KR20020059341A - 치료법-내성 종양의 치료 방법 - Google Patents

치료법-내성 종양의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 병적 세포를 선택적으로 억제하는 방법을 제공하며, 여기에서 세포는 내인성 세포내 활성 효소의 발현을 특징으로 하고, 효소는 기질 프로드러그 화합물에 의해 불활성화되지 않는다. 이 방법은 유효량의 기질 화합물과 세포를 접촉시키는 것을 필요로 하며, 이로써 병적 세포의 증식을 선택적으로 억제한다. 또한, 본 발명은 내인성 세포내 효소를 발현하는 적어도 2개의 시험 세포와 동일하거나 또는 상이한 종으로부터 후보 프로드러그를 접촉시키는 단계, 및 내인성 세포내 효소에 의한 프로드러그의 독성 제제로의 활성화를 분석하는 단계에 의해, 세포에서 독소로 선택적으로 전환된 프로드러그를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

Description

치료법-내성 종양의 치료 방법{METHODS FOR TREATING THERAPY-RESISTANT TUMORS}
본 명세서 전체를 통하여, 다양한 공보가 우선 저자 및 일자, 특허 번호 또는 공보 번호에 의해 참조된다. 각 참고자료에 대한 완전한 서지사항은 명세서 내에서 알 수 있다. 이 공보들의 명세서는 본 발명이 속하는 분야를 더욱 충분히 설명하기 위해 본원에 참고자료로서 포함된다.
암의 화학치료법적 치료에 대한 내성은 주요한 건강 관리 문제이다. 내성 메카니즘은 내인성 및 후천성의 2가지 유형으로 분류될 수 있다. 암에서, 대부분의 약물 내성은 효소 매개된다. 표적 효소가 화학치료법이 숙주에 허용되지 않는 독성 없이 효소의 활성을 차단하기에는 너무 높은 레벨로 발현되거나, 또는 달리, 효소가 화학치료법을 빠르게 변형시키는 병에 걸린 세포에 의해 발현됨으로써, 화학치료법의 치료 활성을 없앤다. 화학치료법에 대한 내인성 내성은 병에 걸린 세포가 종양 억제인자 유전자 기능(p53, RB, p16)을 상실할 때 암에서 발생할 수 있다. 이것이 발생할 때, 티미딜레이트 신타제(TS) 및 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)와 같은 효소가 세포 사이클 동안 내내 구성적으로 발현된다(Yeager and Reznikoff (199 8) J. Urol. 159(2):581-5; el-Deiry (1997) Curr. Opin. Oncol. 9(1):79-87; Goker, Waltham, et al. (1995) Blood 86(2):677-84; Banerjee, Ercikan-Abali, et al. (1995) Acta Biochem Pol. 42(4):457-64; Fan and Bertino (1997) Oncogene 14 (10);1191-1200; Slansky and Farnham (1996) Bioessays 18(1):55-62; Lenz, Danenberg, et al. (1998) Clin. Cancer Res. 4(5):1227-34; 및 Lee, et al. (1997) Exp. Cell Res. 234(2):270-6). 이것은 플루오로피리미딘(TS의 상승된 발현에 의하여) 또는 메토트렉세이트(DHFR의 상승된 발현에 의하여)에 대한 내인성 내성의 증가를 초래한다. 새로운 치료법에 대한 접근법은 더 나은 효소 억제제의 개발, 또는 억제하는 새로운 효소에 대한 조사에 주로 제한되고 있다(Hu, et al. (1998) J. Pharm. Sci. 87(7):886-90; Drake, et al. (1996) Biochem. Pharmacol. 51(10):1349-55; Schultz, et al. (1999) Anticancer Res. 19(1A):437-43; Touroutoglou and Pazdur (1996) Clin. Cancer. Res 2(2):227-43; 및 Handfield and Levesque (1999) FEMS Microbiol. Rev. 23(1):69-91). 본 출원인은 잘 특징된 효소를 표적으로 하는 치료법의 개발에 대한 신규 접근법을 개발했다. 이 기법은 암 치료법에 대한 선행하는 접근법과는 구별되며, 효소 촉매 치료 활성화, 즉 "ECTA"로 간주된다.
본 출원은 35 U.S.C §119(e) 하에 각각 1999년 9월 14일 및 1999년 7월 22일에 제출된 다음의 미국 선출원 U.S. 일련 번호: 60/153,855 및 60/145,364에 대한 우선권을 주장하며, 이것들의 내용은 본 명세서에 참고자료로서 포함된다.
본 발명은 암 치료법의 분야, 특히 치료법-내성 종양의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 ECTA 프로드러그의 작용 메카니즘을 도식적으로 나타낸다.
도 2는 브로모비닐2'-디옥시우리딘 모노포스페이트("BVdUMP")와 재조합 사람 티미딜레이트 신타제("rHuTS")의 인큐베이션으로부터의 형광 생성물을 나타내는 그래프이다. BVdUMP와 티미딜레이트 신타제("TS")의 인큐베이션은 형광 생성물(들)의 시간 및 효소 의존 생성을 가져온다. BVdUMP는 30℃에서 표준 반응 혼합물(물질 및 방법)중에서 나타낸 양의 rHuTS와 함께 인큐베이션되었다. 단, N5,N10-메틸렌 테트라히드로폴레이트는 반응에서 생략되었다. 각 데이타 곡선에 인접한 수가 TS 효소 유니트로 간주된다.
도 3은 BVdUMP가 rHuTS에서 디옥시우리딘 모노포스페이트("dUMP")와 경쟁적임을 나타낸다. dUMP를 dTMP로 전환하는 티미딜레이트 신타제 촉매된 반응이 20μM BVdUMP의 부재(삼각형) 및 존재(정사각형)하에 시험관내에서 행해졌다. dUMP 농도는 10에서 100μM까지 변했고, N5,N10-메틸렌 테트라히드로폴레이트 농도는 140μM이었으며, 효소 농도는 0.1μM이었다. 효소 활성이 A340에서의 증가를 측정함에 의해 측정되었다.
도 4는 BVdUMP와의 예비 인큐베이션이 rHuTS를 불활성화하지 않았음을 증명하는 실험 결과를 나타낸다. 사람 티미딜레이트 신타제는 125μM BVdUMP의 존재 및 부재하에 반응 혼합물중에서 예비 인큐베이션되었다. 20시간 후, BVdUMP를 125μM 농도로 가했고, 최종 농도 125μM로 dUMP를 가했고, N5,N10-메틸렌 테트라히드로폴레이트를 70μM로 가했다. 티미딜레이트 신타제 활성이 A340에서의 증가를 측정함에 의해 측정되었다. 검은색 원(예비 인큐베이션된 반응), 흰색 원(예비 인큐베이션 하지 않음).
도 5는 시험관내 반응 생성물의 구조이다. rHuTS에 의해 촉매된 BVdUMP의 시험관내 반응 생성물의 구조. 구조 I 및 II는 무세포 반응 혼합물에서 확인된 큰 이온과 일치한다.
도 6은 NB1011 활성화의 제안된 메카니즘이다. NB1011은 TS와 상호작용하기 전에 세포에 들어가서 BVdUMP로 전환할 수 있어야 한다. TS에 의한 형질전환 후 생성된 구조는 외향고리 피리미딘 뉴클레오티드 모노포스페이트라고 제안된다. 이들 화합물은 뉴클레오티드 및 핵산 대사의 방해를 포함하여, 다양한 메카니즘에 의해 세포에서 세포독성일 수 있다.
도 7은 NB1011로 처리된 H630R10 세포에서 BVdUMP의 검출을 나타낸다. H630 R10 세포는 5일간 100μM NB1011로 처리된 후, 물질 및 방법에 설명된 바와 같이 LC/MS에 의해 분석되었다.
도 8은 NB1011이 생체내에서 TS를 비가역적으로 불활성화하지 않는다는 것을증명한다. 완전한 세포에서 TS 활성에 대한 NB1011의 효과는 완전히 가역적이다. 물질 및 방법에 설명된 바와 같이, TS 활성이 5-[3H]디옥시우리딘으로부터 [3H]2O의 유리에 의해 완전한 RKO 세포에서 측정되었다. NB1011은 신선한 배지로 교체하고, 37℃에서 60분간 인큐베이션하고, 다음에 이 과정을 반복함에 의해 세포중에서 세척되었다. 대조표준 및 미처리된 세포에 동일한 세척 과정을 행하였다.
도 9는 NB1011 및 항-HER2에 대한 시험관내 효능 필요조건들 간의 현저한 유사성을 나타낸다. A) 표 3, 표 4 및 표 7로부터 선택된 데이타. B) Shepard, et al. (1991) J. Clin. Immun. 11(3): 117-27로부터 선택된 데이타. 수직막대는 만-휘트니 U 테스트를 사용하여 계산된 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 10은 NB1011이 토뮤덱스 내성 암에 대하여 고도로 활성임을 나타낸다. TDXR셀라인에 대한 세포독성이 물질 및 방법에 설명된 바와 같이, 알라마르 블루 분석에 의해 측정되었다.
도 11은 사람의 정상 및 종양 결장 조직에서 티미딜레이트 신타제의 전사 레벨을 나타낸다. RT-PCR 분석이 물질 및 방법에 설명된 바와 같이 수행되었다. 각각 베타-액틴에 대해 정규화된 종양 대 정상 조직 샘플의 TS mRNA 비율은 (왼쪽에서 오른쪽으로) 14.35, 7.31, 0.75, 59.5, 2.53, 24.1 및 4.0이었다.
도 12A는 NB1011이 5-FU 내성 결장암의 성장을 억제함을 나타낸다. H630R10 (5FU 내성) 사람 결장 암종을 지니는 누드 마우스의 치료. 종양 측정을 치료 1일째에 시작했다.
도 12B는 NB1011에 대한 장기 반응이다. 25일까지 모인 데이타의 분석. 통계적 분석이 물질 및 방법에 설명된다.
도 13은 다수의 사람 조직에서 TS의 mRNA 레벨을 나타내는 그래프이다. TS mRNA 레벨은 RT-PCR을 사용하여 측정되었다. 티미딜레이트 신타제에 상응하는 DNA 밴드가 정량되었고, Molecular Dynamics Storm에 의한 베타-액틴의 밴드에 대해 정규화되었다. 칼럼 1 내지 20은 사람 정상 조직에서의 TS mRNA 레벨을 나타낸다. 발현 레벨은 결장(칼럼 16)의 발현 레벨에 상대적인 값으로서 표현된다. 칼럼 21 및 22는 7개의 매치된 결장 정상 및 암 조직에서 평균 TS 전사 레벨을 나타낸다. 발현 값은 정상 결장 조직(칼럼 21)의 발현에 상대적이다.
도 14는 티미딜레이트 신타제 및 투빌린에 대한 항체를 사용하여 발생된 SDS PAGE 웨스턴 블롯에 의해 추정된 바, 토뮤덱스 또는 NB1011을 사용하여 선택된 세포에서 TS 발현 레벨을 나타낸다. 레인 1은 약물을 사용하여 선택되지 않은 MCF7 세포를 나타내고, 레인 2는 2μM 토뮤덱스를 사용하여 선택된 MCF7 세포를 나타내고, 레인 3은 레인 2에서와 같지만, 이어서 선택제로서 NB1011을 사용하여 선택된 MCF7 세포를 나타내고, 레인 4는 레인 2에서와 같지만, 이어서 토뮤덱스 없이 통과시킨 MCF7 세포를 나타낸다.
본 발명은 내인성 세포내 활성 효소의 발현을 특징으로 하는 병적 이상형성성 세포를 선택적으로 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 유효량의 기질 화합물과 세포를 접촉시키는 것이 필요하며, 이로써 세포의 증식이 선택적으로 억제된다. 효소는 기질 프로드러그 화합물에 의해 불활성화되지 않는다.
또한, 본 발명은 내인성 세포내 효소를 발현하는 적어도 2개의 시험 세포와 후보 프로드러그를 접촉시킴으로써, 내인성 세포내 효소에 의해 세포에서 독소로 선택적으로 전환된 프로드러그를 스크리닝하는 방법, 및 내인성 세포내 효소에 의한 독성 제제로의 프로드러그의 활성화를 분석하는 방법을 제공한다.
(발명을 실시하는 방식)
본 발명의 실행은, 달리 나타내지 않았다면, 본 분야의 범위내에 있는 분자생물학, 의약화학, 유기화학, 미생물학, 세포생물학 및 재조합 DNA에 대한 종래의 기법을 사용할 것이다. 예를 들어, Sambrook, et al. MOLECULAR CLONING; A LABORATO- RY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. M. Ausubel, et al. eds., (1987); METHODS IN ENZYMOLOGY 시리즈(Academic Press, Inc.); A PRACTICAL APPROACH(M. J. MacPherson, B. K. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)) 및 ANIMAL CELL CULTURE(R. I. Freshney, ed. (1987)) 참조.
명세서 및 청구항에 사용된 바와 같은, 단수형 "한" 및 "그"는 문맥상에 분명히 다르게 규정하지 않는다면, 복수의 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "한세포"는 그것의 혼합물을 포함하여, 복수의 세포를 포함한다.
용어 "포함하는"은 기재된 요소들을 포함하고, 다른 것도 배제하지 않는 조성물 및 방법을 의미하도록 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는데 사용될 때, "로 본질적으로 구성된"은 그 조합에 있어 어떤 본질적인 중요성을 갖는 다른 요소를 배제함을 의미할 것이다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 구성된 조성물은 분리 및 정제 방법, 그리고 포스페이트 완충 살린, 보존제 등과 같은 제약학적으로 허용되는 담체로부터의 미량 오염물질을 배제하지 않을 것이다. "로 구성된"은 다른 성분 및 본 발명의 조성물을 투여하는 실질적인 방법 단계의 미량 이상의 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 각각의 과도적 용어에 의해 정의된 구체예는 본 발명의 범위내이다.
"조성물"은 활성제와 불활성(예를 들어, 검출가능한 제제 또는 표지, 또는 제약학적으로 허용되는 담체) 또는 활성인 다른 화합물 또는 조성물, 예컨대 애쥬번트의 조합을 의미하도록 의도된다.
"제약학적 조성물"은 활성제와 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 진단적 또는 치료적 사용에 적합한 조성물을 만드는 불활성 또는 활성인 담체의 조합을 포함하도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "제약학적으로 허용되는 담체"는 포스페이트 완충 살린 용액, 물, 및 기름/물 또는 물/기름 에멀전과 같은 에멀전, 및 다양한 종류의 습윤제와 같은 표준 제약학적 담체 중 어느 것을 포함한다. 또한, 조성물은 안정제 및 보존제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 담체, 안정제 및 애쥬번트에대해 Martin, REMINGTON'S PHARM. SCI., 15th Ed(Mack Publ. Co. Easton (1975)) 참조.
"유효량"은 유익한 또는 바람직한 결과를 행하기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여, 도포 또는 투약으로 투여될 수 있다.
"피험자", "개체" 또는 "환자"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 이것은 척추동물, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 사람으로 간주된다. 포유류는 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 뮤린, 유인원, 사람, 농장 동물, 변종 동물, 및 애완 동물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "접촉시키는"은 시험관내, 생체외 및 생체내에서 프로드러그의 투여를 포함한다. 생체내에서 행해질 때, 프로드러그는 유효량으로 피험자에게 투여된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "피험자"는 어떤 적합한 동물 모델, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 유인원을 포함하도록 의도된다. 또한, 사람 환자에게 투여하는 것도 포함한다.
"대조표준"은 비교의 목적으로 실험에 사용된 다른 피험자 또는 샘플이다. 대조표준은 "양성" 또는 "음성"일 수 있다. 예를 들어, 실험의 목적이 유전자의 변경된 발현 레벨과 특정한 종류의 암의 상호 관계를 측정하는 것인 경우, 일반적으로 양성 대조표준(그러한 변경을 갖고 그 질환의 특징적인 증후를 나타내는, 피험자 또는 피험자로부터의 샘플), 및 음성 대조표준(변경된 발현 및 그 질환의 임상적 증후가 결여된, 피험자 또는 피험자로부터의 샘플)을 사용하는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "병적 세포", "표적 세포", "시험 세포" 및 "초증식성 세포"는 유전적 돌연변이 또는 세포내 효소의 내인성 과발현에 의한 활성화를 특징으로 하는 세포를 포함한다. 어떤 구체예에서, 효소의 과발현은 종양 억제인자 유전자 생성물 기능 약물 내성의 상실 또는 병적 표현형에 관련된 유전적 불안정성과 관련된다. 다수의 세포 메카니즘은 약물 내성, 예를 들어 변경된 약물 대사, 활성 화합물에 관한 세포의 불침투성 또는 세포로부터 약물 제거의 촉진, 억제된 효소의 변경된 특이성, 표적 분자의 생성 증가, 세포독성 병소의 회복 증가, 또는 다른 생화학적 경로에 의한 억제 반응의 우회를 수반한다. 활성화 또는 과발현되고, 약물 내성과 관련된 효소는 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 티미딜레이트 신타제, 디히드로폴레이트 환원효소, 티로신 키나제 및 복합약물 내성 효소를 포함하며, ATP-의존 복합약물 내성 관련 단백질 및, 결장 및 전립선암을 포함하는 어떤 질환에서는 토포이소머라제 I를 포함한다. 또는 달리, 한 약물에 대한 내성은 다른 생물학적으로 별개인 약물에 대한 내성을 줄 수 있다.
어떤 유전자의 증폭은 화학치료법에 대한 내성을 수반한다. 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)의 증폭은 메토트렉세이트에 대한 내성과 관련되고, 티미딜레이트 신타제를 코드화하는 유전자의 증폭은 5-플루오로피리미딘을 사용한 종양 치료에 대한 내성과 관련된다. 약물 내성에 관련된 유전자의 증폭은 미국 특허 번호 5,08 5,983에 설명된 바와 같은 변형 중합효소 사슬 반응(PCR)(Kashini-Sabet, et al. (1998) Cancer Res 48:5775-5778)에 의해 검출 및 모니터될 수 있다. 후천성 약물 내성은 세포유전학적 비정상성, 예컨대 상동성 염색체 염색 영역 및 이중 미소 염색체의 검출에 의해 모니터될 수 있으며, 2개 모두 유전자 증폭에 관련된다. 다른 분석법은 직접적 또는 간접적 효소 활성 분석법을 포함하며, 2개 모두 유전자 증폭 및 다른 방법론(예를 들어, 중합효소 사슬 반응 또는 면역조직화학)에 관련된다.
또는 달리, 병적 세포는 TS와 같은 활성 효소의 발현을 증진시킨다고 알려진 불활성화된 종양 억제인자 기능, 예를 들어 레티노블라스토마(RB) 또는 p53의 상실 또는 불활성화를 특징으로 한다.
치료 방법
한 양태로서, 본 발명은 내인성 세포내 활성 효소에 의해 세포에서 독소로 선택적으로 전환되는 기질 프로드러그와 세포를 접촉시킴에 의한, 병적 세포의 증식을 억제하는 방법을 지시한다. 본 발명의 방법 및 조성물은, 어떤 초증식성 또는 이상형성성 세포, 예를 들어 위암 세포, 결장암 세포 및 유방암 세포에서 발생하는, 세포내 효소를 내인성으로 발현하는 세포의 성장 또는 증식을 억제하는데 바람직하게 유용하다. 본 발명의 프로드러그에 대한 선택적 표적 및 활성 효소인 내인성 세포내 효소의 예는 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 티미딜레이트 신타제(TS) 및 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)을 포함한다. 본 발명의 개념은 활성 효소인 티미딜레이트 신타제(TS)를 사용하여 예시된다. 그러나, TS의 사용은 단지 예지이며, 청구항이 TS를 표적으로 하는 시스템에 제한되는 것은 아니다. 티미딜레이트 신타제는 암의 치료에 대해 잘 특징된 표적이며, 또한 감염성 질환 표적으로서 이용되고 있다. 티미딜레이트 신타제는, 그것의 구조 및 기능의 높은 특성화 정도(Carreras and Sani (1995) Annu. Rev. Biochem. 64:721-726), 그것이 유전자 패밀리가 아니라, 단일 유전자, 예를 들어 GST에 의해 코드화된다는 사실, 그리고 마지막으로, 이 효소의 과발현이 화학치료법에 대한 내성 및 질환의 더욱 공격적인 진행을 예언하기(Johnston and Allegra (1995) Cancer Res. 55(7):1407-12) 때문에, 표적 활성 효소로서 예시된다.
