CN101421305A - 针对胰岛素样生长因子ⅰ受体的抗体及其应用 - Google Patents
针对胰岛素样生长因子ⅰ受体的抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种结合IGF-IR的抗体在抗肿瘤治疗中具有提高的特性,所述抗体是人IgG1或IgG3型并且在Asn297上被糖链所糖基化,所述抗体特征在于所述糖链内岩藻糖的量为至少99%,此外NGNA的量为1%或更少和/或N末端α-1,3-半乳糖的量为1%或更少。
Description
本发明涉及针对胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR)的抗体,制备它们的方法,包含所述抗体的药物组合物及其应用。
胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR,EC 2.7.112,CD 221抗原)属于跨膜蛋白酪氨酸激酶的家族(LeRoith,D.,等,Endocrin.Rev(内分泌综述).16(1995)143-163;和Adams,T.E.,等,Cell.Mol.Life Sci(细胞分子生命科学).57(2000)1050-1093)。IGF-IR高亲和力地结合IGF-I并且在体内激发对这种配体的生理响应。IGF-IR还结合IGF-II,但亲和性稍低。IGF-IR的过量表达促进了细胞的致瘤性转化并且存在IGF-IR涉及细胞的恶性转化的证据,因此其是一个开发治疗癌症的治疗剂的有用靶标(Adams,T.E.,等,Cell.Mol.Life Sci(细胞分子生命科学).57(2000)1050-1093)。
针对IGF-IR的抗体在现有技术中是众所周知的,并且在体外和体内对它们的抗肿瘤效果进行了研究(Benini,S.,等,Clin.Cancer Res(临床癌症研究).7(2001)1790-1797;Scotlandi,K.,等,Cancer Gene Ther(癌症基因治疗).9(2002)296-307;Scotlandi,K.,等,Int.J.Cancer(国际癌症杂志)101(2002)11-16;Brunetti,A.,等,Biochem.Biophys.Res.Commun(生物化学生物物理研究通讯).165(1989)212-218;Prigent,S.A.,等,J.Biol.Chem(生物化学杂志).265(1990)9970-9977;Li,S.L,等,Cancer Immunol.Immunother.49(2000)243-252;Pessino,A.,等,Biochem.Biophys.Res.Commun(生物化学生物物理研究通讯).162(1989)1236-1243;Surinya,K.H.,等,J.Biol.Chem(生物化学杂志).277(2002)16718-16725;Soos,M.A.,等,J.Biol.Chem(生物化学杂志).,267(1992)12955-12963;Soos,M.A.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)86(1989)5217-5221;O'Brien,R.M.,等,EMBO J.6(1987)4003-4010;Taylor,R.,等,Biochem.J.242(1987)123-129;Soos,M.A.,等,Biochem.J.235(1986)199-208;Li,S.L,等,Biochem.Biophys.Res.Commun(生物化学生物物理研究通讯).196(1993)92-98;Delafontaine,P.,等,J.Mol.Cell.Cardiol.26(1994)1659-1673;Kull,F.C.Jr.,等J.Biol.Chem(生物化学杂志).258(1983)6561-6566;Morgan,D.O.,和Roth,R.A.,Biochemistry(生物化学)25(1986)1364-1371;Forsayeth,J.R.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)84(1987)3448-3451;Schaefer,E.M.,等,J.Biol.Chem(生物化学杂志).265(1990)13248-13253;Gustafson,T.A.,和Rutter,W.J.,J.Biol.Chem(生物化学杂志).265(1990)18663-18667;Hoyne,P.A.,等,FEBS Lett.469(2000)57-60;Tulloch,P.A.,等,J.Struct.Biol(结构生物学杂志).125(1999)11-18;Rohlik,Q.T.,等,Biochem.Biophys.Res.Comm(生物化学生物物理研究通讯).149(1987)276-281;和Kalebic,T.,等,Cancer Res(癌症研究).54(1994)5531-5534;Adams,T.E.,等,Cell.Mol.Life Sci(细胞分子生命科学).57(2000)1050-1093;Dricu,A.,等,Glycobiology(糖生物学)9(1999)571-579;Kanter-Lewensohn,L,等,Melanoma Res(黑素瘤研究).8(1998)389-397;Li,S.L,等,Cancer Immunol.Immunother.49(2000)243-252)。针对IGF-IR的抗体还描述于许多其它出版物中,例如Arteaga,C.L,等,Breast CancerRes(乳腺癌研究).Treatment(治疗)22(1992)101-106;和Hailey,J.,等,Mol.Cancer Ther(分子癌症治疗).1(2002)1349-1353。
具体地,将针对IGF-IR的称为αIR3的单克隆抗体广泛应用于研究IGF-IR介导的过程和IGF-I介导的疾病诸如癌症的研究中。α-IR-3在Kull,F.C.,J.Biol.Chem(生物化学杂志).258(1983)6561-6566中有所描述。同时,已经公开了约百篇涉及αIR3的研究及其治疗应用的出版物,涉及αIR3单独和与细胞生长抑制剂诸如多柔比星和长春新碱一起的抗肿瘤效果。αIR3是一种鼠单克隆抗体,已知其抑制IGF-I与IGF受体的结合但是不抑制IGF-II与IGF-IR的结合。高浓度的αIR3刺激肿瘤细胞增殖和IGF-IR的磷酸化(Bergmann,U.,等,Cancer Res(癌症研究).55(1995)2007-2011;Kato,H.,等,J.Biol.Chem(生物化学杂志).268(1993)2655-2661)。存在其它抗体(例如,1H7,Li,S.L.,等,Cancer Immunol.Immunother.49(2000)243-252),与抑制IGF-I的结合比较,其更有效抑制IGF-II与IGF-IR的结合。抗体以及它们的特性和性状的现有技术的概要在Adams,T.E.,等.,Cell.Mol.Life Sci(细胞分子生命科学).57(2000)1050-1093中有所描述。
描述在现有技术中的大多数抗体起源自小鼠。如在现有技术中众所周知的,在没有经过进一步的改变诸如嵌合化或人源化的情况下,这些抗体对于治疗人患者是没有作用的。基于这些缺陷,在治疗人患者中,明显优选将人抗体作为治疗人患者的治疗剂。在现有技术中,人抗体是众所周知的(van Dijk,M.A.,和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。基于这项技术,可以制备针对许多种类靶目标的人抗体。针对IGF-IR的人抗体的实例在WO 02/053596,WO2004071529,WO2005016967WO2006008639,US20050249730,US20050084906,WO2005058967,WO2006013472,US20030165502,WO2005082415,WO2005016970,WO03106621,WO04083248,WO2003100008,WO2004087756,WO2005005635和WO2005094376中有所描述。
但是,对于需要抗肿瘤治疗的患者而言,仍然需要具有令人信服的益处的针对IGF-IR的抗体。简而言之,与患者有关的益处是通过用抗肿瘤发生药治疗使肿瘤生长减少,并使其进展时间明显延长。
Routier,F.H.等,Glycoconjugate J(糖缀合物杂志).14(1997)201-207报道在CHO-DUKX细胞中表达的人源化IgG1抗体的糖基化作用模式。这种抗体显示0.8:3.0的Fuc:Man的摩尔比,它表示80%的岩藻糖基化比例。Niwa,R.等,J.Immunol.Methods(免疫方法杂志)306(2005)151-160报道在CHO DG44中重组生产的抗CD20 IgG1和IgG3抗体岩藻糖基化分别为90%和91%。Mimura,Y.等,J.Immunol.Methods(免疫方法杂志)247(2001)205-216报道丁酸盐提高CHO-K1细胞中的人嵌合IgG的生产,同时保持功能和糖形模式。寡糖模式显示相当含量的非岩藻糖基化聚糖结构。Raju,T.S.,BioProcess International 1(2003)44-53报道了表达系统糖基化作用变化对于治疗性免疫球蛋白生物学活性的影响和命名法。Ma,S.等,Anal.Chem.71(1999)5185-5192报道了利妥昔单抗的糖类分析。利妥昔单抗显示9-10%的岩藻糖基化(Niwa,R.等,J.Immunol.Methods(免疫方法杂志)306(2005)151-160)。Fujii,S.,J.Biol.Chem(生物化学杂志)265(1990)6009-6018报道牛IgG包括大约11%的非岩藻糖基化IgG。Mizuochi,T.,J.Immunol(免疫学杂志).129(1982)2016-2020报道人IgG为大约14%非岩藻糖基化。Bergwerff,A.A.,Glycoconjugate J(糖缀合物杂志).12(1995)318-330报道在小鼠SP2/0中生产的抗体包含大量的N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)寡糖。Nahrgang,S.等,在:Animal Cell Technology:Products fromCells,Cells as Products(动物细胞技术:来自细胞的产物,细胞作为产物)中,Bernard,A.等(eds.),Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,NL,(1999)第259-261页,报道了IgG1的CHO表达,在瞬时转染后发现少量的全部(overall)糖基化作用。Lund,J.等,Mol.Immunol.(分子免疫学)30(1993)741-748报道了在小鼠转染瘤细胞中重组生产小鼠-人嵌合抗体。IgG1抗体非岩藻糖基化的量为13%。Patel,T.P.,等,Biochem.J.(生物化学杂志)285(1992)839-845报道了来自杂交瘤细胞和小鼠腹水的抗体的糖基化作用。Niwa R.等,J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)306(2005)151-160,报道在CHO DG44中的重组生产之后CD20 IgG1抗体的岩藻糖基化为91%,而Mori,K.等,Biotech.Bioeng(生物技术生物工程).88(2004)901-908报道岩藻糖基化为94%。Davies,J.,等,Biotechnol.Bioeng(生物技术生物工程).74(2001)288-294报道糖形改变的抗体的表达导致ADCC的提高。Sheeley,D.M.,等,Anal.Biochem.247(1997)102-110比较了不同表达系统中的抗体糖基化作用。Shields,R.L,等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)277(2002)26733-26740报道人IgG1 Fc上岩藻糖的缺失提高了FcγRIII结合和ADCC。约90%岩藻糖基化的抗Her2抗体也显示相当大量的ADCC。Zhu,L.,等,Nature Biotechnol(自然生物技术).23(2005)1159-1169报道了在鸡蛋中生产人抗体。
