CN1192102C - 酶催化的治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了鉴定潜在的治疗剂的方法，该方法包括将靶细胞与候选的治疗剂相接触，所述候选的治疗剂是细胞中内源性细胞内酶的选择性底物，所述酶由于生物或化疗选择作用的结果其表达增加。本发明还提供了用于选择性杀死病理细胞的方法和分子的例子，该方法包括，将细胞与是内源性细胞内酶的选择性底物的前药相接触。所述前药随后被转变成细胞毒素。本发明还提供了治疗患者的特征在于病理性的过度增殖性细胞之疾病的方法，该方法包括，向患者施用是内源性、过度表达的细胞内酶的选择性底物的前药，然后前药在过度增殖的细胞内被酶转变成细胞毒素。

Description

酶催化的治疗剂
                 与相关申请交叉参考
根据35 U.S.C§119(e)，本申请以分别于1998年1月23日、1998年3月5日和1998年11月16日申请的美国临时申请60/072,264；60/076,950和60/108,634为基础要求优先权。将这些申请中的内容引入本发明作为参考。
                      技术领域
本发明涉及药物发现领域，具体地讲，是涉及一种细胞内酶之底物并通过所述细胞内酶可转变成细胞毒素的前药的设计，所述细胞内酶对于病理性细胞的治疗耐药性是至关重要的。
                        背景
在本发明说明书中，各种文献均以第一作者和日期、专利号或公开号作为参考。在本说明书中或在本申请结尾，权利要求之前，可以找到每一引用的完整书目。这些文献的内容均掺入本说明书作为参考以便更充分地描述本发明所属的现有技术的状态。
癌细胞的特征是无限生长、去分化和遗传不稳定性。这种不稳定性表现为染色体数异常、染色体缺失、重排、丢失或者多于正常二倍体数的双联。Wilson，J.D等人(1991)。这种遗传不稳定性是由多种因素引起的。描述最清楚的一个特征是在肿瘤抑制基因功能丢失后发生，基因组可塑性提高(例如Almasan，A等，(1995))。基因组可塑性使得肿瘤细胞可以适应其不断变化的环境，因此可有更经常的突变、基因扩增以及形成染色体外元件(smith，K.A.等(1995)and Wilson，J.D.等(1991))。这些特征提供了导致更具侵略性的恶性肿瘤的机制，因为这种特征可以使肿瘤迅速地发展对天然宿主防御机制、生物治疗(Wilson，J.D.等(1991)和Shepard，H.M.等(1988))以及化疗的抗性。(Almasan，A.等(1995)和Wilson，J.D.等(1991))
癌症是世界上最常见的使人致死的疾病之一。用抗癌药物治疗是一种日益重要的方法，特别是对于全身性恶性肿瘤或者已过了用外科手术治愈状态的转移癌。不幸的是，今天，可以治愈的癌症仍然很少(Haskell，C.M.eds(1995)，p32)。在可治愈人类癌症之药物开发方面的进展很慢。恶性肿瘤在其遗传学、生物学和生物化学方面的异质性以及对治疗的原发性或治疗诱导的抗性降低了癌症治愈的可能性。此外，许多抗癌药物选择性很低，经常造成严重的甚至威胁生命的毒副作用，从而抑制了采用足以杀死所有癌细胞的高剂量。寻找对治疗抗性的疾病、恶性细胞选择性增强的抗癌剂仍是药物开发的中心任务。另外，对抗生素的广泛抗药性已成为日益重要的世界范围内的健康问题。(Segovia，M.(1994)和Snydman，D.R.等(1996))。
化疗剂的种类
化疗剂的主要类型包括烷化剂、抗肿瘤抗生素、植物生物碱、抗代谢剂、激素激动剂和拮抗剂以及各种的其他药物。参见Haskell，C.M.编(1995)和Dorr，R.T.和Von Hoff，D.D.，编(1994)。
经典的烷化剂是能够用烷基取代某些有机化合物的氢原子的高活泼性的化合物。核酸、主要是DNA的烷基化是大部分这些化合物的主要的细胞毒性作用。它们引起的损伤干扰了DNA的复制和RNA的转录。经典的烷化剂包括氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、异环磷酰胺、噻替派和白消安。大量非经典的烷化剂也可以损伤DNA和蛋白质，但是是通过与经典烷化剂不同的复杂机制，例如甲基化或氯乙基化。非经典烷化剂包括达卡巴嗪、卡莫司汀、罗氮芥、顺铂、碳铂、丙卡巴肼和六甲蜜胺。
许多临床上有用的抗肿瘤药物是土壤真菌链霉菌不同菌株的天然产物。它们通过一种或多种机制产生杀肿瘤作用。所有抗生素均能够与DNA结合，通常是通过插入，随后使螺旋解旋。这种扭曲损害了DNA作为DNA合成、RNA合成或这两种合成之模板的能力。这些药物还通过自由基的形成乙基重要金属离子的螯合作用损坏DNA。它们还可作为拓扑异构酶II(对细胞分裂很重要的酶)抑制剂起作用。这类药物包括阿霉素、柔红霉素、去甲氧柔红霉素、米托蒽醌、博莱霉素、放线菌素D、丝裂霉素C、plicamycin和链佐星。
植物已提供了一些最有用的抗肿瘤剂。这种药物中的三种是长春花属生物碱(长春新碱和长春花碱)，表鬼臼毒素(依托泊苷和鬼臼噻吩苷)和紫杉醇(太平洋紫杉素)。长春花属生物碱与正在分裂的细胞和神经系统中的微管蛋白结合。这种结合改变了有丝分裂纺锤体末端微管蛋白加入或丢失的动力学，最终导致抑制有丝分裂。类似的蛋白质组成了神经组织的重要部分；因此，这些药物是有神经毒性的。表鬼臼毒素抑制拓扑异构酶II，因此，对细胞功能有深远的影响。紫杉醇对微管有复杂的影响。
抗代谢剂是细胞功能和复制所需的正常代谢物的结构类似物。它们通过通过与细胞酶的相互作用来发挥作用。已经开发并经临床检测的各种抗代谢剂是甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(FUDR)、阿糖孢苷、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-硫代鸟嘌呤、去氧助间型霉素、氟达拉滨、2-氯脱氧腺苷和羟基脲。
对于数种形式的肿瘤疾病，内分泌操作是一种有效的治疗方法。为了可能用于癌症学，已开发了各种各样的激素和激素拮抗剂。已有的激素类药物是己烯雌酚、他莫昔芬、甲地孕酮乙酸酯、地塞米松、泼尼松、氨鲁米特、利普安、性瑞林、氟利坦和醋酸善得定。
现有化疗剂的缺陷
目前与利用化疗剂治疗癌症有关的问题是需要高剂量的所需化疗剂；对正常细胞的毒性，即缺乏选择性；免疫抑制作用；继发的恶性肿瘤和药物抗性。
现有用于癌症化疗的大部分试剂是通过抗增殖机制来发挥作用。因为许多正常细胞(例如结肠上皮细胞、造血细胞)有高增殖率，因此有毒性产生。由于宿主毒性，不得不在杀死所有活肿瘤细胞所需的剂量以下的剂量水平中断治疗。
与现有治疗方法有关的另一种副作用是化疗对最快速分裂的正常宿主组织如骨髓、肠粘膜和淋巴系统细胞的毒性作用。所述化疗剂还有许多其他的不利影响，包括神经毒性；对性和生殖腺功能的负面影响；心、肺、胰和肝毒性；血管和超敏反应以及皮肤反应。
                         表1
    正常和肿瘤乳腺上皮细胞对阿霉素化疗同样敏感
    细胞或组织     样品数   平均IC50
    正常乳腺     13   14.8±8.7ng/ml
    原发性癌(UT)     19   11.4±6.8ng/ml
    转移癌(UT)     4   36±26.3ng/ml
    转移癌(Rx)     10   19.8±12.7ng/ml
摘自Smith等JNCl74：341-347(1985)。
对于临床中所用的许多抗肿瘤药物来说，血液毒性是最危险的毒性。最常见的形式是中性白细胞减少症，伴随着高度的感染危险，尽管也会发生血小板减少和出血并会威胁生命。化疗还包括多形核白细胞和血小板功能上的性质缺陷。已开发了造血生长因子来克服这些副作用。Wilson，J.D等(1991)和Dorr，R.T.和Von Hoff，D.D.编(1994)。
大部分常用的抗肿瘤剂能够抑制细胞和体液免疫。感染常常导致晚期癌症患者的死亡，受损伤的免疫会加剧所述死亡。慢性的延迟的免疫抑制也是由癌症化疗引起的。
神经毒性的主要形式是蛛网膜炎；脊髓病或脑脊髓病；慢性脑病和瞌睡综合征；急性脑病；外周神经病；和急性小脑综合征或共济失调。
许多常用的抗肿瘤药物是致突变的和引起畸形的。某些抗肿瘤药物包括丙卡巴肼和烷化剂是致癌的。这种致癌作用在用多功能烷化剂和拓扑异构酶II抑制剂如依托泊苷和蒽环素类抗生素治疗的患者中主要是作为延迟的畸形白血病而观察到。化疗还与延迟的非何杰金氏病淋巴瘤和实体肿瘤有关。本发明将使这些影响达到最小的程度，因为仅在肿瘤细胞内激活所述前药。
恶性肿瘤细胞对所用药物的抗性的出现严重限制了化疗剂的临床应用。许多细胞机制都可能与药物抗性有关，例如改变的药物代谢机制、细胞对活性化合物的不可通透性获知使药物从所述细胞中加速消失、受抑制的酶的特异性改变、靶分子的生产增加、细胞毒性损伤的修复增加或者通过其他生化途径发生抑制作用。在某些情况下，对一种药物的抗性可能赋予在生化上对其他不同药物的抗性。对癌症化疗剂的另一种抗性机制是通过肿瘤抑制基因，特别是p53、RB和p16的功能丧失而引起的。这些基因产物功能的丧失导致通常由抗癌药物靶向之酶(例如5FU/胸苷酸合成酶和氨甲喋呤/二氢叶酸还原酶)的表达的去阻遏。(Lee，V.等(1997)，Exp.Cell Res.234：270-6；Lenz，H.J.等(1998)，ClinicalCancer Res.4：1227-34(1998)，Fan，J.和Bertino，J.(1987)，Oncogene14：1191-200)。特定基因的扩增与对生物和化疗的抗性有关。编码二氢叶酸还原酶之基因的扩增与氨甲喋呤抗性有关，而编码胸苷酸合成酶之基因的过表达/扩增与用5-氟嘧啶治疗的抗性有关。Simth(1995)。表2总结了与生物和化疗抗性有关的显著的酶。
                                  表2在对癌症化疗抗性中过表达的酶
酶 生物学或化疗 参考文献(举例)
胸苷酸合成酶 尿嘧啶基的叶酸基的喹唑啉基的 Lonn，U等，癌症77：107，1996Kobayashi，H.等日本癌症研究86：1014，1995Jackman，AL等，Anticancer DrugDes.10：573
二氢叶酸还原酶 叶酸基的 Banerjee，D.等Acta Biochem Pol.42：457，1995Bertino，J.R.等，干细胞14：5，1996
酪氨酸激酶 TNF-α多药物抗性 Hudziak，R.M.等，PNAS85：5102，1988Stuhlinger，M.等甾类生物化学杂志49：39，1994
MDR相关蛋白(ABC P-gp蛋白) 多药物抗性 simon，S.M.和Schindler，M.PNAS91：3497，1994Gottesman，M.M.等，Annu.Rev.Genet.29：607，1995
CAD* PALLA** Smith，K.A.等，Philos.Trans.R.Soc.Lon.B.Biol.Sci.347：49，1995Dorr，R.T.和Von Hoff，D.D.编“癌症化疗手册”第二版(Appleton和Lange1994)，768-773
拓扑异构酶I(结肠&前列腺癌) 喜树碱 Husain等，癌症研究54：539，994
核糖核苷酸还原酶 羟脲 Wettergren，Y.等，Mol.Genet.20：267-85，1994Yen，Y.等癌症研究，54：3686-91，1994
*CAD＝氨基甲酰-P合成酶，天冬氨酸转氨基甲酰酶，二氢乳清酸酶**PALA＝N-(磷酸乙酰)-L-天冬氨酸
用前药作为提高化疗剂选择性的解决方法
了解抗癌剂的选择性差已有很长的时间，而且在改进选择性并使给药剂量增大方面所作的努力很大。一种方法是开发前药。前药是毒性温和并可在体内被转变成治疗活性产物的化合物。在某些情况下，通过经抗体(“ADEPT”或者抗体依赖的酶前药治疗(美国专利4975278))或基因靶向(“GDEPT”或基因依赖性酶-前药治疗)而传递到靶细胞的非内源酶的作用来激活(Melton，R.G.和Sherwood，R.F.(1996))。就其脱离血液并渗透肿瘤的能力而言，这些技术有严重的限制。Connors，T.A.和Knox，R.J.(1995)。
因此，需要可渗透肿瘤并抑制增殖和/或杀死已发展了治疗抗性的癌细胞。本发明满足了这种需要并提供了相应的优点。
                      发明综述
本发明提供了通过将靶或待测细胞与是所述细胞中靶酶的选择性底物的侯选治疗剂或前药接触来鉴定潜在的治疗剂的方法。将所述新方法命名为“ECTA”，即酶催化的治疗剂。在一个实施方案中，靶酶是内源的细胞内酶，该酶被过表达并赋予对生物和化疗剂的抗性。在另一实施方案中，由于肿瘤抑制功能的丧失(Smith，K.A.等(1995)和Li，W.等(1995))和/或因前述与化疗接触而引起的选择，所述酶的活性在肿瘤细胞中已被大大提高(Melton，R.G.和sherwood，R.F.(1996)和Lonn，U.等(1996))。在另一实施方案中，靶酶是细胞中感染剂的表达产物。
将细胞在体外和/或体内与候选前药接触后，通过记录所述试剂是否引起细胞增殖的降低或是否杀死所述细胞来检测所述细胞中所述试剂的效力。在本发明的一个方面，所述前药通过靶酶从前药释放有毒副产物杀死所述细胞或抑制细胞增殖。在本发明的另一方面，可用一种或多种“靶酶”激活所述前药以便使其释放有毒副产物。
本发明的另一方面包括用于检测新前药的试剂盒，所述新前药具有本文所述的对靶酶的特征。所述试剂盒包括完成所述检测和分析结果所必需的试剂和说明。
本发明还提供了通过将病理性细胞与是靶酶，如上述内源细胞内酶之选择性底物的前药接触来选择性杀死所述细胞的方法和分子的实例。所述底物通过所述细胞内靶酶被特异性地转变成细胞毒素。在本发明的另一方面，初始反应的产物随后通过常见的细胞酶如酰基转移酶、磷酸酶或者其他“管家”酶(Voet等(1995))或常见的细胞组分(例如水)被完全激活以便从所述前药释放有毒副产物。
本发明还提供了通过给个体施用前药来治疗以个体病理性过度增殖细胞为特征之疾病的方法，所述前药是靶酶的选择性底物并通过所述酶在所述过度增殖细胞中被选择性地转变成细胞毒素。本发明的前药可以单独使用或者与其他化疗剂或者其他抗癌治疗如照射联用。
本发明的另一方面是制备用于通过给个体施用前药来治疗以个体病理性过度增殖细胞为特征之疾病的药物，所述前药是靶酶的选择性底物并通过所述酶在所述过度增殖细胞中被选择性地转变成细胞毒素。
本发明的另一方面是用于鉴定适用于个体的最佳治疗的方法，所述方法通过分离过表达内源细胞内酶的细胞，然后将所述细胞与至少一种本发明前药接触，接着鉴定哪一种或几种前药抑制增殖或杀死细胞，由此鉴定适用于个体的最佳治疗。
                   附图的简要描述
图1表示细胞中对抗癌方式的抗性的发展和结果。
图2说明本发明前药的激活途径。
图3说明用于筛选被在药物抗性中重要的细胞内酶激活的前药的高效方法。