한 구체예에서, 프로드러그는 본원에 더욱 상세히 정의된 바와 같은 구조를 갖는 화합물이다. 용어 "프로드러그"는 활성 치료제의 선구물질로 간주된다. 이상적인 프로드러그는 의도된 메카니즘에 의해 활성화될 때까지 제약학적으로 불활성인 것이다. 프로드러그 전략은 잠재적으로 독성인 치료법을 질환 부위에 표적화함으로써, 전신성 독성을 피하도록 의도된다. 다수의 접근법이 이 목표를 위해 만들어져 왔다. 암 치료법을 위한 프로드러그에 있어 첫번째 시도는 Mead, et al. (1996) Cancer Res. 26:2374-2379 및 Nichol and Hakala (1996) Biochem. Pharmacol. 15:1621-1623에 의해 보고되었다. 이 노력의 지도적 이론은 메토트렉세이트-내성 백혈병에서 과발현된 디히드로폴레이트 환원효소를 표적화하는 것이었다. 메토트렉세이트-내성 종양 세포에서 상승된 디히드로폴레이트 환원효소가 티미딜레이트 신타제로 지정된 대사 독성물질로 호모폴레이트를 전환시킨다고 가정됨에 따라, 종양 세포의 자가 중독이 기대되었다. 호모폴레이트의 크지 않은 항종양 효과는 대사 활성화가 아니라, 아마 세포로의 폴레이트 운반의 억제에 기인한다는 것이 이후 발견되었다(Livingston, et al. (1968) Biochem 7(8):2814-2818). 이것과, 이어진 치료법 개발을 위한 종양 선택적 표적 수단에 대한 프로드러그형 시도가 하기 표 1에 요약된다.
프로드러그 전략의 비교
기법 약자 설명 주요 참조문헌
대사 활성화 없음 "치사성 합성'에 의한 폴레이트유사체의 독소로의 전환. Mead et al. (1966)위와 동일
항체 지정프로드러그치료법 ADEPT 항체-효소 복합체가 종양 선택성항원에 결합한다.프로드러그가 투여되고 이것이항체 결합된 효소와 만날때활성화된다. Syrigos and Epenetos(1999) Anticancer Res.19 (1A): 605-13
유전자 지정프로드러그치료법 ADEPT 활성 효소를 코드화하는유전자가 큰 t세포로형질도입된다. Connors and Knox (1995)Stem Cells 13: 501-511
효소 지정프로드러그치료법 EDEPT 종양 부위에서만 높은 레벨로나타나는 세포외 효소에 의해활성화되는 프로드러그가투여된다. Breistol et al.(1998)Eur. J. Cancer 34(19): 1602-1606및 Bosslet et al.(1998) Cancer Res.58: 1195-1201.
종양 활성화된세포독성 'TAC' 글루타티온-S-트란스페라제에의해 활성화된 프로드러그 Morgan et al.(1998)위와 동일
효소 촉매치료 활성화 ECTA 프로드러그가 종양 억제 유전자상실 및 화학 치료법에 의한생체내 선택의 결과로서과발현된 효소에 의해활성화된다. 본 원에서 개시된바와 같음
다음의 쟁점 중 하나 이상이 이들 접근법을 곤란하게 한다: a) 활성 효소를 적합하게 위치시키는 것 및/또는 표적 효소의 종양 선택성 결여; b) 활성화된 프로드러그의 전신성 분포 및 결과적 독성; 및 c) 표적 효소 이외의 효소에 의한 활성화를 방지하기 위한 필요한 기질 효소 특이성의 달성. 예를 들어, Morgan, et al. (1998) Cancer Res. 58:2568-2575에 의해 설명된, GST에 대해 특이적인 글루타티온-s-트랜스페라제(GST) 프로드러그는 종양 과발현 GST-P1-1에 대해 특이적일 뿐만 아니라, GST-A1-1에 의해 활성화될 수도 있다. 이것은 부적합한 약물활성화 및 잠재적 독성을 초래한다. 이들 쟁점 중 대부분이 상기 표 1에 제공된 인용 공보에 더욱 상세히 논의된다. 본 발명의 방법 및 조성물은 종양 억제인자 유전자 상실에 이어서 발생하는 전사 활성화 및/또는 유전자 증폭에 의하여 종양 세포에서 선택적으로 과발현된 효소를 표적으로 하는 프로드러그를 제공함에 의해 선행 프로드러그의 기능부전을 피한다.
본 발명의 추가적 양태로서, 활성 효소는 대다수의 암(p53, RB 또는 p16 종양 억제인자 기능 중 어느 것을 상실한 것들)에서, 특히 플루오로피리미딘 치료법(5-FU, 5-FUdR, Xeloda) 또는 다른 TS 억제제(예를 들어, 토뮤덱스)에 노출된 암에서 과발현되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 프로드러그는 정상 세포에서 본질적으로 비독성인 것을 더 특징으로 한다. 이런 양태는, 비정상 또는 병에 걸린 세포만이 유효량의 프로드러그 독성 대사물질을 제공하여 세포 증식을 억제하거나, 또는 더 바람직하게는 세포를 선택적으로 죽이기 때문에, 프로드러그의 선택성을 더 증진시킨다. 실제로, 본 출원인은 정상량 이상의 활성 효소를 발현하는 세포가, 효소의 활성, 예를 들어 Roberts (1966) Biochem. 5(11):3546-3548의 방법에 의해 측정된 바의 TS 활성에 관계 없이, 본 발명의 방법 및 프로드러그에 의해 선택적으로 살해된다는 것을 처음으로 주목한다. 따라서, 용어 "과발현"은 트리튬 유리에 의해 측정된 바의 TS 효소 활성(Roberts (1966) 위와 동일)이 아니라, TS 단백질의 총량으로 간주된다. 이것은 하기 실험 섹션에서 증명된다.
제약학적 개발은 억제제에 중점을 둔다. 억제제에 대한 이론적 근거는 대부분의 종양 세포가 대부분의 정상 세포 보다 생체내에서 더욱 자주 분할한다는 것이다. 결과적으로, 종양 세포에서 TS의 평균량은 그것의 정상 대응물 보다 높다. 이들 화합물을 사용하여, 의미 있는 용량-제한 독성이 수반된 제한된 효능이 관찰되었다. 이들 화합물 중 가장 많이 사용되는 플루오로피리미딘은 20세기 중반에 개발되었고, 진행성 위장암의 치료에서 유용하다고 알려졌다(Heidelberger, et al. (1983) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 54:58-119). 5-플루오로우라실의 초기 개발은, 세포 배양물에서 우라실이 정상 세포 보다는 종양 세포에 의해 더욱 빠르게 대사된다는 Heidelberger의 관찰에 따른 추가적 토대 및 이론적 근거를 가졌다(Heidelberger, et al. (1957) Fluorinated pyrimidnes and their nucleosides in "Handbook of Experimental Pharmacology" pp. 193-231). 치료 반응율은 시종일관 25 내지 30% 근처에 머물러 있다. 치료를 받지 않은 환자는 보통 약 6개월 생존하고, 플루오로피리미딘 치료를 받은 환자는 1년까지 생존한다(Midgley and Kerr (1999) Lancet 353(9150):391-9 및 van Laar, Rustum, et al. (1998) Eur. J. Cancer 34(3):296-306).
생존의 극히 적은 증가가 TS 활성의 억제에 대한 다른 투약 전략 또는 새로운 접근법의 개발을 계속함에 따라 발생하고 있다. 예를 들어, 토뮤덱스와 같은 더욱 이상적인 TS 억제제의 개발은 생존에 의미 있는 개선을 가져오지 않지만, 토뮤덱스의 독성 프로파일은 플루오로피리미딘과는 구별된다(Blackledge (1998) Br. J. Cancer 77(Suppl. 2):29-37). 마지막으로, 플루오로피리미딘 치료 및 토뮤덱스 치료는 모두 TS 레벨의 증가를 초래하며, 의미 있는 교차-내성이 관찰된다. 플루오로피리미딘 기능부전은 또한 토뮤덱스에서도 다루기 어렵다(Farrugia (1998)Eur. J. Cancer 34(7):987-91). 이런 현재의 상황은 신규 메카니즘에 의해 5FU/토뮤덱스 내성 종양 세포를 공격하는 화학치료법을 개발함에 의해 타개될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는, 본원에 정의된 바와 같은 내인성 세포내 효소에 의해 세포에서 독소로 전환되는 치료량의 프로드러그를 피험자에게 투여함에 의해, 피험자에서 병적 세포를 치료하는 방법이다. 효소는 "과발현"되며, 치료되는 세포는 이상형성성 또는 암세포이다.
프로드러그가 마우스, 래트 또는 사람 환자와 같은 피험자에게 투여될 때, 프로드러그는 제약학적으로 허용되는 담체에 첨가되어, 전신적 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
유익하게 치료될 수 있는 환자를 결정하기 위해서, 종양 샘플이 환자로부터 절취되고, 세포가 표적 효소의 발현 레벨에 대해 분석된다. 발현이 정상 세포에서 발현된 것 이상이어서, 투여된 프로드러그의 독성량이 바람직하지 않은 부작용을 일으키지 않는다면, 종양 또는 세포는 유익하게 치료된다고 결정되고, 따라서 환자는 본 발명의 치료법에 적합하다. 예를 들어, 표적 효소가 정상 세포 보다 적어도 약 2배, 바람직하게는 약 3배 높게, 더 바람직하게는 4배 이상 발현된다면, 환자는 본 발명의 치료법 방법에 적합한 피험자이다. 치료량은 경험적으로 결정될 수 있으며, 치료될 병의 상태, 치료될 피험자 및 전환된 프로드러그 또는 세포 독소의 독성에 따라 변할 것이다.
동물에서, 방법은 프로드러그의 효능을 더 확인하는데 유용하다. 동물 모델의 예로서, 누드 마우스(Balb/c NCR nu/nu 암컷, Simonsen, Gilroy, CA)의 군들이약 105내지 약 109의 본원에 정의된 바와 같은 초증식성 암 또는 표적 세포로 각각 피하접종된다. 종양이 정착된 때, 프로드러그가, 예를 들어 종양 주위에 피하주사함에 의해 투여된다. 종양 크기의 감소를 측정하기 위한 종양 측정이 베니어 캘리퍼스를 사용하여 2차원으로 주 2회 행해진다. 다른 동물 모델이 또한 적합하게 사용될 수 있다. 이 방법이 하기 물질 및 방법 섹션에 예시된다.
생체내 투여는 치료 과정 동안 내내 1회 용량으로, 연속 또는 단속적으로 행해질 수 있다. 가장 효과적인 투여 수단 및 용량을 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 치료법에 사용되는 조성물, 치료법의 목적, 치료될 표적 세포, 및 치료될 환자에 따라 변할 것이다. 단일 또는 다수 투여가 주치의에 의해 선택되는 용량 레벨 및 패턴에 따라 실시될 수 있다. 적합한 용량 제제 및 프로드러그의 투여 방법은 하기에서 알 수 있다.
본 발명의 프로드러그 및 조성물은, 제약학적 조성물의 활성 성분과 같이, 종래의 과정에 따르는 투여에 의해 사람 및 다른 동물의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
제약학적 조성물은 경구, 비강내, 비경구 또는 흡입 치료법에 의해 투여될 수 있으며, 정제, 래즌즈, 과립, 캡슐, 알약, 앰플, 좌약 또는 에어로졸형의 형태를 취할 수 있다. 또한, 그것들은 수성 또는 비수성 희석제, 시럽, 과립 또는 분말 중의 활성 성분의 현탁액, 용액 및 에멀젼의 형태를 취할 수 있다. 본 발명의 화합물에 더하여, 제약학적 조성물은 다른 제약학적 활성 화합물, 또는 복수의 본발명의 화합물을 함유할 수 있다.
더욱 특별하게는, 본 발명의 구조식의 화합물이 또한 본원에서 활성 성분으로 간주되며, 경구, 직장, 비강, 국부(경피, 에어로졸, 구강 및 설하를 포함), 질, 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내를 포함) 및 폐를 포함하는, 어떤 적합한 경로에 의해 치료법을 위해 투여될 수 있다. 또한, 바람직한 경로가 레시피언트의 상태 및 나이, 그리고 치료될 질환에 따라 변할 것이라는 것이 인정될 것이다.
일반적으로, 상기 화합물 각각의 적합한 용량은 레시피언트의 kg 체중 당 일일 약 1 내지 약 100mg의 범위, 바람직하게는 kg 체중 당 일일 약 1 내지 약 50mg의 범위, 가장 바람직하게는 kg 체중 당 일일 약 1 내지 약 25mg의 범위내이다. 달리 나타내지 않았다면, 활성 성분의 모든 중량은 그것들의 염 또는 에스테르에 대해 본 발명의 구조식의 모화합물로 계산되며, 이 중량은 비례적으로 증가될 것이다. 바람직한 용량은 하루 동안 내내 적합한 간격으로 투여되는 2, 3, 4, 5, 6 이상의 하위-용량으로 바람직하게 제시된다. 이들 하위-용량은, 예를 들어 단위 용량 형태 당 약 1 내지 약 100mg, 바람직하게는 약 1 내지 약 25mg, 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 25mg의 활성 성분을 함유하는 단위 용량 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 조성물의 적합한 용량이 질환의 종류 및 심각성 및 단계에 좌우될 수 있으며, 환자에 따라 변할 수 있음이 인정될 것이다. 최적 용량의 결정은 일반적으로 본 발명의 치료의 어떤 위험 또는 해로운 부작용에 대한 치료적 유익함의 레벨을 조화시키는 것을 포함한다.
이상적으로, 프로드러그는 질환 부위에서 활성 화합물의 최고 농도를 달성하도록 투여되어야 한다. 이것은, 예를 들어 선택적으로 살린중의 프로드러그의 정맥주사에 의해, 또는 예를 들어 활성 성분을 함유하는 정제, 캡슐 또는 시럽으로서 경구 투여됨에 의해 달성될 수 있다. 프로드러그의 바람직한 혈중 레벨은 질환 조직 내에 활성 성분의 치료량을 제공하기 위한 연속적 주입에 의해 유지될 수 있다. 각각의 치료적 화합물 또는 방법이 단독으로 사용될 때 요구될 수 있는 프로드러그의 총용량을 저하시키고, 이로써 부작용을 감소시키는 치료적 조합을 제공하는, 효험 있는 조합의 사용이 고려된다.
암치료의 성질 및 기초적 접근법은 끊임없이 변화하고 있다. 이러한 변화 중 대부분은 질환의 분자 기초에 대한 더 나은 이해의 결과로서 발생한다. 이들 각각의 새로운 영역에서의 연구는 비악성 질환을 위한 실험적인, 또는 어떤 경우에는 일상적인 사용을 가져온다. 세포독성 항종양 치료법에 사용되는 이 같은 약물은 류마티스성 관절염(메토트렉세이트 및 시클로포스파미드), 기관 이식(메토트렉세이트 및 아자티오프린), 겸상혈구성 빈혈(히드록시우레아), 항-감염성 화학치료법(트리메트렉세이트 및 류코보린), 및 건선(메토트렉세이트)에 대한 치료 섭생의 중요한 성분이 된다. 따라서, 광범위한 의학적, 외과적, 및 소아과적 전문의들이 이상형성성 및 비이상형성성 질환을 위해 이들 약물을 사용한다. 질환 메카니즘의 이해는 또한, 암을 포함하는 질환을 치료하기 위한 약물 조합을 결정하는 더 나은 수단을 가져온다. 예를 들어, 상이한 화학치료법은 별개의 메카니즘에 의해 작용하며, 적합한 조합은 상승 효과를 가져올 수 있다는 것이 현재 알려져 있다. NB1011은 티미딜레이트 신타제에 의한 활성화에 의하여 작용하는 것 같고, 결과의이상 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 대사의 다수 단계를 방해한다고 제안된다(도 6). 별개의 메카니즘에 의해 작용하는 화학치료법 또는 생물제제와의 조합이 증진된 또는 상승적인 활성을 제공한다. 그러한 화합물의 예는 1) DNA 개재 및 자유 라디칼 형성을 포함하는 복합적 메카니즘에 의해 작용하는 독소루비신; 2) 복제 동안 DNA에서 단일 스트랜드 분열을 유도하는 토포테칸과 같은 토포이소머라제 억제제; 3) 항에스트로겐(예를 들어, 타목시펜) 또는 항안드로겐(예를 들어, 플루타미드)을 포함하는 항호르몬, 또는 인터페론(예를 들어, 인터페론 A)과 같은 생물제제를 포함한다. 후자의 경우에서, 항호르몬은 동일 기원의 호르몬에 의해 성장 자극을 방지하고, 인터페론은 세포내 뉴클레아제의 유도 및 암유전자 발현의 억제를 포함하는 다수의 경로를 유도한다. NB1011이 갖는 상승작용은 또한, 많은 세포 성분을 변형 및 불활성화하지만, 가장 중요하게는 DNA 회복 및 세포자살을 변형시키는, 질소머스타드 같은 알킬화제의 사용에 의해 보여진다.
본 발명의 더 이상의 양태는 본원에 설명된 프로드러그와 상술된 바와 같은 추가의 치료법을 조합하는 것이다. 예를 들어, 본원에 설명된 프로드러그가 본 발명의 프로드러그와는 다른 수단에 의해 독성 효과를 발휘하는 약물과 우선적으로 조합된다. 그러한 추가의 치료적 화합물은 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 안지오스타틴, 항에스트로겐, 및 토포이소머라제 억제제를 포함한다. 게다가, 본 발명의 프로드러그 및 방법은 종양의 총 근절을 위해 외과적 또는 방사선 치료법과 조합될 수 있다.
다양한 방법이 치료 방법의 목적이 충족되는지의 여부를 측정하는데 이용가능하다. 이것은 이것들에 제한되는 것은 아니지만, RT-PCR 분석, 성장 억제 연구(알라마르 블루 분석법) 및 플라그 분석법을 포함한다. 이들 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있고, 본원에 설명된다.
또한, 본 출원인은 기질 프로드러그로 치료된 세포가 종래의 치료법에 의해 적합하게 치료되는 이전 표현형으로 되돌아갈 수 있음을 발견했다. 예로서 TS를 사용하여, 본 출원인은 5-FU로 치료된 종양 세포가 약물에 내성으로 되는 것을 알았다. 이때, 세포는 NB1011로 치료되었다. 생존한 하위집단은 NB1011에 내성으로 되었지만, 5-FU에 대한 민감성을 회복했다(표 9 및 도 14 참조). 따라서, 본 발명은 유효량의 다른 제제가 본 발명의 기질 프로드러그와 공동 투여되는, 상술된 방법을 제공한다. 한 양태로서, 제 2 또는 제 3의 제제는 세포가 이미 내성을 가지고 있는 약물이다. 추가의 제제는 기질 프로드러그의 투여와 동시에 또는 이어서 투여될 수 있다.
본 발명은 대응 정상 세포, 예를 들어 동물 세포, 포유류 세포, 또는 사람 세포와 비교하여 병적 세포에 의해 과생산 또는 과발현된 활성 효소에 의해 선택적으로 전환되는 프로드러그를 더 제공한다. 본 출원인은 본 발명의 실행을 위한 몇개의 우선적인 프로드러그를 발견했다. 이들 화합물에 대한 구조 및 합성 방법은 하기 물질 및 방법에 제공된다.
본 발명의 다른 양태는 본원에 정의된 바와 같은 활성 효소에 의해 세포에서 독소로 선택적으로 전환되는 치료적 유효량의 프로드러그를 피험자에게 투여함에 의해, 피험자를 치료하는 방법이다. 다른 양태로서, 적어도 1개의 추가적 치료제의 유효량이 기질 프로드러그의 투여와 동시에 또는 이어서 공동 투여된다.
스크리닝 분석
본 발명은 활성 효소를 발현하는 적어도 2개의 시험 세포를 제공하고, 후보 프로드러그와 세포를 접촉시킴에 의한, 병적 세포에서 독소로 선택적으로 전환된 프로드러그를 스크리닝 하는 방법을 더 제공한다. 다음에, 효소에 의한 독성 제제로의 프로드러그의 활성화에 대해 분석한다. 한 구체예에서, 제 1 시험 세포는 상기 정의된 바와 같은 병적 세포이고, 다른 시험 세포는 효소를 정상 레벨로 발현하는 대응 정상 세포이다. 더 이상의 양태로서, 후보 프로드러그는 검출가능하게 표지된다. 한 구체예에서, 검출가능한 표지는 형광 마커이다. 추가의 구체예에서, 검출가능한 표지는 같은 원자, 예를 들어 브롬의 적어도 2개 이상의 가변적 동위원소이다. 이 구체예에서, 반응 생성물의 질량 분광법에 의해 독성 부생성물로의 프로드러그의 변형에 대해 분석할 수 있다. 독성 대사물질을 생성하는 후보 제제의 치료 잠재성은 독성 생성물을 정제하고, 다음에 병적 세포의 증식을 선택적으로 억제하는 능력을 분석함에 의해 확인되며, 이것은 정상 세포에 대해 식별가능한 독성을 생성하지 않는다고 확인된다. 더 이상의 확인은 상술된 바와 같은 적합한 동물 모델에 프로드러그 및 촉성 대사물질을 투여함에 의해 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 시험 세포는 효소를 발현하거나, 또는 달리 세포내 효소를 발현하도록 형질전환된 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 내포내 효소 TS를 내인성으로 발현하지 않는 원핵 대장균이 적합한 숙주 세포 또는 표적 세포이다. 대장균의 트랜스펙션은 하기 진핵 세포에 대해 설명된 것과 유사하게 실시된다. 또는 달리, 시험 세포는 피험자로부터 분리된 병적 세포, 또는 효소를 발현하는 배양 세포일 수 있다. 세포는 대조표준 대응물(표적 효소가 결여된), 또는 별개의 구체예에서, 표적 효소 또는 효소들을 상이하게 발현하도록 유전적으로 변형된 대응물(표적 효소의 레벨을 변화시키면서 발현함)을 가질 수 있다. 1종 이상의 효소가 별개의 숙주 세포를 개별적으로 형질전환하는데 사용될 수 있으며, 이로써 표적 효소에 대한 후보 약물의 효과가 다른 효소 또는 다른 종으로부터의 상응하는 효소에 대한 그것의 효과와 동시에 비교될 수 있다.