发明概述
本发明包括一种抗体,其结合IGF-IR,是人IgG1或IgG3型并且在Asn297上被糖链所糖基化,所述抗体特征在于所述糖链内岩藻糖的量为至少98%(“完全岩藻糖基化”,优选形式见下面),此外NGNA的量为1%或更少和/或N末端α-1,3-半乳糖的量为1%或更少。
按照本发明“量”意指糖链内Asn297上所述糖的量,涉及G0,G1,G2(无甘露糖(4和5))之和为100%并且如实施例3中所计算的那样。
按照本发明可提供结合IGF-IR的抗体,其甚至具有99.4%或更多,99.5%或更多或99.9%或更多的岩藻糖基化。
优选地NGNA的量为0.5%或更少,更加优选0.1%或更少,甚至不可被LCMS(液相色谱/质谱)检测到。
优选地N末端α-1,3-半乳糖的量为0.5%或更少,更加优选0.1%或更少,甚至不可被LCMS检测到。
优选地糖链显示如下特征:N-连接的聚糖附于抗体的Asn297上,所述抗体结合重组表达在CHO(中国仓鼠卵巢)细胞中的IGF-IR。
优选地所述CHO细胞是这样的CHO细胞,其包含删除(例如DG44)或两种DHFR等位基因的功能性失活或一种DHFR等位基因的删除以及第二种DHFR等位基因的功能性失活(例如DXB11)。
优选地所述抗体是单克隆抗体。优选地所述抗体是嵌合的,人源化的或人抗体。
优选地本发明包括完全岩藻糖基化抗体,其结合IGF-IR并抑制IGF-I和IGF-II与IGF-IR的结合,特征是所述抗体显示一种或多种选自由下列组成的组的特征:
a)显示其对IGF-I与IGF-IR结合的抑制的IC50值与其对IGF-II与IGF-IR结合的抑制的IC50值的比率为1:3-3:1,
b)当与没有所述抗体的这种测定比较时,其在5nM的浓度上,在使用HT 29细胞的细胞磷酸化测定中,抑制至少80%,优选地至少90%的IGF-IR磷酸化,所述HT29细胞在包含0.5%的热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中,
c)当与没有所述抗体的这种测定比较时,在使用3T3细胞的细胞磷酸化测定中,其在10μM的浓度上没有显示如PKB磷酸化所测量的IGF-IR的刺激活性(无信号传导,无IGF-1模拟活性),所述3T3细胞在包含0.5%的热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中提供400,000-600,000分子IGF-IR/细胞,
d)在向细胞中加入抗体后24小时在肿瘤细胞(例如HT29)上表达的IGF-1R下调50%或更多。
按照本发明的抗体显示了对于需要抗肿瘤治疗的患者的益处并且使肿瘤生长减少以及明显延长进展时间。按照本发明的抗体具有新颖性和创造性的特性,其给患有与IGF失调有关的疾病,特别是肿瘤疾病的患者带来了益处。按照本发明的抗体,其特征在于上述特性。
令人惊奇地,按照本发明的抗体(“完全岩藻糖基化抗体”),并不导致ADCC(抗体依赖型细胞介导的细胞毒性)(在来自参照标准抗体(针对匙孔血蓝蛋白的抗体,KLH抗体)的3xSD(标准偏差)内,如实施例中所描述的ADCC测定中所示)。
优选地所述抗体特异性结合IGF-IR,以上述比率抑制IGF-I和IGF-II与IGF-IR的结合,是IgG1同种型,以及甚至在其IC50值的200倍浓度上在IGF-IR过量表达细胞中没有激活IGF-IR信号传导。
当被用作治疗剂时,结合IGF-1R,不具有“IGF-I模拟活性”的组合以“完全岩藻糖基化”的抗体提供强大的益处。
优选地,在5nM的浓度上,按照本发明的抗体完全抑制肿瘤细胞中由IGF-I介导的IGF-IR的信号转导。
下面定义多肽的优选核酸,所述多肽能够与各个其它的抗体链一起组配成按照本发明的抗体:
a)包括作为CDRs的SEQ ID NO:1或3的CDR1(氨基酸31-35),CDR2(氨基酸50-66)和CDR3(氨基酸99-107)的抗体重链;
b)包括作为CDRs的SEQ ID NO:2或4的CDR1(氨基酸24-34),CDR2(氨基酸50-56)和CDR3(氨基酸89-98)的抗体轻链。
优选地所述抗体是单克隆抗体,并且除此之外,是嵌合抗体(人的恒定链),人源化的抗体并且特别优选地是人抗体。
优选地所述抗体与抗体18竞争结合人IGF-IR(EC 2.7.1.112,SwissProtP08069)。
优选地所述抗体的特征还在于亲和性是10-8M(KD)或更少,优选地是约10-9-10-13M。
优选地所述抗体不显示可检测到的浓度依赖性的对胰岛素与胰岛素受体结合的抑制。
优选地所述抗体是IgG1型。
和载体处理的动物比较,在相关异种移植肿瘤模型中,按照本发明的抗体相当长地延长了进展时间并且减少了肿瘤的生长。所述抗体优选地以对IGF-I和IGF-II大约等同的方式,在体外和体内抑制了IGF-I和IGF-II与IGF-IR的结合。
优选地,按照本发明的抗体包括下列序列作为互补决定区(CDRs):
a)包括作为CDRs的SEQ ID NO:1或3的CDR1(氨基酸31-35),CDR2(氨基酸50-66)和CDR3(氨基酸99-107)的抗体重链;
b)包括作为CDRs的SEQ ID NO:2或4的CDR1(氨基酸24-34),CDR2(氨基酸50-56)和CDR3(氨基酸89-98)的抗体轻链。
按照本发明的抗体的重链的优选可变区和CDRs,特别是CDR3由<IGF-1R>HUMAB克隆18(抗体18)和<IGF-1R>HUMAB克隆22(抗体22)提供,保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)),德国。
细胞系 | 保藏号 | 保藏日期 |
<IGF-1R>HUMAB克隆18 | DSM ACC2587 | 10.04.2003 |
<IGF-1R>HUMAB克隆22 | DSM ACC2594 | 09.05.2003 |
这些抗体在WO 2005/005635中详细描述。
按照本发明的抗体的重链的其它优选可变区和CDRs,特别是CDR3由<IGF-1R>HuMab克隆1a(抗体1A,Ab 1A或Ak 1A),<IGF-1R>HuMab克隆23(抗体23),和<IGF-1R>HuMab-克隆8(抗体8)提供,保藏在德意志微生物中心(Deutsche Sammlung von Mikrorganismen und ZellkulturenGmbH(DSMZ)),Germany:
细胞系 | 保藏号 | 保藏日期 |
<IGF-1R>HUMAB克隆1a | DSM ACC 2586 | 10.04.2003 |
<IGF-1R>HUMAB克隆23 | DSM ACC 2588 | 10.04.2003 |
<IGF-1R>HUMAB-克隆8 | DSM ACC 2589 | 24.04.2003 |
这些抗体在WO 2004/087756中详细描述。
本发明还提供重组生产这些抗体的方法。
本发明还提供治疗癌症的方法,其包括向被诊断患有癌症(因此需要抗肿瘤治疗)的患者施用有效量的按照本发明的针对IGF-IR的拮抗抗体。所述抗体可以以药物组合物的形式单独施用,或备选地与细胞毒性的治疗诸如放射疗法或细胞毒性试剂或其前药结合进行施用。
本发明还包括按照本发明的抗体用于癌症治疗以及制备按照本发明的药物组合物的用途。此外,本发明包括制备按照本发明的药物组合物的方法。
本发明还包括一种药物组合物,其包含药物有效量的按照本发明的抗体,以及任选地,对于药用的抗体的制剂是有用的缓冲剂和/或佐剂。
本发明还提供药物组合物,其在药用载体中包含这种抗体。在一个实施方案中,可以将药物组合物包含在制品的物品中或试剂盒中。
本发明还包括制备按照本发明的重组人抗体的方法,其特征在于在CHO宿主细胞中表达编码结合IGF-1R的抗体的核酸,以及从所述细胞中回收所述抗体,所述宿主细胞将所述抗体完全岩藻糖基化。本发明还包括可通过这种重组方法获得的抗体
附图简述
图1是显示在本发明的抗体和在对照抗体和对比抗体中的ADCC活性或其缺乏。
发明详述
术语“抗体”涵盖各种形式的抗体,其包括但不限于只要保留了按照本发明的性状特性的整个抗体、抗体片段、人抗体、人源化抗体以及遗传工程化的抗体。
“抗体片段”包括全长抗体的部分,通常至少是抗原结合部分或其可变区。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子、免疫毒素和由抗体片段形成的多特异性抗体。
用于本文时,术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指专一氨基酸组成(single amino acid composition)的抗体分子的制剂。因此,术语“人单克隆抗体”指显示单一结合特异性的抗体,其具有衍生自人胚系免疫球蛋白序列的可变和恒定区域。
术语“嵌合抗体”指一种单克隆抗体,其包括来自一种来源或物种的可变区域,即结合区域以及来源自不同来源或物种的恒定区域的至少一部分,通常通过重组DNA技术进行制备。特别优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。这种鼠/人嵌合抗体是表达免疫球蛋白基因的产物,所述免疫球蛋白基因包括编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它形式是其中类或亚类已经经过从初级抗体的修饰或改变的那些。也将这种“嵌合”抗体称作“类别转换抗体”。制备嵌合抗体的方法包括目前在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见,例如,Morrison,S.L.,等,Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(美国国家科学院院报)(1984)6851-6855;美国专利号5,202,238和5,204,244。
术语“人源化抗体”指其中的框架或“互补决定区”(CDR)已经被修饰从而包括与亲本免疫球蛋白的特异性不同的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选实施方案中,将鼠CDR移植到人抗体的框架区域以制备所述“人源化抗体”。见,例如,Riechmann,L.,等,Nature(自然)332(1988)323-327;和Neuberger,M.S.,等,Nature 314(1985)268-270。特别优选的CDRs对应于识别上述特别指出的嵌合和双功能抗体的抗原的那些代表性序列。
