの量
で活性成分を含む局所的軟膏またはクリームとして適用される。軟膏に処方され
た場合、このプロドラッグは、パラフィン軟膏基剤または水と混和性の軟膏基剤
のいずれかと共に用いられ得る。あるいは、このプロドラッグ成分は、水中油型
クリーム基剤とともにクリームに処方され得る。
【０１５７】 所望であれば、水相のクリーム基剤は、例えば、少なくとも約３０％ ｗ／ｗ
の多価アルコール（すなわち、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオー
ル、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコール
およびそれらの混合物のような２以上のヒドロキシル基を有するアルコール）を
含み得る。この局所的処方物は、望ましくは、皮膚または他の罹患領域へのプロ
ドラッグ成分の吸収または浸透を増強する化合物が挙げられ得る。このような皮
膚浸透増強剤の例としては、ジメチルスルホキシドおよび関連するアナログが挙
げられる。
【０１５８】 本発明の油相のエマルジョンは、公知の様式で公知の成分から構成され得る。
この相は、乳化剤（他にはエマルジェント（ｅｍｕｌｇｅｎｔ）として公知）を
含むに過ぎないが、所望であれば、この相は、脂肪または油と、または脂肪およ
び油の両方と少なくとも１つの乳化剤との混合物を含む。好ましくは、親水性乳
化剤は、安定化剤として働く親油性乳化剤とともに含まれる。油および脂肪の両
方を含むこともまた好ましい。全体として、安定化剤を伴おうとそうでなかろう
と、乳化剤は、いわゆる乳化ワックスを作製し、そしてこの油および／または脂
肪を伴うワックスは、クリーム処方物の油分散相を形成する、いわゆる乳化軟膏
基剤を形成する。
【０１５９】 本発明の処方物における使用に適切なエマルジェントおよびエマルジョン安定
化剤としては、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｓｐａｎ ８０、セトステアリルアルコール
、ミリスチルアルコール、グリセロールモノステアレートおよびラウリル硫酸ナ
トリウムが挙げられる。
【０１６０】 この処方物に適切な油または脂肪の選択は、所望の審美的特性を達成すること
に基づく。なぜなら、薬学的エマルジョン処方物中で使用されるようである大部
分の油中の活性化合物の溶解性は、非常に低いからである。従って、クリームは
、好ましくは、チューブまたは他の容器からの漏れを避けるために、適切な粘稠
度を有する、油っぽくなく、着色がなく、そして洗浄可能な製品であるべきであ
る。直鎖または分枝鎖の一塩基または二塩基アルキルエステル（例えば、ココナ
ツ脂肪酸のジイソアジピン酸エステル、イソセチルステアリン酸エステル、プロ
ピレングリコールジエステル、イソプロピルミリスチン酸エステル、デシルオレ
イン酸エステル、イソプロピルパルミチン酸エステル、ブチルステアリン酸エス
テル、２−エチルヘキシルパルミチン酸エステルまたはＣｒｏｄａｍｏｌ ＣＡ
Ｐとして公知の分枝鎖エステルのブレンド）が使用され得、最後の３つが好まし
いエステルである。これらは、必要とされる特性に依存して、単独で、または組
合わせて使用され得る。あるいは、高融点脂質（例えば、白色の軟らかいパラフ
ィンおよび／または流動パラフィンまたは他の鉱油）が使用され得る。
【０１６１】 目に対する局所的投与に適切な処方物としては、点眼剤が挙げられ得、ここで
、この活性成分は、適切なキャリア（特にプロドラッグ成分のための水性溶媒）
中に溶解されるか、または懸濁される。このプロドラッグ成分は、好ましくは、
約０．５〜約２０％、有利には、約０．５〜約１０％、特に約１．５％ ｗ／ｗ
の濃度でこのような処方物中に存在する。
【０１６２】 直腸投与のための処方物は、例えば、カカオ脂またはサリチル酸エステルを含
む適切な基剤を含有する坐剤として提示され得る。
【０１６３】 膣投与に適切な処方物は、プロドラッグ成分に加えて、適切であるように、当
該分野で公知であるようなキャリアを含む坐剤、タンポン、クリーム、ゲル、パ
スタ剤、泡沫または噴霧処方物として提示され得る。
【０１６４】 経鼻投与に適切な処方物（ここで、キャリアは、固体である）は、鼻から吸う
様式で（すなわち、鼻の直ぐ近くに保持した粉剤の容器から鼻経路を通して迅速
に吸入することにより）投与される、例えば、約２０〜約５００ミクロンの範囲
の粒子サイズを有する粗雑粉剤を含む。例えば、鼻スプレー、点鼻薬として、ま
たはネブライザーによるエアロゾル投与を用いる投与のためのキャリアが液体で
ある適切な処方物は、プロドラッグ成分の水溶液または油性溶液を含む。
【０１６５】 非経口投与に適切な処方物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および処方
物を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性または非水性
の等張性滅菌注射溶液；ならびに懸濁剤および濃化剤を含み得る水性および非水
性の滅菌懸濁液、ならびに血液成分または１つ以上の器官にこの化合物を標的化
するように設計されたリポソーム系または他の微粒子系が挙げられる。この処方
物は、単位用量または複数用量の密封容器（例えば、アンプルおよびバイアル）
で提示され得、そして使用直前に、滅菌液体キャリア（例えば、注射用水）の添
加のみが必要な凍結乾燥状態で保存され得る。即座の注射溶液および懸濁液は、
先に記載された種類の滅菌粉剤、顆粒および錠剤から調製され得る。
【０１６６】 好ましい単位投薬処方物は、本明細書中上記のように、プロドラッグ成分の一
日用量または単位、一日の分割用量（ｓｕｂｄｏｓｅ）（すなわち、一日用量の
適切な分割）を含む処方物であり得る。
【０１６７】 特に上で言及された成分に加えて、本発明の処方物が、問題の処方物の型に関
して当該分野で従来の他の薬剤を含み得ることが理解されるべきであり、例えば
、経口投与に適切な他の薬剤としては、甘味剤、濃化剤および矯味矯臭剤のよう
なさらなる薬剤が挙げられ得る。
【０１６８】 本発明の式のプロドラッグおよび組成物はまた、獣医学的処方物の形態での使
用のために提示され得る。これらは、例えば、当該分野で従来からの方法により
調製され得る。
【０１６９】 （Ｄ．ヒト正常組織におけるチミジル酸シンターゼの発現） 正常ヒト組織に
おけるＴＳ発現レベルを、チミジル酸シンターゼにより活性化されるプロドラッ
グの全身性の毒性を評価するために試験した。脳、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、結
腸、肺、小腸、胃、筋肉、精巣、卵巣、子宮、前立腺、甲状腺、唾液腺、副腎、
皮膚、ＰＢＬおよび骨髄組織における相対的ＴＳ ｍＲＮＡレベルを、ＲＴ−Ｐ
ＣＲを用いることにより決定した。これらの組織の大部分におけるＴＳ ｍＲＮ
Ａレベルは、骨髄（１．２５倍）、卵巣（１．３８倍）および精巣（２．１３倍
）組織におけるレベルを除いて、結腸組織におけるレベル以下であることが示さ
れた（図１３）。しかし、結腸癌サンプルにおける平均ＴＳ ｍＲＮＡレベルは
、それに合わせた正常結腸組織サンプルにおけるレベルより、４．６倍大きかっ
た（図１３）。この結果により、結腸癌における過剰発現ＴＳにより活性化され
る化合物は、正常ヒト組織に対する毒性が全くまたはほとんどないことが示唆さ
れる。
【０１７０】 複数の正常組織におけるヒトチミジル酸シンターゼの転写レベルを、ＰＣＲ増
幅により調査した。ヒト組織のｃＤＮＡのパネルを、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。ＰＣＲ反
応を、ｃＤＮＡ（１００×）、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．４、０．２ｍＭ の各ｄＮＴＰ、０．２μＭのチ
ミジル酸シンターゼのセンスおよびアンチセンスプライマー、ならびに１．２５
ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ
Ｉから得た）を含む、２５μｌの容量で行った。反応混合物を、９４℃で２分間
インキュベートし、次いで、９４℃で４０秒のインキュベーション、５８℃で１
分インキュベーション、次いで、７２℃で１分インキュベーションを１２サイク
ル行った。０．２μＭ β−アクチンプライマー、０．２μＭのチミジル酸シン
ターゼプライマー、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．４、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰおよび１．２５ユニットのＴａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む２５μｌの反応緩衝液を添加して、反応容量を５
０μｌにし、終濃度０．２μＭのチミジル酸シンターゼプライマーおよび０．１
μＭのβ−アクチンプライマーを達成した。ＰＣＲ反応を合計３６サイクル、次
いで、７２℃で７分間のインキュベーションを続けた。
【０１７１】 １０μＬのＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルでの電気泳動により分離し、次
いで、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，
Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから得た）で染色した。チミジル酸シンターゼに対応するゲ
ルバンドを定量し、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ
によりβ−アクチンのバンドに対して正規化した。定量した発現レベルを、結腸
の発現レベルに対する値として表した。
【０１７２】 （Ｅ．合わせた正常組織および腫瘍組織のＲＴ−ＰＣＲ分析） 結腸癌組織お
よびおよびこれに合わせた正常結腸組織のヒトチミジル酸シンターゼの転写レベ
ルを、ＲＴ−ＰＣＲ増幅を用いることにより定量した。ヒトチミジル酸シンター
ゼおよびβ−アクチンの増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを以下のよ
うに設計した：チミジル酸シンターゼのセンスプライマー５’−ＧＧＧＣＡＧＡ
ＴＣＣＡＡＣＡＣＡＴＣＣ−３’(チミジル酸シンターゼｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎ
ｂａｎｋ登録番号Ｘ０２３０８）の塩基２０８〜２２６に対応)、アンチセンス
プライマー５’−ＧＧＴＣＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＡＡ−３’（塩基５６
４〜５８３に対応）、β−アクチンのセンスプライマー５’−ＧＣＣＡＡＣＡＣ
ＡＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧ−３’（β−アクチン遺伝子配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録
番号Ｍ１０２７７）の塩基２６４３〜２６６１に対応）およびアンチセンスプラ
イマー５’−ＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣ−３’（塩基２９３７〜
２９５５に対応）。
【０１７３】 ヒト結腸腫瘍組織およびそれに合わせた正常組織を、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ
Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ，Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄ
ｉｖｉｓｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から得た。総ＲＮＡを、Ｔｒｉ
ｐｕｒｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮから得た）を用い
て、製造業者のプロトコルに従って単離した。可能なＤＮＡ濃度についてモニタ
ーするために、β−アクチンの増幅のためのプライマーを、エキソン４／イント
ロン５／エキソン５接合部にまたがるように設計した。ゲノムＤＮＡ鋳型は、３
１３ｂｐのβ−アクチンフラグメントを導き、そしてｃＤＮＡ鋳型は、２１０ｂ
ｐの産物を生成する。
【０１７４】 ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ予備増幅系（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、逆転写を行った。３μｇの総ＲＮＡを、容量２０μ
ｌの緩衝液に適用して、製造業者のプロトコルに従って、逆転写反応を行った。
【０１７５】 ＰＣＲ反応を、逆転写反応物からの５μｌのｃＤＮＡ混合物、３ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．４、０．２ｍＭ
の各ｄＮＴＰ、０．３ｐＭのチミジル酸シンターゼのセンスおよびアンチセンス
プライマーならびに５ユニットのＴａｇ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ
，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから得た）を含む容量９６μｌ中で行った。反応混合物
を、９４℃で３分間インキュベートし、次いで、９４℃で１分間インキュベーシ
ョン、５８℃で１分間インキュベーション、次いで７２℃で１分間インキュベー
ションを９サイクル行った。９サイクルの後、４μｌ中でヒトβ−アクチンプラ
イマーを添加して、最終反応容量を１００μｌにし、０．２μＭの終濃度を達成
した。ＰＣＲ反応を、合計３０、３２または３４サイクル、次いで、７２℃で７
分間インキュベートを続けた。
【０１７６】 １０μＬのＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルで電気泳動により分離し、次い
で、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｅ
ｕｇｅｎｅ，ＯＲから得た）で染色した。定量の結果により、チミジル酸シンタ
ーゼおよびβ−アクチンの増幅は、３０サイクルと４０サイクルとの間で線形で
あったことが示された。チミジル酸シンターゼに対応するＤＮＡバンドを定量し
、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍによりβ−アクチ
ンのＤＮＡバンドに対して正規化した。定量した発現レベルを、ＴＳとβ−アク
チンとの間の比の値として表した。
【０１７７】 （Ｆ．細胞株およびトランスフェクション） ＨＴ１０８０細胞を、１０％ウ
シ胎仔血清を補充したＰＲＭＩ１６４０培地中で増殖させ、そしてＧＦＰ−ＴＳ
発現ベクターでトランスフェクトした。４８時間後、トランスフェクション細胞
をトリプシン処理し、そして７５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む培養培地に再プ
レートした。Ｇ４１８での２週間の選択の後、生存細胞を蛍光発現に基づいて分
類した。より高い蛍光発現を有する１つのクローン(ＴＳＨ／ＨＴ１０８０と名
付けた)およびより低い蛍光発現を有する１つのクローン(ＴＳＬ／ＨＴ１０８０
と名付けた）を選択し、細胞株へと拡大した。ｐＥＧＦＰ−Ｃ３でトランスフェ
クトした安定なＨＴ１０８０細胞を、コントロールとして用いた。
【０１７８】 （Ｇ．ＧＦＰ−ＴＳ発現ベクターの構築） ヒトチミジル酸シンターゼの保存
領域（アミノ酸２３〜３１３）をコードするｃＤＮＡフラグメントを、以下のプ
ライマーを用いたＰＣＲ増幅により得た：センスプライマー５’ＣＧＧＡＡＧＣ
ＴＴＧＡＧＣＣＧＣＧＴＣＣＧＣＣＧＣＡ−３’およびアンチセンスプライマー
５’−ＧＡＡＧＧＴＡＣＣＣＴＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡ−３’。このｃ
ＤＮＡを、ＧＦＰ配列とインフレームで、哺乳動物発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ
３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ，ＣＡ）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩ部位にクローニングした。このｃ
ＤＮＡ挿入物を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１７９】 （Ｈ．ウェスタンブロット分析） ヒト正常細胞および癌細胞を、１０％ウシ
胎仔血清を補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で増殖させた。細胞を、コンフル
エントになるまで１００ｍｍ培養ディッシュ中で増殖させ、そして０．５ｍｌの
ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ デ
オキシコール酸（ナトリウム塩）およびプロテアーゼインヒビター）中で溶解し
た。タンパク質濃度を、ＢＣＡ２００タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ
，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから得た）を用いることにより決定した。各細胞株由
来の総タンパク質１５μｇを、１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。分離
したタンパク質を、ＰＶＤＦ膜に転写し、次いで、 ヒトチミジル酸シンターゼ
モノクローナル一次抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡにより
製造）および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスＩｇ二次抗体（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄから得た）でイムノブロットした。ＥＣＬ ｐ
ｌｕｓ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、免疫反応性の検出のために用いた。チ
ミジル酸シンターゼに対応するバンドを定量し、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄ
ｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍによるチューブリンのバンドに対して正規化した。
定量した発現レベルを、細胞株ＣＣＤｌ８ｃｏの発現レベルに対する値として表
した。
【０１８０】 （Ｉ．ｄＵＭＰ−3Ｈからのトリチウムの放出によるＴＳ活性アッセイ）細胞
を、３０，０００細胞／プレートの密度に２４ウェルプレートにプレーティング
し、そして１６時間インキュベートし、プレートのプラスチック表面に接着させ
た。
【０１８１】 チミジン酸シンターゼアッセイの直前に、培地をＲＰＭＩおよび１０％の透析
した胎仔ウシ血清で置換した。０．５μＣｉの５−［3Ｈ］デオキシウリジンを
各ウェルに添加し、そしてプレートをさらなるＣＯ2なしで３７℃にて６０分間
インキュベートした。［3Ｈ］放出を、５分間室温にて活性炭（１×ＰＢＳ中の
１０％）への５−［3Ｈ］デオキシウリジンの吸着によって測定した。１３，０
００ＲＰＭで５分間遠心分離した後、上清中の［3Ｈ］の量を液体シンチレーシ
ョンカウンター法により決定した。
【０１８２】 （Ｊ．増殖阻害研究）指数関数的に増殖している細胞を３８４ウェル平底組織
培養プレートに移した。全ての細胞型を２５μＬの完全培地（ＲＰＭＩ １６４
０＋１０％のウシ胎児血清＋抗生物質／抗真菌剤）中で１ウェルあたり５００細
胞の密度で、プレーティングした。２４時間後（０日）、１０-3〜１０-10の用
量範囲にわたる実験化合物を含む２５μＬの感染培地を３通りで添加した。薬物
曝露時間は、１２０時間（５日）であり、その後、増殖阻害をアッセイした。５
μＬの酸化還元指示薬（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ）を各ウェルに添加した（１０％
ｖ／ｖ）。３７℃で４時間キンキュベーションした後、蛍光を５３５ｎｍ励起
および５９５ｎｍ発光でモニターした。
【０１８３】 濃度 対 相対的蛍光単位（ＲＦＵ）をプロットし、そしてＨｉｌｌ方程式を
使用してシグモイド曲線をフィッティングした。曲線の反曲点を示すＩＣ50は、
増殖が５０％阻害される濃度である。
【０１８４】 （Ｋ．ＮＢ１０１１の細胞毒性のＴｏｍｕｄｅｘ阻害）ＭＣＦ７−ＴＤＸを、
１ウェルあたり２５μＬの完全培地中５００細胞で３８４ウェルアッセイプレー
トに移した。２４時間後（０日）、１ｍＭから２倍ずつ連続希釈したＮＢ１０１
１と別々の濃度（０，１，１０，１００，１０００ｎＭ）のｔｏｍｕｄｅｘとの
組み合わせを含む２５μＬの完全培地を二通りで添加した。薬物曝露時間は１２
０日間（５日）であり、その後、増殖阻害を、増殖阻害研究において上記される
ようにａｌａｍａｒＢｌｕｅで測定した。
【０１８５】 （Ｌ．酵素調製）クローン化ヒトチミジン酸シンターゼプラスミドｐＢＣＨＴ
Ｓを、アミノ末端Ｈｉｓタグを付加するために、ＮｄｅＩ ｎＳａｃＩ挿入部位
を使用して、Ｅ． ｃｏｌｉ．ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２８ａ（＋）（Ｎ
