JP4718634B2 - インスリン様増殖因子ｉ受容体及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、インスリン様増殖因子I受容体(IGF-IR)に対する抗体、これらの生成方法、前記抗体を含む医薬的組成物、及びその使用に関する。
インスリン様増殖因子I受容体(IGF-IR,EC2.7.112, CD 221抗原)は、膜貫通タンパク質チロシンキナーゼのファミリーに属する(LeRoith,D.,et al., Endocrin. Rev.16(1995)143-163、及びAdams,T.Eet al., Cell.Mol.Life Sci.57(2000) 1050-1063)。IGF-IRは、IGF-Iと高親和性で結合し、そしてin-vivo中でこのリガンドに対する生理反応を開始する。しかしながら、さらにIGF-IRは、わずかに低い親和性でIGF-IIにも結合する。IGF-IRが過剰発現すると、細胞の悪性形質転換が促進される。IGF-IRは、細胞の悪性形質転換に関与しているという証拠があるため、ガン治療用の治療剤の生成に有益な標的となっている(Adams,T.E. et al., Cell.Mol.Life Sci.57(2000)1050-1063)。
IGF-IR に対する抗体は技術水準として周知であり、in vitro及びin vivoにおける抗腫瘍効果について研究されている(Benini,S., et al., Clin.Cancer .7(2001)1790-1790-1797、Scotlandi,K.H. et al., Cancer Gene Ther.9(2002)296-307; Scotlandi,K.H. et al., Int.J.Cancer101(2002)11−16、Brunetti,A et al., Biochem.Biophys.Res.Commun、165(165(1989)212-218, Prigent,S.A. et al., J.Biol.Chem.265(1990)9970-9977、Li,S.L. et al., Cancer Immunol.Immunother.49(2000)243-252, Pessino,A. et al., Biochem.Biophys.Res.Commun.162(1989)1236-1243、Surinya,K.H. et al., J.Biol.Chem.277(2002)16718-16725、Soos,M.A. et al., J.Biol.Chem.,267(1992)12955-12963、Soos,M.A. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)5217-5221、O’Brien,R.M.による、EMBO J.6(1987)4003-4010、Taylor,R., et al., Biochem.J.242(1987)123-129、Soos,M.A. et al., Biochem.J.235(1986)199-208、Li,S.L., et al., Biochem.Biophys.Res.Commum.196(1993)92-98、Delafontaine,P., et al., J.Mol.Cell.Cardiol.26(1994)1659-1673、Kull,F.C.Jr et al., J.Biol.Chem.258(1983)6561-6566、Morgan,D.O.及びRoth,R.A.,Biochemistry25(1986)1364-1371, Forsayeth,J.R., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(1987)3448-3451、Schaefer,E.M. et al., J.Biol.Chem.265(1990)13248-13253、Gustafson,T.A.及びRutter,W.J., et al., J.Biol.Chem.265(1990)18663-18667、Hoyne,P.A., et al., FEBS Lett.469(2000)57-60、Tulloch,P.A. et al., J.Struct,Biol.125(1999)、11-18、Rohlik,Q.T. et al., Biochem.Biochem.Biophys.Res.Comm.149(1987)276-281、及びKalebic,T. et al., Cancer Res.54(1994)5531-5534、Adams,T.E., et al., Cell.Mol.Life ,Sci.57(2000)1050-1063、Dricu,A et al., Glycobiology９(1999)571-579、Kanter-Lewensohn,L., et al., Melanoma Res.8(1998)389-397、Li,S.L., et al., Cancer Immunol. Immunother.49(2000)243-252)。IGF-IR に対する抗体はまた、さらに多くの刊行物、たとえばArteaga,C.L. et al., Breast Cancer Res.Treatment22(1992)101-106、及びHailey,J. et al., Mol.Cancer Ther.1(2002)1349-1353に記載されている。
特にαIR3と称されるIGF-IR に対するモノクロナール抗体は、IGF-IR を介在する方法、及びIGF-Iを介在するガンなどの疾患の研究、及び調査に広く使用されている。α-IR-3はKull,F.C.,のJ.Biol.Chem.258(1983)6561-6566で説明されている。一方で、α-IR-3の抗腫瘍効果について、その単独使用、そしてドキソルビシン及びビンクリスチンなどの細胞抗増殖性剤との併用についての研究及び治療用途を題材としたおよそ百もの刊行物が発行されている。αIR3はマウスのモノクロナール抗体であり、これはIGF受容体に結合するIGF-Iを阻害し、IGF-IR に結合するIGF-IIを阻害しないことが知られている。αIR3は腫瘍細胞の増殖及びIGF-IR のリン酸化を高濃度にて刺激する(Bergmann,U., et al., Cancer Res.55(1995)2007-2011, Kato,H. et al., J.Biol.Chem.268(1993)2655-2661)。IGF-Iの結合よりIGF-IR に結合するIGF-IIをより強力に阻害するその他の抗体(例えば1H7,LiS.L., et al., Cancer Immunol.Immunother.49(2000)243-252)も存在している。抗体及び抗体の特性及び特徴付けの技術水準についての概要は、Adams,T.E., et al., Cell.Mol.Life Sci.57(2000)1050-1063に記載されている。
技術水準として記載されているほとんどの抗体が、マウスを起源とするものである。こうした抗体は、技術水準として周知のとおり、化学化又はヒト化のように更に変更されない限りヒトの患者の治療に有益でない。これらの欠点に基づくと、ヒト抗体がヒトの患者の治療における治療剤として明らかに好ましい。ヒト抗体は技術水準として周知である(van Dijk,M.A.,and van de Winkel,J.G.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374)。こうした技術に基づいて、極めて多様な標的に対するヒト抗体を生成することができる。IGF-IR に対するヒト抗体の例は、WO02/053596、WO2004071529、WO2005016967、WO2006008639、US20050249730、US20050084906、WO2005058967、WO2006013472、US20030165502、WO2005082415、WO2005016970、WO03106621、WO04083248、WO2003100008、WO2004087756、WO2005005635及びWO2005094376に記載されている。
しかしながら、抗腫瘍治療が必要な患者に納得いく効果を持ったIGF-IR に対する抗体が尚も必要とされている。患者のために関係する利点は、一言で言うと、抗腫瘍形成剤の治療により生ずる、腫瘍増殖の減少、及び進行の有意な延長である。
Routier, F.H. et al., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207では、CHO-DUKX細胞で発現したヒト化IgG1抗体のグリコシル化パターンが報告されている。この抗体は、Fuc:Manのモル比が0.8:3.0であり、これはフコシル化率が８０％であることを意味している。Niwa, R. et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160においては、CHO DG44で組換えによって生成した抗CD20 IgG1及びIgG3抗体について、フコシル化がそれぞれ９０％及び９１％であることが報告されている。Mimura, Y. et al., J. Immunol. Methods 247 (2001) 205-216では、酪酸塩がCHO-K1細胞でのヒトキメラIgGの産生を増大させ、同時に機能及びグリコフォームプロフィールを維持することが報告されている。オリゴ糖プロファイルは、かなりの量のアフコシル化グリカン(afucosylated glycan)構造を示している。Raju, T.S., BioProcess International 1 (2003) 44-53では、発現系によるグリコシル化のバリエーションが治療上のイムノグロブリンの生体活性及び命名に与える影響について報告されている。Ma, S. et al., Anal. Chem. 71 (1999) 5185- 5192では、リツキシマブの炭水化物解析が報告されている。リツキシマブは、９〜１０％のフコシル化を示す(Niwa, R. et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160)。Fujii, S., J. Biol. Chem 265 (1990) 6009-6018では、ウシIgGが、約１１％の約１１％のアフコシル化IgGを含んでいることが報告されている。Mizuochi, T., J. Immunol. 129 (1982) 2016-2020では、ヒトIgGが約１４％アフコシル化されていることが報告されている。Bergwerff, A.A., Glycoconjugate J. 12 (1995) 318-330では、マウスSP2/Oで産生された抗体が、Ｎ−グリコリルノイラミン酸 (NGNA)オリゴ糖を大量に含むことが報告されている。Nahrgang, S. et al., In: Animal Cell Technology: Products from Cells, Cells as Products, Bernard, A. et al. (eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, (1999) pp. 259-261では、一過性トランスフェクション後のIgG1のCHOに発現ついて、全体的なグリコシル化が乏しいことが報告されている。Lund, J. et al., MoI. Immunol. 30 (1993) 741-748は、マウストランスフェクトーマ細胞におけるマウス−ヒトのキメラ抗体の組換え産生について報告している。IgG1抗体は、１３％の量でアフコシル化されている。Patel, T.P., et al., Biochem. J. 285 (1992) 839-845は、ハイブリドーマ細胞及びマウスの腹水に由来する抗体のグリコシル化について報告している。Niwa R. et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160は、CD20 IgG1抗体について、フコシル化がCHO DG44における組換え産生後に９１％であること、Mori, K. et al., Biotech. Bioeng. 88 (2004) 901-908は、フコシル化が９４％であることを報告している。Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001 ) 288-294では、糖型が変化した抗体の発現により、ADCCの増大が引き起こされることが報告されている。Sheeley, D.M., et al., Anal. Biochem. 247 (1997) 102-110は、異なる発現系での抗体のグリコシル化を比較している。Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740は、ヒトIgG1 Fc上でのフコースの欠如がFcγRIII結合及びADCCを改善することを報告している。約９０％フコシル化されている抗Her2抗体は、かなりの量のADCCを示している。Zhu, L., et al., Nature Biotechnol. 23 (2005) 1159-1169は、鶏卵でのヒト抗体の産生について報告している。
本発明の概要
本発明は、IGF-IRに対して結合し、ヒトIgG1又はIgG3型であり、且つAsn297にある糖鎖でグリコシル化されている抗体であって、前記糖鎖内のフコースの量が少なくとも９８％であること（好ましいバージョンでは「完全にフコシル化」されている。以下参照のこと）、そして更にNGNAの量が１％以下であり、そして／あるいはＮ末端α−１，３−ガラクトースの量が１％以下であること、を特徴とする抗体、を含んで成る。
本発明は、IGF-IRに対して結合し、ヒトIgG1又はIgG3型であり、且つAsn297にある糖鎖でグリコシル化されている抗体であって、前記糖鎖内のフコースの量が少なくとも９８％であること（好ましいバージョンでは「完全にフコシル化」されている。以下参照のこと）、そして更にNGNAの量が１％以下であり、そして／あるいはＮ末端α−１，３−ガラクトースの量が１％以下であること、を特徴とする抗体、を含んで成る。
本発明では、「量」とは、Asn297にある糖鎖内の前記糖の量を意味し、これは１００％としてG0, G1, G2の合計（マンノース（４及び５）以外）と関連しており、実施例３に記載のように算出される。
本発明により、実に９９．４％以上、９９．５％以上又は９９．９％以上フコシル化されている、IGF-IRと結合する抗体が提供される。
好ましくは、NGNAの量は、０．５％以下、より好ましくは０．１％以下、そして更にはLCMS（液体クロマトグラフィー／質量分析）で検出不可能な値である。
