TW201305336A

TW201305336A - 具作用功能的抗ｃｘｃｒ４抗體及其供治療癌症之用途

Info

Publication number: TW201305336A
Application number: TW101121894A
Authority: TW
Inventors: Christine Klinguer-Hamour
Original assignee: Pf Medicament
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2012-06-19
Publication date: 2013-02-01

Abstract

本申請案係有關於一種藉由投與一能夠誘發作用功能之抗CXCR4單株抗體來治療癌症的方法。

Description

具作用功能的抗CXCR4抗體及其供治療癌症之用途

發明領域

發明背景

化學激素(chemokines)是被分泌的小胜肽，其等控制著白血球沿著一已知為化學激素梯度之配位子化學梯度的移動，尤其是在免疫反應期間(Zlotnick A.et al.,2000)。所述化學激素係基於其等之NH₂端半胱胺酸殘基的位置而被分成CC及CXC兩個主要次家族，並且結合至G蛋白質耦合受體；而所述G蛋白質耦合受體之兩個主要次家族係被定名為CCR及CXCR。迄今，有多於50種人類化學激素以及18種化學激素受體已被發覺。

許多癌症具有一複雜的化學激素網絡來影響腫瘤的免疫細胞浸潤以及腫瘤細胞生長、存活、移動和血管生成。免疫細胞、內皮細胞及腫瘤細胞本身係表現化學激素受體並可對化學激素梯度反應。人類癌症生物檢體樣本與小鼠癌症模型的研究顯示出癌症細胞化學激素受體表現係與增加的轉移能力相關。來自不同癌症類型的惡性細胞具有不同的化學激素受體表現態勢(profiles)，但化學激素受體4(CXCR4)是最常見的。來自至少23種不同類型之上皮、間質(mesenchymal)以及生血(haematopoietic)起源之人類癌症的細胞係表現CXCR4受體(Balkwill F.et al.,2004)。

化學激素受體4[亦已知為融合素(fusin)、CD184、LESTR或HUMSTR]存在有如包含352或360個胺基酸的兩種同型異構物(isoforms)。在該受體的細胞外部分上，殘基Asn11係被醣化、殘基Tyr21係藉由添加一硫酸基團來修飾、以及Cys 109與186係以一雙硫鍵(disulfide bridge)鍵結(Juarez J.et al.,2004)。

此受體係被不同種類的正常組織、初始(naïve)非記憶型T細胞、調節型T細胞、B細胞、嗜中性球、內皮細胞、初級單核球、樹狀細胞(dendritic cells)、自然殺手(NK)細胞、CD34+造血幹細胞表現，且在心臟、結腸、肝臟、腎臟以及腦中呈一低位準。CXCR4在白血球運輸(leukocytes trafficking)、B細胞淋巴器形成(B cell lymphopoiesis)以及骨髓形成(myelopoiesis)中扮演一關鍵角色。

CXCR4受體係被過度表現於大量癌症中，包括但不限於淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、結腸癌(Ottaiano A.et al.,2004)、乳房癌(Kato M.et al.,2003)、前列腺癌(Sun Y.X.et al.,2003)、肺癌[小細胞以及非小細胞惡性瘤(Phillips R.J.et al.,2003)]、卵巢癌(Scotton C.J.et al.,2002)、胰臟癌(Koshiba T.et al.,2000)、腎臟癌、腦癌(Barbero S et al.,2002)、神經膠母細胞瘤(glioblastoma)以及淋巴瘤。

迄今所描述之CXCR4受體的獨特配位子是基質細胞衍生因子-1(SDF-1)或CXCL12。SDF-1係大量地分泌於淋巴結、骨髓、肝臟、肺中且被腎臟、腦與皮膚分泌至一較少程度。CXCR4亦被一拮抗性化學激素，人類疱疹病毒第III型所編碼的病毒巨噬細胞炎性蛋白II(vMIP-II)，所辨識。

CXCR4/SDF-1軸在癌症中扮演一關鍵角色且係直接地牽連於移動、侵入導致轉移。確實，癌症細胞表現CXCR4受體，其等移動並且進入全身循環(systemic circulation)。接著，癌症細胞係被滯留(arrested)於產出高位準SDF-1之器官中的血管床(vascular beds)中，該等癌症細胞係在該處增殖、誘發血管生成以及形成轉移腫瘤(Murphy PM.,2001)。該軸亦涉及於經由活化細胞外信號調節激酶(ERK)途徑的細胞增殖(Barbero S.et al.,2003)以及涉及於血管生成(Romagnani P.,2004)。確實，CXCR4受體以及其配位子SDF-1係藉由刺激VEGF-A表現，繼而增加CXCR4/SDF-1的表現，而清楚地促進血管生成(Bachelder R.E.et al.,2002)。亦已知的是：腫瘤相關的巨噬細胞(tumor associated macrophages,TAM)係累積在腫瘤的缺氧性區域且被刺激以與腫瘤細胞共運作(co-operate)及促進血管生成。已觀察到的是：缺氧係在包括TAM之各種細胞類型中選擇性地向上調節CXCR4的表現(Mantovani A.et al.,2004)。近來已被證明的是：CXCR4/SDF-1軸調節CXCR4+造血幹/前驅細胞(hematopoietic stem/progenitor cells,HSC)的運輸/回歸(homing)，並且可在新血管形成(neovascularization)中扮演一角色。證據指出除了HSC，功能性CXCR4亦被表現於來自其他組織的幹細胞[組織定向幹細胞(tissue-committed stem cells)=TCSCs]上，所以SDF-1可在化學吸引就器官/ 組織再生所需的CXCR4+TCSCs上扮演一中樞角色，但是此等TCSC亦可以是癌症發展的一細胞起源[癌症幹細胞學說(cancer stem cells theory)]。癌症之幹細胞起源係已就人類白血病以及近來數種諸如腦瘤及乳房瘤的固態腫瘤(solid tumors)來證明。可能衍生自正常CXCR4+組織/器官專一性幹細胞的CXCR4+腫瘤有數種實例，諸如白血病、腦瘤、小細胞肺癌、乳房癌、肝母細胞瘤(hepatoblastoma)、卵巢癌及子宮頸癌(Kucia M.et al.,2005)。

藉由干擾CXCR4受體來標靶癌症轉移係使用一針對CXCR4受體的單株抗體於活體內證明(Muller A.et al.,2001)。簡言之，所顯示的是：在SCID小鼠中，一針對CXCR4受體的單株抗體(Mab 173 R&D Systems)顯著地減少在一原位(orthotopic)乳房癌模型(MDA-MB231)中淋巴結轉移的數目。另一個研究(Phillips R.J et al.,2003)亦使用對抗SDF-1的多株抗體而顯示出SDF-1/CXCR4軸在一原位肺惡性瘤模型(A549)之轉移上的關鍵角色，但在此研究中，既未有效用於腫瘤生長上，也未有效用於血管生成上。數個其他研究亦描述使用CXCR4之siRNAs雙鏈體(siRNAs duplexes；Liang Z.et al.,2005)生物穩定性CXCR4胜肽拮抗物(Tamamura H.et al.,2003)的活體內轉移抑制，或者使用CXCR4的小分子拮抗物[像是AMD 3100(Rubin J.B.et al.,2003；De Falco V.et al.,2007)或Mab(專利WO2004/059285A2)]的活體內腫瘤生長抑制。因此，就癌症而言，CXCR4是一有效治療標靶。

能夠與CXCR4直接交互作用，因而能夠抑制CXCR4之活化的鼠類單株抗體亦已被描述。此一抑制可藉由干擾下列而發生：i)配位子SDF-1至受體CXCR4之在細胞膜處的專一性結合；ii)GTPγS至受體CXCR4之在細胞膜處的專一性結合；iii)CXCR4媒介之cAMP生產調控；及iv)CXCR4受體媒介之細胞內鈣貯存(stores)調控的活動作用(見WO 2010/037831)。

然而，此等抗體或siRNA無一者導致殺死表現CXCR4的癌性細胞。是以，萬一CXCR4標靶治療被停止，仍有癌症重新開始的風險。因此，對於直接標靶表現CXCR4之細胞且能夠殺死該等表現CXCR4之細胞的藥劑是有需求的。

發明概要

本發明係有關於一種對於標靶CXCR4之抗體從未被識別的新穎性質。

確實，發明人已發現到針對CXCR4之人類或擬人化抗體係能夠誘發作用功能來對抗表現CXCR4之細胞，因此導致細胞毒性作用來對抗該等細胞。

更特別地，本發明係有關於一種用於誘發作用功能來對抗表現CXCR4之癌症細胞的方法。

如描述於習知技藝中者，表現CXCR4之轉移型腫瘤的治療涉及去抑制移動、侵入、增殖或血管生成，但不直接殺死表現CXCR4之細胞。呈鮮明對比地，本發明係有關於導致表現CXCR4之標靶細胞死亡之細胞毒性作用的誘發。特別地，本發明係提供一種人類或擬人化單株抗體，其能夠誘發一或更多作用功能來對抗表現CXCR4之癌症細胞，因此達到殺死該細胞。因此，本發明係提供一種透過藉一人類或擬人化單株抗體誘發一或更多作用功能以對抗表現CXCR4之癌症細胞來治療癌症的方法。

在一第一方面，本發明係有關於一種以結合至CXCR4之人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段來殺死表現CXCR4之癌症細胞的方法；該人類或擬人化抗體包含一重鏈可變域及一輕鏈可變域，該重鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號1、2和3之序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，而該輕鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號4、5和6之序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；其中該方法包含之步驟為：在作用细胞或補體組分之存在下，誘發該人類或擬人化抗體之至少一作用功能。

在另一方面，本發明係有關於一結合至CXCR4之人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段的用途；其中該人類或擬人化抗體包含一重鏈可變域及一輕鏈可變域，該重鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號1、2和3之序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，而該輕鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號4、5和6之序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；該用途為用於製備一組成物以供藉由在作用细胞或補體組分之存在下誘發至少一作用功能來殺死表現CXCR4之癌症細胞。

在又另一方面，本發明亦有關於一種結合至CXCR4之人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段；該人類或擬人化抗體包含一重鏈可變域及一輕鏈可變域，該重鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號1、2和3之序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，而該輕鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號4、5和6之序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；供用於藉由在作用细胞或補體組分之存在下誘發至少一作用功能來殺死表現CXCR4之癌症細胞。

更明確地，本發明係有關於一種藉由以結合至CXCR4之人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段來殺死表現CXCR4之癌症細胞以治療癌症的方法；該人類或擬人化抗體包含一重鏈可變域及一輕鏈可變域，該重鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號1、2和3之序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，而該輕鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號4、5和6之序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；其中該方法包含之步驟為：在作用细胞或補體組分之存在下，誘發該人類或擬人化抗體的至少一作用功能。

在另一方面，本發明係有關於結合至CXCR4之人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段的用途；其中該人類或擬人化抗體包含一重鏈可變域及一輕鏈可變域，該重鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號1、2和3之序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，而該輕鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號4、5和6之序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；該用途為用於製備一組成物以供藉由在作用细胞或補體組分之存在下誘發至少一作用功能來殺死表現CXCR4之癌症細胞以治療癌症。

在又另一方面，本發明亦有關於一種結合至CXCR4之人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段；該人類或擬人化抗體包含一重鏈可變域及一輕鏈可變域，該重鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號1、2和3之序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，而該輕鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號4、5和6之序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；供用於藉由在作用细胞或補體組分之存在下誘發至少一作用功能來殺死表現CXCR4之癌症細胞以治療癌症。

術語“抗體”係以最廣意義使用於此中且具體涵蓋諸如IgG、IgM、IgA、IgD、及IgE之任何同型的單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多重專一性抗體、嵌合抗體、及抗體片段。與一特定抗原反應的抗體可藉由重組方法產生，諸如選擇噬菌體或類似載體中之重組抗體庫；或者藉由以該抗原或一抗原編碼核酸來使動物免疫。

一“多株抗體”是在一或更多其他非等同抗體之中或存在下產出的一種抗體。一般而言，多株抗體是在產出非等同抗體之數種其他B淋巴球的存在下由一B淋巴球產出。通常，多株抗體是直接獲得自一被免疫的動物。

一“單株抗體”，當使用於此中，是獲得自具實質均質抗體之一群體的抗體；即，形成該群體的抗體，除了可能自然發生之可能微量存在的突變以外，基本上是等同的。換言之，一單株抗體是由單一細胞株(例如一融合瘤、一轉染有編碼均質抗體之DNA分子的真核宿主細胞、一轉染有編碼均質抗體之DNA分子的原核宿主細胞等等)之生長所引發的均質抗體構成。此等抗體係針對一單一抗原表位而是以係高度專一性的。

一“抗原表位”是抗原上被一抗體結合的位址。其可由相連殘基或由藉一抗原性蛋白質之摺疊而被帶至緊密鄰近的非相連殘基形成。由相連胺基酸形成之抗原表位在暴露於變性溶劑時典型地會被保留，而由非相連胺基酸形成之抗原表位卻在該暴露下典型地會被喪失。

較佳地，本發明之抗體是一單株抗體。

一典型抗體係包含藉由雙硫鍵接連的兩個等同重鏈及兩個等同輕鏈。各重鏈及輕鏈含有一恆定區及一可變區。各可變區含有首要負責結合抗原之抗原表位的三個稱為“互補決定區”(“CDRs”)或“高度可變區”的區段。其等通常被指稱為相繼從N端編號的CDR1、CDR2及CDR3(見Lefranc M.-P.,Immunology Today 18,509(1997)/Lefranc M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.and Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))。該等可變區之更高度守恆的部分係被稱為“架構區”。

當使用於此中，“VH”或“VH”指的是一抗體之免疫球蛋白重鏈[包括一Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’、或F(ab’)2片段之重鏈]的可變區。提及之“VL”或“VL”指的是一抗體之免疫球蛋白輕鏈[包括一Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’、或F(ab’)2片段之輕鏈]的可變區。

抗體恆定域並未直接涉及於將一抗體結合至一抗原，但展現出各種作用功能。對應於不同免疫球蛋白類別之重鏈恆定區係分別稱為α、δ、ε、γ、及μ。視其等之重鏈恆定區的胺基酸序列而定，抗體或免疫球蛋白可被分派至不同類別，即IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，且其等中之數種可進一步被區分至次類別(同型)，如IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4；IgA1及IgA2(見W.E.Paul,ed.,1993,Fundamental Immunology,Raven Press,New York,New York)。

抗體被木瓜酵素消化可產出兩個稱為Fab片段的等同抗原結合片段，各者具有一單一抗原結合位址及一殘餘"Fc"片段。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc域的邊界可能會變化，但人類IgG重鏈Fc域通常是被界定成自，依據EU指標，樞紐區中之Cys226或Pro230位置處的胺基酸殘基展延至其含有該重鏈之CH2與CH3域的羧基端(Edelman et al.,The covalent structure of an entire gammaG immunoglobulin molecule,PNAS 1969；63：78-85)。為清楚起見，在此應陳述的是：依據EU指標之Cys226/Pro230殘基係對應於卡巴(Kabat)編號系統中之Cys239/Pro243殘基，且對應於依據IMGT之樞紐殘基Cys11/Pro15。

術語"樞紐區"一般係被界定為自人類IgG1之Glu216展延至Pro230(Burton,Mol Immunol,22：161-206,1985)。其他IgG同型之樞紐區可與IgG1序列排比，其係藉由將形成重鏈間S-S鍵的第一及最後的半胱胺酸殘基置於相同位置。人類IgG Fc部分之"CH2域"(亦指稱為"Cγ2"域)通常是自約胺基酸231延伸至約胺基酸340。該CH2域之獨特在於其並非緊密地與另一域配對。反而，兩個N-連接分支醣鏈係介入於一完整天然IgG分子的兩個CH2域之間。已推測的是：該醣可就域-域配對提供取代且幫助穩定該CH2域(Burton,MoI Immunol,22：161-206,1985)。所述"CH3域"包含Fc部分中C端至CH2域的展延殘基(即，自一IgG之約胺基酸殘基341至約胺基酸殘基447)。

IgG免疫球蛋白，包括單株抗體，已顯示在各重鏈的恆定區中被N-醣化。其等在其兩個重鏈各者上之CH2域中的Asn 297處含有一單一N-連接聚醣。當使用於此中，術語"N-聚醣"指的是一N-連接寡糖，如藉一天門冬醯胺酸-N-乙醯葡萄糖胺連接附接至一多胜肽之天門冬醯胺酸殘基者。N-聚醣具有一常見的Man₃GlcNAc₂五糖核心("Man"指的是甘露糖；"Glc"指的是葡萄糖；及"NAc"指的是N-乙醯基；GlcNAc指的是N-乙醯葡萄糖胺)。

N-聚醣對於分支(天線)，包含被附接至Man3核心結構的週邊糖類(如，GlcNAc、半乳糖、海藻糖、及唾液酸)，的數目與本質是不同的。N-聚醣係依據其等之分支構成來分類(如，高甘露糖型、複合型或雜合型)。一"複合、雙天線(bi-antennary)"類型N-聚醣典型地具有至少一GlcNAc附接至三甘露糖核心之1,3甘露糖分支以及至少一GlcNAc附接至三甘露糖核心之1,6甘露糖分支。複合、雙天線N-聚醣亦可具有鏈內取代，包含"等分(bisecting)"GlcNAc及核心海藻糖("Fuc")。一"等分GlcNAc"係為一附接至成熟核心醣結構之β-1,4-甘露糖的GlcNAc殘基。

複合、雙天線N-聚醣亦可具有可選地以唾液酸修飾的半乳糖("Gal")殘基。將唾液酸添加至寡糖鏈是藉由唾液酸轉移酶催化，但需要先將一或更多半乳糖殘基藉由半乳糖轉移酶附接至末端N-乙醯葡萄糖胺。依據本發明之“唾液酸”含括5-N-乙醯神經胺酸(NeuNAc)及5-羥乙醯神經胺酸(NeuNGc)兩者。

寡糖可含有零個(G0)、一個(G1)或兩個(G2)半乳糖殘基和一個附接或未附接至第一GlcNac的海藻糖。此等形式分別被註明為G0/G0F、G2/G2F、G1/G1F(見Theillaud,Expert Opin Biol Ther.,Suppl 1：S15-S27,2005之第1圖)。換言之，當寡糖鏈的兩臂包含半乳糖殘基時，每莫耳重鏈的最大莫耳半乳糖係為二，且該結構係在核心被海藻糖基化(fucosylated)時被指稱為G2F，而在核心未被海藻糖基化時被指稱為G2。當一臂具有末端半乳糖時，該結構係被指稱為G1F或G1，視其是否被海藻糖基化而定；而當沒有末端半乳糖時，該結構係分別被指稱為G0F或G0。

一被分泌的IgG免疫球蛋白因此是一種展現出糖類殘基海藻糖、半乳糖、唾液酸、及等分N-乙醯葡萄糖胺可變添加之糖型的異質混合物。

Fc域是決定免疫球蛋白生物功能的中樞，而此等生物功能係稱作“作用功能”。此等由Fc域媒介之活性是經由諸如殺手細胞、自然殺手細胞、和活化巨噬細胞之免疫作用细胞、或者各種補體組分來媒介。此等作用功能涉及該等作用细胞之表面上受體的活化，其是透過將抗體之Fc域結合至該等受體或結合至補體組分。

"抗體依賴型細胞媒介之細胞毒性"、“抗體依賴型細胞性細胞毒性”或"ADCC"之表達指的是一種細胞毒性形式，其中結合至存在於某些細胞毒性作用細胞上之Fc受體(FcRs)上的Ig係使得此等細胞毒性作用細胞能夠專一性地結合至一含抗原之標靶細胞，而隨後以細胞毒素殺死該標靶細胞。標靶細胞之溶解(lysis)是細胞外的、需要細胞與細胞的直接接觸、且不涉及補體。

細胞破壞可藉由，例如，溶解或吞噬作用而發生。"細胞毒性作用細胞"係為表現一或更多FcRs並執行作用功能的白血球。較佳地，該等細胞至少表現FcγRIII並執行ADCC作用功能。介導ADCC之人類白血球的實例包括周邊血液單核細胞(PBMC)、自然殺手(NK)細胞、單核球、細胞毒性T細胞及嗜中性球，以PBMCs及NK細胞為較佳。該等作用细胞可分離自其天然來源，如分離自血液或PBMCs。能夠藉細胞溶解手段來破壞細胞的細胞毒性作用細胞包括，例如，自然殺手(NK)細胞、嗜酸性球、巨噬細胞及嗜中性球。

在各種人類免疫球蛋白類別中，人類IgG1和IgG3比 IgG2和IgG4更有效地介導ADCC。

有利地，本發明之人類或擬人化抗體、或其含有CH2之片段係能夠藉由誘發抗體依賴型細胞之細胞毒性(ADCC)來殺死表現CXCR4之癌症細胞。

是以，在本發明方法之一第一較佳實施態樣中，該作用功能係由抗體依賴型細胞之細胞毒性(ADCC)構成。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該作用功能係由抗體依賴型細胞之細胞毒性(ADCC)構成。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於該作用功能係由抗體依賴型細胞之細胞毒性(ADCC)構成。

作為非限制性實例，用以活體外評估或量化ADCC的下列方法可被提及：細胞計數法，其使用碘化丙啶(propidium iodide,PI)或鈣黃綠素(calcein)、⁵¹Cr或螢光染料，諸如鈣黃綠素-AM、羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)、2’,7’-雙-(2羧乙基)-5-(及-6)-羧基螢光素(BCECF)或銪，或者藉由測量諸如乳酸去氫酶(LDH)之細胞溶質酵素或ATP的釋放。此等方法係此技藝中具有技能者所熟知[見，如，Jiang et al.,“Advances in the assessment and control of the effector functions of therapeutic antibodies”,Nat Rev Drug Discov.,10：101-110,2011、及其中之參考文獻]而無需進一步詳述於此。

就“補體依賴型細胞毒性”或"CDC"來說，其於此中係指稱使專一性抗體結合至細胞表面上之一抗原所觸發的補體活化透過含有血液中補體相關蛋白質群組之一連串級聯 (cascades)(補體活化途徑)致使標靶細胞溶解的一機制。此外，補體活化所產生的蛋白質片段可誘發免疫細胞的移動和活化。補體依賴型細胞毒性(CDC)活化的第一步驟在於C1q蛋白質之結合至抗體的至少兩個Fc域。"C1q"係為包括一免疫球蛋白Fc區結合位址的一多胜肽。C1q與兩絲胺酸蛋白酶，C1r和C1s，一起形成複合C1，該複合C1是補體依賴型細胞毒性(CDC)途徑的第一組分。

在本發明之另一有利實施態樣中，所述人類或擬人化抗體、或其含有CH2之片段係能夠藉由誘發補體依賴型細胞毒性(CDC)來殺死表現CXCR4之癌症細胞。

是以，本發明亦有關於一種如上述之方法，其中所述作用功能係由補體依賴型細胞毒性(CDC)構成。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該作用功能係由補體依賴型細胞毒性(CDC)構成。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於該作用功能係由補體依賴型細胞毒性(CDC)構成。

CDC對有核細胞之細胞毒性可藉由數種方法於活體外量化，諸如：台盼藍排除(Trypan blue exclusion)、使用碘化丙啶(PI)之流式細胞計數法、⁵¹Cr之釋放、四唑鎓鹽MTT之還原、氧化還原染料阿拉莫爾藍(redox dye Alamar blue)、細胞內ATP之損耗、CellTiter-Glo、LDH釋放或鈣黃綠素-AM釋放。此等方法係為此技藝中具有技能者所熟知[見，如，Jiang et al.,“Advances in the assessment and control of the effector functions od therapeutic antibodies”,Nat Rev Drug Discov.,10：101-110,2011、及其中之參考文獻]而無需進一步詳述於此。

在本發明之另外的有利實施態樣中，抗體依賴型細胞之細胞毒性(ADCC)及補體依賴型細胞毒性(CDC)兩者係被誘發，即該人類或擬人化抗體、或其含有CH2之片段係能夠藉由誘發抗體依賴型細胞之細胞毒性(ADCC)及補體依賴型細胞毒性(CDC)兩者來殺死表現CXCR4之癌症細胞。

在一較佳實施態樣中，本發明方法之作用功能係由抗體依賴型細胞之細胞毒性(ADCC)及補體依賴型細胞毒性(CDC)構成。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該等作用功能係由抗體依賴型細胞之細胞毒性(ADCC)及補體依賴型細胞毒性(CDC)構成。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於該等作用功能係由抗體依賴型細胞之細胞毒性(ADCC)及抗體依賴型細胞之細胞毒性(ADCC)構成。

一抗體之此兩種作用功能係直接相關於該抗體Fc部分之結合至免疫細胞表面上的特定受體-基本上就ADCC為NK細胞、巨噬細胞、單核球上表現的FcγRIIIa(亦被指稱為FcγRIIIA)及FcγRIIa(亦被指稱為FcγRIIA)，而就CDC為補體級聯蛋白質C1q。

一抗體Fc部分與FcγRs和C1q之間的精確交互作用已被精確地映射(mapped)，且此交互作用中所涉及之主要Fc域係對應於CH2域。該Fc部分與該等Fc受體之間的親和性係直接關連至所觸發之免疫反應的程度。

如上述，針對CXCR4之人類或擬人化抗體係能夠誘發作用功能對抗表現CXCR4之細胞，因此導致對抗該等細胞之細胞毒性作用。清楚的是：作用功能誘發地越高，對抗表現CXCR4之細胞的細胞毒性作用也越大。雖然一些抗體可自然地展現升高的ADCC及/或CDC活性，但在其他事例中可能必須就針對CXCR4之人類或擬人化抗體進行工程操作，以為了增強該抗體免疫反應及，更特別地，ADCC及/或CDC。此等經工程操作之抗體亦被本發明範疇所含括。

有數種方式來進行工程操作以及增強抗體免疫反應和，更特別地，ADCC及/或CDC；其等之多數就ADCC是基於直接增加Fc部分至同族(cognate)FcγR的結合。主要目標是要增加至人類FcγRa和人類FcγRIIa的結合，並減少至人類FcγRIIb(一種減少免疫反應之抑制性受體)的結合。此可被達到，不是藉由突變Fc部分內的個別胺基酸殘基，就是藉由修飾連接至CH2域之天門冬醯胺酸297的聚醣部分以增加非典型海藻糖基化(afucosylated)聚醣部分。醣工程操作可被達到，例如，不是藉由關閉(siRNA、KO等等；Toyohide Shinkawa et al.,The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity.J.Biol.Chem 2003；278：3466-3473)產出抗體之宿主細胞中的FUT8基因，就是過度表現產出抗體之細胞中的GlcNAc III轉移酶 (見，如，Pablo Umana et al.Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgG1 with optimized antibody-dependent cellular cytotoxicity activity.Nat Biotechnol 1999；17：176-180)。

此等抗體之獲得可藉由在抗體之恆定域中做出單一或多重取代，因此增加其與Fc受體的交互作用。用以設計此等突變體的方法可見於，例如，Lazar et al.(2006,PNAS,103(11)：4005-4010)及Okazaki et al.(2004,J.MoI.Biol.336(5)：1239-49)。

亦可能使用被特定工程操作以供生產改良抗體的細胞株。特別地，此等細胞株具有已被改變的醣化途徑調節，造成很少被海藻糖基化或甚至完全去海藻糖基化的抗體。此等細胞株及用以工程操作其等之方法係揭露於，如，Shinkawa et al.(2003,J.Biol.Chem.278(5)：3466-3473)、Ferrara et al.(Biotechnol.Bioeng.93(5)：851-61)。

增加ADCC的其他方法亦已被下列描述：Li et al.(2006,Nat Biotechnol.24(2)：210-5)、Stavenhagen et al.(2008,Advan.Enzyme Regul.48：152-164)、Shields et al.(2001,J.Biol.Chem.,276(9)：6591-6604)、及WO 2008/006554。

增加CDC的方法已被下列描述：Idusogie et al.(2001,J Immunol.166(4)：2571-5)、Dall'Acqua et al.(2006,J Immunol,177(2)：1129-38)、Michaelsen et al.(1990,Scand J Immunol,32(5)：517-28)、Brekke et al.(1993,Mol Immunol,30(16)：1419-25)、Tan et al.(1990,Proc；Natl.Acad.Sci.USA,87：162-166)及Norderhaug et al.(1991,Eur J Immunol, 21(10)：2379-84)。

一被充分描述的技術是Kyowa所發展出的補體技術，其在於做出具增強CDC的嵌合型人類IgG1/IgG3 Fc部分(見，如WO 2007/011041)。

描述增加ADCC及CDC之方法的參考文獻包括Natsume et al.(2008,Cancer Res.68(10)：3863-3872)。此等參考文獻各者之揭露內容係包括於此中以為交互參照。

對熟習此技藝者而言將為清楚的是：增強ADCC及/或CDC在癌症治療領域中是特別感興趣的，因其將導致殺死表現CXCR4之癌性細胞，且為此將清楚地限制萬一CXCR4標靶治療被停止時癌症重新開始的風險。

就“含有CH2之結合片段”的表達，其必須被理解為包含親本抗體之6 CDRs及至少已知為負責誘發作用功能之該CH2域的一抗體的任何片段或部段。在一最佳實施態樣中，CH2必須是二聚型，也就是說其包含兩副CH2。

在另一實施態樣中，含有CH2之結合片段包含親本抗體之6 CDRs及至少CH2域和樞紐域。

在另一實施態樣中，含有CH2之結合片段包含親本抗體之6 CDRs及至少CH1域、樞紐域和CH2域。

在另一實施態樣中，含有CH2之結合片段包含親本抗體之6 CDRs及至少CH1域和CH2域。

在另一實施態樣中，含有CH2之結合片段包含親本抗體之6 CDRs及至少CH1域、CH2域和CH3域。

在又另一實施態樣中，含有CH2之結合片段包含親本抗體之6 CDRs及至少CH1域、樞紐域、CH2域和CH3域，即全長Fc。

更較佳地，本發明包含藉基因重組或化學合成所獲得的擬人化抗體、其等之含有CH2之結合片段。

依據一較佳實施態樣，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵在於其係由單株抗體構成。

換言之，本發明之方法包含使用人類或擬人化抗體、或一含有CH2之結合片段，該抗體或片段依據IMGT係包含一重鏈，該重鏈包含下列三個CDRs，分別為CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中：- CDR-H1包含序列辨識編號1之序列、或一在與序列辨識編號1之序列最適排比後有至少80%，較佳85%、90%、95%及98%，同一性的序列；- CDR-H2包含序列辨識編號2之序列、或一在與序列辨識編號2之序列最適排比後有至少80%，較佳85%、90%、95%及98%，同一性的序列；且- CDR-H3包含序列辨識編號3之序列、或一在與序列辨識編號3之序列最適排比後有至少80%，較佳85%、90%、95%及98%，同一性的序列。

甚至更佳地，本發明之方法包含使用人類或擬人化抗體、或一含有CH2之結合片段，該抗體或片段依據IMGT係包含一輕鏈，該輕鏈包含下列三個CDRs，分別為CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中：- CDR-L1包含序列辨識編號4之序列、或一在與序列辨識編號4之序列最適排比後有至少80%，較佳85%、90%、95%及98%，同一性的序列；- CDR-L2包含序列辨識編號5之序列、或一在與序列辨識編號5之序列最適排比後有至少80%，較佳85%、90%、95%及98%，同一性的序列；且- CDR-L3包含序列辨識編號6之序列、或一在與序列辨識編號6之序列最適排比後有至少80%，較佳85%、90%、95%及98%，同一性的序列。

在本描述中，術語“多胜肽”、“多胜肽序列”、“胜肽”是可互換的。

IMGT獨特編號(IMGT unique numbering)已被界定為去比較可變域，不管是什麼抗原受體、鏈類型、或種類[Lefranc M.-P.,Immunology Today 18,509(1997)/Lefranc M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommié,C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E.,Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.and Lefranc,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)]。在IMGT獨特編號中，守恆胺基酸總是具有相同位置，譬如，半胱胺酸23(1st-CYS)、色胺酸41(守恆的TRP)、疏水性胺基酸89、半胱胺酸104(2nd-CYS)、苯丙胺酸或色胺酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT獨特編號提供一標準化的架構區劃界(FR1-IMGT：位置1至26；FR2-IMGT：39至55；FR3-IMGT：66至104；及FR4-IMGT：118至128)以及互補性決定區劃界：CDR1-IMGT：27至38；CDR2-IMGT：56至65；及CDR3-IMGT：105至117。當間隙代表未佔用位置時， CDR-IMGT的長度(顯示於中括號之間且以小圓點分隔，如[8.8.13])會成為決定性的資訊。IMGT獨特編號係使用於命名為IMGT Colliers de Perles之2D圖示表示法中[Ruiz,M.and Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas,Q.and Lefranc,M.-P.,Current Bioinformatics,2,21-30(2007)]以及使用於IMGT/3D結構-DB之3D結構中[Kaas,Q.,Ruiz,M.and Lefranc,M.-P.,T cell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)]。

在本發明之意義中，兩核酸或胺基酸序列之間的“百分比同一性”意指該兩要被比較之序列之間在最適排比後所獲得之等同核苷酸或胺基酸殘基的百分比，此百分比是全然地統計學，且該兩序列之間的差異係沿其等之長度隨機地分佈。兩核酸或胺基酸序列的比較在傳統上係藉由在已將其等最適排比後比較序列來實行，該比較係能以區段或以使用“排比窗”來進行。供比較序列之最適排比的實行除了可用手動比較外，還可用Smith與Waterman之局部同源性演算法(1981)[Ad.App.Math.2：482]、用Neddleman與Wunsch之局部同源性演算法(1970)[J.Mol.Biol.48：443]、用Pearson與Lipman之類似性檢索方法(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444]或用使用此等演算法之電腦軟體(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA、或藉比較軟體BLAST NR或BLAST P)。

兩核酸或胺基酸序列之間的百分比同一性係藉由比較兩最適排比之序列來決定，其中要比較之核酸或胺基酸序列與該兩序列之間最適排比的參考序列比較可具有添加或缺失。百分比同一性之計算係藉由決定兩序列之間，較佳是兩完整序列之間，核苷酸或胺基酸殘基等同之位置的數目、將該等同之位置的數目除以排比窗中位置總數目、再將結果乘以100來獲得該兩序列之間的百分比同一性。

例如，可獲得於http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html位址的BLAST程式，“BLAST 2序列”(Tatusova et al.,“Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”,FEMS Microbiol.,1999,Lett.174：247-250)，可被使用於內定參數下[尤其是參數“開放間隙罰分(open gap penalty)”：5、及“延伸間隙罰分(extension gap penalty)”：2；所選擇之矩陣係為，例如，該程式所提議的“BLOSUM 62”矩陣)；兩要比較序列之間的百分比同一性係直接由該程式計算。

就與一參考胺基酸序列展現出至少80%，較佳85%、90%、95%及98%，同一性的胺基酸序列而言，較佳實例包括那些含有該參考序列、某些修飾(尤其是至少一胺基酸之缺失、添加或取代；截斷或延伸)者。在一或更多接續性或非接續性胺基酸取代的事例中，取代較佳為其中被取代之胺基酸係以“等效”胺基酸置換。在此，“等效胺基酸”之表達係意指可能取代結構胺基酸中之一者然而卻未修飾該對應抗體之生物活性的任何胺基酸，且係具有界定於下之那些特定實例。

等效胺基酸可基於下列來決定：不是基於其等與被其等取代之胺基酸的結構同源性，就是基於可能被產生之各種抗體之間生物活性的比較試驗結果。

作為一非限制性實例，下表1係概述可能被實行而未造成顯著修飾該對應被修飾抗體之生物活性的可能取代；反取代在相同條件下係自然可能的。

熟習此技藝者所知的是：在現行的技藝狀態中，六個CDRs之間的最大變異性(長度及組成)係見於三個重鏈CDRs且，更特別地，是見於此重鏈的CDR-H3。結果，將為明白的是：本發明抗體或其等衍生化合物或功能性片段之一者的較佳特徵CDRs將為重鏈的三個CDRs。

本發明之另一實施態樣揭露一人類或擬人化抗體、或一含有CH2之結合片段的用途，該抗體或片段包含：一重鏈，其包含下列三個CDRs：CDR-H1，其具有序列辨識編號1之序列、或具有一在與序列辨識編號1之序列最適排比後有至少80%，較佳85%、90%、95%及98%，同一性的序列；CDR-H2，其具有序列辨識編號2之序列、或具有一在與序列辨識編號2之序列最適排比後有至少80%，較佳85%、90%、95%及98%，同一性的序列；CDR-H3，其具有序列辨識編號3之序列、或具有一在與序列辨識編號3之序列最適排比後有至少80%，較佳85%、90%、95%及98%，同一性的序列；以及一輕鏈，其包含下列三個CDRs：CDR-L1，其具有序列辨識編號4之序列、或具有一在與序列辨識編號4之序列最適排比後有至少80%，較佳85%、90%、95%及98%，同一性的序列；CDR-L2，其具有序列辨識編號5之序列、或具有一在與序列辨識編號5之序列最適排比後有至少80%，較佳85%、90%、95%及98%，同一性的序列； CDR-L3，其具有序列辨識編號6之序列、或具有一在與序列辨識編號6之序列最適排比後有至少80%，較佳85%、90%、95%及98%，同一性的序列。

為更清楚，下表2a係概述對應於本發明抗體hz515H7之CDRs的各種胺基酸序列；而表2b係概述對應於本發明擬人化抗體之各種變異體之可變域及全長序列的各種胺基酸序列。

作為一實例，為避免疑問，“VH1”之表達係類似於“VH變異體1”、“VH變異體1”、“VH Var 1”或“VH var 1)之表達。

在此可被提及的是：本發明所使用之抗體係獲得自於2008年6月25日提存於法國微生物培養收集中心[CNCM，巴斯德研究院(Institut Pasteur)，巴黎，法國)、編號I-4019之鼠類融合瘤所產出鼠類抗體的擬人化。該融合瘤之獲得係藉由融合Balb/C免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤Sp 2/O-Ag 14株之細胞。

在此指稱為515H7之鼠類單株抗體是由2008年6月25日提存於CNCM、編號I-4019之融合瘤所分泌的。

在一較佳實施態樣中，使用於本發明方法中之抗體是一擬人化抗體。

當使用於此中，術語“擬人化抗體”指的是一種含有極微之衍生自非人類免疫球蛋白之序列的嵌合抗體。“嵌合抗體”當使用於此中是指恆定區或其一部分被改變、置換、或交換，以致於可變區係連接至一不同種類或歸屬於另一抗體類別或次類別之恆定區的一抗體。“嵌合抗體”亦指的是可變區或其一部分被改變、置換、或交換，以致於恆定區係連接至一不同種類或歸屬於另一抗體類別或次類別之可變區的一抗體。

在某些實施態樣中，抗體或其抗原結合片段、變異體、或衍生物之可變區及恆定區兩者係為完全人類的。完全人類抗體可使用此技藝中已知之技術做出。例如，對抗一特定抗原之完全人類抗體的製備可藉由將該抗原投與至一已被修飾以回應抗原挑戰來產出此類抗體、但內源性基因座已被失能的轉殖動物。可用以做出此類抗體的示範性技術係描述於US專利：6,150,584、6,458,592、6,420,140。其他技術係已知於此技藝中。完全人類抗體同樣可藉由，如，噬菌體展現或其他病毒展現系統之各種展現技術來產出。亦見U.S.專利編號4,444,887、4,716,111、5,545,806、及5,814,318；以及國際專利申請案之公開案編號WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、及WO 91/10741(該等參考文獻係以其等之整體併入以作為參考)。

“擬人化抗體”當使用於此中指的是含有衍生自非人類起源抗體之CDR區且抗體分子之其他部段係衍生自一種(或數種)人類抗體的一抗體。此外，一些骨架區段殘基(稱為FR)可被修飾以保留結合親和性(Jones et al.,Nature,321：522-525,1986；Verhoeyen et al.,Science,239：1534-1536,1988；Riechmann et al.,Nature,332：323-327,1988)。

擬人化之目標是在降低供引入至人類內之諸如鼠類抗體之異種抗體的免疫原性，同時維持該抗體的完全抗原結合親和性與專一性。本發明之擬人化抗體或其片段可藉由熟習此技藝者已知之技術來製備(諸如，例如，那些描述於Singer et al.,J.Immun.,150：2844-2857,1992；Mountain et al.,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.,10：1-142,1992；及Bebbington et al.,Bio/Technology,10：169-175,1992者)。此等擬人化抗體就其等之使用於涉及活體外診斷或活體內預防性及/或治療處理之方法中而言是較佳的。其他的擬人化技術亦已為熟習此技藝者所知，諸如，例如，PDL於下列專利中所描述之“CDR移植(CDR grafting)”技術：EP0451261、EP0682040、EP0939127、EP0566647或US5,530,101、US6,180,370、US5,585,089及US5,693,761。US專利5,639,641或6,054,297、5,886,152及5,877,293亦可被引用。

延伸地，在本說明書之事例中，嵌合抗體c151H7將被包含於“擬人化抗體”之表達中。更特別地，該c515H7之特徵係在於其包含具序列辨識編號70(對應於核苷酸序列辨識編號72)之序列的重鏈及具序列辨識編號71(對應於核苷酸序列辨識編號73)之序列的輕鏈。

本發明係有關於生成自上述鼠類抗體515H7的擬人化抗體，該等抗體係以其等之重鏈及/或輕鏈可變域的序列來界定。確實，描述於此中的所有擬人化抗體皆可用於本發明方法中，即，其等可被用以供藉由在作用细胞或補體組分之存在下誘發至少一作用功能來殺死表現CXCR4之癌症細胞，或其等可被用以供藉由在作用细胞或補體組分之存在下誘發至少一作用功能來殺死表現CXCR4之癌症細胞以治療癌症。

在本發明方法的一較佳實施態樣中，人類或擬人化抗體係由包含選自序列辨識編號7至10序列之一重鏈可變域以及選自序列辨識編號11至17序列之一輕鏈可變域的擬人化抗體構成。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該人類或擬人化抗體係由包含選自序列辨識編號7至10序列之一重鏈可變域以及選自序列辨識編號11至17序列之一輕鏈可變域的擬人化抗體構成。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於其係由包含選自序列辨識編號7至10序列之一重鏈可變域以及選自序列辨識編號11至17序列之一輕鏈可變域的擬人化抗體構成。

依據本發明之一較佳擬人化抗體係由包含具序列辨識編號8序列之一重鏈可變域以及選自序列辨識編號11至17序列之一輕鏈可變域的擬人化抗體構成。

依據本發明之又一較佳擬人化抗體係由包含選自序列辨識編號7至10序列之一重鏈可變域以及具序列辨識編號13序列之一輕鏈可變域的擬人化抗體構成。

本發明亦有關於生成自上述鼠類抗體515H7的擬人化抗體，該等抗體係以其等之全長重鏈及/或全長輕鏈的序列來界定。

在本發明方法的一較佳實施態樣中，人類或擬人化抗體係由包含選自序列辨識編號18至21序列之一重鏈以及選自序列辨識編號22至28序列之一輕鏈的擬人化抗體構成。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該人類或擬人化抗體係由包含選自序列辨識編號18至21序列之一重鏈以及選自序列辨識編號22至28序列之一輕鏈的擬人化抗體構成。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於其係由包含選自序列辨識編號18至21序列之一重鏈以及選自序列辨識編號22至28序列之一輕鏈的擬人化抗體構成。

依據本發明之一較佳擬人化抗體係由包含具序列辨識編號19序列之一重鏈及/或選自序列辨識編號22至28序列之一輕鏈的擬人化抗體構成。

依據本發明之另一較佳擬人化抗體係由包含選自序列辨識編號18至21序列之一重鏈及/或具序列辨識編號24序列之一輕鏈的擬人化抗體構成。

在一較佳實施態樣中，本發明係有關於一種擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2、或其衍生化合物或功能性片段，包含具序列辨識編號8序列之一重鏈可變區以及具序列辨識編號13序列之一輕鏈可變區。

在另一較佳實施態樣中，本發明係有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2、或其衍生化合物或功能性片段，包含具序列辨識編號19序列之一重鏈以及具序列辨識編號24序列之一輕鏈。

在另一較佳實施態樣中，本發明係有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2.1、或其衍生化合物或功能性片段，包含具序列辨識編號8序列之一重鏈可變區以及具序列辨識編號14序列之一輕鏈可變區。

在另一較佳實施態樣中，本發明係有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2.1、或其衍生化合物或功能性片段，包含具序列辨識編號19序列之一重鏈以及具序列辨識編號25序列之一輕鏈。

在另一較佳實施態樣中，本發明係有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2.2、或其衍生化合物或功能性片段，包含具序列辨識編號8序列之一重鏈可變區以及具序列辨識編號15序列之一輕鏈可變區。

在另一較佳實施態樣中，本發明係有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2.2、或其衍生化合物或功能性片段，包含具序列辨識編號19序列之一重鏈以及具序列辨識編號26序列之一輕鏈。

在另一較佳實施態樣中，本發明係有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2.3、或其衍生化合物或功能性片段，包含具序列辨識編號8序列之一重鏈可變區以及具序列辨識編號16序列之一輕鏈可變區。

在另一較佳實施態樣中，本發明係有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2.3、或其衍生化合物或功能性片段，包含具序列辨識編號19序列之一重鏈以及具序列辨識編號27序列之一輕鏈。

在另一較佳實施態樣中，本發明係有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1、或其衍生化合物或功能性片段，包含具序列辨識編號9序列之一重鏈可變區以及具序列辨識編號11序列之一輕鏈可變區。

在另一較佳實施態樣中，本發明係有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1、或其衍生化合物或功能性片段，包含具序列辨識編號20序列之一重鏈以及具序列辨識編號22序列之一輕鏈。

在另一較佳實施態樣中，本發明係有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1 T59A E61D、或其衍生化合物或功能性片段，包含具序列辨識編號9序列之一重鏈可變區以及具序列辨識編號12序列之一輕鏈可變區。

在另一較佳實施態樣中，本發明係有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1 T59A E61D、或其衍生化合物或功能性片段，包含具序列辨識編號20序列之一重鏈以及具序列辨識編號23序列之一輕鏈。

在另一較佳實施態樣中，本發明係有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 VL1、或其衍生化合物或功能性片段，包含具序列辨識編號7序列之一重鏈可變區以及具序列辨識編號11序列之一輕鏈可變區。

在另一較佳實施態樣中，本發明係有關於擬人化抗體Hz515H7 VH1 VL1、或其衍生化合物或功能性片段，包含具序列辨識編號18序列之一重鏈以及具序列辨識編號22序列之一輕鏈。

必須被理解的是：以上例示的VH/VL組合並非限制性的。熟習此技藝者當然可以在無過分負擔且未應用創造性技能的狀況下重新排列本說明書中所揭露的所有VH及VL。

在本發明方法之一更佳實施態樣中，該人類或擬人化抗體係由包含具序列辨識編號8序列之一重鏈可變域以及具序列辨識編號13序列之一輕鏈可變域的擬人化抗體構成。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該人類或擬人化抗體係由包含具序列辨識編號8序列之一重鏈可變域以及具序列辨識編號13序列之一輕鏈可變域的擬人化抗體構成。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於其係由包含具序列辨識編號8序列之一重鏈可變域以及具序列辨識編號13序列之一輕鏈可變域的擬人化抗體構成。

就上述不同序列，較佳抗體(但非唯一的一個)亦將以其全長重鏈及輕鏈序列之序列來描述。

在本發明方法之一更佳實施態樣中，人類或擬人化抗體係由包含具序列辨識編號19序列之一重鏈以及具序列辨識編號24序列之一輕鏈的擬人化抗體構成。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該人類或擬人化抗體係由包含具序列辨識編號19序列之一重鏈以及具序列辨識編號24序列之一輕鏈的擬人化抗體構成。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於其係由包含具序列辨識編號19序列之一重鏈以及具序列辨識編號24序列之一輕鏈的擬人化抗體構成。

對熟習此技藝者而言將為明顯的是：本發明抗體必須呈現用以呈現作用功能所需的結構要素。更特別地，該抗體必須具有合適的同型以容許ADCC及/或CDC。例如，已知的是：在各種人類免疫球蛋白類別中，人類IgG1和IgG3在介導ADCC上比IgG2和IgG4更為有效力。另一方面，對CDC之潛力順序係為IgG3IgG1>>IgG2IgG4(Niwa et al.,J Immunol Methods,306：151-160,2005)。

在本發明方法之一較佳實施態樣中，該人類或擬人化抗體係具有IgG1同型。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該人類或擬人化抗體係具有IgG1同型。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於其係具有IgG1同型。

在一特別實施態樣中，本發明係有關於由IgG1 Hz515H7 VH1 D76N VL2構成之本發明較佳抗體的含有CH2之結合片段。

更特別地，一較佳的含有CH2之結合片段係由包含下列之一片段構成：i)一重鏈可變域，其包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號1、2和3之序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；ii)一輕鏈可變域，其包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號4、5和6之序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；以及iii)一CH2域，其包含至少序列辨識編號60之序列。

在本發明方法之一較佳實施態樣中，該含有CH2之結合片段係由包含下列之一片段構成：分別包含序列辨識編號1、2和3的3重鏈CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；分別包含序列辨識編號4、5和6的3輕鏈CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；及至少包含序列辨識編號60的CH2域。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該含有CH2之結合片段係由包含下列之一片段構成：分別包含序列辨識編號1、2和3的3重鏈CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；分別包含序列辨識編號4、5和6的3輕鏈CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；及至少包含序列辨識編號60的CH2域。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於該含有CH2之結合片段係由包含下列之一片段構成：分別包含序列辨識編號1、2和3的3重鏈CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；分別包含序列辨識編號4、5和6的3輕鏈CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；及至少包含序列辨識編號60的CH2域。

另一較佳的含有CH2之結合片段係由包含下列之一片段構成：i)一重鏈可變域，其包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號1、2和3之序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；ii)一輕鏈可變域，其包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號4、5和6之序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；iii)一CH2域，其包含至少序列辨識編號60之序列；及iv)一樞紐域，其包含至少序列辨識編號61之序列。

又另一較佳的含有CH2之結合片段係由包含下列之一片段構成：i)一重鏈可變域，其包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號1、2和3之序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；ii)一輕鏈可變域，其包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號4、5和6之序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；iii)一CH2域，其包含至少序列辨識編號60之序列；iv)一樞紐域，其包含至少序列辨識編號61之序列；及v)一CH1域，其包含至少序列辨識編號62之序列。

又另一較佳的含有CH2之結合片段係由包含下列之一片段構成：i)一重鏈可變域，其包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號1、2和3之序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；ii)一輕鏈可變域，其包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號4、5和6之序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；iii)一CH2域，其包含至少序列辨識編號60之序列；iv)一樞紐域，其包含至少序列辨識編號61之序列；v)一CH1域，其包含至少序列辨識編號62之序列；及vi)一CH3域，其包含至少序列辨識編號63之序列。

在本發明之又另一較佳實施態樣中，一較佳的含有CH2之結合片段係由包含下列之一片段構成：i)一重鏈可變域，其包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號1、2和3之序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3；ii)一輕鏈可變域，其包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號4、5和6之序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；及iii)一全長Fc域，其包含至少序列辨識編號64之序列。

為更清楚，下列表3係例示就抗體Hz515H7 VH1 D76N VL2之各域的序列。

基於此等要素，在無任何過分實驗下產生本申請案所描述之任何序列所衍生出的任何含有CH2之結合片段對熟習此技藝者而言是將為清楚的。結果，任何其他含有CH2之結合片段必須被視為本申請案範疇之部份。

下表4a係概述對應於本發明抗體hz515H7之CDRs的最適化核苷酸序列；而表4b係概述對應於本發明擬人化抗體之各種變異體之可變域及全長序列的各種最適化核苷酸序列。

“最適化序列”之表達係意指編碼組構出感興趣蛋白質(此中為抗體可變域)之胺基酸的密碼子已被修飾以供在此中為哺乳動物細胞之專用細胞類型中能被轉譯工具更好辨認。確實，此技藝中具有技能者已知的是：視基因及用於表現之細胞的來源而定，密碼子最適化可有助於增加本發明所編碼多胜肽的表現。就“密碼子最適化”，其指的是對本發明多胜肽編碼序列的改變，該改變改良了該等序列就密碼子在宿主細胞中之使用。就諸如，如，CHO細胞之哺乳動物細胞以及就種種其他生物體的密碼子使用表係已知於此技藝中。此外，最適化亦可藉由改變多核苷酸序列，包括G/C含量適應及穩定RNA二級結構之預防來達到(見，例如，Kim et al.,1997 Gene199(1-2)：293-301)。

在本描述中可互換地使用的術語“核酸”、“核序列”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”及“核苷酸序列”係意指一精確的經修飾或未修飾的核苷酸序列，其界定出一核酸之含有非自然核苷酸或無非自然核苷酸的一片段或一區，且不是雙股DNA、單股DNA，就是該等DNA的轉錄產物。

本發明之核序列已全部被分離及/或純化，即，其等係直接或間接地以，例如，一副本取樣，其等之環境已被至少部份地修改。“在與一較佳序列最適排比後，展現出百分比同一性為至少80%，較佳85%、90%、95%及98%，的核序列”係意指對於該等參考核序列展現出某些諸如，特別是，缺失、截斷、延伸、嵌合融合及/或取代，尤其是點狀，之修飾的核序列。較佳地，此等序列是編碼與參考序列相同之胺基酸序列者，此係有關於遺傳密碼的簡併化；或者是可能與該等參考序列專一性地雜合的互補性序列，較佳是在高度嚴苛條件下，尤其是那些界定於下者。

高度嚴苛條件下之雜合意指有關於溫度及離子強度之條件的選擇方式係使得其等容許雜合被維持在兩互補性DNA片段之間。基於一全然例示性基礎，雜合步驟之高度嚴苛條件就界定上述多核苷酸片段之目的而言有利地係如下。

DNA-DNA或DNA-RNA雜合係以兩步驟實行：(1)在42℃下於含有5X SSC(1X SSC係對應於具有0.15 M NaCl+0.015 M檸檬酸鈉的一溶液)、50%甲醯胺、7%十二基硫酸鈉(SDS)、10X鄧哈德特(Denhardt’s)、5%硫酸葡聚糖及1%鮭魚精子DNA的磷酸鹽緩衝液(20 mM，pH 7.5)中預雜合達三小時；(2)在視探針長度而定的溫度(即：就>100個核苷酸長度之探針的溫度為42℃)下主雜合達20小時，隨後為在20℃下於2X SSC+2% SDS中的兩次20分鐘洗滌、及在20℃下於0.1X SSC+0.1% SDS中的一次20分鐘洗滌。最後之洗滌就>100個核苷酸長度之探針而言係在60℃下實行於0.1X SSC+0.1% SDS中達30分鐘。上述就已界定大小之多核苷酸的高度嚴苛雜合條件可由熟習此技藝者針對較長或較短的寡核苷酸來調適，依據Sambrook,et al.(Molecular cloning：a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory；3rd edition,2001)中所描述的程序。

為了表現本發明之人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段的重鏈及/或輕鏈，編碼該重鏈及/或輕鏈的多核苷酸係被插入於表現載體中，俾使得該基因係操作性地連接至轉錄及轉譯控制序列。

"可操作地連接"之序列包括與感興趣之基因相連的表現控制序列與以反式作用或在一距離下作用來控制感興趣之基因的表現控制序列兩者。術語"表現控制序列"當使用於此中指的是多核苷酸序列，該等多核苷酸序列係為實現與其等接合之編碼序列的表現及加工所必需的。表現控制序列包括恰當的轉錄起始序列、終止序列、啟動子序列及增強子序列；有效率的RNA加工信號，諸如剪接及聚腺苷酸化信號；穩定細胞質mRNA之序列；增強轉譯效率之序列[即，科扎克共有序列(Kozak consensus sequence)]；增強蛋白質穩定性之序列；及，當所欲時，增強蛋白質分泌之序列。此等控制序列之本質係視宿主生物體而有所不同；在原核生物中，此等控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位址、及轉錄終止序列；在真核生物中，此等控制序列一般包括啟動子及轉錄終止序列。術語"控制序列"係意欲包括最起碼那些其等之存在是表現與加工所必要的所有組分且亦可包括那些其等之存在是有利的額外組分，例如，前導序列及融合夥伴序列。

術語"載體"當使用於此中係意欲指一核酸分子，其能夠輸送其所連接的另一核酸。載體中之一類型係為"質體"，其指的是一圓形雙股DNA環，其中可接合有額外的DNA區段。載體之另一類型係為病毒載體，其中額外DNA區段可被接合至該病毒基因體中。某些載體係能夠在其等被引入的宿主細胞中自主複製[如，具有細菌複製起源的細菌載體及游離(episomal)哺乳動物載體]。其他載體(如，非游離哺乳動物載體)可於引入至宿主細胞中時被整合至該宿主細胞的基因體中且藉此隨著宿主基因體複製。

某些載體係能夠導引其等所操作性地連接之基因的表現。此等載體於此中係指稱為"重組表現載體"(或簡稱"表現載體")。一般而言，重組DNA技術中具有效用的表現載體係呈質體形式。在本說明書中，"質體"與"載體"可被互換地使用，因為質體是最常使用的載體形式。然而，本發明係意欲包括之表現載體形式，諸如細菌質體、YACs、黏質體(cosmids)、反轉錄病毒、EBV衍生之游離基因組(episomes)、及所有其他載體，係為技能人士將知曉為方便確保本發明抗體重鏈及/或輕鏈之表現者。技能人士將了解的是：編碼該等重鏈及輕鏈的多核苷酸可被選殖至不同載體中或被選殖於相同載體中。在一較佳實施態樣中，該等多核苷酸係被選殖於相同載體中。

除了抗體鏈基因及調節型序列，本發明之重組表現載體還可攜載額外序列，諸如調節載體於宿主細胞中之複製的序列(如，複製起源)及可選擇標識基因。該可選擇標識基因係便於選擇已引入有載體的宿主細胞(見，如，美國專利第4,399,216、4,634.665及5,179,017號)。例如，典型地，可選擇標識基因係賦予已引入有載體的宿主細胞抗藥性，諸如抗G418、潮黴素(hygromycin)或胺甲葉酸(methotrexate)。較佳的可選擇標識基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(供用於dhfr-宿主細胞中以胺甲葉酸選擇/擴增)以及neo基因(供G418選擇)。若干選擇系統可依據本發明來使用，包括但不限於，疱疹單純型(simplex)病毒胸腺嘧啶核苷激酶 (Wigler et al.,Cell 11：223,1977)、次黃嘌呤-鳥糞嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Szybalska et al.,Proc Natl Acad Sci USA 48：202,1992)、在甲硫胺酸磺醯亞胺(methionine sulfoximide)的存在下麩胺酸合成酶之選擇(Adv Drug Del Rev,58：671,2006，及Lonza Group Ltd.之網址或文獻)及分別在tk、hgprt或aprt細胞中的腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Lowy et al.,Cell 22：817,1980)基因。並且，抗代謝物質之抗性可被用以作為下列基因之選擇基礎：dhfr，其賦予對胺甲葉酸之抗性(Wigler et al.,Proc Natl Acad Sci USA 77：357,1980)；gpt，其賦予對黴酚酸之抗性(Mulligan et al.,Proc Natl Acad Sci USA 78：2072,1981)；neo，其賦予對胺基糖苷、G-418之抗性(Wu et al.,Biotherapy 3：87,1991)；及hygro，其賦予對潮黴素之抗性(Santerre et al.,Gene 30：147,1984)。此技藝中已知之重組DNA技術方法可被例行地應用於選擇所欲的重組選殖株，且此等方法係描述於，例如，Ausubel et al.,eds.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1993)中。一抗體之表現位準可藉由載體擴增來增加。當表現一抗體之載體系統中的一標識係可擴增，則存在於培養物中抑制物位準的增加將增加標識基因副本之數目。既然該擴增區係與編碼本發明IgG抗體的基因相關，則該抗體之生產亦將增加(Crouse et al.,Mol Cell Biol 3：257,1983)。

本發明之多核苷酸以及包含此等分子之載體可被用以轉形合適的哺乳動物宿主細胞、或轉形有技能者已知的任何其他宿主細胞類型。術語"重組宿主細胞"(或簡稱"宿主細胞")當使用於此中係意欲指已引入有重組表現載體的細胞。應被理解的是：此等術語意欲指的不僅是特別主題細胞，還指該一細胞之子代。因為某些修飾可因突變或環境影響而發生於後續世代，此子代事實上可能未等同於該親代細胞，但仍是包括於當使用於此中之該術語"宿主細胞"的範疇內。

轉形可以是藉由任何已知方法來將多核苷酸引入至宿主細胞中。此等方法係為熟習此技藝者所熟知，且包括葡聚糖媒介之轉形、磷酸鈣沈澱、聚凝胺(polybrene)媒介之轉染、原生質體融合、電穿孔、多核苷酸之封裝(encapsulation)至脂質體中、生物導彈(biolistic)注射及DNA之直接顯微注射至核中。用於表現本發明重組抗體的較佳哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當編碼抗體基因之重組表現載體係被引入至哺乳動物宿主細胞中，該等抗體之產出係藉由培養該等宿主細胞達一段充分時間以容許抗體表現於該等宿主細胞中，或更佳地，容許抗體分泌至該等宿主細胞生長的培養基中。

抗體可使用標準蛋白質純化方法從培養基回收。本發明抗體之可溶形式可從培養物上清液回收。其可接著藉由此技藝中已知用以純化免疫球蛋白分子的任何方法來純化，例如，藉由層析法(如，離子交換層析；親和性層析，特別是利用蛋白質A對Fc的親和性；諸如此類)、離心、差別性溶解度，或藉由任何其他用以純化蛋白質的標準技術。純化之合適方法對此技藝中具有通常技能者而言將是明顯的。

本案發明人已顯示出針對CXCR4之人類或擬人化抗體係能夠透過誘發該抗體的至少一作用功能來殺死表現CXCR4之癌症細胞。

就“表現CXCR4之癌症細胞”，其在此中指的是相對於正常成體細胞上之CXCR4表現位準，顯示出高CXCR4表現的癌症細胞。此等癌症包括(但不限於)下列：惡性瘤及腺癌，包括膀胱、乳房、結腸、頭頸、前列腺、腎臟、肝臟、肺、卵巢、胰臟、胃、子宮頸、甲狀腺及皮膚之惡性瘤及腺癌；且包括鱗狀細胞惡性瘤；淋巴系譜之造血腫瘤，包括多發性骨髓瘤、白血病、急性和慢性淋巴細胞(或淋巴)白血病、急性和慢性淋巴胚細胞白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、非何杰金氏(non-Hodgkin)淋巴瘤[如，伯奇氏(Burkitt's)淋巴瘤]；骨髓系譜之造血腫瘤，包括急性和慢性骨髓性(骨髓或骨髓細胞)白血病及前骨髓細胞白血病；間質起源之腫瘤，包括纖維肉瘤、骨肉瘤及橫紋肌肉瘤；中樞及週邊神經系統之腫瘤，包括星狀細胞瘤、神經胚細胞瘤、神經膠質瘤、及神經鞘瘤；及其他腫瘤，包括黑色素瘤、畸形癌、著色性乾皮病、角質棘皮瘤、及精細胞瘤；以及其他終被決定有CXCR4表現之癌症。

在所請發明方法之一較佳實施態樣中，該表現CXCR4之癌症細胞係由惡性血液細胞構成。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該表現CXCR4之癌症細胞係由惡性血液細胞構成。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於該表現CXCR4之癌症細胞係由惡性血液細胞構成。

更特別地，該CXCR4惡性血液細胞係選自於包含淋巴瘤細胞、白血病細胞或多發性骨髓瘤細胞之群組。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該CXCR4惡性血液細胞係選自於包含淋巴瘤細胞、白血病細胞或多發性骨髓瘤細胞之群組。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於該CXCR4惡性血液細胞係選自於包含淋巴瘤細胞、白血病細胞或多發性骨髓瘤細胞之群組。

在另一較佳實施態樣中，該惡性血液細胞係由淋巴瘤細胞構成。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該惡性血液細胞係由淋巴瘤細胞構成。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於該惡性血液細胞係由淋巴瘤細胞構成。

如上所提及，作用细胞及/或補體組分是本發明特別感興趣的。

在本發明方法之一更佳實施態樣中，該等作用细胞包含NK細胞、巨噬細胞、單核球、嗜中性球或嗜酸性球。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該等作用细胞包含NK細胞、巨噬細胞、單核球、嗜中性球或嗜酸性球。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於該等作用细胞包含NK細胞、巨噬細胞、單核球、嗜中性球或嗜酸性球。

基於下列實例，本發明所用抗體特別令人感興趣的性質係被描述。

在本發明方法之一較佳實施態樣中，在培育4小時時期之後，於RAMOS淋巴瘤細胞上所誘發的ADCC位準係至少40%。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於，在培育4小時時期之後，於RAMOS淋巴瘤細胞上所誘發的ADCC位準係至少40%。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於，在培育4小時時期之後，於RAMOS淋巴瘤細胞上所誘發的ADCC位準係至少40%。

在本發明方法之一較佳實施態樣中，在培育4小時時期之後，於DAUDI淋巴瘤細胞上所誘發的ADCC位準係至少30%，較佳至少40%。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於，在培育4小時時期之後，於DAUDI淋巴瘤細胞上所誘發的ADCC位準係至少30%，較佳至少40%。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於，在培育4小時時期之後，於DAUDI淋巴瘤細胞上所誘發的ADCC位準係至少30%，較佳至少40%。

在本發明方法之一較佳實施態樣中，在培育4小時時期之後，於HeLa子宮頸癌症細胞上所誘發的ADCC位準係至少30%，較佳至少40%。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於，在培育4小時時期之後，於HeLa子宮頸癌症細胞上所誘發的ADCC位準係至少30%，較佳至少40%。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於，在培育4小時時期之後，於HeLa子宮頸癌症細胞上所誘發的ADCC位準係至少30%，較佳至少40%。

本發明之另一特別重要的方面係有賴於所誘發之ADCC及CDC的專一性。

在本發明方法之另一較佳實施態樣中，未有顯著的ADCC被誘發於NK細胞上。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於未有顯著的ADCC被誘發於NK細胞上。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於未有顯著的ADCC被誘發於NK細胞上。

所述補體組分包含至少C1q。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該補體組分包含至少C1q。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於該補體組分包含至少C1q。

在本發明方法之另一較佳實施態樣中，在培育1小時時期之後，於RAMOS淋巴瘤細胞上所誘發的CDC位準係至少30%，優先為至少50%，且最佳為至少70%。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於，在培育1小時時期之後，於RAMOS淋巴瘤細胞上所誘發的CDC位準係至少30%，優先為至少50%，且最佳為至少70%。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於，在培育1小時時期之後，於RAMOS淋巴瘤細胞上所誘發的CDC位準係至少30%，優先為至少50%，且最佳為至少70%。

在本發明方法之又另一較佳實施態樣中，在培育1小時時期之後，於NIH3T3 CXCR4細胞上所誘發的CDC位準係至少30%，優先為至少50%，且最佳為至少70%。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於，在培育1小時時期之後，於NIH3T3 CXCR4細胞上所誘發的CDC位準係至少30%，優先為至少50%，且最佳為至少70%。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於，在培育1小時時期之後，於NIH3T3 CXCR4細胞上所誘發的CDC位準係至少30%，優先為至少50%，且最佳為至少70%。

在本發明方法之又另一較佳實施態樣中，在培育1小時時期之後，於DAUDI淋巴瘤細胞上所誘發的CDC位準係至少30%，優先為至少40%。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於，在培育1小時時期之後，於DAUDI淋巴瘤細胞上所誘發的CDC位準係至少30%，優先為至少40%。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於，在培育1小時時期之後，於DAUDI淋巴瘤細胞上所誘發的CDC位準係至少30%，優先為至少40%。

從本發明抗體ADCC性質的意義上來說，所產生的結果是關於該抗體與FcγR的結合。

本發明之另一特別方面係有關於本發明抗體或具有其含有CH2之結合片段者係能夠結合至少一FcγRs。

在本發明方法之一較佳實施態樣中，該至少一FcγRs是FcγRI。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該至少一FcγRs是FcγRI。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於該至少一FcγRs是FcγRI。

在本發明方法之另一較佳實施態樣中，特徵化本發明抗體與人類Fc[γ]RI之結合的解離常數(K_D)依據朗謬模型(Langmuïr model)是在1與10 nM之間。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於特徵化本發明抗體與人類FcγRI之結合的解離常數(KD)依據朗謬模型是在1與10 nM之間。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於特徵化本發明抗體與人類FcγRI之結合的解離常數(KD)依據朗謬模型是在1與10 nM之間。

在本發明方法之另一較佳實施態樣中，該至少一FcγRs是人類FcγRIIIa。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該至少一FcγRs是人類FcγRIIIa。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於該至少一FcγRs是人類FcγRIIIa。

在本發明方法之一更佳實施態樣中，特徵化本發明抗體與人類FcγRIIIa之結合的解離常數(K_D)依據異質配位子模型(heterogeneous ligand model)是在200與1000 nM之間。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於特徵化本發明抗體與人類FcγRIIIa之結合的解離常數(KD)依據異質配位子模型是在200與1000 nM之間。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於特徵化本發明抗體與人類FcγRIIIa之結合的解離常數(KD)依據異質配位子模型是在200與1000 nM之間。

當使用於此中，術語“K_D”指的是特定抗體/抗原交互作用的解離常數。"結合親和性"一般指的是一分子(如，一抗體)之單一結合位址與其結合夥伴(如，一抗原)之間非共價交互作用的總計強度。除非另有指明，當使用於此中，"結合親和性"指的是反映出一結合對(如，抗體與抗原)之成員之間1：1交互作用的內在(intrinsic)結合親和性。一分子X對其夥伴Y的親和性一般可用K_D表示。親和性可用此技藝中已知的常見方法測量，包括那些描述於此中者。低親和性抗體一般會緩慢地結合抗原且傾向輕易地解離，而高親和性抗體一般卻會較快地結合抗原且傾向更長久地保持相結合。測量結合親和性的種種方法係已知於此技藝中，其等之任一者可為了本發明目的來使用。

較佳地，解離常數是依據朗謬模型計算。

所述朗謬模型正統係描述為：

其中A是分析物，B是配位子，AB是該分析物與該配位子之間的非共價複合，而k_a及k_d分別是該交互作用的締合速率及解離速率。

以相同的方式，配位子被視為具兩組分之混合物的異質配位子模型係以下兩個方程式系統來描述：

其中A是分析物，B1是該配位子的第一組分，AB1是該分析物與該配位子之第一組分之間的非共價複合，k_a1及k_d1分別是該交互作用的締合速率及解離速率，B2是該配位子的第二組分，AB2是該分析物與該配位子之第二組分之間的非共價複合，k_a2及k_d2分別是該交互作用的締合速率及解離速率。

BIAevaluation版本3.1(Biacore AB)已被用於處理BIACORE數據資料。

最後，本發明亦關係到一種治療或預防與存在有表現CXCR4之癌症細胞相關之病理狀態的方法，其包含之步驟為：投與一有效量的一人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段；該人類或擬人化抗體包含一具有序列辨識編號1、2和3之3 CDRs序列的重鏈可變域及一具有序列辨識編號4、5和6之3 CDRs序列的輕鏈可變域；其中該人類或擬人化抗體的至少一作用功能係在作用细胞或補體組分之存在下被誘發。

換言之，本發明係有關於一人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段的用途，用於製備一組成物以供治療與存在有表現CXCR4之癌症細胞相關的病理狀態；其中該人類或擬人化抗體包含一重鏈可變域及一輕鏈可變域，該重鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號1、2和3之序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，而該輕鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號4、5和6之序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；其中該人類或擬人化抗體的至少一作用功能係在作用细胞或補體組分之存在下被誘發。

又換言之，本發明係有關於一種專一性地辨識CXCR4之人類或擬人化抗體、含有CH2之結合片段，其係供用於治療與存在有表現CXCR4之癌症細胞相關的病理狀態；該人類或擬人化抗體包含一重鏈可變域及一輕鏈可變域，該重鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號1、2和3之序列的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，而該輕鏈可變域包含之數個CDR區為分別包含序列辨識編號4、5和6之序列的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；其中該人類或擬人化抗體的至少一作用功能係在作用细胞或補體組分之存在下被誘發。

較佳地，本發明亦關係到一種治療或預防與存在有表現CXCR4之癌症細胞相關之病理狀態的方法，其包含之步驟為：投與一有效量的一人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段；該人類或擬人化抗體包含一選自序列辨識編號7至10之序列的重鏈可變域以及一選自序列辨識編號11至17之序列的輕鏈可變域；其中該人類或擬人化抗體的至少一作用功能係在作用细胞或補體組分之存在下被誘發。

換言之，本發明係有關於一人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段的用途，用於製備一組成物以供治療與存在有表現CXCR4之癌症細胞相關的病理狀態；該人類或擬人化抗體包含一選自序列辨識編號7至10之序列的重鏈可變域以及一選自序列辨識編號11至17之序列的輕鏈可變域；其中該人類或擬人化抗體的至少一作用功能係在作用细胞或補體組分之存在下被誘發。

又換言之，本發明係有關於一種專一性地辨識CXCR4之人類或擬人化抗體、含有CH2之結合片段，其係供用於治療與存在有表現CXCR4之癌症細胞相關的病理狀態；該人類或擬人化抗體包含一選自序列辨識編號7至10之序列的重鏈可變域以及一選自序列辨識編號11至17之序列的輕鏈可變域；其中該人類或擬人化抗體的至少一作用功能係在作用细胞或補體組分之存在下被誘發。

單株抗體係已知會在各重鏈的恆定區中被N-醣化。特定醣化變異體已顯示出會影響ADCC。例如，IgG1s之較低的海藻糖基化係關聯於增加的ADCC(Shields et al.,J Biol Chem.,277(30)：26733-2640,2002；Shinkawa et al.,J Biol Chem.,278(5)：3466-3473,2003)。

半乳糖位準與CDC活性之間的顯著關聯係被觀察到。例如，利妥昔單抗(rituximab)之CDC活性係隨減少半乳糖含量而減少(Hodoniczky et al,Biotechnol Prog.,21(6)：1644-1652,2005)。

用於ADCC及CDC實驗之hz515H7 Mab的代表性醣化態勢係顯示於下表5。

令人驚異地，依據本發明之Hz515H7 Mab係在表現CXCR4之細胞上誘發高百分比的ADCC及CDC，即使將近92%之其醣鏈係包含海藻糖殘基。

因此，本發明亦有關於一種藉由殺死表現CXCR4之癌症細胞來治療癌症的方法，其包含之步驟為：投與一有效量的一人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段；該人類或擬人化抗體包含如下之聚醣態勢：

其中該人類或擬人化抗體的至少一作用功能係在作用细胞或補體組分之存在下被誘發。

本發明亦有關於一種結合CXCR4之擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段，其係供用於藉由殺死表現CXCR4之癌症細胞來治療癌症的方法中；該人類或擬人化抗體包含如下之聚醣態勢：其中該人類或擬人化抗體的至少一作用功能係在作用细胞或補體組分之存在下被誘發。

本發明亦有關於一結合CXCR4之擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段的用途，該人類或擬人化抗體包含如下之聚醣態勢：用於製備一藥物以供藉由殺死表現CXCR4之癌症細胞來治療癌症，其中該人類或擬人化抗體的至少一作用功能係在作用细胞或補體組分之存在下被誘發。

如顯示於此中實例者，本發明之人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段係至少透過誘發ADCC及/或CDC反應而具有抗腫瘤活性，且因此有效用於治療轉移型腫瘤和疾病，諸如癌症。

術語"治療(treating)"或“治療(treatment)”指的是此中所描述之組成物的投與或投藥，其投與或投藥之量、方式、及/或模式係有效於改良與一異常相關的狀態、症狀、或參數，或有效於預防該異常之病程或惡化(包括該異常所致使之二次傷害)，至統計上顯著的程度或至熟習此技藝者可偵測的程度。

本發明之另一方面係有關於具該人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段的藥學組成物。

本發明之藥學組成物可，除了含有載劑及該人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段外，還含有各種稀釋劑、填充劑、鹽類、緩衝液、穩定劑、助溶劑、及其他此技藝中已熟知的材料。

當使用於此中，"藥學上可接受的載劑"包括任一及所有溶劑、緩衝液、鹽溶液、分散介質、塗料、抗菌及抗真菌藥劑、等張及吸收延遲藥劑、以及生理上可相容的相似者。載劑類型之選擇可基於所意欲的投藥路徑。在各種實施態樣中，該載劑係合適於靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、局部、透皮或口腔投藥。藥學上可接受的載劑包括無菌水溶液或分散液及供即席製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。供藥學活性物質所用之介質及藥劑的使用係已熟知於此技藝中。如此下所詳述者，額外的活性化合物亦可被併入於組成物中，諸如抗癌及/或抗血管生成藥劑；特別地，該額外的活性化合物可為一抗血管生成藥劑、一化學治療藥劑、或一低分子量藥劑。供靜脈內灌注的典型藥學組成物可被組成為含有250 ml無菌林格氏(Ringer's)溶液、及100 mg之該組合。用於製備可非經口投與之化合物的實際方法對熟習此技藝者而言將為已知或明顯，且係更詳細地描述於，例如，Remington's Pharmaceutical Science,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1985)以及其第18和19版本，其等係併入此中以作為參考。

組成物中之人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段較佳係被調配呈一有效量。一"有效量"指的是一在劑量及若干時間時期下有效達到所欲結果，諸如誘發腫瘤細胞之細胞凋亡，所需的量。一“治療有效量”意指一足夠影響特別疾病狀態之療程的量。一治療有效量亦為藥劑之治療上有利作用比起任何毒性或有害作用更為重要者。

就治療應用，本發明之人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段係被投與至哺乳類，較佳為人類，且呈諸如那些論述於上之一藥學上可接受的劑型，包括那些可被投與至人類靜脈內如一大丸劑(bolus)者，或者藉由在一段時間內連續灌注，藉由肌內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑液膜內、椎管內、口腔、局部或吸入路徑。該人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段亦適合藉腫瘤內、腫瘤周圍、病灶內、或病灶周圍路徑投與以發揮局部以及全身性治療作用。腹膜內路徑係被預期是特別有效用於，例如，治療卵巢腫瘤。

劑量攝生法可被調整以提供最適反應。例如，一單一大丸劑可被投與，數個分開用量可在一段時間內被投與，或用量可成比例地被減少或增加。本發明之組成物可被投與至一個體以在一個體中影響細胞生長活性。當使用於此中，術語"個體"係意欲包括細胞凋亡可被誘發的活生物體，且明確地包括哺乳類，諸如兔子、狗、貓、小鼠、大鼠、猴子、其等之轉殖種類、及較佳為人類。

本發明之人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段、以及本發明之藥學組成物係尤其有效用於治療或預防數種類型的癌症，包括(但不限於)下列：惡性瘤及腺癌，包括膀胱、乳房、結腸、頭頸、前列腺、腎臟、肝臟、小卵巢、胰臟、胃、子宮頸、甲狀腺及皮膚之惡性瘤及腺癌；且包括鱗狀細胞惡性瘤；淋巴系譜之造血腫瘤，包括多發性骨髓瘤、白血病、急性和慢性淋巴細胞(或淋巴)白血病、急性和慢性淋巴胚細胞白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(如，伯奇氏淋巴瘤)；骨髓系譜之造血腫瘤，包括急性和慢性骨髓性(骨髓或骨髓細胞)白血病、及前骨髓細胞白血病；間質起源之腫瘤，包括纖維肉瘤、骨肉瘤及橫紋肌肉瘤；中樞及週邊神經系統之腫瘤，包括星狀細胞瘤、神經胚細胞瘤、神經膠質瘤、及神經鞘瘤；以及其他腫瘤，包括黑色素瘤、畸形癌、著色性乾皮病、角質棘皮瘤、及精細胞瘤；以及其他終被決定有CXCR4表現之癌症。就具有CXCR4表現之癌症，其在此中指的是相對於正常成體細胞上之CXCR4表現位準，展現出高CXCR4表現的癌症。

本發明之人類或擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段、及本發明之藥學組成物係主要有效用於治療白血病、淋巴瘤及對常使用的抗癌藥劑有抗性的癌症，因為本發明之抗CXCR4抗體具有獨特的作用機制。

在本發明方法之一較佳實施態樣中，該與存在有表現 CXCR4之癌症細胞相關的病理狀態係由淋巴瘤、白血病或多發性骨髓瘤構成，優先為淋巴瘤。

換言之，依據本發明之用途的特徵係在於該與存在有表現CXCR4之癌症細胞相關的病理狀態係由淋巴瘤、白血病或多發性骨髓瘤構成，優先為淋巴瘤。

又換言之，依據本發明之人類或擬人化抗體的特徵係在於該與存在有表現CXCR4之癌症細胞相關的病理狀態係由淋巴瘤、白血病或多發性骨髓瘤構成，優先為淋巴瘤。

作為一非限制性實例，一種於活體外偵測個體中表現CXCR4之腫瘤之存在及/或定位的工序係包含下列步驟：(a)使來自該個體的一樣本與依據能夠專一性地與CXCR4結合的一擬人化抗體重鏈及/或一擬人化抗體輕鏈及/或一擬人化抗體、或其等之一衍生化合物或功能性片段接觸；及(b)偵測該抗體與該樣本之結合。

特別地，一種以活體外或擬體內來測定一個體之表現CXCR4之腫瘤中CXCR4表現位準的工序係包含下列步驟：(a’)使來自該個體的一樣本與能夠專一性地結合至CXCR4的一擬人化抗體重鏈及/或一擬人化抗體輕鏈及/或一擬人化抗體、或其等之一衍生化合物或功能性片段接觸；及(b’)量化該樣本中抗體結合至CXCR4的位準。

在一較佳實施態樣中，該CXCR4表現位準可藉由免疫組織化學(IHC)或FACS分析來測量。

當使用於此中，術語"一與CXCR4之表現相關的致癌異常”或“表現CXCR4之癌症細胞”係意欲包括疾病及其他異常，其中患有該異常之個體中高位準或反常低位準之CXCR4(畸變)的存在已被顯示出或被懷疑是要對該異常之病理生理負責，或已被顯示出或被懷疑是一個對該異常之惡化有貢獻的因子。任擇地，此等異常可藉由，例如，患有該異常之個體受影響細胞或組織中細胞表面上CXCR4位準的增加來予以證明。該CXCR4位準的增加可使用，例如，本發明之抗體515H7或hz515H7來偵測。再者，其指的是展現出相對自主生長，以致展現出以細胞增殖控制之顯著喪失為特徵之畸變生長表現型的細胞。任擇地，該等細胞可表現正常位準的CXCR4，但被標記為反常增殖。

本發明亦描述一種用於篩選結合CXCR4之擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段，以供用於藉由在作用细胞或補體組分之存在下誘發至少一作用功能來殺死表現CXCR4之癌症細胞的方法，其中該方法包含至少一選擇步驟選自於：- 選擇，在培育4小時時期之後，於RAMOS淋巴瘤細胞上誘發至少40%之ADCC位準的抗體；- 選擇，在培育1小時時期之後，於RAMOS淋巴瘤細胞上誘發至少30%，優先為至少50%，且最佳為至少70%之CDC位準的抗體；- 選擇，在培育1小時時期之後，於NIH3T3 CXCR4細胞上誘發至少30%，優先為至少50%，且最佳為至少70%之CDC位準的抗體； - 選擇以依據朗謬模型為1與10 nM之間的解離常數(KD)結合FcγRI的抗體；- 選擇以依據異質配位子模型為200與1000 nM之間的解離常數(KD)結合FcγRIIIA的抗體。

本發明之實施，除非另有其他指明者，係採用習用技術或蛋白質化學、分子病毒學、微生物學、重組DNA技術、及藥理學，其等係在此技藝之技能內。此等技術係完全闡明於文獻中。(見Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Eds.,John Wiley & Sons,Inc.New York,1995；Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985；及Sambrook et al.,Molecular cloning：A laboratory manual 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press-Cold Spring Harbor,NY,USA,1989；Introduction to Glycobiology,Maureen E.Taylor,Kurt Drickamer,Oxford Univ.Press(2003)；Worthington Enzyme Manual,Worthington Biochemical Corp.Freehold,NJ；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins,Vol I 1976 CRC Press；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins,Vol II 1976 CRC Press；Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999))。相關使用之命名法、及實驗室程序和描述於此中之分子與細胞生物學、蛋白質生物化學、酵素學及醫藥和藥學化學的技術係為那些此技藝中已熟知且常使用者。

除非另有界定，此中所用的所有技術及科學術語具有相同於本發明所屬技藝中具有技能者常理解的意義。

本發明之其他特徵和優點係進一步出現於實例與圖示之說明中，該等圖示之圖例說明係呈現於下。

圖式簡單說明

第1圖係顯示出515H7重鏈可變域與人類生殖系(germline)IGHV3-49^＊04和IGHJ4^＊01之胺基酸序列排比。該515H7 VH之胺基酸序列係與經選擇之人類接受體架構序列排比。VH1及VH2(VH3未表述)之序列係對應於經執行擬人化之515H7 VH域變異體，有經回復突變之殘基以粗體呈現。變異體1，VH1，係未攜載經回復突變之殘基且代表一完全人類之變異體。變異體VH2具有8個回復突變且係最鼠類之變異體。變異體VH3係攜載5個回復突變(未表述)。

第2圖係顯示出515H7輕鏈與人類生殖系IGKV4-1^＊01和IGKJ1^＊01之胺基酸序列排比。該515H7 VL之胺基酸序列係與經選擇之人類接受體架構序列排比。VL1至VL3之序列係對應於經執行擬人化之515H7 VL域變異體，有經回復突變之殘基以粗體呈現。變異體VL1係未攜載經回復突變之殘基且代表最人類之變異體。變異體VL2具有13個回復突變且係最鼠類之變異體。變異體VL3係攜載5個回復突變。

第3A-3F圖係顯示出以嵌合515H7及擬人化515H7之不同變異體所為之生物素標記鼠類抗體515H7的交叉封阻(cross blocking)。515H7之擬人化變異體(hz515H7)去交叉封阻親本鼠類抗體515H7之活性係藉由流式細胞計數法使用CXCR4轉染之NIH3T3細胞來評估。該等擬人化變異體之活性係與該嵌合515H7比較。組合以嵌合VL(cVL)之三種不同 VH變異體(VH1-VH3)之交叉封阻活性係非常類似(第3A圖-第3C圖)。當組合以VL之變異體1及2時，所測定之VH變異體1(VH1，未有回復突變之變異體)的活性並未減少。就建構物hz515H7 VH1 VL3則偵測到活性的顯著減少(第3D-3F圖)。

第4圖係顯示出用於檢驗擬人化抗體515H7變異體VH1 VL1之活性的BRET檢定。該擬人化變異體515H7 VH變異體1 VL變異體1(hz515H7 VH1 VL1)的活性係以其抑制SDF-1媒介之信號轉導的能力來評估。如以BRET測定，此變異體顯示出僅微量抑制SDF-1媒介之信號轉導。SDF-1之使用濃度係為100nM。

第5A-5D圖係顯示出具有單一或雙回復突變之VH1不同突變體的比較以及不同VL變異體與hz515H7 VH1D76N之組合的比較。單一及雙回復突變係於VH1中造出且組合以VL1。此等建構物係於BRET檢定中評估(第5A-5C圖)。在此等單一回復突變體中，僅具有回復突變D76N之建構物顯示出增加抑制SDF-1媒介之信號轉導。VH之雙回復突變體無一者具有強抑制活性(第5C圖)。VH1之單一回復突變體D76N係組合以不同的VL變異體。該SDF-1之濃度係為100nM。

第6圖係顯示出具有單一或雙回復突變之VH1及VL1的不同突變體相較於建構物VH1 D76N VL2的排序。單一及雙回復突變係在VH1中造出且組合以VL1。所有建構物係於BRET檢定中評估，並計算其等之抑制百分比。該SDF-1之濃度係為100nM。

第7A-7B圖係顯示出擬人化515H7之不同建構物對SDF-1結合之抑制及以FACS及BRET所獲得結果之間的關聯。具有強活性於封阻β-視紫紅質抑制蛋白(β-arrestin)補充(recruitment)之擬人化抗體515H7之不同變異體係被檢驗其等於流式細胞計數法(FACS)中抑制生物素標記SDF-1結合的能力(A)。此等係與VH1及VL1比較。來自FACS為主之檢定結果係關聯於BRET所獲得的結果(B)。

第8圖係顯示出hz515H7 VL2與進一步擬人化版本515H7 VL2.1、515H7 VL2.2及515H7 VL2.3的胺基酸序列排比。該515H7 VL胺基酸序列係與經選擇的人類接受體架構序列排比。VL2.1、VL2.2及VL2.3之序列係對應於經執行擬人化之擬人化515H7 VL2的變異體，有經突變的殘基以粗體呈現。VL2.1及VL2.2係攜載4個以上的擬人化殘基，而VL2.3係含有5個以上的人類殘基。

第9A-9C圖係顯示出515H7擬人化Mabs(hz515H7 VH1 D76N VL2、hz515H7 VH1 D76N VL2.1、hz515H7 VH1 D76N VL2.2及hz515H7 VH1 D76N VL2.3)係專一性地結合至NIH3T3-CXCR4細胞(第9A圖)、U937細胞(第9B圖)及Ramos細胞(第9C圖)上的CXCR4。

第10圖係顯示出hz515H7VH1D76NVL2 Mab在表現CXCR4之細胞，Ramos細胞(第10A圖)及自然殺手細胞(NK)(第10B圖)，上的抗體依賴型細胞性細胞毒性(ADCC)作用。

第11圖係顯示出c515H7 Mab在表現CXCR4之細胞，Ramos細胞(第11A圖)及自然殺手細胞(NK)(第11B圖)，上的抗體依賴型細胞性細胞毒性(ADCC)作用。

第12圖係顯示出hz515H7VH1D76NVL2 Mab在NIH3T3-CXCR4細胞株及表現CXCR4之Ramos細胞上的補體依賴型細胞毒性(CDC)作用。

第13圖係顯示出c515H7 Mab在表現CXCR4之Ramos細胞上的補體依賴型細胞毒性(CDC)作用。

第14圖係顯示出hz515H7VH1D76NVL2(第14A圖)及c515H7(第14B圖)Mabs在表現CXCR4之Ramos細胞上的補體依賴型細胞毒性(CDC)用量作用。

第15圖：重組人類FcγRI與固定於一CM4感測晶片上之hz515H7VH1D76NVL2 Mab的結合。6種不同濃度的h-FcγRI係被檢驗(200、100、50、25、12.5及6.25 nM)。

第16圖：重組人類FcγRIIIA與固定於一CM4感測晶片上之hz515H7VH1D76NVL2 Mab的結合。5種不同濃度的h-FcγRIIIA係被檢驗(1000、500、250、125及62.5 nM)。

第17圖：h-FcγRIIIA/hz515H7VH1D76NVL2複合物藉使用締合相端反應相對於人類FcγRIIIA濃度(1000、500、250、125及62.5 nM)作圖之穩定狀態分析的解離常數測定。

第18圖：重組小鼠FcγRI與固定於一CM4感測晶片上之hz515H7VH1D76NVL2 Mab的結合。5種不同濃度的m-FcγRI係被檢驗(400、200、100、50及25 nM)。

第19圖：m-FcγRI/hz515H7VH1D76NVL2複合物藉使用締合相端反應相對於小鼠FcγRI濃度(400、200、100、50及25 nM)作圖之穩定狀態分析的解離常數測定。

第20圖：重組小鼠FcγRIII與固定於一CM4感測晶片上之hz515H7VH1D76NVL2 Mab的結合。5種不同濃度的m-FcγRIII係被檢驗(400、200、100、50及25 nM)。

第21圖：四種Fcγ受體與hz-515H7VH1D76NVL2 Mab之結合(以h-FcγRI及m-FcγRIII為一組分以及以h-FcγRIIIA及m-FcγRI為兩組分)基於解離常數(單位為nM)對hz515H7VH1D76NVL2 Mab/Fcγ受體複合物之半衰期(單位為分鐘)作圖的排序。

第22圖：重組人類FcγRI與固定於一CM4感測晶片上之c515H7 Mab的結合。6種不同濃度的h-FcγRI係被檢驗(200、100、50、25、12.5及6.25 nM)。

第23圖：重組人類FcγRIIIA與固定於一CM4感測晶片上之c515H7 Mab的結合。5種不同濃度的h-FcγRIIIA係被檢驗(1000、500、250、125及62.5 nM)。

第24圖：h-FcγRIIIA/c515H7複合物藉使用締合相端反應相對於人類FcγRIIIA濃度(1000、500、250、125及62.5 nM)作圖之穩定狀態分析的解離常數測定。

第25圖：重組小鼠FcγRI與固定於一CM4感測晶片上之c515H7 Mab的結合。5種不同濃度的m-FcγRI係被檢驗(400、200、100、50及25 nM)。

第26圖：m-FcγRI/c515H7複合物藉使用締合相端反應相對於小鼠FcγRI濃度(400、200、100、50及25 nM)作圖之穩定狀態分析的解離常數測定。

第27圖：重組小鼠FcγRIII與固定於一CM4感測晶片上之c515H7 Mab的結合。5種不同濃度的m-FcγRIII係被檢驗(400、200、100、50及25 nM)。

第28圖：四種Fcγ受體與c515H7 Mab之結合(以h-FcγRI及m-FcγRIII為一組分以及以h-FcγRIIIA及m-FcγRI為兩組分)基於解離常數(單位為nM)對c515H7 Mab/Fcγ受體複合物之半衰期(單位為分鐘)作圖的排序。

第29圖係顯示出hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7)Mab在表現CXCR4之細胞：RAMOS、DAUDI及HeLa細胞上的抗體依賴型細胞性細胞毒性(ADCC)作用。

第30圖係顯示出hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7)Mab在表現CXCR4之細胞：DAUDI及RAMOS細胞上的補體依賴型細胞毒性(CDC)作用。

較佳實施例之詳細說明 實例1：產生對抗人類CXCR4之單株抗體(Mabs)

為產生針對CXCR4之單株抗體，Balb/c小鼠係以重組NIH3T3-CXCR4細胞及/或對應於CXCR4細胞外N端(N-term)及環(loops)的胜肽來免疫。6-16週年齡的小鼠在該第一免疫時係以在弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant)中的抗原皮下(s.c.)免疫一次，隨後為以弗氏不完全佐劑中的抗原s.c.免疫2至6次。免疫反應係藉眼窩採血技術(retroorbital bleeds)監測。血清係以ELISA(如描述於下者)篩選，而具有較高抗CXCR4抗體力價(titer)的小鼠係被用於融合(fusions)。小鼠係在犧牲及移除脾臟之前兩天以靜脈內追加(boost)抗原。

-ELISA

為選擇出產出抗CXCR4抗體的小鼠，來自免疫小鼠的血清係以ELISA檢驗。簡言之，微量滴定盤係被塗覆以經純化之接合至BSA的[1-41]N-端胜肽，以5μg等效胜肽/mL、100μL/井培育於4℃過夜，接著以250μL/井之PBS中的0.5%明膠封阻。被CXCR4免疫之小鼠的血漿稀釋物係被添加至各井且於37℃下培育2小時。該等盤係以PBS洗滌且接著以一接合至HRP的山羊抗小鼠IgG抗體(Jackson Laboratories)於37℃下培育達1小時。在洗滌之後，該等盤係以TMB受質顯影，該反應係在5 min後藉添加100 μL/井之1M H₂SO₄來停止。顯影出最高力價之抗CXCR4抗體的小鼠係被用以產生抗體。

-產生可產出針對CXCR4之Mabs的融合瘤

分離自顯影出最高力價之抗CXCR4抗體的Balb/c小鼠的小鼠脾細胞係以PEG融合至一小鼠骨髓瘤細胞株Sp2/O。細胞係以大約1x 10⁵/井置於微量滴定盤中，隨後為培育於含有超培養基+2 mM L-麩醯胺酸+1 mM丙酮酸鈉+1x HAT的選擇性培養基中兩週。各井接著係以ELISA來篩選抗CXCR4單株IgG抗體。分泌抗體之融合瘤接著係藉限制性稀釋次選殖(subcloned)至少兩次，培養於活體外以產生供進一步分析之抗體。

實例2：藉FACS分析抗CXCR4 Mab 515H7的結合專一性及癌症細胞株辨認來特徵化

在此實驗中，抗CXCR4 Mab 515H7之至人類CXCR4的專一性結合係以FACS分析來檢視。

NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4轉染細胞、MDA-MB-231、Hela及U937癌症細胞株係與10 μg/mL單株抗體515H7一起培育。該等細胞接著係以1%BSA/PBS/0.01% NaN3洗滌。然後，經亞力山標誌(Alexa-labeled)之二級抗體係被添加至該等細胞且係容許在4℃下培育達20 min。該等細胞接著係再洗滌兩次。在第二次洗滌過後，FACS分析係被執行。此等結合研究之結果係提供於下表6，其顯示[FACS所獲得的平均螢光強度(MFI)]：抗CXCR4 Mab 515H7係專一性地結合至人類CXCR4-NIH3T3轉染細胞株，卻未辨認出親代NIH3T3細胞。此Mab亦能夠辨認人類癌症細胞株，例如，MDA-MB-231乳房癌症細胞、U937前骨髓細胞癌症細胞及Hela子宮頸癌症細胞。

抗CXCR4 Mab 515H7辨認出NIH3T3-hCXCR4轉染體，而未辨認出親代NIH3T3野生型細胞。Mab 515H7亦能夠辨認癌症細胞株。

實例3：擬人化515H7抗CXCR4鼠類抗體 一般程序

515H7抗CXCR4抗體之擬人化係藉應用CDR-移植(CDR-grafting)之總體規則來執行。免疫遺傳分析及CDR和架構(FR)區之界定係藉應用IMGT獨特編號方案以及IMGT 庫和工具(Lefranc,1997-www.imgt.org)來執行。

擬人化工序之效率係藉生物發光共振能量轉移(BRET)檢定檢驗經工程操作抗體就其等對β-視紫紅質抑制蛋白之SDF-1媒介補充之抑制能力的功能性活性來評估。在此檢定中，CXCR4係標有螢光素酶，而β-視紫紅質抑制蛋白標有YFP。β-視紫紅質抑制蛋白之SDF-1媒介補充至CXCR4是CXCR4信號轉導中的一重要步驟。515H7擬人化變異體之結合亦在穩定地轉染有人類CXCR4之NIH3T3細胞株上測定。該結合活性係藉與生物素標記小鼠抗體之競爭檢定來評估。在一第二企圖中，擬人化抗體係就其等對生物素標記SDF-1之結合至RAMOS細胞的抑制能力來評估。RAMOS細胞被挑選出是因為其等之高表現的CXCR4及低表現的CXCR7和SDF-1。

此等檢定係用以特徵化抗CXCR4抗體的重組擬人化版本。可變域係被安排(formatted)以人類IgG1/k恆定域且被選殖至哺乳動物表現載體pCEP中。重組IgG₁/κ衍生抗體係短暫地表現於HEK293細胞中。表現培養上清液係被過濾且抗體係使用蛋白質A瓊脂糖凝膠(sepharose)來純化。經純化抗體係重新緩衝(re-buffered)於PBS中且抗體濃度係藉ELISA測定。

擬人化515H7可變域

為了選擇恰當的人類生殖系以供CDR移植，與515H7 VH鼠類序列具有最高同源性的人類生殖系基因係被識別出。在IMGT資料庫及工具的幫助下，人類IGHV3-49^＊04生殖系基因及人類IGHJ4^＊01 J生殖系基因係被選擇作為供鼠類515H7 VH CDRs所用之人類接受體序列。該人類V-基因IGHV3-49^＊04與小鼠515H7重鏈可變域之V-基因具有80.27%的同源性。就該人類J-基因IGHJ4^＊01 J之同源性為87.50%。挑選出的人類生殖系基因與小鼠抗體515H7的VH域之間有十九個殘基不同。該親本抗體VH域與該等生殖系序列之間的排比係敘述於第1圖。

關於輕鏈之可變域，人類生殖系基因IGKV4-1^＊01及IGKJ1^＊01係被選擇(第2圖)。與人類V-基因IGKV4-1^＊01之同源性係為79.12%。515H7輕鏈J-基因與人類J-基因IGKJ1^＊01具有84.85%的同源性。

經轉譯之人類生殖系基因IGHV3-49^＊04及IGKV4-1^＊01的胺基酸序列係被用以識別已被結晶化的同源抗體。就重鏈，在RCSB蛋白質資料庫(RCSB Protein Data Bank)具有登錄編號1MAM的抗體係被挑選出作為一模型；而就輕鏈，抗體1SBS係被挑選出。該兩域係使用電腦程式DS視像(visual)彙編(assembled)且使用作為供擬人化抗體515H7所用之模型。

基於親本抗體與對應人類生殖系序列之間不同之各殘基的位置，一優先順序係授予給人類與小鼠序列之間有差異的各殘基(第1及2圖)。此等優先者係用以創出各擬人化可變域之三個不同變異體，分別命名為VH1、VH2及VH3。

在一第一系列實驗中，係建構出且分析該三個第一擬人化變異體的抗CXCR4結合活性。該VH變異體1(VH1)係組合以鼠類VL，且此等建構物係被評估其等對生物素標記鼠類515H7親本抗體之結合的抑制能力。所有建構物係顯示出類似之與鼠類抗體競爭的能力(第3A-C圖)。此指出最人類之VH變異體具有與較不人類之變異體相同的結合能力。是以，VH1係組合以VL之三個不同變異體(第3D-F圖)。僅VH1與VL3之組合顯示出減少之與生物素標記鼠類抗體競爭的能力，而架構中未攜載回復突變的最人類變異體VH1 VL1係顯示出與嵌合抗體相同的交叉封阻活性。

此變異體VH1 VL1係被進一步在BRET檢定中檢驗其對β-視紫紅質抑制蛋白之SDF-1媒介補充的抑制能力(第4圖)。儘管有如藉親本抗體之交叉封阻所測定的合意受體結合活性，該建構物VH1 VL1僅顯示出對β-視紫紅質抑制蛋白之補充的微弱抑制。此強抑制活性之欠缺使得人類架構殘基之取代以鼠類殘基變為必需。單一回復突變係就VH 1來建構。下列殘基係被取代：V48L、E61D、D76N及A81L(編號係依據一級胺基酸序列)。變異體VH1之此等單一回復突變體係組合以變異體VL1。在其中，僅回復突變D76N造成如藉BRET檢定所評估之增加對信號轉導的抑制(第5B圖)。

為增加此建構物的活性且進一步評估其他殘基的重要性，不同雙回復突變體係就VH1來建構。此等建構物之抑制活性係輕微地改良(平均抑制為約45-50%)，但未令人滿意(第5C圖)。所述單一回復突變體D76N係接著組合以三個不同的VL變異體(第5D圖)。建構物hz515H7 VH D76N VL2顯示出平均88.2%的活性，為在與嵌合抗體相同的範圍中。

單一及雙回復突變係被建構於變異體VL1域中且係與建構物hz515H7 VH1 D76N VL2之活性比較(第6圖)。所檢驗的組合中無一者具有與該建構物類似或更好的活性。

架構中人類殘基之百分比係就hz515H7 VH1 D76N VL2來計算：其在180個殘基中含有14個非人類殘基，等於一92.2%的«胚指標(germinality index)»。作為比較，擬人化及市售抗體貝伐單抗(bevacizumab)和曲妥珠單抗(trastuzumab)分別在其等之可變域中含有30及14個非人類殘基。

顯示出抑制SDF-1媒介β-視紫紅質抑制蛋白補充之最強效力的四種最佳擬人化形式亦被檢驗其等對生物素標記SDF-1之結合的抑制能力(第7A圖)。SDF-1結合與β-視紫紅質抑制蛋白補充之抑制的緊密關聯係被測定出。此關聯指出SDF-1結合之抑制是抑制信號轉導最可能的主要機制。

為了進一步擬人化hz515H7 VL2變異體，三種額外變異體係藉由使用第6圖中評估雙及三突變體所得到的資訊來設計。變異體VL2.1、VL2.2及VL2.3(亦被指稱為VL2-1、VL2-2及VL2-3)分別有四及五個額外殘基被擬人化。其等對應於殘基D9、P49、D66、S69、S83、L84、V89。此三種變異體與VL2比較之排比係顯示於第8圖。

此等VL2變異體對β-視紫紅質抑制蛋白之SDF-1媒介補充的抑制能力係被評估。該等擬人化hz515H7 VH D76N VL2、VL2.1、VL2.2及VL2.3變異體顯示出類似於嵌合抗體c515H7的活性(第6圖)。

實例4：藉FACS分析抗CXCR4擬人化Mabs 515H7的結合專一性及癌症細胞株辨認來特徵化

在此實驗中，抗CXCR4擬人化Mabs 515H7之至人類CXCR4的專一性結合係以FACS分析來檢視。

NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4轉染細胞及Ramos、U937癌症細胞株係與0至10 μg/mL的擬人化Mabs 515H7(hz515H7 VH1 D76N VL2、hz515H7 VH1 D76N VL2.1、hz515H7 VH1 D76N VL2.2及hz515H7 VH1 D76N VL2.3)一起在黑暗中於4℃下培育於100 μl Facs緩衝液中達20 min。在Facs緩衝液中之3次洗滌之後，細胞係與二級抗體，山羊抗人類亞力山488(稀釋1/500)，一起在黑暗中於4℃下培育達20分鐘。在Facs緩衝液中之3次洗滌之後，碘化丙啶係被添加於各井中且僅有活細胞係藉由Facs來分析。至少5000個活細胞係被評定以評估各條件下螢光強度的均值。

此等結合研究之結果係提供於第9A-9C圖，其顯示[FACS所獲得的平均螢光強度(MFI)]：抗CXCR4擬人化Mabs hz515H7係專一性地結合至人類CXCR4-NIH3T3轉染細胞株(第9A圖)(就NIH3T3親代細胞之MFI=2.2)且亦辨認人類癌症細胞株，例如，U937(第9B圖)及Ramos(第9C圖)。

實例5：hz515H7VH1D76NVL2 Mab在表現CXCR4之細胞上的抗體依賴型細胞性細胞毒性(ADCC)作用

ADCC係以乳酸去氫酶(LDH)釋放檢定使用細胞毒性偵測套組^PLUS(Cytotoxicity Detection Kit^PLUS，Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA)而依據製造商之指示來測量。乳酸去氫酶是細胞凋亡或壞死所導致膜完整性喪失過後被釋放至培養基中的一種可溶細胞溶質酵素。是以，LDH活性可被使用作為細胞膜完整性的指標且作為評定包括ADCC之細胞毒性的一般手段。

周邊血液單核細胞(PBMC)係使用聚蔗糖(Ficoll)密度梯度(Ficoll-Paque PLUS,GE Healthcare,Amersham,UK)分離自從健康供體獲得的人類膚色血球層(human buffy coats)。自然殺手(NK)細胞係依據RoboSep®人類NK細胞濃化套組製造商的規程(StemCell Technologies)分離自該PBMC部分。NK細胞係置於96-井平底盤中，作用物對標靶比率為50：1，每井50 μL。已與抗體於室溫下預培育達10 min的10000個標靶細胞(Ramos)係被添加於作用细胞上，50 μL/井。在37℃下培育達4 h之後，細胞毒性係藉由測量LDH釋放量來測定。細胞毒性百分比係計算如下：%溶解=[實驗釋放-作用物及標靶自發性釋放]/[標靶最大釋放-標靶自發性釋放]x 100。

第10圖顯示出在表現高位準CXCR4之Ramos細胞上及在單獨NK細胞上的ADCC[CXCR4位準(MFI)：Ramos>NK細胞]。黑色柱狀物：Hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7VL2)(10 μg/mL)；白色柱狀物：同型控制組hIgG1(10 μg/mL)。當細胞係與hIgG1同型控制組一起培育時，未有作用被觀察到(第10A及10B圖)。相對地，hz515H7VH1D76NVL2 Mab係能夠誘發顯著的ADCC(47.9%+/-8.9)於Ramos細胞上(第10A圖)，而卻無顯著的ADCC(3%+/-3)在表現低位準 CXCR4的NK細胞上(第10B圖)。

實例6：c515H7 Mab在表現CXCR4之細胞上的抗體依賴型細胞性細胞毒性(ADCC)作用

ADCC係以乳酸去氫酶(LDH)釋放檢定使用細胞毒性偵測套組^PLUS(Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA)而依據製造商之指示來測量。

周邊血液單核細胞(PBMC)係使用聚蔗糖密度梯度(Ficoll-Paque PLUS,GE Healthcare,Amersham,UK)分離自從健康供體獲得的人類膚色血球層。自然殺手(NK)細胞係依據RoboSep®人類NK細胞濃化套組製造商的規程(StemCell Technologies)分離自該PBMC部分。NK細胞係置於96-井平底盤中，作用物對標靶比率為50：1，每井50 μL。已與抗體於室溫下預培育達10 min的10000個標靶細胞(Ramos)係被添加於作用细胞上，50 μL/井。在37℃下培育達4 h之後，細胞毒性係藉由測量LDH釋放量來測定。細胞毒性百分比係計算如下：%溶解=[實驗釋放-作用物及標靶自發性釋放]/[標靶最大釋放-標靶自發性釋放]x 100。

第11圖顯示出在表現高位準CXCR4之Ramos細胞上及在單獨NK細胞上的ADCC[CXCR4位準(MFI)：Ramos>NK細胞]。黑色柱狀物：c515H7(10 μg/mL)；白色柱狀物：同型控制組hIgG1(10 μg/mL)。當細胞係與hIgG1同型控制組一起培育時，未有作用被觀察到(第11A及11B圖)。相對地，c515H7 Mab係能夠誘發顯著的ADCC(61.4%+/-8.1)於 Ramos細胞上(第11A圖)，而卻無顯著的ADCC(5.4%+/-4.6)在表現低位準CXCR4的NK細胞上(第11B圖)。

實例7：hz515H7VH1D76NVL2 Mab在表現CXCR4之細胞上的補體依賴型細胞毒性(CDC)作用

CDC檢定是基於使用CellTiter Glo試劑(Promega,Madison,WI,USA)的ATP測量。

簡言之，10000個標靶細胞係被置於hz515H7VH1D76NVL2存在下的96-井平底盤中。在室溫培育達10分鐘過後，自健康供體儲集的(pooled)人類血清係以10%之最終濃度添加。在37℃下1h之後，活力係藉測量ATP量來測定。細胞毒性百分比係計算如下：%細胞毒性=100-[[實驗/無抗體標靶細胞]x 100]。

第12圖顯示出在表現高位準CXCR4之Ramos及NIH3T3-CXCR4細胞株上的CDC。黑色柱狀物：Hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7VL2)(10 μg/mL)；白色柱狀物：同型控制組hIgG1(10 μg/mL)。當細胞係與hIgG1同型控制組一起培育時，未有作用被觀察到(第12圖)。相對地，hz515H7VH1D76NVL2 Mab係能夠誘發顯著的CDC(將近80%)於NIH/3T3CXCR4及RAMOS兩者細胞株上(第12圖)。

實例8：c515H7 Mab在表現高位準CXCR4之Ramos細胞上的補體依賴型細胞毒性(CDC)作用

簡言之，10000個Ramos細胞係被置於Mabs存在下的96-井平底盤中。在室溫培育達10分鐘過後，自健康供體儲集的人類血清係以10%之最終濃度添加。在37℃下1h之後，活力係藉測量ATP量來測定。細胞毒性百分比係計算如下：%細胞毒性=100-[[實驗/無抗體標靶細胞]x 100]。

第13圖顯示出在表現高位準CXCR4之Ramos細胞株上的CDC。黑色柱狀物：c515H7(10 μg/mL)；白色柱狀物：同型控制組hIgG1(10 μg/mL)。當細胞係與hIgG1同型控制組一起培育時，未有作用被觀察到(第13圖)。相對地，c515H7 Mab係能夠誘發顯著的CDC(34%)於RAMOS細胞上(第13圖)。

實例9：hz515H7VH1D76NVL2及c515H7 Mabs在表現高位準CXCR4之Ramos細胞上的補體依賴型細胞毒性(CDC)用量作用

第14圖顯示出在表現高位準CXCR4之Ramos細胞株上的CDC。黑色柱狀物：hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7VL2)(第14A圖)或c515H7(第14B圖)(10 μg/mL)；白色柱狀物：同型控制組hIgG1(10 μg/mL)。當細胞係與hIgG1同型控制組一起培育時，未有作用被觀察到(第14A及14B圖)。相對地，hz515H7VH1D76NVL2(第14A圖)及c515H7(第14B圖)Mabs係能夠誘發顯著的CDC於Ramos細胞上，其等之CDC最高分別為74%及34%，其等之EC₅₀分別為0.033 μg/mL及0.04 μg/mL。

實例10：藉由即時表面電漿子共振來研究hz515H7VH1D76NVL2 Mab與h-FcγRI、h-FcγRIIIA、m-FcγRI和m-FcγRIII之間的交互作用

此等實驗係使用Biacore X裝置來實行。使用於此研究中之可溶形式的四種Fcγ受體係購自R&D Systems：

1-重組人類FcγRI[CD64]係對應於具有C端6-His標籤的Gln16-Pro288片段[目錄編號：1257-FC]。使用於此研究中之50 kDa的分子量(供應商所指明者)係對應於還原狀態中SDS-PAGE所界定出之分子量的平均。

2-重組人類FcγRIIIA變異體V[CD16a]係對應於具有C端6-His標籤的Gln17-Gln208片段[目錄編號：4325-FC]。使用於此研究中之45 kDa的分子量(供應商所指明者)係對應於還原狀態中SDS-PAGE所界定出之分子量的平均。

3-重組小鼠FcγRI[CD64]係對應於具有C端6-His標籤的Gln25-Pro297片段[目錄編號：2074-FC]。使用於此研究中之55 kDa的分子量(供應商所指明者)係對應於還原狀態中SDS-PAGE所界定出之分子量的平均。

4-重組小鼠FcγRIII[CD16]係對應於具有C端10-His標籤的Ala31-Thr215片段[目錄編號：1960-FC]。使用於此研究中之37.5 kDa的分子量(供應商所指明者)係對應於還原狀態中SDS-PAGE所界定出之分子量的平均。

其他試劑係由Biacore(GE Healthcare)供應。

1964 RU的hz515H7VH1D76NVL2 Mab係使用胺耦合套組化學固定於一CM4感測晶片之第二流動室(second flowcell,FC2)上。被NHS與EDC混合物活化及被乙醇胺去活化的第一流動室(FC1)係用作為參考表面以檢查並減去分析物(Fcγ受體)與該感測晶片矩陣之間的非專一性交互作用。

動力(kinetic)實驗係於攝氏25度下以30μl/min之流動速率來實行。HBS-EP緩衝液係使用作為泳動(running)緩衝液或者用於製備分析物溶液。該等分析物溶液係於90秒期間內(締合相)注射，有一90秒延遲(解離相)。如分析物之泳動緩衝液的注射係使用作為雙參考。所有感測圖(sensorgrams)係以此雙參考感測圖校準。

在分析物的各個注射之後，感測晶片係藉由注射NaOH溶液而再生：在h-FcγRI及m-FcγRIII之後注射20 mM NaOH溶液或在h-FcγRIIIA及m-FcγRI之後注射10 mM NaOH。

兩種數學模型係被使用以分析感測圖：“朗謬”及“異質配位子”模型。

以h-FcγRI獲得之感測圖[第15圖]並非完美地相稱於朗謬模型(5%<Chi2/Rmax<20%)，但“異質配位子”模型並未改良相稱品質。使用朗謬模型，解離常數係在奈莫耳範圍(0.9±0.1 nM)內。

以h-FcγRIIIA獲得的感測圖[第16圖]係清楚地未相稱於朗謬模型(Chi2/Rmax>20%)。“異質配位子”模型顯著地改良了相稱品質(Chi2/Rmax<5%)。依據此模型，hz515H7VH1D76NVL2 Mab Fc域可被視為兩組分之混合物。代表總量之79%的主要組分係顯示出在300與350nM之間的解離常數，而較少的組分(21%)係顯示出在27與32nM之間的解離常數。依據文獻，以h-FcγRIIIA所觀察到的異質性係可能連結至Mab Fc域上的醣化異質性。

一描繪締合相端RU反應平均(接近於Req)相對於h-FcγRIIIA濃度(C)的作圖可相稱於數學模型：Req=(K_A.C.R_max)/K_A.C.n+1)，其中n=1[第17圖]。對應於1/K_A之解離常數K_D係等於176 nM。

以m-FcγRI獲得的感測圖[第18圖]可相稱於朗謬模型(5%<Chi2/Rmax<10%)，但“異質配位子”模型顯著地改良了相稱品質(Chi2/Rmax<1%)。依據此模型，hz515H7VH1D76NVL2 Mab Fc域可被視為兩組分之混合物。代表總量之82%的主要組分係顯示出在75與80 nM之間的解離常數，而較少的組分(18%)係顯示出將近90 nM的解離常數。即使解離常數係相近，動力學速率係顯著不同(締合速率就主要組分係好5.7倍，但其解離速率係快4.8倍)。

一描繪締合相端RU反應平均(接近於Req)相對於m-FcγRI濃度(C)的作圖可相稱於數學模型：Req=(K_A.C.R_max)/(K_A.C.n+1)，其中n=1[第19圖]。對應於1/K_A之解離常數K_D係等於95 nM。

以m-FcγRIII獲得的感測圖[第20圖]係非完美地相稱於朗謬模型(5%<Chi2/Rmax<20%)，但“異質配位子”模型並未改良相稱品質。使用朗謬模型，解離常數係將近17和18 nM。

四種Fcγ受體的排序係呈現於描繪Kd對複合物半衰期作圖的第21圖。依照文獻，h-FcγRI係以高親和性結合至人類IgG1同型抗體的Fc部段，而h-FcγRIIIA係以較低親和性結合至人類IgG1同型抗體的Fc部段。m-FcγRIII係以在hz-515H7VH1D76NVL2 Mab之主要組分就h-FcγRIIIA的親和性與h-FcγRI的親和性之間的中等親和性結合。hz515H7VH1D76NVL2 Mab之兩組分與m-FcγRI的交互作用係有一在hz515H7VH1D76NVL2之兩組分就h-FcγRIIIA之親和性之間的中等親和性。

此等實驗清楚地顯示出hz515H7VH1D76NVL2 Mab Fc域係顯著地與所檢驗的四種FcγR交互作用。

實例11：藉由即時表面電漿子共振來研究c515H7 Mab與h-FcγRI、h-FcγRIIIA、m-FcγRI和m-FcγRIII之間的交互作用

2-重組人類FcγRIIIA變異體V[CD16a]係對應於具有C 端6-His標籤的Gln17-Gln208片段[目錄編號：4325-FC]。使用於此研究中之45 kDa的分子量(供應商所指明者)係對應於還原狀態中SDS-PAGE所界定出之分子量的平均。

其他試劑係由Biacore(GE Healthcare)供應。

2017 RU的c515H7 Mab係使用胺耦合套組化學固定於一CM4感測晶片之第二流動室(FC2)上。被NHS與EDC混合物活化及被乙醇胺去活化的第一流動室(FC1)係用作為參考表面以檢查並減去分析物(Fcγ受體)與該感測晶片矩陣之間的非專一性交互作用。

動力實驗係於攝氏25度下以30μl/min之流動速率來實行。HBS-EP緩衝液係使用作為泳動緩衝液或者用於製備分析物溶液。該等分析物溶液係於90秒期間內(締合相)注射，有一90秒延遲(解離相)。如分析物之泳動緩衝液的注射係使用作為雙參考。所有感測圖係以此雙參考感測圖校準。

在分析物的各個注射之後，感測晶片係藉由注射20 mM NaOH、75mM NaCl溶液而再生。

以h-FcγRI獲得的感測圖[第22圖]並非完美地相稱於朗謬模型(Chi2/Rmax>10%)，但“異質配位子”模型並未改良相稱品質。使用朗謬模型，解離常數係接近於奈莫耳範圍(1.2±0.1 nM)。

以h-FcγRIIIA獲得的感測圖[第23圖]係清楚地未相稱於朗謬模型(Chi2/Rmax>20%)。“異質配位子”模型顯著地改良了相稱品質(Chi2/Rmax<5%)。依據此模型，c515H7 Mab Fc域可被視為兩組分之混合物。代表總量之81%的主要組分係顯示出在380與450 nM之間的解離常數，而較少的組分(19%)係顯示出在32與37 nM之間的解離常數。依據文獻，以h-FcγRIIIA所觀察到的異質性係可能連結至Mab Fc域上的醣化異質性。締合相端係接近於達到穩定狀態。一描繪締合相端RU反應平均(接近於Req)相對於h-FcγRIIIA濃度(C)的作圖可相稱於數學模型：Req=(K_A.C.R_max)/K_A.C.n+1)，其中n=1[第24圖]。對應於1/K_A之解離常數K_D係為160 nM。

以m-FcγRI獲得的感測圖[第25圖]可相稱於朗謬模型(5%<Chi2/Rmax<10%)，但“異質配位子”模型顯著地改良了相稱品質(Chi2/Rmax<2%)。依據此模型，c515H7 Mab Fc域可被視為兩組分之混合物。代表總量之81%的主要組分係顯示出將近380和450 nM的解離常數，而較少的組分(19%)係顯示出在32與37 nM之間的解離常數。

締合相端係接近於達到穩定狀態。一描繪締合相端RU反應平均(接近於Req)相對於m-FcγRI濃度(C)的作圖可相稱於數學模型：Req=(K_A.C.R_max)/K_A.C.n+1)，其中n=1[第26圖]。對應於1/K_A之解離常數K_D係等於107nM。

以m-FcγRIII獲得的感測圖[第27圖]係非完美地相稱於朗謬模型(10%<Chi2/Rmax<20%)，但“異質配位子”模型並未改良相稱品質。使用朗謬模型，解離常數係將近20 nM。

四種Fcγ受體的排序係呈現於描繪Kd對複合物半衰期作圖的第28圖。依照文獻，h-FcγRI係以高親和性結合至人類IgG1同型抗體的Fc部段，而h-FcγRIIIA係以較低親和性結合至人類IgG1同型抗體的Fc部段。m-FcγRIII係以在c515H7Mab之主要組分就h-FcγRIIIA的親和性與就h-FcγRI的親和性之間的中等親和性結合。c515H7 Mab之兩組分係以類似於與h-FcγRIIIA的方式來與m-FcγRI交互作用。

實例12：hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7)Mab在表現CXCR4之細胞上的抗體依賴型細胞性細胞毒性(ADCC)作用

ADCC係使用上述乳酸去氫酶(LDH)釋放檢定來測量(見實例5)。

簡言之，人類PBMCs係使用聚蔗糖密度梯度從自願之健康供體的血液分離。NK細胞係依據人類NK細胞濃化套組製造商的規程純化自該PBMCS部分。使用作為作用细胞(E)的NK細胞係混合以RAMOS(淋巴瘤)、DAUDI(淋巴瘤) 或HeLa(子宮頸癌症)腫瘤標靶細胞(T)，E：T比率為50：1；該等標靶細胞先前已與hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7)抗體(10 μg/ml)於室溫下預培育達10分鐘。在37℃下培育4小時之後，特定細胞溶解係藉由使用細胞毒性偵測套組^PLUS依據製造商之指示測量LDH釋放量來測定。細胞毒性百分比係計算如下：%溶解=[實驗釋放-作用物及標靶自發性釋放]/[標靶最大釋放-標靶自發性釋放]x 100。

第29圖顯示出在表現CXCR4之細胞：RAMOS、DAUDI及HeLa細胞上的ADCC。當細胞係與hIgG1同型控制組(10 μg/ml)一起培育時，未有作用被觀察到。相對地，hz515H7 Mab(10 μg/ml)係能夠誘發顯著ADCC(將近40%)於RAMOS、DAUDI及HeLa細胞上。

實例13：hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7)Mab在表現CXCR4之細胞上的補體依賴型細胞毒性(CDC)作用

CDC檢定是基於使用CellTiter Glo試劑(Promega,Madison,WI,USA)的ATP測量，如描述於實例7中者。

簡言之，10000個標靶細胞係被置於hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7)Mab存在下的96-井平底盤中。在室溫培育達10分鐘過後，自健康供體儲集的人類血清係以10%之最終濃度添加。在37℃下1h之後，活力係藉測量ATP量來測定。細胞毒性百分比係計算如下：%細胞毒性=100-[[實驗/無抗體標靶細胞]x 100]。

第30圖顯示出在表現CXCR4之細胞株：RAMOS及 DAUDI細胞上的CDC。當細胞係與hIgG1同型控制組(10 μg/ml)一起培育時，未有作用被觀察到。相對地，hz515H7VH1D76NVL2(hz515H7-1)Mab(10 μg/mL)係能夠誘發顯著CDC：就RAMOS細胞為將近58%，而就DAUDI細胞為36%。

第1圖係顯示出515H7重鏈可變域與人類生殖系IGHV3-49^＊04和IGHJ4^＊01之胺基酸序列排比。該515H7 VH之胺基酸序列係與經選擇之人類接受體架構序列排比。VH1及VH2(VH3未表述)之序列係對應於經執行擬人化之515H7 VH域變異體，有經回復突變之殘基以粗體呈現。變異體1，VH1，係未攜載經回復突變之殘基且代表一完全人類之變異體。變異體VH2具有8個回復突變且係最鼠類之變異體。變異體VH3係攜載5個回復突變(未表述)。

第3A-3F圖係顯示出以嵌合515H7及擬人化515H7之不同變異體所為之生物素標記鼠類抗體515H7的交叉封阻。515H7之擬人化變異體(hz515H7)去交叉封阻親本鼠類抗體 515H7之活性係藉由流式細胞計數法使用CXCR4轉染之NIH3T3細胞來評估。該等擬人化變異體之活性係與該嵌合515H7比較。組合以嵌合VL(cVL)之三種不同VH變異體(VH1-VH3)之交叉封阻活性係非常類似(第3A圖-第3C圖)。當組合以VL之變異體1及2時，所測定之VH變異體1(VH1，未有回復突變之變異體)的活性並未減少。就建構物hz515H7 VH1 VL3則偵測到活性的顯著減少(第3D-3F圖)。

第4圖係顯示出用於檢驗擬人化抗體515H7變異體VH1VL1之活性的BRET檢定。該擬人化變異體515H7 VH變異體1 VL變異體1(hz515H7 VH1 VL1)的活性係以其抑制SDF-1媒介之信號轉導的能力來評估。如以BRET測定，此變異體顯示出僅微量抑制SDF-1媒介之信號轉導。SDF-1之使用濃度係為100nM。

第6圖係顯示出具有單一或雙回復突變之VH1及VL1的不同突變體相較於建構物VH1 D76N VL2的排序。單一及雙回復突變係在VH1中造出且組合以VL1。所有建構物係於 BRET檢定中評估，並計算其等之抑制百分比。該SDF-1之濃度係為100nM。

第7A-7B圖係顯示出擬人化515H7之不同建構物對SDF-1結合之抑制及以FACS及BRET所獲得結果之間的關聯。具有強活性於封阻β-視紫紅質抑制蛋白補充之擬人化抗體515H7之不同變異體係被檢驗其等於流式細胞計數法(FACS)中抑制生物素標記SDF-1結合的能力(A)。此等係與VH1及VL1比較。來自FACS為主之檢定結果係關聯於BRET所獲得的結果(B)。

<110> 皮爾法伯製藥公司(PIERRE FABRE MEDICAMENT)

<120> 具作用功能的抗CXCR4抗體及其供治療癌症之用途

<130> 361040D29882

<150> EP 11305773.1

<151> 2011-06-20

<150> US 61/499,004

<151> 2011-06-20

<160> 73

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 2

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 3

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 4

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 6

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 7

<210> 8

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 8

<210> 9

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 9

<210> 10

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 10

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 11

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 12

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 13

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 14

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 15

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 16

<210> 17

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 17

<210> 18

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 18

<210> 19

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 19

<210> 20

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 20

<210> 21

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 21

<210> 22

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 22

<210> 23

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<200>

<223> 擬人化抗體

<400> 23

<210> 24

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 24

<210> 25

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 25

<210> 26

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 26

<210> 27

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 27

<210> 28

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 28

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 29

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 30

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 31

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 32

<210> 33

<211> 9

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 33

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 34

<210> 35

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 35

<210> 36

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 36

<210> 37

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 37

<210> 38

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 38

<210> 39

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 39

<210> 40

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 40

<210> 41

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 41

<210> 42

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 42

<210> 43

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 43

<210> 44

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 44

<210> 45

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 45

<210> 46

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 46

<210> 47

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 47

<210> 48

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 48

<210> 49

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 49

<210> 50

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 50

<210> 51

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 51

<210> 52

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 52

<210> 53

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 53

<210> 54

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 54

<210> 55

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 55

<210> 56

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 56

<210> 57

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 最適密碼子

<400> 57

<210> 58

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 最適密碼子

<400> 58

<210> 59

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 擬人化抗體

<400> 59

<210> 60

<211> 110

<212> PRT

<213> 人類

<400> 60

<210> 61

<211> 15

<212> PRT

<213> 人類

<400> 61

<210> 62

<211> 98

<212> PRT

<213> 人類

<400> 62

<210> 63

<211> 106

<212> PRT

<213> 人類

<400> 63

<210> 64

<211> 329

<212> PRT

<213> 人類

<400> 64

<210> 65

<211> 330

<212> DNA

<213> 人類

<400> 65

<210> 66

<211> 45

<212> DNA

<213> 人類

<400> 66

<210> 67

<211> 294

<212> DNA

<213> 人類

<400> 67

<210> 68

<211> 318

<212> DNA

<213> 人類

<400> 68

<210> 69

<211> 987

<212> DNA

<213> 人類

<400> 69

<210> 70

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗體

<400> 70

<210> 71

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗體

<400> 71

<210> 72

<211> 1404

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗體

<400> 72

<210> 73

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗體

<400> 73

Claims

一種結合至CXCR4之擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段，該擬人化抗體包含一選自序列辨識編號7至10之序列的重鏈可變域以及一選自序列辨識編號11至17之序列的輕鏈可變域；係供用於一種藉由在作用细胞或補體組分之存在下誘發至少一作用功能來殺死表現CXCR4之癌症細胞以治療癌症的方法中。
如申請專利範圍第1項之擬人化抗體，其特徵在於該作用功能係由抗體依賴型細胞性細胞毒性(ADCC)構成。
如申請專利範圍第1項之擬人化抗體，其特徵在於該作用功能係由補體依賴型細胞毒性(CDC)構成。
如申請專利範圍第1項之擬人化抗體，其特徵在於該等作用功能係由抗體依賴型細胞性細胞毒性(ADCC)及補體依賴型細胞毒性(CDC)構成。
如申請專利範圍第1至4項中任一項之擬人化抗體，其中該擬人化抗體係選擇於由下列構成之群組：一擬人化抗體，其包含一具序列辨識編號8之序列的重鏈可變域及一選自序列辨識編號11至17之序列的輕鏈可變域；一擬人化抗體，其包含一選自序列辨識編號7至10之序列的重鏈可變域及一具序列辨識編號13之序列的輕鏈可變域；一擬人化抗體，其包含一具序列辨識編號8之序列的重鏈可變域及一具序列辨識編號13之序列的輕鏈可變域；一擬人化抗體，其包含一選自序列辨識編號18至21之序列的重鏈及/或一選自序列辨識編號22至28之序列的輕鏈；一擬人化抗體，其包含一具序列辨識編號19之序列的重鏈及/或一選自序列辨識編號22至28之序列的輕鏈；一擬人化抗體，其包含一選自序列辨識編號18至21之序列的重鏈及/或一具序列辨識編號24之序列的輕鏈；以及一擬人化抗體，其包含一具序列辨識編號19之序列的重鏈及/或一具序列辨識編號24之序列的輕鏈。
如申請專利範圍第1至7項中任一項之擬人化抗體，其特徵在於該抗體是IgG1。
如申請專利範圍第1至6項中任一項之擬人化抗體，其特徵在於該表現CXCR4之癌症細胞係由惡性血液細胞構成。
如申請專利範圍第7項之擬人化抗體，其特徵在於該CXCR4惡性血液細胞係選自於包含淋巴瘤細胞、白血病細胞或多發性骨髓瘤細胞之群組。
如申請專利範圍第1至8項中任一項之擬人化抗體，其特徵在於該等作用细胞包含NK細胞、巨噬細胞、單核球、嗜中性球或嗜酸性球。
如申請專利範圍第1至9項中任一項之擬人化抗體，其特徵在於，在培育4小時時期之後，其在RAMOS淋巴瘤細胞上所誘發的ADCC位準係至少40%。
如申請專利範圍第1至10項中任一項之擬人化抗體，其特徵在於未有顯著ADCC被誘發於NK細胞上。
如申請專利範圍第1至11項中任一項之擬人化抗體，其特徵在於該等補體組分係包含至少C1q。
如申請專利範圍第1至12項中任一項之擬人化抗體，其特徵在於，在培育1小時時期之後，其在RAMOS淋巴瘤細胞上所誘發的CDC位準係至少30%，優先為至少50%，且最佳為至少70%。
如申請專利範圍第1至13項中任一項之擬人化抗體，其特徵在於，在培育1小時時期之後，其在NIH3T3 CXCR4細胞上所誘發的CDC位準係至少30%，優先為至少50%，且最佳為至少70%。
如申請專利範圍第1至14項中任一項之擬人化抗體，其特徵在於該擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段係結合至少一人類FcγRs。
如申請專利範圍第15項之擬人化抗體，其特徵在於該至少一FcγRs是人類FcγRI。
如申請專利範圍第16項之擬人化抗體，其特徵在於其以依據朗謬模型為在1與10 nM之間的解離常數(KD)結合該FcγRI。
如申請專利範圍第17項之擬人化抗體，其特徵在於該至少一FcγRs是人類FcγRIIIA。
如申請專利範圍第18項之擬人化抗體，其特徵在於其以依據異質配位子模型為在200與1000 nM之間的解離常數(KD)結合該FcγRIIIA。
一種結合至CXCR4之擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段，供用於一種藉由殺死表現CXCR4之癌症細胞來治療癌症的方法中；該人類或擬人化抗體包含一選自序列辨識編號7至10之序列的重鏈可變域及一選自序列辨識編號11至17之序列的輕鏈可變域；其中該人類或擬人化抗體的至少一作用功能係在作用细胞或補體組分之存在下被誘發。
如申請專利範圍第20項之擬人化抗體，其特徵在於該癌症係由淋巴瘤構成。
一種篩選結合至CXCR4之擬人化抗體、或其含有CH2之結合片段以供用於藉由在作用细胞或補體組分之存在下誘發至少一作用功能來殺死表現CXCR4之癌症細胞的方法，其中該方法包含至少一選擇步驟選自於：-選擇在培育4小時時期之後於RAMOS淋巴瘤細胞上誘發至少40%之ADCC位準的抗體；-選擇在培育1小時時期之後於RAMOS淋巴瘤細胞上誘發至少30%，優先為至少50%，且最佳為至少70%之CDC位準的抗體；-選擇在培育1小時時期之後於NIH3T3 CXCR4細胞上誘發至少30%，優先為至少50%，且最佳為至少70%之CDC位準的抗體；-選擇以依據朗謬模型為在1與10 nM之間的解離常數(KD)結合FcγRI的抗體；-選擇以依據異質配位子模型為在200與1000 nM之間的解離常數(KD)結合FcγRIIIA的抗體。