CN1947012A - 激动剂抗－trkC抗体和使用其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及激动剂抗－trkC抗体、多肽和编码其的多核苷酸。本发明进一步涉及所述抗体、多肽和/或多核苷酸在神经病，如感觉神经病，包括紫杉酚－诱发的感觉神经病、顺氯氨铂－诱发的感觉神经病和吡哆醇－诱发的感觉神经病的治疗和/或预防中的用途。

Description

激动剂抗-trkC抗体和使用其的方法
            相关申请的交叉引用
本申请要求2003年12月23目申请的美国临时申请系列No.60/532,592的利益，其作为参考整体引入本文。
                发明领域
本发明涉及激动剂抗-trkC抗体和多肽。本发明进一步涉及所述抗体和多肽在疾病，如感觉神经病的治疗和/或预防中的用途。
        关于联邦赞助研究或开发的声明
不适用。
                发明背景
神经营养蛋白为小的同型二聚体蛋白家族，其在神经系统的发育和维持中起着非常重要的作用。该神经营养蛋白家族的成员包括神经生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)、神经营养蛋白-6(NT-6)和神经营养蛋白-7(NT-7)。神经营养蛋白，与其他的多肽生长因子类似，通过与细胞表面受体的相互作用而影响其靶细胞。根据当前的认识，两类跨膜糖蛋白充当神经营养蛋白的受体。神经营养蛋白-应答的神经元具有常见的低分子量(65-80kD)、低亲合力的受体(LNGFR)，也称为p75NTR或p75，其以2×10-9M的KD结合NGF、BDNF、NT-3和NT-4/5；和大分子量(130-150kD)、高-亲合力(10-11M范围的KD)的受体，其为受体酪氨酸激酶trk家族的成员。trk受体家族鉴定的成员有trkA、trkB和trkC。
TrkC在中枢神经系统中以及在外周神经系统神经元的亚单位上广泛表达。TrkC还在一些副交感神经、肠神经元和一些非神经组织上表达。其在交感神经原上以及DRG的第一级感觉神经元(DRG的大纤维感觉神经元)亚单位上表达。大纤维感觉神经元具有延伸至外周的大有髓轴突，其中其传达有关本体感觉的信息和精细触觉以及振动感觉。
全长天然trkA、trkB和trkC受体的胞外域具有5个结构域，其根据各种其他蛋白质中鉴定的同源或换言之类似的结构而确定。从成熟trk受体的氨基酸序列N末端开始，这些域依次为：1)第一个半胱氨酸富集域；2)亮氨酸-富集域；3)第二个半胱氨酸-富集域；4)第一个免疫球蛋白样结构域；和5)第二个免疫球蛋白样结构域。参见，例如PCT公开文本WO0198361；Urfer等.，J.Biol.Chem.273：5829-5840(1998)。
神经营养蛋白作为用于各种神经变性和神经学疾病的潜在治疗剂而受人关注。神经营养蛋白，如NGF和NT-3，已在动物模型中检验用于治疗与吡哆醇或顺铂治疗有关的感觉神经病。美国专利No.5,604,202；PCT公开文本WO0198361。在神经变性和神经学上疾病治疗中使用神经营养蛋白具有若干缺点。一个显著的缺点是缺乏特异性。大多数神经营养蛋白与一种以上的受体有交叉反应。例如，NT-3这种优选的trkC受体酪氨酸激酶的配体，还结合并活化trkA和trkB(Barbacid，J.Neurobiol.25：1386-1403，1994；Barbarcid，Ann.New York Acad.Sci.766：442-458，1995；Ryden和Ibanez，J.Biol.Chem.271：5623-5627，1996；Belliveau等，J.Biol.Chem.136：375-388，1997；Farinas等，Neuron 21：325-334，1998)。其结果是，很难设计目标为特异性神经元群体的治疗。神经营养蛋白治疗的另一个限制是，已知神经营养蛋白，包括NT-3，能引发痛觉过敏(Chaudhry等，Muscle and Nerve 23：189-192，2000)。此外，某些神经营养蛋白比如NT-3在啮齿类动物中有差的药物动力学和生物利用率特性，这就产生了有关其在人类临床应用方面的严重问题(Haase等，J.Neurol.Sci.160：S97-S105，1998，Helgren等在J.Neurol.17(1)：372-82，1997中所用的剂量)。由此，对开发治疗神经变性病症和神经学疾病，且没有现有神经营养蛋白缺点的新的治疗剂有很大的需求。
已报道了啮齿类激动剂抗-trkC抗体。参见PCT公开文本WO01/98361。然而，当啮齿类抗体治疗性地用于人时，在大量治疗个体中出现人抗-鼠抗体反应。此外，已证实小鼠抗体的效应物功能在人范围中较少有效。因此，对改进的激动剂抗-trkC抗体，包括人源化的激动剂抗-trkC促效抗体有着强烈的需求。
此处所有参考文献、出版物和公开的专利申请在此作为参考整体引入本文。
                        发明概述
在此公开的本发明涉及针对trkC受体的激动剂抗体。因此，在一个方面，本发明为人源化的和成熟亲合力的抗体A5，其特异性结合人和啮齿类的trkC受体(″trkC″)。A5的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别在图1A(SEQ ID NO：1)和1B(SEQ ID NO：2)中显示。抗体A5的互补决定区(CDR)部分(包括Chothia和Kabat CDR)在图1A和1B中用图解法描述。A5重链和轻链以及个别延长的CDR的氨基酸序列也在底下显示(参见，″抗体序列″，底下)。
本发明还提供包括含有以下重链CDR的激动剂抗-trkC抗体(在一些实施方案中，为多肽)：(a)式GYTFTSYXaaXaaH(SEQ ID NO：16)的CDR1，其中位置8的Xaa为R或W，以及位置9的Xaa为I、L、R或M；(b)式EIYPSNXaaRTNYNEKFXaaS(SEQ ID NO：17)的CDR2，其中位置7的Xaa为A、T、S或G；以及位置16的Xaa为K或E；和(c)式KYYYGNXaaXaaRSWYFDV(SEQ ID NO：18)的CDR3，其中位置7的Xaa为T或S；其中位置8的Xaa为R、Q、K、S或Y；其中该抗体不是包括含有SEQ ID NO：22的CDR1区域、SEQ ID NO：23的CDR2区域和SEQ ID NO：24的CDR3区域的重链CDR的抗体。在一些实施方案中，CDR1具有式GYTFTSYXaaXaaH(SEQ ID NO：16)的序列，其中位置8的Xaa为R，并且位置9的Xaa为I、L或R。在一些实施方案中，CDR2具有式EIYPSNXaaRTNYNEKFXaaS(SEQ ID NO：17)的序列，其中位置7的Xaa为A、T或S；以及位置16的Xaa为K或E。在一些实施方案中，CDR3具有式KYYYGNXaaXaaRSWYFDV(SEQ ID NO：18)的序列，其中位置7的Xaa为T；其中位置8的Xaa为R、Q、K或S。在一些实施方案中，抗体包括轻链可变区。
本发明还提供包括含有以下轻链CDR的激动剂抗-trkC抗体(在一些实施方案中，为多肽)：(a)式RASESXaaDXaaYGISFXaaXaa(SEQID NO：19)的CDR1，其中位置6的Xaa为I或V；位置8的Xaa为N或S；位置14的Xaa为L或M；位置15的Xaa为A、T或N；(b)式AASNXaaGS(SEQ ID NO：20)的CDR2，其中位置5的Xaa为R、L或Q；和(c)式QQSKXaaVPRT(SEQ ID NO：21)的CDR3，其中位置5的Xaa为T、A、S或E；其中该抗体不是包括含有SEQ ID NO：25的CDR1区域、SEQ ID NO：26的CDR2区域和SEQ ID NO：27的CDR3区域的轻链CDR的抗体。在一些实施方案中，CDR1具有式RASESXaaDXaaYGISFXaaXaa(SEQ ID NO：19)的序列，其中位置6的Xaa为I；位置8的Xaa为N或S；位置14的Xaa为L；位置15的Xaa为A或T。在一些实施方案中，CDR2具有式AASNXaaGS(SEQ ID NO：20)的序列，其中位置5的Xaa为R或L。在一些实施方案中，CDR3具有QQSKXaaVPRT(SEQ ID NO：21)的序列，其中位置5的Xaa为T、A或S。在一些实施方案中，抗体包括重链可变区。
本发明还提供激动剂抗-trkC抗体(在一些实施方案中，为多肽)，包括：(a)重链CDR，包括：(i)式GYTFTSYXaaXaaH(SEQ ID NO：16)的CDR1，其中位置8的Xaa为R或W，以及位置9的Xaa为I、L、R或M；(ii)式EIYPSNXaaRTNYNEKFXaaS(SEQ ID NO：17)的CDR2，其中位置7的Xaa为A、T、S或G；以及位置16的Xaa为K或E；和(iii)式KYYYGNXaaXaaRSWYFDV(SEQ ID NO：18)的CDR3，其中位置7的Xaa为T或S；其中位置8的Xaa为R、Q、K、S或Y；和(b)轻链CDR，包括：(i)式RASESXaaDXaaYGISFXaaXaa(SEQ ID NO：19)的CDR1，其中位置6的Xaa为I或V；位置8的Xaa为N或S；位置14的Xaa为L或M；位置15的Xaa为A、T或N；(ii)式AASNXaaGS(SEQ ID NO：20)的CDR2，其中位置5的Xaa为R、L或Q；和(iii)式QQSKXaaVPRT(SEQ ID NO：21)的CDR3，其中位置5的Xaa为T、A、S或E；其中该抗体不是下述抗体，即包括(a)含有SEQ ID NO：22的CDR1区域、SEQ ID NO：23的CDR2区域和SEQ ID NO：24的CDR3区域的重链CDR；和(b)含有SEQ ID NO：25的CDR1区域、SEQ ID NO：26的CDR2区域和SEQ ID NO：27的CDR3区域的轻链CDR的抗体。
在另一个方面，本发明为包括抗体A5(此处可互换称为″A5″)的片段或区域的抗体。在一个实施方案中，片段为如SEQ ID NO：29中所示的抗体A5的轻链。在另一个实施方案中，片段为如SEQ ID NO：28中所示的抗体A5的重链。在又一个实施方案中，片段含有来自抗体A5的轻链和/或重链的一个或多个可变区。在又一个实施方案中，片段含有来自如图1A和1B中所示的抗体A5的轻链和/或重链的一个或多个CDR。
在另一个方面，本发明为包含由保藏号为ATCC No.PTA-5682的宿主细胞产生的多核苷酸所编码轻链的抗体。在另一个方面，本发明为包含由保藏号为ATCC No.PTA-5683的宿主细胞产生的多核苷酸所编码重链的抗体。在另一个方面，本发明为抗体，包括(a)由保藏号为ATCC No.PTA-5682的宿主细胞产生的多核苷酸所编码的轻链；和(b)由保藏号为ATCC No.PTA-5683的宿主细胞产生的多核苷酸所编码的重链(此处为了方便起见，由保藏的宿主细胞产生的多核苷酸称为具有ATCC NO.PTA-5682和PTA-5683的保藏号)。在另一个方面，本发明为包含由保藏号为ATCC No.PTA-5682的宿主细胞产生的多核苷酸所编码轻链可变区的抗体。在另一个方面，本发明为包含由保藏号为ATCCNo.PTA-5683的宿主细胞产生的多核苷酸所编码重链可变区的抗体。在另一个方面，本发明为抗体，包括(a)由保藏号为ATCC No.PTA-5683的宿主细胞产生的多核苷酸编码的重链可变区和(b)由保藏号为ATCCNo.PTA-5682的宿主细胞产生的多核苷酸编码的轻链可变区。仍然在另一个方面，本发明为抗体，包括由(a)由保藏号为ATCC No.PTA-5682的宿主细胞产生的多核苷酸编码的一个或多个CDR；和/或(b)由保藏号为ATCC No.PTA-5683的宿主细胞产生的多核苷酸编码的重链。
在一些实施方案中，抗体包括修饰的恒定区，如免疫惰性的，例如不引发补体介导的溶解或不刺激抗体-依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)的恒定区。在其他实施方案中，恒定区如Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624；PCT申请No.PCT/GB99/01441；和/或英国专利申请No.9809951.8中所述的而修饰。仍然在其他实施方案中，抗体包括含有下列突变：A330P331至S330S331(氨基酸编号对照野生IgG2a序列)的人重链IgG2a恒定区。Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624。
在另一个方面，本发明提供包括下列任何一个或多个的多肽(其可以是或不是抗体)：a)图1A和1B中所示的抗体A5的一个或多个CDR；b)来自图1A中所示的抗体A5重链的CDRH3；c)来自图1B中所示的抗体A5轻链的CDRL3；d)来自图1B中所示的抗体A5轻链的三个CDR；e)来自图1A中所示的抗体A5重链的三个CDR；和f)来自图1A和1B中所示的抗体A5轻链的三个CDR和重链的三个CDR。本发明进一步提供包括下列任何一个或多个的多肽(其可以是或不是抗体)：a)源自图1A和1B中所示的抗体A5的一个或多个(一个、两个、三个、四个、五个或六个)CDR；b)源自来自图1A中所示的抗体A5重链的CDRH3的CDR；和/或c)源自来自图1B中所示的抗体A5轻链的CDRL3的CDR。
本发明还提供包括下列任何一个或多个的多肽(其可以是或不是抗体)：(a)式GYTFTSYXaaXaaH(SEQ ID NO：16)的序列，其中位置8的Xaa为R或W；以及位置9的Xaa为I、L、R或M；其中序列不是GYTFTSYWMH(SEQ ID NO：22)；(b)式GYTFTSYXaaXaaH(SEQ IDNO：16)的序列，其中位置8的Xaa为R；以及位置9的Xaa为I、L或R；(c)式EIYPSNXaaRTNYNEKFXaaS(SEQ ID NO：17)的序列，其中位置7的Xaa为A、T、S或G；以及位置16的Xaa为K或E；其中序列不是EIYPSNGRTNYNEKFKS(SEQ ID NO：23)；(d)式EIYPSNXaaRTNYNEKFXaaS(SEQ ID NO：17)的序列，其中位置7的Xaa为A、T或S；以及位置16的Xaa为K或E；(e)式KYYYGNXaaXaaRSWYFDV(SEQ ID NO：18)的序列，其中位置7的Xaa为T或S；其中位置8的Xaa为R、Q、K、S或Y；其中序列不是KYYYGNSYRSWYFDV(SEQ IDNO：24)；(f)式KYYYGNXaaXaaRSWYFDV(SEQ ID NO：18)的序列，其中位置7的Xaa为T；其中位置8的Xaa为R、Q、K或S；(g)式RASESXaaDXaaYGISFXaaXaa(SEQ ID NO：19)的序列，其中位置6的Xaa为I或V；位置8的Xaa为N或S；位置14的Xaa为L或M；位置15的Xaa为A、T或N；其中序列不是RASESVDNYGISFMN(SEQ ID NO：25)；(h)式RASESXaaDXaaYGISFXaaXaa(SEQ ID NO：19)的序列，其中位置6的Xaa为1；位置8的Xaa为N或S；位置14的Xaa为L；位置15的Xaa为A或T；(i)式AASNXaaGS(SEQ ID NO：20)的序列，其中位置5的Xaa为R或L；(j)式QQSKXaaVPRT(SEQ ID NO：21)的序列，其中位置5的Xaa为T、A或S。
在一些实施方案中，本发明提供任何上述抗体，进一步其中抗体为人的。在其他实施方案中，本发明提供任何上述抗体，进一步其中抗体为人源化的。在一些实施方案中，抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体结合人trkC。在一些实施方案中，抗体优先结合人trkC。在一些实施方案中，抗体以小于约5nM的KD结合人trkC。在一些实施方案中，抗体另外结合啮齿类trkC。
当然明确排除由和小鼠单克隆抗体2256的序列相同的序列(多核苷酸或氨基酸)组成的实施方案(多核苷酸或多肽)。2256可变区(包括CDR区域)的氨基酸序列在图2A和2B中显示。
在另一个方面，本发明提供分离的多核苷酸，其包括编码抗体A5(此处可互换称为″A5″)的片段或区域的多核苷酸。在一个实施方案中，片段为图1B中所示的抗体A5的轻链。在另一个实施方案中，片段为如图1A中所示的抗体A5的重链。在又一个实施方案中，片段含有来自抗体A5的轻链和/或重链的一个或多个可变区。在又一个实施方案中，片段含有来自如图1A和1B中所示的抗体A5的轻链和/或重链的一个或多个互补决定区(CDR)。
在另一个方面，本发明为包括编码抗体A5的多核苷酸的分离的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包括SEQ ID NO：11和13中所示的多核苷酸。在另一个实施方案中，多核苷酸包括SEQ ID NO：10和12中所示的多核苷酸。
在另一个方面，本发明为具有保藏号ATCC No.PTA-5682的编码A5轻链的分离的多核苷酸。在另一个方面，本发明为具有保藏号ATCCNo.PTA-5683的编码A5重链的分离的多核苷酸。在又一个方面，本发明为分离的多核苷酸，包括(a)具有保藏号ATCC No.PTA-5682的编码可变区的多核苷酸和(b)具有保藏号ATCC No.PTA-5683的编码可变区的多核苷酸。在又一个方面，本发明为分离的多核苷酸，包括(a)具有保藏号ATCC No.PTA-5682的编码一个或多个CDR的多核苷酸；和/或(b)具有保藏号ATCC No.PTA-5683的编码一个或多个CDR的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供编码此处所述的任何抗体(包括抗体片段)或多肽的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供包含此处公开的任何多核苷酸的载体(包括表达和克隆载体)和宿主细胞。
在另一个方面，本发明为包含编码A5轻链的多核苷酸和编码A5重链的多核苷酸的宿主细胞，其中编码A5轻链的多核苷酸具有保藏号ATCC No.PTA-5682，以及编码A5重链的多核苷酸具有保藏号ATCCNo.PTA-5683(此处为了方便起见，由保藏的宿主细胞产生的多核苷酸称为具有保藏号ATCC No.PTA-5682和PTA-5683)。在一些实施方案中，宿主细胞包含多核苷酸，其包括(a)具有保藏号ATCC No.PTA-5682的编码可变区的多核苷酸和/或(b)具有保藏号ATCC No.PTA-5683的编码可变区的多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包含多核苷酸，其包括(a)具有保藏号ATCC No.PTA-5682的编码一个或多个CDR的多核苷酸；和/或(b)具有保藏号ATCC No.PTA-5683的编码一个或多个CDR的多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞为哺乳动物细胞。
在另一个方面，本发明提供以保藏号ATCC No.PTA-5683保藏在ATCC的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供以保藏号ATCCNo.PTA-5682保藏在ATCC的多核苷酸。
在另一个方面，本发明为由抗体A5结合的trkC复合物。在一些方面中，复合物是分离的。在一些实施方案中，trkC为人的。
在另一个方面，本发明为由此处所述的任何抗体或多肽结合的trkC复合物。在一些方面中，复合物是分离的。
在另一个方面，本发明为包括此处所述的任何多肽(包括如抗体A5的抗体)或多核苷酸的药物组合物，如包括抗体A5或含有抗体A5的片段的抗体，以及药物可接受赋形剂的药物组合物。
在另一个方面，本发明为产生抗体A5的方法，包括制备包含编码抗体A5的表达载体的宿主细胞；在允许抗体A5产生的条件下培养物宿主细胞或其子代；和纯化抗体A5。在一些实施方案中，多核苷酸包括SEQ ID NO：11和13中所示的多核苷酸。在另一个实施方案中，多核苷酸包括SEQ ID NO：10和12中所示的多核苷酸。
在另一个方面，本发明为产生抗体A5的方法，包括在合适的细胞中表达编码A5轻链的多核苷酸和编码A5重链的多核苷酸，其中编码A5轻链的多核苷酸具有保藏号ATCC No.PTA-5682，以及编码A5重链的多核苷酸具有保藏号ATCC No.PTA-5683；通常随后回收和/或分离抗体。
在另一个方面，本发明提供通过在合适的细胞中表达编码抗体的一个或多个多核苷酸(其可以单一轻链或重链分别表达，或轻链或重链表达自一个载体)，通常随后回收和/或分离目的抗体或多肽而产生此处所述的任何抗体的方法。
在另一个方面，本发明为利用此处公开的任何多肽(包括如抗体A5的抗体)激活人trkC或其他哺乳动物trkC生物学活性的方法。在一个实施方案中，该方法包括将人trkC与此处所述的任何多肽(包括抗体A5)接触，由此激活人trkC的活性。
在另一个方面，本发明为利用此处所述的的任何多肽(包括如抗体A5的抗体)检测trkC的方法。通过检测trkC和此处所述的任何多肽(如抗体A5)之间的复合物而检测trkC的存在。如此处所用的术语″检测″包括在有无对照时的定性和/或定量检测(测定水平)。
在另一个方面，本发明为通过将有效量的包括抗体A5或此处所述的任何多肽(包括抗体)或多核苷酸实施方案的组合物给药而治疗感觉神经病，如大纤维感觉神经病的方法。在一些实施方案中，感觉神经病为紫杉酚-诱发的感觉神经病。在一些实施方案中，感觉神经病为顺氯氨铂-诱发的感觉神经病。在一些实施方案中，感觉神经病为吡哆醇-诱发的感觉神经病。
在另一个方面，本发明提供包括此处所述的任何一种或多种组合物的试剂盒和组合物。这些通常合适地包装和备有相应说明书的试剂盒可用于此处所述的任何方法。
