CN100341568C - 改变化学治疗剂的活性的丁酰胆碱酯酶变体 - Google Patents

改变化学治疗剂的活性的丁酰胆碱酯酶变体 Download PDF

Info

Publication number
CN100341568C
CN100341568C CNB2003801050807A CN200380105080A CN100341568C CN 100341568 C CN100341568 C CN 100341568C CN B2003801050807 A CNB2003801050807 A CN B2003801050807A CN 200380105080 A CN200380105080 A CN 200380105080A CN 100341568 C CN100341568 C CN 100341568C
Authority
CN
China
Prior art keywords
butyrylcholine esterase
leu
gly
ser
asn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB2003801050807A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1720063A (zh
Inventor
J·D·沃特金斯
J·D·潘库克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Applied Molecular Evolution Inc
Original Assignee
Applied Molecular Evolution Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applied Molecular Evolution Inc filed Critical Applied Molecular Evolution Inc
Publication of CN1720063A publication Critical patent/CN1720063A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100341568C publication Critical patent/CN100341568C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了丁酰胆碱酯酶变体，通过将喜树碱衍生物与丁酰胆碱酯酶变体接触将喜树碱衍生物转化成拓扑异构酶抑制剂的方法，还提供了通过对个体施用有效量的丁酰胆碱酯酶变体治疗癌症的方法，其中该丁酰胆碱酯酶变体与丁酰胆碱酯酶相比将喜树碱衍生物转化成拓扑异构酶抑制剂的能力增强。

Description

改变化学治疗剂的活性的丁酰胆碱酯酶变体
技术领域
本发明涉及丁酰胆碱酯酶变体，更特别地，还涉及其生产和治疗性用途。
发明背景
癌症是美国死亡的主要原因之一。每年，50万以上的美国人死于癌症，并且一百万以上的人被新近诊断患有该疾病。在癌症中，赘生性细胞逃脱它们的正常生长调节机制并以失控的方式增殖，导致恶性肿瘤形成。如果原发性肿瘤的治疗不完全或者未在该疾病的实质恶化之前启动，那么肿瘤细胞可以转移到另一部位。因此恶性肿瘤的早诊断和有效治疗是幸存所必需的。
当前治疗癌症的方法包括手术、放射疗法和化学疗法。这些治疗每一种的一个主要问题是它们缺乏对癌细胞的特异性和许多副作用。例如，由于对正常组织的毒性，可以安全使用的放射或化学治疗剂的量通常不足以杀死所有赘生性细胞。甚至少许残留的赘生性细胞也可以是致命的，因为它们可以快速增殖并转移到其他部位。不幸的是，与放射和化学疗法相关的毒性表现为让人不愉快的副作用，包括恶性和脱发，它们严重降低了经历这些治疗的癌症患者的生活质量。显然，需要更具选择性和更有效的治疗方法。
最近，已经发现了多种化学治疗剂，它们可以在体内被活化而产生代谢性产物，该产物对癌细胞具有毒性。这些化疗剂有时被称为“前药”，因为它们在体内被转化成活性药物。这些化学治疗剂包括紫杉醇(paclitaxel)前药和喜树碱(CPT-11)。这些治疗剂被内源羧酸酯酶，如丁酰胆碱酯酶代谢而分别产生活性药物如紫杉醇和SN-38。不幸的是，尽管这些化学治疗剂具有良好的体外抗肿瘤活性，但是已经报导了这些药物在患者中的严重副作用，如腹泻、脱发、恶心、呕吐和胆碱能症状。
这些化学治疗剂的低治疗指数限制了它们在癌症治疗中的用途。因为这些治疗剂的更高剂量导致更大副作用，所以需要不同方法以使得这些治疗剂更有效。一种方法是增加这些治疗剂在体内向活性药物的转化效能。许多天然发生的人丁酰胆碱酯酶以及物种变体是公知的，然而，这些酶没有一种表现出增强的前药水解活性。此外，已经试验了来自非-人物种的酶和细胞间酶将前药向活性药物转化的能力。然而，来自非-人物种的酶和细胞间酶都是免疫原性的，这严重限制了它们的用途。有利地，人丁酰胆碱酯酶位于血浆中并且免疫原性较低。
从而，需要丁酰胆碱酯酶变体，该变体能够比野生型丁酰胆碱酯酶更有效地改变化学治疗剂的活性。本发明满足了该需求并且还提供了相关的优点。
发明概述
本发明提供了丁酰胆碱酯酶变体，其具有选自SEQ ID NOS：4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的氨基酸序列，或者该丁酰胆碱酯酶变体的功能片段。
此外，本发明提供了通过将喜树碱衍生物与选自SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段在允许喜树碱衍生物向拓扑异构酶抑制剂转化的条件下接触，将喜树碱衍生物转化成拓扑异构酶抑制剂的方法。
此外，本发明提供了通过对个体施用有效量的选自SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段治疗癌症的方法，该丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段与丁酰胆碱酯酶相比表现出将喜树碱衍生物向拓扑异构酶抑制剂转化的能力增强。
附图简述
图1显示了代表性乙酸邻硝基苯基酯试验，该试验显示了羧酸酯酶活性增加的丁酰胆碱酯酶变体。
图2显示了CPT-11和SN-38的化学结构和通过羧酸酯酶活性使CPT-11向SN-38的转化。
图3显示了对SN-38形成的高效液相层析(HPLC)测定。图3显示来自模拟-转染的细胞的条件培养基。条件培养基被暴露于CTP-11并通过HPLC分析SN-38的形成。标出CPF-11和SN-38峰。
图4显示了对用F227A变体转染的细胞的条件培养基形成的SN-38的高效液相层析(HPLC)测定。条件培养基被暴露于CTP-11并通过HPLC分析SN-38的形成。CTP-11和SN-38峰被标记。
图5显示了对用F227A/L286S变体转染的细胞的条件培养基形成的SN-38的高效液相层析(HPLC)测定。条件培养基被暴露于CTP-11并通过HPLC分析SN-38的形成。CTP-11和SN-38峰被标记。
图6显示了MTT细胞毒性测定的结果。将CPT-11与野生型丁酰胆碱酯酶、6-6变体、或F227A/L286Q变体孵育以激活CTP-11。显示了暴露于活化的CPT-11时被杀死的SW38结肠癌细胞的百分数并将其与没有用丁酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶变体(标记为“模拟”的道)孵育的CTP-11比较。
图7显示了ELISA试验，该试验展示表达的抗-EGFR-BChE L530与抗-κ捕获抗体的结合并通过丁酰硫代胆碱酯的水解测量结合的丁酰胆碱酯酶的活性。
图8显示了ELISA试验，该试验测量特异地与含有EGFR抗原的细胞膜制品结合的抗-EGFR-BChE L530的丁酰胆碱酯酶酶活性。
图9显示了小鼠抗-EGFR可变轻链的核苷酸和氨基酸序列(SEQ IDNOS：17和18)。
图10显示了L530的小鼠抗-EGFR可变重链和恒定重链铰链区的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOS：19和20)。
图11显示了人丁酰胆碱酯酶的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOS：21和22)。F227、T284、L286和S287的位置以粗体和下划线标记。
图12的表格显示了对丁酰胆碱酯酶变体4-1转化SN38的定量。
图13显示了丁酰胆碱酯酶变体4-1水解CTP-11的Hofstee图。
图14显示了抗体-丁酰胆碱酯酶融合蛋白与固定化SKW肿瘤细胞的结合。
图15显示了抗-CD20-丁酰胆碱酯酶融合蛋白对SKW肿瘤细胞的靶定的细胞毒性。
图16显示了给出丁酰胆碱酯酶变体F227A(SEQ ID NO：2)的结构和功能特征的表格。
图17显示了给出被指定为SEQ ID NOS：24到176的丁酰胆碱酯酶变体的结构和功能特征的表格，所有这些变体都是双突变，其中包括作为两个氨基酸改变之一的F227A改变。
图18显示了给出被指定为SEQ ID NOS：178到196的丁酰胆碱酯酶变体的结构和功能特征的表格，所有这些变体都包括F227A改变作为氨基酸改变之一。
图19显示了抗-CD20VH-CH1铰链cys L530BChE.4-1重链构建体的氨基酸序列(SEQ ID NO：200)和相应核苷酸序列(SEQ ID NO：199)。这是融合蛋白重链，其由抗-CD20抗体可变重链区与含有半胱氨酸的铰链区及被指定为SEQ ID NO：180的丁酰胆碱酯酶变体的L530片段(SEQ IDNO：201)组成，其掺入4-1变体氨基酸(H77F/F227A/P285N/V331A)。
图20显示了抗-CD20轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：198)和相应核苷酸序列(SEQ ID NO：197)。
发明详述
本发明提供了丁酰胆碱酯酶变体，其表现出将化学治疗剂前药转化成活性药物的能力增强。表现出将化学治疗剂前药转化成活性药物的能力增强的丁酰胆碱酯酶变体的鉴定为癌症提供了治疗选择。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有癌症症状的个体的方法。本发明的丁酰胆碱酯酶变体具有重要的临床价值，因为它们能够比任何公知的天然发生的野生型丁酰胆碱酯酶以更高的速度将前药转化成活性药物。正是前药转化活性的增加使得可以更有效地治疗癌症并且具有更小的副作用，这使得本发明的丁酰胆碱酯酶变体与其他治疗方案区别开来。在一个实施方案中，本发明提供了通过将喜树碱衍生物与选自SEQ IDNOS：2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段在允许喜树碱衍生物向拓扑异构酶抑制剂转化的条件下接触，将喜树碱衍生物转化成拓扑异构酶抑制剂的方法。
如此处所用的，术语“丁酰胆碱酯酶”旨在指具有天然发生的丁酰胆碱酯酶的序列的多肽。天然发生的丁酰胆碱酯酶可以是任何物种来源，例如，人、灵长类、马或鼠来源。因此，丁酰胆碱酯酶可以是，例如，脊椎动物或无脊椎动物丁酰胆碱酯酶，例如，哺乳动物丁酰胆碱酯酶。此外，本发明的丁酰胆碱酯酶可以是天然发生的丁酰胆碱酯酶的多态性变体或者任何其他等位基因变体。编码本发明的丁酰胆碱酯酶的核酸编码具有任何天然发生的丁酰胆碱酯酶的序列的多肽。因此，编码丁酰胆碱酯酶的核酸可以编码任一物种来源，例如，人、灵长类、马或鼠的丁酰胆碱酯酶。此外，编码丁酰胆碱酯酶的核酸包括任何天然发生的等位基因或多态性。人丁酰胆碱酯酶的GenBank记录号为M16541。
如此处所用的，术语“丁酰胆碱酯酶变体”旨在指结构上类似于丁酰胆碱酯酶，但是与丁酰胆碱酯酶至少有1个氨基酸不同的分子。丁酰胆碱酯酶变体具有如丁酰胆碱酯酶的氨基酸序列并且表现出将喜树碱衍生物转化成拓扑异构酶抑制剂的代谢能力增强。关于这一点，丁酰胆碱酯酶变体可以具有，例如，与丁酰胆碱酯酶相比，将喜树碱衍生物转化成拓扑异构酶抑制剂的降低或增强的能力。例如，本发明的丁酰胆碱酯酶变体的转化能力可以增加2、5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、4000、5000倍、或更多倍。
丁酰胆碱酯酶变体与丁酰胆碱酯酶相比可以具有单个氨基酸改变以及多个氨基酸改变。丁酰胆碱酯酶变体的一个特定实例是在227位为丙氨酸的丁酰胆碱酯酶，其氨基酸序列和编码核酸序列分别被指定为SEQ IDNOS：2和1。另一实例是在77位为苯丙氨酸、227位为丙氨酸、285位为天冬酰胺、331位为丙氨酸的丁酰胆碱酯酶变体，其氨基酸序列和编码核酸序列分别被指定为SEQ ID NOS：180和179，并且其与丁酰胆碱酯酶相比将喜树碱衍生物CTP-11转化成拓扑异构酶抑制剂SN-38的能力增加至少3000倍。该术语还旨在包括含有例如，天然发生的氨基酸的修饰形式诸如D-立体异构体、非天然发生的氨基酸、氨基酸类似物和模拟物的丁酰胆碱酯酶变体，只要这些变体具有与丁酰胆碱酯酶基本相同的氨基酸序列并且表现出将喜树碱衍生物转化成拓扑异构酶抑制剂的能力。本发明的丁酰胆碱酯酶变体可以具有一个或多个氨基酸改变，这些改变位于被确定或预测为对于此处将喜树碱衍生物转化为拓扑异构酶抑制剂的能力重要的区域之外。此外，本发明的丁酰胆碱酯酶变体可以具有一个或多个额外的修饰，这些修饰不显著改变其将喜树碱衍生物转化成拓扑异构酶抑制剂活性的能力。本发明的丁酰胆碱酯酶变体与丁酰胆碱酯酶相比还可以具有增强的稳定性。
如此处所用的，本发明的丁酰胆碱酯酶变体包括与参比氨基酸序列基本相同的序列，从而丁酰胆碱酯酶变体旨在包括具有相同氨基酸序列的多肽、片段或节段，或者具有类似的、不相同的序列的多肽、片段或节段，该类似但不同的序列被本领域中技术人员认为是功能上等价的氨基酸序列。与参比丁酰胆碱酯酶基本相同的氨基酸序列或者本发明的丁酰胆碱酯酶变体可以与参比丁酰胆碱酯酶具有至少70％、至少80％、至少81％、至少83％、至少85％、至少90％、至少95％或以上的同一性。基本上相同的氨基酸序列还旨在包括含有例如，天然发生的氨基酸的修饰形式诸如D-立体异构体、非天然发生的氨基酸、氨基酸类似物和模拟物的多肽，只要这些多肽保持如上面定义的功能活性。本发明的丁酰胆碱酯酶变体的生物学活性是如此处描述的能够将喜树碱衍生物转化成拓扑异构酶抑制剂的能力。例如，被指定为SEQ ID NO：2的丁酰胆碱酯酶变体F227A与丁酰胆碱酯酶相比表现出将喜树碱衍生物CTP-11转化成拓扑异构酶抑制剂SN-38的能力增加至少3倍。另一实例是指定为SEQ ID NO：180的丁酰胆碱酯酶变体H77F，F227A，P285N，V331A，该变体与丁酰胆碱酯酶相比表现出将喜树碱衍生物CTP-11转化成拓扑异构酶抑制剂SN-38的能力增加至少3000倍。
可以理解多肽中一级氨基酸序列的微小修饰可以导致与本发明的多肽相比具有基本等价的功能的多肽。这些修饰可以是故意的，如通过定点诱变，或者可以是偶然的，如通过自发突变。例如，可以理解，为了实现将喜树碱衍生物转化成拓扑异构酶抑制剂的能力，可能仅需要丁酰胆碱酯酶变体的全部一级结构的一部分。而且，本发明的丁酰胆碱酯酶变体序列的片段可以类似地被包括在该定义中，只要该片段保留丁酰胆碱酯酶变体的至少一种生物学功能。可以理解各种分子，例如，其他多肽、糖类、脂质或化学部分可以附着到本发明的多肽上。
本发明的核酸分子包括与本发明的参比核酸分子基本相同的核酸序列或者其片段，并且旨在包括与参比序列相比具有一个或多个添加、缺失或置换的序列，只要该核酸分子保留在中等严格条件，或者高度严格条件下与主题核酸分子选择性杂交的能力。中等严格条件旨在包括等价于将滤膜-结合的核酸在50％甲酰胺、5×Denhardt溶液、5×SSPE、0.2％SDS中在42℃杂交，然后在0.2×SSPE、0.2％SDS中50℃洗涤的杂交条件。如此处所用的，高度严格杂交条件是等价于将滤膜-结合的核酸在50％甲酰胺、5×Denhardt溶液、5×SSPE、0.2％SDS中在42℃杂交，然后在0.2×SSPE、0.2％SDS中65℃洗涤的条件。其他适宜的中等严格和高度严格杂交缓冲液和条件是本领域技术人员熟知的并且在例如，Sambrook等人， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork(1992)和Ausubel等人， Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1998)中描述。从而，不必两个核酸表现出基本上互补的序列同一性，只要它们能特异杂交或者使得它们能特异杂交而没有与其他类似序列的可检测的交叉反应性即可。
通常，与参比序列具有基本上相同的核苷酸序列的核酸分子将与参比序列具有大于约60％的同一性，如大于约65％、70％、75％同一性，如在所比较的两个序列的全长上与参比序列具有大于约80％、85％、90％、95％、97％或99％的同一性。本领域技术人员基于例如，BLAST 2.0计算机比对，使用默认参数可以确定任何两个核酸序列的同一性。BLAST 2.0搜索可以在ncbi.nlm.nih.gov/gorffbl2.html.得到，如Tatiana等人， FEMS Microbiol Lett.174：247-250(1999)所描述。
如此处所用的术语“片段”当与编码本发明多肽的核酸相关时，旨在表示具有与编码本发明多肽的核酸或者其节段的一部分基本相同的序列的核酸。核酸片段在长度和序列上足够与丁酰胆碱酯酶变体编码核酸或者丁酰胆碱酯酶变体编码核酸的互补核苷酸序列选择性杂交。因此，片段旨在包括用于测序和聚合酶链式反应(PCR)的引物以及用于核酸印迹或溶液杂交的探针。
类似地，术语“功能片段”当用于编码丁酰胆碱酯酶或者丁酰胆碱酯酶变体的核酸时，旨在指编码丁酰胆碱酯酶或者丁酰胆碱酯酶变体的一部分的核酸的一部分，该丁酰胆碱酯酶或者丁酰胆碱酯酶变体的一部分仍然保留亲本多肽的一些或者全部代谢转化能力。表现出功能活性的本发明多肽的功能片段可以具有，例如，本发明多肽的至少6个连续氨基酸残基，本发明多肽的至少8、10、15、20、30或40个氨基酸，或者常具有至少50、75、100、200、300、400或更多个氨基酸，直到全长多肽减去一个氨基酸。本发明的丁酰胆碱酯酶变体的功能片段的一个实例是在530位被截短的变体，野生型丁酰胆碱酯酶中530位为亮氨酸残基。尽管L530截短对于相应全长变体的功能活性没有影响，但是该截短防止四聚体形成，从而增强了该变体的生物活性和药物动力学性质。因此，本发明的丁酰胆碱酯酶变体包括L530截短，其被认为是参比变体的功能片段。
如此处所用的，关于本发明多肽的术语“功能片段”指参比多肽的一部分，该部分能够表现或实施参比多肽的功能活性。表现出功能活性的本发明多肽的功能片段可以具有，例如，本发明多肽的至少6个连续氨基酸残基，本发明多肽的至少8、10、15、20、30或40个氨基酸，并常具有至少50、75、100、200、300、400或更多个氨基酸，直到全长多肽减去一个氨基酸。本领域技术人员根据功能片段的计划用途可以确定本发明多肽的功能片段的氨基酸序列及适宜长度。例如，丁酰胆碱酯酶或者丁酰胆碱酯酶变体的功能片段旨在指丁酰胆碱酯酶或者丁酰胆碱酯酶变体的一部分，该部分仍然保留亲本多肽的一些或全部的代谢转化能力。
如此处所用的，术语“抗体”旨在指应答抗原而产生的多肽，该多肽能够特异结合诱导其形成的抗原。抗体包括，例如，单克隆和多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、双功能或双特异抗体、人源化抗体、人抗体，和互补决定区(CDR)-嫁接的抗体，包括含有CDR或抗原结合序列的化合物，其特异结合本发明的多肽。“抗体片段”指抗体多肽的一部分，其保留完整抗体的部分功能。例如，抗体片段可以保留完整抗体的部分或所有抗原结合能力。抗体片段包括，例如，Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv。用于确定本发明的抗体或抗体片段的结合特异性或排他性的筛选测定法是本领域中熟知的(见Harlow等人(编者)，Antibodies A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratory；Cold Spring Harbor，N.Y.(1988))。
使用本领域中熟知的任一种方法，利用本发明的任一多肽或其免疫原性片段可以产生可用于本发明的抗体。例如，用完全人种系构架区可以制备人源化抗体。此外，免疫原性多肽可以从天然来源、从重组宿主细胞分离，或者可以化学合成。合成这些肽的方法是本领域中公知的，例如，如R.P.Merrifield， J.Amer.Chem.Soc.85：2149-2154(1963)；J.L.Krstenansky，等人， FEBS Lett.211：10(1987)中所描述的。
如此处所用的，术语“喜树碱衍生物”指结构与喜树碱的结构相同或基本上相同并且可以通过丁酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶变体水解的化合物。例如，喜树碱衍生物可被F227A/L286Q变体(SEQ ID NO：6)水解。喜树碱来自中国的一种称为喜树(Camptotheca acuminata Decaisne)的树的树皮。喜树碱衍生物可以通过它们的代谢分解产物抑制DNA拓扑异构酶I。一种水可溶的喜树碱衍生物CPT-11的结构在图2中显示。CPT-11的化学名称是7-乙基-10-[4-(1-哌啶基)-1-哌啶]羰氧基喜树碱。CPT-11还被称为CAMPTOSAR和依立替康。喜树碱的成员包括，例如，拓扑替康、依立替康、9-氨基喜树碱和9-硝基喜树碱，它们是植物生物碱20(S)-喜树碱的类似物。
如此处所用的，术语“拓扑异构酶抑制剂”指可以抑制拓扑异构酶的化合物。一些拓扑异构酶是本领域中公知的。例如，拓扑异构酶抑制剂可以抑制I型拓扑异构酶，如拓扑异构酶I，或II型拓扑异构酶。I型酶通过在DNA的一条链中产生暂时断裂而起作用，II型酶通过导入暂时双链断裂起作用。一些DNA拓扑异构酶可以松弛或除去仅仅DNA上的负超螺旋，而其他DNA拓扑异构酶可以松弛正的和负的超螺旋，还有的可以导入负超螺旋。拓扑异构酶抑制剂的一个实例是SN-38，其结构在图2中显示。
SN-38的化学名是7-乙基-10-羟基喜树碱。在体外，已经表明SN-38比CPT-11的细胞毒性强1000多倍(Pavillard等人， Cancer Chemother Pharmacol.49：329-35(2002))。在人中，认为主要在肝脏中通过两种羧酸酯酶同工型：人羧酸酯酶-1(hCE-1)和人羧酸酯酶-2(hCE-2)的活性发生前药转化(Humerickhouse等人， Cancer Res 60：1189-92(2000))。hCE-2和hCE-1的Km值分别为3.4μM和43μM，hCE-2的催化效率比hCE-1的高60倍。在药物的药理学相关浓度(～1-10μM)，hCE-2将CTP-11转化成SN38的速率比hCE-1的高25-30倍(12)。SN-38可以与拓扑异构酶I和DNA相互作用而形成切割复合体，并防止拓扑异构酶I-介导的DNA单链断裂的再次封闭。该相互作用最终导致双链DNA断裂和细胞死亡，如凋亡。
如此处所用的，术语“喜树碱转化活性”或者喜树碱水解活性旨在指喜树碱衍生物向拓扑异构酶抑制剂的化学转化。例如，在图2中显示了CTP-11向SN-38的转化。可以用此处描述的一些测定法(见实施例II、III，和IV)直接或间接测量转化活性。
如此处所用的，术语“有效量”旨在指可以降低癌症严重性的本发明的丁酰胆碱酯酶变体的量。严重性降低包括，例如，症状、生理学指标、生化标记或代谢指标的抑制或减小。癌症的症状包括，例如，体重降低、疼痛，和器官衰竭。如此处所用的，术语“治疗”旨在表示导致癌症严重性降低。
本发明提供了丁酰胆碱酯酶变体，其具有选自SEQ ID NOS：4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的氨基酸序列，或者该丁酰胆碱酯酶变体的功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：4，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：6，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：8，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：10，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：12，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：14，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：24，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：26，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：28，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：30，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ IDNO：32，或者其功能片段。
本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：34，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：36，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：38，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：40，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：42，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ IDNO：44，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：46，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：48，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：50，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：52，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQID NO：54，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：56，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：58，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：60，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：62，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：64，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：66，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：68，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：70，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ IDNO：72，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：74，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：76，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：78，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：80，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQID NO：82，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：84，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：86，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：88，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：90，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：92，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：94，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：96，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：98，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ IDNO：100，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：102，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：104，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：106，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：108，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQID NO：110，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：112，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：114，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：116，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ IDNO：118，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：120，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：122，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：124，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：126，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQID NO：128，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：130，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：132，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：134，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ IDNO：136，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：138，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：140，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：142，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：144，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQID NO：146，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：148，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：150，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：152，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ IDNO：154，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：156，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：158，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：160，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：162，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQID NO：164，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：166，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：168，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：170，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ IDNO：172，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：174，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：176，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：178，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：180，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQID NO：182，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：184，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：186，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：188，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ IDNO：190，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：192，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：194，或者其功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中氨基酸含有SEQ ID NO：196，或者其功能片段。
本发明提供了丁酰胆碱酯酶变体，其喜树碱转化活性与丁酰胆碱酯酶的相比增加了3000倍，或者该变体的功能片段。本发明还提供了丁酰胆碱酯酶变体，其喜树碱转化活性与丁酰胆碱酯酶的相比增加了至少4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300-倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3500倍或以上，或者该变体的功能片段。