다른 구체예에서, 제 3의 표적 세포가, 하기 나타낸 화합물과 같은 강력한 프로드러그로 나타난 화합물의 유효량을 받을 수 있기 때문에, 양성 대조표준으로 사용된다.
Ras-형질전환 NIH 3T3 세포(ATCC 10801 University Blvd., Manassas, VA 201 10-2209, U.S.A.)가 적합한 진핵 세포이다. 이 세포는 효소를 코딩하는 클론된 cDNA로부터 관심의 표적 효소의 양을 가변적으로 증가시키면서 발현하도록 조작된다. 트랜스펙션은 본 분야에 잘 공지되고, Sambrook 등(위와 동일)에 설명된 과정을 사용하는 일시적 또는 영구적 트랜스펙션이다. cDNA의 삽입을 위한 적합한 벡터는 Stratagene, La Jolla, CA 및 다른 판매자로부터 상업적으로 입수가능하다. 각각의 트랜스펙션된 셀라인에서 효소의 발현 레벨이, 면역-검출용 효소에 대해 이미 발생된 단일클론 또는 다중클론 항체를 사용하는, 세포 용해물의 면역블롯 및 효소 분석법에 의해 모니터될 수 있다. 발현량은 세포로 도입된 발현 카세트의 카피수에 의해, 또는 프로모터 용법을 변화시킴에 의해 조절될 수 있다. 또한, 발현된 효소의 양을 검츨하기 위한 효소 분석법이 Carreras 및 Santi (1995)(위와 동일)에 의해 검토된 바와 같이, 또는 하기 설명된 방법에 의해 수행될 수 있다.
시험 세포는 작은 멀티-웰 플레이트에서 성장될 수 있으며, 시험 프로드러그의 생물학적 활성을 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 성공적인 후보 약물은 병적 세포의 성장을 억제하거나, 또는 그것을 죽이지만, 대조표준 세포 종류는 손상되지 않고 남아있을 것이다.
후보 프로드러그는 세포 배양 배지에 직접적으로 첨가되거나, 또는 세포 표면 리셉터에 대한 특이적 리간드에 미리 콘쥬게이트된 후 배지에 첨가될 수 있다. 세포 특이적 운반을 위한 콘쥬게이트 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,459,127, 5,264,618, 및 공개 특허 명세서 WO 91/17424 (1991년, 11월 14일 공개) 참조. 후보 프로드러그의 이탈기는, 예를 들어 트리튬을 사용하여 검출가능하게 표지될 수 있다. 다음에, 표적 세포 또는 배양 배지가 후보 프로드러그로부터 유리된 표지량에 대해 분석된다. 또는 달리, 세포 흡수가 본 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 리포솜으로 프로드러그를 포장함에 의해 증진되거나, 또는 본 분야에 또한 잘 공지된 바와 같이, 시토펙틴과 조합될 수 있다.
항상 명백한 바는 아니지만, 각각의 구체예가 하기 나타낸 화합물과 같은, 강력한 프로드러그로 나타난 화합물의 유효량을 받음으로써 대조표준으로서 작용하는 별개의 표적 세포를 제공함에 의해 더 변형될 수 있음이 이해되어야 한다.
본 방법에 의해 확인된 제제들이 본원에서 더 제공된다.
상기 스크리닝을 사용하여, 또한 사람 환자와 같은 피험자로부터 취해진 샘플에 대한 몇개의 프로드러그를 예비-스크리닝할 수 있다. 각 표적 효소 및 환자에 대한 가장 효과적인 기질 프로드러그 및 치료법을 결정하기 위해 스크리닝을 사용할 수 있다. 본 방법은 상기에 더욱 상세히 설명된다.
본 발명의 프로드러그
I. 물질 및 방법
A. 합성 방법
(E)-5-(2-브로모비닐)-2'-디옥시우리딘(BVdU)을 Dyer 등(Dyer, et al. (199 1) Nucleic Acid Chemistry: Improved and New Synthetic Procedures, Methods and Techniques, Townsend, et al. (eds) John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 79-83)의 방법에 의해 제조했다. 이것 및 상업적(Fisher/Acros) 5-플루오로-2'-디옥시우리딘(5FdU)을 각각 사용하기 바로 전에 P2O4에 인접한 75℃에서 진공하에 건조시켰다. 흡착제로서 형광 지시약을 사용하는 Merck 실리카겔-60을 사용하여, 방사상 크로마토그래피를 크로마트론 장치(Harrison Research, Palo Alto, CA)에서 수행했다. (E)-5-(2-브로모비닐)-2'-디옥시우리딘 5'-모노포스페이트("BVdUMP")를 BVdU의 표준 화학적 인산화에 의해 제조했다.
NMR: 1H NMR 스펙트럼을 헥사듀테리오-디메틸 술폭시드(C2H3)2SO 용액을 사용하여, 300MHz Varian Associates Gemini 분광기에서 기록했다. 화학적 이동을 d= 0.0ppm의 내부 테트라메틸실란 기준에 상대적으로 기록했다.13C NMR 스펙트럼을 75MHz에서 기록하고, 화학적 이동을 d=39.5ppm의 내부 펜타듀테리오-디메틸 술폭시드에 상대적으로 기록했다.31P NMR 스펙트럼을 202MHz Bruker 분광기에서 기록하고, 화학적 이동을 d=0.0ppm의 외부 85% H2O/15% H3PO4vol/vol에 상대적으로 기록했다.
NB1011: ((E)-5-(2-브로모비닐)-2'-디옥시-5'-우리딜 페닐 L-알라닌일포스포르아미데이트(BVdU-PA, "NB1011"))을 다음과 같이 제조했다. 아르곤하의 무수 DMF 2mL 중의 BVdU(420mg, 1.26mmol) 및 이미다졸(103mg, 1.51mmol) 용액을 페닐-L-메톡시알라닌일포스포로클로리데이트(McGuigan, et al. (1996) J. Med. Chem. 39:17 49-1753)로 적하처리(15방울, 350mg, 1.26mmol)하고, 반응 혼합물을 24시간 동안 아르곤하에 23℃에서 교반했다. 용리액으로서 10% MeOH/90% CH2Cl2vol/vol를 사용하는 실리카겔 TLC에 의해, 출발 물질로부터 전환 생성물(Rf=0.07)의 생성이 발생했지만 부분적(약 15%)이었고, 그래서 추가의 이미다졸(52mg, 0.75mmol) 및 포스포로클로리데이트 시약(8방울, 175mg, 0.63mmol)을 가하고, 혼합물을 다시 24시간 동안 아르곤하에 23℃에서 교반했다. TLC에 의해, 전환이 약 30% 정도로 증가되었다. 포스포로클로리데이트 및 이미다졸을 사용한 이어지는 처리는 반응의 진행을 거의 촉진시키지 않았다. 용액을 약 40℃에서 진공하에 회전식 증발에 의해 0.75mL로 부피를 감소시키고, 다음에, 같은 부피의 CH2Cl2를 가하고, 용액을 건조 4mm 실리카겔 크로마토트론 플레이트에 직접 적용시켰다. 이 시점에서, 30분간 진공 데시케이터에 플레이트를 둠으로써 벌크한 잔류 DMF를 제거하여, 이어지는 분리를 용이하게 했다. CH2Cl2(잔류 시약 및 DMF를 용리하기 위해) 250mL, 이어서 10% MeOH/90% CH2Cl2vol/vol(생성물 및 이어서 출발 물질을 용리하기 위해)를 사용하는 방사상 크로마토그래피로 중간체 144mg(20%) 및 출발 물질 294mg를 얻었으며, 미전환 출발 물질을 기초로 한 전환 생성물의 수율은 67%이다. 오염된 이미다졸(d=7.65 및 7.01) 또는 DMF(d=7.95, 2.89, 및 2.73)의 존재가1H NMR에 의해 검출되었다면, 추가의 방사상 크로마토그래피 정제를 수행했다. 이 방식으로, TLC 및1H NMR에 의한 순도 98%의 전환 생성물을 기름/검 또는 거품이 이는 분말 형태로 거의 등몰랄 혼합물의 인중심-기제 부분입체이성질체로서 얻었다.1H NMR((C2H3)2SO) d=11.4(bs,2H2O로 교환, 1, N3H), 8.28(위-t, 1, H6), 7.35(위-t, 2, o-Ph), 7.31(d, 1, 비닐1H), 7.20 (위-t, 3, m 및 p-Ph), 6.89(d, 1, 비닐2H), 6.19(t, 1, H1'), 6.08(t,2H2O로 교환, 1, 알라닌일 NH), 5.45(bs,2H2O로 교환, 1, O3'H), 4.32(m, 1, H3'), 4.22(m, 2, 5'CH2), 3.97(m, 1, H4'), 3.86 (t, 1, 알라닌일 CH), 3.58(2s, 3, CO2Me), 2.15 (m, 2, 2'CH2), 1.23(위-t, 3, 알라닌일 CH3). J비닐CH-비닐CH=13.5, JH1'-H2'~ 6.8, JH2'-H3'~5, JH3'-H4'~0, J알라닌일CH-알라닌일NH~6Hz. 스펙트럼 지정은 1H/1H COSY 2D NMR 분석에 의해 확인했다.13C NMR((C2H3)2SO)) d=173.7 및173.6(알라닌일 CO2), 162.1 및 161.6(C2), 150.6, 150.5(입소-Ph), 149.2(C4), 139.4 및 139.2(C6), 129.8 및 129.6(m-Ph), 124.7(p-Ph), 120.3, 120.2(o-Ph), 107.1(비닐 C1), 87.5(비닐 C2), 84.8(C4'), 83.8(C1'), 70.1(C3'), 66.1(C5'), 51.9(알라닌일 OMe), 49.7(알라닌일 α-H), 29.5(C2'), 19.6(알라닌일 α-Me). 3JP-C4'=7.8, 2JP-C5'=3.69. 저분해능 DCI(NH3) 질량: 593/591(MNH4 +), 576/574 (MH+).
단지 편의를 위해서, 본 발명의 방법에 유용한 프로드러그의 구조를 I형 및 II형으로 분류했다.
I형 화합물의 일반적 합성
I형 화합물의 L 및 D 이성질체는 다음 구조식을 갖는다:
상기 구조식에서, R1(5-위치)은 피리미딘 고리로부터의 추출과 양립할 수 있는 분자 치수 및 친전자성을 갖는 화학적 실체인 이탈기이거나 또는 그러한 이탈기를 함유하며, 이것은 피리미딘 고리로부터의 유리된 때 세포의 증식을 억제하거나, 또는 세포를 죽이는 능력을 갖는다.
상기 구조식에서, Q는 당, 탄소환식 또는 비환식 화합물, 또는 그것들의 차폐된 포스페이트 또는 포스포르아미데이트 유도체이다. 당기, 티오-당기로 구성된 군으로부터 선택된 화학적 실체인 Q는 탄소환식기 및 그것들의 유도체이거나 또는 그러한 유도체를 함유한다. 당기의 예는 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 옥세탄(4-원고리당), 푸라노스(5-원고리당), 및 피라노스 (6-원고리당)로부터 유도된 것들과 같은 일당류 환식당기를 포함한다. 푸라노스의 예는 트레오-푸라노실(트레오스로부터, 4-탄당); 에리트로-푸라노실(에리트로스로부터, 4-탄당); 리보-푸라노실(리보스로부터, 5-탄당); 아라-푸라노실(또한 주로 아리비노-푸라노실로 간주됨; 아라비노스로부터, 5-탄당); 크실로-푸라노실(크실로스로부터, 5-탄당); 및 리소-푸라노실(리소스로부터, 5-탄당)을 포함한다. 당기 유도체의 예는 "디옥시", "케토", 및 "디히드로" 유도체 뿐만 아니라, 치환된 유도체도 포함한다. 티오-당기의 예는 고리 산소가 황 원자로 대체된 상기 당기의 황 유사체를 포함한다. 탄소환식기의 예는 C4탄소환기, C5탄소환기, 및 C6탄소환기를 포함하며, 이것은 -OH 기와 같은 1개 이상의 치환기를 더 가질 수 있다.
한 구체예에서, Q는 다음 구조식의 β-D-리보푸라노실기이다.
상기 식에서, R7은 H, 차폐된 포스페이트 또는 포스포르아미데이트 및 그것들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되고, R2및 R3은 동일하거나 또는 상이하며,독립적으로 -H 또는 -OH이다.
상기 구조식의 어떤 구체예에서, R1은 알킬렌기, 즉 (-CH=CH)n-R4이며, 여기에서 n은 0 또는 1 내지 10의 정수이고, R4는 I, Br, Cl 또는 CN과 같은 할로겐, 또는 수은이다. R2는 H이고 R3은 -OH이거나, R2는 OH이고 R3은 H이거나, 또는 R2및 R3은 H이거나, 또는 R2및 R3은 OH이다.
다른 양태로서, R4는 H, 알킬, 알켄일, 알킨일, 히드록시 1, -O-알킬, -O-아릴, O-헤테로아릴, -S-알킬, -S-아릴, 시아나이드, 시아네이트 및 티오시아네이트 할로비닐기, 할로수은기, -S-헤테로아릴, -NH2, -NH-알킬, -N(알킬)2, -NHCHO, -NHOH, -NHO-알킬, NH2CONHO-, 및 NHNH2로 구성된 군으로부터 선택된 기이거나 또는 그러한 기를 함유한다. 이들 구체예에서, 더 이상의 양태는 R2및 R3이 H이거나; R2가 OH이고 R3이 H이거나; R2가 H이고 R3이 OH이거나; 또는 R2및 R3이 OH인 것을 포함한다.
R1위치의 치환기에 대한 바람직한 구체예는 알릴 상호교환을 당할 수 있는 것이다.
다른 양태로서, 후보 치료제는 다음 구조식의 화합물이다.
상기 식에서, n은 0 내지 10의 정수이고, A는 인 유도체이거나, 또는 구조식
의 화합물이며,
상기 식에서, Q는 H, 상기 정의된 바와 같은 비치환 또는 치환 당 및 상기 정의된 바와 같은 치환 또는 비치환 탄소환으로 구성된 군으로부터 선택된다.
여기에서, R은 2'-디옥시-5-우리딜이고, m은 0 또는 1이고, n은 0 내지 10의 정수이다.
적합한 경우, 화합물은, 예를 들어 D- 또는 L-형을 포함하는 그것들의 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 또는 입체이성질체 형태 중 어느 것 일 수 있으며, 예를 들어 α- 또는 β-아노머형을 포함하는 어떤 입체화학 구조일 수 있다.
상기 기재된 5-치환 피리미딘 뉴클레오시드 및 5-치환 피리미딘 뉴클레오시드 모노포스페이트의 합성은 본 분야에 잘 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.예를 들어, Li2PdCl4의 존재하에 할로알킬 화합물, 할로아세테이트 또는 할로알켄을 사용한 5-클로로머큐리-2'디옥시우리딘의 처리는 유기팔라듐 중간체를 거쳐 각각 5-알킬, 5-아세틸 또는 5-알켄 유도체의 형성을 가져온다. 피리미딘 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드의 C5-변형의 다른 예는, Li2PdCl4의 존재하에 아세트산수은을 사용하여 비보호 뉴클레오티드를 처리하고, 이어서 스티렌 또는 고리-치환 스티렌을 첨가함에 의한 C5-트랜스-스티릴 유도체의 형성이다. Bigge, et al. (1980) J. Am. Chem. Soc. 102(6):2033-2038. 3시간 동안 50℃에서 아세테이트 완충액중의 아세트산수은을 사용한 처리에 의해 피리미딘 고리의 5-위치에 수은을 갖는 피리미딘 디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트가 유도되었다. Dale, et al. (1973) PNAS 70(8):238-2242. 그러한 처리는 또한 모노포스페이트의 변형을 위해 효과적일 것으로 기대된다. 또는 달리, 변형된 트리포스페이트는, 예를 들어 알칼리성 포스파타제를 사용한 조정된 처리와, 이어서 모노포스페이트의 정제에 의해 변형된 모노포스페이트로 효소적으로 전환될 수 있다. 수은과 유사한 분자 특성을 갖지만, 제약학적 특성이 바람직한 유기 또는 비유기인 다른 작용기가 치환될 수 있다. 치환된 피리미딘의 합성을 위한 일반적 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 4,247,544; 4,267,171 및 4,948,882, 및 Bergstrom, et al. (1981) J. Org. Chem. 46(7):1432-1441 참조. 상기 방법은 또한 리보스 또는 2'-디옥시리보스 이외의 당, 예를 들어 2',3'-디디옥시리보스, 아라비노스, 푸라노스, 리소스, 펜토스, 헥소스, 헵토스 및 피라노스를 함유하는 5-치환 피리미딘 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유도체의 합성에 적용될 수 있다. 5-위치 치환의 예는 할로비닐기, 예를 들어, E-5-(2-브로모비닐)-2'-디옥시우리딜레이트이다. Barr, et al. (1983) 위와 동일. 본 발명의 목적을 위하여, 상기 구조식의 2가지 구체예의 합성이 하기 설명된 바와 같이 합성되었다.
또는 달리, 5-브로모디옥시우리딘, 5-요도디옥시우리딘, 및 그것들의 모노포스페이트 유도체가 Glen Research, Sterling, VA(USA), Sigma-Aldrich Corporati-on, St. Louis, MO(USA), Moravek Biochemicals, Inc., Brea, CA(USA), ICN, Costa Mesa, CA(USA) 및 New England Nuclear, Boston, MA(USA)로부터 상업적을 입수가능하다. 상업적으로 입수가능한 5-브로모디옥시우리딘 및 5-요도디옥시우리딘은 Glen Research, Sterling, VA(USA) 및 ICN, Costa Mesa, CA(USA)로부터 상업적으로 입수가능한 시약을 사용한 키나제 효소의 작용을 통해, 화학적 또는 효소적으로 그것의 모노포스페이트로 전환될 수 있다. 이들 할로겐 유도체는 다른 치환기와 조합되어 신규의 더욱 강력한 항대사물질을 만들 수 있다.
II형 화합물의 일반적 합성
II형 화합물을 4가지 부류의 화합물을 포함한다. 각 부류는 우라실 염기, 또는 변형된 우라실 염기의 구조에 의해 정의된다. 이들 부류는 I) 염기가 우라실의 푸라노-피리미디논 유도체이고, II) 염기가 6-푸라노 우라실이고, III) 염기가 4-히드라존 치환 우라실 유도체이고, IV) 염기가 우라실인, ECTA 화합물이다. 우라실 또는 변형된 우라실 유도 염기는 5-위치에서 독성 이탈기로 치환되고, 이 5-위치에서 전자 콘딧 테더에 의해 부착되고, 전자 콘딧과 독성 이탈기 사이의 적합한 스페이서 부분을 포함하는 화합물을 합성하는데 사용된다. ECTA 화합물은 인산화되지 않은, 5'-모노포스페이트, 5'-포스포디에스테르, 또는 5'-보호된("차폐된") 디옥시우리딘 또는 R7위치에 다른 탄화수소 작용기를 갖는 비교가능한 유도체일 수 있는 "Q"를 함유하며, 하기 설명된 바와 같다. 보호된 5-치환 디옥시우리딘 모노포스페이트 유도체는 포스페이트 작용기가 적합한 화학적 보호기의 부착을 통해 차단된 것들이다. 5-치환 디옥시우리딘 모노포스페이트 유도체의 보호는 용해성을 개선시키고, 세포 침투를 용이하게 하고, 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 통과를 용이하게 하고, 세포 또는 세포외 포스페이트의 작용을 방지할 수 있으며, 다르게는 포스페이트기의 상실을 가져올 수 있다. 다른 구체예에서, 5-치환 우라실 또는 우리딘 유도체는 뉴클레오시드 키나제 활성을 함유하는 세포에 투여되며, 여기에서 5-치환 우라실/우리딘 유도체는 5-치환 우리딘 모노포스페이트 유도체로 전환된다. 또한, 우리딘 유도체는 그것들의 용해성, 세포 침투, 및/또는 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 능력이 증가되도록 변형될 수 있다.
5-치환 우리딘 모노포스페이트 유도체에 대한 티미딜레이트 신타제의 작용은 피리미딘 고리의 5-위치에 부착된 치환기("이탈기")를 유리할 수 있다. 다음에, 유리된 치환기는, 본래 또는 다른 세포 성분과의 반응 후, 세포 증식의 독소 또는 억제제로 작용할 수 있다.