用于本文时,术语“人抗体”意欲包括具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。可变的重链优选地来自种系序列DP-50(GenBank LO6618)并且可变轻链优选地来自种系序列L6(GenBankX01688)或可变重链优选地衍生自DP61(GenBank M99682),并且可变轻链来自种系序列L15(GenBank K01323)。抗体的恒定区是人IgG1型的恒定区。这些区域可以是异型的并且在例如Johnson,G.,和Wu,T.T.,NucleicAcids Res(核酸研究).28(2000)214-218以及其参考的数据库中有所描述。
术语“重组人抗体”指以重排方式具有来自人胚系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。按照本发明的重组人抗体已经经过体内体细胞高变。因此,重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是尽管来自和涉及人胚系VH和VL序列,但可能在体内非天然存在于人抗体胚系所有组成成分中的序列。
用于本文时,“结合”指抗体以约10-13-10-8M(KD),优选地约10-13-10-9M的亲和性结合于IGF-IR。
用于本文时“核酸分子”意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的,但是优选地是双链DNA。
IgG1或IgG3型的人恒定结构域详细描述于Kabat E.A.等,Sequencesof Proteins of Immunological Interest(免疫目的蛋白质序列),第5版.PublicHealth Service(公众健康服务),National Institutes of Health(国立健康研究所),Bethesda,MD.(1991)和Brüggemann,M.,等,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361;Love,T.W.,等,Methods Enzymol(酶学方法).178(1989)515-527。实例显示于SEQ ID NOS:5-8。其它有用且优选的恒定结构域是可以从用于本发明以DSMZ保藏的杂交瘤细胞系中获得的抗体的恒定结构域。
IgG1或IgG3型的恒定结构域在Asn297上被糖基化。按照本发明的“Asn297”意指位于Fc区中大约位置297上的氨基酸天冬酰胺;基于抗体的较小序列变化,Asn297还可以位于上游或下游一些氨基酸上(通常不超过±3个氨基酸)。例如,在一种按照本发明的抗体中,“Asn297”位于氨基酸位置298上。
人IgG1或IgG3的糖基化作用发生在Asn297上,因为核心岩藻糖基化双触角复合物寡糖糖基化作用以多达2个Ga1(半乳糖)残基终止。根据末端Ga1残基的量,这些结构被命名为G0,G1(α1,6或α1,3)或G2聚糖残基(Raju,T.S.,BioProcess Int.1(2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化作用被例如Routier,F.H.,Glycoconjugate J.(糖缀合物杂志)14(1997)201-207所描述。
用于本文时,“可变区”(轻链的可变区(VL),重链的可变区(VH))表示直接涉及抗体与抗原结合的每个轻链和重链对。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构并且每个结构域包括4个框架区域(FR),其序列是广泛保守的,并通过三个“高变区”(或互补决定区,CDRs)连接。所述框架区域采取β折叠构象并且所述CDRs可以形成连接β折叠结构的环。通过框架区域,每条链的CDRs保持在它们的三维结构中并且与来自其它链的CDRs一起形成抗原结合部位。抗体的重链和轻链CDR3区域在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和性中具有特别重要的作用,并且因此提供本发明的另外的目的。
用于本文时,术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区域是除本文详细说明的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此,抗体的轻链和重链包括从N端到C端的结构域FR1,CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地,重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。按照Kabat E.A.等,Sequences ofProteins of Immunological Interest(免疫目的蛋白质序列),第5版,PublicHealth Service(公众健康服务),National Institutes of Health(国立健康研究所),Bethesda,MD.(1991))的标准定义和/或来自“高变环”的那些残基来确定CDR和FR区域。
用于本文时,术语“与IGF-IR结合”意味着在体外试验中,优选地在结合试验中进行抗体与IGF-IR的结合,在所述试验中,所述抗体与表面结合并且通过表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance)(SPR)来测量与IGF-IR的结合。结合意味着10-8M或更少,优选地10-13-10-9M的结合亲和性(KD)。
通过BIAcore分析(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden)可以研究与IGF-IR的结合。通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的关联的速率常数)、kd(解离常数)以及KD(kd/ka)来定义结合的亲和性。按照本发明的抗体显示10-10M或更少的KD。
IGF-I和IGF-II与IGF-IR的结合还受到按照本发明的抗体的抑制。在进行肿瘤细胞上IGF-I/IGF-II与IGF-IR的结合的试验中,测量抑制,表示为IC50。在实施例7中描述了这种试验。在这种试验中,在不增加和增加抗体的浓度情况下,测量与所述肿瘤细胞(例如HT29)表面提供的IGF-IR结合的放射性标记的IGF-I或IGF-II或IGF-IR结合片段的量。对于IGF-I和IGF-II与IGF-IR的结合而言,按照本发明的抗体的IC50值不超过2nM并且IGF-I/IGF-II与IGF-IR的结合的IC50值的比率是约1:3-3:1。测量的IC50值是至少三次独立测量的平均值或中位值。单个IC50可不在这个范围内。
用于本文时,术语“抑制IGF-I和IGF-II与IGF-IR的结合”指在体外试验中,抑制I125标记的IGF-I或IGF-II与存在于HT29(ATCC HTB-38)肿瘤细胞表面的IGF-IR的结合。抑制意味着IC50值为2nM或更低。
术语“IGF-IR表达细胞”指过量表达IGF-I受体到约至少20,000受体/细胞的这种细胞。这些细胞是,例如,肿瘤细胞系诸如NCI H322M或HT29,或在用IGF-IR的表达载体转染后,过量表达IGF-IR的细胞系(例如3T3 ATCC CRL1658)。按照Lammers,R.,等EMBO J.8(1989)1369-1375来测量每个细胞的受体的量。
术语“抑制IGF-IR磷酸化”指一种细胞磷酸化测定,其在包含0.5%热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中使用提供400,000-600,000分子IGF-IR/细胞的3T3细胞,届时与没有所述抗体的这种测定比较。使用特异于酪氨酸磷酸化的蛋白质的抗体通过蛋白质印迹法来检测磷酸化。这种测定在实施例11中有所描述。通过短期加热到56℃进行FCS的热灭活从而钝化补体系统。
术语“抑制PKB磷酸化”指一种细胞磷酸化测定,其在包含0.5%热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中使用提供400,000-600,000分子IGF-IR/细胞的3T3细胞,届时与没有所述抗体的这种测定比较。使用特异于在PKB的丝氨酸473被磷酸化的PKB的抗体(Akt1,Swiss Prot Acc.No.P31749)通过蛋白质印迹法来检测磷酸化。这种测定在实施例11中有所描述。
术语“抗体-依赖型细胞的细胞毒性(ADCC)”指在存在效应细胞的情况下,通过按照本发明的抗体裂解人肿瘤靶细胞。在存在效应细胞诸如新鲜分离的PBMC(外周血单核细胞)或来自暗黄覆盖层(buffy coats)的纯化效应细胞,象单核细胞或NK细胞(天然杀伤细胞)的情况下,优选地通过用按照本发明的抗体处理表达IGF-IR的细胞制剂进行ADCC的测量。
术语“IGF-I介导的信号转导的完全抑制”指IGF-I介导的对IGF-IR的磷酸化的抑制。对于这种分析,用IGF-I对IGF-IR表达细胞,优选地H322M细胞进行刺激,并用按照本发明的抗体进行处理(5nM的抗体浓度或更高是有效的)。随后,进行SDS PAGE,并且通过以特异于磷酸化的酪氨酸的抗体进行的蛋白质印迹法分析来测量IGF-IR磷酸化。如果在蛋白质印迹中,明显不能观察到指示磷酸化的IGF-IR的条带,则发现信号转导的完全抑制。
优选地按照本发明的抗体显示结合于与抗体18相同的IGF-IR的表位,或者由于抗体18的结合的空间位阻,在与IGF-IR结合中被抑制。使用20-50nM浓度的固定化的抗体18和IGF-IR以及在100nM浓度上待检测的抗体通过SPR分析可以检测结合抑制。50%或更多的信号减少显示所述抗体与抗体18竞争。通过将抗体22用作固定化抗体,以相同的方式可以进行这种分析。
术语“表位”表示能够特异性地与抗体结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团诸如氨基酸或糖侧链组成,并且通常具有特异性三维结构特性,以及特异性电荷特性。构象和非构象表位的区别在于在变性溶剂存在下,对前者的结合而不是后者的结合丢失。
按照本发明的抗体抑制IGF-IR酪氨酸磷酸化并优选地也抑制PKB酪氨酸磷酸化到相似的程度。
按照本发明的抗体优选地在肿瘤细胞,和肿瘤例如异种移植的肿瘤中下调IGF-IR蛋白质水平。
按照本发明的抗体优选地在集落形成试验中抑制肿瘤细胞的三维生长以及抑制IGF-IR表达细胞(例如NIH 3T3细胞)的增殖。
使用200nmol/l浓度的所述抗体,在胰岛素受体过量表达的3T3细胞的结合竞争分析中,优选地按照本发明的抗体不抑制胰岛素与胰岛素受体的结合。
通过重组方法在完全将抗体岩藻糖基化的CHO细胞中生产按照本发明的抗体。对于蛋白质表达,通过标准方法将编码轻和重链的核酸或其片段插入表达载体中。在这些CHO细胞中进行表达,并从细胞中(上清液或裂解后的细胞)回收抗体。
可以通过这样的方法来生产有用的CHO宿主细胞,其包括培养CHO细胞,用编码按照本发明的抗体的核酸进行转染,在DHFR选择压力下,挑取扩增克隆的单个克隆并选择产生具有按照本发明的糖基化作用模式的抗体的克隆。优选地至少进行两周,优选地至少三周培养。优选地所述CHO细胞为DG44细胞。