本发明还提供了编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，该核酸具有选自SEQID NOS：3、5、7、9、11、13、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、和195的核酸序列，或者其片段。此外，本发明提供了编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸或者其功能片段，其中该丁酰胆碱酯酶变体具有选自SEQ ID NOS：4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的氨基酸序列。此外，本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：3的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：5的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：7的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：9的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：11的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：13的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：23的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：25的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：27的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：29的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：31的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：33的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：35的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：37的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：39的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：41的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：43的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：45的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：47的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：49的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：51的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：53的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：55的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：57的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：59的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：61的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：63的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：65的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：67的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：69的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：71的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：73的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：75的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：77的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：79的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：81的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：83的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：85的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：87的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：89的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：91的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：93的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：95的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：97的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：99的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：101的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQID NO：103的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：105的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：107的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：109的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：111的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：113的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：115的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：117的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：119的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：121的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：123的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：125的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：127的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：129的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：131的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：133的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：135的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：137的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：139的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：141的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：143的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：145的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：147的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：149的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：151的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：153的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：155的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：157的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：159的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：161的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：163的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：165的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：167的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：169的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：171的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：173的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：175的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：177的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：179的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：181的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：183的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：185的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：187的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：189的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：191的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：193的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。本发明还提供了含有核酸序列SEQ ID NO：195的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸，或者其功能片段。
胆碱酯酶是普遍存在的多态性B型羧化酶，能够水解神经递质乙酰胆碱和各种含有酯的化合物。两种主要的胆碱酯酶是乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。丁酰胆碱酯酶催化许多胆碱酯的水解，如下所示：
Figure C20038010508000231
丁酰胆碱酯酶优选使用丁酰胆碱和苯甲酰胆碱作为底物。丁酰胆碱酯酶在哺乳动物血浆、肝脏、胰腺、肠粘膜和中枢神经系统的白质中发现。编码丁酰胆碱酯酶的人基因位于3号染色体并且公知丁酰胆碱酯酶的30种以上的天然发生的基因变异。丁酰胆碱酯酶多肽长574个氨基酸并且被1,722个碱基对的编码序列编码。三种天然发生的丁酰胆碱酯酶变异是被称为A变体、J变体和K变体的非典型等位基因。A变体具有D70G突变并且不常见(0.5％等位基因频率)，而J变体具有E497V突变并且仅在一个家族中发现。K变体具有核苷酸1615位的点突变，其导致A539T突变并且在高加索人中等位基因频率为约12％。
除了丁酰胆碱酯酶的天然发生的人变异之外，还公知许多物种变异。猫丁酰胆碱酯酶的氨基酸序列与人丁酰胆碱酯酶的具有88％同一性。在不同的70个氨基酸中，三个位于活性部位沟中并且被称为A277L、P285L和F398I。类似地，马丁酰胆碱酯酶与人丁酰胆碱酯酶相比在活性部位具有三个氨基酸差异，它们是A277V、P285L和F398I。大鼠丁酰胆碱酯酶的氨基酸序列在活性部位沟中含有6个氨基酸差异，它们是A277K、V280L、T284S、P285I、L286R和V288I。
Xie等人，M olecular Pharmacology 55：83-91(1999)以前已经描述了天然发生的人丁酰胆碱酯酶变异、物种变异以及重组制备的突变。可以通过本领域中熟知的各种方法制备本发明的丁酰胆碱酯酶变体。如果希望，可以实施随机诱变以制备本发明的丁酰胆碱酯酶变体。备选地，如此处公开的，可以基于从此处描述的结构、生化和建模方法得到的信息，集中在离散区域实施随机诱变，以靶定被预测对催化活性重要的那些氨基酸。例如，可以使用丁酰胆碱酯酶活性部位中底物的分子建模基于酶和其底物之间更好的匹配来预测使得具有更高催化效率的氨基酸改变。
此外，可以使用分子建模预测减小酶和底物之间空间位阻的氨基酸改变。基于以可卡因作为底物的实验，预测对水解活性重要的残基包括8个疏水性沟残基和催化性三联体残基。此外，可以理解在制备具有水解活性的丁酰胆碱酯酶变体过程中，通常不改变对丁酰胆碱酯酶变体的功能性结构重要的氨基酸残基，它们包括与链内二硫键有关的半胱氨酸残基65Cys-92Cys、252Cys-263Cys、400Cys-519Cys。
丁酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶变体的诱变后，可以通过本领域中熟知的方法实施丁酰胆碱酯酶变体的纯化和功能表征。
本发明的丁酰胆碱酯酶变体表现出喜树碱转化或水解活性。如此处公开的，本发明的丁酰胆碱酯酶变体可以具有增强的喜树碱转化或水解活性并且可用于治疗癌症。与本发明的丁酰胆碱酯酶变体相比具有微小改变的多肽可以被本发明包括，只要其保留等价喜树碱转化或水解活性。此外，本发明类似地包括丁酰胆碱酯酶变体的功能片段，只要该片段仍然保留亲本丁酰胆碱酯酶变体的一些或所有喜树碱转化或水解活性。类似地，本发明包括核酸的功能片段，其编码本发明的丁酰胆碱酯酶变体的功能片段。
可以通过重组方法制备本发明的丁酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶变体的功能片段，这些方法包括表达编码丁酰胆碱酯酶变体或其功能片段的核酸分子，然后通过此处描述的常规生化方法分离该变体或其功能片段。可以理解通过酶或化学切割全长丁酰胆碱酯酶变体也可以制备功能片段。酶和化学切割的方法和所得肽片段的纯化方法是本领域中熟知的(见，例如，Deutscher， Methods in Enzvmology，卷182，″蛋白质纯化指南，″(Guide toProtein Purification)San Diego：Academic Press，Inc.(1990)，其在此处被并入作为参考)。
此外，通过化学合成可以产生丁酰胆碱酯酶变体的功能片段。如果希望，可以修饰这些分子以包括D-立体异构体、非天然发生的氨基酸和氨基酸类似物和模拟物以优化它们的功能活性、稳定性或生物利用度。修饰的氨基酸和它们的用途的实例在Sawyer， Peptide Based Drug Design，ACS，Washington(1995)和Gross和Meienhofer， The Peptides：Analysis， Synthesis，Biology，Academic Press，Inc.，New York(1983)中给出，这两篇文献都在此处被并入作为参考。
如果希望，可以制备并以此处描述的测定法检验丁酰胆碱酯酶变体的随机片段。可以制备与本发明的参比丁酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶变体的氨基酸序列相比具有任何希望的边界和修饰的片段。备选地，可以利用通过此处描述的结构、生化和建模方法得到的可利用信息，仅仅制备丁酰胆碱酯酶变体的这样一些片段，这些片段可能保留亲本变体的喜树碱转化或水解活性。如此处描述的，预测对喜树碱转化或水解活性重要的残基包括8个疏水性沟残基(gorge residues)和催化性三联体残基(triad residues)。此外，对丁酰胆碱酯酶变体的功能性结构重要的氨基酸残基包括与链内二硫键有关的半胱氨酸残基65Cys-92Cys、252Cys-263Cys、和400Cys-519Cys。功能片段可以包括非肽结构元件，这些非肽结构元件模拟参比变体的结构上或功能上重要的残基。
本发明的丁酰胆碱酯酶变体还包括融合蛋白，其通过将丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段与异源蛋白，如治疗蛋白连接得到，并包括编码这些融合蛋白的核酸的融合构建体。可以与丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段杂交的核酸片段可用作例如，杂交探针并且也被本发明包括。
本发明还提供了含有抗体或抗体片段的丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段。本发明的丁酰胆碱酯酶变体可以与抗体或抗体片段融合。例如，本发明的丁酰胆碱酯酶变体可以与结合肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段融合。这样，丁酰胆碱酯酶变体可被直接递送到肿瘤，这可导致副作用数目降低。已知一些抗原在肿瘤细胞中过表达或者仅在肿瘤细胞中表达。这些肿瘤相关的抗原包括，例如，Lewis Y(Siegall，C.， Semin.Cancer Biol.6：289-295(1995))、癌胚抗原(CEA)(Watine等人， Dis.Colon Rectum 44：1791-1799(2001))、tetraspanin L6(Kaneko等人， Am.J.Gastroenterol.96：3457-3458(2001))、17-1A(Indar等人， J.R.Coll.Surg.Edinb.47：458-474(2002))、mucin-1(MUC-1)(Segal-Eiras和Croce， Allerg.Immunopath.25：176-181(1997))、表皮生长因子受体(EGFR)(Bookman，M.， Semin. Oncol.25：381-396(1998))、癌抗原125(CA 125)(Cherry和Vacchiano，Semin.Oncol.Nurs.18：167-173(2002))、p97(Srivastava，P.， Curr.Opin. Immunol.3：654-658(1991))、黑素瘤抗原基因(MAGE)(Barker和Salehi，J.Neurosci.Res.67：705-712(2002))、CD20(Kosmas等人， Leukemia 16：2004-2015(2002))、CD33(Countouriotis等人， Stem Cells 20：215-229(2002))、神经节苷脂GD2(Ragupathi，G.， Cancer Immunol.Immunother.43：152-157(1996))，和神经节苷脂GD3(Ragupathi，G，如前(1996))。
本发明的丁酰胆碱酯酶变体可以与内化抗体或者抗体片段或者非内化抗体或者抗体片段融合。当与非内化抗体或者抗体片段融合时，丁酰胆碱酯酶变体可以通过结合到经历内化的细胞表面多肽上而被内化。例如，本发明的丁酰胆碱酯酶变体可以与针对经历内化的受体的抗体融合。
本发明提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中抗体或抗体片段特异结合细胞表面受体。在一个实施方案中，本发明提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中抗体或抗体片段特异结合表皮生长因子受体(EGFR)。公知EGFR在一些肿瘤细胞类型，例如，乳腺癌细胞中被上调。在各种相关的实施方案中，本发明提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中抗体或抗体片段含有选自接头变体、铰链变体，和合成的接头变体的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中抗体或抗体片段含有SEQ ID NOS：18和20中所示的氨基酸序列。在图7和图8中显示了使用模型抗体得到的ELISA结果。
在另一实施方案中，本发明提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中抗体或抗体片段特异结合CD20。CD20是B细胞表面上一种未糖基化的磷蛋白。CD20-抗体复合体不内化，从而允许细胞表面结合的免疫球蛋白与效应细胞或补体相互作用更长时间。在一个实施方案中，本发明提供了丁酰胆碱酯酶变体，其中抗体或抗体片段含有SEQ ID NOS：198中所示的氨基酸序列，并且特异结合CD20。公知CD20在一些肿瘤细胞类型，例如，B细胞淋巴瘤，如非何杰金氏淋巴瘤以及各种自身免疫病症中被上调。
使用称为抗体-定向的酶前药疗法(ADEPT)(Jung，M.， Mini Rev. Med.Chem.1：399-407(2001)；Bagshawe，K.D.， Mol.Med.Today 1：424-431(1995)；和Senter，P.D.， FASEB J 4：188-193(1990))的方法，丁酰胆碱酯酶变体和抗体或抗体片段之间的融合可用于靶定的、肿瘤细胞特异的、丁酰胆碱酯酶介导的毒性。也可以使用一种相关方法，其被称为病毒定向的酶前药疗法(VDEPT)。对于用于靶定的肿瘤细胞特异的丁酰胆碱酯酶介导的毒性，丁酰胆碱酯酶变体和抗体或抗体片段之间的融合的一个实例为SEQ ID NO：200的氨基酸序列及其相应核苷酸序列(显示于SEQ ID NO：199)，该序列相应于抗-CD20 VH-CH1铰链cys L530 BChE.4-1重链构建体。指定为SEQ ID NO：202的丁酰胆碱酯酶变体是一种融合蛋白，其含有由抗-CD20抗体可变重链区与含有半胱氨酸的铰链区组成的重链和指定为SEQ ID NO：180的丁酰胆碱酯酶变体的L530功能片段(SEQ ID NO：201)，该功能片段掺入4-1变体氨基酸(H77F/F227A/P285N/V331 A)。VDEPT使用病毒载体递送酶，诸如本发明的丁酰胆碱酯酶变体。使用这些方法，酶的选择性表达可将肿瘤细胞中无毒或具有温和毒性的前药有效活化成高度毒性的代谢产物，导致抗肿瘤活性增强和治疗指数提高。为了使这些方法成功，需要酶具有高度活性，例如，可以使用本发明的丁酰胆碱酯酶变体。
本发明的丁酰胆碱酯酶变体来自如实施例1中公开的文库。可以通过本领域中熟知的各种方法制备足够多样化以致含有具有增强的喜树碱转化或水解活性的丁酰胆碱酯酶变体的文库。本领域中技术人员将知道对于计划的目的，怎样的大小和多样性是必需的或足够的。例如，可以制备丁酰胆碱酯酶变体文库，其在约573个氨基酸位置的每个位置具有参比丁酰胆碱酯酶中没有发现的19种氨基酸之每一种，并在所得变体文库中筛选具有增强的喜树碱水解活性的丁酰胆碱酯酶变体。
备选地，可以使用如此处描述的丁酰胆碱酯酶的结构、生化和建模信息制备聚焦文库(focused library)。可以理解，与确定或预测对喜树碱的转化或水解活性或者丁酰胆碱酯酶的结构功能重要的残基或区域有关的任何信息，都可用于设计具有增强的喜树碱水解活性的本发明丁酰胆碱酯酶变体的聚焦文库。从而，组成本发明的丁酰胆碱酯酶变体文库的丁酰胆碱酯酶变体可以含有位于如下区域的氨基酸位置上的氨基酸改变，所述区域被确定或预测对喜树碱转化或水解活性是重要的。丁酰胆碱酯酶变体的聚焦文库可能是所希望的，因为其通过将氨基酸改变靶定到被确定或预测对活性重要的区域而显著减少了为了鉴定活性增强的丁酰胆碱酯酶变体而需要筛选的变体数。
可以通过本领域中公知的各种方法确定或预测对丁酰胆碱酯酶的喜树碱转化或水解活性重要的区域，并且这些区域可用于聚焦合成丁酰胆碱酯酶变体文库。具有高度序列相似性和生化上类似的催化性质的相关酶，例如，乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶，可提供有关对丁酰胆碱酯酶的催化活性重要的区域的信息。例如，结构建模可以揭示酶的活性部位，该活性部位是由通常在一级结构上相互分开的氨基酸残基形成的三维结构，如裂缝、沟或裂隙。因此，构成丁酰胆碱酯酶中对喜树碱转化或水解活性重要的区域的氨基酸残基可以包括沿着活性部位沟定位的残基。关于丁酰胆碱酯酶的结构建模的描述，见例如，Harel等人， Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89：10827-10831(1992)和Soreq等人，Trends Biochem.Sci.17(9)：353-358(1992)，它们在此处被并入作为参考。
除了丁酰胆碱酯酶的结构建模，当制备丁酰胆碱酯酶变体的聚焦文库时，生化数据也可用于确定或预测对喜树碱转化或水解活性重要的丁酰胆碱酯酶的区域。关于这一点，对喜树碱转化或水解活性改变的天然发生的丁酰胆碱酯酶变体的表征可用于鉴定对丁酰胆碱酯酶的催化活性重要的区域。类似地，定点诱变研究可以提供关于催化上重要的氨基酸残基的数据，综述见例如Schwartz等人， Pharmac.Ther.67：283-322(1992)，其被并入作为参考。
为了产生本发明的丁酰胆碱酯酶变体文库，可单独或联合使用不同类型的信息以确定或预测对喜树碱转化或水解活性重要的丁酰胆碱酯酶的氨基酸序列区域。例如，将基于结构建模的信息和生化数据联合，确定对喜树碱转化或水解活性重要的丁酰胆碱酯酶的氨基酸序列区域。因为可以联合通过各种方法得到的信息以预测催化活性区，所以本领域中技术人员将明白区域自身是近似性的而不是严格限制的。因此，丁酰胆碱酯酶文库可以含有这样的丁酰胆碱酯酶变体，这些变体具有位于经确定或预测对喜树碱转化或水解活性重要的区域之外的氨基酸改变。类似地，本发明的丁酰胆碱酯酶变体可以具有位于经确定或预测对喜树碱转化或水解活性重要的区域之外的氨基酸改变。此外，本发明的丁酰胆碱酯酶变体可以具有任何其他修饰，只要该修饰不显著改变本发明变体的喜树碱转化或水解活性。还可以理解基于所用的预测方法，经确定或预测对喜树碱转化或水解活性重要的区域的数目可以变化。
一旦通过适于确定对喜树碱水解重要的区域的任一方法或者方法联合鉴定了多个区域，那么每个区域都可以在一些或所有氨基酸位置随机化以产生变体文库，该变体文库将在每个区域内一个或多个位置上含有野生型氨基酸加上其他19种天然发生的氨基酸中的一种或多种。在表1中显示了本发明提供的为丁酰胆碱酯酶变体的聚焦文库所选的7个丁酰胆碱酯酶氨基酸序列区域。
表1.经预测对催化效率重要的丁酰胆碱酯酶区域
  区域   位置   长度
  1   68-82   15
  2   110-121   12
  3   194-201   8
  4   224-234   11
  5   277-289   13
  6   327-332   6
  7   429-442   14
制备含有各种类型分子，如肽、类肽(peptoid)、肽模拟物(peptidomimetise)的不同群体的文库是本领域中熟知的(见，例如，Ecker和Crooke， Biotechnology 13：351-360(1995)，和Blondelle等人 Trends Anal.Chem.14：83-92(1995)，和其中引用的参考文献，它们的每一篇都在此处被并入作为参考；还见，Goodman和Ro， 用于药物设计的肽模拟物，″Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery″卷1(编者M.E.Wolff；John Wiley & Sons 1995)，803-861页，和Gordon等人， J.Med. Chem.37：1385-1401(1994)，它们的每一篇都在此处被并入作为参考)。当分子是肽、蛋白质或其片段时，该分子可以体外直接产生或者从核酸表达，该核酸可以在体外产生。合成肽化学的方法是本领域中熟知的。
例如，通过构建编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸表达文库可以产生丁酰胆碱酯酶变体文库。产生这些文库的方法是本领域中熟知的(见，例如，Sambrook等人， Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press 1989)，其在此处被并入作为参考)。编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸文库可以由DNA、RNA或其类似物组成。例如，通过化学合成RNA分子可以构建含有RNA分子的文库。
可以通过用户所希望的任一种方法产生编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸文库。本领域技术人员将知道可以使用那种方法产生编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸文库。例如，使用本领域中技术人员熟知的方法(MolecularCloning：A Laboratory Manual，Sambrook等人，编者，Cold Spring HarborPress，Plainview，NY(1989))通过对编码丁酰胆碱酯酶的核酸的诱变可以产生丁酰胆碱酯酶变体。可以将编码本发明丁酰胆碱酯酶变体的核酸的文库随机化以获得足够多样性而含有在丁酰胆碱酯酶的每个氨基酸位置上编码每一种可能的天然氨基酸的核酸。备选地，可以制备核酸文库，使得其含有仅在如下位置的每个氨基酸处编码每种可能的天然氨基酸的核酸，这些位置位于被预测或确定对于喜树碱转化或水解活性是重要的丁酰胆碱酯酶区域中。
使用例如，定点诱变(见Wu(编者)， Meth.In Enzvmol.卷217，SanDiego：Academic Press(1993)；Higuchi，″重组PCR″，Innis等人(编者)，PCR Protocols，San Diego：Academic Press，Inc.(1990)，每一篇都在此处被完整并入作为参考)可以将一个或多个突变导入编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸分子以产生修饰的核酸分子。这些诱变可以用于导入特定的、所希望的氨基酸变化。从而，可以制备不同文库，这些文库在一个或多个被确定对于喜树碱转化或水解活性是重要的区域中含有氨基酸改变，还可以制备在一些或所有这样的区域中含有突变的单一文库。
使用寡核苷酸-定向诱变可以有效合成和表达丁酰胆碱酯酶变体文库，如以前被Wu等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：6037-6042(1998)；Wu等人， J.Mol.Biol.，294：151-162(1999)；和Kunkel， Proc.Natl.Acad.Sci. USA，82：488-492(1985)所描述的，这些文献在此处被并入作为参考。寡核苷酸-定向诱变是系统地导入突变的一种熟知且有效的方法，该方法独立于突变的表型并且因此理想地适用于蛋白质工程的定向进化方法。为了实施寡核苷酸-定向诱变，将编码所希望的突变的核酸的文库与野生型序列的含有尿嘧啶的单链模板杂交。该方法学是灵活的，允许导入精确诱变而不使用限制酶，并且如果使用基于密码子的诱变来合成寡核苷酸，该方法是相对廉价的。
基于密码子的合成或诱变是本领域中熟知的一种方法，其用于避免遗传冗余而快速有效地在已知氨基酸序列中产生大量改变或者用于产生多样的随机序列群体。该方法是美国专利号5,264,563和5,523,388的主题并且也在Glaser等人， J.Immunology 149：3903-3913(1992)中描述。简言之，在单独的反应容器中进行偶联反应以例如，对规定氨基酸的遗传密码的所有20种密码子进行随机化，并通过将每个反应容器的产物混合以实现特定密码子位置的随机化。混合后，随机化的反应产物相应于编码所有20种氨基酸的等量混合物的密码子，之后将混合物分到单独的反应容器中以在下一个位置合成每个随机化密码子。如果希望，可以用含有等份的20种密码子的20个容器实现所有20种氨基酸的相等频率。从而，可以利用该方法产生丁酰胆碱酯酶的全部序列的随机文库，或者区域的聚焦文库，其中所述区域被确定或预测为对于喜树碱转化或水解活性是重要的。
此外，还存在上面合成方法的变体方案，其包括，例如，在所希望的位置合成预定的密码子和在一个或多个密码子位置上偏向合成预定序列，如Wu，等人，如前引文，1998描述的。偏向合成包括使用两个反应容器，其中在一个容器中合成预定的或亲本密码子，在第二容器中合成随机密码子序列。第二容器可被分成多个反应容器，例如上面描述的用于在特定位置合成规定完全随机氨基酸的密码子的反应容器。备选地，诸如通过NNG/T核苷酸或NNX/X的偶联，其中N是所有四种核苷酸的混合物，可以在第二个反应容器中合成简并密码子群体。合成预定的和随机的密码子后，将两个反应容器中的反应产物混合并重新分到另外的两个容器中以在下一个密码子位置进行合成。
可以类似使用用于产生各种变体序列的上述基于密码子的合成方法的改良方案来产生此处描述的丁酰胆碱酯酶变体文库。该改良方案基于上述两容器方法，其使合成偏向于亲本序列并允许用户将变体分成含有规定数目的如下密码子位置的群体，其中所述密码子位置具有随机密码子改变。
简言之，持续在每个密码子位置的合成后将反应容器分成两个新容器，实施该合成。分开后，从第二个容器开始，将来自每一连续的反应容器对的反应产物混合。该混合使得含有相同数目的具随机改变的密码子位置的反应产物混合。将第一个和最后一个容器的产物和来自每一连续反应容器对的新近混合的产物分开并再分到两个新容器中，以继续合成。在一个新容器中，合成亲本密码子，在另一容器中，合成随机密码子。例如，在第一个密码子位置的合成要求在第一个反应容器中合成亲本密码子和在第二个反应容器中合成随机密码子。对于第二个密码子位置的合成，头两个反应容器的每一个被分成两个容器，产生两对容器。对于每一对，在一个容器中合成亲本容器并在第二个密码子中合成随机密码子。当线性排列时，将第二个和第三个容器中的反应产物混合从而将在单个密码子位置具有随机密码子序列的那些产物合并。该混合还将产物群体减小到3个，这三个群体是下一轮合成的起始群体。类似地，对于第三、第四和每个剩余的位置，将前一位置的每个反应产物群体分开并合成亲本和随机密码子。
按照上面基于密码子合成的方法的改良方案，可以方便地分开在1个、2个、3个和4个等位置含有随机密码子改变的群体并基于个体的需要使用。此外，该合成方案还允许相对于亲本序列富集随机序列群体，因为仅含有亲本序列合成的容器被类似地与随机密码子合成分开。
该方法可用于合成编码如下丁酰胆碱酯酶变体的核酸文库，这些丁酰胆碱酯酶变体在一个或多个被预测对于喜树碱转化或水解活性是重要的区域中具有氨基酸改变。
备选地，使用基因改组也可以产生编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸文库。基因改组或DNA改组是一种定向进化方法，其通过重组产生多样性(见，例如，Stemmer， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370：389-391(1994)；Crameri等人，Nature 391：288-291(1998)；Stemmer等人，美国专利号5,830,721，1998年11月3日颁发)。基因改组或DNA改组是使用所选突变基因池的体外同源重组的一种方法。例如，可以使用特定基因的点突变体池。例如，使用DNA酶将这些基因随机片段化，并通过PCR再装配。如果希望，可以使用来自不同生物的同源基因实施DNA改组以产生多样性(Crameri等人，如前，1998)。如果希望，可以进行多轮片段化和再装配。所得再装配的基因构成丁酰胆碱酯酶变体的文库，这些变体可用于本发明的组合物和方法。
可以在各种真核细胞中表达编码丁酰胆碱酯酶变体的本发明核酸文库。例如，可以在哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞，和非酵母真菌细胞中表达核酸。用于表达本发明的编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸文库的哺乳动物细胞系包括，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)、人293T和人NIH 3T3细胞系。通过稳定的或暂时的细胞转染可以实现本发明编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸文库的表达(见，实施例III，表3)。
在基因组中相同位点掺入变异核酸或者异源核酸片段可以产生等基因细胞系，这些细胞系仅在特定变体或异源核酸的表达上不同。单个位点上的掺入使得在基因组中多个位点整合的位置效应最小，该位置效应影响核酸编码的mRNA的转录，并且使得由于每个细胞掺入多个拷贝或者表达一种以上的核酸种类而造成的复杂性最小。本领域中公知的用于将变异的或异源的核酸靶向基因组中的特定位置的技术包括，例如，同源重组、逆转录病毒靶定和重组酶介导的靶定。
将变异的或异源的核酸靶向基因组中的单个位点的一种方法，使用Cre重组酶将外源DNA靶向插入真核生物基因组中含有特定重组序列的位点(Sauer和Henderson， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5166-5170(1988)；Fukushige和Sauer， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：7905-7909(1992)；Bethke和Sauer， Nuc.Acids Res.，25：2828-2834(1997))。除了Cre重组酶，还可以使用Flp重组酶使外源DNA的插入靶向基因组中特定位置(Dymecki， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：6191-6196(1996))。可以理解本发明方法中可以使用位点-特异的重组酶和相应重组位点的任何组合以将核酸靶向基因组中的特定位点。
可以在一个载体上编码适宜的重组酶，该载体与含有编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸的载体共转染。备选地，重组酶的表达元件可被掺入到表达编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸的相同载体中。除了编码重组酶的核酸与编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸同时转染，还可以用编码重组酶的载体转染细胞，并可以选择表达重组酶的细胞。可以用编码丁酰胆碱酯酶变体的核酸随后转染稳定表达重组酶的细胞。
Cre重组酶介导的精确的定点DNA重组可用于产生稳定的哺乳动物转化体，其含有单一拷贝的编码丁酰胆碱酯酶变体的外源DNA。如下面例证的，使用改良的双lox策略(doublelox strategy)可以实质性地增加Cre-介导的靶定事件的频率。双lox策略是基于如下观察：lox位点的核心区域内的某些核苷酸变化可以改变Cre-介导的重组的位点选择特异性而对重组效率几乎没有影响(Hoess等人， Nucleic Acids Res.14：2287-2300(1986))。靶定载体和宿主细胞基因组中loxP和改变的loxP位点(称为lox 511)的掺入导致通过双交换事件的位点-特异的重组。双lox方法比单交换插入重组将位点特异的整合体的回收增加20倍，增加位点-特异的重组的绝对频率，从而其超过了非正常重组的频率(Bethke和Sauer， Nuc.Acids Res.，25：2828-2834(1997))。
丁酰胆碱酯酶变体文库在哺乳动物细胞系中表达后，可以对随机选择的克隆测序并筛选增加的催化活性。对所选克隆测序的方法是本领域中技术人员熟知的并且例如，在Sambrook等人，如前，1992，和Ausubel等人，如前，1998中描述。选择测量丁酰胆碱酯酶变体的喜树碱转化或水解活性的适宜方法取决于各种因素，例如，可以利用的丁酰胆碱酯酶变体的量。例如，通过分光光度法，通过基于微量滴定的测定法，使用多克隆抗丁酰胆碱酯酶抗体以均一地捕获丁酰胆碱酯酶变体和通过高效液相层析(HPLC)可以测量丁酰胆碱酯酶变体的喜树碱转化或水解活性。
通过用本领域中公知的和此处描述的测定法确定催化效率，并比较所测催化效率可以确定与丁酰胆碱酯酶相比丁酰胆碱酯酶变体的增强的喜树碱转化或水解活性。例如，用乙酸邻硝基苯基酯测定法(见实施例II)、CPT-11向SN-38转化的HPLC测定法(见实施例III)、或细胞毒性测定法(见实施例IV)可以确定丁酰胆碱酯酶变体的喜树碱转化或水解活性。为了确保已经彻底筛选了丁酰胆碱酯酶变体文库，可以继续筛选每个文库直到编码相同丁酰胆碱酯酶氨基酸改变的克隆已经多次被鉴定。
表达具有增强的喜树碱水解活性的丁酰胆碱酯酶变体的克隆可用于建立适于纯化大量丁酰胆碱酯酶的大规模培养物。可以将目标丁酰胆碱酯酶变体克隆到表达载体中并用于转化细胞系，并可以随后扩大细胞系。本领域技术人员将知道哪种表达载体适于具体应用。可以将表现出增强的喜树碱转化或水解活性的丁酰胆碱酯酶变体克隆到例如，表达载体中，该表达载体携带赋予对特定化学剂抗性的基因以允许所转染细胞的阳性选择。适于转染例如，哺乳动物细胞系的表达载体可以含有启动子，如用于在哺乳动物细胞中选择的巨细胞病毒(CMV)启动子。如此处所描述的，可将丁酰胆碱酯酶变体克隆到哺乳动物表达载体并瞬时转染到人293T细胞中。适于表达丁酰胆碱酯酶变体的表达载体是本领域中熟知的和通过商业途径可得到的。
可以选择并试验表达丁酰胆碱酯酶变体的克隆的喜树碱转化或水解活性。可以将携带表现出增强的喜树碱转化或水解活性的克隆的细胞通过常规细胞培养系统扩大以产生更大量的目标丁酰胆碱酯酶变体。可以收获浓缩的重组丁酰胆碱酯酶变体并通过本领域中熟知的和例如，由Masson等人 Biochemistry 36：2266-2277(1997)(其在此处被并入作为参考)描述的方法纯化重组丁酰胆碱酯酶变体。
具有增强的血清半寿期的丁酰胆碱酯酶变体可用于检验受试者中丁酰胆碱酯酶变体或者治疗个体中癌症。用以增加丁酰胆碱酯酶变体的血清半寿期的有用方法包括，例如，将丁酰胆碱酯酶变体转化成四聚体；将合成的和天然的聚合物，如聚乙二醇(PEG)和葡聚糖共价连接到截短的丁酰胆碱酯酶变体；脂质体制剂；或将酶作为Ig融合蛋白表达。如此处所公开的，通过将宿主细胞系以COLQ基因共转染以及向所转染细胞的培养基中加入聚-L-脯氨酸可以实现丁酰胆碱酯酶变体向四聚体的转化。用于增加丁酰胆碱酯酶变体的血清半寿期的这些方法和本领域中公知的其他方法可以用于检验动物受试者中丁酰胆碱酯酶变体或者治疗个体中癌症。
本发明提供了通过将喜树碱衍生物与选自SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段在允许喜树碱衍生物向拓扑异构酶抑制剂转化的条件下接触，将喜树碱衍生物转化成拓扑异构酶抑制剂的方法。在一个实施方案中，拓扑异构酶抑制剂是SN-38。在另一实施方案中，喜树碱衍生物是CTP-11。在一个实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体与丁酰胆碱酯酶相比表现出转化能力增加2倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加10倍或以上，或与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加50倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加100倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加200倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加300倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加400倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加500倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加1000倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加5000倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加2000倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加3000倍或以上。