본 발명의 화합물의 L 및 D 이성질체는 하기 나타낸 구조식을 갖는 화합물로구성된 군으로부터 선택된다:
상기 구조식에서, R1은 구조식
의 부분이다.
상기 식에서, R2는 2가 전자 콘딧 부분이거나 또는 그러한 부분을 함유한다. 한 구체예에서, R2는 피리미딘 고리로부터 떨어져서 그리고 이탈기 R1을 향해 전자를 콘덕트하도록 작용하는 모노- 또는 폴리불포화 전자 콘딧이거나 또는 그러한 부분을 함유한다. 단, I형 화합물에서 n은 0일 수 있다. 한 구체예에서, R2는 불포화 히드로카르빌기, 1개 이상의 불포화 히드로카르빌기를 포함하는 방향족 히드로카르빌기, 및 1개 이상의 불포화 히드로카르빌기를 포함하는 헤테로방향족기로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서, MISO 및 R2는
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 불포화 히드로카르빌기이다.
한 구체예에서, R2및 R3은 함께
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 형성한다.
한 구체예에서, R2는
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 방향족 히드로카르빌기이다.
한 구체예에서, R2는
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 헤테로방향족기이다.
여기에서, J는 -O-, -S- 또는 -Se-와 같은 헤테로 원자, 또는 -NH- 또는 -NRALK-와 같은 헤테로 원자기이며, 여기에서 RALK는 1 내지 10 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지 알킬 또는 3 내지 10 탄소 원자를 갖는 시클로알킬기이다.
상기 구조식에서, R3은 2가 스페이서 부분이며, 또한 스페이서 단위로서 간주된다. 한 구체예에서, R3은
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 2가 스페이서 부분이다.
여기에서, R5동일하거나 상이하고, 독립적으로 1 내지 10 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지 알킬기, 또는 3 내지 10 탄소 원자를 갖는 시클로알킬기이거나, 또는 R5는 할로겐(F, Cl, Br, I)이다.
한 구체예에서, R3은
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 2가 스페이서 부분이다.
한 구체예에서, R3은
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 2가 스페이서 부분이다.
상기 구조식에서, n은 0 또는 1 내지 10의 정수이고, m은 0 또는 1이다. 한 구체예에서, n은 0 또는 1 내지 10의 정수이고, m은 1이다. 한 구체예에서, n은 0이고, m도 0이다. 한 구체예에서, R7이 -H일 때, n은 0이 아니다. 한 구체예에서, R7이 -H일 때, m은 0이 아니다. 한 구체예에서, R7이 -H일 때, n은 0이 아니고 m도 0이 아니다. 한 구체예에서, R7이 -H일 때, R4는 할로겐(즉, -F, -Cl, -Br, -I)이 아니다. 한 구체예에서, R7이 -H일 때, m은 0이고, R4는 할로겐(즉, -F, -Cl, -Br, -I)이 아니다. 한 구체예에서, R7이 -H일 때, m은 0이고 n도 0이며, R4는 할로겐(즉, -F, -Cl, -Br, -I)이 아니다.
상기 구조식에서, R4는 톡소포어 부분이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "톡소포어"는 활성 효소에 의한 피리미딘 고리로부터의 추출과 양립할 수 있는 분자 치수 및 친전자성을 갖는 화학적 실체인 이탈기이거나 또는 그러한 이탈기를 함유하는 부분을 의미할 것이며, 이것은 효소에 의해 피리미딘 고리로부터 유리된 때, 세포의 증식을 억제하거나 또는 세포를 죽이는 능력을 갖는다.
한 구체예에서, 톡소포어는 세포에서 과발현된 세포내 효소에 의해 활성화되거나 또는 유리되는 이탈기이거나 또는 그러한 이탈기를 함유한다. 한 구체예에서, R4는
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 기이거나 또는 그러한 기를 함유한다.
여기에서, X는 각 위치에서 동일하거나 상이하며, -Cl, -Br, -I, 또는 다른 강력한 이탈기(이것들에 제한되는 것은 아니나 -CN, -OCN, 및 -SCN 포함함)이고; Y는 각 위치에서 동일하거나 상이하며, 독립적으로 -H 또는 -F이고; Z는 동일하거나 상이하며, 독립적으로 -O- 또는 -S-이고, R8및 R9는 저급 알킬이고, R10은 H 또는 CH3이다.
한 구체예에서, R4는 -Br, -I, -O-알킬, -O-아릴, O-헤테로아릴, -S-알킬, -S-아릴, -S-헤테로아릴, -CN, -OCN, -SCN, -NH2, -NH-알킬, -N(알킬)2, -NHCHO, -NHOH, -NHO-알킬, NH2CONHO-, NHNH2, -N3, 및
와 같은 시스-플라틴의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 화학적 실체이거나 또는 그러한 실체를 포함한다.
상기 구조식에서, Q는 I형 화합물에 대해 설명된 바와 같고, 따라서 프로드러그와 효소, 예를 들어 TS 또는 TK의 기능적 결합을 지지하는 부분이거나 또는 그러한 부분을 함유한다. 한 구체예에서, Q는
로 구성된 군으로부터 선택된다.
여기에서, R6은 각 위치에서 동일하거나 상이하며, 독립적으로 -H, F, OH, -OC(=O)CH3, 또는 보호된 히드록실기(이것들에 제한되는 것은 아니지만, 벤조일 -COC6H5, 및 톨루오일 -COC6H4CH3을 포함함)이고; R7은 5'-위치에서 Q에 부착되며, 수소, 포스페이트기, 포스포디에스테르기, 포스포르아미데이트기, 또는 다른 인함유기이다.
한 구체예에서, Q는
이다.
한 구체예에서, R7은 수소이다. 다른 구체예에서, R7은 포스페이트기, 차폐된 포스페이트기, 포스포디에스테르기, 또는 포스포르아미데이트기이다. 바람직한구체예에서, R7은 포스포르아미데이트기이다.
한 구체예에서, R7은, 예를 들어 20개의 천연 아미노산을 포함하는 아미노산으로부터 유도된 포스포르아미데이트기이다. 한 구체예에서, R7은 알라닌으로부터 유도된 포스포르아미데이트기이다. 한 구체예에서, R7은 구조
를 갖는 기이거나 또는 그러한 기를 함유한다.
상기 기 및 그것의 제조 방법은 McGuigan, et al. (1993) J. Med. Chem. 36: 1048-1052 및 McGuigan, et al. (1996) J. Med. Chem. 39: 1748-1753에 설명된다.
한 구체예에서, R7은 트립토판으로부터 유도된 포스포르아미데이트기이다. 한 구체예에서, R7은 구조
를 갖는 기이거나 또는 그러한 기를 함유한다.
상기 기 및 그것의 제조 방법은 Abraham, et al. (1996) J. Med. Chem. 39: 4569-4575에 설명된다.
한 구체예에서, R7은 포스페이트기이다. 한 구체예에서, R7은
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 기이거나 또는 그러한 기를 함유한다.
2개 기들 중 첫번째 및 그것의 제조 방법은 Freed, et al. (1989) Biochem. Pharmacol. 38:3193-3198; Sastry, et al. (1992) Mol. Pharmacol. 41:441-445; Arquhar, et al. (1994) J. Med. Chem. 37:3902-3909 및 Farquhar, et al. (1995) J. Med. Chem. 38:448-495에 설명된다. 2개 기들 중 두번째 및 그것의 제조 방법은 Valette, et al. (1996) J. Med. Chem. 39:1981 및 Benzaria, et al. (1996) J. Med. Chem. 39, p. 4958에 설명된다.
한 구체예에서, R7은
(여기에서, R은 방향족 치환기이다)
로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 기이거나 또는 그러한 기를 함유한다.
2개 기들 중 첫번째 및 그것의 제조 방법은 Meier, et al. (1997) Bioorg. Med. Chem. Lett. 7:1577; Meier, et al. (1997) Bioorg. Med. Chem. Lett 7:99; 및 Meier, et al., (1997) International Antiviral News. 5:183에 설명된다. 2개 기들 중 두번째 및 그것의 제조 방법은 Hostetler, et al. (1997) Biochem. Pharmacol. 53:1815; 및 Hostetler 등의 공개된 국제 특허 출원 No. WO 96/40088 (1996)에 설명된다.
한 구체예에서, R7은 Q 내에 고리기를 형성한다. 한 그러한 구체예 및 그것의 제조 방법을 하기 나타낸다(여기에서, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸이고, Boc는 t-부틸옥시카르보닐이고, DCC는 1,3-디시클로헥실카르보디이미드이고, 4-DMAP는 4-디메틸아미노피리딘이다).
한 구체예에서, 화합물은 D-형, L-형, α-아노머형, 및 β-아노머형을 포함하는 어떤 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 또는 입체이성질체 형태일 수 있다.
한 구체예에서, 화합물은 염 형태, 또는 보호된 또는 프로드러그 형태, 또는 그것들의 조합, 예를 들어 염, 에테르, 또는 에스테르일 수 있다.
별개의 구체예에서, 상기 구조들은 하기 방법을 사용하여, 포스포디아지리딘기 대신에 트리포스포디아지리딘으로 진행하도록 더 변형될 수 있다.
우라실의 5-위치에 있는 구조들은, 그것들이 제안된 이탈기(톡소포어)와 헤테로고리를 연결하기 때문에, 테더로서 간주된다. 예를 들어 사람 TS의 활성 부위에 있는 Cys 잔기와의 반응에 의한 헤테로고리의 활성화에 의하여, 음전하가 우라실의 6-위치로부터 테더로 이동된다. 이 메카니즘은 BVDU(Barr, et al. (1983) Biochemistry 22:1696-1703) 및 (E)-5-(3,3,3-트리플루오로-1-프로페닐)-2'-디옥시우리딘(TFPe-dUrD)(Wataya, et al. (1979) J. Med. Chem. 22: 339-340; Santi (1980) J. Med. Chem. 23:103-111; 및 Bergstrom, et al. (1984) J. Med. Chem. 27:279-284)의 5'-일인산화 버전에 대해 설명되었다.
독소와 dNMP 사이의 테더 "스페이서"는 불포화되어야 하며, 이로써 TS-Cys-술프히드릴 어택에 의해 공급된 독소-불안정화 음전하를 이동시킬 수 있다. 이런 목적을 위해 이용할 수 있는 많은 불포화 유기 작용기 중, 비닐, 알릴 및 프로파르길 단위가 간단하고, 작고, 쉽게 합성적으로 접근가능하다. 비닐 및 알릴 단위가 그것들이 2개의 비-내부전향성 기하 이성질체 형태 중 어느 것으로 제조될 수 있기 때문에 유리하다. 따라서, 그것들은 TS 활성 부위에 의한 프로드러그 적응의 "프로브"로서 사용될 수 있다. 한편, 프로파르길는 원통형 대칭의 이점을 가지며, 이로써 이 종류의 테더로부터 TS-촉매 독소 유리는, 비닐 및 알릴 분자를 사용한 경우에서처럼, dUMP의 우라실 고리에 있어서 그것의 배향에 좌우되지 않는다.
본 발명의 뉴클레오티드-기제 프로드러그을 디자인하기 위해 2가지의 별개의접근법을 취하였다. 한가지는 BVDU 모노포스페이트의 구조를 기초로 하며, dUMP의 C5에서 (폴리)비닐 치환기의 말단에 직접 부착된 이탈기/독소를 특징으로 한다. 이것은 비닐 테더 접근법이다. 다른 한가지는 TFPe-dUMP의 구조를 기초로 하며, 첫번째와 유사하지만 이탈기/독소를 분리하는 메틸렌 단위 및 불포화 단위를 가지고, 따라서 알릴 또는 프로파르길 단위를 함유한다. 이것은 알릴 테더 접근법이다. 알릴 테더 접근법의 프로파르길 버전의 활성화 메카니즘은 5-에티닐-2'-디옥시우리딘 5'-모노포스페이트(EdUMP) 및 5-(3-히드록실-1-프로피닐)-2'-디옥시우리딘 5'-모노포스페이트(HOPdUMP)와 TS의 상호작용의 전례를 가진다(Barr et al. (1981) J. Med. Chem. 24:1385-1388 및 Barr et al. (1983) 위와 동일). EdUMP는 TS(Ki=0.1TM )의 강력한 억제제이며, 활성 부위에서 알렌-기제 종을 형성하기 쉽다. HOPdUM P(Ki=3.0TM)은 보기 드문 억제 키네틱을 나타내며, 이것은 활성 부위에서 쿠물렌-기제 종의 형성에 기인할 수 있다.
비닐 및 알릴 테더 접근법 메커니즘 모두에 공통적인 중간체와 구조상 유사한 5-알킬변성 5,6-디히드로우라실이 최근 합성되었다(Anglada et al. (1996) J. Het-erocycl. Chem. 33:1259-1270). 이들은 고도의 친전자성을 나타냈다. 5-(에톡시메틸)우라실을 생성하기 위한, 이들의 에탄올과의 준비된 반응은 컴패턴트 TS를 촉매적으로 재생성하는 물 첨가를 전례로 한다. 훨씬 최근에, 길게 포착하기 어려운 TS에 의해 생성된 C5 메틸렌 중간체가 트랩핑 연구에 의해 증명되었다(Barrett et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:449-450).
프로파르길 테더를 사용한 ECTA 화합물의 합성
프로파르길 및 알릴 알콜-장착 2'-디옥시우리딘의 합성은 간단하다. 이들의 다수 및 가까운 유도체가 문헌에 보고되며, 일부는 TS와 관련하여 연구되고 있다. 예를 들어, 5-(3-메톡시-1-프로피닐) 및 5-(3-히드록시-1-프로피닐)을 포함하는 5-알키닐-dUMP가 TS 억제제로서 시험되었으며(Barr et al. (1981) J. Med. Chem. 24: 1385-1388), 이들 중 일부는 TS-손상 암세포의 DNA에 결합되는 것으로 나타났다 (Balzarini et al. (1985) FEBS Lett 373(1):41-4).
5-머큐리-(Ruth et al. (1978) J. Org. Chem. 43:2870-2876) 및 5-요도우리딘(Robins et al. (1981) Tetrahedron Lett 22:421-424) 모두는 팔라듐 촉매의 존재하에 알켄 및 알킨과 쉽게 축합되어 C5 테더-장착 우리딘을 제공한다. 후자의 경로가 더욱 자주 사용된다(Robins et al. (1982) Can. J. Chem. 60:554-557; Asakura (1988) Tetrahedron Lett. 29:2855-2858; 및 Asakura (1990) J. Org. Chem. 55:4928-4933). 보호된 5-요도2'-디옥시우리딘과 t-부틸디메틸실릴 프로파르길 에테르(Graham et al. (1998) J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1:1131-1138 및 De Clercq et al. (1983) J. Med. Chem. 26:661-666), 메틸 프로파르길 에테르 (Tolstikov et al. (1997) Nucleosides Nucleotides 16:215-225), 및 심지어 프로파르길 알콜 자체(Chaudhuri et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:10434-10442 및 Goodwin et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34:5549-5552)의 고수율 축합이 달성되었다. 또한, 후자의 반응에 의해 도입된 3-히드록시-1-프로피닐 치환기는, BVDU의 합성에 사용된 동일한 Heck 반응으로부터 생기는 메타크릴레이트기의 DIBAL-H 환원 (Cho et al. (1994) Tetrahedron Lett. 25:1149-1152)에 의해 접근될 수 있다. 이들 팔라듐-촉매 반응은 만능이라서 5-요오도-2'-디옥시우리딘에 오래 공들여 작용기화된 프로파르길-기제 테더를 축합시키는데 사용될 수 있다(Livak et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:4831-4837 및 Hobbs (1989) J. Org. Chem. 54:3420-3422). (Z)-알릴-기제 테더는 Undiar 촉매에 우선하여 프로파르길 전구물질의 부분 수소화에 의해 생성되며(Robins (1983) J. Org. Chem 5(11):3546-3548 및 Barr (1983) J. Biol. Chem. 258(22):13627-13631 및 Biochem. 22:1696-1703), (E)-알릴-기제 테더는 (E)-트리부틸스탄닐화 에틸렌의 Heck 커플링에 의해 가장 잘 제조된다(Crisp (1989) Synth. Commun. 19:2117-2123).
문헌의 과정에 따라 면밀히, t-부틸디메틸실릴 프로파르길 에테르-장착 3', 5'-디-O-보호 2'-디옥시우리딘(Graham et al. (1998) 위와 동일; De Clercq et al. (1983) J. Med. Chem. 26:661-666)을 제조하고, 상응하는 (Z)-알릴 에테르로 전환된 그것의 일부(Barr et al. (1983) 위와 동일)를 환원시킨다. TBDMS 기의 TBAF-매개 제거가 제자리 작용기화될 수 있는 산소음이온을 생성하기 때문에, 이들 TBDMS-보호 프로파르길- 및 (Z)-알릴-테더 뉴클레오시드는 어떤 톡소포어-장착 표적에 대한 편리한 전구물질로서 사용할 수 있을 것이다. (E)-알릴 알콜-장착 뉴클레오시드에 대해서, 공지의 O-테트라히드로피라닐 에테르 유도체가 문헌상의 (E)-트리부틸스탄닐화 에틸렌의 Heck 커플링(Crisp (1989) 위와 동일)에 의해 제조된다.
문헌상의 2 단계 프로토콜(Phelps et al. (1980) J. Med. Chem. 23:1229-1232; 및 Hsiao and Bardos (1981) J. Med. Chem. 24:887-889)을 사용하여, 5'-모노뉴클레오티드 버전에 대한 TS 프로세싱이 각각 세포증식억제 약물 TEPA 또는 ThioTEPA(Dirven et al. (1995) Cancer Res. 55:1701-1706)의 활성 대사물질을 방출하도록, 프로파르길 및 (E) 및 (Z)-알릴 알콜을 그것들의 상응하는 비스-아지리디닐 포스포르아미데이트 또는 티오포스포르아미데이트로 전환시킨다.
비스-아지리딘-1-일-포스핀산 3-[2-디옥시우리딘-5-일]-프로프-2-인일 에스테르("TEPA")를 합성했고,1H NMR로 분석하여 다음의 결과를 얻었다:1H NMR((CD3)2SO)은 노이즈로 인해 분석하기 어려웠다. 현저한 특징: δ 8.28(d, 1, H6), 6.10(위-t, 1, H1'), 5.26(m, D20로 교환, 1,3'-OH), 5.13(m, D20로 교환, 1,5'-OH), 4.81(q 또는 dd, 2, 프로파르길-CH2), 4.24(m, 1, H3'), 3.57(m, 2, 5'-CH2), 2.15-2.0(m, 8, 아지리딘-CH2).
비스-아지리딘-1-일-포스피노티오산 3-[2-디옥시우리딘-5-일]-프로프-2-인일 에스테르(ThioTEPA)를 또한 합성했고,1H NMR로 분석하여 다음의 결과를 얻었다:1H NMR((CD3)2SO)은 노이즈로 인해 분석하기 어려웠다. 현저한 특징: δ 8.29(d, 1, H6), 6.10(위-t, 1, H1'), 5.22(m, D20로 교환, 1,3'-OH), 5.10(m, D20로 교환, 1,5'-OH), 4.88(q 또는 dd, 2, 프로파르길-CH2), 4.31(m, 1, H3'), 3.52 (m, 2, 5'-CH2), 2.15-2.0(m, 8, 아지리딘-CH2).
푸라노-피리미디논의 합성
푸라노-피리미디논의 합성을 C5 프로파르길 알콜-장착 2'-디옥시우리딘의 합성으로 시작했다. 다음에, 푸라노-피리미디논 화합물을 상술된 O-테트라히드로피라닐 에테르 유도체로부터 형성한다. 프로파르길 결합의 제 2 탄소와 피리미딘 고리의 C4 위치에 부착된 산소의 반응에 의해 합성을 진행하여, 반응 혼합물로부터 쉽게 분리될 수 있는 형광 푸라노-피리미디논을 얻었다. 그러한 화합물은 특이적 전자 콘딧, 스페이서 및 독성 이탈기의 다양한 조합을 통한 ECTA 화합물의 합성에대한 추가적인 근거를 제공한다.
푸로[2,3-d]피리미디논 뉴클레오시드를 이들 형광성 화합물의 형성을 촉진하는 것으로 공지된 조건(Barr et al. (1983) 위와 동일) 하에서, 2',3'-디-O-p-톨루오일 또는 2',3'-디-O-아세틸-5-요도-2'-디옥시우리딘과 1-(테트라히드로피라닐옥시)-2-프로핀을 축합하여 제조했다(Jones and Mann (1953) J. Am. Chem. Soc. 75: 4048-4052). 탄수화물 보호기의 염기-촉매 제거로 6-(테드라히드로피란-2-일옥시메틸)-치환 이중고리 뉴클레오시드를 얻었고, 이것을 표준 산성 THP기 가수분해 (CH2C12중의 TFA)하거나, 또는 BvdU-PA 및 5FUdR-PA를 제조하는데 사용된 동일한 과정에 의해 위치선택적으로 5'-포스포르아미데이트화했다.