本发明还提供用于此处所述任何用途的此处所述的任何组合物(如抗体、多肽、多核苷酸)，而不论其是否在用作药物和/或药物制造的范围内(例如)。
在一些实施方案中，本发明的多肽或抗体不包括此处所排除的。根据此处的式，对于本领域技术人员显而易见的是可独立选择每个氨基酸的取代。本发明还提供其中排除一个或多个氨基酸取代的式。
                    附图简述
图1A：显示了A5抗体重链可变区的氨基酸序列(标记为A5-H)。延长的CDR加上框并且Chothia CDR和Kabat CDR分别通过斜体文本和粗体文本描述。可变区的氨基酸残基连续编号。
图1B：显示了A5抗体轻链可变区的氨基酸序列(标记为A5-L)。延长的CDR加上框并且Chothia CDR和Kabat CDR分别通过斜体文本和粗体文本描述。可变区的氨基酸残基连续编号。
图2A：显示了小鼠单克隆的激动剂抗-trkC抗体2256重链可变区的氨基酸序列(标记为2256H)。延长的CDR加上框并且Chothia CDR和Kabat CDR分别通过斜体文本和粗体文本描述。可变区的氨基酸残基连续编号。
图2B：显示了小鼠单克隆的激动剂抗-trkC抗体2256轻链可变区的氨基酸序列(标记为2256L)。延长的CDR加上框并且Chothia CDR和Kabat CDR分别通过斜体文本和粗体文本描述。可变区的氨基酸残基连续编号。
图3：为显示小鼠单克隆的激动剂抗-trkC抗体2256和抗体A5在鼠E20三叉神经神经元存活测定法中促效活性的图。
图4：为比较小鼠单克隆的激动剂抗-trkC抗体2256和抗体A5利用KIRA所测定的活性的图。
图5A：为显示在对照、PDX、PDX+QL2HNT3和PDX+A5治疗的动物中测定的感觉神经振幅的图。
图5B：为显示在对照、PDX、PDX+QL2HNT3和PDX+A5治疗的动物中测定的感觉神经传导速率的图。
图5C：为显示在对照、PDX、PDX+QL2HNT3和PDX+A5治疗的动物中测定的H型波的图。
图5D：为显示在对照、PDX、PDX+QL2HNT3和PDX+A5治疗的动物中测定的滑倒数的图。
图6：为显示在对照、CDDP、CDDP+2256(2mg/kg)、CDDP+2256(10mg/kg)、CDDP+A5(2mg/kg)和CDDP+A5(10mg/kg)治疗的动物中测定的尾神经传导速率的图。
                   发明详述
此处公开的本发明提供结合trkC的抗体和多肽(如A5)，以及制备和使用这些抗体的方法。在一些实施方案中，本发明提供人源化抗体A5，其结合trkC受体(″trkC″)，以及制备和使用该抗体的方法。本发明还提供结合trkC的A5多肽(包括抗体)，以及编码A5抗体和/或多肽的多核苷酸。
此处公开的本发明还提供通过将治疗有效量的激动剂抗-trkC抗体给药而预防和/或治疗个体中感觉神经病(如紫杉酚-诱发的感觉神经病)的方法。
常规技术
除非另有陈述，本发明的操作将应用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规方法，其均在本领域的技术范围内。所述技术在文献中充分阐明，如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等.，1989)Cold SpringHarbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Methods in Molecular Biology，Humana；Cell Biology：A LaboratoryNotebook(J.E.Cellis，ed.，1998)Academic Press；Animal CellCulture(R.I.Freshney，ed.，1987)Introduction to Cell and TissueCulture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell andTissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths，和D.G.Newell，eds.，1993-1998)J.Wiley和Sons；Methods inEnzymology(AcademicPress，Inc；Handbook of ExperimentalImmunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.)；Gene TransferVectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos，eds.，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等.，eds.，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等.，eds.，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等.，eds.，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.，ed.，IRLPress，1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd和C.Dean，eds.，OxfordUniversity Press，2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra，eds.，Harwood AcademicPublishers，1995)。
定义
″抗体″为能通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别点特异性结合靶，如糖类、多核苷酸、脂类、多肽等等的免疫球蛋白分子。如此处所用的，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(ScFv)、其变体、包括抗体部分的融合蛋白和包括抗原识别点的任何其他免疫球蛋白分子的修饰构型。抗体包括任何种类的抗体，如IgG、IgA或IgM(或其亚类)和无须为任何具体种类的抗体。根据其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同的类型。有五种主要的免疫球蛋白类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中的一些可以被进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类型的免疫球蛋白相对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。
如此处所用的，″单克隆抗体″指获自基本上同源的抗体群体的抗体，即除了可小量存在的天然存在的突变，包含群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的，针对单一的抗原位点。此外，与多克隆抗体制剂相反，其通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰剂“单克隆”表明了获自基本上同源的抗体群体的抗体的特性，且不能理解为需要用任何特定的方法产生抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可通过如美国专利No.4,816,567所述的重组DNA方法制备。例如单克隆抗体还可从利用McCafferty等.，1990，Nature，348：552-554中所述的技术产生的噬菌体文库中分离。
如此处所用的，″人抗体″指具有与通过人产生的抗体相应的氨基酸序列的抗体和/或利用本领域已知的或此处公开的制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的该定义包括含有至少一个人重链多肽或至少一个人轻链多肽的抗体。一个这样的实例为包括鼠轻链和人重链多肽的抗体。人抗体可利用本领域已知的各种技术产生。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等.，1996，Nature Biotechnology，14：309-314；Sheets等.，1998，PNAS，(USA)95：6157-6162；Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.，227：381；Marks等.，1991，J.Mol.Biol.，222：581)。人抗体还可以通过人免疫球蛋白基因座导入其中内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的转基因动物，例如小鼠中而制备。该方法在美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016中描述。或者，人抗体可通过永生化产生针对靶抗原的人B淋巴细胞而制备(所述B淋巴细胞可从个体回收或已经过体外免疫)。参见例如，Cole等.，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等.，1991，J.Immunol.，147(1)：86-95；和美国专利No.5,750,373。
如此处所用的，术语″A5″和″抗体A5″互换使用而指包括图1A和1B中所示的重链和轻链可变区氨基酸序列的抗体。抗体A5的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDR)在图1A和1B中用图解法描述。SEQID NO：11和13分别显示编码A5重链和轻链可变区的多核苷酸。A5的特性在实施例中描述。不同生物学功能都与A5有关，包括但不限于，结合和激活trkC受体和/或由trkC信号功能介导的下游途径的能力。在一些实施方案中，术语″A5″指由(a)具有保藏号ATCC No.PTA-5682的编码A5轻链的多核苷酸，和(b)具有保藏号ATCC No.PTA-5683的编码A5重链多核苷酸编码的免疫球蛋白。
术语″多肽″、″寡肽″、″肽″和″蛋白质″在此可互换使用而指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线性的或分枝的，其可包括修饰的氨基酸，并且其可由非氨基酸间断。该术语还包括天然地或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分偶联。该定义还包括的有，例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括，例如非天然的氨基酸等等)，以及本领域已知的其他修饰型的多肽。当然，由于本发明的多肽以抗体为基础，多肽可以单链或联合链存在。
此处可互换使用的″多核苷酸″或″核酸″指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或其类似物，或可通过DNA或核糖核酸聚合酶引入聚合物的任何底物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和其类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可在聚合物组装前后给予。核苷酸的序列可由非核苷酸组分间断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，如通过与标记组分偶联。其他类型的修饰包括，例如，″加帽″、一个或多个天然存在的核苷酸用类似物的取代、核苷酸内修饰如，例如，那些带有无电荷键(如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)的多核苷酸和那些带电荷键(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的多核苷酸、那些包含悬挂部分的多核苷酸，其中所述悬挂部分如蛋白质(如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)、那些带有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的多核苷酸、那些包含螯合剂(如金属、放射活性金属、硼、氧化金属等)的多核苷酸，那些包含烷化剂的多核苷酸，那些具有修饰键的多核苷酸(如α-异头核酸等)，以及多核苷酸的修饰形式。此外，任何通常存在于糖中的羟基可被膦酸基、磷酸基置换，可用标准保护基团保护，或可被活化以制备与其它核苷酸连接的其它键，或可被连接至固相载体。5′和3′末端的OH可被磷酸化或用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团取代。其它羟基也可被衍生为标准的保护基团。多核苷酸也可包含通常本领域已知的核糖或脱氧核糖的类似物形式，包括如2′-O-甲基-、2′-O-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮基-核糖、碳环形糖类似物、o-端基异构糖、差向异构糖，如阿拉伯糖、木糖或来苏糖，吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物，如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯键可由其它连接基取代。这些其它连接基包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯被P(O)S(“硫酯”)、P(S)S(“二硫酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛”)取代，其中每一R或R′分别为H或者为取代或未取代烷基(1-20C)，取代或未取代烷基任选地包含醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环链烯基或芳烷基。多核苷酸中并非所有的键都需要相同。前面的描述适用于所有此处提及的多核苷酸，包括RNA和DNA。
抗体的″可变区″指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独的或组合的。每个由通过三个互补决定区(CDR)连接的四个构架区(FR)组成的重链和轻链可变区也称为高变区。每条链中的CDR通过FR非常紧密地结合在一起，并且和其它链的CDR一起，有助于形成抗体的抗原结合位点。至少具有两种测定CDR的技术：(1)基于交叉-种类序列可变性的方法(即，Kabat等.Sequences of Proteins ofImmunological Interest，(5th ed.，1991，National Institutes ofHealth，Bethesda MD))；和(2)基于抗原-抗体复合物结晶研究的方法(Al-lazikani等.(1997)J.Molec.Biol.273：927-948))。如此处所用的，CDR可指通过任一方法或通过两种方法的组合而定义的CDR。
抗体的″恒定区″指抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区，单独的或组合的。
如此处所用的，″trkC″指trkC受体多肽，酪氨酸激酶超家族的成员。trkC包括任何哺乳动物种类的天然trkC受体，包括但不限于，人、狗、猫、牛、马、灵长类和啮齿类(包括小鼠和大鼠)。全长天然trkC的胞外域已参照各种其他蛋白质中鉴定的同源或换言之类似的结构而定义。从成熟trk受体的氨基酸序列的N末端开始，这些区域依次为：1)从第1个氨基酸到第48个氨基酸的第一个半胱氨酸富集域；2)从第49个氨基酸到第120个氨基酸的亮氨酸富集域；3)从第121个氨基酸到第177个氨基酸的第二个半胱氨酸富集域；4)从约第196个氨基酸到第257个氨基酸的第一个免疫球蛋白样结构域；5)从约第288个氨基酸到第351个氨基酸的第二个免疫球蛋白样结构域。参见例如，PCT公开No.WO0198361。trkC受体胞外域的域结构还通过参照以下的晶体结构而确定：从第1个氨基酸到第47个氨基酸的区域1；从第48个氨基酸到第130个氨基酸的区域2；从第131个氨基酸到第177个氨基酸的区域3；从第178个氨基酸到第165个氨基酸的区域4；和从第166个氨基酸到第381个氨基酸的区域5。参见例如，PCTWO01/98361；Urfer等.J.BioL.Chem.273：5829-5840(1998)。还包括trkC的变体，其实例包括但不限于，无激酶区域的变体(Shelton，等.，J.Neurosci.15(1)：477-491，1995)，和有修饰的激酶区域的变体(Shelton，等.，J.Neurosci.15(1)：477-491，1995)。
″激动剂抗-trkC抗体″(可互换称为″抗-trkC激动剂抗体″或″抗-trkC抗体″)指能结合并且激活trkC受体和/或由trkC信号传导功能介导的下游途径的抗体。例如，激动剂抗体可结合trkC受体的胞外域并因此导致受体的二聚化，其结果是活化了细胞内的催化激酶区域。因此，这可能会刺激在体外和/或体内表达受体的细胞的生长和/或分化。在一些实施方案中，激动剂抗-trkC抗体结合至trkC并且激活trkC生物学活性。在一些实施方案中，用于本发明方法的激动剂抗体识别trkC的区域V和/或区域IV。参见Urfer等.，J.Biol.Chem.273：5829-5840(1998)。此处提供激动剂抗-trkC抗体的实例。
当与本发明的抗trkC激动剂抗体联合使用时，“生物学活性”通常是指具有结合并且活化trkC受体酪氨酸激酶和/或由trkC信号功能介导的下游途径的能力。如此处所用的，″生物学活性″包括和通过trkC-表达细胞上的trkC天然配体NT-3的作用诱发的一种或多种相同的效应物功能。trkC的″生物学活性″还可包括下游信号途径或不同于通过NT-3的作用诱发的效应物功能。没有任何限制，生物学活性包括下列的任何一种或多种：结合并且活化trkC的能力；促进trkC受体二聚化并且活化trkC的能力；促进细胞(包括损伤细胞)，尤其是体外或体内的神经元，包括外周(交感、副交感、感觉和肠)神经元和中枢(脑和脊索)神经元，以及非神经元细胞，如外周血白细胞的发育、存活、发挥功能、维持和/或再生的能力。因为所公开的对于本领域技术人员是显而易见的，这些原理适用于多肽的实施方案。
″优先结合″或″特异性结合″(此处可互换使用)至抗体或多肽的表位是本领域熟知的术语，并且测定所述特异性或优先结合的方法也是本领域熟知的。如果一种分子比其与另一种细胞或物质更频繁、更快速，以更长的持续时间和/或更强的亲和力与特定的细胞或物质反应或结合的话，称为呈现″特异性结合″或″优先结合″的分子。如果抗体以比其结合其他物质更强的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更长的持续期间结合靶的话，则称为″特异性结合″或″优先结合″至靶的抗体。例如，特异性或优先结合至trkC表位的抗体为以比其结合至其他trkC表位或非trkC表位更强的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更长的持续期间结合trkC表位的抗体。通过阅读该定义还可理解，例如，特异性地或优先结合至第一个靶的抗体(或部分或表位)可能或可能不特异性地或优先结合至第二个靶。因而，″特异性结合″或″优先结合″不一定需要(虽然它可以包括)专一的结合。通常，而不是必要的，对结合的引用指优先结合。
如此处所用的，抗体的″免疫特异性″结合指抗体的抗原-结合位点和抗体识别的特异性抗原之间的抗原特异性结合相互作用(即，在ELISA或其他免疫测定法中抗体与蛋白质反应，而不与无关的蛋白质进行可检测的反应)。
如此处所用的，″基本上纯的″指至少50％纯的(即，无杂质)、更优选至少90％纯的、更优选至少95％纯的、更优选至少98％纯的、更优选至少99％纯的材料。
″宿主细胞″包括可以是或已经是用于多核苷酸插入物掺入的载体的受体的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，和由于天然的、偶然的或人为的突变而未必需要与原始的母细胞完全相同的子代(在形态或基因组DNA染色体套上)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染地细胞。
如此处所用的，″Fc受体″和″FcR″描述了结合抗体地Fc区域的受体。优选地FcR为人FcR的天然序列。此外，优选的FcR为结合IgG抗体(γ受体)的并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类，包括这些受体的等位变体和替代剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(″活化受体″)和FcγRIIB(″抑制受体″)，其具有主要在其胞质区域不同的相似的氨基酸序列。FcR在Ravetch和Kinet，1991，Ann.Rev.Immunol.，9：457-92；Capel等.，1994，Immunomethods，4：25-34和de Haas等.，1995，J.Lab.Clin.Med.，126：330-41中综述。″FcR″还包括新生儿受体FcRn，其负责母亲的IgG转移至胎儿(Guyer等.，1976，J.Immunol.，117：587；和Kim等.，1994，J.Immunol.，24：249)。