在一个实施方案中，本发明提供了通过将喜树碱衍生物与具有如SEQID NOS：2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、或196所示序列或者其功能片段的丁酰胆碱酯酶变体在允许喜树碱衍生物向拓扑异构酶抑制剂转化的条件下接触，将喜树碱衍生物转化成拓扑异构酶抑制剂的方法。例如，在一个实施方案中，本发明提供了通过将喜树碱衍生物与具有如SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列或者其功能片段的丁酰胆碱酯酶变体在允许喜树碱衍生物向拓扑异构酶抑制剂转化的条件下接触，将喜树碱衍生物转化成拓扑异构酶抑制剂的方法。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在再一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在再一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ IDNO：10中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQID NO：24中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：28中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：30中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：34中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：36中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：38中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ IDNO：40中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：42中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：44中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQID NO：46中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：48中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：50中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：54中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：56中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：58中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：60中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ IDNO：62中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：64中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：66中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQID NO：68中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：70中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：72中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：74中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：76中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：78中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：80中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：82中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ IDNO：84中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：86中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：88中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQID NO：90中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：92中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：94中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：96中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：98中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：100中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：102中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：104中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ IDNO：106中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：108中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：110中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：112中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：114中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：116中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：118中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：120中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ IDNO：122中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：124中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：126中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：128中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：130中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：132中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：134中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：136中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ IDNO：138中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：140中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：142中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：144中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：146中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：148中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：150中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：152中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ IDNO：154中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：156中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：158中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：160中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：162中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：164中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：166中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：168中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ IDNO：170中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：172中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：174中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：178中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：180中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：182中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：184中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：186中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ IDNO：188中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：190中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：192中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：194中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。在另一实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体具有SEQ ID NO：196中所示的氨基酸序列，或者其功能片段。
本发明还提供了通过将紫杉醇前药与选自SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段在允许紫杉醇前药向紫杉醇转化的条件下接触，将紫杉醇前药转化成紫杉醇的方法。在一个实施方案中，丁酰胆碱酯酶变体与丁酰胆碱酯酶相比表现出转化能力增加2倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加10倍或以上，或与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加50倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加100倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加200倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加300倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加400倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加500倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加1000倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加5000倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加2000倍或以上，与丁酰胆碱酯酶相比转化能力增加3000倍或以上。
紫杉醇前药诸如紫杉醇-2-乙基碳酸酯(PC)在人类癌症的啮齿动物模型中具有显著水平的抗肿瘤活性。紫杉醇(也称作TAXOL)最初从太平洋紫杉(Pacific yew)树的树皮中分离并且已经被用于治疗一些癌症，它们包括，例如，乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌和卡波西肉瘤。这类化疗剂的作用机理是稳定微管蛋白。血清羧酸酯酶诸如大鼠羧酸酯酶已经被证明可以将紫杉醇前药，如PC，转化成紫杉醇。这些血清羧酸酯酶增强了PC对肺癌和黑素瘤细胞系的细胞毒性(Senter等人， Cancer Res.56：1471-1474(1996))。本发明的丁酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶变体可用于将紫杉醇前药如PC转化成活性药物用以治疗癌症。
如此处描述的，表现出增强的喜树碱转化或水解活性的丁酰胆碱酯酶变体可以在体外以及体内转化或水解底物，如喜树碱衍生物或紫杉醇。例如，通过将底物加入从丁酰胆碱酯酶变体文库克隆的培养物分离的上清液，可以在体外将喜树碱衍生物丁酰胆碱酯酶底物与本发明的丁酰胆碱酯酶变体接触。备选地，可以在与底物接触前纯化丁酰胆碱酯酶变体。本领域技术人员可以容易地确定适于底物如喜树碱衍生物底物与本发明的丁酰胆碱酯酶变体接触的介质条件。如下面描述，使用捕获剂，如抗体可以将来自培养上清液的丁酰胆碱酯酶变体固定，之后与底物接触，这使得可以除去培养上清液组分并能够使固定的变体与底物在无污染物存在下接触。本发明的丁酰胆碱酯酶变体与底物接触后，可以测量变体酶的活性。例如，本发明的丁酰胆碱酯酶变体与喜树碱衍生物接触后，可以通过本领域中公知的和此处描述的各种方法，如高效液相层析或细胞毒性测定法测量喜树碱转化或水解活性。
本发明还提供了通过对个体使用有效量的选自SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、和196的丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段来治疗癌症的方法，该丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段表现出与丁酰胆碱酯酶相比将喜树碱衍生物转化成拓扑异构酶抑制剂的能力增加。在一个实施方案中，癌症是转移性结肠癌。在另一实施方案中，癌症是卵巢癌。在另一实施方案中，癌症是肺癌，例如，小细胞肺癌或非小细胞肺癌。在再一个实施方案中，癌症是非何杰金氏淋巴瘤。在另一实施方案中，癌症是中枢神经系统癌。
本发明还提供了通过对个体施用有效量的选自SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、200和201的丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段来治疗癌症的方法，该丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段表现出与丁酰胆碱酯酶相比将CPT-11转化成拓扑异构酶抑制剂的能力增加。在一个实施方案中，拓扑异构酶抑制剂是SN-38。
本发明还提供了通过对个体施用有效量的选自SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、200和201的丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段来治疗癌症的方法，该丁酰胆碱酯酶变体或者其功能片段表现出与丁酰胆碱酯酶相比将紫杉醇前药转化成紫杉醇的能力增加。在一个实施方案中，癌症是转移性结肠癌。在另一实施方案中，癌症是卵巢癌。在另一实施方案中，癌症是乳腺癌。在再一实施方案中，癌症是肺癌。在再一实施方案中，癌症是卡波西肉瘤。
公知紫杉醇和喜树碱衍生物是针对各种癌症的有效化疗剂。例如，CTP-11已经被FDA批准用于治疗结肠癌。CTP-11向SN-38的水解的改善将有助于该药物的有用性和减小在患者中的副作用。例如，CTP-11治疗的副作用可诱导腹泻、脱发、恶心、呕吐、骨髓抑制、高血糖、脱毛症和胆碱能症状(Moertel等人， Cancer Chemo.R.56：95-101(1972)；Muggia等人， Ca.Chemother.Rep.56：515-521(1972))。除了结肠癌，已经在各种其它癌症中试验了这些药物(见，Hare等人， Cancer Chemother.Pharmacol.39：187-191(1997)，其在此处被并入作为参考)。
本发明提供了通过施用治疗有效量的丁酰胆碱酯酶变体治疗个体中癌症的方法。可以考虑，通过施用治疗有效量的丁酰胆碱酯酶变体治疗个体中癌症的方法可以是施用一种变体，该变体还含有抗体或抗体片段，例如，CD20(SEQ ID NOS：198)和EGF(SEQ ID NOS：18和20)抗体和此处描述的相应片段。丁酰胆碱酯酶变体的有效剂量取决于例如，施用途径和形式、被施用的分子的效力和生物活性半寿期、个体的体重和状况，和以前或并存的治疗。本领域技术人员使用此处提供的教导和指导可以确定对于本方法的具体应用而言被认为是有效剂量的适宜量。例如，可以从此处描述的体外或体内丁酰胆碱酯酶测定法外推该适宜量。本领域中技术人员将认识到在治疗期间需要监视个体的状况并相应调节所使用的组合物的量。
为了治疗癌症，本发明的丁酰胆碱酯酶变体的治疗有效量可以为，例如，约0.1mg/kg到0.15mg/kg体重，例如，约0.15mg/kg到0.3mg/kg，约0.3mg/kg到0.5mg/kg，或约1mg/kg到5mg/kg，这取决于治疗方案。类似地，允许丁酰胆碱酯酶变体定时释放的制剂将使得可以将更小量的丁酰胆碱酯酶变体连续释放给进行癌症治疗的个体。可以理解，必须基于变体的催化活性调节丁酰胆碱酯酶变体的剂量，从而与具有较低喜树碱转化或水解活性的变体的所需剂量相比，可以施用较低剂量的具有显著增强的喜树碱转化或水解活性的变体。
可以系统地，如静脉内或动脉内递送丁酰胆碱酯酶变体。用本领域中普通技术人员公知的配制方法以药学上可接受的制剂中的分离的并基本纯化的多肽和多肽片段的形式提供丁酰胆碱酯酶变体。可以通过标准途径，包括例如，局部、透皮、腹膜内、颅内、脑室内、脑内、阴道内、子宫内、经口、直肠或肠胃外(例如，静脉内、脊柱内、皮下或肌内)途径施用这些制剂。此外，丁酰胆碱酯酶变体可被掺入生物可降解的聚合物，该聚合物允许该化合物的持续释放以治疗个体的癌症症状。生物可降解的聚合物和它们的用途在例如，Brem等人，J.Neurosurg.74.441-446(1991)(其在此处被并入作为参考)中描述。
丁酰胆碱酯酶变体可以作为溶液或悬浮液与药学上可接受的介质一起施用。这种药学上可接受的介质可以为，例如，水、磷酸钠缓冲液、磷酸缓冲盐水、生理盐水或林格液或其他生理缓冲盐水，或者其他溶剂或载体，如乙二醇、甘油、油，如橄榄油或可注射的有机酯。药学上可接受的介质可以还含有生理学上可接受的化合物，它们例如，稳定或增加丁酰胆碱酯酶变体的吸收。这些生理学上可接受的化合物包括，例如，糖类，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂如EDTA，其破坏微生物膜；二价金属离子例如，钙或镁；低分子量蛋白；脂质或脂质体；或者其他稳定剂或赋形剂。
适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射液，如上述药学上可接受的介质。该溶液可以还含有，例如，缓冲剂、细菌抑制剂和使得制剂与目的受体的血液等渗的溶质。其他制剂包括，例如，水性和非水性无菌悬浮液，它们可包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以在单位剂量或者多剂量容器，例如，密封的安瓿和小瓶中给出，并且可以在冻干条件中保存，需要例如，临使用前加入无菌液体载体。可以从前面描述的无菌粉剂、粒剂和片剂制备现用现制的注射溶液和悬浮液。
本发明的丁酰胆碱酯酶变体可以与其他治疗剂用于联合治疗中。包括丁酰胆碱酯酶变体的联合治疗可由分别单独在适宜制剂中包含变体和其它的治疗剂的制剂组成。备选地，联合治疗可以由融合蛋白组成，其中丁酰胆碱酯酶变体连接到异源蛋白，如治疗蛋白或抗体或抗体片段上。
施用抗体治疗剂的体内模式可包括腹膜内、静脉内和皮下施用融合多肽抗体或其功能片段。抗体治疗剂的剂量是公知的或可由本领域中技术人员常规地确定。例如，典型地施用这些剂量以便实现血浆浓度为约0.01μg/ml到约100μg/ml，约1-5μg/ml或约5μg/ml。按照每体重的量计，这些剂量通常相应于约0.1-300mg/kg，约0.2-200mg/kg或约0.5-20mg/kg。根据需要，在治疗期间可以一次或多次施用剂量。通常，剂量将随着受试者的年龄、状况、性别和病理程度而变并且应不要太高以导致不利的副作用。此外，治疗期间也可以由医生调节剂量以增强治疗或减小副作用的潜在发展。这些方法是公知的并且由本领域中技术人员常规实施。
通过施用编码多肽或变体的核酸也可以将本发明的丁酰胆碱酯酶变体递送到个体。本发明丁酰胆碱酯酶变体的编码核酸可以与本领域中公知的各种基因治疗方法结合以递送治疗有效量的多肽或变体。使用此处提供的教导和指导，丁酰胆碱酯酶变体的编码核酸可以被掺入本领域中公知的载体或递送系统并用于递送并表达编码序列以实现治疗有效量。本领域中公知的适宜载体和递送系统包括，例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒、缀合配体的颗粒和用于靶定的核酸、分离的DNA和RNA、脂质体、聚赖氨酸、和细胞疗法，包括肝细胞疗法(其使用被修饰而表达丁酰胆碱酯酶变体的细胞的移植)，以及本领域中公知的各种其他基因递送方法和改良方法，如Shea等人， Nature Biotechnology 17：551-554(1999)中描述的方法，该文献在此处被并入作为参考。
通过表达编码核酸序列递送丁酰胆碱酯酶变体的方法的具体实例是本领域中熟知的并且在，例如，美国专利号5,399,346、美国专利号5,580,859、5,589,466、5,460,959、5,656,465、5,643,578、5,620,896、5,460,959、5,506,125；欧洲专利申请号EP 0779 365 A2、PCT No.WO 97/10343、PCT No.WO97/09441、PCT No.WO 97/10343中描述，所有这些文献都在此处被并入作为参考。还存在本领域中技术人员公知的其他方法并且它们可类似用于通过表达编码核酸序列递送丁酰胆碱酯酶变体。
可以理解，此处提供的本发明定义中还包括修改方案，它们不会实质性影响本发明的各种实施方案的行为。因此，下面的实施例旨在阐明但不限制本发明。
实施例I丁酰胆碱酯酶变体文库
该实施例描述了合成和表征哺乳动物细胞中表达的丁酰胆碱酯酶变体文库。通过将被确定为对于丁酰胆碱酯酶的催化活性重要的残基突变，产生丁酰胆碱酯酶变体的最初文库。在Silicone Graphics Octane计算机上用Sybyl 6.4软件中的FlexiDock程序(Tripos Inc.，St.Louis，MO)将底物停靠到丁酰胆碱酯酶的活性部位，以确定丁酰胆碱酯酶内对催化活性潜在重要的残基。用如此处描述的基于PCR的诱变或者基于密码子的诱变，突变对催化活性重要的残基并将它们包装到文库中。
例如利用Pfu聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)通过人丁酰胆碱酯酶DNA的PCR-定点诱变产生丁酰胆碱酯酶变体文库。用三种寡核苷酸引物实施诱变。诱变引物与一般引物如SP6启动子测序引物(MBI Fermentas，Amherst，NY)同时使用以扩增丁酰胆碱酯酶cDNA的一端。在QuiaQuickPCR(Qiagen，Santa Clarita，CA)上根据生产商的方案清洁PCR反应产物(巨引物(mega primer))以除去过量引物。所清洁的巨引物在第二个PCR反应中延伸以产生每种变体的完整1.8kb编码序列。
将组成丁酰胆碱酯酶变体的1.8-kb片段克隆到pGS质粒中并再次测序以确保存在所希望的突变。质粒pGS与pRc/CMV(Invitrogen，Carlsbad，CA)相同，只是Neo基因已经被大鼠谷氨酰胺合成酶代替。这些变体可以在例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中稳定表达，或者例如，如下面描述的，在293T细胞中瞬时表达。
例如，通过对人丁酰胆碱酯酶DNA的基于密码子的诱变也产生了丁酰胆碱酯酶变体文库。基于结构建模或者不同物种之间的序列比对预测的对催化效率重要的丁酰胆碱酯酶区域是诱变的靶标。在表1中显示了经预测对催化效率重要的7个区域。
被选择用于聚焦文库合成的丁酰胆碱酯酶的7个区域所跨越的残基包括8个芳香族活性部位沟残基(W82、W112、Y128、W231、F329、Y332、W430和Y440)以及两个催化性三联体残基。保持位于65Cys-92Cys、252Cys-263Cys、400Cys-519Cys之间的链内二硫键的完整性以确保功能性丁酰胆碱酯酶结构。此外，在文库合成中通常避开位于残基17、57、106、241、256、341、455、481、485、和486处的假定的糖基化位点(N-X-S/T)。总体上，7个聚焦文库跨越79个残基，代表约14％的丁酰胆碱酯酶线性序列，并导致约1500种不同丁酰胆碱酯酶变体的表达。
通过如上面描述的基于密码子的诱变，合成相应于所要诱变的人丁酰胆碱酯酶的7个区域的核酸文库。简言之，通过如由Glaser等人，如前引文，1992以前描述的β-氰乙基亚磷酰胺化学，用多个DNA合成柱合成寡核苷酸。在第一步中，在一个柱上合成编码丁酰胆碱酯酶的氨基酸的三核苷酸，而第二柱被用于合成三核苷酸NN(G/T)，其中N是dA、dG、dC和dT氰乙基亚磷酰胺的混合物。使用三核苷酸NN(G/T)导致具有最小简并性的彻底诱变，这通过所有20种氨基酸在每个位置的系统表达来实现。
合成第一个密码子后，将来自两个柱子的树脂混合在一起，分开，并置于四个柱子中。通过添加针对每个密码子的额外合成柱并混合柱树脂，简并寡核苷酸池将基于诱变的程度分离。基于密码子的诱变的树脂混合方面使得该方法快速并且划算，因为其不需要合成多种寡核苷酸。在本研究中，编码单氨基酸突变的寡核苷酸池被用于合成聚焦的丁酰胆碱酯酶文库。使用寡核苷酸-定向的诱变(Kunkel，如前，1985)可以将编码含有单个氨基酸突变的丁酰胆碱酯酶变体的寡核苷酸克隆到例如，双lox靶定载体中。当与野生型丁酰胆碱酯酶比较时，发现来自上述文库的一些丁酰胆碱酯酶变体具有增强的催化活性。使用此处描述的各种测定法，诸如乙酸邻硝基苯基酯水解测定法和SN-38的HPLC测定法，还测定了来自上述文库的变体的增强的羧酸酯酶活性。在HPLC测定中，来自这些文库的一种称为F227A(SEQ ID NO：2)的变体表现出与野生型丁酰胆碱酯酶相比丁酰胆碱酯酶活性增加至少3倍。F227A在人丁酰胆碱酯酶多肽序列中含有单个氨基酸置换，该置换为用丙氨酸代替了227位的苯丙氨酸。在DNA水平上，这是从TTT密码子向GCG密码子的改变。
使用F227A变体作为模板，产生了额外的定点突变，导致构建了一些双突变体。被选择用于定点突变的区域是如此处描述的预测对催化效率重要的残基(见，例如，表1)。例如，产生了下面的双突变(见表2)。作为参考，在图11中显示了人丁酰胆碱酯酶的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOS：21和22)。
表2
  BChE变体   氨基酸改变(除了F227A改变，苯丙氨酸到丙氨酸)   密码子改变(除了F227A改变，TTT到GCT)
  F227A/T284A   苏氨酸到丙氨酸   ACT到GCT
  F227A/L286Q   亮氨酸到谷氨酰胺   TTG到CAG
  F227A/L286S   亮氨酸到丝氨酸   TTG到TCG
  F227A/L286H   亮氨酸到组氨酸   TTG到CAT
  F227A/L286W   亮氨酸到色氨酸   TTG到TGG
  F227A/S287P   丝氨酸到脯氨酸   TCA到CCT
使用293T人胚肾细胞在瞬时系统中表达含有双突变的丁酰胆碱酯酶变体。简言之，在第1天，将293T细胞以1.5×105个细胞/孔铺在BioCoat24-孔板中。然后允许细胞过夜恢复。在第二天，将2μl Lipofectamine2000/孔在50μl Opti-MEM/孔中稀释并孵育5分钟。在50μl Opti-MEM/孔中稀释500ng-1μg DNA/孔。将两种稀释的溶液混合，室温下孵育20分钟。从细胞除去培养基并用500μl/孔完全生长培养基(没有青霉素或链霉素)代替。随后向每孔加入100μl稀释的溶液，并在细胞上孵育4小时。从细胞除去培养基/DNA/Lipofectamine 2000，并每孔用1ml的Ultraculture无血清培养基(Bio Whittaker)代替。允许丁酰胆碱酯酶变体多肽积累48-96小时并直接使用来自细胞的条件培养基。对于其他应用，可以如下述实施例VI中描述的纯化丁酰胆碱酯酶变体多肽。
如下描述的测定含有双突变的丁酰胆碱酯酶变体的活性。例如，使用乙酸邻硝基苯基酯水解测定法、使用基于HPLC的CTP-11转化活性测定法，和对癌细胞系的细胞毒性，测定变体的羧酸酯酶活性。
实施例II丁酰胆碱酯酶变体的羧酸酯酶活性
该实施例表明了一些丁酰胆碱酯酶变体的羧酸酯酶活性。羧酸酯酶活性的标准测定法是乙酸邻硝基苯基酯(o-NPA)水解测定法(见Beaufay等人，J.Cell.Biol.61：188-200(1974))。如下描述地实施该测定法的一种改良方法，其测量通过用抗丁酰胆碱酯酶的抗体捕获来标准化的丁酰胆碱酯酶变体的o-NPA活性。
通过乙酸邻硝基苯基酯确定捕获的丁酰胆碱酯酶的羧酸酯酶活性的方案：
1)用PBS(100μl/孔)中的10mg/ml兔抗人丁酰胆碱酯酶(Dako#A0032)在4℃包被96孔Immulon 2板过夜。
2)除去包被溶液并用PBS(250μl/孔)中的3％BSA在室温封闭板2小时。
3)加入200μl丁酰胆碱酯酶变体条件培养基并在室温孵育2小时。
4)用250μl/PBS洗涤板3次。
5)加入85μl/孔0.1M磷酸钾，pH 7.0。
6)向100ml乙腈中加入13.6mg o-NPA，混合以溶解。向100ml该母液中加入6.3ml水并充分混合。
7)用PBS洗涤板3次。
8)加入15μl稀释的o-NPA底物。
9)在405nm读出吸收。
使用上述抗-丁酰胆碱酯酶抗体捕获/标准化测定法检验来自293T细胞中瞬时表达的丁酰胆碱酯酶变体的条件培养基的羧酸酯酶活性。如在图1中代表性测定法中所示，一些丁酰胆碱酯酶变体表现出羧酸酯酶活性。图1中所示的第一个变体是F227A(见最左边的柱)。其他变体的活性水平可以与F227A的活性水平相比较。该测定中野生型丁酰胆碱酯酶的活性水平为用F227A所看到的活性水平的约50％。为了确定该测定中存在的变异(variability)，一些孔含有相同的变体。例如，除了第一个孔之外，还要四个孔被标记为含有F227A变体。所有5个孔中的活性水平是类似的并表明该测定中存在低水平的变异。
通过该方法鉴定的实现羧酸酯酶底物水解的丁酰胆碱酯酶残基包括：F227、A328、Y332、T284、P285、L286。该测定法可用于快速筛选许多变体的活性。在该测定法中测定的活性可以预测CPT-11的活化并可用于鉴定与CTP-11活化有关的BChE的残基或区域。
实施例III丁酰胆碱酯酶变体的CTP-11转化活性
该实施例表明与丁酰胆碱酯酶相比丁酰胆碱酯酶变体具有增加的CTP-11转化活性。
如Dodds和Rivory， Mol.Pharmacol.56：1346-1353(1999)(其在此处被并入作为参考)中描述的，使用高效液相层析(HPLC)检测SN-38形成来测定丁酰胆碱酯酶变体的CPT-11转化活性。图2中显示了CPT-11向SN-38的转化。简言之，来自瞬时表达的BChE变体的条件培养基在37℃暴露于20mM CTP-11 72小时并通过HPLC分析SN-38形成(在约4分钟的柱存留时间处的峰)。图3显示了使用来自模拟-转染的细胞的条件培养基产生的SN-38的量，模拟-转染意味着如通常的进行转染，然而不加入DNA。图4显示了使用来自用F227A转染的细胞的条件培养基产生的SN-38的量，图5显示了使用来自用F227A/L286S转染的细胞的条件培养基产生的SN-38的量。
如图3-5中所示，F227A变体产生少量SN-38，与模拟和F227A变体条件培养基相比，变体F227A/L286S表现出CPT-11向SN-38的显著转化。在该测定中，野生型丁酰胆碱酯酶没有表现出可检测的SN-38水平。
通过该方法鉴定的与野生型丁酰胆碱酯酶相比能增强地将CPT-11转化为SN-38的丁酰胆碱酯酶变体包括：F227A(SEQ ID NO：2)、F227A/T284A(SEQ ID NO：4)、F227A/L286Q(SEQ ID NO：6)、F227A/L286S(SEQ ID NO：8)、F227A/L286H(SEQ ID NO：10)、F227A/L286W(SEQ ID NO：12)、和F227A/S287P(SEQ ID NO：14)。表3显示了这些变体中CTP-11向SN-38转化的大概提高倍数。实际的提高倍数可以比表3中所列的高得多，因为表3中的值是基于与野生型丁酰胆碱酯酶比较的提高倍数。因为野生型丁酰胆碱酯酶的活性在该测定中极低(小于1％转化)，所以野生型丁酰胆碱酯酶的值倾向于比其他活性值更具可变性。因此，表2中所列的活性值是这些变体的活性的非常保守的值，因此表3中变体具有至少所列的活性值或者更高值。例如，与丁酰胆碱酯酶相比，丁酰胆碱酯酶变体F227A/L268S(SEQ ID NO：8)的喜树碱转化活性增加至少50倍。换句话说，与丁酰胆碱酯酶相比，丁酰胆碱酯酶变体F227A/L268S(SEQ ID NO：8)表现出转化能力增加50倍或更大。
表3
  SEQ ID NO：   BChE变体   CTP-11转化的提高倍数
  2   F227A   ＞3
  4   F227A/T284A   ＞7
  6   F227A/L286Q   ＞10
  8   F227A/L286S   ＞50
  10   F227A/L286H   ＞35
  12   F227A/L286W   ＞42
  14   F227A/S287P   ＞6
实施例IV通过丁酰胆碱酯酶变体引起的丁酰胆碱酯酶介导的细胞毒性和增强的CPT-11活化杀伤作用
该实施例表明与丁酰胆碱酯酶相比，丁酰胆碱酯酶变体在癌细胞中具有增强的细胞毒性。
用细胞毒性测定法阐明BChE变体活化CPT-11的水平。将临床相关浓度的CPT-11(0.5-10mM)在37℃下暴露于BChE变体24-72小时。简言之，将4mM CPT-11与表达的野生型BChE、6-6变体或F227A/L286Q变体孵育72小时。SW48结肠癌细胞被暴露于浓度为0.5mM的活化的CTP-11 72小时并通过MTT方法测量细胞存活力。MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑基-2)-2，5-二苯基四唑)测定法可通过商业途径得到并且可用于基于细胞还原一种氧化还原敏感染料的能力测量细胞存活力。注意6-6变体是在全文中用于描述变体的命名法中被称为A328W/Y332M/S287G/F227A(SEQ ID NO：16)的四突变体。6-6变体在突变位置处含有下面的密码子：GCG编码氨基酸位置227处的丙氨酸，GGT编码氨基酸位置287处的甘氨酸，ATG编码氨基酸位置332处的甲硫氨酸，TGG编码氨基酸位置328处的色氨酸。
如图6中所示，在BChE和BChE变体存在下SW48结肠癌细胞中CTP-11介导的细胞毒性显著增强了。6-6变体(SEQ ID NO：16)和F227/L286Q(SEQ ID NO：6)变体都表现出增强的由CPT-11活化介导的肿瘤细胞细胞毒性。
实施例V用于CTP-11靶定活化的抗体-丁酰胆碱酯酶融合多肽
该实施例说明了抗-EGF受体-BChE融合多肽的构建和表征，该融合多肽可用于使用CPT-11的抗体定向的酶前药疗法(ADEPT)。
将BChE(截短的L530单体)的N-末端融合到抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体ch225的CH1结构域的C-末端构建模型抗体-BChE融合多肽。两个结构域通过GGGS接头或者天然抗体铰链区连接。
产生了模型抗体-酶融合多肽，其表现出抗原结合和催化酶功能。图9中显示了小鼠抗-EGF可变轻链的核苷酸和氨基酸序列。图10中显示了小鼠抗-EGF可变重链和恒定重链1铰链区及L530的核苷酸和氨基酸序列。
截短的L530单体在Blong等人，Biochem.J.327：747-757(1997)中描述并且该文献在此处被并入作为参考。该单体含有在C末端截断的BChE，从而其不装配成使用野生型BchE时所看到的四聚体。L530单体保留了大部分或所有的丁酰胆碱酯酶(BChE)活性。
图7中显示了ELISA试验，其表明了表达的抗-EGFR-BChE L530与抗-κ捕获抗体的结合并通过丁酰硫代胆碱水解测量了结合的丁酰胆碱酯酶的活性。这表明完整融合多肽(通过抗体轻链结合)表现出丁酰胆碱酯酶活性。
抗-EGFR-L530的抗-κ捕获的方案如下：
1)用200μl于PBS中的10mg/ml抗人κ抗体过夜包被96-孔Immulon 2板。
2)用PBS(250μl/孔)中的3％BSA在室温下封闭板2小时。
3)用250μl/孔PBS洗涤板3次。
4)加入200μl BChE条件培养基并在室温孵育2小时。
5)通过将5mM DTNB母液在0.1M磷酸钾(pH 7.0)中以1∶10稀释制备DTNB的工作液。每孔加入180μl。
6)通过将200mM丁酰硫代胆碱(BTC)母液在水中以1∶20稀释制备工作液。每孔加入20μl。
7)37℃孵育板并在分光光度计上以A405nm读数。
图8中显示了ELISA测定法，其测量了特异结合含有EGFR抗原的细胞膜制品的抗-EGFR-BChE L530的丁酰胆碱酯酶活性。这些结果表明了融合蛋白通过抗体结构域的抗原特异结合和丁酰胆碱酯酶结构域的酶活性。
抗-EGFR与A431膜制品结合的方案如下：
1)用在10mM HEPES pH 7.4、0.1％Triton X-100中以1/20稀释的50μl/孔A431细胞裂解物包被96-孔Immulon 2板，并在通风厨中过夜干燥。
2)用PBS(250μl/孔)中的3％BSA在室温下封闭板2小时。
3)用250μl/孔PBS洗涤板3次。
4)加入200μl BChE条件培养基并在室温孵育2小时。
5)通过将5mM DTNB母液在0.1M磷酸钾(pH 7.0)中以1∶10稀释而制备DTNB的工作液。每孔加入180μl。
6)通过将200mM丁酰硫代胆碱(BTC)母液在水中以1∶20稀释制备工作液。每孔加入20μl。
7)37℃孵育板并在分光光度计上以A405nm读数。
实施例VI纯化和表征丁酰胆碱酯酶变体
该实施例说明了可以怎样纯化丁酰胆碱酯酶变体多肽。这些纯化的多肽可用于，例如，此处描述试验和药物组合物中。
为了纯化丁酰胆碱酯酶变体，将相应于每种变体的培养基通过Buchner漏斗上的Whatman#1滤纸(Whatman Inc.，Clifton，NJ)过滤。将滤液倒入层析柱(XK50/30，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，该层析柱填装有100ml亲和凝胶普鲁卡因酰胺-Sepharose 4B。丁酰胆碱酯酶变体在上样期间粘附到亲和凝胶上，从而以前在20升中的20mg酶被浓缩到100ml亲和凝胶中。随后用20mM磷酸钾(pH 7.0)和1mM EDTA中的.3M氯化钠洗涤亲和凝胶以洗脱污染性蛋白。然后，用含有20mM磷酸钾和1mMEDTA的缓冲液(pH 7.0)洗涤亲和凝胶以减小离子强度。最后，用250ml溶于缓冲液的0.2M普鲁卡因酰胺洗脱丁酰胆碱酯酶变体。
为了进一步纯化丁酰胆碱酯酶变体并除去普鲁卡因酰胺，可以实施另一纯化步骤。将在第一个纯化步骤中回收的丁酰胆碱酯酶变体用缓冲液(20mM TrisCl，1mM EDTA pH 7.4)稀释10倍以将离子强度减小到约0.02M。将稀释的酶加到含有400ml弱阴离子交换剂DE52(Whatman，Clifton，NJ)的柱子上。在该低离子强度下，丁酰胆碱酯酶变体粘附到阴离子交换凝胶上。上样完成后，用含有20mM TrisCl和1mM EDTA的缓冲液(pH 7.4)2升洗涤柱子直到洗脱物在280nm处的吸收接近0，表明普鲁卡因酰胺被洗除。随后，用20mM TrisCl(pH 7.4)中的0到0.2M NaCl的盐梯度从柱上洗脱丁酰胆碱酯酶变体。丁酰胆碱酯酶变体洗脱后，用级分收集器为每种变体收集10ml级分。实施活性测定以鉴定含有丁酰胆碱酯酶变体的峰。可以实施SDS凝胶电泳以确定每种丁酰胆碱酯酶变体的纯度，通常确定的纯度为约90％。
实施例VII抗体-BChE融合蛋白的产生和体外靶定前药活化和细胞毒性的评价
该实施例阐明了在抗体-定向的酶前药治疗模型中BChE变体的优化。通过文库筛选鉴定了掺入优化的变异残基的抗体-酶融合蛋白并通过靶定CD20——B淋巴细胞上存在的一种非内化细胞表面抗原——证实了在使用CPT-11的ADEPT中使用优化的BChE的可行性。
CD20是检验ADEPT中使用优化的BChE的可行性的有用靶抗原，因为该抗原在人B淋巴瘤细胞系中大量表达(3.2×105个分子/细胞)并且在抗体结合时不经历显著的内化。AME133是一种人源化抗-CD20，其具有图20中所示并如SEQ ID NO：198所示的完全人种系构架区，其相应核酸序列为SEQ ID NO：197。在Applied Molecular Evolution使用该公司的定向进化策略产生了该抗体，并且单价Fab以极高的亲和力(1×10-9M)结合CD20。产生并在图19中显示了融合蛋白的示例性模型(抗-CD20-BChE.4-1)。抗-CD20-BChE.4-1(SEQ ID NO：200)由在CH1重链结构域的C-末端与修饰的BChE变体L530(SEQ ID NO：201)的N-末端融合的AME 133Fab组成，修饰的BChE变体L530是参比SEQ ID NO：180的功能片段。BChE变体在氨基酸530处被截断而不能正常装配成四聚体。该酶的单体形式表现出与天然四聚体形式的每个亚单位等价的活性，没有由于如Blong等人， Biochem J 327(Pt 3)：747-57(1997)描述的变构效应而损失活性。
使未贴壁的HEK293细胞适应于在无血清的低蛋白质培养基(UltraCULTURE，Bio Whittaker)中的悬浮培养并用融合蛋白瞬时转染，产率为2-5mg/L。开发了两步纯化方法，其使用在Sepharose Q上的阴离子交换，然后在苯基Sepharose上的疏水相互作用层析。这导致产物纯度＞90％，通过SDS-PAGE检测到一个主要污染带。该融合蛋白对CPT-11的Km值保持与单独BChE.4-1变体的相同。还产生并表达了对照融合蛋白构建体。它们是在CH1重链结构域的C-末端与截断的野生型BChE的N-末端融合的AME133Fab(抗-CD20-BChE.wt)和与BChE.4-1融合的抗-表皮生长因子受体(EGFR)Fab。
