CN1391486A - 治疗对治疗有抗性的肿瘤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种选择性抑制病理细胞的方法，其中所述细胞特征在于表达一种内源胞内激活酶，并且其中所述酶不被底物前体药物化合物灭活。该方法要求使细胞接触有效量的底物化合物从而选择性抑制病理细胞的增殖。本发明还提供了筛选通过酶在细胞内选择性将前体药物转化为毒素的前体药物的方法，该方法包括使至少两种表达内源胞内酶的试验细胞与来自相同或不同物种的候选前体药物接触并且测定通过内源胞内酶将前体药物激活为毒素物质的激活作用。

Description

治疗对治疗有抗性的肿瘤的方法
相关申请交叉参考
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求1999年9月14日申请的登记号No.60/1 53855和1999年7月22日申请的登记号No.60/145364的美国临时申请的优先权，其公开内容被引入作为本发明公开的参考。
                          技术领域
本发明涉及癌症治疗领域，更具体地说，涉及治疗对治疗有抗性的肿瘤的组合物和方法。
                          发明背景
该公开文本自始至终，通过第一作者和日期，专利号或公开号引用参考各文献。该说明书中可以看到各参考文献的总文献目录。这些出版物的公开内容被引入本公开文本中作为参考以更详细地描述本发明所涉及的本领域的状况。
癌症对化学治疗的抗性是一个主要的健康护理问题。抗性机理可以分作两种类型：内源性的和获得性的。对于癌症，大多数抗药性是酶介导的。或者是靶酶对化学治疗以太高的水平表达，从而不能阻断其活性同时没有对宿主的不可接受的毒性；或者酶被快速改变化学治疗的染病细胞表达，从而破坏其治疗活性。当染病细胞丧失肿瘤抑制剂基因功能(p53，RB，p16)时，癌症发生对化学治疗的内源性抗性。当该内源性抗性发生时，细胞周期自始至终组成性地表达酶，例如胸苷酸合成酶(TS)和二氢叶酸还原酶(DHFR)(Yeager和Reznikoff(1998)J.Urol.(159)(2)：581-5；el-Deiry(1997)Curr.Opin.Oncol.9(1)：79-87；Goker，Waltham，等(1995)血液(Blood)86(2)：677-84；Banerjee，Ercikan-Abali等(1995)ActaBiochem Pol42(4)：457-64；Fan和Bertino(1997)癌症基因(Oncogene)14(10)：1191-1200；Slansky和Farnham(1996)生物测试(Bioassay)18(1)：55-62；Lenz，Danenberg等(1998)临床癌症研究(Clin.CancerRes.)4(5)：1227-34；和Lee等(1997)表达细胞研究(Exp.CellRes.)234(2)：270-6)。这导致对氟代嘧啶(通过提高TS的表达)或对甲氨蝶呤(通过提高水平的DHER的表达)的内源性抗性的增加。最新治疗的发展大部分限制在开发更好的酶抑制剂，或者对要抑制的新的酶的研究(Hu等(1998)药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)87(7)：886-90；Drake等(1996)生化药理学(Biochem.Pharmacol)51(10)：1349-55；Schultz等(1999)抗癌研究(Anticancer Res.)19(1A)：437-43；Touroutoglou和Pazdur(1996)临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)2(2)：227-43；和Handfield和Levesque(1999)FEMS微生物研究(FEMSMicrobiol.Rev.)23(1)：69-91)。申请人发现了很好地定向表征的酶的治疗的新途径。该项技术与先前的和历史上的对癌症治疗的途径不同，并且称之为“ECTA”，即酶催化的治疗性激活。
                          本发明的公开
本发明提供选择性抑制病理肿瘤细胞的方法，特征在于表达内源性的细胞内激活酶。该方法要求使细胞接触有效量的底物化合物从而选择性抑制细胞的增殖。该底物前体药物化合物不灭活该酶。
本发明还提供抑制通过使至少两种表达内源性的细胞内酶的试验细胞接触候选前体药物而被内源性的细胞内酶在细胞内选择性转化为毒素的前体药物的筛选方法和内源性的细胞内酶将前体药物激活成毒素物质的测定方法。
                   附图简要描述
图1图示说明本发明的ECTA前体药物的作用机理。
图2是说明从溴乙基2’-脱氧尿苷一磷酸(“BVdUMP”)与重组人胸苷酸合成酶(“rHuTS”)培养得到的荧光产物的图。BVdUMP与胸苷酸合成酶(“TS”)的温育导致荧光产物的时间和酶依赖性产生。BVdUMP与指定量的rHuTS在标准反应混合物中在30℃下温育(材料和方法)，但是从反应中省去了N5，N10-亚甲基四氢叶酸。与各数据曲线相邻的数字参见TS酶单位。
图3说明在rHuTS中BVdUMP与脱氧尿苷一磷酸(“dUMP”)竞争。在不存在(三角形)和存在(方形)20μMBVdUMP下，体外进行将dUMP转化为dTMP的胸苷酸合成酶催化的反应。dUMP的浓度范围是10-100μM，N5，N10-亚甲基四氢叶酸浓度是140μM，酶浓度是0.1μM。通过测量A340的增加测定酶活性。
图4说明证明与BVdUMP的预先温育不灭活rHuTS的实验结果。人胸苷酸合成酶在反应混合物中与和不与125μM的BVdUMP预先温育。20小时后，加入BVdUMP至125μM的浓度，dUMP至125μM的终浓度，加入N5，N10-亚甲基四氢叶酸至70μM的浓度。通过测量A340的增加测定胸苷酸合成酶活性。实心圆(预先温育的反应)，虚心圆(没有预先温育的)。
图5是体外反应产物的结构òrHuTS催化的BVdUMP的体外反应的产物的结构。结构I和II与没有细胞的反应混合物中鉴定的质量离子相吻合。
图6是提出的NB1011激活的机理。NB1011一定能够进入细胞并且在与TS反应之前转化为BVdUMP。推测TS转化后产生的结构是外环嘧啶核苷一磷酸。这些化合物可以通过各种机理而对细胞有细胞毒性，包括干扰核苷和核酸代谢。
图7说明对用NB1011处理过的H630R10细胞中BVdUMP的检测。用100μM NB1011将H630R10细胞处理5天，然后进行材料与方法中描述的LC/MS分析。
图8证明NB1011不会在体外不可逆灭活TS。完整细胞内NB1011对TS活性的作用完全是可逆的。根据材料与方法中所述，通过从5-[3H]脱氧尿苷释放[3H]2O测定完整RKO细胞内TS活性。通过更换新鲜培养基，在37℃下培养60分钟，然后重复该过程，从细胞中洗出NB1011。对对照和未处理过的细胞进行相同的洗涤程序。
图9说明NB1011和抗-HER2要求的体外效力之间具有显著的相似性。A).从表3，4和7采集的数据。B).来自Shepard等(1991)临床免疫学杂志(J.Clin.Immun.)11(3)：117-27的数据。纵向条块表示利用Mann-WhitneyU测定计算的平均值的标准误差。
图10说明NB1011具有对托木迪斯(Tomudex)抗性癌症的高活性。根据下面材料与方法所述，在alamar蓝分析中测定对TDX8细胞系的细胞毒性。
图11说明人正常和肿瘤结肠组织中胸苷酸合成酶的转录水平。据下面材料与方法所述进行RT-PCR分析。都校正为β-肌动蛋白的肿瘤与正常组织样品中TSmRNA的比例(从左至右)是14.35，7.31，0.75，59.5，2.53，24.1和4.0。
图12A说明NB1011抑制5-FU抗性结肠癌的生长。治疗携带H630R10(5FU抗性)人结肠癌的裸鼠。在治疗的第一天(第一天)开始测量肿瘤。
图12B是对NB1011的长期反应。第25天对收集的数据进行分析。统计学分析在下面的材料与方法章节中描述。
图13是说明多种人组织中TS的mRNA水平的示意图。通过利用RT-PCR测定TSmRNA水平。定量测定相应于胸苷酸合成酶的DNA带并且通过分子动力学反应(Molecular Dyuamics Storm)校正为β-肌动蛋白的情况。1-20栏表示人正常组织中TSmRNA水平。表达水平表示为相对于结肠(16栏)的值。第21和22栏表示7对结肠正常组织和癌症组织中平均TS转录水平。表达值是相对于正常结肠组织(第21栏)的值。
图14说明用抗胸苷酸合成酶抗体和tubilin进行的SDS PAGE蛋白质印迹估计的用Tomudex或NB1011筛选的细胞内TS表达水平。泳道1表示MCF7细胞，没有用药物选择；泳道2表示用2μM tomudex选择的MCF7细胞；泳道3如泳道2一样表示MCF7细胞，但是之前使用NB1011作为选择试剂进行后续筛选；泳道4如泳道2一样表示MCF7细胞，之前在没有Tomudex下通过。
                    实施本发明的方法
除非另有说明，本发明的实施将应用本领域技术人员公知的分子生物学，药物化学，有机化学，微生物学，细胞生物学和重组DNA的常规技术。参见，例如Sambrook等，分子克隆：实验手册(MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL)第二版(1989)：分子生物学现行方法(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)F.M.Ausubel等编著(1987))；酶学方法(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(AcademicPress.Inc.)：PCR2：实用方法(PCR2：A PRACTICALAPPROACH)(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著(1995))和动物细胞培养(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.Freshney编著(1987))。
如在说明书和权利要求书中使用的，除非清楚指明外，单数形式的“一个”和“这个”包括多数形式。例如，术语“一个细胞”包括细胞的复数，包括其混合物。
术语“包括”意指组合物和方法包括指明的要素，但是不排除其它。当用来定义组合物和方法时，“基本上由…组成”意指排除任何对组合基本上显著的其它要素。因此，如本文定义的基本上由一些要素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法和药学可接受载体例如磷酸盐缓冲液，防腐剂等的痕量杂质。“由…组成”应该指排除比其它成分的痕量要素多的要素和用于施用本发明的组合物的基本方法步骤。这些转换术语各自定义的实施方案在本发明的范围内。
“组合物”意指活性物质与惰性的(例如可检测试剂或标记物或药学可接受载体)或活性的(例如佐剂)其它化合物或成分的组合。
“药物组合物”意指包括使组合物适合体外，体内或离体诊断或治疗的活性物质与惰性或活性载体的组合。
如这里使用的，术语“药学可接受载体”包括任何标准药学载体，例如磷酸盐缓冲液，水，和乳浊液，例如油/水或水/油乳浊液，各种类型的湿润剂。该组合物还包括稳定剂或防腐剂。载体，稳定剂和佐剂的例子参见Martin，REMINGTON’S PHARM.SCI.第15版(MackPubl.Co.，Easton(1975))。
“有效量”是足以得到有利的或期望的结果的量。可以一次或多次给与，施用或给药施用有效量。
“受试者”，“个体”或“患者”在这里互换使用，指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于鼠，猴，人，农场动物，运动动物和宠物。
如这里使用的，术语“接触”包括体外，离体和体内施用前体药物。当体内给药时，对受试者施用有效量前体药物。如这里使用的，术语“受试者”意包括所有的合适的动物模型，例如小鼠，大鼠，兔，猴。也包括对人患者给药。
“对照”是在实验中使用的其他受试者或样品，用于对比目的。对照可以是“阳性”或“阴性”对照。例如，实验目的是测定基因的改变的表达水平与某种特定类型癌症的关系时，一般优选使用阳性对照(携带这种改变并且表现出该疾病特征的症状的受试者或来自受试者的样品)，和阴性对照(没有这种改变的表达和该疾病的临床特征的受试者或来自受试者的样品)。
如这里使用的，术语“病理细胞”，“靶细胞”，“试验细胞”和“过度增殖细胞”包括特征在于细胞内酶的基因突变或内源性过度表达激活的细胞。在一些实施方案中，酶的过度表达与肿瘤抑制剂基因产物功能药物抗性的丧失或与病理表型相关的的基因不稳定性有关。抗药性中涉及多种细胞机理，例如改变的药物代谢，对于活性化合物的细胞的不渗透性或加快药物从细胞的消失，被抑制的酶的特异性改变，靶分子的产生增加，细胞毒性损伤的修复加快，或者改变的生物化学途径抑制的反应的旁路。被激活或过度表达和与抗药性相关的酶包括但不限于胸苷酸合成酶，二氢叶酸还原酶，酪氨酸激酶和多抗药性酶；和ATP-依赖性多抗药性相关的蛋白质，和，在某些疾病中，包括结肠癌和前列腺癌，拓扑异构酶I。或者，对一种药物的抗药性可以转移给其它生物化学上不同的药物。
对化学治疗的抗性中涉及某些基因的扩增。二氢叶酸还原酶(DHFR)的扩增与对甲氨蝶呤的抗性相关而编码胸苷酸合成酶的基因的扩增与对用5-嘧啶治疗肿瘤的抗性相关。根据(Kashini-Sabet等(1988)癌症研究(Cancer Res.)48：5775-5778)美国专利No.5085983所述，通过改进的聚合酶链反应(PCR)可以检测和监测与抗药性相关的基因扩增。通过测定细胞遗传异常，例如均与基因扩增有关的同源染色体染色区和双微染色体，能够监测获得性抗药性。另外的测试包括直接或间接酶活性测定，这两者均与基因扩增相关，和其它方法(例如聚合酶链反应或免疫组织化学)。
或者，病理细胞被表征为具有灭活的肿瘤抑制剂功能，例如已知增强活性酶例如TS的表达的成视网膜细胞瘤(RB)或p53的消除或失活。
治疗方法
一方面，本发明涉及通过使细胞接触通过内源性细胞内活性酶在细胞内选择性转化为毒素的底物前体药物而抑制病理细胞的增殖的方法。本发明的方法和组合物优选用于抑制内源性表达胞内酶的细胞的生长或增殖，这发生在一些过度增殖的细胞或瘤细胞(例如胃癌细胞，结肠癌细胞和乳腺癌细胞)中。是本发明的选择性靶物和前体药物的激活酶的内源性胞内酶的例子包括但不限于胸苷酸合成酶(TS)和二氢叶酸还原酶(“DHFR”)。利用激活胸苷酸合成酶(TS)详细说明本发明的概念。但是，使用TS只是说明性的，不认为权利要求书仅局限于针对TS的体系。胸苷酸合成酶是用于治疗癌症的充分表征的靶物，也已经被用作传染病靶物。胸苷酸合成酶是一种说明性靶物，激活酶，因为其结构和功能的高度表征(Carreras和Santi(1995)Anne.Rev.Biochem 64：721-726)，其由单一基因而不是基因族(例如GST)表达的事实，最后，因为该酶的过度表达预示对化学治疗的抗性和疾病的更加恶化(Johnston和Allegra(1995)癌症研究(CancerRes.)55(7)：1407-12)。
在一个实施方案中，前体药物是具有这里更详细描述中定义的结构的化合物。术语前体药物指活性治疗剂的母体。完美的前体药物是在被期望的机理激活之前是药理学惰性的前体药物。前体药物方案是指对病灶有潜在定向毒性的治疗方法，从而避免全身毒性。针对这一目的已经进行了很多探索。Mead等(1996)癌症研究(CancerRes.)26：2374-2379以及Nichol和Hakala(1966)生化药理学(Biochem.Pharmacol.)15：1621-1623报道了用于癌症治疗的前体药物的第一次尝试。该尝试的指导性原理是在甲氨蝶呤-抗性白血病中靶向过度表达二氢叶酸还原酶。因为在甲氨蝶呤-抗性肿瘤细胞中二氢叶酸还原酶的升高可能会将高叶酸转化为对胸苷酸合成酶的代谢毒物，期望有肿瘤细胞的自身毒性。后来发现高叶酸的合理的抗肿瘤效果不是由于代谢激活，而更可能是由于对叶酸转运到细胞内的抑制作用(Livingston等(1968)生物化学(Biochem.)7(8)：2814-2818)。下面的表1中汇总了用于进行治疗的裂解肿瘤的选择性靶物的前体药物-样尝试。
                            表1.前体药物方案比较
    技术 缩写     说明     主要参考文献
  代谢激活 没有     通过‘致死性合成’的叶酸类似物向毒素的转化     Mead等(1996)上文
  抗体控制的前体药物治疗 ADEPT     抗体-酶复合物结合肿瘤选择性抗原。施用前体药物并且当其遇到抗体结合的酶时被激活。     Syrigos和Epenetos(1999)抗癌研究(AnticancerRes.)19(1A)：605-13
  基因控制的前体药物治疗 GDEPT     编码激活酶的基因被转导到大T细胞中     Connors和Knox(1995)干细胞(StemCells)13：501-511
  酶控制的前体药物治疗 EDEPT     施用前体药物，其被只是在肿瘤位点处高水平存在的胞外酶激活。     Breistol等(1998)欧洲癌症杂志(Eur.J.Cancer)34(19)：1602-0606
  肿瘤激活的细胞毒素 “TAC”     谷胱甘肽-s-转移酶激活的前体药物     Morgan等(1998)上文
  酶催化的治疗激活 ECTA     作为肿瘤抑制剂基因丧失和通过化学治疗体内筛选的结果的过量表达的酶激活前体药物     如本文公开的
下面结果的一项或几项混淆了这些探讨：a)适当定位激活酶和/或缺少靶向酶的肿瘤选择性；b)激活的前体药物的系统分布和得到的毒性；和c)实现需要的防止被除靶向的酶之外的酶激活的底物酶特异性。例如，Morgan等(1998)癌症研究(Cancer Res.)58：2568-2575描述的谷胱甘肽-s-转移酶(GST)前体药物，在对GST有特异性的同时，不只是对肿瘤过度表达的GST-P1-I有特异性，而且也能被GST-A1-1激活。这导致不适当的药物激活作用和潜在的毒性。在上文表1中提供的引用参考文献中更详细讨论了很多这样的论述。通过提供靶向酶的前体药物(所述酶由于转录激活和/或肿瘤抑制剂基因丧失后发生的基因扩增而在肿瘤细胞中选择性过度表达)，本发明的方法和组合物避免了现有技术前体药物的缺点。
在本发明的另一个方面中，激活酶被表征为在大多数癌症中，并且特别是在已经接受氟代嘧啶治疗(5-FU，5-FudR，Xeloda)或者其它TS抑制剂(例如Tomudex)的癌症中，过度表达(丧失所有的p53，RB或p16肿瘤抑制剂功能的那些)。本发明的前体药物进一步表征为对正常细胞基本上没有毒性。该方面进一步增强前体药物的选择性，因为只有异常或病态细胞提供有效量的前体药物的有毒代谢产物来抑制细胞增殖，并且更优选地，选择性杀死细胞。事实上，申请人第一次注意到通过本发明的方法和前体药物选择性杀死表达比正常量多的激活酶的细胞而不关酶的活性，例如TS活性，正如Roberts(1966)生物化学(Biochem.)5(11)：3546-3548测定的。因此，术语“过度表达”指TS蛋白质的总量，而不是根据氚释放(Roberts(1966)上文)测定的TS酶活性。在下面的实验章节中证明这一点。
