MX2013015061A - Anticuerpo anti-cxcr4 con funciones efectoras y su uso para el tratamiento del cancer. - Google Patents

Abstract

La presente solicitud se relaciona con un método para tratar el cáncer administrando un anticuerpo monoclonal anti-CXCR4 capaz de inducir funciones efectoras.

Description

ANTICUERPO ANTI-CXCR4 CON FUNCIONES EFECTORAS Y SU USO PARA EL TRATAMIENTO DEL CANCER CAMPO DE LA INVENCION La presente solicitud se relaciona con un método para tratar el cáncer administrando un anticuerpo monoclonal anti-CXCR4 capaz de inducir funciones efectoras.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las quimocinas son péptidos pequeños, secretados, que controlan la migración de los leucocitos a lo largo de un gradiente químico de ligandos, conocido como gradiente de quimocina, especialmente durante reacciones inmunes (Zlotnick A. et al., 2000). Ellas se dividen en dos familias principales, CC y CXC, sobre la base de la posición de sus residuos de cisteína NH2-terminales , y la unión a receptores acoplados a la proteína G, cuyas dos subfamilias principales son designadas como CCR y CXCR. Han sido descubiertas hasta ahora más de 50 quimocinas humanas y 18 receptores de quimocina .

Muchos cánceres tienen una red de quimocinas compleja que tiene influencia sobre la infiltración de células inmunes del tumor, así como el crecimiento, supervivencia, migración y angiogénesis del tumor. Las células inmunes, células endoteliales , y células tumorales por si mismas se expresan en receptores de quimocina y pueden responder a gradientes de quimocina. Los estudios de muestras de biopsia de cáncer humano y modelos de cáncer de ratón muestran que la expresión del receptor de quimocina de la célula cancerígena está asociada con una capacidad metastática incrementada. Las células malignas de diferentes tipos de cánceres tienen diferentes perfiles de expresión de receptores de quimocina, pero el receptor de quimocina 4 (CXCR4) es el más comúnmente encontrado. Las células de al menos 23 diferentes tipos de cánceres humanos de origen epitelial, mesenquimal y hematopoyético expresan receptor CXCR4 (Balkwill F. et al., 2004).

El receptor de quimocina 4 (también conocido como fusina, CD184, LESTR o HUMSTR) existe en dos isoformas que comprenden 352 o 360 aminoácidos. El residuo Asnll está glicosilado, el residuo Tyr21 está modificado por la adición de un grupo sulfato y el Cys 109 y 186 se unen con un puente disulfuro sobre la parte extracelular del receptor (Juárez J. et al. , 2004) .

Este receptor es expresado por diferentes tipos de tejido normales, no expuestos, células T sin memoria, células T reguladoras, células B, neutrófilos, células endoteliales, monolitos primarios, células dendríticas, células Asesinas Naturales (NK) , y mastocitos hematopoyéticos CD34+ a un bajo nivel en el corazón, colon, hígado, ríñones y cerebro. El CXCR4 juega un papel clave en el tráfico de leucocitos, linfopoyesis y mielopoyesis de células B.

El receptor CXCR4 es sobreexpresado en un gran número de cánceres incluyendo pero sin limitarse al linfoma, leucemia, mieloma múltiple, de colon (Ottaiano A. et al., 2004), mama (Kato M et al., 2003 ), próstata (Sun Y.X. et al., 2003), pulmón [carcinoma de células pequeñas y células no pequeñas (Phillips R.J. et al., 2003)], ovarios (Scotton C.J. et al., 2002), páncreas (Koshiba T. et al., 2000), ríñones, cerebro (Barbero S et al., 2002), glioblastoma y linfomas.

El único ligado del receptor CXCR4 descrito hasta ahora es el Factor 1 derivado de células estromales (SDF-1) o CXCL12. El SDF-1 es secretado en grandes cantidades en los nodos linfáticos, célula ósea, hígado, pulmones y en un menor grado por los ríñones, cerebro y piel. El CXCR4 también es reconocido por una quimosina antagónica, la proteína inflamatoria de macrófago viral II (vMIP-II) codificada por el herpesvirus humano tipo III.

El eje CXCR4/SDF-1 juega un papel clave en el cáncer y está implicado directamente en la migración, invasión que conduce a metástasis. En realidad, las células cancerosas que expresan receptor CXCR4 , migran y entran a la circulación sistémica. Entonces las células cancerosas son retenidas en los lechos vasculares en órganos que producen altos niveles de SDF-1 donde proliferan, inducen angiogénesis y forman tumores metastáticos (Murphy PM., 2001). Este eje también está implicado en la ploriferación celular a través de la activación de la via de la cinasa regulada por la señal extracelular (ERK) (Barbero S. et al., 2003) y angiogénesis (Romagnani P. , 2004). En realidad, el receptor CXCR4 y su ligando SDF-1 claramente promueven la angiogénesis simulando la expresión de VEGF-A, lo cual a su vez incrementa la expresión de CXCR /SDF-1 (Bachelder R.E. et al., 2002). También se sabe que los macrófagos asociados con el tumor (TAM) se acumulan en áreas hipóxicas de tumores que son estimulados para cooperar con las células tumorales y promover angiogénesis. Se observó que la hipoxia sobrerreguló la expresión selectiva de CXCR4 en varios tipos de células incluyendo TAM (Mantovani A. et al., 2004). Recientemente se ha demostrado que el eje CXCR4 /SDF-1 regula el tráfico/guia de células no diferenciadas/progenitoras hematopoyéticas CXCR4+ (HSC) y podría jugar un papel en la neovascularización. La evidencia indica además que las HSC, las CXCR4 funcionales también son expresadas en células no diferenciadas de otros tejidos (células no diferenciadas comprometidas con el tejido = TCSCs) de modo que el SDF-1 puede jugar un papel central en la quimioatraccion de CXCR4+ TCSCs necesaria para la regeneración del órgano/tejido pero esas TCSC también pueden ser un origen celular del desarrollo del cáncer (teoría de las células no diferenciadas cancerosas) . Un origen de célula no diferenciada del cáncer fue demostrado para la leucemia humana y recientemente para varios tumores sólidos como el de cerebro y mama. Existen varios ejemplos de tumores CXCR4+ que pueden derivarse de células no diferenciadas especificas del tejido/órgano CXCR4+ normales como las leucemias, tumores de cerebro, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer de mama, hepatoblastoma, cánceres de ovario y cervical (Kucia M. et al., 2005).

La metástasis dirigida del cáncer interfiriendo con el receptor CXCR4 fue demostrada in vivo usando un anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor CXCR4 ( uller A. et al., 2001). De manera breve, se mostró que un anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor CXCR4 Mab 173 R&D Systems) hizo disminuir significativamente el número de metástasis de nodo linfático en un modelo de cáncer de mama ortotópico (MDA-MB231) en ratones SCID. Otro estudio (Phillips R.J. et al., 2003) también mostró el papel critico del eje SDF-1/CXCR4 en la metástasis en un modelo de carcinoma de pulmón ortotópico (A549) usando anticuerpos policlonales contra SDF-1 pero en este estudio no hubo efectos ni sobre el crecimiento del tumor ni sobre la angiogénesis . Varios otros estudios también describen la inhibición de la metástasis in vivo usando dúplex de siARN de CXCR4 (Liang Z. et al., 2005) antagonistas del péptido CXCR4 bioestables (Tamamura H. et al., 2003) o crecimiento del tumor in vivo usando antagonistas de molécula pequeña de CXCR4 como el AMD 3100 (Rubín J.B. et al., 2003; De Falco V. et al., 2007) o Acm (patente WO2004/059285 A2). De este modo, el CXCR4 es un blanco terapéutico validado para cánceres.

También han sido descritos anticuerpos monoclonales murinos capaces de dirigir la interacción con CXCR4 , y de este modo inhibir la activación de CXCR4. Esa inhibición puede ocurrir interfiriendo con: i) la unión específica en las membranas celulares del ligando SDF-1 al receptor CXCR4, ii) la unión específica membranas celulares del GTPyS al receptor CXCR4 , iii) la modulación de la producción de AMPc mediada por CXCR4 , y iv) la movilización mediada por el receptor CXCR4 de la modulación de almacenes de calcio intracelular (véase la WO 2010/037831) .

Sin embargo, en ninguno de esos anticuerpos o siARN conduce a la eliminación de las células cancerosas que expresan CXCR . Por lo tanto existe aún un riesgo de resurgimiento del cáncer, si se interrumpe el tratamiento dirigido con CXCR . De este modo existe la necesidad de agentes que hagan blanco directamente en células que expresen CXCR4, y que sean capaces de matar las células que expresan CXCR4.

BREVE DESCRICPION DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con una propiedad novedosa que nunca había sido identificada en relación con un anticuerpo dirigido a CXCR .

En realidad, los inventores han encontrado que anticuerpos humanos o humanizados dirigidos contra CXCR4 son capaces de inducir funciones efectoras contra una célula que expresa CXCR4, conduciendo de este modo a efectos citotóxicos contra las células.

De manera más particular, la invención se relaciona con un método para la inducción de funciones efectoras contra una célula cancerosa que expresa CXCR .

Como se describe en la técnica anterior, el tratamiento de tumores metastáticos que expresan CXCR4 implicaba la inhibición de la migración, invasión, proliferación o angiogénesis, pero no la eliminación directa de las células que expresan CXCR4. De manera contrastante, la presente invención se relaciona con la inducción de efectos citotóxicos que conducen a la muerte de la célula blanco que expresa CXCR4. En particular, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano o humanizado el cual es capaz de inducir una o más funciones efectoras contra una célula cancerosa que expresa CXCR4, logrando de este modo la eliminación de la célula. De este modo la invención proporciona un método de tratamiento del cáncer a través de la inducción de una o más funciones efectoras contra una célula cancerosa que expresa CXCR4 por un anticuerpo monoclonal humano o humanizado.

En un primer aspecto, la presente invención se relaciona con un método para matar o eliminar una célula cancerosa que expresa CXCR4 con un anticuerpo humano o humanizado que se une a CXCR4 , o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2; comprendiendo el anticuerpo humano o humanizado un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones CDR, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3, respectivamente; y un dominio variable de cadena ligera que comprende las regiones CDR, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos.4, 5 y 6, respectivamente; donde el método comprende el paso de inducir al menos una función efectora del anticuerpo humano o humanizado en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un anticuerpo humano o humanizado que se une a CXCR4, o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2, donde el anticuerpo humano o humanizado comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende las regiones CDR, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 1 2 y 3, respectivamente; y un dominio variable de cadena ligera que comprende las regiones CDR, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. , 5 y 6, respectivamente; para preparar una composición para matar una célula cancerosa que expresa CXCR4 por inducción al menos de una función efectora, en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

En otro aspecto más, la invención también se relaciona con un anticuerpo humano o humanizado que se une a CXCR4, o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2; comprendiendo el anticuerpo humano o humanizado un dominio variable de cadena pesada que comprende las regiones CDR, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3, respectivamente; y un dominio variable de cadena ligera que comprende las regiones CDR, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos.4, 5 y 6, respectivamente; para usarse matando una célula cancerosa que expresa CXCR4 por inducción al menos de una función efectora, en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

De manera más especifica, la presente invención se relaciona con un método para tratar el cáncer matando una célula cancerosa que expresa CXCR4 con un anticuerpo humano o humanizado que se une a CXCR4 , o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2; comprendiendo el anticuerpo humano o humanizado un dominio variable de cadena pesada que comprende las regiones CDR, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3, respectivamente; y un dominio variable de cadena ligera que comprende las regiones CDR, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos.4, 5 y 6, respectivamente; donde el método comprende el paso de inducir al menos una función efectora del anticuerpo humano o humanizado en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un anticuerpo humano o humanizado que se une a CXCR4, o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2; donde el anticuerpo humano o humanizado comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende las regiones CDR, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3, respectivamente; y un dominio variable de cadena ligera que comprende las regiones CDR, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos.4, 5 y 6, respectivamente; para preparar una composición para tratar el cáncer matando una célula cancerosa que expresa CXCR4 por inducción de al menos una función efectora, en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

En otro aspecto más, la invención también se relaciona con un anticuerpo humano o humanizado que se une a CXCR4, o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2; comprendiendo el anticuerpo humano o humanizado un dominio variable de cadena pesada que comprende las regiones CDR, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3, respectivamente; y un dominio variable de cadena ligera que comprende las regiones CDR, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos.4, 5 y 6, respectivamente; para usarse en el tratamiento del cáncer matando una célula cancerosa que expresa CXCR4 por inducción de al menos una función efectora, en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

El término "anticuerpo" se usa aquí en el sentido más amplio y cubre específicamente a los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa) de cualquier isotipo como IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecífieos, anticuerpos quiméricos, y fragmentos de anticuerpo. Un anticuerpo reactivo con un antígeno específico puede ser generado por métodos recombinantes como la selección de bibliotecas y anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, o inmunizando a un animal con el antígeno o un ácido nucleico que codifique para el antígeno.

Un "anticuerpo policlonal" es un anticuerpo el cual fue producido entre o en presencia de uno o más de otros anticuerpos no idéntico. En general, los anticuerpos policlonales son producidos a partir de un linfocito B en presencia de varios otros linfocitos B que producen anticuerpos no idénticos. Usualmente, los anticuerpos policlonales son obtenidos directamente de un animal inmunizado .

Un "anticuerpo monoclonal", como se usa aquí, es un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir que los anticuerpos que forman esta población son esencialmente idénticos, excepto por posibles mutaciones naturales que puedan estar presentes en cantidades menores. En otras palabras, un anticuerpo monoclonal consiste de un anticuerpo homogéneo que surge del crecimiento de un clon de una sola célula (por ejemplo un hibridoma, una célula eucariótica anfitriona transfectada con una molécula de ADN que codifique para el anticuerpo homogéneo, una célula eucariótica anfitriona transfectada con una molécula de ADN que codifique para el anticuerpo homogéneo, etc.). Esos anticuerpos están dirigidos contra un solo epitope y por lo tanto son altamente específicos.

Un "epitope" es el sitio sobre un antígeno al cual se une el anticuerpo. Este puede estar formado por residuos contiguos o por residuos no contiguos en las proximidades por el doblez de una proteína antigénica. Los epítopes formados por aminoácidos contiguos son retenidos típicamente tras la exposición a solventes desnaturalizantes, mientras que los epítopes formados por aminoácidos no contiguos típicamente se pierden bajo tal exposición.

Preferiblemente, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal.

Un anticuerpo típico está comprendido de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable. Cada región variable contiene tres segmentos llamadas "regiones determinadoras de la complementaridad ("CDRs") o "regiones hipervariables", las cuales son responsables principalmente de la unión a un epitope de un antigeno. Ellas usualmente son conocidas como CDR1, CDR2, y CDR3, numeradas secuencualmente desde el N-terminal (véase Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C, Ruiz, M . , Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet , V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Los puntos más altamente conservados de las regiones variables son las llamadas "regiones estructurales".

Como se usa aquí, "VH" o "VH" se refiere a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo la cadena pesada de un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' , o F(ab')2. Las referencia a "VL" o "VL" se refiere a la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo la cadena ligera de un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab', o F(ab')2.

Los dominios constantes de un anticuerpo no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antigeno, pero exhiben varias funciones efectoras. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulina son llamadas , d, e, ?, y µ, respectivamente. Dependiendo de la secuencia de aminoácido de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas pueden ser asignados a diferentes clases, es decir, IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de esas pueden además ser dividas en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4; IgAl y IgA2 (véase, . E. Paul, ed. , 1993, Fundamental Immunology, Raven Press, Nueva York, Nueva York) .

La digestión con papaina de anticuerpos produce dos fragmentos de unión de antigeno idénticos, llamados fragmentos Fab, cada uno con un solo sitio de unión de antigeno, y un fragmento "Fe" residual. Aunque los limites del dominio de Fe de una cadena pesada de imnunoglobulina pueden variar, los dominios Fe de la cadena pesada de la IgG humada usualmente se define abarcando desde un residuo de aminoácido en la posición, de acuerdo con el índice EU, Cys226 o Pro230 en la región de la bisagra, al carboxilo terminal el mismo que contiene el dominio CH2 y CH3 de la cadena pesada (Edelman et al., The covalent structure of an entire gammaG immunoglobulin molecule, PNAS 1969; 63:78-85). Con el propósito de ser claros, deberá establecerse que los residuos Cys226/Pro230 de acuerdo con el índice EU corresponden a los residuos Cys239/Pro243 en el sistema de numeración de Kabat y a los residuos de la bisagra Cysll/Prol5 de acuerdo con I GT.

El término "región bisagra" se define de manera general como la extensión de Glu216 y Pro230 de la IgGl humana (Burton, Mol Immunol, 22: 161-206, 1985). Las regiones bisagra de otros isotipos de IgG pueden ser alineadas con la secuencia de IgGl colocando el primero y último residuos de cisteina que forman los enlaces S-S intercadena pesada en las mismas posiciones. El "dominio CH2" de una porción Fe de IgG humana (también conocido como dominio "Cy2") usualmente se extiende desde aproximadamente el aminoácido 231 hasta aproximadamente el aminoácido 340. El dominio CH2 es único dado que no se aparea estrechamente con otro dominio. Además, dos cadenas de carbohidratos ramificadas ligadas por N se interponen entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. Se ha especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustituto para el apareamiento dominio dominio y ayuda a estabilizar el dominio CH2 (Burton, Mol Immunol, 22: 161-206, 1985). El "dominio CH3 " comprende la extensión de los residuos C terminales a un dominio CH2 en una porción Fe (es decir, de aproximadamente el aminoácido residual 341 hasta aproximadamente el aminoácido residual 447 de una IgG) .

Las inmunoglobulinas IgG, incluyendo los anticuerpos monoclonales han mostrado estar N-glicosilados en la región constante de cada cadena pesada. Ellas contienen un solo glicano ligado en N en Asn 297 en el dominio CH2 sobre cada una de sus dos cadenas pesadas. Como se usa aquí, el término "N-glicano" se refiere a un oligosacárido ligado en N, por ejemplo uno que es unido por un enlace asparagina-N-acetilglucosamina a un residuo de asparagina de un polipéptido. Los N-glicanos tienen un núcleo de pentasacárido común de Man3GlcNAc2 ("Man" se refiere a la mañosa; "Glc" se refiere a la glucosa; y "NAc" se refiere a N-acetilo; GlcNAc se refiere a N-acetilglucosamina) .