如图14中所示，与对照抗-EGFR-BChE构建体相比，抗-CD20-BChE融合蛋白表现出对CD20阳性SKW肿瘤细胞的抗原特异结合。通过碘化丁酰硫代胆碱的BChE特异水解检测结合的融合蛋白。
为了阐明融合蛋白在ADEPT中的效用，证明抗-CD20-BChE融合蛋白在体外紧密结合肿瘤细胞并在CPT-11存在下产生细胞毒性SN38。将抗原阳性SKW 6.4人B淋巴细胞与抗-CD20-BChE.4-1一起孵育并通过洗涤除去未结合的融合蛋白。然后将细胞与浓度递增的CPT-11孵育4小时并再次洗涤。72小时后评估细胞存活性。用抗-CD20-BChE.4-1孵育后，观察到相对于用模拟条件培养基处理的细胞，CPT-11的EC50降低了7到10倍(图15)。简言之，将活肿瘤细胞与抗-CD20-BChE.4-1或模拟条件培养基预孵育并洗涤，然后暴露于一系列浓度的CPT-11，暴露时间为4小时。结合的融合蛋白导致CTP-11杀伤的EC50的显著减小。在72小时的MTT测定中评价细胞存活性。使用对照抗-EGFR-BChE.4-1或抗-CD20-BChE.Wt的类似实验表明没有比仅用CTP-11时增加的细胞毒性。在这些实验中，每1×106(1.2mg)SKW细胞定位约0.8单位融合蛋白BTC活性。
在用200mg/m2 CPT-11治疗的患者中，CPT-11的血浆浓度至少24小时保持高于0.1μM(Ducreux等人， Ann Oncol 14 Suppl 2：ii17-23(2003))。CPT-11作为单一药剂给药，高达500mg/m2，并且血浆峰浓度与剂量成比例(Mathijssen等人， Clin Cancer Res 7：2182-94(2001)；Ducreux等人，如前引文，2003)。这些发现证明了在CPT-11浓度为药理学相关的并且可以在患者中随时间维续的浓度时，体外抗-CD20-BChE.4-1对肿瘤细胞的靶定杀伤。
实施例VIII为了提高CPT-11的活化对丁酰胆碱酯酶的优化
该实施例阐明了鉴定掺入来自不同文库区域的有益突变的其它变体，该鉴定导致尤其是H77F，F227A，P285N，V331A变体(SEQ ID NO：180)的分离，H77F，F227A，P285N，V331A变体也被称作4-1变体，其在CPT-11水解方面表现出比野生型BChE增强＞3000倍(图12)，并且其对于CPT-11的Km提高5-6倍(从40μM到～7μM)。
合成了一系列聚焦的BChE变体文库，这些文库对应于被预测沿着酶的活性部位沟(Harel等人，如前，1992)排列的氨基酸。针对7个不同文库区域(6-15个残基)使用编码单氨基酸突变的寡核苷酸的池，用含有尿嘧啶的单链DNA作为寡核苷酸-定向诱变(Glaser等人，如前引文，1992)的模板合成文库。将转化的文库铺在琼脂上，挑取细菌克隆并以96-孔形式生长以用于DNA质粒制备。
BChE质粒变体在人胚肾细胞系293T中瞬时表达并在转染后72小时测定活性。通过在SW48结肠癌细胞细胞毒性测定中间接测量CTP-11的酶促活化(图2)，实施变体的初步筛选。该系统中酶表达的孔间变异小于20％。为了避免鉴定表达变体，仅挑选表现出毒性增加＞2倍的命中物。通过对来自最初制备物的相应DNA的测序分析，表征在这些测定中鉴定的功能性命中物。初步筛选鉴定了该酶的25个不同位置上的65种有益的氨基酸改变。通过荧光检测反相HPLC(Dodds和Rivory， Mol Pharmacol 56：1346-53(1999)分离的SN38，以定量方式直接测量BChE-介导的CPT-11水解。该方法用于比较由表达的变体与野生型酶形成的SN38并计算变体对于CPT-11的Km。鉴定掺入来自不同文库区域的有益突变的额外变体，该鉴定导致分离了一种变体，其在CPT-11水解方面表现出比野生型BChE增强＞3000倍(图12)，并且对于CPT-11的Km提高5-6倍(从40μM到～7μM)(图13)。图13显示了BChE变体4-1水解CPT-11的Hofstee图。在37℃下将酶与浓度范围1-80μM的CPT-11孵育24小时。变体表现出的Km为6.9μM，其比天然血清BChE的特征性40μM Km提高5倍以上。速度(v)是在540nm的光吸收单位。底物浓度[s]为μM CPT-11。
为了定量由BChE变体4-1造成的SN38形成，将野生型(20μg)或BChE.4-1(0.05μg)酶与CTP-11在37℃孵育24小时。酸化样品并通过反相HPLC在NovaPak C18柱上分离以将SN38和未活化的CTP-11分开。SN38峰的曲线下面积(AUC)被用于比较野生型酶和优化的BChE.4-1变体对CTP-11的活化。
在本申请全文中，已经在括号内引用了各种出版物。每一篇出版物的完整公开在此处被并入本申请作为参考，以便更完全地描述本发明所属领域的状态。
尽管参考公开的实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员将容易理解所详述的具体实验仅用于阐明本发明。应该理解可以作出各种修改而不背离本发明的精神。因此，本发明仅被后面的权利要求所限制。
                                  序列表
<110>应用分子进化公司(Applied Molecular Evolution，Inc.)
<120>改变化学治疗剂的活性的丁酰胆碱酯酶变体
<130>X16700
<140>PCT/US 03/038684
<141>2003-12-04
<150>US 10/310,666
<151>2002-12-04
<160>201
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>1
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>2
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<400>2
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>3
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>3
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatgggg ckcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat   1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag   1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca   1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat   1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga   1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>4
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(284)..(284)
<223>Xaa＝Ala
<400>4
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Xaa Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>5
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>5
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctcagtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat   1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag   1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca   1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat   1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga   1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa   1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa   1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                      1722
<210>6
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(286)..(286)
<223>L286Q
<400>6
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Gln Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>7
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>7
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa     540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga     600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc     660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg     720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata     780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc     840
ccctatggga ctccttcgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact     900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaaeaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>8
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(286)..(286)
<223>L286S
<400>8
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Ser Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>9
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>9
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctcattc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>10
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(286)..(286)
<223>L286H
<400>10
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro His Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>11
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>11
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc gaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctccttggtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>12
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>F227A
<220>
<221>变异
<222>(286)..(286)
<223>L286W
<400>12
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Ala Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Trp Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>13
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>13
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc gaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgcc kgtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat   1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag   1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca   1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat   1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga   1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa   1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa   1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>14
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>F227A
<220>
<221>变异
<222>(287)..(287)
<223>Xaa＝Pro
<400>14
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Ala Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Xaa Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>15
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>15
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag     240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca     300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact     360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt     420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct     480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa     540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga     600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc     660
attctgcaaa gtggttccgc gaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg     720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata     780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc     840
ccctatggga ctcctttggg tgtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact     900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac atggttttta gtcatgggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>16
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>F227A
<220>
<221>变异
<222>(287)..(287)
<223>S287G
<220>
<221>变异
<222>(328)..(328)
<223>A328W
<220>
<221>变异
<222>(332)..(332)
<223>Y332M
<400>16
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Ala Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Gly Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Trp Phe Leu Val Met Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>17
<211>711
<212>DNA
<213>小鼠(Mus sp.)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(711)
<223>小鼠抗EGFR抗体可变轻链
<400>17
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc     60
aaatgtgaca tcttgctgac tcagtctcca gtcatcctgt ctgtgagtcc aggagaaaga    120
gtcagtttct cctgcagggc cagtcagagt attggcacaa acatacactg gtatcagcaa    180
agaacaaatg gttctccaag gcttctcata aagtatgctt ctgagtctat ctctgggatc    240
ccttccaggt ttagtggcag tggatcaggg acagatttta ctcttagcat caacagtgtg    300
gagtctgaag atattgcaga ttattactgt caacaaaata ataactggcc aaccacgttc    360
ggtgctggga ccaagctgga gctgaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc    420
ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac    480
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac    540
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc    600
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat    660
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta g             711
<210>18
<211>236
<212>PRT
<213>Mus sp.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(236)
<223>小鼠抗EGFR抗体可变轻链
<400>18
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Leu Pro Gly Ala Lys Cys Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile
            20                  25                  30
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser
        35                  40                  45
Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly
    50                  55                  60
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile
65                  70                  75                  80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser
                85                  90                  95
Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln
            100                 105                 110
Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
        115                 120                 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
    130                 135                 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
            180                 185                 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
        195                 200                 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
    210                 215                 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>19
<211>2349
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>misc_festure
<222>(1)..(2349)
<223>L530的小鼠抗EGFR抗体可变重链和恒定重链铰链区
<400>19
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag     60
gtgcagctga agcagtcagg acctggccta gtgcagccct cacagagcct gtccatcacc    120
tgcacagtct ctggtttctc attaactaac tatggtgtac actgggttcg ccagtctcca    180
ggaaagggtc tggagtggct gggagtgata tggagtggtg gaaacacaga ctataataca    240
cctttcacat ccagactgag catcaacaag gacaattcca agagccaagt tttctttaaa    300
atgaacagtc tgcaatctaa tgacacagcc atatattact gtgccagagc cctcacctac    360
tatgattacg agtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgcagcctcc    420
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca    480
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac     540
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc     600
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc     660
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagcaga gcccaaatct     720
tgtgacaaaa ctcacacatg tccaccgtgt ccaaagcttg aagatgacat cataattgca     780
acaaagaatg gaaaagtcag agggatgaac ttgacagttt ttggtggcac ggtaacagcc     840
tttcttggaa ttccctatgc acagccacct cttggtagac ttcgattcaa aaagccacag     900
tctctgacca agtggtctga tatttggaat gccacaaaat atgcaaattc ttgctgtcag     960
aacatagatc aaagttttcc aggcttccat ggatcagaga tgtggaaccc aaacactgac    1020
ctcagtgaag actgtttata tctaaatgta tggattccag cacctaaacc aaaaaatgcc    1080
actgtattga tatggattta tggtggtggt tttcaaactg gaacatcatc tttacatgtt    1140
tatgatggca agtttctggc tcgggttgaa agagttattg tagtgtcaat gaactatagg    1200
gtgggtgccc taggattctt agctttgcca ggaaatcctg aggctccagg gaacatgggt    1260
ttatttgatc aacagttggc tcttcagtgg gttcaaaaaa atatagcagc ctttggtgga    1320
aatcctaaaa gtgtaactct ctttggagaa agtgcaggag cagcttcagt tagcctgcat    1380
ttgctttctc ctggaagcca ttcattgttc accagagcca ttctgcaaag tggttccttt    1440
aatgctcctt gggcggtaac atctctttat gaagctagga acagaacgtt gaacttagct    1500
aaattgactg gttgctctag agagaatgag actgaaataa tcaagtgtct tagaaataaa    1560
gatccccaag aaattcttct gaatgaagca tttgttgtcc cctatgggac tcctttgtca    1620
gtaaactttg gtccgaccgt ggatggtgat tttctcactg acatgccaga catattactt    1680
gaacttggac aatttaaaaa aacccagatt ttggtgggtg ttaataaaga tgaagggaca    1740
gcttttttag tctatggtgc tcctggcttc agcaaagata acaatagtat cataactaga    1800
aaagaatttc aggaaggttt aaaaatattt tttccaggag tgagtgagtt tggaaaggaa    1860
tccatccttt ttcattacac agactgggta gatgatcaga gacctgaaaa ctaccgtgag    1920
gccttgggtg atgttgttgg ggattataat ttcatatgcc ctgccttgga gttcaccaag    1980
aagttctcag aatggggaaa taatgccttt ttctactatt ttgaacaccg atcctccaaa    2040
cttccgtggc cagaatggat gggagtgatg catggctatg aaattgaatt tgtctttggt    2100
ttacctctgg aaagaagaga taattacaca aaagccgagg aaattttgag tagatccata    2160
gtgaaacggt gggcaaattt tgcaaaatat gggaatccaa atgagactca gaacaatagc    2220
acaagctggc ctgtcttcaa aagcactgaa caaaaatatc taaccttgaa tacagagtca    2280
acaagaataa tgacgaaact acgtgctcaa caatgtcgat tctggacatc attttttcca    2340
aaagtctga                                                            2349
<210>20
<211>782
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(782)
<223>L530的小鼠抗EGRF抗体可变重链和恒定重链铰链区
<400>20
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
        35                  40                  45
Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr
65                  70                  75                  80
Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
                85                  90                  95
Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp
        115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
    130                 135                 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
                165                 170                 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
            180                 185                 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
        195                 200                 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
    210                 215                 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser
225                 230                 235                 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys Leu Glu Asp Asp
                245                 250                 255
Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met Asn Leu Thr
            260                 265                 270
Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro Tyr Ala Gln
        275                 280                 285
Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser Leu Thr Lys
    290                 295                 300
Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser Cys Cys Gln
305                 310                 315                 320
Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu Met Trp Asn
                325                 330                 335
Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Val Trp Ile
            340                 345                 350
Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp Ile Tyr Gly
        355                 360                 365
Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr Asp Gly Lys
    370                 375                 380
Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met Asn Tyr Arg
385                 390                 395                 400
Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro Glu Ala Pro
                405                 410                 415
Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln Trp Val Gln
            420                 425                 430
Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val Thr Leu Phe
        435                 440                 445
Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu Leu Ser Pro
    450                 455                 460
Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser Gly Ser Phe
465                 470                 475                 480
Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg Asn Arg Thr
                485                 490                 495
Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn Glu Thr Glu
            500                 505                 510
Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile Leu Leu Asn
        515                 520                 525
Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val Asn Phe Gly
    530                 535                 540
Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp Ile Leu Leu
545                 550                 555                 560
Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly Val Asn Lys
                565                 570                 575
Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly Phe Ser Lys
            580                 585                 590
Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu Gly Leu Lys
        595                 600                 605
Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser Ile Leu Phe
    610                 615                 620
His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn Tyr Arg Glu
625                 630                 635                 640
Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys Pro Ala Leu
                645                 650                 655
Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala Phe Phe Tyr
            660                 665                 670
Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu Trp Met Gly
        675                 680                 685
Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu Pro Leu Glu
    690                 695                 700
Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser Arg Ser Ile
705                 710                 715                 720
Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro Asn Glu Thr
                725                 730                 735
Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr Glu Gln Lys