好ましくは、Ｎ末端α−１，３−ガラクトースの量は、０．５％以下、より好ましくは０．１％以下、そして更にはLCMSで検出不可能な値である。
前記糖鎖は、好ましくは、CHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞で組換え発現したIGF-IRと結合する抗体のAsn297に付いているＮ結合型グリカンの特性を示す。
好ましくは、CHO細胞は、DHFR対立遺伝子の両方の欠損（例えば、DG44）又は機能的不活性化又はDHFR対立遺伝子の一方の欠損及び第二のDHFR対立遺伝子（例えば、DXB11）の機能的不活性化を含むCHO細胞である。
好ましくは、前記抗体はモノクローナル抗体である。好ましくは、前記抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。
本発明は、IGF-IRと結合し、且つIGF-IRに対するIGF-I及びIGF-IIの結合を阻害する、完全にフコシル化された抗体であって、以下の群から選択される１又は複数の特性を示す抗体を含んで成る：
a) IGF-IRに対するIGF-I及びIGF-IIの結合阻害のIC50値対：IGF-IRに対するIGF-IIの結合阻害のIC50値の比率が１：３〜３：１を示すこと、
b) ０．５％熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)を含む培地中のHT29細胞を用いた細胞リン酸化アッセイにおいて、前記抗体を用いないアッセイと比較した場合に、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、５ｎＭの濃度で、IGF-IRのリン酸化を阻害すること、
c) ０．５％熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)を含む培地中、細胞当たり４００，０００〜６００，０００個の分子のIGF-IRを提供する3T3細胞を用いた細胞リン酸化アッセイにおいて、前記抗体を用いないアッセイと比較した場合に、１０μＭの濃度で、PKBリン酸化として測定されるIGF-IR刺激活性を示さないこと（シグナル伝達無し、IGF-1ミメティック(mimetic)活性無し）、
d) 前記細胞に前記抗体を添加してから２４時間後に腫瘍細胞（例えば、HT29）上で発現したIGF-IRのうち５０％以上をダウンレギュレートすること。
a) IGF-IRに対するIGF-I及びIGF-IIの結合阻害のIC50値対：IGF-IRに対するIGF-IIの結合阻害のIC50値の比率が１：３〜３：１を示すこと、
b) ０．５％熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)を含む培地中のHT29細胞を用いた細胞リン酸化アッセイにおいて、前記抗体を用いないアッセイと比較した場合に、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、５ｎＭの濃度で、IGF-IRのリン酸化を阻害すること、
c) ０．５％熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)を含む培地中、細胞当たり４００，０００〜６００，０００個の分子のIGF-IRを提供する3T3細胞を用いた細胞リン酸化アッセイにおいて、前記抗体を用いないアッセイと比較した場合に、１０μＭの濃度で、PKBリン酸化として測定されるIGF-IR刺激活性を示さないこと（シグナル伝達無し、IGF-1ミメティック(mimetic)活性無し）、
d) 前記細胞に前記抗体を添加してから２４時間後に腫瘍細胞（例えば、HT29）上で発現したIGF-IRのうち５０％以上をダウンレギュレートすること。
本発明の抗体は、抗腫瘍治療を必要とする患者にとっての効果を示し、そして腫瘍成長の減少及び進行期間の有意な延長を提供するものである。本発明の抗体は、IGFの調節解除(deregulation)に関連する疾患、特に腫瘍疾患に罹患した患者に利益をもたらす、新規で且つ進歩性のある特性を有するものである。本発明の抗体は、上記特性を特徴とする。
驚くべきことに、本発明の抗体（「完全にフコシル化された抗体」）は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）を引き起こさない（実施例に記載のＡＤＣＣで示されているように、参照標準抗体（キーホールリンペットヘモシアニンに対する抗体、KLH抗体）から３ｘＳＤ（標準偏差）内）。
好ましくは、前記抗体は、IGF-IRに対し特異的に結合し、上記比率でIGF-IRに対するIGF-I及びIGF-IIの結合を阻害する抗体であり、IgG1アイソタイプのものであり、そしてそのIC50値の２００倍の濃度でIGF-IRを過剰発現する細胞中であってもIGF-IRのシグナル伝達を活性化しない、抗体である。
IGF-IRと結合し、「IGF-Iミメティック活性」がなく、「完全フコシル化」がなされてる抗体は、治療剤として使用する場合、強力な利点をもたらす。
好ましくは、５ｎＭの濃度で、本発明の抗体は、腫瘍細胞における、IGF-Iを媒介したIGF-IRのシグナル伝達を完全に阻害する。
本発明の抗体に対するそれぞれの他の抗体鎖と一緒に集合することのできるポリペプチドの好ましい核酸は以下の通り規定される：
a) CDRとして配列番号１又は３のCDR1 (aa31-35)、CDR2 (aa50-66)及びCDR3 (aa99-107)を含んで成る抗体重鎖；
b) CDRとして配列番号２又は４のCDR1 (aa24-34)、CDR2 (aa50-56)及びCDR3 (aa89-98)を含んで成る抗体軽鎖。
a) CDRとして配列番号１又は３のCDR1 (aa31-35)、CDR2 (aa50-66)及びCDR3 (aa99-107)を含んで成る抗体重鎖；
b) CDRとして配列番号２又は４のCDR1 (aa24-34)、CDR2 (aa50-56)及びCDR3 (aa89-98)を含んで成る抗体軽鎖。
前記抗体は、好ましくはモノクロナール抗体、さらにキメラ抗体(ヒト定常域鎖)、ヒト化抗体、そして特に好ましくはヒト抗体である。
前記抗体は、好ましくは、抗体18へ競合してヒトIGF-IR (EC 2.7.1.112,SwissProt P08069)と結合する。
前記抗体は、好ましくは、親和性が10-8M(KD)以下、好ましくは10-9〜10-13Mであることを更に特徴とする。
前記抗体は、好ましくは、インスリン受容体と結合するインスリンの濃度依存性の検出可能な阻害を示さない。
前記抗体は好ましくはIgG1型のものである。
本発明の抗体は、関連の異種移植腫瘍モデルにおいて、ビヒクル処理した動物と比較して、進行時間を大幅に延長し、そして腫瘍成長を低下させる。当該抗体は、in vitro及びin vivoにおいてIGF-IR に対するIGF-I及びIGF-II の結合を阻害し、好ましくはIGF-I及びIGF-IRに対し同等に阻害する。
好ましくは、本発明の抗体は、相補性決定領域(CDR)として、以下の配列：
a) CDRとして配列番号１又は３のCDR1 (aa31-35)、CDR2 (aa50-66)及びCDR3 (aa99-107)を含んで成る抗体重鎖；
b) CDRとして配列番号２又は４のCDR1 (aa24-34)、CDR2 (aa50-56)及びCDR3 (aa89-98)を含んで成る抗体軽鎖、
を含んで成る。
a) CDRとして配列番号１又は３のCDR1 (aa31-35)、CDR2 (aa50-66)及びCDR3 (aa99-107)を含んで成る抗体重鎖；
b) CDRとして配列番号２又は４のCDR1 (aa24-34)、CDR2 (aa50-56)及びCDR3 (aa89-98)を含んで成る抗体軽鎖、
を含んで成る。
本発明の抗体の重鎖の好ましい可変領域及びCDR、特にCDR3は、ドイツ国のDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)に寄託された<IGF-IR >HUMABクローン18(抗体 18)、<IGF-IR >HUMABクローン22(抗体 22)により提供される。
これらの抗体は、WO2005/005635で詳細に説明されている。
本発明の抗体の重鎖のさらに好ましい可変領域及びCDR、特にCDR3は、ドイツ国のDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)に寄託された<IGF-IR >HuMabクローン1a (抗体aA, Ab 1A又はAk 1A)、<IGF-1R> HuMabクローン23 (抗体23)、及び<IGF-1R>HuMab-クローン8 (抗体8)によって提供される。
これらの抗体は、WO2004/087756で詳細に説明されている。
本発明は更に、かかる抗体の組換えによる産生方法を提供する。
本発明は更に、癌を治療する方法であって、癌を有する（そして、それ故に抗腫瘍治療が必要である）と診断された患者に対して、有効量の本発明のIGF-IRに対するアンタゴニスト抗体を投与すること、を含んで成る方法を提供する。当該抗体は、単独で、医薬組成物として、あるいは細胞毒性治療、例えば放射線治療又は細胞毒性薬若しくはそのプロドラッグと組み合わせて投与してもよい。
本発明は更に、癌治療のための、そして本発明の医薬組成物の製造のための本発明の抗体の使用を含んで成る。また、本発明は、本発明の医薬組成物の製造方法を提供する。
本発明は更に、医薬として有効な量の本発明の抗体と、任意に、医薬目的で抗体を処方するのに有用な緩衝液及び／又はアジュバントとを一緒に含む医薬組成物を含んでなる。
本発明は更に、かかる抗体を医薬として許容される担体中に含んで成る医薬組成物を提供する。１つの態様において、当該医薬組成物は製品又はキットに含めてもよい。
本発明は更に、本発明の組換えヒト抗体の製造方法であって、IGF-IRに対する抗体をコードする核酸を、前記抗体を完全にフコシル化するCHO宿主細胞で発現させ、そして前記抗体を前記細胞から回収すること、を特徴とする方法を含んで成る。本発明は更に、かかる組換え法によって得られる抗体を含んで成る。
本発明の詳細な説明
用語「抗体」は、種々の形態の抗体を包含し、限定しないが、例えば抗体全体、抗体の断片、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び、並びに、本発明の特性が保持されている限り、一般的な遺伝子操作がされた抗体を含む。
用語「抗体」は、種々の形態の抗体を包含し、限定しないが、例えば抗体全体、抗体の断片、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び、並びに、本発明の特性が保持されている限り、一般的な遺伝子操作がされた抗体を含む。
「抗体断片」は、全長抗体、通常少なくとも抗原結合部分、又はその種々の領域を含む。抗体断片の例としては、二重特異性抗体(diabody)、一本鎖抗体分子、免疫毒素、及び抗体断片から形成される多特異的抗体がある。
用語「モノクロナール抗体」又は「モノクロナール抗体組成物」は、本明細書で使用する場合、単一のアミノ酸組成物の抗体分子の調製物を意味する。従って、用語「ヒトモノクロナール抗体」は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列から誘導される可変及び定常領域を有する単一の特異的結合を示す抗体を意味している。
用語「キメラ抗体」は、１種類の起源又は種に由来する可変領域、すなわち結合領域、及び、異なる起源又は種から誘導された、通常は組換えＤＮＡ技術により調製された定常領域、を含んで成るモノクローナル抗体を意味する。マウスの可変領域及びヒトの定常領域を含むキメラ抗体が特に好ましい。こうしたマウス/ヒトのキメラ抗体は、マウスの免疫ブロブリン可変領域をコード化するＤＮＡセグメント、及びヒトの免疫ブロブリン定常領域をコード化するＤＮＡ断片を含むイムノグロブリン遺伝子の発現産物である。本発明に包含される他の形態の「キメラ抗体」は、「クラススイッチ抗体」とも称される。キメラ抗体の生成方法は、現在当業界で周知の、常用されている組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術を包含している。例えば、Morrison,S.L., et al., Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855;米国特許番号5,202,238及び5,204,244を参照のこと。
用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク又は「相補性決定領域」(CDR)が修飾されることで、親免疫ブロブリンのものと比較して特異性の異なるイムノグロブリンのCDRを含んで成る抗体を意味する。好ましい態様において、マウスCDRをヒト抗体のフレームワーク領域へ移植することで、「ヒト化抗体」が調製される。例えば、Riechmann,L., et al., Nature 332(1988)323-327；及びMeuberger,M.S., et al., Nature 314(1985)268-270を参照のこと。特に好ましいCDRは、キメラ及び２機能抗体として上記抗原を認識する配列を表すものである。
用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、ヒト生殖系イムノグロブリン配列から誘導される可変領域及び定常領域を有する抗体を含む意味である。可変重鎖は、好ましくは生殖系配列 DP-50（GenBank LO6618）由来であり、そして可変軽鎖は、生殖系配列 L6(GenBank X01668)由来である。あるいは、可変重鎖は、好ましくはDP-61（GenBank LO6618）由来であり、そして可変軽鎖は、生殖系配列 L15(GenBank K01323)由来である。前記抗体の定常領域は、ヒトIgG1型の定常領域である。かかる領域はアロタイプであってもよく、そして、例えばJohnson,G.,and Wu,T.T.,Nucleic acids Res.28(2000)214-218、及び本明細書に引用されたデータベースにて説明されている。
用語「組み換えヒト抗体」は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列から誘導される可変領域及び定常領域を再配列した形態で有する抗体を意味する。本発明の組換えヒト抗体は、in vivoでの体細胞超変異にかけられている。従って、組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH及びVL配列から誘導され、これに関連しているが、ヒト抗体のin vivoの生殖系列レパートリーには天然には存在し得ない配列である。
