KR20230080460A - 단백질을 농축시키는 방법 - Google Patents

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제시카 조이 헝
멜리사 앤 홀스타인
싱 펑 람
산차이타 고세
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브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
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Abstract

유가식 설정을 사용하는 회분식-유사 모드로 한외여과에 의해 큰 부피의 항체 공급원료를 농축시켜 농축된 약물 물질을 생성하는 최적화된 방법이 본원에 제공된다.

Description

단백질을 농축시키는 방법
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본 출원은 2020년 10월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 63/087,719를 우선권 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
항체 요법은 보다 큰 환자 편의성 및 환자 순응도로 인해 피하 포맷으로 전달되는 방향으로 점점 더 이동하고 있다. 피하 전달을 가능하게 하기 위해, 치료 단백질, 예컨대 항체는 고용량 저부피 주사를 통해 전달되어야 하며, 이는 고농도의 최종 약물 제품의 제제화를 필요로 한다. 단백질 제조 공정에서, 고농도 약물 물질을 생성하는 부담은 주로 한외여과/투석여과 (UF/DF) 단계에 속하며, 여기서 정제된 단백질 공급 스트림은 전형적으로 제1 한외여과 단계에서 중간 농도로 농축되고, 완충제는 표적 제제로 교환되고, 제2 한외여과 단계에서 높은 최종 농도로 농축된다. 이는 농도에 따른 용액 점도의 상당한 증가 뿐만 아니라 전단 및 계면 응력에 대한 장기간 노출 하의 단백질의 응집 성향으로 인해 고유한 문제를 제기한다. 고점도는 높은 시스템 압력을 유발하고, 이는 시스템 압력에 대한 안전성-관련 제약으로 인해 최대 달성가능한 단백질 농도를 제한한다. 점도의 증가는 단백질 응집의 위험성을 악화시킬 수 있는 긴 공정 시간으로 이어지는 투과 플럭스의 상당한 감소와 상관관계가 있을 수 있다. 고농도 물질의 생성은 로드 물질의 상당한 부피 감소를 초래하며, 이는 시설 적합성 및 용량에 대한 문제를 제기할 뿐만 아니라 전단 및 계면 응력에 대한 장기간 노출에 기인한 응집 문제를 악화시킬 수 있다.
고농도 약물 물질을 생성하기 위한 개선된 방법에 대한 필요성이 존재한다.
본 개시내용은, 적어도 1회 여과된 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물 ("보유물")을 공급 탱크에 연속적으로 로딩하는 것을 포함하며, 여기서 공급 탱크는 주 저장 ("보유물") 탱크로부터 분리된 것인, 관심 단백질의 여과 공정 시간을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한, 적어도 1회 여과된 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물 ("보유물")을 공급 탱크에 연속적으로 로딩하는 것을 포함하며, 여기서 공급 탱크는 주 저장 ("보유물") 탱크로부터 분리된 것인, 관심 단백질을 농축시키는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 공급 탱크는 적어도 1회 여과되지 않은 관심 단백질을 포함하는 초기 단백질 혼합물을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 초기 단백질 혼합물 및 보유물은 함께 혼합된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물 및/또는 보유물은 필터를 통해 여과된다. 일부 측면에서, 여과된 단백질 혼합물 및 보유물 ("보유물")은 공급 탱크 내로 로딩된다. 일부 측면에서, 로딩은 관심 단백질이 적어도 약 1 mg/mL, 적어도 약 10 mg/mL, 적어도 약 20 mg/mL, 적어도 약 30 mg/mL, 적어도 약 40 mg/mL, 적어도 약 50 mg/mL, 적어도 약 60 mg/mL, 적어도 약 70 mg/mL, 또는 적어도 약 80 mg/mL로 농축될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 로딩은 관심 단백질이 약 1 mg/mL 내지 80 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 70 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 60 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 50 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 40 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 30 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 20 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 70 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 60 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 50 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 40 mg/mL, 또는 약 20 mg/mL 내지 30 mg/mL로 농축될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 보유물의 로딩은 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 적어도 10회, 적어도 20회, 적어도 30회, 적어도 40회, 적어도 50회, 적어도 60회, 적어도 70회, 적어도 80회, 적어도 90회, 적어도 100회, 적어도 110회, 적어도 120회, 적어도 130회, 적어도 140회, 적어도 150회, 적어도 160회, 적어도 170회, 적어도 180회, 적어도 190회, 적어도 200회, 적어도 210회, 적어도 220회, 적어도 230회, 적어도 240회, 적어도 250회, 적어도 260회, 적어도 270회, 적어도 280회, 적어도 290회, 또는 적어도 300회 반복된다. 일부 측면에서, 방법은 공급 탱크로의 보유물의 로딩을 중단하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 보유물을 저장 탱크로 보내는 것을 추가로 포함한다.
본 개시내용은 또한, 공급 탱크, 저장 탱크, 필터, 필터를 공급 탱크에 연결하는 공급 탱크 밸브 및 필터를 저장 탱크에 연결하는 저장 탱크 밸브를 포함하는 3방향 밸브, 및 공급 탱크와 저장 탱크를 연결하는 저장 주입구를 포함하는 여과 시스템에 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물을 로딩하는 것을 포함하는, 관심 단백질의 여과 공정 시간을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한, 공급 탱크, 저장 탱크, 필터, 필터를 공급 탱크에 연결하는 공급 탱크 밸브 및 필터를 저장 탱크에 연결하는 저장 탱크 밸브를 포함하는 3방향 밸브, 및 공급 탱크와 저장 탱크를 연결하는 저장 주입구를 포함하는 여과 시스템에 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물을 로딩하는 것을 포함하는, 관심 단백질을 농축시키는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 저장 탱크 밸브는 관심 단백질이 충분히 농축될 때까지 폐쇄된다. 일부 측면에서, 방법은 단백질 혼합물을 공급 탱크에 연속적으로 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 공급 탱크에서 저장 탱크로 보내진다. 일부 측면에서, 저장 탱크는 필터에 연결된다. 일부 측면에서, 필터는 인-라인 여과 막을 포함한다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 한외여과 막이다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 폴리비닐에테르, 폴리비닐알콜, 나일론, 규소, 폴리실리콘, 울트라나노결정질 다이아몬드, 다이아몬드-유사-탄소, 이산화규소, 티타늄, 실리카, 질화규소, 폴리테트라플루오르에틸렌, 실리콘, 폴리메타크릴레이트, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리카르보네이트, 그래핀, 그래핀 옥시드, 폴리사카라이드, 세라믹 입자, 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 개질된 폴리에테르술폰, 폴리아릴술폰, 폴리페닐 술폰, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 폴리락트산, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리피페라진, 폴리아미드-폴리에테르 블록 중합체, 폴리이미드, 폴리에테르이미드, 폴리아미드, 재생 셀룰로스, 복합 재생 셀룰로스, 또는 그의 조합이다. 일부 측면에서, 여과 막은 약 50 kD 내지 약 5 kD, 약 50 kD, 약 40 kD, 약 30 kD, 약 20 kD, 약 10 kD, 또는 약 5 kD 미만의 분자량 컷오프 (MWCO)를 갖는다. 일부 측면에서, MWCO는 약 5 kD 미만이다.
일부 측면에서, 혼합물을 목적하는 여과된 단백질 농도에 도달할 때까지 유동하게 한다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 10 mg/mL 내지 약 300 mg/mL, 예를 들어 약 10 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 100 mg/mL, 약 110 mg/mL, 약 120 mg/mL, 약 130 mg/mL, 약 140 mg/mL, 약 150 mg/mL, 약 160 mg/mL, 약 170 mg/mL, 약 180 mg/mL, 약 190 mg/mL, 약 200 mg/mL, 약 250 mg/mL, 또는 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 150 mg/mL이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 0 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 20 cP 내지 약 60 cP이다. 일부 측면에서, 공급 탱크의 부피와 저장소의 부피 사이의 부피 비는 약 1:2 내지 약 10:1, 약 1:2 내지 약 1:1, 약 1:1 내지 약 1:2, 약 1:1 약 1:3, 약 1:1 내지 약 1:4, 약 1:1 내지 약 1:5, 약 1:1 내지 약 1:6, 약 1:1 내지 약 1:7, 약 1:1 내지 약 1:8, 약 1:1 내지 약 1:9, 또는 약 1:1 내지 약 1:10이다. 일부 측면에서, 공급 탱크의 부피와 저장소의 부피 사이의 부피 비는 약 1:1, 약 2:1, 또는 약 5:1이다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 다이어프램 펌프, 회전 로브 펌프, 또는 연동 펌프를 사용하여 저장 탱크 및/또는 필터로 보내진다.