开发药物的焦点在于抑制剂。抑制剂的基本原理是与大多数正常细胞相比，大多数肿瘤细胞在体内更频繁地分裂。结果，肿瘤细胞中TS的平均量比它们的正常细胞中TS的平均量高。用这些化合物发现有限药效，伴随明显的剂量-限制性毒性。二十世纪中叶发展到广泛应用这些化合物，氟代嘧啶类，并且发现其在治疗晚期胃肠癌的用途(Heidelberger等(1983)酶学相关领域分子生物学进展(Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.)54：58-119)。5-氟代尿嘧啶的最初发展具有另外的支持和Heidelberger发现的基本原理，即在细胞培养中，与正常细胞相比，肿瘤细胞更快代谢尿嘧啶(Heidelberger等(1957)氟代嘧啶及其核苷，“实验药物学手册”(Handbook ofExperimental Pharmacology)pp.193-231)。治疗反应速度一直在大约25-30％左右。没有治疗的患者通常存活大约6个月，用氟代嘧啶治疗，存活至多一年(Midgley和Kerr(1999)Lancet 353(9150)：391-9和van Laar，Rustum等(1998)欧洲癌症杂志(Eur.J.Cancer)34(3)：296-306)。
持续开发可替代的药剂的方案或新的抑制TS活性的方法很少能使或不会使存活率提高。例如，开发更完美的TS抑制剂，例如Tomudex，没有导致存活率的显著提高，但是Tomudex的毒性曲线与氟代嘧啶不同(Blackledge(1998)英国癌症杂志(Br.J.Cancer)77(增刊.2)：29-37)。最后，因为氟代嘧啶治疗和Tomudex治疗都导致TS水平升高，发现明显的交叉-抗性。用氟代嘧啶无效用Tomudex也难治(Farrugia(1998)欧洲癌症杂志(Eur.J.Cancer)34(7)：987-91)。当前的状况是开发通过新的机理进攻5FU/Tomudex抗性肿瘤细胞的化学疗法。
本发明的另一方面是通过对受试者施用治疗有效量的前体药物治疗受试者病理细胞的方法，所述前体药物通过如上定义的内源性胞内酶在细胞内转化为毒素。该酶是“过度表达”的并且接受治疗的细胞是肿瘤细胞或癌细胞。
当对受试者例如小鼠，大鼠或人施用前体药物时，可以将前体药物加到药学可接受载体中并且全身给药或局部给药。
为了确定可以有利地接受治疗的患者，要从患者取出肿瘤样品并且对细胞测定靶酶的表达水平。如果表达高于在正常细胞中的表达使得毒性量的前体药物会引起给药并且没有不期望的副作用，则测得该肿瘤或细胞有利地可接受治疗，因此，该患者适合本发明的治疗。例如，与正常细胞相比，靶酶表达至少高大约2倍并且优选至少大约3倍更优选高于4倍，则该患者是适合接受本发明治疗方法的患者。可以根据经验确定治疗量，并且治疗量随着治疗的病理状态，被治疗的患者和转化的前体药物或细胞毒素而不同。
当送递给动物时，该方法用于进一步证明前体药物的药效。作为动物模型的一个例子，分别用大约105至大约109个如上定义的过度增殖的癌细胞或靶细胞皮下接种裸鼠组(Balb/cNCR nu/nu雌性Simonsen，Gilroy，CA)。当有了肿瘤时，施用前体药物，例如，通过在肿瘤周围皮下注射。一周两次用venier卡尺两维测量肿瘤以确定肿瘤体积的减小。如果合适也可以使用其它动物模型。在下文的材料与方法章节中举例说明了该方法。
以一次剂量，或者在整个治疗过程中连续式或间歇式进行体内给药。测定最有效方式和施用剂量的方法对于本领域技术人员是公知的并且随着用于治疗的组合物，治疗的目的，和治疗的靶细胞而不同。通过治疗医生选择的剂量水平和方式进行一次或多次给药。下面可以看到施用前体药物的合适的剂量形式和方法。
本发明的前体药物和组合物可以用于制备药物和通过根据常规方法例如在药物组合物中的活性成分给药用于治疗人和其它动物。
药物组合物可以口服，鼻内，肠胃外或通过吸入疗法给药，并且可以是片剂，锭剂，颗粒剂，胶囊，丸剂，安瓿，栓剂或气雾剂形式。它们也可以是活性成分在含水或不含水稀释剂中的悬浮液，溶液和乳浊液形式，糖浆，颗粒剂或粉末剂形式。除了本发明的化合物之外，所述药物组合物还可以含有其它药物活性化合物或多种本发明的化合物。
更具体地说，本发明的结构式的化合物也在这里指作活性成分，可以通过任何合适的途径施用用于治疗，包括口服，直肠，鼻，局部(包括经皮，气雾剂，含剂和舌下)，阴道，肠胃外(包括皮下，肌内，静脉内和皮内)和肺内。还要理解优选途径将随着接受者的状况和年龄以及治疗的疾病而不同。
一般情况下，对于各上述化合物的合适的剂量是每天每公斤接受者体重大约1至大约100毫克范围内，优选每天每公斤接受者体重大约1至大约50毫克范围内，最优选每天每公斤接受者体重大约1至大约25毫克范围内。除非另有说明，所有的活性化合物重量对于盐或者其酯以本发明的母体化合物来计算，重量将按比例增加。一天内以合适的时间间隔施用两次，三次，四次，五次，六次或更多次亚剂量。可以以单位剂量形式施用这些亚剂量，例如每单位剂量形式含有大约1至大约100毫克，优选大约1至高于大约25毫克，最优选大约5至高于大约25毫克的活性成分。要理解本发明的化合物和组合物的剂量可以依赖于疾病类型和严重程度和阶段，并且可以随着患者与患者的变化而不同。确定最佳剂量一般涉及本发明的治疗有益水平与任何风险或不利的副作用的平衡。
理想情况是，施用前体药物实现在病灶处活性化合物的最高浓度。例如，通过静脉内注射，任选地，在盐水中，或者口服，例如，作为含有活性成分的片剂，胶囊或糖浆来实现。通过连续输液到疾病组织中以提供治疗量的活性成分可以保持期望的前体药物的血液水平。操作组合的应用涉及提供比单独使用各治疗化合物或方法可能需要较低剂量的前体药物从而降低副作用的治疗组合。
对于癌症治疗的性质和基础讨论在不断地变化。这种变化是对疾病的分子基础的更好理解的结果。在这些新领域的研究导致对非恶性疾病的实验性的，或者在某些情况下是日常性的应用。用于细胞毒性抗肿瘤治疗的相同药物成为于下面治疗方案的的重要组成部分：类风湿性关节炎(甲氨蝶呤和环磷酰胺)，器官移植(甲氨蝶呤和硫唑嘌呤)，镰状细胞性贫血(羟基脲)，抗-感染性化学治疗(trimetrexate和亚叶酸)，和牛皮癣(甲氨蝶呤)。因此，许多内科、外科和儿科专家使用这些药物用于肿瘤和非肿瘤疾病。对这些疾病机理的理解也可以帮助确定对治疗疾病(包括癌症)的药物组合的更好方法。例如，现在已知通过不同机理起作用的不同化学治疗，并且合适的组合能导致协同效果。NB1011通过被胸苷酸合成酶激活而起作用，并且推测得到的异常核苷酸干扰核苷酸代谢中的多个步骤(图6)。与通过不同的机理起作用的化学治疗或生物疗法结合应该给出增强的或协同的活性。这样的化合物的例子包括：1)阿霉素，其通过多个机理起作用，包括DNA插入和自由基形成；2)拓扑异构酶抑制剂(象topotecan)，其诱导DNA在复制期间单链断裂；3)抗激素，包括抗雌激素(例如三苯氧胺)或抗雄激素(例如氟硝丁酰胺)，或生物制品，象干扰素(例如内含子A)。在后面这些情况下中，通过关连激素；诱导多条途径(包括诱导胞内核酸酶和抑制癌基因表达)的干扰素，抗激素抑制生长刺激。通过利用烷基化试剂，象氮芥子气，其修饰和灭活很多细胞成分，但是最重要的是修饰DNA配对和编程性细胞死亡，也可以看到与NB1011的协同作用。
将这里描述的前体药物与上述另外的治疗结合是本发明的另一方面。例如，这里描述的前体药物优选与通过不是通过本发明前体药所经途径发挥它们的毒性作用的药物结合。所述另外的治疗化合物包括但不限于：制管张素，抗雌激素和拓扑异构酶抑制剂。另外，本发明的前体药物和方法可以与完全根治肿瘤的手术或放疗结合。
可以有多种方法确定治疗方法是否达到了目的。这包括但不限于RT-PCR分析，生长抑制研究(alamar蓝测试)和噬菌斑测定。这些方法是本领域公知的并且在本文中有所描述。
申请人也发现用底物前体药物处理过的细胞可以转化为适当地通过常规疗法处理的先前的表型。用TS作为例子，申请人证明用5-FU处理过的癌细胞变得对药物有抗性。此时，用NB1011处理细胞。亚群成活并且变得对NB1011有抗性但是再次获得对5-FU的敏感性(参见表9和图14)。因此，本发明提供了上述方法，其中有效量的另一种活性剂与本发明的底物前体药物一起施用。一方面，第二种或第三种活性剂是细胞对其预先产生抗药性的药物。所述另外的活性剂可以在施用底物前体药物的同时或随后给药。
本发明进一步提供了与对应的正常细胞相比病理细胞过量产生或过度表达的激活酶选择性转化的前体药物；例如动物细胞，哺乳动物细胞，或人细胞。申请人发现几种实施本发明的优选前体药物。这些化合物的结构和合成方法在下面的材料与方法中描述。
本发明的另一方面是通过对受试者施用有效量前体药物治疗受试者的方法，所述前体药物被这里定义的激活酶细胞内转化为毒素。另一方面，在施用底物前体药物的同时或随后共同施用有效量的至少一种另外的治疗活性剂。
筛选测试
本发明进一步提供筛选前体药物的方法，通过提供至少两种表达激活酶的试验细胞并且使该细胞接触候选前体药物，在病理细胞中所述前体药物被选择性转化为毒素。测试所述酶将该前体药物激活为毒物的反应。在一个实施方案中，第一种试验细胞是如上定义的病理细胞，另一种试验细胞是表达正常水平酶的对应的正常细胞。另一方面，可检测标记的候选前体药物。在一个实施方案中，可检测标记是荧光标记。在另一个实施方案中，可检测标记是相同原子例如溴原子的至少两个或多个不同的同位素。在该实施方案中，人们通过反应产物的质谱能检测前体药物修饰为毒性副产物。通过纯化毒性产物并且接着分别测定其选择性抑制病理细胞的增殖并且对正常细胞不产生可分辨的毒性的能力证实产生了毒性代谢产物的候选活性剂的治疗疗效。通过对上述合适的动物模型施用前体药物和毒性代谢产物能够实现进一步证明。
如这里使用的，试验细胞可以是表达所述酶或者被转化表达所述胞内酶的原核细胞或真核细胞。例如，不内源性表达胞内酶TS的原核生物大肠埃希氏杆菌是合适的宿主细胞或靶细胞。类似于上文对真核细胞所述进行大肠埃希氏杆菌的转染。或者，测试细胞可以是从受试者分离的病理细胞，或者表达所述酶的培养细胞。细胞可以有对照对应物(缺少靶酶)，或者在另一个实施方案中，是经基因修饰差异表达靶酶或酶(表达不同水平靶酶)的对应物。可以使用一种以上的酶来分别转导各宿主细胞，使得候选药物对靶酶的作用同时与其对另一种酶或者来自另一物种的相应的酶的作用相比较。
在另一个实施方案中，将第三靶细胞用作阳性对照，因为其接受有效量的化合物，例如下面给出的化合物，它们是有效的前体药物。
Ras-转化的NIH3T3细胞(ATCC，10801 UniversityBLVD.，Manassas，VA 20110-2209，美国)是合适的真核细胞。对细胞进行基因工程处理使从编码所述酶的克隆cDNA可变量和渐增量表达感兴趣的靶酶。转染是使用本领域公知的方法和上文Sambrook等描述的方法的瞬时转染或永久转染。插入所述cDNA的合适的载体是从Stratagene，La Jolla，CA和其它供应商处购得。使用预先产生的抗所述酶的单克隆或多克隆抗体用于免疫检测，通过细胞溶胞产物中的免疫印迹和免疫测试，可以监测各转染的细胞系中酶的表达水平。通过导入到细胞中的表达盒的拷贝数或者通过利用不同的启动子可以调节表达量。也可以根据Carreras和Santi(1995)(上文)或下文描述的方法来进行检测表达的酶的量的酶测定。
试验细胞在小的多孔板上培养并且被用来测定试验前体药物的生物活性。为了本发明目的，成功的候选药物将抑制病理细胞的生长或者杀死它但是不伤害对照细胞型。
可以将候选前体药物直接加入细胞培养基中或者预先偶联一种对细胞表面受体特异性的配体然后加入培养基。细胞特异性送递的偶联方法是本领域公知的，参见例如美国专利No.5459127；5264618；和公开的专利说明书WO91/17424(1991年11月14日公开)。候选前体药物的离去基团可以用例如氚可检测性标记。然后对靶细胞或培养基测定从候选前体药物释放的标记的量。或者，通过使用本领域公知的方法将前体药物包装到脂质体中或者与细胞转染剂组合(这也是本领域公知的)可以增强细胞摄入。
应该明白，尽管不总是明确地陈述，但是通过提供不同的靶细胞作为对照通过接受有效量的化合物(例如下面给出的化合物(已经证明其是潜在的前体药物))可以进一步改动各实施方案。
这里还提供了本方法鉴定的活性剂。
利用上述筛选，人们也可以从获自受试者(例如人患者)的样品预筛选几种前体药物。人们可以利用该项筛选来测定最有效的底物前体药物和针对各靶酶和受试者的治疗。该方法在上文中作了更详细的描述。
本发明的前体药物
I.材料与方法
A.合成方法
通过Dyer等的方法(Dyer等(1991)核酸化学：改进的和新的合成方法，方法和技术，Townsend等(编著)John Wiley&Sons，Inc.，纽约，pp.79-83)制备(E)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脱氧尿苷(BVdU)。在真空下在75℃下分别干燥该化合物和购得的(Fisher/Acros)5-氟-2’-脱氧尿苷(5FdU)，在使用之前用P2O5干燥。在Chromatotron仪器(HarrisonResearch，Palo Alto，CA)上进行径向层析，使用带有荧光指示剂的Merck硅胶-60作为吸附剂。通过BVdU的标准化学磷酸化作用制备(E)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脱氧尿苷5’-一磷酸(“BVdUMP”)。
在Varian Associates Gemini分光计上在300MHz处记录NMR 1HNMR谱，使用六氘化-二甲亚砜(C2H3)2SO溶液。以d＝0.0ppm内标四甲基甲硅烷参照物相对表示化学位移。在75MHz处记录13CNMR谱，以d＝39.5ppm内标五氘化-二甲亚砜相对表示化学位移。在Bruker光度计上在202MHz处记录31P NMR谱，以d＝0.0ppm外标85％H2O/15％H3PO4，体积/体积比，相对表示化学位移。
如下制备NB1011(E)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脱氧-5’-尿苷基苯基L-丙氨酰基氨基磷酸酯(BVdU-PA，“NB1011”)。氩气下滴加苯基L-甲氧基丙氨酰基偶磷氯化物(McGuigan等(1996)，药物化学杂志(J.Med.Chem.)39：1748-1753)(15滴，350毫克，1.26毫摩尔)处理2毫升无水DMF中BVdU(420毫克，1.26毫摩尔)和咪唑(103毫克，1.51毫摩尔)的溶液，并且将反应混合物在23℃下氩气下搅拌24小时。通过在硅胶上用10％MeOH/90％CH2Cl2，体积/体积，作为洗脱剂进行TLC，从起始物(Rf＝0.53)产生转化产物(Rf＝0.70)，但是只是一定程度(大约15％)，因此加入另外的咪唑(52毫克，0.75毫摩尔)和偶磷氯化物试剂(8滴，175毫克，0.63毫摩尔)，并且将该混合物在23℃下氩气下再搅拌24小时。通过TLC监测，转化率提高到大约30％的程度。下面用另外的偶磷氯化物和咪唑处理一点也不促进反应的进展。通过在不等于40℃下真空下旋转蒸发将溶液减少至0.75毫升体积，然后加入等体积的二氯甲烷，将溶液直接施加给干燥4毫米硅胶板。此时，如果通过将该板放入真空干燥器中30分钟去除大部分残留的DMF则有利于下面的处理。使用250毫升二氯甲烷(来洗脱残留试剂和DMF)，接着用10％甲醇/90％二氯甲烷，体积/体积(来洗脱产物之后洗脱起始物)，进行径向色谱，得到144毫克(20％)中间体(3)和294毫克起始物，以没有回收的起始物为基础，得到67％产率的转化产物。通过1HNMR检测是否存在杂质咪唑(d＝7.65和7.01)或DMF(d＝7.95，2.89和2.73)，进行另外的径向色谱纯化。以这种方法，获得转化产物，TLC和1HNMR检测纯度是98％，为磷原子中心基非对映体接近等摩尔混合物，是油/胶或泡沫-粉末形式：1H NMR((C2H3)2SO)d＝11.4(bs可与2H2O交换，1，N3H)，8.28(假-t，1，H6)，7.35(假-t，2，o-Ph)，7.31(d，1，乙烯基1H)，7.20(假-t，3，m-和p-Ph)，6.89(d，1，乙烯基2H)，6.19(t，1，H1′)，6.08(t，可与2H2O交换，1，丙氨酰基NH)，5.45(bs，可与2H2O交换，1，O31H)，4.32(m，1，H3′)，4.22(m，2，5′CH2)，3.97(m，1，H4′)，3.86(t，1，丙氨酰基CH)，6.58(两个s，3，CO2Me)，2.15(m，2，2′CH2)，1.23(假-t，3，丙氨酰基CH3)，J乙烯基CH-丙氨酰基NH～6Hz.用1H/1H COSY 2D NMR分析确定光谱转移。13C NMR((2H3O)2SO))d＝173.7和173.6(丙氨酰基CO2)，162.1和161.6(C2)，150.61，150.5(ipso-Ph)，149.2(C4)，139.4和139.2(C6)，129.8和129.6(M-Ph)，124.7(P-Ph)，120.3，120.2(o-Ph)，107.1(乙烯基C1)，87.5(乙烯基C2)，84.8(C4′)，83.8(C1′)，70.1(C3′)，66.1(C5′)，51.9(丙氨酰基OMe)，49.7(丙氨酰基α-H)，29.5(C2′)，19.6(丙氨酰基α-Me)，3JP-C4′＝7.8，2JP-C5′＝4.4，2JP-ipso-Ph＝6.5Hz.31P NMRd＝3.99，3.69低分辨率DCI(NH3)，质谱：593/591(MNH4 +)，576/574(MH+)。
只是为了方便，将本发明方法中使用的前体药物的结构分为I组和II组。
I组化合物的一般合成
I组化合物的L和D异构体具有下面的结构：
Figure A0081286800241
在上面的结构式中，(5-位)R1是或者包含离去基团，其是具有与从嘧啶环的分离相适应的分子大小和亲电性的化学个体并且其从嘧啶环释放时具有抑制细胞增殖或杀死细胞的能力。
在上面的结构式中，Q是糖，是碳环或非环化合物，或者是其掩蔽的磷酸酯或氨基磷酸酯衍生物。选自糖基，硫代糖基的化学个体，Q是或包含碳环基团和其衍生物。糖基的例子包括但不限于单糖环状糖基，例如从氧杂环丁烷(4-元环糖)，呋喃糖(5-元环糖)，和吡喃糖(6-元环糖)衍生的那些基团。呋喃糖的例子包括呋喃苏-糖基(来自苏糖，一种4碳糖)；呋喃赤藓糖基(来自赤藓糖，一种4碳糖)；呋喃核糖基(来自核糖，一种5碳糖)；呋喃阿拉伯糖基(也称之为阿拉伯呋喃糖基；来自阿拉伯糖，一种5碳糖)；呋喃木糖基(来自木糖，一种5碳糖)和呋喃来苏糖基(来自来苏糖，一种5碳糖)。糖基衍生物的例子包括“脱氧”，“酮”和“脱氢”衍生物以及取代衍生物。硫代糖基的例子包括上述糖基的硫类似物，其中成环氧原子被硫原子置换。碳环基团的例子包括可以进一步具有一个或多个取代基(例如-OH基团)的C4碳环，C5碳环，和C6碳环。
在一个实施方案中，Q是下式的β-D-呋喃核糖基
其中R7选自H，掩蔽的磷酸酯或氨基磷酸酯及其衍生物，并且其中R2和R3是相同或不同的并且独立地是-H或-OH。
在上式的一些实施方案中，R1是链烯基，即(-CH＝CH)n-R4，其中n是0或1-10的整数，R4是卤原子(例如I，Br，Cl)，或CN或汞。R2是H而R3是-OH或者R2是OH而R3是H或者R2和R3是H或者其中R2和R3是OH。
另一方面，R4是或包含选自H，烷基，链烯基，炔基，羟基，-O-烷基，-O-芳基，-O-杂芳基，-S-烷基，-S-芳基，氰化物，氰酸酯，和硫代氰酸酯卤代乙烯基，卤代汞基，-S-杂芳基，-NH2，-NH-烷基，-N(烷基)2，-NHCHO，-NHOH，-NHO-烷基，NH2CONHO-，和NHNH2的基团。在这些实施方案中，其它方面包括：其中R2和R3是H；其中R2是OH和R3是H；其中R2是H而R3是OH；或者其中R2和R3是OH。
R1位取代基优选实施方案是可以有烯丙基互换的基团。
在另一方面，所述候选治疗剂是下式的化合物：其中n是0-10的整数；其中A是磷衍生物，或者是下式的化合物：
其中Q选自H，如上定义的未取代的或取代的糖和如上定义的取代的或未取代的碳环。
其中R＝2’-脱氧-5-尿苷基，m是0或1，而n是0-10的整数。
在适当情况下，化合物可以是它们的对映异构体，非对映异构体或立体异构体形式，包括，例如D-或L-构型，并且可以是任何立体化学构象，包括，例如α-或β-端基差向异构体形式。