3-(2-디옥시-β-D-리보푸라노실)-6-(테트라히드로피란-2-일옥시메틸)푸로[2,3-d]피리미딘-2(3H)-온.1H NMR((CD3)2SO) δ 8.80(s, 1, H4), 6.74(s, 1, H5),6.16(위-t, 1, H1'), 5.27(d, D2O로 교환, 1,3'-OH), 5.12(t, D2O로 교환, 1, 5'-OH), 4.72(m, 1, THP-H2), 4.56(q, 2, CH2OTHP), 3.92(m, 1, H4'), 3.64(m, 2,5'-CH2), 2.40(m, 1, H2'a), 2.03(m, 1, H2'b), 1.68 및 1.50(m, 8, THP). 비스-TMS 유도체에 대한 저분해능 질량 스펙트럼(DCI-NH3),m/z323(B+TMS+H+), 511(MH+), 583(M+TMS+).
3-(2-디옥시-β-D-리보푸라노실)-6-(히드록시메틸)푸로[2,3-d]피리미딘-2(3H)-온.1H NMR((CD3)2SO) δ 12.0(bs, 1, OH), 8.24(s, 1, H4), 6.53(s, 1, H5), 5.51(위-t, 1, H1'), 4.42(m, 2, CH2OH). 저분해능 질량 스펙트럼(DCI-NH3), m/z 167(B+2H+), 184(B+NH4+).
1-[6-(테트라히드로피란-2-일옥시메틸)푸로[2,3-d]피리미딘-2(3H)-온-3-일]-2-디옥시-β-D-리보푸라노스-5-일 페닐 메톡시-L-알라닐포스포르아미데이트.1H NMR((CD3)2SO)는 부분입체이성질체의 존재로 인해 분석하기 어려웠다. 현저한 특징: δ 8.62 및 8.59(각각 s, 각각 1, H4), 7.4-7.1(m, 5, PhO), 6.61 및 6.60(각각 s, 각각 1, H5), 6.25(m, 1, H1'), 4.56(q, 2, 프로파르길-CH2), 3.56 및 3.54(각각 s, 각각 3, C02Me), 2.0(m, 1, H2'b), 1.22(m, 3, 알라닌일-α-Me). 저분해능질량 스펙트럼(DCI-NH3), m/z 167(B+2H+), 184(B+H++NH4+-THP).
1-[6-(히드록시메틸)푸로[2,3-d]피리미딘-2(3H)-온-3-일]-2-디옥시-β-D-리보푸라노스-5-일 페닐 메톡시-L-알라닌일포스포르아미데이트.1H NMR(CDCl3)은 부분입체이성질체의 존재로 인해 분석하기 어려웠다. 현저한 특징: δ 8.5(s, 1, H4), 7.4 7.1(m, 5, PhO), 6.36 및 6.30(각각 s, 각각 1, H5), 6.23(m, 1, H1'), 3.67 및 3.65(각각 s, 각각 3, CO2Me), 2.69(m, 1, H2'a), 2.10 (m, 1, H2'b), 1.35(m, 3, 알라닌일-α-Me). 저분해능 질량 스펙트럼(DCI-NH3),m/z525(MH+), 595(MNH4+).
5-(3-히드록시-1-프로피닐)-2'-디옥시우리딘의 4-니트로페닐 에테르 유도체를 하기에 나타낸 바와 같이 표준 에테르 합성에 따라 제조했다.
5-[3-(4-니트로페녹시)-1-프로피닐]-2'-디옥시우리딘. 40mL의 무수 THF 중의 미리 건조된 5-(3-히드록시-1-프로피닐)-2'-디옥시우리딘("Nucleic Acid Compo-unds. 39. Efficient Conversion of 5-Iodo to 5-Alkynyl and Derived 5-Substituted Uracil Bases and Nucleosides" Robins and Barr, (1983) 위와동일)(565mg, 2mmol) 용액을 아르곤하에서 4-니트로페닐(696mg, 5mmol), 트리페닐포스핀(787mg, 3mmol), 및 디이소프로필 아조디카르복실레이트(590L, 3mmol)로 처리하고, 반응 혼합물을 용액이 투명해질 때까지 60℃에서 가열한 후, 1시간 더 가열한다. 혼합물을 23℃로 냉각한 후 Si02위에서 증발시키고 용리액으로서 MeOH/CH2Cl2를 사용하는 크로마토그래피로정제하여 원하는 에테르 생성물 107mg(13% )을 얻었다: mp 112-118℃.1H NMR((CD2)2SO) δ 11.65(s, D20로 교환, 1, NH), 8.29 (s, 1, H6), 8.24(d, J=9.3Hz, 2,m-ArH), 7.23(d, J=9.3Hz, 2,o-ArH), 6.09(위-t, 1, H1'), 5.17(s, 2, 프로파르길-CH2), 4.22(m, 1, H3'), 3.80(m, 1, H4'), 3.59(m, 2,5'-CH2), 2.13(위-t, 2,2'CH2).per-트리메틸실릴화 물질에 대한 저분해능 질량 스펙트럼(DCI-NH3),m/z547[M(TMS)2H+], 565[M(TMS)2NH4 +], 620[M(TMS)3H+].
푸라노-피리미디논을 기제로 한 TS ECTA 화합물.상술된 TEPA 및 ThioTEPA의 합성에서 설명된 바와 같이, C5 프로파르길 우리딘 화합물상의 히드록실에 독성 이탈기를 부착하는데 사용된 것과 유사한 방법을 사용하여, 독성 R4 이탈기를 푸란-2-메틸 알콜에 부착할 수 있다. 당업자에게 명백한 여러가지의 다른 독성 이탈기가 본 발명의 주제이다. 게다가, R2전자 콘딧 성분의 길이 및 조성에 대한 변형, 및 R3스페이서 요소의 조성 변형 또한 청구될 수 있다.
푸라노-피리미디논을 기제로 한 TS ECTA 화합물은 또한 다양하게 변형된 "Q" 부분으로 구성될 수 있다. 많은 5-치환 2'-디옥시우리딘은 사람 TK에 대한 기질이 아니지만, 흥미롭게도 5-(4-히드록시-l-부티닐)-2'-디옥시우리딘은 예외로 밝혀졌다(Barr et al. (1981) 위와 동일). 따라서, 일부의 톡소포어-장착 뉴클레오시드가 또한 좋은 TK 기질 활성을 가질 것이라고 기대된다. 따라서, ECTA 화합물은 다른 탄수화물기에 부착된 자유 5'-히드록실, 5'-모노포스페이트, 또는 5'-포스포르아미데이트기를 가질 수 있다. 그러한 포스포르아미데이트 화합물의 합성을 위한 신규 방법은, HCl 스캐빈저의 존재하에 2-디옥시 3'-히드록시, 5'-히드록시 미보호 뉴클레오티드와 포스포클로리데이트를 반응시킴에 의해 달성된다. 바람직한 구체예에서, 포스포클로리데이트는 알라닌과 같은 아미노산으로부터 유도된 인치환기를 포함한다. 예를 들어, 포스포클로리데이트는 페닐-L-메톡시알라닌 포스포로클로리데이트일 수 있다.
C6 플루오로 우리딘 및 C4 히도존 기제 화합물.dUMP와 정상 TS 반응에서, 피리미딘 C5-C6 이중결합에 중성 티올 첨가는 발열 반응(몰당 3-9kcal; Les et al (1998) Biomolecular Structure and Dynamics 15 (4):703-715)로서 진행한다. 활성 사람 TS 시스테인(L. casei의 시스-1998과 상동성)에 의하여, 효소와 술피드릴 결합의 형성을 용이하게 할 수 있는 6 위치의 TS 반응성 수소에 대한 다른 치환기는 불소를 포함한다. 또한, 피리미딘 고리의 다른 위치에 있는 그러한 치환기가 기질과 TS 사이의 반응을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 우라실상의 4-히드라존 치환(Les and Rhode. (1998) Biomolcular Structure and Dynamics 15(4):703-715)은 TS를 갖는 티올의 형성을 용이하게 한다. 결과의 뉴클레오티드-티올(TS) 중간체가 가수분해에 의하여 피동적으로 달성될 수 있는 변경된 뉴클레오티드를 방출하는 방식으로 재배열하는 것이 중요하다.
C6 위치에서 플루오린의 도입은 이전에 보고되지 않았지만, 이것은 다수의 6-치환 우라실 및 우리딘 유사체의 합성을 설명한, Krajewskas and Shugar (1982) Biochem. Pharmacol. 31(6):1097-102의 합성 설명에 따라 합성될 수 있다.
피리미딘 염기의 C4 위치에서의 치환을 용이하게 하는 화학은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 문헌상의 설명의 예는 Wallis et al. (1999) Farmaco. 54(1-2): 83-89; Negishi et al. (1996) Nucleic Acids Symp. Ser.35(Twentythird Symposium on Nucleic Acids Chemistry) 137-138; Barbato et al. (1991) Nucleosides Nucleotides 10(4):853-66; Barbato et al. (1989) Nucleosides Nucleotides 8(4): 515-528; 및 Holy et al. (1999) J. Med. Chem. 42(12):2064-2086를 포함한다. 이들 합성 기법 또한, 예를 들어 피리미딘 고리의 C4 및 C5 위치(Pluta et al. (1999) Boll. Chim. Farm. 138(1):30-33), 또는 피리미딘 고리의 C2 및 C4 위치 (Zeid et al. (1999) Nucleosides Nucleotides 18(1):95-111)에서의 치환의 조합을가능하게 한다.
본 발명의 다른 구체예에서, ECTA 화합물은 다른 전자 콘딧, 스페이서 부분 및 독성 이탈기를 C6 플루오로-우리딘 염기 또는 C4 히드라존 변형된 피리미딘에 첨가함으로써 합성된다. 2'-디옥시우리딘 기제의 ECTA 화합물의 합성을 위한 상술된 방법은 그이러한 분자의 합성을 위해 다시 사용될 수 있다.
B. I형 및 II형 화합물의 유도체
본원에 개시된 상기 화합물의 염, 및 에테르가 또한 본 발명의 범위내이다. 발명의 프로드러그의 염은 무기 또는 유기 산 및 염기로부터 유도될 수 있다. 산의 예는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-술폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-술폰산 및 벤젠술폰산을 포함한다. 옥살산과 같은 다른 산들은 그 자체가 제약학적으로 허용되는 것은 아니지만, 본 발명의 화합물 및 그것들의 제학적으로 허용되는 산부가염을 얻는데 있어서 중간체로서 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다. 염기의 예는 알칼리금속(예를 들어, 나트륨) 수산화물, 알칼리토금속(예를 들어, 마그네슘) 수산화물, 암모니아, 및 NW4+(여기에서, W는 C1-4알킬이다)의 화합물을 포함한다.
염의 예는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 비술페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 푸마레이트, 플루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 염산염, 브롬산염, 요오드산염, 2-히드록시에탄술포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트 및 운데카노에이트를 포함한다. 염의 다른 예는 Na+, NH4+, 및 NW4+(여기에서, W는 C1-4알킬이다)와 같은 적합한 양이온과 화합된 본 발명의 화합물의 음이온을 포함한다.
치료적 사용을 위해, 본 발명 화합물의 염은 제약학적으로 허용될 수 있을 것이다. 그러나, 제약학적으로 허용되지 않는 산 및 염기의 염은 또한, 예를 들어 제약학적으로 허용되는 화합물의 제조 또는 정제에 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 확인된 프로드러그 또는 화합물의 에스테르는 2'-, 3'- 및/또는 5'-히드록시기의 에스테르화에 의해 얻어진 카르복실산 에스테르(즉, -O-C(=O)R)를 포함하며, 여기에서 R은 (1) 직쇄 또는 분지쇄 알킬(예를 들어, n-프로필, t-부틸, 또는 n-부틸), 알콕시알킬(예를 들어, 메톡시메틸), 아랄킬(예를 들어, 벤질), 아릴옥시알킬(예를 들어, 페녹시메틸), 아릴(예를 들어, 할로겐, C1-4알킬 또는 C1-4알콕시 또는 아미노에 의해 선택적으로 치환된 페닐); (2) 알킬술포닐 (예를 들어, 메탄술포닐) 또는 아랄킬술포닐과 같은 술포네이트 에스테르; (3) 아미노산 에스테르(예를 들어, L-발릴 또는 L-이소로이실); (4) 포스포네이트 에스테르 및 (5) 모노-, 디- 또는 트리포스페이트 에스테르로부터 선택된다. 포스페이트 에스테르는, 예를 들어 C1-20알콜 또는 그것의 반응성 유도체에 의해, 또는 2,3-디-(C6-24)아실 글리세롤에 의해 더 에스테르화 될 수 있다. 그러한 에스테르에서, 달리 명시되지 않는다면, 존재하는 어떤 알킬 작용기는 1 내지 18 탄소 원자, 특히 1 내지 6 탄소 원자, 더욱 특히 1 내지 4 탄소 원자를 함유하는 것이 유리하다. 그러한 에스테르에 존재하는 어떤 시클로알킬 작용기는 3 내지 6 탄소 원자를 함유하는 것이 유리하다. 그러한 에스테르에 존재하는 어떤 아릴 작용기는 페닐기를 포함하는 것이 유리하다. 본 발명의 릭소-푸라노실 프로드러그 유도체의 예는, 예를 들어 2'-O-아세틸-릭소-푸라노실; 3'-O-아세틸-릭소-푸라노실; 5'-O-아세틸-릭소-푸라노실; 2',3'-디-O-아세틸-릭소-푸라노실 및 2',3',5'-트리-O-아세틸-릭소-푸라노실과 같은, 화학적으로 보호된 히드록실기를 갖는 것들을 포함한다.
본 발명의 화합물의 에테르는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소부틸, 및 sec-부틸 에테르를 포함한다.
더 이상의 구체예에서, 기질은 피리미딘 또는 폴레이트와 화학적으로 관련이 없어도, 합리적인 약물 디자인의 공지된 파라미터를 토대로 합성될 수 있다(Dunn et al. (1996) J. Med. Chem. 39:4825 참조).
생성물에 대한 화학적 분석은, 예를 들어 반응 생성물이 dUMP의 브로모비닐-유도체의 항-대사물질인 경우, 하기 제공된 실시예에, 또는 Barr et al. (1983) 위와 동일)에 기술된다.
C. 제제
제제는 경구, 직장, 비강, 국부(경피, 구강 및 설하를 포함), 질, 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내를 포함) 및 폐 투여에 적합한 것들을 포함한다. 제제는 단위 용량 형태로 편리하게 존재할 수 있으며, 제약분야에 잘 공지된 어떤 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러한 방법은 활성 성분과 1개 이상의 보조 성분으로 구성된 담체가 회합되도록 하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분과 액체 담체 또는 미립자 고체 담체, 또는 2개 모두가 균일하게 친밀히 회합되도록 하고, 다음에 필요한 경우 생성물을 형상화함에 의해 제조된다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는, 각각 정해진 양의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 샤세 또는 정제와 같은 분리된 단위; 분말 또는 과립; 수성 또는 비수성 액체중의 용액 또는 현탁액; 또는 기름/물 액체 에멀젼 또는 물/기름 액체 에멀젼으로 존재할 수 있다. 또한, 활성 성분은 환약, 연약 또는 페이스트로 존재할 수 있다.
정제는 선택적으로 1개 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 몰딩함에 의해 만들어질 수 있다. 압축 정제는 적합한 기계에서, 선택적으로 바인더(예를 들어, 포비돈, 젤라틴, 히드록시프로필메틸셀룰로스), 윤활제, 비활성 희석제, 보존제, 붕해제(예를 들어, 나트륨 녹말 글리콜레이트, 교차결합 포비돈, 교차결합 나트륨카르복시메틸 셀룰로스), 표면-활성 또는 분산제와 혼합된 분말 또는 과립과 같은 자유 유동 형태의 활성 성분을 압축함에 의해 제조될 수 있다. 몰드 정제는 적합한 기계에서, 불활성 액체 희석제로 축축해진 분말 화합물의 혼합물을 몰딩함에 의해 만들어질 수 있다. 정제는 선택적으로 코팅되거나, 또는 새김눈을 넣을 수 있고, 바람직한 방출 프로파일을 제공하기 위해, 예를 들어 비율을 변화시키면서 히드록시프로필메틸 셀룰로스를 사용하여 정제에서 활성 성분이 서서히 또는 제어되어 방출되도록 제조될 수 있다. 정제는 선택적으로 위 이외의 소화관에서 일부 방출되도록 장코팅과 함께 제공될 수 있다.
입으로 국부 투여하기 적합한 제제는 향이 있는 기제, 보통 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔스중에 활성 성분을 포함하는 래즌즈; 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아와 같은 불활성 기제중에 활성 성분을 포함하는 패스틸; 및 적합한 액체 담체중에 활성 성분을 포함하는 마우스워시를 포함한다.
본 발명에 따르는 국부 투여용 제제 조성물은 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 기름으로 조제될 수 있다. 또는 달리, 제제는 활성 성분 및 선택적으로 1개 이상의 부형제 또는 희석제가 침투된 붕대 또는 접착성 고약과 같은 패치 또는 드레싱을 포함할 수 있다.
눈 또는 다른 외부 조직, 예를 들어 입 및 피부의 질환을 위해서, 제제는 바람직하게, 예를 들어 약 0.075 내지 약 20% w/w, 바람직하게 약 0.2 내지 약 25% w/w, 가장 바람직하게 약 0.5 내지 약 10% w/w의 양으로 활성 성분을 함유하는 국부 연고 또는 크림으로 적용된다. 연고로 조제될 때, 프로드러그는 파라핀성 또는물-혼화성 연고 기제와 함께 사용될 수 있다. 또는 달리, 프로드러그 성분은 기름/물 크림 기제와 함께 크림으로 조제될 수 있다.
바람직하다면, 크림 기제의 수성상은, 예를 들어 다가 알콜, 즉 프로필렌 글리콜, 부탄-1,3-디올, 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜 및 그것들의 혼합물과 같은 2개 이상의 히드록실기를 갖는 알콜을 적어도 약 30% w/w 포함할 수 있다. 국부 제제는 바람직하게 피부 또는 다른 피부위을 통한 프로드러그 성분의 흡수 또는 침투를 증진시키는 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 에멀젼의 유질상은 공지된 방법으로 공지된 성분으로부터 구성될 수 있다. 이 상은 단지 유화제(다르게는 에멀전트로서 공지된)만을 포함할 수도 있지만, 바람직하게는 적어도 1개의 유화제와 지방 또는 기름의, 또는 지방 및 기름 모두의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 친수성 유화제가 안정제로서 작용하는 친유성 유화제와 함께 포함된다. 또한, 기름 및 지방을 모두 포함하는 것이 바람직하다. 안정제(들)와 함께 또는 안정제 없이 유화제(들)는 소위 유화 왁스를 만들며, 기름 및/또는 지방과 함께 왁스는 크림 제제의 유질 분산상을 형성하는 소위 유화 연고 기제를 만든다.
본 발명의 제제에 사용하기 적합한 에멀전트 또는 에멀전 안정제는 Tween 60, Span 80, 세토스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 글리세릴 모노스테아레이트 및 나트륨 라우릴 술페이트를 포함한다.
제제를 위한 적합한 기름 또는 지방의 선택은, 제약학적 에멀젼 제제에 사용될수 있는 대부분의 기름에서 활성 성분의 용해성이 매우 낮으므로, 바람직한 연고특성을 달성하는데 기초를 둔다. 따라서, 크림은 바람직하게 튜브 또는 다른 용기로부터 새지 않을 만큼의 적합한 컨시스턴시를 갖는, 기름기가 없고, 얼룩지지 않으며, 씻겨질 수 있는 제품이어야 한다. 디이소아디페이트, 이소세틸 스테아레이트, 코코넛 지방산의 프로필렌 글리콜 디에스테르, 이소프로필 미리스테이트, 데실 올레이이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트, 2-에틸헥실 팔미테이트 또는 Crodamol CAP로 알려진 분지쇄 에스테르의 블렌드와 같은 직쇄 또는 분지쇄 모노- 또는 디베이직 알킬 에스테르가 사용될 수 있으며, 마지막 3개의 에스테르가 바람직하다. 이들은 요구되는 특성에 따라 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 또는 달리, 흰색 연성 파라핀 및/또는 액체 파라핀과 같은 고용융점 지질 또는 다른 광물성 기름이 사용될 수 있다.
눈에 국부 투여하기 적합한 제제는 또한, 활성 성분이 정합한 담체, 특히 프로드러그 성분용 수성 용매중에 용해 또는 현탁된 점안제를 포함한다. 프로드러그 성분은 바람직하게 그러한 제제중에 약 0.5 내지 약 20%, 유리하게는 약 0.5 내지 약 10%, 특히 약 1.5% w/w의 농도로 존재한다.
직장 투여용 제제는, 예를 들어 코코아 버터 또는 살리실레이트를 포함하는 적합한 기제를 갖는 좌약으로서 존재할 수 있다.