일부 측면에서, 방법은 적어도 1회 여과된 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물 ("보유물")을 공급 탱크에 연속적으로 로딩하기 전에 적어도 1회 여과되지 않은 관심 단백질을 포함하는 초기 단백질 혼합물을 공급 탱크에 로딩하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 초기 단백질 혼합물은 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL의 농도로 공급 탱크에 첨가된다. 일부 측면에서, 초기 단백질 혼합물은 약 5 mg/mL의 농도로 공급 탱크에 첨가된다.
일부 측면에서, 공정 시간은 유가식 농축 공정의 공정 시간과 비교하여 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 감소된다. 일부 측면에서, 공정 시간은 유가식 농축 공정의 공정 시간과 비교하여 약 40% 감소된다.
일부 측면에서, 공정 시간은 유가식 농축 공정의 공정 시간과 비교하여 약 0.2시간, 약 0.4시간, 약 0.5시간, 약 0.6시간, 약 0.8시간, 또는 약 1.0시간 감소된다. 일부 측면에서, 공정 시간은 유가식 농축 공정의 공정 시간과 비교하여 약 0.5시간 감소된다.
일부 측면에서, 1-2 μm 미립자 수는 유가식 농축 공정의 미립자 수와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 감소된다. 일부 측면에서, 5-10 μm 미립자 수는 유가식 농축 공정의 미립자 수와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 감소된다. 일부 측면에서, 10-25 μm 미립자 수는 유가식 농축 공정의 미립자 수와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 감소된다.
일부 측면에서, 단백질 혼합물은 항체, 항체 단편, 항원-결합 단편, 융합 단백질, 자연 발생 단백질, 키메라 단백질, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 IgM, IgA, IgE, IgD, 및 IgG로부터 선택된 항체를 포함한다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 항체를 포함하고, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터 선택된 IgG 항체이다. 일부 측면에서, 항체는 이중 가변 도메인 이뮤노글로불린을 포함한다. 일부 측면에서, 항체는 3가 항체를 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA4, 항-TIM3, 항-LAG3, 항-NKG2a, 항-ICOS, 항-CD137, 항-KIR, 항-TGFβ, 항-IL-10, 항-B7-H4, 항-GITR, 항-CXCR4, 항-CD73, 항-TIGIT, 항-OX40, 항-IL-8 항체 또는 그의 항체 단편을 포함한다.
일부 측면에서, 단백질 혼합물은 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포 배양물로부터 유래된다. 일부 측면에서, 포유동물 세포 배양물은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양물이다.
일부 측면에서, 단백질 혼합물은 회분식 세포 배양물로부터 수득된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 유가식 세포 배양물로부터 수득된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 생물반응기에서 생산된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 단회-사용 생물반응기에서 생산된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 관류 세포 배양물로부터 수득된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 관류 또는 TFF 관류 생물반응기에서 생산된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 약 1 내지 약 60일 지속되는 세포 배양물에서 생산된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 약 25일 지속되는 세포 배양물에서 생산된다.
일부 측면에서, 단백질 혼합물은 로딩 완충제와 함께 공급 탱크에 첨가된다. 일부 측면에서, 로딩 완충제는 아미노산, 약산, 약염기 및/또는 당을 포함한다.
일부 측면에서, 방법은 단백질을 제약 조성물로 제제화하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 단백질은 본원에 개시된 방법에 의해 제조된다. 일부 측면에서, 제약 조성물은 본원에서 제조된 바와 같은 단백질을 포함한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 제약 조성물을 투여하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한, 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한, 하기를 포함하는, 관심 단백질을 농축시키기 위한 시스템에 관한 것으로서:
(a) 공급 탱크;
(b) 제1 유체 경로에 의해 공급 탱크에 연결된 저장 탱크;
(c) 제2 유체 경로에 의해 저장 탱크에 연결된 여과 막; 및
(d) 3-방향 밸브로서, 여기서 3-방향 밸브는 제3 유체 경로에 의해 여과 막에 연결되고, 3-방향 밸브는 제4 유체 경로에 의해 저장 탱크에 연결되고, 3-방향 밸브는 제5 유체 경로에 의해 공급 탱크에 연결된 것인 3-방향 밸브,
여기서 저장 탱크는 제1 유체 경로를 통해 공급 탱크로부터 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물을 수용하고,
여기서 여과 막은 제2 유체 경로를 통해 저장 탱크로부터 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물을 수용하고, 단백질 혼합물을 여과하고,
여기서 3-방향 밸브는 제3 유체 경로를 통해 필터로부터 보유물을 수용하고, 보유물을 제4 유체 경로를 통해 저장 탱크로 또는 제5 유체 경로를 통해 공급 탱크로 보낸다.
일부 측면에서, 3-방향 밸브는 시스템 내의 단백질 혼합물의 총 부피가 저장 탱크의 용량보다 작은 경우에 보유물을 저장 탱크로 보내고, 여기서 3-방향 밸브는 시스템 내의 단백질 혼합물의 총 부피가 저장 탱크의 용량보다 큰 경우에 보유물을 공급 탱크로 보낸다.
일부 측면에서, 시스템은 시스템 내의 단백질 혼합물의 총 부피 및/또는 농도를 결정하도록 구성된 센서를 추가로 포함하고, 여기서 3-방향 밸브는 센서로부터의 피드백에 기초하여 보유물을 저장 탱크로 또는 공급 탱크로 자동으로 보낸다. 일부 측면에서, 시스템은 하나 이상의 다이어프램 펌프, 회전 로브 펌프, 또는 연동 펌프를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 필터는 인-라인 여과 막을 포함한다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 한외여과 막이다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 폴리비닐에테르, 폴리비닐알콜, 나일론, 규소, 폴리실리콘, 울트라나노결정질 다이아몬드, 다이아몬드-유사-탄소, 이산화규소, 티타늄, 실리카, 질화규소, 폴리테트라플루오르에틸렌, 실리콘, 폴리메타크릴레이트, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리카르보네이트, 그래핀, 그래핀 옥시드, 폴리사카라이드, 세라믹 입자, 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 개질된 폴리에테르술폰, 폴리아릴술폰, 폴리페닐 술폰, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 폴리락트산, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리피페라진, 폴리아미드-폴리에테르 블록 중합체, 폴리이미드, 폴리에테르이미드, 폴리아미드, 재생 셀룰로스, 복합 재생 셀룰로스, 또는 그의 조합이다.
도 1a-1c는 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템의 개략적 다이어그램을 나타낸다. 도 1a는 유가식 구성으로 설정된 TFF 한외여과/투석여과 시스템의 개략적 다이어그램을 나타낸다. 도 1b는 유사-회분식 구성으로 설정된 TFF 한외여과/투석여과 시스템의 개략적 다이어그램을 나타낸다. 도 1c는 회분식 구성으로 설정된 TFF 한외여과/투석여과 시스템의 개략적 다이어그램을 나타낸다.
도 2a-2b는 회분식 로딩, 유가식 로딩 및 유사-회분식 로딩 구성에 대한 경과된 공정 시간의 함수로서 보유물 mAb 농도를 나타낸다. 도 2a는 회분식, 유가식 및 유사-회분식 로딩 전략에 대한 경과된 공정 시간 (시간)의 함수로서 mAb A의 계산된 보유물 농도 (g/L)를 나타낸다. 도 2b는 각각 좌측에서 우측으로 공정의 각각의 단계에 대한 상응하는 공정 시간을 나타낸다: 한외여과 1 (UF1), 투석여과 (DF) 및 한외여과 2 (UF2).