图4说明用TS-阴性大肠杆菌作为细胞靶如何发现前导人胸苷酸合成酶(TS)前药。
图5举例说明用所述筛选方法如何同时优化与两种靶酶反应的前药。
图6说明用于产生胸苷酸合成酶(TS)-可激活前药的分成多块底物的实施方案。
方框1代表掩蔽或没有的磷酸基团的R7。当被掩蔽时，它是促进细胞进入并在细胞内被加工成与TS结合的单磷酸的氨基磷酸酯或者类似的衍生物。参见Fries，K.M等(1995)。当没有时，R7是氢原子，所述前药是细胞胸苷激酶(TK)的底物，在体内产生必不可少的单磷酸。
方框2是2’-脱氧呋喃核糖基团或者其他类似糖、硫代糖、碳环的或者无环的基团，所述基团以支持所述前药与TS功能结合，而当R7是氢原子时，与TK结合的方式将所述单磷酸与嘧啶环相连。该基团不需利用氧原子与方框1的R7基团相连。因此，糖磷酸的膦酸类似物是可接受的。
方框3表示连接基团，其中n是0-10，该基团是一个单或多不饱和的电子导管，其作用是当TS作用于前药时，它可以将电子导离嘧啶环并导向离去基R4。该连接基团由0-10个可以随意混合或匹配的不饱和的部分如非环的乙烯基、乙炔基、亚胺或偶氮单元或环状不饱和的、芳族或杂芳族的部分组成，只要它们的连接可以产生所需的导电导管即可。
方框4表示连接连接基团和离去基R4的间隔单元X，其中m是0-1的整数。如果方框3的n等于0，则方框4的m等于1。在优选的形式中，X是带或不带取代基的亚甲基(CH2)单元。此外，X可以是氧、硫、氮或其它可以形成至少两个共价键的原子。当X不存在时(方框4，m等于0)，在TS对前药的加工过程中离去基R4的离去留下了基于嘧啶核苷酸的烷基化实体。参见Barr等(1983)。当X存在时(方框4，m等于1)，离去基R4的离去在TS对前药的加工过程的早期离去。
方框5表示在TS对前药的作用下释放的离去基R4，其本身是有毒的抗代谢剂或烷化剂或是易于在体内产生有毒的抗代谢剂或烷化剂的实体。例如，在TS的作用下释放时，离去基R4可以以抗癌剂Tepa或赛替派、磷酰胺氮芥、N-乙酰基鞘氨醇(C2神经酰胺，一种肿瘤抑制剂类脂)或羟基脲(核糖核苷酸还原酶抑制剂)的活性代谢物形式离去。离去基R1还可以是α，α-二卤代的醚，在该情况下，当由TS释放的α，α-二卤代醇经历水解时可以提供羧酸基团。因此，离去基R4可以以氟代乙酸酯、氟代柠檬酸酯、丙二酸、甲基丙二酸或3-硝基丙酸的前体的形式离去，所有这些物质均是氧化磷酸化的有效抑制剂。
图7表示用编码新霉素抗性的带有或不带有HER-2原癌基因的质粒转染的细胞系的TS Western印迹。道(1)MCF7/HER2；(2)MCF7/neo；(3)MDA-MB-435/HER2；(4)MDA-MB-435/neo；(5)BT-20/HER2；(6)BT-20/neo。
图8表示前药化合物与酶胸苷酸合成酶的反应产物。
                      发明详述
通过研究与癌细胞的生物和化疗抗性密切相关的一些关键基因组和表型变化完成了本发明。本发明提供了体内选择性抑制细胞生长和/或杀死细胞的手段，所述细胞通过暴露于癌症治疗(包括生物治疗如肿瘤坏死因子(TNF)或化疗)而经过了选择。(参照表2)。结果，已通过突变或基因扩增激活的特定酶对所述试剂的初始或进一步治疗有抗性。与有关产生更强的内源、细胞内酶抑制剂的现有治疗方法不同，本发明利用与治疗抗性疾病细胞和组织相对正常细胞和组织有关的更高的酶活性而且不依赖于抑制所述酶。在一个方面，用本发明前药成功治疗的肿瘤细胞的特征是靶酶活性提高，因此比没有过表达靶酶的正常细胞有更高许多的将所述前药转变成其毒性形式的潜力。本文所用术语“靶酶”有一种或多种上述特征的酶。
除非特别说明，本发明的实践将使用常规分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA技术，这些技术是本领域技术人员熟知的。参见例如Sambroo，Fritsch和Maniatis，分子克隆：实验室手册，第二版(1989)；分子生物学的现有工具(CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY)(F.M.Ausubel等编(1987))；酶学方法(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(Academic Press，Inc.)：PCR2：一种实用方法(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995))和ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney，编(1987))。
本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”和“某个”除非特别清楚地说明，否则包括复数关系。例如，术语“一个细胞”包括许多细胞，包括其混合物。
“有效量”指实现有益的或所需结果的量。可将有效量以一次或多次给药、应用或者剂量施用。
本文所用术语“宿主细胞”、靶细胞”和“过度增殖的细胞”包括其特征在于基因突变或细胞内酶的内源过表达而激活的细胞。在一些实施方案中，所述酶的过表达与起药物抗性功能的肿瘤抑制基因产物的丧失或者与疾病表型相关的遗传不稳定性有关。许多细胞机制都与药物抗性有关，例如所述药物的代谢机制发生改变，细胞对活性化合物的不通透性或者药物从所述细胞中加速消除、细胞毒性损伤的修复增加或者通过另外的生化途径绕开受到抑制的反应。激活的或过表达的以及与药物抗性有关的酶包括，但不限于胸苷酸合成酶(TS)(Lonn，U.等(1996)；Kobayashi，H.等(1995)；Jackman，A.L.等(1995))，二氢叶酸还原酶(Banerjee，D.等(1995)和Bertino，J.R.等(1996))，酪氨酸激酶(TNF-α，Hudziak，R.M.等(1988))和多药物抗性(Stuhlinger，M等(1994))；Akdas，A.等(1996)和(Tannock，I.F.(1996))；以及ATP-依赖的多药物抗性相关蛋白(Simon，S.M.和Schindler，M(1994))，而且在包括结肠和前列腺癌的一些疾病中，拓扑异构酶I(Husain等(1994))。或者，对一种药物的抗性可赋予对其他生化上完全不同的药物的抗性。尽管本申请具体涉及癌症，但相似的方法可适用于由人和动物病原体编码的酶，其中由于抗性的产生而使抑制剂无效。
特定基因的扩增与化疗抗性有关。二氢叶酸还原酶(DHFR)与氨甲喋呤抗性有关，而编码胸苷酸合成酶之基因的扩增与用5-氟嘧啶治疗肿瘤的抗性有关。通过Kashini-Sabet等(1988)，美国专利5085983或本文所述的改进的聚合酶链发应(PCR)可以检测和监测与药物抗性有关的基因的扩增。通过检测细胞遗传异常例如均与基因扩增有关的均匀染色体染色区和双微小染色体可监测获得的药物抗性。其他检测方法包括直接或间接的酶活性检测，两者均与基因扩增有关(例如Carreras &Santi(1995))；其他方法(例如聚合酶链反应，Houze，T.A.等(1997))或免疫化学法(Johnson，P.G.等(1997))。
或者，靶细胞的特征为含有失活的肿瘤抑制功能，例如已知提高TS(Li，W.等(1995))或DHFR(Bertino，等(1996)和Li，W.等(1995))表达的成视网膜细胞瘤(RB)或p53的丧失或失活。
本发明的前药用于治疗或缓解疾病，其中所述疾病-相关的酶与对化疗的药物抗性有关，不论是由于肿瘤抑制剂功能的丧失，体内化疗选择性还是这两种情况的结合。这包括其中所述酶，例如TS酶在相对于正常细胞的疾病细胞中被过表达、过度积累或者激活的情况。特别排除的是已表明在一些人类肿瘤中偶尔升高的谷胱甘肽-S-转移酶。Morgan，A.S.等(1998)。在相对于正常细胞的疾病细胞中，本发明的靶酶通常被过表达、过度积累或激活，在此基础上，可以辨别本发明的前药。本发明区别于其他方法的最重要的原理是：
(1)本发明描述了酶例如胸苷酸合成酶底物的合成。所述过表达的酶将优先在疾病细胞中产生毒素。以前的方法依赖于抑制剂。所述抑制剂导致所述酶的扩增的表达，因而随后对治疗产生抗性(参见例如Lonn，U.等(1996))。
(2)本发明的方法还区别于其他“底物-前药”方法，例如谷胱苷肽-S-转移酶(参见，例如Morgan A.S等(1998))。细胞为了对毒性攻击作出反应而以提高的水平表达GST家族的酶。GST家族的酶具有重叠的底物特异性，这使得很难设计仅与一种在癌细胞中表达水平提高的酶反应的底物(Morgan A.S等(1998))。由于本发明的每种酶(例如胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和胸苷激酶)就其结构和底物特异性而言均是独一无二的，因此容易设计独一无二的底物。在本申请说明书中提供了胸苷酸合成酶的数种底物的例子。
(3)在一些情况下，编码靶酶(例如胸苷酸合成酶)的基因可经突变对抑制剂产生抗性(Barbour，K.W.等(1992)和Dicken，A.P.等(1993))，但仍能够与非抑制剂底物前药进行反应。
(4)本方法进一步的优点是肿瘤抑制功能的丧失对于恶性肿瘤的发展是至关重要的。大部分肿瘤细胞丧失了p53、RB或p16肿瘤抑制剂功能之一。所述丧失导致抗性酶(例如胸苷酸合成酶)表达的增加，不依赖于以前与化疗接触。本文所述的前药将用于治疗早期恶性肿瘤以及以前用化疗治疗的疾病。酶例如GST的底物需要事先将肿瘤暴露于化疗以便产生足够的过表达，从而甚至提供中等治疗指数的可能性。
药物检测
本发明提供了用于鉴定有治疗过度增殖或肿瘤疾病例如癌症的治疗潜力之试剂的方法。所述方法还鉴定抑制过度增殖细胞例如癌细胞之细胞生长或细胞周期的试剂。所包括的其他细胞是导致由于在患者体内的不适当增殖而引起疾病的细菌、酵母或寄生虫细胞。如果相对于对照样品中的细胞，细胞增殖、复制或细胞周期降低，则认为所述试剂是潜在的治疗剂。最佳是所述细胞被所述试剂杀死。所述细胞可以是原核细胞(细菌例如大肠杆菌)或者真核细胞。所述细胞可以是哺乳动物或非哺乳动物细胞例如小鼠细胞、大鼠细胞、人细胞、引起疾病的真菌(例如酵母)或者寄生虫(例如肺囊虫或利什曼原虫)。
本文所用“过度增殖细胞”包括去分化的、无限增殖的、瘤性的、恶性的、转移的或转化的细胞。所述细胞的实例包括但不限于肉瘤细胞、白血病细胞、癌细胞或者腺癌细胞。更具体地讲，所述细胞可以是乳腺癌细胞、肝细胞瘤细胞、可检测的癌细胞、胰腺癌细胞、食管癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、皮肤癌细胞、肝癌细胞或者胃癌细胞。在另一实施方案中，所述靶细胞可以是对药物或化合物有抗性的，所述药物或化合物用于抑制或杀死经感染剂感染的对常规抗生素有抗性的细胞。感染剂包括细菌、酵母和寄生虫例如锥虫。
在表2(上述)或表3(下文)中列出了是本发明主题的靶酶的具体实例。这些酶与化疗抗性有关，在对癌症治疗有抗性的细胞中是经内源激活的、过表达的或过度积累的，且与疾病有关，包括但不限于例如酪氨酸激酶超家族的成员或者ATP-依赖的MDR相关蛋白、CAD、胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和核糖核苷酸还原酶。表3提供了在感染性疾病中可通过本方法靶向的酶的目录。
                               表3在感染性疾病中过表达的并引起药物抗性的酶
酶 提供对以下化合物的提高的抗性
β内酰胺酶 青霉素和其他含β内酰胺的抗生素
氨基糖苷酶或者氨基糖苷修饰酶 氨基糖苷抗生素(例如链霉素、庆大霉素)
氯霉素乙酰转移酶 氯霉素
二氢叶酸还原酶 三甲氧苄二氨嘧啶
参考文献：微生物病的机制(Mechanisms of Microbial)，第2版，M.schaechter，G.Medloff，B.I.Eisenstein，Editor TS Satterfield，Publ.Williams和Wilkins，pp.973(1993)。
用本发明方法鉴定的潜在治疗剂是前药，它是酶的底物并在细胞内转变成细胞内毒素。本文所用“前药”是与药物代谢产物相比，对靶或过度增殖的细胞有较低细胞毒性并能够经酶激活的或转变成更有活性的形式的药物学活性剂或物质的前体或衍生形式(参见Connors，T.A.(1986)和Connors，T.A.(1996))。所述试剂的毒性是针对产生有效量转变酶的细胞，所述转变酶的数量足以在疾病细胞中产生治疗浓度的细胞毒素。
本发明还提供了一种快速简单的筛选方法，所述方法能够初步鉴定具有至少某些所需特征的化合物。为了达到本发明的该目的，在图3中列出了一个实施方案的一般方案。此图描述了如何安排此检测以及其中所需的材料。如图3所示，所述检测需要两种细胞类型，第一种是其中不表达或者以很低的水平表达靶酶的对照细胞。第二种是检测细胞，其中以可检测的水平，例如高水平表达靶酶。例如，内源不表达靶酶TS的原核细胞大肠杆菌是适宜的宿主细胞或靶细胞。所述细胞可含有对照对应物(没有靶酶)，或者，在另一实施方案中含有遗传工程修饰的对应物以便有差别地表达靶酶或者酶(含适宜种类的靶酶的)。可以用一种以上的酶分别转导不同的宿主细胞，以便可以将候选药物对靶酶的作用同时与其对另一种酶或来自另一种的对应酶的作用进行比较。
在另一实施方案中，用第三种靶细胞作为对照，因为它接受了有效量的化合物，例如下列所示的已表明是有效前药的化合物。本实施方案对筛选通过胸苷酸合成酶激活的新药是特别有用的。
在另一实施方案中，对转化的细胞系例如ras-转化的NIH 3T3细胞(ATCC，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA)进行工程加工以便从编码所述酶的克隆的cDNA表达不定量和增加数量的所需靶酶。转染是利用本领域熟知的和Chen，L等(1996)，Hudziak，R.M等(1988)或Carter，P等(1992)以及下文实验节所述的方法完成的瞬时或永久转染。用于插入cDNA的适宜载体可从Stratagene，La Jolla，CA和其他供应商处购买。用预先产生的针对免疫检测的酶的单克隆或多克隆抗体，用细胞裂解产物通过免疫印迹和酶检测可以监测在各转染细胞系中的酶表达水平。参见例如Chen，L等(1996)所述的。通过将表达盒导入细胞的拷贝的数量或改变启动子的用法可以调整表达量。按Carreras，C.W.和Santi，D.V.(1995)的综述或者在下文试验节中描述的方法可以完成用于检测被表达之酶的数量的酶检测。可以选择肿瘤细胞系以表达提高水平的胸苷酸合成酶(例如结肠肿瘤细胞，按Copur等(1995)所述)。