질 투여에 적합한 제제는 프로드러그 성분에 더하여, 본 분야에서 적합하다고 공지된 것과 같은 담체를 함유하는 좌약, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포말 또는 스프레이 제제로서 존재할 수 있다.
비강 투여에 적합한 담체가 고체인 제제는, 예를 들어 약 20 내지 약 500 미크론 범위의 입자 크기를 갖는 조대 분말을 포함하고, 코로 복용되는 방식, 즉 코에 가까이 고정된 분말 용기로부터 비강 통로를 통한 빠른 흡입에 의해 투여된다. 예를 들어, 비강 스프레이, 점비제로서, 또는 분무기에 의한 에어로졸 투여에 의한 투여를 위한, 담체가 액체인 적합한 제제는 프로드러그 성분의 수성 또는 유질 용액을 포함한다.
비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충액, 세균발육 저지제 및 제제를 의도된 레시피언트이 혈액과 등장으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 점증제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액, 및 화합물이 혈액 성분 또는 1개 이상의 기관을 표적으로 하도록 디자인된 리포솜 또는 다른 마이크로미립자 시스템을 포함한다. 제제는 단위-용량 또는 다수-용량 밀봉 용기, 예를 들어 앰플 및 바이알로 존재할 수 있으며, 사용하기 바로 전에 주사용 멸균 액체 담체, 예를 들어 물을 첨가하기만 하면 되는 냉동건조(동결건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 또는 현탁액은 이미 설명된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
바람직한 단위 용량 제제는 본원에서 상기 기재된 바와 같은, 일일 용량 또는 단위, 일일 하위용량, 또는 그것들의 적합한 부분의 프로드러그 성분을 함유하는 것들이다.
특히 상기 언급된 성분에 더하여, 본 발명의 제제는 해당 제제의 종류를 고려하여 본 분야의 종래의 다른 제제를 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 하며, 예를 들어 경구 투여에 적합한 것들이 감미료, 점증제 및 향미료로서 그러한 더 이상의 제제를 포함할 수 있다.
본 발명의 구조식의 프로드러그 및 조성물은 또한 수의학적 제제의 형태로 사용하기 위해 존재할 수 있으며, 이것은 예를 들어 본 분야의 종래의 방법에 의해 제조될 수 있다.
D. 사람 정상 조직에서 티미딜레이트 신타제의 발현
정상 사람 조직에서 TS 발현 레벨이 티미딜레이트 신타제에 의해 활성화되는 프로드러그의 전신성 독성을 추정하기 위해 시험되었다. 뇌, 심장, 신장, 비장, 간, 결장, 폐, 소장, 위근육, 고환, 난소, 자궁, 전립선, 갑상선, 타액선, 부신, 피부, PBL 및 골수 조직에서의 상대적 TS mRNA 레벨을 RT-PCR을 사용하여 측정했다. 골수(1.25배), 난소(1.38배) 및 고환 조직(2.13배)을 제외한, 대부분의 조직 에서 TS mRNA 레벨은 결장 조직에서의 레벨과 동일하거나 또는 보다 적었다(도 13). 그러나, 결장암 샘플에서 평균 TS mRNA 레벨은 그것들의 매치된 정상 결장 조직 샘플의 4.6배 이상이었다. 이 결과는 결장암에서 과발현된 TS에 의해 활성화된 화합물이 정상 사람 조직에 대해서는 극히 적은 독성을 가진다는 것을 시사한다.
다수의 정상 조직에서 사람 티미딜레이트 신타제의 전사 레벨을 PCR 증폭에 의해 조사했다. 사람 조직의 cDNA 패널을 OriGene Technologics, Inc.(Rockville, MD)로부터 입수했다. PCR 반응을 cDNA(100X), 3mM MgCl2, 50mM KCl 20mM 트리스-C1, pH 8.4, 0.2mM 각 dNTP , 0.2μM 티미딜레이트 신타제 센스 및 안티센스 프라이머 및 Taq DNA 중합효소 1.25 유니트(Promega, Madison, WI로부터 입수)를 함유하는 25㎕ 부피에서 수행했다. 반응 혼합물을 2분간 94℃에서 인큐베이션하고, 이어서 94℃ 40초 인큐베이션, 58℃ 1분 인큐베이션, 다음에 72℃ 1분 인큐베이션을 12 사이클 수행했다. 0.2μM β-액틴 프라이머, 0.2μM 티미딜레이트 신타제 프라이머, 3mM MgCl2, 50mM KCl, 20mM 트리스-C1 pH 8.4, 0.2mM 각 dNTP 및 Taq DNA 중합효소 1.25 유니트를 함유한 25㎕ 반응 완충액을 가하여 0.2μM 티미딜레이트 신타제 프라이머 및 0.1μM β-액틴 프라이머 최종 농도를 달성하고, 반응 부피를 50㎕으로 했다. PCR 반응을 총 36 사이클 계속하고, 이어서 72℃에서 7분간 인큐베이션했다.
PCR 생성물 10㎕를 2% 아가로스겔에서 전기영동에 의해 분해하고, 이어서 SYBR Gold 핵산 염료(Molecular probes, Eugene, OR로부터 입수)를 사용하여 염색했다. 티미딜레이트 신타제에 상응하는 DNA 밴드를 정량하고, Molecular Dynamics Storm의 β-액틴의 DNA 밴드에 대해 정규화했다. 정량된 발현 레벨은 결장의 발현 레벨에 상대적인 값으로 표현했다.
E. 매치된 정상 및 종양 조직의 RT-PCR 분석
결장암 조직 및 매치된 정상 결장 조직에서 사람 티미딜레이트 신타제의 전사 레벨을 역 RT-PCR 증폭을 사용하여 정량했다. 사람 티미딜레이트 신타제 및 β-액틴의 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 다음과 같이 디자인했다: 티미딜레이트 신타제 센스 프라이머 5'-GGGCAGATCCAACACATCC-3'(Genbank 승인 번호X02308의 티미딜레이트 신타제 cDNA 서열의 염기 208에서 226에 상응), 안티센스 프라이머 5'-GGTCAACTCCCTGTCCTGAA-3'(염기 564에서 583에 상응), β-액틴 센스 프라이머 5'-GCCAACACAGTGCTGTCTG-3'(Genbank 승인 번호 M10277의 β-액틴 유전자 서열의 염기 2643에서 2661에 상응) 및 안티센스 프라이머 5'-CTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'(염기 2937에서 2955에 상응).
사람 결장 종양 조직 및 매치된 정상 조직을 Cooperative Human Tissue Network(CHTN, Western Division, Cleveland, OH)로부터 입수했다. 총 RNA를 제조 프로토콜에 따라서, Tripure 분리 시약(Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN로부터 입수)을 사용하여 분리했다. 가능한 DNA 오염을 모니터하기 위해서, β-액틴 증폭용 프라이머를 엑손4/인트론5/엑손5 접합부에 걸쳐지도록 디자인했다. 게놈 DNA 템플레이트는 313bp β-액틴 단편을 가져오고, cDNA 템플레이트는 210bp 생성물을 생성한다.
SuperScript 예비증폭 시스템(Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)을 사용하여 역전사를 수행했다. 제조 프로토콜에 따라서, 3μg의 총 RNA를 부피 20㎕의 완충액에 적용하여 역전사 반응을 행했다.
PCR 반응을 역전사 반응으로부터의 cDNA 혼합물 5㎕, 3mM MgCl2, 50mM KCl, 20mM 트리스-Cl pH 8.4, 0.2mM 각 dNTP, 0.3μM 티미딜레이트 신타제 센스 및 안티센스 프라이머, 및 Taq DNA 중합효소(Promega, Madison, WI에서 입수) 5 유니트를 함유하는 부피 96㎕에서 수행했다. 반응 혼합물을 94℃에서 3분간 인큐베이션한후, 94℃에서 1분 인큐베이션, 58℃에서 1분 인큐베이션, 다음에 72℃에서 1분 인큐베이션의 9 사이클을 행했다. 9 사이클 후, 4㎕ 중 사람 β-액틴 프라이머를 가하여 최종 농도 0.2μM를 달성하고, 최종 반응 부피를 100㎕로 했다. PCR 반응을 총 30, 32 또는 34 사이클로 계속한 후, 72℃에서 7분 인큐베이션했다.
10㎕의 PCR 생성물을 2%의 아가로스겔 전기영동에 의해 분해하고, 이어서 SYBR Gold 핵산 겔 염료(Molecular probes, Eugene, OR에서 입수)로 염색했다. 정량 결과는 티미딜레이트 신타제 및 β-액틴의 증폭이 사이클 30과 34 사이에서 선형이라는 것을 나타냈다. 티미딜레이트 신타제에 상응하는 DNA 밴드를 정량하고 Molecular Dynamics Storm에 의해 β-액틴의 DNA 밴드에 대해 정규화했다. 정량된 발현 레벨을 TS와 β-액틴간 비율의 값으로 표현했다.
F. 셀라인 및 트랜스팩션
HT1080 세포를 10% 태아소혈청으로 보충된 PRMI1640 배지중에서 성장시켰고, GFP-TS 발현 벡터로 트랜스펙션했다. 48시간 후, 트랜스펙션 세포를 트립신화하고, 750μg/ml G418을 함유하는 배양 배지에서 다시 플레이팅했다. 2주간 G418을 사용하여 선택한 후, 생존 세포를 형광 발현을 기초로 분류했다. 높은 형광 발현이 있는 1개 클론(TSH/HT1080로 명명) 및 낮은 형광 발현이 있는 1개 클론(TSL/HT1080로 명명)을 선택하고 셀라인으로 확장시켰다. pEGFP-C3으로 트랜스펙션된 안정한 HT1080 세포를 대조표준으로서 사용했다.
G. GFP-TS 발현 벡터의 구성
사람 티미딜레이트 신타제의 보존 영역(아미노산 23에서 313)을 코드화하는cDNA 단편을 다음의 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 얻었다: 센스 프라이머 5'-CGGAAGCTTGAGCCGCGTCCGCCGCA-3' 및 안티센스 프라이머 5'-GAAGGTACCCTAAACAGCCA TTTCCA-3'. cDNA를 GFP 서열을 갖는 프레임내에서, 포유류 발현 벡터 pEGFP-C3 (Clontech Laboratories. Inc., Palo Alto, CA)의 HindIII 및 KpnI 부위로 클론했다. cDNA 삽입을 DNA 서열화에 의해 확인했다.
H. 웨스턴 블롯 분석
사람 정상 및 암세포를 10% 태아소혈청으로 보충된 RPMI1640 배지중에서 성장시켰다. 세포를 100mm 배양 접시에서 합류까지 성장시켰고, 0.5ml의 RIPA 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.5% 트리톤 X-100, 0.1% SDS, 0.5% 디옥시콜산, 나트륨염 및 프로테아제 억제제) 중에 용해했다. 단백질 농도를 BCA-200 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL에서 입수)를 사용하여 측정했다. 각 세포주/셀라인으로부터의 총 단백질 15μg을 12% SDS-PAGE에 의해 분해했다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인 위로 옮기고, 이어서 사람 티미딜레이트 신타제 단일클론 1차 항체(NeoMarkers제, Fremont, CA) 및 양 항-마우스 Ig 2차 항체(Amersham, England에서 입수)에 연결된 양고추냉이 퍼옥시다제로 면역블롯했다. ECL 플러스 키트(Amersham)를 면역반응성의 검출을 위해 사용했다. 티미딜레이트 신타제에 상응하는 밴드를 정량하고 Molecular Dynamics Storm에 의해 투불린의 밴드에 대해 정규화했다. 정량된 발현 레벨을 세포주 CCD18co의 발현 레벨에 상대적인 값으로서 표현했다.
I. dUMP- 3 H으로부터 트리튬 유리에 의한 TS 활성 분석
세포를 24-웰 플레이트에서 30,000세포/플레이트의 밀도로 플레이팅했고, 16시간 동안 인큐베이션하여 플레이트의 플라스틱 표면에 부착시켰다.
티미딜레이트 신타제 분석 바로 전에, 배지를 RPMI+10% 투석된 태아소혈청으로 교환하였다. 0.5μCi의 5-[3H] 디옥시우리딘을 각 웰에 가하고, 플레이트를 CO2첨가 없이 37℃에서 60분간 인큐베이션했다. [3H] 유리를 실온에서 5분간 5-[3H] 디옥시우리딘을 활성탄(1xPBS 중 10%)에 흡착시킴에 의해 측정했다. 13,000RPM으로 5분간 원심분리한 후, 상청액 중의 [3H] 양을 액체 섬광 계수하여 측정했다.
J. 성장 억제 연구
지수적으로 증가하는 세포를 384-웰 평바닥 조직 배양 플레이트로 옮겼다. 모든 세포 종류를 25㎕의 완전 배지(RPMI1640+10% 태아소혈청+항생제/항진균제) 중에 웰 당 500세포 밀도로 플레이팅했다. 24시간 후(0일), 10ʼn3내지 10ʼn10M 용량 범위에 대한 실험 화합물을 함유하는 완전 배지 25㎕를 3번 가했다. 약물 노출 시간은 120시간(5일)이었고, 이후 성장 억제를 분석했다. 산화환원 지시제인 알라마르 블루 5㎕를 각 웰(10%v/v)에 가했다. 37℃에서 4시간 인큐베이션한 후, 형광을 여기 535nm 및 방출 595nm에서 모니터했다.
농도 대 상대 형광 단위(RFU)를 도시하고, s자형 곡선을 Hill 방정식을 사용하여 피팅했다. 곡선의 굴곡점으로 표시된 IC50은 성장이 50%까지 억제되는 농도이다.
K. NB1O11 세포독성의 토뮤덱스 억제
MCF7-TDX를 웰 당 25㎕의 완전 배지중에 500세포로 384-웰 분석 플레이트로 옮겼다. 24시간 후(0일), 1mM로부터 이중으로 연속 희석한 NB1011과 불연속적 농도(0, 1, 10, 100, 1000nM)의 토뮤덱스의 조합을 함유하는 완전 배지 25㎕를 2번 가하였다. 약물 노출 시간은 120시간(5일)이었고, 이후 성장 억제를 성장 억제 연구에 상술된 바와 같이 알라마르 블루를 사용하여 측정했다.
L. 효소제조
아미노 말단 His Taq를 첨가하기 위해서, 클론된 사람 티미딜레이트 신타제 플라스미드 pBCHTS를 NdeI nSacI 삽입 부위를 사용하여 대장균 BL21(DE3)/pET-28a (+)(Novagen)로 서브클론했다. 효소를 IPTG를 사용한 유도에 의해 대장균에서 발현했고, Ni2+His Bind 금속 킬레이션 수지(Novagen)의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제했다. Ni2+His Bind 금속 킬레이션 칼럼을 20mM 트리스 pH 7.9, 5mM 이미다졸, 0.5M NaCl로 세척하고, 티미딜레이트 신타제 활성을 20mM 트리스 pH 7.9, 60mM 이미다졸, 0.5M NaCl로 용리했다.
M. 효소 분석 및 키네틱 측정
티미딜레이트 신타제 분석을 400mM 트리스 pH 7.5, 25mM MgCl2, 1mM EDTA,25mM 메르캅토에탄올, 125M dUMP, 및 65μM N5,N10-메틸렌히드로폴레이트로 구성된 반응 부피 200㎕로 96-웰 Costar UV 투명 플레이트에서 행했다. 테트라히드로폴레이트 스톡 용액을 테트라히드로폴산(Sigma)을 0.2M 트리스 pH 7.5, 0.5M 메르캅토에탄올에 직접 용해하여 제조했고, 스톡 용액은 -80℃에 저장했다. N5,N10-메틸렌 히드로폴레이트를 3.8% 포름알데히드 12㎕를 0.65mM 테트라히드로폴레이트 용액 1ml에 첨가하고, 37℃에서 5분간 인큐베이션함에 의해 제조했다. N5,N10-메틸렌 히드로폴레이트는 얼음상에 보관했고, 제조 후 2시간내에 사용했다.
티미딜레이트 신타제에 의한 BVdUMP의 형광 생성물로의 전환을 96-웰 Dynex Microfluor Black "U" 바닥 마이크로타이터 플레이트에서 125M BVdUMP를 함유하는 200mul 티미딜레이트 신타제 반응에서, 여기 파장 340nm 및 방출 파장 595nm를 사용하여 측정했다. 형광은 Tecan Spectrafluor Plus fluorimeter를 사용하여 측정하였다.
효소 키네틱 상수(Km및 Vmax)를 상술된 효소 분석 조건을 사용하여 사람 티미딜레이트 신타제 기질 dUMP 및 BVdUMP에 대해 측정했다. 효소 반응의 초기 속도를, dUMP와의 반응에서 A340의 증가 및 BVdUMP와의 반응에서 A294의 감소를 측정함에 의해 측정했다. 효소의 촉매 효능(Kcar/Km)을 키네틱 상수 Km및 Vmax로부터 계산했다.
N. 액체 크로마토그래피/질량 분광법
세포를 실온에서 PBS로 3회 세척한 후, 5ml PBS 중에서 냉동/해동 용해했다.세포 추출물을 10K RPM으로 10분간 원심분리한 후, Sep-Pak C18에 흡착시키고 10ml PBS로 세척했다. BVdUMP를 증류수 1ml로 용리했다. 선형 구배의 0.1% 포름산-0.1% 포름산/95% 아세토니트릴을 사용하여 C18칼럼 역상 크로마토그래피로 LC/MS 샘플을 분석했다.
O. 내성의 반전
사람 유방암 MCF7 TDX 셀라인의 기원 및 특징은 이미 설명되었다(Drake et al. (1996) Biochem. Pharmcol. 51(10):1349-1355). 간단히 말해서, TCF7 유방암 세포를 2.0μM까지 단계적으로 증가하는 TDX 농도에 연속 노출함에 의해 토뮤덱스에 대한 내성에 대해 시험관내 선택했다. 내성 서브라인을 TDX 없이 모 MCF7 TDX 셀라인의 NB1011에 대한 IC50보다 약 16배 높은 농도인 50μM NB1011로 보충된 배지에 모 MCF7 TDX 셀라인의 연속 노출에 의해 NB1011에 대한 내성에 대해 선택했다. 극적인 초기의 세포 살해 효과 후, 내성 콜로니가 출현했고, 활발하게 성장하는 단일층이 형성되었다. 5-FU, TDX, 및 NB1011에 대한 TS 단백질 레벨 및 IC50을 각각 웨스턴 블롯 및 알라마르 블루 세포독성 분석에 의해, "물질 및 방법"에 설명된 바와 같은 결과의 MCF7 TDX/1011 셀라인에 대해 측정했다.
II. 실험
A. 생체내 TS-발현, 5-FU 내성, H630-10 결장 암종 이종이식에서 NB1011의 분석
5-FU에 대한 내성에 대해 선택된, H630-10 결장암 세포는 시험관내에서 티미딜레이트 신타제를 높은 레벨로 발현하고, 의식상실 마우스에 이종이식을 형성한다. 세포 팽창 후, 생체외 H630-10을 4 내지 6주된 암컷 CD-1(nu/nu) 의식상실 마우스(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)의 등중앙에 1.5x107세포/종양으로 피하주사(S.Q.)했다. 생성물의 길이, 폭 및 깊이로서 계산된 종양 부피를 단일 관찰자에 의한 연속 마이크로미터 측정에 의해 주 2회 모니터했다. 6마리 동물을 각 치료군에 무작위적으로 할당하고, 출발 종양 부피의 균일성을 확보하기 위한 통계적 시험을 수행했다(단일-인자 ANOVA). NB1011을 복강내(I.P.) 또는 종양내(IT) 주사에 의해 투여했다. 시험된 실험 제제의 용량은 다음과 같았다: 1 군: DMSO 부형제 대조표준 용액(IP), 2 군: 5-FU(15mg/kg x 5일 IP = 이 모델의 5-FU용 MTD), 3 군: NB1011 = 1.25mg x 5일(IP), 4 군: NB1011 = 2.5mg x 5일(IP), 5 군: NB1011 = 3.5mg x 5일(IP), 6 군: DMSO 대조표준(IT), 7 군: NB1011 = 1.25mg x 5일(IT), 및 8 군: NB1011 = 2.5mg x 5일(IT). 이들 용량은 우리 연구실에서 수행된 독립적인 용량-발견 실험을 기초로 하며, 이 특정한 나이 및 스트레인의 암컷 의식상실 마우스에 대한 NB1011의 최대-내성 용량에 근접했다. 정확한 용량을 확보하기 위해서, 약물 용량은 각각 주사하기 바로 전에 측정된 동물 중량을 토대로 개별화했다. 대조표준 용액 또는 NB1011을 사용한 처리는 이종이식 부피가 45 내지 68mm3으로 측정된 때인 이종이식 후 10일에 개시했다. 군들 사이의 25일된 이종이식 부피의 차이를 로그 변환된 종양 부피 데이타에 대한 단일-인자 ANOVA에 의해 분석했다. 실험 의식상실 마우스를 UCLA Animal Care Facility의 전용 방에서 무균 상태하에 유지했다. University of California(LA)의 Research Risks, Laboratory Animal Safety Assurance Number A-3196-01으로부터 Office of Protection으로 제출된 Animal Welfare Assurance 서류가 있다. 모든 실험은 UCLA 수의사에 의해 면밀하게 감독되었다. UCLA에 의해 사용된 안락사 기법은 American Veterinary Medical Association의 패널에 의해 지지된다. University of California(LA)의 실험 동물 프로그램 및 기능관리는 American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care에 의해 공인된다. 이 프로토콜에서 설명된 동물 과정/조작을 수행하는 개인은 이들 과정의 기술적인 요소이며, Animal Welfare Act of 1985에 의해 요구되는 바의 연구에 있어 동물 사용에 대한 트레이닝을 받는다.