″依赖补体的细胞毒性″和″CDC″指补体存在时靶的溶解。补体激活途径通过补体系统的第一个组分(Clq)结合至与同种抗原复合的分子(例如抗体)而起始。为了评估补体激活，可进行例如在Gazzano-Santoro等.，J.Immunol.Methods，202：163(1996)中所述的CDC测定法。
″功能性Fc区域″具有Fc区域天然序列的至少一种效应物功能。典型的″效应物功能″包括Clq结合；依赖补体的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；依赖抗体的细胞介导的毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等等。所述的效应物功能通常需要Fc区域与结合区域(例如抗体可变区)结合并且可利用本领域已知的评估所述抗体效应物功能的各种测定法评估。
″Fc区域天然序列″包括与天然发现的Fc区域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。″变体Fc区域″包括由于至少一个氨基酸修饰而不同于Fc区域天然序列，但仍维持Fc区域天然序列的至少一种效应物功能的氨基酸序列。优选，变体Fc区域相比Fc区域天然序列或相比亲本多肽的Fc区域具有至少一个氨基酸取代，例如在Fc区域天然序列中或亲本多肽的Fc区域中约一个至约十个氨基酸的取代，并且优选约一个至约五个氨基酸的取代。此处变体Fc区域优选具有与Fc区域天然序列和/或与亲本多肽的Fc区域至少约80％的序列同一性，并且最优选与此至少约90％的序列同一性，更优选与此至少约95％的序列同一性。
如此处所用的″依赖抗体的细胞介导的细胞毒性″和″ADCC″指细胞-介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并且随后导致靶细胞的溶解。目的分子的ADCC活性可利用体外ADCC测定法评估，如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所述的那些。可用于所述测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。或者或另外，目的分子的ADCC活性可在体内评估，例如在如Clynes等.，1998，PNAS(USA)，95：652-656中公开的动物模型中。
如此处所用的，″治疗″为获得有利的或所期望的临床结果的方法。对于本发明，有利的或所期望的临床结果包括但不限于，症状的减轻、疾病程度的降低、(即，不再恶化)疾病状态的稳定、疾病发展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻和症状缓解(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。“治疗”也可以指与如果未接受治疗的预期的存活期相比，延长存活期。“治疗”是以防治疾病发展或改变疾病的病状为目的进行的干涉。因此，“治疗”是指治疗性的手段和预防性或防御性的措施。需要治疗的目标包括那些已经患病以及那些需要预防疾病的目标。特别地，治疗可以是直接的预防、减慢或减少损伤的细胞退化的病状，比如神经细胞的病状，也可以用其它治疗剂使细胞，如神经元，对治疗更敏感。
″紫杉酚-诱发的感觉神经病″为用化疗剂紫杉酚或其他紫杉烷治疗引起的神经系统紊乱。如此处所用的，″紫杉酚-诱发的感觉神经病″指并且包括与该神经系统紊乱有关的任何一种或多种病征。紫杉酚-诱发的感觉神经病可影响各种类型的第一级感觉神经元、包括交感神经元的自主神经元和特定感觉的神经元，如味觉、嗅觉、听觉和前庭。如此处所用的，″紫杉酚-诱发的感觉神经病″指影响与制剂，紫杉酚或有关的紫杉烷的给药相关的感觉神经元或在其给药期间或之后个体中出现的神经系统紊乱。在一些实施方案中，″紫杉酚-诱发的感觉神经病″以外周感觉神经元(包括大纤维感觉神经元)的变性为特征。在一些实施方案中，″紫杉酚-诱发的感觉神经病″以下列为特征：未梢对称的感觉异常、厌烦-感觉减退、关节位置感觉的丧失、痛觉迟钝、Lhermitte氏病症、疼痛、渐进性未梢和/或近端局部麻痹、肌痛、麻痹性肠梗阻、直立性低血压和心律失常；以及外周感觉神经元(包括大纤维感觉神经元)的变性。这些可通过标准的神经病学检查、患者会见或更专业的定量试验确定。这些更专业的定量试验可包括但不限于，受影响的神经元通过例如微神经学或其他电生理学试验的传导速率的测定；感觉皮肤刺激能力的定量和/或定量测定，包括但不限于热、轻触、振动或双点鉴别；听觉试验；专门的平衡试验；专门的本体感觉或运动感觉试验；植物神经机能试验包括但不限于，血压控制试验；和对各种生理学和药理学刺激夫人心率反应试验。这些试验也可包括运动技能试验。
如此处所用的，″紫杉酚″指紫杉醇(TAXOL，Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，NJ)、多烯紫杉醇(TAXOTERE，Rhane-Poulenc Rorer，Antony，France)及其他紫杉烷。紫杉酚(包括其他紫杉烷)可单独或结合其他药物给药。紫杉酚批准用于并且通常用于治疗各种恶性肿瘤，包括Kapos肉瘤以及乳房、卵巢和肺恶性肿瘤。紫杉酚也用于治疗前列腺、头和颈的恶性肿瘤，以及各种血液恶性肿瘤。紫杉酚也在骨髓移植期间给予。
″有效量″(例如，紫杉酚-诱发的感觉神经病情况中)为足以产生包括临床结果或延缓疾病发作的有利的或所期望的临床结果的量。有效量可以一次或多次给药而给予。对于本发明，此处所述的激动剂抗-trkC抗体的有效量为足以改善、稳定、反转、减缓和/或延缓感觉神经病的发展或预防感觉神经病的量，如大纤维感觉神经病，如紫杉酚-诱发的感觉神经病。如此处所述的，激动剂抗-trkC抗体的有效量也包括足以提高癌症的紫杉酚治疗(治疗作用)的激动剂抗-trkC抗体的量(其随后可指提高紫杉酚的剂量和/或观察到一些其他有利的结果，如紫杉酚治疗副作用的降低)。如本领域中所理解的，激动剂抗-trkC抗体的有效量可根据尤其是患者的病史以及其他因素如所用的激动剂抗-trkC抗体的类型(和/或剂量)而变化。因为所公开的对于本领域技术人员是显而易见的，这些原理适用于多肽的实施方案。
如此处所用的，″联合″给药包括同时给药和/或在不同的时期的给药。联合给药还包括作为共同制剂的给药(例如，激动剂抗-trkC抗体和紫杉酚存在于同样的组合物中)或作为分离组合物的给药。如此处所用的，联合给药包括其中激动剂抗-trkC抗体和紫杉酚给药至个体的任何状况，其可同时和/或各自存在。如此处进一步论述的，可理解的是激动剂抗-trkC抗体和紫杉酚可以不同的给药频率或时间间隔给药。例如，激动剂抗-trkC抗体可每周给药，而紫杉酚可更低频率地给药。可理解的是激动剂抗-trkC抗体和紫杉酚可利用同样的给药途径或不同地给药途径给药。
″生物样品″包括各种获自个体的各种样品类型并且可用于诊断或监测测定法。该定义包括血液及其他生物学来源的液体样品、实体组织样品如活检标本或源自其的组织培养物或细胞，以及其子代。该定义还包括已在获取后以任何方式，如通过用试剂处理、增溶或对某些组分如蛋白质或多核苷酸的富集，或用于切片目的而嵌入半固体或固体基质而操作的样品。术语″生物样品″包括临床样品，还包括细胞培养物、细胞上清、细胞裂解物、血清、血浆、生物液体和组织样品。
″个体″为脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括，但不限于家畜(如牛)、运动型动物、宠物(如猫、狗、马)、灵长类、小鼠和大鼠。
如此处所用的，″载体″指构建体，其能递送和优选表达宿主细胞中的一种或多种目的基因或序列。载体的实例包括但不限于，病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂有关的DNA或RNA表达载体、在脂质体中形成胶囊的DNA或RNA表达载体，和某些真核细胞，如生产细胞。
如此处所用的，″表达调控序列″指指导核酸转录的核酸序列。表达调控序列可为启动子，如组成型或诱导型启动子，或增强子。表达调控序列有效地连接至转录的核酸序列。
如此处所用的，″药学可接受载体″包括任何材料，其当与活性组分结合时能使该组分维持生物学活性并且与患者免疫系统无反应性且当递送时对患者无毒。实例包括但不限于，任何标准药物载体如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液如油/水乳胶，和各种类型的润湿剂。优选用于气雾剂或肠胃外给药的稀释剂为磷酸盐缓冲盐水或生理盐水(0.9％)。
包括所述载体的组合物通过熟知的常规方法配制(参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990；和Remington，TheScience and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing，2000)。
如此处所用的术语″koff″是指抗体从抗体/抗原复合物的解离速率常数。
如此处所用的术语″KD″是指抗体-抗原相互作用的解离常数。
组合物和制备组合物的方法
本发明包括含有药物组合物的组合物，其包括此处所述的激动剂抗-trkC抗体(如A5抗体)或多肽；以及包括编码该抗体(如A5抗体)或多肽序列的多核苷酸。如此处所用的，组合物包括结合trkC的一种或多种抗体或多肽(其可能是或可能不是抗体)，和/或包括编码结合trkC的一种或多种抗体或多肽序列的一种或多种多核苷酸。这些组合物可进一步包括合适的赋形剂，如包含缓冲液的药物可接受赋形剂，其为本领域熟知。
本发明还包括分离的抗体、多肽和多核苷酸实施方案。本发明还包括基本上纯的的抗体、多肽和多核苷酸实施方案。
本发明的抗体和多肽以任何下列特征(一种或多种)表征：(a)结合trkC受体；(b)结合trkC受体的一个或多个表位；(c)结合trkC受体以激活trkC受体和/或由trkC信号功能介导的一个或多个下游途径；(d)结合trkC受体以激活trkC受体并且治疗、预防、反转或改善感觉神经病的一种或多种病征(如紫杉酚-诱发的感觉神经病)；(e)不与trkB或trkA结合和/或激活之；(f)显示良好的药物动力学和生物利用率特性。
相比鼠抗-trkC抗体2256(″Mab 2256″)以高亲和力和缓慢的解离过程动力学结合人trkC的抗体A5的结合特性概括如下。A5重链和轻链可变区的氨基酸序列在图1中显示。Mab 2256重链和轻链可变区的氨基酸序列在图2中显示。
  抗体   KD   koff(s-1)   kon(s-1)
  2256(Fab)   40   0.02   5.30e5
  A5(Fab)   0.28   3.70e-4   1.33e6
表中的“men”指：m×10n。
如通过Sadick等.，Exp.Cell Res.(1997)234：354-361中所述的激酶受体激活测定法(KIRA)评估的，A5抗体和相关抗体(此处所述的)还呈现激活人trkC的强能力，以及如通过体外神经元存活测定法评估的，其激活大鼠trkC的强能力。如图3和4所示，A5为用于人和啮齿类trkC的有效激动剂。
因此，在一些实施方案中，本发明的抗体和多肽进一步鉴定和表征如下：(g)以缓慢的解离过程动力学高亲和力结合人trkC(在一些实施方案中，以小于约10nM的KD和/或慢于0.01s-1的koff)和/或(h)以约100pM或更低的EC50激活trkC-依赖的大鼠E12三叉神经神经元存活的能力。
在一些实施方案中，本发明为包含由保藏号为ATCC No.PTA-5682的宿主细胞产生的多核苷酸所编码轻链的抗体。在另一个方面，本发明为包含由保藏号为ATCC No.PTA-5683的宿主细胞产生的多核苷酸所编码重链的抗体。本发明还包括A5的各种制剂和等价抗体片段(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc等等)、单链(ScFv)、其变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含所需特异性抗原(trkC)识别位点的A5的任何其他修饰构型。A5的等价抗体，包括A5的抗体和多肽片段(其可能是或可能不是抗体)以及包括A5多肽片段的多肽通过上述任何标准(一个或多个)鉴定和表征。
因此，本发明提供下列任何的或包括下列任何的组合物(包括药物组合物)：(a)抗体A5；(b)抗体A5的片段或区域；(c)如SEQID NO：29所示的抗体A5的轻链；(c)如SEQ ID NO：28所示的抗体A 5的重链；(d)来自抗体A5轻链和/或重链的一个或多个可变区；(e)图1A和1B所示的抗体A5的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；(f)来自图1A所示的抗体A5重链的CDRH3；(g)来自图1B所示的抗体A5轻链的CDRL3；(h)来自图1B所示的抗体A5轻链的三个CDR；(i)来自图1A所示的抗体A5重链的三个CDR；(j)来自图1A和1B所示的抗体A5轻链的三个CDR和重链的三个CDR；和(k)包括(b)至(j)任何一个的抗体。本发明还提供(a)至(j)任何一个或多个的多肽。在一些实施方案中，抗体A5进一步包括含有下列突变的人重链IgG2a恒定区：A330P331至S330S331(氨基酸编号对照野生型IgG2a序列；参见Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624)；和人轻链κ恒定区。
抗体A5的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDR)在图1A和1B中用图解法描述。CDR区域的确定在本领域技术人员的技能内。显然在一些实施方案中，CDR可以是Kabat和Chothia CDR的组合(也称为″组合的CDR″或″延伸的CDR″)。在一些实施方案中，CDR为KabatCDR。在其他的实施方案中，CDR为Chothia CDR。
在一些实施方案中，本发明提供包括基本上与A5的至少一个CDR、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个CDR同源的至少一个CDR的抗体(或，在一些实施方案中基本上与A5或源自A5的所有六个CDR同源)。其他的实施方案包括具有基本上与A5或源自A5的至少两个、三个、四个、五个或六个CDR同源的至少两个、三个、四个、五个或六个CDR的抗体。当然对于本发明，虽然相比A5，活性程度可以变化(可以更强或更弱)，通常维持结合特异性和/或总的活性(其根据治疗和/或预防感觉神经病(如大纤维感觉神经病，如紫杉酚-诱发的感觉神经病)，或激活trkC-依赖的E12大鼠三叉神经神经元的存活)。在一些实施方案中，基本上与A5的至少一个CDR、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或六个CDR同源的一个或多个CDR与A5的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或六个CDR具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的同一性。
本发明还提供多肽(其可能是或可能不是抗体)，其包括具有下列任何的A5氨基酸序列(图1A和1B所示的)：A5序列的至少5个连续的氨基酸、至少8个连续的氨基酸、至少约10个连续的氨基酸、至少约15个连续的氨基酸、至少约20个连续的氨基酸、至少约25个连续的氨基酸、至少约30个连续的氨基酸，其中至少3个氨基酸来自A5可变区，条件是由和小鼠单克隆抗体2256的氨基酸序列相同的氨基酸序列组成的实施方案明确排除。2256可变区(包括CDR区域)的氨基酸序列在图2A和2B中显示。在一个实施方案中，可变区来自A5的轻链。在另一个实施方案中，可变区来自A5的重链。在另一个实施方案中，5个(或更多)连续的氨基酸来自图1A和1B所示的A5的互补决定区(CDR)。
在另一个实施方案中，本发明提供多肽，其包括具有下列任何的A5氨基酸序列：A5序列的至少5个连续的氨基酸、至少8个连续的氨基酸、至少约10个连续的氨基酸、至少约15个连续的氨基酸、至少约20个连续的氨基酸、至少约25个连续的氨基酸、至少约30个连续的氨基酸，其中A5序列包括任何一种或多种的：CDRH1的氨基酸残基R33和/或I34；CDRH2的A56；CDRH3的T105和/或R106；CDRL1的I29、L37和/或A38；CDRL2的R58和/或CDRL3的T97。
抗-trkC抗体对trkC(如htrkC)的结合亲和力可以约为0.10至约0.80nM、约0.15至约0.75nM和约0.18至约0.72nM。在一些实施方案中，结合亲和力为约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM、约40pM或大于约40pM。在一个实施方案中，结合亲和力在约2pM和22pM之间。在其他的实施方案中，结合亲和力为小于约10nM、约5nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约150pM、约100pM、约90pM、约80pM、约70pM、约60pM、约50pM、约40pM、约30pM、约10pM。在一些实施方案中，结合亲和力为约10nM。在其他的实施方案中，结合亲和力小于约10nM。在其他的实施方案中，结合亲和力为约0.1nM或约0.07nM。在其他的实施方案中，结合亲和力小于约0.1nM或小于约0.07nM。在其他的实施方案中，结合亲和力为任何的约10nM、约5nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约150pM、约100pM、约90pM、约80pM、约70pM、约60pM、约50pM、约40pM、约30pM、约10pM至任何的约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM或约40pM。在一些实施方案中，结合亲和力为任何的约10nM、约5nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约150pM、约100pM、约90pM、约80pM、约70pM、约60pM、约50pM、约40pM、约30pM、约10pM。仍然在其他的实施方案中，结合亲和力为约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM、约40pM或大于约40pM。
抗体对trkC的结合亲和力可利用本领域熟知的方法测定。如实施例中所述的，测定抗体对trkC结合亲和力的一种方法为通过测定抗体单功能Fab片段的亲和力。为了获得单功能Fab片段，抗体(例如IgG)可用木瓜蛋白酶或重组表达的木瓜蛋白酶裂解。如实施例中所述的，抗体抗-trkC Fab片段的亲和力可通过表面胞质基因组共振(BlAcore3000TM表面胞质基因组共振(SPR)系统，BIAcore，INC，Piscaway NJ)测定。该方案适用于测定抗体对任何种类trkC的结合亲和力，包括人trkC、另一种脊椎动物的trkC(在一些实施方案中，为哺乳动物)(如小鼠trkC、大鼠trkC或灵长类trkC)。
在此提供本发明的其他多肽和抗体实施方案，包括在本发明概述中。本发明的多肽还可用作合成中间体。
本发明还提供制备任何这些抗体或多肽的方法。本发明的抗体可通过本领域已知的方法制备。多肽可通过抗体的蛋白水解或其他降解、通过如上所述的重组方法(即，单一或融合多肽)或通过化学合成而产生。抗体的多肽，尤其是上至约50个氨基酸的较短的多肽，通过化学合成很方便地制备。化学合成方法是本领域已知的并且是商业上可获得的。例如，A5抗体可通过利用固相方法的自动化多肽合成器生产。也参见，美国专利No.5,807,715；4,816,567和6,331,415。
在另一种可选择方式中，抗体可利用本领域熟知的方法重组制备。在一个实施方案中，编码抗体A5可变区和轻链区域的多核苷酸(SEQ IDNO：10和12)克隆入用于表达或增殖的载体。在另一个实施方案中，SEQ ID NO：11和13中所示的多核苷酸序列克隆入用于表达或增殖的一个或多个载体。编码目的抗体的序列可在宿主细胞的载体中维持并且宿主细胞可随后扩大以及冷冻备用。载体(包括表达载体)和宿主细胞在此进一步描述。
本发明包括人源化的抗体，其指非-人(例如鼠的)抗体的形式，即为含有抗原-结合亚序列)源自非-人免疫球蛋白最小序列的特异性嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他多半，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基由具有所期望的特异性、亲合力和能力的来自非-人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔CDR的残基替换。在有些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基由相应的非-人残基替换。此外，人源化抗体可包括既不在受体抗体中又不在引入的CDR或框架序列中，但包括在进一步的精制和优化抗体性能内的残基。通常，人源化抗体基本上包括所有的至少一个，一般两个可变区，其中对应于非-人免疫球蛋白的所有或基本上所有的CDR区域以及所有或基本上所有的FR区域为人免疫球蛋白保守序列。人源化抗体最好还包括通常为人免疫球蛋白的至少一部分免疫球蛋白恒定区或区域(Fc)。优选的为具有如WO99/58572中所述而修饰的Fc区域的抗体。人源化抗体的其他形式具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，其根据原始抗体改变，其也称为″源自″来自原始抗体一个或多个CDR的一个或多个CDR。