本明細書で使用する場合、「結合」とは、約10-13から10-8M(KD)、好ましくは約10-13から10-9Mの親和性にて、IGF-IR に結合する抗体を意味する。
用語「核酸分子」は、本明細書で使用する場合、DNA分子及びRNA分子を含む意味である。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。
IgG1又はIgG3型のヒト定常領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda,MD.(1991)、及びBruggemann.M. et al., J. Exp.Med.166(1987)1351-1361、Love,T.W., et al., Methods Enzymol.178(1989)515-527に詳細に記載されている。例えば、配列番号5〜8に示されている。他の有用で好ましい定常領域は、本発明についてDSMZに寄託されたハイブリドーマ細胞系から得られる抗体の定常領域である。
IgG1又はIgG3型の定常領域は、Asn297でグリコシル化されている。本発明における「Asn297」とは、Fc領域のほぼ297位に位置しているアミノ酸、アスパラギンを意味している。抗体の軽微な配列変更に基づけば、Asn297は幾つかのアミノ酸（通常ほぼ±３個のアミノ酸）上流又は下流に位置することもある。例えば、本発明に従う一つの抗体では、「Asn297」はアミノ酸298位に位置している。
ヒトIgG1又はIgG3のグリコシル化は、最大２個のGal（ガラクトース）残基で停止した、コアのフコシル化された二アンテナ複合体のオリゴ糖グリコシル化としてAsn297で生じる。これらの構造は、末端のGal残基の量に応じて、G0、G1(α1,6又はα1,3)又はG2グリカン残基と命名されている (Raju, T.S., BioProcess Int. 1(2003)44-53)。抗体のFc部分のCHO型グリコシル化は、例えばRoutier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 202-207に記載されている。
「可変領域」(軽鎖(LH)の可変領域、重鎖(VH) の可変領域)は、本明細書で使用する場合、抗原が抗原と結合するのに直接関与する軽鎖と重鎖のそれぞれの対を表している。ヒトの軽鎖及び重鎖の可変領域は、同じ一般構造を有し、そして各領域は４個のフレームワーク(FR)領域を含み、その配列は広く保存され、３個の「超可変領域」(又は相補性決定領域、CDR)により接合されている。フレームワーク領域はβシート立体配座を採用しており、そしてそのCDRはβシート構造に接続するループ構造を形成することもある。各鎖のCDRはフレームワーク領域によりそれらの三次元構造が保持されており、そして他の鎖由来のCDRと一緒に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖と軽鎖のCDR3領域は、本発明による結合特異性/親和性において特に重要な役割を果たすため、本発明の追加の目的を提供するものである。
用語「超可変領域」又は「抗体の抗原結合部分」は、本明細書で使用する場合、抗原結合にとって重要な抗体のアミノ酸残基を指している。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「CDR」由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「FR」領域は、本明細書で規定する超可変領域残基以外のこれらの可変ドメイン領域である。そのため、抗体の軽鎖及び重鎖は、N-からC-末端から、以下のドメインFR1,CDR1, FR2,CDR2 FR3,CDR3,及びFR4を含む。特に重鎖のCDR3は、抗原結合に最も寄与する領域である。CDR及びFR領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))の標準的な定義により決定され、そして／あるいは、「超可変ループ」由来の残基である。
用語「IGF-IRに対する結合」は、本明細書で使用する場合、in vitroアッセイ、好ましくは結合アッセイにおいて、抗体が表面に結合され、そしてIGF-IR の結合が、表面プラズモン共鳴(SPR)により測定されるという、IGF-IRに対する抗体の結合を意味する。結合とは、結合親和性(KD)が10-8M以下であること、好ましくは10-13〜10-9Mであることを意味する。
IGF-IRに対する結合は、BIAコアアッセイ(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden)で研究することができる。結合親和性は、ka(抗体/抗原複合体から抗体の結合速度定数)、kd(解離定数)、及びKD(kd/ka)の用語により定義される。本発明による抗体は、KDが10-10M以下であることを示している。
IGF-IRに対するIGF-I及びIGF-IIの結合は、本発明の抗体によっても阻害される。当該阻害は、腫瘍細胞上のIGF-IRに対するIGF-I/IGF-IIの結合についてのアッセイにおけるIC50として測定される。このようなアッセイは実施例７に記載されている。かかるアッセイにおいて、前記腫瘍細胞(たとえばHT29)の表面に提示されるIGF-IRと結合した、放射性標識されたIGF-I又はIGF-II、あるいはそのIGF-IR結合断片の量は、抗体の濃度を増大させずに、又は増大させて測定される。IGF-IR に対するIGF-I及びIGF-IIの結合についての本発明の抗体のIC50値はわずか2nMであり、そしてIGF-IR に対するIGF-I/IGF-IIの結合に対するIC50値の比率は、約1:3〜3:1である。IC50値は少なくとも３つの独立した測定値の平均値又は中央値として測定される。シングルのIC50値が範囲外であってもよい。
用語「IGF-IR に対するIGF-I及びIGF-IIの結合の阻害」とは、本明細書で使用する場合、in vitroアッセイにおけるHT29(ATCC HTB-38)腫瘍細胞の表面上に提示されるIGF-IR に対するI125標識IGF-I又はIGF-IIの結合の阻害を意味している。阻害とは、IC50値が2nM以下であることを意味している。
用語「IGF-IR発現細胞」とは、細胞当たり少なくとも約20,000個の受容体に対しIGF-I受容体を過剰発現している細胞を指す。このような細胞は、たとえば、NCL H322M又はHT29などの腫瘍細胞株、又はIGF-IRについての発現ベクターでトランスフェクションした後の、IGF-IR を過剰発現する細胞株(たとえば3T3 ATCC CRL1658)である。細胞当りの受容体の量は、Lammers,R., et al., EMBO J.8(1989)1369-1375に従い測定される。
用語「IGF-IR のリン酸化の阻害」は、前記抗体を用いないアッセイと比較した場合に、０．５％熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)を含む培地中、細胞当たり４００，０００〜６００，０００個の分子のIGF-IRを提供する3T3細胞を用いた細胞リン酸化アッセイを指している。このようなアッセイは実施例１１に記載されている。FCSの不活性は、相補系の不活性のため56℃で短時間で加熱することにより行う。
用語「PKBリン酸化の阻害」は、前記抗体を用いないアッセイと比較した場合に、０．５％熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)を含む培地中、細胞当たり４００，０００〜６００，０００個の分子のIGF-IRを提供する3T3細胞を用いた細胞リン酸化アッセイを指している。リン酸化は、PKBのセリン473でリン酸化されたPKBに対して特異性がある抗体を用いたウェスタンブロットにより検出される(Akt 1,Swiss Prot Acc.NO.P31749)。このようなアッセイは実施例１１に記載されている。
用語「抗体依存性細胞障害(ADCC)」は、エフェクター細胞の存在下での、本発明の抗体によるヒト腫瘍標的細胞の溶解を指している。好ましくはADCCは、本発明の抗体を用いて、エフェクター細胞、バフィーコート、例えば単球又はNK細胞（ナチュラルキラー細胞）から新たに単離されたPBMC（末梢血単核細胞）又は精製されたPBMCの存在下IGF-IR発現細胞の調製物を処理することで測定される。
用語「IGF-I媒介型シグナル伝達の完全な阻害」は、IGF-IRのIGF-Iを媒介するリン酸化の阻害を意味する。このようなアッセイのために、IGF-IR発現細胞、好ましくはH322M細胞はIGF-Iで刺激され、そして本発明による抗体で処理される(5nM以上の抗体濃度が有効である)。その後、SDS PAGEを実施し、そしてIGF-IR のリン酸化を、リン酸化チロシンに対し特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析によって測定する。ウェスタンブロット上でバンドがヒトの眼で検出できない場合、IGF-IRはリン酸化されているため、シグナル伝達は完全に阻害されていることが分かる。
本発明による抗体は、抗体18と同じIGF-IR のエピトープへの結合を示すか、あるいは抗体18よる結合の立体障害が原因で、IGF-IR への結合が阻害される。結合阻害は、固定化された抗体18又はIGR-IRを20-50nMの濃度で、そして検出されるべき抗体を100nMの濃度で用いたSPRアッセイにより検出することができる。50%以上のシグナルの減少は、抗体が抗体18と競合していることを示している。このようなアッセイは、固定化された抗体として抗体22を使用することで同じように行うことができる。
用語「エピトープ」は、抗体と特異的に結合できるタンパク質決定因子を意味する。通常エピトープは、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性な表面分子群から成り、そして通常特異的な三次元構造特性、及び特異的な電荷特性を有する。
立体構造と非立体構造のエピトープは、前者に対する結合は変性溶媒の存在下で損なわれるのに対し、後者に対する結合は損なわれない点で区別される。
本発明の抗体は、チロシンのIGF-IRリン酸化を阻害し、好ましくはチロシンのPKBリン酸化も同程度阻害する。
本発明の抗体は、好ましくは、腫瘍細胞及び腫瘍、例えば異種移植腫瘍におけるIGF-IRタンパク質レベルをダウンレギュレートする。
本発明の抗体は、好ましくは、コロニー形成アッセイにおける腫瘍細胞の三次元成長並びにIGF-IR発現細胞（例えば、NIH 3T3細胞）の増殖を阻害する。
本発明の抗体は、好ましくは、前記抗体を200 nmol/Lの濃度で用いた、インスリン受容体を過剰発現する3T3細胞上での結合競合アッセイにおいて、インスリン受容体に対するインスリンの結合を阻害する。
本発明の抗体は、当該抗体を完全にフコシル化するCHO細胞において組換え手段により産生される。タンパク質発現のために、軽鎖及び重鎖あるいはその断片をコードする核酸が、標準的な方法により発現ベクター内に挿入される。発現は、かかるCHO細胞で実施され、そして当該細胞（上清又は溶解後の細胞）から前記抗体は回収される。
有用なCHO宿主細胞は、本発明の抗体をコードする核酸でトランスフェクションしたCHO細胞を、DHFR選択圧のもと培養し、一種のクローンをピッキングし、当該クローンを広げ、そして本発明のグリコシル化パターンを有する抗体を産生するクローンを選択すること、を含んで成る方法によって産生することができる。好ましくは、培養は少なくとも２週、好ましくは少なくとも３週間実施される。CHO細胞は好ましくはDG44細胞である。
用語「CHO細胞」とは、機能的に不活性な、好ましくは欠失されている、２つのdhfr対立遺伝子（ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損(dhfr-)）をベースとした、種々の形態のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を包含している。かかるdhfr-細胞及びその生成方法は、例えばUrlaub, G. et al., Cell 33 (1983) 405-412; Chasin, L. et al., Som. Cell Molec. Genet. 12 (1986) 555-556; Kolkekar, A.S. et al., Biochemistry 36 (1997) 10901-10909において説明されている。好ましくは、当該細胞はDG44細胞系である。そのようなCHO dhfr-細胞は、ガンマ線を用いてdhfr遺伝子座の全体を排除することで産生することができる。突然変異していない、野生型の細胞においては、dhfrはグリシン、プリン、及びチミジル酸の新規合成にとって必須の酵素である。これにより、プラスミド上でコードされたdhfr遺伝子が、dhfr-欠損細胞系におけるタンパク質の発現のための優性選択マーカー及び遺伝子増幅因子(amplifier)として使用可能となる。DG44細胞におけるdhfr-突然変異は、安定で且つ不可逆的である。ヒトIgG1又はIgG3型の抗体のための発現ベクター及びDHFR遺伝子を用いて首尾よくコトランスフェクトされたCHO細胞は、dhfr+の表現型を有することとなり、そしてチミジン及びヒポキサンチンを欠き、任意に増幅用のメトトレキサート（ＭＴＸ）を含む培地上でコロニーを培養することで容易に選択することができる。
DG44細胞は当業界で周知であり、例えば、Invitrogen Corp (USA)から細胞系として市販されている。DG44細胞は、懸濁液及び／又は無血清培地中で接着して生育することができる。本明細書で使用する場合、「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」は、同義的に使用され、そしてCHO dhfr-細胞系（２つの欠失したdhfr対立遺伝子）の全てのそのような標記は、子孫を含むものである。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、形質転換の回数に関係なく、初代の対象細胞及びそれに由来する培養物を含む。全ての子孫は、意図的又は偶発的な突然変異のため、ＤＮＡの内容が厳密に同一でなくてもよいと理解されたい。本発明のグリコシル化特性を有する突然変異した子孫は、スクリーニングされる場合、最初に形質転換した細胞に含められる。