术语“CHO细胞”包括各种形式的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,其基于两种功能性失活的,优选删除的dhfr等位基因(二氢叶酸还原酶缺陷(dhfr-))。这些dhfr-细胞及其生成方法在例如Urlaub,G.等,Cell(细胞)33(1983)405-412;Chasin,L.等,Som.Cell Molec.Genet.12(1986)555-556;Kolkekar,A.S.等,Biochemistry(生物化学)36(1997)10901-10909中进行描述。优选地所述细胞是DG44细胞系。利用γ射线来消除完整dhfr基因座可以产生这种CHO dhfr-细胞。在未突变的野生型细胞中,dhfr对于甘氨酸、嘌呤和胸苷酸的从新合成是必需的酶。这就允许在质粒上编码的dhfr基因被用作显性可选择的标记以及基因扩增剂来在dhfr-缺陷细胞系中表达蛋白质。DG44细胞中的dhfr-突变是稳定的并且是不可逆转的。成功共转染人IgG1或IgG3型抗体的表达载体和DHFR基因的CHO细胞将具有dhfr+表型并且能够通过在培养基上培养克隆轻易地进行选择用于扩增,所述培养基缺乏胸腺嘧啶脱氧核苷和次黄嘌呤并且任选地包含甲氨蝶呤(MTX)。
DG44细胞是现有技术中众所周知的,并且例如作为细胞系是可商购的,例如由Invitrogen Corp.(USA)商购。DG44细胞可以在混悬液和/或在无血清的培养基中贴附生长。用于本文时,表述"细胞,""细胞系,"和"细胞培养物"可以交换使用并且CHO dhfr-细胞系(两种删除的dhfr等位基因)的所有这些命名都包括后代。因而,单词“转化子”和“经转化的细胞”包括原代主题细胞及源于它的培养物,不考虑转移的数量。还理解由于有意或无意的突变,所有后代可能在DNA内容上并不精确相同。包括在最初转化的细胞中筛选的具有按照本发明的糖基化作用特性的不同后代。
优选地所述CHO dhfr-细胞系至少与作为一个可选择标记基因的DHFR一起共扩增。例如将包含所述可选择标记的哺乳动物表达载体和抗体基因共转染入受体CHO细胞中。可以选择得到的克隆并且显示预期表型的克隆能够表达所述抗体。其它可选择的标记是或可以不是显性的。用于共转染的其它可选择标记的实例包括腺苷脱氨酶(Kaufman,R.J.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)83(1986)3136-3140),天冬酰胺合成酶(Cartier,M.,等,Mol.Cell Biol.(分子细胞生物学)7(1987)1623-1628),大肠杆菌(E.coli)trpB基因和沙门氏菌属(Salmonella)hisD基因(Hartman,S.C.,和Mulligan,R.C.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)85(1988)8047-8051),M2小鼠核糖核苷酸还原酶(Thelander,M.,和Thelander,L.,EMBO J.8(1989)2475-2479),人多种药物抗性基因(Kane,S.E.,等,Gene(基因)84(1989)439-446),谷氨酰胺合成酶(Bebbington,C.R.等,DNA Cloning(DNA克隆),Vol.III,D.M.Glover(ed.),IRL Press,pp.163-188,1987),黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)(Mulligan,R.C.,和Berg,P,Science(科学)209(1980)1422-1427),潮霉素B(Santerre,R.F.,等,Gene(基因)30(1984)147-156),新霉素基因(Southern,P.J.,和Berg,P.,J.Mol.Appl.Genet.(分子应用遗传学杂志)1(1982)327-341)。
可选择的标记还可以提供编码抗体的基因可以扩增的基础。在CHO细胞系的共转染中,载体DNAs经常在相同位点整合到细胞的染色体中。因而,只使用一种可选择标记作为扩增基础一般情况下导致两种基因拷贝数的同时增长。以此方式使用的一种特定可选择标记是dhfr,其能够通过使用浓度提高的MTX(甲氨蝶呤)来获得所需扩增。第二种优选的可选择标记是GS,其允许通过加入methionine sulphoximine(MSX)进行扩增。
可选择标记当然是在DNA调控元件的控制下,以便提供它们的表达。在使用dhfr作为可选择标记的情况下,所述调控元件优选地是病毒来源的,诸如来自DNA肿瘤病毒。特别优选使用SV40或腺病毒主要晚期启动子。在此方面特别有益的是从启动子上除去增强子元件,由此有效地“凸出(crippling)”它。这种修饰允许在甲氨蝶呤选择的每种浓度上,与如果使用强启动子相比,提高基因扩增水平。在使用新霉素作为可选择标记的情况下,合适启动子的实例为小鼠金属硫蛋白启动子。
重组制备抗体的一般方法在现有技术中众所周知,并且,描述于例如,Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.,等,ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161;Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880的综述文献中。
所述抗体可以存在于整个细胞中,在上清液中,在细胞溶解产物中,或以部分纯化或基本纯化形式存在。通过标准技术,包括碱/SDS处理、CsCl显带法、柱层析、琼脂糖凝胶电泳,以及其它本领域众所周知的技术来进行纯化以去除其它细胞成分或其它污染物,例如其它细胞的核酸或蛋白质。见,Ausubel,F.,等,编辑Current Protocols in Molecular Biology(,现代分子生物学操作方法),Greene Publishing and Wiley Interscience,纽约(1987)。
例如,适合于原核生物的调控序列,包括启动子、任选地操纵序列,和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。
当核酸被置于与另外的核酸序列的功能性关联中时,核酸被“可操作地连接”。例如,如果前序列或分泌前导区的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白,所述DNA可操作地与多肽的DNA连接;如果启动子或增强子影响序列的转录,其可操作地与编码序列连接;或如果将核糖体结合部位定位以促进翻译,其可操作地与编码序列连接。通常,“可操作地连接”意味着被连接的DNA序列是连续的,并且在分泌前导区的情况中,是连续的,并且在阅读框中。但是,增强子不一定是连续的。通过在适宜限制性位点的连接反应来完成连接。如果这些位点不存在,依照常规惯例,使用合成的寡核苷酸连接物或接头。
通过常规免疫球蛋白纯化方法诸如,例如蛋白质A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析,或亲和层析来适当地从杂交瘤培养基中适当地分离单克隆抗体。使用常规方法,容易将编码所述单克隆抗体的DNA和RNA从杂交瘤中分离并进行测序。杂交瘤细胞可以作为这种DNA和RNA的来源。一旦鉴定和分离,可以将DNA插入表达载体中,然后将其转染到不另外产生免疫球蛋白蛋白质的CHO细胞中,以便在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。
本发明还涉及免疫缀合物,其包括与细胞毒性试剂诸如化疗剂、毒素(例如,细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素,或其片段)、放射性活性同位素(即放射性缀合物)或细胞毒性试剂的前体药物连接的按照本发明的抗体。上面已描述了有效用在产生这些免疫缀合物中的试剂。可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白II A链、α-帚曲霉素、Aleuritesfordii蛋白质、香石竹毒蛋白质、Phytolaca americana蛋白质(PAPI,PAPII,和PAP-S)、momordica charantia抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonariaofficinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和tricothecenes。
使用许多双官能的蛋白质偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫酚)丙酸酯(SRDP)、iminothiolane(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物;(诸如二甲基adipimidate HCL)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、二-叠氮基化合物(诸如二(对-叠氮基苯甲酰基)已二胺)、二-重氮化衍生物(诸如二-(对-二重氮化苯甲酰基)-ethylenediatnine)、二异氰酸酯(诸如tolyene 2,6-二异氰酸酯)和双活性的氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备抗体和细胞毒性试剂的缀合物。例如,可以如在Vitetta,E.S.,等,Science(科学)238(1987)1098-1104)中所描述的制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是放射性核苷酸与抗体结合的示范性螯合剂。见WO 94/11026。
在另一个方面,本发明提供一种组合物,例如,药物组合物,其包含与药用载体一起配制的本发明的抗体。
还可以在组合疗法中,即与其它试剂组合来施用本发明药物组合物。例如,组合疗法可以包括本发明的组合物与至少一种抗肿瘤试剂,像化疗剂,细胞毒性剂或前体药物或其它常规疗法组合。
“化疗剂”是在癌症治疗中有用的化合物。化疗剂的实例包括阿霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷("Ara-C")、环磷酰胺、塞替派、泰索帝(多西他赛)、白消胺、吉西他滨、Cytoxin、泰素、甲氨蝶呤,顺铂、美法仑、长春碱,博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、Vincreistine、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、道诺红霉素、洋红霉素、氨蝶呤、放线菌素D、丝裂霉素(Mitomycins)、Esperamicins(见美国专利号4,675,187)、美法仑和其它相关的氮芥。
用于本文时,术语“细胞毒性试剂”指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞损伤的物质。该术语意欲包括放射性同位素、化疗剂和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素或其片段。
用于本申请时,术语“前体药物”指与亲本药物相比对肿瘤细胞具有较少细胞毒性的药用活性物质的前体或衍生物形式,并且其能够被酶促地活化或转化为更有活性的亲本形式。见,例如,Wilman,DE,BiochemicalSociety Transaction(生物化学社会学报)14(1986),375-382,和Stella V.J.等,"Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery(前药:靶向药物递送的化学方法),"在Directed Drug Delivery(定向药物递送),BorchardtR.T.等,(编辑),247-267页,Humana Press,Clifton,新泽西(1985)中。本发明的前体药物包括,但不限于:含磷酸盐(酯)的前体药物、含硫代磷酸盐(酯)的前体药物、含硫酸盐(酯)的前体药物、含肽的前体药物、D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化的前体药物、β-内酰胺环前体药物,包含任何取代的苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代的苯乙酰胺的前体药物,可以被转化为更具活性的无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前体药物。可以被衍生为用在本发明中的前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于上述的那些化疗剂。