本发明还包括本发明抗体如A5的单链可变区片段(″scFv″)。单链可变区片段通过利用短的连接肽连接轻链和/或重链可变区而制备。Bird等.(1988)Science 242：423-426.连接肽的一个实例为(GGGGS)3(SEQ ID NO：3)，其在一个可变区的羧基末端和另一个可变区的氨基末端之间架起约3.5nm。已设计和使用其他序列的接头。Bird等.(1988)。接头随后可修饰用于另外的功能，如药物的附着或附着于固相支持物。单链变体可重组或合成产生。对于scFv的合成产生，可使用自动化合成器。对于scFv的重组产生，含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒可导入合适的宿主细胞，无论是真核的，如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或原核的，如大肠杆菌。编码目的scFv的多核苷酸可通过常规操作如多核苷酸的连接而制备。得到的scFv可利用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离。
还包括单链抗体的其他形式，如双抗体。双抗体为二价的、双特异性抗体，其中VH和VL区域在单条多肽链上表达，通过使用一个过短而不能在同一链上的两个区域间进行配对的接头，这些区域不得不与另一链的互补区域配对，从而产生了两个抗原结合位点(参见例如，Holliger，，等.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.，等.(1994)Structure 2：1121-1123)。
例如，双特异性抗体，即对至少两个不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体，可利用此处公开的抗体制备。制备双特异性抗体的方法为本领域已知的(参见，例如，Suresh等.，1986，Methods inEnzymology 121：210)。通常，双特异性抗体的重组生产基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，这里的两条重链有不同的特异性(Millstein和Cuello，Nature 305，537-539(1983))。
根据一种制备双特异性抗体的方法，具有所期望结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)融合到免疫球蛋白恒定区序列上。优选是和含有至少部分铰链区、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。在至少一个融合体中存在含有轻链结合所必需的位点的第一个重链恒定区(CH1)较好。编码免疫球蛋白重链融合体和如果需要的话，免疫球蛋白轻链的DNA分离的表达载体并共转染入合适的宿主生物中。当用于构建的比例不等的三种多肽链提供了最佳产量时，这为调节实施方案中的三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，当至少两种多肽链以等比例表达导致高产量，或当这些比例不是特别重要时，也可以在一种表达载体中插入两种或三种多肽链的编码序列。
在一种方法中，双特异性抗体由一条臂上具有第一种结合特异性的杂种免疫球蛋白重链，和在另一条臂上的杂种免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)组成。这种不对称结构，仅在双特异性分子的一半具有免疫球蛋白轻链，有利于从不想要的免疫球蛋白链组合物中分离所期望的双特异性化合物。该方法在1994年3月3日出版的PCT公开No.WO94/04690中描述。
异共轭抗体，包括两个共价连接的抗体，也包括在本发明的范围内。所述抗体已用于将免疫系统的细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)以及HIV感染的治疗(PCT申请公开No.WO91/00360和WO92/200373号；和EP03089)。可以用任何方便的交联法制备异共轭抗体。合适的交联剂和技术为本领域所熟知，且在美国专利No.4,676,980中描述。
嵌合或杂种抗体也可利用已知的人工合成蛋白质化学方法包括包含交联剂的那些方法，在体外制备。例如，免疫毒素可利用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键而构建。用于此目的的合适的试剂包括亚氨基硫醇和甲基-4-巯基丁酰亚胺酸酯。
包括抗体A5的一个或多个CDR或源自抗体A5的一个或多个CDR的人源化抗体可利用本领域已知的任何方法制备。例如，四个常规步骤可用于人源化单克隆抗体。这些为：(1)测定起始抗体轻链和重链可变区的核苷酸和预测的氨基酸序列(2)设计人源化抗体，即在人源化过程期间决定使用哪个抗体构架区(3)实际的人源化方法/技术和(4)人源化抗体的转染和表达。参见例如，美国专利No.4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089；6,180,370；5,225,539；6,548,640。
在重组的人源化抗体中，可修饰Fc部分以避免Fcγ受体和补体免疫系统的相互作用。这类修饰由来自Department of Pathology atCambridge University的Dr.Mike Clark设计，并且用于所述抗体制备的技术在1999年11月18日出版的PCT公开No.WO99/58572中描述。
例如，如果抗体用于临床试验和人的治疗，则可改造恒定区以更类似于人恒定区而避免免疫应答。参见例如，美国专利No.5,997,867和5,866,692。
本发明包括对此处所述的抗体(如抗体A5)或多肽的修饰，包括不显著影响其特性的功能等效抗体和具有提高的或降低的活性的变体。多肽的修饰为本领域的常规操作并且无须在此详细描述。多肽的修饰在实施例中举例说明。经修饰多肽的实例包括具有氨基酸残基的保守取代、一个或多个氨基酸的缺失或添加，其不显著有害地改变功能活性，或化学试剂类似物的使用的多肽。
氨基酸序列插入或添加包括从一个残基到含有数百或更多残基多肽的长度范围的氨基-和/或羧基末端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体或融合至表位标签的抗体。抗体分子其他的插入变体包括提高抗体血清半衰期的酶或多肽融合至抗体的N-或C-末端。
取代变体具有抗体分子中至少一个氨基酸残基除去并且不同的残基插入该位点。倍受瞩目的取代诱变位点包括高变区，但是也考虑了FR变化。表1在“保守取代”标题下列出了保守取代。如果所述取代导致了生物活性的变化，然后更加实质性的变化，在表1中被称为“典型取代”，或根据氨基酸类型在下文中进一步描述，可以被引入并筛选产物。
表1：氨基酸取代
  原始残基   保守性取代   示例性取代
  Ala(A)   Val   Val；Leu；IIe
  Arg(R)   Lys   Lys；Gln；Asn
  Asn(N)   Gln   Gln；His；Asp，Lys；Arg
  Asp(D)   Glu   Glu；Asn
  Cys(C)   Ser   Ser；Ala
  Gln(Q)   Asn   Asn；Glu
  Glu(E)   Asp   Asp；Gln
  Gly(G)   Ala   Ala
  His(H)   Arg   Asn；Gln；Lys；Arg
  Ile(I)   Leu   Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸
  Leu(L)   Ile   Norleucine；Ile；Val；Met；Ala；Phe
  Lys(K)   Arg   Arg；Gln；Asn
  Met(M)   Leu   Leu；Phe；IIe
  Phe(F)   Tyr   Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
  Pro(P)   Ala   Ala
  Ser(S)   Thr   Thr
  Thr(T)   Ser   Ser
  Trp(W)   Tyr   Tyr；Phe
  Tyr(Y)   Phe   Trp；Phe；Thr；Ser
  Val(V)   Leu   Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸
在抗体的生物学特性中进行的具体修饰通过选择取代完成，这些取代在维持(a)取代区域中多肽主链的结构，例如，作为片层或螺旋构型，(b)位于靶位点的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小方面的作用显著不同。按照侧链的常规性质可以将天然存在的残基分成几类：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；和
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代通过将这些类型之一的成员与另一种类型交换而制备。
任何不参与维持抗体适当构象的胱氨酸残基通常也可以用丝氨酸取代，以改进分子的抗氧化性和防止异常交联。反之，半胱氨酸键可加入抗体以改进其稳定性，尤其当抗体是如Fv片段的抗体片段时。
氨基酸修饰可包括转变或修饰一个或多个氨基酸至区域的全部重新设计，如可变区。可变区的改变可改变结合亲和力和/或特异性。在一些实施方案中，在CDR区域内制备不超过一个至五个保守的氨基酸取代。在其他的实施方案中，在CDR区域内制备不超过一个至三个保守的氨基酸取代。仍然在其他的实施方案中，CDR区域为CDR H3和/或CDR L3。
修饰也包括糖基化和非糖基化的多肽，以及具有其他翻译后修饰，如例如，用不同糖的糖基化、乙酰化和磷酸化的多肽。抗体在其恒定区中的保守位点被糖基化(Jefferis和Lund，1997，Chem.Immunol.65：111-128；Wright和Morrison，1997，TibTECH15：26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质的功能(Boyd等，1996，Mol.Immunol.32：1311-1318；Wittwe和Howard，1990，Biochem.29：4175-4180)和在糖蛋白部分之间的分子内相互作用，其可影响糖蛋白的构型和现有三维表面(Hefferis和Lund，同上；Wyss和Wagner，1996，Current Opin.Biotech.7：409-416)。寡糖还可用来以特异性识别结构为基础而将给定的糖蛋白靶向至某些分子。还报道了抗体糖基化影响抗体-依赖的细胞毒性(ADCC)。特别地，据报道，用四环素调节β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)，一种催化等分GlcNAc形成的糖基转移酶，表达的CHO细胞有改善的ADCC活性(Umana等，1999，Nature Biotech.17：176-180)。
抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接的指糖类部分附着于天门冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸，其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，是酶促将糖类部分结合到天冬氨酸侧链的识别序列。因此，多肽中任何一个这些三肽序列的存在产生一个潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指N-乙酰葡糖胺、半乳糖或木糖中的一种结合到羟氨基酸上，通常是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
糖基化位点添加至抗体通过改变氨基酸序列以使其包含一个或多个上述三肽序列(用于N-连接的糖基化位点)而方便地完成。这种改变也可以在原始抗体序列中一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加或取代而实现(用于O-连接的糖基化位点)。
不用改变下面的核苷酸序列也可以改变抗体的糖基化模式。糖基化主要取决于用于表达抗体的宿主细胞。由于用于作为潜在的治疗剂的重组糖蛋白，例如抗体表达的细胞类型很少是天然细胞，可预见抗体糖基化模式中的改变(参见，例如Hse等，1997，J.Biol.Chem.272：9062-9070)。
除了宿主细胞的选择外，在抗体的重组生产中影响糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养物密度、氧合作用、pH、纯化方案等。各种方法已建议用来在特定的宿主生物中改变糖基化模式，包括引入或过表达某些参与寡糖生产的酶(美国专利No.5,047,335；5,510,261和5,278,299)。糖基化或某些类型的糖基化可以通过酶的方法从糖蛋白中除去，例如用内切糖苷酶H(Endo H)。此外，可以通过遗传工程方法改造重组宿主细胞而在加工某些多糖类型时为缺陷型的。这些技术和类似的技术为本领域所熟知。
修饰的其他方法包括利用本领域已知的偶联技术，包括但不限于酶促方法、氧化取代和螯合作用。
修饰可用于例如，用于免疫测定法标记物的附着。修饰的多肽(如A5)利用本领域已建立的方法制备并且可利用本领域已知的标准测定法筛选，其中的一些在底下和实施例中描述。
其他的抗体修饰包括已如1999年11月18日出版的PCT公开文本WO99/58572中所述的而修饰的抗体。除了针对靶分子的结合区域外，这些抗体包括具有与人免疫球蛋白重链恒定区的全部或部分基本上同源的氨基酸序列的效应物区域。这些抗体能结合靶分子而不触发靶的显著的补体依赖的溶解或细胞-介导的破坏。在一些实施方案中，效应物区域能特异性结合FcRn和/或FcγRIIb。这些通常基于源自两个或更多人免疫球蛋白重链CH2区域的嵌合区域。如此修饰的抗体尤其适用于慢性抗体疗法以避免常规抗体疗法的炎症和其他不良反应。
本发明包括亲和力成熟的实施方案。例如，亲和力成熟的抗体可通过本领域已知的方法产生(Marks等.，1992，Bio/Technology，10：779-783；Barbas等.，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813；Schier等.，1995，Gene，169：147-155；Yelton等.，1995，J.Immunol.，155：1994-2004；Jackson等.，1995，J.Immunol.，154(7)：3310-9；Hawkins等.，1992，J.Mol.Biol.，226：889-896；和WO2004/058184)。
下列方法可用于调节抗体的亲和力和表征CDR。表征抗体CDR和/或改变(如提高)多肽如抗体的结合亲和力的一种方法称为″文库扫描诱变″。通常，文库扫描诱变如下作用。CDR中一个或多个氨基酸位点利用领域认可的方法用两个或更多(如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个氨基酸替换。此产生了小的克隆文库(在一些实施方案中，为一个分析每个氨基酸位点的文库)，每个具有两个或更多成员的复杂性(如果在每个位点有两个或更多个氨基酸取代)。通常，文库还包括包括天然(未被取代的)氨基酸的克隆。对来自每个文库的少量克隆，例如，约20-80个克隆(取决于文库的复杂性)筛选至靶多肽(或其他的结合靶)的结合亲和力，并且鉴定具有提高的、同样的、降低的或无结合的候选者。用于测定结合亲和力的方法为本领域所熟知。结合亲和力可利用BIAcore表面胞质基因组共振分析测定，其检测结合亲和力的约2倍或更大的差异。在起始抗体已以相对高的亲和力结合时，例如约10nM或更低的KD，BIAcore尤其有用。利用BIAcore表面胞质基因组共振的筛选此处在实施例中描述。
结合亲和力可利用Kinexa Biocensor、闪烁亲近测定法、ELISA、ORIGEN免疫测定法(IGEN)、荧光猝灭、荧光转移和/或酵母展示测定。结合亲和力还可利用合适的生物测定法筛选。
在一些实施方案中，利用本领域认可的诱变方法(其中一些在此描述)用全部20个天然氨基酸替换CDR中的每个氨基酸位点(在一些实施方案中，一次一个)。此产生了小的克隆文库(在一些实施方案中，为一个分析每个氨基酸位点的文库)，每个具有20个成员的复杂性(如果在每个位点有全部20个氨基酸取代)。
在一些实施方案中，筛选的文库包括两个或更多位点的取代，其可在同样的CDR或两个或更多的CDR中。因此，文库可包括在一个CDR中两个或更多位点的取代。文库可包括在两个或更多CDR中两个或更多位点的取代。文库可包括3、4、5或更多位点的取代，所述位点存在于两个、三个、四个、五个或六个CDR中。取代可利用低丰余性的密码子制备。参见例如，Balint等.，(1993)Gene 137(1)：109-18的表2。
CDR可以是CDRH3和/或CDRL3。CDR可以是CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3的一种或多种。CDR可以是Kabat CDR、Chothia CDR或延伸的CDR。
具有改进结合的候选者可经测序，由此鉴定导致提高的亲和力的CDR取代变体(也称为″改进的″取代)。结合的候选者也可测序，由此鉴定维持结合的CDR取代。非结合的序列也可测序以便知晓哪个抗体消除了结合。
可进行多轮筛选。例如，具有改进结合的候选者(每个包括一个或多个CDR的一个或多个位点的氨基酸取代)还可用于含有至少原始的和每个改进的CDR位点取代氨基酸(即，在CDR中的该氨基酸位点的取代变体显示改进的结合)的第二个文库的设计。该文库的制备和筛选或选择在底下进一步论述。
由于具有改进的结合、同样的结合、降低的结合或无结合的克隆的频率还提供与每个氨基酸位点对抗体-抗原复合物稳定性的重要性的相关信息，文库扫描诱变还提供表征CDR的方法。例如，如果CDR的一个位点当转变为全部20个氨基酸时维持结合，则该位点确定为抗原结合不太可能必须的位点。反之，如果CDR的位点只在小百分比的取代中维持结合，则该位点确定为对CDR功能重要的位点。因此，文库扫描诱变方法产生其可转变为许多不同的氨基酸(包括全部20个氨基酸)，和其不能改变或其只能转变为几个氨基酸的有关CDR中位点的信息。
具有改进的亲和力的候选者可结合在第二个文库中，其包括该位点改进的氨基酸、原始的氨基酸，并且可进一步包括该位点另外的取代，取决于所需文库的复杂性，或利用所需的筛选或选择方法允许的文库复杂性。此外，如果需要，相邻的氨基酸位点可随机化为至少两个或更多的氨基酸。相邻氨基酸的随机化可允许变体CDR中另外的构象灵活性，其随后可允许或促进大量改进突变的引入。文库还可包括在第一轮筛选中不显示改进亲和力的位点的取代。
利用本领域已知的任何方法筛选或选择第二个文库文库成员的改进的和/或改变的结合亲和力，包括利用BIAcore表面胞质基因组共振分析的筛选和利用本领域已知的用于选择的任何方法的选择，包括噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示。
本发明还包括包含来自本发明或抗体(如A5)或多肽的一个或多个片段或区域的融合蛋白。在一个实施方案中，提供融合多肽，其包括图1B中所示可变轻链区的至少10个连续的氨基酸和/或图1A中所示可变重链区的至少10个氨基酸。在另一个实施方案中，融合多肽包括图1A和1B中所示A5的轻链可变区和/或重链可变区。在另一个实施方案中，融合多肽包括A5的一个或多个CDR。仍然在其他的实施方案中，融合多肽包括抗体A5的CDRH3和/或CDRL3。在另一个实施方案中，融合多肽包括任何一个或多个的：CDRH1的氨基酸残基R33和/或I34；CDRH2的A56；CDRH3的T105和/或R106；CDRL1的I29、L37和/或A38；CDRL2的R58；和/或CDRL3的T97。对于本发明，A5融合蛋白含有一个或多个A5抗体和另一种氨基酸序列，其不附着于天然分子中，例如来自另一区域的异源序列或同源序列。典型的异源序列包括但不限于，″标签″如FLAG标签或6His标签。标签为本领域所熟知。
融合多肽可通过本领域已知的方法，例如合成或重组产生。通常，本发明的A5融合蛋白通过利用此处所述的重组方法制备和表达编码其的多核苷酸而制备，虽然其也可通过本领域已知的其他方法制备，包括例如化学合成。
本发明还提供包括抗体(如A5)或偶联(例如连接的)至促进与固相支持物偶联的试剂(如生物素或亲和素)的多肽的组合物。为方便起见，通常以A5或抗体为参照，条件是这些方法适用于此处所述的任何trkC结合实施方案。偶联泛指连接如此处所述的这些组分。连接(至少对于给药，其通常为以紧邻的联合固定这些组分)可以多种方式实现。例如，当每个具有能与另一个反应的取代基时，试剂和抗体间的直接反应是可能的。例如，一个上的亲核基团，如氨基或巯基可以与另一个上的含有羰基的基团，如酸酐或卤化酰基，或含有烷基的良好游离的基团(例如卤化物)反应。
本发明的抗体或多肽可连接至标记试剂(或者称为″标记物″)，如荧光分子、放射性分子或本领域已知的任何其它标记物。本领域已知的标记物通常提供(直接或间接)信号。因此，本发明包括标记的抗体和多肽。
本发明抗体和多肽的能力，如结合trkC、激活trkC生物学活性；和/或提高E12大鼠三叉神经神经元的trkC-诱导的存活，可利用本领域已知的方法检验，其中一些在实施例中描述。
本发明还提供包含抗体A5，以及如本公开清楚显示的，此处所述的任何或所有抗体和/或多肽的组合物(包括药物组合物)和试剂盒。