ｏｖａｇｅｎ）中にサブクローニングした。酵素をＩＰＴＧと共にインキュベー
トすることによりＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＮｉ2+ Ｈｉｓ Ｂｉｎｄ
金属キレート化樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ）上でアフィニティーカラムクロマトグラ
フィーにより精製した。カラムＮｉ2+ Ｈｉｓ Ｂｉｎｄ金属キレート化カラム
を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）、５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌで洗浄し；チミジン酸シンターゼ活性を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．９）
、６０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出した。
【０１８６】 （Ｍ．酵素活性および速度測定）チミジン酸シンターゼアッセイを、示される
４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、２５ｍＭ メルカプトエタノール、１２５Ｍ ｄＵＭＰ、および６５μＭ
Ｎ５，Ｎ１０−メチレンテトラヒドロ葉酸からなる２００μｌの反応容量で９６
ウェルＣｏｓｔａｒＵＶ透過プレート中で行った。テトラヒドロ葉酸貯蔵溶液を
、０．２ Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．５メルカプトエタノールにテトラ
ヒドロ葉酸（Ｓｉｇｍａ）を直接溶解させることにより調製し；貯蔵溶液を−８
０℃で貯蔵した。Ｎ５，Ｎ１０−メチレンテトラヒドロ葉酸を１２μｇの３．８
％ホルムアルデヒドを１ｍｌのテトラヒドロ葉酸の０．６５ｍＭ溶液に添加し、
そして３７℃にて５分間インキュベートすることにより調製した。Ｎ５，Ｎ１０
−メチレンテトラヒドロ葉酸を氷上に保ち、そして調製の２時間以内に使用した
。
【０１８７】 チミジル酸シンターゼによるＢＶｄＵＭＰの蛍光生成物への変換を、３４０ｎ
ｍの励起波長および５９５ｎｍの発光波長を使用して、９６ウェルＤｙｎｅｘ
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ Ｂｌａｃｋ「Ｕ」型底マイクロタイター中の、１２５Ｍ
ＢＶｄＵＭＰを含む２００ｍｕｌチミジル酸シンターゼ反応において測定した
。蛍光を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ｆｌｕｏｒｉｍ
ｅｔｅｒで測定した。
【０１８８】 酵素速度定数（ＫmおよびＶmax）を上記の酵素アッセイ条件を使用して、ヒト
チミジン酸シンターゼ基質（ｄＵＭＰおよびＢＶｄＵＭＰ）について決定した。
酵素反応の初期速度を、ｄＵＭＰとの反応についてはＡ340における増加を、そ
してＢＶｄＵＭＰとの反応についてはＡ294における減少を測定することにより
決定した。酵素の触媒能（Ｋcat／Ｋm）を速度定数ＫmおよびＶmaxから算出した
。
【０１８９】 （Ｎ．液体クロマトグラフィー／質量分析） 細胞を、室温のＰＢＳで３回洗浄し、次いで、５ｍｌのＰＢＳ中で凍結／吸引
溶解に供した。細胞抽出物を、１０ＫＲＰＭにて１０分間遠心分離し、次いでＳ
ｅｐ−ＰａｋＣ18に吸着させ、そして１０ｍｌ ＰＢＳで洗浄した。ＢＶｄＵＭ
Ｐを１ｍｌの蒸留水で溶出した。ＬＣ／ＭＳサンプルを、０．１％ギ酸−０．１
％ギ酸／９５％アセトニトリルの直線勾配を使用して、Ｃ18カラム上で逆相カラ
ムクロマトフラフィーにより分析した。質量分析を、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕ
ａｔｔｒｏ 三重ＩＩ四極（ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ）分光器を用いて行った。
【０１９０】 （Ｏ．耐性の逆転）ヒト乳癌ＭＣＦ７ ＴＤＸ細胞株の起源および特徴は、以
前に記載されている（Ｄｒａｋｅら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍｃ
ｏｌ．５１（１０）：１３４９−１３５５）。簡潔には、ＭＣＦ−７乳癌細胞を
、２．０μＭまでのＴＤＸ濃度の段階的な減少に連続して曝すことにより、Ｔｏ
ｍｕｄｅｘに対する耐性についてインビトロで選択した。耐性亜系統を、親ＭＣ
Ｆ７ ＴＤＸ細胞株の、ＴＤＸなしだが５０μＭのＮＢ１０１１ありで補充した
培地への連続した曝露により（濃度は、親ＭＣＦ７ ＴＤＸ細胞株におけるＮＢ
１０１１についてのＩＣ50よりも約１６倍）、ＮＢ１０１１に対する耐性につい
て選択した。劇的な初期細胞殺傷効果の後、耐性コロニーが出現し、そして活発
な増殖単層を形成した。５−ＦＵ、ＴＤＸおよびＮＢ１０１１についてのＴＳタ
ンパク質レベルおよびＩＣ50を、各々「材料および方法」に記載されるように、
ウェスタンブロットおよびａｌａｍａｒＢｌｕｅ細胞障害性アッセイにより、耐
性ＭＣＦ７ ＴＤＸ／１０１１細胞株について決定した。
【０１９１】 （ＩＩ．実施例） （Ａ．インビボでのＴＳ発現、５−ＦＵ耐性、Ｈ６３０−１０大腸癌異種移殖
片におけるＮＢ１０１１の分析） Ｈ６３０−１０大腸癌細胞は、インビボで５−ＵＦに対する耐性について選択
され、高レベルのチミジン酸シンターゼを発現し、そして無胸腺マウス中で異種
移殖片を形成する。細胞エキソビボ拡張後、Ｈ６３０−１０を、４〜６週齢の雌
性ＣＤ−１（ｎｕ／ｎｕ）無胸腺マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の背中央（ｍｉｄ−ｂａｃ
ｋ）領域に１．５×１０7細胞／腫瘍で皮下に（Ｓ．Ｑ．）注射した。長さ、幅
および深さの結果として算出した腫瘍容量を、１人の観測者により連続マイクロ
メーター測定法により１週間に２回モニターした。６匹の動物を無作為に各々処
置群に割り当て、そして実験の開始において、試験統計学的試験を行い（１つの
因子、ＡＮＯＶＡ）、処置群とコントロール群との間で開始腫瘍容量における均
一性を確実にした。ＮＢ１０１１を、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注射または腫瘍内（Ｉ
Ｔ）注射により投与した。試験した実験薬剤の用量は以下であった：群１：ＤＭ
ＳＯビヒクルコントロール溶液（ＩＰ）、群２：５−ＦＵ（１５ｍｇ／ｋｇ×５
日ＩＰ＝このモデルにおいて５−ＦＵについてＭＴＤ）、群３：ＮＢ１０１１＝
１．２５ｍｇ×５日（ＩＰ）、群４：ＮＢ１０１１＝２．５ｍｇ×５日（ＩＰ）
，群５：ＮＢ１０１１＝３．５ｍｇ×５日（ＩＰ），群６：ＤＭＳＯコントロー
ル（ＩＴ），群７：ＮＢ１０１１＝１．２５ｍｇ×５日（ＩＴ），および群８：
ＮＢ１０１１＝２．５ｍｇ×５日（ＩＴ）。これらの容量は、本発明者らの研究
室で行われた独立した容量探索実験に基づき、そして雌性無胸腺マウスの特定の
年齢および系統についてＮＢ１０１１の最大許容容量に近い。適切な投薬を確か
めるために、薬物容量は、個別に、各注射の直前に決定した動物の重量に基づい
た。コントロール溶液またはＮＢ１０１１での処置を、異種移殖片接種後１０日
状態で開始し、そのとき、異種移殖片容積は、４５〜６８ｍｍ3と測定された。
２５日目の群間の異種移殖片容量の差異を、対数転換した腫瘍容量データの１因
子ＡＮＯＶＡにより分析した。実験無胸腺マウスを、ＵＣＬＡ動物ケア施設（Ａ
ｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）中の専用の部屋で無菌条件下で維持
した。カリフォルニア大学（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ）は、研究リスク（Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｒｉｓｋｓ）（実験動物安全保証番号Ａ−３１９６−０１）から保
護局（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）に保管された動物快適保証
（Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｓｓｕｒａｎｃｅ）文書を有する。全ての
実験は、ＵＣＬＡ獣医師により綿密に指示された。ＵＣＬＡにより使用された安
楽死技術は、米国獣医学協会の専門家（Ｐａｎｅｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）により指示
される。カリフォルニア大学（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ）の実験動物プログラム
および施設は、米国実験動物ケア認定協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａ
ｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）により公認される。このプロトコールにお
いて記載される動物の手順／操作を実行できる人は、１９８５年のＡｎｉｍａｌ
Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔにより要求されるように、これらの手順において技術
的に適格であり、そして研究において動物の使用に対するそれらの訓練を受けて
いる。
【０１９２】 （Ｂ．ヒトチミジル酸シンターゼを用いる、ＢＶｄＵＭＰのインビトロ研究） （１．ｒＨｕＴＳによるＢＶｄＵＭＰの無細胞処理は、蛍光生成物を生じる） Ｌ．ｃａｓｅｉ ＴＳによるＢＶｄＵＭＰの無細胞処理は、潜在的に反応性の
中間体を生成することが、示されている（Ｂａｒｒら（１９８３）（前出））。
このことから、ＴＳによるＢＶｄＵＭＰの処理が、ヒトＴＳの不可逆的な不活性
化を結果として生じることが考えられてきた（Ｂａｌｚａｒｉｎｉ（１９８７）
Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（３）：４１０−６）。ＤｅＣｌｅｒｃｑ，
Ｂａｌｚａｒｉｎｉおよび同僚による細胞ベースの実験（Ｂａｌｚａｒｉｎｉ（
１９８７）（前出）；Ｂａｌｚａｒｉｎｉ（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６８（ａ）：６３３２−７；Ｂａｌｚａｒｉｎｉ（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔ ３７３（１）：４１−４）は、一旦ＢＶＤＵが（恐らく、ウイルスチミ
ジンキナーゼを介して）細胞中で一リン酸に変換されると、処理の間にヒトＴＳ