            740                 745                 750
Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr Lys Leu Arg
        755                 760                 765
Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys Val
    770                 775                 780
<210>21
<211>1722
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1722)
<223>人丁酰胆碱酯酶
<400>21
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga     600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc     660
attctgcaaa gtggttcctt taatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg     720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata     780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc     840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact     900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>22
<211>574
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(574)
<223>人丁酰胆碱酯酶
<400>22
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Phe Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>23
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>23
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaagatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>24
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(68)..(68)
<223>N68K
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<400>24
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Lys Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>25
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>25
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gcggatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat   1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag   1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca   1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat   1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga   1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>26
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(68)..(68)
<223>N68R
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<400>26
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Arg Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>27
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>27
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa     180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacataggg caaagttttc caggcttcca tggatcagag     240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca     300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact     360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt     420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct     480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa     540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga     600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc     660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg     720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata     780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc     840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact     900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>28
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(70)..(70)
<223>D70G
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<400>28
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Gly Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>29
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>29
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatacat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa     540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga     600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc     660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg     720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata     780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc     840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact     900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
ascaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>30
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(70)..(70)
<223>D70H
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<400>30
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile His Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>31
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>31
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttctt cggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>32
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(77)..(77)
<223>H77F
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<400>32
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe Phe Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>33
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>33
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttccc tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>34
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(77)..(77)
<223>H77P
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<400>34
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe Pro Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>35
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>35
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaatgg    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat   1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag   1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca   1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat   1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga   1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa   1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa   1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>36
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(120)..(120)
<223>T120W
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<400>36
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Trp Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
ASn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>37
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>37
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag     240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca     300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaatat     360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt     420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct     480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa     540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga     600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc     660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg     720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata     780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc     840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact     900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>38
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(120)..(120)
<223>T120Y
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<400>38
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Tyr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>39
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>39
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga     600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc     660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg     720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata     780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc     840
cccggtggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact     900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgecttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc  tc                      1722
<210>40
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(282)..(282)
<223>Y282G
<400>40
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Gly Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>41
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>41
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
cccaatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>42
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(282)..(282)
<223>Y282N
<400>42
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Asn Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>43
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>43
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga accctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>44
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(284)..(284)
<223>T284N
<400>44
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Asn Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>45
<21l>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>45
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctccct    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>46
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(300)..(300)
<223>T300P
<400>46
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn  Pro
145                 150                 155                  160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Pro Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                  350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 4l0                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>47
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>47
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatgggc gtcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>48
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(284)..(284)
<223>T284R
<400>48
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
l               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Arg Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<2l0>49
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>49
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgCaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatgggt ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctctct    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>50
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(284)..(284)
<223>T284S
<400>50
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Ser Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Ser Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Ash Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>51
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>51
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatgggt atcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>52
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(284)..(284)
<223>T284Y
<400>52
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Tyr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>53
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>53
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctaatttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>54
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(285)..(285)
<223>P285N
<400>54
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Asn Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>55
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>55
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcagttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>56
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(285)..(285)
<223>P285Q
<400>56
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    2l0                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Gln Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>57
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>57
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctgcgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>58
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(286)..(286)
<223>L286A
<400>58
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Ala Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>59
<21l>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>59
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctgggtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>60
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(286)..(286)
<223>L286G
<400>60
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Gly Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>61
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>61
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctaagtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>62
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(286)..(286)
<223>L286K
<400>62
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Lys Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>63
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>63
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctatgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>64
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(286)..(286)
<223>L286M
<400>64
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Met Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>65
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>65
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctaattc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    l080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>66
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(286)..(286)
<223>L286N
<400>66
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Asn Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>67
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>67
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctcgttc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>68
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(286)..(286)
<223>L286R
<400>68
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Arg Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>69
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>69
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtt tgtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>70
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(287)..(287)
<223>S287F
<400>70
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>71
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>71
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgca tgtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>72
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(287)..(287)
<223>S287H
<400>72
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu His Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>73
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>73
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgcg tgtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>74
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(287)..(287)
<223>S287R
<400>74
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Arg Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>75
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>75
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgac tgtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>76
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(287)..(287)
<223>S287T
<400>76
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Thr Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>77
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>77
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaaggggc tgctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>78
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(327)..(327)
<223>T327A
<400>78
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Ala Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>79
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>79
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggcc tgctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>80
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(327)..(327)
<223>T327P
<400>80
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
 1              5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Pro Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                  445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>81
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>81
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctctttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>82
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(329)..(329)
<223>F329L
<400>82
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Leu Leu Val Tyr Gly Ala  Pro Gly
                325                 330                  335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>83
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>83
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttcg gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>84
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(330)..(330)
<223>L330S
<400>84
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Ser Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>85
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>85
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gcgtatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>86
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(331)..(331)
<223>V331A
<400>86
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Ala Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>87
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>87
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta ggttatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>88
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(331)..(331)
<223>V331G
<400>88
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Gly Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>89
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>89
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagt9tc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaat9aagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta ccttatggtc ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>90
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(331)..(331)
<223>V331P
<400>90
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Pro Tyr Gly Pro Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>91
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>91
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta tcttatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>92
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(331)..(331)
<223>V331S
<400>92
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Ser Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>93
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>93