多核苷酸、载体和宿主细胞
本发明还提供编码本发明的抗体和多肽(包括包含图1A和1B中所示轻链和重链可变区多肽序列的抗体)的分离多核苷酸以及包含该多核苷酸的载体和宿主细胞。
因此，本发明提供多核苷酸(或组合物，包括药物组合物)，其包含编码下列任何的多核苷酸：(a)抗体A5；(b)抗体A5的片段或区域；(c)如图1B中所示的抗体A5的轻链；(d)如图1A中所示的抗体A5的重链；(e)来自抗体A5轻链或/或重链的一个或多个可变区；(f)图1A或1B所示的抗体A5的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；(g)来自图1A所示的抗体A5重链的CDRH3；(h)来自图1B所示的抗体A5轻链的CDRL3；(i)来自图1B所示的抗体A5轻链的三个CDR；(j)来自图1A所示的抗体A5重链的三个CDR；(k)来自图1A或1B所示的抗体A5轻链的三个CDR或重链的三个CDR；或(1)包括(b)至(k)任何一个的抗体。在一些实施方案中，多核苷酸包括SEQ ID NO：10和12中所示的多核苷酸。在其他的实施方案中，多核苷酸包括SEQ ID NO：11和13中所示的多核苷酸。在其他的实施方案中，多核苷酸包括SEQ ID NO：10和13中所示的多核苷酸。在其他的实施方案中，多核苷酸包括SEQ IDNO：11和12中所示的多核苷酸。
在另一个方面，本发明为具有保藏号ATCC No.PTA-5682的编码A5轻链的分离的多核苷酸。在另一个方面，本发明为具有保藏号ATCCNo.PTA-5683的编码A5重链的分离的多核苷酸。在又一个方面，本发明为分离的多核苷酸，包括(a)具有保藏号ATCC No.PTA-5682的编码可变区的多核苷酸和(b)具有保藏号ATCC No.PTA-5683的编码可变区的多核苷酸。在又一个方面，本发明为分离的多核苷酸，包括(a)具有保藏号ATCC No.PTA-5682的编码一个或多个CDR的多核苷酸；和/或(b)具有保藏号ATCC No.PTA-5683的编码一个或多个CDR的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供编码此处所述的任何抗体(包括抗体片段)和多肽的多核苷酸。多核苷酸可通过本领域已知的方法制备。
在另一个方面，本发明提供包括任何本发明多核苷酸的组合物(如药物组合物)。在一些实施方案中，该组合物包括包含编码如此处所述的A5抗体的多核苷酸的表达载体。在其他的实施方案中，该组合物包括包含编码此处所述的任何抗体或多肽的多核苷酸的表达载体。仍然在其他的实施方案中，组合物包括SEQ ID NO：10和12中所示的多核苷酸。在其他的实施方案中，组合物包括SEQ ID NO：11和13中所示的多核苷酸。在其他的实施方案中，组合物包括SEQ ID NO：10和13中所示的多核苷酸。在其他的实施方案中，组合物包括SEQ ID NO：11和12中所示的多核苷酸。表达载体和多核苷酸组合物的给药在此进一步描述。
在另一个方面，本发明提供制备此处所述的任何多核苷酸的方法。
与任何所述的序列互补的多核苷酸也包括在本发明中。多核苷酸可以是单链的(编码链或反义链)或双-链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其含有内含子并且以一对一的方式相应于DNA分子，和mRNA分子，其不含有内含子。另外的编码或非编码序列可以，但不必须包含在本发明的多核苷酸内，并且多核苷酸可以，但不必须连接其他的分子和/或支持材料。
多核苷酸可包括天然序列(即，编码抗体或其部分的内源序列)或可包括所述序列的变体。多核苷酸变体含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，使得所编码的多肽的免疫反应性或效力相对于天然的免疫活性分子并不减弱。对所编码的多肽的免疫反应性效果通常如此处所述评估。变体优选呈现与编码天然抗体或其部分的多核苷酸序列至少约70％的同一性，更优选至少约80％同一性和最优选至少约90％的同一性。
如果两个序列中的核苷酸或氨基酸序列如以下所述排列用于最大比对时是相同的，则两个多核苷酸或多肽序列称作″相同的″。两条序列间的比较通常通过在比对窗口比较序列以鉴定和比较序列相似的局部区域而进行。如此处所用的″比对窗口″指至少约20个连续位点，通常30至约75、40至约50的区段，其中在两条序列最佳排列后序列可与具有相同的连续位点数目的参照序列作比较。
用于比对的序列最佳排列可利用生物信息软件的Lasergene程序组中(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的Megalign程序，利用缺省参数进行。该程序包含下列参考文献中所述的若干排列方案：Dayhoff，M.O.(1978)Amodel of evolutionary change in proteins-Matficesfor detecting distantrelationships.Dayhoff，M.O.(ed.)Atlasof Protein Sequence and Structure，National Biomedical ResearchFoundation，Washington DC Vol.5，Suppl.3，pp.345-358；HeinJ.，1990，Unifzed Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645Methods in Enzymologyvol.183，Academic Press，Inc.，SanDiego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.，1989，CABIOS 5：151-153；Myers，E.W.和Muller W.，1988，CABIOS 4：11-17；Robinson，E.D.，1971，Comb.Theor.11：105；Santou，N.Nes，M.，1987，Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.，1973，Numerical Taxonomythe Principles and Practice of Numerical Taxonomy，PreemanPress，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。
优选，″序列同一性的百分比″通过在比对窗口比较两条最佳排列的序列的至少20位而确定，其中为了两条序列的最佳排列，比对窗口中的多核苷酸或多肽序列部分相比参照序列(其不包括添加或缺失)，可包括20％或更低，通常5％至15％，或10％至12％的添加或缺失(即缺口)。百分比通过确定两条序列中存在的相同核酸碱基或氨基酸残基位点的数目以得到匹配部位的数目，将匹配位点的数目除以参照序列中位点的总数(即窗口大小)并且将结果乘以100以得到序列同一性的百分比而计算。
变体也可，或者与天然基因其部分或互补基本上同源。所述多核苷酸变体能在中等严谨条件下与编码天然抗体的天然存在的DNA序列(或互补序列)杂交。
合适的″中等严谨条件″包括在5×SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗；在50℃-65℃，5×SSC杂交过夜；随后在65℃或42℃用含有0.1％SDS的2×，0.5×和0.2×SSC每次20分钟洗涤两次。
如此处所用的，″高度严谨条件″或″高严谨度条件″为：(1)采用低离子强度和高的洗涤温度，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基磺酸钠，温度为50℃；(2)在杂交过程中使用变性剂，如甲酰胺，例如用50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，温度为42C；或(3)使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhard溶液、超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％的硫酸葡聚糖，温度为42C，在42℃用0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)以及在55℃用50％甲酰胺洗涤，随后为55℃或68℃用含有EDTA的0.1×SSC组成的高-严谨度洗涤。熟练技术人员将认识到如何根据需要调节温度、离子强度等等而适应因子如探针长度等等。
本领域技术人员可以理解的是，由于遗传密码的简并性，存在编码此处所述多肽的许多核苷酸序列。一些多核苷酸具有和任何天然基因的核苷酸序列最低的同源性。尽管如此，本发明仍具体涉及由于密码子选择的差异而变化的多核苷酸。此外，此处提供的包括多核苷酸序列的基因的等位基因也在本发明范围内。等位基因为由于核苷酸的一个或多个突变，如缺失、添加和/或取代而改变的内源基因。得到的mRNA和蛋白质可，但不必须具有改变的结构或功能。等位基因可利用标准技术鉴定(如杂交、扩增和/或数据库序列比较)。
本发明的多核苷酸可利用化学合成、重组方法或PCR获得。化学多核苷酸合成的方法为本领域所熟知并且无须在此详细描述。本领域技术人员可利用此处提供的序列以及商品化的DNA合成仪产生所需的DNA序列。
如此处进一步论述的，对于利用重组方法制备多核苷酸，包括所需序列的多核苷酸可插入合适的载体，并且载体随后可引入合适的宿主细胞而用于复制和扩增。多核苷酸可通过本领域已知的任何方法插入宿主细胞。细胞通过直接摄取、内吞作用、转染、F-交配或电穿孔导入外源多核苷酸而转化。一旦导入，外源多核苷酸可在细胞内以非整合的载体(如质粒)或整合入宿主细胞基因组而维持。如此扩增的多核苷酸可通过本领域内熟知的方法从宿主细胞分离。See，例如Sambrook等.(1989)。
或者，PCR提供DNA序列的复制。PCR技术为本领域所熟知并且在美国专利No.4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202，以及PCR：The Polymerase Chain Reaction，Mullis等.eds.，Birkauswer Press，Boston(1994)中描述。
RNA可通过利用合适的载体中分离的DNA并且插入合适的宿主细胞而获得。当细胞复制并且DNA转录为RNA时，RNA可随后利用本领域技术人员已知，例如Sambrook等.，(1989)中所述的的方法分离。
合适的克隆载体可根据标准技术构建，或可选自本领域中可利用的大量克隆载体。虽然所选择的克隆载体可根据想要利用的宿主细胞而改变，有用的克隆载体通常具有自我复制能力，可具有针对特定限制性核酸内切酶的单个靶和/或可携带标志物基因，其可用于选择含有载体的克隆。合适的实例包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如，pBS SK+)和其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA和穿梭载体如pSA3和pAT28。这些和许多其他的克隆载体可从商品供应商如BioRad、Stratagene和Invitrogen获得。
表达载体通常为可复制的多核苷酸构建体，其含有本发明的多核苷酸。意味着表达载体在宿主细胞中必须是可复制的，无论是以游离基因或染色体DNA的整合部分。合适的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体，包括腺病毒、腺病毒相关病毒、反转录病毒，粘粒和PCT公开No.WO87/04462中公开的表达载体。载体组件通常可包括但不限于，下列的一个或多个：信号序列；复制起点；一个或多个标志基因；合适的转录调控元件(如启动子、增强子和终止子)。用于表达(即翻译)，通常还需要一个或多个翻译调控元件，如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。
含有目的多核苷酸的载体可通过任何大量合适的方法导入宿主细胞，包括电穿孔、利用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微粒轰击；脂转染和感染(例如，其中载体为传染物如牛痘病毒)。导入载体或多核苷酸的选择常常取决于宿主细胞的特征。
本发明还提供包括此处所述的任何多核苷酸或多肽或抗体的宿主细胞。能表达(包括过-表达)异源DNA的任何宿主细胞可用于分离编码目的抗体、多肽或蛋白质的基因的目的。哺乳动物宿主细胞非限制性的实例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。也参见PCT公开No.WO87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(如大肠杆菌或芽孢杆菌)和酵母(如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母或乳酸克鲁维酵母)。优选，宿主细胞以比如果存在，宿主细胞中相应的内源目的抗体或蛋白质高约5倍，更优选10倍，甚至更优选20倍的水平表达cDNA。筛选用于产生能特异性结合trkC的多肽的宿主细胞通过免疫测定法或FACS完成。可鉴定过表达目的抗体或蛋白质的细胞。
使用抗体或多肽的方法
结合trkC的抗体A5可用于鉴定或检测trkC或trkC片段的存在或缺乏。为方便起见，通常以A5或抗体为参照，条件是这些方法适用于此处所述的任何trkC结合实施方案(如多肽)。检测通常包括将生物样品与此处所述结合trkC的抗体接触以及trkC和特异性结合trkC的抗体(例如，A5)之间复合物的形成。所述复合物可在体外或在体内形成。如此处所用的术语″检测″包括在有无对照时的定性和/或定量检测(测定水平)。
任何各种已知的方法可用于探测，包括但不限于，利用结合多肽的抗体的免疫测定法，例如通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)等等；和用于所编码多肽的功能性测定法，例如结合活性或酶促测定法。在一些实施方案中，抗体为可检测的标记物。其他的实施方案为本领域所知并且在此描述。
抗体的诊断用途
本发明的抗体和多肽可用于和改变的或异常的trkC表达(在一些实施方案中，为提高的或降低的trkC表达(相对于正常样品)，和/或不适当的表达，如在通常无trkC表达的组织和/或细胞中表达的存在，或在通常具有trkC表达的组织或细胞中trkC表达的缺乏)相关的疾病、病情或病症的检测、诊断和监测。例如，trkC表达的肿瘤为本领域所知，并且包括原始神经外胚层肿瘤(PNET)、尤因氏瘤细胞、胰腺癌和骨髓甲状腺癌。本发明的抗体和多肽可进一步用于trkC表达的检测，例如在与改变的trkC表达或对trkC表达异常的灵敏度或应答相关的疾病中。因此，在一些实施方案中，本发明提供包括将疑是具有改变的或异常的trkC表达的个体样本(样品)与本发明的抗体或多肽接触并且确定trkC的水平是否不同于对照或比较样品的方法。
在其他实施方案中，本发明提供包括接触个体的样本(样品)并且确定trkC表达水平的方法。在一些实施方案中，个体疑是患有以改变的trkC表达或对trkC表达异常的灵敏度或应答为特征或相关的疾病、病症。
对于诊断应用，抗体可用可检测的部分包括但不限于放射性同位素、荧光标记物和各种酶-底物标记物标记。将标记物偶联至抗体的方法为本领域所知。在本发明其他的实施方案中，本发明的抗体无须标记，并且其存在可利用结合本发明抗体的标记抗体检测。
本发明的抗体可用于任何已知的测定法中，如竞争性结合测定法、直接和间接的夹心测定法以及免疫沉淀测定法。Zola，MonoclonalAntibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，Inc.1987)。
抗体还可用于体内诊断测定法，如体内成像。通常，抗体用放射性核素标记(如111In、99Tc、14C、131I、125I或3H)以使目的细胞或组织可利用免疫闪烁照相术定位。
抗体还可用作病理学着色剂，伴随本领域熟知的技术。
为治疗目的使用抗体或多肽(如A5)的方法
抗体A5可用于激活trkC的生物学活性。该激动剂活性认为在与感觉神经病或神经变性疾病或修复损伤神经细胞相关的病理学病情的治疗中有效。神经病可以例如为外周神经病，包括而不限于大纤维感觉神经病。在一些实施方案中，患有感觉神经病，如大纤维感觉神经病、如紫杉酚-诱发的感觉神经病、顺氯氨铂-诱发的感觉神经病或吡哆醇-诱发的神经病的个体用此处所述的A5或其他抗体或多肽给予治疗。通常，在这些实施方案中以有效量给药至个体。
为方便起见，通常以A5或抗体为参照，条件是这些方法适用于此处所述的任何trkC结合实施方案。
A5或A5片段(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc等等)的各种制剂，如单链(ScFv)、其变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含所需特异性抗原trkC识别部位的A5的任何其他修饰构型可用来给药。在一些实施方案中，A5抗体或A5的各种制剂可以均匀给药。在其他实施方案中，给药以A5或A5的各种制剂(包括此处所述的任何组合物实施方案)和药物可接受赋形剂，并且可以为各种配方。药学可接受赋形剂在本领域已知，并且为促进药理学有效物质给药的相对惰性的物质。例如，赋形剂可产生形状或粘稠性，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、湿的和乳化剂、用于改变渗透性的盐、包被剂、缓冲液和皮肤渗透增强剂。用于肠胃外和非肠胃外药物传递的赋形剂以及制剂在Remington，The Science and Practice ofPharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)中阐述。
虽然也可利用其他形式的给药(例如，口服、经粘膜、通过吸入法、舌下给药等等)，在一些实施方案中这些制剂配制用于经注射(例如，经腹膜、鞘内、静脉内、皮下、肌内等等)给药。因此，A5抗体和其等价物优选与药物可接受赋形剂如盐水、生理盐水、右旋糖溶液等等结合。该具体的给药方案，即剂量、时间和重复将取决于特定的个体以及该个体的病史。通常，给药以下列剂量：小于约1μg/kg体重、至少约1μg/kg体重、至少约2μg/kg体重、至少约5μg/kg体重；至少约5mg/kg体重、至少约10μg/kg体重；至少约20μg/kg体重、至少约50μg/kg体重、至少约100μg/kg体重、至少约200μg/kg体重、至少约500μg/kg体重、至少约1mg/kg体重、至少约2mg/kg体重、至少约5mg/kg体重、至少约10mg/kg体重、至少约30mg/kg体重、或更多(如约50mg/kg、约100mg/kg、约200mg/kg或约500mg/kg)。对于取决于病情的超过若干天或更久的重复给药，持续治疗直至出现所需的病征抑制。典型剂量给药方式包括给药以抗-trkC抗体约2mg/kg的首次剂量，随后为约1mg/kg的每周维持剂量，或约1mg/kg的每隔一周维持剂量。然而，其他的给药方案也是有效的，取决于医师希望获得的药物动力学衰退模式。经验性的考虑，如半衰期，一般将有助于剂量的确定。该治疗的进展很容易通过常规技术和测定法监测。
在一些个体中，可能需要不止单一的剂量。给药频率可根据治疗过程确定和调整。例如，给药频率可根据将要治疗的病征的类型和严重程度确定或调整，而不管制剂是否对于预防或治疗目的给药、之前的治疗、患者的病历和对该制剂的反应以及主治医师的判断。通常临床医师将给药以激动剂抗-trkC抗体(如A5)直至剂量达到获得所需结果的程度。有时，维持A5抗体制剂的持续释放可能是合适的。用于实现持续释放的各种制剂和装置为本领域所知。
在一个实施方案中，A5抗体(或多肽)的剂量可在已给予一次或多次给药的个体中凭经验确定。个体给予A5递增的剂量。为了评估A5或其他等价抗体的效力，可监测病征指标(如疼痛)。
抗体(如A5)或多肽根据本发明方法的给药可以是连续的或间断的，例如取决于受体的生理条件，而不管给药的治疗或预防目的，及熟练医师所知的其他因素。抗体的给药可以是在预选时间内基本连续的或可以是一系列的间隔剂量，例如，症状发展之前、期间或之后、症状发展之前、期间、前后、期间和之后或之前、期间和之后。给药可以是伤口、切割、创伤、手术和可能引起病征(如感觉神经病，如紫杉酚-诱发的感觉神经病)的任何其他事件之前、期间和/或之后。
其他制剂包括本领域已知的合适的传递形式，包括但不限于，载体如脂质体。参见，例如Mahato等.(1997)Pharm.Res.14：853-859。脂质体制剂包括，但不限于细胞转染剂、多层囊和单层囊。
在一些实施方案中，可存在一种以上的抗体或多肽。抗体可以以是单克隆或多克隆的。所述组合物可包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同的抗体。如其在本领域常表示的抗体的混合物，可能在治疗大量群体或个体中尤其有效。
编码本发明任何抗体或多肽(如抗体A5)的多核苷酸也可用于本发明任何抗体或多肽(如抗体A5)在所需细胞中的递送和表达。显然表达载体可用于A5抗体或多肽的直接表达。表达载体可通过本领域已知的任何方法给药，如经腹膜、静脉内、肌内注射、皮下、鞘内、心室内、口服、肠内、肠胃外、鼻内、经皮、舌下给药或通过吸入法。例如，表达载体的给药包括局部或全身给药，包括注射、口服、基因枪或插入导管给药以及局部给药。本领域技术人员熟知表达载体的给药而获得外源蛋白质在体内的表达。参见例如，美国专利No.6,436,908；6,413,942和6,376,471。