酵素に結合しそして不活性化するという概念を支持する。しかし、ＢＶｄＵＭＰ
とヒトＴＳとの実際の反応は、決して十分に特徴付けられていない。Ｓａｎｔｉ
および同僚（Ｂａｒｒ（１９８３）（前出））は、彼らの研究に細菌性ＴＳを使
用し、そしてＢＶｄＵＭＰとＴＳとの反応からの生成物の生成を示し、そしてＤ
ｅＣｌｅｒｃｑおよび同僚は、精製されたヒトＴＳではなく、細胞および細胞溶
解産物を使用した（Ｂａｌｚａｒｉｎｉ（１９８７）（前出）；Ｂａｌｚａｒｉ
ｎｉ，（１９９３）（前出）；Ｂａｌｚａｒｉｎｉ（１９９５）（前出））。
【０１９３】 治療基質の生成についての出願人らの興味に起因して、これがＴＳによって特
異的に活性化され得ること（ＢＶｄＵＭＰの組換えヒトＴＳ（ｒＨｕＴＳ）との
相互作用）を再度考える。ＢＶｄＵＭＰが、標準反応混合物中でｒＨｕＴＳと共
にインキュベートした場合、この反応は、蛍光生成物の形成を生じた（図２）。
蛍光の時間依存性は、開始ＢＶｄＵＭＰ濃度の減少が伴う。この生成された生成
物は、部分的に特徴付けられており、そして環外プリミジンヌクレオチド誘導体
であるようである（以下を参照のこと） この結果は、以前の結果が、ＢＶｄＵＭＰとＴＳとの反応がヒトＴＳ酵素を不
活性化するという考えを支持した（Ｂａｌｚａｒｉｎｉら（１９８７）、（１９
９３）、（１９９５）（前出））ので、驚くべきである。上記の反応は、精製さ
れた成分を有する無細胞系で行われたので、細胞内環境が、細胞の内部の遊離ヌ
クレオチド一リン酸へのＮＢ１０１１の変換後のＴＳ不活性化を生じる成分を提
供し得るという可能性が残っている。この問題は以下により詳細に取り扱う。
【０１９４】 （２．ｒＨｕＴＳとの、ｄＵＭＰおよびＢＶｄＵＭＰの比較反応速度） Ｌ．ｃａｓｅｉ ＴＳを使用するＢａｒｒら（１９８３）、細胞および細胞溶
解産物を使用する（Ｂａｌｚａｒｉｎｉ（１９９５）（前出）およびＢａｌｚａ
ｒｉｎｉ（１９８７）（前出）；Ｂａｌｚａｒｉｎｉ（１９９３）（前出）；Ｂ
ａｌｚａｒｉｎｉ（１９９５）（前出））により以前報告された研究は、ヒトＴ
ＳとＢＶｄＵＭＰとの反応が、酵素の不可逆的な不活性化を生じるか否かに関わ
らず、核を残した。この問題に取り組むために、ｄＵＭＰの存在下または非存在
下で、ｒＨｕＴＳとＢＶｄＵＭＰとの反応の速度論を決定した。
【０１９５】 競合阻害は、ＢＶｄＵＭＰはＴＳ酵素を不活性化しない反応と最も一致する。
この状況をさらに明確にすることを援助するために、ＢＶｄＵＭＰとｒＨｕＴＳ
との延長したインキュベーションを、速度論が行われる時間よりも長い時間にわ
たって生じ得る任意の不活性化を測定するために行った（図４）。
【０１９６】 これらのデータは、基質としてのＴＨＦ ＤＨＰ ｄＵＭＰの変換率により測
定されるように、ＢＶｄＵＭＰとｒＨｕＴＳとの２０時間のインキュベーション
後でさえも、あるかなしかかの酵素不活性化が明らかであることを示した。この
結果は、細胞中（好ましくは、ＴＳを過剰発現する細胞中）で、最終的には酵素
を不活性化することなく、ＢＶｄＵＭＰを細胞障害性代謝物へ変換する過剰発現
されたＴＳの能力についての期待と一致する。
【０１９７】 （３．ＴＳとのＢＶｄＵＭＰ反応の特徴付け（補助因子およびインヒビター）
） 最も良く特徴付けられたＴＳの反応は、ｄＴＭＰへのｄＵＭＰの変換である。
この反応は、Ｎ５，Ｎ１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）からｄＵＭＰ
のＣ−５位へのメチレン基の転移を含む（Ｃａｒｒｅｒａｓ ＣＷ （１９９５
）（前出））。この反応は、補助因子（ＴＨＦ）に依存し、そしてウリジル酸模
倣物（５Ｆ−ｄＵＭＰ）により阻害される。この模倣物は、酵素との反応に際し
て、安定な複合体の形成および酵素活性の損失を生じる。ＴＳ活性の第２の十分
特徴付けられたインヒビターは、Ｔｏｍｕｄｅｘである。これは、ＴＳホモ二量
体の葉酸結合部位を占有し、ＴＨＦの結合を妨げ、そして細胞におけるＴＳ活性
をブロックする（Ｄｒａｋｅ（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
．５１（１０）：１３４９−１３５５ならびにＴｏｕｒｏｕｔｏｇｌｏｕおよび
Ｐａｚｄｕｒ（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２（２）：２２７
−２４３）。ＢＶｄＵＭＰとｒＨｕＴＳとの反応を特徴付ける予備的な努力の一
部として、５Ｆ−ｄＵＭＰ，Ｔｏｍｕｄｅｘおよび補助因子の影響を、ｄＵＭＰ
およびＢＶｄＵＭＰとの酵素の反応について比較した。これらの実験（表４）は
、ｄＵＭＰの場合と同様に、５Ｆ−ｄＵＭＰが、ＢＶｄＵＭＰの蛍光生成物への
変換を妨げ得ることを示した。さらに、Ｔｏｍｕｄｅｘはまた、ｄＵＭＰおよび
ＢＶｄＵＭＰの両方からの生成物形成を阻害し得る。しかし、Ｌ．ｃａｓｅｉ
ＴＳで報告された初期の結果（Ｂａｒｒら（１９８３）（前出））と一致して、
ＴＨＦは、蛍光生成物へのＢＶｄＵＭＰの変換に必要とされない。さらに、表４
に示されるデータはまた、ＴＨＦが、ｒＨｕＴＳとのＢＶｄＵＭＰ反応における
蛍光性生成物の生成を刺激することを示す。この結果は、ＴＨＦがこの反応に対
して影響を有さないということを報告する初期のデータ（Ｂａｒｒら（１９８３
）（前出））からは予測されず、そして補助因子またはロイコボリンのような補
助因子アゴニストがヒトＴＳとＢＶｄＵＭＰとの反応を調節し得るという潜在的
に重要な可能性を示す。
【０１９８】 この反応のミカエリス−メンテン速度論の分析は、ｄＵＭＰによるＢＶｄＵＭ
Ｐの阻害が競合阻害についての予測された形態に合致し、ｒＨｕＴＳについての
基質として振舞う両方のヌクレオチドと一致することを示した。
【０１９９】 以前に報告されたＬ．ｃａｓｅｉ ＴＳでのデータは、ＢＶｄＵＭＰが、ｄＵ
ＭＰの場合より３８５倍少ない効率の基質であることを示した（Ｂａｒｒら（１
９８３）（前出）；Ｓａｎｔｉ Ｄ．Ｖ．（１９８０）（前出））。本明細書中
で報告される実験は、この状況がヒト酵素と随分異なることを示している。ｒＨ
ｕＴＳについて、ＢＶｄＵＭＰと比較したｄＵＭＰの相対的触媒効率は、６０倍
であった。このことは、内因性基質と比較した場合、６．４倍を超える触媒効率
の増加を示す。Ｌ．ｃａｓｅｉ ＴＳでの以前の結果は、細胞内での酵素反応の
効率が、効果的な治療基質であるＮＢ１０１１に対して非常に低いという予測に
至った。なぜなら、大量の内因性ｄＵＭＰと競合しなければならないならないか
らである。本明細書中で報告される発見（すなわち、ヒト酵素がＢＶｄＵＭＰの
変換の６．４倍より高い改良された効率を有するという発見）は、ＮＢ１０１１
の有用性を与える重要な因子である。Ｌ．ｃａｓｅｉ酵素と比較した場合のヒト
酵素によるＢＶｄＵＭＰ利用の増加した効率はまた、種特異的基質が可能であり
かつ設計できることを確立する。Ｌ．ｃａｓｅｉ 対 ヒトＴＳの表面の種特異
的領域への結合を介する異種酵素を特異的に阻害する能力は、最近報告されてい
る（Ｓｔｏｕｔ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８（５）：１６０７
−１７およびＣｏｓｔｉら（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２（１２）：
２１１２−２１２４）。ＴＳの活性化部位（これはタンパク質の最も高度に保存
された領域からなるＴＳの活性部位（Ｃａｒｒｅｒａｓ（１９９５）（前出））
に関する特異性における差異は、驚くべきであり、そして以前には報告されてい
ない。
【０２００】 ＢＶｄＵＭＰとｒＨｕＴＳとの無細胞酵素反応の生成物を質量分析法により分
析した。図５に示される分子構造ＩおよびＩＩは、精製されたｒＨｕＴＳとＢＶ
ｄＵＭＰとのインキュベーション後にＴＳ反応混合物において検出された分子イ
オンの質量と一致する。この反応の生成物の知識は、ＮＢ１０１１の作用の最終
的な機構を理解するために使用され得る。さらに、この情報は、新たな化学療法
を設計するために使用され得る。なぜなら、ＴＳ−ＢＶｄＵＭＰ反応の生成物は
、それら自体、化学療法として潜在的に使用され得るからである。
【０２０１】 （４．ＮＢ１０１１は、腫瘍細胞中で一リン酸に変換される） ＮＢ１０１１は、ＴＳへの結合の必要条件として、細胞中でホスホラミデート
から一リン酸形態へ変換される。ＮＢ１０１１のリン酸の脱遮蔽（ｕｎｍａｓｋ
ｉｎｇ）、そのＴＳへの結合および毒性代謝物への変換の提案される経路は、図
６に示される。
【０２０２】 変換においてこの重大な工程が行われるか否かを決定するために、臭素原子の
独特の特性（すなわち、天然で２つの等量のアイソトープ形態で存在する）を利
用した。この状況は、ＢＶｄＵＭＰの推定質量イオン（４１１ダルトンおよび４
１３ダルトン）に対する質量分析に焦点をあてることにより臭素含有一リン酸の
検出を可能にする。Ｈ６３０ Ｒ１０腫瘍細胞（これは、高レベルのＴＳを発現
する）を１００μＭのＮＢ１０１１と共にインキュベートした。処理した細胞溶
解産物の抽出物を方法に記載されるように調製した。液体クロマトグラフィーで
の最初の精製後に質量分析を使用する検出は、逆相クロマトグラフィーの同一保
持時間を有する、ＢＶｄＵＭＰの脱保護されたヌクレオチド質量イオンの形成に
依存する。
【０２０３】 これらの結果（図７）は、活性化経路における第１工程後のＮＢ１０１１と一
致する。
【０２０４】 （Ｃ．ＮＢ１０１１の細胞毒性活性の特徴付け） （１．腫瘍細胞／正常細胞のスクリーニング） ＮＢ１０１１の生物学的活性を特徴付ける際の初めの工程として、多数の正常
細胞型および腫瘍細胞型をＮＢ１０１１および５−フルオロウラシルの両方に対
する感受性についてａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイにおいて試験した。
【０２０５】 アッセイを上記（方法）に記載されるように行った。正常細胞についての平均
ＩＣ50と腫瘍細胞についての平均ＩＣ50との割合として、治療係数を算出する。
全てのアッセイを少なくとも３回行った。
【０２０６】 これらのデータは、ＮＢ１０１１がＴＳ ＥＣＴＡ化合物について初期の設計
目的（すなわち、正常細胞型に対して腫瘍細胞型の増加した作用強度）を満たす
ことを示した。概して、ＮＢ１０１１は、正常細胞 対 腫瘍細胞に対して約２
倍細胞障害性であり、一方５ＦＵは、腫瘍細胞に対するよりも正常細胞に対して
３倍毒性である。したがって、ＮＢ１０１１の総合的な利点は、５ＦＵと比較し
た場合のＮＢ１０１１についての治療係数において、（２）×（３）＝６倍の改
良である。正の治療係数を有する化学療法の選択を可能にする重要な手段は、正
常細胞型および腫瘍細胞型の両方についての活性のスクリーニングである。この
アプローチは、新規癌薬物開発の分野において、一貫して使用されてきた。例え
ば、正常細胞型に対する新たな候補化合物のスクリーニングは、国立癌研究所（