Los N-glicanos difieren con respecto al número y naturaleza de ramificaciones (antenas) que comprenden azúcares periféricos (por ejemplo, GlcNAc, galactosa, fucosa, u ácido siálico) que se unen a la estructura del núcleo de Man3. Los N-glicanos se clasifican de acuerdo con sus constituyentes ramificados (por ejemplo, altos en mañosa, complejos o híbridos) . Un N-glicano del tipo biantenario, complejo típicamente tiene al menos una GlcNAc unida a la ramificación de 1,3 mañosa y al menos una GlcNAc unida a la ramificación de 1,6 mañosa del núcleo de trimanosa. Los N-glicanos biantenarios complejos pueden también tener sustituciones intracadena que comprendan GlcNAc "bisectante" y fucosa nuclear ("Fue"). Una "GlcNAc bisectante" es un residuo de GlcNAc unido a ß-l, 4-mannosa de la estructura de carbohidrato central madura.

Los N-glicanos biantenarios complejos también tienen residuos de galactosa ("Gal") que son opcionalmente modificados con ácido siálico. La adición de ácido siálico a la cadena de oligosacárido es catalizada por una sialiltransferasa, pero requiere la unión previa de uno o más residuos de galactosa por una galactosiltransferasa o N-acetilglucosaminas terminales. Los "ácidos siálicos" de acuerdo con la invención abarcan al ácido 5-N-acetilneuraminico (NeuNAc) y ácido 5-glicolilneuramínico (NeuNGc) .

Los oligosacáridos puedn contener cero (GO), uno (Gl) o dos (G2) residuos de galactosa, asi como una mucosa unida a la primera GlcNac o no. Esas formas son anotadas como GO/GOF, G2/G2F, G1/G1F, respectivamente (véase la Figura 1 de Theillaud, Expert Opin Biol Ther. , Suppl 1: S15-S27, 2005). En otras palabras, cuando ambos brazos de la cadena de oligosacáridos comprenden residuos de galactosa, las moles máximas de galactosa por mol de cadena pasada son dos y la estructura es referida como G2F cuando el núcleo está fucosilado y G2 cuando no lo está. Cuando un brazo o ramificación tiene galactosa terminal, la estructura es referida como GIF o Gl, dependiendo de si está fucosilada o no, mientras que la estructura es referida como GOF o GO, respectivamente, cuando no existe galactosa terminal.

Una inmunoglobulina IgG secretada es de este modo una mezcla heterogénea de glicoformos que exhiben adición variable en los residuos de azúcar fucosa, galactosa, ácido siálico, y N-acetilglucosamina disectante.

Los dominios Fe son centrales en la determinación de las funciones biológica de la inmunoglobulina y esas funciones biológicas son llamadas "funciones efectoras". Esas actividades mediadas por el domino Fe son mediadas vía células efectoras inmunológicas, como las células asesinas, células asesinas naturales, y macrófagos activadas, o varios componentes del complemento. Esas funciones efectoras implican la activación de receptores sobre la superficie de las células efectivas, a través de la unión del domino Fe de un anticuerpo al receptor o a componentes del complemento.

La expresión "citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo", "citotoxicidad dependiente del anticuerpo" or "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual la Ig unida sobre los receptores Fe (FcRs) presente sobre ciertas células efectoras citotóxicas permite que esas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula blanco que contenga el antígeno y posteriormente mate a la célula blanco con citotoxinas. La lisis de la célula blanco es extracelular, requiere el contacto directo célula a célula, y no implica complemento.

La destrucción de la célula puede ocurrir, por ejemplo, por lisis o fagocitosis. Las "células efectoras citotóxicas" son leucocitos los cuales expresan uno o más FcRs y efectúan funciones efectoras. Preferiblemente, las células se expresan al menos FCYRIII y llevan a cabo la función efectora de ADCC. Los ejemplo de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC), células asesinas naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos ; con las PBMCs y células NK siendo las preferidas. Las células efectoras pueden ser aisladas de una fuente nativa de las mismas, por ejemplo, de la sangre o del PBMCs. Las células efectoras que pueden efectuar la destrucción celular por medios líticos incluyen, por ejemplo, células asesinas naturales (NK) , eosinófilos, macrófagos y neutrófilos.

De las diferentes clases de inmunoglobulinas humanas, la IgGl e IgG3 humanas median la ADCC más efectivamente que la IgG2 e IgG4.

De manera ventajosa, el anticuerpo humano o humanizado de la invención, o el fragmento que contiene CH2 del mismo, es capaz de matar a una célula cancerosa que exprese CXCR4 induciendo citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) .

Por lo tanto, en una modalidad preferida del método de la invención, la función efectora consiste de la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) .

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque la función efectora consiste de la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) .

Aún en otras palabras, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque la función efectora consiste de la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) Como ejemplos no limitantes, pueden ser mencionados los siguientes métodos para evaluar o cuantificar la DAC in vitro: Citometria usando yoduro de propidio (PI) o calceina, 51Cr o tintes fluorescentes como calceina-AM, carboxifluorescein succinimidil éster (CFSE) , 2' , 1' -bis- (2-carboxietil) -5- (y-6) -carboxifluoresceina (BCECF) o Europio, o midiendo la liberación de enzima citosólica como la lactato deshidrogenasa (LDH) o ATP. Esos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica [véase por ejemplo, Jiang et al., "Advances in the assessment and control of the effector functions of therapeutic antibodies", Nat Rev Drug Discov. , 10: 101-110, 2011, y referencias en ellas] y no necesitan ser más detallados aquí.

Por "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC", se entiende aquí un mecanismo por el cual la activación del complemento iniciada por la unión del anticuerpo especifico a un antigeno o la superficie de una célula causa la lisis de la célula blanco, a través de una serie de cascadas (vías de activación del complemento) que contienen grupos y proteínas relacionas con el complemento en la sangre. Además, los fragmentos de proteína generados por la activación de un complemento pueden inducir la migración y activación de células inmunes. El primer paso de la activación de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) consiste de la unión de la proteína Clq a al menos dos dominios Fe del anticuerpo. La "Clq" es un polipéptido que incluye un sitio de unión para la región Fe de una inmunoglobulina. La Clq junto con dos serina proteasas, Clr y Cls, forma el complejo Cl, el primer componente de la vía de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

En otra modalidad ventajosa de la invención, el anticuerpo humano o humanizado, o el fragmento del mismo que contiene CH2, es capaz de matar una célula cancerosa que expresa CXCR4 por inducción de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

Por lo tanto, la presente invención también se relaciona con un método como se describió anteriormente, donde la función efectora consiste de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque la función efectora consiste de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque la función efectora consiste de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

La citotoxicidad de células nucleadas por CDC puede ser cuantificada in vitro por varios métodos, como: exclusión de azul de Tripan, citometria de flujo usando yoduro de propidio (PI), liberación de51Cr, reducción de la sal de tetrazolio TT, tinte azul de Alamar redox, pérdida de ATP intracelular, CellTiter-Glo, liberación de LDH o liberación de calceina-AM. Esos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica, [véanse por ejemplo. Jiang et al., "Advances in the assessment and control of the effector functions od therapeutic antibodies", Nat Rev Drug Discov., 10: 101-110, 2011, y referencias en ellas] y no necesita ser más detallados aquí.

En una modalidad ventajosa más de la invención, ambas de la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) son inducidas, es decir que el anticuerpo humano o humanizado, o el fragmento del mismo que contiene CH2, es capaz de matar una célula cancerosa que expresa CXCR4 induciendo citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

En una modalidad preferida, las funciones efectoras del método de la invención consiste de la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque las funciones efectoras consisten de la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque las funciones efectoras consisten de la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) .

Esas dos funciones efectoras de un anticuerpo están asociadas directamente con la unión de la porción Fe del anticuerpo a receptores específicos sobre la superficie de células inmunes - esencialmente FcYRIIIa (también conocido como FcyRIIIA) y FcyRIIa (también conocida como FcyRIIA) expresados sobre las células NK, macrófagos, monolitos para la ADCC y la proteína de la cascada del complemento Clq para CDC.

Las interacciones precisas entre la porción Fe de un anticuerpo y los FcyRs y Clq han sido asignadas con precisión y el dominio Fe mayor implicado en esta interacción corresponde al dominio CH2. La afinidad entre la porción de Fe y los receptores de Fe está ligada directamente al grado de respuestas inmunes que sean activadas.

Como se describió anteriormente, los anticuerpos humanos o humanizados dirigidos contra CXCR4 son capaces de inducir funciones efectoras contra células que expresan CXCR4, conduciendo de este modo efectos citotóxicos contra las células. Está claro que a mayor inducción de la función efectora, mayor el efecto citotóxico contra las células que expresan CXCR4. Aunque algunos anticuerpos pueden presentar actividad de ADCC y/o CDC elevada de manera natural, en otros casos puede ser necesario diseñar un anticuerpo humano o humanizado dirigido contra CXCR4 para mejorar la respuesta inmune del anticuerpo, y de manera más particular, la ADCC y/o CDC. Esos anticuerpos modificados también son abarcados por el alcance de la presente invención.

Existen varias formas de modificar y mejorar las respuestas inmunes de anticuerpos y, de manera más particular la ADCC y/o CDC, basándose la mayoría de ellas en el incremento directo de la unión de la porción Fe al FcyR cognado para la ADCC. La meta principal es incrementar la unión al FcyRa humano y FcyRIIa humano y hacer disminuir la unión al FcyRIIb humano (un receptor inhibidor que hace disminuir las respuestas inmunes) . Esto puede ser logrado ya sea haciendo mutar residuos de aminoácidos individuales dentro de la porción Fe o modificando la porción de glicano ligada a la asparagina 297 del dominio CH2 para incrementar la porción de glicano afucosilada. Puede ser lograda glicomodificación, por ejemplo, ya sea por inactivación (siARN, KO, etc; Toyohide Shinkawa et al., The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgGl complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity . J. Biol. Chem 2003; 278: 3466-3473) del gen FUT8 en la célula anfitriona productora del anticuerpo, o sobre expresión de GlcNAc III transferasa en la célula productora del anticuerpo (véase por ejemplo Pablo Umana et al. Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgGl with optimized antibody-dependent cellular cytotoxicity activity. Nat Biotechnol 1999;17:176-180).

Esos anticuerpos pueden ser obtenidos efectuando sustituciones individuales o múltiples en el dominio constante del anticuerpo, incrementando de este modo su interacción con los receptores Fe. Los métodos para diseñar esos mutantes pueden ser encontrados por ejemplo en Lazar et al. (2006, PNAS, 103(11): 4005-4010) y Okazaki et al. (2004, J. Mol. Biol. 336(5): 1239-49).

También es posible usar lineas celulares específicamente modificadas para la producción de anticuerpos mejorados. En particular, esas líneas tienen alterada la regulación de la vía de la glicosilación, dando como resultado anticuerpos que están pobremente fucosilados o aún totalmente desfucosilados . Esas líneas celulares y métodos para modificarlas son descritas por ejemplo en Shinkawa et al. (2003, J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473), Ferrara et al. (Biotechnol. Bioeng. 93(5): 851-61).

Otros métodos para incrementar la ADCC también han sido descritos por Li et al. (2006, Nat Biotechnol. 24 (2) : 210-5) , Stavenhagen et al. (2008, Advan. Enzyme Regul . 48:152-164), Shields et al. (2001, J. Biol. Chem., 276 (9) : 6591-6604) ; y la WO 2008/006554.

Los métodos para incrementar la CDC han sido descritos por Idusogie et al. (2001, J Immunol. 166(4) :2571-5), Dall'Acqua et al. (2006, J Immunol, 177 (2) : 1129-38) , Michaelsen et al. (1990, Scand J Immunol, 32(5) :517-28), Brekke et al. (1993, Mol Immunol, 30 ( 16) : 1419-25 ) , Tan et al. (1990, Proc ; Nati. Acad. Sci . USA, 87:162-166) y Norderhaug et al. (1991, Eur J Immunol, 21 ( 10 ) : 2379-8 ) .

Una tecnología bien descrita es la tecnología del complemento desarrollada por Kyowa la cual consiste de producir una porción Fe de IgGl/IgG3 humana quimérica con CDC mejorada (véase por ejemplo la WO 2007/011041) .

Las referencias que describen métodos para incrementar la ADCC y CDC incluyen Natsume et al. (2008, Cáncer Res. 68(10): 3863-3872). Las descripciones de cada una de esas referencias se incluyen aquí como referencia cruzada.

Estará claro para el experto en la técnica que, mejorar la ADCC y/o CDC es de interés particular en el campo del tratamiento de los cánceres puesto que conducirá a la eliminación de células cancerosas que expresen CXCR4, y por lo tanto, claramente limitará el riesgo de resurgimiento del cáncer, si el tratamiento dirigido a CXCR4 es interrumpido.

Debe comprenderse que la expresión "fragmento de unión que contiene CH2", se refiere a cualquier fragmento o parte de un anticuerpo que comprenda las 6 CDRs del anticuerpo original y al menos el dominio CH2, el cual se sabe responsable de inducir una función efectora. En una modalidad preferida más, el CH2 debe ser dimérico, es decir que debe comprender dos copias del CH2.

En otra modalidad, el fragmento de unión que contiene CH2 comprende las 6 CDRs del anticuerpo original y al menos el CH2 de los dominios bisagra.

En otra modalidad, el fragmento de unión que contiene CH2 comprende las 6 CDRs del anticuerpo original y al menos el CH1, la bisagra y los dominios CH2.

En otra modalidad, el fragmento de unión que contiene CH2 comprende las 6 CDRs del anticuerpo original y al menos los dominios de CH1 y CH2.

En otra modalidad, el fragmento de unión que contiene CH2 comprende las 6 CDRs del anticuerpo original y al menos los dominios de CH1, CH2 y CH3.

En otra modalidad más, el fragmento de unión que contiene CH2 comprende las 6 CDRs del anticuerpo original y al menos CH1, la bisagra, los dominios de CH2 y CH3, es decir el Fe de longitud completa.

De manera más preferible, la invención comprende los anticuerpos humanizados, sus fragmentos de unión que contienen CH2 obtenidos por recombinación genética o síntesis química .

De acuerdo con una modalidad preferida, el anticuerpo humano o humanizado se caracteriza porque consiste de un anticuerpo monoclonal.

En otras palabras, el método de la invención comprende el uso de anticuerpos humanos o humanizados, o un fragmento de unión que contiene CH2 que comprende, de acuerdo con la IMGT, una cadena pesada que comprende las siguientes tres CDR, respectivamente, CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3, donde: - la CDR-Hl comprende la secuencia SEQ ID No. 1, o una secuencia con al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98%, de identidad después de la alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 1; - la CDR-H2 comprende la secuencia SEQ ID No. 2, o una secuencia con al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98%, de identidad después de la alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 2; y - la CDR-H3 comprende la secuencia SEQ ID No. 3, o una secuencia con al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98%, de identidad después de la alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 3.

De manera aún más preferida, el método de la invención comprende el uso de anticuerpos humanos o humanizados, o un fragmento de unión que contiene CH2, el cual comprende, de acuerdo con la IMGT, una cadena ligera que comprende las siguientes tres CDRs, respectivamente CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, donde: - la CDR-L1 comprende la secuencia SEQ ID No. 4, o una secuencia con al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y , 98%, de identidad después de la alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 4; - la CDR-L2 comprende la secuencia SEQ ID No. 5, o una secuencia con al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98%, de identidad después de la alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 5; y - CDR-L3 comprende la secuencia SEQ ID No. 6, o una secuencia con al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98%, de identidad después de la alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 6.

En la presente invención, los términos "polipéptidos" , "secuencias polipeptidicas", "péptidos" son intercambiables .

La numeración única de la IMGT ha sido definida para comparar los dominios variables cualquiera que sea el receptor del antigeno, el tipo de cadena, o la especie [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M. -P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C, Ruiz, . , Giudicelli, V., Foulquier, E . , Truong, L . , Thouvenin-Contet , V. y Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) ] . En la numeración única de la IMGT, los aminoácidos conservados siempre tienen la misma posición, por ejemplo la cisteina 23 (Ira CYS) , triptófano 41 (TRP CONSERVADO) , aminoácido hidrofóbico 89, cisteina 104 (2da CYS) , fenilananina o triptófanos 118 ( J-PHE o J-TRP) . La numeración única de la IMGT proporciona una delimitación estandarizada de las regiones estructurales (FR1-IMGT: posiciones 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones determinantes de la complementaridad: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT: 105 a 117. Puesto que los huecos o espacios representan posiciones no ocupadas, las longitudes de CDR-IMGT (mostradas entre corchetes y separadas por puntos, por ejemplo [8.8.13]) se convierten en información crucial. La numeración única de la IMGT es usada en representaciones gráficas 2D, designadas como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. y Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], y en estructuras 3D en IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., T cell receptor y MHC structural data. Nucí. Acids . Res., 32, D208-D210 (2004)].

En el sentido de la presente invención, el "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos significa que el porcentaje de nucleótidos o aminoácidos residuales idénticos entre dos secuencias a ser comparadas, obtenido después de la alineación óptima, siendo este porcentaje meramente estadístico y estando las diferencias entre las dos secuencias distribuidas aleatoriamente a lo largo de su longitud. La comparación de dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos tradicionalmente es llevada a cabo comparando las secuencias después de haber sido alineadas de manera óptima, viendo llevarse a cabo la comparación segmento por segmento usando una "ventana de alineación". La alineación óptima de la secuencia para la comparación puede ser llevada a cabo, además de la comparación manual, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], por medio del algoritmo de homología local de Neddleman y unsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 : 443], por medio del método de búsqueda de similitud Pearson y Lipman (1988) [Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444] o por medio de un software de computadora usando esos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o por el software de comparación BLAST NR o BLAST P) .

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos es determinado comparando las dos secuencias alineadas de manera óptima en las cuales la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos a comparar puede tener adiciones o supresiones en comparación con la secuencia de referencia para la alineación óptima entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad es calculado determinando el número de posiciones en las cuales el nucleótido o aminoácido residual es idéntico entre las dos secuencias, preferiblemente entre las dos secuencias completas, dividiendo el número de posiciones idénticas por el número total de posiciones en la ventana de alineación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre las dos secuencias.