B. BVdUMP와 사람 티미딜레이트 신타제의 시험관내 반응
1. rHuTS에 의한 BVdUMP의 무세포 진행은 형광 생성물(들)을 생성한다.
L. caseiTS에 의한 BVdUMP의 무세포 진행은 잠재적으로 반응성인 중간체를 만드는 것으로 나타났다(Barr et al. (1983) 위와 동일). 이런 이유로, TS에 의한 BVdUMP의 진행은 사람 TS의 비가역적 불활성화를 가져온다고 여겨졌다(Balzarini (1987) Mol. Pharmacol. 32(3):410-6). DeClercq, Balzarini 및 동료들에 의한 세포-기제 실험(Balzarini (1987) 위와 동일; Balzarini (1993) J. Biol. Chem. 268(a):6332-7; Balzarini (1995) FEBS Lett 373(1):41-4)은, 일단 BVDU가 세포에서 모노포스페이트로 전환되고(예를 들어, 포진 바이러스 티미딘 키나제에 의해), 다음에 그것이 진행 동안 Hu TS 효소와 결합되어 불활성화한는 개념을 뒷받침한다. 그러나, 사람 TS와 BVdUMP의 실제 반응은 충분히 특성화되지 않았었다. Santi 및동료들(Barr et al. (1983) 위와 동일)은 BVdUMP+TS 반응으로부터의 생성물의 생성을 보이기 위한 그들의 연구를 위해 바이러스성 TS를 이용했고, DeClercq 및 동료들은 정제된 사람 TS가 아니라, 세포 및 세포 용해물을 사용했다(Balzarini (1987) 위와 동일); Balzarini (1993) 위와 동일; Balzarini (1995) 위와 동일).
TS에 의해 특이적으로 활성화될 수 있는 치료 기질을 생성하는데 대한 본 출원인의 관심 때문에, BVdUMP와 정제된 재조합 사람 TS(rHuTS)의 상호작용을 재방했다. BVdUMP를 표준 반응 혼합물중에서 rHuTS와 함께 배양했들 때, 반응은 형광 생성물(들)의 형성을 가져온다(도 2). 시간 의존 증가는 초기 BVdUMP 농도의 감소에 의해 달성된다. 생성된 생성물(들)은 부분적으로 특성화되었으며, 외향고리 피리미딘 뉴클레오티드 유도체인 것으로 여겨진다(하기 참조).
이전의 결과가 BVdUMP과 TS 반응이 사람 TS 효소를 불활성화해야한다는 생각(Balzarini et al. (1987), (1993) 위와 같음, 및 Balzarini et al. (1995) 위와 같음)을 뒷받침했기 때문에, 이 결과는 놀라웠다. 상술된 반응이 정제된 성분을 갖는 무세포 시스템에서 행해졌기 때문에, 세포내 환경이 세포 내부에서 NB1011의 자유 뉴클레오티드 모노포스페이트로의 전환 후 TS 불활성화를 가져오는 성분을 제공할 수 있다는 가능성이 남아 있다. 이런 쟁점을 아래에 더욱 상세히 설명한다.
2. rHuTS를 사용한 dUMP과 BVdUMP의 비교 반응 키네틱
세포 및 세포 용해물을 사용하는L. caseiTS(Balzarini (1995) 위와 같음; Balzarini (1987) 위와 같음; 및 Balzarini (1993) 위와 같음)를 이용한 Barr등(1983)에 의해 이전에 보고된 연구는 BVdUMP와 사람 TS의 반응이 효소의 비가역적 불활성화를 가져올 것인지의 여부가 불분명했다. 이 문제를 타개하기 위해서, dUMP의 존재 또는 부재하에, BVdUMP와 rHuTS의 상호작용의 키네틱을 측정했다.
경쟁적 억제가 BVdUMP가 TS 효소를 불활성화하지 않는 반응과 가장 일치된다. 이 상황을 더욱 분명히 하도록 하기 위해서, BVdUMP와 함께 rHuTS의 연장된 인큐베이션을 행하여, 키네틱이 수행되었던 시간 보다 더 오랜 시간에 걸쳐 발생할 수 있는 어떤 불활성화를 측정한다(도 4).
이들 데이타로, BVdUMP와 함께 rHuTS를 20시간 인큐베이션한 후에도, 기질로서 THF DHP dUMP의 전환 속도에 의해 측정된 바, 극히 적은 효소 불활성화가 명백하다. 이 결과는 세포에서, 우선적으로는 TS를 과발현하는 세포에서, 그리고 최종적으로 효소를 불활성화하지 않고, BVdUMP를 세포독성 대사물질로 전환시키는 과발현된 TS의 능력에 대한 희망과 일치한다.
3. TS와 BVdUMP 반응의 특성화: 보조인자 및 억제제
가장 특성화된 TS의 반응은 dUMP의 dTMP로의 전환이다. 이 반응은 N5,N10-메틸렌 테트라히드로폴레이트(THF)로부터 dUMP의 C-5 위치까지 메틸렌기의 수송을 포함한다(Carreras CW (1995) 위와 같음). 이 반응은 보조인자(THF)에 좌우되며, 효소와의 반응에 의하여 안정한 착물의 형성 및 효소 활성의 상실을 가져오는 우리딜레이트 의태성 5F-dUMP에 의해 억제된다. 두번째로 잘 특성화된 TS 활성 억제제는 토뮤덱스이며, 이것은 TS 호모다이머의 폴레이트 결합 부위를 차지하고, THF의 결합을 방지하며, 세포에서 TS 활성을 차단한다(Drake et al. (1996) Biochem.Pharmacol. 51(10):1349-1355; Touroutoglou and Pazdur (1996) Clin. Cancer Res. 2(2):227-243). rHuTS와 BVdUMP의 반응을 특정화하려는 예비적인 노력의 일환으로, 5F-dUMP, 토뮤덱스 및 보조인자의 효과를 효소와 dUMP 및 BVdUMP의 반응에 대해 비교했다. 이들 실험(표 1)은 dUMP의 경우와 유사하게, 5F-dUMP가 BVdUMP의 형광 생성물(들)로의 전환을 방지할 수 있다는 것을 나타낸다. 게다가, 토뮤덱스는 또한 dUMP 및 BVdUMP 모두로부터 생성물 형성을 방지할 수 있다. 그러나, THF는 BVdUMP의 형광 생성물(들)로의 전환이 필요하지 않으며, 이것은L. caseiTS(Barr et al. (1983) 위와 동일)를 사용한 이전에 보고된 결과와 일치한다. 게다가, 표 4에 나타낸 데이타는 THF가 rHuTS와 BVdUMP의 반응에서 형광 생성물(들)의 생성을 자극하는 것을 증명한다. 이 결과는 THF가 이 반응에 대한 효과를 가지지 않는다고 보고한 이전 데이타(Barr et al. (1983) 위와 동일)로부터는 예상되지 않으며, 보조인자, 또는 류코보린과 같은 보조인자 아고니스트가 BVdUMP와 사람 TS의 반응을 조절할 수 있는 잠재적으로 중요한 가능성을 예시한다.
이 반응의 미카엘-멘텐 키네틱의 분석은 dUMP에 의한 BVdUMP의 억제가 rHuTS에 대한 기질로서 거동하는 2개 뉴클레오티와 일치하는, 경쟁 억제에 대한 예상된 형태에 부합한다는 것을 나타낸다.
L. caseiTS를 사용한 이전에 보고된 데이타는 BVdUMP가 dUMP로서 385배 덜 효과적인 기질임을 나타냈다(Barr et al. (1983) 위와 동일, 및 Santi (1980) 위와 동일). 본원에 보고된 실험은 이런 상황이 사람 효소와는 아주 다르다는 것을 나타냈다. rHuTS에 대하여, BVdUMP에 비교한 dUMP의 상대 촉매 효능은 60배이다.이것은 내인성 기질과 비교하여 촉매 효능의 a>6.4배 증가를 표시한다.L. caseiTS를 사용한 이전 결과는, 그것이 다량의 내인성 dUMP와 경쟁해야 하므로, NB1011이 효과적인 치료 기질이 되기에는 세포에서 효소 반응의 효능이 너무 낮다는 것을 예언한다. 본원에 보고된 발견, 즉 사람 효소가 BVdUMP의 전환에 대한 6.4배 개선된 효능을 갖는다는 발견은 NB1011의 유용성을 부여하는 중요한 보조인자이다. 또한,L. caseiTS 효소와 비교하여 사람 효소에 의한 BVdUMP 활용성의 증가된 효능은 가능한 종 특이적 기질이 디자인될 수 있음을 성립한다.L. casei대 사람 TS 표면상의 종 특이적 영역과의 결합에 의하여 이종성 효소를 특이적으로 억제하는 능력이 최근 보고되었다(Stout (1999) Biochemistry 38(5):1607-17 및 Costi et al. (1999) J. Med. Chem. 42(12):2112-2124). 단백질의 가장 고도로 보존된 영역으로 구성된(Carreras (1995) 위와 동일) TS의 활성 부위와 관련 있는 특이성의 차이는 놀라우며 이전에는 보고되지 않았었다.
rHuTS와 BVdUMP의 무세포 효소 반응의 생성물을 질량 분광법으로 분석했다. 도 5에 나타낸 분자구조 I 및 II는 정제된 rHuTS와 함께 BVdUMP를 인큐베이션한 후 TS 반응 혼합물에서 검출된 분자 이온의 질량과 일치하는 질량을 갖는다. 이 반응의 생성물에 관한 지식은 NB1011의 작용에 대한 최종 메카니즘을 이해하는데 사용될 수 있다. 게다가, 이 정보는 TS-BVdUMP 반응의 생성물 자체가 화학치료법으로서 잠재적으로 사용될 수 있으므로, 신규 화학치료법을 디자인하는데 사용될 수 있다.
4. NB1011은 종양 세포에서 모노포스페이트로 전환된다
NB1011은 TS와의 결합을 위한 선행요건으로서, 세포에서 포스포르아미데이트로부터 모노포스페이트로 전환된다. NB1011 포스페이트의 미차폐, 그것의 TS와의 결합, 및 독성 대사물질로의 전환에 대한 제안된 경로를 도 6에 나타낸다.
전환의 중요한 단계가 유리하게 일어났는지의 여부를 측정하기 위해서, 2개의 동등하게 풍부한 동위원소 형태로 자연에 존재한다는 보기 드문 특성을 갖는 브롬 원자를 사용했다. 이런 상황은 BVdUMP의 예측된 큰 이온(411 및 413달톤)에 대한 질량 분광법에 초점을 맞춤으로써, 브롬 함유 모노포스페이트의 검출을 허용한다. H630R10 종양 세포(TS를 높은 레벨로 발현)를 100μM NB1011와 함께 인큐베이션했다. 처리된 세포 용해물의 추출물을 방법에 설명된 바와 같이 제조했다. 액체 크로마토그래피로 초기 정제한 후, 질량 분광기를 사용한 검출은 BVdUMP의 미보호 뉴클레오티드 큰 이온의 형성에 의존했으며, 이것은 역상 크로마토그래피의 머무름 시간과 동일하다.
이들 결과(도 7)는 활성화 경로의 제 1 단계 후, NB1011과 일치한다.
C. NB1011의 세포독성 활성의 특성화
1. 종양/정상 세포 스크린
NB10111의 생물학적 활성을 특성화하는 초기 단계로서, 많은 일련의 정상 및 종양 세포 종류를 NB1011 및 5-플루오로우라실 모두에 대한 민감성에 대해 알라마르 블루 분석으로 시험했다.
분석은 방법에 설명된 바와 같이 수행했다. 치료 지수는 정상 세포의 평균IC50대 종양 세포의 평균 IC50의 비율로서 계산한다. 모든 분석은 적어도 3회 수행했다.
이들 데이타는 NB1011이 TS ECTA 화합물의 주요한 디자인 목표, 즉 정상 세포 종류에 비해서 종양 세포에 대한 증가된 효능을 충족한다는 것을 나타낸다. 전반적으로, NB1011은 정상 세포에 비해서 종양 세포에 약 2배 더 세포독성이며, 5FU는 종양 세포에 비해서 정상 세포에 3배 더 독성이다. 따라서, NB1011의 총 이득은 5FU와 비교하여 NB1011의 치료 지수의 (2)x(3)=6배 개선이다. 양의 치료 지수를 갖는 화학치료법의 선택을 허용하는 중요한 전술은 정상 및 종양 세포 종류 모두에 대한 활성의 스크리닝이다. 이런 접근법은 새로운 암 약물 발견 분야에 시종일관 사용되지는 않고 있다. 예를 들어, 정상 세포 종류에 대한 새로운 후보 화합물의 스크리닝은 National Cancer Institute의 스크리닝 과정(Curt (1996) Oncolog-ist 1(3):II-III)의 일부이다.
2. NB1011는 생체내에서 TS를 불활성화하지 않는다
상술된 결과는 NB1011로부터 세포내적으로 생성된 BVdUMP가 이것의 생성물(들)로의 형질전환 동안 TS를 불활성화하는 것 같지 않다는 것을 나타낸다. 그러나, 무세포 시스템은 세포내 환경과는 다르다. 이 문제를 더 탐구하기 위해서, TS 활성에 대한 세포-기제 분석을 수행했다. 이들 실험에서 외인성 5-(3H) 디옥시우리딘을 세포 배양 배지에 첨가하고, 3중수소수의 유리를 모니터한다(Carreras et al. (1995) 위와 동일, 및 Roberts (1966) Biochem. 5(11):3546-3548). 도 8은 세포배양 배지에 NB1011의 존재가 [3H]2O가 5-[3H]duMP로부터 유리되는 속도를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 이것이 TS의 비가역적 억제의 결과인지의 여부를 측정하기 위해서, NB1011-처리된 세포를 신선한 배양 배지에서 간단히 회수한 후, TS 활성에 대해 분석했다. NB1011이 결여된 배양 배지에서 회수된 세포는 처리되지 않은 세포와 동일한 TS 활성 레벨을 갖는다. 이 결과는 NB1011이 세포내 진행 후 TS 효소를 비가역적으로 불활성화하지 않는다는 제안을 뒷받침한다.
NB1011이 주로 TS를 불활성화함에 의해 세포 성장을 방해하는지의 여부를 이해하기 위해 추가의 접근법을 사용했다. 이 접근법은 TS-차단된 세포의 티미딘 구조를 기초로 한다. 토뮤덱스 또는 5FdUMP(5FdUrd에 의한 처리 후)에 의해 차단된 세포는 새로운 합성에 의해 dTMP를 만들지 않는다. 이런 이유로, 그것들은 단지 스캐빈저 메카니즘에 의해서만 생존한다. 중요한 스캐빈저 메카니즘의 하나는 세포외 티미딘의 활용이다. 표적 세포에 의해 결합된 티미딘은 보통 티미딘 키나제에 의해 dTMP로 전환됨으로써, DNA 합성을 계속할 수 있다. 외인성 티미딘의 사용을 위한 경로가 또한 선택된다. NB1011 활성의 중요한 메카니즘이 외인성 TS의 억제에 의한다면, 세포독성은 티미딘이 세포 배양 배지에 첨가될 때 완화되어야 한다. 이 실험을 위하여, 다수의 종양 셀라인을 토뮤덱스 및 5FdUrd에 대한 민감성, 및 티미딘 보강에 의하여 이들 제제로부터 구조되는 능력에 대해 스크리닝했다. 정상 결장 상피 세포 CCD18co는 NB1011, 5FUdR 및 토뮤덱스에 대한 측정가능한 민감성 때문에 사용했다. 실험은 알라마르 블루 분석(물질 및 방법 참조)을 사용하여 세포독성을 측정한 것을 제외하고는, 1OuM의 티미딘을 사용하거나, 또는 이것 없이 Patterson et al. (1998) Cancer Res. 58:2737-2740)에 설명된 바대로 실시했다. 결과는 토뮤덱스로부터의 15배 구조(6.5nM에서 95nM까지 IC50변화), 5FudR로부터 590배 이상의 구조(0.01μM 미만의 IC50에서 5.9μM 이상까지), 및 10μM 티미딘 존재하에 223μM로 티미딘의 부재에 있어 약간의 감소를 나타냈다.
3. 종양 셀라인에 대한 TS 레벨과 NB1011-매개 세포독성 사이의 관계
TS가 NB1011-매개 세포독성에 참여한다는 확증을 몇가지의 접근법을 사용하여 성립했다; 1) NB1011의 활성을 정상 세포 대 높은 TS 발현 5FU-내성 종양 세포에 대해 시험; 2) 종양 세포 백그라운드로 TS의 트랜스펙션, 및 TS 발현 레벨에 의해 주로 차이가 있지만, 다른 점에서는 매우 유사한 클론 유도체의 생성; 및 3) 세포내 TS 활성을 감소시키기 위한 TS의 특이적 억제제인 토뮤덱스의 사용.
초기 분석에서, NB1011 및 5FUdR-매개 세포독성을 CCD18co 정상 결장 상피 세포 종류 및 H630R10, 5FU-내성 결장 종양 셀라인에 대해 비교했다(Copur S. et al. (1995) Biochem Pharm. 49(10):1419-1426). 이것은 TS를 과발현하는 약물-내성 종양 세포(H630R10)에 대한 세포독성의 측정 뿐만 아니라, 정상 세포(CCD18co)에 대한 세포독성의 측정을 허용한다. 이것은 현재의 화학치료법에 있어 의미 있는 제한이 정상 조직에 대한 그것들의 독성이기 때문에 중요하다. 결과를 표 4에 나타낸다.
이 실험은 5FUdR이 5FU-내성 H630R10 종양 세포에서 보다 정상 결장 세포(CCD18co)에서 약 18배 더 독성이라는 것을 나타낸다. 이 음의 치료 지수는 현재의 화학치료법의 주요한 제한, 즉 정상 조직에 대한 그것의 독성을 특성화한다. 그러한 음의 치료 지수는 또한 독소루비신에 대해서도 보고되었다(Smith et al. (1985) J. Natl. Cancer Inst. 74(2):341-7 및 Smith et al. (1990) Cancer Res. 50 (10): 2943-2948). 그러나, 5FUdR과는 반대로, NB1011은 정상 결장 상피 세포 (2500μM 이상의 IC50)에 비해서 약물-내성 H630R10 세포(IC50=216.7μM)에 대해 11배 개선된 활성을 갖는다. 이 결과는 1) NB1011의 활성은 높은 TS 발현 종양 세포에서 더욱 명백하고; 2) 5FUdR에 비해서 치료 지수에 (18)x(11)=198배의 총 개선이 TS ECTA를 사용하여 달성가능하다.
4. HT1080 종양 세포에서 TS의 과발현은 NB1011에 대한 그것들의 민감성을 증진시킨다
NB1011의 활성화는 여러 단계를 필요로 한다. 이들은 뉴클레오티드 모노포스페이트로의 세포 침투 전환, TS와 결합, 및 이어지는 독성 대사를 포함한다. 세포 침투 및 전환의 정확한 메카니즘은 완전히 정의되지 않고 있다. 세포 침입은 뉴클레오시드 수송 메카니즘에 일부 좌우될 수 있다(Cass et al. (1998) Biochem. Cell Biol. 76(5):761-70). 유사하게, 포스포르아미데이트로부터 모노포스페이트로의 진행은 불충분하게 정의된 메카니즘(Abraham et al. (1996) J. Med. Chem. 8: 39(23):4589-4575)을 사용한다.
이들 결과는 그것들이 균일한 유전적 백그라운드에서, 증가한 TS 레벨이NB1011에 대한 증진된 민감성을 예언한다는 것을 증명하기 때문에 특히 의미 있다. 게다가, 데이터는 증가한 TS 레벨이 플루오로피리미딘에 대한 내성을 예언한다는 것을 또한 나타내며, 이는 문헌에 보고된 바와 일치하는 결과이다(Copur et al. (1995) Bioche. Pharm. 49(10):1419-1426 및 Banerjee et al. (1998) Cancer Res. 58:4292-4296).