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のスクリーニング手順
の一部である（Ｃｕｒｔ（１９９６）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １（３）：ＩＩ−
ＩＩＩ）。
【０２０７】 （２．ＮＢ１０１１は、インビボでＴＳを不活性化しない） 上記の結果は、ＮＢ１０１１から細胞内生成されたＢＶｄＵＭＰが、生成物へ
のその転換の間に、ＴＳを不活性化しないようであることを示す。しかし、無細
胞系は、細胞内環境とは異なる。この疑問をさらに探索するために、ＴＳ活性に
ついての細胞ベースのアッセイを行った。これらの実験において、内在性５−（ 3 Ｈ）デオキシウリジンを、細胞培養培地に添加し、そしてトリチウム化された
水の放出をモニターする（ＣａｒｒｅｒａｓおよびＳａｎｔｉ（１９９５）（前
出）；Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．５（１１）３５４６−３５
４８）。図８は、細胞培養培地中のＮＢ１０１１の存在が、［3Ｈ］2Ｏが５−［ 3 Ｈ］ｄＵＭＰから放出される割合を減少させることを示す。これがＴＳの不可
逆な阻害の結果であるか否かを決定するために、ＮＢ１０１１処理した細胞を、
新鮮培養培地中に簡単に回収させ、次いでＴＳ活性についてアッセイした。ＮＢ
１０１１を欠く培養培地中に回収された細胞は、未処理細胞のＴＳ活性と同じレ
ベルのＴＳ活性を有する。この結果は、ＮＢ１０１１が細胞内処理後のＴＳ酵素
を不可逆的に不活性化しないという提唱を支持する。
【０２０８】 さらなるアプローチが、主にＮＢ１０１１がＴＳを不活性化することにより細
胞増殖を妨げるか否かを理解するために行われた。このアプローチは、ＴＳブロ
ックした細胞のチミジンレスキューに基づく。（ＳＦｄＵｒｄによる処理後に）
Ｔｏｍｕｄｅｘによってかまたは５ＦｄＵＭＰによってブロックされた細胞は、
新規合成によってはｄＴＭＰを作製しない。このことから、これらの細胞は、ス
カベンジャー機構のみにより生存する。重要なスカベンジャー機構の１つは、細
胞外チミジンの利用である。標的細胞により取り込まれたチミジンは、通常チミ
ジンキナーゼによりｄＴＭＰへ変換され得、このようにしてＤＮＡ合成を続けさ
せる。外因性チミジンの使用のための他の経路もまた、記載された。ＮＢ１０１
１活性のために重要な機構が内在性ＴＳの阻害を介する場合、細胞障害性は、チ
ミジンが細胞培養培地に添加された場合に、明らかである。この実験について、
多くの腫瘍細胞株を、ＴｏｍｕｄｅｘおよびＳＦｄＵｒｄについてのそれらの感
受性ならびにチミジン補充を介してこれらの薬剤からレスキューされる活性につ
いてスクリーニングした。正常大腸上皮（ｅｐｔｈｅｌｉａｌ）細胞（ＣＣＤ１
８ｃｏ）を、ＮＢ１０１１、５ＦＵｄＲおよびＴｏｍｕｄｅｘに対するその測定
可能な感受性に起因して使用した。実験を、ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイ（
材料および方法を参照のこと）を使用して細胞障害性を決定したことを除いて、
１０ｕＭチミジンを用いてか用いずに、（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら（１９９８）Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２７３７−２７４０）により記載されるように実施
した。結果は、Ｔｏｍｕｄｅｘからの１５倍のレスキュー（６．５ｎＭ〜９５ｎ
ＭのＩＣ50変化）、ＳＦｕｄＲからの５９０倍を超えるレスキュー（０．０１μ
Ｍ未満のＩＣ50〜５．９μＭを超えるＩＣ50）、および１０μＭ〜２２３μＭの
チミジンの存在下での僅かな減少を示した。
【０２０９】 （３．腫瘍細胞株に対する、ＴＳレベルとＮＢ１０１１媒介細胞障害性との間
の相関関係） ＴＳがＮＢ１０１１媒介細胞障害性に関与するということの確認を以下のいく
つかのアプローチを使用して確立した：１）ＮＢ１０１１の活性を、正常大腸細
胞 対 高ＴＳ発現の５ＦＵ−耐性の腫瘍細胞に対して試験した；２）腫瘍細胞
バックグラウンドへのＴＳのトランスフェクション、そして主にＴＳ発現レベル
により異なる大腸誘導体を生じたが、これらは非常に似通っていた：および３）
細胞内ＴＳ活性を減少するためのＴＳの特異的インヒビター（Ｔｏｍｕｄｅｘ）
の使用。
【０２１０】 ＮＢ１０１１媒介細胞障害性およびＳＦＵｄＲ媒介細胞障害性の最初の分析に
おいて、これらをＣＣＤ１８ｃｏ正常大腸上皮細胞型およびＨ６３０Ｒ１０（Ｓ
ＦＵ−耐性大腸腫瘍細胞株）と比較した（Ｃｏｐｕｒら（１９９５）Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｐｈａｒｍ．４９（１０）：１４１９−１４２６）。このことは、正常細
胞（ＣＣＤ１８ｃｏ）に対する細胞障害性の決定、およびＴＳを過剰発現する薬
物耐性腫瘍細胞（Ｈ６３０Ｒ１０）に対する細胞障害性の測定を可能にする。こ
れは、現在の化学療法に対する有意な限界が正常組織に対する化学療法の毒性で
あることから、重要である。結果を表４に示す。
【０２１１】 この実験は、５ＦＵｄＲが、５ＦＵ−耐性Ｈ６３０Ｒ１０腫瘍細胞よりも、正
常大腸細胞（ＣＣＤ１８ｃｏ）に対して約１８倍毒性であることを示す。この負
の治療係数は、現在の化学治療の主要な限界（すなわち、正常組織に対するその
毒性）を特徴付ける。このような負の治療係数はまた、ドキソルビシンについて
報告されている（Ｓｍｉｔｈら（１９８５）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ
ｓｔ．７４（２）：３４１−７およびＳｍｉｔｈら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５０（１０）：２９４３−２９４８）。しかし、ＳＦＵｄＲと対照的に
、ＮＢ１０１１は、正常大腸上皮細胞（２５００μＭを超えるＩＣ50）に対して
、薬物耐性Ｈ６３０Ｒ１０細胞に対して１１倍を超える改良された活性（ＩＣ50 ＝２１６．７μＭ）を有する。この結果は以下を示唆する：１）ＮＢ１０１１の
活性が、高ＴＳ発現腫瘍細胞に対してより明白である；および２）ＳＦＵｄＲに
対する、（１８）×（１１）＝１９８倍の、治療係数における総合的な改良がＴ
Ｓ ＥＣＴＡ化合物を使用して達成され得る。
【０２１２】 （４．ＨＴ１０８０腫瘍細胞中のＴＳの過剰発現は、ＮＢ１０１１に対するそ
の感受性を増強する。） ＮＢ１０１１の活性化は、数段階を必要とする。これらとしては、ヌクレオチ
ド一リン酸に対する細胞浸透転換、ＴＳへの結合、および引き続く毒性代謝が挙
げられる。細胞浸透および変換の正確な機構は、完全に規定されていない。細胞
の侵入は、ある部分ヌクレオチド輸送機構に依存し得る（Ｃａｓｓら（１９９８
）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７６（５）：７６１−７０）。同様に
、ホスホラミデートから一リン酸へのプロセシングは、ほとんど規定されていな
い機構を使用する（Ａｂｒａｈａｍら（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：
３９（２３）：４５８９−４５７５）。
【０２１３】 これらの結果は、特に重要である。なぜなら、これらは、かなり均一な遺伝子
背景において、増加するＴＳレベルがＮＢ１０１１に対する増強された感受性を
予測することを示すからである。さらに、このデータはまた、増加するＴＳレベ
ルがフルオロピリミジンに対する耐性を予測し、文献（Ｃｏｐｕｒら（１９９５
）前出：Ｂａｎｅｒｊｅｅら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：４２９
２−４２９６）の報告と一致する結果を示す。
【０２１４】 （５．ＮＢ１０１１媒介細胞傷害性のインヒビター） Ｔｏｍｕｄｅｘは、主にＴＳの阻害を介して作用する化学療法剤である。ＮＢ
１０１１がＴＳ酵素を介して細胞傷害性を及ぼす場合、Ｔｏｍｕｄｅｘを用いた
ＴＳの阻害は、ＮＢ１０１１媒介細胞傷害性を減少させるはずである。この仮説
を直接試験するために、Ｔｏｍｕｄｅｘ耐性ＭＣＦ７細胞（これは、親のＭＣＦ
７細胞株と比較して、ＴＳを１１倍過剰発現する）を、漸増する濃度のＴＤＸの
存在下でＮＢ１０１１に曝露した。
【０２１５】 細胞をプレートに播き、上記の材料および方法の節で記載されたように示され
た濃度の化合物に曝露した。
【０２１６】 このデータは、特定のインヒビターＴｏｍｕｄｅｘを用いたＴＳの阻害を示し
、約２５倍のＮＢ１０１１媒介細胞傷害性の阻害という結果になる。これらの結
果は、ＮＢ１０１１の活性がＴＳによるその代謝から生じるという概念を支持す
る。
【０２１７】 ＮＢ１０１１の細胞内代謝をさらに特徴付けるために、ロイコボリン（ＬＶ；
５−ホルミルテトラヒドロホレート）との組み合わせ実験を実施した。本発明者
らは、ＴＨＦがＢＶｄＵＭＰとｒＨｕＴＳとの無細胞反応において蛍光生成物の
生成を刺激することを発見していたので、この実験を開始した。蛍光生成物がＮ
Ｂ１０１１の細胞傷害性効果と関連するのならば、培養培地中にＬＶを提供する
ことによるＴＨＦの細胞内レベルの増強が、ＮＢ１０１１媒介細胞傷害性効果も
また増強する、と仮説を立てた。驚いたことに、３μＭ ＬＶの存在下において
、Ｈ６３０Ｒ１０細胞株に対するＮＢ１０１１活性は、ＮＢ１０１１単独と比較
して９０％より多く減少された（アラマーブルーアッセイ（ａｌａｍａｒ ｂｌ
ｕｅ ａｓｓａｙ）で測定した場合）。ＮＢ１０１１活性が、ＬＶ（これは、細
胞内の減少されたホレートプールを補充する）によってによって無効にされた事
実は、ＮＢ１０１１が、これらのプールを減少することによってある部分はたら
き得るということを支持する。あるいは、ＬＶ（または代謝産物）は、ＴＳとの
相互作用を妨害することによってＢＶｄＵＭＰの代謝に直接影響を与え得る。
【０２１８】 ＬＶがＢＶｄＵＭＰとＴＳとの反応に直接影響を与え得るか否かを調べるため
に、＋／−ＴＨＦをＢＶｄＵＭＰと、またはＴＨＦ＋ｄＵＭＰ、および＋／−メ
トトレキサート（ＭＴＸ）、ＬＶもしくはＴｏｍｕｄｅｘ（ＴＤＸ）で反応を実
行した。
【０２１９】 結果（表６）は、２つの点で驚きである：１）蛍光生成物における増加は、Ｔ
ＨＦの存在下でＢＶｄＵＭＰから注目すべきであるが、基質消費（ＢＶｄＵＭＰ
）利用の減少した割合が、補因子の存在下で生じる、そして２）補因子の存在下
において、試験された３つ全ての化合物（ＭＴＸ、ＴＤＸおよびＬＶ）は、ＢＶ
ｄＵＭＰ＋ｒＨｕＴＳ反応を劇的に阻害した。各場合、この阻害は、ｄＵＭＰ＋
ｒＨｕＴＳ反応において見出されたもの、またはＴＨＦの非存在下でのＢＶｄＵ
ＭＰを用いた反応よりも顕著であった。
【０２２０】 ＬＶ、ＭＴＸおよびＴＤＸによるＢＶｄＵＭＰ＋ＴＳ反応の阻害（そしてさら