도 3은 한외여과/투석여과 실행 동안 mAb A에 대해 계산된 보유물 농도의 함수로서 투과 플럭스 (LHM)를 나타낸다. 실행은 회분식, 유가식, 또는 유사-회분식 로딩 (UF1)을 사용하여 수행하였지만, 모든 3개의 실행은 DF 및 UF2 단계를 위해 회분식 구성으로 작동시켰다.
도 4는 회분식, 유가식 (하이브리드), 및 유사-회분식 로딩 전략을 위한 UF/DF 공정의 중간 지점에서 mAb A에 대한 고분자량 (HMW) 종의 수준을 나타낸다.
도 5a-5d는 회분식, 유가식 (하이브리드) 및 유사-회분식 로딩 전략을 사용하여 생성된 공정중 UF/DF 풀에 대한 미립자에 대한 mAb A 입자 수를 나타낸다. 도 5a는 1-2 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 도 5b는 5-10 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 도 5c는 10-25 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 도 5d는 50-100 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 입자 함량을 마이크로유체 영상화를 사용하여 정량화하였다. 간결성을 위해 2-5 μm 및 25-50 μm 크기 범위에 대한 입자 수를 생략하였지만, 각각 5-10 μm 및 50-100 μm 크기 범위에 대해 관찰된 경향과 일치하였다.
도 6a는 다이어프램 펌프 및 연동 펌프를 사용한 유사-회분식 실행에 대한 공정 시간의 함수로서 보유물 mAb 농도를 나타낸다. 도 6b는 도 6a의 공정의 각각의 단계 (예를 들어, UF1, DF 및 UF2)에 대한 상응하는 공정 시간을 나타낸다.
도 7은 다이어프램 펌프 및 연동 펌프를 사용한 유사-회분식 실행에 대한 보유물 농도의 함수로서 투과 플럭스를 나타낸다.
도 8은 다이어프램 펌프 및 연동 펌프를 사용하는 유사-회분식 공정에 대한 고분자량 (HMW) 종의 수준을 나타낸다.
도 9a-9d는 다이어프램 펌프 또는 연동 펌프를 사용하는 유사-회분식 로딩 전략을 사용하여 생성된 공정중 UF/DF 풀에 대한 입자에 대한 mAb A 입자 수를 나타낸다. 도 9a는 1-2 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 도 9b는 5-10 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 도 9c는 10-25 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 도 9d는 50-100 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 입자 함량을 마이크로유체 영상화를 사용하여 정량화하였다.
도 10a는 유사-회분식 실행에 대한 공정 시간의 함수로서 보유물 mAb 농도를 나타내며, 여기서 로딩 단계 동안 보유물 탱크 내의 액체 부피는 총 로드 부피에 비해 보다 낮은 부피 (예를 들어, 10% 및 20%)로 일정하게 유지되었다. 도 10b는 도 10a의 공정의 각각의 단계 (예를 들어, UF1, DF 및 UF2)에 상응하는 공정 시간을 나타낸다.
도 11은 유사-회분식 실행에 대한 보유물 농도의 함수로서 투과 플럭스를 나타내며, 여기서 로딩 단계 동안 보유물 탱크 내의 액체 부피를 총 로드 부피에 비해 더 낮은 부피로 일정하게 유지하였다.
도 12는 유사-회분식 실행에 대한 고분자량 (HMW) 종의 수준을 나타내며, 여기서 로딩 단계 동안 보유물 탱크 내의 액체 부피를 총 로드 부피에 비해 더 낮은 부피로 일정하게 유지하였다.
도 13a-13d는 유사-회분식 로딩을 사용하여 생성된 공정중 UF/DF 풀에 대한 입자에 대한 mAb A 입자 수를 나타내며, 여기서 로딩 단계 동안 보유물 탱크 내의 액체 부피를 총 로드 부피에 비해 더 낮은 부피로 일정하게 유지하였다. 도 13a는 1-2 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 도 13b는 5-10 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 도 13c는 10-25 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 도 13d는 50-100 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 입자 함량을 마이크로유체 영상화를 사용하여 정량화하였다.
도 14는 비-mAb 치료 단백질에 대한 유사-회분식 및 유가식 공정 실행에 대한 공정 시간의 함수로서 보유물 단백질 농도를 나타낸다 (MW는 대략 20 Da임).
도 15는 도 14에 나타낸 유사-회분식 및 유가식 공정 실행에 대한 보유물 농도의 함수로서 투과 플럭스를 나타낸다.
도 16은 도 14에 나타낸 유사-회분식 및 유가식 공정 실행에 대한 고분자량 (HMW) 종의 수준을 나타낸다.
도 17a-17d는 도 14의 비-mAb 치료 단백질에 대한 유사-회분식 및 유가식 공정 실행에 대한 입자 수를 나타낸다. 도 17a는 1-2 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 도 17b는 5-10 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 도 17c는 10-25 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 도 17d는 50-100 μm 입자에 대한 입자 수를 나타낸다. 입자 함량을 마이크로유체 영상화를 사용하여 정량화하였다.
본 개시내용은 관심 단백질의 여과 공정 시간을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 관심 단백질을 농축시키는 방법에 관한 것이다.
I. 정의
본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어를 먼저 정의한다. 본원에 달리 명백하게 제공된 경우를 제외하고는, 본 명세서에 사용된 각각의 하기 용어는 하기 제시된 의미를 가질 것이다. 추가의 정의는 명세서 전반에 걸쳐 제시된다.
단수 용어는 그 개체 중 하나 이상을 지칭하며; 예를 들어, "뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "및/또는"은 2개의 명시된 특색 또는 성분 각각을 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 구체적으로 개시하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 다음 측면 각각을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
측면이 용어 "포함하는"과 함께 본원에 기재된 모든 경우에, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"으로 기재된 다른 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반 사전을 제공한다.
단위, 접두어 및 기호는 그의 국제단위계 (SI) 허용 형태로 표시된다. 수치 범위는 범위를 규정하는 숫자들을 포함한다. 본원에 제공된 표제는 본 개시내용의 다양한 측면의 제한이 아니며, 이는 본 명세서를 전체로서 참조할 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 본 명세서를 그 전문으로 참조하여 보다 완전히 정의된다.
대안 (예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다, 또는 그의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 단수 형태는 임의의 언급되거나 열거된 성분 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "약" 또는 "로 본질적으로 구성된"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값 또는 조성에 대한 허용 오차 범위 내에 있는 값 또는 조성을 지칭하며, 이는 값 또는 조성이 측정되거나 또는 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 예를 들어, "약" 또는 "로 본질적으로 구성된"은 관련 기술분야의 실시에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "로 본질적으로 구성된"은 최대 20%의 범위를 의미할 수 있다. 게다가, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 상기 용어는 값의 최대 한 자릿수 또는 최대 5배를 의미할 수 있다. 특정한 값 또는 조성이 본 출원 및 청구범위에 제공되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "로 본질적으로 구성된"의 의미는 그 특정한 값 또는 조성에 대한 허용 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다.
본원에 기재된 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는, 달리 나타내지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절한 경우에 그의 분율 (예컨대, 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "한외여과"는, 예를 들어 상이한 분자의 분리를 달성하거나 또는 유사 분자의 농축을 달성할 수 있는, 크기에 기초하여 용액 중 분자를 분리하는 막-기반 분리 공정을 지칭한다.
용어 "접선 흐름 여과"는 용질-함유 용액이 한외여과 막을 접선하여 통과하고, 보다 저분자량의 용질이 압력을 가함으로써 막을 통과하는 특정 여과 방법을 지칭한다. 한외여과 막을 접선하여 통과하는 보다 고분자량 용질-함유 용액은 보유되고, 따라서 이 용액은 본원에서 "보유물"로 지칭된다. 한외여과 막을 통과하는 보다 저분자량 용질은 본원에서 "투과물"로 지칭된다. 따라서, 보유물은 압력 하에 한외여과 막의 표면을 따라, 예를 들어 접선하여 유동함으로써 농축된다. 한외여과 막은 특정 컷오프 값을 갖는 세공 크기를 갖는다. 일부 측면에서, 컷오프 값은 약 50 kDa 이하, 예를 들어 50 kDa, 40 kDa, 30 kDa, 20 kDa, 또는 10 Da이다. 일부 측면에서, 컷오프 값은 30 kD 이하이다.