用于本文时,“药用载体”包括生理相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延缓试剂等。优选地,所述载体适合于静脉内的、肌内的、皮下的、肠胃外的、脊柱的或表皮的施用(例如,通过注射或灌输)。
“药用盐”指保留抗体的所需的生物学活性并不带来任何不需要的毒理作用的盐(见例如,Berge,S.M.,等,J.Pharm.Sci(药物科学杂志).66(1977)1-19)。将这些盐包括在本发明中。这些盐的实例包括酸式加成盐和碱式加成盐。酸式加成盐包括从非毒性无机酸衍生的那些,诸如盐酸盐。
通过许多本领域已知的各种方法可以施用本发明的组合物。如本领域技术人员将理解,施用路径和/或模式将取决于所需结果而变化。
为了通过某些施用路径来施用本发明化合物,用一种材料来包被化合物,或与一种材料共同施用化合物以预防其失活可能是必需的。例如,可以以适当载体,例如脂质体或稀释剂来给受试者施用所述化合物。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。
药用载体包括用于即时制备灭菌的可注射溶液或分散体的灭菌水溶液或分散体和灭菌粉末。将这些介质和试剂用于药用活性物质的应用为本领域所知。
在用于本文时,短语“肠胃外的施用”和“经肠胃外施用”表示除肠内的和局部施用以外的通常通过注射的施用模式,包括但不局限于,静脉内的、肌内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的、硬膜外的、胸骨内的注射和灌输。
这些组合物还可以包含佐剂诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述的灭菌方法以及加入各种抗细菌和抗真菌试剂,例如,对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等都可以确保预防微生物的存在。将等渗试剂,诸如糖、氯化钠等包括在组合物中也可能是理想的。此外,通过将延缓吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶加入可导致可注射的药用形式的延长吸收。
无论选择何种施用路径,通过为本领域技术人员已知的常规方法,将可以以适合的水合形式和/或本发明的药物组合物形式使用的本发明的化合物配制成可药用剂型。
对于特定患者、组合物和施用方式,本发明药物组合物的活性成分的实际剂量水平可以变化以获得有效实现理想的治疗反应而不会对患者具有毒性的活性成分的量。选定的剂量水平将取决于许多药物动力学因素,其包括所用的本发明特定组合物的活性,施用的路径,施用的时间,所用的特定化合物的排泄率,治疗的持续时间,与所用的特定化合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质,待治疗的患者的年龄、性别、体重、疾病状况、一般健康和以前的疾病史等医学领域众所周知的类似因素。
所述组合物必须灭菌并且形成流体到组合物可以通过注射器进行传递的程度。除了水之外,载体优选是等渗缓冲盐溶液。
例如,通过应用包衣诸如磷脂酰胆碱,通过在分散状况下维持所需的颗粒大小,以及通过表面活性剂的使用可以保持适当的流动性。在许多情况中,将等渗试剂,例如,糖,多元醇诸如甘露糖醇或山梨糖醇和氯化钠包括在组合物中是优选的。
提供下列实施例、附图和序列表以协助理解本发明,在后附的权利要求中要求其实际范围。要理解的是可以在不背离本发明精神的情况下在提出的方法中进行修改。
实施例
细胞系
用于生成重组IgG表达的细胞系的亲本细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系,CHO-DG44(Flintoff,W.F.等,Somat.Cell.Genet.2(1976)245-261;Flintoff等,Mol.Cell.Biol(分子细胞生物学).2(1982)275-285;Urlaub,G.等,Cell(细胞)33(1983)405-412;Urlaub,G.等,Somat.Cell Mol.Genet.12(1986)555-566)。CHO-DG44细胞已经丢失了二氢叶酸还原酶(DHFR)的两个内源性位点。
将CHO-DG44细胞培养在MEMα负型培养基中(Gibco No.22561),10%透析的FCS(Gibco No.26400-044)和2mmol/L L-谷氨酰胺,100μM次黄嘌呤,16μM胸苷(HT添加物)。
质粒
表达系统包含CMV启动子并且描述于表1中。作为抗体使用针对IGF-1R的抗体(WO2005005635;AK18或AK22)。
表1
Bp | 载体元件/DNA片段 |
1-2627-614615-641642-780642-686687-768769-780781-11051106-1140 | 独特的限制性位点:SgrAI,Sse83871人巨细胞病毒(HCMV)启动子(CMV-Prom)包括人CMV IE启动子包括合成的5’-UTR接头鼠Ig重链前导序列(L1,信号序列内含子,L2)L1信号内含子(SS内含子)L2IGF-1R抗体(AK18)的可变κ-轻链结构域接头 |
Bp | 载体元件/DNA片段 |
1141-31342433-29133135-34753476-37953796-40984099-41374138-58004138-44854486-45025403-55285529-55355536-57955796-58005801-69445801-60886089-61056106-66726673-66796680-69446945-71817182-89417182-77927793-79397940-88478848-8941 | 人/小鼠κ-轻链杂合内含子2κ-增强子片段接头κ-轻链恒定区(C-κ)人Igκ-轻链多腺苷化序列(C-κpA)接头潮霉素抗性SV40启动子(SV40Prom)incl.72bp重复序列,TATA,SV40起源接头潮霉素-B-磷酸转移酶(Hyg)接头SV40多腺苷化信号(SV40pA)接头鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)SV40启动子(SV40Prom)incl.缩短的72bp重复序列,SV40起源接头鼠DHFR基因(鼠DHFR)接头SV40多腺苷化信号(SV40pA)接头源自质粒pUC18的细菌复制起点和选择性标记复制起点(,,pUC起源“)接头β-内酰胺酶基因(Ap(r))接头 |
Bp | 载体元件/DNA片段 |
8942-95299530-95569557-96969557-96029603-96859686-96969697-1005110052-1008510086-1168211683-1190911910-1350411910-1220312594-1263812757-1308613184-1350413505-1396713968-13970 | 人巨细胞病毒(HCMV)启动子(CMV-Prom)包括人CMV IE启动子包括合成的5’-UTR接头鼠Ig重链前导序列(L1,信号序列内含子,L2)L1信号内含子(SS内含子)L2IGF-1R抗体(AK18)的可变IgG1重链结构域接头人/小鼠重链杂合内含子2包括小鼠Ig重链J-片段区的部分包括Ig重链增强子元件(部分JH3,JH4)小鼠Ig重链增强子元件接头人IgG1重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)CH1铰链CH2CH3(删除的备选剪接位点)人IgG1重链多腺苷化序列(IgG1pA)SgrAI-接头 |
实施例1
转染和选择
用Fugene(Roche Diagnostics(罗氏诊断)GmbH)进行表达质粒的转染。转染后1天,将DG44细胞置于由MEMα负型培养基,10%透析的FCS和2mmol/L L-谷氨酰胺和20nM甲氨蝶呤(MTX)组成的选择压力下。在选择压力下3周后,从板上挑取单一克隆并进行扩增。
收集上清液并用人IgG-特异性的ELISA来分析抗体的存在。进一步扩增亚克隆并分析特异性抗体的产生。
将克隆在混悬培养物和无血清培养基,包含20nM MTX的HyQ SFM4CHO-Utility(HyClone#SH30516)中培养。同时,测定糖模(glycopattern)模式。选择提供2.0%或更低去岩藻糖基化的亚克隆(相对于总的摩尔寡糖量)。
实施例2
培养和纯化
将3×105细胞于37℃,5%CO2,100rpm下培养在加载了30ml培养基的125ml摇瓶(Corning)中10天。通过CASY计数器测量细胞密度并取上清液通过蛋白A亲和层析来测定抗体浓度。对于每种上清液纯化大约20ml用于通过蛋白A亲和层析作进一步生化表征(用PBS平衡,用25mM柠檬酸钠缓冲液pH5.2洗涤,用100mM柠檬酸钠缓冲液pH2.8洗脱,用10mM NaOH CIP)。
实施例3
抗体的糖结构分析
通过液相色谱/质谱(LCMS)肽图谱分析来分析纯化的抗体物质。将样品还原(0.4M TRIS/HCl,8M胍/HCl,pH8.5,DTT(3mg/ml),羧甲基化(碘乙酸)并用胰蛋白酶剪切。用RP-HPLC分离肽-糖肽混合物并用电雾化质谱进行在线分析。整合包含糖结构的肽的m/z谱,结果在表2中给出。
表2
糖基化变体的相对量
克隆号 | G0[%] | G1[%] | G2[%] | NoFuc[%] | Man1[%] |
1 | 38,4 | 51,4 | 10,2 | 0,1 | 0,5 |
2 | 44,3 | 47,6 | 8,1 | 0,1 | 0,6 |
3 | 42,8 | 48,7 | 8,5 | 0,2 | 0,8 |
4 | 49,2 | 43,6 | 7,2 | 0,3 | 1,2 |
5 | 62,7 | 33,0 | 4,3 | 0,6 | 1,0 |
6 | 60,4 | 35,5 | 4,2 | 0,5 | 1,2 |
7 | 40,4 | 49,8 | 9,8 | 0,3 | 0,6 |
8 | 46,9 | 45,9 | 7,3 | 0,3 | 1,1 |
Man:分别具有四和五个甘露糖残基的高甘露糖结构。
G0,G1,G2:具有岩藻糖基化双触角复合型糖的还原的重链,所述糖具有1,2或3个末端半乳糖残基。
NonFuc:具有双触角复合型糖的还原的重链,所述糖无岩藻糖。
在国际公认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约下,将CHO细胞系克隆5(hu MAb<IGF-1R>B1-4E10_9-16)于2006年6月21日保藏于德意志微生物中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)),德国,保藏号为DSM ACC 2795。