に、この効果は補因子（ＴＨＦ）の存在下でより顕著である）を示す上記の結果
は、ＮＢ１０１１活性が、他の化学療法剤によって調節され得ることを示す。重
要なことに、ＮＢ１０１１処理細胞のレスキューは、ＭＴＸからのＬＶレスキュ
ーと同様にＬＶを提供することによって実行可能であった。ＭＬＸの場合、ＬＶ
レスキューは、細胞内ホレートプール（これは、デヒドロホレートレダクターゼ
およびＴＳのＭＴＸ阻害を介して減少される）の補充を介して生じる。減少され
たホレートが細胞内においてＢＶｄＵＭＰとＴＳとの反応の間に減少される場合
、他の化合物（これは、別の機構によって細胞内チミジンヌクレオチドプールま
たは細胞内プリンヌクレオチドプールを減少する）が、ＮＢ１０１１とともに用
いられる際に付加的または相乗作用の、抗細胞効果を与え得る。このような化合
物の例としては（ＤｏｒｒおよびＶｏｎ Ｈｏｆｆ（１９９４）前出）、６−メ
ルカプトプリン、チオグアニン、および２ｉ−ジオキシコホルミシン（２ｉ−ｄ
ｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）、プリン代謝を妨害する全てが挙げられる。ア
ザシチジン媒介のオロチジル酸デカルボキシラーゼの阻害は、ピリミジン生合成
をブロックし、そして、ＮＢ１０１１の機構とは異なる機構によって、細胞中の
細胞内チミジンレベルを低下させ得る。
【０２２１】 （Ｃ．ＴＳ ＥＣＴＡの薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）
） （１．ＴＳおよびＨＥＲ２の比較） 新規な治療剤の発見および開発のための現在のアプローチの重要な局面は、処
置に最も応答しそうである患者を同定する能力（陽性薬理ゲノム学選択）である
。この領域において１つの先駆的な薬物は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎであり、これは
現在、ＨＥＲ２原癌遺伝子を過剰発現する乳癌を処置するために使用される。抗
ＨＥＲ２抗体を用いた初期のデータは、無作為に選択された腫瘍細胞および正常
細胞に対する活性が、最小化されたことを示した。しかし、少なくとも４倍増加
したＨＥＲ２発現を有する腫瘍細胞株が選択された場合、正常細胞または低い量
のＨＥＲ２遺伝子残物を発現する腫瘍細胞と比較した際に有意な活性および抗Ｈ
ＥＲ２抗体が示され得た（Ｓｈｅｐａｒｄら（１９９１）前出）；（Ｌｅｗｉｓ
（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３７（４
）：２５５−６３）。図９に示されるこのデータは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎを用い
た場合と類似したものを示す。
【０２２２】 図２に示される細胞株の結果は、ＴＳとＨＥＲ２／ＮＥＵ系との間のさらなる
類似性を示唆し得る。この類似性とは、各々が類似の過剰発現の必要性（約４〜
６倍）（これは、ＴＳ過剰発現患者およびＨＥＲ２／ＮＥＵ過剰発現患者の両方
に関してより侵襲性の疾患を予測する）を有することである（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ
ら（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２：２６４０−２６４７）。
【０２２３】 （２．ＮＢ１０１１は、５ＦＵならびにＴｏｍｕｄｅｘ耐性の結腸癌細胞株お
よび乳癌細胞株に対して活性である。） ＮＢ１０１１は期待される抗癌活性を有するので、ＮＢ１０１１を他の化学療
法剤と安全性に関して比較することが重要である。癌の処置におけるＮＢ１０１
１の利用性は、Ｔｏｍｕｄｅｘと比較される場合、さらに強化され、５ＦＵのよ
うな化学療法剤は、しばしば、結腸癌および乳癌（特に、悪性腫瘍）を処置する
ために使用される。
【０２２４】 結果（図１０）は、ＮＢ１０１１が、正常細胞（ＣＣＤ１８ｃｏ）に対してＴ
ＤＸよりも、１０分の１よりも低い毒性であるが、ＭＣＦ７−ＴＤＸ耐性腫瘍細
胞に対してＴＤＸよりも、３０倍よりも大きくより強力であることを示す。同様
の結果が、他のＴＤＸ耐性腫瘍細胞株から得られた。正常細胞に対する低レベル
の毒性、およびＴＤＸR腫瘍細胞に対する高い活性は、ＴＳを過剰発現する薬剤
耐性癌へのＮＢ１０１１の適用を支持する。
【０２２５】 （３．ＮＢ１０１１は、ｄＵＭＰ−3Ｈからのトリチウム放出によって測定さ
れる場合、ＴＳ活性よりもＴＳタンパク質レベルにより依存する。） 細胞および組織中のＴＳレベルを特徴付けるために、４つの型のアッセイを用
いた。最も一般に使用されるのは、抗体ベースの技術（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９
９４）前出）；（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９５）前出）であるが、ＲＴ−ＰＣＲ
、５ＦｄＵＭＰ結合、およびトリチウム放出（ｖａｎ Ｌａａｒ（１９９６）Ｃ
ｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２（８）：１３２７−３３；ｖａｎ Ｔｒｉｅ
ｓｔ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．５（３）：６４３−５４；
Ｊａｃｋｍａｎ（１９９５）Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．６（９）：８７１−８１；Ｌ
ａｒｓｓｏｎ（１９９６）Ａｃｔａ．Ｏｎｃｏｌ．３５（４）：４６９−７２；
Ｋｏｍａｋｉ（１９９５）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．
３５（２）：１５７−６２；Ｍｕｌｄｅｒ（１９９４）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．１４（６Ｂ）：２６７７−８０）がまた、種々の研究において測定され
ている。細胞株の特徴付けのために、本研究者らは、ウエスタンブロッティング
および3Ｈ−ｄＵＭＰからのトリチウム放出に焦点を当てた。抗体検出が臨床サ
ンプルに通常使用され、そして標識されたデオキシウリジンからのトリチウム放
出が細胞中のＴＳ触媒活性の直接的な測定であるので、これらのアッセイを選択
した。
【０２２６】 細胞を、方法に記載されるように増殖し、そして特徴付けした。ＴＳ発現レベ
ルは、ＣＣＤ１８ｃｏ、正常結腸上皮細胞株に関する。トリチウム放出は、方法
に記載されるようにバックグラウンドを差し引きする。ＮＤ＝バックグラウンド
を超えて検出可能ではなかった。
【０２２７】 表７に示されるデータの分析は、ＴＳ活性（3Ｈ−ｄＵＭＰからのトリチウム
放出）とＮＢ１０１１感受性との間よりも、ＴＳタンパク質レベルとＮＢ１０１
１に対する感受性との間のほうがより密接な関係であることを示す。一致した親
細胞型および薬物耐性腫瘍細胞型の各セットにおいて、薬物耐性誘導体（各々は
親よりもよりＴＳタンパク質を有する）はまた、ＮＢ１０１１に対する増加した
感受性を有する。しかし、同じ比較をＴＳ活性に関して実行する場合、親細胞株
はしばしば、匹敵するかまたはより大きいＴＳ活性を有し、そしてＮＢ１０１１
媒介細胞傷害性に対して低い感受性である。
【０２２８】 これらの結果は種々の異なる機構または機構の組み合わせを介して生じ得るが
、ｄＴＭＰへの3Ｈ−ｄＵＭＰの変換（そしてトリチウム放出を伴う）は、いく
つかの成分による制限（おそらく、補因子の利用可能性）に供され得るようであ
る。しかし、ＢＶｄＵＭＰの変換は補因子に依存しないので、ＢＶｄＵＭＰとＴ
Ｓとの反応は、補因子が制限される細胞環境中でさえ、続き得る。この知見は重
要である。なぜなら、治療剤としてのＴＳ基質は、最も侵襲性かつ薬物耐性の腫
瘍細胞がその前駆体よりも低いＴＳ活性を有することが観察される、ＴＳ活性の
典型的なトリチウム放出アッセイの結果に基づくことを試みないからである。こ
れらの結果により、抗体染色によって検出されるＴＳレベルに単純に基づく、Ｔ
Ｓ ＥＣＴＡ治療のために患者を選択する提案のさらなる支持が導かれる。
【０２２９】 （４．腫瘍サンプル中のＴＳレベルは、しばしば、正常組織に対して４倍の増
加を超える。） 上記で示された結果は、ＴＳ ＥＣＴＡ治療（少なくともＮＢ１０１１を用い
る）が、癌がＴＳを少なくとも４倍過剰発現する患者において使用される場合、
最も効果的であることを示唆する。
【０２３０】 文献（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９４）前出；Ｂａｔｈｅ（１９９９）Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．５（１）：３４−４０；Ｌｅｉｃｈｍａｎ（１９９８
）Ｏｎｃｏｌ．（Ｈｕｎｔｉｎｇｔ．）１２（８補遺６）：４３−７；およびＬ
ｅｎｚ（１９９５）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．４：３０５−３０８）
によって、４倍の範囲の過剰発現が約５０％の癌の間で生じ、そしてさらに、こ
のレベルの過剰発現がより侵襲性の疾患を予測することが示唆される。ヒト結腸
癌におけるＴＳの少なくとも４倍の過剰発現の頻度を確認するために、本発明者
らは、一致した正常サンプルおよび腫瘍サンプルをＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈ
ｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋから得た。これらのサンプルを、ＲＴ
−ＰＣＲ（これは、免疫組織化学に匹敵する結果を与える）によってＴＳ ｍＲ
ＮＡレベルに関して分析した（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら（１９９５）前出）。これら
のサンプルのＲＴ−ＰＣＲ評価の結果を、図１１に示す。
【０２３１】 上記の分析した７サンプルのうち５つは、ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって決定
した場合、少なくとも４倍のレベルの過剰発現したＴＳを有した。これらの患者
のうちいずも、化学療法剤で以前に処置されておらず、これは、この過剰発現の
頻度およびレベルが、侵襲性の疾患と関連し、化学療法剤による選択に起因する
ものではないことを示唆する。ＴＳインヒビター（例えば、Ｔｏｍｕｄｅｘまた
は５ＦＵもしくは５−ＦｄＵｒｄの同化誘導体、５ＦｄＵＭＰ）に曝露された癌
細胞が、増強された発現に関して選択され得ることが予想される（Ｌｏｎｎら（
１９９６）Ｃａｎｃｅｒ ７７（１）：１０７−１２）。平均の過剰発現の程度
は、全ての７サンプルについてＲＴ−ＰＣＲによって測定した場合、約４．７倍