通过本领域公知的方法能实现上述5-取代的嘧啶核苷和5-取代的嘧啶核苷一磷酸的合成。例如，在Li2PdCl4存在下用卤代烷基化合物，卤代乙酸酯或卤代链烯烃处理5-氯代汞基-2’-脱氧尿苷，导致通过有机钯中间体分别形成5-烷基，5-酰基或5-酮链烯基衍生物。嘧啶核苷和核苷酸的C5-修饰的另一个例子是通过用乙酸汞处理接着在Li2PdCl4存在下加入苯乙烯或环-取代的苯乙烯形成C5-反-苯乙烯基衍生物。Bigge等(1980)美国化学学会会刊(J.Am.Chem.Soc.)102(6)：2033-2038。通过在50℃下用乙酸盐缓冲液中的乙酸汞处理3小时使嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸用汞在嘧啶环的5位衍生化。Dale等(1973)PNAS 70(8)：238-2242。预计这样的处理对修饰一磷酸酯也是有效的；或者，被修饰的三磷酸酯可以酶促转化为修饰的一磷酸酯，例如，通过用碱磷酸酶控制处理接着纯化一磷酸酯。分子性能类似于汞但是具有优选的药学性能的有机或无机的其它部分可以被取代。关于合成取代的嘧啶的一般方法参见例如美国专利No.4247544；4267171；和4948882；和Bergstrom等(1981)有机化学杂志(J.Org.Chem.)46(7)：1432-1441。上述方法也可以应用于包含除了核糖或2’-脱氧核糖(例如2’-3’-二脱氧核糖，阿拉伯糖，呋喃糖，来苏糖，五糖，六糖，七糖和吡喃糖)之外的糖的5-取代的嘧啶核苷和核苷酸的衍生物的合成。5-位取代基的一个例子是卤代乙烯基，例如E-5-(2-溴乙烯基)-2’脱氧尿苷酸，Barr等(1983)，上文。为了本发明的目的，如下所述合成上面结构式的两个实施方案的合成。
或者，从Glen Research，Sterling，VA(USA)，Sigma-AldrichCorporation，St.Louis，MO(USA)，Moravek Biochemicals，Inc.，Brea，CA(USA)，ICN，Cost a Mesa，CA(USA)和New England Nuclear，Boston，MA(USA)购得5-溴脱氧尿苷，5-碘脱氧尿苷及其一磷酸衍生物。使用从Glen Research，Sterling，VA(USA)和ICN，Costa Mesa，CA(USA)购得的试剂通过激酶作用，用化学方法或酶学方法可以将购得的5-溴脱氧尿苷和5-碘脱氧尿苷转化为它们的一磷酸酯。这些卤原子衍生物可以与其它取代基组合产生新的而且更有效的抗代谢物。
II组化合物的一般合成
II组的化合物包括四类化合物。每一类由尿嘧啶碱基或修饰的尿嘧啶碱基的结构定义。它们是ECTA化合物，其中：I)碱基是尿嘧啶的呋喃基-嘧啶酮衍生物；II)碱基是6-氟尿嘧啶；和III)碱基是4-腙取代的尿嘧啶衍生物和IV)碱基是尿嘧啶。使用尿嘧啶或修饰的尿嘧啶衍生物合成5位被毒性离去基团取代的化合物，通过在5-位电子轨道的链连接，并且包括电子轨道和毒性离去基团之间的间隔基团部分。ECTA化合物包含“Q”，其可以是没有被磷酰化的，5’一磷酸酯，5’-磷酸二酯，或5’-保护的(“掩蔽的”)脱氧尿苷或者R7位可替换的碳水化合物部分的可比较的衍生物并且如下所述。保护的5-取代的脱氧尿苷一磷酸衍生物是其中通过连接合适的化学保护基而封闭磷酸部分的那些。5-取代的脱氧尿苷一磷酸衍生物的保护能够改进溶解性，有利于细胞渗透，有利于通过血脑屏障，并且防止细胞或胞外磷酸酶的作用，其可能另外导致磷酸根基团的失去。在另一个实施方案中，对具有核苷激酶活性的细胞施用5-取代的尿嘧啶或尿苷衍生物，其中5-取代的尿嘧啶/尿苷衍生物被转化为5-取代的尿苷一磷酸衍生物。也可以修饰尿苷衍生物以提高它们的溶解性，细胞穿透性和/或越过血脑屏障的能力。
胸苷酸合成酶对5-取代的尿苷一磷酸衍生物的作用可以释放与嘧啶环的5-位连接的取代基(“离去基团”)。释放的取代基然后能内在地或与另一种细胞成分进行反应后，作为毒素或细胞增殖的抑制剂起作用。
本发明的化合物的L和D异构体选自具有下面结构式的化合物：在上述结构式中，R1是下式部分：
Figure A0081286800282
在上述结构式中，R2是或包含二价电子轨道基团。在一个实施方案中，R2是或包含一不饱和或多不饱和电子轨道，作用是使电子从嘧啶环传导并且传向离去基团R1，前提是在I组化合物中，n可以是零。在一个实施方案中，R2是选自不饱和的烃基；包括一个或多个不饱和烃基的芳香族烃基；和包括一个或多个不饱和烃基的杂芳基。
在一个实施方案中，MISO和R2是具有选自下面的结构式的不饱和烃基：
在一个实施方案中，R2和R3一起形成选自下面的结构：
Figure A0081286800291
在一个实施方案中，R2是具有选自下面结构的芳香族烃基：
Figure A0081286800292
在一个实施方案中，R2是具有选自下面结构的杂芳基：
其中J是杂原子，例如-O-，-S-，或-Se-，或杂原子，例如-NH-或-NRALK，其中RALK是具有1-10个碳原子的直链或支链烷基或具有3-10个碳原子的环烷基。
在上面的结构式中，R3是二价间隔基团部分，也称之为间隔基单元。在一个实施方案中，R3是具有选自下面结构的二价间隔基团部分：
Figure A0081286800294
其中R5是相同或不同的，并且独立地是具有1-10个碳原子的直链或支链烷基或具有3-10个碳原子的环烷基或R5是卤原子(F，Cl，Br，I)。
在一个实施方案中，R3是具有选自下面结构的二价间隔团部分：在一个实施方案中，R3是具有选自下面结构的二价间隔团部分：
在上面的结构式中，n是0或1-10的整数，m是0或1。在一个实施方案中，n是0或1-10的整数，m是1。在一个实施方案中，n是0且m是0。在一个实施方案中，当R7是-H时，则n不是0。在一个实施方案中，当R7是-H时，则m不是0。在一个实施方案中，当R7是-H时，则n不是0且m不是0。在一个实施方案中，当R7是-H时，R4不是卤原子(即-F，-Cl，-Br，-I)。在一个实施方案中，当R7是-H且m是0时，则R4不是卤原子(即-F，-Cl，-Br，-I)。在一个实施方案中，当R7是-H且m是0且n是0时，则R4不是卤原子(即-F，-Cl，-Br，-I)。
在上面的结构式中，R4是发毒基团。如这里使用的，术语“发毒基团”指是或包含是化学个体的离去基团的部分，所述化学个体具有与通过激活酶从嘧啶环提出的部分一致的分子大小和亲电性，并且其从嘧啶环酶促释放时具有抑制细胞增殖或杀死细胞的能力。
在一个实施方案中，发毒基团是或包含在细胞内过度表达的胞内酶激活或释放的离去基团。在一个实施方案中，R4是或包含具有选自下面结构的基团：
Figure A0081286800311
其中，X在各位置是相同或不同的，并且是-Cl，-Br，-I或其它潜在的离去基团(包括但不限于-CN，-OCN，和-SCN)；Y在各位置是相同或不同的，并且独立地是-H或-F；Z是相同或不同的，并且独立地是-O-或-S-，R8和R9是低级烷基，R10是H或CH3。
在一个实施方案中，R4是或包含选自下面的化学个体：-Br，-I，-O-烷基，-O-芳基，-O-杂芳基，-S-烷基，-S-芳基，-S-杂芳基，-CN，-OCN，-SCN，-NH2，-NH-烷基，-N(烷基)2，-NHCHO，-NHOH，-NHO-烷基，NH2CONHO-，NHNH2，-N3和顺铂衍生物，例如
Figure A0081286800321
在上面的结构式中，Q如对于I组的化合物的描述，因此是或包含支持前体药物与酶(例TS或TK)的功能性结合的部分。在一个实施方案中，Q是选自下面的结构：
其中在各位置的R6是相同或不同的并且独立地是-H，F，-OH，-OC(＝O)CH3，或其它保护的羟基(包括但不限于苯甲酰基，-COC6H5，和甲苯酰基，-COC6H4CH2)；R7在5’位与Q连接并且是氢原子，磷酸根，磷酸二酯基团，氨基磷酸酯，或者其它含磷基团。
在一个实施方案中，Q是：
Figure A0081286800331
在一个实施方案中，R7是氢原子。在另一个实施方案中，R7是磷酸酯基团，保护的磷酸酯基团，磷酸二酯基团，或者氨基磷酸酯基团。在优选的实施方案中，R7是氨基磷酸酯基团。
在一个实施方案中，R7是从氨基酸(包括例如二十种天然存在的氨基酸)衍生的氨基磷酸酯基团。在一个实施方案中，R7是从丙氨酸衍生的氨基磷酸酯基团。在一个实施方案中，R7是或包含具有下面结构的基团：
Figure A0081286800332
上述基团以及其制备方法描述于McGuigan等(1993)药物化学杂志(J.Med.Chem.)36：1048-1052，和McGuigan等(1996)药物化学杂志(J.Med.Chem.)39：1748-1753。
在一个实施方案中，R7是从色氨酸衍生的氨基磷酸酯基团。在一个实施方案中，R7是或包含具有下面结构的基团：
上述基团及其制备方法描述于Abraham等(1996)药物化学杂志(J.Med.Chem.)39：4569-4575。
在一个实施方案中，R7是磷酸酯基团。在一个实施方案中，R7是或包含具有选自下面结构的基团：
上面两个基团的第一个及其制备方法描述于Freed等(1989)生物化学药物(Biochem.Pharmacol.)38：3193-3198；Sastry等(1992)分子药物学(Mol.Pharmacol.)41：4411-445；Arquhar等(1994)药物化学杂志(J.Med.Chem.)37：3902-3909和Farquhar等(1995)药物化学杂志(J.Med.Chem.)38：448-495。上面两个基团的第二个及其制备方法描述于Valette等(1996)药物化学杂志(J.Med.Chem.)39：1981和Benzaria等(1996)药物化学杂志(J.Med.Chem.)39，p.4958。
在一个实施方案中，R7是或包含具有选自下面结构的基团(其中R是芳香取代基)：
Figure A0081286800343
上面两个基团的第一个及其制备方法描述于Meier等(1997)生物有机药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)7：1577；Meier等(1997)生物有机药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)7：99；和Meier等(1997)国际抗病毒新闻(International Antiviral News)5：183。上面两个基团的第二个及其制备方法描述于Hostetler等(1997)生物化学药物(Biochem.Pharmacol.)53：1815；和Hostetler等，公开的国际专利申请No.WO96/40088(1996)。
在一个实施方案中，R7与Q形成环基。下面描述这样的实施方案及其制备方法(其中DMTr是4，4’-二甲氧基三苯甲基，Boc是叔丁氧羰基，DCC是1，3-二环己基碳化二亚胺，4-DMAP是4-二甲基氨基吡啶)：
Figure A0081286800351
在一个实施方案中，化合物可以是任何对映异构体，非对映异构体或立体异构体形式，包括，D-构型或L-构型，和α-端基差向异构体或β-端基差向异构体形式。
在一个实施方案中，化合物可以是盐形式，或者是保护的或前体药物形式，或者其组合，例如作为盐，醚或酯。
在另一个实施方案中，利用下面描述的方法上述结构被进一步修饰使具有硫代磷酸二氮丙啶代替磷酸二氮丙啶基团。
5-位处的结构被称之为链，因为它们连接假定的离去基团(发毒基团)和杂环。在例如人TS的激活位点通过与Cys残基反应激活杂环时，一个负电荷从尿嘧啶的6-位传导给链。关于(BVDU)的5’-一磷酸化化合物，Barr等(1983)生物化学(Biochenistry)22：1696-1703描述了其机理，关于(E)-5-(3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2’-脱氧尿苷(TFPe-dUrd)，Wataya等(1979)药物化学杂志(J.Med.Chem.)22：339-340；Santi(1980)药物化学杂志(J.Med.Chem.)23：103-111；和Bergstrom等(1984)药物化学杂志(J.Med.Chem.)27：279-284描述了其机理。
毒素和dNMP之间的链“间隔基”必须是不饱和的，这样其能够传导TS-Cys巯基连接供给的毒素-不稳定负电荷。为了该目的可获得的很多不饱和有机官能团中，乙烯基，烯丙基和炔丙基是简单的，小的并且容易合成的。乙烯基和烯丙基单元的优点在于它们可以制备成两种不能相互转化的几何异构体形式之一。因此，它们可以用作通过TS激活位点调节前体药物的“探针”。一方面，炔丙基单元具有圆柱型对称的优点，这样TS-催化的毒素从该类型的链释放不取决于关于dUMP尿嘧啶环的取向，乙烯基和烯丙基分子的情况一样。
采用两种不同的方法设计本发明的核苷酸-基前体药物。一种以BVDU一磷酸的结构为基础，并且特征在于离去基团/毒素直接连接dUMP的C5处(多)乙烯基取代基的末端。这是乙烯基链方法。另一种以TFPe-dUMP的结构为基础，并且类似于第一种，但是有亚甲基单元分开离去基团/毒素和不饱和单元，因此包含烯丙基或炔丙基单元。这是烯丙基链方法。
烯丙基链方法的炔丙基形式的激活的机理在5-乙炔基-2’-脱氧尿苷5’-一磷酸(EdUMP)和5-(3-羟基-1-丙炔基)-2’脱氧尿苷5’-一磷酸(HOPdUMP)与TS的相互作用中有先例(Barr等(1981)药物化学杂志(J.Med.Chem.)24：1385-1388和Barr等(1983)上文)。EdUMP是TS的潜在抑制剂(Ki＝0.1TM)，并且可能在活性位点形成基于丙二烯的物质。HOPdUMP(Ki＝3.0TM)表现出不一般的抑制动力学。这可能由于在活性位点形成基于累积多烯的物质。
最近合成出了结构类似于对乙烯基和烯丙基链方法机理常见的中间体的5-烷烯化的5，6-二氢尿嘧啶(Anglada等(1996)杂环化学(J.Hetercyclic Chem.)33(4)：1259)。这些表现出高亲电性。它们与乙醇反应生成5-(乙氧基甲基)尿嘧啶是加水催化再生合适的TS的惯例。最近，追踪研究证明存在通过TS产生的C5亚甲基中间体(Barett等(1998)美国化学学会会刊(J.Am.Chem.Soc.)120：449-450)。
带有炔丙基链的ECTA化合物的合成
目的在于合成有炔丙基和烯丙基的携带醇的2’脱氧尿苷。文献中报道了很多这些化合物及其密切的衍生物，一些甚至与TS关联进行了研究。例如，5-炔基-dUMP，包括5-(3-甲氧基-1-丙炔基)和5-(3-羟基-1-丙炔基)已经被验证为TS抑制剂(Bart等(1981)药物化学杂志(J.Med.Chem.)24：1385-1388)，并且其中的一些已经被证明导入TS-缺乏癌细胞的DNA中(Balzarini等(1985)FEB Slett 373(1)：41-4)。
在钯催化剂存在下，5-汞(Ruth等(1978)有机化学杂志(J.Org.Chem.)43：2870-2876)和5-碘尿苷(Robins等(1981)四面体快报(Tetrahedron Lett)22：421-424)容易与烯和炔缩合产生有C5链的尿苷。后一途径更经常使用(Robins等(1982)加拿大化学杂志(Can.J.Chem.)60：554-557；Asakura(1988)四面体快报(TetrahedronLett)29：2855-2858；和Asakura(1990)有机化学杂志(J.Org.Chem.)55：4928-4933)。已经实现了保护的5-碘-2’-脱氧尿苷与叔丁基二甲基甲硅烷基炔丙基醚(Graham等(1998)J.Med.Soc.Perk.Trans.1：1131-1138和DeClercq等(1983)药物化学杂志(J.Med.Chem.)26：661-666)，与甲基炔丙基醚(Tolstikov等(1997)核苷核苷酸(Nucleoside Nucleotides)16：215-225)，甚至和炔丙基醇本身(Chaudhuri等(1995)美国化学学会会刊(J.Am.Chem.Soc.)117：10434-10442和Goodwin等(1993)四面体快报(Tetrahedron Lett)34：5549-5552)的高产率缩合。通过甲基丙烯酸基的DIBAL-H还原也可以增加通过后一反应导入的3-羟基-1-丙炔基取代基(Cho等(1994)四面体快报(Tetrahedron Lett)25：1149-1152)，其本身从在BVDU的合成中使用的相同Heck反应产生。这些钯催化的反应是如此多面性使得它们能被用来缩合非常长而且功能复杂的基于炔丙基的链和5-碘-2’-脱氧尿苷(Livak等(1992)核酸研究(NucleicAcids Res.)20：4831-4837和Hobbs(1989)有机化学杂志(J.Org.Chem.)54：3420-3422)。通过用Undiar催化剂部分氢化炔丙基母体产生基于(Z)-烯丙基的链(Robins(1983)有机化学杂志(J.Org.Chem.)5(11)：3546-3548)和(Barr(1983)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)258(22)：13627-13631和生物化学(Biochem.)22：1696-1703)，而通过(E)-三丁基甲锡烷基化乙烯的Heck偶联制备基于(E)-烯丙基的化合物最好(Crisp(1989)合成通讯(Synth.Commun.)19：2117-2123)。
严格根据文献方法，制备带有叔丁基二甲基甲硅烷基炔丙基醚的3’，5’-二-O-保护的2’-脱氧尿苷(Graham等(1998)上文；DeClercq等(1983)药物化学杂志(J.Med.Chem.)26：661-666)，并且还原其转化为相应的(Z)-烯丙基醚的那部分(Barr等(1983)上文)。因为TBDMS基团的TBAF-介导的去除产生氧阴离子，其可以原位功能化，这些TBDMS-保护的炔丙基-和(Z)-烯丙基链化核苷将作为某些有发毒基团的靶物的方便的母体。关于带(E)-烯丙基醇的核苷，通过(E)-三丁基甲锡烷基化乙烯的文献Heck偶联制备已知的O-四氢吡喃基醚衍生物(Crisp(1989)上文)。
Figure A0081286800381
利用两步文献方法(Phelps等(1980)药物化学杂志(J.Med.Chem.)23：1229-1232和Hsiao和Bardos(1981)药物化学杂志(J.Med.Chem.)24：887-889)，炔丙基和(E)和(Z)-烯丙基醇转化为它们相应的双氮丙啶氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯，这样5’-单核苷酸的TS处理分别释放抑制细胞药物TEPA或硫代TEPA的活性代谢产物(Dirven等(1995)癌症研究(Cancer Res.)55：1701-1706)。
Figure A0081286800391
合成二-氮丙啶-1-基-次膦酸3-[2-脱氧尿苷-5-基]-丙-2-炔酯(“TEPA”)并且通过1HNMR分析得到下面的结果：1H NMR((CD3)2SO)由于噪音而复杂。显著特征：δ8.28(D，1，H6)，6.10(假-t，1，H1′)，5.26(m，可与D2O交换，1，3′-OH)，5.13(m，可与D2O交换，1，5′-OH)，4.81(q or dd，2，炔丙基-CH2)，4.24(m，1，H3′)，3.57(m，2，5′-CH2)，2.15-2.0(m，8，氮丙啶-CH2).
合成二-氮丙啶-1-基-硫代次膦酸3-[2-脱氧尿苷-5-基]-丙-2-炔酯(“硫代TEPA”)并且通过1HNMR分析得到下面的结果：1H NMR((CD3)2SO)由于噪音而复杂。显著特征：δ8.29(D，1，H6)，6.10(假-t，1，H1′)，5.22(m，可与D2O交换，1，3′-OH)，5.10(m，可与D2O交换，1，5′-OH)，4.88(q or dd，2，炔丙基-CH2)，4.31(m，1，H3′)，3.52(m，2，5′-CH2)，2.15-2.0(m，8，氮丙啶-CH2).