好ましくは、CHO dhfr-細胞系は、選択マーカー遺伝子として少なくともDHFRでコトランスフェクトされる。例えば、選択マーカー及び抗体遺伝子を含む哺乳類発現ベクターは、レシピエントCHO細胞内にコトランスフェクトされる。その結果生じたコロニーを選択してもよく、そして期待した表現型を示すコロニーは、当該抗体を発現することができるものである。追加の選択マーカーは、優性の性質のものであるか、あるいはそうでなくてもよい。コトランスフェクションに使用するための追加の選択マーカーの例には、アデノシンデアミナーゼ(Kaufman, RJ., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 3136-3140)、アスパラギン合成酵素(Cartier, M., et al., Mol.Cell Biol. 7 (1987) 1623-1628)、E. コリtrpB遺伝子及びサルモネラhisD遺伝子 (Hartman, S.C., and Mulligan, R.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 8047- 8051)、M2マウスリボヌクレオチドレダクターゼ (Thelander, M., and Thelander, L., EMBO J. 8 (1989) 2475-2479)、ヒト多剤耐性遺伝子 (Kane, S.E., et al., Gene 84 (1989) 439-446)、グルタミン合成酵素 (Bebbington, CR. et al., DNA Cloning, Vol. Ill, D.M. Glover (ed.), IRL Press, pp. 163-188, 1987)、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ (gpt) (Mulligan, R.C., and Berg, P., Science 209 (1980) 1422-1427)、ハイグロマイシンB (Santerre, R.F., et al., Gene 30 (1984) 147-156)、ネオマイシン遺伝子(Southern, P.J., and Berg, P., J. MoI. Appl.Genet. 1 (1982) 327-341)がある。
選択マーカーは、前記抗体をコードする遺伝子が増幅されうる際の基礎を提供することもある。CHO細胞系のコトランスフェクションにおいて、前記ベクターのＤＮＡは、同一の遺伝子座で細胞の染色体内に組み込まれる。従って、増幅用の基礎としての選択マーカーのいずれか一つの使用は、通常、両遺伝子のコピー数の並列的な増大をもたらす。この方法に使用するためのある特定の選択マーカーはdhfrであり、これは所望の増幅がMTX（メトトレキサート）の濃度の増大を利用することで得られることを可能にするものである。
選択マーカーは、当然のことながら、それらの発現が提供されるように、ＤＮＡの制御因子の調節下にある。選択マーカーとしてdhfrを使用する場合、制御因子は、好ましくはウイルス起源のものであり、例えば腫瘍ウイルス由来のＤＮＡである。特に好ましくは、SV40又はアデノウイルス主要後期プロモーターが使用される。この点で、プロモーターからエンハンサー因子を除去し、それにより効果的にこれを「無能化(crippling)」することが特に有利である。この修飾は、強力なプロモーターが使用された場合、他の方法で生じるものと比較して、メトトレキサート選択の各濃度での遺伝子増幅レベルの増大を可能にする。選択マーカーとしてネオマイシンが使用される場合、適当なプロモーターの例はマウスメタロチオネインプロモーターである。
抗体の組み換え体の生成は当業界で周知であり、そして例えばthe revirw article of Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999);Geisse,S. et al., Protein Expr.Purif.8 (1996)271-282; Kaufman,R.J,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161;Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880に記載されている。
抗体は細胞全体、上清、細胞可溶化物、あるいは部分的に精製され又は実質的に純粋な形態に存在することもある。精製は、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動、及び当業界で周知の他の技術により、他の細胞成分、又は他の感染体たとえば核酸又はタンパク質を除去するために行われる。Ausubel,F., et al., ed.Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)を参照のこと。
原核細胞にとって適切な制御配列には、例えば、プロモーター、任意にはオペレーター配列、及びリボソーム結合部位がある。原核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係で配置される場合、「作用可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダー配列のDNAは、それがポリペプチドの分泌において沈殿するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのためにDNAに作用可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作用可能に連結され；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するために位置決定される場合、コード配列に作用可能に連結される。一般的に「作用可能に連結」とは、連結されるDNA配列が連続的であり、そして分泌リーダー配列の場合、及び読み枠において、連続的であることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続的であるべきではない。連結は、都合の良い制限部位での連結により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、従来の実施に従って使用される。
モノクローナル抗体は、従来のイムノグロブリン精製方法、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィーにより、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするDNA及びRNAは、従来の方法を用いて、容易に単離され、そして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNA及びRNAの起源として作用することができる。一旦同定され、そして単離されると、当該DNAは発現ベクター中に挿入され、次に、他の方法ではイムノグロブリンタンパク質を生成しないCHO細胞内にトランスフェクションされ、その結果宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成が得られる。
本発明はまた、細胞毒性剤、例えば化学療法剤、毒素（例えば、細菌、菌類、植物又は動物起源の酵素的活性毒素、又はそのフラグメント）、放射性同位体（すなわち、放射性接合体）、又は細胞毒性剤のプロドラッグに接合される本発明の抗体を含んで成る免疫接合体にも関する。使用され得る酵素的活性毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素A鎖（シュードモナス・アエルギノサ由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI, PAPII、及びPAP-S）、ニガウリ(Momordica charantia)インヒビター、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス(Sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを包含する。
抗体及び細胞毒性剤の接合体は、種々の二官能基製タンパク質カップリング剤、例えば次の化合物を用いて製造される：N-スクシンイミジル-３-（２-ピリジルジチオール）プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルのニ官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート（HCL））、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えば、ビス（p-アジドベンゾイル）-エチレンジアトニン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６-ジイソシアネート）、及びビス-活性フッ素化合物（例えば、１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン）。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta, E. S. ,など., Science 238 (1987)1098-1104に記載のようにして調製され得る。14C-標識１-イソチオシアネートベンジル-３-メチルジエチレントリアミノ五酢酸（MX-DTPA）は、抗体への放射性ヌクレオチドの接合のための典型的なキレート化剤である。WO94/11026号を参照のこと。
別の観点において、本発明は、医薬として許容される担体と一緒に調製される、本発明の抗体を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、併用療法で、すなわち、他の物質とともに投与することができる。例えば、併用療法には、本発明の組成物と、少なくとも１つの抗腫瘍剤、例えば化学療法剤、細胞毒又はプロドラッグ又は他の常用の療法が含まれることがある。
「化学療法剤」とは、癌の治療において有用な化合物である。化学療法剤の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５-フルオロウラシル、シトシン アラビノシド（“Ara-C”）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソテール（ドセタキセル）、ブスルファン、サイトキシン(Cytoxin)、タキソール、メトトレキサート、シスプラスチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクリスチン(Vincreistine)、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン（米国特許第4,675,187号を参照のこと）、メルファラン及び他の関連するナイトロジェンマスタードがある。
用語「細胞毒性剤」とは、本明細書において使用される場合、細胞の機能を阻害するか、又は防げ、そして/又は細胞の破壊を引起す物質を指す。この用語は、放射性同位体、化学療法剤、及び毒素、例えば細菌、菌類、植物又は動物起源の酵素的活性の毒素、又はそのフラグメントを包含する。
用語「プロドラッグ」とは、本出願において使用する場合、親薬物と比較して、腫瘍細胞に対して低い細胞毒性であり、且つ酵素的に活性化することができるか、又はより活性的な親の形態に変換することができる医薬活性物質の前駆体又は誘導体型を指す。例えば、Wilman,"Prodrugs in CancerChemotherapy"Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th MeetingBelfast(1986), 及び Stellaら.,"Prodrugs : A Chemical Approach to Targeted DrugDelivery,"Directed Drug Delivery, Borchardt et al. , (ed. ), pp. 247-267, Humana Press(1985)を参照のこと。本発明のプロドラッグは、限定しないが、より活性的な細胞毒性のある遊離薬物に転換され得る、リン酸塩含有プロドラッグ 、チオリン酸塩含有プロドラッグ 、硫酸塩含有プロドラッグ 、ペプチド含有プロドラッグ 、D-アミノ酸-修飾プロドラッグ 、グリコシル化プロドラッグ 、β-ラクタム環プロドラッグ 、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ 又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ 、５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグ を包含する。本発明で使用するためのプロドラッグの形態に誘導体化され得る細胞毒性薬物の例として、上記のそれらの化学療法剤があるが、これには限定されない。
本明細書において使用される場合、「医薬として許容される担体」とは、生理学的に適合できる、いずれかの及びすべての溶媒、分散媒体、コーティング、殺菌剤及び抗菌剤、等張及び吸収遅延剤、等を包含する。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）のために適切である。
「医薬として許容される塩」とは、抗体の所望する生体活性を保持し、そしていずれの所望しない毒物学的効果も付与しない塩を言及する（例えば、Berge, S. M. , など. , J. Pharm. Sci. 66 (1977) 1-19を参照のこと）。そのような塩は本発明に包含される。そのような塩の例は、酸付加塩及び塩基付加塩を包含する。酸付加塩は、非毒性無機塩から誘導されるそれら、例えば塩酸塩を包含する。
本発明の組成物は、当業界において知られている種々の方法により投与され得る。当業者により理解されるように、投与の経路及び/又は形は、所望する結果に依存して変化するであろう。
一定の投与経路により本発明の化合物を投与するためには、その不活性化を妨げるための材料と共に化合物を被覆するか、又はそれと共に化合物を同時投与する必要がある。例えば、化合物は、適切な担体、例えばリポソーム又は希釈剤において、対象に投与され得る。医薬として許容される希釈剤は、塩溶液及び緩衝水溶液を包含する。
医薬として許容される担体は、滅菌した注射用溶液又は分散液の即座の調製のための滅菌水溶液又は分散液及び滅菌粉末を包含する。医薬活性物質のためへのそのような媒体及び剤の使用は、当業界で知られている。