である。これらのデータは、腫瘍病巣において４倍よりも大きいＴＳの過剰発現
が、通常の事象であることを示唆する。
【０２３２】 （５．５ＦＵ耐性ヒト結腸癌の実験的治療） ＴＳを標的化する新規化合物に関する最も重要な疾患は、胃腸癌である。イン
ビボモデルにおいてＮＢ１０１１の活性を研究するために、Ｈ６３０Ｒ１０（５
ＦＵ耐性ヒト結腸癌細胞を、ヌードマウスにおいて５０ｍｍ3の平均腫瘍サイズ
に皮下増殖させた。次いでこのマウスを、賦形剤（ＤＭＳＯ、５ＦＵまたはＮＢ
１０１１）を用いて処置した。
【０２３３】 ３．５ｍｇ、２．５ｍｇ、および１．２５ｍｇの用量のＮＢ１０１１を、腫瘍
保有マウスに腫瘍周囲または腹腔内のいずれかで５日間毎日投与した。図１２Ａ
は、賦形剤または５ＦＵ処理動物と比較した場合の、ＮＢ１０１１を用いた５日
間の処置によって誘導された腫瘍増殖における最初のブロックを示す。統計的に
有意な用量応答関係はＮＢ１０１１群の間で明らかではないが、ＮＢ１０１１群
対 ５ＦＵまたは賦形剤コントロールのいずれかの間には有意な差異（６日目
から開始）がある。この差異は、例え治療が５日目より後に続けられなかったと
しても、コントロール動物が２５日目に屠殺されるまで維持される（図１２Ｂ）
。 本発明は詳細にかつその特定の実施形態に関して記載されてきたが、種々の変更
および改変が本発明の精神および範囲から離れることなく本発明においてなされ
得ることは、当業者に明らかである。 （表２．細菌とｒＨｕＴＳの動力学（ｋｅｎｅｔｉｃ）パラメーターの比較）
【０２３４】
【表２】 酵素動力学は、方法に記載されたとおりに実行した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃａｓｅｉからのデータは、Ｂａｒｒら（１９８３）（前出）由来である。
ｒＨｕＴＳを、上記の材料および方法に記載されるように調製した。
【０２３５】 （表３．Ｔｏｍｕｄｅｘおよび５−ＦｄＵＭＰによるｒＨｕＴＳ反応の阻害）
【０２３６】
【表３】 ｒＨｕＴＳ反応のＴｏｍｕｄｅｘおよび５−ＦｄＵＭＰによる阻害。酵素インヒ
ビターおよび補因子を含むチミジル酸シンターゼ反応物を、材料および方法に記
載されるように３０℃でインキュベートし、そして酵素反応の初期速度を、ＢＶ
ｄＵＭＰ反応に関しては３４０ｎｍ励起、５９５ｎｍ発光で相対蛍光単位におけ
る増加を測定するか、またはｄＵＭＰ反応に関してはＡ340における増加を測定
することによって決定した。
【０２３７】 （表４．正常細胞系統および腫瘍細胞系統に対する、ＮＢ１０１１ 対 ５Ｆ
Ｕの細胞傷害性）
【０２３８】
【表４】 （表４．続き）
【０２３９】
【表５】 細胞を、アラマーブルーアッセイ（方法）において、ＮＢ１０１１または５Ｆ
Ｕのいずれかに対する応答について分析した。全てのアッセイは、少なくとも３
回実施した。標準偏差は、０％より小さい。治療剤指標（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ
ｃ ｉｎｄｅｘ）を、ＩＣ50（全ての細胞型の平均）対ＩＣ50（全ての腫瘍細胞
株の平均）の比として算出した。
【０２４０】 （表５．ＨｕＴＳを発現するように操作された細胞株に対するＮＢ１０１１細
胞傷害性）
【０２４１】
【表６】 ｒＨｕＴＳをコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ３（インフレーム
でＧＦＰを有する）にサブクローニングした。この構築物をＨＴ１０８０細胞に
トランスフェクトし、そして融合ｒＨｕＴＳを安定に発現するクローンを得るた
めにＧ４１８（７５０μｇ／ｍｌ）で選択した。個々の細胞を、方法に記載され
たように、高い蛍光発現または低い蛍光発現に基づいてクローン化した。*ＴＳ
レベルを、ウエスタンブロット分析を用いて決定し、定量された発現レベルを、
細胞系統ＣＣＤ１８ｃｏの値と比較した値として示した。
【０２４２】 （表６．Ｔｏｍｕｄｅｘは、ＮＢ１０１１媒介細胞傷害性を阻害する。）
【０２４３】
【表７】 Ｔｏｍｕｄｅｘレスキューアッセイ（アラマーブル）を、方法に記載されたよう
にＴＤＸ耐性ＭＣＦ７乳癌細胞を用いて実施した。「〜倍の保護」を、添加され
るＴＤＸの有りおよび無しのＩＣ50の比として算出した。
【０２４４】 （表７．ホレートインヒビターの影響）
【０２４５】
【表８】 ｒＨｕＴＳを用いた無細胞アッセイ、適切な基質および他の成分を、方法に記載
されるように合わせた。ＭＴＸ（１４０μＭ）、ＬＶ（１４０μＭ）、またはＴ
ＤＸ（５μＭ）を、その阻害活性を評価するために添加した。基質（ＢＶｄＵＭ
ＰまたはＴＨＦのいずれか）の使用を、反応速度の測定として使用した。これら
の数は、残存している活性を示す。
【０２４６】 （表８．ＮＢ１０１１活性は、トリチウム放出とよりもＴＳタンパク質とより
関連する。）
【０２４７】
【表９】 （表９．ＮＢ１０１１に耐性として選択されたＭＤＦ７ ＴＤＸ細胞は、５−
フルオロウラシルおよびＴｏｍｕｄｅｘに対してより感受性である。
【０２４８】
【表１０】 *は、材料および方法に記載されたアラマーブルーアッセイによって決定した。
ＴＤＸは、Ｔｏｍｕｄｅｘ；１０１１は、ＮＢ１０１１。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明のＥＣＴＡプロドラッグの作用の機構を模式図的に示す。
【図２】 図２は、ブロモビニル２’−デオキシウリジンモノホスフェート（「ＢＶｄＵ
ＭＰ」）と組換えヒトチミジル酸シンターゼ（「ｒＨｕＴＳ」）とのインキュベ
ーションからの蛍光産物を示すグラフである。ＢＶｄＵＭＰとチミジル酸シンタ
ーゼ（「ＴＳ」）とのインキュベーションは、蛍光産物の時間および酵素依存性
生成を生じる。Ｎ５，Ｎ１０−メチレンテトラヒドロホレートを反応系から除い
たことを除いて、ＢＶｄＵＭＰを、３０℃での標準反応混合物においてｒＨｕＴ
Ｓの示された量ととにインキュベートした（材料および方法）。各データ曲線に
隣接する数は、ＴＳ酵素単位を示す。
【図３】 図３は、ＢＶｄＵＭＰが、ｒＨｕＴＳにおいてデオキシウリジンモノホスフェ
ート（Ｄｅｏｘｇｕｒｉｄｉｎｅ Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（「ｄＵＭＰ
」）を競合することを示す。ｄＵＭＰをｄＴＭＰに変換する反応を触媒するチミ
ジル酸シンターゼは、ＢＶｄＵＭＰの非存在下で、インビトロで（三角形）、お
よび２０μＭ ＢＶｄＵＭＰ（四角）の存在下で、測定された（ｒｕｎ）。ｄＵ
ＭＰ濃度は、１０〜１００μＭで変化し、Ｎ５，Ｎ１０−メチレンテトラヒドロ
ホレート濃度は、１４０μＭであり、そして酵素濃度は、０．１μＭであった。 酵素活性を、Ａ340の増加を測定することによって決定した。
【図４】 図４は、ＢＶｄＵＭＰとのプレインキュベーションは、ｒＨｕＴＳを不活性化
しないことを立証する実験結果を示す。ヒトチミジル酸シンターゼは、１２５μ
ＭのＢＶｄＵＭＰとともにおよびそれがない場合に、反応混合物中でインキュベ
ートされた。２０時間後、ＢＶｄＵＭＰを、１２５μＭの濃度まで添加し、ｄＵ
ＭＰを１２５μＭの最終濃度まで添加し、そしてＮ５，Ｎ１０−メチレンテトラ
ヒドロホレートを７０μＭまで加えた。チミジル酸シンターゼ活性を、Ａ340に
おける増加を測定することによって決定した。黒丸（プレインキュベートされた
反応）、白丸（プレインキュベーションなし）。
【図５】 図５は、インビトロ反応の生成物の構造である。ｒＨｕＴＳによって触媒され
た、ＢＶｄＵＭＰのインビトロ反応の生成物の構造。構造ＩおよびＩＩは、細胞
の内反応混合物において同定された大部分のイオンと一貫する。
【図６】 図６は、ＮＢ１０１１活性化の提唱される機構である。ＮＢ１０１１は、ＴＳ
と相互作用する前に、細胞に入り、そしてＢＶｄＵＭＰに転換することが可能で
なければならない。ＴＳによる形質転換に続いて生成される構造は、環外ピリミ
ジンヌクレオチドモノホスフェートであることが提唱される。これらの化合物は
、種々の機構（ヌクレオチドおよび核酸代謝への干渉を含む）により細胞に対し
て、細胞傷害性であり得る。腫瘍
【図７】 図７は、ＮＢ１０１１で処理されたＨ６３０Ｒ１０細胞におけるＢＶｄＵＭＰ
の検出を示す。Ｈ６３０Ｒ１０細胞を１００μＭ ＮＢ１０１１で５日間処理し
、次いで、材料および方法に記載されるようにＬＣ／ＭＳによって分析した。
【図８】 図８は、ＮＢ１０１１が、インビボで不可逆的にＴＳを不活性化しないことを
立証する。ＮＢ１０１１のＴＳ活性に対する効果は、インタクトな細胞において
完全に可逆的である。ＴＳ活性を、材料および方法に記載されるように、５−［ 3 Ｈ］デオキシウリジンからの［3Ｈ］2Ｏの放出によって、インタクトなＲＫＯ
細胞において測定した。ＮＢ１０１１を新鮮な培地と置き換えることによって細
胞から洗浄し、３７℃で６０分間インキュベートし、次いで、この手順を繰り返
した。コントロールおよび未処理細胞を同じ洗浄手順に供した。
【図９】 図９は、ＮＢ１０１１および抗ＨＥＲ２に対するインビトロ効力要求の間に顕
著な類似性が存在することを示す。Ａ）表３、４および７から得られたデータ。
Ｂ）Ｓｈｅｐａｒｄ，ら（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．１１（３）：
１１７−２７からのデータ。垂直方向のバーは、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ
検定を使用して計算した平均の標準誤差を示す。
【図１０】 図１０は、ＮＢ１０１１が、Ｔｏｍｕｄｅｘ耐性癌に対して高度に活性である
ことを示す。細胞傷害性 対 ＴＤＸR細胞株を、上記材料および方法に記載さ
れるように、アラマーブルー（ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ）アッセイにおいて測定
した。
【図１１】 図１１は、ヒト正常結腸組織および腫瘍結腸組織におけるチミジル酸シンター
ゼの転写物レベルを示す。ＲＴ−ＰＣＲ分析を、上記の材料および方法に記載さ
れるように実施した。腫瘍におけるＴＳ ｍＲＮＡ 対 正常な組織サンプルに
おけるＴＴＳ ｍＲＮＡの比（各々は、β−アクチンに対して規格化される）は
、（左から右に）１４．３５、７．３１、０．７５、５９．５、２．５３、２４
．１、および４．０であった。
【図１２Ａ】 図１２Ａは、ＮＢ１０１１が、５−ＦＵ耐性結腸癌の増殖を阻害することを示
す。Ｈ６３０Ｒ１０（５ＦＵ耐性）ヒト結腸癌を保有するヌードマウスの処置。
腫瘍測定を、処置の最初の日（１日目）に始めた。
【図１２Ｂ】 図１２Ｂは、ＭＢ１０１１に対する長期応答である。２５日目におけるプール
されたデータの分析。統計的分析は、上記の材料および方法の節に記載される。
【図１３】 図１３は、多数のヒト組織におけるＴＳのｍＲＮＡレベルを示すグラフである
。ＴＳ ｍＲＮＡレベルを、ＲＴ−ＰＣＲを使用して決定した。チミジル酸シン