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta acttatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>94
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(331)..(331)
<223>V331T
<400>94
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Thr Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>95
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>95
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtcgcgggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>96
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(332)..(332)
<223>Y332A
<400>96
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Ala Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>97
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>97
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtcgggggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>98
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(332)..(332)
<223>Y332G
<400>98
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Gly Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Pne Pne Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>99
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>99
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtcttgggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>100
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(332)..(332)
<223>Y332L
<400>100
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Leu Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                 565                 570
<210>101
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>101
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctctggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>102
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(332)..(332)
<223>Y332S
<400>102
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Ser Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>103
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>103
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctggggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    l500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>104
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(332)..(332)
<223>Y332W
<400>104
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Trp Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>105
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>105
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttaagtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>106
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(429)..(429)
<223>P429K
<400>106
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Lys Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Tnr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>107
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>107
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttttgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>108
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(429)..(429)
<223>P429L
<400>108
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Leu Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>109
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>109
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttcagtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>110
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(429)..(429)
<223>P429Q
<400>110
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Gln Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>111
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>111
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttaggtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga  tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg  gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                        1722
<210>112
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(429)..(429)
<223>P429R
<400>112
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 1l0
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Arg Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>113
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>113
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa actttcgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>114
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(429)..(429)
<223>P429S
<400>114
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Ser Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>115
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>115
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttacgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>116
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(429)..(429)
<223>P429T
<400>116
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala  Pro Gly
                325                 330                  335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Thr Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>117
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>117
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttgtttgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>118
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(429)..(429)
<223>P429V
<400>118
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu  Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Val Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>119
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>119
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgatg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>120
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(430)..(430)
<223>W430M
<400>120
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                 55                   60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Met Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>121
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>121
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtat ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                    1722
<210>122
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(430)..(430)
<223>W430Y
<400>122
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Tyr Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>123
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>123
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg caggaatgga tgggagtgat gcatggctat   1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag   1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca   1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat   1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga   1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa   1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa   1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                      1722
<210>124
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(431)..(431)
<223>P431Q
<400>124
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Gln Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>125
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>125
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga     600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc     660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg     720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata     780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc     840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact     900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaaggga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>126
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(433)..(433)
<223>W433G
<400>126
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Gly Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>127
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>127
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatggt ttggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>128
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(434)..(434)
<223>M434F
<400>128
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            2602                 65                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Phe Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>129
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>129
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatggg ggggagtgat gcatggctat   1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>130
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(434)..(434)
<223>M434G
<400>130
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Gly Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>131
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>131
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga agggagtgat gcatggctat   1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag   1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca   1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat   1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga   1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa   1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa   1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                      1722
<210>132
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(434)..(434)
<223>M434K
<400>132
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Lys Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>133
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>133
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact     360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt     420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct     480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa     540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga     600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc     660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg     720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata     780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc     840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact     900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatggc tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>134
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(434)..(434)
<223>M434L
<400>134
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Leu Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>135
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>135
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg     720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata     780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc     840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact     900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    l140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga atggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>136
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(434)..(434)
<223>M434N
<400>136
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Asn Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala  Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                  550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>137
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>137
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttGattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatggt cgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    l440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>138
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(434)..(434)
<223>M434S
<400>138
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Ser Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>139
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>139
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa sctaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatggt ggggagtgat gcatggctat   1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag   1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca   1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>140
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(434)..(434)
<223>M434W
<400>140
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Trp Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>141
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>141
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt      60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga     120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa     180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag     240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca     300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact     360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt     420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct     480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa     540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga     600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc     660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg     720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata     780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc     840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact     900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgtgtgtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>142
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(435)..(435)
<223>G435C
<400>142
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1                   5               10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Cys Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>143
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>143
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtggg gcatggctat   1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag   1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca   1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat   1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga   1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa   1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa   1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                      1722
<210>144
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(437)..(437)
<223>M437G
<400>144
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Gly His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>145
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>145
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc     840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact     900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat tcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>146
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(437)..(437)
<223>M437I
<400>146
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Ile His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>147
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>147
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatacgtat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>148
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(439)..(439)
<223>G439T
<400>148
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Thr Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>149
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>149
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggcgct   1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag   1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca   1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat   1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga   1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa  1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa  1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                     1722
<210>150
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(440)..(440)
<223>Y440A
<400>150
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Ala Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>151
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>151
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga     120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa     180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag     240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca     300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact     360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt     420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct     480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa     540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga     600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc     660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg     720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata     780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc     840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact     900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggcgag    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>152
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(440)..(440)
<223>Y440E
<400>152
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Glu Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>153
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>153
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa   540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga   600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc   660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg   720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata   780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc   840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact   900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt   960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat  1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga  1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag  1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc  1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat  1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggcttt  1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag  1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca  1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat  1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga  1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa  1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa  1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                     1722
<210>154
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(440)..(440)