용어 "투석여과" 또는 "DF"는, 예를 들어 단백질, 펩티드, 핵산 또는 다른 생체분자를 함유하는 용액 또는 혼합물로부터 용매, 완충제 및/또는 염의 농도를 제거, 대체 또는 저하시키기 위해 한외여과 막을 사용하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유가식", "유가식 여과" 또는 "유가식 여과 공정"은 관심 단백질을 포함하는 공급원료가 공급 탱크에 로딩되고, 후속적으로 저장 탱크로 보내지는 접선 흐름 여과의 여과 (예를 들어, 한외여과) 방법을 지칭하며, 여기서 공급원료는 TFF 시 농축되고, 보유물은 다시 보유물 탱크로 보내진다. 용어 "회분식", "회분식 여과" 또는 "회분식 여과 공정"은 단백질 혼합물이 저장 탱크 내로 로딩되고, 그로부터 보유물이 생성되고, 보유물은 다시 저장 탱크로 보내지고, 투과물은 폐기물용 배수구로 보내지는 여과 (예를 들어, 한외여과) 구성을 지칭한다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 변형 조작, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 예를 들어 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함), 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 상기 정의에 포함된다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 구체적으로 항체 및 Fc 도메인-함유 폴리펩티드 (예를 들어, 이뮤노어드헤신)를 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "관심 단백질"은 정제가 요구되는 혼합물 중에 존재하는 임의의 단백질 (천연 또는 재조합)을 포함하도록 사용된다. 이러한 관심 단백질은 비제한적으로 효소, 호르몬, 성장 인자, 시토카인, 이뮤노글로불린 (예를 들어, 항체), 및/또는 임의의 융합 단백질을 포함한다. 일부 측면에서, 관심 단백질은 본원에 기재된 접선 흐름 여과 (TFF) 방법을 사용하여 정제 및/또는 농축될 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다. 일부 측면에서, 관심 단백질은 항체이다. 일부 측면에서, 관심 단백질은 재조합 단백질이다.
본원에 사용된 용어 "유가식 배양" 또는 "유가식 배양 공정"은 추가의 성분이 배양 공정의 시작 후 어느 시점에 배양물에 제공되는 세포를 배양하는 방법을 지칭한다. 유가식 배양은 기초 배지를 사용하여 시작될 수 있다. 추가의 성분이 배양 공정의 시작 후 어느 시점에 배양물에 제공되는 배양 배지는 공급 배지이다. 유가식 배양은 전형적으로 어느 지점에서 중단되고, 배지 내의 세포 및/또는 성분은 수거되고 임의로 정제된다.
본원에 사용된 "관류" 또는 "관류 배양" 또는 "관류 배양 공정"은 생리학적 영양 용액이 세포의 집단을 통해 또는 세포의 집단에 걸쳐 일정한 속도로 연속적으로 유동하는 것을 지칭한다. 관류 시스템은 일반적으로 배양 유닛 내에 세포의 체류를 수반하기 때문에, 관류 배양은 특징적으로 비교적 높은 세포 밀도를 갖지만, 배양 조건을 유지 및 제어하기가 어렵다. 또한, 세포는 성장한 다음 배양 유닛 내에 높은 밀도로 보유되기 때문에, 성장 속도는 전형적으로 시간 경과에 따라 연속적으로 감소하여, 세포 성장의 후기 지수기 또는 심지어 정지기로 이어진다. 이 연속식 배양 전략은 일반적으로 연속식 세포 배양 시스템에서 생산기 동안 관심 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 발현하는 포유동물 세포, 예를 들어 비-고정 의존성 세포를 배양하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "설정점"은 달리 나타내지 않는 한 단백질 생성물을 농축시키고/거나 생산하는 데 사용되는 TFF 시스템 또는 다른 상류 가공 용기에서의 조건의 초기 설정을 지칭한다. 설정점은 본원에 기재된 UF/DF 공정의 초기에 확립된다. 설정점 이후 UF/DF 동안의 조건의 후속 변화는 TFF 동안의 UF/DF 조건의 변화로 인해 발생할 수 있다. 예를 들어, 설정점은 중량 설정점일 수 있다. 일부 측면에서, 설정점은 온도 설정점이다. 일부 측면에서, 설정점은 세포 배양 방법 전반에 걸쳐 유지될 수 있다. 다른 측면에서, 설정점은 상이한 설정점이 설정될 때까지 유지될 수 있다. 다른 측면에서, 설정점은 또 다른 설정점으로 변화될 수 있다.
"항체" (Ab)는 비제한적으로 항원에 특이적으로 결합하고 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질 이뮤노글로불린을 포함할 것이다. 각각의 H 쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 불변 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 점재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (C1q)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 중쇄는 C-말단 리신을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 일부 측면에서, 항체는 전장 항체이다.
이뮤노글로불린은 IgA, 분비형 IgA, IgG, IgD, IgE 및 IgM을 포함하나 이에 제한되지는 않는 통상적으로 공지된 이소형 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. IgG 하위부류는 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류 또는 하위부류 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. 용어 "항체"는 예로서 모노클로날 및 폴리클로날 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 또는 비인간 항체; 완전 합성 항체; 및 단일 쇄 항체를 포함한다. 비인간 항체는 인간에서 그의 면역원성을 감소시키기 위해 재조합 방법에 의해 인간화될 수 있다. 용어 "항체"는 2개 초과의 항원에 결합할 수 있는 다가 항체 (예를 들어, 3가 항체)를 포함할 수 있다. 3가 항체는 가요성 링커 펩티드를 통해 하나의 비대칭 제3 Fab-크기 결합 모듈에 융합된 2개의 정규 Fab 아암으로 구성된 IgG-형상 이중특이적 항체이다. 이 제3 모듈은 IgG Fc 영역을 대체하고, "노브"-돌연변이를 갖는 CH3에 융합된 중쇄의 가변 영역, 및 매칭 "홀"을 갖는 CH3에 융합된 경쇄의 가변 영역으로 구성된다. 힌지 영역은 제3 결합 부위로의 항원 접근을 용이하게 하는 디술피드 결합을 함유하지 않는다. 명백하게 언급되지 않는 경우 및 문맥상 달리 나타내지 않는 한, 용어 "항체"는 단일특이적, 이중특이적 또는 다중특이적 항체, 뿐만 아니라 단일 쇄 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, LC 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편 (파파인 절단으로부터의 단편) 또는 유사한 1가 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 F(ab')2 단편 (펩신 절단으로부터의 단편) 또는 유사한 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)로 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 이뮤노글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
"이중특이적" 또는 "이중기능적 항체"는 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 2개의 항원 결합 부위를 생성하는, 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍을 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)]을 참조한다.