ターゼに対応するＤＮＡバンドが定量され、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎ
ａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍによって、β−アクチンのそれに対して規格化される。
欄１〜２０は、ヒトの正常組織におけるＴＳ ｍＲＮＡレベルを示す。発現レベ
ルは、結腸（欄１６）に対する値として表現される。欄２１および２２は、７の
適合した結腸の正常組織および癌組織における平均ＴＳ転写物レベルを示す。そ
の発現値は、正常な結腸組織（欄２１）の発現値に対してであった。
【図１４】 図１４は、チミジル酸シンターゼおよびチューブリンに対する抗体とともに展
開されたＳＤＳ ＰＡＧＥウエスタンブロットによって評価されるように、Ｔｏ
ｍｕｄｅｘまたはＮＢ１０１１とともに選択された細胞におけるＴＳ発現のレベ
ルを示す。レーン１は、ＭＣＦ７細胞（薬物は、選択されていない）を示し；レ
ーン２は、２μＭのｔｏｍｕｄｅｘとともに選択されたＭＣＦ７細胞を示し；レ
ーン３は、選択薬剤としてＮＢ１０１１を使用する引き続き選択位後の、レーン
２におけるようなＭＣＦ７細胞を示し；レーン４は、Ｔｏｍｕｄｅｘを用いるこ
となく、続いて通過させた（ｐａｓｓａｇｉｎｇ）後の、レーン２におけるよう
なＭＣＦ細胞７を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｈ 19/073 Ｃ０７Ｈ 19/073 ４Ｃ０８６ 19/10 19/10 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 FB01 FB07 FB12 4B024 AA01 AA12 CA01 CA11 4B063 QA20 QQ08 QR66 QS02 4C057 CC03 DD01 GG03 LL09 LL10 LL15 LL19 LL21 4C084 AA17 NA14 ZA362 ZC412 4C086 AA01 AA02 AA03 BC42 BC43 EA17 MA01 MA04 NA14 ZB26 ZC19

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 病理学的細胞を選択的に阻害するための方法であって、ここ
    で該細胞は、内在性細胞内活性化酵素の過剰発現により特徴付けられ、そしてこ
    こで該酵素は、基質であるプロドラッグ化合物により不活性化されず、該方法は
    、該活性化酵素によって細胞内で毒物に選択的に変換される構造を有する有効量
    の該基質化合物と該細胞とを接触させ、これにより該病理学的細胞の増殖を選択
    的に阻害する工程を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 以下の化合物： 【化１】 であって、 ここでＲ1は、分子の寸法および活性化酵素によるピリミジン環からの引き抜
    きと一致する求電子性を有する、化学的実体である脱離基であるかまたは該脱離
    基を含み、そして該脱離基は、ピリミジン環活性化酵素からの放出に際して、該
    細胞の増殖を阻害するかまたは該細胞を殺傷する能力を有し； ここでＱは、糖、炭素環、非環式化合物およびそれらのマスクされたホスフェ
    ートまたはホスホラミデート誘導体ならびに任意の２，Ｂからなる群より選択さ
    れる、 化合物。
  3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の方法であって、前記化合物が以下
    の構造： 【化２】 を有し、ここで： Ｒ1は、以下の式： 【化３】 を有し、但し化合物Ｉにおいてはｎは０であり得、 Ｒ2は、以下： 不飽和ヒドロカルビル基； １以上の不飽和ヒドロカルビル基を含む芳香族ヒドロカルビル基；および １以上の不飽和ヒドロカルビル基を含む複素芳香族基； からなる群より選択される二価の電子コンジット部分であり； Ｒ3は、以下： 【化４】 からなる群より選択される二価のスペーサー部分であり： Ｒ5は、同じであっても異なってもよく、そして独立して、１〜１０個の炭素
    原子を有する直鎖状もしくは分枝状アルキル基、または３〜１０個の炭素原子を
    有するシクロアルキル基、またはハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）であり； ｎは０〜１０の整数であり； ｍは、０または１であり； Ｒ4は、以下： 【化５】 からなる群より選択される毒素族部分であり： Ｒ8およびＲ9は、低級アルキルであり、かつＲ10は、ＨまたはＣＨ3であり： Ｘは、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは他の強力な脱離基であり、但しＲ7が−Ｈ
    でありかつｍがゼロである場合、Ｒ4はハロゲンでなく、またはｍがゼロであり
    かつｎがゼロである場合、Ｒ4はハロゲンではなく； Ｙは、独立して−Ｈまたは−Ｆであり； Ｚは、独立して−Ｏ−または−Ｓ−であり； Ｑは、以下： 【化６】 からなる群より選択される部分であり； Ｒ6は、独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ3、Ｆ、または他の保護
    されたヒドロキシル基であり；そして Ｒ7は、水素、リン酸基、ホスホジエステル基、またはホスホラミデート基で
    あり； そして、ここで該化合物は、任意のエナンチオマー形態、ジアステレオマー形
    態またはステレオアイソマー形態であり得、これらの形態としては、Ｄ体、Ｌ体
    、α−アノマー体、およびβ−アノマー体が挙げれられる、方法。
  4. 【請求項４】 前記病理学的細胞が、腫瘍サプレッサー機能の欠失の結果と
    して、活性化酵素を過剰発現する、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記活性化酵素が、前の化学療法の結果として過剰発現され
    る、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記化学療法が、フルオロピリミジンまたはＴｏｍｕｄｅｘ
    である、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記細胞が、過剰増殖細胞または新生物性細胞である、請求
    項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記新生物性細胞が、胃癌細胞、乳癌細胞および大腸癌細胞
    からなる群より選択される細胞である、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記活性化酵素が、チミジル酸シンターゼである、請求項１
    に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記活性化酵素が、チミジル酸シンターゼ、チロシンキナ
    ーゼ、またはジヒドロ葉酸レダクターゼからなる群より選択される、請求項１に
    記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記細胞および前記活性化酵素が、同種の細胞および活性
    化酵素である、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記細胞を第２の治療剤と接触させる工程をさらに包含す
    る、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記第２の薬剤が、フルオロピリミジンまたはＴｏｍｕｄ
    ｅｘである、請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記接触させる工程が、インビトロ、エキソビボおよびイ
    ンビボである、請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記接触させる工程が、インビボである、請求項１に記載
    の方法。
  16. 【請求項１６】 前記活性化酵素が少なくとも４倍過剰発現される、請求項
    １に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記細胞を、細胞内チミジンまたはプリンを減少させる有
    効量の化合物と接触させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記細胞を、有効量の６−メルカプトプリン、チオグアニ
    ンまたは２’−デオキシコフォルマイシンと接触させる工程をさらに包含する、
    請求項１に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記化合物が、（ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２’
    −デオキシ−５’−ウリジルフェニルＬ−アラニニルホスホルアミデートである
    、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 プロドラッグについてスクリーニングするために方法であ
    って、該薬物は、内在性細胞内酵素によって細胞中で毒物へ選択的に変換され、
    該細胞内酵素は、プロドラッグによって阻害も不活性化もされず、ここで該方法
    は、候補プロドラッグを少なくとも２つの試験細胞と接触させる工程、およびに
    該内在性細胞内酵素による該薬物毒性薬剤への該プロドラッグの活性化について
    アッセイする工程を包含し、該細胞は、同じかまたは異なる種由来の内在性細胞
    内酵素を発現する、方法。
  21. 【請求項２１】 １つの試験細胞が正常細胞であって、そして他の試験細胞
    が病理学的細胞である、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記アッセイが、質量分析による細胞内代謝物の分析を含
    む、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記候補薬剤が、検出可能な薬剤を含む，請求項２０に記
    載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記検出可能な薬剤が、蛍光マーカーである、請求項２３
    に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 少なくとも１つの試験細胞が、過剰増殖または新生物性細
    胞である、請求項２０に記載の方法。
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