还可利用包含编码本发明任何抗体或多肽(如抗体A5)多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。受体-介导的DNA递送技术在例如Findeis等.，Trends Biotechnol.(1993)11：202；Chiou等.，GeneTherapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff，ed.)(1994)；Wu等.，J.Biol.Chem.(1988)263：621；Wu等.，J.Biol.Chem.(1994)269：542；Zenke等.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1990)87：3655；Wu等.，J.Biol.Chem.(1991)266：338中描述。包含多核苷酸的治疗组合物以约100ng至约200mgDNA的范围用于基因治疗方案中的局部给药。基因治疗方案期间也可使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg和约20μg至约100μg的DNA浓度范围。本发明的治疗多核苷酸和多肽可利用基因运载工具递送。基因运载工具可以是病毒或非病毒来源的(通常参见，Jolly，Cancer Gene Therapy(1994)1：51；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5：845；Connelly，Human GeneTherapy(1995)1：185；和Kaplitt，Nature Gennetics(1994)6：148)。所述编码序列的表达可利用内源哺乳动物的或异源启动子诱导。编码序列的表达可以是组成型的或可调节的。
用于所需多核苷酸递送和在所需细胞中表达的基于病毒的载体为本领域所熟知。典型的基于病毒的载体包括但不限于，重组逆转录病毒(参见，例如，PCT公开No.WO90/07936；WO94/03622；WO93/25698；WO93/25234；WO93/11230；WO93/10218；WO91/02805；美国专利No.5,219,740；4,777,127；英国专利No.2,200,651；和欧洲专利No.0345242)、基于甲病毒属的载体(例如，辛德毕斯病毒载体、西门利克森林病毒(ATCCVR-67；ATCCVR-1247)、罗斯河病毒(ATCCVR-373；ATCCVR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCCVR-923；ATCCVR-1250；ATCCVR1249；ATCCVR-532))和腺病毒相关病毒(AAV)载体(参见，例如，PCT公开No.WO94/12649；WO93/03769；WO93/19191；WO94/28938；WO95/11984和WO95/00655)。还可利用Curiel，Hum.GeneTher.(1992)3：147中所述的连接至灭活腺病毒的DNA的给药。
还可利用非病毒运载工具和方法，包括但不限于，单独的连接或未连接至灭活腺病毒的聚阳离子凝聚的DNA(参见例如，Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147)；配体-连接的DNA(参见例如，Wu，J.Biol.Chem.(1989)264：16985)；真核细胞运载工具细胞(参见例如，美国专利No.5,814,482；PCT公开No.WO95/07994；WO96/17072；WO95/30763和WO97/42338)和电荷中和或与细胞膜融合的核。还可利用裸DNA。典型的裸DNA导入方法在PCT公开No.WO90/11092和美国专利No.5,580,859中描述。可充当基因运载工具的脂质体在美国专利No.5,422,120；PCT公开No.WO95/13796；WO94/23697；WO91/14445和EP专利No.0524968中描述。另外的方法在Philip，Mol.Cell.Biol.(1994)14：2411和Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：1581中描述。
根据此处所述的全部方法，激动剂抗-trkC抗体(或多肽)的参照也包括包含一种或多种这些制剂的组合物。这些组合物可进一步包括合适的赋形剂，如包含缓冲液的药物可接受赋形剂，其为本领域熟知。本发明可单独或与其他的治疗常规方法结合使用。
激动剂抗-trkC抗体(或多肽)可通过任何合适的途径给药至个体。在此描述不同给药途径的实例。
激动剂抗-trkC抗体的给药
激动剂抗-trkC抗体(或多肽)可通过任何合适的途径给药至个体。对于本领域技术人员显而易见的是此处所述的实例并不试图限制可用技术而只是对其的说明。为方便起见，通常以A5或抗体为参照，条件是这些方法适用于此处所述的任何trkC结合实施方案。因此，在一些实施方案中，激动剂抗-trkC抗体根据已知方法给药至个体，如静脉给药，例如作为丸剂或通过一段时期的连续输液、通过肌内注射、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、舌下、滑膜内、通过吹入法、鞘内、口服、吸入法或局部途径。给药可以是全身的，例如静脉内给药，或局部的。市场上可买到的用于液剂的喷雾器，包括喷射喷雾器和超声喷雾器可用于给药。液剂可直接雾化并且冻干粉剂可在重构后雾化。或者，激动剂抗-trkC抗体可利用氟烃制剂和计量剂量吸入器或以冻干和磨碎的粉剂吸入而雾化。
在一个实施方案中，激动剂抗-trkC抗体通过位点特异性的或局部靶向递送技术给药。位点特异的或靶向局部递送的技术的实例包括激动剂抗-trkC抗体或局部传递导管的各种可植入的储存来源，如输液导管、留置导管或针管、合成的移植物、外膜包装、分流器和斯坦特固定模或其他的可植入的装置、位点特异的载体、直接注射或直接施用。参见，例如PCT公开No.WO00/53211和美国专利No.5,981,568。
多种激动剂抗-trkC抗体制剂可用于给药。在一些实施方案中，激动剂抗-trkC抗体可均匀给药。在一些实施方案中，激动剂抗-trkC抗体和药物可接受赋形剂可以是各种剂型。药学可接受赋形剂在本领域已知，并且为促进药理学有效物质给药的相对惰性的物质。例如，赋形剂可产生形状或粘稠性，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、湿的和乳化剂、用于改变渗透性的盐、包被剂、缓冲液和皮肤渗透增强剂。用于肠胃外和非肠胃外药物传递的赋形剂以及制剂在Remington，The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.MackPublishing(2000)中阐述。
在一些实施方案中，这些制剂配制成通过注射给药(例如，经腹膜、鞘内、静脉内、皮下、肌内注射等等)。因此，这些制剂可与药物可接受赋形剂如盐水、生理盐水、右旋糖溶液等等结合。该具体的给药方案，即剂量、时间和重复将取决于特定的个体以及该个体的病史。
抗-trkC抗体可利用任何合适的方法，包括通过注射给药(例如，经腹膜、鞘内、静脉内、皮下、肌内注射等等)。如此处所述，抗-trkC抗体还可以通过吸入法给药。通常，给药以下列剂量：小于约1μg/kg体重、至少约1μg/kg体重、至少约2μg/kg体重、至少约5μg/kg体重；至少约10μg/kg体重；至少约20μg/kg体重、至少约50μg/kg体重、至少约100μg/kg体重、至少约200μg/kg体重、至少约500μg/kg体重、至少约1mg/kg体重、至少约2mg/kg体重、至少约5mg/kg体重、至少约10mg/kg体重、至少约30mg/kg体重、或更多(如约50mg/kg、约100mg/kg、约200mg/kg或约500mg/kg)。对于取决于病情的超过若干天或更久的反复给药，持续治疗直至出现所需的病征抑制或直至获得减轻病征，例如神经病的足够的治疗水平。典型剂量给药方式包括给药以抗-trkC抗体约2mg/kg的首次剂量，随后为约1mg/kg的每周维持剂量，或约1mg/kg的每隔一周维持剂量。然而，其他的给药方案也是有效的，取决于医师希望获得的药物动力学衰退模式。例如，在一些实施方案中，考虑剂量为一周一至四次。该治疗的进展很容易通过常规技术和测定法监测。剂量给药方式(所用的包括trkC激动剂)可随时间改变。
对于本发明，激动剂抗-trkC抗体合适的剂量取决于所用的激动剂抗-trkC抗体(或其组合物)、所要治疗的病征的类型和严重程度，而不管制剂是给药用于预防或是治疗目的、之前的治疗。患者的病历和对制剂的反应以及主治医师的判断。通常临床医师将给药以激动剂抗-trkC抗体，直至剂量达到获得所需结果的程度。剂量和/或频率可随疗程改变。
经验性的考虑，如半衰期，一般将有助于剂量的确定。例如，适于人免疫系统的抗体，如人源化的抗体或完全的人抗体，可用于延长抗体的半衰期以及防止抗体受宿主免疫系统的攻击。给药的频率可根据疗程确定和调整，并且通常，而不一定，以病征(例如神经病)的治疗和/或抑制和/或改善和/或延缓为基础。或者，维持激动剂抗-trkC抗体制剂的持续释放可能是合适的。用于实现持续释放的各种制剂和装置为本领域所知。
在一个实施方案中，激动剂抗-trkC抗体的剂量可在已给予激动剂抗-trkC抗体一次或多次给药的个体中凭经验确定。个体给予激动剂抗-trkC抗体递增的剂量。为了评估激动剂抗-trkC抗体的效力，可以神经病(如感觉神经病，包括紫杉酚-诱发的感觉神经病)的指标为根据。
激动剂抗-trkC抗体根据本发明方法的给药可以是连续的或间断的，例如取决于受体的生理条件，而不管给药的治疗或预防目的，及熟练医师所知的其他因素。激动剂抗-trkC抗体的给药可以是在预选时间内基本连续的或可以是一系列的间隔剂量，例如感觉神经病发展之前、期间或之后；感觉神经病发展之前；期间；前后；期间和之后；之前和期间；或之前、期间和之后。
在一些实施方案中，可存在一种以上的激动剂抗-trkC抗体。可存在至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或更多种激动剂抗-trkC抗体。通常，那些激动剂抗-trkC抗体具有互补的活性而不会不利地相互影响。激动剂抗-trkC抗体还可与用来提高和/或补充该制剂有效性的其他制剂联合使用。
本发明所用的激动剂抗-trkC抗体的治疗剂型通过将具有所需纯度的抗体与任选的药物可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington，TheScience and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000))混合，而以冻干剂型或含水溶剂形式制备用于储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在用药剂量和浓度对受体是无毒的，并且包括如磷酸盐、柠檬酸盐和其它无机盐的缓冲液；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；酚、丁基或苄基醇；烷基对羟基苯甲酸酯类，如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和包括葡萄糖、甘露糖或糊精在内的其它碳水化合物；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的反荷离子，如钠离子；金属复合物(例如，锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
含有激动剂抗-trkC抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，如Epstein，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)和美国专利No.4,485,045和4,544,545中所述的。具有提高的流通时间的脂质体在美国专利No.5,013,556中公开。特别有效的脂质体可用包括卵磷脂、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法产生。脂质体挤出规定孔径大小的过滤器以产生具有所需直径的脂质体。
活性成分也可截留在微胶囊中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合作用制备的，例如胶体药物传递系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳胶、纳米颗粒和纳米胶囊)中或巨乳胶(macroemulsions)中分别有羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯(methylmethacylate))微胶囊。所述技术见Remingtons，The Scienceand Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半透基质，这些基质以成型物体的形式出现，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-异丁烯酸脂)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如Lupron DepotTM(含有乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林的可注射的微球体)、蔗糖乙酸异丁酸盐和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
供体内给药的制剂必需是无菌的。这可以通过无菌滤膜过滤很容易的实现。激动剂抗-trkC抗体治疗组合物通常置于具有无菌入孔的容器中，例如，具有通过皮下注射针或预填充注射器可刺穿的塞子的静脉溶液袋或小瓶。
本发明的组合物可以是用于口服、肠胃外或直肠给药，或通过吸入法或吹入法给药的单位剂量形式如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、粒剂、溶液或悬浮液或栓剂。
对于制备固体组合物如片剂，主要的活性成分与药物载体，例如常规片剂配料如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶，以及其他的药物稀释剂，例如水混合以形成含有本发明化合物或其无毒的药物可接受盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。当指这些预制剂组合物为均匀的时，其表示活性成分均匀分散在组合物中以使组合物很容易细分为同样有效的单位剂量形式如片剂、丸剂和胶囊剂。该固体预制剂组合物随后细分为含有0.1至约500mg本发明活性成分的上述类型的单位剂量形式。新组合物的片剂或丸剂可包衣或换言之复合以提供具有延长作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包括内部剂量和外部剂量组分，后者为包裹前者的形式。这两种组分可通过用来抵抗在胃中分解的肠层隔离而允许内部组分完好地经过十二指肠或延缓释放。各种材料可用于所述的肠层或包衣，所述材料包括许多聚合酸类和聚合酸类与所述材料如虫胶、十六烷醇和醋酸纤维素的混合物。
合适的表面活性剂包括尤其是，非离子试剂，如聚氧乙烯脱水山梨醇(例如TweenTM20、40、60、80或85)和其他的山梨聚糖(例如SpanTM20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物适宜包括0.01和5％之间，并且可在0.1和2.5％之间的表面活性剂。可以理解的是必要时可添加其他配料，例如甘露糖醇或其他的药物可接受载体。
合适的乳剂可利用市场上可买到的脂肪乳浊液制备，如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM。活性成分可溶于预混合的乳剂组合物中或者可溶于油中(例如豆油、红花油、棉子油、芝麻油、玉米油或杏仁油)并且在与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆磷脂)以及水混合时形成乳剂。可以理解的是可添加其他的配料，例如甘油或葡萄糖，以调整乳剂的张力。合适的乳剂通常含有上至20％的油，例如5和20％之间的。脂肪乳浊液可包括0.1和1.0μM，尤其是0.1和0.5μM之间的脂肪滴，并且具有5.5至8.0范围内的pH。
乳剂组合物可通过将trkC激动剂抗体与IntralipiTM或其组分(豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备。
用于吸入法或吹入法的组合物包括在药物可接受的水或有机溶剂中的溶液和悬浮液，或其混合物和粉剂。液体或固体组合物可含有以上所述的合适的药物可接受赋形剂。在一些实施方案中，组合物通过口服或鼻呼吸途径局部或全身作用而给药。在优选无菌的药物可接受溶剂中的组合物可通过利用气体雾化。雾化溶液可从雾化装置直接呼吸或雾化装置可附着于面具、罩子或间歇性加压呼吸机。溶液、悬浮液或粉剂组合物可优选从以合适的方式递送该制剂的装置口服或经鼻给药。
治疗效力可通过本领域熟知的方法评估。
包含本发明抗体、多肽和多核苷酸的试剂盒
本发明还提供用于检测和/或治疗的包含抗体或多肽的试剂盒。因此，在一些实施方案中，试剂盒包含抗体A5。在一些实施方案中，试剂盒包含此处所述的任何抗体或多肽。
在其他方面，试剂盒可用于此处所述的任何方法，包括例如，治疗患有感觉神经病的(在一些实施方案中，为大纤维感觉神经病)个体，如紫杉酚-诱发的感觉神经病、吡哆醇-诱发的神经病、顺氯氨铂-诱发的神经病。本发明的试剂盒合适地包装，并且可任选提供另外的组分如缓冲液和此处所述的任何方法抗体的使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒包括此处所述的激动剂抗-trkC抗体和用于治疗和/或预防个体中感觉神经病(如紫杉酚-诱发的感觉神经病、吡哆醇-诱发的神经病或顺氯氨铂-诱发的神经病)的说明书。在一些实施方案中，激动剂抗-trkC抗体为抗体A5。
在另一个方面，本发明提供包含编码此处所述A5多肽的多核苷酸的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括此处所述的任何方法中多核苷酸的使用说明书。
下列实施例提供用以举例说明，而不是限制本发明。
                        实施例
实施例1小鼠单克隆抗体2256的人源化和亲和力成熟。
A.常规方法
下列常规方法用于本实施例。用于克隆的表达载体特征
抗体在类似于Barbas(2001)Phage display：a laboratorymanual，Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbor LaboratoryPress pg2.10.Vector pComb3X)中所述的IPTG诱导型lacZ启动子调控下表达，然而改进包括下列另外区域的添加和表达：人κ轻链恒定区和IgG2a人免疫球蛋白CH1恒定区。Igγ-2链C区，蛋白质登录号P01859；免疫球蛋白κ轻链(人)，蛋白质登录号CAA09181。
小规模Fab制备
Fab在96孔平板中的小规模表达如下进行。从用Fab文库转化的大肠杆菌开始，挑选菌落接种至主平板(琼脂LB+氨苄青霉素(50μg/ml)+2％葡萄糖)和工作板(2ml/孔，96孔/平板，含有1.5mLLB+氨苄青霉素(50μg/ml)+2％葡萄糖)。两种平板在30℃培养8-12小时。主平板储存在4℃并且来自工作板的细胞在5000rpm沉淀以及用1mLLB+氨苄青霉素(50μg/ml)+1mM IPTG重悬以诱导Fab的表达。细胞在30℃表达5h后通过离心收集，随后重悬于500μlHBS-P缓冲液中(100mM HEPES缓冲液，pH7.4，150mM NaCl，0.005％P20)。HBS-P重悬细胞的裂解通过冷冻(-80℃)，随后在37℃解冻的一轮而实现。细胞裂解物在5000rpm离心30分钟以从含有Fab的上清分离细胞碎片。上清随后注入BIAcore胞质基因组共振装置以获得每种Fab的亲和力信息。从主平板拯救表达Fab的克隆而测定DNA序列并且用于如下所述的大规模Fab生产和详细的表征。
大规模Fab制备
为获得详细的动力学参数，表达并且从大量培养物纯化Fab。含有200mL LB+氨苄青霉素(50μg/ml)+2％葡萄糖的三角烧瓶用来自所选择表达Fab的大肠杆菌克隆的5mL过夜培养物接种。克隆在30℃温育直至获得1.0的OD550nm并且随后通过更换200ml培养基，LB+氨苄青霉素(50μg/ml)+1mM IPTG而诱导。30℃5h表达时间后，细胞通过离心沉淀，随后重悬于10mL PBS(pH8)。细胞的裂解通过冷冻/解冻(分别在-80℃和37℃)两轮而获得。细胞裂解物的上清装载在用的pH8的PBS平衡的Ni-NTA超流琼脂糖凝胶柱上(Qiagen，Valencia.CA)，随后用5倍柱体积的pH8的PBS洗涤。各个Fab用PBS(pH8)+300mM咪唑洗脱于不同的部份。合并含有Fab的部份并且在PBS中透析，随后在亲和力表征前通过ELISA定量。
完整抗体的制备
为了完整抗体的表达，重链和轻链可变区克隆入哺乳动物表达载体中并且利用脂质转染胺(lipofectamine)转染入HEK293细胞用于瞬时表达。利用标准方法用蛋白A纯化抗体。
Biacore测定法