"융합" 또는 "키메라" 단백질은 자연에서는 자연적으로 연결되지 않는 것인 제2 아미노산 서열에 연결된 제1 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로 별개의 단백질에 존재하는 아미노산 서열이 융합 폴리펩티드에서 합쳐질 수 있거나, 또는 일반적으로 동일한 단백질에 존재하는 아미노산 서열이 융합 폴리펩티드, 예를 들어 본 개시내용의 인자 VIII 도메인과 Ig Fc 도메인의 융합에서 새로운 배열로 배치될 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어 화학적 합성에 의해, 또는 펩티드 영역이 목적하는 관계로 코딩된 폴리뉴클레오티드를 생성하고 번역함으로써 생성된다. 키메라 단백질은 공유, 비-펩티드 결합 또는 비-공유 결합에 의해 제1 아미노산 서열과 회합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
"투여하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 치료제를 포함하는 조성물을 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 본원에 개시된 제제에 대한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 본원에 사용된 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 비-비경구 경로를 통해 투여되고, 일부 실시양태에서, 경구로 투여된다. 다른 비-비경구 경로는 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비강내, 질, 직장, 설하 또는 국소 투여를 포함한다. 투여는 또한, 예를 들어 1회, 복수회, 및/또는 1회 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
대상체의 "치료" 또는 "요법"은 질환과 연관된 증상, 합병증 또는 상태, 또는 생화학적 징후의 역전, 완화, 개선, 억제, 진행, 발달, 중증도 또는 재발의 둔화를 목적으로 대상체에 대해 수행되는 임의의 유형의 개입 또는 과정, 또는 대상체에 대한 활성제의 투여를 지칭한다. 고형 종양의 반응 평가 기준 (RECIST)은 치료 효능에 대한 척도이고, 종양이 치료 동안 반응하거나, 안정화되거나, 또는 진행되는 경우를 규정하는 확립된 규칙이다. RECIST 1.1은 성인 및 소아 암 임상 시험에서 사용하기 위한 종양 크기 변화의 객관적 평가를 위한 고형 종양 측정 및 정의에 대한 현재의 가이드라인이다. 동부 종양학 협력 그룹 (ECOG) 수행 상태는, 환자를 등록하는 의사들 사이에서 균일하게 재현되도록 시험에서 연구될 환자 집단을 규정하는 데 사용되는 넘버링 척도이다. 소아과 환자에서, 란스키 수행 척도는 소아에서의 기능적 상태를 기재하는 방법이다. 이는 암을 갖는 소아에서 요법에 대한 반응 및 전체 상태를 평가하기 위해 도출되고 내부적으로 검증되었다.
본원에 기재된 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는, 달리 나타내지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절한 경우에 그의 분율 (예컨대, 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "목적하는 최종 단백질 농도"는 본원에 기재된 접선 흐름 여과 방법을 사용하여 농축된 관심 단백질의 단백질 농도를 지칭한다. 예를 들어, 관심 단백질에 대한 목적하는 최종 단백질 농도는 관심 단백질을 포함하는 혼합물을 본원에 기재된 바와 같은 UF1, DF 및 UF2 단계에 적용함으로써 달성된다. 일부 측면에서, 목적하는 최종 단백질 농도는 300 mg/mL 이하이다.
본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 약리학적 활성제에 대한 비히클을 지칭한다. 담체는 작용제의 기능을 종결시키지 않으면서 표적 부위로의 활성제의 전달을 용이하게 한다. 담체의 적합한 형태의 비제한적 예는 국소 투여에 적합한 용액, 크림, 겔, 겔 에멀젼, 젤리, 페이스트, 로션, 살브, 스프레이, 연고, 분말, 고체 혼합물, 에어로졸, 에멀젼 (예를 들어, 유중수 또는 수중유), 겔 수용액, 수용액, 현탁액, 도찰제, 팅크제 및 패치를 포함한다.
본원에 사용된 어구 "제약상 허용되는 조성물" (또는 "제약 조성물")은 제약 투여, 예컨대 인간에게 허용되는 조성물을 지칭한다. 이러한 조성물은 제약 투여에 허용되는 수준을 초과하지 않는 수준으로 불순물을 갖는 물질을 포함할 수 있고 (이러한 수준은 이러한 불순물의 부재를 포함함), 임의의 활성제(들) 외에도, 예를 들어 투여의 용이성을 위해 이러한 조성물을 제제화하는 제약상 허용되는 부형제, 비히클, 담체 및 다른 불활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제약상 허용되는 항-PD1 항체 조성물은 인간에게 투여하기에 허용되는 수준인 한 DNA를 포함할 수 있다.
II. 한외여과 방법
본 개시내용은 최종 단백질 수율이 고도로 농축될 수 있게 하는 단백질 정제 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 방법은 단백질 정제 공정을 위한 제1 한외여과 단계 (예를 들어, 제1 한외여과 단계, 투석여과, 및 제2 한외여과 단계를 포함하거나 이로 이루어진 공정에서)에 요구되는 공정 시간을 감소시키며, 여기서 공급원료는 큰 부피 감소를 겪고, 초기 부피는 초기에 유가식 모드로 작동할 것을 요구할 정도로 충분히 크다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 방법은 한외여과에 의한 고농도 약물 물질 (예를 들어, 관심 단백질)의 생성과 연관된 간접적인 문제를 완화시킨다. 예를 들어, 고농도 물질 (예를 들어, 대략 150-300 g/L)의 생성은 로드 물질의 상당한 부피 감소를 초래하며, 이는 전단 및 계면 응력에 대한 장기간 노출로 인한 응집 문제를 악화시키는 것에 추가로 시설 적합성 및 용량에 대한 문제를 제기한다. 한외여과 동안, 샘플 부피는 보유물 용기 및 시스템 보유 부피가 고정된 동안 유의하게 (예를 들어, 전형적으로 10배 이상) 감소하여, 시스템의 규모 (예를 들어, 보유물 용기 및 시스템 보유 부피)와 샘플 부피 사이에 큰 미스매치가 존재하는 공정 지점이 발생한다. 용기의 하단 부분을 포함하는 시스템 유동 경로가 여과 공정 내내 액체로 충전되어 유지되어야 하기 때문에, 보유물 용기 기하구조와 합한 최종 농도의 약물 물질 (예를 들어, 관심 단백질) 부피가 시스템에 대한 최소 작업 부피를 규정한다. 최소 작업 부피가 용기 크기에 따라 증가하기 때문에, 최종 약물 물질은 보유물 용기 크기의 상한을 설정한다. 이 상한은 로드 부피보다 낮다. 이와 같이, 로드 물질의 일부는 유가식 로딩을 사용하여 보유물 용기로 공급될 필요가 있다. 유가식 로딩에 의해 공급되어야 하는 초기 로드 부피의 백분율은 이용가능한 용기 크기 및 시스템 유지 부피와 같은 시설 적합성의 함수이다.
유가식 로딩은 큰 로드 부피의 가공을 가능하게 하지만, 이 로딩 전략은 회분식 작업과 비교하여 공정 시간 페널티를 부과한다. 나머지 샘플 부피의 주어진 양에 대해, 샘플의 액체 (완충제) 부피가 회분식에서와 같이 총 단백질 질량 (예를 들어, 보유물 용기 내의 모든 것) 사이에 균질하게 분포되기 보다는 유가식에서는 로드 용기 (예를 들어, 공급 탱크) 내의 묽은 물질과 보유물 용기 내의 농축된 단백질 사이에 분할되기 때문에, 보유물 단백질 농도는 회분식 공정보다 유가식 공정에 대해 더 높다. 그 결과, 유가식 투과 플럭스는 보다 높은 보유물 농도로 인해 보다 낮다. 따라서, 시스템은 회분식 모드와 비교하여 유가식 모드에서 제1 한외여과 단계의 대부분 동안 보다 높은 농도 및 보다 낮은 플럭스로 작동하고, 이는 보다 긴 공정 시간으로 이어지고, 차례로 전단 및 계면 응력-유도된 응집의 위험성을 증가시킨다.
제조-규모 설정에서, 고농도 약물 물질을 생성하기 위한 제1 한외여과 단계의 작업 모드는 전형적으로 완전 회분식 또는 유가식이 아니다. 대신에, 한외여과 단계는 보유물 용기 내로의 로드 물질의 공급 동안 유가식 모드로 작동하고, 이어서 로드 물질이 보유물 용기에 완전히 함유되면 회분식 모드로 전환한다. 이러한 혼합 모드 한외여과 단계를 이하 "하이브리드" 모드로 지칭할 것이다. 하이브리드 모드는 제1 한외여과 단계를 위한 공정 시간을 초래하며, 이는 회분식 모드 또는 유가식 모드로 완전히 작동하기 위해 예상되는 공정 시간 사이에 속하고, 시스템이 유가식 모드의 작동으로부터 회분식 모드로 전환되는 교차점에 따라 달라진다. 교차점 및 하이브리드 공정 시간을 기재하는 방정식은 실시예 1에 기재되어 있다. 교차점에 상응하는 농도는 또한 상대적 로드 및 시스템 부피의 함수이며, 이는 공정 시간을 시설 적합성의 강력한 함수로 만든다.