呋喃并嘧啶酮的合成
从合成有C5炔丙基-醇的2’-脱氧尿苷开始合成呋喃并嘧啶酮。然后从上述O-四氢吡喃基醚衍生物形成呋喃并嘧啶酮化合物。通过炔丙基的第二个碳与嘧啶环的C4位连接的氧键合的反应进行合成，得到荧光呋喃并嘧啶酮，其容易从反应混合物中分离。这样的化合物提供了另外的通过具体电子轨道，间隔基和毒性离去基团的各种组合合成ECTA化合物的基础。
在已知促进这些荧光化合物生成的条件下(Barr等(1983)上文)，通过缩合2’，3’-二-O-对-甲苯酰基或2’，3’-二-O-乙酰基-5-碘-2’-脱氧尿苷与1-(四氢吡喃基氧基)-2-丙炔(Jones和Mann(1953)美国化学学会会刊(J.Am.Chem.Soc.)75：4048-4052)，制备呋喃并[2，3-d]嘧啶酮核苷。碱-催化去除糖保护基团得到6-(四氢吡喃-2-基氧基甲基)-取代的双环核苷，其或者进行标准酸性THP基水解(二氯甲烷中的TFA)或者通过制备BvdU-PA和5FUdR-PA使用的相同方法区域选择性地5’-氨基磷酸酯化。氨基磷酸酯化作用之后，通过酸解能去除THP基团。
Figure A0081286800402
3-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-6-(四氢吡喃-2-基氧基甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮1H NMR((CD3)2SO)δ 8.28(s，1，H4)，6.74(s，1，H5)，6.16(假-t，1，H1′)，5.27(d，可与D2O交换，1，3′-OH)，5.12(m，可与D2O交换，1，5′-OH)，4.72(m，1，THP-H2)，4.56(q，2，CH2OTHP)，3.92(m，1，H4′)，3.64(m，2，5′-CH2)，2.40(m，1，H2′a)，2.03(m，1，H2′b)，1.68和1.50(m，8，THP).低分辨率质谱(DCI-NH3)on bis-TMS derivative，m/z323(B+TMS+H+)，511(MH+)，583(M+TMS+).
3-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-6-(羟甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮1H NMR((CD3)2SO)δ12.0(bs，1，OH)，8.24(s，1，H4)，6.53(s，1，H5)，5.51(假-t，1，H1′)，4.42(m，2，CH2OH)低分辨率质谱(DCI-NH3)，m/z167(B+2H+)，184(B+NH4+).
1-[6-(四氢吡喃-2-基氧基甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮-3-基]-2-脱氧-β-D-呋喃核糖-5-基苯基甲氧基-L-丙氨酰氨基磷酸酯。1H NMR((CD3)2SO)由于存在非对映异构体而复杂。显著特征：δ8.62和8.59(each s，each 1，H4)，7.4-7.1(m，5，PhO)，6.61和6.60(each s，each 1，H5)，6.25(m，1，H1′)，4.56(q，2，炔丙基CH2)，3.56和3.54(each s，each 3，CO2Me)，2.0(m，1，H2′b)，1.22(m，3，丙氨酰基-α-Me)，低分辨率质谱(DCI-NH3)，m/z167(B+2H+)，184(B+H++NH4+-THP).
1-[6-(羟甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮-3-基]-2-脱氧-β-D-呋喃核糖-5-基苯基甲氧基-L-丙氨酰氨基磷酸酯。1HNMR(CDCl3)2SO由于存在非对映异构体而复杂。显著特征：δ8.5(s，1，H4)，7.4-7.1(m，5，PhO)，6.36和6.30(each s，each1，H5)，6.23(m，1，H1′)，3.67和3.65(each s，each 3，CO2Me)，2.69(m，1，H2′a)，2.1(m，1，H2′b)，1.35(m，3，丙氨酰基-α-Me)，低分辨率质谱(DCI-NH3)，m/z 525(MH+)，595(MNH4 +).
根据如下所示标准醚合成方法制备5-(3-羟基-1-丙炔基)-2’-脱氧尿苷的4-硝基苯基醚衍生物。
5-[3-(4-硝基苯氧基)-1-丙炔基]-2’-脱氧尿苷。氩气下，用4-硝基苯酚(696毫克，5毫摩尔)，三苯基膦(787毫克，3毫摩尔)和二异丙基偶氮二羧酸(590升，3毫摩尔)处理40毫升无水THF中预先干燥过的5-(3-羟基-1-丙炔基)-2’-脱氧尿苷(“核酸化合物39，5-碘至5-炔的有效转化和衍生的5-取代的尿嘧啶碱基和核苷’Robins和Barr(1983)上文)(565毫克，2毫摩尔)，并且将反应混合物在60℃下加热直到溶液澄清，然后再加热1小时。使该混合物冷却到23℃，然后使其蒸发到SiO2上并且通过使用甲醇/二氯甲烷进行色谱纯化，得到107毫克(13％)的期望的醚产物：Mp 112-118℃.1H NMR((CD3)2SO)δ11.65(s，可与D2O交换，1，-NH)，
8.29(s，1，H6)，2.24(d，j＝9.3Hz，2，m-ArH)，7.23(d，j＝9.2Hz，2，o-ArH)，6.09(假-t，1，H1′)，5.17(s，2，炔丙基-CH2)，4.22(m，1，H3′)，3.80(m，1，H4′)，3.59(m，2，5′-CH2)，2.13(假-t，2，2′-CH2).在per-三甲基甲硅烷基化材料上的低分辨率质谱(DCI-NH3)，m/z547[M(TMS)2H+]，565[M(TMS)2NH4 +]，620[M(TMS)3H+]
以呋喃并-嘧啶酮为基础的TS ECTA化合物。如同对上述合成TEPA和硫代TEPA衍生物解释的，用使毒性离去基团与C5丙炔基尿苷化合物上的羟基连接所使用的类似方法使毒性R4离去基团连接呋喃-2甲基醇。对于本领域技术人员是显而易见的是各种不同的毒性离去基团是本发明的主题。另外，也要求了对R2电子轨道成分的长度和组成以及对R3间隔基元件的组成的修饰。
以呋喃并-嘧啶酮为基础的TS ECTA化合物也可以由不同修饰的“Q”部分组成。很多5-取代的2’-脱氧尿苷不是人TK的底物，但是令人感兴趣的是发现5-(4-羟基-1-丁炔基)-2’-脱氧尿苷是一个例外(Barr等(1981)上文)。因此，预期一些带发毒基团的核苷也具有合适的TK底物活性。因此，ECTA化合物可以具有与不同的糖基连接的自由5’-羟基，5’-一磷酸酯，或5’-氨基磷酸酯基团。通过在HCl清除剂存在下使2-脱氧-3’-羟基，5’-羟基没有保护的核苷酸与氯代磷酸酯反应实现了这样的氨基磷酸酯化合物合成的新方法。在一个优选的实施方案中，所述氯代磷酸酯包括磷取代基，其从氨基酸例如丙氨酸衍生。例如，所述氯代磷酸酯可以是苯基-L-甲氧基丙氨酸氯代磷酸酯。
基于C6氟尿苷和C4腙基的化合物。在与dUMP的正常TS反应中，对嘧啶C5-C6双键加中性硫醇进行放热反应(每摩尔3-9千卡；参见综述Les等(1998)生物分子结构和动力学(Biomolecular Structure andDynamics)15(4)：703-715)。通过活性人TS半胱氨酸(与L.casci的cys-198同源)，用酶有利于形成巯基键的6位TS活泼氢的不同取代基，包括氟原子。在嘧啶环中的其它位置的这样的取代基也能有利于底物与TS之间的反应。例如，尿嘧啶上的4-腙取代(Les和Rhode(1998)生物分子结构和动力学(Biomolecular Structure andDynamics)15(4)：703-715所述)有利于硫醇(TS)与TS的反应。得到的核苷酸-硫醇(TS)中间体以这样一种方式重排使得可以通过水解被动完成改变的核苷酸的释放这一点是重要的。
以前没有报道过在C6位引入氟原子，但是可以根据Krajewskas和Shugar(1982)生物化学药物(Biochem.Pharmacol.)31(6)：1097-102对合成的描述来合成，上述文献描述了几种6取代的尿嘧啶和尿苷类似物的合成。
嘧啶碱基的C4位的有利于化学反应的取代是本领域技术人员公知的。文献说明的例子包括Wallis等(1999)Farmaco54(1-2)：83-89；Negishi等(1996)核酸研讨会35(第23届核酸化学研讨会)137-138；Barbato等(1991)核苷核苷酸(NucleosideNucleotides)10(4)：853-66；Barbato等(1989)核苷核苷酸(NucleosideNucleotides)8(4)：515-528；和Holy等(1999)药物化学杂志(J.Med.Chem.)42(12)：2064-2086。这些合成技术也能将取代作用组合，例如在嘧啶环的C4和C5位(Pluta等(1999)Boll.Chim.Farm.138(1)：30-33)或在嘧啶环的C2和C4位(Zeid等(1999)核苷核苷酸(Nucleoside Nucleotides)18(1)：95-111)。
在本发明的一个实施方案中，通过对C6氟-尿苷碱基或C4腙修饰的嘧啶加上不同的电子轨道，间隔基部分和毒性离去基团合成ECTA化合物。上文对于2-脱氧尿苷碱基ECTA化合物的合成描述的方法也适用于这样的分子的合成。
B.I组和II组的化合物的衍生物
这里公开的上述化合物的盐，酯和醚也在本发明的范围内。本发明的前体药物的盐可以从无机或有机酸和碱衍生。酸的例子包括盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，高氯酸，富马酸，马来酸，磷酸，乙醇酸，乳酸，水杨酸，琥珀酸，对甲苯磺酸，酒石酸，乙酸，柠檬酸，甲磺酸，乙磺酸，甲酸，苯甲酸，丙二酸，萘-2-磺酸和苯磺酸。其它酸，例如草酸，尽管其本身是药学不可接受的，但是可以在用作获得本发明的化合物及其药学可接受酸加成盐的中间体的盐的制备中使用。碱的例子包括碱金属(例如钠)氢氧化物，碱土金属(例如镁)氢氧化物，氨，和式NW4 +的化合物，其中W是C1-4烷基。
盐的例子包括：乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，苯磺酸盐，硫酸氢盐，丁酸盐，柠檬酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊烷丙酸盐，二葡糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，富马酸盐，fluco庚酸盐，甘油磷酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，2-羟基乙磺酸盐，乳酸盐，马来酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，草酸盐，棕榈酸盐，果胶酸盐，过二硫酸盐，苯基丙酸盐，苦味酸盐，戊二酸盐，丙酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，硫代氰酸盐，甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。盐的其它例子包括与合适的阳离子例如Na+，NH4 +，和NW4 +(其中W是C1-4烷基)化合的本发明的化合物的阴离子。
对于治疗用途，本发明的化合物的盐是药学可接受的。但是，在药学可接受化合物的制备和纯化中也可以发现非药学可接受酸和碱的盐的用途。通过本发明的方法鉴定的前体药物或化合物的酯包括通过酯化2’-，3’-和/或5’-羟基获得的羧酸酯(即-O-C(＝OR))，其中R选自(1)直链或支链烷基(例如正丙基，叔丁基或正丁基)，烷氧基烷基(例如甲氧基甲基)，芳烷基(例如苄基)，芳基氧基烷基(例如苯氧基甲基)，芳基(例如任选地被例如卤原子，C1-4烷基或C1-4烷氧基或氨基取代的苯基)；(2)磺酸酯，例如烷基磺酰基(例如甲磺酰基)或芳烷基磺酰基；(3)氨基酸酯(例如L-缬氨酰或L-异亮氨酰)；(4)磷酸酯和(5)一-，二-或三磷酸酯。通过例如C1-20醇或者其反应衍生物，或者通过2，3-二(C6-24)酰基甘油可以进一步酯化磷酸酯。在这些酯中，除非另有说明，存在的烷基部分有利地含有1-18个碳原子，特别是1-6个碳原子，更特别地1-4个碳原子。这样的酯中存在的任何环烷基部分有利地含有3-6个碳原子。这样的酯中存在的任何芳基部分有利地包括苯基。本发明的呋喃来苏糖前体药物衍生物的例子包括例如有化学保护羟基(例如有O-乙酰基)的那些，例如2’-O-乙酰基-呋喃来苏糖基；3’-O-乙酰基-呋喃来苏糖基；5’-O-乙酰基-呋喃来苏糖基；2’，3’-二-O-乙酰基-呋喃来苏糖基和2’，3’，5’-三-O-乙酰基-呋喃来苏糖基。
本发明的化合物的酯包括甲酯，乙酯，丙酯，丁酯，异丁酯和仲丁酯。
在另一个实施方案中，底物可能与嘧啶或叶酸不是化学相关的，但是确实是在合理药物设计的已知参数的基础上合成的(参见Dunn等(1996)药物化学杂志(J.Med.Chem.)39：4825)。
按照下面提供的实施例或者(Barr等(1983)上文)描述的方法测定产物(例如其中反应产物是dUMP的溴乙烯基衍生物的抗代谢产物)。
C.制剂
制剂包括适合口服，直肠，鼻，局部(包括经皮，含剂和舌下)，阴道，肠胃外(包括皮下，肌内，静脉内和皮内)和肺内给药的那些。制剂可以方便地以单位剂量形式存在并且可以用制药领域公知的任何方法制备。这样的方法包括将活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体混合。一般情况下，通过均匀地并且密切地混合活性成分和液体载体或研细的固体载体或两者，然后，如果需要，将产品成型。
适合口服的本发明制剂可以以离散的单位存在，例如胶囊，扁囊剂或片剂，各自含有预定量的活性成分；作为粉末剂或颗粒剂；作为在含水或不含水液体中的溶液或悬浮液；或者作为水包油液体乳浊液或油包水液体乳浊液。活性成分也可以以大丸剂，药糖剂或糊剂存在。
通过任选地与一种或多种辅助成分一起压制或模制可以制备片剂。通过在合适的机器中压制活性成分可以制备压片，其中活性成分呈自由流动形式，例如是粉末剂或颗粒剂，任选地与粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮，明胶，羟丙基甲基纤维素)，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，崩解剂(例如淀粉乙醇酸钠，交联聚乙烯吡咯烷酮，交联羧甲基纤维素钠)，表面活性剂或分散剂混合。通过在合适的机器中模压用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物来制备模压片剂。片剂可以任选地包衣或刻痕并且可以配制成能够缓慢或受控释放其中的活性成分的剂型，例如，使用不同比例的羟丙基甲基纤维素来提供期望的释放曲线。片剂可以任选地进行肠包衣，来提供在肠的部分而不是在胃中释放。
适合在口中局部给药的制剂包括锭剂，其在矫味基质中含有活性成分，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；软锭剂，其在惰性基质例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶中含有活性成分；和漱口液，其在合适的液体载体中含有活性成分。
根据本发明的局部给药的药物组合物可以配制成软膏剂，乳膏剂，悬浮液，洗剂，粉末剂，溶液，糊剂，凝胶，喷雾剂，气溶胶或油状物。或者，制剂可以包括透皮贴或敷料，例如浸有活性成分和任选的一种或多种赋形剂或稀释剂的绷带或粘石膏。
对于眼部或者其它外部组织例如口和皮肤，优选以含有活性成分的局部用软膏或乳膏，以活性成分的量是，例如，大约0.075至大约20％w/w，优选大约0.2至大约25％w/w，最优选大约0.5至大约10％w/w的量施用制剂。当配制成软膏时，前体药物可以与石蜡或水不相混溶的基质一起使用。或者，可以在乳膏中使用水包油乳膏基质配制前体药物成分。
如果需要，乳膏基质的水相可以包括，例如，至少大约30％w/w的多羟基醇，即具有两个或多个羟基的醇，例如丙二醇，丁烷-1，3-二醇，甘露糖醇，山梨糖醇，甘油和聚乙二醇及其混合物。局部用制剂最好包括增强前体药物成分通过皮肤或其它受影响区域的吸收或穿透的化合物。这样的表皮渗透增强剂的例子包括二甲亚砜和相关类似物。
本发明乳浊液的油相可以用已知方法用已知成分构成。该相可以只含有乳化剂(也被称作乳化剂emulgent)，最好含有至少一种乳化剂与脂肪或油或者是脂肪和油的混合物。优选地，含有亲水性乳化剂和亲脂性乳化剂，后者作为稳定剂。也优选含有油和脂肪。乳化剂在有或没有稳定剂的情况下构成称之为乳化蜡状物的物质，该蜡状物与油和/或脂肪一起制成称之为乳化软膏基质的物质，其形成乳膏制剂的油分散相。
适合在本发明的制剂中使用的乳化剂和乳化稳定剂包括Tween60，Span 80，十六醇十八醇混合物，十四醇，一硬脂酸甘油酯和月桂基硫酸钠。
用于制剂的合适的油或脂肪的选择以实现期望的化妆性质为基础，因为活性化合物在大多数可能能在药物乳化制剂中使用的油中的溶解度非常低。因此软膏应该优选是没有油脂的没有颜色的和可洗去的产品，其有适当的持久性，避免从试管或其它容器泄漏。可以使用直链或支链的一-或二烷基酯，例如二异己二酸酯，硬脂酸异十六烷基酯，椰子油脂肪酸丙二醇二酯，十四烷酸异丙酯，油酸癸酯，棕榈酸异丙酯，硬脂酸丁酯，棕榈酸2-乙基己酯或称作CrodamolCAP支链酯的混合物，后三种是优选的酯。这些可以单独使用或者根据要求的性质组合使用。或者，可以使用高熔点脂类，例如白软石蜡和/或液体石蜡或者其它矿物油。
适合对眼局部给药的制剂还包括滴眼药，其中活性成分溶解于或悬浮于合适的载体中，特别是用于前体药物成分的含水溶剂。所述前体药物成分优选以这样的制剂存在，其中浓度是大约0.5至大约20％，有利地是大约0.5至大约10％，特别是大约1.5％w/w。
用于直肠给药的制剂可以作为栓剂存在，有合适的基质，包括例如可可脂或水杨酸酯。
适合阴道给药的制剂可以以栓剂，棉塞，乳膏，凝胶，糊剂，泡沫剂或喷雾剂存在，除了前体药物成分之外含有本领域公知的合适的载体。
其中载体是固体适合鼻给药的制剂包括具有例如大约20至大约500微米范围颗粒度的粗粉，其以使劲吸入的方式给药，即通过从紧贴鼻子的盛粉末的容器中通过鼻道快速吸入。其中载体是用于给药的液体的合适的制剂，例如鼻喷雾剂，滴鼻剂或者通过喷雾器气雾剂给药的制剂包括前体药物成分的水溶液或油溶液。
适合肠胃外给药的制剂包括含水和不含水的等渗灭菌注射液，其可以含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂和使制剂与要给药的接受者的血液等渗的溶质；含水和不含水的灭菌悬浮液(其可以含有悬浮剂和增稠剂)，以及被设计成使所述化合物靶向血液成分或一个或多个器官的脂质体或其它微粒化体系。制剂可以分装在单位剂量密封的容器，例如安瓿和小管瓶，并且可以保存在冷冻干燥(冻干)条件下，在使用之前要求只加入灭菌液体载体，例如注射用水。可以从先前描述类型的灭菌粉末剂，颗粒剂和片剂制备即用的注射液和悬浮液。
优选的单位剂量制剂是前体药物成分的上述含有日剂量或单位，日亚剂量的那些，或者其合适的等份。
应该理解除了上面特别提到的成分之外，本发明的制剂根据要求的剂型可以含有其它本领域常规物质，例如适合口服给药的制剂可以含有象甜味剂，增稠剂和矫味剂这样的其它试剂。
本发明结构式的前体药物和组合物也可以以兽药制剂形式存在，其可以例如通过本领域常规方法制备。