Por ejemplo, el programa BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein y nucleotide sequences", FEMS Microbiol . , 1999, Lett. 174:247-250) disponible en el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, puede ser usado con los parámetros predeterminados (especialmente para los parámetros "penalidad de espacio abierto": 5, y "penalidad de espacio de extensión": 2; siendo la matriz seleccionada por ejemplo la matriz "BL0SUM 62" propuesta para el programa) ; el porcentaje de identidad entre las dos secuencias a comparar es calculado directamente por el programa.

Para una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia, los ejemplos preferidos incluyen aquellos que contienen la secuencia de referencia, ciertas modificaciones, especialmente una supresión, adición o sustitución de al menos un aminoácido, truncado o extensión. En el caso de la sustitución de uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos, se prefieren las sustituciones en las cuales los aminoácidos sustituidos son reemplazados por aminoácidos "equivalentes". Aquí, la expresión "aminoácidos equivalentes" significa cualquier aminoácido que probablemente sea sustituido por uno de los aminoácidos estructurales, sin embargo, modificar las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y de aquellos ejemplos específicos definidos más adelante.

Los aminoácidos equivalentes pueden ser determinados ya sea sobre su homología estructural con los aminoácidos por los cuales son sustituidos o sobre los resultados de pruebas comparativas de actividad biológica entre los diferentes anticuerpos que probablemente sean generados.

Como un ejemplo no limitante, la Tabla 1 resume a continuación las posibles sustituciones que probablemente se lleven a cabo sin dar como resultado una modificación significativa de la actividad biológica del anticuerpo modificado correspondiente; naturalmente son posibles sustituciones inversas las mismas condiciones .

Tabla 1 Es sabido por aquellos expertos en la técnica que en el estado actual de la técnica la mayor variabilidad (longitud y composición) entre las seis CDRs se encuentra en las tres CDRs de cadena pesada y, de manera más particular, la CDR-H3 de esta cadena pesada.

En consecuencia, será evidente que las CDRs de características preferidas de la invención, o uno de sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, serán las tres CDRs de la cadena pesada.

Otra modalidad de la invención describe el uso de un anticuerpo humano o humanizado, o un fragmento de unión que contiene CH2, el cual comprende: Una cadena pesada que comprende las siguientes tres CDRs : CDR-H1 de la secuencia SEQ ID No. 1 o de una secuencia con al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de la alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 1; CDR-H2 de la secuencia SEQ ID No. 2 o de una secuencia con al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de la alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 2; CDR-H3 de la secuencia SEQ ID No. 3 o de una secuencia con al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de la alineación óptima con la secuencia SEQ ID No 3; y una cadena ligera que comprende las siguientes tres CDRs: CDR-L1 de la secuencia SEQ ID No. 4 o de una secuencia con al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de la alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 4; CDR-L2 de la secuencia SEQ ID No. 5 o de una secuencia con al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de la alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 5; CDR-L3 de la secuencia SEQ ID No. 6 o de una secuencia con al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad después de la alineación óptima con la secuencia SEQ ID No. 6.

Para mayor claridad, la Tabla 2a resume a continuación las diferentes secuencias de aminoácidos correspondientes a las CDRs del anticuerpo hz515H7 de la invención; mientras que la Tabla 2b resume las diferentes secuencias de aminoácidos correspondientes a las variables y las secuencias de longitud completa de las diferentes variantes del anticuerpo humanizado de la invención.

Tabla 2a Tabla 2b Como un ejemplo, para evitar dudas, la expresión "VH1" es similar a la expresión "Variante 1 de VH", "Variante 1 de VH", "Var 1 de VH" o "var 1 de VH") .

Puede mencionarse aquí que el anticuerpo usado para la invención fue obtenido a partir de la humanización del anticuerpo murino producido por el hibridoma murino presentado con la colección francesa de cultivos de microorganismos (CNCM, Institut Pasteur, París, Francia) el 25 de junio de 2008, bajo el número 1-4019. El hibridoma fue obtenido por la fusión de esplenocitos de ratones inmunizados BALB/c y células líneas de mieloma Sp 2/O-Ag 14.

El anticuerpo monoclonal murino, referido aquí como 515H7 es secretado por el hibridoma presentado con la CNCM el 25 de junio de 2008, bajo el número 1-4019.

En una modalidad preferida, el anticuerpo usado en el método de la invención es un anticuerpo humanizado.

Como se usa aqui, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico el cual contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Un "anticuerpo quimérico", como se usa aquí, es un anticuerpo en el cual la región constante, o una porción de la misma, es alterada, reenlazada o intercambiada, de modo que la región variable se ligue a una región constante de una especie diferente, o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpo. "Anticuerpo quimérico" también se refiere a un anticuerpo en el cual la región variable, o una porción del mismo, es alterada, reemplazada, o intercambiada, de modo que la región constante se ligue a una región variable de una especie diferente, o pertenezca a otra clase o subclase de anticuerpo .

En ciertas modalidades, ambas regiones variable y constante de los anticuerpos, o fragmentos de unión de antígeno, variantes, o derivados de los mismos son completamente humanos. Los anticuerpos completamente humanos pueden ser producidos usando métodos que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos completamente humanos contra un antigeno especifico pueden ser preparados administrando el antigeno a un animal transgénico que haya sido modificado para producir esos anticuerpos en respuesta a la un desafio antigénico, pero aquellos sitios endógenos han sido desactivados. Las técnicas ejemplares que pueden ser usadas para producir esos anticuerpos son descritos en las patentes Estadounidenses: 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140. Otros métodos son conocidos en la técnica. Los anticuerpos completamente humanos pueden igualmente ser producidos por varias tecnologías de presentación, por ejemplo, presentación de fago u otros sistemas de presentación viral. Véanse también las Patentes Estadounidenses Nos. 4,444,887, 4,716,111, 5,545,806, y 5,814,318, y los números de publicación de solicitud de Patente Internacional WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741 (referencias incorporadas como referencia en su totalidad) .

Un "anticuerpo humanizado" como se usa aquí se refiere a un anticuerpo que contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano, siendo las otras partes de la molécula del anticuerpo derivadas de uno (o varios) anticuerpo humano. Además, algunos de los residuos del segmento del esqueleto (llamados FR) pueden ser modificados para preservar la afinidad de unión (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).

La meta de la humanización es una reducción en la inmunogenicidad de un anticuerpo xenogénico, como un anticuerpo murino, para introducirse en un humano, manteniendo a la vez toda la afinidad de unión del antigeno y especificidad del anticuerpo. Los anticuerpos humanizados de la invención o fragmentos de los mismos pueden ser preparados por métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica (como, por ejemplo, aquellos descritos en Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Moutain et al., Biotechnol Genet Eng Rev., 10:1-142, 1992; y Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). Esos anticuerpos humanizados son preferidos para usarse en métodos que impliquen diagnósticos in vitro o tratamiento preventivo y/o terapéutico in vivo. Otras técnicas de humanización, también conocidas por un experto en la técnica, como, por ejemplo, lá técnica de "injerto de CDR" descrita por PDL en las patentes EP 0 451 261, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP 0 566 647 o US 5,530;101, US 6,180,370, US 5,585,089 y US 5,693,761, y las Patentes US 5,639,641 o 6,054,297, 5,886,152 y 5,877,293 también pueden ser citadas.

Por extensión, en el caso de esta presente especificación, el anticuerpo quimérico cl51H7 estará comprendido en la expresión "anticuerpo humanizado". De manera más particular, el c515H7 se caracteriza porque comprende una cadena- pesada de la secuencia SEC ID No. 70 (correspondiente al nucleótido SEC ID No 73) .

La invención se relaciona a los anticuerpos humanizados que surgen del anticuerpo murino 515H7 descrito anteriormente, siendo los anticuerpos definidos por las secuencias de sus dominios variables de cadenas pesada y/o ligera. En realidad, todos los anticuerpos humanizados descritos aquí pueden ser usados en los métodos de la invención, es decir, que pueden ser usados para matar células cancerosas que expresen CXCR4 por inducción de al menos una función efectora, en presencia de células efectoras o componentes del complemento, o pueden ser usados para tratar el cáncer matando células cancerosas que expresen CXCR4 por inducción de al menos una función efectora, en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

En una modalidad preferida del método de la invención, el anticuerpo humano o humanizado consiste de un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado de las secuencias SEC ID No. 7 a 10 y un dominio variable de cadena ligera seleccionado de la • secuencia SEC ID No. 11 a 17.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque el anticuerpo humano o humanizado consiste de un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado de las secuencias SEC ID No. 7 a 10 y un dominio variable de cadena ligera seleccionado de las secuencias SEQ ID No. 11 a 17.

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque consiste de un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado de las secuencias SEC ID No. 7 a 10 y un dominio variable de cadena ligera seleccionado de las secuencias SEQ ID No. 11 a 17.

Un anticuerpo humanizado preferido de acuerdo con la invención consiste de un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 8 y un dominio variable de cadena ligera seleccionado de las secuencias SEC ID No. 11 a 17.

Un anticuerpo humanizado preferido más de acuerdo con la invención consiste de un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado entre las secuencias SEC ID No. 7 a 10 y un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID No. 13.

La invención también se relaciona con los anticuerpos humanizados que surgen del anticuerpo murino 515H7 descrito anteriormente, siendo los anticuerpos definidos por las secuencias de sus cadenas pesada y/o ligera de longitud completa.

En una modalidad preferida del método de la invención, el anticuerpo humano o humanizado consiste de un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada seleccionada de las secuencias SEC ID No. 18 a 21 y una cadena ligera seleccionada de las secuencias SEC ID No. 22 a 28.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque el anticuerpo humano o humanizado consiste de un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada seleccionada de las secuencias SEC ID No. 18 a 21 y una cadena ligera seleccionada de las secuencias SEQ ID No. 22 a 28.

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque consiste de un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada seleccionada de las secuencias SEC ID No. 18 a 21 y una cadena ligera seleccionada de las secuencias SEQ ID No. 22 a 28.

Un anticuerpo humanizado preferido de acuerdo con la invención consiste de un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de las secuencias SEC ID No. 19 y/o una cadena ligera seleccionada de las secuencias SEC ID No. 22 a 28.

Otro anticuerpo humanizado preferido de acuerdo con la invención consiste de un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada seleccionada de las secuencias SEC ID No. 18 a 21 y/o una cadena ligera de las secuencias SEC ID No. 24.

En una modalidad preferida, la invención se relaciona con el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl D76N VL2, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 8, y una región variable de cadena ligera de la SEC ID No. 13.

En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl D76N VL2, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 19, y una cadena ligera de secuencia SEC ID No. 24.

En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl D76N VL2.1, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 8, y una región variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID No. 14.

En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl D76N VL2.1, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una cadena pesada de secuencia SEC ID No. 19, y una cadena ligera de secuencia SEC ID No. 25.

En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl D76N VL2.2, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 8, y una región variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID No. 15.

En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl D76N VL2.2, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 19, y una cadena ligera de la secuencia SEC ID No. 26.

En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl D76N VL2.3, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 8, y región variable de cadena ligera de secuencia SEC ID No. 16.

En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl D76N VL2.3, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 19, y una cadena ligera de la secuencia SEC ID No. 27.

En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl V48L D76N VL1, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia de la. SEC ID No. 9, y región variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID No. 11.

En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl V48L D76N VL1, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 20, y una cadena ligera de secuencia SEC ID No. 22.

En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl V48L D76N VL1 T59A E61D, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 9, y una región variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID No. 12.

En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl V48L D76N VL1 T59A E61D, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una cadena pesada de secuencia SEC ID No. 20, y una cadena ligera de secuencia SEC ID No. 23.

En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl VL1, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia SEQ ID No. 7, y región variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID No. 11.

En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con el anticuerpo humanizado Hz515H7 VHl VL1, o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, que comprende una cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 18, y una cadena ligera de secuencia SEC ID No. 22.

Debe comprenderse que las combinaciones de VH/VL ejemplificados anteriormente no son limitantes. El experto en la técnica podría, por supuesto, sin una carga indebida y sin aplicar una destreza inventiva, rearreglar todas las VH y VL descritas en la presente especificación.

En una modalidad preferida más del método de la invención, el anticuerpo humano o humanizado consiste de un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 8 y un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID No. 13.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque el anticuerpo humano o humanizado consiste de un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 8 y un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID No. 13.

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque consiste de un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia ID SEC No. 8 y un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID No. 13.

En cuanto a las diferentes secuencias descritas anteriormente, el anticuerpo preferido (pero no exclusivo) también será descrito por las secuencias de sus secuencias completas de cadena pesada y ligera de longitud.

En una modalidad preferida más del método de la invención, el anticuerpo humano o humanizado consiste de un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 19 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID No. 24.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque el anticuerpo humano o humanizado consiste de un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 19 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID No. 24.

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención, se caracteriza porque consiste de un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de la secuencia SEC ID No. 19 y una cadena ligera de secuencia SEC ID No. 24.

Será obvio para el experto en la técnica que el anticuerpo de la invención debe presentar los elementos estructurales necesarios para presentar las funciones efectoras. De manera más particular, el anticuerpo debe ser de un isotipo adecuado para permitir la ADCC y/o CDC. Por ejemplo, se sabe que, de las diferentes clases de inmunoglobulinas humanas, las IgGl e IgG3 humanas median la ADCC de manera más efectiva que las IgG2 e IgG4. Por otro lado, el orden de potencia para la CDC es IgG3 = IgGl » IgG2 * IgG4 (Niwa et al., J Immunol Methods, 306: 151-160, 2005).

En una modalidad preferida del método de la invención, el anticuerpo humano o humanizado es para el isotipo IgGl.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque el anticuerpo humano o humanizado es el isotipo IgGl.

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque es el isotipo IgGl.

En una modalidad particular, la invención se relaciona con un fragmento de unión que contiene CH2 de un anticuerpo preferido de la invención que consiste de la IgGl HZ515H7 VH1 D76N VL2.

De manera más particular, un fragmento de unión preferido que contiene CH2 consiste de un fragmento que comprende i) un dominio variable de cadena pesada que comprende las regiones CDR de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3, respectivamente; ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las regiones CDR de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden las secuencias SEC ID Nos. 4, 5 y 6, respectivamente, y iii) un dominio de CH2 que comprende al menos la secuencia SEC ID No. 60.

En una modalidad preferida del método de la invención, el fragmento de unión que contiene CH2 consiste de un fragmento que comprende las 3 cadenas pesadas CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3 que consisten de las SEQ ID Nos. 1, 2 y 3, respectivamente; las 3 cadenas ligeras CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden las SEQ ID Nos. 4, 5 y 6, respectivamente; y al menos el dominio de CH2 que comprende la SEC ID No. 60.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque el fragmento de unión que contiene CH2 consiste de un fragmento que comprende las 3 cadenas pesada CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden las SEQ ID Nos. 1, 2 y 3, respectivamente; las 3 cadenas ligeras de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden las SEQ ID Nos. 4, 5 y 6, respectivamente, y al menos el dominio CH2 que comprende la SEC ID No. 60.

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque el fragmento de unión que contiene CH2 consiste de un fragmento que comprende las 3 cadenas pesada CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden las SEC ID No. 1, 2 y 3, respectivamente; la 3 cadenas ligeras CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden las SEQ ID Nos. 4, 5 y 6, respectivamente; y al menos el dominio de CH2 que comprende la SEC ID No. 60.

Otro fragmento de unión preferido que contiene CH2 consiste de un fragmento que comprende i) un dominio variable de cadena pesada que comprende las regiones CDR de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3, respectivamente; ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las regiones CDR de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 4, 5 y 6, respectivamente, iii) un dominio de CH2 que consiste de al menos la secuencia SEC ID No. 60, y iv) un dominio bisagra que comprende al menos la secuencia SEC ID No. 61.

Otro fragmento de unión preferido más que contiene CH2 consiste de un fragmento que comprende i) el dominio variable de cadena pesada que comprende las regiones CDR CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden las secuencias de SEQ ID Nos. 1, 2 y 3, respectivamente; ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las regiones CDR CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 4, 5 y 6, respectivamente, iii) un dominio de CH2 que comprende al menos una secuencia SEC ID No. 60; iv) un dominio bisagra que comprende al menos la secuencia SEC ID No. 61, y v) un dominio de CHl que comprende al menos la secuencia SEC ID No. 62.

Otro fragmento de unión preferido más que contiene CH2 consiste de un fragmento que comprende i) un dominio variable de cadena pesada que comprende las regiones CDR CDR- Hl, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3, respectivamente; ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las regiones CDR CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3 que comprende las secuencias SEQ ID Nos. 4, 5 y 6, respectivamente, iii) un dominio CH2 que comprende al menos la secuencia SEC ID No. 60; iv) un dominio bisagra que comprende al menos la secuencia SEC ID No. 61; v) un dominio CH1 que comprende al menos la secuencia SEC ID No. 62, y vi) un dominio de CH3 que comprende al menos la secuencia SEC ID No. 63.

En otra modalidad preferida más de la invención, un fragmento de unión que contiene CH2 preferido consiste de un fragmento que comprende i) un dominio variable de cadena pesada que comprende las regiones CDR de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3, respectivamente; ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende las regiones CDR de CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3 que comprende las secuencias SEC ID Nos. 4, 5 y 6, respectivamente, y iii) un dominio Fe de longitud completa que comprende al menos la secuencia SEC ID No. 64.

Para mayor claridad, la siguiente tabla 3 ilustra las secuencias para cada dominio para el anticuerpo Hz515H7 VH1 D76N VL2.

Tabla 3 Sobre la base de esos elementos, está claro para el experto en la técnica como generar cualquier fragmento de unión que contenga CH2, derivado de cualquier secuencia descrita en la presente solicitud, sin ninguna experimentación indebida. Como consecuencia, cualquier otro fragmento de unión que contenga CH2 debe ser considerado como parte del alcance de la presente solicitud.

La Tabla 4a resume a continuación las secuencias de nucleótidos optimizados correspondientes a las CDRs del anticuerpo HZ515H7 de la invención, mientras que la Tabla 4b resume las diferentes secuencias de nucleótidos optimizadas correspondientes a los dominios variables y la secuencia de longitud completa de las diferentes variantes del anticuerpo humanizado de la invención.