상대 로드 및 시스템 부피의 차이가 기술 전달 동안 고려되지 않는다면 실험실 규모에서 개발된 공정 파라미터 사양이 제조 규모에서 예상외로 더 긴 공정 시간으로 이어질 수 있기 때문에, 이 의존성은 공정 개발 및 기술 전달에 대한 도전과제를 생성한다. 대조적으로, 회분식 공정의 공정 시간은 막 로딩에만 의존하며, 이는 공정을 완전히 확장가능하게 한다.
제1 한외여과 단계 동안 하이브리드 작동 모드로부터 초래되는 공정 시간 페널티 또는 설비 피팅 의존성을 다루기 위한 전신 접근법은 개발되지 않았다. 이들 도전과제를 완화시키기 위해, 본원에 개시된 방법은 유가식-유사 설정을 사용하여 한외여과 단계의 회분식-유사 작업을 가능하게 하도록 개발되었고, 이는 본원에서 유사-회분식 작업 모드로 지칭된다.
본 개시내용은 유가식 설정을 사용하는 회분식-유사 모드로 한외여과에 의해 큰 부피의 단백질 공급원료를 농축시켜 농축된 약물 물질을 생성하는 최적화된 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 접선 흐름 여과 (TFF)에 의해 고도로 농축된 단백질을 포함하는 용액을 생성하는 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 방법은 공정을 위한 제1 한외여과 단계 (예를 들어, 제1 한외여과 단계, 투석여과 및 제2 한외여과 단계를 포함하거나 그로 이루어진 공정에서)에 요구되는 공정 시간을 감소시키며, 여기서 공급원료는 큰 부피 감소를 겪고, 초기 부피는 초기에 유가식 모드로 작동할 것을 요구할 정도로 충분히 크다. 일부 측면에서, 방법은, 한외여과 공정 동안 생성된 미립자 및 불순물 부담에 의해 정량화된 바와 같이, 보다 짧은 공정 시간에 의해 제품 품질을 개선시킨다. 일부 측면에서, 방법은 유가식 모드로 작동 시 실험실, 예를 들어 개발, 및 제조 규모 사이의 장비 설정 간에 관찰되는 공정 시간의 가변성을 제거한다. 일부 측면에서, 규모 사이의 공정 시간의 개선된 일관성 생성은 스케일-다운 한외여과/투석여과 (UF/DF) 모델의 정확도를 개선시켜, 보다 효율적인 스케일-업 및 기술 전달 캠페인으로 이어질 수 있다.
본 개시내용은, 일부 측면에서, 유가식 설정 (예를 들어, 공급 탱크 및 보유물 용기를 사용함)을 회분식-유사 작업 (예를 들어, 접선 흐름 여과 (TFF) 재순환 루프에서 단일 용기로서 기능하도록 본원에 기재된 바와 같이 공급 탱크 및 보유물 용기를 연결함)으로 전환시켜 관심 단백질을 농축시킴으로써 유가식 로딩과 연관된 시간 페널티를 완화시킬 수 있는 UF/DF에 대한 유사-회분식 구성에 관한 것이다.
접선 흐름 여과는 한외여과 막을 통한 보다 작은 분자의 이동을 구동하면서 동시에 보다 큰 분자 (예를 들어, "보유물")를 보유하는 유체 압력의 사용에 의존하는 한외여과 절차이다. 일반적으로, 보유될 단백질의 분자량보다 3 내지 6배 더 작은 분자량 컷-오프 (MWCO)를 갖는 막이 선택된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 인자, 예를 들어 유량, 가공 시간, 막횡단 압력, 분자 형상 또는 구조, 용질 농도, 다른 용질의 존재, 및 이온 조건 또한 적절한 MWCO의 선택에 영향을 미칠 수 있다.
전통적인 유가식 TFF 구성이 도 1a에 나타나 있으며, 여기서 로드 물질을 보유하는 공급 탱크는 공급 펌프에 의해 보유물 용기 (예를 들어, 저장소)에 연결되고, 보유물 용기는 TFF 막 장치 및 재순환 펌프를 갖는 재순환 루프에 별도로 혼입된다.
일부 측면에서, TFF에 의해 관심 단백질을 농축시키고/거나 그에 대한 여과 시간을 감소시키는 방법은 제1 한외여과 단계 (UF1), 투석여과 (DF), 및 제2 한외여과 단계 (UF2)를 포함한다.
본원에 기재된 유사-회분식 구성에서, 일부 측면에서, 유동 경로는 공급 탱크를 재순환 루프에 혼입하도록 변형된다 (도 1b). 3-방향 밸브를 TFF 필터 모듈의 보유물 포트 뒤에 위치시켜 제1 한외여과 단계의 상태에 따라 보유물 유동을 공급 탱크 또는 보유물 용기로 보낸다. 일부 측면에서, 혼합기는 공급 탱크 및 저장 (예를 들어, 보유물) 탱크 둘 다에 사용된다.
일부 측면에서, UF1의 초기 로딩 단계 동안, 3-방향 밸브는 보유물 유동을 공급 탱크로 보내고 보유물 용기로의 유동을 차단하도록 설정된다. 로드 물질은 공급 펌프에 의해 공급 탱크로부터 보유물 용기로 공급되지만, TFF 필터 모듈로부터의 보유물은 공급 탱크로 복귀되고, 나머지 로드 물질과 혼합된다. 이 새로운 로드 물질 혼합물은 이제 약간 더 농축되고, 보유물 용기에 공급되고, 사이클이 반복된다. 일부 측면에서, 로드 물질이 초기 묽은 농도에서 고정된 채로 유지되면서 보유물이 점점 더 농축되는 유가식 로딩과 달리, 공급 탱크 및 보유물 용기 둘 다 내의 단백질 용액은 동일한 속도로 농축된다. 이 구성에서, 공급 탱크는 보유물 용기의 연장으로서 효과적으로 작용하고, 둘은 회분식 설정과 유사하게 재순환 루프에서 단일 저장소로서 작용한다 (도 1c). 본원에 기재된 유사-회분식 구성은 다른 하이브리드-모드 공정을 회분식-유사 공정으로 전환시켜, 제1 한외여과 단계의 유가식 로딩 부분에 대한 시간 페널티 뿐만 아니라 공정 시간의 설비 피트 의존성을 완화시킨다. 일부 측면에서, 로딩 단계 동안, 보유물 탱크 내의 액체 부피는 총 로드 부피에 비해 더 낮은 부피로 일정하게 유지된다. 일부 측면에서, 액체 부피는 로딩 단계 동안 총 초기 로드 부피의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35% 또는 약 40%로 일정하게 유지된다. 일부 측면에서, 액체 부피는 로딩 단계 동안 총 초기 로드 부피의 약 5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 또는 약 25% 내지 약 30%로 일정하게 유지된다. 일부 측면에서, 액체 부피는 로딩 단계 동안 총 초기 로드 부피의 약 10%로 일정하게 유지된다. 일부 측면에서, 액체 부피는 로딩 단계 동안 총 초기 로드 부피의 약 20%로 일정하게 유지된다.
일부 측면에서, 로딩 단계가 완료되었을 때 (예를 들어, 총 단백질 용액 부피가 보유물 용기 부피 미만으로 감소되었을 때), 3-방향 밸브는 보유물 유동을 보유물 용기로 다시 보내고 공급 탱크로의 유동을 차단하여, 재순환 루프로부터 공급 탱크를 효과적으로 제거하고 TFF 설정을 진정한 회분식 구성으로 전환시키도록 작동된다. 일부 측면에서, 2개의 용기 사이의 연결 배관 내의 잔류 물질의 (예를 들어, 보유물 용기 내로의) 공기 추적을 수행하기 위해 공급 펌프를 추가의 시간 동안 작동하여 로드 물질의 회수를 최대화할 수 있다.