如上所述，可从冷泉港、农业研究服务培养物保藏中心(theAgricultural Research Service Culture Collection)或者美国典型培养物保藏中心得到含所需遗传缺陷的细胞。还可按照Miller(1992)，Sambrook等(1989)和Spector等(1998)所述的标准方法，通过将编码靶酶的基因插入细胞来制备适宜的株。按照Miller(1992)，Sugarman等(1985)和Spector等(1998)所述的标准方法，可完成生长检测。
本领域技术人员应理解，图3中所示的筛选方法可广泛地适用于发现抗生素。例如，在图4中，可以用来自酵母的胸苷酸合成酶取代大肠杆菌的。这可以发现靶向酵母相关的病原体的特定的抗真菌抗生素。另外，可对其他酶进行这种处理。例如，可以选择特异性地靶向感染剂例如卡氏肺囊虫的二氢叶酸还原酶活性的前药。利用图3中所描述的筛选方法选择这些试剂对靶酶的特异性，可以表明这些试剂不激活天然宿主中的酶。对照细胞构建体会含有相应的正常人酶以便表明仅当存在正常人酶时没有毒性。
例如并如图4所示，可将外源基因例如编码TS的人基因插入到宿主细胞中以便表达人TS。这种遗传工程细胞在图3中是验测细胞”。“对照细胞”不表达靶酶。在一些实施方案中，需要用靶酶的蛋白质产物补充培养基。
在其他实施方案中，野生型细胞是缺陷型的或者不表达一种以上的所需酶。如图4所示，所述宿主细胞内源不产生胸苷激酶(TK)或胸苷酸合成酶(TS)。将编码这些酶的人对应物的基因导入宿主细胞以便得到所需水平的表达。通过本文所述的方法，例如利用预先得到的抗免疫检测酶的单克隆或多克隆抗体，通过细胞裂解产物的免疫印迹和酶检测，监测在各转染细胞系中的酶表达水平。参见例如Chen，L等(1996)所述。还可按照Carreras，C.W.和Santi，D.N.(1996)所述，用可检测的标记的取代基例如氚标记的取代基完成酶检测。“两酶”系统可能具有的优点是通过优先在肿瘤细胞中过表达的两种酶进行激活的要求将给正常细胞提供更高的安全性。
使待测细胞生长在小的多孔平板中并用所述细胞检测待测前药的生物活性。为了达到本发明的目的，成功的候选药物将会阻断待测细胞的生长或者杀死所述细胞，但是使对照细胞不受伤害。
可将候选前药直接加到培养基中或预先与细胞表面受体特异性的配体结合，然后加到培养基中。用于细胞特异性传递的结合方法是本领域熟知的，参见例如美国专利5459127；5264618和公开的专利说明书WO 91/71424(1991年11月14日公开)。可将候选前药的离去基团例如用氚可检测地标记。然后检测靶细胞或培养基从候选前药释放的标记数量。或者，利用Lasic，D.D.(1996)所述的方法通过将前药包装到脂质体中或者按Lewis，J.G.等(1996)所述与细胞转染剂混合可提高细胞的摄入。
在另一实施方案中，按上述方法鉴定过表达所需酶，即靶酶的培养的人肿瘤细胞。在有利于治疗剂掺入到细胞内室的条件下，将细胞与潜在的治疗剂接触。然后检测细胞对细胞增殖的抑制作用或杀死细胞的情况。
应理解，尽管并不总是明确地予以了说明，但是通过提供不同的靶细胞作为对照，接受有效量的已表明是有效前药的化合物例如下列所列的化合物可进一步修饰各实施方案。
在图3、4和5中列出了用于鉴定生物活性化合物的高效(highthroughput)筛选方法。该检测的基础是遗传操作和大肠杆菌以及类似单细胞生物(例如酵母)生长容易，参见Miller(1992)和Spector等(1998)。关键的步骤是除去对应于前药设计的靶酶的内源酶活性。这可通过Miller(1992)、Sambrook等(1989)和Spector等(1998)描述的任何方法完成。这些方法包括化学和生物(例如病毒或转座子插入)诱变，然后是适宜的选择方法。TS阴性(TS-)细胞然后变成用于鉴定前药的阴性对照，当通过胸苷酸合成酶作用后，该前药变成细胞毒素。用其他细胞类型例如其他细菌、酵母或其他可选择的单细胞生物可完成类似的方法。在该检测中，对照和重组生物对待测化合物的敏感性均需比较。如本领域技术人员所理解的，从该方法也可得到区别不同种酶的前药。例如可用表达人和酵母酶的其它相同细胞检测仅对表达酵母酶的细胞有优先毒性的抗生素前药。用这种方法可发现新的和特异性的抗生素。
举例性的细胞系是ras-转化的NIH 3T3细胞(从ATCC得到的)并将其进行加工以便从克隆的cDNA表达增加数量的人胸苷酸合成酶(HuTS)。在瞬时或永久基础上完成转染(参见Chen，L等(1996)，Hudziak，R.M.等(1988)和Carter，P.等(1992))。NIH-000(ras-转化的亲本细胞系)；NIH-001(HuTS的低水平表达者)；NIH-002(HuTS的中等水平表达者)；NIH-003(HuTS的高水平表达者)。用细胞裂解产物的免疫印迹和酶检测，使用抗用于免疫检测的HuTS蛋白的抗体监测各细胞系中的TS表达水平(例如按照Chen，L.等(1996)所述)。按照Carreras和Santi(1995)的综述完成酶检测。
筛选人结肠直肠和乳腺肿瘤细胞系的HuTS酶表达。按上述对NIH3T3细胞系的描述，将表达低、中和高水平HuTS的细胞系与药物候选物接触。按上述监测生长抑制作用和细胞毒性。对表1中所列的酶进行类似的检测。
在肿瘤细胞中利用TS过表达的前药的另一实施方案是脱氧尿苷氨基磷酸或与治疗放射性核素结合的其他修饰物(本文引用的)。治疗放射性核素的一个实例是铼188。可基本按照Callahan等(1989)所述合成该同位素。或者，例如从Mallicrodt Medical BV，荷兰购买该同位素。可将治疗放射性核素通过标准方法(例如Lin，W-Y等(1997)所述)与脱氧尿苷或者脱氧尿苷5’-氨基磷酸或者其他衍生物结合。含放射性核素的脱氧尿苷氨基磷酸将被优先摄入到过表达胸苷酸合成酶的肿瘤细胞的DNA中，并因β和γ射线的集中发射而引起死亡。其他的放射性核素包括铼186和其他的放射性核素(Troutner，D.A.(1987))。
体内给药
用带有人肿瘤或用抗生素抗性微生物感染的动物模型确定体内效力以确认体外检测。
本发明的另一方面是用于治疗以个体内过度增殖的细胞为特征的疾病的方法，该方法包括给所述个体施用治疗量的前药，所述前药经本文所述的内源细胞内酶可在过度增殖的细胞内转变成毒素。在一优选的实施方案中，从下文“前药”节中定义的化合物中选择所述化合物。
当将所述前药施用给个体例如小鼠、大鼠或人患者时，可将所述试剂加到可药用载体中，通过全身或局部施用给所述个体。
为了确定可被有益治疗的患者，从所述患者体内取肿瘤样品，然后检测细胞表达所需酶的水平。如果表达水平高于在正常细胞中的水平以致毒性量的前药的给药不会引起不需要的副作用，然后确定肿瘤或细胞得到了有益的治疗，因此，患者适用本发明的治疗。例如，如果以比正常细胞高至少约2倍，优选约3倍的水平表达所述靶酶，则患者适合本发明的所述治疗方法。治疗量是以经验确定的并且随待治疗的疾病、待治疗的个体以及所转变的前药或细胞毒素的毒性而定。
当传递给动物时，该方法用于进一步确定所述前药的效力。作为一个动物模型的实例，给裸小鼠(Balb/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy，CA)组分别皮下接种约105至约109本文所述的过度增殖的癌或靶细胞。建立了肿瘤时，例如通过在肿瘤周围皮下注射施用前药。一周两次用游标卡尺测量两次肿瘤以确定肿瘤大小的减小。酌情还可使用其他动物模型。Lovejoy等(1997)和Clarke，R.(1996)。
在治疗过程中可以一次、连续或者间歇地进行体内给药。确定最有效方式的方法以及给药剂量是本领域技术人员熟知的，而且随用于治疗的组合物、治疗的目的、待治疗的靶细胞以及待治疗的个体而定。可按照医生所选的剂量水平和方式进行一次或多次给药。下文给出适宜的剂型和施用药物的方法。
本发明的试剂和组合物可用于制造药物和按照常规方法例如用在药物组合物中的活性成份给药用于治疗人和其他动物。
所述药物组合物可经口、鼻内、不经肠道给药或者通过吸入治疗，并可采用片剂、锭剂、颗粒剂、胶囊、粒剂、安瓿、栓剂或气溶胶的形式。它们还可采用活性成份在水或非水稀释剂、糖浆、颗粒或粉末中的悬浮剂、溶液剂和乳剂形式。除本发明的化合物外，所述药物组合物还可含有其他药物学活性化合物或者多种本发明的化合物。
更具体地讲，本发明分子式的化合物，也指活性成份，可通过任何适宜的途径包括口、直肠、鼻、局部(包括经皮的、气溶胶、颊和舌下)、阴道、非肠道(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)和肺给药用于治疗。还应理解，优选的途径将随受体的状况和年龄以及待治疗的疾病而改变。
总之，适用于上述化合物的适宜剂量为约1-约100mg/kg受体体重/天，优选约1-约50mg/kg受体体重/天，最佳为约1-约25mg/kg受体体重/天。除非特别说明，所有活性成分的重量均按照本发明结构式的母体化合物计算，对于其盐或酯，重量应成比例地增加。所需剂量优选以两个、三个、四个、五个、六个或多个亚剂量在一天内以适宜的间隔给药。这些亚剂量可以以单位剂量形式给药，每单位剂量形式可以含有例如，约1至约100mg，优选约1至约25mg，首选约5至约25mg活性成分。可以理解，本发明化合物和组合物的适宜剂量取决于疾病的类型、严重程度和阶段，并且在不同患者之间可以不同。最佳剂量的确定通常涉及本发明治疗方法的治疗益处和危险性或不利副作用水平之间的平衡。
理想的，给药的前药应能在疾病的部位达到活性化合物的峰浓度。这可以通过，例如静脉内注射前药(任选地溶于生理盐水中)或口服给药含有活性成分的片剂、胶囊或糖浆等来达到。前药的理想的血液水平可以通过连续输注来维持，以在疾病组织内提供治疗量的活性成分。可以采用有效的组合以提供使各抗病毒剂的总的剂量低于各治疗化合物或药物单独使用时所需的剂量的治疗组合，从而减少副作用。
尽管可以将前药成分单独给药，但优选将其以含有至少一种上文定义的活性成分和一种或多种可药用载体以及任选的其它治疗剂的药物制剂的形式提供。就与制剂中其它成分的相容性而言，每一载体必需是“可接受的”并且对患者无害。
制剂包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括经皮、颊和舌下)、阴道、非肠道(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)和肺给药的制剂。制剂可以方便地单位剂量形式存在并且可以通过制药领域熟知的各种方法制备。所述方法包括将活性成分与载体混合的步骤，所述载体由一种或多种辅助成分组成。通常，制剂可以通过将活性成分与液体载体或细分散的固体载体或同时两种载体均匀紧密地混合进行制备，然后根据需要将产品成型。
适于口服给药的本发明制剂可以是含有预定量活性成分的不连续的单元如胶囊、扁囊剂或片剂；散剂或颗粒剂；在含水或非水液体中的溶液或混悬液；水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分还可以是大丸剂、干药糖剂或糊剂。
片剂可以任选地用一种或多种辅助成分通过压片或模压进行制备。压制的片剂可以通过将自由流动形式的活性成分如粉末或颗粒在适宜的机器中压片进行制备，可将活性成分选择性地与粘合剂(例如聚维酮、明胶、羟丙甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉甘醇酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合。模压片剂可以通过将用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物在适宜的机器中模压进行制备。可将片剂选择性地包衣或刻痕，并可用各种比例的例如羟丙甲基纤维素进行配制以缓释或控释其中的活性成分，从而提供所需的释放曲线。还可对片剂选择性地进行肠溶包衣，以在除胃之外的肠道部分进行释放。
适于在口腔中局部给药的制剂包括，在矫味基质、通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中含有活性成分的糖锭；在惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中含有活性成分的软锭剂；在适宜的液体载体中含有活性成分的漱口水。
用于局部给药的本发明的药物组合物可以配制成软膏、霜剂、混悬液、洗剂、散剂、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油。此外，制剂还包括贴剂或敷料，例如浸渗了活性成分和任选的一种或多种赋形剂或稀释剂的绷带或粘性硬膏剂。
对于眼或其它外部组织如口腔或皮肤的疾病，优选将制剂以含有约0.075至约20％w/w，优选约0.2至约25％w/w，首选约0.5至约10％w/w活性成分的局部用软膏或霜剂的形式涂抹。当配制成软膏时，可将前药与石蜡或与水混溶的软膏基质一起使用。或者，可将前药成分用水包油霜剂基质配制成霜剂。
如需要，霜剂基质的水相可以包括，例如至少约30％w/w的多元醇，即含有两个或多个羟基的醇如丙二醇、1，3-丁二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇以及它们的混合物。局部制剂优选含有可以促进前药成分吸收或穿透皮肤或其它感染部位的化合物。所述透皮促进剂的例子包括二甲亚砜和相关的类似物。
本发明乳液的油相可以用已知成分按照已知方式构成。尽管该相可以仅含有乳化剂，但优选含有至少一种乳化剂与脂肪或油或脂肪和油二者的混合物。优选在含有亲水性乳化剂的同时还含有亲脂性乳化剂，后者起稳定剂的作用。还优选同时含有油和脂肪。乳化剂(一种或多种)加或不加稳定剂(一种或多种)构成了所谓的乳化蜡，蜡与油和/或脂肪一起构成了所谓的乳化软膏基质，该基质形成了霜剂的油分散相。
适用于本发明制剂的乳化剂(Emulgent)和乳液稳定剂包括吐温60、斯盘80、鲸蜡基硬脂醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸钠。
对用于制剂的适宜的油或脂肪的选择是以获得所需的化妆品特性为基础，因为活性化合物在大部分常用于药物乳剂的油中的溶解度非常低。因此，霜剂优选是不油腻、不染色并且可以洗掉的产品，其具有适宜的稠度以避免从管或其它容器中漏出。可以使用直链或支链的一元或二元烷基酯如二-异己二酸酯、异鲸蜡基硬脂酸酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、2-乙基己基棕榈酸酯或称为Crodamol CAP的支链酯的混合物，后三种是优选的酯。根据所需的性质，可将其单独使用或组合使用。或者，可以使用高熔点的类脂如白凡士林和/或液体石蜡或其它矿物油。
适于对眼局部给药的制剂还包括滴眼剂，其中的活性成分溶解或悬浮于适宜的载体中，特别是用于前药成分的含水溶剂。前药成分在所述制剂中的浓度优选为约0.5至约20％，更优选约0.5至约10％，特别优选约1.5％w/w。
用于直肠给药的制剂可以是栓剂的形式，适宜的基质包括，例如可可脂或水杨酸酯。