Tabla 4a La expresión "secuencia optimizada" significa que los codones que codifican para los aminoácidos constitutivos de la proteina de interés (aquí los dominios variables del anticuerpo) han sido modificados para un mejor reconocimiento por la maquinaria de traducción en un tipo de célula dedicada, en las presentes células de mamífero. En realidad, el experto en la técnica sabe que, dependiendo de la fuente u origen del gen y de la célula usada para la expresión, una optimización de codón puede ser útil para incrementar la expresión de los polipéptidos codificados de la invención. "Optimización de codón", se refiere a las alteraciones a las secuencias codificadoras para los polipéptidos de la invención, lo cual mejora las secuencias para el uso del codón en la célula anfitriona. En la técnica son conocidas tablas de usos del codón para células de mamífero, como por ejemplo, células CHO, así como para una variedad de otros organismos. Además, la optimización también puede ser lograda mediante alteraciones de las secuencias de polinucleotídicas, las cuales incluyen adaptación del contenido de G/C y la prevención de la estructura secundaria de ARN estable (véase como ejemplo Kim et al., 1997 Genel99 (l-2):293 - 301).

Los términos "ácido nucleico", "secuencia nucleica", "secuencia de ácido nucleico", "polinucleótido", "secuencia polinucleotídica" y "secuencia nucleotidica", usados de manera intercambiable en la presente descripción, significan una secuencia precisa de nucleotidos, modificada o no, que define un fragmento o una región de un ácido nucleico, que contiene nucleotidos no naturales o no, y que es un ADN de doble hebra, un ADN de una sola hebra o productos de transcripción de los ADNs.

Las secuencias nucleicas de la presente invención han sido aisladas y/o purificadas, es decir, que fueron muestreadas directa o indirectamente, por ejemplo, por una copia, habido siendo su ambiente modificado al menos parcialmente. Las "secuencias nucleicas que exhiben un porcentaje de identidad de al menos 80%, preferiblemente 85%, 90%, 95% y 98%, después de la alineación óptima con una secuencia preferida" significa que las secuencias nucleicas exhiben, con respecto a la secuencia nucleica de referencia, ciertas modificaciones como, en particular, una supresión, un truncado, una extensión, una fusión quimérica y/o una sustitución, especialmente puntual. Preferiblemente, esas son secuencias las cuales codifican para las mismas secuencias de aminoácidos de la secuencia de referencia, estando esto relacionado con la degeneración del código genético, o secuencias complementarias que probablemente se hibriden específicamente con las secuencias de referencia, preferiblemente bajo condiciones altamente controladas, especialmente aquellas definidas más adelante.

La hibridación bajo condiciones altamente controladas significa aquellas condiciones que se relacionan con la temperatura y fuerza iónica que son seleccionadas, de tal manera que permiten que la hibridación sea mantenida entre dos fragmentos de ADN complementarios. Sobre una base meramente ilustrativa, las condiciones altamente controladas del paso de hibridación para el propósito de definir los fragmentos polinucleótidos descritos anteriormente son, de manera ventajosa las siguientes.

La hibridación ADN-ADN o hibridación ADN-ARN es llevada a cabo en dos pasos: (1) hibridación a 42°C durante tres horas en amortiguador de fosfato (20 mM, pH 7.5) que contiene 5X SSC (IX SSC corresponde a una solución de NaCl 0.15 M + citrato de sodio 0.015 M) , formamida al 50%, dodecil sulfato de sodio (SDS) al 7%, 10X Denhardt, sulfato de dextrano al 5% y ADN de esperma de salmón al 1%; (2) hibridación primaria durante 20 horas a una temperatura dependiendo de la longitud de la sonda (es decir: 42 °C para una sonda > 100 nucleótidos de longitud) seguida por dos lavados de 20 minutos a 20°C en 2X SSC + SDS al 2%, un lavado de 20 minutos a 20°C en 0. IX SSC + SDS al 0.1%. El último lavado es llevado a cabo en 0. IX SSC + SDS al 0.1% durante 30 minutos a 60°C para una sonda > 100 nucleótidos de longitud. Las condiciones de hibridación altamente controladas o rigurosas descritas anteriormente para un polinucleótido de un tamaño definido pueden ser adaptadas por un experto en la técnica para oligonucleótidos más largos o más cortos, de acuerdo a los procedimientos descritos en Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 3a edición, 2001) .

Para expresar la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo humano o humanizado, o el fragmento de unión que contiene CH2 del mismo, de la invención, los polinucleótidos de acuerdo con las cadenas pesada y/o ligera son insertados en vectores de expresión de modo que los genes son ligados operativamente a secuencias de control transcripcional y traslacional .

Las secuencias "ligadas operativamente" incluyen ambas secuencias de control que están contiguas al gen de interés y secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de expresión" como se usa aquí, se refiere a secuencias de polinucleotidicas que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de secuencias codificadoras a las cuales se ligan. La expresión de las secuencias de control incluyen las secuencias de inicio, terminación, promotoras y mej oradoras de la transcripción, señales de procesamiento de ARN eficiente, como señales de empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que mejoran la eficiencia de la traducción (es decir, secuencias de consenso de Kozak) ; secuencias que mejoran la estabilidad de la proteína; y cuando se desee, secuencias que mejoran la secreción de proteínas. La naturaleza de esas secuencias de control difiere dependiendo del organismo anfitrión; en los procariotes, esas secuencias de control generalmente incluyen una secuencia promotora, del sitio de unión ribosomal, y de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, esas secuencias de control incluyen la secuencia promotora y de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de par de fusión.

El término "vector", como se usa aquí, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido ligada. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual se refiere a un lazo de ADN de doble hebra circular en el cual pueden ser ligados segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, donde pueden ser ligados segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores pueden replicarse de manera autónoma en una célula anfitriona a la cual hayan sido introducidos, (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamíferos) pueden ser integrados al genoma de una célula anfitriona tras la introducción en la célula anfitriona, y por lo tanto se replican junto con el genoma del anfitrión.

Ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los cuales están ligados operativamente. Esos vectores son .referidos aquí como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión") . En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están en forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden ser usados de manera intercambiable puesto que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, se pretende que la invención incluya aquellas formas de vectores de expresión, como plásmidos bacterianos, YACs, cósmidos, retrovirus, episomas derivados de VEB, y todos los otros vectores que el experto en la técnica sepa que son convenientes para asegurar la expresión de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos de la invención. El experto reconocerá que los polinucleótidos que codifican para las cadenas pesadas y ligeras pueden ser clonados en diferentes vectores o en el mismo vector. En una modalidad preferida, los polinucleótidos son clonados en el mismo vector.

Además de los genes de cadena de anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden contener secuencias adicionales, como secuencias que regulan la replicación del vector en la célula anfitriona (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables . El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células anfitrionas en las cuales haya sido introducido el vector (véanse, por ejemplo, las patentes de Estadounidenses Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionadle confiere resistencia a fármacos, como G418, higromicina o metotrexato, o una célula anfitriona en la cual haya sido introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen al gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usarse en células anfitrionas dhfr-con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección de G418). Pueden ser usados numerosos sistemas de selección de acuerdo con la invención, incluyendo pero sin limitarse a los genes de timidina cinasa del virus del herpes simple (Wigler y et al., Cell 11:223, 1977), hipoxantina-guanin fosforribosiltransferasa (Szybalska et al., Proc Nati Acad Sci USA 48: 202, 1992), selección de glutamato sintasa en presencia de metionin sulfoximida (Adv Drug del Rev., 58:671, de 2006, y sitio en la red o literatura de Lonza Group Ltd.) y adenin fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22: 817, 1980) en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. También, puede ser usada la resistencia antimetabolito como base de la selección para los siguientes genes: dhfr, el cual confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., Proc Nati Acad Sci USA 77:357, 1980); gpt, el cual confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan et al., Proc Nati Acad Sci USA 78:2072, 1981); neo, el cual confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Wu et al., Biotherapy 3:87, 1991); e hygro, el cual confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30:147, 1984). Los métodos de tecnología del ADN recombinante conocidos en la técnica pueden ser aplicados de manera rutinaria para seleccionar la clona recombinante deseada, y esos métodos son descritos, por ejemplo, en Ausubel et al., eds . , Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons (1993) . Los niveles de expresión de un anticuerpo pueden ser incrementados por amplificación del vector. Cuando un marcador en el sistema vectorial que expresa un anticuerpo sea amplificable, un incremento en el nivel de inhibición presente en el cultivo incrementará el número de copias del gen marcador. Debido a que la región amplificada está asociada con el gen que codifica para el anticuerpo IgG de la invención, la producción del anticuerpo también se incrementará (Crouse et al., Mol Cell Biol 3:257, 1983).

Los polinucleótidos de la invención y los vectores que comprenden esas moléculas pueden ser usados para la transformación de una célula anfitriona de mamífero adecuada, o cualquier otro tipo de célula anfitriona conocida por el experto en la técnica. El término "célula anfitriona recombinante" (o simplemente "célula anfitriona") , como se usa aquí, pretende referirse a una célula en la cual ha sido introducido un vector de expresión recombinante. Deberá comprenderse que esos términos pretenden referirse no únicamente a la célula objeto particular, sino también a la progenie de esa célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones posteriores debido a mutaciones o influencias ambientales, esa progenie no puede, en efecto, ser idéntica a la célula de origen, pero aún se incluyen dentro del alcance del término "célula anfitriona" como se usa aquí.

La transformación puede ser llevada a cabo por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula anfitriona. Esos métodos son bien conocidos por el experto en la técnica e incluyen transformación mediada con dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión protoplástica, electroporación, encapsulación del polinucleótido en liposomas, inyección biolistica y microinyección directa del ADN en los núcleos. Las células anfitrionas de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) , de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican para genes de anticuerpo son introducidos en células anfitrionas de mamífero, los anticuerpos son producidos cultivando las células anfitrionas durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células anfitrionas o, de manera más preferiblemente, secreción del anticuerpo al medio de cultivo en el cual crezcan las células anfitrionas.

Los anticuerpos pueden ser recuperados del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteina estándar. Las formas solubles del anticuerpo de la invención pueden ser recuperadas del sobrenadante de cultivo. Estas pueden entonces ser purificadas por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad de proteína A para Fe, y así sucesivamente) , centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Los métodos de purificación adecuados serán evidentes al experto en la técnica .

Los inventores de la presente han mostrado que un anticuerpo humano o humanizado dirigido contra CXCR4 es capaz de matar a una célula cancerosa que expresa CXCR4 través de la inducción de al menos una función efectora del anticuerpo.

"Célula cancerosa que expresa CXCR4", se refiere aquí a una célula de un cáncer que muestra una alta expresión de CXCR4, con relación al nivel de expresión de CXCR4 en una célula adulta normal. Esos cánceres incluyen (pero no se limitan a) los siguientes: carcinomas y adenocarcinomas, incluyendo el de vejiga, mama, colon, cabeza y cuello, próstata, riñon, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cérvix, tiroides y piel, e incluyendo el carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluyendo el mieloma, la leucemia, leucemia linfocítica aguda y crónica (o linfoide) , leucemia linfoblástica aguda y crónica, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma no Hodgkin (por ejemplo linfoma de Burkitt) ; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluyendo leucemias mielógenas aguda y crónica (mieloide o mielocítica) y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma, osteosarcoma y rabdomiosarcoma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas ; y otros tumores, incluyendo el melanoma, teratocarcinoma, xeroderma pigmentoso, queratoacantoma y seminoma, y otros cánceres aún no determinados, que exprese CXCR4.

En una modalidad preferida del método reclamado por la invención, la célula cancerosa que expresa CXCR4 consiste de una célula hematológica maligna.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza la célula cancerosa que expresa CXCR4 consiste de una célula hematológica maligna.

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque la célula cancerosa que expresa CXCR4 consiste de una célula hematológica maligna.

De manera más particular, la célula hematológica maligna CXCR4 es seleccionada del grupo que comprende célula de linfoma, célula de leucemia o célula de mieloma múltiple.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque la célula hematológica maligna CXCR4 es seleccionada del grupo que consiste de célula de linfoma, célula de leucemia o célula de mieloma múltiple .

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque la célula hematológica maligna CXCR4 es seleccionada del grupo que consiste de célula de linfoma, célula de leucemia o célula de mieloma múltiple.

En otra modalidad preferida, la célula hematológica maligna consiste de una célula de linfoma.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque la célula hematológica maligna consiste de una célula de linfoma.

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque la célula hematológica maligna consiste de una célula de linfoma .

Como se mencionó anteriormente, las células efectoras y/o componentes del complemento son de interés particular para la invención.

En una modalidad preferida más del método de la invención, las células efectoras comprenden células NK, macrófagos, monocitos, neutrófilos o eosinófilos.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque las células efectoras comprenden células NK, macrófagos, monocitos, neutrófilos o eosinófilos .

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque las células efectoras comprenden células NK, macrófagos, monocitos, neutrófilos o eosinófilos.

Sobre la base de los siguientes ejemplos, se describen propiedades particularmente interesantes de los anticuerpos usados en la invención.

En una modalidad preferida del método de la invención, el nivel de ADCC inducida en células de linfoma de Ramos, después de un periodo de incubación de 4 horas, es de al menos 40%.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque el nivel de ADCC inducida en células de linfoma de Ramos, después de un periodo de incubación de 4 horas, es de al menos 40%.

Aún en otras palabras, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque el nivel de ADCC inducida en células de linfoma de Ramos, después de un periodo de incubación de 4 horas, es de al menos 40%.

En una modalidad preferida del método de la invención, el nivel de ADCC inducido en células de linfoma DAUDI, después de un periodo de incubación de 4 horas, es de al menos 30%, preferiblemente al menos 40%.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza en que el nivel de ADCC inducida en las células de linfoma DAUDI, después de un periodo de incubación de 4 horas, es de al menos 30%; preferiblemente al menos 40%.

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque el nivel de ADCC inducida en células de linfoma de Daudi, después de un periodo de incubación de 4 horas, es de al menos 30%, preferiblemente al menos 40%.

En una modalidad preferida del método de la invención, el nivel de ADCC inducida en células de cáncer de cerviz HeLa, después de un periodo de incubación de 4 horas, es de al menos 30%, preferiblemente al menos 40%.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque el nivel de ADCC inducida en células de cáncer de cérvix HeLa, después de un periodo de incubación de 4 horas, es de al menos 30%, preferiblemente al menos 40%.

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque el nivel de ADCC inducida sobre células de cáncer de cérvix HeLa, después de un periodo de incubación de 4 horas, es de al menos 30%, preferiblemente al menos 40%.

Otro aspecto importante particular de la invención reside sobre la especificidad de la ADCC y CDC inducida.

En otra modalidad preferida del método de la invención, no es inducida ADCC significativa en las células NK.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque no se induce ADCC significativa en las células NK.

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque no es inducida ADCC significativa en las células NK.

Los componentes del complemento comprenden al menos el Clq.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque los componentes del complemento comprenden al menos el Clq.

En otras palabras más, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque los componentes del complemento comprenden al menos el Clq.

En otra modalidad preferida del método de la invención, el nivel de CDC inducida en células de linfoma de Ramos, después de un periodo de incubación de 1 hora, es de al menos 30%, preferiblemente al menos 50% y de manera más preferible al menos 70%.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque el nivel de CDC inducida en células de linfoma de Ramos, después de un periodo de incubación de 1 hora, es al menos 30%, preferiblemente al menos 50% y de manera más preferible al menos 70%.

En otras palabras aún, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque el nivel de CDC inducida sobre células de linfoma de Ramos, después de un periodo de incubación de 1 hora, es de al menos 30%, preferiblemente al menos 50% y de manera más preferible al menos 70%.

En otra modalidad preferida más del método de la invención, el nivel de CDC inducida sobre células NIH3T3 CXCR4, después de un periodo de incubación de 1 hora, es de al menos 30%, preferiblemente al menos 50 % de manera más preferible al menos 70%.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque el nivel de CDC inducida en células NIH3T3 CXCR4, después de un periodo de incubación de 1 hora, es al menos 30%, preferiblemente al menos 50% y de manera más preferible al menos 70%.

En otras palabras aún, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque el nivel de CDC inducida sobre células NIH3T3 CXCR4, después de un periodo de incubación de 1 hora, es de al menos 30%, preferiblemente al menos 50% y de manera más preferible al menos 70%.

En otra modalidad preferida más del método de la invención, el nivel de CDC inducida sobre células de linfoma DAUDI, después de un periodo de incubación de 1 hora, es de al menos 30%, preferiblemente al menos 40%.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque el nivel de CDC inducida sobre células de linfoma DAUDI, después de un periodo de incubación de 1 hora, es de al menos 30%, preferiblemente al menos 40%.

En otras palabras aún, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque el nivel de CDC inducida sobre células de linfoma DAUDI, después de un periodo de incubación de 1 hora, es de al menos 30%, preferiblemente al menos 40%.

En el sentido de las propiedades de la ADCC del anticuerpo de las invenciones, han sido generados resultados con respecto a la unión del anticuerpo con FcyR.

Otro aspecto de la invención que se relaciona con el anticuerpo de la invención, o una de sus fragmentos de unión que contiene CH2 es que es capaz de unirse al menos a un FcyRs .

En una modalidad preferida del método de la invención, al menos un FcyRs es FcyRI .

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque al menos un FcyRs es FcyRI.

En otras palabras aún, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque al menos un FcyRs es FcyRI .

En otra modalidad preferida del método de la invención, la constante de disociación (KD) que caracteriza la unión del anticuerpo de la invención con el Fe [gamma] RI, de acuerdo con el modelo de Langmuir, es de entre 1 y 10 nM.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque la constante de disociación (KD) que caracteriza la unión del anticuerpo de la invención con el FcyRI, de acuerdo con el modelo de Langmuir, es de entre 1 y 10 nM.

En otras palabras aún, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque la constante de disociación (KD) que caracteriza la unión del anticuerpo de la invención con el FcyRI humano, de acuerdo con el modelo de Langmuir, es de entre 1 y 10 nM.

En otra modalidad preferida del método de la invención, al menos un FcyRs es FcyRIIIa humano.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque al menos un FcyRs es FcyRIIIa humano .

En otras palabras aún, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque dicho al menos un FcyRs es FcyRIIIa humano.

En una modalidad más preferida del método de la invención, la constante de disociación (KD) que caracteriza la unión del anticuerpo de la invención con FcyRIIIa humano, de acuerdo con el modelo de ligando heterogéneo, es de. entre 200 y 1000 nM.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque la constante de disociación (KD) que caracteriza la unión del anticuerpo de la invención con FcyRIIIa humano, de acuerdo con el modelo de ligando heterogéneo, es de entre 200 y 1000 nM.