D.人正常组织中胸苷酸合成酶的表达
为了估算胸苷酸合成酶激活的前体药物的全身毒性，检测正常人组织中TS表达水平。通过使用RT-PCR测定脑，心脏，肾，脾，肝，结肠，肺，小肠，胃肌，睾丸，卵巢，子宫，前列腺，甲状腺，唾液腺，肾上腺，皮肤，PBL和骨髓组织中相对TS mRNA水平。发现这些组织的大多数中TSmRNA水平等于或小于在结肠组织中的水平，但在骨髓中的(1.25倍)，在卵巢中的(1.38倍)和睾丸中的(2.13倍)除外(图13)。但是，结肠癌样品中平均TS mRNA水平是它们相应的正常结肠组织样品中的4.6倍(图13)。该结果提示结肠癌中TS过度表达激活的化合物对人正常组织可能没有或几乎没有毒性。
通过PCR扩增研究多种正常组织中人胸苷酸合成酶的转录水平。从OriGene Technologics，Inc.(Rockville，MD)获得一系列人组织的cDNA。在25微升的体积中进行PCR反应，该体积含有cDNA(100X)，3mMMgCl2，50mM KCl，20mM Tris-Cl，pH8.4，0.2mM的各种dNTP，0.2μM胸苷酸合成酶有义和反义引物和1.25单位Taq DNA聚合酶(获自Promega，Madison，WI)。该反应混合物在94℃下温育2分钟，接着下面12次循环：94℃温育40秒，58℃温育1分钟，然后72℃温育1分钟。加入25微升反应缓冲液，其中含有0.2μMβ-肌动蛋白引物，0.2μM胸苷酸合成酶引物，3mM MgCl2，50mM KCl，20mM Tris-Cl，pH8.4，0.2mM的各种dNTP，和1.25单位Taq DNA聚合酶，达到0.2μM胸苷酸合成酶引物和0.1μMβ-肌动蛋白引物的终浓度，使反应体积达到50微升。PCR反应总共进行36次循环，接着在72℃温育7分钟。
通过在2％琼脂糖凝胶上电泳接着用SYBR Gold核酸凝胶染料(获自Molecular probes，Eugene，OR)染色分离10微升PCR产物。定量测定相应于胸苷酸合成酶的DNA泳带并且通过分子动力学Storm相对β-肌动蛋白的值校正。定量表达水平表示为相对于结肠的表达水平的值。
E.匹配的正常组织和肿瘤组织的RT-PCR分析
通过利用逆RT-PCR扩增定量测定结肠癌组织和匹配的正常结肠组织中人胸苷酸合成酶的转录物水平。如下设计用于扩增人胸苷酸合成酶和β-肌动蛋白的寡核苷酸引物：胸苷酸合成酶有义引物5’-GGGCAGATCCAACACATCC-3’(相应于胸苷酸合成酶cDNA序列的碱基208-226，Genbank登记号No.X02308)，反义引物5’-GGTCAACTCCCTGTCCTGAA-3’(相应于碱基564-583)，β-肌动蛋白有义引物5’-GCCAACACAGTGCTGTCTG-3’(相应于β-肌动蛋白基因序列的碱基2643-2661，Genbank登记号No.M10277)，和反义引物5’CTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’(相应于碱基2937-2955)。
从Cooperative Human Tissue Network(CHTN，Western Division，Cleveland，OH)获得人结肠癌组织和匹配的正常组织。根据供应商说明，使用Tri纯分离试剂(获自Boehringer MannheinCorp.，Indianapolis，IN)分离总RNA。为了检测可能的DNA污染，设计用于扩增β-肌动蛋白的引物跨越外显子4/内含子5/外显子5连接。基因组DNA模板产生313bpβ-肌动蛋白片段，cDNA模板产生210bp产物。
使用SuperScript预扩增系统(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)进行逆转录。根据供应商说明，用3微克总RNA在20微升体积的缓冲液中进行逆转录反应。
在96微升的体积中进行PCR反应，该体积含有5微升来自逆转录反应的cDNA混合物，3mM MgCl2，50mM KCl，20mM Tris-Cl，pH8.4，0.2mM的各种dNTP，0.3μM胸苷酸合成酶有义和反义引物和5单位Taq DNA聚合酶(获自Promega，Madison，WI)。该反应混合物在94℃下温育3分钟，接着进行下面9次循环：94℃温育1分钟，58℃温育1分钟，然后72℃温育1分钟。9次循环之后，加入4微升人β-肌动蛋白引物，达到0.2μM的终浓度，使最终反应体积达到100微升。继续进行PCR反应总共进行30次，32次或34次循环，接着在72℃温育7分钟。
通过在2％琼脂糖凝胶上电泳接着用SYBR Gold核酸凝胶染料(获自Molecular probes，Eugene，OR)染色分离10微升PCR产物。定量测定结果表明胸苷酸合成酶和B-肌动蛋白的扩增在30和34次循环之间是线性的。定量测定相应于胸苷酸合成酶的DNA泳带并且通过分子动力学Storm校正为相对β-肌动蛋白的值。定量表达水平表示为TS和β-肌动蛋白之间的比值。
F.细胞系和转染
在补充有10％胎牛血清的PRMI 1640培养基中培养HT1080细胞，并且用GFP-TS表达载体转染。48小时之后，将转染的细胞用胰蛋白酶处理(tripsinized)并且在含有750微克/毫升G418的培养基中再次培养。用G418筛选2周之后，以荧光表达为基础将成活细胞分类。选择较高荧光表达的一个克隆(命名为TSH/HT1080)和较低荧光表达的一个克隆(命名为TSL/HT1080)，并且扩增到细胞系中。用pEGFP-C3转染的稳定HT1080细胞作为对照。
G.GFP-TS表达载体的构建
使用下面的引物通过PCR扩增获得编码人胸苷酸合成酶的保守区(氨基酸23-313)的cDNA片段：有义引物，5’-CGGAAGCTTGAGCCGCGTCCGCCGCA-3’和反义引物，5’-GAAGGTACCCTAAACAGCCATTTCCA-3’。用GFP序列符合读框将cDNA克隆到哺乳动物表达载体pEGFP-C3(Clontech Laboratories.Inc.，Palo Alto，CA)的HindIII和Kpn I位点。通过DNA测序证实cDNA插入。
H.蛋白质印迹分析
在补充有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养人正常细胞和癌细胞。细胞在100毫米培养皿中生长至融合并且在0.5毫升RIPA缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，0.5％TritonX-100，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸，钠盐和蛋白酶抑制剂)中溶解。通过使用BCA-200蛋白质测定试剂盒(获自Pierce，Rockford，IL)测定蛋白质浓度。通过12％SDS-PAGE从各细胞株/系分离15微克总蛋白质。分离的蛋白质转移到PVDF膜上，接着用人胸苷酸合成酶单克隆一抗(NeoMarkers，Fremont，CA制备)和辣根过氧化物酶连接的绵羊抗-小鼠Ig二抗(获自Amersham，英国)进行免疫印迹。使用ECLplus试剂盒(Amersham)测定免疫反应性。定量测定相应于胸苷酸合成酶的泳带并且通过分子动力学storm相对微管蛋白校正。定量表达水平表示为相对于细胞株CCDl8co的值。
I.通过从dUMP-3H的氚释放测定TS活性
细胞在24孔平板上铺平板至30000细胞/板的密度并且温育16小时使粘附平板的塑料表面。
在胸苷酸合成酶测定之前，用RPMI+10％透析的胎牛血清替换培养基。向各孔加入0.5μC i5-[3H]脱氧尿苷，不加CO2下平板在37℃下温育60分钟。通过室温下活性炭(10％，于1×PBS)吸附5-[3H]脱氧尿苷5分钟来测定[3H]释放。以13000RPM离心5分钟之后通过液体闪烁计数测定上清液中的[3H]量。
J.生长抑制研究
指数生长细胞被转移到384-孔平底组织培养板中。将所有的细胞类型铺平板，在25微升完全培养基(RPMll640+10％胎牛血清+抗生素/抗霉剂)中，密度为每孔500个细胞。24小时之后(第0天)，一式三份加入含有剂量范围是 至
Figure A0081286800522
M的实验化合物的完全培养基25微升。接触药物时间是120小时(第5天)，然后测定生长抑制作用。向各孔中加入5微升氧化还原指示剂alamarBlue(10％v/v)。在37℃温育4小时之后，在535nm激发和595nm发射下监测荧光。
浓度对相对荧光单位(RFU)作图，使用Hill等式，S形曲线吻合。曲线的回折点指示的IC50是生长被抑制50％时的浓度。
K.NB1011细胞毒性的Tomudex抑制
将MCF7-TDX转移到384孔测试板，每孔25微升完全培养基中500个细胞。24小时之后(第0天)，双份加入含有由1mM系列二倍稀释的NB1011和不连续浓度(0，1，10，100，1000nM)的Tomudex的混合物的25微升完全培养基。接触药物时间是120小时(第5天)，然后如在上文生长抑制研究中描述的用alamarBlue测定生长抑制作用。
L.酶制备
为了加上氨基末端His标记，使用NdeI SacI插入位点，将克隆的人胸苷酸合成酶质粒pBCHTS亚克隆到大肠埃希氏杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)(Novagen)。通过用IPTG诱导在大肠埃希氏杆菌中表达酶，并且通过在Ni2+His Bind金属螯合树脂(Novagen)上的亲和层析纯化。柱Ni2+His Bind金属螯合树脂柱用20Mm Tris pH7.9，5mM咪唑，0.5mM NaCl洗涤：用20mM Tris pH7.9，60mM咪唑，0.5mM NaCl洗脱胸苷酸合成酶活性。
M.酶测试和动力学测定
在由40mM Tris pH7.5，25mM MgCl2，1mm EDTA，25mM巯基乙醇，125MdUMP，和65μM指明的N5，N10-亚甲基四氢叶酸构成的200微升反应体积中在96孔Costar UV透明板中进行胸苷酸合成酶测定。通过将四氢叶酸(Sigma)直接溶解于0.2MT ris pH7.5，0.5M-巯基乙醇制备四氢叶酸贮备溶液；在-80℃下贮存贮备溶液。通过向1毫升0.65mM四氢叶酸溶液加入12微升3.8％甲醛并且在37℃下温育5分钟来制备N5，N10-亚甲基四氢叶酸。N5，N10-亚甲基四氢叶酸保存在冰上并且在制备之后2小时内使用。
用340nm激发波长和595nm发射波长在96孔Dynex MicrofluorBlack“U”型底微量滴定板中在200mul含有125M BV dUMP的胸苷酸合成酶反应中测定通过胸苷酸合成酶将BV dUMP转化为荧光产物的转化。用Tecan Spectrafluor Plus荧光计测定荧光。
使用上述酶测定条件对人胸苷酸合成酶底物dUMP和BV dUMP测定酶动力学常数(Km和Vmax)。通过测定对与dUMP反应的A340增加和对与BV dUMP反应的A294降低来测定酶反应初始速率。从动力学常数Km和Vmax计算酶催化效率(Kcat/Km)。
N.液相色谱/质谱
室温下用PBS将细胞洗涤三次，然后在5毫升PBS中冷冻/解冻溶解。以10KRPM将细胞提取液离心10分钟，然后吸附于Sep PakC18并且用10毫升PBS洗涤。用1毫升蒸馏水洗脱BVdUMP。通过使用0.1％甲酸-0.1％甲酸/95％乙腈的线性梯度在C18柱上通过反相色谱分析LC/MS样品。用Micromass Quattro II三级四极分光计进行质谱分析。
O.抗性的恢复
先前描述过人乳腺癌MCF7 TDX细胞系的来源和特征(Drake等(1996)生物化学药物(Biochem.Pharmacol.)51(10)：1349-1355)。简要地说，通过连续暴露给至多2.0μM的浓度逐步递增的TDX，对MCF-7乳腺癌细胞体外筛选对Tomudex的抗药性。通过连续将亲本MCF7 TDX细胞系暴露给没有TDX但是有50μM NB1011的培养基，对抗药性亚系筛选对NB1011的抗药性，其中NB1011浓度大约比亲本MCF 7TDX细胞系中对NB1011的IC50高大约16倍。显著的初始细胞杀死效果之后，出现抗药性菌落，形成茁壮生长的单层。根据“材料与方法”中的描述分别通过蛋白质印迹和alamarBlue细胞毒性测定，对得到的MCF7TDX/1011细胞系测定5-FU，TDX，和NB1011的TS蛋白质水平和IC50。
II.实验
A.体内分析NB1011的TS-表达，5-FU抗药性，H630-10结肠癌异种移植。
体外筛选的对5-FU抗药性的H630-10结肠癌细胞表达高水平的胸苷酸合成酶，并且在无胸腺小鼠中形成异种移植。细胞离体扩增之后，在4-6周龄雌性CD-1(nu/nu)无胸腺小鼠(Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA)的背部中部以1.5×107细胞/肿瘤皮下注射(S.Q.)H630-10。一个人进行一系列微米测定每周两次监测根据长乘宽乘高计算的肿瘤体积。六只动物随机分为各处理组并且进行统计学试验(单因数ANOVA)来保证在实验开始时处理组和对照组之间起始肿瘤体积的一致性。通过腹膜内(I.P.)或肿瘤内注射(I.T.)施用NB1011。试验试剂的实验剂量如下：第1组：DMSO赋形剂对照溶液(IP)，第2组：5-FU(15毫克/千克×5天IP＝以该方式对5-FU的MTD)，第3组：NB1011＝1.25毫克×5天(IP)，第4组：NB1011＝2.5毫克×5天(IP)，第5组：NB1011＝3.5毫克×5天(IP)，第6组：DMSO对照(IT)，第7组：NB1011＝1.25毫克×5天(IT)，和第8组：NB1011＝2.5毫克×5天(IT)。这些剂量以在实验室进行的独立的发现剂量实验为基础并且接近该具体年龄和品种的雌性无胸腺小鼠的NB1011最大耐受剂量。为了保证精确剂量给药，在每次注射之前确定的动物体重的基础上分别给出药物剂量。在异种移植接种之后测得异种移植物体积为45-68mm3时开始用对照溶液或NB1011治疗10天。通过对数转化肿瘤体积数据的单因数ANOVA分析各组之间的第25天异种移植物体积的差异。在UCLAAnimal Care Facility的专用房间里在无菌条件下保持实验无胸腺小鼠。洛山矶加里弗尼亚大学有Animal Welfare Assurance文档，Officeof Protection from Research Risks，Laboratory Animal SafetyAssuranceNo.A-3196-01。所有的实验由UCLA兽医严格指导。Panel oftheAmerican Veterinary MedicalAssociation支持UCLA使用的安死术。American Association for the Accreditation of LaboratoryAnimal Care委托洛山矶加里弗尼亚大学实验动物计划和设备。该方案中描述的个人进行的动物程序和操作在那些程序中在技术上是合格的，并且根据Animal Welfare Actof 1985的要求接受对研究中动物的使用训练。
B.BVdUMP与人胸苷酸合成酶的体外反应
1.用rHuTS对BVdUMP进行无细胞处理产生荧光产物。
干酪乳杆菌(L.casei)TS对BVdUMP的无细胞处理证明产生了潜在的活性中间体(Barr等(1983)上文)。因为这个原因，想到TS对BVdUMP的处理导致人TS不可逆的灭活(Balzarini(1987)分子药物(Mol.Pharmacol.)32(3)：410-6)。DeClercq，Balzarini及其同事(Balzarini(1987)上文；Balzarini(1993)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268(a)：6332-7；Balzarini(1995)FEBS Lett373(1)：41-4)进行的分子基础实验支持这样的概念，即一旦BVDU在细胞内转化为一磷酸酯(通过疱疹病毒腺苷激酶)，则其在该过程中结合并灭活Hu TS。但是，从来没有充分表征过人TS与BVdUMP的实际反应。Santi和同事(Barr(1983)上文)对于他们的工作使用了细菌TS来证明从BVdUMP+TS反应产生产物，DeClercq及其同事使用了细胞和细胞溶胞产物，没有纯化的人TS(Balzarini(1987)上文；Balzarini(1993)上文；Balzarini(1995)上文)。
由于申请人对可以特异性被TS激活的治疗底物的产生感兴趣，反复研究了BVdUMP与纯化的重组人TS(rHuTS)的相互作用。当BVdUMP与rHuTS在标准反应混合物中温育时，反应导致荧光产物的生成(图2)。荧光时间依赖性增加伴随初始BVdUMP浓度的降低。部分表征了得到的产物，表现出是外向环嘧啶核苷酸衍生物(见下文)。
该结果是令人惊奇的，引起先前的结果支持这样的概念，即TS与BVdUMP反应应该灭活人TS酶(Balzarini等(1987)，(1993)，(1995)，上文)。因为上述反应在具有纯化的成分的无细胞系统中进行，可能胞内介质提供的成分导致在NB1011转化为细胞内自由核苷酸一磷酸之后TS失活。下面进行详细描述
2.dUMP和BVdUMP与rHuTS的反应动力学比较
先前Barr等(1983)报道的工作使用于酪乳杆菌TS(Balzarini(1995)上文；Balzarini(1987)上文；Balzarini(1993)上文)，使用细胞和细胞溶胞产物，不清楚BVdUMP与人TS的反应是否导致该酶的不可逆失活。为了明确该问题，在存在或不存在dUMP下测定了BVdUMP与rHuTS的反应动力学。
竞争抑制作用与其中BVdUMP不灭活TS酶的反应最吻合。为了帮助进一步澄清该情况，为了测定比其中进行动力学更长时间可能发生的任何灭活作用进行想要的rHuTS与BVdUMP的温育(图4)。
这些数据表明即使在温育rHuTS与BVdUMP之后20小时，根据作为底物的THF DHP dUMP的转化速率测定的，没有或几乎没有酶失活情况出现。该结果与对在细胞内，优选在过度表达TS的细胞内，过度表达的TS将BVdUMP转化为细胞毒性代谢产物的预期能力相吻合，最后没有使该酶失活。
3.BVdUMP与TS反应的表征：辅因子和抑制剂
TS的最完全表征的反应是dUMP向dTMP的转化。该反应包括将N5，N10-亚甲基四氢叶酸(THF)的亚甲基转化为dUMP的C-5位(Carreras CW(1995)上文)。该反应取决于辅因子(THF)，并且被尿苷酸模拟物、5F-dUMP抑制，5F-dUMP在与酶反应时，导致稳定复合物的产生并且丧失了酶活性。TS活性的第二种被完全表征的抑制剂是Tomudex，Tomudex占据了TS同型二聚体的叶酸结合位点，防止THF的结合，并且阻断TS在细胞内的活性(Drake(1996)生物化学药物(Biochem.Pharmacol.)51(10)：1349-1355和Touroutoglou和Pazdur(1996)临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)2(2)：227-243)。作为表征rHuTS与BVdUMP反应初步努力的一部分，对酶与dUMP和BVdUMP的反应比较了5F-dUMP，Tomudex和辅因子的效果。这些实验证明(表4)，与dUMP的情况类似，5F-dUMP能够防止BVdUMP向荧光产物的转化。另外，Tomudex也能防止从dUMP和BVdUMP两者形成产物。但是，与干酪乳杆菌较早的报道(Barr等(1983)上文)相吻合，BVdUMP向荧光产物的转化不需要THF。另外，表4中的数据也证明在BVdUMP与rHuTS的反应中THF刺激荧光产物的产生。从早期报道THF对该反应没有影响的数据(Barr等(1983)上文)不能预期该结果，并且说明潜在的重要可能性，即辅因子，或辅因子拮抗剂，象甲酰四氢叶酸，不能调节BVdUMP与人TS的反应。