适于阴道给药的制剂可以是栓剂、棉塞、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂的形式，除前药成分外，制剂中还含有本领域已知的适宜载体。
其中的载体是固体的适于鼻给药的制剂包括粒度在约20至约500微米范围内的粗粉，其通过使用鼻吸药的方式给药，即，从靠近鼻子的粉末容器中通过鼻通道迅速吸入。其中的载体是液体的用于例如鼻喷雾、滴鼻或通过喷雾器以气雾剂给药的适宜制剂包括前药成分的含水或油溶液。
适于胃肠外给药的制剂包括，含水和非水的等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与使用者的血液等渗的溶质；含水和非水无菌混悬液，其可含有助悬剂和增稠剂；以及用于将化合物靶向于血液成分或一个或多个器官的脂质体或其它微颗粒系统。制剂可以存在于单剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶中，也可以在冷冻干燥条件下保存，在临用前仅需加入无菌液体载体如注射用水。可以从前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时的注射溶液和混悬液。
优选的单位剂量制剂是含有每日剂量或单位、以上所述的每日亚剂量或其适当部分的前药成分的制剂。
应当理解，除以上具体提到的成分外，本发明的制剂还可含有本领域常用于所述制剂类型的其它试剂，例如，适于口服给药的制剂可含有甜味剂、增稠剂和矫味剂等其它试剂。
本发明的式的前药和组合物还可以是兽用药物制剂的形式，该制剂可以通过本领域的常规方法制备。
以下将简要描述用于活化本发明前药的细胞和目标酶。
酪氨酸激酶
酪氨酸激酶超家族包括EGF受体(EGFR)、巨噬细胞集落刺激因子(CSF-1)受体(v-fms)和胰岛素受体，所述超家族与ros癌基因产物有30-40％的同一性。更具体地讲，该超家族的成员包括v-src，C-src，EGFR、HER2、CSF-1受体、c-fms、v-ros、胰岛素受体和c-mos。参见Burck，K.B.等(1988)的图8.5。在许多类型的癌症中均报道过酪氨酸激酶超家族1型受体的过表达成员(Eccles，S.A.等(1994-5))。酪氨酸激酶的过表达与暴露于α-癌生物学因子TNF-α(Hudziak，R.M.等(1988)和Hudziak，R.M.等(1990))和化疗有关(Stuhlinger等(1994))。
Rous肉瘤病毒的转化基因，v-src，编码使蛋白质上酪氨酸磷酸化的酶。在染色体20上发现了c-src原癌基因。来自具有神经表型的神经外胚层的组织和细胞系表达高水平的c-src并有高度特异性的激酶活性。
数组研究人员已报道了c-erbB-2/neu(HER2)癌基因在癌细胞中的过表达。Brison(1993)注意到在大多数情况下，erbB原癌基因在人肿瘤中被扩增同时伴有过表达。已报道了c-erbB-2/neu癌基因在人乳腺肿瘤(Slamon，等(1987)，van de Vijver等(1987)，Pupa等(1993)和Andersen等(1995))和膀胱肿瘤(Sauter等(1993))中扩增，而且在每种情况下，扩增均伴有过表达。还报道过c-erbB-2/neu在卵巢组织样品(Slamon，等(1989)，Meden等(1994)和Felip等(1995))以及在外周神经系统肿瘤中的过表达。Sukumar和Barbacid(1990)。
为了完成药物筛选检测，检测肿瘤细胞系中癌基因的表达或者将肿瘤细胞系进行工程处理以表达不同水平的酪氨酸激酶。培养所选的细胞系并加入不同浓度的候选药物。按Hudziak，R.M.等(1988)和Hudziak，R.M.等(1990)所述检测细胞的细胞杀死情况或细胞增殖的抑制作用。
二氢叶酸还原酶
氨甲喋呤是一种强二氢叶酸还原酶抑制剂，二氢叶酸还原酶是一种细胞内叶酸代谢所必需的酶。二氢叶酸还原酶从二氢叶酸再生四氢叶酸，一种胸苷酸合成酶反应的产物(Voet，等(1995)，p813)。已确立细胞的氨甲喋呤抗性的重要机制是由于DHFR基因的扩增而提高了DHFR活性。Banerjee，D.等(1995)，Schimke，R.T.等(1988)。Lonn，U.等(1996)报道DHFR基因的扩增发生在手术后曾接受辅助化疗(环磷酰胺，氨甲喋呤，5-氟尿嘧啶(CMF))的乳腺癌患者中。没有成视网膜细胞瘤(Rb)可能也会导致MTX抗性提高，这是没有基因扩增的DHFR mRNA表达活性提高的结果。Li，W.W.等(1995)。已表明带有突变的p53的细胞系有基因扩增，并通过化疗选择细胞抗性。Banerjee，D.等(1995)，Yin，Y.等(1992)和Livingston，L.R.等(1988)。为了完成本发明的检测，Schimke，R.T.等(1992)描述了数种小鼠、仓鼠和人细胞系。另外，用LonnU等(1996)的PCR方法检测DHFR基因扩增并鉴定可用于完成本文所述的鉴定治疗剂之方法的细胞。Masters，J.N.和Attardi，G.(1983)提供了编码人二氢叶酸还原酶的cDNA的核苷酸序列，可将细胞进行工程处理以使其表达不同水平的本文所述的酶。Dicken，a.P.等(1993)描述了通过化疗选择的突变型DHFR基因。Nakano，T等(1994)中描述了DHFR的纯化以及与酶功能有关的检测。另外，将编码DHFR的cDNA转染到NIH 3T3细胞中。加入不同浓度的候选药物，然后检测杀死细胞的情况和增殖的抑制作用。
通过例如将烷基化基团连接到二氢叶酸的N5或者C6位可以合成依赖二氢叶酸还原酶活性的抗代谢剂。DHFR还原N5-C6键将会释放烷基化剂。除烷基化基团外，通过DHFR的释放会产生毒素或抗代谢剂的任何部分均可用于实现本发明。通过加入磷酸酯(phosphatese)或者氨基磷酸酯部分可进一步修饰这些化合物。
多药物抗性肿瘤
多药物抗性(MDR)是一个用来描述肿瘤细胞用于逃避抗癌药物的细胞毒作用的各种策略的总术语。MDR的特征在于肿瘤肿瘤细胞对用于化疗的药物的敏感性降低，而且对既没有明显的结构同源性也没有共同靶的光谱药物的敏感性也降低。这种多效抗性是成功治疗肿瘤的主要障碍之一。MDR可能是由于在质膜或胞质内、细胞区室或核的结构或功能发生变化而引起的。从解毒作用和DNA修复途径的修饰、药物螯合作用的细胞位点的改变、药物-靶亲和性的降低、细胞内特异性药物抑制剂的合成、蛋白质的寻靶发生改变或者不适当以及药物的加速去除或分泌来讨论MDR的分子机制。
与MDR有关的一种机制是由药物筛选细胞系中称为ATP-依赖的多药物抗性相关蛋白质(MRP)之基因的扩增和过表达引起的。有关MDR机制的综述参见Gottesman，M.M.等(1995)和Noder等(1996)。
为了建立MDR细胞系，如Gottesman，M.M.等(1995)和Simon，S.M.和Schindler，M.(1994)以及本文引用的参考文献所述，用一步或多步完成药物筛选。编码各种哺乳动物MDR的DNA序列的分离方法在Gros，P.等(1986)，Gudkov，A.V.等(1987)和roninson，I.B.等(1984)中有描述，并在Gottesman，M.M.等(1995)中有综述，可按上文所述对细胞进行工程处理以使其表达不同水平的该酶。前药靶向的MDR是基于这种转运蛋白的ATPase活性。
核糖核苷酸还原酶
核糖核苷酸还原酶将核糖核苷二磷酸还原为相应的脱氧核糖核苷二磷酸。这种酶是由两个α亚单位和两个β亚单位组成的四聚体。羟脲通过与β2-底物复合物的酪氨酰自由基(Tyr-122)相互作用而特异性地阻断该反应。Voet等(1995)。靶向该反应的目的是积累自由基产物O2 -，其是高细胞毒性。
将该技术应用于其他疾病
尽管本发明的主要焦点是针对癌症，但是应认识到该技术可广泛地用于其他疾病，特别是抗生素抗性的细菌感染。由于β内酰胺酶的过表达而使β内酰胺抗生素在细菌中遇到抗性。Hamilton-Miller，J.M.T.和Smith，J.T.编(1979)，443页。诱导其他酶例如III型氨基糖苷磷酸转移酶并在用氨基糖苷抗生素例如卡那霉素治疗后对所述酶进行筛选。McKay，G.A.等(1994)。为了达到本申请的目的，将制备不阻断酶活性，但将利用高酶活性对感染性因素产生细胞内毒素的来自已知底物的前药底物。
胸苷酸合成酶
胸苷酸合成酶的过表达与结肠癌、乳腺癌、胃癌、头颈癌、肝癌和胰腺癌有关。目前用抗代谢剂药物(尿嘧啶基的、叶酸基的或喹唑啉基(参见表1))治疗这些疾病。在每种情况下，肿瘤抑制丧失和/或5-氟尿嘧啶治疗可能会导致TS活性增加，或者选择该酶的药物抗性形式，由此导致疾病复发的药物抗性。Lonn，R等(1996)报道TS基因的扩增发生在手术后曾接受辅助化疗(环磷酰胺、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶[CMF])的乳腺癌患者中。这种TS表达的提高是除因肿瘤抑制剂功能丧失而引起的TS基本增加以外的。正常情况下由TS完成的主要反应是从脱氧尿苷一磷酸(dUMP)和N(5)，N(10)-亚甲基-四氢叶酸(THF)合成脱氧胸苷一磷酸(dTMP)。在一个实施方案中，将尿嘧啶或THF提供给表达TS的细胞。就本发明目的而言，“尿嘧啶”(仅碱基)和“尿苷”(碱基和糖)交换使用并且是同义词。表4(下文)总结了受TS表达增加之影响的许多癌症。
                           表4胸苷酸合成酶过表达影响癌患者的中位数存活时间(月)
  癌症   TS(低)     TS(高)     参考文献
  乳腺   84     54     Pestalozzi等，1997
  NSCLC   46     10     Volm and Mattern，1992
  结肠   13.6     8.2     Leichman等1997
  直肠   ＞60     24     Johnston等1994
  头颈   ＞72     24     Johnston等1997
  胃   43     6     Lenz等1995
  平均＞53.1     平均21
平均数的倍数差异＞2.5
衍生物或“前药”通过所述酶转变成高度细胞毒性的代谢产物。在正常细胞中表达的低水平TS将不产生毒性量的转变的毒素。在疾病组织中表达的高水平TS产生更多的毒素，由此导致细胞增殖的抑制作用和/或细胞死亡。例如，目前的治疗使用5-氟脱氧尿苷酸抑制TS活性。在与底物反应的过程中，氟原子不可逆的与TS酶相连并抑制该酶。在一个实施方案中，建议的新治疗方法使TS完成反应，但产生一种修饰的产物，当掺入DNA时引起毒性作用。酶产物还可以阻断其他重要的细胞功能(例如蛋白质合成或者能量代谢)。前药的转变还可释放代谢产物，例如对细胞有毒的CN-。可以合成尿嘧啶/dUMP和N(5)(10)-THF的衍生物，所有这些化合物都有可能在通过TS代谢转化后产生毒性产物。
一级序列表明TS是一种高度保守的酶。Perry，K.等(1990)。已经确定了来自数种原核种，干酪乳杆菌(Hardy，L.W.等(1987)；Finer-Moore，J.等(1993))和大肠杆菌(Perry，K.等(1990))和真核生物大型利什曼原虫(Knighton，E.R.等(1994))以及T4噬菌体(Finer-Moore，J.等(1994))的TS的晶体结构，并表明四级结构也是非常保守的。Schiffer，C.A等(1995)确定并描述了三维结构的TS的种的序列排列。从这些氨基酸序列，可以用本领域技术人员熟知的方法推导或分离DNA序列。Sambrook等(1989)。另外，来自不同生物的一些29 TS序列已被克隆并保存到Carreras，C.W.和Santi，D.V.(1995)所述的DNA数据库中。Takeish，K等(1985)，Davisson，V.J.等(1989)和Davisson，V.J.等(1994)提供了人胸苷酸合成酶基因序列、其克隆、表达和纯化。用本领域技术人员熟知的方法构建编码TS蛋白质并含必需的调节序列的基因。通过电穿孔、转化或者转染方法将编码TS的基因导入靶细胞。Sambrook等(1989)。另外，用本领域技术人员熟知的方法，例如按Carreras，C.W.和Santi，D.V.(1995)，Miller(1992)和Spector等(1998)所述的方法将所述基因插入到适宜的表达载体中。表达载体将TS基因插入到细胞中。然后使细胞在有利于TS蛋白质表达和生产的条件下生长。
在上述检测中可以使用人胃癌细胞系，MKN-74、MKN-45、MKN-28和KATO-III以鉴定是TS的选择性底物的潜在治疗剂。分别从良好和不良分化的腺瘤建立MKN-74和MKN-45。在Osaki，M等(1997)和本文引用的参考文献中描述了这些细胞系和培养条件。另外，可以使用已用5-FU选择过的过表达胸苷酸合成酶的肿瘤细胞系，例如由Copur，S.等(1995)描述的那些。
用本领域技术人员熟知的酶生物化学检测方法可以对TS进行定量分析。为了对来自人肿瘤组织样品的TS蛋白质水平和TS基因表达进行定量分析，由Johnston，P.G.等(1991)和Horikoshi，T等(1992)报告的方法提供了敏感性检测。另外，用Lonn，U等(1996)的PCR方法检测TS基因扩增并鉴定用于本文所述的鉴定治疗剂之方法的细胞。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，还需检测不含药物以及分别含参照药物如下文举证的化合物的对照细胞培养系统。前导化合物是以比对正常细胞高约2倍优选高约3倍的活性优先杀死靶细胞的化合物。本发明还提供了通过本文所述方法鉴定的试剂。
在另一方面，本发明通过首先完成上述检测提供了抑制过度增殖之细胞增殖的方法。将用所述检测方法鉴定的前药与细胞接触然后通过上述内源细胞内酶在细胞内转变成有毒的代谢产物。按Miller等(1992)，Sugarman等(1985)和Spector等(1998)所述监测细菌、酵母和其他种类细胞的生长或细胞毒性。
TS前药
在一优选的实施方案中，本发明涉及两类由TS激活的化合物，各自是5-取代的脱氧尿苷一磷酸或者保护的5-取代的尿嘧啶或者脱氧尿苷一磷酸的衍生物。保护的5-取代脱氧尿苷一磷酸衍生物是其中已通过连接适宜的化学保护基团封闭了磷酸部分的那些化合物。5-取代脱氧尿苷一磷酸衍生物的保护可以提高溶解度，有利于细胞穿透、有利于跨过血-脑屏障并防止可能另外导致磷酸基团丢失的细胞或细胞外磷酸酶的作用。在另一实施方案中，将5-取代的尿嘧啶或者尿苷衍生物施用给含核苷激酶活性的细胞，其中5-取代的尿嘧啶/尿苷衍生物被转变成5-取代的尿苷一磷酸衍生物。还可以修饰尿苷衍生物以提高其溶解度、细胞穿透作用和/或跨过血-脑屏障的能力。
胸苷酸合成酶作用于5-取代尿苷一磷酸衍生物可释放与嘧啶环5位相连的取代基(离去基团)。然后释放的取代基本身能够或者与另一细胞组分相互作用后能够作为毒素或者细胞增殖抑制剂发挥作用。