用語「非経口投与」及び「非経口投与される」とは、本明細書において使用される場合、腸内及び局部投与以外の投与の態様、通常、注射を意味し、そして静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮膚内、腹膜内、経気管内、皮下、表皮下、関節内、皮膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜下及び胸骨内注射及び注入を包含する。
それらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含むことができる。微生物の存在の予防は、上記殺菌工程により、及び種々の殺菌剤及び抗菌剤、例えばパラベン、クロロブラノール、フェノール、ソルビン酸及び同様のものの注入により確保され得る。組成物中に等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム及び同様のものを包含することがまた、所望される。さらに、注射用医薬形の延長された吸収が、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの包含によりもたらされ得る。
選択される投与経路とは無関係に、適切な水和された形で使用され得る本発明の化合物、及び/又は本発明の医薬組成物は、当業界に知られている従来の方法により、医薬として許容される剤形へと調剤される。
本発明の医薬組成物における活性成分の実際の用量レベルは、特定の患者のための所望する治療応答を達成するために効果的である量の活性成分、組成物、及び投与の態様を得るために変更され得る。選択される用量レベルは、種々の薬物動力学的因子、例えば使用される本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩又はアミドの活性、投与の経路、投与の時間、使用される特定化合物の排泄の経路、処理の持続期間、他の薬物、使用される特定組成物と組合して使用される化合物及び/又は材料、処理される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康及び病歴、及び当業者において良く知られている同様の因子に依存するであろう。
組成物は、その組成物が注射器により供給される程度まで、滅菌され、且つ流体でなければならない。水に加え、前記担体は好ましくは等張緩衝生理食塩水である。
適切な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用により、分散体の場合、必要とされる粒度の維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール又はソルビトール及び塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。
好ましくは、本発明により完全にフコシル化された抗体は、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）の治療の場合、好ましくはエルロチニブ（タルセバ（登録商標））と、乳癌の治療の場合、好ましくはハーセプチン（トランスツヅマブ）と、そして膵臓腫瘍の治療の場合、好ましくはゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））と組み合わせるのが有用である。
以下の実施例、図及び配列表は、本発明の理解を助けるために提供するものであり、発明の真の範囲は特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神を逸脱することなく、記載された手順に変更が加えられることがあることを理解されたい。
細胞系
組換えIgG発現のための細胞系の生成に使用される親細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系のCHO-DG44（Flintoff, W.F. et al., Somat. Cell Genet. 2 (1976) 245-261；Flintoff et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982) 275-285；Urlaub, G. et al., Cell 33 (1983) 405-412；Urlaub, G. et al., Somat. Cell Mol. Genet. 12 (1986) 555-566）である。CHO-DG44細胞は、酵素、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の内在性遺伝子座の両方を失っている。CHO-DG44細胞を、MEMαマイナス培地（Gibco No. 22561）、10%の透析FCS（Gibco No.26400-044）及び2mmol/LのL-グルタミン、100μMのヒポキサンチン、16μMのチミジン（HTサプリメント）中で培養した。
組換えIgG発現のための細胞系の生成に使用される親細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系のCHO-DG44（Flintoff, W.F. et al., Somat. Cell Genet. 2 (1976) 245-261；Flintoff et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982) 275-285；Urlaub, G. et al., Cell 33 (1983) 405-412；Urlaub, G. et al., Somat. Cell Mol. Genet. 12 (1986) 555-566）である。CHO-DG44細胞は、酵素、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の内在性遺伝子座の両方を失っている。CHO-DG44細胞を、MEMαマイナス培地（Gibco No. 22561）、10%の透析FCS（Gibco No.26400-044）及び2mmol/LのL-グルタミン、100μMのヒポキサンチン、16μMのチミジン（HTサプリメント）中で培養した。
プラスミド
発現系は、CMVプロモーターを含ん成り、そして、表1で説明されている。抗体として、IGF-1Rに対する抗体（WO 2005005635；AK18又はAK22）を使用した。
発現系は、CMVプロモーターを含ん成り、そして、表1で説明されている。抗体として、IGF-1Rに対する抗体（WO 2005005635；AK18又はAK22）を使用した。
実施例1
トランスフェクションと選択
発現プラスミドのトランスフェクションを、Fugene（Roche Diagnostics GmbH）を用いて実施した。トランスフェクションの1日後に、DG44細胞を、MEMαマイナス培地、10%の透析FCS、2mmol/LのL-グルタミン、及び20nMのメトトレキサート（MTX）から成る選択圧下に置いた。選択圧下において3週間後に、単一クローンを、プレートから選定し、そして、増やした。
トランスフェクションと選択
発現プラスミドのトランスフェクションを、Fugene（Roche Diagnostics GmbH）を用いて実施した。トランスフェクションの1日後に、DG44細胞を、MEMαマイナス培地、10%の透析FCS、2mmol/LのL-グルタミン、及び20nMのメトトレキサート（MTX）から成る選択圧下に置いた。選択圧下において3週間後に、単一クローンを、プレートから選定し、そして、増やした。
上清を回収し、そして、抗体の存在を、ヒトIgG特異的ELISAを用いて分析した。サブクローンを、特異的抗体の産生のためにさらに増やし、そして、分析した。
クローンを、浮遊培養による、20nMのMTXを含む無血清培地HyQ SFM4 CHO-Utility（HyCIone #SH30516）中での増殖に順応させた。平行して、グリコパターン（glycopattern）特性を測定した。サブクローンを、（総モル・オリゴ糖量に関して）2.0%以下の脱フコシル化（defucosylation）を条件として選択した。
実施例2
培養と精製
3×105個の細胞を、30mlの培地を入れた125ml容の振とうフラスコ（Corning）内、37℃、5%のCO2、100rpmにて10日間培養した。細胞密度を、CASY Counterによって計測し、そして、プロテインAアフィニティー・クロマトグラフィーによる抗体濃度の定量のために、上清を取った。さらなる生物化学的特徴づけのために、それぞれの上清、約20mlをタンパク質Aクロマトグラフィー（PBSで平衡化、25mMのクエン酸ナトリウム・バッファーpH5.2で洗浄、100mMのクエン酸ナトリウム・バッファーpH2.8で溶出、10mMのNaOHでCIP）で精製した。
培養と精製
3×105個の細胞を、30mlの培地を入れた125ml容の振とうフラスコ（Corning）内、37℃、5%のCO2、100rpmにて10日間培養した。細胞密度を、CASY Counterによって計測し、そして、プロテインAアフィニティー・クロマトグラフィーによる抗体濃度の定量のために、上清を取った。さらなる生物化学的特徴づけのために、それぞれの上清、約20mlをタンパク質Aクロマトグラフィー（PBSで平衡化、25mMのクエン酸ナトリウム・バッファーpH5.2で洗浄、100mMのクエン酸ナトリウム・バッファーpH2.8で溶出、10mMのNaOHでCIP）で精製した。
実施例3
抗体の糖構造の分析
精製した抗体物質を、液体クロマトグラフィー／質量分析（LCMS）ペプチド・マップ解析によって分析した。サンプルを、還元し（0.4MのTRIS/HCl、8Mのグアニジン/HCl、pH8.5、DTT（3mg/ml））、カルボキシメチル化し（ヨード酢酸）、そして、トリプシンで開裂した。ペプチド-糖ペプチド混合物を、RP-HPLCで分離し、そして、エレクトロスプレー質量分析法を用いてオンラインで分析した。ペプチドを含めた糖構造のm/zスペクトルをまとめ、結果を表2に示す。
抗体の糖構造の分析
精製した抗体物質を、液体クロマトグラフィー／質量分析（LCMS）ペプチド・マップ解析によって分析した。サンプルを、還元し（0.4MのTRIS/HCl、8Mのグアニジン/HCl、pH8.5、DTT（3mg/ml））、カルボキシメチル化し（ヨード酢酸）、そして、トリプシンで開裂した。ペプチド-糖ペプチド混合物を、RP-HPLCで分離し、そして、エレクトロスプレー質量分析法を用いてオンラインで分析した。ペプチドを含めた糖構造のm/zスペクトルをまとめ、結果を表2に示す。
CHO細胞系クローン5（hu MAb＜IGF-1R＞B1-4E10_9-16）を、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、ドイツ国Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSMZ）に2006年6月21日付けで登録番号DSM ACC2795にて寄託した。
種々のクローンの培養に使用した培地を、Hyclone（HyQ SFM4 CHO-Utility、クローン4〜6に使用した）又はSigma（C-8862、クローン1〜3及び7に使用した）から入手した。
LCMSペプチド・マップ解析を、すべての糖ペプチドに関するすべての荷電状態の特異的イオン・クロマトグラムの集積によって実施した。
分岐GlcNac、NGNA und、及び高マンノースを、同様に測定した。
分岐GlcNacとNGNAは検出できなかった。従って、NGNAの量は、0.5%以下であり、しかも、0.1%以下でもある。分岐GlcNacの量もまた、0.5%以下であり、しかも、0.1%以下である。
典型的なグリコシル化の計算を、表3に示した（表3a：クローン3、表3b：クローン5；H27という、asn298を含んで成るペプチド）。
実施例4
抗IGF-IR HuMAbsによる抗体媒介型エフェクター機能の定量
生じたHuMAb抗体が免疫エフェクター作用機序を誘発する能力を測定するために、抗体依存性細胞毒性（ADCC）研究を実施した。
抗IGF-IR HuMAbsによる抗体媒介型エフェクター機能の定量
生じたHuMAb抗体が免疫エフェクター作用機序を誘発する能力を測定するために、抗体依存性細胞毒性（ADCC）研究を実施した。
ADCCによる抗体の効果を研究するために、IGF-IRを発現するDU145前立腺癌細胞（HTB-81 ATCC；2〜4mlのRPMI-FM中、1×106個）を、細胞インキュベータ内、37℃にて25分間、1μlのビス（アセトキシメチル）2,2’：6’,2’’-ターピリジン-6,6''-ジカルボキシラート（BATDA）溶液で標識した。細胞を、10mlのRPMI-FMで4回洗浄し、ブレーキをかけながら200×gにて10分間、遠心機にかけた。その後、細胞を、1mlあたり1×105細胞の濃度に調整した。5,000個の細胞を、50μlの量に相当する丸底プレート内のウェルごとに蒔いた。HuMAb抗体を、50μlの細胞培地量に25〜0.1ng/mlの範囲にわたる終濃度にて加えた。それに続いて、50μlのエフェクター細胞である、全血から新たに単離したPBMC、又はバフィーコートからの精製したエフェクター細胞を、25：1の範囲のE：T比にて加えた。プレートを、すぐに、ブレーキをかけながら200×gにて1分間遠心分離し、そして、37℃にて2時間インキューベートした。インキュベーション後に、細胞を、200×gにて10分間遠沈し、そして、20μlの上清をOptiplate 96-Fマイクロタイタープレートに移した。（室温の）200μlのユーロピウム溶液を加え、そして、その混合物を振とう機上で15分間インキューベートした。得られた蛍光を、Perkin ElmerからのEU-TDAプロトコールを使用した時間分解蛍光光度計により計測した。
ADCCによる細胞溶解の程度を、それぞれの標的細胞からの2’,2’’-ターピリジン-6,6’’-ジカルボキシラート（TDA）の自然放出に対して補正した、界面活性剤によって溶解された標的細胞からのTDAの最大放出に対する%として示す。
「ADCCなし」を示す抗体の参照標準として、約35.000人のドナーから分離された同じIgGタイプ又はIgG混合物（「Redimune」）のKLH（キーホール・リンペット・ヘモシアニン）に対する（モノクローナル）抗体を使用する。IGF-IRに対する75%フコース不含抗体を、ポジティブコントロールとして使用した。本発明による抗体は、標準抗体のTDA放出の3×SD以内のTDA放出しか示さなかった（図1）。
実施例5
IGF-IRに対する抗IGF-IR抗体の親和性の定量