농축을 위한 TFF 막은 농축될 샘플에 대한 그의 거부 특징에 기초하여 선택될 수 있다. 일반적으로, 막의 분자량 컷-오프 (MWCO)는 완전한 체류를 보장하기 위해 보유될 분자 (예를 들어, 관심 단백질)의 분자량의 1/3rd 내지 1/6th이어야 한다. MWCO가 샘플의 MWCO에 가까울수록, 농축 동안 일부 생성물 손실에 대한 위험성이 더 크다. 투석여과가 또한 사용될 경우에 위험성은 증가하는데, 이는 상대 손실이 생성될 여과물의 총 부피에 의존하기 때문이다. 막 유동률 (막의 단위 면적당 여과물 유량)은 세공 크기와 관련된다. 세공이 작을수록, 동일한 적용 압력에 대한 유동률은 낮아진다. 따라서, 농축/투석여과를 위한 막을 선택할 때, 시간 인자 대 생성물 회수를 고려해야 한다. 공정 시간은 사용되는 막 면적의 양을 증가시킴으로써 감소될 수 있다.
투석여과는 단백질, 펩티드 핵산 및 다른 생체분자를 함유하는 용액으로부터 염 또는 용매의 농도를 완전히 제거, 대체 또는 저하시키기 위해 여과 막 (예를 들어, 한외여과 막)을 사용하는 기술이다. DF는 용액 및 현탁액의 성분을 그의 분자 크기에 기초하여 분리하기 위해 투과성 (예를 들어, 다공성) 막 필터를 선택적으로 이용한다. 한외여과 막은 막의 세공보다 큰 분자를 보유하고, 100% 투과성인 보다 작은 분자, 예컨대 염, 용매 및 물은 막을 자유롭게 통과한다. DF는 궁극적으로 농도를 변화시키지 않으면서 막을 통해 보다 작은 분자를 세척하고 보유물 내에 보다 큰 분자 (예를 들어, 관심 단백질)를 보유하는 분획화 공정이다.
투석여과는 연속식 또는 불연속식일 수 있다. 연속식 투석여과에서, 투석여과 용액 (예를 들어, 완충제)은 여과물이 생성되는 것과 동일한 속도로 샘플 공급 저장소에 첨가된다. 이러한 방식으로, 샘플 저장소 내의 부피는 일정하게 유지되지만, 막을 통해 자유롭게 투과할 수 있는 소분자 (예를 들어, 염)는 세척 제거된다. 예로서 염 제거를 사용하여, 각각의 추가의 투석여과 부피 (DV)는 염 농도를 추가로 감소시킨다. (DV는 DF 단계 동안 수행된 세척 정도의 척도이다. 이는 보유물 부피와 비교하여 도입된 투석여과 완충제의 부피를 기준으로 한다. 일정한-부피 DF에서, 보유물 부피는 일정하게 유지되고, DF 완충제는 투과물이 나가는 속도와 동일한 속도로 진입한다. 예를 들어, 하나의 투석여과 부피는 시스템 내의 생성물의 부피와 동일한 부피의 완충제를 공급물 저장소에 첨가한 후, 다시 출발 부피로 농축시키는 것과 동일하다. 예를 들어, 200 mL 샘플로 시작 시, 하나의 투석여과 부피 (DV 1)는 200 mL와 동일하다.) 제2 투석여과 부피 (DV 2)는 연속식 투석여과로 이온 강도를 ~99% 감소시킬 것이다. 불연속식 투석여과에서, 용액을 먼저 희석한 다음, 출발 부피로 다시 농축시켰다. 이어서, 저장소에 잔류하는 소분자 (예를 들어, 염)의 요구되는 농도에 도달할 때까지 상기 과정을 반복한다. 각각의 추가의 DV는 염 농도를 추가로 감소시킨다. 연속식 투석여과는 불연속식 투석여과와 동일한 정도의 염 감소를 달성하기 위해 보다 적은 여과물 부피를 필요로 한다. 먼저 샘플을 농축함으로써, 특정 이온 강도를 달성하는 데 요구되는 투석여과 용액의 양이 실질적으로 감소될 수 있다.
일부 측면에서, 보유물 용기 중량이 보유물 용기 중량 설정점 미만인 경우 DF 공급 펌프는 DF 또는 회수 모드 동안에만 작동될 것이다. 일부 측면에서, 이 중량은 2초마다 제어 시스템에 의해 체크된다. 일부 측면에서, DF 중량이 설정되고, DF 펌프는 DF 종점까지 유지될 것이다. 일부 측면에서, 용기 중량이 입력된 설정점 아래로 떨어지면 DF 펌프는 켜질 것이다. DF 종점에 도달한 후, 시스템은 농축 단계로 진행될 것이다. 일부 측면에서, DF 종점 선택은 제어 시스템의 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 선택된다. 일부 측면에서, 디폴트 종점 선택은 라인 내의 공기이다. 일부 측면에서, DF 중량 설정점은 전체 보유물 용기 중량일 것이다.
본 개시내용은 적어도 1회 여과된 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물 (예를 들어, 보유물)을 공급 탱크에 연속적으로 로딩하는 것을 포함하며, 여기서 공급 탱크는 주 저장 (예를 들어, 보유물) 탱크로부터 분리된 것인, 관심 단백질의 여과 공정 시간을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 관심 단백질의 여과 공정 시간을 감소시키는 방법은 공급 탱크, 저장 탱크, 필터, 필터를 공급 탱크에 연결하는 공급 탱크 밸브 및 필터를 저장 탱크에 연결하는 저장 탱크 밸브를 포함하는 3방향 밸브, 및 공급 탱크와 저장 탱크를 연결하는 저장 주입구를 포함하는 여과 시스템에 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물을 로딩하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 또한 적어도 1회 여과된 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물 (예를 들어, 보유물)을 공급 탱크에 연속적으로 로딩하는 것을 포함하며, 여기서 공급 탱크는 주 저장 (예를 들어, 보유물) 탱크로부터 분리된 것인, 관심 단백질을 농축시키는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 관심 단백질을 농축시키는 방법은 공급 탱크, 저장 탱크, 필터, 필터를 공급 탱크에 연결하는 공급 탱크 밸브 및 필터를 저장 탱크에 연결하는 저장 탱크 밸브를 포함하는 3방향 밸브, 및 공급 탱크와 저장 탱크를 연결하는 저장 주입구를 포함하는 여과 시스템에 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물을 로딩하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 공급 탱크는 적어도 1회 여과되지 않은 관심 단백질을 포함하는 초기 단백질 혼합물을 추가로 포함하고, 여기서 초기 단백질 혼합물 및 보유물은 함께 혼합된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물 및 보유물은 필터 (예를 들어, 한외여과 필터)를 통해 여과된다. 일부 측면에서, 여과된 단백질 혼합물 및 보유물은 공급 탱크에 로딩된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물 및 보유물은 관심 단백질이 적어도 약 1 mg/mL, 적어도 약 10 mg/mL, 적어도 약 20 mg/mL, 적어도 약 30 mg/mL, 적어도 약 40 mg/mL, 적어도 약 50 mg/mL, 적어도 약 60 mg/mL, 적어도 약 70 mg/mL, 또는 적어도 약 80 mg/mL로 농축될 때까지 공급 탱크 내로 연속적으로 로딩된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물 및 보유물은 관심 단백질이 적어도 약 1 mg/mL, 적어도 약 5 mg/mL, 적어도 약 10 mg/mL, 적어도 약 11 mg/mL, 적어도 약 12 mg/mL, 적어도 약 13 mg/mL, 적어도 약 14 mg/mL, 적어도 약 15 mg/mL, 적어도 약 16 mg/mL, 적어도 약 17 mg/mL, 적어도 약 18 mg/mL, 적어도 약 19 mg/mL, 적어도 약 20 mg/mL로 농축될 때까지 공급 탱크 내로 연속적으로 로딩된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물 및 보유물은 관심 단백질이 적어도 약 21 mg/mL, 적어도 약 22 mg/mL, 적어도 약 23 mg/mL, 적어도 약 24 mg/mL, 적어도 약 25 mg/mL, 적어도 약 26 mg/mL, 적어도 약 27 mg/mL, 적어도 약 28 mg/mL, 적어도 약 29 mg/mL, 또는 적어도 약 30 mg/mL로 농축될 때까지 공급 탱크 내로 연속적으로 로딩된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물 및 보유물은 관심 단백질이 적어도 약 31 mg/mL, 적어도 약 32 mg/mL, 적어도 약 33 mg/mL, 적어도 약 34 mg/mL, 적어도 약 35 mg/mL, 적어도 약 36 mg/mL, 적어도 약 37 mg/mL, 적어도 약 38 mg/mL, 적어도 약 39 mg/mL, 적어도 약 40 mg/mL, 적어도 약 45 mg/mL, 적어도 약 50 mg/mL, 적어도 약 55 mg/mL, 적어도 약 60 mg/mL, 적어도 약 65 mg/mL, 적어도 약 70 mg/mL, 적어도 약 75 mg/mL, 또는 적어도 약 80 mg/mL, 적어도 약 85 mg/mL, 또는 적어도 약 90 mg/mL로 농축될 때까지 공급 탱크 내로 연속적으로 로딩된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물 및 보유물은 관심 단백질이 약 1 mg/mL 내지 80 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 70 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 60 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 50 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 40 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 30 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 20 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 70 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 60 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 50 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 40 mg/mL, 또는 약 20 mg/mL 내지 30 mg/mL로 농축될 때까지 공급 탱크 내로 연속적으로 로딩된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물 및 보유물은 관심 단백질이 약 1 mg/mL 내지 10 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 20 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 30 mg/mL, 약 30 mg/mL 내지 40 mg/mL, 약 40 mg/mL 내지 50 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 60 mg/mL, 약 60 mg/mL 내지 70 mg/mL, 또는 약 70 mg/mL 내지 80 mg/mL로 농축될 때까지 공급 탱크 내로 연속적으로 로딩된다.