对该反应的Michaelis-Menton动力学分析证明dUMP对BVdUMP的抑制作用符合预期形式的竞争抑制作用，与作为rHuTS的底物的行为的核苷酸吻合。
先前用干酪乳杆菌TS报道的数据表明BVdUMP是比dUMP效果小385倍的底物(Barr等(1983)上文；SantiD.V.(1980)上文)。这里报道的实验证明这种情况在用人酶时完全不同。对于rHuTS，dUMP的相对催化效率与BVdUMP相比是60倍。这代表与内源底物相比催化效率的提高大于6.4倍。先前用干酪乳杆菌TS的结果导致预计细胞内酶反应的效率对于NB1011太低不是有效的治疗底物，因为它不得不与大量的内源dUMP竞争。这里报道的发现，即人酶具有大于6.4倍的提高的BVdUMP转化效率，是使用NB1011的一个重要的因素。人酶与干酪乳杆菌酶相比对BVdUMP应用的提高的效率也确定物种特异性底物是可能的并且能够设计。最近报道了与人TS相比的通过结合干酪乳杆菌的表面上物种特异性区特异性抑制异源酶的能力(Stout(1999)生物化学(Biochemistry)38(5)：1607-17和Costi等(1999)药物化学杂志(J.Med.Chem.)42(12)：2112-2124)。与由蛋白质的最高度保守区组成的TS的活性位点相关的特异性差异(Carreras(1995)上文)是令人惊奇的并且先前没有报道过。
通过质谱分析rHuTS与BVdUMP的无细胞酶促反应的产物。图5给出的分子结构I和II具有与BVdUMP与纯化的rHuTS温育之后TS反应混合物中分子离子的质量相吻合的质量。对该反应产物的知识可以用来理解NB1011的作用的最终机理。另外，该信息可以用来设计新的化学治疗剂，因为TS-BVdUMP反应产物本身有用作化学治疗剂的潜在可能性。
4.NB1011在肿瘤细胞中转化为一磷酸酯
根据与TS结合的预先要求，在细胞中NB1011从氨基磷酸酯转化为一磷酸酯形式。图6说明对于NB1011的没有掩蔽的磷酸酯的推定的途径，其与TS的结合和向毒性代谢产物的转化。
为了确定转化中是否有利地发生该关键步骤，利用了溴原子的不常见的性质，即其在自然界中以两种相等丰度的同位素形式存在。这种情况要通过集中对BVdUMP预计质量离子(411和413道尔顿)的质谱分析来测定包含溴的一磷酸酯。将H630 R10肿瘤细胞(其表达高水平的TS)与100μM NB1011温育。根据方法中所述制备处理过的细胞溶胞产物的提取物。使用质谱检测，接着根据BVdUMP的没有保护的核苷酸质量离子(其在反相色谱上有相同的滞留时间)的形成用液相色谱进行初始纯化。
这些结果(图7)与激活途径中第一步骤之后的NB1011相吻合。
C.NB1011的细胞毒活性的表征
1.肿瘤/正常细胞的筛选
作为表征NB1011的生物活性的开始步骤，在alarmar blue测试中对大量系列正常和肿瘤细胞类型测试对NB1011和5-氟尿嘧啶两者的灵敏性。
根据上文方法中的描述进行测定。以对正常细胞的平均IC50与对肿瘤细胞的平均IC50的比值计算治疗指数。所有的测定至少进行三次。
这些数据证明NB1011符合对TS ECTA化合物的基本设计目的，即与正常细胞类型相比对肿瘤细胞的效力更高。总之，与对正常细胞相比，对肿瘤细胞的细胞毒性高大约2倍，而5FU对正常细胞的毒性比其对肿瘤细胞的毒性大3倍。因此，与5FU相比，NB1011的总的有利点在于NB1011治疗指数提高(2)×(3)＝6倍。筛选具有正治疗指数的化学治疗剂的严格方法是筛选对正常细胞和肿瘤细胞类型的活性。在发现新的癌症治疗药物的领域没有一直使用该方法。例如，筛选对正常细胞类型的新的候选化合物是国家癌症研究所(National Cancer Institute)的筛选方法(Curt(1996)Oncologistl(3)：II-III)的一部分。
2.体内NB1011不使TS失活
上述结果指明细胞内从NB1011产生的BVdUMP在其转化为产物期间不可能灭活TS。但是，无细胞系统与胞内介质不同。为了进一步解释该问题，进行对TS活性的基于细胞的测定。在这些实验中向细胞培养基加入外源5-(3H)脱氧尿苷并且监测氚化水的释放(Carreras和Santi(1995)上文；Roberts(1966)生物化学(Biochem.)5(11)3546-3548)。图8说明细胞培养基中NB1011的存在降低了[3H]2O从5-(3H)dUMP的释放速度。为了确定这是不是TS不可逆抑制作用的结果，在新鲜培养基中回收NB1011-处理过的细胞，然后测定TS活性。在没有NB1011的培养基中回收的细胞具有与未处理细胞相同水平的TS活性。该结果支持这样一个假设，即NB1011在经历胞内过程后不会不可逆灭活TS酶。
采用另外的途径来理解NB1011主要通过灭活TS是否可能干扰细胞生长。该项研究以TS-封闭的细胞的腺苷拯救为基础。Tomudex或5FdUMP(接着用5FdUrd处理)阻断的细胞不能通过从头合成来制备dTMP。因为这个原因，它们只有通过清除剂机理才能存活。重要的清除剂机理之一是利益胞外腺苷。通过靶细胞掺入的腺苷通常通过胸苷激酶可以转化为dTMP，并且这样持续进行DNA合成。也描述过使用外源腺苷的其它途径。如果NB1011活性的重要机理是通过内源TS的抑制，则当对细胞培养基加入腺苷时应该减轻细胞毒性。对于该项实验，对多种细胞系筛选它们对Tomudex和5FdUrd的敏感性，和通过腺苷补充从这些试剂恢复的能力。使用正常的结肠内皮细胞，CCD18co，因为它们对NB1011，5FUdR和Tomudex有可测定的敏感性。根据(Patterson等(1998)癌症研究(Cancer Res.)58：2737-2740)所述，有或没有10μM腺苷下，进行实验，但是使用alamar blue测定(参见材料与方法)来测定细胞毒性。结果表明从Tomudex拯救15倍(IC50从6.5nM变为95nM)，从5FudR拯救大于590倍(IC50从小于0.01μM变为大于5.9μM)，不存在腺苷下稍微降低变为存在10μM腺苷下的223μM。
3.对肿瘤细胞系的TS水平和NB1011介导的细胞毒性之间的相关性
利用几种方法确立TS参与NB1011-介导的细胞毒性：1)检查NB1011对正常结肠细胞与高TS表达，5FU-抗性，肿瘤细胞相比的活性；2)TS转染到肿瘤细胞背景中，产生克隆衍生物，其基本上与TS表达不同但是非常相似；和3)使用TS的特异性抑制剂，Tomudex，来降低细胞内TS活性。
在开始对NB1011和5FUdR-介导的细胞毒性分析时，对CCD18co正常结肠内皮细胞类型和H630R10，5FU抗药性结肠肿瘤细胞系进行比较(Copur等(1995)生物化学药物(Biochem.Pharm)49(10)：1419-1426)。这测得了对正常细胞(CCD18co)的细胞毒性，以及测得对过度表达TS的抗药性肿瘤细胞(H630R10)的细胞毒性。这是重要的，因为明显限制当前化学治疗物的是它们对正常组织的细胞毒性。表4给出了结果。
该实验证明与5FU-抗性H630R10肿瘤细胞相比5FUdR对正常结肠细胞(CCD18co)的毒性高大约18倍。该负治疗指数是当前化学治疗的主要局限性，即其对正常组织的毒性。对于阿霉素也报道过这样的负治疗指数(Smith等(1985)J.Natl.Cancer Inst.74(2)：341-7和Smith等(1990)癌症研究(Cancer Res.)50(10)：2943-2948)。但是与5FUdR相反，与正常结肠内皮细胞相比(IC50大于2500μM)，对抗药性H630R10细胞(IC50＝216.7μM)，NB1011具有提高11倍以上的活性。该结果提示：1)NB1011的活性对高TS表达肿瘤细胞更显著；和2)与5FUdR相比，使用TS ECTA化合物可实现治疗指数共提高(18)×(11)＝198倍。
4.HT1080肿瘤细胞中TS的过度表达提高它们对NB1011的敏感性。
NB1011的激活需要几个步骤。这些包括细胞穿透转化为核苷酸一磷酸，结合TS，和接着的毒性代谢。细胞穿透和转化的精确机理还没有完全确定。细胞进入可能部分取决于核苷传输机理(Cass等(1998)生物化学与细胞生物学(Biochem.Cell Biol.)76(5)：761-70)。类似地，氨基磷酸酯转化为一磷酸酯的过程应用了定义不太确切的机理(Abraham等(1996)药物化学杂志(J.Med.Chem.)8：39(23)：4589-4575)。
这些结果是特别明显的，因为它们证明，在十分均匀的遗传背景下，提高的TS水平指示对NB1011的增强的敏感性。另外，数据也证明提高的TS水平指示对氟代嘧啶的抗性，结果与文献报道(Copur等(1995)上文；Banerjee等(1998)癌症研究(CancerRes.)58：4292-4296)相吻合。
5.NB1011-介导的细胞毒性的抑制剂
Tomudex是主要通过对TS的抑制作用起作用的化学治疗剂。如果NB1011通过TS酶表现出细胞毒性，则用Tomudex对TS的抑制应该降低NB1011-介导的细胞毒性。为了直接测试该假设，与亲本MCF7细胞系相比过度表达TS11倍的Tomudex-抗性MCF7细胞在渐增浓度的TDX存在下接触NB1011。
将细胞铺平板并且根据上面材料与方法章节中描述接触指定浓度的化合物。
数据表明，使用特异性抑制剂Tomudex对TS的阻断导致对NB1011-介导的细胞毒性的高达大约25倍的抑制。这些结果支持这样的概念，即通过TS从其代谢产物产生NB1011活性。
为了进一步表征NB1011的胞内代谢，用甲酰四氢叶酸(LV；5-甲酰基四氢叶酸)进行组合实验。该项实验是首创的，因为我们发现THF刺激BVdUMP和rHuTS的无细胞反应中荧光产物的产生。假设如果荧光产物与NB1011的细胞毒性作用相关，则通过在培养基中提供LV提高的THF胞内水平也增强NB1011-介导的细胞毒性作用。令人惊奇地，根据在alarmar blue测试中测定的，与单独的NB1011相比，在3μM LV存在下，NB1011对H630R10细胞系的活性减小90％以上。补充胞内减少的叶酸总量的LV破坏NB1011活性的事实提示NB1011可能部分通过减少这些集合而起作用。或者，LV(或代谢产物)可能部分由于通过与TS相互干扰而直接冲击BVdUMP的代谢。
为了揭示LV是否直接冲击BVdUMP与TS的反应，进行反应，+/-THF与BVdUMP，或者用THF+dUMP，和+/-氨甲喋呤(MTX)，LV或Tomudex(TDX)。
这些结果(表6)在两方面是令人惊奇的：1)尽管在THF的存在下从BVdUMP产生的荧光产物增加，但是在该辅因子的存在下发生了使用的底物消耗(BVdUMP)的速率降低；和2)在辅因子存在下，所有三种实验化合物(MTX，TDX和LV)大大抑制rHuTS+BVdUMP反应。在各种情况下，该抑制作用比在dUMP+rHuTS反应中或者在没有THF存在下与BVdUMP的反应中见到的更显著。
上述结果证明LV，MTX和TDX对BVdUMP+TS反应的抑制作用，和另外的，该作用在辅因子(THF)存在下更显著，上述结果提示其它化学治疗剂可以调节NB1011活性。重要的是，通过提供LV容易拯救NB1011-处理过的细胞，类似于从MTX的LV拯救。在MTX情况下，LV拯救通过补充胞内叶酸总量而发生，胞内叶酸总量通过二氢叶酸还原酶和TS的MTX抑制作用而减少。如果在BVdUMP与TS反应期间被还原的叶酸在细胞内减少，则通过不同机理减少胞内胸苷或嘌呤核苷酸总量的其它化合物当与NB1011一起使用时可以给出加和或协同抗细胞效果。这样的化合物的例子(Dorr和VonHoff(1994)上文)，包括6-巯基嘌呤，硫代鸟嘌呤和2’-脱氧助间型霉素，所有这些都干扰嘌呤代谢。氮胞苷-介导的乳清苷脱羧酶的抑制作用阻断嘧啶生物合成，这样通过与NB1011不同的机理降低细胞内胞内胸苷水平。
D.TS ECTA的药物基因组学
1.TS和HER2的比较
当前发现和开发新的治疗方法的一个重要的方面是鉴定最可能对治疗产生反应的(阳性药物基因组选择)的患者。该领域占先锋位置的药物之一是Herceptin，现在用来治疗过度表达HER2原癌基因的乳腺癌。使用抗-HER2抗体的早期数据表明对随机选择的肿瘤细胞和正常细胞的活性是小的。但是，如果选择HER2表达提高至少4倍的肿瘤细胞系，则可以证明与正常细胞或表达较低量的HER2基因产物的肿瘤细胞相比明显的活性和抗-HER2抗体(Shepard等(1991)上文)；(Lewis(1993)Cancer Immural Immunother37(4)：255-63)。图9给出的数据证明与用Herceptin的情况类似。
图2给出的细胞系结果可以提示TS和HER2/NEU体系之间的另外的相似性。该相似性是每一个具有类似的过度表达要求(大约4倍)，其指示TS和HER2/NEU过度表达患者疾病更严重(Johnston等(1994)J.Clin.Oncol.12：2640-2647)。
2.NB1011抗5FU和Tomudex-抗性结肠和乳腺癌细胞系是有活性的。
因为NB1011具有预见的抗癌活性，将其就安全性与其它化学治疗剂相比较是重要的。当将其与Tomudex相比较时，进一步强调在癌症的治疗中使用NB1011，Tomudex是一种化学治疗剂，象5FU一样，其经常被用来治疗结肠癌和乳腺癌以及恶性肿瘤。
结果(图10)表明对正常细胞(CCD18co)，NB1011比TDX毒性小10倍以上，对MCF7-TDX抗性肿瘤细胞，其比TDX更有效达30倍以上。对于其它TDX-抗性肿瘤细胞系获得了类似结果。对正常细胞的低水平毒性和对TDXR肿瘤细胞的高毒性支持对过度表达TS的抗药性癌症施用NB1011。
3.根据从dUMP-3H氚释放的测定，NBl011比TS活性更依赖TS蛋白质水平。
使用四种类型的测试来表征细胞和组织内TS水平。最常用的是以抗体为基础的技术(Johnston(1994)上文；Johnston(1995)上文)，但是在各种研究中也测定了RT-PCR，5FdUMP-结合和氚释放(van Laar(1996)临床癌症研究(Clin.Cancer Res)2(8)：1327-33；vanTriest(1999)Clin.Cancer.Res.5(3)：643-54；Jackman(1995)耳鼻咽喉科学纪事(Ann.Oncol.)6(9)：871-81；Larsson(1996)Acta.Oncol.35(4)：469-72；Komaki(1995)乳腺癌研究治疗(Breast CancerRes.Treat.)35(2)：157-62；Mulder(1994)抗癌研究(AnticancerRes.)14(6B)：2677-80)
为了表征细胞系，我们集中进行蛋白质印迹和从3H-dUMP的氚释放。选择这些测试，因为抗体-检测常用于临床样品，而来自标记的脱氧尿苷的氚释放直接测定细胞内TS的催化活性。
根据方法中所述培养细胞并表征。TS表达水平是相对于CCD18co，正常结肠内皮细胞系的。根据方法中所述，氚释放是减去背景值的。ND＝未能检测到高于背景的值。
表7中给出的数据分析表明TS蛋白质水平和对NB1011的敏感性之间的关系比TS活性(从3H-dUMP的氚释放)和NB1011敏感性之间的关系更密切。在各套匹配的亲本细胞系和抗药性肿瘤细胞系中，抗药性衍生物，各有比亲本更多的TS蛋白质，也具有提高的对NB1011的敏感性。但是，当关于TS活性进行相同的比较时，亲本细胞系常常具有可比的，或者更大的TS活性，并且对NB1011-介导的细胞毒性更不敏感。
这些结果通过很多不同机理或机理的组合而发生，可能是3H-dUMP向dUMP的转化(和伴随氚释放)可能受到某些成分的限制，可能是辅因子可获得性。但是，因为BVdUMP的转化不依赖于辅因子，所以其与TS的反应即使在其中辅因子是有限的这样的细胞培养基中也是连续的。该发现是重要的，因为作为治疗剂的TS底物没有试图以对TS活性的典型氚释放测试的结果为基础，在所述测试中，发现最恶化的抗药性肿瘤细胞比它们的亲本具有更低的TS活性。这些结果另外支持这样的提示，即通过抗体染色检测TS水平的基础上简单地选择进行TS ECTA治疗的患者。
4.肿瘤样品中TS水平经常超过正常组织的4倍。
上面给出的结果提示，TS ECTA治疗，至少用NB1011，当对过度表达TS至少4倍的癌症患者使用时最有效。
文献(Johnston(1994)上文；Bathe(1999)美国癌症科学研究(CancerJ.Sci.Am)5(1)：34-40；Leichman(1998)Oncol.(Huntingt.)12(8增刊6)：43-7；和Lenz(1995)PCR方法应用(PCR MethodsAppl.)4：305-308)提出大约50％的癌症患者过度表达在4倍范围内，并且，此外，过度表达的该水平预示更恶化的疾病。为了证实人结肠癌中TS至少4倍过度表达的概率，从Cooperative Human Tissue Network获得匹配的正常样品和肿瘤样品。通过RT-PCR对这些样品分析TSmRNA水平，将得到的结果与免疫组织化学的结果相比较(Johnston等(1995)上文)。图11给出了对样品RT-PCR评价的结果。
根据RT-PCR测试确定的，上面分析的7份样品中的5份过度表达TS至少4倍水平。这些患者中没有一名事先用化学治疗治疗，这提示该概率和过度表达水平与发病有关，而不是由于化学治疗的选择。预计为了提高表达可以筛选接触了TS抑制剂例如Tomudex或5FU或5-FdUrd，5-FdUMP的合成代谢衍生物的癌细胞(Lonn等(1996)癌症(Cancer)77(1)：107-12)。根据对所有7份样品的RT-PCR测定的，过度表达的程度是大约4.7倍。这些数据提示肿瘤病灶中TS过量4倍以上表达是常见的。
5. 5FU-抗性人结肠癌的实验性治疗。
定向TS的新化合物治疗的最重要的疾病是胃肠癌。为了在体内模型中研究NB1011的活性，H630R10，5FU-抗性人结肠癌细胞在裸鼠体内皮下生长至平均肿瘤大小为50mm3。然后用赋形剂(DMSO，5FU或NB1011)处理小鼠。
肿瘤内或腹膜内对有肿瘤的小鼠每天给药3.5毫克，2.5毫克和1.25毫克剂量的NB1011，给药5天。图12A说明与赋形剂或5FU处理动物相比，用NB1011治疗5天诱导了肿瘤生长的最初的阻断。尽管在NB1011组中没有证明统计学意义的剂量反应相关性，但是从第6天开始NB1011组相对5FU或赋形剂对照组之间出现明显不同。在第25天杀死对照动物之前这种差异都一直保持(图12B)，即使在第5天之后治疗就不持续了。
尽管参照具体实施方案详细描述了本发明，但是对本领域技术人员显而易见的是不超出本发明的精神和范围可以进行各种变化和修饰。
表2  细菌和rHuTS动力学参数的比较
动力学常数 干酪乳杆菌  rHuTS
 dUMP Km 3.0μM  7.7μM
Kcat 6.4s-1  0.2s-1
Kcat/Km 2.1×106M-1s-1  2.6×104M-1s-1
Ki(of BVdUMP) 0.6μM  4.5μM
 BVdUMP Km 3.3μM  16μM
Kcat 0.018s-1  0.0067s-1
Kcat/Km 5.6×103M-1s-1  4.2×103M-1s-1
Ki(of dUMP) 2.0μM  17.5μM
相对催化效率(dUMP对BVdUMP) 385-倍  60-倍
根据方法中所述进行酶动力学实验。关于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的数据得自Barr等(1983)上文。根据上文材料与方法中所述制备rHuTS。
表3 Tomudex和5-FdUMP对rHuTS反应的抑制作用
底物+辅因子 没有抑制剂 Tomusdex(500nM) 5-FdUMP(500nM)
BVdUMP+THF  109±16RFU/min(100％) 67±3(61％) 44±2(40％)
BVdUMP-THF  75±11(100％) 34±3(45％) 93±13(129％)