<223>Y440F
<400>154
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Phe Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>155
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>155
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact     900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt     960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggcggt    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>156
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(440)..(440)
<223>Y440G
<400>156
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
        370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
                420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Gly Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>157
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>157
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggccat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>158
<21l>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(440)..(440)
<223>Y440H
<400>158
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly His Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>159
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>159
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggcttg   1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag   1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca   1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat   1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga   1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa   1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>160
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(440)..(440)
<223>Y440L
<400>160
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Leu Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>161
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>161
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat   1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga   1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag   1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc   1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat   1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggcatg   1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag   1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca   1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat   1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga   1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa   1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa   1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                      1722
<210>162
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<22l>变异
<222>(440)..(440)
<223>Y440M
<400>162
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Met Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>163
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>163
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt     60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggcaat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>164
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(440)..(440)
<223>Y440N
<400>164
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Asn Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>165
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>165
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggccag    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>166
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(440)..(440)
<223>Y440Q
<400>166
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Gln Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>167
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>167
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggcagg    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>168
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(440)..(440)
<223>Y440R
<400>168
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Arg Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>169
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>169
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctct    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>170
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(440)..(440)
<223>Y440S
<400>170
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala  Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Ser Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>171
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>171
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggcact    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>172
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(440)..(440)
<223>Y440T
<400>172
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Thr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>173
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>173
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
actattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>174
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(441)..(441)
<223>E441T
<400>174
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Thr Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>175
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>175
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaactggaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>176
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(442)..(442)
<223>I442L
<400>176
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Leu Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>177
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>177
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaagatagat caaagttttc caggcttctt tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctaatttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gcgtatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>178
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(68)..(68)
<223>N68K
<220>
<221>变异
<222>(77)..(77)
<223>H77F
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(285)..(285)
<223>P285N
<220>
<221>变异
<222>(331)..(331)
<223>V331A
<400>178
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Lys Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe Phe Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                      95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys  Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala  Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                 165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Asn Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Ala Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>179
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>179
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttctt tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctaatttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gcgtatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>180
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(77)..(77)
<223>H77F
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(285)..(285)
<223>P285N
<220>
<221>变异
<222>(331)..(331)
<223>V331A
<400>180
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe Phe Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Asn Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Ala Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>181
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>181
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttctt tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctoct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctaatttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gcgtatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatggc tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>182
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(77)..(77)
<223>H77F
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(285)..(285)
<223>P285N
<220>
<221>变异
<222>(331)..(331)
<223>V331A
<220>
<221>变异
<222>(434)..(434)
<223>M434L
<400>182
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe Phe Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Asn Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Ala Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Leu Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu  Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val  Gly Leu
                565                 570
<210>183
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>183
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttctt tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctaatttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gcgtatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttcggtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>184
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(77)..(77)
<223>H77F
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(285)..(285)
<223>P285N
<220>
<221>变异
<222>(331)..(331)
<223>V331A
<220>
<221>变异
<222>(429)..(429)
<223>P429R
<400>184
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                 55                   60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe Phe Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Asn Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Ala Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Arg Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>185
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>185
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttctt tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaatgg    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctaatttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gcgtatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>186
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(77)..(77)
<223>H77F
<220>
<221>变异
<222>(120)..(120)
<223>T120W
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(285)..(285)
<223>P285N
<220>
<221>变异
<222>(331)..(331)
<223>V331A
<400>186
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe Phe Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Trp Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Asn Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Ala Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>187
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>187
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttctt tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctaatttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gcgtatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggccag    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>188
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(77)..(77)
<223>H77F
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(285)..(285)
<223>P285N
<220>
<221>变异
<222>(331)..(331)
<223>V331A
<220>
<221>变异
<222>(440)..(440)
<223>Y440Q
<400>188
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe Phe Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Asn Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Ala Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Gln Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>189
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>189
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttcctt taatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagt ctttgttgtc    840
ccctatggga ctctcttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tattatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>190
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(277)..(277)
<223>A277V
<220>
<221>变异
<222>(285)..(285)
<223>P285L
<220>
<221>变异
<222>(398)..(398)
<223>F398I
<400>190
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Phe Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Val Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Leu Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Ile Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>191
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>191
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctgggtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctcgggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>192
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(286)..(286)
<223>L286G
<220>
<221>变异
<222>(332)..(332)
<223>Y332S
<400>192
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Gly Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Ser Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>193
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>193
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctcctttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gtctatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttctctgg ccagaatggg ttggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>194
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(429)..(429)
<223>P429L
<220>
<221>变异
<222>(434)..(434)
<223>M434V
<400>194
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Pro Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Leu Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Val Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>195
<211>1722
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<400>195
gaagatgaca tcataattgc aacaaagaat ggaaaagtca gagggatgaa cttgacagtt    60
tttggtggca cggtaacagc ctttcttgga attccctatg cacagccacc tcttggtaga    120
cttcgattca aaaagccaca gtctctgacc aagtggtctg atatttggaa tgccacaaaa    180
tatgcaaatt cttgctgtca gaacatagat caaagttttc caggcttcca tggatcagag    240
atgtggaacc caaacactga cctcagtgaa gactgtttat atctaaatgt atggattcca    300
gcacctaaac caaaaaatgc cactgtattg atatggattt atggtggtgg ttttcaaact    360
ggaacatcat ctttacatgt ttatgatggc aagtttctgg ctcgggttga aagagttatt    420
gtagtgtcaa tgaactatag ggtgggtgcc ctaggattct tagctttgcc aggaaatcct    480
gaggctccag ggaacatggg tttatttgat caacagttgg ctcttcagtg ggttcaaaaa    540
aatatagcag cctttggtgg aaatcctaaa agtgtaactc tctttggaga aagtgcagga    600
gcagcttcag ttagcctgca tttgctttct cctggaagcc attcattgtt caccagagcc    660
attctgcaaa gtggttccgc kaatgctcct tgggcggtaa catctcttta tgaagctagg    720
aacagaacgt tgaacttagc taaattgact ggttgctcta gagagaatga gactgaaata    780
atcaagtgtc ttagaaataa agatccccaa gaaattcttc tgaatgaagc atttgttgtc    840
ccctatggga ctaatttgtc agtaaacttt ggtccgaccg tggatggtga ttttctcact    900
gacatgccag acatattact tgaacttgga caatttaaaa aaacccagat tttggtgggt    960
gttaataaag atgaagggac agctttttta gcgtatggtg ctcctggctt cagcaaagat    1020
aacaatagta tcataactag aaaagaattt caggaaggtt taaaaatatt ttttccagga    1080
gtgagtgagt ttggaaagga atccatcctt tttcattaca cagactgggt agatgatcag    1140
agacctgaaa actaccgtga ggccttgggt gatgttgttg gggattataa tttcatatgc    1200
cctgccttgg agttcaccaa gaagttctca gaatggggaa ataatgcctt tttctactat    1260
tttgaacacc gatcctccaa acttccgtgg ccagaatgga tgggagtgat gcatggctat    1320
gaaattgaat ttgtctttgg tttacctctg gaaagaagag ataattacac aaaagccgag    1380
gaaattttga gtagatccat agtgaaacgg tgggcaaatt ttgcaaaata tgggaatcca    1440
aatgagactc agaacaatag cacaagctgg cctgtcttca aaagcactga acaaaaatat    1500
ctaaccttga atacagagtc aacaagaata atgacgaaac tacgtgctca acaatgtcga    1560
ttctggacat cattttttcc aaaagtcttg gaaatgacag gaaatattga tgaagcagaa    1620
tgggagtgga aagcaggatt ccatcgctgg aacaattaca tgatggactg gaaaaatcaa    1680
tttaacgatt acactagcaa gaaagaaagt tgtgtgggtc tc                       1722
<210>196
<211>574
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>变异
<222>(227)..(227)
<223>Xaa＝Ala
<220>
<221>变异
<222>(285)..(285)
<223>P285N
<220>
<221>变异
<222>(331)..(331)
<223>V331A
<400>196
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe His Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Asn Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Ala Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu Glu Met Thr Gly Asn Ile Asp Glu Ala Glu Trp Glu Trp Lys
    530                 535                 540
Ala Gly Phe His Arg Trp Asn Asn Tyr Met Met Asp Trp Lys Asn Gln
545                 550                 555                 560
Phe Asn Asp Tyr Thr Ser Lys Lys Glu Ser Cys Val Gly Leu
                565                 570
<210>197
<211>642
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(642)
<223>抗-CD20抗体轻链
<400>197
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc    60
ctctcctgca gggccagctc aagtgtaccg tacatccact ggtaccagca gaaacctggc    120
caggctccca ggctcctcat ctatgccaca tccgctctgg cttctggcat cccagacagg    180
ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagact ggagcctgaa    240
gattttgcag tgtattactg tcagcagtgg ctgagtaacc cacccacttt tggccagggg    300
accaagctgg agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct    360
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc    420
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag    480
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg    540
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg    600
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag                       642
<210>198
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(213)
<223>抗CD20抗体轻链
<400>198
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Thr Ser Ala Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Leu Ser Asn Pro Pro Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
            100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
        115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
    130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
                165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
            180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
        195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>199
<211>2298
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2298)
<223>抗CD20抗体VH-CH1铰链cys L530 BChE.4-1重链构建体
<400>199
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc    60
tcctgtaagg gttctggccg tacatttacc agttacaata tgcactgggt gcgccagatg    120
cccgggaaag gcctggagtg gatgggggct atttatccct tgacgggtga tacttcctac    180
aatcagaagt cgaaactcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac    240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagatcgact    300
tacgtgggcg gtgactggca gttcgatgtc tggggcaagg ggaccacggt caccgtctcc    360
tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct    420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg    480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc    540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag    600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagcagag    660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc caaagcttga agatgacatc    720