I类化合物的一般合成方法
I类化合物的L和D异构体具有如下结构
Figure C9980322100331
或 或
Figure C9980322100333
在以上结构式中，R1(位于5位)是离去基或含有离去基，所述离去基是具有与通过胸苷酸合成酶从嘧啶环上释放相适应的分子大小和亲电性的化学实体，所述离去基在由胸苷酸合成酶从嘧啶环上释放后，可以抑制细胞的增殖或杀死细胞。
在以上结构式中，Q是含有选自糖基团、硫代糖基团、碳环基团及其衍生物的化学实体的磷酸或氨基磷酸衍生物。糖基团的例子包括但不仅限于单糖环状糖基团，例如从氧杂环丁烷类化合物(4元环的糖)、呋喃糖(5元环的糖)和吡喃糖(6元环的糖)衍生的单糖环糖基团。呋喃糖的例子包括苏呋喃糖基(来自苏糖，一种四碳糖)；赤呋喃糖基(来自赤藓糖，一种四碳糖)；核呋喃糖基(来自核糖，一种五碳糖)；阿拉伯呋喃糖基(来自阿拉伯糖，一种五碳糖)；木呋喃糖基(来自木糖，一种五碳糖)和来苏呋喃糖基(来自来苏糖，一种五碳糖)。糖基团衍生物的例子包括“脱氧”、“酮基”和“脱氢”衍生物以及取代的衍生物。硫代糖基团的例子包括其中的环氧被硫原子所代替的上述糖基团的硫类似物。碳环基团的例子包括C4碳环基团、C5碳环基团和C6碳环基团，这些基团还可含有一个或多个取代基，例如-OH基团。
在一个实施方案中，Q是下式的β-D-呋喃核糖基团：
Figure C9980322100341
其中R7选自磷酰基、氨基磷酸根及其衍生物，其中的R2和R3相同或不同并且彼此独立地是-H或-OH。
在某些实施方案中，R1是链烯基，即(-CH＝CH)n-R4，其中n是0-10的整数，R4是卤素如I-或Br-、CN-或汞；其中R2是H并且R3是-OH；其中R2是OH并且R3是H；其中R2和R3是H；或者其中R2和R3是OH。
另一方面，R1是链烯基，即(-CH＝CH)n-R4，其中n是0-10的整数，R4是或含有选自H、卤素、烷基、链烯基、炔基、羟基、-O-烷基、-O-芳基、-O-杂芳基、-S-烷基、-S-芳基、氰化物、氰酸酯和硫氰酸酯卤代乙烯基(a cyanide，cyanate and thiocyanate halovinyl group)、卤代汞基、-S-杂芳基、-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NHCHO、-NHOH、-NHO-烷基、NH2CONHO-和NHNH2基团。在这些实施方案中，另一方面包括：其中R2和R3是H；其中R2是OH并且R3是H；其中R2是H并且R3是OH；或者其中R2和R3是OH。
R1位上取代基的一个优选实施方案中可以经历图8所示的烯丙型互换的基团。
又一方面，候选的治疗剂是下式的化合物：
Figure C9980322100351
其中n是0-10的整数；其中A是磷酰胺衍生物，或下式化合物：
Figure C9980322100352
其中Q选自H、以上所定义的未取代或取代的糖以及以上所定义的取代或未取代的碳环。
在其它实施方案中，上述化合物被具有如下结构式的Q修饰：
Figure C9980322100361
其中R7选自H、磷酰基、氨基磷酸酯及其衍生物，其中R2和R3相同或不同并且彼此独立地是-H或-OH。在一个实施方案中，R7不是H。对于这些实施方案，R1还可以具有-(CH＝CH)n-R4的结构，其中n是0-10的整数，R4选自H、卤素、烷基、链烯基、炔基、羟基、-O-烷基、-O-芳基、-O-杂芳基、-S-烷基、-S-芳基、-S-杂芳基、-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NHCHO、氰化物、氰酸酯和硫氰酸酯卤代乙烯基化合物(a cyanide，cyanate and thiocyanate halovinyl compound)、卤代汞化合物、-NHOH、-NHO-烷基、NHNH2和NH2CONHO-。
此外，在另一方面，候选的治疗剂是下式化合物：
Figure C9980322100362
其中R＝2′-脱氧-5-尿苷酰基(uridyl)，m是0或1，n是0-10的整数。
适当的时候，化合物可以是其对映体、非对映体或立体异构体的形式，包括，例如D-或L-形式，并且可以是任何立体化学构型，包括，例如α-或β-异头物的形式。
上述5-取代的嘧啶核苷和5-取代的嘧啶核苷单磷酸的合成可以通过本领域熟知的方法来完成。例如，将5-氯汞基-2′-脱氧尿苷用卤代烷基化合物、卤代乙酸酯或卤代烯烃在Li2PdCl4的存在下处理，经过有机金属钯中间体分别生成5-烷基、5-乙酰基或5-烯烃衍生物。Wataya等(1979)和Bergstrom等(1981)。嘧啶核苷和核苷酸C5-修饰的另一个例子是将未保护的核苷酸用乙酸汞处理然后在Li2PdCl4的存在下加入苯乙烯或环取代的苯乙烯形成C5-反-苯乙烯基衍生物。Bigge等(1980)。嘧啶脱氧核苷三磷酸通过用乙酸汞在乙酸盐缓冲液中于50℃处理3小时在嘧啶环的5位用汞衍生化。Dale等(1973)。预期所述处理还可以有效地修饰单磷酸酯；或者，可将修饰的三磷酸酯通过酶转变成修饰的单磷酸酯，例如用碱性磷酸酶进行有控制的处理然后纯化单磷酸酯。可以用与汞具有类似的分子特性但药理学特性较为优选的其它部分(包括有机的或无机的)进行替换。合成取代嘧啶的一般方法可以参见，例如美国专利427544、4267171和4948882和Bergstrom等(1981)。以上方法还可用于合成含有除核糖或2′-脱氧核糖之外的其它糖如2′，3′-二脱氧核糖、阿拉伯糖、呋喃糖、来苏糖、戊糖、己糖、庚糖和吡喃糖的5-取代的嘧啶核苷和核苷酸的衍生物。5-位取代基的例子是卤代乙烯基，例如E-5-(2-溴乙烯基)-2′-脱氧尿苷酸。Barr，P.J.等(1983)。该化合物按照如下实验部分的描述合成。
或者，5-溴脱氧尿苷、5-碘脱氧尿苷及它们的单磷酸酯衍生物可以从Glen Research，Sterling，VA(USA)、Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO(USA)、Moravek Biochemicals，Inc.，Brea，CA(USA)、ICN，Costa Mesa，CA(USA)和New England Muclear，Boston，MA(USA)购买到。市售的5-溴脱氧尿苷和5-碘脱氧尿苷可以通过化学方法或酶方法，通过激酶的作用用可从Glen Research，Sterling，VA(USA)和ICN，Costa Mesa，CA(USA)购买到的试剂转变成它们的单磷酸酯。这些卤代衍生物可与其它取代基组合形成新的、更有效的抗代谢剂。
II类化合物的一般合成方法
另一方面，与过表达胸苷酸合成酶的细胞接触的前药是下式化合物的L或D异构体：
Figure C9980322100371
或 或
在以上结构式中，R1是下式的部分：
Figure C9980322100381
在以上结构式中，R2是或含有二价的电子导管部分。在一个实施方案中，R2是或含有单或多不饱和的电子导管，其作用是将电子导离嘧啶环并导向离去基R1。在一个实施方案中，R2选自不饱和的烃基；含有一个或多个不饱和烃基的芳香族烃基以及含有一个或多个不饱和烃基的杂芳基团。
在一个实施方案中，R2是不饱和烃基，其具有选自如下的结构：
Figure C9980322100382
和
在一个实施方案中，R2和R3合在一起形成选自如下的结构：
和
在一个实施方案中，R2是芳香族烃基，其具有选自如下的结构：
和
在一个实施方案中，R2是杂芳族烃基，其具有选自如下的结构：
Figure C9980322100388
和
Figure C9980322100389
其中J是杂原子如-O-、-S-或-Se-或杂原子基团如-NH-或-NRALK-，其中RALK是含有1-10个碳原子的直链或支链烷基或含有3-10个碳原子的环烷基。
在以上结构式中，R3是二价间隔基部分，也称为间隔基单元。在一个实施方案中，R3是具有选自如下结构的二价间隔基部分：
和
Figure C9980322100393
其中R5相同或不同并且彼此独立地是含有1-10个碳原子的直链或支链烷基或含有3-10个碳原子的环烷基。
在一个实施方案中，R3是具有选自如下结构的二价间隔基部分：
和
Figure C9980322100395
在以上结构式中，n是0-10的整数，m是0或1。在一个实施方案中，n是0-10的整数，m是1。在一个实施方案中，n是0并且m是0。在一个实施方案中，当R7是-H时，则n不是0。在一个实施方案中，当R7是-H时，则m不是0。在一个实施方案中，当R7是-H时，则n不是0并且m不是0。在一个实施方案中，当R7是-H时，则R4不是卤素(即，-F、-Cl、-Br、-I)。在一个实施方案中，当R7是-H并且m是0时，则R4不是卤素(即，-F、-Cl、-Br、-I)。在一个实施方案中，当R7是-H，m是0并且n是0时，则R4不是卤素(即，-F、-Cl、-Br、-I)。
在以上结构式中，R4是发毒团。本文所用术语“发毒团”是指是或含有是具有与通过胸苷酸合成酶从嘧啶环上释放相适应的分子大小和亲电性的化学实体的离去基，其在由胸苷酸合成酶从嘧啶环上释放后，可以抑制细胞的增殖或杀死细胞。
在一个实施方案中，发毒团是或含有可被细胞内过表达的细胞内的酶激活或释放的离去基。在一个实施方案中，R4是或含有具有如下结构的基团：
Figure C9980322100401
Figure C9980322100411
和
Figure C9980322100412
其中X是-Cl、-Br、-I或其它有效的离去基(包括但不仅限于-CN、-OCN和-SCN)；Y相同或不同并且彼此独立地是-H或-F；Z相同或不同并且彼此独立地是-O-或-S-。
在一个实施方案中，R4是或含有具有如下结构的基团：
和
在一个实施方案中，R4是或含有具有如下结构的基团：
和
在一个实施方案中，R4是或含有具有如下结构的基团：
在一个实施方案中，R4是或含有具有如下结构的基团：
在一个实施方案中，R4是或含有具有如下结构的基团：
Figure C9980322100421
和
Figure C9980322100423
在一个实施方案中，R4是或含有具有如下结构的基团：
在一个实施方案中，R4是或含有具有如下结构的基团：
Figure C9980322100425
在一个实施方案中，R4是或含有具有如下结构的基团：
在一个实施方案中，R4是或含有选自如下一组的化学实体：-Br、-I、-O-烷基、-O-芳基、-O-杂芳基、-S-烷基、-S-芳基、-S-杂芳基、-CN、-OCN、-SCN、-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NHCHO、-NHOH、-NHO-烷基、NH2CONHO-、NHNH2、-N3和顺铂衍生物，例如
在以上结构式中，Q是或含有支持前药与酶例如TS或TK功能结合的糖部分或类似的部分。在一个实施方案中，Q选自：
和
其中R6相同或不同并且彼此独立地是-H、-OH、-OC(＝O)CH3或其它保护的羟基(包括但不仅限于苯甲酰基，-COC6H5和甲苯酰基-COC6H4CH3)；R7是氢、磷酸酯基团、氨基磷酸酯基团或其它含磷基团。
在一个实施方案中，Q是：
在一个实施方案中，Q是：
Figure C9980322100441
在一个实施方案中，R7是氢。在一个实施方案中，R7不是氢。在一个实施方案中，R7是磷酸酯基团或氨基磷酸酯基团。在一个实施方案中，R7是磷酸酯基团或氨基磷酸酯基团。在一个实施方案中，R7是氨基磷酸酯基团。
在一个实施方案中，R7是从氨基酸衍生的氨基磷酸酯基团，所述氨基酸包括20种天然的氨基酸。在一个实施方案中，R7是从丙氨酸衍生的氨基磷酸酯基团。在一个实施方案中，R7是或含有具有如下结构的基团：
Figure C9980322100442
以上基团及其制备方法记载于McGuigan等(1993)和McGuigan等(1996)。
在一个实施方案中，R7是从色氨酸衍生的氨基磷酸酯基团。在一个实施方案中，R7是或含有具有如下结构的基团：
以上基团及其制备方法记载于Abraham等(1996)。
在一个实施方案中，R7是磷酸酯基团。在一个实施方案中，R7是或含有具有如下结构的基团：
和
Figure C9980322100452
以上两种基团中的第一种及其制备方法记载于Freed等(1989)；Sastry等(1992)；Farquhar等(1994)和Farquhar等(1995)。以上两种基团中的第二种及其制备方法记载于Valette等(1996)和Benzaria等(1996)。
在一个实施方案中，R7是或含有具有如下结构的基团(其中R是芳香族取代基)：
和
Figure C9980322100454
以上两种基团中的第一种及其制备方法记载于Meier等(1997)；Meier等(1997)和Meier等(1997)。以上两种基团中的第二种及其制备方法记载于Hostetler等(1997)和Hostetler等，公开的国际专利申请WO 96/40088(1996)。
在一个实施方案中，R7在Q内形成环状基团。其中的一个实施方案及其制备方法如下所示(其中DMTr是4，4′-二甲氧基三苯甲基，Boc是叔丁氧羰基，DCC是1，3-二环己基碳化二亚胺，4-DMAP是4-二甲氨基吡啶)：
在一个实施方案中，化合物可以是任何对映体、非对映体或立体异构体形式，包括D-构型、L-构型、α-异头物形式和β-异头物形式。
在一个实施方案中，化合物可以是盐的形式，或是保护的或前药的形式或它们的组合，例如，是盐、醚或酯的形式。
在一个实施方案中，前药是下式的化合物：
Figure C9980322100462
在一个实施方案中，前药是下式的化合物：
在一个实施方案中，前药是下式的化合物：
在一个实施方案中，前药是下式的化合物：
Figure C9980322100473
在一个实施方案中，前药是下式的化合物：
在另一个实施方案中，以上结构被进一步修饰以含有硫代磷酸二氮杂环丙烷而不是磷酸二氮杂环丙烷，所用方法如下所述。
II类化合物的一般合成策略
尿嘧啶5位上的结构被称为连接基，因为它们将计划的离去基(发毒团)与杂环相连接。基于与人TS内的Cys-195反应使杂环激活，负电荷从尿嘧啶的6位被导向连接基团。该机制曾被用于描述5′-单磷酸化形式的(E)-5-(溴乙烯基)-2′-脱氧尿苷(BVDU)，Barr等，(1983)和(E)-5-(3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2′-脱氧尿苷(TFPe-dUrd)，Wataya等，(1979)、Santi(1980)和Bergstrom等(1984)。