dUMP+THF  1500±20nmoles/min(100％) 690±40(46％) 290±70(19％)
Tomudex和5-FdUMP对rHuTS反应的抑制作用。根据材料与方法中所述将含有酶抑制剂或辅因子的胸苷酸合成酶反应在30℃下温育，对于BVdUMP反应，通过测定340nm激发和595nm发射下相对荧光单位的增加，或者，对于dUMP反应，测定A340的增加，测定酶反应的初始速率。表4  对正常和肿瘤细胞株的相对5FU的NB1011的细胞毒性
         正常细胞       IC50(μM)            肿瘤细胞     IC50(μM)
 NB 101.1    5FU  NB101.1    5FU
  CCD1800 (结肠)     562     2.0     H630R10   (结肠)     65     41.6
  DET551 (皮肤)     262     0.8     HT1080   (结肠)     449     0.8
  NHDF (皮肤)     359     0.8     COLO320   (结肠)     401     1.5
  H527 (皮肤)     273     1.6     COLO205   (结肠)     105     1.3
  W138 (肺)     335     1.0     SW620   (结肠)     374     4.6
  MRC9 (肺)     303     1.1     SKCO1   (结肠)     184     1.4
  NHLF (肺)     139     0.9     HCTC   (结肠)     280     2.8
  NHA (脑)     839     0.9     MCF7   (乳腺)     141     1.0
  NHOST (骨)     642     4.7     MDAMB361   (乳腺)     365     5.0
  NPRSC (前列腺)     369     1.7     MDAMB468   (乳腺)     172     4.4
  NHEPF (肝)     2085     1.7     SW527   (乳腺)     431     4.3
    NCIH520     (肺)     135     0.6
平均值     561     1.6     SKLU1   (肺)     270     7.9
    SOAS2     (骨)     232     1.4
    PANC1     (胰)     492     1.9
    SKOV3   (卵巢)     484     3.0
    PC3 (前列腺)     184     0.9
    HEPG2   (肝)     704     22.8
    SKHEP1   (肝)     247     1.7
    A431   (皮肤)     266     0.2
    MCIxc   (脑)     61.     1.2
  平均值     288     5.3
表4，续
   NB101.1  5FU
治疗指数(N/T)     1.95   0.30
在alamar blue测试(方法)中对细胞分析对NB1011或5FU的反应。所有的测试至少进行三次。标准偏差小于0％。以IC50(所有细胞类型的平均值)与IC50(所有肿瘤细胞系的平均值)之比计算治疗指数。
表5 对基因工程处理以表达HuTS的细胞系的NB1011细胞毒性
  细胞系 TS水平               IC50
(％)* NB1011(μM) FUDR(μM) 5-FU(μM) TDX(μM)
C/HT1080  100  320 ＜0.1  1.0  3.6
TSL/HT1080  409  196  2.2  1.7  24
TSL/HT1080  702  0.8  3.1  3.5  153
用GFP符合读框将编码rHuTS的cDNA亚克隆到载体pEGFP-C3中。将该构建体转染到HT1080细胞中并且为了获得稳定表达融合rHuTS的克隆用G418(750μg/毫升)筛选。根据方法中所述以高荧光表达或低荧光表达为基础克隆各细胞。通过使用蛋白质印迹分析测定*TS水平，以相对于细胞株CCD18co的值表示定量测定的表达水平。
表6 Tomudex抑制NB1011介导的细胞毒性
[Tomudex](nM) 0nM  1nM  10nM  100nM  1000nM
NB1011IC50(μM) 5.7  25.5  87.7  140.3  103.0
保护倍数 1  4.5x  15.4x  24.6x  181x
根据方法中所述，用TDX-抗性MCF7乳腺癌细胞进行Tomudex拯救测试(alamar blue)。以有或没有加TDX的IC50的比例计算“保护倍数”。表7 叶酸抑制剂的影响
抑制剂 BVdUMP，和THF  BVdUMP，w/o THF  dUMP，和THF
None  100％ 138％ 100％
MTX  10％ 24％ 31％
LV  17％ 97％ 77％
TDX  0％ 25％ 18％
根据方法中所述，使用rHuTS进行无细胞测试，合并合适的底物和其它成分。加入MTX(140μM)，LV(140μM)或TDX(5μM)来估算它们的抑制活性。底物的应用(或者BVdUMP或者THF)被用作反应速率的量度。数字表示残留的活性。
表8  与氚释放相比，NB1011活性与TS蛋白质更相关
细胞系 药物筛选 蛋白 氚释放 NB1011-IC50
H630   无  288  3206  414
结肠癌   5FU  2350  1840  65
  TDX  671  3980  2.3
RKO   无  142  4920  136
结肠癌   TDX  279  1625  28
MCF7   无  178   5185   327
乳腺癌   TDX  1980   875   2.8
N1S1   无  197   12,565   494
  5FU  1241   ND   204
表9选择的MDF7TDX细胞对NB1011的抗性比
对5-氟尿嘧啶和Tomudex更敏感
                   IC50(微摩尔)*
                                                         相对TS
                       5-FU         Tomudex    NB1011    蛋白质水平MCF7                     10-          .026-      291-      1X-MCF7 TDX                 32           ＞10       2         11XMCF7 TDX/1011            2            .041       240       4X*＝根据通过材料与方法中描述的alamar blue测试测定的结果。TDX＝Tomudex；1011＝NB1011。

Claims (25)

1.一种选择性抑制病理细胞的方法，其中所述细胞特征在于过度表达内源胞内激活酶，并且其中所述酶不被底物前体药物化合物灭活，该方法包括使细胞接触有效量的具有通过激活酶在细胞内选择性转化为毒素从而选择性抑制病理细胞增殖的结构的底物化合物。
2.下面的化合物
Figure A0081286800021
其中R1是或者包含离去基团，所述离去基团是具有与通过激活酶从嘧啶环的分离相适应的分子大小和亲电性的化学个体，并且其从嘧啶环激活酶释放时具有抑制细胞增殖或杀死细胞的能力；
其中Q选自糖，碳环化合物，非环化合物，和掩蔽的磷酸酯或氨基磷酸酯衍生物。
3.权利要求1或2的方法，其中所述化合物具有下面的结构：
其中R1是下式基团：
前提是化合物I中，n可以是0，
R2是选自下面的二价电子轨道基团：
不饱和的烃基；
包括一个或多个不饱和烃基的芳香族烃基；
包括一个或多个不饱和烃基的杂芳基；
R3是选自下面的二价间隔基部分：
R5可以是相同或不同的，并且独立地是具有1-10个碳原子的直链或支链烷基，或具有3-10个碳原子的环烷基，或R5是卤原子(F，Cl，Br，I)；
n是0-10的整数；
m是0或1；
R4是选自下面的发毒基团：
Figure A0081286800041
R8和R9是低级烷基且R10是H或CH3；
X是-Cl，-Br，-I，或者其它可能的离去基团，前提是当R7是-H且m是0时，则R4不是卤原子，或者当m是0且n是0时，则R4不是卤原子；
Y独立地是-H或-F；
Z独立地是-O-或-S-；
Q是选自下面的基团：
Figure A0081286800051
R6独立地是-H，-OH，-OC(＝O)CH3，F或者其它保护的羟基；而
R7是氢，磷酸酯基团，磷酸二酯基团或氨基磷酸酯基团；
其中所述化合物可以是任何对映异构体，非对映异构体，或立体异构体形式，包括，D-构型，L-构型，α-端基差向异构体，和β-端基差向异构体形式。
4.权利要求1的方法，其中所述病理细胞由于丧失肿瘤抑制剂功能过度表达激活酶。
5.权利要求1的方法，其中所述激活酶由于前化学治疗被过度表达。
6.权利要求5的方法，其中所述化学治疗是氟代嘧啶或托木迪斯。
7.权利要求1的方法，其中所述细胞是过渡增殖细胞或肿瘤细胞。
8.权利要求7的方法，其中所述肿瘤细胞是选自胃癌细胞，乳腺癌细胞和结肠癌细胞的细胞。
9.权利要求1的方法，其中所述激活酶是胸苷酸合成酶。
10.权利要求1的方法，其中所述激活酶选自胸苷酸合成酶，酪氨酸激酶或二氢叶酸还原酶。
11.权利要求1的方法，其中所述细胞和激活酶是相同物种的。
12.权利要求1的方法，进一步包括使细胞接触第二种治疗剂。
13.权利要求1的方法，其中所述第二种治疗剂是氟代嘧啶或托木迪斯。
14.权利要求1的方法，其中所述接触是在体外，离体和体内。
15.权利要求1的方法，其中所述接触是在体内。
16.权利要求1的方法，其中所述激活酶过度表达至少4倍。
17.权利要求1的方法，进一步包括使细胞接触有效量的减少胞内胸苷或嘌呤的化合物。
18.权利要求1的方法，进一步包括使细胞接触有效量的6-巯基嘌呤，硫代鸟嘌呤或2’-脱氧助间型霉素。
19.权利要求1-18任一项的方法，其中所述化合物是(e)-5-(2-溴乙烯基)-2’-脱氧-5’-尿苷基苯基L-丙氨酰基氨基磷酸酯。
20.筛选通过不被前体药物抑制也不被灭活的内源胞内酶选择性胞内转化为毒素的前体药物的方法，包括使候选前体药物与至少两种试验细胞接触，所述试验细胞表达来自相同或不同物种的内源胞内酶，并且测定通过内源胞内酶将前体药物激活为毒性物质的激活作用。
21.权利要求20的方法，其中一种试验细胞是正常细胞，另一种试验细胞是病理细胞。
22.权利要求21的方法，其中所述测试包括通过质谱分析胞内代谢产物。
23.权利要求20的方法，其中所述候选物质包括可检测试剂。
24.权利要求23的方法，其中所述可检测试剂是荧光标记。
25.权利要求20的方法，其中至少一种试验细胞是过渡增殖细胞或肿瘤细胞。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100394920C (zh) * 2003-03-24 2008-06-18 雷斯普罗泰克特有限公司 加强细胞生长抑制药凋亡作用的5-取代核苷的用途

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9708611D0 (en) * 1997-04-28 1997-06-18 Univ Cardiff Chemical compounds
US6703374B1 (en) 1997-10-30 2004-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleosides for imaging and treatment applications
US7462605B2 (en) * 1998-01-23 2008-12-09 Celmed Oncology (Usa), Inc. Phosphoramidate compounds and methods of use
JP2003527317A (ja) * 1999-07-22 2003-09-16 ニューバイオティックス インコーポレイテッド 酵素触媒抗感染性治療剤
US6683061B1 (en) 1999-07-22 2004-01-27 Newbiotics, Inc. Enzyme catalyzed therapeutic activation
WO2001007088A2 (en) 1999-07-22 2001-02-01 Newbiotics, Inc. Methods for treating therapy-resistant tumors
GB0009486D0 (en) * 2000-04-17 2000-06-07 Univ Cardiff Chemical compounds
AU2001277093A1 (en) * 2000-07-20 2002-02-05 Newbiotics, Inc. Methods for identifying therapeutic targets
WO2002056832A2 (en) 2001-01-19 2002-07-25 Newbiotics, Inc. Methods to treat autoimmune and inflammatory conditions
US6987180B2 (en) 2002-02-07 2006-01-17 President And Fellows Of Harvard College Uridine analogs and techniques for making and using
GB0609178D0 (en) 2006-05-09 2006-06-21 Univ Cardiff Novel compounds
US20100255514A1 (en) 2007-08-16 2010-10-07 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Tumor cell-derived microvesicles
CA2733672C (en) * 2007-08-16 2018-09-11 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Tumor cell-derived microvesicles
EP2971153B1 (en) * 2013-03-15 2018-10-10 The General Hospital Corporation Glycine, mitochondrial one-carbon metabolism, and cancer

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB982776A (en) * 1962-01-24 1965-02-10 Wellcome Found 2-deoxyuridines and their use in pharmaceutical compositions having anti-immune activity
JPS5017989B1 (zh) * 1970-12-24 1975-06-25
US4267171A (en) 1979-07-02 1981-05-12 The Regents Of The University Of California C-5 Substituted cytosine nucleosides
US4247544A (en) 1979-07-02 1981-01-27 The Regents Of The University Of California C-5 Substituted uracil nucleosides
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
JPS5843993A (ja) 1981-09-09 1983-03-14 Yamasa Shoyu Co Ltd １−β−Ｄ−アラビノフラノシル−（Ｅ）−５−（２−ハロゲノビニル）ウラシル−５′−りん酸およびその製造法
EP0095294A1 (en) 1982-05-22 1983-11-30 Beecham Group Plc Deoxyuridine compounds, methods for preparing them and their use in medicine
DE3229169A1 (de) 1982-08-05 1984-02-09 Robugen GmbH Pharmazeutische Fabrik, 7300 Esslingen Verwendung von 5-alkylpyrimidinnukleosiden und deren derivate als zytostatika
US4816570A (en) 1982-11-30 1989-03-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Biologically reversible phosphate and phosphonate protective groups
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
RO88451A2 (ro) 1984-06-05 1986-01-30 Intreprinderea De Antibiotice,Ro Derivati ai acidului 7-aminocefalosporanic si procedeu de preparare aacestora
US5116827A (en) * 1986-10-23 1992-05-26 American Cyanamid Company Quinolinecarboxylic acid derivatives as solubilized pro-drugs
US5077283A (en) * 1986-10-23 1991-12-31 American Cyanamid Company Solubilized imidazole pro-drugs
US5070082A (en) * 1986-10-23 1991-12-03 American Cyanamid Company Solubilized pro-drugs
US5077282A (en) * 1986-10-23 1991-12-31 American Cyanamid Company Solubilized pro-drugs
US5212291A (en) * 1986-10-23 1993-05-18 American Cyanamid Company Anthracycline derivatives as solubilized pro-drugs
US4963533A (en) 1986-10-24 1990-10-16 Stichting Rega Vzw (Rega) Therapeutic application of dideoxycytidinene
US5116822A (en) 1986-10-24 1992-05-26 Stichting Rega Vzw Therapeutic application of dideoxycytidinene