En otras palabras aún, el anticuerpo humano o humanizado de acuerdo con la invención se caracteriza porque la constante de disociación (KD) que caracteriza la unión del anticuerpo de la invención con el FcyRIIIa humano, de acuerdo con el modelo de ligando heterogéneo, es de entre 200 y 1000 nM.

Como se usa aquí, el término "KD" se refiere a la constante de disociación de una interacción de anticuerpo/antígeno particular. La "afinidad de unión" generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su par de unión (por ejemplo, un antigeno). A menos que se indique otra cosa, como se usa aquí, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, el anticuerpo y el antígeno) . La- afinidad de una molécula X por su par Y puede ser representada generalmente por la KD. La afinidad puede ser medida por métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo aquellos descritos aquí. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos más tiempo. Una variedad de métodos de medición de la afinidad de unión son conocidos en la técnica, cualquiera de los cuales pueden ser usados para los propósitos de la presente invención.

Preferiblemente, la constante de disociación es calculada de acuerdo con el modelo de Langmuir.

El modelo de Langmuir es descrito de manera clásica como : ka A + B.—- AB Donde A es el analito, B es el ligando, AB es el complejo no covalente entre el analito y el ligando, y ka y ¾ son las velocidades de asociación y disociación, respectivamente de esta interacción.

De la misma manera, el modelo de ligando heterogéneo donde el ligando es considerado como una mezcla de dos componentes es descrito por los dos siguientes sistemas de ecuaciones: donde A es el analito, Bl es el primer componente del ligando, AB1 es el complejo no covalente entre el analito y el primer componente del ligando, KA1 y KD1 son las velocidades de asociación y disociación, respectivamente de esta interacción, B2 es el segundo componente del ligando, AB2 es el complejo no covalente entre el analito y el segundo componente del ligando, K32 y kc¡2 son las velocidades de asociación y disociación, respectivamente, de esta interacción .

Ha sido usada la versión 3.1 de BIAevaluation (Biacore AB) para el tratamiento de datos de BIACORE.

Al menos, la invención se relaciona también con un método para tratar o prevenir una condición patológica asociado con la presencia de células cancerosa que expresan CXCR4 que comprende el paso de administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo humano o humanizado, o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2; comprendiendo el anticuerpo humano o humanizado un dominio variable de cadena pesada que tiene las 3 secuencias de CDR SEQ ID Nos. 1, 2 y 3 y un dominio variable de cadena ligera que tiene las 3 secuencias de CDR secuencias SEC ID Nos. 4, 5 y 6, donde al menos una función efectora del anticuerpo humano o humanizado es inducida, en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

En otras palabras, la invención se relaciona con el uso de un anticuerpo humano o humanizado, o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2, para preparar una composición para el tratamiento de una condición patológica asociada con la presencia de células cancerosas que expresan CXCR4, donde el anticuerpo humano o humanizado comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la regiones CDR CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprende las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3, respectivamente; y un dominio variable de cadena ligera que comprende las regiones CDR CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 4, 5 y 6, respectivamente; donde al menos una función efectora del dicho anticuerpo humano o humanizado es inducida, en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

En otras palabras aún, la invención se relaciona con un anticuerpo humano o humanizado que reconoce específicamente CXCR4, un fragmento de unión que contiene CH2, para usarse en el tratamiento de una condición patológica asociada con la presencia de células cancerosas que expresan CXCR4; comprendiendo el anticuerpo humano o humanizado un dominio variable de cadena pesada que comprende las regiones CDR CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden las secuencias SEQ ID Nos. 1, 2 y 3, respectivamente; y un dominio variable de cadena ligera que comprende las regiones CDR CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 que comprenden las secuencias SEC ID Nos. 4, 5 y 6, respectivamente; donde al menos una función efectora del anticuerpo humano o humanizado es inducida, en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

Preferiblemente, la invención se relaciona también con un método para tratar o prevenir una condición patológica asociada con la presencia de células cancerosas que expresan CXCR4 que comprende el paso de administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo humano o humanizado, o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2; comprendiendo el anticuerpo humano humanizado un dominio de cadena pesada seleccionado de las secuencias SEC ID No. 7 a 10 y un dominio variable de cadena ligera seleccionado de las secuencias SEC ID No. 11 a 17, donde al menos una función efectora del anticuerpo humano o humanizado es inducida, en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

En otras palabras, la invención se relaciona con el uso de un anticuerpo humano o humanizado, o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2, para preparar una composición para el tratamiento de una condición patológica asociada con la presencia de células cancerosas que expresan CXCR4; comprendiendo el anticuerpo humano o humanizado un dominio variable de cadena pesada seleccionado de las secuencias SEC ID No. 7 a 10 y un dominio variable de cadena ligera seleccionado de las secuencias SEC ID No. 11 a 17, donde al menos una función efectora del anticuerpo humano o humanizado es inducida, en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

En otras palabras aún, la invención se relaciona con un anticuerpo humano o humanizado que reconoce específicamente CXCR4 , fragmento de unión que contiene CH2, para usarse en el tratamiento de una condición patológica asociada con la presencia de células cancerosas que expresan CXCR4; comprendiendo el anticuerpo humano o humanizado un dominio variable de cadena pesada seleccionado de las secuencias SEC ID No. 7 a 10 y un dominio variable de cadena ligera seleccionado de las secuencias SEC ID No. 11 a 17; donde al menos una función efectora del anticuerpo humano o humanizado es inducida, en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

Se sabe que los anticuerpos monoclonales son N-glicosilados en la región constante de cada cadena pesada. Se ha mostrado que las variantes de glicosilación especificas afectan la ADCC. Por ejemplo, una menor fucosilación de las IgGl se correlaciona con un incremento de la ADCC (Shields et al., J Biol Chem. , 277(30): 26733-2640, 2002; Shinkawa et al., J Biol Che ., 278(5): 3466-3473, 2003).

Se observó una correlación significativa entre el nivel de galactosa y la actividad de CDC. Por ejemplo, la actividad de CDC del rituximab disminuye con la disminución del contenido de galactosa (Hodoniczky et al, Biotechnol Prog., 21(6): 1644-1652, 2005) Un perfil de glicosilación representativo de la Acm hz515H7 usado para experimentos de ADCC y CDC se muestra en la siguiente Tabla 5.

Tabla 5 De manera sorprendente, el Acm Hz515H7 de acuerdo con la .invención induce un alto porcentaje de ADCC y CDC sobre células que expresan CXCR4, aún cuando aproximadamente 92% de sus cadenas de carbohidratos comprenden un residuo de fucosa .

De este modo, la presente invención también da como resultado un método para tratar el cáncer matando células cancerosas que expresan CXCR4 , que comprende el paso de administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo humano o humanizado, o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2; comprendiendo el anticuerpo humano o humanizado el perfil de glicano como sigue: donde es inducida al menos una función efectora del anticuerpo humano o humanizado, en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

La invención también se relaciona con un anticuerpo humanizado que se une a CXCR4 , o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2, para usarse en un método para tratar el cáncer matando células cancerosas que expresan CXCR4, comprendiendo el anticuerpo humano o humanizado un perfil de glicano como sigue: donde es inducida al menos una función efectora del anticuerpo humano o humanizado, en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

La invención también se relaciona con el uso de un anticuerpo humanizado que se une a CXCR4, o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2, comprendiendo el anticuerpo humano o humanizado un perfil de glicano como sigue: para preparar un medicamento para tratar el cáncer matando células cancerosas que expresan CXCR4, donde se induce al menos una función efectora del anticuerpo humano o humanizado, en presencia de las células efectoras o componentes del complemento.

Como se muestra en los Ejemplos de la presente, el anticuerpo humano o humanizado, o fragmento de unión del mismo que contiene CH2 de la presente invención tiene actividad antitumoral, al menos a través de la inducción de respuestas de ADCC y/o CDC, y de este modo son útiles en el tratamiento de tumores metastáticos y enfermedades como el cáncer .

Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a la administración o la administración de una composición descrita aquí en una cantidad, forma, y/o modo efectivo para mejorar una condición, síntoma o un parámetro asociado con un trastorno, para evitar el progreso o exacerbación del trastorno (incluyendo daño secundario causado por el trastorno) en cualquiera de un grado estadísticamente significativo o en un grado detectable por un experto en la técnica .

Otro aspecto de la invención se relaciona con composiciones farmacéuticas del anticuerpo humano o humanizado, o fragmento de unión del mismo que contiene CH2. La composición farmacéutica de la invención puede contener, además del soporte y del anticuerpo humano o humanizado, un fragmento de unión del mismo que contiene CH2, varios diluentes, cargas, sales, amortiguadores, estabilizadores, solubilizadores, y otros materiales bien conocidos en la técnica .

Como se usa aquí, "soporte farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, amortiguadores, soluciones salinas, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotonicos y retardantes de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. El tipo de soporte puede ser seleccionado sobre la base de la ruta de administración pretendida. En varias modalidades, el soporte es adecuado para la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, transdérmica u oral. Los soportes farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Como se detallada más adelante, también pueden ser incorporados en las composiciones compuestos activos adicionales como agentes anticáncer y/o antiangiogénesis , en particular, el compuesto activo adicional puede ser un agente antiangiogénico, un agente quimioterapéutico, o un agente de bajo peso molecular. Podría hacerse que una composición farmacéutica típica para infusión intravenosa contenga 250 mL de solución de Ringer estéril, y 100 mg de la combinación. Los métodos reales para preparar compuestos administrables parenteralmente serán conocidos o evidentes a aquellos expertos en la técnica y son descritos con mayor detalle, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science, 17a ed., ack Publishing Company, Easton, PA (1985), 18a y 19a ediciones del mismo, las cuales se incorporan aquí como referencia.

El anticuerpo humano o humanizado, o fragmento de unión del mismo que contiene CH2 de la composición es preferiblemente formulado en una cantidad efectiva. Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado deseado, como la inducción de apoptosis en células tumorales. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad suficiente para influenciar el curso terapéutico de un estado de enfermedad particular. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual los efectos tóxicos o de al menos del agente son superados por los efectos terapéuticamente benéficos.

Para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo humano o humanizado, o fragmento de unión del mismo que contiene CH2 del mismo, de la invención es administrado a un mamífero, preferiblemente a un humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, como aquellas discutidas anteriormente, incluyendo aquellas que pueden ser administradas a un humano de manera intravenosa como un bolo por infusión continua durante un período de tiempo, por las rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o de inhalación . El anticuerpo humano humanizado, o fragmento de unión del mismo que contiene CH2, es también administrado de manera adecuada por las rutas intratumoral, peritumoral, intralesional, o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos locales asi como sistémicos. Se espera que la ruta intraperitoneal sea particularmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de tumores de ovario.

Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta óptima. Por ejemplo, puede ser administrado un solo bolo, puede ser administrada a varias dosis con el tiempo, o la dosis puede ser reducida o incrementada de manera proporcional. Las composiciones de la invención pueden ser administradas a un sujeto para efectuar la actividad de crecimiento celular en un sujeto. Como se usa aquí, el término "sujeto" pretende incluir organismos vivos en los cuales puede ser inducida la apoptosis, e incluye específicamente mamíferos, como conejos, perros, gatos, ratones, ratas, monos, especies transgénicas de los mismos, y preferiblemente humanos.

El anticuerpo humano o humanizado de la invención, o fragmento de unión del mismo que contiene CH2, y las composiciones farmacéuticas de la invención son especialmente útiles en el tratamiento o prevención de varios tipos de cánceres, incluyendo (pero sin limitarse) a los siguientes: carcinomas y adenocarcinomas, incluyendo aquellos de la vejiga, colon, cabeza y cuello, próstata, riñon, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cérvix, tiroides y piel, e incluyendo el carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos del linaje linfoide, incluyendo el mieloma múltiple, leucemia, leucemia linfocitica aguda y crónica (o linfoide) , leucemia linfoblástica crónica, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma no Hodgkin (por ejemplo, linfoma de Burkitt) ; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluyendo leucemias mielogenas aguda y crónica (o mieloide o mielocíticas ) , y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma, osteosarcoma y rabdomiosarcoma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitomas, neuroblastoma, glioma, y schwannomas; y otros tumores, incluyendo el melanoma, teratocarcinoma, xeroderma pigmentosa, queratoacantoma y seminoma, y otros cánceres aún no eterizados en los cuales se exprese CXCR4. Cánceres que tienen expresión de CXCR4, se refiere aquí a cánceres que presentan una alta expresión de CXCR4, con relación al nivel de expresión de CXCR 4 en células adultas normales.

El anticuerpo humano o humanizado de la invención, o fragmento de unión del mismo que contiene CH2, y las composiciones farmacéuticas de la invención son principalmente útiles para tratar la leucemia, linfoma y cáncer resistentes a los agentes anticáncer comúnmente usados puesto que los anticuerpos anti-CXCR4 de la invención tienen un único mecanismo de acción.

En una modalidad preferida del método de la invención, la condición patológica asociada con la presencia de células cancerosas que expresan CXCR4 consiste de linfoma, leucemia o mieloma múltiple, preferiblemente linfoma.

En otras palabras, el uso de acuerdo con la invención se caracteriza porque la condición patológica asociada con la presencia de células cancerosas que expresan CXCR4 consiste de linfoma, leucemia o mieloma múltiple, preferiblemente linfoma.

En otras palabras aún, el anticuerpo humano o humanizado se caracteriza porque la condición patológica asociada con la presencia de células cancerosas que expresan CXCR4 consiste de linfoma, leucemia o mieloma múltiple, preferiblemente linfoma.

Como un ejemplo no limitante, un proceso para detectar in vitro la presencia y/o ubicación de un tumor que expresa CXCR4 en un sujeto, comprende los pasos de: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con una cadena pesada de un anticuerpo humanizado y/o una cadena ligera de un anticuerpo humanizado y/o un anticuerpo humanizado, o un compuesto o fragmento funcional derivado del mismo, capaz de unirse específicamente con CXCR ; (b) detectar el anticuerpo con la muestra.

Particularmente, un proceso para determinar in vivo o ex vivo el nivel de expresión de CXCR4 en un tumor que expresa CXCR4 de un sujeto comprende los pasos de: (a') poner en contacto la muestra del sujeto con una cadena pesada de un anticuerpo humanizado y/o una cadena ligera de un anticuerpo humanizado y/o un anticuerpo humanizado, o un compuesto o fragmento funcional derivado del mismo, capaz de unirse específicamente a CXCR4; y (b' ) cuantificar el nivel de unión del anticuerpo a CXCR4 en la muestra.

En una modalidad preferida, el nivel de expresión de CXCR4 puede ser medido por inmunoestoquímica (IHC) o análisis FACS.

Como se usa aquí, el término "un trastorno oncogénico asociado con la expresión de CXCR4" o "célula cancerosa que expresa CXCR4" pretende incluir enfermedades y otros trastornos en los cuales la presencia de altos niveles o niveles anormalmente bajos de CXCR4 (aberrantes) en un sujeto que padece de un trastorno han sido mostrados o se sospecha que son responsables de la patofisiologia del trastorno o un factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. De manera alternativa, esos trastornos pueden ser evidenciados, por ejemplo, por un incremento en los niveles de CXCR4 sobre la superficie celular en las células o tejidos afectados de un sujeto que padece del trastorno. El incremento en los niveles de CXCR4 puede ser detectado, por ejemplo, usando el anticuerpo 515H7 o hz515H7 de la invención. Además, se refiere a células las cuales exhiben crecimiento relativamente autónomo, de modo que exhiben un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa de control de la proliferación celular. De manera alternativa, las células pueden expresar niveles normales de CXCR4 pero estar marcadas por una proliferación anormal .

La invención también describe un método para seleccionar anticuerpos humanizados que se unan a CXCR4, o fragmentos de unión de los mismos que contienen CH2, para usarse para matar una célula cancerosa que expresa CXCR4 por inducción al menos de una función efectuada, en presencia de las células efectoras con componentes del complemento, donde el método comprende al menos un paso de selección seleccionado de: - seleccionar anticuerpos que inducen un nivel de ADCC · sobre células de linfornas de Ramos, después de un periodo de incubación de 4 horas, de al menos 40%; - seleccionar anticuerpos que inducen un nivel de CDC sobre células de linfornas de Ramos, después de un periodo de incubación de 1 hora, de al menos 30%, preferiblemente al menos 50% y de manera más preferible al menos 70%; - seleccionar anticuerpos que unen a FcyRI con la constante de disociación (KD) de acuerdo con el modelo de Langmuir, de entre 1 y 10 nM; - seleccionar anticuerpos que se unen FCYRIIIA con una constante de disociación (KD) , de acuerdo con el modelo de ligando heterogéneo, de entre 200 y 1000 nM.

La práctica de la invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de química de proteínas, virología molecular, microbiología del ADN recombinate, y farmacología, las cuales están dentro de las destrezas del experto en la técnica. Esas técnicas son explicadas completamente en la literatura. (Véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Eds . , John Wiley & Sons, Inc. New York, 1995; Remington' s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa . , 1985; y Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press - Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989; Introduction to Glycobiology, Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp. Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry : Section A Proteins, Vol I 1976 CRC Press; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II 1976 CRC Press; Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)). Las nomenclaturas usadas en relación con, los procedimientos y técnicas de laboratorio de, biología molecular y celular, bioquímica de proteínas, enzimología y química medicinal y farmacéutica descritas aquí son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica.

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen los mismos significados que son comúnmente comprendidos por el experto en la técnica a la cual pertenece esta invención.

Otras características y ventajas de la invención aparecen mejor en la descripción con ejemplos y figuras cuyas leyendas se presentan a continuación.

La Figura 1 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de 515H7 con la línea germinal humana IGHV3-49*04 y IGHJ4*01. La secuencia de aminoácidos de VH 515H7 se alineó con las secuencias del marco del receptor humano seleccionado. Las secuencias de VHl y VH2 (se representó VH3) corresponden a las variantes humanizadas implementadas del dominio VH 515H7, con los residuos de retromutantes en negrillas. La variante 1 VH1 no contiene residuos de retromutantes y representa una variante completamente humana. La variante VH2 tiene 8 retromutaciones y es la variante más murina. La variante VH3 contiene 5 retromutaciones (no representadas) .

La Figura 2 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de 515H7 con la linea germinal humana IGKV4-1*01 y IGKJ1*01. La secuencia de aminoácidos de VL de 515H7 se alineó con las secuencias del marco receptor humano seleccionado. Las secuencias de VL1 a VL3 corresponden a las variantes humanizadas implementadas del dominio de VL 515H7, los residuos retromutantes en negrillas. La variante VL1 no contiene residuos retromutantes y representa la variante más humana. La variante VL2 tiene 13 retromutaciones y es la variante más murina. La variante VL3 contiene 5 retromutaciones.

Las figuras 3A-3F muestran el bloqueo cruzado del anticuerpo murino biotinilado 515H7 por las variantes quiméricas 515H7 y diferentes variantes del 515H7 humanizado. La actividad de las variantes humanizadas de 515H7 (hz515H7) para el bloqueo cruzado del anticuerpo murino original 515H7 fue evaluada por citometria de flujo usando células NIH3T3 transíectadas con CXCR . La actividad de las variantes humanizadas fue comparada con la de la 515H7 quimérica. La actividad de bloqueo cruzado de las tres diferentes variantes de VH (VH1 - VH3) combinadas con la VL quimérica (CVL) fue muy similar (Figura 3A - Figura 3C) . No se determinó la reducción de la actividad de la variante VH1 (VHl, la variante sin retromutaciones) cuando se combinó con las variantes 1 y 2 de VL. Se detectó una reducción significativa de la actividad para el constructo hz515H7 VHl VL3 (Figuras 3D - 3F) .

La Figura 4 muestra el ensayo de BRET para probar la actividad del anticuerpo humanizado 515H7 variante VHl VL1. La actividad de la variante humanizada 515H7 VH variante 1 VL variante 1 (hz515H7 VHl VL1) fue evaluada por su capacidad para inhibir la transduccion de señales mediada por SDF-l. Esta variante mostró solo una inhibición menor de la transduccion de señales mediada por SDF-l de acuerdo a lo determinado por BRET. SDF-l se usó a una concentración de 100 nM.

Las Figuras 5A-5D muestran la comparación de diferentes mutantes de VHl con una sola y retromutaciones dobles y combinaciones de diferentes variantes de VL con hz515H7 VH1D76N. Se produjeron retromutaciones simples y dobles en VHl y se combinaron con VL1. Esos constructor fueron evaluados con ensayos de BRET (Figuras 5A-5C) . De esas mutaciones individuales únicamente el constructo con la retromutación D76N mostró una inhibición incrementada de la transduccion de señales mediada por SDF-l. Ninguna retromutación doble en VH tuvo una fuerte actividad inhibidora (Figura 5C) . La retromutación individual D76N de VH1 fue combinada con diferentes variantes de VL. La concentración de SDF-1 fue de 100 nM.

La Figura 6 muestra la clasificación de los diferentes mutantes de VH1 y VL1 con retromutaciones simples y dobles en comparación con el constructo VH1 D76N VL2. Las retromutaciones simples y dobles fueron producidas en VH1 y combinadas con VLl. Todos los constructos fueron evaluados en ensayos de BRET y su porcentaje de inhibición calculado. La concentración de SDF-1 fue de 100 nM.

Las Figuras 7A - 7B muestran la inhibición de la unión de SDF-1 por diferentes constructos de 515H7 humanizado y la correlación entre los resultados obtenidos por FACS y BRET. Las diferentes variantes del anticuerpo humanizado 515H7 con una fuerte actividad en el bloqueo del reclutamiento de ß-arrestina fueron probadas por su capacidad para inhibir la unión de SDF-1 biotilada en citometria de flujo (FACS) (A). Esas fueron comparadas con VH1 y VLl. Los resultados del ensayo basado en FACS se correlacionan con los resultados obtenidos por BRET (B) .

La Figura 8 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de alineación de hz515H7 VL2, y versiones humanizadas adicionales 515H7 VL2.1, 515H7 VL2.2 y 515H7 VL2.3. La secuencia de aminoácidos de VL de 515H7 se alineó con las secuencias del marco receptor humano seleccionado.

Las secuencias de VL2.1, VL2.2 y VL2.3 corresponden a las variantes humanizadas implementadas del 515H7 VL2 humanizado, con residuos mutantes con negrillas. VL2.1 y VL2.2 tienen 4 o más residuos humanizados mientras que VL2.3 contiene 5 o más residuos humanos.

Las Figuras 9A - 9C muestran la unión especifica de los Acm humanizados 515H7 (hz515H7 VH1 D76N VL2, hz515H7 VH1 D76N VL2.1, hz515H7 VH1 D76N VL2.2 y hz515H7 VHl D76N VL2.3) a CXCR4 sobre células NIH3T3-CXCR4 (Figura 9A) U937 (Figura 9B) y ramos (Figura 9C) .

La Figura 10 muestra el efecto de citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) del Acm hz515H7VHlD76NVL2 sobre células que expresan CXCR4 , células de Ramos (Figura 10A) y células asesinas naturales (NK) (Figura 10B) .

La Figura 11 muestra el efecto de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) del Acm c515H7 sobre células que expresan CXCR4 , células de Ramos (Figura 11A) y las células asesinas naturales (NK) (Figura 11B) .

La Figura 12 muestra el efecto de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del Acm hz515H7VHlD76NVL2 sobre la linea celular, NIH3T3-CXCR4 y células de Ramos que expresan CXCR4.

La Figura 13 el efecto de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del Acm c515H7 sobre células de Ramos que expresan CXCR4.

La Figura 14 muestra el efecto de la dosis de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) de los Acm hz515H7VHlD76NVL2 (Figura 14A) y c515H7 (Figura 14B) sobre células de Ramos que expresan CXCR4.

Figura 15: Unión del FCYRI recombinante humano con el Acm hz515H7VHlD76NVL2 inmovilizado sobre un circuito de detección CM . Fueron probadas 6 diferentes concentraciones de h-FcyRI (200, 100, 50, 25, 12.5 y 6.25 nM) .

Figura 16: Unión del FCYRIIIA recombinante humano con el Acm hz515H7VHlD76NVL2 inmovilizados sobre un microcircuito de detección CM . Fueron probadas 5 diferentes concentraciones de FCYRIIIA (1000, 500, 250, 125 y 62.5 nM) .

Figura 17: Determinación de la constante de disociación del complejo h-FcYRIIIA/hz515H7VHlD76NVL2 por análisis en estado estacionario usando la gráfica de la respuesta al final de la fase de asociación contra las concentraciones de FcyRIIIa humano (1000, 500, 250, 125 y 62.5 nM) .

Figura 18: Unión del FcyRI de ratón recombinante con el Acm hz515H7VHlD76NVL2 inmovilizado sobre un microcircuito de detección CM . Fueron probadas 5 diferentes concentraciones de m-FcyRI (400, 200, 100, 50 y 25 nM) .

Figura 19: Determinación de la Constante de disociación del complejo m-FcYRI/hz515H7VHlD76NVL2 por análisis de estado estacionario usando la gráfica de la respuesta al final de la fase de asociación contra las concentraciones de FCYRI de ratón (400, 200, 100, 50 y 25nM) .

Figura 20: Unión del FCYRIII de ratón recombinante con el Acm hz515H7VHlD76NVL2 inmovilizado sobre un microcircuito de detección CM4. Fueron probadas 5 diferentes concentraciones de m-FCYRIII (400, 200, 100, 50 y 25nM) .

Figura 21: Clasificación de los cuatro receptores Fe gamma que se unen con Acm hz-515H7VHlD76NVL2 (un componente con h-FcyRI y m-FcyRIII y dos componentes con h-FcyRIIIA y m-FcyRI) sobre una gráfica la constante de disociación (en nMolar) en función de la vida media (en minutos) de los complejos de Acm hz515H7VHlD76NVL2 receptor/Fc gamma.

Figura 22: Unión del FcyRI recombinante humano con el Acm c515H7 inmovilizados sobre un microcircuito de detección CM4. Fueron probadas 6 concentraciones diferentes de h-FcyRI (200, 100, 50, 25, 12.5 y 6.25 nM) .

Figura 23: Unión del FcyRIIIA recombinante humano con el Acm c515H7 inmovilizado sobre un microcircuito de detección CM4. Fueron probadas 5 concentraciones diferentes de h-FcYRIIIA (1000, 500, 250, 125 y 62.5 nM) .

Figura 24: Determinación de la Constante de Disociación del complejo h-FcYRIIIA/c515H7 por análisis en estado estacionario usando la gráfica de la respuesta al final de la fase de asociación contra las concentraciones de FCYRIIIA humano (1000, 500, 250, 125 y 62.5 nM) .

Figura 25: Unión del FcyRI de ratón recombinante con el Acm c515H7 inmovilizado sobre un microcircuito de detección CM4. Fueron probadas 5 concentraciones diferentes de m-FcyRI (400, 200, 100, 50 y 25nM) .

Figura 26: Determinación de la constante de disociación del complejo m-FcYRI/c515H7 por análisis del estado estacionario usando la gráfica de la respuesta al final de la fase de asociación contra las concentraciones de FcyRI de ratón (400, 200, 100, 50 y 25nM) .

Figura 27: Unión del FCYRIII de ratón recombinante con el Acm c515H7 inmovilizado sobre un microcircuito de detección CM4. Fueron probadas 5 concentraciones diferentes de m-FcYRIII (400, 200, 100, 50 y 25nM) .

Figura 28: clasificación de los cuatro receptores de Fe gamma que se unen al Acm c515H7 (un componente con h-FcyRI y m-FcYRIII y dos componentes con h-FcyRIIIA y m-FcYRI) sobre una gráfica de la constante de disociación (en nMolar) en función de la vida media (en minutos) de los complejos de Acm c515H7 receptor/Fc gamma.

La Figura 29 muestra el efecto de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) del Acm hz515H7VHlD76NVL2 (hz515H7) sobre células que expresan CXCR : células de Ramos, DAUDI y HeLa.

La Figura 30 muestra el efecto de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del Acm hz515H7VHlD76NVL2 (hz515H7) sobre células que expresan CXCR4 : células DAUDI y de Ramos.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales (Acm) contra CXCR4 humano Para generar anticuerpos monoclonales para CXCR4 , fueron inmunizados ratones Balb/c con células NIH3T3-CXCR4 recombinantes y/o péptidos correspondientes al N terminal y lazos extracelulares de CXCR4. Los ratones de 6-16 semanas de edad tras la primera inmunización, fueron inmunizados una vez con el antígeno en adyuvante de Freund completo, subcutáneamente (s.c), seguido por 2 a 6 inmunizaciones con antígeno en adyuvante de Freund completo s.c. La respuesta inmune fue verificada por sangrados retroorbitales . El suero fue tamizado por ELISA (como se describe más adelante) y los ratones con títulos más altos de anticuerpos anti-CXCR4 fueron usados para fusiones. Los ratones fueron reforzados intravenosamente con antígeno dos días antes del sacrificio y la remoción del bazo.

- ELISA Para seleccionar los ratones productores de anticuerpos anti-CXCR4, los sueros de los ratones inmunizados fueron probados por ELISA. De manera breve, fueron recubiertas a placas microtituladoras con péptido N terminal purificado [1-41] conjugado con BSA equivalente a 5µg de péptido/mL, ???µ?/???? incubados a 4°C durante la noche, entonces bloqueados con 250µ1/???? de gelatina al 0.5% en PBS. Se agregaron diluciones de plasma de ratones inmunizados con CXCR4 a cada pozo y se incubaron durante 2 horas a 37 °C. Las placas fueron lavadas con PBS y entonces incubadas con un anticuerpo anti IgG de ratón de cabra conjugado con HRP (Jackson Laboratories) durante 1 hora a 37°C. Después de lavar, las placas fueron reveladas con sustrato TMB, la reacción fue interrumpida 5 minutos más tarde mediante la adición de 100 µ?/???? de H2S04 1 . Los ratones que revelaron los títulos más altos de anticuerpos de anti-CXCR4 fueron usados para la generación de anticuerpos.

- Generación de hibridomas que producen Acm para CXCR4 Los esplenocitos de ratón, aislados de ratones Balb/c que desarrollaron los títulos más altos de anticuerpos anti-CXCR4 fueron usados con PEG para una línea celular de mieloma de ratones Sp2/0. Las células fueron cultivadas a aproximadamente 1 x 105/pozo en placas microtituladoras seguido por dos semanas de incubación en medio selectivo que contenía medio de ultracultivo + L-glutamina 2 mM + piruvato de sodio 1 mM + lx HAT. Los pozos fueron entonces tamizados o seleccionados por ELISA para anticuerpos IgG monoclonales anti-CXCR4. Los hibridomas que secretan anticuerpo fueron entonces subclonados al menos dos veces por dilución limitante, cultivados in vitro para generar anticuerpos monoclonal para su análisis adicional.

Ejemplo 2 : Caracterización por análisis FACS de la especificidad de unión del Acm anti-CXCR4 515H7 de reconocimiento de lineas celulares cancerosas En este experimento, se examinó la unión especifica al CXCR4 humano del Acm anti-CXCR4 515H7 por anñalis a FACS.

Las células NIH3T3, NIH3T3-hCXCR4 transfectadas, las lineas celulares de cáncer MDA-MB-231, HeLa y U937 fueron incubadas con 10 pg/mL de anticuerpo monoclonal 515H7. Las células fueron entonces lavadas con BSA al l%/PBS/NaN3 al 0.01%. A continuación, fueron agregados anticuerpos secundarios marcados con Alexa a las células y se dejaron incubar a 4°C durante 20 min. Las células fueron entonces lavadas nuevamente dos veces. Después del segundo lavado, se efectuó el análisis FACS. Los resultados de esos estudios de unión se proporcionan en la siguiente Tabla 6 la cual muestra [Intensidad de Fluoresencia Media (MFI) obtenida por FACS] el Acm anti-CXCR4 515H7 se unión específicamente a la línea celular transfectada CXCR4-NIH3T3 humana mientras que no hubo reconocimiento de las células NIH3T3 originales. Este Acm también fue capaz de reconocer lineas celulares de cáncer humano, por ejemplo las células de cáncer de mama MDA-MB-231, células de cáncer promielositico U937 y células de cáncer de cérvix HeLa.

El Acm anti-CXCR4 515H7 reconoció la transfectante NIH3T3-hCXCR4 mientras que no existió reconocimiento de las células naturales NIH3T3 de origen. El Acm 515H7 también fue capaz de reconocer lineas celulares de cáncer.

Tabla 6 Ejemplo 3: Humanización del anticuerpo murino anti-CXCR4 515H7 Procedimiento General Humanización del anticuerpo anti-CXCR4 515H7 fue efectuada aplicando las reglas generales del injerto de CDR. El análisis inmunogénico y la definición de las regiones CDR y estructurales o del marco (FR) fueron efectuadas aplicando el esquema de numeración único IMGT asi como las bibliotecas y herramientas de IMGT (Lefranc, 1997 - www.imgt.org).

La eficiencia del proceso de humanización fue evaluada probando la actividad funcional de los anticuerpos modificados por su capacidad para inhibir el reclutamiento de ß-arrestina mediado por SDF-1 por ensayo de transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) . En este ensayo se hizo blanco sobre CXCR4 con luciferasa y ß-arrestina con YFP. El reclutamiento de ß-arrestina mediado por SDF-1 para CXCR4 es un paso importante en la transducción de señales de CXCR4. La unión de las variantes humanizadas de 515H7 también fue determinada sobre la línea celular NIH3T3 transfectada de manera estable con CXCR4 humano. La actividad de unión fue evaluada por el ensayo de competencia con el anticuerpo de ratón biotinilado. En un segundo intento, los anticuerpos humanizados fueron evaluados por su capacidad para inhibir la unión SDF-1 biotinilada a células de Ramos. Las células de Ramos fueron elegidas debido a su alta expresión de CXCR4 y baja expresión de CXCR7 y SDF-1.

Esos ensayos fueron usados para caracterizar las versiones humanizadas recombinantes de anticuerpos anti-CXCR4. A los dominios variables se les asignó un formato con dominios constantes de IgGl/k humanos y clonados en el vector de expresión de mamífero pCEP. Los anticuerpos derivados de IgGl/? recombinantes fueron expresados de manera transitoria en células HEK293. Los sobrenadantes del cultivo de expresión fueron filtrados y los anticuerpos purificados usando proteina A sefarosa. Los anticuerpos purificados fueron reamortiguados en PBS y las concentraciones de anticuerpos determinadas por ELISA.

Humanización de dominios variables de 515H7 Para seleccionar una linea germinal humana apropiada para el injerto de CDR, fue identificado el gen de la linea germinal humana con la mayor homología con la secuencia murina de 515H7 VH. Con la ayuda de las bases de datos y herramientas IMGT, fue seleccionado el gen de la línea germinal IGHV3-49*04 humana y el gen de la línea germinal IGHJ4*01 humana como las secuencias receptoras humanas para las 515H7 VH CDR murinas. El gen V humano IGHV3-49*04 tiene una homología del 80.27% con el gen V del dominio variable de la cadena pesada de 515H7 de ratón. La homología para el gen J humano IGHJ4*01 J es del 87.50%. Diecinueve residuos son diferentes entre los genes de la línea germinal humana elegida y el dominio VH del anticuerpo de ratón 515H7. La alineación entre el dominio VH del anticuerpo original y las secuencias de la línea germinal se describe en la Figura 1.

Con relación al dominio variable de la cadena ligera, fueron seleccionados los genes de la línea germinal humana IGKV4-1*01 e IGKJ1*01 (Figura 2) . La homología con el gen V IGKV4-1*01 es 79.12%. El J del 515H7 de la cadena ligera tiene una homología de 84.85% con el gen J humano IGKJ1*01.

La secuencia de aminoácidos de los genes de la linea germinal humana traducidos IGHV3-49*04 y IGKV4-1*01 fue usada para identificar anticuerpos homólogos que hayan cristalizado. Para la cadena pesada el anticuerpo con el número de acceso IMAM en el Banco de Datos de Proteínas RCSB fue elegido como modelo, mientras que para la cadena ligera fue elegido el anticuerpo 1SBS. Los dos dominios fueron montados usando el programa de computadora DS visual y usados como un modelo para el anticuerpo humanizado 515H7.

Sobre la base de la posición de cada residuo que es diferente entre el anticuerpo de origen y la secuencia de la linea germinal humana correspondiente, se dio un orden de clasificación de prioridad para cada residuo diferente entre las secuencias de humano y ratón (Figuras 1 y 2) . Esas prioridades fueron usadas para crear tres variantes diferentes de cada dominio variable humanizado nombradas VH1, VH2 y VH3, respectivamente.

En una primera serie de experimentos, construimos y analizamos las actividades de unión de anti-CXCR4 de las tres primeras variantes humanizadas. La variante de 1 de VH (VH1) fue combinada con la VL murina y estos constructos fueron evaluados en su capacidad para inhibir la unión de un anticuerpo de origen 515H7 murino biotinilado. Todos los constructos mostraron una capacidad similar para competir con el anticuerpo murino (Figura 3A-C) . Esto indica que la variante de VH más humana tiene la misma capacidad de unión que las variantes menos humanas. Por lo tanto, VH1 fue combinada con tres diferentes variantes de VL (Figura 3D-F) . Únicamente la combinación de VH1 y VL3 mostró una capacidad reducida para competir con el anticuerpo murino biotinilado, mientras que la variante más humana VH1 VLl que no contiene retromutaciones en los marcos mostró la misma actividad de bloqueo cruzado que el anticuerpo quimérico.

Esta variante VH1 VLl fue probada además por su capacidad para inhibir el reclutamiento ß-arrestina mediado por SDF-1 en ensayos de BRET (Figura 4) . A pesar de la actividad de unión deseable al receptor de acuerdo a lo determinado por el bloqueo cruzado del anticuerpo de origen, el constructo VH1 VLl mostró sólo una débil inhibición del reclutamiento de ß-arrestina. Esta carencia de actividad fuertemente inhibidora hace que la sustitución de los residuos del marco humano con los residuos murinos necesaria. Fueron construidas retromutaciones simples para VH1. Los siguientes residuos fueron sustituidos: V48L, E61D, D76N y A81L (numeración de acuerdo con la secuencia de aminoácidos primaria) . Esas retromutanciones simples de la variante VH1 fueron combinadas con la variante VLl. De esas únicamente la retromutación de D76N condujo a un incremento de la inhibición de la transducción de señales de acuerdo a lo determinado por el ensayo de BRET ensayo (Figura 5B) .

Para incrementar la actividad de este constructo y evaluar aún más la importancia de otros residuos diferentes se construyeron retromutantes dobles para VH1. La actividad inhibidora de esos constructos mejoró ligeramente (inhibición promedio de aproximadamente 45-50%) , pero no fue satisfactoria (Figura 5C) . El retromutante simple D76N fue entonces combinado con tres diferentes variantes de VL (Figura 5D) . El constructo hz515H7 VH D76N VL2 mostró una actividad de 88.2% en promedio la cual se encuentra en el mismo intervalo que la del anticuerpo quimérico.

Fueron construidas retromutaciones simples y dobles en el dominio variante de VL1 y se compararon con la actividad del constructo hz515H7 VH1 D76N VL2 (Figura 6) . Ninguna de esas combinaciones probadas tuvo una actividad similar o mejor a la de este constructo.

Se calculó el porcentaje de residuos humanos en el marco para hz515H7 VHl D76N VL2 : este contiene 14 residuos no humanos de 180 residuos, lo cual es igual a "índice de germinalidad» del 92.2%. A manera de comparación, los anticuerpos humanizados y comercializados bevacizumab y trastuzumab contienen respectivamente 30 y 14 residuos no humanos en sus dominios variables.

Las cuatro formas menor humanizadas, que muestran la eficacia más fuerte para inhibir el reclutamiento de ß- arrestina mediado por SDF-1 también fueron probados por su capacidad para inhibir la unión de SDF-1 (Figura 7A) . Fue determinada una estrecha correlación de la inhibición del reclutamiento de ß-arrestina y unión de SDF-1. Esta correlación indica que la inhibición de la unión de SDF-1 que probablemente es el mecanismo principal de la inhibición de la transducción de señales.

Para humanizar aún más la variante hz515H7 VL2, fueron diseñadas tres variantes adicionales, usando la información obtenida con las mutantes dobles y triples evaluadas en la Figura 6. Fueron humanizados cuatro y cinco residuos adicionales, respectivamente, en las variantes, VL2.1 VL2.2 y VL2.3 (también referidas como VL2-1, VL2-2 y VL2 -3) . Ellas corresponden a los residuos de D9, P49, D66, S69, S83, L84, V89. La alineación de esas tres variantes en comparación con VL2 se muestra la Figura 8.

Se evaluó la capacidad de esas variantes de VL2 para inhibir el reclutamiento de ß-arrestina mediada por SDF-1. Las variantes hz515H7 VH D76N VL2, VL2.1, VL2.2 y VL2.3 humanizadas mostraron una actividad similar a la del anticuerpo quimérico c515H7 (Figura 6) .

Ejemplo 4: Caracterización por análisis FACS de la especi icidad de unión de Acm humanizados CXCR4 515H7 y reconocimiento de la linea celular de cáncer.

En este experimento, se examinó la unión especifica a CXCR4 de Acm analizados anti-CXCR4 515H7 por análisis FACS.

Las células NIH3T3, NIH3T3-hCXCR4 transfectadas y de Ramos, las lineas celulares de cáncer de U937 fueron incubadas con 0 a 10 g/mL de Acm humanizado 515H7 (hz515H7 VH1 D76N VL2, hz515H7 VH1 D76N VL2.1, hz515H7 VH1 D76N VL2.2 y hz515H7 VH1 D76N VL2.3) durante 20 min a 4°C en la oscuridad en 100 ?? de amortiguador de FACS. Después de lavar 3 veces en amortiguador de FACS, las células fueron incubadas con el anticuerpo secundario, una Alexa 488 antihumano de cabra (dilución 1/500), durante 20 minutos a 4°C en la oscuridad. Después de 3 lavados en amortiguador de FACS, se agregó yoduro de propidio en cada pozo y únicamente las células viables fueron analizadas por FACS. Fueron evaluadas al menos 5,000 células viables para evaluar el valor medio de la intensidad de fluorescencia para cada condición.

Los resultados de esos estudios de unión se proporcionan en las Figuras 9A-9C las cuales muestran [Intensidad de Fluorescencia Media (MFI) obtenida por FACS] que los Acm humanizados anti-CXCR4 hz515H7 se unen específicamente a la línea celular transfectada CXCR4-NIH3T3 humana (Figura 9A) (MFI=2.2 con las células de origen NIH3T3) y también reconoce líneas celulares de cáncer humano, por ejemplo U937 (Figura 9B) y de Ramos (Figura 9C) .

Ejemplo 5: Efecto de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) del Acm hz515H7VHlD76NVL2 sobre células que expresan CXCR4 La ADCC fue medida por un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) usando un equipo de Detección de CitotoxicidadPLUS (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La lactato deshidrogenasa es una enzima citosólica soluble que es liberada hacia el medio de cultivo después de la pérdida de la integridad de la membrana resultante de apoptosis o necrosis. Actividad de LDH, por lo tanto, puede ser usada como un indicador de la integridad de la membrana celular y sirve como medios generales para evaluar la citotoxicidad, incluyendo la ADCC.

Fueron aisladas células mononucleares de sangre periférica (PB C) de la capa amarilla obtenida de donadores sanos, usando un gradiente de densidad de Ficoll (Ficoll-Paque PLUS," GE Healthcare, Amersham, Reino Unido) . Las células asesinas naturales (NK) fueron separadas de la fracción de PBMC de acuerdo con el protocolo del fabricante del equipo de enriquecimiento de células NK humanas RoboSep® (StemCell Technologies) . Las células NK fueron cultivadas en placas de 96 pozos de fondo plano a una relación de efector a gradiente de 50:1 a 50 µL por pozo. Fueron agregadas 10000 células blanco (Ramos), preincubadas con anticuerpos a temperatura ambiente durante 10 min, sobre las células efectoras a 50 L/pozo. Después de incubar durante 4 horas a 37 °C, la citotoxicidad fue determinada midiendo la cantidad de LDH liberada. El por ciento de citotoxicidad fue calculado como sigue: % lisis = [liberación experimental - liberación espontánea de efector y blanco] / [liberación máxima de blanco - liberación espontánea de blanco] x 100.

La Figura 10 muestra la ADCC sobre células de Ramos que expresan un alto nivel de CXCR4 y sobre células NK solas [niveles de CXCR4 ( FI) : Ramos > células NK] . Columnas negras: Hz515H7VHlD76NVL2 (hz515H7VL2) (10 yg/mL) , columnas blancas: control isotipico hlgGl (10 µg/ L·) . No se observó efecto cuando las células fueron incubadas con el control isotipico hlgGl (Figuras 10A y 10B) . En contraste el Acm hz515H7VHlD76NVL2 fue capaz de inducir una ADCC significativa (47.9% +/- 8.9) sobre células de Ramos (Figura 10A) mientras que no hubo una ADCC significativa (3% +/- 3) sobre las células NK que expresan un nivel bajo de CXCR4 (Figura 10B) .

Ejemplo 6: Efecto de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) del Acm c515H7 sobre células que expresan CXCR4 La ADCC fue medida por el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) usando el Equipo de Detección de CitotoxicidadPLUS (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Fueron aisladas células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la capa leucocitaria humana obtenida de donadores sanos, usando un gradiente de densidad de Ficoll ( Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare, Amersham, Reino Unido) . Las células asesinas naturales (NK) fueron separadas de la fracción de PBMC de acuerdo con el protocolo del fabricante del Equipo de Enriquecimiento de Células NK Humanas RoboSep® (StemCell Technologies) . Las células NK fueron cultivadas en placas de 96 pozos de fondo plano a una relación de efector a blanco de 50:1 a 50 \i por pozo. Fueron agregadas 10000 células blancas (Ramos), preincubadas con anticuerpos a temperatura ambiente durante 10 min., sobre las células efectoras a 50 µL/pozo. Después de la incubar durante 4 h a 37 °C, la citotoxicidad fue evaluada midiendo la cantidad de LDH liberada. El por ciento de citotoxicidad fue calculado como sigue: % lisis = [liberación experimental - liberación espontánea de efector y blanco] / [liberación máxima de blanco - liberación espontánea de blanco] x 100.

La Figura 11 muestra la ADCC sobre células de Ramos que expresan un alto nivel de CXCR4 y sobre células NK solas [niveles de CXCR4 (MFI) : Ramos > células NK] . Columnas negras: c515H7 (10 µg/mL) , columnas blancas: control isotipico de hlgGl (10 g/mL) . No se observó efecto cuando las células fueron incubadas con el control isotipico hlgGl (Figuras 11A y 11B) . En contraste, el Acm C515H7 fue capaz de inducir una ADCC significativa (61.4% +/- 8.1) sobre células de Ramos (Figura 11A) mientras que no hubo una ADCC significativa (5.4% +/- 4.6) sobre las células NK que expresan bajos niveles de CXCR4 (Figura 11B) .

Ejemplo 7 : Efecto de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del Acm hz515H7VHlD76NVL2 sobre células que expresan CXCR4 El ensayo se basó en la medición de ATP usando el reactivo CellTiter Glo ( Promega, ' Madison, WI, USA).

De manera breve, fueron cultivadas 10000 células blanco en placas de 96 pozos de fondo plano en presencia de hz515H7VHlD76NVL2. Después de incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos, se agregó el suero humano reunido de donadores sanos a una concentración final del 10%. Después de 1 h a 37 °C, la viabilidad fue determinada midiendo la cantidad de ATP. El por ciento de citotoxicidad fue calculado como sigue: % citotoxicidad = 100- [ [células experimental/ blanco sin anticuerpo] x 100] .

La Figura 12 muestra la CDC sobre lineas celulares de Ramos y NIH3T3-CXCR4 que expresan altos niveles de CXCR4. Columnas negras: Hz515H7VHlD76NVL2 (hz515H7VL2) (10 pg/mL) , columnas blancas: control isotipico hlgGl (10 pg/mL) . No se observó efecto cuando las células fueron incubadas con el control isotipico hlgGl (Figura 12) . En contraste, el Acm hz515H7VHlD76NVL2 fue capaz de inducir una CDC significativa (aproximadamente 80 %) sobre ambas lineas celulares NIH/3T3CXCR4 y de Ramos (Figura 12) .

Ejemplo 8: Efecto de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del Acm c515H7 sobre células de Ramos que expresan altos niveles de CXCR4 El ensayo de CDC se basó en la medición de ATP usando el reactivo CellTiter (Promega, adison, WI, EUA) .

De manera breve, 10000 células de Ramos se sembraron en placas de 96 pozos de fondo plano en presencia de Acm. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos, el suero humano reunido de donadores sanos fue agregado a una concentración final del 10%. Después de 1 h a 37°C, fue determinada la viabilidad midiendo cantidad de ATP. El por ciento de citotoxicidad fue calculado como sigue: % citotoxicidad = 100 - [[experimental / célula blanco sin anticuerpo] x 100] .

La Figura 13 muestra las CDC sobre la linea de células de Ramos gue expresa un alto nivel de CXCR4. Columnas negras: c515H7 (10 g/mL) , columnas blancas: control isotipico hlgGl (10 g/mL) . No se observó efecto cuando las células fueron incubadas con el control isotipico hlgGl (Figura 13) . En contraste, el Acm c515H7 fue capaz de inducir una CDC significativa (34 %) sobre las células de Ramos (Figura 13) .

Ejemplo 9: Efecto de la dosis sobre la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y de los Acm hz515H7VHlD76NVL2 y c515H7 sobre células de Ramos que expresan un alto nivel de CXCR4 El ensayo de CDC se basó en la medición de ATP usando el reactivo CellTiter Glo (Promega, Madison, WI, EUA) .

De manera breve, 10000 células de Ramos fueron sembradas en placas de 96 pozos de fondo plano en presencia de Acm. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos, el suero humano reunido de donadores sanos fue agregado a una concentración final del 10%. Después de 1 h a 37 °C, la viabilidad fue determinada midiendo la cantidad de ATP. El por ciento de citotoxicidad fue calculado como sigue: % citotoxicidad = 100 - [[experimental / célula blanco sin anticuerpo] x 100] .

La Figura 14 muestra las CDC sobre la linea celular de Ramos que expresa un alto nivel de CXCR4. Columnas negras: cualquiera de hz515H7VHlD76NVL2 (hz515H7VL2) (Figura 14A) o c515H7 (Figura 14B) (10 µg/mL) , columnas blancas: control isotipico hlgGl (10 g/mL) . No se observó efecto cuando las células fueron incubadas con el control isotipico hlgGl (Figuras 14A y 14B) . En contraste, los Acm hz515H7VHlD76NVL2 (Figura 14A) y c515H7 (Figura 14B) fueron capaces de inducir una CDC significativa sobre las células de Ramos con una CDC máxima de 74% y 34%, respectivamente, con CE50 de 0.033 iq/m y 0.04 µg/mL, respectivamente.

Ejemplo 10: Estudio de la interacción entre el Acm hz515H7VHlD76NVL2 y h-FcyRI, FcylORIIIA y m-FcyRIII por Resonancia Plasmonica de Superficie en Tiempo Real.

Los experimentos fueron llevados a cabo usando un dispositivo de Biacore X. Las formas solubles de los cuatro receptores Fe gamma usados en este estudio fueron compradas de R&D Systems: 1 - El Fcy I [CD64] recorabinante humano corresponde al fragmento Glnl6-Pro288 con la etiqueta 6-His C-terminal [número de catálogo: 1257-FC] . El peso molecular de 50 kDa (especificado por el distribuidor) usado en este estudio corresponde a la media del peso molecular definido por SDS-PAGE en condiciones reductores. 2 - La variante V del FcyRIIIA [CD16a] recombinante humano corresponde al fragmento Glnl7-Gln208 con una etiqueta 6-His C-terminal [número de catálogo: 4325 -FC] . El peso molecular de 45 kDa (especificado por el distribuidor) usado en este estudio corresponde a la media del peso molecular definido por SDS-PAGE en condiciones reductoras. 3 - El FcyRI [CD64] de ratón recombinante corresponde al fragmento Gln25-Pro297 con una etiqueta 6-His C-terminal [número de catálogo: 2074-FC] . El peso molecular de 55 kDa (especificado por el distribuidor) usado en este estudio corresponde a la media del peso molecular definido por SDS-PAGE en condiciones reductoras. 4 - El FcyRIII [CD16] de ratón recombinante corresponde al fragmento Ala31 - Thr215 con una etiqueta 10-His C-terminal [número de catálogo: 1960 -FC] . El peso molecular de 37.5 kDa (especificado por el distribuidor) usado en este estudio corresponde a la media del peso molecular definido por SDS-PAGE en condiciones reductoras.

Los otros reactivos fueron distribuidos por Biacore (GE Healthcare) .

Fueron inmovilizadas 1964 RU de Acm hz515H7VHlD76NVL2 usando la química del equipo de acoplamiento de amina sobre la segunda célula de flujo (FC2) en un microcircuito de detección CM4. La primera célula de flujo (FC1) activada por una mezcla de NHS y EDC y desactivada por etanolamina sirvió como la superficie de referencia para verificar y sustraer la interacción no específica entre el analito (receptores de Fe gamma) y la matriz del microcircuito de detección.

Los experimentos cinéticos fueron llevados a cabo a 25° Celsius a una velocidad de flujo de 30 uL/min. El amortiguador HBS-EP fue usado como el amortiguador de ensayo o para la preparación de las soluciones de analito. Las soluciones de analito fueron inyectadas durante 90 segundos (fase de asociación) con un retraso de 90 segundos (fase de disociación) . Se usó una inyección de amortiguador de ensayo como analito como una referencia doble. Todos los sensogramas fueron corregidos por este sensograma de referencia doble. Después de cada inyección del analito, el microcircuito de detección fue regenerado por inyección de solución de NaOH 20 mM después de h-yFcRI y m-FcYRIII o NaOH 10 mM después de h-FcYRIIIA y m-FcyRI.

Fueron usados dos modelos matemáticos para analizar los sensogramas: los modelos de "Langmuir" y del "ligando heterogéneo" .

Los sensogramas obtenidos con h-FcyRI [Figura 15] no fueron ajustados perfectamente por el modelo de Langmuir (5% < Chi2/Rmax < 20%), pero el modelo de "ligando heterogéneo" no mejoró la calidad del ajuste. Usando el modelo de Langmuir, la constante de disociación estuvo en el intervalo nanomolar (0.9 ± 0.1 nM) .