5. NB1011-매개 세포독성의 억제제
토뮤덱스는 주로 TS의 억제제에 의하여 작용하는 화학치료법이다. NB1011이 TS 효소에 의하여 세포독성을 발휘한다면, 토뮤덱스를 사용한 TS의 억제는 NB1011-매개 세포독성을 증가시켜야 한다. 이런 가설을 직접적으로 시험하기 위해서, 모 MCF7 셀라인과 비교하여 TS를 11배 과발현하는 토뮤덱스-내성 MCF7 세포를 증가한 농도의 TDX 존재하에 NB1011에 노출시켰다.
세포를 상기 물질 및 방법에 설명된 바와 같이, 플레이팅하고 나타낸 농도의 화합물(들)에 노출시켰다.
데이터는 특이적 억제제 토뮤덱스를 사용한 TS의 봉쇄가 약 25배까지의 NB1011-매개 세포독성의 억제를 가져온다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 NB1011의 활성이 TS에 의한 그것의 대사에 기인한다는 개념을 뒷받침한다.
NB1011의 세포내 대사를 더 이상 특성화하기 위해서, 류코보린(LV; 5-포르밀테트라히드로폴레이트)과의 조합 실험을 수행했다. 이 실험은 우리가 THF가 BVdUMP 및 rHuTS의 무세포 반응에서 형광 생성물(들)의 생성을 자극한다는 것을 관찰했기 때문에 시작되었다. 형광 물질이 NB1011의 세포독성 효과에 관련된다면,배양 배지에 LV를 제공함에 의한 THF의 증진된 세포내 레벨이 또한 NB1011-매개 세포독성 효과를 증진시킬 것이라는 가설을 세웠다. 놀랍게도, 3μM LV의 존재하에, H630R10 셀라인에 대한 NB1011 활성은, 알라마르 블루 분석법에서 측정된 바, NB1011 단독과 비교하여 90% 이상까지 감소되었다. NB1011 활성이 세포내 감소된 폴레이트 풀을 보충하는 LV에 의해 없어진다는 사실은 NB1011이 이들 풀을 감소시킴에 의해 일부 작용할 수 있다는 것을 뒷받침한다. 또는 달리, LV(또는 대사물질)는 TS와의 상호작용을 방해함에 의해 BVdUMP의 대사를 직접적으로 임팩트할 수 있다.
LV가 BVdUMP와 TS의 반응을 직접적으로 임팩트할 수 있는지의 여부를 탐구하기 위해서, 반응을 BVdUMP, 또는 THF+dUMP와 함께 +/-THF, 및 LV 또는 토뮤덱스 (TDX)와 함께 +/-메토트랙세이트(MTX)로 실시했다.
결과(표 6)는 2가지 면에서 놀랍다: 1) 형광 생성물의 증가가 THF의 존재하에 BVdUMP로부터 기록되었지만, 감소된 기질 소모(BVdUMP) 비율이 보조인자의 존재하에 발생했고, 2) 보조인자의 존재하에, 시험된 3개 화합물 모두(MTX, TDX 및 LV)가 BVdUMP + rHuTS 반응을 극적으로 억제했다. 각 경우에서, 억제는 dUMP + rHuTS 반응, 또는 THF의 부재하에 BVdUMP와의 반응에서 보여진 것 보다 더 명백했다.
LV, MTX 및 TDX에 의한 BVdUMP + TS 반응의 억제를 증명하고, 더 이상으로 이 효과가 보조인자(THF)의 존재하에 더 명백하다는 것을 증명하는 상술된 결과는 NB1011 활성이 다른 화학치료법에 의해 조절될 수 있음을 시사한다. 중요하게, NB1011-처리 세포의 구조는 LV를 제공함에 의해 가능하며, 이는 MTX로부터의 LV 구조와 유사하다. MLX의 경우에, LV 구조는 디히드로폴레이트 환원효소 및 TS의 MTX 억제에 의하여 감소되는 세포내 폴레이트 풀의 보충에 의하여 발생한다. 환원된 폴레이트가 TS와 BVdUMP 반응 동안 세포내에서 감소된다면, 별개의 메카니즘에 의해 세포내 티미딘 또는 푸린 뉴클레오티드 풀을 감소시키는 다른 성분은 NB1011과 함께 사용된 때 추가적 또는 상승적인 항-세포 효과를 제공할 수 있다. 그러한 성분(Dorr and Von Hoff (1994) 위와 동일)의 예는 6-메르캅토푸린, 티오구아닌 및 2'-디옥시코포르마이신을 포함하며, 이것들 모두는 푸린 대사를 방해한다. 오로티딜레이트 디카르복실라제의 아자시티딘-매개 억제는 피리미딘 생합성을 차단하고, 이로써 NB1011과는 별개의 메카니즘에 의해 세포에서 세포내 티미딘 레벨을 저하시킬 수 있다.
C. TS ECTA의 약물유전학
1. TS 및 HER2의 비교
신규 치료법의 발견 및 개발을 위한 현 접근법의 중요한 양태는 치료에 대해 가장 반응할 것 같은 환자를 확인하는 능력이다(양의 약물유전 선택). 이 분야의 선구적인 약물 중 하나가 현재 HER2 프로토암유전자를 과발현하는 유방암의 치료에 사용되는 Herceptin이다. 항-HER2 항체를 사용한 초기 데이터는 무작위적으로 선택된 종양 세포 및 정상 세포에 대한 활성이 최소였음을 나타냈다. 그러나, 적어도 4배 증가된 HER2의 발현을 갖는 종양 셀라인이 선택되었다면, 정상 세포 또는 더 낮은 양의 HER2 유전자 생성물을 발현하는 종양 세포와 비교하여, 의미 있는 활성 및 항-HER2 항체가 증명될 수 없었다(Shepard et al. (1991) J. Nat. CancerInst. 74(2):341-347 및 Lewis (1993) Cancer Immural. Immunother. 37(4):255-63).
도 2에 나타낸 셀라인 결과는 TS와 HER2/NEU 시스템 사이의 추가적 유사성을 시사할 수 있다. 이 유사성은 각각이 TS 및 HER2/NEU 과발현 환자 모두에 대해 더 공격적인 질환을 예언하는 유사한 과발현 필요조건(약 4배)을 갖는다는 것이다 (John et al. (1994) J. Clin. Oncol. 12:2640-2647).
2. NB1011은 5FU 및 토뮤덱스-내성 결장 및 유방 종양 셀라인에 대해 활성이다
NB1011이 유망한 항암 활성을 갖기 때문에, 그것을 안전성에 관해 다른 화학치료법과 비교하는 것은 중요하다. 암치료에 NB1011의 효용은 5FU처럼, 다른 악성종양 중에서, 결장 및 유방암의 치료에 주로 사용되는 화학치료법인 토뮤덱스와 비교했을 때 더 강화된다.
결과는 NB1011이 정상 세포에 대해 TDX 보다 대 10배 이상 독성이 낮은 반면, MCF7-TDX 내성 종양 세포에 대해서는 TDX 보다 30배 이상 효능 있다는 것을 나타낸다. 유사한 결과가 다른 TDX-내성 종양 셀라인에 대해서 얻어졌다. 정상 세포에 대한 낮은 레벨의 독성 및 TDXR 종양 세포에 대한 높은 활성은 TS를 과발현하는 약물 내성 암에 대한 NB1011의 사용을 지원한다.
3. NB1011은 dUMP-3H로부터의 트리튬 유리에 의해 측정된 바, TS 활성 보다 TS 단백질 레벨에 더 좌우된다
4가지 종류의 분석법이 세포 및 조직에서 TS 레벨을 특성화하기 위해 사용되었다. 가장 통상적으로 사용된 것은 항체-기체 기법(Johnston (1994) J. Clin. Oncol. 12:2640-2647; Johnston and Allegra (1995) Cancer Res. 55: 1407-1412)이지만, RT-PCR, 5FdUMP-결합 및 트리튬 유리(van Laar (1996) Clin Cancer Res 2(8):1327-33; van Triest (1999) Clin. Cancer. Res. 5(3):643-54; Jackman (1995) Ann. Oncol. 6(9):817-81; Larsson (1996) Acta. Oncol. 35(4):469-72; Lomaki (1995) Breast Cancer Res. Treat. 35(2):157-62; 및 Mulder (1994) Anticancer Res. 14(6B):2677-80)가 또한 여러 가지 연구에서 측정되었다. 셀라인의 특성화를 위하여, 본 출원인은 웨스턴 블롯팅 및 3H-dUMP로부터의 트리튬 유리에 초점을 맞췄다. 항체-검출이 임상 샘플에 대해 통상적으로 사용되고, 표지된 디옥시우리딘으로부터의 트리튬 유리가 세포에서 TS 촉매 활성의 직접 측정이기 때문에, 이들 분석법을 선택했다.
세포를 방법에 설명된 바와 같이 성장시켜서 특성화했다. TS 발현 레벨은 정상 결장 상피 셀라인인 CCD18co에 상대적이다. 트리튬 유리는 방법에 설명된 바와 같이 substracted 백그라운드이다. ND=백그라운드 이상 검출가능하지 않음.
표 7에 제시된 데이터의 분석은 TS 활성(3H-dUMP로부터 트리튬 유리)와 NB1011 민감성 사이 보다 TS 단백질 레벨과 NB1011에 대한 민감성 사이의 관계가 더 밀접함을 나타낸다. 각 세트의 매치된 모 및 약물-내성 종양 세포 종류에서, 모세포 보다 각각 더 많은 TS 단백질을 갖는 약물-내성 유도체가 또한 NB1011에 대한 증가된 민감성을 갖는다. 그러나, 동일한 비교가 TS 활성에 관해 행해졌을 때, 모 셀라인은 주로 비슷하거나, 또는 더 큰 TS 활성을 가졌고, NB1011-매개 세포독성에 대한 민감성은 더 적었다.
이들 결과는 다수의 상이한 메카니즘, 또는 메카니즘들의 조합에 의하여 발생할 수 있지만, dTMP로의 3H-dUMP의 전환(및 수반하는 트리튬 유리)은 어떤 성분, 아마 보조인자 효용성에 의해 제한될 수 있다. 그러나, BVdUMP의 전환이 보조인자에 좌우되지 않으므로, 그것의 TS와의 반응은 보조인자가 제한하고 있는 세포 환경에서 조차 계속될 수 있다. 치료법으로서 TS 기질이 가장 공격적이고 약물-내성인 종양 세포가 그것들의 선구물질 보다 낮은 TS 활성을 갖는다고 관찰된 TS 활성에 대한 전형적인 트리튬 유리 분석의 결과를 토대로 시도될 수 없기 때문에, 이런 관찰이 중요하다. 이들 결과는 항체 염색에 의해 검출된 TS 레벨에 단순히 기초하여 TS ECTA 치료법을 위한 환자를 선택한다는 제안을 추가적으로 뒷받침한다.
4. 종양 샘플에서 TS 레벨은 정상 조직을 능가하여 주로 4배 증가를 초과한다
상기 나타낸 결과는 적어도 NB1011을 사용한 TS ECTA 치료법이 TS를 적어도 4배 과발현하는 암을 갖는 환자에 사용될 때 가장 효과적일 것이라는 것을 시사한다.
문헌(Johnston (1994) 위와 동일; Bathe (1999) Cancer J. Sci. Am. 5(1): 3440; Leichman (1998) Oncol. (Huntingt.) 12(8Suppl. 6):43-7; 및 Lenz(1995) PCR Methods Appl. 4:305-308)은 4배 범위의 과발현이 약 50%의 암에서 발생하며, 더욱이 이 레벨의 과발현이 더욱 공격적인 질환을 예언한다는 것을 시사한다. 사람 결장암에서 TS의 적어도 4배 과발현의 빈도를 확인하기 위해서, 우리는Cooperative Human Tissue Network로부터 매치된 정상 및 종양 샘플을 얻었다. 이들 샘플을 RT-PCR에 의하여 TS mRNA 레벨에 대해 분석했고, 면역조직화학( (Johnston, et al. (1995) 위와 동일)과 비슷한 결과를 얻었다. 샘플의 RT-PCR 평가의 결과를 도 11에 나타낸다.
상기 분석된 7개 샘플 중 5개가 RT-PCR 분석에 의해 측정된 바, 적어도 4배 레벨의 TS 과발현을 갖는다. 이들 환자 중 아무도 화학치료법으로 미리 치료되지 않았으며, 이것은 과발현의 이런 빈도 및 레벨이 침략적인 질환에 관련되며, 화학치료법에 의한 선택으로 인해서가 아니라는 것을 시사한다. 토뮤덱스와 같은 TS 억제제 또는 5FU 또는 5-FdUrd, 5FUdUMP의 동화작용 유도체에 노출된 암세포가 증가된 발현에 대해 선택될 수 있다고 기대된다(Lonn, et al. (1996) Cancer 77(1):107-12). RT-PCR에 의해 측정된 바, 7개 샘플 모두에 대한 평균 과발현도는 약 4.7배이다. 이들 데이타는 종양 초점에서 TS의 4배 과발현 이상이 통상적인 사건임을 시사한다.
5. 5FU-내성 사람 결장암의 실험 치료법
TS를 표적으로 하는 새로운 화합물을 위한 가장 중요한 질환은 위장암이다. 생체내 모델에서 NB1011의 활성을 연구하기 위해서, 5FU-내성 사람 결장암 세포인 H630R10을 누드 마우스에서 50mm3의 평균 종양 크기로 피하에 성장시켰다. 다음에, 미우스를 부형제(DMSO, 5FU 또는 NB1011)을 사용하여 처리했다.
3.5mg, 2.5mg 및 1.25mg 용량의 NB1011을 종양을 지니는 마우스에 종양근처또는 복강내적으로 5일간 매일 투여했다. 도 12A는 종양 성장의 초기 차단이 부형제 또는 5FU 치료된 동물과 비교하여 NB1011을 사용한 5일간의 치료에 의해 유도됨을 나타낸다. 통계적으로 의미 있는 용량 반응 관계가 NB1011 군들 사이에서 증명되지는 않았지만, 6일부터 시작하여 5F 또는 부형제 대조표준에 대하여 NB1011 군들 사이에는 의미 있는 차이가 있다. 이 차이는 치료법이 5일째 중단되었음에도 불구하고, 대조표준 동물이 25일째 희생될 때까지 유지된다.
본 발명은 특정한 구체예와 관련하여 상세히 설명되지만, 여러가지 변화 및 변형이 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 행해질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
효소 키네틱을 방법에 설명된 바와 같이 행했다.Lactobacillus casei에 대한 데이타는 Barr 등(1983, 위와 동일)으로부터 유도한다. rHuTS는 상기 물질 및방법에 기술된 바와 같이 제조했다.
토뮤덱스 및 5-FdUMP에 의한 rHuTS 반응의 억제. 효소 억제제 또는 보조인자를 함유하는 티미딜레이트 신타제 반응물을 물질 및 방법에 설명된 바와 같이 30℃에서 인큐베이션하고, 효소 반응의 초기 속도를 BVdUMP 반응에 대한 여기 340nm, 방출 595nm에서 상대 형광 단위의 증가, 또는 dUMP 반응에 대한 A340에서의 증가를 측정함에 의해 측정했다.
CTF를 갖는 프레임내에서, rHuTS를 코드화하는 cDNA를 벡터 pEGFP-C3로 서브클로닝했다. 이 구성물을 HT1080 세포로 트랜스펙션하고 G418(750ug/ml)로 선택하여, 융합 rHuTS를 안정하게 발현하는 클론을 얻었다. 개별 세포를 방법에 설명된 바와 같이 높거나 낮은 형광 발현을 기초로 클로닝했다. * TS 레벨을 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 측정했고, 정량된 발현 레벨을 세포주 CCDl8co의 레벨에 상대적인 값으로 나타냈다.
토뮤덱스 구조 분석(알라마르 블루)을 방법에 설명된 바와 같이 TDX-내성 MCF7 유방 종양 세포를 사용하여 행했다. "보호 배수"를 TDX가 첨가된 IC50및 TDX가 첨가되지 않은 IC50의 비로서 계산했다.
rHuTS를 사용한 무세포 분석에서, 적합한 기질 및 다른 성분을 방법에 설명된 바와 같이 조합했다. MTX(140μM), LV(140μM) 또는 TDX(5μM)를 가하여 그것들의 억제성 활성을 평가했다. 기질(BVdUMP 또는 THF)의 활용성을 반응 속도의 측정으로 사용했다. 숫자는 남아 있는 활성을 나타낸다.

Claims (25)

  1. 병적 세포를 선택적으로 억제하는 방법으로서, 여기에서 세포는 내인성 세포내 활성 효소의 과발현을 특징으로 하고, 효소는 기질 프로드러그 화합물에 의해 불활성화되지 않으며, 방법은 활성 효소에 의해 세포에서 독소로 선택적으로 전환되는 구조를 갖는 기질 화합물의 유효량과 세포를 접촉시킴으로써, 병적 세포의 증식을 선택적으로 억제하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. (여기에서, R1은 활성 효소에 의한 피리미딘 고리로부터의 추출과 양립할 수 있는 분자 치수 및 친전자성을 갖는 화학적 실체인, 활성 효소에 의한 피리미딘 고리로부터의 유리시에 세포의 증식을 억제하거나 또는 세포를 죽이는 능력을 갖는 이탈기이거나 또는 그러한 이탈기를 함유하며;
    Q는 당, 탄소환식 또는 비환식 화합물, 및 그것들의 차폐된 포스페이트 또는 포스포라미데이트 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다)
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 화합물은 하기의 구조식을 가지며,
    상기 구조식에서, R1은 구조식
    의 부분이고(단, 화합물 I에서 n은 0일 수 있다),
    R2는 불포화 히드로카르빌기;
    하나 이상의 불포화 히드로카르빌기를 포함하는 방향족 히드로카르빌기; 및
    하나 이상의 불포화 히드로카르빌기를 포함하는 헤테로방향족기로 구성된 군으로부터 선택된 2가 전자 콘딧 부분이고,
    R3은
    로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 갖는 2가 스페이서 부분이며,
    R5는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 1 내지 10 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지 알킬기, 또는 3 내지 10 탄소 원자를 갖는 시클로알킬기이거나, 또는 할로겐(F, Cl, Br, I)이고,
    n은 0 내지 10의 정수이고,
    m은 0 또는 1이고,
    R4는
    로 구성된 군으로부터 선택된 톡소포어 부분이고,
    R8및 R9는 저급 알킬이고, R10은 H 또는 CH3이고,
    X는 -Cl, -Br, -I, 또는 다른 강력한 이탈기이며(단, R7이 -H일때, m은 0이고, R4는 할로겐이 아니거나, 또는 m이 0일때 n은 0이고, R4는 할로겐이 아니다),
    Y는 독립적으로 -H 또는 -F이고,
    Z는 독립적으로 -O- 또는 -S-이고,
    Q는
    로 구성된 군으로부터 선택된 부분이며;
    R6은 독립적으로 -H, -OH, -OC(=O)CH3, F, 또는 다른 보호된 히드록실기이고,
    R7은 수소, 포스페이트기, 포스포디에스테르기, 포스포르아미데이트기이며,
    상기 화합물은 D-형, L-형, α-아노머형 및 β-아노머형을 포함하는 어떤 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 또는 입체이성질체 형태일 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 병적 세포가 종양 억제인자 기능 상실의 결과로서 활성 효소를 과발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 활성 효소가 선행 화학치료법의 결과로서 과발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 화학치료법이 플루오로피리미딘 또는 토뮤덱스인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 세포가 초증식성 또는 이상형성성 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 이상형성성 세포가 위암 세포, 유방암 세포 및 결장암 세포로 구성된 군으로부터 선택된 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 활성 효소가 티미딜레이트 신타제인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 활성 효소가 티미딜레이트 신타제, 티로신 키나제 또는 디히드로폴레이트 환원효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 세포 및 활성 효소가 동일한 종인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 제 2의 치료제와 세포를 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 제 2의 제제가 플루오로피리미딘 또는 토뮤덱스인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 시험관내, 생체외 및 생체내에서 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 생체내에서 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 활성 효소가 적어도 4배 과발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 세포내 티미딘 또는 푸린을 감소시키는 화합물의 유효량과 세포를 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 6-메르캅토푸레인, 티오구아닌, 또는 2'-디옥시코포르마이신의 유효량과 세포를 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 (e)-5-(2-브로모비닐)-2'-디옥시-5'-우리딜 페닐 L-알라닌일포스포르아미데이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 프로드러그에 의해 억제되거나 불활성화되지 않는 내인성 세포내 효소에 의해 세포에서 독소로 선택적으로 전환된 프로드러그의 스크리닝 방법으로서, 동일하거나 또는 상이한 종으로부터 내인성 세포내 효소를 발현하는 적어도 2개의 시험 세포와 후보 프로드러그를 접촉시키는 단계, 및 내인성 세포내 효소에 의한 프로드러그의 독성 제제로의 활성화를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 한 시험 세포는 정상 세포이고, 다른 시험 세포는 병적 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 분석법이 질량 분광법에 의한 새포내 대사물질의 분석을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 20 항에 있어서, 후보 제제가 검출가능한 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 검출가능한 제제가 형광 마커인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 20 항에 있어서, 적어도 1개 시험 세포가 초증식성 또는 이상형성성 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
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