NL8700366A (nl) 1987-02-13 1988-09-01 Stichting Rega V Z W Combinatie van fu met bvdu als middel tegen adenocarcinoom.
US5085983A (en) 1988-08-19 1992-02-04 City Of Hope Detection of human tumor progression and drug resistance
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
JPH01301690A (ja) 1987-10-08 1989-12-05 Stichting Rega Vzw 抗ｈｉｖ活性をもつ３’−アジド−２，６−ジアミノプリン−２’，３’−ジデオキシリボシド
JPH01265099A (ja) 1987-10-08 1989-10-23 Stichting Rega Vzw 抗ｈｉｖ活性をもつ３’，−フルオロプリン−２’，３’−ジデオキシリボシド類
US4963263A (en) 1988-03-24 1990-10-16 Terrapin Technologies, Inc. Method of identity analyte-binding peptides
US5217869A (en) 1987-10-13 1993-06-08 Terrapin Technologies, Inc. Method to produce immunodiagnostic reagents
US5338659A (en) 1991-04-02 1994-08-16 Terrapin Technologies, Inc. Method for determining analyte concentration by cross-reactivity profiling
US5300425A (en) 1987-10-13 1994-04-05 Terrapin Technologies, Inc. Method to produce immunodiagnostic reagents
US5133866A (en) 1988-03-24 1992-07-28 Terrapin Technologies, Inc. Method to identify analyte-bending ligands
EP0316592A3 (en) 1987-11-13 1990-09-19 Stichting REGA V.Z.W. 3'-fluoro-2',3'-dideoxyuridine, and its therapeutic application
CA1317291C (en) 1987-12-14 1993-05-04 Naeem Botros Hanna Antitumor 6-sulfenamide, 6-sulfinamide and 6-sulfonamide purines, purine nucleosides, purine nucleotides and related compounds
AU631119B2 (en) * 1988-02-24 1992-11-19 Institut De Recherches Chimiques Et Biologiques Appliquees (I.R.C.E.B.A.) New derivatives of deoxy-2'-uridine substituted in the 5,3' or 5' position by acylated alpha-amino groups, process for obtaining them and drugs containing them
WO1990003978A1 (en) 1988-10-03 1990-04-19 Stichting Rega Vzw 5-halogeno-3'-fluoro-2',3'-dideoxyuridine compounds and their therapeutic application
US5596018A (en) 1988-12-28 1997-01-21 Toray Industries, Inc. Antiviral agents against aids-causing virus
US5433955A (en) 1989-01-23 1995-07-18 Akzo N.V. Site specific in vivo activation of therapeutic drugs
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
SK280313B6 (sk) 1990-04-24 1999-11-08 �Stav Organick� Chemie A Biochemie Av �R N-(3-fluór-2-fosfonylmetoxypropyl)deriváty purínov
AU7979491A (en) 1990-05-03 1991-11-27 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5137724A (en) 1990-05-23 1992-08-11 Stichting Rega Vzw Combinations of TS-inhibitors and viral TK-inhibitors in antiherpetic medicines
US5627165A (en) 1990-06-13 1997-05-06 Drug Innovation & Design, Inc. Phosphorous prodrugs and therapeutic delivery systems using same
WO1992019767A1 (en) 1991-04-29 1992-11-12 Terrapin Technologies, Inc. Methods to profile and treat abnormal cells
US5556942A (en) 1991-04-29 1996-09-17 Terrapin Technologies, Inc. Glutathione S-transferase-activated compounds
US5645988A (en) 1991-05-08 1997-07-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods of identifying drugs with selective effects against cancer cells
AU1787492A (en) 1991-05-16 1992-12-30 Glaxo Group Limited Antiviral combinations containing nucleoside analogs
EP0530407B1 (en) 1991-09-04 1996-06-05 Stichting REGA V.Z.W. Substituted, nucleoside derivatives, methods for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5233031A (en) 1991-09-23 1993-08-03 University Of Rochester Phosphoramidate analogs of 2'-deoxyuridine
US5879700A (en) 1991-10-15 1999-03-09 Hostetler; Karl Y. Nucleoside analogue phosphates for topical use
US5274162A (en) 1991-12-13 1993-12-28 Arnold Glazier Antineoplastic drugs with bipolar toxification/detoxification functionalities
WO1993013740A2 (en) * 1991-12-31 1993-07-22 Worcester Foundation For Experimental Biology Antiparasitic oligonucleotides active against drug resistant malaria
US5430148A (en) 1992-03-31 1995-07-04 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Antiproliferative quinazolines
US5668828A (en) * 1992-05-08 1997-09-16 Sanconix, Inc. Enhanced frequency agile radio
US6057305A (en) 1992-08-05 2000-05-02 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Of The Academy Of Sciences Of The Czech Republic Antiretroviral enantiomeric nucleotide analogs
US5516631A (en) 1992-10-13 1996-05-14 La Jolla Cancer Research Foundation Method of inhibiting replication of hyperproliferative cells
IL105244A (en) * 1993-03-31 2003-07-31 Dpharm Ltd Prodrugs with enhanced penetration into cells
US5502037A (en) 1993-07-09 1996-03-26 Neuromed Technologies, Inc. Pro-cytotoxic drug conjugates for anticancer therapy
US5798340A (en) 1993-09-17 1998-08-25 Gilead Sciences, Inc. Nucleotide analogs
WO1995008556A1 (en) * 1993-09-21 1995-03-30 Amersham International Plc Reagents comprising chimeric molecules of nucleic acids and nucleic acid analogs
US5908919A (en) 1993-10-01 1999-06-01 Terrapin Technologies Urethane mediated, GST specific molecular release systems
GB9323008D0 (en) 1993-11-05 1994-01-05 Connors Thomas Improvements relating to cancer therapy
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5521161A (en) 1993-12-20 1996-05-28 Compagnie De Developpment Aguettant S.A. Method of treating HIV in humans by administration of ddI and hydroxycarbamide
US5643893A (en) 1994-06-22 1997-07-01 Macronex, Inc. N-substituted-(Dihydroxyboryl)alkyl purine, indole and pyrimidine derivatives, useful as inhibitors of inflammatory cytokines
GB9415167D0 (en) * 1994-07-27 1994-09-14 Springer Caroline J Improvements relating to cancer therapy
US5556992A (en) * 1994-09-02 1996-09-17 Universite De Montreal Novel rhodamine derivatives for photodynamic therapy of cancer and in vitro purging of the leukemias
US5968910A (en) 1994-11-30 1999-10-19 Jan M. R. Balzarini Compositions containing two or three inhibitors of different HIV reverse transcriptases
DK0806956T3 (da) 1995-02-01 2003-01-06 Resprotect Gmbh Anvendelse af 5-substituerede nucleosider til hæmning af resistensdannelse ved cytostatikabehandling
GB9505025D0 (en) 1995-03-13 1995-05-03 Medical Res Council Chemical compounds
IL117940A (en) 1995-04-19 2003-06-24 Kumiai Chemical Industry Co Benzylsulfide derivatives, process for their production and insecticide compositions containing them
US5856464A (en) * 1995-06-07 1999-01-05 Lajolla Pharmaceutical Company Selective capping solution phase oligonucleotide synthesis
US5981507A (en) 1995-12-14 1999-11-09 Advanced Magnetics, Inc. Polymeric carriers linked to nucleotide analogues via a phosphoramide bond
US5880097A (en) 1996-01-04 1999-03-09 Terrapin Techologies, Inc. Tethered prodrugs
JP2000504670A (ja) * 1996-01-31 2000-04-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 腫瘍細胞の成長を抑制する方法
RU2111970C1 (ru) 1996-06-25 1998-05-27 Иван Игоревич Федоров 3'-оксимино-2',3'-дидезоксинуклеозиды
GB9708611D0 (en) 1997-04-28 1997-06-18 Univ Cardiff Chemical compounds
WO1999006072A1 (en) 1997-07-30 1999-02-11 Boehringer Mannheim Corporation Cyclized prodrugs
JP2001512830A (ja) * 1997-08-08 2001-08-28 ニューバイオティックス インコーポレイテッド 生物療法耐性および化学療法耐性を克服するための方法および組成物
AU729377B2 (en) * 1997-10-23 2001-02-01 Asterias Biotherapeutics, Inc. Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
US6703374B1 (en) 1997-10-30 2004-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleosides for imaging and treatment applications
ATE287414T1 (de) 1997-10-30 2005-02-15 Us Gov Health & Human Serv Antitumorale uridinderivate
ES2172303T3 (es) * 1998-01-23 2002-09-16 Newbiotics Inc Agentes terapeuticos obtenidos por catalisis enzimatica.
GB9821058D0 (en) 1998-09-28 1998-11-18 Univ Cardiff Chemical compound
AU773420B2 (en) 1998-12-11 2004-05-27 Medarex, Inc. Prodrug compounds and process for preparation thereof
JP4982019B2 (ja) * 1999-07-22 2012-07-25 セルメド オンコロジー （ユーエスエイ）， インコーポレイテッド 酵素によって触媒される治療活性化
WO2001007088A2 (en) 1999-07-22 2001-02-01 Newbiotics, Inc. Methods for treating therapy-resistant tumors
US6683061B1 (en) * 1999-07-22 2004-01-27 Newbiotics, Inc. Enzyme catalyzed therapeutic activation
JP2003527317A (ja) * 1999-07-22 2003-09-16 ニューバイオティックス インコーポレイテッド 酵素触媒抗感染性治療剤
US6294546B1 (en) 1999-08-30 2001-09-25 The Broad Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Uses of diterpenoid triepoxides as an anti-proliferative agent
GB0009486D0 (en) 2000-04-17 2000-06-07 Univ Cardiff Chemical compounds
GB0011203D0 (en) 2000-05-09 2000-06-28 Univ Cardiff Chemical compounds
US20020147175A1 (en) * 2000-11-16 2002-10-10 Shepard H. Michael Synergistic ECTA compositions
WO2002056832A2 (en) * 2001-01-19 2002-07-25 Newbiotics, Inc. Methods to treat autoimmune and inflammatory conditions

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100394920C (zh) * 2003-03-24 2008-06-18 雷斯普罗泰克特有限公司 加强细胞生长抑制药凋亡作用的5-取代核苷的用途

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