Los sensogramas obtenidos con H-FcyRIIIA [Figura 16] no fueron claramente ajustados por el modelo de Langmuir (Chi2/Rmax > 20%). El modelo del "ligando heterogéneo" mejoró significativamente la calidad del ajuste (Chi2/Rmax < 5%). De acuerdo con este modelo, el dominio de Fe del Acm hz515H7VHlD76NVL2 puede ser considerado como una mezcla de dos componentes. El mayor que representa el 79% de la cantidad total mostró la constante de disociación de entre 300 y 350 nm, el menor (21%) mostró una constante de disociación de entre 27 y 32 nM. De acuerdo con la literatura, la heterogeneidad observada con el h-FcYRIIIA probablemente estuvo ligada a la heterogeneidad de la glicosilación sobre el dominio Fe del Acm.

Una gráfica que representa una media de la respuesta en RU (cercana a Req) al final de la fase de asociación contra la concentración de h-FcYRIIIA (C) puede ser ajustada con el modelo matemático: Req = (KA. C . Rmax) /KA. C . n+1 ) , con n = 1 [Figura 17]. La constante de disociación KD que corresponde a 1/K¾ es igual a 176 nM.

Los sensogramas obtenidos con m-FcYRI [Figura 18] pueden ser ajustados por el modelo de Langmuir (5% < Chi2/Rmax < 10%) pero el modelo del "ligando heterogéneo" mejoró significativamente la calidad del ajuste (Chi2/Rmax < 1%) . De acuerdo con este modelo, el dominio Fe del Acm hz515H7VHlD76NVL2 puede ser considerado como una mezcla de dos componentes. El mayor, que representa el 82% de la cantidad total mostró una constante de disociación de entre 75 y 80 nM, el menor (18%) mostró una constante de disociación de aproximadamente 90 nM. Aún si la constante de disociación fuera cercana, las velocidades cinéticas serian significativamente diferentes, (la velocidad de asociación fue 5.7 veces mejor para el componente principal pero su velocidad de disociación fue 4.8 veces más rápida).

Una gráfica que representa una media de la respuesta en RU (cercana a Req) al final de la fase de acociación contra la concentración m-FcYRI (C) puede ser ajustada con el modelo matemático : Req = (KA.C.Rmax) / (KA.C.n+l) con n = 1 [Figura 19]. La constante de disociación KD que corresponde a 1/KA es igual a 95 nM.

Los sensogramas obtenidos con m-FcYRIII [Figura 20] no fueron ajustados perfectamente por el modelo de Langmuir (5% < Chi2/Rmax < 20%) pero el modelo del "ligando heterogéneo" no mejora la calidad del ajuste. Usando el modelo de Langmuir la constante de disociación fue de aproximadamente de 17 yl8 nM.

Una clasificación de los cuatro receptores de Fe gamma se presenta en la Figura 21 que representa la gráfica de KD en función de la vida media del complejo. De acuerdo con la literatura, h-FcYRI se une con una alta afinidad y h-FcYRIIIA con una menor afinidad a la parte Fe del anticuerpo isotipico IgGl humano. El m-FcYRIII se une con una afinidad intermedia entre la afinidad del componente principal del Acm hz-515H7VH1D76NVL2 para h-FcYRIIIA y la afinidad de h-FcyRI. Ambos componentes del Acm hz515H7VHlD76NVL2 interactúan con m-FcYRI con una afinidad intermedia entre las afinidades de ambos componentes de hz515H7VHlD76NVL2 para h-FcYRIIIA.

Esos experimentos mostraron claramente que el dominio Fe del Acm hz515H7VHlD76NVL2 interactúa significativamente con los cuatro FcyR probados.

Ejemplo 11: Estudio de la interacción entre el Acm c515H7 y h-FcyRI , II-FCYRIIIA, m-FcyRI and m-FcYRIII por Resonancia Plasmónica Surfacial en tiempo real .

Los experimentos fueron llevados a cabo usando un dispositivo Biacore X. Las formas solubles de los cuatro receptores Fe gamma usados en este estudio fueron compradas en R&D Systems: 1 - El FcyRI [CD64] recom inante humano corresponde al fragmento Glnl6-Pro288 con una etiqueta 6-his c-terminal [catálogo número: 1257-FC] . El peso molecular de 50 kDa (especificado por el distribuidor) usado en este estudio corresponde a la media del peso molecular definido por SDS-PAGE en condiciones reductoras. 2 - La variante del V FcyRIIIA [CD16a] humano recombinante corresponde al fragmento Glnl7-Gln208 con una etiqueta ß-His C-terminal [número de catálogo: 4325-FC] . El peso molecular de 45 kDa (especificado por el distribuidor) usado en este estudio corresponde a la media del peso molecular definido por SDS-PAGE en condiciones reductoras. 3- El FcyRI [CD64] de ratón recombinante corresponde al fragmento Gln25-Pro297 con una etiqueta 6-His C-terminal [número de catálogo: 2074-FC] . El peso molecular de 55 kDa (especificado por el distribuidor) usado en este estudio corresponde a la media del peso molecular definido por SDS-PAGE en condiciones reductoras. 4 - El FcyRIII [CD16] de ratón recombinante corresponde al fragmento Ala31-Thr215 con una etiqueta 10-His C-terminal [número de catálogo: 1960-FC] . El peso molecular de 37.5 kDa (especificado por el distribuidor) usado en este estudio corresponde a la media del peso molecular definido por SDS-PAGE en condiciones reductoras.

Los otros reactivos fueron distribuidos por Biacore (GE Healthcare) .

Fueron inmovilizadas 2017 RU del Acm c515H7 usando la química del equipo de acoplamiento de amina sobre la segundas células de flujo (FC2) de un microcircuito de detección CM4. La primera célula de flujo (FC1) activada por una mezcla de NHS y EDC y desactivada por etanolamina sirvió como una superficie de referencia para verificas y sustraer la interacción no especifica entre el analista (receptores de Fe gamma) y la matriz de microcircuito de detección.

Los experimentos cinéticos fueron llevados a cabo a 25° Celsius a una velocidad de flujo de 30pl/min. El amortiguador de HBS-EP fue usado como el amortiguador de ensayo o para la preparación de la soluciones de analito. Las soluciones de analito fueron inyectadas durante 90 segundos (fase de asociación) con un retraso de 90 segundos (fase de disociación) . Una inyección de amortiguador de ensayo como analito fue usada como una referencia doble. Todos los sensogramas fueron corregidos por este sensograma de referencia doble.

Después de cada inyección del analito. El microcircuito de detección fue regenerado por la inyección de NaOH 20 mM, solución de NaCl 75mM.

Fueron usados dos modelos matemáticos para analizar los sensogramas: los modelos de "Langmuir" y "ligando heterogéneo".

Los sensogramas obtenidos con h-FcyRI [Figura 22] no fueron ajustados perfectamente por un modelo de Langmuir (Chi2/Rmax > 10%) pero el modelo de "ligando heterogéneo" mo mejoró la calidad del ajuste. Usando el modelo de Langmuir, la constante de disociación fue cercana al intervalo nanomolar (1.2 ± 0.1 nM) .

Los sensogramas obtenidos con h-FcYRIIIA [Figura 23] claramente no fueron ajustados por un modelo de Langmuir (Chi2/Rmax > 20%) . El modelo del "ligando heterogéneo" mejoró significativamente la calidad del ajuste (Chi2/Rmax < 5%) . De acuerdo con este modelo el dominio Fe del Acm c515H7 puede ser considerado como una mezcla de dos componentes. El mayor que representa el 81% de la cantidad total muestra una constante de disociación entre 380 y 450nM, el menor (19%) mostró una constante de disociación entre 32 y 37nM. De acuerdo con la literatura la heterogeneidad observada con el h-FcYRIIIA probablemente estuvo ligada a la heterogeneidad de la glicosilación sobre el dominio Fe del Acm. El fin de la fase de disociación estuvo cerca de alcanzar el estado estacionario. Una gráfica que representa una media de la respuesta en RU (cercana a Req) al final de la fase de asociación contra la concentración de h-FcYRIIIA (C) puede ser ajustada con el modelo matemático: Req= ( A.C. Rmax) /KA. C.n+1) con n=l [Figura 24], La constante de disociación KD que corresponde a 1/KA fue de 160 nM.

Los sensogramas obtenidos con m-FcYRI [Figura 25] pueden ser ajustados por el modelo de Langmuir (5% < Chi2/Rmax < 10%) pero el modelo del "ligando heterogéneo" mejoró significativamente la calidad del ajuste (Chi2/Rmax < 2%). De acuerdo con este modelo, el dominio Fe del Acm c515H7 puede ser considerado como una mezcla de dos componentes. El mayor que representa 81% de la cantidad total mostró una constante de disociación de aproximadamente 380 y 450 nM, el menor (19%) mostró una constante de disociación entre 32 y 37 nM.

El fin de la fase de asociación estuvo cerca de alcanzar el estado estacionario. La gráfica que representa la media de la respuesta en RU (cercana a Req) al fin de la fase de asociación contra a la concentración de m-FcYRI (C) puede ser ajustada con el modelo matemático: Req = (Kft.C.Rmax) /KA.C.n+l) con n=l [Figura 26]. La constante de disociación KD que corresponde a 1/K¾ es igual a 107nM.

Los sensogramas obtenidos con m-FcYRIII [Figura 27] no fueron ajustados perfectamente por el modelo de Langmuir (10% < Chi2/Rmax < 20%), pero el modelo de "ligando heterogéneo" no mejoró la calidad del ajuste. Usando el modelo de Langmuir la constante de disociación fue de aproximadamente de 20 nM.

Una clasificación de los cuatro receptores Fe gamma se presenta en la Figura 28 que representa la gráfica de KD en función de la vida media del complejo. De acuerdo con la literatura, el h-FcYRI se une con alta afinidad y el h-FCYRIIIA con una menor afinidad a la parte Fe de un anticuerpo isotipico IgGl humano. El m-FcYRIII se une con una afinidad intermedia entre la afinidad del componente mayor del Acm c515H7 para h-FcyRIIIa y la afinidad para h-FcyRI. Ambos componentes del Acm c515H7 interactúan con m-FcYRI de una forma similar que con h-FcyRIIIA.

Ejemplo 12: Efecto de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) del Acm hz515H7VHlD76NVL2 (hz515H7) sobre células que expresan CXCR4 El ADCC fue medido usando el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) descrito anteriormente (véase el ejemplo 5) .

De manera breve, los PBMC fueron aislados de sangre de donadores sanos voluntarios usando un gradiente de densidad de Ficoll. Las células NK fueron purificadas de la fracción de PBMC de acuerdo con el protocolo del fabricante del equipo de enriquecimiento de células NK humanas. Las células NK, usadas como células efectoras (E) , fueron mezcladas con células blanco (T) tumorales de Ramos (linfoma) , DAUDI (linfoma) o HeLa (cáncer de cérvix) a una relación de E:T de 50:1, habiendo sido las células blanco previamente preincubadas durante 10 minutos a temperatura ambiente con el anticuerpo hz515H7VH1D76NVL2 (hz515H7) (10 µg/mL) . Después de 4 horas de incubación a 37 °C, fue determinada la lisis celular especifica midiendo la cantidad de LDH liberada con el Equipo de Detección de CitotoxicidadPLDS de acuerdo con las instrucciones del fabricante) . El por ciento de citotoxicidad fue calculado como sigue: % de lisis = [liberación experimental liberación espontánea de efector y blanco] / [liberación máxima de blanco - liberación espontánea de blanco] x 100.

La Figura 29 muestra la ADCC sobre células que expresan CXCR4 : células de Ramos, DAUDI y HeLa. No se observó efecto cuando las células fueron incubadas con el control isotipico hlgGl (10 g/mL) . En contraste, el Acm hz515H7 (10 µg/mL) fue capaz de inducir una ADCC significativa (alrededor de 40%) sobre células de Ramos, DAUDI y células HeLa .

Ejemplo 13: Efecto de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del Acm hz515H7VHlD76 VL2 (hz515H7) sobre células que expresan CXCR4 El ensayo de CDC se basó en la medición de ATP usando el reactivo CellTiter Glo (Promega, Madison, WI, EUA) , como se describe en el ejemplo 7.

De manera breve, fueron cultivadas 10000 células blanco en placas de 96 pozos de fondo plano en presencia de Acm hz515H7VHlD76NVL2 (hz515H7) . Después de la incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos, el suero humano reunido de donadores sanos fue agregado a una concentración final del 10%. Después de 1 h a 37° C, la viabilidad fue determinada midiendo la cantidad de ATP. El por ciento de citotoxicidad fue calculado como sigue: % de lisis [liberación experimental - liberación espontánea de e'fector y blanco] / [liberación máxima de blanco - liberación espontánea de blanco] x 100.

La Figura 30 muestra la CDC sobre lineas celulares que expresan CXCR4 : células de Ramos y DAUDI. No se observó efecto cuando las células fueron incubadas con el control isotipico hlgGl (10 µg/mL) . En contraste, el Acm hz515H7VHlD76NVL2 (hz515H7-l) (10 g/mL) fue capaz de inducir una CDC significativa: aproximadamente 58% para células de Ramos y 36% para células DAUDI .

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humanizado que se une a CXCR4, o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2, el anticuerpo humanizado se caracteriza porque comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado de las secuencias SEQ ID No. 7 a 10 y un dominio variable de cadena ligera seleccionado de la secuencia SEQ ID No. 11 a 17; para usarse en un método de tratamiento del cáncer matando una célula cancerosa que expresa CXCR4 por inducción de al menos una función efectora, en presencia de células efectores o componentes del complemento.

2. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la función efectora consiste de la citotoxicidad dependiente del anticuerpo (ADCC) .

3. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la función efectora consiste de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

4. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las funciones efectoras consisten de la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y la citotoxicidad del complemento (CDC) .

5. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el anticuerpo humanizado es seleccionado del grupo que consiste de: un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEQ ID No. 8 y un dominio variable de cadena ligera seleccionado de las secuencias SEQ ID No. 11 a 17; un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado de las secuencias SEQ ID No. 7 a 10 y un dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID No. 13; un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado de las secuencias SEQ ID No. 8 y un dominio variable de cadena ligera seleccionado de la secuencia SEQ ID No. 13; un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado de las secuencias SEQ ID No. 18 a 21 y/o una cadena ligera seleccionada de las secuencias SEQ ID No. 22 a 28; un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado de las secuencias SEQ ID No. 19 y/o una cadena ligera seleccionada de las secuencias SEQ ID No. 22 a 28; un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado de las secuencias SEQ ID No. 18 a 21 y/o una cadena ligera de las secuencias SEQ ID No. 24; y un anticuerpo humanizado que comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado de las secuencias SEQ ID No. 19 y/o una cadena ligera de las secuencias SEQ ID No. 24.

6. El anticuerpo humanizado de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el anticuerpo es una IgGl .

7. El anticuerpo humanizado de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la célula cancerosa que expresa CXCR4 consiste de una célula hematológica maligna

8. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la célula hematológica maligna CXCR4 es seleccionada del grupo que comprende célula de linfoma, célula de leucemia o célula de mieloma múltiple.

9. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque las células efectoras comprenden células NK, macrófagos, monocitos, neutrófilos o eosinófilos.

10. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque induce un nivel de ADCC sobre células de linfoma de RAMOS, después de un periodo de incubación de 4 horas, de al menos 40%.

11. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque es inducida una ADCC significativa sobre células NK.

12. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque los componentes del complemento comprenden al menos el Clq.

13. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque induce un nivel de CDC sobre células de linfoma de RAMOS, después de un periodo de incubación de 1 hora, de al menos 30%, preferiblemente al menos 50% y de manera más preferible al menos 70%.

14. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque induce CDC sobre células NIH3T3 CXCR4, después de un periodo de incubación de 1 hora, a un nivel de al menos 30%, preferiblemente al menos 50% y de manera más preferible 70%.

15. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el anticuerpo humanizado, o fragmento de unión del mismo que contiene CH2 se une a al menos un FCYRS humano.

16. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque al menos un FCYRS es FCYRI humano .

17. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque se une al FCYRI con una constante de disociación en (KD) , de acuerdo con el modelo de Langmuir, entre 1 y 10 n .

18. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque al menos un FCYRS es FcyRIIIA humano.

19. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque se une al FCYRIIIA con una constante de disociación (KD) , de acuerdo con el modelo de ligando heterogéneo, de entre 200 y 1000 nM.

20. El anticuerpo humanizado que se une a CXCR4 , o un fragmento de unión del mismo que contiene CH2, para usarse en un método de tratamiento de cáncer matando células cancerosas que expresan CXCR4; el anticuerpo humano o humanizado se caracteriza porque comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado de las secuencias SEQ ID No. 7 a 10 y un dominio variable de cadena ligera seleccionado de las secuencias SEQ ID No. 11 a 17; donde al menos una función efectora del anticuerpo humano o humanizado es inducido, en presencia de células efectoras o componentes del complemento.

21. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el cáncer consiste de linfoma.

22. Un método para seleccionar anticuerpos humanizados que se unen a CXCR4, o un fragmento de unión del mismo que contiene CH25, para usarse para matar una célula cancerosa que expresa CXCR4 por inducción de al menos una función efectora, en presencia de células efectoras o componentes del complemento, donde el método comprende al menos un paso de selección seleccionado de: - seleccionar anticuerpos que induzcan un nivel de ADCC sobre células de linfoma de RAMOS después de un periodo de incubación de 4 horas, de al menos 40%; - seleccionar anticuerpos que induzcan un nivel de CDC sobre células de linfoma de RAMOS, después de un periodo de incubación de 1 hora, de al menos 30%, preferiblemente de al menos 50% y de manera más preferible al menos 70%; - seleccionar anticuerpos que induzcan a un nivel de CDC sobre células NIH3T3 CXCR4 , después de un periodo de incubación de 1 hora, de al menos 30%, preferiblemente de al menos 50% y de manera más preferible de al menos 70%; - seleccionar anticuerpos que se unan a FcyRI con una constante de disociación (KD) , de acuerdo con el modelo de Langmuir, entre 1 y 10 nM; - seleccionar anticuerpos que se unan a FcyRIIIA con una constante de disociación (KD) de acuerdo con el modelo de ligando heterogéneo, de entre 200 y 1000 nM.