毒素和dNMP之间的连接“间隔基”必需是不饱和的以便能够传递由TS-Cys-巯基攻击所提供的活化毒素的负电荷。在可用于该目的的许多不饱和有机功能基中，乙烯基、烯丙基和炔丙基单元简单、体积小并且易于合成。乙烯基和烯丙基单元的优点在于它们可以制成两种不能互换的几何异构体形式中的任何一种。因此，它们可以用作通过TS活性位点的前药适应的“探针”。另一方面，炔丙基单元的优点在于是圆柱形对称的，从而TS-催化的从该类型连接基上释放毒素不取决于其相对于dUMP的尿嘧啶环的取向，这与乙烯基和烯丙基分子的情况不同。
采用了两种不同的途径来设计本发明的基于核苷酸的前药。一种是基于BVDU单磷酸酯的结构，其特点是离去基/毒素直接连接在dUMP的C5上的(聚)乙烯基取代基的末端。这是乙烯基连接途径。这些化合物在“I类”化合物部分进行定义。另一种是基于TFPe-dUMP的结构，其与第一种类似，但有隔离离去基/毒素和不饱和单元的亚甲基单元，从而包括烯丙基或炔丙基单元，以下将作为“II类”进行描述。这是烯丙基连接途径。
各种类型的5′-氨基磷酸酯变型的结构如下所示：
Figure C9980322100491
烯丙基连接途径的炔丙基变型的活化机制的先决条件是5-乙炔基-2′-脱氧尿苷5′-单磷酸酯(EdUMP)和5-(3-羟基-1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷5′-单磷酸酯(HOPdUMP)都与TS的相互作用(Barr等，1981，Barr和Robins，1983)。EdUMP是TS的强效抑制剂(Ki＝0.1μM)，并且可能在活性位点形成了基于丙二烯的物质。HOPdUMP(Ki＝3.0μM)显示与众不同的抑制动力学，可能是由于在活性位点形成了基于累积烯的物质。
最近合成了在结构上与乙烯基和烯丙基连接途径机制的共同中间体类似的5-亚烷基化的5，6-二-氢尿嘧啶(Anglada等，1996)。它们显示出高的亲电性。它们易于和乙醇反应生成5-(乙氧基甲基)尿嘧啶是图8所示的机制中水加成反应再生有催化能力的TS的先决条件。最近，通过捕捉法研究证实了由TS产生的长的难以捉摸的C5亚甲基中间体的存在(Barrett等，1998)。
带有C5炔丙基和烯丙基醇的2′-脱氧尿苷可以简单地合成。在文献中报道了许多这些类型化合物及其衍生物，甚至有一些联同TS进行了研究。例如，对5-炔基-dUMP，包括5-(3-甲氧基-1-丙炔基)和5-(3-羟基-1-丙炔基)酮作为TS抑制剂进行了实验(Barr等，1981)，已证实其中的一些掺入到TS-缺乏的癌细胞的DNA中(Balzarini等，1985)。
5-汞-(Ruth等，1978)和5-碘尿苷(Robins等，1981)均很容易在钯催化剂的存在下与烯烃和炔烃缩合形成带有C5连接基的尿苷。后一种方法最为常用(Robins等，(1982)，Asakura和Robins(1988)和(1990))。已经实现了保护的5-碘-2′-脱氧尿苷与叔丁基二甲基甲硅烷基炔丙基醚(Graham等，(1998)，De Clercq等(1983))、甲基炔丙基醚(Tolstikov等(1997))甚至炔丙醇本身(Chaudhuri等(1995)，Goodwin等，(1993))的高产率的缩合。后一反应引入的3-羟基-1-丙炔基取代基还可以通过用DIBAL-H还原甲基丙烯酸酯基团得到(Cho等，(1994))，后者本身可以从用于合成BVDU的相同的Heck反应得到。这些钯催化的反应用途如此广泛，以致于可用于将非常长而复杂的功能基化的基于炔丙基的连接基与5-碘-2′-脱氧尿苷缩合(Livak等，(1992)，Hobbs，(1989))。基于(Z)-烯丙基的连接基通过用Undiar催化剂部分氢化炔丙基前体产生(Robins和Barr(1983))，而基于(E)-烯丙基的连接基则最好通过(E)-三丁基锡烷基化的乙烯的Heck偶联反应制备(Crisp(1989))。
按照文献的方法，制备带有叔丁基二甲基硅烷基炔丙基醚的3′，5′-二-O-保护的2′-脱氧尿苷(Graham等，(1998)，De Clercq等(1983))并将其转变成相应的(Z)-烯丙基醚的一部分还原(Robins和Barr(1983))。由于TBAF-介导的TBDMS基团的脱除可产生就地发挥功能的氧阴离子，这些TBDMS保护的炔丙基-和(Z)-烯丙基连接的核苷可以方便地作为某些带有发毒团的靶的前体。对于带有(E)-烯丙醇的核苷，可以通过文献中描述的(E)-三丁基锡烷基化的乙烯的Heck偶联反应制备已知的O-四氢吡喃基醚衍生物(Crisp(1989))。
采用两步文献中描述的方法(Phelps等(1980)，Hsiao和Bardos(1981))，将炔丙基及(E)和(Z)-烯丙醇转变成其相应的二-氮杂环丙烷基氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯，从而TS对5′-单核苷酸变型的加工将分别释放出细胞抑制药物TEPA或硫代TEPA的活性代谢物(Dirven等，(1995))。
为了避免从炔丙基或烯丙基醇衍生的酯潜在的水解不稳定性，将发毒团的羧酸部分如3-硝基丙酸通过与醇以α，α-二氟代醚的形式连接进行“掩蔽”。为此，将正常的酯用Lawesson’s试剂处理先制得炔丙基或烯丙基硫代酯连接基(Cava和Levinson)，然后将硫代酯按照公认的方式用四丁基铵二氢三氟化物转变成α，α-二氟代醚(Kuroboshi和Hoyama(1991)和(1994))。然后将基于α，α-二氟代醚的连接基与保护的5-碘-2′-脱氧尿苷按照常规方法缩合。作为α，α-二氟代醚，掩蔽的发毒团将是稳定的，直至TS将其以潜伏的活泼酰氟的形式释放。随后发生的迅速水解将就地产生基于羧酸的发毒团。
含有CS炔丙基以及(E)和(Z)-烯丙基醇的2′-脱氧尿苷的对-硝基苯基醚衍生物提供了体外TS酶试验的良好试剂，因为释放的对-硝基苯酚的分光光度、动力学测定将可以鉴定那些与TS以易于从连接基的末端催化释放离去基的方式结合的连接的dUMP平台。所需的对-硝基苯基醚可以直接从醇通过与4-氟硝基苯的碱催化的缩合制得，或通过适宜的对-硝基苯基炔丙基或烯丙基醚的Heck偶联从头合成。TS试验所需的5′-单磷酸酯可从核苷通过酶学方法生成，或按照公认的区域选择性的5′-单磷酸化方法化学合成(Imai等，(1969))。
许多5-取代的2′-脱氧尿苷不是人TK的底物，但有趣的是，发现5-(4-羟基-1-丁炔基)-2′-脱氧尿苷是个例外(Barr等(1981))。因此，预期某些带有发毒团的核苷也可以具有适宜的TK底物活性，因此将检测它们抑制肿瘤生长的活性。此外，根据新开发的区域选择性的方法，5″-氨基磷酸酯的制备现在已是很简单的事，因此对这些前药变型也进行了制备和测试。
组合合成
一种迅速获得先导化合物的途径是采用组合化学方法。由于对胸苷酸合成酶作用机制的大量了解(Schiffer等，(1995))，预定了如下主题：前药的细胞进入、胸苷激酶对前药的磷酸化以及胸苷酸合成酶使前药(尿苷衍生物)向活性药物的转化。就细胞进入而言，可采用改良的磷酸化的核苷酸(参见，例如美国专利5233031和5627165)。此外，由于肿瘤抑制剂基因丧失所引起的大部分肿瘤细胞内胸苷激酶的过表达促进了前药在肿瘤细胞内的优先磷酸化(Hengstschlager等(1996))。类似地，由于伴随肿瘤抑制物丧失(Li，W.等，(1995))和化疗(Peters，G.J.等，(1995))的胸苷酸合成酶的过表达，在肿瘤细胞内将会发生磷酸化的前药或氨基磷酸酯衍生物的优先活化。靶向于尿苷环的5-位(可以由此产生细胞毒素)或戊糖的5′-位(促进与胸苷酸合成酶的结合)的组合化学，将可以通过优化尿苷环上离去基(细胞毒素)的结构以及促进戊糖的5′-位上能磷酸化基团的优化而大大加快先导化合物的发现。为了图3、4和5所示的筛选目的，进行测试的化学实体可以通过针对单一位点的化学方法产生(图4)，也可以在分子上的两个位点同时产生(图5)。结合图3所示的筛选，已经开发了用于发现靶向于胸苷酸合成酶的前药的强有力的系统。所用的组合化学途径与Lam，K.S.(1997)描述的类似。在一个实施方案中，提供毒性离去基的前药如图6所示。图6所示的尿苷底物利用磷酰胺酶(phosphoramidase)(存在于所有细胞中)和肿瘤细胞中升高的胸苷酸合成酶(TS)。本领域技术人员可以理解，合理化的药物设计可广泛用于合成本文所定义的其它前药。
本领域技术人员应当理解，图3所示的筛选可广泛用于发现抗生素。例如，可用来自酵母的胸苷酸合成酶代替图4所示的大肠杆菌的胸苷酸合成酶。这将可以发现靶向于与酵母有关之疾病的特异性抗真菌剂。此外，对其它酶也可进行该处理。例如，可以选择出特异性地靶向于传染物如卡氏肺囊虫的二氢叶酸还原酶活性的前药。针对靶酶的特异性选择这些传染物，并且可以通过图3所述的筛选试验证实不会激活自然宿主的酶。对照细胞构成物可以含有相应的正常人的酶，以证实仅存在正常人的酶时没有毒性。
可以通过各种化学修饰的方法使本发明或本文所述的前药或试剂穿透细胞膜和血脑屏障的通透性更强。这包括，在其磷酸酯部分连接各种能够改善膜通透性的功能基。所述功能基包括但不仅限于，美国专利5233031和5627165；Fries，K.M.等(1995)和McGuigan，C.等(1984)中所描述的那些。某些二脱氧尿苷(ddU)的氨基磷酸酯衍生物对HIV有活性并可以成功地绕过胸苷酸合成酶。McGuigan，C.等(1984)。这些化学修饰还可以保护取代的嘧啶单磷酸酯衍生物防止细胞和细胞外的磷酸酯酶的作用。尽管汞或卤素衍生物是有效的，但预期可以释放烷基化或抗代谢化合物的修饰是优选的。优选的实施方案如图6所示。
I类和II类化合物的衍生物
本文所公开的上述化合物的盐、酯和醚也包括在本发明的范围内。本发明前药的盐可以从无机和有机酸和碱衍生得到。酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。其它酸如草酸，尽管本身不是可药用的，但可用于制备用作中间体的盐以得到本发明的化合物及其可药用酸加成盐。碱的例子包括碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、铵和式NW4 +的化合物，其中W是C1-4烷基。
盐的例子包括：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、葡萄糖酸氢盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、flucoheptanoate、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐。盐的其它例子包括本发明化合物的阴离子与适宜的阳离子如Na+、NH4 +和NW4 +(其中W是C1-4烷基)的盐。
对于治疗应用，本发明化合物的盐应是可药用的。但是，也发现不可药用的酸和碱的盐可用于制备或纯化可药用化合物。
本发明方法所鉴定的前药或化合物的酯包括通过将2′-、3′-和/或5′-羟基酯化得到的羧酸酯(即-O-C(＝O)R)，其中R选自：(1)直链或支链的烷基(例如正丙基、叔丁基或正丁基)、烷氧基烷基(例如甲氧基甲基)、芳烷基(例如苄基)、芳氧基烷基(例如苯氧基甲基)、芳基(例如，被例如卤素、C1-4烷基或C1-4烷氧基或氨基选择性取代的苯基)；(2)磺酸酯，例如烷基磺酰基(例如甲磺酰基)或芳烷基磺酰基；(3)氨基酸酯(例如L-缬氨酰基或L-异亮氨酰基)；(4)膦酸酯和(5)单、二或三磷酸酯。磷酸酯还可以被例如C1-20醇或其活泼衍生物酯化，或被2，3-二(C6-24)酰基甘油酯化。在所述酯中，若无例外说明，所存在的所有烷基部分均优选含有1-18个碳原子，特别是1-6个碳原子，更优选1-4个碳原子。所述酯中所存在的所有环烷基部分均优选含有3-6个碳原子。所述酯中所存在的芳基部分优选含有苯基。本发明的来苏-呋喃糖基(lyxo-furanosyl)前药的例子包括，例如羟基被化学保护(例如用O-乙酰基)的那些，例如2′-O-乙酰基-来苏-呋喃糖基；3′-O-乙酰基-来苏-呋喃糖基；5′-O-乙酰基-来苏-呋喃糖基；2′，3′-二-O-乙酰基-来苏-呋喃糖基和2′，3′，5′-三-O-乙酰基-来苏-呋喃糖基。
本发明化合物的醚包括甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基和仲丁基醚。
在其它的实施方案中，底物可能在化学上与嘧啶化合物或叶酸化合物无关，而是在合理药物设计的已知参数基础上进行了合成。参见Dunn，W.J.等(1996)。
按照以下实施例或Barr，P.J.等(1983)的描述对例如其中的反应产物是dUMP的溴乙烯基-衍生物的抗代谢剂的产物的产物进行化学检测。
诊断应用
本发明的另一方面涉及筛选治疗剂的方法，该方法包括将靶细胞与本发明的前药化合物接触。
在一个实施方案中，用于检测胸苷酸合成酶的细胞内水平的诊断目的，前药是下述II类化合物，其中R4是：
Figure C9980322100561
靶细胞倾向于将其掺入到靶细胞内。
                        实施例
以下实施例是具体涉及靶酶TS。本领域技术人员可以理解，可以对以下方法进行改良以发现针对本文所定义的靶酶的其它前药，或在发现TS和其它细胞内酶的其它前药时用作对照。
前药的合成
合成了5-氟-2′-脱氧尿苷(5-FUdR)的氨基磷酸酯衍生物，和(E)-5-(2-溴乙烯基)-2′-脱氧尿苷(BVDU)和BVDU的氨基磷酸酯衍生物。
BVDU按照文献中的方法(Dyer等，(1991))从2′-脱氧尿苷制备。按照标准的方法，首先在O5′-位用二甲氧基三苯甲基(DMTr)基团保护，然后在O3′-位用叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)基团保护，然后用酸处理除去5′-O-DMTr基团(见下)。
将得到的3′-O-TBDMS-保护的核苷与L-甲氧基丙氨酰基氯代磷酸苯酯(PMPC)反应(McGuigan等(1992))得到3′-O-TBDMS-保护的BVDU-PA。但是，出人意料的是，经1H核磁共振(NMR)波谱证实，氨基磷酸酯功能基在非常温和的脱硅烷基化条件下(用四丁基氟化铵在硅胶上)是不稳定的。对弱碱性条件敏感的观察结果为目前所报道的除了一个阿拉伯糖核苷(McGuigan等(1998))外的其它所有核苷5′-氨基磷酸酯衍生物均没有3′-羟基功能基(参见McGuigan等(1996)；McGuigan等(1993)；McGuigan等(1994)；Balzarini等(1997)；Balzarini等(1996))提供了一个可能的解释。开发了一种新的合成方法来解决这个问题。