用来培养不同克隆的培养基获自Hyclone(HyQ SFM4 CHO-Utility,用于克隆4-6)或西格玛(Sigma)(C-8862用于克隆1-3和7)。
对于所有糖肽通过整合全部电荷状态的特异性离子色谱来进行LCMS肽图谱分析。
以相同的方式测定等分GlcNac,NGNA和高甘露糖。
等分GlcNac和NGNA是不可检测的。因而NGNA的量是0.5%或更低,此外是0.1%或更低。另外等分GlcNac的量是0.5%或更低,和0.1%或更低。
糖基化作用的示范性计算显示于表3中(表3a:克隆3,表3b:克隆5;包含asn298的肽,名为H27)。
表3a
区域z=2 | 区域z=3 | 区域z=4 | 总和 | 相对量% | |
H27_G0 | 616 | 198 | 0 | 814 | 28,7 |
H27_G1 | 734 | 425 | 0 | 1158 | 40,9 |
H27_G2 | 103 | 135 | 0 | 238 | 8,4 |
H27_G3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,0 |
H27_G4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,0 |
H27_G1_1NGNA | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,0 |
H27_G2_1NGNA | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,0 |
H27_G2_2NGNA | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,0 |
H27_G3_1NGNA | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,0 |
H27_G32NGNA | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,0 |
G0负型GlcNAc和负型Man | 0 | 57 | 0 | 57 | 2,0 |
G0负型GlcNAc | 330 | 0 | 0 | 330 | 11,7 |
G1负型GlcNAc | 208 | 0 | 0 | 208 | 7,4 |
Man5 | 22 | 0 | 0 | 22 | 0,8 |
G0负型Fuc | 5 | 0 | 0 | 5 | 0,2 |
G1负型Fuc | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,0 |
Man4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,0 |
合计 | 2833,15 | 100,00 |
具有NGNA的糖结构的相对量 0,0 |
具有半乳糖的糖结构(G3和G4)的相对量 0,0 |
高甘露糖的相对量 0,8 |
G0负型Fuc和G1负型Fuc的相对量 0,2 |
G0的和 42,4 |
G1的和 48,2 |
G2的和8,4 |
总合 99,0 |
相对于100%的 |
G0-1-2 |
G0 42,8 |
G1 48,7 |
G2 8,5 |
无Man的和 99,2 |
G0/1负型Fuc的和 0,2 |
无Fuc的相对量 0,2 |
区域:峰区
H27_G0-H27_G4:具有岩藻糖基化双触角复合型糖的糖肽H27(包含Asn298),所述糖具有x-末端半乳糖(例如具有4个半乳糖单位的G4)无Fuc的相对量:涉及无甘露糖(4和5)糖结构(高甘露糖)的所有G0,G1,G2的Fuc的百分比。
H27_G1_1NGNA-H27_G3_2NGNA:具有岩藻糖基化双触角复合型糖的糖肽H27(包含Asn298),所述糖具有x-末端半乳糖单位(例如具有2个单位的G2),所述半乳糖单位具有1-2个N-羟乙酰-神经氨酸。
无Fuc的相对量:涉及无甘露糖(4和5)糖结构(高甘露糖)的所有G0,G1,G2的Fuc的百分比。
表3b
糖基化作用的示范性计算(克隆5)
1)具有x-末端半乳糖(分别为0,1,2,3和4个)的岩藻糖基化双触角复合型糖结构
2)具有x-末端半乳糖(分别为0,1,2,3和4个)的岩藻糖基化双触角复合型糖结构,具有另外的n-羟乙酰神经氨酸残基
3)岩藻糖基化双触角复合型糖结构(该方法的主要人工制品)
4)分别具有四或五个甘露糖残基的高甘露糖结构
5)非岩藻糖基化的糖结构
实施例4
通过抗IGF-IR HuMAbs测定抗体介导的效应子功能
为了测定产生的HuMAb抗体激发免疫效应器机制的能力,进行抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)研究。
为了研究抗体在ADCC中的效果,用1μl二(乙酰氧基甲基)2,2’:6’,2”-三联吡啶-6,6”-二羧酸酯(BATDA)溶液于37℃在细胞培养箱中将表达IGF-IR的DU145前列腺癌细胞(HTB-81ATCC;1 x 106于2-4mlRPMI-FM中)标记25分钟。用10ml RPMI-FM将细胞洗涤四次并于200xg制动离心10分钟。此后,将细胞调整到1 x 105细胞/ml的浓度。以5000细胞/孔将细胞在50μl的体积中接种于圆底平板的每个孔中。在50μl细胞培养基的体积中以25-0.1ng/ml的终浓度加入HuMAb抗体。随后,以25:1的E:T比例加入50μl的效应细胞、刚从全血中分离的PBMC或来自暗黄覆盖层的纯化的效应细胞。立即将板于200xg制动离心1分钟,并于37℃温育2小时。温育后于200xg将细胞离心10分钟并将20μl上清液转移至Optiplate 96-F微量培养板中。加入200μl铕溶液(于室温)并将混合物在振荡器上温育15分钟。利用来自Perkin Elmer(铂尔金爱尔默)的EU-TDA方案在时间分辨荧光计中测量得到的荧光。
将通过ADCC细胞裂解的量表示为来自去污剂裂解的靶细胞的TDA的最大释放的%,并作来自各靶细胞的2,2’:6’,2”-三联吡啶-6,6”-二羧酸酯(TDA)自发释放的校正。作为不显示“ADCC”的抗体参照标准,使用分离自大约35.000供体(“Redimune”)的相同IgG类型或IgG混合物的针对KLH(匙孔血蓝蛋白)的(单克隆)抗体。使用针对IGF-IR的不含75%岩藻糖(75% fucose free)的抗体作为阳性对照。按照本发明的抗体显示TDA释放,其在标准抗体的TDA释放的3xSD内(图1)。
实施例5
测定抗-IGF-IR抗体与IGF-IR的亲和性
芯片:CM5
偶联:胺偶联
缓冲液:HBS(HEPES,NaCl),pH7.4,25℃
对于亲和性测试,已经将抗人Fcγ抗体(来自兔)与存在针对IGF-IR的抗体的芯片表面偶联。以各种浓度将IGF-IR胞外结构域添加到溶液中。通过IGF-IR注射3分钟来测量关联性;通过用缓冲液洗涤芯片表面5分钟来测量解离。将抗体18和22的亲和性数据显示于表4中。
表4:
抗体 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
18 | 1.49 x 105 | 1.03 x 10-7 | 6.95 x 10-13 |
22 | 1.47 x 105 | 9.64 x 10-5 | 6.56 x 10-10 |
实施例6
对IGF-I和IGF-II结合表达IGF-IR的肿瘤细胞的抑制
为了测定本发明抗体阻遏配体IGF-I和IGF-II结合IGF-I受体(IGF-IR)的能力,用放射性标记的配体肽进行竞争实验。
将人肿瘤细胞(HT29,NCI H322M,0.5-1×105/ml)接种于RPMI 1640培养基中(PAA,Cat.No.E15-039),所述培养基中添加了2mM L-谷氨酰胺,1×非必需氨基酸(Gibco,Cat.No.11140-035),1mM丙酮酸钠(Gibco,Cat.No.11360-039)和10%热灭活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。对于每个实验,在各自培养基中,将20ml细胞接种于六个T175形式的瓶并于37℃和5%CO2下培养两天以获得汇合的单细胞层。
为了收集个体细胞,加入2ml的1×胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Cat.No.25300-054)/T175烧瓶并用Zeiss Axiovert 25显微镜监测细胞的脱附。收集细胞并如前所述将具有10%FCS的培养基加至总体积50ml。通过于1000rpm离心10分钟(Heraeus sepatech,Omnifuge 2.0 RS)重新分离细胞并重悬于50ml的结合缓冲液中(120mM NaCl,5mM KCl,1.2mM MgSO4,1mM EDTA,10mM D(+)葡萄糖,15mM NaAc,100mM Hepes pH7.6,1%BSA)。对细胞进行计数,通过离心重新分离并用结合缓冲液调整到1×106细胞/ml。
将溶于0.1% CH3COOH的I125标记的IGF-I和IGF-II肽(阿莫仙(Amersham),~2000Ci/mmol,Cat.No.IM172和IM238)在结合缓冲液中稀释到最终活性4×105计数/(分钟×ml)。将75μl特定浓度的抗体与25μl预稀释的I125标记的IGF-I或IGF-II肽一起加入到200μl的细胞混悬液中并于4℃温育3,5小时。通过于2000rpm(Eppendorf,5415C)离心5分钟重新分离细胞并去除上清液。在1ml结合缓冲液中洗涤两次后,将细胞重悬于1ml结合缓冲液中并转移到闪烁管中。在闪烁计数器上测量结合到细胞表面受体上的放射性肽的量。
抗体18的IC50的平均值是0.3nM。没有观察到对于IGF-II结合的可检测的抑制。
实施例7
IGF-IR结合的抗体竞争分析
对于抗IGF-IR单克隆抗体的表位图谱,选择与亲和性测量(实施例5)相似的格式,但是以在溶液中的抗体于室温将IGF-IR预培养至少0.5小时。注射该混合物并检测IGF-IR的结合(或抑制)。这种测定容许测量IGF-IR结合的单克隆抗体的相应(reciprocal)抑制活性。发现本发明的抗体与αIR3竞争和IGF-IR的结合,已知所述αIR3是一种与217-274氨基酸结合的抗体(Gustafson,T.A.,和Rutter,W.J.,J.Biol.Chem(生物化学杂志).265(1990)18663-18667)。
实施例8
IGF-I介导的IGF-IR和Akt/PKB的磷酸化的抑制
为了测定本发明抗体抑制IGF-I受体(IGF-IR)的活化和磷酸化的能力,以IGF-I肽进行竞争实验和随后用特异于磷酸化酪氨酸的抗体进行蛋白质印迹分析。
将人肿瘤细胞(HT29,NCI H322M,5×104/ml)接种于RPMI 1640培养基中(PAA,Cat.No.E15-039),所述培养基中添加了2mM L-谷氨酰胺,1×非必需氨基酸(Gibco,Cat.No.11140-035),1mM丙酮酸钠(Gibco,Cat.No.11360-039)和0.5%热灭活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。为了测定IC50值,对于每个实验,在各自的培养基中,将1ml细胞接种12孔板并于37℃和5%CO2下培养2天。