抗-trkCFab和单克隆抗体的亲和力利用BlAcore 3000TM表面胞质基因组共振(SPR)系统(BIAcore，INC，Piscaway NJ)测定。根据供应商的说明书，CM5芯片用N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰胺(NHS)活化。人或大鼠trkC-Fc融合蛋白稀释于10mM pH5.0的乙酸钠中并且以0.005mg/mL的浓度注入活化的芯片。使用通过单个芯片通道的可变的流动时间，获得两种范围的抗原密度：用于详细的动力学研究的200-400反应单位(RU)和用于筛选测定法的500-1000RU。芯片用乙醇胺封闭。再生研究表明Pierce洗脱缓冲液(Product.No.21004，Pierce Biotechnology，Rockford，IL)和4M NaCl(2∶1)的混合物有效地除去结合的Fab而保持超过200注射的芯片上htrkC的活性。HBS-EP缓冲液(0.01MHEPES，pH7.4，0.15 NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20)用作所有BIAcore测定法的跑样缓冲液。纯化的Fab样品的连续稀释物(0.1-10×评估的KD)以100μl/min注入1min并且提供最多2h的解离时间。Fab蛋白质的浓度通过利用浓度已知的Fab作为标准(如通过氨基酸分析测定的)的ELISA和/或SDS-PAGE电泳而测定。动力学结合速率(kon)和离解速率(koff)通过利用BIA评估程序将数据调整为1∶1 Langmuir结合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L.Petersson，B.(1994).Methods.Enzymology 6.99-110)而同时获得。平衡解离常数(KD)值以koff/kon计算。
筛选测定法
优化筛选BIAcore测定法以测定来自文库的Fab克隆的亲和力。少量培养物裂解物的上清以50μl/min注入2min。5分钟的解离时间用于单指数离解速率(koff)利用BIA评估软件的测定。注入样品用于确认并且提供最多45min的解离时间以获得更好的koff值。显示改善的(更慢)koff值的克隆大规模表达并且对纯化的蛋白质测定全部的动力学参数，kon和koff。该测定法能检测大约2倍或更大倍数的亲和力差异。
B.小鼠单克隆抗体2256的人源化和亲和力成熟
选择小鼠单克隆trkC促效抗体2256用于人源化和亲和力成熟。参见PTC/US01/20153(WO01/98361A2)。如利用BIAcore表面胞质基因组共振所测定的，Mab 2256具有对人trkC大约62nM的结合亲和力。如利用KIRA测定法用人trkC所测定的，Mab 2256具有大约40nM的EC50以及如利用此处所述的大鼠三叉神经神经元存活测定法测定的，大约5nM的EC50。
小鼠单克隆激动剂抗-trkC抗体2256(也称为″Mab 2256″或″2256″)的扩展CDR在图2中显示(对应Kabat和Chothia的CDR H2、H3、L1、L2、L3，即这些CDR中100％一致)。H1为Kabat和Chothia的折中并且包括来自两者定义的所有残基。图2还显示了Chothia和Kabat CDR。
下列人种系受体序列用于人源化和亲和力成熟抗体2256：人轻链受体种系序列08(GenBank登记号No.M64855)；和人重链受体种系序列VH1-46(GenBank登记号No.AB019438)。VH1-46和08的构架区序列在图1中显示(抗体A5氨基酸的范围内)。氨基酸编号为连续的。人源化抗体包括下列人J序列：(a)重链：人JH4(WQGTLVTV SS(SEQ ID NO：14)；和(b)轻链：TFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：15)。
我们制备了具有表1中所示CDR和/或构架区取代突变的抗体克隆并且利用此处所述的BIAcore分析法测定了KD和其他动力学参数。图1中所示的取代突变指定为下列：(a)对于构架区：取代突变相对轻链受体种系序列08或人重链受体种系序列VH1-46描述；和(b)对于CDR区：取代突变相对对应的Mab 2256 CDR序列描述。表2中，测定变体Fab对人trkC的结合亲和力(包括KD)。
表3概述了如利用BIAcore分析法测定的，Fab A5、Fab 2256(亲本)和对大鼠和人trkC所选择变体的其他克隆的动力学分析结果。
选择抗体A5(也称为克隆129(T8)(H8×E10)(10B)(A5))用于进一步表征。A5重链和轻链可变区的序列在SEQ ID NO：1和2中显示。A5对人trkC的亲和力提高了200倍(相对于亲本抗体2256的亲和力)并且A5对大鼠TrkC的亲和力增至19nM，适于动物研究的值(相比亲本抗体2256的μM范围的亲和力)。
表2.抗体2256变体的氨基酸序列和动力学数据。
利用BIACORE分析法检验与人TRKC的结合
  克隆   轻链构架(2)   CDR L1   CDRL2   CDR L3   重链构架(3)   CDRH1   CDRH2   CDRH3   kon(Ms-1)   koff(s-1)   KD(nM)
  129(T26)   A47P   E97A   R72L，T74K，E82Q   Y106R   1.20E-3   2.31
  129(T34)   K46Q，A47P   E97T   E82Q   Y106R   1.20E-3   2.31
  129(T8)   E97T   V68A，R72G，T74K   Y106R   1.60E-3   3.01
  129(C36)   A47P   E97A   R72L，T74K，E82Q   Y106R   2.00E-3   3.81
  129(C28)   K46Q   E97T   V68A，R72G，E82Q   Y106Q   1.90E-3   3.61
  129(C14)   K46Q   T74K，E82H   Y106R   1.70E-3   3.21
  129(T6)   K46Q   R72G，E82Q   Y106K   3.40E-3   6.41
  129(C2)   K46Q，A47P，S69T   R72G，E82Q   Y106K   2.50E-3   4.71
  129(C16)   A47P，I52M   R72L，E82Q   Y106K   2.50E-3   4.71
  129(C26)   K46Q   E97S   R72G，T74K   Y106S   7.00E-3   13.21
  129(T8)(H8)   N38T   Q58L   E97T   V68A，R72G，T74K   W33R，M34I   G56S   Y106R   6.0E-4   1.21
  129(T8)(E12)   N31S   Q58L   E97T   V68A，R72G，T74K   M34L   G56S   Y106R   9.0E-4   1.81
  129(T8)(E10)   V29I，M37L，N38A   Q58R   E97T   V68A，R72G，T74K   W33R，M34L   K65E   Y106R   1.6E-3   3.21
  129(T8)(H9)   Q58R   E97T   V68A，R72G，T74K   M34R   Y106R   1.5E-3   3.01
  129(T8)(H8xE10)   V29I，M37L，N38A   Q58R   E97T   V68A，R72G，T74K   W33R，M34I   G56S   Y106R   1.0E-3   2.01
  129(T8)(H8xE10)(9A)   V29I，M37L，N38A   Q58R   E97T   V68A，T74K   W33R，M34I   G56S   Y106R   3.0E-4   0.61
  129(T8)(H8xE10)(4B)   V29I，M37L，N38A   Q58R   E97T   R72G   W33R，M34I   G56S   Y106R   2.0E-3   4.01
  129(T8)(H8xE10)(10B)   V29I，M37L，N38A   Q58R   E97T   W33R，M34I   G56S   Y106R   8.0E-4   1.61
  129(T8)(H8xE10)(10B)(A5)   V29I，M37L，N38A   Q58R   E97T   W33R，M34I   G56A   S105T，Y106R   1.3E6   3.70E-4   0.28
  129(T8)(H8xE10)(10B)(C7)   V29I，M37L，N38A   Q58R   E97T   W33R，M34I   G56T   S105T，Y106R   4.2E5   4.70E-4   1.1
  129(T8)(H8xE10)(10B)(E2)   V29I，M37L，N38A   Q58R   E97T   W33R，M34I   S105T，Y106R   1.4E6   3.60E-4   0.25
1＝利用BIAcore测定的koff和利用2256kon-5E51/Ms计算的KD
2＝相对人轻链受体种系序列08的框架序列显示的取代变体。08构架区的序列在图1中显示。氨基酸编号为连续的。
3＝相对人重链受体种系序列VH1-46的框架序列显示的取代变体。VH1-46构架区序列在图1中显示。氨基酸编号为连续的。
表中的″men″指：m×10n。
             表3.抗体2256变体的动力学数据。
               检验对大鼠TRKC的结合亲和力
  克隆   kon(Ms-1)   koff(s-1) KD(nM)
  2256(PARENT) ＞1000
  129(T8)(H8xE10)   9.00E-2
  129(T8)(H8xE10)(4B)   0.0289
  129(T8)(H8xE10)(4B)   0.0627
  129(T8)(H8xE10)(10B)   0.01
  129(T8)(H8xE10)(10B)(A5)   1.30E6   0.0267 19
  129(T8)(H8xE10)(10B)(C7)   7.80E5   0.03 39
  129(T8)(H8xE10)(10B)(E2)   1.50E6   9.40E-3 6
表中的″men″指：m×10n。
C.人源化的和亲和力成熟的抗体A5的表征。
抗体A5表示为完整的IgG并且其对人TrkC的促效活性通过Sadick等.，Exp.Cell.Res.(1997)234：354-361中所述的KIRA测定，并且其对大鼠TrkC的促效活性通过如下列方案中所述而进行的神经元存活测定法测定。图3和4表明抗体A5为用于人和啮齿类TrkC的有效激动剂。神经元存活中A5对啮齿类TrkC的EC50为0.001nM，而对于2256为5nM，非常符合这些抗体间的亲和力差异。
在另一个实验中，抗体A5对trkC的特异性通过利用基本上如上所述用于trkC结合亲和力的BIAcore测定法测定A5抗体对人和大鼠trkA和trkB的结合亲和力而检验。与阳性对照相反(对于人trkA，使用抗-人trkA抗体；对于大鼠trkA，使用人NGF；对于人trkB，使用抗-人trkB抗体；对于大鼠trkB，使用人NT-4/5)没有检测到A5对人trkA、大鼠trkA、人trkB或大鼠trkB的结合。
E12三叉神经大鼠神经元存活测定法
三叉神经节包括神经支配面区的皮肤感觉神经元。这些神经元在神经节发生早期由BDNF和NT3并且在后期由NGF支持。获自E12胚胎的三叉神经节神经元由NT3支持，以使在神经营养因子饱和浓度时培养48小时，存活接近100％。缺乏NT3时，经过48小时小于5％的神经元存活。因此，E12三叉神经神经元的存活为用以评估TrkC促效抗体促效活性的灵敏测定法。
定时受孕的Sprague Dawley雌性大鼠经过CO2吸入处死。除去子宫角并且取出胚期E12的胚胎且去头。三叉神经节利用电解削尖的钨针解剖。神经节随后胰蛋白酶化，机械分离并且以200-300个细胞/孔的密度接种于包被聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白的96-孔平板的既定无血清培养液中。抗TrkC抗体的促效活性以一式三份的剂量-反应方式评估。培养48小时后细胞经历在Biomek FX液体处理工作站(Beckman Coulter)上进行的自动化免疫细胞化学方案。该方案包括固定(4％甲醛，5％蔗糖，PBS)、透化(PBS中0.3％ TritonX-100)、非特异性结合部位的封闭(5％标准山羊血清，0.1％BSA，PBS)和用一抗和二抗的依次温育以检测神经元。为确定的神经元表型标志物的抗蛋白质基因产物9.5(PGP9.5，Chemicon)的兔多克隆抗体用作一抗。Alexa Fluor 488羊抗-兔(分子探针)与核染料Hoechst 33342(分子探针)一起用作二级试剂以标记培养物中存在的所有细胞的细胞核。在Discovery-1/GenIIImager(UniversalImagingCorporation)上进行图象获取和图像分析。对于该图象仪基于-图象的自动聚焦系统，由于核染存在于所有的孔中，因此其用作参考点，由此在针对AlexaFluor 488和Hoechst 33342的两种波长自动获得图像。每孔选择合适的目标和成像位点的数目以覆盖每个孔的整个表面。建立自动化图像分析以根据其用抗-PGP9.5抗体的特异性染色而计数培养48小时后存在于每孔的神经元。图象的精细定阈值和基于滤片选择能力的形态和荧光强度的应用产生每孔神经元的精确计数。
实施例2：抗体A5对吡哆醇诱发的神经病的作用。
治疗方案。实验在开始时在150至200g体重的成年雄性Sprague-Dawley大鼠上，并且遵照批准的机构动物管理和使用方案进行。六至八只动物用于每个治疗组。神经病通过在注射之前以蒸馏水中100mg/ml吡哆醇(PDX，Sigma，St.Louis，MO)的立即注射而诱发，并且以400mg/kg经腹膜的每天两次，共8天进行给药。A5-治疗动物在PDX治疗开始前3天通过腹膜内注射而接受A5(5mg/kg)，并且1周后再次接受A5的初始剂量。载体-治疗动物在中毒开始前3天在两后足的足底面接受25μl的载体QL2HNT3(1×109pfu/ml)单次皮下接种。载体QL2HNT3为复制-缺陷的、含有NT-3编码序列的基于基因组单纯疱疹病毒的载体并且能在体内传感大鼠脊神经后根神经节的感觉神经元以及在这些神经元中表达NT-3。Chattopadhyay等.，Ann.Neurol 51：19-27(2002)。对照包括未治疗的动物(对照)和用PDX(PDX)下毒而未接受其他治疗的动物。
电生理学测量。在吡哆醇初始剂量后15天利用标准的临床肌电描记装置(Viking II，Nicole tBiomedical，Madison，WI)和Grass针电极进行所有的记录。大鼠用水合氯醛(400mg/kg IP)麻醉，后肢以相对躯体长轴30至45度的角度固定，皮下温度维持在36至37℃以及接地电极插入尾部。坐骨神经中运动神经传导速率和振辐用插入腓肠肌中的记录电极测定。刺激电极对置于坐骨神经切口或膝的近端并且对照-记录电极皮下插入后肢的第五个趾。测定潜伏期和振辐并且计算传导速率。在坐骨神经切口刺激并且从置于第五个趾近端的钳电极记录后记录H波。获得至少八个响应并且测定最大的H波振辐。对于感觉神经记录，置于坐骨神经切口的电极用作记录电极；刺激电极置于踝关节并且对照电极置于第一个趾。组间差异的统计显著性通过利用用于所进行的多个post hoc分析的Bonferroni校正的方差分析(ANOVA)(Systat 9)测定。
神经病的行为评估。为了评估本体感受功能，大鼠在中毒之前训练横越3cm-直径、185cm长的桩。0.6cm宽的一对黑线沿着桩的长度方向喷涂，每侧位于至中线外侧1.05cm。PDX中毒进行后第8天，每只大鼠进行五次试验以通过该线。从以低速记录的录像磁带计数与得分线有关的爪(跖趾关节)的放置以及从桩的滑倒次数。组间差异的统计显著性通过利用用于所进行的多个post hoc分析的Bonferroni校正的ANOVA(Systat 9)测定。
通过电生理学测定的神经病经抗体A5的避免。如图5A和5B中所示，激发感觉神经动作电位的测量显示相比对照，用PDX下毒的大鼠中振辐的明显降低和足感觉神经传导速率的变缓。感觉神经振辐从对照动物中的16.2±1μV降低至PDX下毒动物中的6.8±0.6μV(P＜0.001，ANOVA)，并且传导速率从23.6m/sec降低至19.3m/sec(P＜0.001，ANOVA)。在PDX下毒前三天用QL2HNT3转染的动物中，感觉神经振辐为16.1±2.4μV(相比单独的PDX，P＜0.001，ANOVA)。用A5治疗的动物相比PDX组显示感觉神经振辐显著的维持(11.9±3μV，P＜0.005，ANOVA)。同样，PDX-下毒的QL2HNT3-治疗动物具有与对照相同的(相比单独的PDX，P＜0.001，ANOVA)感觉神经传导速率(23m/sec)。用A5治疗的PDX下毒的动物具有并不显著不同于PDX-处理组的感觉神经传导速率(21.1m/sec)。如图5C中所示，相比对照，接受PDX的大鼠中H反射严重衰减，而如之前报道的，直接的M响应未衰减。用PDX下毒的动物具有基本不能检测到的H反射。用PDX下毒并且用QL2HNT3治疗的动物显示虽不完全而基本上的H波维持(1.84±0.8mV，P＜0.001PDX+QL2HNT3相比单独的PDX，ANOVA)。用PDX下毒且用A5治疗的动物显示H波的一部分维持(0.6±0.5mV)但相比PDX-下毒组差异并不显著。
通过行为表现测定的神经病经抗体A5的避免。为了检验本体感觉功能，大鼠在PDX下毒前训练走过3.0cm直径的杆，并且在PDX处理完成后(处理开始后第15天和载体或初始抗体接种后第18天)相同的杆上检验。如图5D中所示，通过得分线下无滑倒所显示的，对照动物通过杆没有困难。用PDX下毒的动物基本上经历困难，在试验期间记录了从的平均16次滑倒。PDX下毒前3天用QL2HNT3转染的大鼠基本定性地和定量地好于仅PDX处理的动物。用QL2HNT3治疗的动物记录了平均3次滑倒(相比仅PDX处理的，P＜0.001，ANOVA)。接受A5的动物在试验期间记录了从杆的平均6.5次滑倒，此为统计上显著的但小于载体-治疗的PDX下毒动物的值(相比单独的PDX，P＜0.001)的差异。
实施例3抗体A5对顺氯氨铂-诱发的神经病的作用
治疗方案。实验在开始时在称重180-200g的雌性Wistar大鼠(Harlan，Correzzana，Italy)上进行。动物通过电脑-产生的随机选择分入不同的组并且每个治疗组八只动物。神经病通过顺氯氨铂(CDDP)(Bristol Meyer Squibbs，无菌盐水中0.5mg/ml)以2mg/kg每周两次，共四周的经腹膜(ip)注射诱发。组1动物(对照)为未治疗的。组2动物用CDDP以2mg/kg每周两次共四周ip注射。组3动物用CDDP以2mg/kg每周两次共四周ip注射并且用抗体2256以2mg/kg每7天一次皮下(sc)注射。组4动物用CDDP以2mg/kg每周两次共四周ip注射并且用抗体2256以10mg/kg每7天一次皮下注射。组5动物用CDDP以2mg/kg每周两次共四周ip注射并且用抗体A5以2mg/kg每7天一次皮下注射。组6动物用CDDP以2mg/kg每周两次共四周ip注射并且用抗体A5以10mg/kg每7天一次皮下注射。
神经生理学测定。在实验开始之前和治疗结束时期(4周)，每只动物测定尾部的感觉神经传导速率。这些方法通过Pisano等.，Clin.Cancer.Res.9：5756-67(2003)和Tredici等.，Exp.Neurol.159：551-8(1999)详细描述。简要地，尾部神经的逆向神经传导通过将记录环状电极置于尾部远侧，而刺激环状电极置于接近该记录点5cm和10cm处而评估。测定(峰-峰)神经刺激后在2位点记录的电位的潜伏期并且据此计算神经传导速率。所有神经生理学测定在邻近动物居住房间的温度控制房中在标准条件下进行。实验期间不同组中获得的神经传导速率的差异利用方差分析(ANOVA)和Tukey-Kramer post-检验(显著水平设为p＜0.05)进行统计学评估。
病理学测定。在治疗期结束时(4周)从每组4只大鼠的试验点获得坐骨神经和脊神经后根神经节样本并且如Tredici等.，Exp.Neurol.159：551-8(1999)所述进行病理检查。
A5对顺氯氨铂-诱发神经病的作用。如图6和底下表4所示，相比对照组，CDDP注射明显(P＜0.001)降低尾部的神经传导速率约30％。2mg/kg和10mg/kg的抗体A5均显著提高尾部的神经传导速率。相对之前所述的对照组，CDDP给药诱发涉及DRG神经元的体细胞大小、核大小和核仁面积显著的形态变化。Pisano等.，Clon.Cancer.Res.9：5756-67(2003)和Tredici等.，Exp.Neurol.159：551-8(1999)。然而，相对CDDP-注射的大鼠，在2256或A5治疗的CDDP-注射大鼠中没有观察到涉及DRG神经元体细胞大小、核大小或核仁面积的显著变化。
表4.不同治疗组中尾部神经传导速率的概要
  治疗组   对照   CDDP   CDDP+2256(2mg/kg)  CDDP+2256(10mg/kg)   CDDP+A5(2mg/kg)  CDDP+A5(10mg/kg)
  Mean   38.56   27.22   28.87  30.8   31.79  32.02
  SEM   0.7338   0.2056   0.2555  0.3733   0.4777  0.2934