ataattgcaa caaagaatgg aaaagtcaga gggatgaact tgacagtttt tggtggcacg    780
gtaacagcct ttcttggaat tccctatgca cagccacctc ttggtagact tcgattcaaa    840
aagccacagt ctctgaccaa gtggtctgat atttggaatg ccacaaaata tgcaaattct    900
tgctgtcaga acatagatca aagttttcca ggcttctttg gatcagagat gtggaaccca    960
aacactgacc tcagtgaaga ctgtttatat ctaaatgtat ggattccagc acctaaacca    1020
aaaaatgcca ctgtattgat atggatttat ggtggtggtt ttcaaactgg aacatcatct    1080
ttacatgttt atgatggcaa gtttctggct cgggttgaaa gagttattgt agtgtcaatg    1140
aactataggg tgggtgccct aggattctta gctttgccag gaaatcctga ggctccaggg    1200
aacatgggtt tatttgatca acagttggct cttcagtggg ttcaaaaaaa tatagcagcc    1260
tttggtggaa atcctaaaag tgtaactctc tttggagaaa gtgcaggagc agcttcagtt    1320
agcctgcatt tgctttctcc tggaagccat tcattgttca ccagagccat tctgcaaagt    1380
ggttccgcta atgctccttg ggcggtaaca tctctttatg aagctaggaa cagaacgttg    1440
aacttagcta aattgactgg ttgctctaga gagaatgaga ctgaaataat caagtgtctt    1500
agaaataaag atccccaaga aattcttctg aatgaagcat ttgttgtccc ctatgggact    1560
aatttgtcag taaactttgg tccgaccgtg gatggtgatt ttctcactga catgccagac    1620
atattacttg aacttggaca atttaaaaaa acccagattt tggtgggtgt taataaagat    1680
gaagggacag cttttttagc gtatggtgct cctggcttca gcaaagataa caatagtatc    1740
ataactagaa aagaatttca ggaaggttta aaaatatttt ttccaggagt gagtgagttt    1800
ggaaaggaat ccatcctttt tcattacaca gactgggtag atgatcagag acctgaaaac    1860
taccgtgagg ccttgggtga tgttgttggg gattataatt tcatatgccc tgccttggag    1920
ttcaccaaga agttctcaga atggggaaat aatgcctttt tctactattt tgaacaccga    1980
tcctccaaac ttccgtggcc agaatggatg ggagtgatgc atggctatga aattgaattt    2040
gtctttggtt tacctctgga aagaagagat aattacacaa aagccgagga aattttgagt    2100
agatccatag tgaaacggtg ggcaaatttt gcaaaatatg ggaatccaaa tgagactcag    2160
aacaatagca caagctggcc tgtcttcaaa agcactgaac aaaaatatct aaccttgaat    2220
acagagtcaa caagaataat gacgaaacta cgtgctcaac aatgtcgatt ctggacatca    2280
ttttttccaa aagtctga                                                  2298
<210>200
<211>765
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(765)
<223>抗CD20抗体VH-CH1铰链cys L530 BChE.4-1重链构建体
<400>200
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser
    50                  55                  60
Lys Leu Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
                165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
            180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
        195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys
    210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Lys Leu Glu Asp Asp Ile
225                 230                 235                 240
Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met Asn Leu Thr Val
                245                 250                 255
Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro Tyr Ala Gln Pro
            260                 265                 270
Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser Leu Thr Lys Trp
        275                 280                 285
Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser Cys Cys Gln Asn
    290                 295                 300
Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe Phe Gly Ser Glu Met Trp Asn Pro
305                 310                 315                 320
Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Val Trp Ile Pro
                325                 330                 335
Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp Ile Tyr Gly Gly
            340                 345                 350
Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr Asp Gly Lys Phe
        355                 360                 365
Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met Asn Tyr Arg Val
    370                 375                 380
Gly Ala Leu gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro Glu Ala Pro Gly
385                 390                 395                 400
Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln Trp Val Gln Lys
                405                 410                 415
Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val Thr Leu Phe Gly
            420                 425                 430
Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu Leu Ser Pro Gly
        435                 440                 445
Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser Gly Ser Ala Asn
    450                 455                 460
Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg Asn Arg Thr Leu
465                 470                 475                 480
Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn Glu Thr Glu Ile
                485                 490                 495
Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile Leu Leu Asn Glu
            500                 505                 510
Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Asn Leu Ser Val Asn Phe Gly Pro
        515                 520                 525
Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp Ile Leu Leu Glu
    530                 535                 540
Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly Val Asn Lys Asp
545                 550                 555                 560
Glu Gly Thr Ala Phe Leu Ala Tyr Gly Ala Pro Gly Phe Ser Lys Asp
                565                 570                 575
Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu Gly Leu Lys Ile
            580                 585                 590
Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser Ile Leu Phe His
        595                 600                 605
Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn Tyr Arg Glu Ala
    610                 615                 620
Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys Pro Ala Leu Glu
625                 630                 635                 640
Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala Phe Phe Tyr Tyr
                645                 650                 655
Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu Trp Met Gly Val
            660                 665                 670
Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu Pro Leu Glu Arg
        675                 680                 685
Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser Arg Ser Ile Val
    690                 695                 700
Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro Asn Glu Thr Gln
705                 710                 715                 720
Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr Glu Gln Lys Tyr
                725                 730                 735
Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr Lys Leu Arg Ala
            740                 745                 750
Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys Val
        755                 760                 765
<210>201
<211>530
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的丁酰胆碱酯酶变体
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(530)
<223>L530构建体
<400>201
Glu Asp Asp Ile Ile Ile Ala Thr Lys Asn Gly Lys Val Arg Gly Met
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Val Phe Gly Gly Thr Val Thr Ala Phe Leu Gly Ile Pro
            20                  25                  30
Tyr Ala Gln Pro Pro Leu Gly Arg Leu Arg Phe Lys Lys Pro Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Lys Trp Ser Asp Ile Trp Asn Ala Thr Lys Tyr Ala Asn Ser
    50                  55                  60
Cys Cys Gln Asn Ile Asp Gln Ser Phe Pro Gly Phe Phe Gly Ser Glu
65                  70                  75                  80
Met Trp Asn Pro Asn Thr Asp Leu Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn
                85                  90                  95
Val Trp Ile Pro Ala Pro Lys Pro Lys Asn Ala Thr Val Leu Ile Trp
            100                 105                 110
Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Gln Thr Gly Thr Ser Ser Leu His Val Tyr
        115                 120                 125
Asp Gly Lys Phe Leu Ala Arg Val Glu Arg Val Ile Val Val Ser Met
    130                 135                 140
Asn Tyr Arg Val Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ala Leu Pro Gly Asn Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Phe Asp Gln Gln Leu Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Trp Val Gln Lys Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asn Pro Lys Ser Val
            180                 185                 190
Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val Ser Leu His Leu
        195                 200                 205
Leu Ser Pro Gly Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ala Ile Leu Gln Ser
    210                 215                 220
Gly Ser Xaa Asn Ala Pro Trp Ala Val Thr Ser Leu Tyr Glu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Asn Arg Thr Leu Asn Leu Ala Lys Leu Thr Gly Cys Ser Arg Glu Asn
                245                 250                 255
Glu Thr Glu Ile Ile Lys Cys Leu Arg Asn Lys Asp Pro Gln Glu Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Asn Glu Ala Phe Val Val Pro Tyr Gly Thr Asn Leu Ser Val
        275                 280                 285
Asn Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Leu Thr Asp Met Pro Asp
    290                 295                 300
Ile Leu Leu Glu Leu Gly Gln Phe Lys Lys Thr Gln Ile Leu Val Gly
305                 310                 315                 320
Val Asn Lys Asp Glu Gly Thr Ala Phe Leu Ala Tyr Gly Ala Pro Gly
                325                 330                 335
Phe Ser Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Thr Arg Lys Glu Phe Gln Glu
            340                 345                 350
Gly Leu Lys Ile Phe Phe Pro Gly Val Ser Glu Phe Gly Lys Glu Ser
        355                 360                 365
Ile Leu Phe His Tyr Thr Asp Trp Val Asp Asp Gln Arg Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Tyr Arg Glu Ala Leu Gly Asp Val Val Gly Asp Tyr Asn Phe Ile Cys
385                 390                 395                 400
Pro Ala Leu Glu Phe Thr Lys Lys Phe Ser Glu Trp Gly Asn Asn Ala
                405                 410                 415
Phe Phe Tyr Tyr Phe Glu His Arg Ser Ser Lys Leu Pro Trp Pro Glu
            420                 425                 430
Trp Met Gly Val Met His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val Phe Gly Leu
        435                 440                 445
Pro Leu Glu Arg Arg Asp Asn Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Ile Leu Ser
    450                 455                 460
Arg Ser Ile Val Lys Arg Trp Ala Asn Phe Ala Lys Tyr Gly Asn Pro
465                 470                 475                 480
Asn Glu Thr Gln Asn Asn Ser Thr Ser Trp Pro Val Phe Lys Ser Thr
                485                 490                 495
Glu Gln Lys Tyr Leu Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Arg Ile Met Thr
            500                 505                 510
Lys Leu Arg Ala Gln Gln Cys Arg Phe Trp Thr Ser Phe Phe Pro Lys
        515                 520                 525
Val Leu
    530

Claims (9)

1.含有选自SEQ ID NO：32、54、86和180的氨基酸序列的丁酰胆碱酯酶变体，或者通过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加衍生自所述丁酰胆碱酯酶变体的丁酰胆碱酯酶变体。
2.权利要求1的丁酰胆碱酯酶变体，其中所述丁酰胆碱酯酶变体含有SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列，或者所述丁酰胆碱酯酶变体通过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加衍生自所述SEQ ID NO：180序列。
3.权利要求1或2的丁酰胆碱酯酶变体，其进一步含有特异结合表皮生长因子受体的抗体或抗体片段。
4.权利要求1或2的丁酰胆碱酯酶变体，其进一步含有特异结合CD20细胞表面抗原的抗体或抗体片段。
5.权利要求1-4之任一项的丁酰胆碱酯酶变体，其用作药物。
6.用作药物的包含SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列的丁酰胆碱酯酶变体或通过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加衍生自所述SEQ IDNO：180序列的丁酰胆碱酯酶变体。
7.权利要求1-4之任一项的丁酰胆碱酯酶变体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
8.包含SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列的丁酰胆碱酯酶变体或通过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加衍生自所述SEQ ID NO：180序列的丁酰胆碱酯酶变体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
9.权利要求1的丁酰胆碱酯酶变体，其由SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列组成。
CNB2003801050807A 2002-12-04 2003-12-04 改变化学治疗剂的活性的丁酰胆碱酯酶变体 Expired - Fee Related CN100341568C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31066602A 2002-12-04 2002-12-04
US10/310,666 2002-12-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1720063A CN1720063A (zh) 2006-01-11
CN100341568C true CN100341568C (zh) 2007-10-10

Family

ID=32468084

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2003801050807A Expired - Fee Related CN100341568C (zh) 2002-12-04 2003-12-04 改变化学治疗剂的活性的丁酰胆碱酯酶变体

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20080213281A1 (zh)
EP (1) EP1581253A4 (zh)
JP (1) JP2006508665A (zh)
CN (1) CN100341568C (zh)
AU (1) AU2003298920A1 (zh)
BR (1) BR0316865A (zh)
CA (1) CA2507626A1 (zh)
MX (1) MXPA05005996A (zh)
WO (1) WO2004050041A2 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6989261B2 (en) * 2001-12-20 2006-01-24 Eli Lilly And Company Butyrylcholinesterase variant polypeptides with increased catalytic efficiency and methods of use
AR044388A1 (es) * 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
JP2009545329A (ja) * 2006-08-04 2009-12-24 ファーマシーネ，インコーポレイテッド 長い半減期の組換え型ブチリルコリンエステラーゼ
US20100009390A1 (en) * 2008-05-09 2010-01-14 The Regents Of The University Of California Mutant antibodies with high affinity for egfr
US20100008978A1 (en) * 2008-05-09 2010-01-14 The Regents Of The University Of California Nanoparticles effective for internalization into cells
WO2009139905A2 (en) * 2008-05-16 2009-11-19 Nektar Therapeutics Conjugates of a cholinesterase moiety and a polymer
CA2784861A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Pharmathene, Inc. Recombinant butyrylcholinesterases and truncates thereof
CN103898101B (zh) * 2012-12-27 2017-08-08 上海桀蒙生物技术有限公司 利用转基因动物乳腺生物平台大规模生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法
CN104630177A (zh) * 2013-11-08 2015-05-20 中国农业大学 一种利用人丁酰胆碱酯酶迷你基因在乳腺中表达重组人丁酰胆碱脂酶的方法
EP3719123A1 (en) 2014-04-29 2020-10-07 Mayo Foundation for Medical Education and Research Uses of butyrylcholinesterase variants having an enhanced ability to hydrolyze acyl-ghrelin
US11865163B2 (en) 2016-09-15 2024-01-09 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for using butyrylcholinesterases to treat cancer

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6001625A (en) * 1995-05-19 1999-12-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Site-directed mutagenesis of esterases
WO1999066072A2 (en) * 1998-06-16 1999-12-23 Nova Molecular, Inc. Methods for treating a neurological disease by determining bche genotype
CN1331339A (zh) * 2000-06-26 2002-01-16 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人dna拓扑异构酶i11.44和编码这种多肽的多核苷酸
WO2002064796A2 (en) * 2000-12-26 2002-08-22 Applied Molecular Evolution, Inc. Butyrylcholinesterase polypeptide variants with increased catalytic efficiency and methods of use

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0378576B1 (en) * 1987-09-11 1995-01-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Transduced fibroblasts and uses therefor
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) * 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5264563A (en) * 1990-08-24 1993-11-23 Ixsys Inc. Process for synthesizing oligonucleotides with random codons
US5643578A (en) * 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
US5620896A (en) * 1992-03-23 1997-04-15 University Of Massachusetts Medical Center DNA vaccines against rotavirus infections
US5506125A (en) * 1993-12-22 1996-04-09 Agracetus, Inc. Gene delivery instrument with replaceable cartridges
US5605793A (en) * 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5656465A (en) * 1994-05-04 1997-08-12 Therion Biologics Corporation Methods of in vivo gene delivery
US20030153062A1 (en) * 2001-12-20 2003-08-14 Watkins Jeffry D. Butyrylcholinesterase variant polypeptides with increased catalytic efficiency and methods of use
US7070973B2 (en) * 2000-12-26 2006-07-04 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Butyrylcholinesterase variants and methods of use
US6989261B2 (en) * 2001-12-20 2006-01-24 Eli Lilly And Company Butyrylcholinesterase variant polypeptides with increased catalytic efficiency and methods of use
US7049121B2 (en) * 2001-12-20 2006-05-23 Applied Molecular Evolution Butyrylcholinesterase variant polypeptides with increased catalytic efficiency and methods of use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6001625A (en) * 1995-05-19 1999-12-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Site-directed mutagenesis of esterases
WO1999066072A2 (en) * 1998-06-16 1999-12-23 Nova Molecular, Inc. Methods for treating a neurological disease by determining bche genotype
CN1331339A (zh) * 2000-06-26 2002-01-16 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人dna拓扑异构酶i11.44和编码这种多肽的多核苷酸
WO2002064796A2 (en) * 2000-12-26 2002-08-22 Applied Molecular Evolution, Inc. Butyrylcholinesterase polypeptide variants with increased catalytic efficiency and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The anticancer prodrug CPT-11 is a potent inhibitor ofacetylcholinesterase but is rapidly catalyzed to SN-38 bybutyrylcholinesterase Christopher L. Morton,et al.,Cancer research,No.59 1999 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20080213281A1 (en) 2008-09-04
EP1581253A4 (en) 2007-02-14
WO2004050041A2 (en) 2004-06-17
CN1720063A (zh) 2006-01-11
AU2003298920A1 (en) 2004-06-23
WO2004050041A3 (en) 2004-10-28
MXPA05005996A (es) 2006-04-18
JP2006508665A (ja) 2006-03-16
CA2507626A1 (en) 2004-06-17
EP1581253A2 (en) 2005-10-05
BR0316865A (pt) 2005-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7091423B2 (ja) 改変ｃｄ１６が関係するポリペプチド、細胞、及び方法
Doherty et al. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo
CN100341568C (zh) 改变化学治疗剂的活性的丁酰胆碱酯酶变体
CN1606453A (zh) Cripto阻断抗体及其用途
CN1596313A (zh) 人源化的胶原抗体及相关方法
CN1636017A (zh) 含有蛋白酶激活序列的气单胞菌溶素原及其在前列腺癌治疗中的使用方法
CN1229499C (zh) 磷酸二酯酶8a
CN1753911A (zh) 调节血管生成的α5β1整合素的嵌合的和人源化的抗体
Richard et al. The binding site of human adenosine deaminase for CD26/Dipeptidyl peptidase IV: the Arg142Gln mutation impairs binding to cd26 but does not cause immune deficiency
CN1575302A (zh) 人组织因子抗体
CN1739788A (zh) Trip－br功能的调节和治疗增殖性紊乱的方法
CN1527723A (zh) 用cd2-结合剂治疗或预防皮肤病症的方法
WO2007058381A1 (ja) 基質特異性を変換した新規高機能酵素
CN1606569A (zh) 具有mn结合和细胞粘附中和活性的人类抗体
CN1433466A (zh) Masp－3,一种固定补体的酶,及其应用
CN1694902A (zh) 调节癌症的方法
CN101060863A (zh) 疼痛的治疗和预防中神经胶质细胞来源的bdnf的调节
CN1768142A (zh) 嵌合多肽及其用途
CN1250717C (zh) 金属蛋白酶家族中的人酶
CN1961073A (zh) 切割型dance、dance复合体及其使用方法
CN1774634A (zh) 作用于酪氨酸激酶以诊断和治疗骨关节炎的方法和组合物
CN1590407A (zh) 多功能性造血受体激动剂
CN1575338A (zh) 具有促细胞分裂活性的Bv8的核酸和多肽
CN1947012A (zh) 激动剂抗－trkC抗体和使用其的方法
CN101035554A (zh) 介导应激反应的肽抑制剂

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee