KR20080113233A

KR20080113233A - 인슐린-유사 성장 인자 ｉ 수용체에 대한 항체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20080113233A
Application number: KR1020087024802A
Authority: KR
Inventors: 질케 한젠; 클라우스-페터 퀸켈레; 디트마르 로이슈; 랄프 슈마허
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2006-04-11
Filing date: 2007-04-10
Publication date: 2008-12-29
Also published as: ZA200808597B; UA95284C2; ES2403075T3; CN101421305A; EP2363417A1; AU2007236199B2; RU2541765C2; KR101276513B1; BRPI0710185B8; WO2007115814A2; IL194397A0; IL194397A; NO20084082L; BRPI0710185A8; AR060592A1; EP2007810A2; JP2009533367A; EP2007810B1; BRPI0710185B1; CR10301A

Abstract

인간 IgG1 또는 IgG3 유형이며 Asn297 에서 당 사슬로 글리코실화된 IGF-IR 에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 상기 당 사슬 내 푸코스의 양이 99% 이상이고, 또한, NGNA 의 양이 1% 이하이고/거나 또는 N-말단 알파-1,3-갈락토스의 양이 1% 이하인 것을 특징으로 하고, 항종양 치료에서 향상된 특성을 가진다.

IGF-IR

Description

인슐린-유사 성장 인자 Ｉ 수용체에 대한 항체 및 그의 용도 {ANTIBODIES AGAINST INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR I RECEPTOR AND USES THEREOF}

본 발명은 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체 (IGF-IR) 에 대한 항체, 그의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학적 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다.

인슐린-유사 성장 인자 I 수용체 (IGF-IR, EC 2.7.112, CD 221 항원) 는 막관통 단백질 티로신 키나아제의 패밀리에 속한다 (LeRoith, D., 등, Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163 ; and Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093). IGF-IR 은 IGF-I 에 높은 친화성으로 결합하고, 생체 내에서 상기 리간드에 대한 생리학적 반응을 개시한다. IGF-IR 은 또한 IGF-II 에도 결합하나, 조금 더 낮은 친화성으로 결합한다. IGF-IR 과발현은 세포의 신생물적 변형을 촉진시키고, IGF-IR 이 세포의 악성 변형에 관여한다는 증거가 존재하고, 따라서, 암 치료용 치료제의 개발에 대한 유용한 표적이다 (Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093).

IGF-IR 에 대한 항체는 당업계에 잘 알려져 있고, 시험관 내 및 생체 내에서 그의 항종양 효과에 대해 조사되어 있다 (Benini, S., 등, Clin. Cancer Res. 7 (2001) 1790-1797 ; Scotlandi, K., 등, Cancer Gene Ther. 9 (2002) 296-307; Scotlandi, K., 등, Int. J. Cancer 101 (2002) 11-16 ; Brunetti, A., 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 212-218 ; Prigent, S.A., 등, J. Biol. Chem. 265 (1990) 9970-9977 ; Li, S.L., 등, Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252 ; Pessino, A., 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243 ; Surinya, K.H., 등, J. Biol. Chem. 277 (2002) 16718-16725 ; Soos, M.A., 등, J. Biol. Chem., 267 (1992) 12955-12963 ; Soos, M.A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 5217-5221 ; O'Brien, R.M., 등, EMBO J. 6 (1987) 4003-4010 ; Taylor, R., 등, Biochem. J. 242 (1987) 123-129 ; Soos, M.A., 등, Biochem. J. 235 (1986) 199-208 ; Li, S.L., 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (1993) 92-98 ; Delafontaine, P., 등, J. Mol. Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659-1673 ; Kull, F.C. Jr., 등, J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566 ; Morgan, D.O., and Roth, R.A., Biochemistry 25 (1986) 1364-1371 ; Forsayeth, J.R., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 3448-3451 ; Schaefer, E.M., 등, J. Biol. Chem. 265 (1990) 13248-13253 ; Gustafson, T.A., and Rutter, W.J., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667 ; Hoyne, P.A., 등, FEBS Lett. 469 (2000) 57-60 ; Tulloch, P.A., 등, J. Struct. Biol. 125 (1999) 11-18 ; Rohlik, Q.T., 등, Biochem. Biophys. Res. Comm. 149 (1987) 276-281 ; 및 Kalebic, T., 등, Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534 ; Adams, T. E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093 ; Dricu, A., 등, Glycobiology 9 (1999) 571-579 ; Kanter-Lewensohn, L., 등, Melanoma Res. 8 (1998) 389-397 ; Li, S.L., 등, Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252). IGF-IR 에 대한 항체는 또한, 많은 추가의 공개문헌, 예를 들어, [Arteaga, C.L., 등, Breast Cancer Res. Treatment 22 (1992) 101-106] ; 및 [Hailey, J., 등, Mol. Cancer Ther. 1 (2002) 1349-135] 에 기술되어 있다.

특히, αIR3 이라고 하는 IGF-IR 에 대한 모노클로날 항체는 IGF-IR 매개 과정 및 암과 같은 IGF-I 매개 질환을 연구하는 목적으로 광범위하게 사용된다. 알파-IR-3 은 [Kull, F.C., J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566] 에 의해 기술되었다. 한편, 약 100 개의 공개문헌이 αIR3 의 단독, 및 독소루비신 및 빈크리스틴과 같은 세포독성제와 함께, 그의 항종양 효과에 관한 연구 및 치료적 용도를 다루면서 출판되었다. αIR3 은 IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것이 아닌, IGF-I 이 IGF 수용체에 결합하는 것을 억제시키는 것으로 알려진 쥣과 모노클로날 항체이다. αIR3 은 고농도에서 종양 세포 증식을 및 IGF-IR 인산화를 자극시킨다 (Bergmann, U., 등, Cancer Res. 55 (1995) 2007-2011 ; Kato, H., 등, J. Biol. Chem. 268 (1993) 2655-2661). IGF-I 이 IGF-IR 에 결합하는 것보다 IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것을 더욱 강력하게 억제시키는 다른 항체 (예를 들어, 1H7, Li, S.L., 등, Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252) 가 존재한다. 항체 및 그의 특성 및 특징에 대한 당업계의 요약은 [Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093] 에 의해 기술되어 있다.

당업계에서 기술된 항체의 대부분은 마우스 기원이다. 그러한 항체는 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 키메라화 또는 인간화와 같은 추가의 변형 없이는 인 간 환자의 치료에 유용하지 않다. 이러한 단점을 바탕으로, 인간 항체는 확실히 인간 환자의 치료에서 치료제로서 바람직하다. 인간 항체는 당업계에 잘 알려져 있다 (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 상기 기술을 바탕으로, 많은 다양한 표적에 대한 인간 항체를 제조할 수 있다. IGF-IR 에 대한 인간 항체의 예는 WO　02/053596, WO2004071529, WO2005016967 WO2006008639, US20050249730, US20050084906, WO2005058967, WO2006013472, US20030165502, WO2005082415, WO2005016970, WO03106621, WO04083248, WO2003100008, WO2004087756, WO2005005635 및 WO2005094376 에 기술되어 있다.

그러나, 항종양 치료를 필요로 하는 환자에 확실히 이점을 제공하는 IGF-IR 에 대한 항체에 대한 요구는 여전히 존재한다. 환자에 대한 적절한 이점은 간단하게는 종양 성장의 감소 및 항종양원성제를 사용한 치료에 의해 야기되는 진전에 대한 유의한 기간 연장이다

[Routier, F.H. 등, Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207] 은 CHO-DUKX 세포에서 발현되는 인간화된 IGF1 항체의 글리코실화 패턴을 보고한다. 이러한 항체는 0.8 : 3.0 의 Fuc : Man 몰 비를 나타내고, 이는 80% 의 푸코실화 비율을 말한다. [Niwa, R. 등, J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160] 은 각각 90% 및 91% 의 CHO DG44 푸코실화에서 재조합적으로 생성된 항-CD20 IgG1 및 IgG3 항체에 대해 보고한다. [Mimura, Y. 등, J. Immunol. Methods 247 (2001) 205-216] 은 부티레이트가 기능 및 글리코폼 (glycoform) 프로파일을 유지하면서 CHO-K1 세 포에서 인간 키메라성 IgG 의 제조를 증가시키는 것을 보고한다. 올리고사카라이드 프로파일은 상당한 함량의 아푸코실화된 (afucosylated) 글리칸 구조를 보여준다. [Raju, T.S., BioProcess International 1 (2003) 44-53] 는 치료적 면역글로불린의 생물학적 활성에 있어서 발현 시스템에 의한 글리코실화 변화의 효과 및 명칭을 보고한다. [Ma, S. 등, Anal. Chem. 71 (1999) 5185-5192] 는 리툭시마브의 탄수화물 분석을 보고한다. 리툭시마브는 9 ~ 10% 푸코실화를 나타낸다 (Niwa, R. 등, J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160). [Fujii, S., J. Biol. Chem 265 (1990) 6009-6018] 은 소 IgG 이 약 11% 의 아푸코실화된 IgG 를 포함한다는 것을 보고한다. [Mizuochi, T., J. Immunol. 129 (1982) 2016-2020] 은 인간 IgG 가 약 14% 아푸코실화되었음을 보고한다. [Bergwerff, A.A., Glycoconjugate J. 12 (1995) 318-330] 은 마우스 SP2/0 에서 생성된 항체가 N-글리콜릴뉴라민산 (NGNA) 올리고사카라이드를 대량 함유한다는 것을 보고한다. [Nahrgang, S. 등, In: Animal Cell Technology: Products from Cells, Cells as Products, Bernard, A. 등, (eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, (1999) pp. 259-261] 은 일시적인 트랜스펙션 후에 IgG1 의 CHO 발현에 대해 불량한 전반적인 글리코실화가 발견된다는 것을 보고한다. [Lund, J. 등, Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748] 은 마우스 트랜스펙토마 (transfectoma) 세포에서 마우스-인간 키메라성 항체의 재조합 제조를 보고한다. IgG1 항체는 13% 의 양으로 아푸코실화되어 있다. [Patel, T.P., 등, Biochem. J. 285 (1992) 839-845] 는 하이브리도마 세포 및 마우스 복수로부터의 항체의 글리코실화에 대해 보고한 다. [Niwa R. 등, J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160] 은 CD20 IgG1 항체에 대해, CHO DG44 에서 재조합 제조 후에 91% 의 푸코실화를 보고하고, [Mori, K. 등, Biotech. Bioeng. 88 (2004) 901-908] 은 94% 의 푸코실화를 보고한다. [Davies, J., 등, Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294] 는 글리코폼이 변형된 항체의 발현이 ADCC 의 증가를 초래한다는 것을 보고한다. [Sheeley, D.M., 등, Anal. Biochem. 247 (1997) 102-110] 은 상이한 발현 시스템에서 항체 글리코실화를 비교한다. [Shields, R.L., 등, J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740] 은 인간 IgG1 Fc 상의 푸코스 (fucose) 의 결핍이 FcγRIII 결합 및 ADCC 를 향상시킨다는 것을 보고한다. 약 90% 푸코실화된 항 Her2 항체 또한 상당한 양의 ADCC 를 보여준다. [Zhu, L., 등, Nature Biotechnol. 23 (2005) 1159-1169] 는 계란에서의 인간 항체의 제조에 대해 보고한다.

본 발명의 개요

본 발명은 인간 IgG1 또는 IgG3 유형이고, Asn297 에서 당 사슬로 글리코실화되어 있는 IGF-IR 에 결합하는 항체를 포함하는데, 상기 항체는 상기 당 사슬 내 푸코스의 양이 98% 이상이고 ("완전히 푸코실화된", 바람직한 버전은 하기 참조), 뿐만 아니라 NGNA 의 양이 1% 이하이고/거나 또는 N-말단 알파-1,3-갈락토스의 양이 1% 이하인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, "양" 은 Asn297 에 있는 당 사슬 내의 상기 당의 양을 의미하고, G0, G1, G2 (만노스 (4 및 5) 없음) 의 합을 100% 로 하고, 실시예 3 에서 계산한 바와 같다.

본 발명에 따르면, 99.4% 이상, 99.5% 이상 또는 99.9% 이상 푸코실화된 IGF-IR 에 결합하는 항체를 제공할 수 있다.

바람직하게는, NGNA 의 양은 0.5% 이하, 더욱 바람직하게는 0.1% 이하이고, 심지어 LCMS (액체 크로마토그래피/질량분석법) 에 의해 검출가능하지 않은 양이다.

바람직하게는, N-말단 알파-1,3-갈락토스의 양은 0.5% 이하, 더욱 바람직하게는 0.1% 이하, 및 심지어 LCMS 에 의해 검출가능하지 않은 양이다.

당 사슬은 바람직하게는 CHO (차이니즈 햄스터 난소 (chinese hamster ovary)) 세포 내에서 재조합적으로 발현된 IGF-IR 에 결합하는 항체의 Asn297 에 부착된 N-연결 글리칸의 특징을 보여준다.

바람직하게는, CHO 세포는 DHFR 대립인자 둘 다의 소실 (예를 들어, DG44) 또는 기능적 비활성화, 또는 하나의 DHFR 대립인자의 소실 및 제 2 DHFR 대립인자의 기능적 비활성화 (예를 들어, DXB11) 를 포함하는 CHO 세포이다.

바람직하게는, 항체는 모노클로날 항체이다. 바람직하게는, 항체는 키메라성, 인간화된 또는 인간 항체이다.

본 발명은 바람직하게는, IGF-IR 에 결합하고, IGF-I 및 IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것을 억제시키는 완전히 푸코실화된 항체를 포함하며, 상기 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 보여주는 것을 특징으로 한다 :

a) IGF-I 의 IGF-IR 에의 결합 억제 IC₅₀ 값 대 IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합 억제 IC₅₀ 값의 비율이 1:3 내지 3:1 임을 보여줌,

b) 0.5% 열 비활성화된 태아 소 혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 내 HT29 세포를 사용한 세포의 인산화 어세이에서, 상기 항체가 없는 어세이와 비교했을 때, 5 nM 의 농도에서 IGF-IR 인산화를 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상 억제시킴,

c) 0.5% 열 비활성화된 태아 소 혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 내 세포 당 400,000 내지 600,000 개의 분자 IGF-IR 을 제공하는 3T3 세포를 사용한 세포의 인산화 어세이에서, 상기 항체가 없는 어세이와 비교했을 때, 10 μM 의 농도에서 PKB 인산화로서 측정되는 IGF-IR 자극 활성을 나타내지 않음 (신호화 없음, IGF-1 모방 활성 없음),

d) 세포에 항체를 첨가한 지 24 시간 후에, 종양 세포 (예를 들어, HT29) 상에서 발현되는 IGF-IR 을 50% 이상 하위조절함.

본 발명에 따른 항체는 항종양 치료가 필요한 환자에 이점을 나타내고, 종양 성장의 감소 및 진행 시 유의한 시간 연장을 제공한다. 본 발명에 따른 항체는 IGF 하위조절과 연관된 질환, 특히 종양 질환으로부터 고통받는 환자에 이점을 야기하는 신규 그리고 진보적인 특성을 가진다. 본 발명에 따른 항체는 전술한 특성을 특징으로 한다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 항체 ("완전히 푸코실화된 항체") 는 실시예에서 기술된 ADCC 어세이에서 나타낸 바와 같이 ADCC (항체-의존성 세포-매개 세포독성) 를 야기하지 않는다 (대조군 표준 항체 (키홀 림펫 헤모시아닌에 대한 항체, KLH 항체) 로부터 3xSD (표준 편차) 내에서).

바람직하게는, 항체는 IGF-IR 에 특이적으로 결합하고, 전술된 비율에서 IGF-I 및 IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것을 억제시키며, IgG1 아이소타입이고, 그의 IC₅₀ 값의 200-배 농도에서 IGF-IR 과발현 세포에서조차 IGF-IR 신호화를 활성화시키지 않는다.

"완전한 푸코실화" 가 있으면서 "IGF-I 모방 활성" 이 없는, IGF-IR 에 결합하는 항체는 치료제로서 사용되는 경우 강한 이점을 제공한다.

바람직하게는, 5 nM 의 농도에서 본 발명에 따른 항체는 종양 세포 내 IGF-IR 의 IGF-I 매개 신호 전달을 완전히 억제시킨다.

각각의 다른 항체 사슬과 함께 본 발명에 따른 항체로 조립할 수 있는 폴리펩티드의 바람직한 핵산은 하기에 정의된다 :

a) CDR 로서 SEQ　ID　NO:1 또는 3 의 CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) 및 CDR3 (aa 99-107) 을 포함하는 항체 중쇄 ;

b) CDR 로서 SEQ　ID　NO:2 또는 4 의 CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) 및 CDR3 (aa 89-98) 을 포함하는 항체 경쇄.

항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이고, 또한 키메라성 항체 (인간 불변 사슬), 인간화된 항체 및 특히 바람직하게는 인간 항체이다.

항체는 바람직하게는 항체 18 과 경합하여 IGF-IR 인간 (EC 2.7.1.112, SwissProt P08069) 에 결합한다.

항체는 바람직하게는 추가로 10^-8 M (K_D) 이하, 바람직하게는 약 10^-9 내지 10^-13 M 의 친화성을 특징으로 한다.

항체는 바람직하게는 인슐린 수용체에 결합하는 인슐린의 검출가능한 농도 의존성 억제를 나타내지 않는다.

항체는 바람직하게는 IgG1 유형이다.

본 발명에 따른 항체는 비히클 처리된 동물과 비교해 적절한 이종 이식 종양 모델에서 진행 시 시간을 상당히 연장시키고, 종양 성장을 감소시킨다. 항체는 시험관 내 및 생체 내에서 IGF-I 및 IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것을 억제시키고, 바람직하게는 IGF-I 및 IGF-II 에 대해 대략 동일한 방식으로 억제시킨다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 상보성 결정 영역 (CDR) 으로서 하기 서열을 포함한다 :

본 발명에 따른 항체의 중쇄의 바람직한 가변 영역 및 CDR, 특히 CDR3 은 [Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germany] 에 기탁된 <IGF-1R> HUMAB 클론 18 (항체 18) 및 <IGF-1R> HUMAB 클론 22 (항체 22) 에 의해 제공된다.

세포주	기탁 번호	기탁일
<IGF-1R> HUMAB-클론 18	DSM ACC 2587	2003.04.10
<IGF-1R> HUMAB-클론 22	DSM ACC 2594	2003.05.09

이들 항체는 WO 2005/005635 에 상세히 기술된다.

본 발명에 따른 항체의 중쇄의 추가의 바람직한 가변 영역 및 CDR, 특히 CDR3 은 [Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germany] 에 기탁된 <IGF-1R> HuMab 클론 1a (항체 1A, Ab　1A 또는 Ak　1A), <IGF-1R> HuMab 클론 23 (항체 23), 및 <IGF-1R> HuMab-클론 8 (항체 8) 에 의해 제공된다.

세포주	기탁 번호	기탁일
<IGF-1R> HUMAB-클론 1a	DSM ACC 2586	2003.04.10
<IGF-1R> HUMAB-클론 23	DSM ACC 2588	2003.04.10
<IGF-1R> HUMAB-클론 8	DSM ACC 2589	2003.04.24

이들 항체는 WO 2004/087756 에 상세히 기술되어 있다.

본 발명은 추가로, 상기 항체의 재조합 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로, 암을 가진 것으로 진단된 (따라서, 항종양 치료가 필요한) 환자에 본 발명에 따른 IGF-IR 에 대한 안타고니스틱 항체를 유효량 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 항체는 단독으로 약학적 조성물 내에서, 또는 대안적으로는 방사선 치료 또는 세포독성제 또는 그의 전구약물과 같은 세포독성 치료와 병용해서 투여될 수 있다.

본 발명은 추가로, 암 치료를 위한, 그리고 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제조 방법을 포함한다.

본 발명은 추가로, 임의로 약학적 목적을 위한 항체의 제형에 유용한 완충제 및/또는 보조제와 함께, 본 발명에 따른 항체를 약학적 유효량 함유하는 약학적 조성물을 포함한다.

본 발명은 추가로, 약학적으로 허용가능한 담체 내에서 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 한 구현예에서, 약학적 조성물은 제조 물품 또는 키트 내에 포함될 수 있다.

본 발명은 추가로, 본 발명에 따른 재조합 인간 항체의 제조 방법을 제공하며, 이는 상기 항체를 완전히 푸코실화시키는, CHO 숙주 세포에서 IGF-IR 에 결합하는 항체를 암호화하는 핵산을 발현시키고, 상기 세포에서 상기 항체를 회수하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 추가로, 그러한 재조합 방법에 의해 수득가능한 항체를 포함한다.

도 1 은 대조군 및 비교 항체에서 그리고 본 발명의 항체에서 ADCC 활성 또는 그의 결힙을 보여주는 막대 차트이다.

발명의 상세한 설명

용어 "항체" 는 본 발명에 따른 특징이 유지되는 한, 전체 항체, 항체 절편, 인간 항체, 인간화된 항체 및 유전자 조작 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 다 양한 형태의 항체를 포함한다.

"항체 절편" 은 전장 항체의 부위, 일반적으로 적어도 항원 결합 부위 또는 그의 가변 영역을 포함한다. 항체 절편의 예에는 항체 절편으로부터 형성된 디아바디 (diabody), 단쇄 항체 분자, 면역독소, 및 다중특이적 항체가 포함된다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물" 은 단일 아미노산 조성물의 항체 분자의 제조를 말한다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체" 는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다.

용어 "키메라성 항체" 는 재조합 DNA 기술에 의해 통상 제조되는, 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 하나 이상의 불변 영역 부위 및 하나의 공급원 또는 종으로부터의 가변 영역, 즉 결합 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 말한다. 쥣과 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라성 항체가 특히 바람직하다. 그러한 쥣과/인간 키메라성 항체는 쥣과 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 DNA 분절 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 본 발명에 포함되는 다른 형태의 "키메라성 항체" 는 본래의 항체의 것에서 개질 또는 변화된 부류 (class) 또는 하위부류의 항체이다. 그러한 "키메라성" 항체를 또한, "부류-스위칭된 항체" 라고도 한다. 키메라성 항체의 제조 방법은 현재 당업계에 잘 알려진 통상의 재조합 DNA 및 유전자 트랜스펙션 기술을 포함한다. 예를 들어, [Morrison, S.L., 등, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; 미국 특허 제 5,202,238 호 및 제 5,204,244 호] 를 참조한다.

용어 "인간화된 항체" 는 골격 또는 "상보성 결정 영역" (CDR) 이 모 면역글로불린의 것과 비교해 상이한 특이성의 면역글로불린의 CDR 을 포함하도록 개질된 항체를 말한다. 바람직한 구현예에서, 쥣과 CDR 이 인간 항체의 골격 영역에 이식되어, "인간화된 항체" 가 제조된다. 예를 들어, [Riechmann, L., 등, Nature 332 (1988) 323-327] ; 및 [Neuberger, M.S., 등, Nature 314 (1985) 268-270] 을 참조한다. 특히 바람직한 CDR 은 키메라성 및 2 작용성 항체에 대해 상기에서 주지한 항원 인지 서열을 나타내는 CDR 에 상응한다.

본원에 사용된 용어 "인간 항체" 는 인간 생식선 면역글로불린 서열으로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것이다. 가변 중쇄는 바람직하게는 생식선 서열 DP-50 (GenBank LO6618) 으로부터 유래되고, 가변 경쇄는 바람직하게는 생식선 서열 L6 (GenBank X01668) 로부터 유래되거나, 또는 가변 중쇄는 바람직하게는 DP-61 (GenBank M99682) 로부터 유래되고, 가변 경쇄는 생식선 서열 L15 (GenBank K01323) 로부터 유래된다. 항체의 불변 영역은 인간 IgG1 유형의 불변 영역이다. 그러한 영역은 알로타입일 수 있고, 예를 들어, [Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218] 및 거기에서 참조된 데이타베이스에 기술되어 있다.

용어 "재조합 인간 항체" 는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 재배열된 형태로 갖는 항체를 말한다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체 내에서 체세포성 과변이를 받았다. 따라서, 재조합 항 체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 그와 관련된 한편, 본래는 생체 내에서 인간 항체 생식선 저장고 내에 존재할 수 없는 서열이다.

본원에 사용된 바와 같이, "결합" 은 항체가 약 10^-13 내지 10^-8 M (K_D), 바람직하게는, 약 10^-13 내지 10^-9 M 의 친화성으로 IGF-IR 에 결합하는 것을 말한다.

본원에 사용된 용어 "핵산 분자" 는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것이다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 이다.

IgG1 또는 IgG3 유형을 갖는 인간 불변 도메인은 [Kabat, E.A. 등, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)], 및 [Brueggemann, M., 등, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361] ; [Love, T.W., 등, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527] 에 상세히 기술되어 있다. 예는 SEQ　ID　NOS:5 내지 8 에 나타나 있다. 다른 유용하고 바람직한 불변 도메인은 본 발명에 대한 DSMZ 에 기탁된 하이브리도마 세포주로부터 수득가능한 항체의 불변 도메인이다.

IgG1 또는 IgG3 유형의 불변 도메인은 Asn297 에서 글리코실화되어 있다. 본 발명에 따른 "Asn 297" 은 Fc 영역 내 약 위치 297 에 위치한 아미노산 아스파라긴을 의미하고 ; 항체의 최소한의 서열 변이를 바탕으로, Asn297 은 또한 일부 아미노산 (보통 ±3 아미노산 이하) 상부 또는 하부에 위치할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 한 항체에서, "Asn297" 은 아미노산 위치 298 에 위치한다.

인간 IgG1 또는 IgG3 의 글리코실화는 2 개 이하의 Gal (갈락토스) 잔기로 종결된 중심 푸코실화된 바이안테나리 (bianntennary) 착체 올리고사카라이드 글리코실화로서 Asn297 에서 일어난다. 이들 구조를 말단 Gal 잔기의 양에 따라, G0, G1 (α1,6 또는 α1,3) 또는 G2 글리칸 잔기라고 한다 (Raju, T.S., BioProcess Int. 1 (2003) 44-53). 항체 Fc 부분의 CHO 유형 글리코실화는 예를 들어, [Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207] 에 의해 기술된다.

본원에 사용된 "가변 영역" (경쇄의 가변 영역 (VL), 중쇄의 가변 영역 (VH)) 은 항체가 항원에 결합하는데 직접 관여하는 경쇄 및 중쇄의 짝의 각각을 말한다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인은 동일한 구조를 가지고, 각각의 도메인은 그의 서열이 3 개의 "초가변 영역" (또는 상보성 결정 영역, CDR) 에 의해 연결된 광범위하게 보존된 4 개의 골격 (FR) 영역을 포함한다. 골격 영역은 β-병풍 구조를 취하고 있고, CDR 은 β-병풍 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 사슬 내 CDR 은 골격 영역에 의해 그의 3 차 구조에서 고정되어 있고, 다른 사슬로부터의 CDR 과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 특히 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 있어서 중요한 역할을 하고, 따라서 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.

본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "항체의 항원-결합 부위" 는 항원-결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3 은 항원 결합에 가장 기여하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 [Kabat, E.A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))] 의 표준 정의에 따라 결정되고/거나 "초가변 루프" 로부터의 잔기이다.

본원에 사용된 용어 "IGF-IR 에의 결합" 은 시험관 내 어세이, 바람직하게는 결합 어세이에서 항체가 IGF-IR 에 결합하는 것을 의미하고, 여기서 항체는 표면에 결합하고, IGF-IR 의 결합은 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 에 의해 측정된다. 결합은 10^-8 M 이하, 바람직하게는, 10^-13 내지 10^-9 M 의 결합 친화성 (K_D) 을 의미한다.

IGF-IR 에의 결합은 BIAcore 어세이 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) 에 의해 연구될 수 있다. 결합의 친화성은 용어 ka (항체/항원 착체로부터 항체의 결합에 대한 속도 상수), kd (해리 상수) 및 K_D (kd/ka) 에 의해 정의된다. 본 발명에 따른 항체는 10^-10 M 이하의 K_D 값을 나타낸다.

IGF-I 및 IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합은 또한, 본 발명에 따른 항체에 의해 억제된다. 억제는 종양 세포 상의 IGF-IR 에 IGF-I/IGF-II 가 결합하는 것에 대한 어세이에서 IC₅₀ 으로서 측정된다. 상기 어세이는 실시예 7 에 기술되어 있다. 상기 어세이에서, 상기 종양 세포 (예를 들어, HT29) 의 표면에 제공된 IGF-IR 에 결합된 방사성표지된 IGF-I 또는 IGF-II 또는 그의 IGF-IR 결합 절편의 양은 증가하는 농도의 항체가 없는 상태 및 있는 상태에서 측정된다. IGF-I 및 IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합에 대한 본 발명에 따른 항체의 IC₅₀ 값은 2 nM 이하이고, IGF-I/IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합에 대한 IC₅₀ 값의 비율은 약 1:3 내지 3:1 이다. IC₅₀값은 3 개 이상의 독립적인 측정의 평균 또는 중앙값으로서 측정된다. 단일 IC₅₀ 값은 범주에 없을 수 있다.

본원에 사용된 용어 "IGF-I 및 IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합 억제" 는 시험관 내 어세이에서 HT29 (ATCC HTB-38) 종양 세포 표면 상에 제시된 IGF-IR 에 I¹²⁵-표지된 IGF-I 또는 IGF-II 가 결합하는 것을 억제시키는 것을 말한다. 억제는 2　nM 이하의 IC₅₀ 값을 의미한다.

용어 "IGF-IR 발현 세포" 는 세포 당 약 20,000 개 이상의 수용체만큼 IGF-I 수용체를 과발현하는 세포를 말한다. 상기 세포는 예를 들어, NCI H322M 또는 HT29 와 같은 종양 세포주, 또는 IGF-IR 에 대한 발현 벡터로 트랜스펙션한 후 IGF-IR 을 과발현하는 세포주 (예를 들어, 3T3 ATCC CRL1658) 를 말한다. 세포 당 수용체의 양은 [Lammers, R., 등, EMBO J. 8 (1989) 1369-1375] 에 따라 측정된 다.

용어 "IGF-IR 인산화의 억제" 는 상기 항체가 없는 어세이와 비교했을 때, 0.5% 열 비활성화된 태아 소 혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 내 세포 당 400,000 내지 600,000 개의 분자 IGF-IR 을 제공하는 3T3 세포를 사용한 세포의 인산화 어세이를 말한다. 인산화는 티로신-인산화된 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅에 의해 검출된다. 상기 어세이는 실시예 11 에서 기술된다. FCS 의 열 비활성화는 보체계의 비활성화를 위해 56℃ 로 단기간 가열함으로써 수행된다.

용어 "PKB 인산화의 억제" 는 상기 항체가 없는 어세이와 비교했을 때, 0.5% 열 비활성화된 태아 소 혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 내 세포 당 400,000 내지 600,000 개의 분자 IGF-IR 을 제공하는 3T3 세포를 사용한 세포의 인산화 어세이를 말한다. 인산화는 PKB 의 세린 473 에서 인산화된 PKB 에 특이적인 항체 (Akt 1, Swiss Prot Acc. No. P31749) 를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 검출된다. 상기 어세이는 실시예 11 에 기술되어 있다.

용어 "항체-의존성 세포의 세포독성 (ADCC)" 은 효과기 세포의 존재 하에 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 종양 표적 세포의 파쇄를 말한다. ADCC 는 바람직하게는 단핵구 또는 NK 세포와 같이 백혈구연층으로부터 정제한 효과기 세포 또는 갓 단리한 PBMC 와 같은 효과기 세포의 존재 하에 본 발명에 따른 항체로 IGF-IR 발현 세포의 제제를 처리함으로써 측정된다.

용어 "IGF-I 매개 신호 전달의 완전한 억제" 는 IGF-IR 의 IGF-I-매개 인산 화의 억제를 말한다. 상기 어세이를 위해, IGF-IR 발현 세포, 바람직하게는 H322M 세포를 IGF-I 으로 자극시키고, 본 발명에 따른 항체로 처리한다 (5 nM 이상의 항체 농도가 유용함). 이어서, SDS PAGE 를 수행하고, 인산화된 티로신에 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블로팅 분석에 의해 IGF-IR 의 인산화를 측정한다. 웨스턴 블롯 상에 인산화된 IGF-IR 을 말하는 밴드가 가시적으로 검출될 수 없다면, 신호 전달의 완전한 억제가 발견된다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 항체 18 로서 IGF-IR 의 동일한 에피토프에의 결합을 보여주거나, 또는 항체 18 에 의한 입체 장애로 인해 IGF-IR 에의 결합이 억제된다. 결합 억제는 20 ~ 50　nM 의 농도에서 고정화된 항체 18 및 IGF-IR, 및 100　nM 의 농도에서 검출되는 항체를 사용한 SPR 어세이에 의해 검출될 수 있다. 50% 이상의 신호 감소는, 항체가 항체 18 과 경합함을 나타낸다. 상기 어세이는 고정화된 항체로서 항체 22 를 사용하여 동일한 방식으로 수행될 수 있다.

용어 "에피토프" 는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정소를 의미한다. 에피토프는 보통 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 기로 이루어져 있고, 보통 특이적인 3 차 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징도 가진다.

구조 및 비구조성 에피토프는, 비구조성 에피토프가 아닌 구조성 에피토프에의 결합이 변성화 용매의 존재 하에서는 상실되는 점에서, 구별된다.

본 발명에 따른 항체는 티로신의 IGF-IR 인산화 및 바람직하게는 또한 티로 신의 PKB 인산화를 유사한 정도로 억제시킨다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 종양, 예를 들어, 이종 이식 종양에서와 종양 세포에서 IGF-IR 단백질 수준을 하위조절한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, IGF-IR 발현 세포 (예를 들어, NIH 3T3 세포) 의 증식뿐만 아니라 콜로니 형성 어세이에서 종양 세포의 3 차 성장을 억제시킨다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, 항체를 200 nmol/l 의 농도로 사용하여서는 인슐린 수용체 과발현 3T3 세포 상에서의 결합 경합 어세이에서 인슐린이 인슐린 수용체에 결합하는 것을 억제시키지 않는다.

본 발명에 따른 항체는 항체를 완전히 푸코실화시키는 CHO 세포에서 재조합 기술에 의해 제조된다. 단백질 발현을 위해, 경쇄 및 중쇄 또는 그의 절편을 암호화하는 핵산을 표준 방법에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다. 발현은 상기 CHO 세포에서 수행되고, 항체를 상기 세포 (파쇄 후의 상청액 또는 세포) 로부터 회수한다.

CHO 세포를 배양하고, 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 핵산으로 트랜스펙션시키고, DHFR 선별 압력 하에, 클론을 팽창시키는 단일 클론을 집어내고, 본 발명에 따른 글리코실화 패턴이 있는 항체를 제조하는 클론을 선별하는 것을 포함하는 방법에 의해, 유용한 CHO 숙주 세포를 제조할 수 있다. 바람직하게는, 배양은 2 주 이상, 바람직하게는 3 주 이상 동안 수행된다. CHO 세포는 바람직하게 는DG44 세포이다.

용어 "CHO 세포" 는 2 개의 기능적으로 비활성의, 바람직하게는 소실된 dhfr 대립인자 (디하이드로폴레이트 환원효소 부족 (dhfr^-) 을 바탕으로 한, 다양한 형태의 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포를 포함한다. 상기 dhfr 세포 및 그의 제조 방법은 예를 들어, [Urlaub, G. 등, Cell 33 (1983) 405-412; Chasin, L. 등, Som. Cell Molec. Genet. 12 (1986) 555-556; Kolkekar, A.S. 등, Biochemistry 36 (1997) 10901-10909] 에 기술되어 있다. 바람직하게는, 세포는 DG44 세포주이다. 상기 CHO dhfr^- 세포는 전체 dhfr 좌위를 제거하기 위해 감마선을 사용해 제조될 수 있다. 비-돌연변이의, 야생형 세포에서, dhfr 은 글리신, 퓨린 및 티미딜레이트의 드 노브 (de novo) 합성을 위한 필수적인 효소이다. 이는, 플라스미드 상에서 암호화된 dhfr 유전자가 dhfr^- 결핍 세포주에서 단백질의 발현에 대한 지배적인 선별 마커 및 유전자 증폭제로서 사용될 수 있게 한다. DG44 세포에서의 dhfr^-돌연변이는 안정하고, 비가역적이다. CHO 세포는 인간 IgG1 또는 IgG3 유형의 항체에 대한 발현 벡터(들) 로 성공적으로 공동-트랜스펙션되고, DHFR 유전자는 dhfr+ 표현형을 가질 것이고, 티미딘 및 하이폭산틴이 없고, 임의로 증폭을 위한 메토트렉세이트 (MTX) 가 든 배지 상에서 콜로니를 배양함으로써 쉽게 선별될 수 있다.

DG44 세포는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, Invitrogen Corp.(USA) 으로부터 세포주로서 시판된다. DG44 세포는 현탁액 및/또는 혈청-없는 배지 내에서 부착하면서 자랄 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 표현 "세포," "세포주," 및 "세포 배양물" 은 상호교환적으로 사용되고, CHO dhfr^- 세포주 (2 개의 소실된 dhfr 대립인자) 의 모든 그러한 지정은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질변환체" 및 "형질변환된 세포" 는 1 차 주체 세포 및 트랜스퍼의 수에는 관계없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 정교하거나 또는 우연의 돌연변이로 인해 모든 자손의 DNA 함량이 정확하게 동일할 수 없음을 이해한다. 본래 형질변환된 세포에 대해 스크리닝되는 바와 같은 본 발명에 따른 글리코실화 특성을 가진 변이체 자손이 포함된다.

바람직하게는, CHO dhfr^- 세포주는 하나의 선별가능한 마커 유전자로서 적어도 DHFR 과 함께 공동-증폭된다. 예를 들어, 선별 마커(들) 및 항체 유전자를 함유하는 포유류 발현 벡터는 수여자 CHO 세포 내로 공동-트랜스펙션된다. 생성 콜로니를 선별할 수 있고, 예상된 표현형을 나타내는 콜로니는 항체를 발현할 수 있다. 추가의 선별 마커는 지배적이거나 또는 지배적이지 않을 수 있다. 공동-트랜스펙션의 사용에 대한 추가의 선별 마커의 예에는 아데노신 디아미나제 (Kaufman, R.J., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 3136-3140), 아스파라긴 합성효소 (Cartier, M., 등, Mol. Cell Biol. 7 (1987) 1623-1628), E. coli trpB 유전자 및 Salmonella hisD 유전자 (Hartman, S.C., and Mulligan, R.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 8047-8051), M2 마우스 리보뉴클레오티드 환원효소 (Thelander, M., and Thelander, L., EMBO J. 8 (1989) 2475-2479), 인간 다중약물 내성 유전자 (Kane, S.E., 등, Gene 84 (1989) 439-446), 글루타민 합성효소 (Bebbington, C.R. 등, DNA Cloning, Vol. III, D.M. Glover (ed.), IRL Press, pp. 163-188, 1987), 산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (gpt) (Mulligan, R.C., and Berg, P., Science 209 (1980) 1422-1427), 하이그로마이신 B (Santerre, R.F., 등, Gene 30 (1984) 147-156), 네오마이신 유전자 (Southern, P.J., and Berg, P., J. Mol. Appl.Genet. 1 (1982) 327-341) 가 포함된다.

선별 마커는 또한, 항체를 암호화하는 유전자가 증폭될 수 있는 기본을 제공할 수 있다. CHO 세포주의 공동-트랜스펙션에서, 벡터 DNA 가 종종 동일한 좌위에서 세포의 염색체 내로 삽입된다. 따라서, 증폭을 위한 기본으로서 선별 마커 중 단지 하나를 사용하는 것은 두 유전자 모두의 복사수를 평행하게 증가시킨다. 이러한 방식으로 사용하기 위한 한 특별한 선별 마커는 dhfr 로서, 이는 증가하는 농도의 MTX 를 사용함으로써 원하는 증폭이 수득되게 할 수 있다. 두번째 바람직한 선별 마커는 메티오닌 술폭시민 (MSX) 의 첨가에 의해 증폭을 가능하게 하는 GS 이다.

선별 마커는 물론 DNA 의 조절 원의 조절 하에 있어서, 그의 발현을 제공한다. 선별 마커로서 dhfr 을 사용하는 경우, 조절 원은 바람직하게는 DNA 종양 바이러스와 같은 바이러스 공급원의 것이다. SV40 또는 아데노바이러스 주요 후발 프로모터 (major late promoter) 를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 특히, 이러한 면에서, 프로모터로부터 인핸서 원을 제거해서 그것을 효과적으로 "심 하게 손상시키는 것 (crippling)" 이 유리하다. 이러한 개질은 각각의 농도의 메토트렉세이트 선별에서 강한 프로모터를 사용한다면 발생할 유전자 증폭의 수준이 증가되게 한다. 네오마이신을 선별 마커로서 사용하는 경우, 적합한 프로모터의 예는 마우스 메탈로티오네인 프로모터이다.

항체의 재조합 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, [the review articles of Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., 등, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880] 에 기술되어 있다.

항체는 전체 세포, 상청액, 세포 파쇄물, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태에서 존재할 수 있다. 정제를 수행하여, 다른 세포 성분 또는 다른 오염원, 예를 들어, 다른 세포의 핵산 또는 단백질을 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동, 및 기타 당업계에 잘 알려진 방법을 포함한 표준 기술에 의해 제거한다. [Ausubel, F., 등, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 을 참조한다.

원생동물에 적합한 대조군 서열은 예를 들어, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 사용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적으로 관계하도록 위치될 때, "조작적으로 연결된다". 예를 들어, 예비서열 또는 분비 리더를 위한 DNA 는 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비단백질로서 발현된다면 폴리펩티드를 위한 DNA 에 조작적으로 연결되고 ; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 준다면 코딩 서열에 조작적으로 연결되고 ; 또는 리보좀 결합 부위는 그것이 번역을 유용하게 하도록 위치된다면 코딩 서열에 조작적으로 연결된다. 일반적으로, "조작적으로 연결된" 은 연결되는 DNA 서열이 인접해 있고, 분비 리더의 경우, 인접하면서 해독 골격 내에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해 있을 필요가 없다. 연결은 통상의 제한 부위에서 연결에 의해 이루어진다. 그러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 연결기가 통상의 방식에 따라 사용된다.

모노클로날 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 과정에 의해 하이브리도마 배양 배지로부터 적합하게 분리될 수 있다. 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA 및 RNA 는 통상의 과정을 사용해 하이브리도마로부터 쉽게 단리되고, 서열화된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA 및 RNA 의 공급원으로서 작용할 수 있다. 일단 규명되고 단리되면, DNA 는 발현 벡터 내로 삽입된 다음, 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 CHO 세포에 트랜스펙션되어, 숙주 세포에서 재조합 모노클로날 항체의 합성을 수득할 수 있다.

본 발명은 또한, 화학치료제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 절편), 방사성 동위원소 (즉, 방사성컨쥬 게이트) 또는 세포독성제의 전구약물과 같은 세포독성제에 공액된 본 발명에 따른 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트에 관한 것이다. 상기 면역컨쥬게이트의 제조에 유용한 제제는 상기 기술되었다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 절편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 절편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사신, 알류리테스포디 (Aleuritesfordii) 단백질, 디안틴 (dianthin) 단백질, 파이톨락카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모디카 샤란티아 억제제 (momordica charantia inhibitor), 쿠친 (curcin), 크로틴 (crotin), 사파오나리아 오피시날리스 억제제 (sapaonaria officinalis inhibitor), 겔로닌 (gelonin), 미토겔린 (mitogellin), 레스트릭토신 (restrictocin), 페노마이신 (phenomycin), 에노마이신 (enomycin) 및 트리코테센 (tricothecenes) 을 포함한다.

항체 및 세포독성제의 컨쥬게이트는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2 작용성 유도체 (디메틸 아디피미데이트 HCL 과 같은), 활성 에스테르 (디숙신이미딜 수베레이트와 같은), 알데하이드 (글루타르알데하이드와 같은), 비스-아지도 화합물 (비스(p-아지도벤질)헥산디아민과 같은), 비스-디아조늄 유도체 (비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민과 같은), 디이소시아네이트 (톨릴렌 2,6-디이소시아네이트와 같은), 및 비스-활성 불소 화합물 (1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같은) 과 같은 다양한 2 작용성 단백질 커플링제를 사용하여 생성된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 [Vitetta, E.S., 등, Science 238 (1987) 1098-1104)] 에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA) 은 방사성뉴클레오티드의 항체에의 공액을 위한 실례의 킬레이트제이다. WO　94/11026 을 참조한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형된, 본 발명에 따른 항체를 함유하는 약학적 조성물과 같은 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한, 병용 치료, 즉 다른 제제와 병용해서 투여될 수 있다. 예를 들어, 병용 치료는 본 발명의 조성물을 화학치료제, 세포독성제 또는 전구약물과 같은 항종양제제와 함께 또는 기타 통상의 치료와 함께 포함할 수 있다.

"화학치료제" 는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예에는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노사이드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 탁소테레 (독세탁셀), 부술판, 겜시타빈, 시톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포사이드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크레이스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포사이드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제 4,675,187 호 참조), 멜팔란 및 기타 관련 질소 머스타드가 포함된다.

본원에 사용된 용어 "세포독성제" 는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/거나 또는 세포의 파괴를 야기하는 성분을 말한다. 상기 용어는 방사성 동위원 소, 화학치료제, 및 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 절편과 같은 독소를 포함하는 것이다.

본원에 사용된 용어 "전구약물" 은 모 약물에 비해 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고, 더욱 활성인 모 형태로 화학적으로 활성화되거나 또는 전환될 수 있는 약학적으로 활성인 성분의 전구체 또는 유도체 형태를 말한다. 예를 들어, [Wilman, D.E., Biochemical Society Transactions 14 (1986) 375-382], 및 [Stella, V.J. 등, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," In: Directed Drug Delivery, Borchardt, R.T. 등, (eds.), pp. 247-267, Humana Press, Clifton, New Jersey (1985)] 을 참조한다. 본 발명의 전구약물에는 더욱 활성의 세포독성 자유 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-개질된 전구약물, 글리코실화된 전구약물, β-락탐 고리 전구약물, 임의 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용되는 전구약물 형태로 유도될 수 있는 세포독성 약물의 예에는 상기 기술된 화학치료제가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체" 는 생리학적으로 융화가능한 임의의 그리고 모든 용매, 현탁 매질, 코팅제, 항박테리아 및 항균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 상피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입) 에 적합하다.

"약학적으로 허용가능한 염" 은 항체의 목적하는 생물학적 활성을 유지하고 임의의 목적하지 않는 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 말한다 (예를 들어, [Berge, S.M., 등, J. Pharm. Sci. 66 (1977) 1-19] 참조). 그러한 염은 본 발명에 포함된다. 그러한 염의 예에는 산 부가염 및 염기 부가염이 포함된다. 산 부가염은 염산염과 같이 비독성 무기산으로부터 유도된 염을 포함한다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자에게 알려질 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 다양할 것이다.

특정 투여 경로에 의해 본 발명의 화합물을 투여하기 위해서는, 그의 비활성화를 예방하는 물질로 화합물을 코팅하거나 또는 그러한 물질과 함께 화합물을 공동-투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 적절한 담체, 예를 들어 리포좀, 또는 희석제 내에서 개체에 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제에는 식염수 및 수성 완충액이 포함된다.

약학적으로 허용가능한 담체에는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 약학적 활성 성분을 위한 상기 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다.

본원에 사용된 구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된" 은 보통 주사에 의한 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관 (transtracheal), 피 하, 큐티클하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외, 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.

이러한 조성물은 또한, 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 멸균 과정 등에 의해, 및 다양한 항박테리아 및 항균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 함입 둘 다에 의해 수행될 수 있다. 또한, 당, 염화나트륨 등과 같은 등장성제를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약학적 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써 수행될 수 있다.

선별된 투여 경로와 상관 없이, 적합한 수화물 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 투여량 형태로 제형된다.

본 발명의 약학적 조성물 내 활성 성분의 실제적인 투여 수준은 다양할 수 있어서, 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대한 목적하는 치료적 반응을 달성하기에 효과적이면서 환자에 독성이지 않은 활성 성분의 양을 수득할 수 있다. 선별된 투여량 수준은 적용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 적용되는 특정 화합물의 분비 속도, 치료 기간, 적용되는 특정 조성물과 병용해서 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강상태 및 이전의 의학적 개인력 등 의료 분야에 잘 알려 진 인자를 포함하여 다양한 약물학적 인자에 따라 다를 것이다.

조성물은, 조성물이 주사기에 의해 운반가능할 정도로 유체성이고 멸균되어야 한다. 물 외에도, 담체는 바람직하게는 등장성의 완충된 식염수이다.

적절한 유체성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 현탁액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장성제, 예를 들어, 당, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 폴리알콜, 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 완전히 푸코실화된 항체는 NSCLC (비소세포폐암) 의 치료를 위해서는 바람직하게는 에를로티니브 (타세바

(Tarceva

)) 와 병용해서, 유방암의 치료를 위해서는 허셉틴

(트라스투주마브 (Trastuzumab)) 과 병용해서, 그리고 췌장 종양의 치료를 위해서는 겜시타빈 (겜자

(Gemzar

)) 과 병용해서 유용하다.

하기 실시예, 도면 및 서열 목록은 본 발명의 이해를 돕고자 제공되고, 본 발명의 진정한 범주는 첨부된 청구항에 나타나 있다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않으면서 나타내는 과정에 변형이 이루어질 수 있음을 이해한다.

세포주

재조합 IgG 발현을 위한 세포주의 생성에 사용되는 모 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주, CHO-DG44 이다 (Flintoff, W.F. 등, Somat. Cell Genet. 2 (1976) 245-261; Flintoff 등, Mol. Cell. Biol. 2 (1982) 275-285; Urlaub, G. 등, Cell 33 (1983) 405-412; Urlaub, G. 등, Somat. Cell Mol. Genet. 12 (1986) 555-566). CHO-DG44 세포는 효소 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 에 대해 내성 좌위 둘 다를 상실하였다.

CHO-DG44 세포를 MEM 알파 마이너스 배지 (Gibco No. 22561), 10% 투석된 FCS (Gibco No. 26400-044) 및 2 mmol/L L-글루타민, 100 μM 하이폭산틴, 16 μM 티미딘 (HT 보충제) 내에서 키웠다.

플라스미드

발현 시스템은 CMV 프로모터를 포함하였고, 표 1 에 기술되어 있다. 항체로서, IGF-IR 에 대한 항체 (WO2005005635; AK18 또는 AK22) 를 사용하였다.

Bp	벡터 원/DNA 분절
1-26	독특한 제한 부위 :SgrAI, Sse83871
27-614	인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 프로모터 (CMV-Prom) 인간 CMV IE 프로모터 포함 합성 5'-UTR 포함
615-641	링커
642-780	쥣과 Ig 중쇄 리더 서열 (L1, 신호 서열 인트론, L2)
642-686	L1
687-768	신호 인트론 (SS 인트론)
769-780	L2
781-1105	IGF-IR 항체 (AK18) 의 가변 κ-경쇄 도메인
1106-1140	링커
1141-3134	인간/마우스 κ-경쇄 하이브리드 인트론 2
2433-2913	κ-인핸서 절편
3135-3475	링커
3476-3795	κ-경쇄 불변 영역 (C-카파)
3796-4098	인간 Ig κ-경쇄 폴리아데닐화 서열 (C-카파 pA)
4099-4137	링커
4138-5800	하이그로마이신 내성
4138-4485	72bp 반복, TATA, SV40 기원 포함 SV40 프로모터 (SV40 Prom)
4486-4502	링커
5403-5528	하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제 (Hyg)
5529-5535	링커
5536-5795	SV40 폴리아데닐화 신호 (SV40 pA)
5796-5800	링커
5801-6944	쥣과 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR)
5801-6088	72bp 반복 단축, SV40 기원 포함 SV40 프로모터 (SV40 Prom)
6089-6105	링커
6106-6672	쥣과 DHFR 유전자 (쥣과 DHFR)

Bp	벡터 원/DNA 분절
6673-6679	링커
6680-6944	SV40 폴리아데닐화 신호 (SV40 pA)
6945-7181	링커
7182-8941	pUC18 플라스미드 유래의 박테리아 복제 기원 및 선별 마커
7182-7792	복제 기원 ("pUC 기원")
7793-7939	링커
7940-8847	β-락타마제 유전자 (Ap(r))
8848-8941	링커
8942-9529	인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 프로모터 (CMV-Prom) 인간 CMV IE 프로모터 포함 합성 5'-UTR 포함
9530-9556	링커
9557-9696	쥣과 Ig 중쇄 리더 서열 (L1, 신호 서열 인트론, L2)
9557-9602	L1
9603-9685	신호 인트론 (SS 인트론)
9686-9696	L2
9697-10051	IGF-IR 항체 (AK18) 의 가변 IgG1 중쇄 도메인
10052-10085	링커
10086-11682	인간/마우스 중쇄 하이브리드 인트론 2 마우스 Ig 중쇄 J-분절 영역 일부 포함 Ig 중쇄 인핸서 원 (부분 JH₃, JH₄) 포함 마우스 Ig 중쇄 인핸서 원
11683-11909	링커
11910-13504	인간 IgG1 중쇄 불변 영역 (CH₁-힌지-CH₂-CH₃)
11910-12203	CH1
12594-12638	힌지
12757-13086	CH2
13184-13504	CH3 (대안적인 스플라이스 부위 소실)
13505-13967	인간 IgG1 중쇄 폴리아데닐화 서열 (IgG1 pA)
13968-13970	SgrAI-링커

실시예 1

트랜스펙션 및 선별

발현 플라스미드의 트랜스펙션을 Fugene (Roche Diagnostics GmbH) 을 사용해 수행하였다. 트랜스펙션 후 1 일째에, DG44 세포를 MEM 알파 마이너스 배지, 10% 투석된 FCS 및 2 mmol/L L-글루타민 및 20 nM 메토트렉세이트 (MTX) 로 이루어진 선별 압력 하에 놓았다. 선별 압력 하에 3 주 후, 단일 클론을 플레이트 상에서 집어 내고, 팽창시켰다.

상청액을 수합하고, 항체의 존재를 인간 IgG-특이적 ELISA 를 사용해 분석하였다. 하위클론을 추가로 팽창시키고, 특이적 항체 생성에 대해 분석하였다.

클론은 현탁 배지 및 혈청 없는 배지, 20 nM MTX 를 함유하는 HyQ SFM4 CHO-Utility (HyClone #SH30516) 내에서 성장하도록 적응되었다. 마찬가지로, 글리코패턴 프로파일을 측정하였다. 하위클론을 2.0% 이하의 디푸코실화를 제공하도록 (총 몰 올리고사카라이드 양을 말함) 선별하였다.

실시예 2

배양 및 정제

3 x 10⁵ 세포를 37℃, 5% CO₂, 100 rpm 에서, 30 ml 배지로 채운 125 ml 쉐이크 플라스크 (Corning) 에서 10 일 동안 키웠다. 세포 밀도를 CASY 계수기에 의해 측정하고, 상청액을 취해, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 항체 농도를 측정하였다. 각각의 상청액 약 20 ml 을 단백질 A 크로마토그래피 (PBS 로 균등화시킴, pH 5.2 의 25 mM 소듐 시트레이트 완충액으로 세정, pH 2.8 의 100 mM 소듐 시트레이트 완충액으로 용출, 10 mM NaOH 로 CIP) 에 의해 추가의 생화학적 특징화를 위해 정제하였다.

실시예 3

항체의 글리코구조의 분석

정제된 항체 물질을 액체 크로마토그래피/질량분석법 (LCMS) 펩티드 지도 분석에 의해 분석하였다. 샘플을 환원시키고 (0.4 M TRIS/HCl, 8 M 구아니딘/HCl, pH 8.5, DTT (3 mg/ml)), 카르복시메틸화시키고 (요오도아세트산) 및 트립신으로 절단하였다. 펩티드-글리코펩티드 혼합물을 RP-HPLC 를 사용해 분리하고, 전기분무 질량분석법을 사용해 온라인 분석하였다. 펩티드를 함유하는 글리코구조의 m/z 스펙트럼을 통합하고, 그 결과를 표 2 에 나타내었다.

글리코실화 변이체의 상대량
클론 번호	G0 [%]	G1 [%]	G2 [%]	NonFuc [%]	Man¹ [%]
1	38.4	51.4	10.2	0.1	0.5
2	44.3	47.6	8.1	0.1	0.6
3	42.8	48.7	8.5	0.2	0.8
4	49.2	43.6	7.2	0.3	1.2
5	62.7	33.0	4.3	0.6	1.0
6	60.4	35.5	4.2	0.5	1.2
7	40.4	49.8	9.8	0.3	0.6
8	46.9	45.9	7.3	0.3	1.1
Man : 각각 4 개 및 5 개의 만노스 잔기를 갖고 있는 높은 만노스 구조들. G0, G1, G2 : 1, 2 또는 3 개의 말단 갈락토스 잔기가 있는 푸코실화된 바이안테나리 착체 유형 탄수화물이 있는 환원된 중쇄. nonFuc : 푸코스가 없는 바이안테나리 착체 유형 탄수화물이 있는 환원된 중쇄.

CHO 세포주 클론 5 (hu MAb<IGF-IR>B1-4E10_9-16) 를 특허 과정의 목적을 위해 미생물 기탁의 국제 인정의 부다페스트 조약 하에 [Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germany] 에 2006 년 6 월 21 일에 기탁 번호 DSM ACC 2795 하에 기탁하였다.

HyClone (HyQ SFM4 CHO-Utility, 클론 4 ~ 6 에 사용) 또는 Sigma (C-8862, 클론 1-3 및 7 에 사용) 로부터 상이한 클론의 배양에 사용되는 배지를 구입하였다.

LCMS 펩티드 지도 분석을 모든 글리코펩티드에 대한 모든 전하 상태의 특정 이온 크로마토그램의 삽입에 의해 수행하였다.

바이섹팅 (bisecting) GlcNac, NGNA 및 높은 만노스를 동일한 방식으로 측정하였다.

바이섹팅 GlcNac 및 NGNA 는 검출불가능하였다. 따라서, NGNA 의 양은 0.5% 이하, 바람직하게는 또한 0.1% 이하이다. 또한, 바이섹팅 GlcNac 의 양은 또한 0.5% 이하, 및 0.1% 이하이다.

글리코실화의 실례의 계산은 표 3 에 나타내었다 (표 3a : 클론 3, 표 3b : 클론 5, H27 이라고 하는 asn298 을 포함하는 펩티드).

	영역 z=2	영역 z=3	영역 z=4	합계	상대량 %
H27_G0	616	198	0	814	28.7
H27_G1	734	425	0	1158	40.9
H27_G2	103	135	0	238	8.4
H27_G3	0	0	0	0	0.0
H27_G4	0	0	0	0	0.0
H27_G1_1NGNA	0	0	0	0	0.0
H27_G2_1NGNA	0	0	0	0	0.0
H27_G2_2NGNA	0	0	0	0	0.0
H27_G3_1NGNA	0	0	0	0	0.0
H27_G3_2NGNA	0	0	0	0	0.0
G0 마이너스 GlcNAc 및 마이너스 Man	0	57	0	57	2.0
G0 마이너스 GlcNAc	330	0	0	330	11.7
G1 마이너스 GlcNAc	208	0	0	208	7.4
Man5	22	0	0	22	0.8
G0 마이너스 Fuc	5	0	0	5	0.2
G1 마이너스 Fuc	0	0	0	0	0.0
Man4	0	0	0	0	0.0
총				2833.15	100.00

NGNA 가 있는 글리코구조의 상대량	0.0
갈락토스 (G3 및 G4) 가 있는 글리코구조의 상대량	0.0
높은 만노스의 상대량	0.8
G0 마이너스 Fuc 및 G1 마이너스 Fuc 의 상대량	0.2

합계 G0	42.4
합계 G1	48.2
합계 G2	8.4
총 합계	99.0
100% G0-1-2 에 관해
G0	42.8
G1	48.7
G2	8.5

Man 이 없는 합계	99.2
G0/1 마이너스 Fuc 의 합계	0.2
Fuc 가 없는 상대량	0.2
영역 : 피크 영역. H27-G0-H27-G4 : x-말단 갈락토스가 있는 푸코실화된 바이안테나리 착체 유형 탄수화물이 있는 글리코펩티드 H27 (Asn298 함유) (4 개의 갈락토스 유닛이 있는 G4). Fuc 가 없는 상대량 : 만노스 (4 및 5) 글리코구조 (높은 만노스) 가 없는 모든 G0, G1, G2 와 관련된 Fuc 의 백분율. H27-G1-1NGNA ~ H27-G3-2NGNA : 1 내지 2 개의 N-글리코실-뉴라민산을 갖고 있는 x-말단 갈락토스 유닛 (예를 들어, 2 유닛이 있는 G2) 이 있는 푸코실화된 바이안테나리 착체 유형 탄수화물이 있는 글리코펩티드 H27 (Asn298 함유). Fuc 가 없는 상대량 : 만노스 (4 및 5) 글리코구조 (높은 만노스) 가 없는 모든 G0, G1, G2 와 관련된 Fuc 의 백분율.

글리코실화의 실례의 계산 (클론 5)
	영역 z=2	영역 z=3	영역 z=4	합계	상대량 [%]
G0¹⁾	1108	318	0	1426	43.8
G1¹⁾	579	319	0	897	27.6
G2¹⁾	67	71	0	139	4.3
G3¹⁾	0	0	0	0	0.0
G4¹⁾	0	0	0	0	0.0
G1-1NGNA²⁾	0	0	0	0	0.0
G2-1NGNA²⁾	0	0	0	0	0.0
G2-2NGNA²⁾	0	0	0	0	0.0
G3-1NGNA²⁾	0	0	0	0	0.0
G3-2NGNA²⁾	0	0	0	0	0.0
G0-GlcNAc-Man³⁾	0	95	0	95	2.9
G0-GlcNAc³⁾	485	0	0	485	14.9
G1-GlcNAc³⁾	159	0	0	159	4.9
Man5⁴⁾	32	0	0	32	1.0
G0-Fuc⁵⁾	11	0	0	11	0.3
G1-Fuc⁵⁾	9	0	0	9	0.3
Man4⁴⁾	0	0	0	0	0.0
총				3253.88	100.00

G0					62.7
G1					33.0
G2					4.3
푸코스가 없는 글리코구조					0.6
NGNA 가 있는 글리코구조					0.0
추가의 헥소스가 있는 글리코구조 (G3 + G4)					0.0
높은 만노스 글리코구조					1.0
¹⁾ x-말단 갈락토스 (각각 0, 1, 2, 3 및 4) 가 있는 푸코실화된 바이안테나리 착체유형 글리코구조 . ²⁾ 추가의 n-글리코일 뉴라민산 잔기가 있는 x-말단 갈락토스 (각각 0, 1, 2, 3 및 4) 가 있는 푸코실화된 바이안테나리 착체 유형 글리코구조. ³⁾ 푸코실화된 바이안테나리 착체 유형 글리코구조 (주로 방법의 인공 산물). ⁴⁾ 각각 4 개 또는 5 개의 만노스 잔기를 갖고 있는 높은 만노스 구조. ⁵⁾ 비-푸코실화된 글리코구조.

실시예 4

항-IGF-IR HuMAb 에 의한 항체 매개 효과기 기능의 측정

면역 효과기 기작을 유도하는 생성된 HuMAb 항체의 능력을 측정하기 위해, 항체-의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 연구를 수행하였다.

ADCC 에서 항체의 효과를 연구하기 위해, IGF-IR 을 발현하는 DU145 전립선암 세포 (HTB-81 ATCC ; 2 내지 4 ml RPMI-FM 중 1 x 10⁶) 를 세포 인큐베이터, 37℃ 에서 25 분 동안 1 ㎕ 비스(아세톡시메틸)2,2':6',2"-테르피리딘-6,6"-디카르복실레이트 (BATDA) 용액으로 표지하였다. 세포를 10 ml 의 RPMI-FM 으로 4 회 세정하고, 브레이크가 있는 200 x g 에서 10 분 동안 회전시켰다. 이후, 세포를 ml 당 1 x 10⁵ 세포의 농도로 조정하였다. 5,000 개의 세포를 부피가 50 ㎕ 인 둥근 바닥 플레이트에서 웰 당 플레이팅하였다. HuMAb 항체를 50 ㎕ 부피의 세포 배양 배지에서 25 ~ 0.1 ng/ml 범위의 최종 농도에서 첨가하였다. 이어서, 50 ㎕ 의 효과기 세포, 전혈에서 갓 단리한 PBMC 또는 백혈구연층에서 가져온 정제된 효과기 세포를 25:1 범위의 E:T 비율로 첨가하였다. 플레이트를 브레이크가 있는 200 x g 에서 1 분 동안 바로 원심분리하고, 37℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 200 x g 에서 10 분 동안 회전시켜 가라앉히고, 20 ㎕ 의 상청액을 Optiplate 96-F 마이크로타이터플레이트에 옮겼다. 200 ㎕ 의 유로퓸 용애 (Europium solution) (실온) 을 첨가하고, 혼합물을 쉐이커 상에서 15 분 동안 인큐베이션시켰다. 생성 형광을 Perkin Elmer 사의 EU-TDA 프로토콜을 사용해 시분할 형광분석기에서 측정하였다.

ADCC 에 의한 세포 파쇄의 규모를 각각의 표적 세포에서의 2,2':6',2"-테르피리딘-6,6"-디카르복실레이트 (TDA) 의 지속적인 방출에 대해 보정한, 세제에 의해 파쇄된 표적 세포에서의 TDA 의 최대 방출의 % 로서 표현하였다. "ADCC 없음" 을 보여주는 항체의 대조군 표준물로서, 약 35.000 공여자로부터 단리한 IgG 항체 ("레드이뮨 (Redimune)") 또는 동일한 IgG 유형의 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌) 에 대한 (모노클로날) 항체를 사용하였다. IGF-IR 에 대한 75% 푸코스 없는 항체를 양성 대조군으로서 사용하였다. 본 발명에 따른 항체는, 표준 항체의 TDA 방출의 3xSD 내의 TDA 방출을 보여주었다 (도 1).

실시예 5

항-IGF-IR 항체의 IGF-IR 에 대한 친화성 측정

장비 : BIACORE

3000

칩 : CM5

커플링 : 아민 커플링

완충제 : HBS (HEPES, NaCl), pH 7.4, 25℃

친화성 측정을 위해, 항 인간 FCγ 항체 (토끼에서) 를 IGF-IR 에 대한 항체의 존재에 대해 칩 표면에 커플링시켰다. IGF-IR 세포외 도메인을 용액 내에 다양한 농도로 첨가하였다. 3 분의 IGF-IR-주사에 의해 결합을 측정하고 ; 5 분 동안 완충제로 칩 표면을 세정함으로써 해리를 측정하였다. 항체 18 및 22 에 대한 친화성 데이타를 표 4 에 나타내었다.

SPR (BIACORE 3000) 에 의해 측정된 친화성 데이타
항체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
18	1.49 x 10⁵	1.03 x 10^-7	6.95 x 10^-13
22	1.47 x 10⁵	9.64 x 10^-5	6.56 x 10^-13

실시예 6

IGF-I 및 IGF-II 의, IGF-IR 을 발현하는 종양 세포에의 결합 억제

본 발명의 항체의, 리간드 IGF-I 및 IGF-II 가 IGF-I 수용체 (IGF-IR) 에 결합하는 것을 차단하는 능력을 측정하기 위해, 방사성 표지된 리간드 펩티드를 사용한 경합 실험을 수행하였다.

인간 종양 세포 (HT29, NCI H322M, 0.5 내지 1 x 10⁵/ml) 를 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산 (Gibco, Cat. No. 11140-035), 1 mM 소듐 피루베이트 (Gibco, Cat. No. 11360-039) 및 10% 열 비활성화된 FCS (PAA, Cat. No. A15-771) 가 보충된 RPMI 1640 배지 (PAA, Cat. No. E15-039) 에서 플레이팅하였다. T175 형태의 6 개의 병에 각 실험에 위해 각각의 배지 내 20 ml 세포를 넣고, 37℃ 및 5% CO₂ 에서 2 일 동안 배양하여, 풍부한 세포 단층을 수득하였다.

개별 세포를 수합하기 위해, T175 플라스크 당 2 ml 의 1 x 트립신/EDTA (Gibco, Cat. No. 25300-054) 를 첨가하고, 세포의 탈착을 Zeiss Axiovert25 현미경을 사용해 모니터링하였다. 세포를 수합하고, 이전에 기술한 10% FCS 가 든 배지를 총 부피 50 ml 이 되게 첨가하였다. 세포를 1000 rpm (Heraeus sepatech, Omnifuge 2.0 RS) 에서 10 분 동안 원심분리에 의해 재단리하고, 50 ml 의 결합 완충액 (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgSO₄, 1 mM EDTA, 10 mM D(+)글루코스, 15 mM NaAc, 100 mM Hepes pH 7.6, 1% BSA) 내에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고, 원심분리에 의해 재단리하고, 1 x 10⁶세포/ml 이 되게 결합 완충액으로 조정하였다.

0.1% CH₃COOH 에서 용해된 I¹²⁵-표지된 IGF-I 및 IGF-II 펩티드 (Amersham, ~2000 Ci/mmol, Cat. No. IM172 및 IM238) 를 4 x 10⁵ 수/(분 x ml) 의 최종 활성이 되도록 결합 완충액 내에서 희석시켰다. 25 ㎕ 의 미리희석된 I¹²⁵-표지된 IGF-I 또는 IGF-II 펩티드와 함께 특정 농도에서 75 ㎕ 의 항체를 200 ㎕ 의 세포 현탁액에 첨가하고, 4℃ 에서 3.5 시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 2000 rpm (에펜도르프, 5415C) 에서 5 분 동안 원심분리에 의해 재단리하고, 상청액을 제거하였다. 1 ml 결합 완충액 내에서 2 회 세정한 후, 세포를 1 ml 결합 완충액 내에서 재현탁시키고, 섬광계수 튜브에 옮겼다. 세포 표면 수용체에 결합된 방사성 펩티드의 양을 섬광계수기에서 측정하였다.

항체 18 에 대한 평균 IC₅₀값은 0.3 nM 이었다. IGF-II 결합에 대한 어떠한 검출가능한 억제를 관찰할 수 없었다.

실시예 7

IGF-IR 결합에 대한 항체 경합 어세이

항-IGF-IR 모노클로날 항체의 에피토프 지도화를 위해, 친화성 측정 (실시예 5) 에서와 유사한 포맷을 선택하였으나, IGF-IR 을 용액 내에서 항체와 함께 실온에서 0.5 시간 이상 동안 미리 인큐베이션시켰다. 상기 혼합물을 주입하고, IGF-IR 결합 (또는 억제) 을 검출하였다. 상기 어세이는, IGF-IR 결합에 대한 모노클로날 항체의 상호간의 억제 활성을 측정할 수 있게 한다. 본 발명의 항체가 aa 217-274 에 결합하는 것으로 알려진 항체 αIR3 과 함께 IGF-IR 에의 결합에 대해 경합한다는 것을 발견하였다 (Gustafson, T.A., and Rutter, W.J., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667).

실시예 8

IGF-IR 및 Akt/PKB 의 IGF-I 매개 인산화의 억제

본 발명의 항체가 IGF-I 수용체 (IGF-IR) 의 활성화 및 인산화를 억제시키는 능력을 측정하기 위해, IGF-I 펩티드를 사용한 경합 실험 및 인산화된 티로신에 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블로팅 분석을 수행하였다.

인간 종양 세포 (HT29, NCI H322M, 5 x 10⁴/ml) 를 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산 (Gibco, Cat. No. 11140-035), 1 mM 소듐 피루베이트 (Gibco, Cat. No. 11360-039) 및 0.5% 열 비활성화된 FCS (PAA, Cat. No. A15-771) 가 보충된RPMI 1640 배지 (PAA, Cat. No. E15-039) 내에 플레이팅하였다. IC₅₀ 값의 측정을 위해, 각각의 실험에 위해 12 웰 플레이트에 각각의 배지 내의 1 ml 세포를 넣고, 37℃, 5% CO₂ 에서 2 일 동안 배양하였다.

저 혈청 배지를 사용해 배양한 지 48 시간 후에, 배지를 조심스럽게 제거하고, 각각의 배지 내에 희석시킨 상이한 농도의 항체로 대체하였다. 37℃, 5% CO₂ 에서 5 분 동안 인큐베이션한 후, IGF-I 펩티드를 2 nM 의 최종 농도에서 첨가하고, 세포를 다시 상기 언급한 조건 하에 10 분 동안 인큐베이션시켰다. 배지를 흡입에 의해 조심스럽게 제거하고, 100 ㎕ 의 냉각된 파쇄 완충액을 웰 당 첨가하였다 (50 mM Hepes pH 7.2, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% 글리세롤, 1% Triton

-X100, 100 mM NaF, 10 mM Na₄P₂O₇, 완전

프로테아제 억제제). 세포를 세포 스크랩퍼 (Corning, Cat. No. 3010) 를 사용해 떼어내고, 웰 내용물을 에펜도르프 반응 튜브에 옮겼다. 세포 절편을 13000 rpm, 4℃ 에서 10 분 동안 원심분리에 의해 제거하고, 상청액의 절반을 2 x Laemmli 샘플 완충액에 1:1 (v/v) 의 비율로 첨가하였다. IGF-IR 의 면역침전을 위해, IGF-IRβ 에 대한 폴리클로날 항체 (C-20, Santa Cruz Biotechnologies), 또는 인간 IGF Type 1 수용체의 세포외 도메인 (α-사슬) 의 아미노산 440-586 내의 에피토프를 인지하는 쥣과 모노클로날 항체 (IgG1) (mAb 24-55, GroPep) 1 ㎕ 를 첨가하기 바로 직전에, 남은 절반의 세포 파쇄물을 클리어리파잉 스핀 (clearifying spin) (13000 rpm 및 4℃ 에서 10 분) 시켰다. 회전 에펜도르프 반응 튜브 내, 4℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 25 ㎕ 단백질 G 세파로스

비드 (Amersham Biosciences, Cat. No. 17-0618-01) 를첨가하고, 4℃ 에서 1 시간 동안 또다른 인큐베이션 단계를 후속하였다. 항체-단백질-착체와 결합한 비드를 원심분리 (2000 rpm, 4℃ 에서 1 분) 에 의해 단리하고, 세정 완충액 (0.1% Triton

-X100 만 있는 파쇄 완충액) 으로 3 회 세정하였다. Laemmli 샘플 완충액 내에서 비드를 끓인 후, 세포의 단백질을 SDS-PAGE 에 의해 분리하고, 반건조 웨스턴 블로팅에 의해 니트로셀룰로스막 (PROTRAN

BA 85, Schleicher&Schuell) 에 옮겼다.

포스포티로신 특이적 항체 (Upstate, 클론 4G10, Cat. No. 05-321) 를 사용하여, 면역정제된 IGF-IR 의 인산화 상태를 측정하였다. 인산화된 Akt/PKB 검출을 위해, 인산화된 Ser473 에 대한 특이성을 가진 항체 (Cell Signalling, Cat. No. 9271) 를 사용하였다.

항체 18 이 IGF-IR 및 PKB 의 IGF-1 매개 인산화를 0.6 nM 의 IC₅₀ 으로 억제시킬 수 있음을 발견하였다.

실시예 9

IGF-IR 의 항체 매개 하위조절의 시험관 내 유도

본 발명의 항체의, 종양 세포의 IGF-I 수용체 (IGF-IR) 양에 대한 효과를 검출하기 위해, IGF-IR 특이적 항체를 사용한 시간 경과 실험 및 후속한 웨스턴 블로팅 분석을 수행하였다.

2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산 (Gibco, Cat. No. 11140-035), 1 mM 소듐 피루베이트 (Gibco, Cat. No. 11360-039) 및 10% 열 비활성화된 FCS (PAA, Cat. No. A15-771) 가 보충된 RPMI 1640 배지 (PAA, Cat. No. E15-039) 내 인간 종양 세포 (HT29, 5 x 10⁴ 세포/ml) 를 사용하였다. 각 인큐베이션 기간 동안, 각각의 실험을 위해 하나의 12 웰 플레이트에 각각의 배지 내 1 ml 세포를 넣고, 37℃ 및 5% CO₂에서 24 시간 동안 배양하였다.

배지를 조심스럽게 제거하고, 각각의 배지 내에 희석시킨 상이한 농도의 항체로 대체하였다. 2 개의 대조군 웰에서, 배지를 항체가 없는 배지, 또는 대조군 항체 (AB-1, Oncogene, Cat. No. GR11) 가 있는 배지로 대체하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂ 에서 인큐베이션시키고, 개별 플레이트를 15 분, 24 시간 및 48 시간 후에 추가의 처리를 위해 수집하였다.

배지를 흡입에 의해 조심스럽게 제거하고, 100 ㎕ 의 냉각된 파쇄 완충액을 웰 당 첨가하였다 (50 mM Hepes pH 7.2, 150 mM NaCl, 1mM EGTA, 10% 글리세롤, 1% Triton

-X100, 100 mM NaF, 10 mM Na₄P₂O₇, 완전

프로테아제 억제제). 세포를 세포 스크랩퍼 (Corning, Cat. No. 3010) 를 사용해 떼어내고, 웰 내용물을 에펜도르프 반응 튜브에 옮겼다. 세포 절편을 13000 rpm, 4℃ 에서 10 분 동안 원심분리에 의해 제거하고, 상청액의 절반을 2 x Laemmli 샘플 완충액에 1:1 (v/v) 의 비율로 첨가하였다. 세포의 단백질을 SDS-PAGE 에 의해 분리하고, 반건조 웨스턴 블로팅에 의해 니트로셀룰로스막 (PROTRAN

BA 85, Schleicher&Schuell) 에 옮겼다.

IGF-IR 에 특이적인 항체 (C-20, Santa Cruz Biotechnologies, Cat. No. sc-713) 를 사용하여, IGF-IR 의 단백질 수준을 측정하였다.

항체 첨가 후 24 시간 미만 후에 본 발명의 항체에 의해 유도되는 IGF-IR 의 하위조절을 관찰하였다.

실시예 10

인간 인슐린 수용체를 발현하는 3T3-세포에의 인슐린 결합 억제

본 발명의 항체가 인슐린이 인슐린 수용체 (IR) 에 결합하는 것을 또한 차단하는지 알아보기 위해, 방사성 표지 리단드 펩티드를 사용해 경합 실험을 수행하였다.

재조합적으로 높은 수의 (> 10⁵) 인간 IR 을 발현하는 3T3 세포 (1 x 10⁵/ml) 를 2 mM L-글루타민 (Gibco, Cat. No. 25030-024) 및 10% 열 비활성화된 FCS (PAA, Cat. No. A15-771) 가 보충된 높은 글루코스 (PAA, Cat. No. E15-009) 가 있는 MEM Dulbecco 배지 (DMEM) 에서 플레이팅하였다. 각각의 실험을 위해, T175 형태의 6 개의 병에 개별 배지 내의 20 ml 세포를 넣고, 37℃ 및 5% CO₂ 에서 2 일 동안 배양하여, 풍부한 세포 단층을 수득하였다.

개별 세포를 수합하기 위해, T175 플라스크 당 2 ml 의 1 x 트립신/EDTA (Gibco, Cat. No. 25300-054) 를 첨가하고, 세포의 탈착을 현미경을 사용해 모니터링하였다. 세포를 수합하고, 이전에 기술한 10% FCS 가 든 배지를 첨가하여 총 부피가 50ml 이 되게 하였다. 세포를 1000 rpm 에서 10 분 동안 원심분리하여 재단리하고, 50 ml 의 결합 완충액 (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgSO₄, 1 mM EDTA, 10 mM D(+)글루코스, 15 mM NaAc, 100 mM Hepes pH 7.6, 1% BSA) 에서 재현탁시켰다. 세포를 계수하고, 원심분리에 의해 재단리하고, 결합 완충액으로 1 x 10⁶ 세포/ml 로 조정하였다.

0.1% CH₃COOH 에서 용해된 I¹²⁵-표지된 인슐린 펩티드 (Amersham, Cat. No. IM166, ~2000 Ci/mmol) 를 최종 활성이 4 * 10⁵ 수/(분 * ml) 가 되게 결합 완충액 내에서 희석시켰다. 25 ㎕ 의 미리희석시킨 I¹²⁵-표지된 인슐린 펩티드와 함께 75 ㎕ 의 항체를 200 ㎕ 의 세포 현탁액 (최종 항체 농도 200　nM) 에 첨가하고, 4℃ 에서 3.5 시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 2000 rpm 에서 5 분 동안 원심분리에 의해 재단리하고, 상청액을 제거하였다. 1 ml 결합 완충액에서 2 회 세정한 후, 세포를 1 ml 결합 완충액 내에 재현탁시키고, 섬광계수 튜브에 옮겼다. 세포 표면 수용체에 결합된 방사성 펩티드의 양을 섬광계수기에서 측정하였다.

결과에서, 본 발명의 항체가 인슐린 리간드가 인슐린 수용체에 결합하는 것을 방해하지 않는다는 것을 알게 되었다.

실시예 11

IGF-IR 및 Akt/PKB 인산화의 비자극

본 발명의 항체의 IGF-IR 자극 활성을 차단하기 위해, IGF-IR 의 인산화를 IGF-I 리간드의 부재 하에, 그러나 본 발명의 항체 및 대조군 항체 (αIR3, Oncogene, Germany) 의 존재 하에 측정하였다. 인산화-상태 특이적 항체를 사용한 웨스턴 블로팅 분석에 의해 이를 수행하였다. IGF-IR (5 * 10⁴세포/ml, Pietrzkowski, Z., 등, Cell Growth Differ. 4 (1992) 199-205) 로 트랜스펙션시킨3T3 세포 (ATCC CRL 1658) 를 2 mM L-글루타민 (Gibco, Cat No. 25030-024) 및 0.5% 열 비활성화된 FCS (PAA, Cat No. A15-771) 가 보충된 높은 글루코스 (PAA, Cat No. E15-009) 가 있는 MEM Dulbecco 배지 (DMEM) 에서 플레이팅하거나, 또는 인간 종양 세포 (HT29, NCI H322M, 5 * 10⁴/ml) 를 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산 (Gibco, Cat No. 11140-035), 1 mM 소듐 피루베이트 (Gibco, Cat No. 11360-039) 및 0.5% 열 비활성화된 FCS (PAA, Cat No. A15-771) 가 보충된 RPMI 1640 배지 (PAA, Cat No. E15-039) 에서 플레이팅하였다. IC₅₀ 값의 측정을 위해, 개별 실험을 위한 12 웰 플레이트에 각각의 배지 내 1 ml 세포를 넣고, 37℃ 및 5% CO₂에서 2 일 동안 배양하였다.

저 혈청 배지를 사용한 배양 48 시간 후에, 배지를 조심스럽게 제거하고, 각각의 배지에 희석시킨 상이한 농도의 항체로 대체하였다. 세포를 상기 언급한 조건 하에 15 분 동안 인큐베이션시켰다. 배지를 흡입에 의해 조심스럽게 제거하고, 100 ㎕ 의 냉각된 파쇄 완충액을 웰 당 첨가하였다 (50 mM Hepes pH 7.2, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% 글리세롤, 1% Triton

-X100, 100 mM NaF, 10 mM Na₄P₂O₇, 완전

프로테아제 억제제). 세포를 세포 스크랩퍼 (Corning, Cat. No. 3010) 를 사용해 떼어내고, 웰 내용물을 에펜도르프 반응 튜브에 옮겼다. 세포 절편을 13000 rpm, 4℃ 에서 10 분 동안 원심분리에 의해 제거하고 (에펜도르프 원심분리 5415R), 상청액의 절반을 2 x Laemmli 샘플 완충액에 1:1 (v/v) 의 비율로 첨가하였다. IGF-IR 의 면역침전을 위해, IGF-IR 에 대한 항체 (C-20, Santa Cruz Biotechnologies, Cat No. sc-713 또는 mAb 24-55, GroPep, Cat No. MAD1) 1 ㎕ 를 첨가하기 바로 직전에, 남은 세포 파쇄물의 상청액을 클리어리파잉 스핀 (13000 rpm 및 4℃ 에서 10 분) 시켰다. 회전 에펜도르프 반응 튜브 내, 4℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 25 ㎕ 단백질 G 세파로스™ 비드 (Amersham Biosciences, Cat. No. 17-0618-01) 를 첨가하고, 4℃ 에서 1 시간 동안 또다른 인큐베이션 단계를 후속하였다. 항체-단백질-착체와 결합한 비드를 원심분리 (2000 rpm, 4℃ 에서 1 분) 에 의해 단리하고, 세정 완충액 (0.1% Triton

BA 85, Schleicher&Schuell) 에 옮겼다.

포스포티로신 특이적 항체 (Upstate, 클론 4G10, Cat. No. 05-321), 티로신-인산화된 단백질 인지를 사용하여, 면역정제된 IGF-IR 의 인산화 상태를 측정하였다. 인산화된 Akt/PKB 검출을 위해, 인산화된 Ser473 에 대한 특이성을 가진 Akt1 에 대한 항체 (Cell Signalling, Cat. No. 9271) 를 사용하였다.

IGF-IR 의 신호 경로에 있는 Akt/PKB 키나아제 하류가 5 nM 초과의 농도에서 대조군 항체에 의해 유의하게 활성화되었으나, 10.000 nM 이하의 농도에서 본 발명의 항체에 의해서는 활성화되지 않았음을 관찰하였다.

실시예 12

H322M 이종 이식 모델에서 수용체 하위 조절의 유도

종양을 누드 마우스에서 유도하고, 상이한 농도의 본 발명의 항체로 한번 처리하였다. 처리 후 24 시간 째에, 종양을 추출하고, 액체 질소 하에 균질화시켰다. 냉각된 파쇄 완충액을 완충액 부피 대 종양 중량비를 3:1 로 해서 첨가하고 (50 mM Hepes pH 7.2, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% 글리세롤, 1% Triton-X100, 100 mM NaF, 1 mM Na₃V0₄, 10 mM Na₄P₂O₇, 완전™ 프로테아제 억제제, 1 mM PMSF), 종양 균질물을 해동하면서 완전히 혼합하였다. 조직을 얼음 상에서 15 분 동안 용해시킨 후, 불용성 절편을 13000 rpm 및 4℃ 에서 10 분 동안 원심분리에 의해 제거하였다 (에펜도르프 원심분리 5415R). 샘플의 단백질 농도를 Micro BCA™ 시약 (Pierce) 을 사용해 측정하고, 파쇄 완충액을 첨가하여, 동일한 농도로 조정하였다. 상청액 일부를 2 x Laemmli 샘플 완충액에 1:1 (v/v) 비율로 첨가하였다. 세포의 단백질을 SDS-PAGE 에 의해 분리하고, 니트로셀룰로스막 (PROTRAN BA 85, Schleicher&Schuell, CatNo. 10 401196) 에 반건조 웨스턴 블로팅에 의해 옮겼다. IGF-IR 특이적 항체 (C-20, Santa Cruz Biotechnologies, CatNo. sc-713) 를 사용하여, IGF-IR 을 검출하였다.

본 발명의 항체를 사용한 처리 시, 0.6 mg/kg 에서 측정된 EC50 값을 가진 IGF-IR 수준의 농도 의존성 감소가 관찰되었다.

실시예 1 3

H322M 종양 성장 억제

생체 내 항체 18 의 효과를 구축된 방법에 따라 흉선이 없는 누드 마우스 (athymic nude mice) 에 종양을 유도함으로써 연구하였다. 인간 H322M NSCLC 세포를 6 ~ 7 주령의 흉선이 없는 누드 마우스 (nu/nu) 에 마트리젤 (Matrigel) 과 함께 지속적으로 공동주사하였다. 이를 위해, 5 x 10⁶ H322M 세포를 100 ㎕ 배양 배지에서 농축시키고, 100 ㎕ 마트리젤과 혼합하였다. 200 ㎕ 의 상기 혼합물을 마우스의 우측 옆구리에 주사하였다. Geran 등 ("Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological system", Cancer Chemother. Rep. 11.301, 1972) 에 의해 처음으로 출판된 화학식에 따라 1 주에 2 회 Vernier 칼리퍼를 사용해 종양 직경을 측정함으로써 종양 부피를 계산하였고, 여기서 종양 부피 [mg] = (길이 x (너비)²) 이었다. 항체를 10 ml/kg 에서 복강 내 (i.p.) 투여하였다. 부피가 2 배로 되었을 때 투여되는 항체의 투여량을 2 배로 해서 치료를 시작하였다. 상기 기술된 바와 같이 누드 마우스에서 종양을 유도하였다. 종양이 160 mg 의 평균 부피로 자란 후에, 치료 첫 날에 일단 12, 1.2 및 0.12 mg/kg 으로 로딩 투여량을 제공하여 시작하면서 연속적인 투여로서 6, 0.6 및 0.06 mg/kg 의 항체를 1 주에 1 회씩 6 회 마우스에 복강 내 처리하였다. 실험은, rhu 항-IGF-IR mAb 18 에 의한 IGF-IR 축의 차단이 항종양 효능을 초래하였고, 이는 6 및 0.6 mg/kg 에서 단일 제제로서 투여했을 때였음을 보여주었다. 반대로, 0.06 mg/kg 은 종양 성장에 대해 어떠한 효과를 미치지 않았다.

또한, 항체 18 을 동일한 모델에서 겜시타빈과 병용해서 테스트하였다. 종양을 상기 기술된 바와 같이 유도하였고, 종양이 구축되고, 모든 군에서 평균 170 mm³ 로 자랐을 때, 치료를 시작하였다. 항체를 0.6 mg 에서 62 mg/kg 의 겜시타빈과 병용해서 6 및 0.6 mg/kg 에서 1 주에 1 회 복강 내 투여하였다. 겜시타빈을 1 사이클, 즉 총 4 회 동안 매 3 일째에 투여하였다. 항체의 투여량을 2 배로 해서 투여함으로써 치료를 시작하였다. 실험은, 항체 18 을 7 일 마다 1 회씩 투여하는 치료는 종양 성장 자체를 억제시키고, 공지된 항대사성 화합물인 겜시타빈의 효능을 증대시키는 것을 보여주었다.

실시예 14

3T3 종양 성장 억제

인간 IGF-IR 을 과발현하는 쥣과 3T3 섬유아세포를 사용하는 것을 제외하고는, 종양을 실시예 15 에서 기술한 바와 같이 본질적으로 누드 마우스에서 유도하였다. 대략 180 mg 의 종양이 구축된 마우스에 18, 6 또는 0.6 mg/kg 의 항체 18 을 매 주 1 회씩 7 회 동안 복강 내 처리하였다. 로딩 투여량으로서 주어지는 항체를 2 배 투여량 (36, 12 및 1.2 mg/kg) 으로 해서 치료를 시작하였다. 실험은, 18 및 6 mg/kg 에서 1 주에 1 회씩 투여했을 때, 항체를 사용한 치료에 의해 종양 성장이 지연될 수 있음을 보여주었다.

실시예 15

IGF-IR 의 항체 매개 하위조절의 시험관 내 유도

종양 세포에서 IGF-I 수용체 (IGF-IR) 의 양에 대한 본 발명의 항체의 효과를 검출하기 위해, IGF-IR 특이적 항체를 사용한 시간 경과 실험 및 후속한 웨스턴 블로팅 분석을 수행하였다.

2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산 (Gibco, Cat. No. 11140-035), 1 mM 소듐 피루베이트 (Gibco, Cat. No. 11360-039) 및 10% 열 비활성화된 FCS (PAA, Cat No. A15-771) 가 보충된 RPMI 1640 배지 (PAA, Cat No. E15-039) 에 있는 인간 종양 세포 (HT29, 5 x 10⁴ 세포/ml) 를 사용하였다. 각 인큐베이션 기간 동안, 1 개의 12 웰 플레이트에 각각의 실험을 위한 개별 배지 내 1 ml 세포를 넣고, 37℃ 및 5% CO₂에서 24 시간 동안 배양하였다.

배지를 조심스럽게 제거하고, 각각의 배지 내에서 희석시킨 상이한 농도의 항체로 대체하였다. 2 개의 대조군 웰에서, 배지를 항체가 없는 배지, 또는 대조군 항체 (AB-1, Oncogene, Cat. No. GR11) 가 있는 배지로 대체하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션시키고, 15 분, 24 시간 및 48 시간 후에 추가의 처리를 위해 개별 플레이트를 취하였다.

배지를 흡입에 의해 조심스럽게 제거하고, 100 ㎕ 의 냉각된 파쇄 완충액을 웰 당 첨가하였다 (50 mM Hepes pH 7.2, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% 글리세롤, 1% Triton

-X100, 100 mM NaF, 10 mM Na₄P₂O₇, 완전

프로테아제 억제제). 세포를 세포 스크랩퍼 (Corning, Cat. No. 3010) 를 사용해 떼어내고, 웰 내용물을 에펜도르프 반응 튜브에 옮겼다. 세포 절편을 13000 rpm, 4℃ 에서 10 분 동안 원심분리에 의해 제거하고, 상청액을 2 x Laemmli 샘플 완충액에 1:1 (v/v) 의 비율로 첨가하였다. 세포의 단백질을 SDS-PAGE 에 의해 분리하고, 반건조 웨스턴 블로팅에 의해 니트로셀룰로스막 (PROTRAN

BA 85, Schleicher&Schuell) 에 옮겼다.

항체 첨가 후 24 시간 후에 본 발명의 항체에 의해 유도되는 50% 이상의 IGF-IR 의 하위조절을 관찰하였다.

<110> F. Hoffmann-La Roche <120> Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof <130> 23707 WO <150> EP 06007571 <151> 2006-04-11 <150> EP 06016204 <151> 2006-08-03 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys 100 105 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(990) <400> 5 gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 384 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 432 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 528 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 576 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag 720 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 990 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 6 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 7 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 7 cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 tcg ggt aac tca cag gag agc gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt 321 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims

인간 IgG1 또는 IgG3 유형이며 Asn297 에서 당 사슬로 글리코실화된 IGF-IR 에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 상기 당 사슬 내 푸코스의 양이 99% 이상 ("완전 푸코실화된") 이고, 또한, NGNA 의 양이 1% 이하이고/거나 또는 N-말단 알파-1,3-갈락토스의 양이 1% 이하인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항에 있어서, NGNA 의 양이 0.5% 이하인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, N-말단 알파-1,3-갈락토스의 양이 0.5% 이하인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 키메라성, 인간화된 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 보여주는 것을 특징으로 하는 항체 :

a) IGF-I 의 IGF-IR 에의 결합 억제의 IC₅₀ 값 대 IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합 억제의 IC₅₀ 값의 비율이 1:3 내지 3:1 임을 보여줌,

b) 0.5% 열 비활성화된 태아 소 혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 내의 HT29 세포를 사용한 세포의 인산화 어세이에서, 상기 항체가 없는 그러한 어세이와 비교했을 때, 5 nM 의 농도에서 IGF-IR 인산화를 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상 억제시킴,

c) 0.5% 열 비활성화된 태아 소 혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 내의 세포 당 400,000 내지 600,000 개의 분자 IGF-IR 을 제공하는 3T3 세포를 사용한 세포의 인산화 어세이에서, 상기 항체가 없는 그러한 어세이와 비교했을 때, 10 μM 의 농도에서 PKB 인산화로서 측정되는 IGF-IR 자극 활성을 나타내지 않음 (신호화 없음, IGF-1 모방 활성 없음).
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10^-13 내지 10^-9　M (K_D) 의 친화성을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상보성 결정 영역 (CDR) 으로서 하기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 :

a) CDR 로서 SEQ　ID　NO:1 또는 3 의 CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) 및 CDR3 (aa 99-107) 을 포함하는 항체 중쇄 :

b) CDR 로서 SEQ　ID　NO:2 또는 4 의 CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) 및 CDR3 (aa 89-98) 을 포함하는 항체 경쇄.
약학적 조성물의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 약학적 유효량으로 함유하는 약학적 조성물.
약학적 유효량의 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법.
약학적 유효량의 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는, 항종양 치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법.
제 15 항에 있어서, 항체를 세포독성제, 그의 전구약물 또는 세포독성 방사선치료와 병용해서 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 재조합적으로 발현할 수 있는 CHO 세포.