機器：BIACORE（登録商標）3000
チップ：CM5
結合：アミン結合
バッファー：HBS（HEPES、NaCl）、pH7.4、25℃
親和性測定のために、（ウサギからの）抗ヒトFCγ抗体を、IGF-IRに対する抗体の提示のためにチップ表面に結合させた。IGF-IR細胞外ドメインを、異なる濃度にて溶液中に加えた。3分のIGF-IR注入によって、会合を計測し；バッファーで5分間、チップ表面を洗浄することによって、解離を計測した。抗体18及び22に関する親和性データを、表4に示す。
IGF-IRに対する抗IGF-IR抗体の親和性の定量
機器：BIACORE（登録商標）3000
チップ：CM5
結合：アミン結合
バッファー：HBS（HEPES、NaCl）、pH7.4、25℃
親和性測定のために、（ウサギからの）抗ヒトFCγ抗体を、IGF-IRに対する抗体の提示のためにチップ表面に結合させた。IGF-IR細胞外ドメインを、異なる濃度にて溶液中に加えた。3分のIGF-IR注入によって、会合を計測し；バッファーで5分間、チップ表面を洗浄することによって、解離を計測した。抗体18及び22に関する親和性データを、表4に示す。
実施例6
IGF-IRを発現する腫瘍細胞へのIGF-I及びIGF-IIの結合の阻害
本発明の抗体がIGF-I受容体（IGF-IR）へのリガンドIGF-I及びIGF-IIの結合を妨げる能力を測定するために、放射活性物質で標識したリガンド・ペプチドを用いた競合実験を実施した。
IGF-IRを発現する腫瘍細胞へのIGF-I及びIGF-IIの結合の阻害
本発明の抗体がIGF-I受容体（IGF-IR）へのリガンドIGF-I及びIGF-IIの結合を妨げる能力を測定するために、放射活性物質で標識したリガンド・ペプチドを用いた競合実験を実施した。
ヒト腫瘍細胞（HT29、NCI H322M、0.5〜1×105/ml）を、2mMのL-グルタミン、1×非必須アミノ酸（Gibco、Cat. No. 11140-035）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco、Cat. No. 11360-039）、及び10%の熱不活性化FCS（PAA、Cat. No. A15-771）を補ったRPMI 1640培地（PAA、Cat. No. E15-039）中に蒔いた。T175形式の6本の瓶に、各実験のための個別の培地中の細胞20mlを接種し、そして、37℃、5%のCO2にて2日間培養して、コンフルエントな細胞単層を得た。
個々の細胞を回収するために、T175フラスコあたり2mlの1×トリプシン／EDTA（Gibco、Cat. No. 25300-054）を加え、そして、細胞の剥離をZeiss Axiovert25顕微鏡で観察した。細胞を回収し、そして、以前に記載した10%のFCSを含む培地を、50mlの全容積まで加えた。細胞を、1000rpmにて10分間遠心分離することによって再分離し（Heraeus sepatech、Omnifuge 2.0RS）、そして、50mlの結合バッファー（120mMのNaCl、5mMのKCl、1.2mMのMgSO4、1mMのEDTA、10mMのD（＋）グルコース、15mMのNaAc、100mMのHepes pH7.6、1%のBSA）中に再懸濁した。細胞を、カウントし、遠心分離によって再分離し、そして、結合バッファーで1×106細胞/mlに調整した。
0.1%のCH3COOH中に可溶化したI125-標識IGF-I及びIGF-IIぺプチド（Amersham、〜2000Ci/mmol、Cat. No. IM172及びIM238）を、結合バッファー中、4×105カウント／（分×ml）の最終活性に希釈した。25μlの前もって希釈したI125-標識IGF-I又はIGF-IIペプチドと一緒に、75μlの規定の濃度の抗体を、200μlの細胞懸濁液に加え、そして、4℃にて3.5時間インキューベートした。細胞を、2000rpmにて5分間の遠心分離（Eppendorf、5415C）によって再分離し、そして、上清を取り除いた。1mlの結合バッファーで2回洗浄した後に、細胞を、1mlの結合バッファー中に再懸濁し、そして、シンチレーション管に移した。細胞表面受容体に結合した放射性ペプチドの量を、シンチレーション・カウンターにより計測した。
抗体18の平均IC50値は0.3nMである。IGF-II結合について検出可能な阻害は観察できなかった。
実施例7
IGF-IR結合に関する抗体競合アッセイ
抗IGF-IRモノクローナル抗体のエピトープ・マッピングのために、親和性測定（実施例5）のような同様の形式を選択したが、IGF-IRを、溶液中、抗体と共にRTにて少なくとも0.5時間プレインキュベートした。この混合物を、注入し、そして、IGF-IR結合（又は阻害）を検出した。このアッセイは、IGF-IR結合に関するモノクローナル抗体の相互阻害活性（reciprocal inhibitory activity）を計測することを可能にする。本発明の抗体が、aa217-274に結合することが知られている抗体であるαIR3（Gustafson, T.A., and Rutter, W.J., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667）によるIGF-IRへの結合と競合することがわかった。
IGF-IR結合に関する抗体競合アッセイ
抗IGF-IRモノクローナル抗体のエピトープ・マッピングのために、親和性測定（実施例5）のような同様の形式を選択したが、IGF-IRを、溶液中、抗体と共にRTにて少なくとも0.5時間プレインキュベートした。この混合物を、注入し、そして、IGF-IR結合（又は阻害）を検出した。このアッセイは、IGF-IR結合に関するモノクローナル抗体の相互阻害活性（reciprocal inhibitory activity）を計測することを可能にする。本発明の抗体が、aa217-274に結合することが知られている抗体であるαIR3（Gustafson, T.A., and Rutter, W.J., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667）によるIGF-IRへの結合と競合することがわかった。
実施例8
IGF-IR及びAkt/PKBのIGF-I媒介型リン酸化の阻害
本発明の抗体がIGF-I受容体（IGF-IR）の活性化及びリン酸化を抑制する能力を測定するために、IGF-Iペプチドを用いた競合実験と、それに続く、リン酸化チロシンに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング分析を実施した。
IGF-IR及びAkt/PKBのIGF-I媒介型リン酸化の阻害
本発明の抗体がIGF-I受容体（IGF-IR）の活性化及びリン酸化を抑制する能力を測定するために、IGF-Iペプチドを用いた競合実験と、それに続く、リン酸化チロシンに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング分析を実施した。
ヒト腫瘍細胞（HT29、NCI H322M、5×104/ml）を、2mMのL-グルタミン、1×非必須アミノ酸（Gibco、Cat. No. 11140-035）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco、Cat. No. 11360-039）、及び0.5%の熱不活性化FCS（PAA、Cat. No. A15-771）を補ったRPMI 1640培地（PAA、Cat. No. E15-039）中に蒔いた。IC50値の定量のために、12ウェル・プレートに、各実験のための個別の培地中の細胞1mlを接種し、そして、5%のCO2、37℃にて2日間培養した。
低血清培地を用いた48時間の培養後に、培地を慎重に取り除き、そして、個別の培地中に希釈した異なる濃度の抗体によって置き換えた。37℃、5%のCO2にて5分間のインキュベーションの後に、IGF-Iペプチドを、2nMの終濃度にて加え、そして、細胞を、先に触れた条件下で10分間、再びインキューベートした。培地を、アスピレーションによって慎重に取り除き、そして、1ウェルあたり100μlの冷やした溶解バッファー（50mMのHepes pH7.2、150mMのNaCl、1mMのEGTA、10%のグリセロール、1%のTriton（登録商標）-X100、100mMのNaF、10mMのNa4P2O7、Complete（登録商標）プロテアーゼ・インヒビター）を加えた。細胞を、細胞スクレーパー（Corning、Cat. No. 3010）を使用して剥離し、そして、ウェル内容物をエッペンドルフ反応管に移した。細胞片を、13000rpm、4℃にて10分間の遠心分離によって取り除き、そして、上清の半分を、1：1（v/v）比で2×Laemmliサンプル・バッファーに加えた。IGF-IRの免疫沈降反応のために、細胞溶解物の残った上清を、清澄遠心（13000rpm、4℃にて10分間）にかけた直後に、1μlの、IGF-IRβに対するポリクローナル抗体（C-20、Santa Cruz Biotechnologies）、又はヒトIGFタイプ1受容体の細胞外ドメインの第440-586アミノ酸（α鎖）の中のエピトープを認識するマウス・モノクローナル抗体（IgG1）（mAb24-55、GroPep）を加えた。回転させたエッペンドルフ反応管中、4℃にて2時間のインキュベーションの後に、25μlのプロテインG Sepharose（登録商標）ビーズ（Amersham Biosciences、Cat. No. 17-0618-01）を加え、さらに、4℃にて1時間のインキュベーション・ステップが続いた。抗体-タンパク質複合体を結合しているビーズを、遠心分離（2000rpm、4℃にて1分間）によって分離し、そして、洗浄バッファー（0.1%しかTriton（登録商標）-X100を含まない溶解バッファー）で3回洗浄した。Laemmliサンプル・バッファー中でビーズを煮沸した後に、細胞タンパク質を、SDS-PAGEによって分離し、そして、セミドライ・ウェスタンブロッティングによってニトロセルロース膜（PROTRAN（登録商標）BA85、Schleicher & Schuell）に移した。
ホスホチロシン特異的抗体（Upstate、クローン4G10、Cat. No. 05-321）を、免疫精製したIGF-IRのリン酸化状態を測定するために使用した。リン酸化Akt/PKBの検出のために、リン酸化Ser473に対して特異性を有する抗体（Cell Signalling、Cat. No. 9271）を適用した。
抗体18が、0.6nMのIC50でIGF-1R及びPKBのIGF-1媒介型リン酸化を抑制することがわかった。
実施例9
in-vitroにおけるIGF-IRの抗体媒介型ダウンレギュレーションの誘導
腫瘍細胞におけるIGF-I受容体（IGF-IR）量に対する本発明の抗体の効果を検出するために、タイムコース実験と、その後のIGF-IR特異的抗体を用いたウエスタンブロッティング分析を実施した。
in-vitroにおけるIGF-IRの抗体媒介型ダウンレギュレーションの誘導
腫瘍細胞におけるIGF-I受容体（IGF-IR）量に対する本発明の抗体の効果を検出するために、タイムコース実験と、その後のIGF-IR特異的抗体を用いたウエスタンブロッティング分析を実施した。
2mMのL-グルタミン、1×非必須アミノ酸（Gibco、Cat. No. 11140-035）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco、Cat. No. 11360-039）、及び10%の熱不活性化FCS（PAA、Cat. No. A15-771）を補ったRPMI 1640培地（PAA、Cat. No. El5-039）中のヒト腫瘍細胞（HT29、5×104細胞/ml）。それぞれのインキュベーション期間に関して、1枚の12ウェルプレートに、各実験のための個別の培地中の細胞1mlを接種し、そして、37℃、5%のCO2にて24時間培養した。
培地を慎重に取り除き、そして、個別の培地中に希釈した異なる濃度の抗体によって置き換えた。2つのコントロールウェルでは、培地を、抗体を含まない培地、又はコントロール抗体（AB-1、癌遺伝子、Cat. No. GR11）を含む培地のいずれかによって置き換えた。細胞を、37℃、5%のCO2にてインキューベートし、そして、個々のプレートを、15分後、24時間後、及び48時間後のさらなる処理のために抜き取った。
培地を、アスピレーションによって慎重に取り除き、そして、1ウェルあたり100μlの冷やした溶解バッファー（50mMのHepes pH7.2、150mMのNaCl、1mMのEGTA、10%のグリセロール、1%のTriton（登録商標）-X100、100mMのNaF、10mMのNa4P2O7、Complete（登録商標）プロテアーゼ・インヒビター）を加えた。細胞を、細胞スクレーパー（Corning、Cat. No. 3010）を使用して剥離し、そして、ウェル内容物をエッペンドルフ反応管に移した。細胞片を、13000rpm、4℃にて10分間の遠心分離によって取り除き、そして、上清の半分を、1：1（v/v）比で2×Laemmliサンプル・バッファーに加えた。細胞タンパク質を、SDS-PAGEによって分離し、そして、セミドライ・ウェスタンブロッティングによってニトロセルロース膜（PROTRAN（登録商標）BA85、Schleicher & Schuell）に移した。
IGF-IRに特異的な抗体（C-20、Santa Cruz Biotechnologies、Cat. No. sc-713）を、IGF-IRのタンパク質レベルを測定するために使用した。
抗体の添加から24時間後以内に本発明の抗体によって引き起こされたIGF-IRのダウンレギュレーションが観察された。
実施例10
ヒト・インスリン受容体を発現する3T3細胞へのインスリン結合の阻害
本発明の抗体がインスリン受容体（IR）へのインスリンの結合を妨げるかどうか測定するために、放射活性物質で標識したリガンド・ペプチドを用いた競合実験を実施した。
組換えにより多くの（＞105）ヒトIRを発現する3T3細胞（1×105/ml）を、2mMのL-グルタミン（Gibco、Cat. No. 25030-024）及び10%の熱不活性化FCS（PAA、Cat. No. A15-771）を補った高グルコース（PAA、Cat. No. E15-009）を含むMEMダルベッコ培地（DMEM）中に蒔いた。T175形式の6本の瓶に、各実験のための個別の培地中の細胞20mlを接種し、そして、37℃、5%のCO2にて2日間培養して、コンフルエントな細胞単層を得た。
ヒト・インスリン受容体を発現する3T3細胞へのインスリン結合の阻害
本発明の抗体がインスリン受容体（IR）へのインスリンの結合を妨げるかどうか測定するために、放射活性物質で標識したリガンド・ペプチドを用いた競合実験を実施した。
組換えにより多くの（＞105）ヒトIRを発現する3T3細胞（1×105/ml）を、2mMのL-グルタミン（Gibco、Cat. No. 25030-024）及び10%の熱不活性化FCS（PAA、Cat. No. A15-771）を補った高グルコース（PAA、Cat. No. E15-009）を含むMEMダルベッコ培地（DMEM）中に蒔いた。T175形式の6本の瓶に、各実験のための個別の培地中の細胞20mlを接種し、そして、37℃、5%のCO2にて2日間培養して、コンフルエントな細胞単層を得た。
個々の細胞を回収するために、T175フラスコあたり2mlの1×トリプシン／EDTA（Gibco、Cat. No. 25300-054）を加え、そして、細胞の剥離を顕微鏡で観察した。細胞を回収し、そして、以前に記載した10%のFCSを含む培地を、50mlの全容積まで加えた。細胞を、1000rpmにて10分間遠心分離することによって再分離し、そして、50mlの結合バッファー（120mMのNaCl、5mMのKCl、1.2mMのMgSO4、1mMのEDTA、10mMのD（＋）グルコース、15mMのNaAc、100mMのHepes pH7.6、1%のBSA）中に再懸濁した。細胞を、カウントし、遠心分離によって再分離し、そして、結合バッファーで1×106細胞/mlに調整した。
0.1%のCH3COOH中に可溶化したI125-標識インスリン・ぺプチド（Amersham、Cat. No. IM166、〜2000Ci/mmol）を、結合バッファー中、4×105カウント／（分×ml）の最終活性に希釈した。25μlの前もって希釈したI125-標識インスリン・ペプチドと一緒に、75μlの抗体を、200μlの細胞懸濁液に加え（最終的な抗体濃度200nM）、そして、4℃にて3.5時間インキューベートした。細胞を、2000rpmにて5分間の遠心分離によって再分離し、そして、上清を取り出した。1mlの結合バッファーで2回洗浄した後に、細胞を、1mlの結合バッファー中に再懸濁し、そして、シンチレーション管に移した。細胞表面受容体に結合した放射性ペプチドの量を、シンチレーション・カウンターにより計測した。
結果は、本発明の抗体がインスリン・リガンドのインスリン受容体への結合を妨げないことを実証している。
結果は、本発明の抗体がインスリン・リガンドのインスリン受容体への結合を妨げないことを実証している。
実施例11
IGF-IR及びAkt/PKBリン酸化を刺激しない
本発明の抗体のIGF-IR刺激活性を排除するために、IGF-IRのリン酸化を、IGF-Iリガンドの不存在下であるが、本発明の抗体、及び基準抗体（αIR3、癌遺伝子、Germany）の存在下において測定した。これを、リン酸化状態に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティング分析によって実施した。IGF-IRをトランスフェクトした3T3細胞（ATCC CRL 1658）（5×104細胞/ml、Pietrzkowski, Z., et al., Cell Growth Differ. 4 (1992) 199-205）を、2mMのL-グルタミン（Gibco、Cat. No. 25030-024）及び0.5%の熱不活性化FCS（PAA、Cat. No. A15-771）を補った高グルコース（PAA、Cat. No. E15-009）を含むMEMダルベッコ培地（DMEM）中に蒔くか、又はヒト腫瘍細胞（HT29、NCI H322M、5×104/ml）を、2mMのL-グルタミン、1×非必須アミノ酸（Gibco、Cat. No. 11140-035）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco、Cat. No. 11360-039）、及び0.5%の熱不活性化FCS（PAA、Cat. No. A15-771）を補ったRPMI 1640培地（PAA、Cat. No. E15-039）中に蒔いた。IC50値の定量のために、12ウェル・プレートに、各実験のための個別の培地中の細胞1mlを接種し、そして、37℃、5%のCO2にて2日間培養した。
IGF-IR及びAkt/PKBリン酸化を刺激しない
本発明の抗体のIGF-IR刺激活性を排除するために、IGF-IRのリン酸化を、IGF-Iリガンドの不存在下であるが、本発明の抗体、及び基準抗体（αIR3、癌遺伝子、Germany）の存在下において測定した。これを、リン酸化状態に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティング分析によって実施した。IGF-IRをトランスフェクトした3T3細胞（ATCC CRL 1658）（5×104細胞/ml、Pietrzkowski, Z., et al., Cell Growth Differ. 4 (1992) 199-205）を、2mMのL-グルタミン（Gibco、Cat. No. 25030-024）及び0.5%の熱不活性化FCS（PAA、Cat. No. A15-771）を補った高グルコース（PAA、Cat. No. E15-009）を含むMEMダルベッコ培地（DMEM）中に蒔くか、又はヒト腫瘍細胞（HT29、NCI H322M、5×104/ml）を、2mMのL-グルタミン、1×非必須アミノ酸（Gibco、Cat. No. 11140-035）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco、Cat. No. 11360-039）、及び0.5%の熱不活性化FCS（PAA、Cat. No. A15-771）を補ったRPMI 1640培地（PAA、Cat. No. E15-039）中に蒔いた。IC50値の定量のために、12ウェル・プレートに、各実験のための個別の培地中の細胞1mlを接種し、そして、37℃、5%のCO2にて2日間培養した。
低血清培地を用いた48時間の培養後に、培地を慎重に取り除き、そして、個別の培地中に希釈した異なる濃度の抗体によって置き換えた。細胞を、先に触れた条件下で15分間インキューベートした。培地を、アスピレーションによって慎重に取り除き、そして、1ウェルあたり100μlの冷やした溶解バッファー（50mMのHepes pH7.2、150mMのNaCl、1mMのEGTA、10%のグリセロール、1%のTriton-X100、100mMのNaF、10mMのNa4P2O7、Complete（商標）プロテアーゼ・インヒビター）を加えた。細胞を、細胞スクレーパー（Corning、Cat. No. 3010）を使用して剥離し、そして、ウェル内容物をエッペンドルフ反応管に移した。細胞片を、13000rpm、4℃にて10分間の遠心分離（Eppendorf遠心分離機5415R）によって取り除き、そして、上清の半分を、1：1（v/v）比で2×Laemmliサンプル・バッファーに加えた。IGF-IRの免疫沈降反応のために、細胞溶解物の残った上清を、清澄遠心（13000rpm、4℃にて10分間）にかけた直後に、1μlの、IGF-IRに対する抗体（C-20、Santa Cruz Biotechnologies、Cat. No. sc-713又はmAb24-55、GroPep、Cat. No. MAD1）を加えた。回転させたエッペンドルフ反応管中、4℃にて2時間のインキュベーションの後に、25μlのプロテインG Sepharose（商標）ビーズ（Amersham Biosciences、Cat. No. 17-0618-01）を加え、さらに、4℃にて1時間のインキュベーション・ステップが続いた。抗体-タンパク質複合体を結合しているビーズを、遠心分離（2000rpm、4℃にて1分間）によって分離し、そして、洗浄バッファー（0.1%しかTriton-X100を含まない溶解バッファー）で3回洗浄した。Laemmliサンプル・バッファー中でビーズを煮沸した後に、細胞タンパク質を、SDS-PAGEによって分離し、そして、セミドライ・ウェスタンブロッティングによってニトロセルロース膜（PROTRAN BA85、Schleicher & Schuell、Cat. No. 10 401196）に移した。
ホスホチロシン特異的抗体（Upstate、クローン4G10、Cat. No. 05-321、チロシンリン酸化タンパク質を認識する）を、免疫精製したIGF-IRのリン酸化状態を測定するために使用した。リン酸化Akt/PKBの検出のために、リン酸化Ser473に特異性を有するAkt1に対する抗体（Cell Signalling、Cat. No. 9271）を適用した。
IGF-IRのシグナル伝達経路の中のAkt/PKBキナーゼ下流は、5nMより高い濃度にて基準抗体によって有意に活性化されたが、10,000nMまでの濃度でも本発明の抗体によって活性化されなかったことを観察した。
実施例12
H322M異種移植モデルにおける受容体ダウンレギュレーションの誘導
腫瘍を、ヌード・マウスにおいて誘発し、そして、異なる濃度の本発明の抗体で1回処置する。処置の24時間後に、腫瘍を、摘出し、そして、液体窒素下でホモジナイズした。3：1のバッファー体積対腫瘍重量比で、冷やした溶解バッファー（50mMのHepes pH7.2、150mMのNaCl、1mMのEGTA、10%のグリセロール、1%のトリトン-X100、100mMのNaF、1mMのNa3VO4、10mMのNa4P2O7、Complete（商標）プロテアーゼ・インヒビター、1mMのPMSF）を加え、融解腫瘍ホモジネートと十分に混合した。氷上において15分間、組織を可溶化した後に、不溶性断片を、13000rpm、4℃にて10分間の遠心分離（Eppendorf遠心分離機5415R）によって取り除いた。サンプルのタンパク質濃度を、Micro BCA（商標）Reagents（Pierce）を用いて測定し、そして、溶解バッファーを加えて、等しい濃度に調整した。上清の一部を、1：1（v/v）の比で2×Laemmliサンプル・バッファーに加えた。細胞タンパク質を、SDS-PAGEによって分離し、そして、セミドライ・ウェスタンブロッティングでニトロセルロース膜（PROTRAN BA85、Schleicher & Schuell、Cat. No. 10 401196）に移した。IGF-IR特異的抗体（C-20、Santa Cruz Biotechnologies、Cat. No. sc-713）を、IGF-IRを検出するために使用した。
H322M異種移植モデルにおける受容体ダウンレギュレーションの誘導
腫瘍を、ヌード・マウスにおいて誘発し、そして、異なる濃度の本発明の抗体で1回処置する。処置の24時間後に、腫瘍を、摘出し、そして、液体窒素下でホモジナイズした。3：1のバッファー体積対腫瘍重量比で、冷やした溶解バッファー（50mMのHepes pH7.2、150mMのNaCl、1mMのEGTA、10%のグリセロール、1%のトリトン-X100、100mMのNaF、1mMのNa3VO4、10mMのNa4P2O7、Complete（商標）プロテアーゼ・インヒビター、1mMのPMSF）を加え、融解腫瘍ホモジネートと十分に混合した。氷上において15分間、組織を可溶化した後に、不溶性断片を、13000rpm、4℃にて10分間の遠心分離（Eppendorf遠心分離機5415R）によって取り除いた。サンプルのタンパク質濃度を、Micro BCA（商標）Reagents（Pierce）を用いて測定し、そして、溶解バッファーを加えて、等しい濃度に調整した。上清の一部を、1：1（v/v）の比で2×Laemmliサンプル・バッファーに加えた。細胞タンパク質を、SDS-PAGEによって分離し、そして、セミドライ・ウェスタンブロッティングでニトロセルロース膜（PROTRAN BA85、Schleicher & Schuell、Cat. No. 10 401196）に移した。IGF-IR特異的抗体（C-20、Santa Cruz Biotechnologies、Cat. No. sc-713）を、IGF-IRを検出するために使用した。
本発明の抗体を用いた処置により、0.6mg/kgにてEC50と推定されるIGF-IRレベルの濃度依存的な減少が観察された。
実施例13
H322M腫瘍の増殖阻害
in-vivoにおける抗体18の効果を、確立された方法に従った無胸腺症ヌード・マウスにおける腫瘍の誘発によって調査した。ヒトH322M NSCLC細胞を、6〜7週齢の無胸腺症nuマウス（nu/nu）にマトリゲルと一緒に皮下注射した。そのために、5×106のH322M細胞を、100μl培地中に濃縮し、そして、100μlのマトリゲルと混合した。この混合物200μlを、マウスの右側腹部に注射した。腫瘍体積を、腫瘍体積［mg］=（長さ×（幅）2）であるところの、Geranら（”Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems”, Cancer Chemother. Rep. 11.301, 1972）によって最初に発表された式に従って1週間に2回ノギスで腫瘍の直径を計測することによって計算した。抗体を、10ml/kg腹腔内（i.p.）に投与した。処置を、倍の体積で投与される倍の用量の抗体から開始した。腫瘍を、先に記載したように、ヌード・マウスにおいて誘発した。腫瘍が160mgの平均体積まで増殖した後、処置の初日に1回与えられる初期量として12、1.2、及び0.12mg/kgから開始し、継続的な用量として6、0.6、及び0.06mg/kgの抗体を用いて週に1回で6回、マウスに腹腔内への処置を加えた。本実験は、単剤として6及び0.6mg/kgにて投与されたときに、rhu抗IGF-IR mAb18によるIGF-IR軸（IGF-IR axis）の遮断が、抗腫瘍効果をもたらすことを実証している。対照的に、0.06mg/kgでは、腫瘍増殖に対して効果がなかった。
H322M腫瘍の増殖阻害
in-vivoにおける抗体18の効果を、確立された方法に従った無胸腺症ヌード・マウスにおける腫瘍の誘発によって調査した。ヒトH322M NSCLC細胞を、6〜7週齢の無胸腺症nuマウス（nu/nu）にマトリゲルと一緒に皮下注射した。そのために、5×106のH322M細胞を、100μl培地中に濃縮し、そして、100μlのマトリゲルと混合した。この混合物200μlを、マウスの右側腹部に注射した。腫瘍体積を、腫瘍体積［mg］=（長さ×（幅）2）であるところの、Geranら（”Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems”, Cancer Chemother. Rep. 11.301, 1972）によって最初に発表された式に従って1週間に2回ノギスで腫瘍の直径を計測することによって計算した。抗体を、10ml/kg腹腔内（i.p.）に投与した。処置を、倍の体積で投与される倍の用量の抗体から開始した。腫瘍を、先に記載したように、ヌード・マウスにおいて誘発した。腫瘍が160mgの平均体積まで増殖した後、処置の初日に1回与えられる初期量として12、1.2、及び0.12mg/kgから開始し、継続的な用量として6、0.6、及び0.06mg/kgの抗体を用いて週に1回で6回、マウスに腹腔内への処置を加えた。本実験は、単剤として6及び0.6mg/kgにて投与されたときに、rhu抗IGF-IR mAb18によるIGF-IR軸（IGF-IR axis）の遮断が、抗腫瘍効果をもたらすことを実証している。対照的に、0.06mg/kgでは、腫瘍増殖に対して効果がなかった。
加えて、抗体18を、同じモデルにおいてゲムシタビンと組み合わせて試験した。腫瘍を先に記載したように誘発し、そして、腫瘍が定着し、全群で平均170mm3まで増殖したときに処置を開始した。抗体を、6及び0.6mg/kgにて、そして、62mg/kgのゲムシタビンと組み合わせて0.6mgにてi.p.に週に1回投与した。ゲムシタビンを1サイクル、すなわち、合計4回の間、3日おきに投与した。処置を、倍の用量の抗体を投与することによって開始した。本実験は、7日に1回投与される抗体18が、それ自体によって腫瘍増殖を阻害し、且つ、代謝拮抗化合物として知られているゲムシタビンの有効性を高めることを実証した。
実施例14
3T3腫瘍の増殖阻害
ヒトIGF-IRを過剰発現するマウス3T3線維芽細胞を使用したことを除いて、基本的に実施例15に記載のように、腫瘍をヌード・マウスにおいて誘発した。約180mgの定着した腫瘍をもつマウスに、18、6、又は0.6mg/kgの抗体18を用いて、毎週1回で7回、腹腔内への処置を加えた。処置を、初期量として与えられる倍の用量の抗体を用いて開始した（36、12、及び1.2mg/kg）。本実験は、抗体での処置によって、毎週1回、18及び6mg/kgにて投与されたときに、腫瘍増殖を遅延できることを実証している。
3T3腫瘍の増殖阻害
ヒトIGF-IRを過剰発現するマウス3T3線維芽細胞を使用したことを除いて、基本的に実施例15に記載のように、腫瘍をヌード・マウスにおいて誘発した。約180mgの定着した腫瘍をもつマウスに、18、6、又は0.6mg/kgの抗体18を用いて、毎週1回で7回、腹腔内への処置を加えた。処置を、初期量として与えられる倍の用量の抗体を用いて開始した（36、12、及び1.2mg/kg）。本実験は、抗体での処置によって、毎週1回、18及び6mg/kgにて投与されたときに、腫瘍増殖を遅延できることを実証している。
実施例15
in-vitroにおけるIGF-1Rの抗体媒介型ダウンレギュレーションの誘導
腫瘍細胞におけるIGF-I受容体（IGF-IR）量に対する本発明の抗体の効果を検出するために、タイムコース実験と、その後のIGF-IR特異的抗体を用いたウエスタンブロッティング分析を実施した。
in-vitroにおけるIGF-1Rの抗体媒介型ダウンレギュレーションの誘導
腫瘍細胞におけるIGF-I受容体（IGF-IR）量に対する本発明の抗体の効果を検出するために、タイムコース実験と、その後のIGF-IR特異的抗体を用いたウエスタンブロッティング分析を実施した。
2mMのL-グルタミン、1×非必須アミノ酸（Gibco、Cat. No. 11140-035）、1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco、Cat. No. 11360-039）、及び10%の熱不活性化FCS（PAA、Cat. No. A15-771）を補ったRPMI 1640培地（PAA、Cat. No. El5-039）中のヒト腫瘍細胞（HT29、5×104細胞/ml）。それぞれのインキュベーション期間に関して、1枚の12ウェルプレートに、各実験のための個別の培地中の細胞1mlを接種し、そして、37℃、5%のCO2にて24時間培養した。
培地を慎重に取り除き、そして、個別の培地中に希釈した異なる濃度の抗体によって置き換えた。2つのコントロールウェルでは、培地を、抗体を含まない培地、又はコントロール抗体（AB-1、癌遺伝子、Cat. No. GR11）を含む培地のいずれかによって置き換えた。細胞を、37℃、5%のCO2にてインキューベートし、そして、個々のプレートを、15分後、24時間後、及び48時間後のさらなる処理のために抜き取った。
培地を、アスピレーションによって慎重に取り除き、そして、1ウェルあたり100μlの冷やした溶解バッファー（50mMのHepes pH7.2、150mMのNaCl、1mMのEGTA、10%のグリセロール、1%のTriton（登録商標）-X100、100mMのNaF、10mMのNa4P2O7、Complete（登録商標）プロテアーゼ・インヒビター）を加えた。細胞を、細胞スクレーパー（Corning、Cat. No. 3010）を使用して剥離し、そして、ウェル内容物をエッペンドルフ反応管に移した。細胞片を、13000rpm、4℃にて10分間の遠心分離によって取り除き、そして、上清の半分を、1：1（v/v）比で2×Laemmliサンプル・バッファーに加えた。細胞タンパク質を、SDS-PAGEによって分離し、そして、セミドライ・ウェスタンブロッティングによってニトロセルロース膜（PROTRAN（登録商標）BA85、Schleicher & Schuell）に移した。
培地を、アスピレーションによって慎重に取り除き、そして、1ウェルあたり100μlの冷やした溶解バッファー（50mMのHepes pH7.2、150mMのNaCl、1mMのEGTA、10%のグリセロール、1%のTriton（登録商標）-X100、100mMのNaF、10mMのNa4P2O7、Complete（登録商標）プロテアーゼ・インヒビター）を加えた。細胞を、細胞スクレーパー（Corning、Cat. No. 3010）を使用して剥離し、そして、ウェル内容物をエッペンドルフ反応管に移した。細胞片を、13000rpm、4℃にて10分間の遠心分離によって取り除き、そして、上清の半分を、1：1（v/v）比で2×Laemmliサンプル・バッファーに加えた。細胞タンパク質を、SDS-PAGEによって分離し、そして、セミドライ・ウェスタンブロッティングによってニトロセルロース膜（PROTRAN（登録商標）BA85、Schleicher & Schuell）に移した。
IGF-IRに特異的な抗体（C-20、Santa Cruz Biotechnologies、Cat. No. sc-713）を、IGF-IRのタンパク質レベルを測定するために使用した。
抗体の添加24時間後に、本発明の抗体によって誘導された50%以上のIGF-IRのダウンレギュレーションが観察された。
Claims (2)
- 登録番号DSM ACC2795にて寄託されたCHO細胞から産生される、インスリン様増殖因子I受容体に対して結合し、ヒトIgG1又はIgG3型であり、且つAsn297にある糖鎖でグリコシル化されている抗体であって、前記糖鎖内のフコースの量が少なくとも９９％であること、そして更にＮ−グリコリルノイラミン酸の量が１％以下であり、そして／あるいはＮ末端α−１，３−ガラクトースの量が１％以下であること、を特徴とする抗体。
- 登録番号DSM ACC2795にて寄託されたＣＨＯ細胞。
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|---|---|---|---|---|
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| AR120719A1 (es) * | 2019-12-10 | 2022-03-09 | Horizon Therapeutics Ireland Designated Activity Company | Anticuerpos glicosilados contra el receptor del factor de crecimiento i similar a la insulina y sus usos |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000061739A1 (en) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for controlling the activity of immunologically functional molecule |
| WO2005014651A1 (ja) * | 2003-08-11 | 2005-02-17 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 糖鎖改変抗hm1.24抗体 |
| WO2005034994A1 (ja) * | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 固形腫瘍治療剤 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4675187A (en) | 1983-05-16 | 1987-06-23 | Bristol-Myers Company | BBM-1675, a new antibiotic complex |
| US5204244A (en) * | 1987-10-27 | 1993-04-20 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
| US5202238A (en) * | 1987-10-27 | 1993-04-13 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
| US5770429A (en) * | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| GB9022543D0 (en) * | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Antibody production |
| US5610297A (en) * | 1991-12-27 | 1997-03-11 | Georgia Tech Research Corp. | Peptides ketoamides |
| DK0669836T3 (da) | 1992-11-13 | 1996-10-14 | Idec Pharma Corp | Terapeutisk anvendelse af kimære og radioaktivt mærkede antistoffer og humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantigen til behandling af B-cellelymfom |
| US20030165502A1 (en) * | 2000-06-13 | 2003-09-04 | City Of Hope | Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth |
| US7241444B2 (en) * | 2002-01-18 | 2007-07-10 | Pierre Fabre Medicament | Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof |
| US7553485B2 (en) * | 2002-01-18 | 2009-06-30 | Pierre Fabre Medicament | Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof |
| US7217796B2 (en) * | 2002-05-24 | 2007-05-15 | Schering Corporation | Neutralizing human anti-IGFR antibody |
| ES2383014T3 (es) * | 2003-04-02 | 2012-06-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Anticuerpos contra el factor I de crecimiento similar a insulina y usos de los mismos |
| AR046071A1 (es) * | 2003-07-10 | 2005-11-23 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000061739A1 (en) * | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for controlling the activity of immunologically functional molecule |
| WO2005014651A1 (ja) * | 2003-08-11 | 2005-02-17 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 糖鎖改変抗hm1.24抗体 |
| WO2005034994A1 (ja) * | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 固形腫瘍治療剤 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012254996A (ja) * | 2006-04-11 | 2012-12-27 | F Hoffmann La Roche Ag | グリコシル化抗体 |
Also Published As
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| EP1959014B1 (en) | Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof | |
| US20120076778A1 (en) | Antibodies Against Insulin-Like Growth Factor I Receptor and Uses Thereof | |
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