用低血清培养基培养48小时之后,小心去除培养基并替代以不同浓度的稀释于各自培养基中的抗体。于37℃和5%CO2中温育5分钟后,以2nM的终浓度加入IGF-I肽并在上面所述的条件下将细胞再次温育10分钟。通过抽吸小心去除培养基并加入100μl/孔的冷裂解缓冲液(50mMHepes pH7.2,150mM NaCl,1mM EGTA,10%甘油,1%-X100,100mM NaF,10 mMNa4P2O7,蛋白酶抑制剂)。用细胞刮器(Corning,Cat.No.3010)使细胞脱附并将孔内容物转移到Eppendorf反应管中。通过于13000rpm和4℃离心10分钟去除细胞片段并以1:1(v/v)的比例将一半的上清液加到2×Laemmli样品缓冲液中。对于IGF-IR的免疫沉淀,将细胞裂解物的剩余上清液进行清除性离心(于13000rpm和4℃ 10分钟),随即(right before)加入1μl的针对IGF-IRβ的多克隆抗体(C-20,Santa Cruz生物技术),或鼠单克隆抗体(IgG1),所述单克隆抗体识别在人IGF类型1受体中的胞外结构域(α链)的氨基酸440-586中的表位(mAb,24-55,GroPep)。在转动的Eppendorf反应管中于4℃温育2小时后,加入25μl Protein G 珠(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences),Cat.No.17-0618-01),随后于4℃进行另一次1小时的温育步骤。通过离心(于2000rpm和4℃ 1分钟)分离具有结合抗体-蛋白质-复合物的珠并用洗涤缓冲液(只具有0.1% -X100的裂解缓冲液)洗涤三次。在将珠于Laemmli样品缓冲液中煮沸后,通过SDS-PAGE分离细胞蛋白质并通过半干蛋白质印迹转移到硝化纤维膜上(BA85,Schleicher & Schuell)。
利用一种磷酸酪氨酸特异性抗体(Upstate,clone 4G10,Cat.No.05-321)测定免疫纯化的IGF-IR的磷酸化状态。为了检测磷酸化的Akt/PKB,应用一种具有对于磷酸化的Ser473的特异性的抗体(细胞信号传导,Cat.No.9271)。
发现抗体18能够以0.6nM的IC50抑制IGF-1介导的IGF-1R和PKB的磷酸化作用。
实施例9
体外诱导抗体介导的IGF-IR的下调
为了检测本发明抗体对于肿瘤细胞中IGF-I受体(IGF-IR)量的影响,进行时程实验和随后使用IGF-IR特异性抗体的蛋白质印迹分析。
将人肿瘤细胞(HT29,5×104/ml)接种于RPMI 1640培养基中(PAA,Cat.No.E15-039),所述培养基中添加了2mM L-谷氨酰胺,1×非必需氨基酸(Gibco,Cat.No.11140-035),1mM丙酮酸钠(Gibco,Cat.No.11360-039)和10%热灭活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。对于每个实验的每个温育时期,在各自的培养基中,将1ml细胞接种一个12孔板并于37℃和5%CO2中培养24小时。
小心去除培养基并替代以不同浓度的稀释于各自培养基中的抗体。在两个对照孔中,将培养基替代以没有抗体的培养基或具有对照抗体(AB-1,Oncogene,Cat.No.GR11)的培养基。将细胞于37℃和5%CO2中培养并在15分钟、24小时和48小时后将单个板取出进行进一步处理。
通过抽吸小心去除培养基并且每孔加入100μl的冷裂解缓冲液(50mM Hepes pH7.2,150mM NaCl,1mM EGTA,10%甘油,1%-X100,100mM NaF,10mM Na4P2O7,蛋白酶抑制剂)。使用细胞刮器(Corning,Cat.No.3010)使细胞脱附并将孔内容物转移到Eppendorf反应管中。通过于13000rpm和4℃离心10分钟去除细胞片段并以1:1(v/v)的比例将上清液加到2×Laemmli样品缓冲液中。通过SDS-PAGE分离细胞蛋白质并通过半干蛋白质印迹转移到硝化纤维膜上BA 85,Schleicher & Schuell,Cat.No.10401196)。
利用特异于IGF-IR的抗体(C-20,Santa Cruz生物技术,Cat.No.sc-713)测定IGF-IR的蛋白质水平。
在加入抗体之后不到24小时观察到由本发明抗体诱导的IGF-IR的下调。
实施例10
抑制胰岛素结合表达人胰岛素受体的3T3细胞
为了测定本发明的抗体是否也阻遏胰岛素结合胰岛素受体(IR),用放射性标记的配体肽进行竞争实验。
将表达重组高数目(>105)的人IR的3T3细胞(1×105/ml)接种于具有高葡萄糖的MEM Dulbecco培养基(DMEM)(PAA,Cat.No.E15-009)中,所述培养基添加了2mM L-谷氨酰胺(Gibco,Cat.No.25030-024)和10%热灭活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。对于每个实验,在各自的培养基中,将20ml细胞接种于六个T175形式的瓶中,并于37℃和5%CO2中培养两天以获得汇合的单细胞层。
为了收集个体细胞,加入2ml的1×胰蛋白酶/EDTA(Gibco,Cat.No.25300-054)/T175烧瓶并用显微镜监测细胞的脱附。收集细胞并如前所述将具有10%FCS的培养基加至总体积50ml。通过于1000rpm离心10分钟重新分离细胞并重悬于50ml的结合缓冲液中(120mM NaCl,5mMKC1,1.2mM MgSO4,1mM EDTA,10mM D(+)葡萄糖,15mM NaAc,100mM Hepes pH7.6,1% BSA)。对细胞进行计数,通过离心重新分离并用结合缓冲液调整到1×106细胞/ml。
将溶于0.1% CH3COOH的I125标记的胰岛素肽(Amersham(阿莫仙),Car.No.IM166~2000Ci/mmol)在结合缓冲液中稀释到最终活性4*105计数/(分钟*ml)。将75μl抗体与25μl预稀释的I125标记的胰岛素肽一起加入到200μl的细胞混悬液中(最终抗体浓度200nM)并于4℃温育3,5小时。通过于2000rpm离心5分钟重新分离细胞并去除上清液。在1ml结合缓冲液中洗涤两次后,将细胞重悬于1ml结合缓冲液中并转移到闪烁管中。在闪烁计数器上测量结合到细胞表面受体上的放射性肽的量。
结果表明本发明的抗体并不干扰胰岛素配体结合胰岛素受体。
实施例11
对IGF-IR和Akt/PKB磷酸化没有刺激
为了排除本发明抗体的IGF-IR刺激活性,在缺乏IGF-I配体而存在本发明抗体和参比抗体(αIR3,Oncogene,德国)时,确定IGF-IR的磷酸化。用磷酸化状态的特异性抗体对此进行蛋白质印迹分析。将用IGF-IR转染的3T3细胞(ATCC CRL1658)(5*104细胞/ml,Pietrzkowski,Z.,等,CellGrowth Differ(细胞生长分化).4(1992)199-205)接种在具有高葡萄糖的MEM Dulbecco培养基(DMEM)(PAA,CatNo.E15-009)中,所述培养基补充以2mM L-谷氨酰胺(Gibco,CatNo.25030-024)和0.5%热灭活的FCS(PAA,CatNo.A15-771)或将人肿瘤细胞(HT29,NCI h322M 5×104/ml)接种于RPMI 1640培养基中(PAA,Cat.No.E15-039),所述RPMI 1640培养基中添加了2mM L-谷氨酰胺,1×非必需氨基酸(Gibco,Cat.No.11140-035),1mM丙酮酸钠(Gibco,Cat.No.11360-039)和0.5%热灭活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。为了测定IC50值,对于每个实验,在各自的培养基中,将1ml细胞接种12孔板并于37℃和5% CO2下培养2天。
用低血清培养基培养48小时之后,小心去除培养基并替代以不同浓度的稀释于各自培养基中的抗体。在上述条件下,将细胞温育15分钟。通过抽吸小心去除培养基并加入100μl/孔的冷裂解缓冲液(50mM HepespH7.2,150mM NaCl,1mM EGTA,10%甘油,1%Triton-X100,100mMNaF,10mM Na4P2O7,CompleteTM蛋白酶抑制剂)。用细胞刮器(Corning,Cat.No.3010)使细胞脱附并将孔内容物转移到Eppendorf反应管中。通过于13000rpm和4℃离心10分钟(Eppendorf离心机5415R)去除细胞片段并以1:1(v/v)的比例将一半的上清液加到2×Laemmli样品缓冲液中。对于IGF-IR的免疫沉淀,将细胞裂解物的剩余上清液进行清除性离心(于13000rpm和4℃10分钟),随即(right before)加入1μl的针对IGF-IR的抗体(C-20,Santa Cruz生物技术,CatNo.sc-713或mAb 24-55,GroPep,CatNo.MAD1)。在转动的Eppendorf反应管中于4℃温育2小时后,加入25μlProtein G SepharoseeTM珠(Amersham Biosciences(阿莫仙生物科学),Cat.No.17-0618-01),随后于4℃进行另一次1小时的温育步骤。通过离心(于2000rpm和4℃ 1分钟)分离具有结合抗体-蛋白质-复合物的珠并用洗涤缓冲液(只具有0.1% Triton-X100的裂解缓冲液)洗涤三次。在将珠于Laemmli样品缓冲液中煮沸后,通过SDS-PAGE分离细胞蛋白质并通过半干蛋白质印迹转移到硝化纤维膜上(PROTRAN BA85,Schleicher &Schuell,CatNo.10 401196)。
将磷酸酪氨酸特异性抗体(Upstate,克隆4G10,CatNo.05-321,识别酪氨酸磷酸化的蛋白质)用于测定免疫纯化的IGF-IR的磷酸化状态。为了检测磷酸化的Akt/pkB,应用一种针对Akt1特异于磷酸化的丝氨酸473(细胞信传导,CatNo.9271)的抗体。
观察到在IGF-IR信号传导途径中的Akt/pkB激酶下调明显地被以高于5nM浓度的参比抗体激活,但是没有被在多至10.000nM浓度上的本发明抗体激活。
实施例12
在H322M异种移植模型中诱导受体下调
在裸鼠中诱导肿瘤并以不同浓度的本发明抗体处理1次。在处理后24小时,在液氮下提取肿瘤并进行匀浆。以3:1的缓冲液体积对肿瘤重量比加入冷裂解缓冲液(50mM Hepes pH7.2,150mM NaCl,1mM EGTA,10%甘油,1% Triton-X100,100mM NaF,1mM Na3VO4,10mM Na4P2O7,CompleteTM蛋白酶抑制剂,1mM PMSF)并与融解的肿瘤匀浆物一起充分混合。在冰上溶解组织15分钟后,通过于13000rpm和4℃离心(Eppendorf离心机5415R)10分钟去除不可溶的片段。用Micro BCATMReagents(Pierce)测定样品的蛋白质浓度并加入裂解缓冲液以调节相等的浓度。将部分上清液以1:1(v/v)的比例加入到2×Laemmli样品缓冲液中。通过SDS-PAGE分离细胞蛋白质并通过半干蛋白质印迹转移到硝化纤维膜上(PROTRANBA 85,Schleicher & Schuell,Cat.No.10401196)。利用IGF-IR特异性抗体(C-20,Santa Cruz生物技术,Cat.No.sc-713)检测IGF-IR。
用本发明的抗体处理后,观察到浓度依赖型的IGF-IR水平的减少,估计的EC50为0.6mg/kg。
实施例13
H322M肿瘤的生长抑制