为了合成(E)-5-(溴乙烯基)-2′-脱氧-5’-尿苷酰基(-5’-uridyl)苯基L-丙氨酰基(L-alaninyl)氨基磷酸酯(BVDU-PA)，将BVDU(420mg，1.26mmol)的2ml无水DMF溶液在氮气氛下用咪唑(103mg，1.51mmol)处理，然后滴加L-甲氧基丙氨酰基氯代磷酸苯酯(350mg，1.26mmol)(McGuigan等(1992))。将反应混合物在氮气氛下于23℃搅拌24小时。经硅胶TLC(洗脱剂为10％甲醇的二氯甲烷溶液)证实，已经开始从BVDU(Rf 0.53)生成BVDU-PA(Rf 0.70)，但仅进行到部分程度(约15％)，于是补加咪唑(52mg，0.75mmol)和PMPC试剂(175mg，0.63mmol)并将混合物在氮气氛下于23℃继续搅拌12小时。经TLC证实，反应进程有所增加(约30％完成)。通过旋转蒸发将溶液的体积减少至0.75ml，然后将其用等体积的二氯甲烷稀释并直接上到干燥的4mm硅胶Chromatotron板上。进行径向色谱，用250毫升二氯甲烷洗脱残余的DMF，然后用10％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱产物和原料得到144mg(20％)BVDU-PA和294mg未反应的BVDU，以未回收的原料计，BVDU-PA的收率为67％。如果产物的1H NMR波谱证实有咪唑(δ7.65和7.01)和DMF(δ7.95，2.89和2.73)存在，则再次进行径向色谱纯化。按照该方法，可以得到油状或发泡粉状的BVDU-PA，经TLC和1HNMR证实，纯度至少为98％。1H NMR((CD3)2SO)δ11.4(bs，与D2O交换，1，3′OH)，8.28(t，1，H6)，7.35(m，2，Ph)，7.31(d，1，乙烯基1H)，7.20(m，3，Ph)，6.89(d，1，乙烯基2H)，6.19(假t，1，H1′)，6.08(t，与D2O交换，1，丙氨酰基NH)，5.45(bs，与D2O交换，1，3′OH)，4.32(m，1，H4′)，4.22(m，2，5′CH2)，3.97(m，1，H3’)，3.86(t，1，丙氨酰基CH)，3.58(s，3，CO2Me)，2.15(m，2，2′CH2)，1.23(t，3，丙氨酰基CH3)。J乙烯基CH-乙烯基CH＝13.5，JH1′-H2′～6.8，JH2′-H3′～5，JH3′-H4′～0，alaCH-Ala-NH3NH～6Hz。1H/1H COSY 2D NMR波谱证实了光谱的归属。
按照类似的方式制得了5-氟-2′-脱氧-5′-尿苷酰基苯基L-丙氨酰基氨基磷酸酯(5-FUdR-PA)，经TLC和1H NMR证实，纯度至少为98％。1H NMR((CD3)2SO)δ11.9(bs，与D2O交换，1，N3H)，7.88(t，1，H6)，7.36(m，2，Ph)，7.19(m，3，Ph)，6.15(假t，1，H1′)，6.07(t，与D2O交换，1，丙氨酰基NH)，5.42(bs，与D2O交换，1，3′OH)，4.21(m，3，H4′和5′CH2)，3.98(m，1，H3′)，3.84(t，1，丙氨酰基CH)，3.58(s，3，CO2Me)，2.08(m，2，2′CH2)，1.22(t，3，丙氨酰基CH3)。JH6-5F＝7.1，JH1′-H2′～5.2，JH2′-H3′～2，JH3′-H4′～0，J丙氨酰基CH-丙氨酰基NH～6Hz。1H/1H COSY 2D NMR波谱证实了光谱的归属。低分辨质谱(DCI-NH3)，m/z 505(MNH4 +)，488(MH+)。
推测未保护的2′-脱氧核糖核苷与PMPC的直接缩合可以非常好地进行，生成所需的氨基磷酸酯，并且当缩合反应是在不存在碱但存在所生成的HCl的清除剂的条件下进行时，反应以5′-O-区域选择性的方式进行。BVDU和5FUdR均可与McGuigan试剂在咪唑的存在下在无水DMF溶液中缩合，分别生成所需的BVDU-PA和5FUdR-PA(见下)。未对反应条件进行优化，尽管反应没有进行完全，但在两种情况下，经薄层色谱(TLC)证实，易于分离的产物混合物均主要由所需的产物和原料组成。合成方案如下所述。
(E)-5-(溴乙烯基)-2′-脱氧-5′-尿苷酰基苯基L-丙氨酰基氨基磷酸酯 (BVDU-PA)
TLC监测(洗脱剂为10％甲醇的二氯甲烷溶液)证实了从BVDU(Rf0.53)生成BVDU-PA(Rf 0.70)。以该方法得到BVDU-PA，经TLC和1HNMR证实，纯度至少为98％。1H NMR((CD3)2SO)。1H/1H COSY 2DNMR波谱证实了光谱的归属。用NH3直接化学解离(DCI)的低分辨质谱，m/z 593/591(M·NH4 +)，576/574(M·H+)。
5-氟-2′-脱氧-5′-尿苷酰基苯基L-丙氨酰基氨基磷酸酯(5FUdR-PA)
按照类似的方式得到5FUdR-PA，经TLC和1H NMR证实，纯度至少为98％。1H NMR((CD3)2SO)。1H/1H COSY 2D NMR波谱证实了光谱的归属。低分辨质谱(DCI-NH3)，m/z 505(M·NH4 +)，488(M·H+)。
因此，一方面，本发明涉及制备呋喃糖基核苷的2′-脱氧，3′-羟基，5′-氨基磷酸酯的方法，该方法包括，将未保护的呋喃糖基核苷(2′-脱氧，3′-羟基，5′-羟基)与氯代磷酸酯在HCl清除剂的存在下反应。在一个实施方案中，氯代磷酸酯含有从氨基酸如丙氨酸衍生的磷取代基。在一个实施方案中，氯代磷酸酯是苯基-L-甲氧基丙氨酸氯代磷酸酯。因此，在另一个实施方案中，本发明涉及形成下式化合物的方法：
Figure C9980322100612
其中“碱”是指核酸的碱基(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤，但优选尿嘧啶，或其衍生物)；所述方法包括，将下式的化合物：
Figure C9980322100621
与下式的化合物：
Figure C9980322100622
在HCl清除剂的存在下反应。
在一个实施方案中，呋喃糖核苷是尿苷核苷。在另一个实施方案中，呋喃糖核苷是尿苷呋喃核糖核苷。在另一个实施方案中，呋喃糖核苷是尿苷β-D-呋喃核糖核苷。因此，在一个实施方案中，本发明涉及形成下式化合物的方法：
Figure C9980322100623
其中R1是取代基(包括，例如以上R1中所描述的那些)；该方法包括，将下式化合物：
与下式化合物：
Figure C9980322100632
在HCl清除剂的存在下反应。
在一个实施方案中，反应在不存在碱但存在HCl清除剂如咪唑的条件下进行。在另一个实施方案中，反应在非水介质中进行。在另一个实施方案中，反应在含有无水二甲基甲酰胺(DMF)的非水介质中进行。
以化学物质和细胞为基础的检测
在这些检测中使用两个细胞系，H630R10(Copur，等(1995))和正常结肠上皮细胞CCD18co(ATCC)。根据对10μM 5-FU的抗性筛选H630P(Copur，等(1995))细胞系，得到H630R10。这些细胞系的特征是表达较高水平的TS酶。比较正常结肠上皮细胞CCD18co(可从ATCC获得)与H630R10对待测化合物的敏感性。按Pegram等(1997)所述制备仅表达p185-HER2或新霉素标记的细胞系，通过Western印迹分析表明，H630R和H630R10表达的胸苷酸合成酶比CCD18co高10倍。
通过结晶紫方法(Sugarman等(1985)和Antelman等(1995))确定待测化合物阻断细胞增殖的能力。
将化合物溶解于二甲亚砜中达到1M的浓度。将其按照需要稀释到DMEM细胞培养基中，随机放到96孔微滴定板的第一排孔中。在靶细胞系上，每个浓度检测3份。将细胞与化合物保温72小时，洗涤平板，用甲醇固定细胞，然后按Sugarman等(1985)和Antelman等(1995)所述用结晶紫染色。
Western印迹分析细胞系中的TS水平
用人正常结肠上皮细胞CCD18co(可从ATCC，Manassas，VA获得)、结肠腺癌细胞系H630R10(从耶鲁大学的S.Copur博士处获得)和HER2转染的乳腺癌细胞系(Pegram等(1997))完成Western印迹试验。将细胞裂解于RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，0.5％Triton X-100，0.1％sDS和0.5％脱氧胆酸、钠盐和蛋白酶抑制剂)中。用BCA-200蛋白质检测试剂盒(从Pierce，rockford，IL获得)确定蛋白质的浓度。用12％SDS-PAGE分辨来自各细胞系的10微克蛋白质。将分离开的蛋白质转移到PVDF膜(从amersham，England)上，然后用人胸苷酸合成酶单克隆一级抗体和抗微管蛋白单克隆抗体(NeoMarkers，Fremont，CA制造的)免疫印迹。用辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠Ig作为二级抗体(Amersham)。用ECL加试剂盒(Amersham)检测免疫反应。对对应于胸苷酸合成酶的带进行定量分析，然后通过成像分析(Molecular Dynamics Storm)标准化成微管蛋白的量。
RT-PCR分析细胞系中的TS mRNA
用RT-PCR定量分析在不同细胞系中人胸苷酸合成酶转录体的表达水平。按如下设计用于扩增人胸苷酸合成酶和β-肌动蛋白的寡核苷酸引物：胸苷酸合成酶有意义引物5’-GGGCAGATCCAACACATCC-3’(对应于胸苷酸合成酶cDNA序列的碱基208-226，Genbank Accession No.X02308)，反义引物5’-GGTCAACTCCCTGTCCTGAA-3’(对应于碱基564-583)，β-肌动蛋白有意义引物5’-GCCAACACAGTGCTGTCTG-3’(对应于β肌动蛋白基因序列Genbank Accession No.M10277的碱基2643-2661)和反义引物5’-CTCCTGCTTGCTGATCCAG-3’(对应于碱基2937-2955)。
用Rneasy mini试剂盒(从Qiagen，Valencia，C获得A)从CCD18co和H630R10细胞中分离总RNA。为了监测可能的DNA污染，设计用于扩增β肌动蛋白的引物跨外显子4/内含子5/外显子5汇合处。基因组DNA模板产生313bpβ肌动蛋白片段，cDNA模板产生210bp产物。
用SuperScript预扩增系统(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)完成反转录反应。按制造商的说明，将3微克总RNA加到20微升缓冲液中以完成反转录反应。在含3微升来自反转录反应的cDNA混合物、3mMMgCl2、50mM Kcl、20mM Tris-Cl，pH8.4、各0.2mMdNTP、0.4μM胸苷酸合成酶有义和反义引物以及3单位Tag DNA聚合酶(从Promega，Madison，WI获得)的48微升体积中完成PCR反应。将反应混合物在94℃保温3分钟，然后以在94℃保温1分钟、在58℃保温1分钟，在72℃保温1分钟进行10个循环。10个循环后，加入2微升人β肌动蛋白引物达到0.2μM的终浓度，使最后的反应物体积为50微升。连续进行28个循环的PCR，然后在72℃保温7分钟。
通过在2％琼脂糖凝胶上电泳，然后用SYBR Gold核酸凝胶染料(从Molecular Probes，Eugene，OR获得)染色来分辨5微升PCR产物。将对应于胸苷酸合成酶的DNA带进行定量分析，然后用MolecularDynamics Storm标准化成β肌动蛋白的量。
Northern印迹分析
从Invitrogen(Carlsbad，CA)得到Northern印迹，然后与克隆的TS cDNA探针杂交。按照作为管家转录体的核糖体蛋白S9将杂交信号标准化。如果与正常组织对照相比，如果标准化的信号至少提高2倍，则认为肿瘤过表达TS mRNA。
克隆、表达并纯化人胸苷酸合成酶
用修饰的在pGCHTS中的人TS cDNA构建用于人胸苷酸合成酶(TS)的大肠杆菌质粒表达载体。从Dan Santi博士得到的该克隆含有人TS的完整开放阅读框。
为了在大肠杆菌中进行表达，将完整的人TS ORF亚克隆到T7启动子表达载体pET28a(Novagen Inc.)中。所得的质粒载体编码有6个组氨酸然后是凝血酶裂解位点的重组融合蛋白的人TS的合成。该融合蛋白将20个额外氨基酸加到人TS的氨基末端。为了产生重组蛋白，将人TS表达载体导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，该菌株带有位于lac操纵基因控制下的插入染色体的T7 RNA聚合酶基因。
用金属螯合亲和树脂(Novagen Inc.)纯化人TS-poly-His融合蛋白。蛋白质纯化后，在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳。用Pierce BCA蛋白质检测确定蛋白质浓度。从500毫升大肠杆菌培养物中回收约10毫克人TS融合蛋白。用银染色肉眼观察时，仅出现对应于人TS的带。用抗TS单克隆抗体TS106(NeoMarkers)，通过完成Western印迹确定人TS带的特性。
胸苷酸合成酶酶活性检测
用Wahba和Friedkin(1961)的分光光度检测测量TS活性。在该检测中，通过测量在340nm吸收值的增加来监测TS活性，当因dUTP被转变成dTTP而将辅因子5，10亚甲基四氢叶酸氧化成二氢叶酸时会发生吸收值的增加。用该方法制备的酶的比活性为0.5-0.65单位/mg蛋白质。一单位指每分钟产生一微摩尔dTNP。该值与用Pedersen-Lane等(1997)制备的相似。
试验结果
这些结果确定了在肿瘤细胞中用胸苷酸合成酶作为细胞毒性的可行性。在该检测中，使用CCD18co细胞(正常结肠上皮细胞)和H630R10，后者是表达高数倍的胸苷酸合成酶的H630P的衍生物(Copur等(1995))。完成各种细胞中TS蛋白质水平的Western印迹分析然后通过与人微管蛋白抗体进行比较在样品间将所述分析结果标准化(表5)。得到H630R10(13x)和CCD18co(1x)的等级。
另外再比较通过RT-PCR确定的细胞系间的mRNA水平。参见表5。与Western印迹分析相似，当对β肌动蛋白RT-PCR标准标准化后，等级是H630R10(24x)和CCD18co(1x)。
                         表5分析TS蛋白质和mRNA在CCD18co和H630R10细胞中的表达
                 TS表达
    细胞系   相对mRNA水平     相对蛋白质水平
    CCD18co   1     1
    H630R10   24     13
HER2原癌基因表达提高了肿瘤细胞中的TS水平
用免疫印迹技术评估在新霉素和HER2/neu-转染的人乳腺癌细胞中TS的表达水平。结果(见图7)表明转染和过表达人HER2/neu cDNA后，TS表达提高。用HER2/neu-转染的人卵巢癌细胞可以得到相似的结果。MCF7/HER2和MCF7/neo细胞系是本发明检测的靶细胞，因为在这些细胞中TS的诱导最显著(约20倍)。
氟嘧啶，5-FUdR经与5-FU类似的机制抑制细胞生长。这包括掺入到核酸中而引起的细胞毒作用以及TS酶活性的抑制作用(Goodman和Gilamn(1996))。因此，期望表达较高水平TS的细胞通常会比表达较低水平该酶的细胞有更强的抗性(有较高的IC50)。表6(第一行)表明这是得到的结果。此外，正如从早期工作所预期的，在该检测中BVDU几乎没有活性(表6，第二行)。这可能是因BVDU对通过人胸苷激酶的单磷酸化无能为力导致的，而这种能力是结合胸苷酸合成酶的需要(Balzarini等(1987)，Balzarini等(1993)，Carreras和Santi(1995))。两个细胞系对BVDU的敏感性没有显著差异。BVDU的活化与核糖部分的5’羟基的氨基磷酸酯化同时发生。BVDU-PA(表6，第三行)对高度表达的H630R10细胞系比对CCD18co细胞有高出10的活性。
                             表6较高水平的TS表达预示对BVDU-PA有更高的敏感性
                IC50(μM)1
    化合物     CCD18co     H630R10
    1.5-FUdR     9.5M±0.42     169.8±2.4
    2.BVDU     2540±58.2     2876.2±54.5
    3.BVDU-PA     2810.2±75.1     216.7±15.7
1标准误差低于20％
然后将这两个细胞系就对5-FUdR，和BVDU的氨基磷酸酯衍生物(BVDU-PA)进行比较。由于5-FUdR经与5FU相同的机制抑制细胞生长，因此预期CCD18co比H630R10更敏感(有较低的IC-50)，因为后者细胞系具有较高的胞内水平的胸苷酸合成酶。表7中所列的数据证明这是用上文所述的结晶紫检测得到的结果。该结果还说明现有癌症化疗的关键问题之一，即化疗对正常细胞的毒性常常比对癌细胞的毒性高。表7中所列的数据表明正常结肠上皮细胞(CCD18co；IC-50＝9.5μM)对5-FUdR的敏感性是H630-R10结肠肿瘤细胞(IC-50＝169.8)的约18倍。但是前药底物BVDU-PA扭转了这种关系。通过TS转变成细胞毒部分的BVDU-PA对高水平表达TS的H630R10细胞(IC50＝216.7)比对正常结肠细胞(IC50＝2810.2)的活性强约13倍。
                         表7TS前药BVDU-PA对过表达胸苷酸合成酶的肿瘤细胞系的活性比对正常细胞的高(1，2)
化合物                  IC50
CCD18co(正常结肠上皮细胞) H630R10(结肠癌细胞系)
5-FUdR(氟尿苷) 9.5μM 169.8μM
BVDU-PA 2810.2μM 216.7μM
1.来自数个试验的代表性数据
2.每个浓度用一式三份孔完成的试验。标准误差低于20％。
用Alamar Blue检测(可从ACCUMED Int.，West Lake，OH购买)确认了所述结果。下列表8中的数据表明甚至5-FU也具有对正常和肿瘤细胞均有毒的非选择性。
                          表8正常细胞至少与肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶一样敏感
  正常细胞     IC50   肿瘤细胞     IC50
  结肠上皮细胞(CCD18co)     0.2   乳腺(MCF7)     0.61
  皮肤成纤维细胞(DET551)     1.1   乳腺(MDA468)     0.40
  肺上皮细胞(W138)     0.4   肉瘤(Saos 2)     11.30
             X＝0.57μM                        X＝4.10μM
本发明的另一种检测需要在含人胸苷酸合成酶和候选前药的反应混合物中筛选候选药物，所述混合物含有和不含有N5N10-亚甲基四氢叶酸。用本领域熟知的方法例如用氚标记候选前药的离去基团(在嘧啶的5位)。对照底物是在相同的反应条件下类似地标记的(例如5-3H)dUMP。按照Carreras，C.W.和Santi，D.W.(1995)提供的描述和本文引用的参考文献类似地完成所述检测。可从含表达的人胸苷酸合成酶的大肠杆菌中纯化人胸苷酸合成酶。参见DaVisson，V.J.等(1989)和Davisson，V.J.等(1994)。该方法提供了能够筛选大量候选化合物的规模可调节的检测方法。
确定TS前药代谢的细胞内产物
为了证实提出的活化和作用机制并确定是候选治疗剂的试剂，确定TS前药代谢的细胞内产物是非常重要的。有关芳基磷酸二酯酰胺化物细胞内代谢的一种可接受的观点涉及酶促转变成羧酸，磷酸单酯酰胺化物分子内重排成5’-单磷酰基核苷(Valette等(1996))。但是，这种机制不可能描述所有氨基磷酸酯为基础的核苷酸原的细胞内加工。例如，就芳基磷酸单酯酰胺加工提出了不同的机制，一种涉及将磷酰胺通过磷酰胺hydrolate简单直接地转变成单磷酸(McIntee等(1997)和Fries等(1995))。无论暴露核苷一磷酸的机制如何，这种检测方法可以检测细胞内单磷酸经TS在细胞内转变成细胞毒化合物的产物。
在图8中列出了经TS而得到的前药化合物的建议的反应产物。为了完成这一工作，将细胞与一定量的诱导高表达TS细胞系的50％生长抑制作用(在上文72H检测)的前药化合物一起保温。使用低和高TS表达者细胞(例如CCD18co对H630R10)。完成时间过程研究，其中将处理的细胞按照McIntee等(1997)所述的方法处理。在-20℃水中，将细胞用60％甲醇裂解，然后离心除去颗粒残余物。将上清液干燥并于-20℃贮存。先用RP-HPLC，然后用LC-MS评估等份试样以证明氨基磷酸酯到单磷酸的细胞内转变，同时确保通过胸苷酸合成酶转化单磷酸。
用纯化的胸普酸合成酶证明底物活性
该检测确定未来TS酶制剂的比活性，以确保所述制剂的活性能够经过一段时间并确定具有适宜活性的筛选的化合物是否确实在体外反应条件下使TS酶失活。
为了确定当前药化合物与纯化的重组TS酶一起保温时产生什么反应产物，用与用TS活性检测所用类似的反应条件在体外得到反应产物。然后用GC-质谱分析这些反应产物以鉴定形成的实际分子。
体内效力研究
1.细胞系和细胞培养
从Dennis Slamon(UCLA)博士处得到MCF7/NEO和MCF7/HER2转染的乳腺细胞系。证明MCF7/HER2转染的乳腺癌细胞以及其他HER-2/neu转染的细胞系有提高的TS表达(Pegram等(1997))。因此，除CCD18co和H630R10外，这些细胞系也适合检测对前药的差别反应。首先用与上述体外试验相同的方法，在体外确认MCF7/NEO和MCF7/HER2对5-FUdR和BVDU-PA的差别反应。对从Bertino博士(Banerjee等(1998))处得到的HT1080肿瘤细胞系进行同样的鉴定。
2.用于检测前药化合物的异种移植模型
MCF7/HER2乳腺细胞在无胸腺小鼠中高效率形成异种移植，而且对其生长特性已作了彻底的表征(Pegram等(1997))。该异种移植模型的生长特性如此均匀以致可以预测用不同药物治疗后这些肿瘤的生长轨道的计算机模型已由UCLA医学院生物数学系的Angela Lopez博士和Elliot Landau博士开放出来(Lopez等正在提交)。由于该模型的均匀性和再现性，它在新试验治疗剂的临床前试验中非常有用。例如，该模型形成了Herceptin_的初步体内分析的基础，该药物已被美国FDA批准用于治疗转移性乳腺癌(Pegram等(1998))。结肠肿瘤细胞系(HT1080/NEO和HT1080/E2F1.1)有致瘤力(Banerjee等(1998))。
将ras-转化的NIH 3T3细胞系皮下移植到免疫缺陷小鼠中。开始的治疗可以是直接在肿瘤内注射。预期的结果是升高水平的人TS或靶酶导致药物候选物引起的抗肿瘤活性提高。用表达高水平人TS或靶酶的人肿瘤完成类似的研究，并表明对药物反应的效力与其人TS表达和靶酶水平有关。任选地，按上述完成试验，不同的是将药物静脉内施用到动物体内以研究药物候选物的效力、毒性和药学生物学问题。在另一实施方案中，对照动物将接受有效量在上文“前药”节鉴定的化合物。
更具体地讲，用两种不同的异种移植模型完成体内研究(见表9)。
                             表9用于体内效力试验的致肿瘤细胞系
  异种移植   相对的TS表达 细胞源   来源
  MCF7/NEOMCF7/HER2   低(1X)高(20X) 人乳腺癌   Slamon博士
  H630R10   高(13X) 人结肠癌   Copur等(1995)
  HT1080/NEOHT1080/E2F1.1   低(1X)高(14X) 人结肠癌   Bertino Banerjee博士等(1998)
按所述(Pegram等(1997))在4-6周龄(20-25克)CD-1(nu/nu)无胸腺小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)的胁区，以5×106/位点皮下注射确定表达TS(表9中所说明的)的试验细胞。每个治疗组(载体对照溶液或者前药化合物)用8只小鼠(每笼4只)。每只小鼠建立了两个异种移植，这样减少了每个试验所需的动物数并改善了组间检测反应差异的统计力。通过标记耳朵来鉴定每个小鼠以便除分析组平均数外，计算每个小鼠的异种移植轨道。在MCF7乳腺异种移植模型中所用的有有小鼠均是雌性，而且在注射前，皮下施用在生物可降解载体粘结剂中的17B-雌二醇(Innovative Research of America，Toledo，OH)引发所述小鼠以促进肿瘤细胞生长。由单盲观察者通过系列微米测量每周两次监测预期的肿瘤体积，按(宽度2X长度)/2计算。将动物分配到每个治疗组中，使每组中平均的起始肿瘤体积相同。完成统计学试验(单因素ANOVA)以确保治疗组间起始肿瘤体积的统一。在第一组试验中，通过一次I.P.注射施用前药或者同体积载体对照溶液。如果在开始的试验中鉴定效力，则用每天皮下给药方案X5天完成另外的研究，总前药剂量等于在一次I.P.给药研究中确定的IC50。
对于这些效力试验，当每组的平均异种移植体积达到50 MM3时开始前药给药。用图形分析，用描述性统计说明相对于对照治疗动物的前药治疗动物的平均肿瘤体积。将应用统计学试验(单因素ANOVA)比较治疗组间的异种移植体积差异。当说明时，将对数变换应用ANOVA计算，稳定异种移植体积数据组的方差。如果需要，根据异种移植体积数据分布应用非参数统计学检验。通过使用所述(Pegram等(1997))统计资料的前药-处理的/对照处理的肿瘤体积比(T/C比)，将高TS表达的异种移植间的效力差与低TS表达的进行比较。该方法可调节高TS-表达异种移植和低TS-表达异种移植间的内在生长率方面的差异。
按Harris，MP等(1996)和Antelman，D.等(1995)所述完成体内研究。
3.用不携带肿瘤无胸腺小鼠完成剂量发现研究以确定最大耐受剂量(MTD)
经腹膜内(I.P.)给6只CD-1nu/nu无胸腺小鼠(Charles RiverLaboratories)(3雄，3雌)组注射单剂量前药。通过能达到等于体外IC50的血清浓度的前药量的起始剂量来根据经验开始给药，假定所述前药的体积分布限于小鼠的总体水(TBW)(0.6X体重克数TBW小鼠)室。如果在该水平未观察到毒性，则以半对数间隔逐步升高6只小鼠组的剂量。如果在该经验剂量水平即观察到毒性，则同样从毒性剂量的10％开始重复剂量逐步增加试验。每天观察小鼠的活动性、理毛行为以及摄取食物和水的能力。每周测量小鼠体重。将MTD定义为在观察期间导致体重下降10％或更少的剂量，或者剂量＝LD50的90％。如果在某一特定剂量水平发生致死，则重复试验(假定在该水平未观察到毒性)。观察期为60天。如果在一特定剂量水平没有观察到毒性，则以3周的间隔在以后的组中进行剂量逐步增加试验。
尽管参照具体实施方案详细描述了本发明，但可以进行不偏离本发明精神和范围的各种改变和修饰，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
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PCT申请WO 91/17474，1991年11月4日公开
Hostetler等，专利申请WO 96/40088(1996)

Claims (10)

1.用于鉴定潜在治疗剂的方法，包括：
(a)在有利于所述药剂掺入到靶细胞的细胞内区的条件下，将过量表达胸苷酸合成酶的靶细胞与是胸苷酸合成酶之选择性底物的候选治疗的磷酰基或氨基磷酸酯前药接触；
(b)检测靶细胞的细胞增殖抑制作用或杀死细胞的情况。
2.权利要求1的方法，其中所述前药是2’-脱氧尿苷的氨基磷酸酯衍生物。
3.用于鉴定潜在治疗剂的方法，包括：
(a)在有利于所述药剂掺入到靶细胞的细胞内区的条件下，将过量表达胸苷酸合成酶的靶细胞与带有可检测地标记的毒性离去基团并且是所述胸苷酸合成酶之选择性底物的候选治疗的磷酰基或氨基磷酸酯前药接触；
(b)检测培养基中释放的标记量。
4.权利要求3的方法，其中所述前药是2’-脱氧尿苷的氨基磷酸酯衍生物。
5.权利要求1-4的任一方法，其中所述靶细胞的特征是对化疗药物有抗性。
6.权利要求5的方法，其中所述胸苷酸合成酶是通过化疗法的体内选择而扩增得到的。
7.体外抑制过量表达胸苷酸合成酶的过度增殖细胞增殖的方法，包括使所述细胞与有效量的下式的L-或D-化合物接触：
Figure C998032210003C1
或 或
其中R1是或含有具有与通过胸苷酸合成酶从嘧啶环上分离相适应的分子大小和亲电性的化学实体，并且当其由胸苷酸合成酶从嘧啶环上释放后，可以抑制细胞的增殖或杀死细胞；或是下式的化合物：
其中n是0-10的整数；其中A是磷酰基或磷酰胺衍生物，或是下式的化合物：
其中Q是糖基团的、硫代糖基团的或碳环基团的5′-磷酰基或5′-氨基磷酸酯衍生物。
8.权利要求7的方法，其中的Q具有如下结构式：
其中R7选自磷酰基、氨基磷酸酯及其衍生物，且其中的R2和R3相同或不同并且彼此独立地是-H或-OH。
9.权利要求7的方法，其中R1是卤素。
10.权利要求7的方法，其中R1是烷基，即(-CH＝CH)n-R4，其中n是0-10的整数，R4选自H、卤素、烷基、链烯基、炔基、羟基、-O-烷基、-O-芳基、-O-杂芳基、-S-烷基、-S-芳基、-S-杂芳基、-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NHCHO、氰化物、氰酸酯和硫氰酸酯、卤代乙烯基化合物、卤代汞化合物、-NHOH、-NHO-烷基和NHNH2。
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