  统计   P＜0.001(相比于对照组)   P＞0.05(相比于CDDP组)  P＜0.001(相比于CDDP组)   P＜0.001(相比于CDDP组))  P＜0.001(相比于CDDP组))
单因素ANOVA(Tukey post-检验)用于统计分析。
生物材料的保藏
下列材料已保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 UniversityBoulevard，Manassas，Virginia，USA(ATCC)：
材料                          ATCC登记号          保藏日期
Eb.pur.2256.A5  A5轻链        PTA-5682            2003年12月5日
Db.2256.A5      A5重链        PTA-5683            2003年12月5日
载体Eb.pur.2256.A5为编码A5轻链可变区和人轻链κ恒定区的多核苷酸；以及载体Db.2256.A5为编码A5重链可变区和含有下列突变：A330P331至S330S331(氨基酸编号对照野生型IgG2a序列；参见Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624)的人重链IgG2a恒定区的多核苷酸。
根据用于专利程序和管理的微生物保藏国际公认的布达佩斯条约规定进行保藏(布达佩斯条约)。以上保藏确保培养物自保藏日起30年内保持存活。ATCC根据布达佩斯相关条约，以及Genetech，Inc.与ATCC之间的协议获得以上微生物，其保证自相关美国专利授权或在任一美国或国外专利申请最先公开后，培养物的后代永久地、无限制地对公众开放，并保证对美国专利商标局根据35USC§122和委员会的相关规定(包括37CFR1.14章节，尤其是886 OG 638)认可的主体开放。
本申请的受让人同意，如果保藏物在适当的培养条件下死亡或丢失或破坏，将在收到通知后立即更换以同种培养物的活样品。不应将可以获得保藏物理解为获得许可实施本发明，这样的理解将违反各国政府根据各自专利法所授予的权利。
抗体序列
A5重链可变区氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYRIHWVRQAPGQGLEWMGEIYPSNAR
TNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARKYYYGNTRRSWYFDVW
GQGTTVTVS(SEQ ID NO：1)
A5重链氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYRIHWVRQAPGQGLEWMGEIYPSNAR
TNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARKYYYGNTRRSWYFDVW
GQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV
HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC
PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPRPQ
VYTLPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDLAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：28)
A5轻链可变区氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESIDNYGISFLAWYQQKPGKAPKLLIYAASNRGS
GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDLATYYCQQSKTVPRTFGQGTKLEIKRT(SEQ ID
NO：2)
A5轻链氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESIDNYGTSFLAWYQQKPGKAPKLLIYAASNRGS
GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDLATYYCQQSKTVPRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS
STLTLSKADYEKHKVYACEATHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：29)
A5 CDR H1(延伸的CDR)
GYTFTSYRIH(SEQ ID NO：4)
A5 CDR H2(延伸的CDR)
EIYPSNARTNYNEKFKS(SEQ ID NO：5)
A5 CDR H3(延伸的CDR)
KYYYGNTRRSWYFDV(SEQ ID NO：6)
A5 CDR L1(延伸的CDR)
RASESIDNYGISFLA(SEQ ID NO：7)
A5 CDR L2(延伸的CDR)
AASNRGS(SEQ ID NO：8)
A5 CDR L3(延伸的CDR)
QQSKTVPRT(SEQ ID NO：9)
A5轻链可变区核苷酸序列
GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCGCGTC
ACCATCACCTGCCGCGCAAGTGAGAGCATCGACAACTATGGCATTTCCTTCCTGGCC
TGGTATCAGCAGAAGCCGGGCAAAGCACCAAAACTCCTGATCTATGCTGCATCCAA
TCGGGGTTCAGGTGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTCAC
CTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCCACTTATTACTGCCAACAGAG
TAAGACTGTGCCACGCACTTTCGGTCAAGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGCACT
(SEQ ID NO：10)
A5轻链全长核苷酸序列
GATATCCAGATGACACAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGTGACCGCGTC
ACCATCACCTGCCGCGCAAGTGAGAGCATCGACAACTATGGCATTTCCTTCCTGGCC
TGGTATCAGCAGAAGCCGGGCAAAGCACCAAAACTCCTGATCTATGCTGCATCCAA
TCGGGGTTCAGGTGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGTACAGATTTCAC
CTTCACCATTAGCAGCCTGCAACCAGAAGATATTGCCACTTATTACTGCCAACAGAG
TAAGACTGTGCCACGCACTTTCGGTCAAGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGCACTG
TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAA
CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGGCCAAAGTACAGT
GGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAG
GACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAG
ACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGCCACCCATCAGGGCCTGAGTTCT
CCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGC(SEQ ID NO：11)
A5重链可变区核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGAA
GGTTTCCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTTACCAGCTATCGGATCCACTGGGTGCG
CCAAGCCCCTGGTCAAGGCCTGGAGTGGATGGGCGAAATCTACCCAAGCAACGCGC
GCACTAACTACAACGAGAAGTTCAAATCCCGGGTGACCATGACTCGCGATACCTCC
ACCAGCACTGTCTACATGGAACTGAGCTCTCTGCGCTCTGAGGACACTGCTGTGTAT
TACTGTGCCCGCAAGTACTATTACGGCAATACGCGTCGCTCCTGGTACTTCGATGTG
TGGGGCCAGGGTACCACTGTTACCGTGTCC(SEQ ID NO：12)
A5重链全长核苷酸序列(包括此处所述修饰的IgG2)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGAA
GGTTTCCTGCAAAGCATCTGGTTACACCTTTACCAGCTATCGGATCCACTGGGTGCG
CCAAGCCCCTGGTCAAGGCCTGGAGTGGATGGGCGAAATCTACCCAAGCAACGCGC
GCACTAACTACAACGAGAAGTTCAAATCCCGGGTGACCATGACTCGCGATACCTCC
ACCAGCACTGTCTACATGGAACTGAGCTCTCTGCGCTCTGAGGACACTGCTGTGTAT
TACTGTGCCCGCAAGTACTATTACGGCAATACGCGTCGCTCCTGGTACTTCGATGTG
TGGGGCCAGGGTACCACTGTTACCGTGTCCTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTC
TTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGC
CTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTG
ACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTC
AGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAA
CGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGT
TGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTG
TTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTG
TGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGG
ACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTC
CACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAA
AGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACC
ATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGC2CACAGGTGTATACCCTGCCACCATC
CAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCT
ATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTAT
AAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTG
ACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCA
CGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAG
(SEQ ID NO：13)
2256 CDR H1(延伸的CDR)
GYTFTSYWMH(SEQ ID NO：22)
2256 CDR H2(延伸的CDR)
EIYPSNGRTNYNEKFKS(SEQ ID NO：23)
2256 CDR H3(延伸的CDR)
KYYYGNSYRSWYFDV(SEQ ID NO：24)
2256 CDR L1(延伸的CDR)
RASESVDNYGISFMN(SEQ ID NO：25)
2256 CDR L2(延伸的CDR)
AASNQGS(SEQ ID NO：26)
2256 CDR L3(延伸的CDR)
QQSKEVPRT(SEQ ID NO：27)
很显然此处所述的实施例和实施方案仅是用于说明性的目的并且本领域技术人员在其启示下将想到各种改进或变化且其将包括在本申请的精神和范围内。

Claims (27)

1.包括含有以下重链CDR的激动剂抗-trkC抗体：
(a)式GYTFTSYXaaXaaH(SEQ ID NO：16)的CDR1，其中位置8的Xaa为R或W，以及位置9的Xaa为I、L、R或M；
(b)式EIYPSNXaaRTNYNEKFXaaS(SEQ ID NO：17)的CDR2，其中位置7的Xaa为A、T、S或G；以及位置16的Xaa为K或E；和
(c)式KYYYGNXaaXaaRSWYFDV(SEQ ID NO：18)的CDR 3，其中位置7的Xaa为T或S；其中位置8的Xaa为R、Q、K、S或Y；
其中该激动剂抗-trkC抗体不是包括含有SEQ ID NO：22的CDR1区、SEQ ID NO：23的CDR2区和SEQ ID NO：24的CDR 3区的重链CDR的抗体。
2.权利要求1的激动剂抗-trkC抗体，其中该激动剂抗-trkC抗体进一步包括轻链可变区。
3.包括含有以下轻链CDR的激动剂抗-trkC抗体：
(a)式RASESXaaDXaaYGI SFXaaXaa(SEQ ID NO：19)的CDR1，其中位置6的Xaa为I或V；位置8的Xaa为N或S；位置14的Xaa为L或M；位置15的Xaa为A、T或N；
(b)式AASNXaaGS(SEQ ID NO：20)的CDR2，其中位置5的Xaa为R、L或Q；和
(c)式QQSKXaaVPRT(SEQ ID NO：21)的CDR 3，其中位置5的Xaa为T、A、S或E；
其中该激动剂抗-trkC抗体不是包括含有SEQ ID NO：25的CDR1区、SEQ ID NO：26的CDR2区和SEQ ID NO：27的CDR 3区的轻链CDR的抗体。
4.权利要求1的激动剂抗-trkC抗体，其中该激动剂抗-trkC抗体进一步包括重链可变区。
5.激动剂抗-trkC抗体，包括：
(a)重链CDR，包含：
(i)式GYTFTSYXaaXaaH(SEQ ID NO：16)的CDR1，其中位置8的Xaa为R或W，以及位置9的Xaa为I、L、R或M；
(ii)式EIYPSNXaaRTNYNEKFXaaS(SEQ ID NO：17)的CDR2，其中位置7的Xaa为A、T、S或G；以及位置16的Xaa为K或E；和
(iii)式KYYYGNXaaXaaRSWYFDV(SEQ ID NO：18)的CDR3，其中位置7的Xaa为T或S；其中位置8的Xaa为R、Q、K、S或Y；和
(b)轻链CDR，包含：
(i)式RASESXaaDXaaYGISFXaaXaa(SEQ ID NO：19)的CDR1，其中位置6的Xaa为I或V；位置8的Xaa为N或S；位置14的Xaa为L或M；位置15的Xaa为A、T或N；
(ii)式AASNXaaGS(SEQ ID NO：20)的CDR2，其中位置5的Xaa为R、L或Q；和
(iii)式QQSKXaaVPRT(SEQ ID NO：21)的CDR 3，其中位置5的Xaa为T、A、S或E；
其中该激动剂抗-t rkC抗体不是包括(a)含有SEQ ID NO：22的CDR1区、SEQ ID NO：23的CDR2区和SEQ ID NO：24的CDR 3区的重链CDR；和(b)含有SEQ ID NO：25的CDR1区、SEQ ID NO：26的CDR2区和SEQ ID NO：27的CDR3区的轻链CDR的抗体。
6.权利要求1-5中任一项的激动剂抗-trkC抗体，其中该激动剂抗-trkC抗体结合人trkC。
7.权利要求6的激动剂抗-trkC抗体，其中该激动剂抗-trkC抗体以小于约5nM的KD结合人trkC。
8.权利要求6的激动剂抗-trkC抗体，其中该激动剂抗-trkC抗体还结合啮齿类trkC。
9.权利要求1-5中任一项的激动剂抗-trkC抗体，其中该激动剂抗-trkC抗体为单克隆抗体。
10.权利要求1-5中任一项的激动剂抗-trkC抗体，其中该激动剂抗-trkC抗体为人源化抗体。
11.权利要求1-5中任一项的激动剂抗-trkC抗体，其中该激动剂抗-trkC抗体包括含有下列的重链可变区：
(a)SEQ ID NO：4的CDR1区；
(b)SEQ ID NO：5的CDR2区；和
(c)SEQ ID NO：6的CDR3区。
12.权利要求11的激动剂抗-trkC抗体，其中该重链可变区由SEQID NO：1的序列组成。
13.权利要求1-5中任一项的激动剂抗-trkC抗体，其中该激动剂抗-trkC抗体包括含有下列的轻链可变区：
(a)SEQ ID NO：7的CDR1区；
(b)SEQ ID NO：8的CDR2区；和
(c)SEQ ID NO：9的CDR3区。
14.权利要求13的激动剂抗-trkC抗体，其中该轻链可变区由SEQID NO：2的序列组成。
15.权利要求1-5中任一项的激动剂抗-trkC抗体，其中该激动剂抗-trkC抗体包括
(a)重链可变区，含有：
(i)SEQ ID NO：4的CDR1区；
(ii)SEQ ID NO：5的CDR2区；和
(iii)SEQ ID NO：6的CDR3区；以及
(b)轻链可变区，含有：
(i)SEQ ID NO：7的CDR1区；
(b)SEQ ID NO：8的CDR2区；和
(c)SEQ ID NO：9的CDR3区。
16.权利要求15的激动剂抗-trkC抗体，其中该重链可变区由SEQID NO：1组成，并且该轻链可变区由SEQ ID NO：2的序列组成。
17.权利要求15的激动剂抗-trkC抗体，其中该重链由SEQ ID NO：28的序列组成，并且该轻链可变区由SEQ ID NO：29的序列组成。
18.编码权利要求1-17中任一项的激动剂抗-trkC抗体的核酸。
19.权利要求18的核酸，其中该核酸包括编码该激动剂抗-trkC抗体重链可变区的SEQ ID NO：12的序列，以及编码该激动剂抗-trkC抗体轻链可变区的SEQ ID NO：10的序列。
20.权利要求19的核酸，其中该核酸包括编码该激动剂抗-trkC抗体重链可变区的SEQ ID NO：13的序列，以及编码该激动剂抗-trkC抗体轻链可变区的SEQ ID NO：11的序列。
21.包含权利要求18的核酸的载体。
22.包含权利要求18的核酸的宿主细胞。
23.一种药物组合物，包含(a)有效量的权利要求1-17中任一项的激动剂抗-trkC抗体和(b)药物可接受的赋形剂。
24.包含权利要求1-17中任一项的激动剂抗-trkC抗体的试剂盒。
25.制备激动剂抗-trkC抗体的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码权利要求1-17中任一项的激动剂抗-trkC抗体的多核苷酸。
26.结合trkC的多肽，包括：
(a)式GYTFTSYXaaXaaH(SEQ ID NO：16)的CDR1，其中位置8的Xaa为R或W，以及位置9的Xaa为I、L、R或M；
(b)式EIYPSNXaaRTNYNEKFXaaS(SEQ ID NO：17)的CDR2，其中位置7的Xaa为A、T、S或G；以及位置16的Xaa为K或E；和
(c)式KYYYGNXaaXaaRSWYFDV(SEQ ID NO：18)的CDR3，其中位置7的Xaa为T或S；其中位置8的Xaa为R、Q、K、S或Y；
其中该多肽不是包括含有SEQ ID NO：22的CDR1区、SEQ ID NO：23的CDR2区和SEQ ID NO：24的CDR3区的CDR的多肽。
27.结合trkC的多肽，包括：
(a)式RASESXaaDXaaYGISFXaaXaa(SEQ ID NO：19)的CDR1，其中位置6的Xaa为I或V；位置8的Xaa为N或S；位置14的Xaa为L或M；位置15的Xaa为A、T或N；
(b)式AASNXaaGS(SEQ ID NO：20)的CDR2，其中位置5的Xaa为R、L或Q；和
(c)式QQSKXaaVPRT(SEQ ID NO：21)的CDR3，其中位置5的Xaa为T、A、S或E；
其中该多肽不是包括含有SEQ ID NO：25的CDR1区、SEQ ID NO：26的CDR2区和SEQ ID NO：27的CDR3区的CDR的多肽。
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