通过按照已确定的方法在无胸腺裸鼠中诱导肿瘤来研究抗体18在体内的效应。将人H322M NSCLC细胞与基质胶(Matrigel)一起皮下共注射到6-7周龄的无胸腺nu小鼠(nu/nu)中。为此目的,将5 x 106H322M细胞浓缩在100μl培养基中并混和以100μl基质胶。将200μl的该混和物注射到小鼠的右胁。按照由Geran等首先公开的公式(“Protocols for screeningchemical agents and natural products against animal tumors and otherbiological systems(针对动物肿瘤和其它生物系统筛选化学剂和天然产物的方法)”,Cancer Chemother.Rep.11.301,1972),其中肿瘤体积[mg]=(长度x(宽度)2)通过每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径来计算肿瘤的体积。以10ml/kg腹膜内地(i.p.)施用抗体。处理开始以双倍体积的双倍剂量抗体施用。如上所述在裸鼠中诱导肿瘤。在肿瘤生长到160mg的平均体积后,对小鼠进行腹膜内处理6次,所述处理在处理的第一天以12,1.2和0.12mg/kg作为负荷剂量给药1次,以6、0.6和0.06mg/kg的抗体作为连续剂量,每周一次。该实验证明当以6和0.6mg/kg的单个试剂施用时,由rhu抗-IGF-IR mAb 18对IGF-IR轴(axis)的阻断导致抗肿瘤效率。与此相对,0.06mg/kg对肿瘤生长没有影响。
此外,在相同的模型中结合吉西他滨检验了抗体18。如上所述诱导肿瘤并且当肿瘤已经在所有的组中形成并长到170mm3的平均大小时开始治疗。以6和0.6mg/kg并以0.6mg结合62mg/kg的吉西他滨i.p.施用抗体每周1次。施用吉西他滨一个周期,即每隔三天,总共4次。通过施用双倍剂量的抗体再次开始治疗。实验证明了以每7日施用1次用抗体18进行的治疗本身抑制肿瘤生长并增加了吉西他滨的有效性,已知所述吉西他滨是一种抗代谢化合物。
实施例14
对3T3肿瘤的生长抑制
基本如实施例15中所述在裸鼠中诱导肿瘤,除了应用过度表达人IGF-IR的鼠3T3成纤维细胞之外。以18,6或0.6mg/kg的抗体18对具有约180mg的形成的肿瘤的小鼠进行腹膜内处理,每周1次,共7次。将双倍剂量的抗体给药作负荷剂量(36,12和1.2mg/kg)来开始治疗。所述实验证实了通过用抗体治疗,当被以18和6mg/kg,每周1次给药时,肿瘤的生长可被延缓。
实施例15
体外诱导抗体介导的IGF-1R的下调
为了检测本发明抗体对于肿瘤细胞中IGF-I受体(IGF-IR)量的影响,进行时程实验和随后使用IGF-IR特异性抗体的蛋白质印迹分析。
将人肿瘤细胞(HT29,5×104/ml)接种于RPMI 1640培养基中(PAA,Cat.No.E15-039),所述培养基中添加了2mM L-谷氨酰胺,1×非必需氨基酸(Gibco,Cat.No.11140-035),1mM丙酮酸钠(Gibco,Cat.No.11360-039)和10%热灭活的FCS(PAA,Cat.No.A15-771)。对于每个实验的每个反应时期,在各自的培养基中,将1ml细胞接种12孔板并于37℃和5%CO2中培养24小时。
小心去除培养基并替代以不同浓度的稀释于各自培养基中的抗体。在两个对照孔中,将培养基替代以没有抗体的培养基或具有对照抗体(AB-1,Oncogene,Cat.No.GR11)的培养基。将细胞于37℃和5%CO2中培养并在15分钟、24小时和48小时后将单个板取出进行进一步处理。
通过抽吸小心去除培养基并且每孔加入100μl的冷裂解缓冲液(50mM Hepes pH7.2,150mM NaCl,1mM EGTA,10%甘油,1%-X100,100mM NaF,10mM Na4P2O7,蛋白酶抑制剂)。使用细胞刮器(Corning,Cat.No.3010)使细胞脱附并将孔内容物转移到Eppendorf反应管中。通过于13000rpm和4℃离心10分钟去除细胞片段并以1:1(v/v)的比例将上清液加到2×Laemmli样品缓冲液中。通过SDS-PAGE分离细胞蛋白质并通过半干蛋白质印迹转移到硝化纤维膜上(BA 85,Schleicher & Schuell,Cat.No.10401196)。
利用特异于IGF-IR的抗体(C-20,Santa Cruz生物技术,Cat.No.sc-713)测定IGF-IR的蛋白质水平。
在加入抗体之后24小时后观察到由本发明抗体诱导的50%或更多IGF-IR的下调。
序列表
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Claims (13)
1.结合IGF-IR的抗体,其是人IgG1或IgG3型并且在Asn297上被糖链所糖基化,所述抗体特征在于所述糖链内岩藻糖的量为至少99%(“完全岩藻糖基化”),此外NGNA的量为1%或更少和/或N末端α-1,3-半乳糖的量为1%或更少。
2.按照权利要求1的抗体,其特征在于NGNA的量为0.5%或更少。
3.按照权利要求1或2的抗体,其特征在于N末端α-1,3-半乳糖的量为0.5%或更少。
4.按照权利要求1-3的抗体,其特征在于所述抗体是嵌合的,人源化的或人抗体。
5.按照权利要求1-4的抗体,其特征在于所述抗体显示一种或多种选自由下列组成的组的特性:
a)显示其对IGF-I与IGF-IR结合的抑制的IC50值与其对IGF-II与IGF-IR结合的抑制的IC50值的比率为1:3-3:1,
b)当与没有所述抗体的这种测定比较时,其在5nM的浓度上,在使用HT 29细胞的细胞磷酸化测定中,抑制至少80%,优选地至少90%的IGF-IR磷酸化,所述HT 29细胞在包含0.5%的热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中,
c)当与没有所述抗体的这种测定比较时,在使用3T3细胞的细胞磷酸化测定中,其在10μM的浓度上没有显示如PKB磷酸化所测量的IGF-IR的刺激活性(无信号传导,无IGF-1模拟活性),所述3T3细胞在包含0.5%的热灭活胎牛血清(FCS)的培养基中提供400,000-600,000分子IGF-IR/细胞。
6.按照权利要求1-5的抗体,其特征在于亲和性为约10-13到10-9M(KD)。
7.按照权利要求1-5的抗体,其特征在于包含作为互补决定区(CDRs),具有下列序列:
a)包括作为CDRs的SEQ ID NO:1或3的CDR1(氨基酸31-35),CDR2(氨基酸50-66)和CDR3(氨基酸99-107)的抗体重链;
b)包括作为CDRs的SEQ ID NO:2或4的CDR1(氨基酸24-34),CDR2(氨基酸50-56)和CDR3(氨基酸89-98)的抗体轻链。
8.按照权利要求1-7的抗体用于制备药物组合物的应用。
9.药物组合物,其包含药物有效量的按照权利要求1-7的抗体。
10.制备药物组合物的方法,所述药物组合物包括药物有效量的按照权利要求1-7的抗体。
11.治疗需要抗肿瘤治疗的患者的方法,其特征是向该患者施用药物有效量的按照权利要求1-7的抗体。
12.按照权利要求15的方法,其特征在于组合细胞毒性剂、其前体药物或细胞毒性放疗施用所述抗体。
13.能够重组表达按照权利要求1-7的抗体的CHO细胞。
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US5202238A (en) * | 1987-10-27 | 1993-04-13 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
US5204244A (en) * | 1987-10-27 | 1993-04-20 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
US5770429A (en) * | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
GB9022543D0 (en) * | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Antibody production |
US5610297A (en) * | 1991-12-27 | 1997-03-11 | Georgia Tech Research Corp. | Peptides ketoamides |
NZ258392A (en) | 1992-11-13 | 1997-09-22 | Idec Pharma Corp | Chimeric and radiolabelled antibodies to the b lymphocyte cellsurface antigen bp35 (cd-20) and their use in the treatment of b cell lymphona |
CA2704600C (en) * | 1999-04-09 | 2016-10-25 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | A method for producing antibodies with increased adcc activity |
US20030165502A1 (en) * | 2000-06-13 | 2003-09-04 | City Of Hope | Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth |
US7553485B2 (en) * | 2002-01-18 | 2009-06-30 | Pierre Fabre Medicament | Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof |
US7241444B2 (en) * | 2002-01-18 | 2007-07-10 | Pierre Fabre Medicament | Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof |
JP4563171B2 (ja) * | 2002-05-24 | 2010-10-13 | シェーリング コーポレイション | 中和ヒト抗igfr抗体 |
US7378503B2 (en) * | 2003-04-02 | 2008-05-27 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibodies against insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof |
US7579157B2 (en) * | 2003-07-10 | 2009-08-25 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antibody selection method against IGF-IR |
WO2005014651A1 (ja) * | 2003-08-11 | 2005-02-17 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 糖鎖改変抗hm1.24抗体 |
US8603481B2 (en) * | 2003-10-10 | 2013-12-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Therapeutic agents for solid tumors |
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