일부 측면에서, 보유물의 로딩은 본원에 기재된 유사-회분식 유동 경로를 통해 재순환된다. 일부 측면에서, 보유물의 로딩은 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 적어도 10회, 적어도 20회, 적어도 30회, 적어도 40회, 적어도 50회, 적어도 60회, 적어도 70회, 적어도 80회, 적어도 90회, 적어도 100회, 적어도 110회, 적어도 120회, 적어도 130회, 적어도 140회, 적어도 150회, 적어도 160회, 적어도 170회, 적어도 180회, 적어도 190회, 적어도 200회, 적어도 210회, 적어도 220회, 적어도 230회, 적어도 240회, 적어도 250회, 적어도 260회, 적어도 270회, 적어도 280회, 적어도 290회, 또는 적어도 300회 반복된다.
일부 측면에서, 방법은 공급 탱크로의 보유물의 로딩을 중단하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 보유물을 저장 탱크로 보내는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 저장 탱크 밸브는 관심 단백질이 충분히 농축될 때까지 폐쇄된다. 일부 측면에서, 방법은 단백질 혼합물을 공급 탱크에 연속적으로 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 공급 탱크에서 저장 탱크로 보내진다.
일부 측면에서, 저장 탱크는 필터에 연결된다. 일부 측면에서, 필터는 인-라인 여과 막을 포함한다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 한외여과 막이다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 폴리비닐에테르, 폴리비닐알콜, 나일론, 규소, 폴리실리콘, 울트라나노결정질 다이아몬드, 다이아몬드-유사-탄소, 이산화규소, 티타늄, 실리카, 질화규소, 폴리테트라플루오르에틸렌, 실리콘, 폴리메타크릴레이트, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리카르보네이트, 그래핀, 그래핀 옥시드, 폴리사카라이드, 세라믹 입자, 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 개질된 폴리에테르술폰, 폴리아릴술폰, 폴리페닐 술폰, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 폴리락트산, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리피페라진, 폴리아미드-폴리에테르 블록 중합체, 폴리이미드, 폴리에테르이미드, 폴리아미드, 재생 셀룰로스, 복합 재생 셀룰로스, 또는 그의 조합이다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 폴리에테르술폰이다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 셀룰로스이다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 폴리에테르술폰 및 셀룰로스의 조합이다. 일부 측면에서, 여과 막은 약 50 kD 내지 약 5 kD 미만의 분자량 컷오프 (MWCO)를 갖는다. 일부 측면에서, 여과 막은 약 5 kD 미만의 MWCO를 갖는다.
일부 측면에서, 혼합물을 목적하는 여과된 단백질 농도에 도달할 때까지 유동 (예를 들어, 재순환)하게 한다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 10 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 20 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 30 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 40 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 50 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 60 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 70 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 80 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 90 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 100 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 110 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 120 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 130 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 140 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 150 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 160 mg/ml 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 170 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 180 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 190 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 200 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 210 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 220 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 230 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 240 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 250 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 260 mg/mL 내지 약 300 mg/ml이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 270 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 280 mg/ml 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 290 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 측면에서, 목적하는 여과된 단백질 농도는 약 150 mg/mL이다.
일부 측면에서, 단백질 점도는 약 0 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 20 cP 내지 약 60 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 10 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 20 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 30 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 40 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 50 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 60 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 70 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 80 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 90 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 100 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 100 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 120 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 130 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 140 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 150 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 160 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 170 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 180 cP 내지 약 200 cP이다. 일부 측면에서, 단백질 점도는 약 190 cP 내지 약 200 cP이다.
일부 측면에서, 공급 탱크의 부피와 저장소의 부피 사이의 부피 비는 약 1:2 내지 약 10:1, 약 1:2 내지 약 1:1, 약 1:1 내지 약 1:2, 약 1:1 약 1:3, 약 1:1 내지 약 1:4, 약 1:1 내지 약 1:5, 약 1:1 내지 약 1:6, 약 1:1 내지 약 1:7, 약 1:1 내지 약 1:8, 약 1:1 내지 약 1:9, 또는 약 1:1 내지 약 1:10이다. 일부 측면에서, 공급 탱크의 부피와 저장 탱크의 부피 사이의 부피 비는 약 1:1, 약 2:1, 또는 약 5:1이다.
일부 측면에서, 단백질 혼합물은 다이어프램 펌프, 회전 로브 펌프, 또는 연동 펌프를 사용하여 저장 탱크 및/또는 필터로 보내진다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 다이어프램 펌프를 사용하여 저장 탱크 및/또는 필터로 보내진다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 연동 펌프를 사용하여 저장 탱크 및/또는 필터로 보내진다.
일부 측면에서, 관심 단백질을 농축시키고/거나 관심 단백질에 대한 여과 공정 시간을 감소시키는 방법은 적어도 1회 여과된 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물 ("보유물")을 공급 탱크에 연속적으로 로딩하기 전에 적어도 1회 여과되지 않은 관심 단백질을 포함하는 초기 단백질 혼합물을 공급 탱크에 로딩하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 초기 단백질 혼합물은 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL의 농도로 공급 탱크에 첨가된다. 일부 측면에서, 초기 단백질 혼합물은 약 5 mg/mL의 농도로 공급 탱크에 첨가된다.
일부 측면에서, 공정 시간은 유가식 농축 공정의 공정 시간과 비교하여 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 감소된다. 일부 측면에서, 공정 시간은 유가식 농축 공정의 공정 시간과 비교하여 약 40% 감소된다. 일부 측면에서, 공정 시간은 유가식 농축 공정의 공정 시간과 비교하여 약 0.2시간, 약 0.4시간, 약 0.5시간, 약 0.6시간, 약 0.8시간, 또는 약 1.0시간 감소된다. 일부 측면에서, 공정 시간은 유가식 농축 공정의 공정 시간과 비교하여 약 0.5시간 감소된다.
일부 측면에서, 1-2 μm 미립자 수는 유가식 농축 공정의 미립자 수와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 감소된다. 일부 측면에서, 5-10 μm 미립자 수는 유가식 농축 공정의 미립자 수와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 감소된다. 일부 측면에서, 10-25 μm 미립자 수는 유가식 농축 공정의 미립자 수와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 감소된다.
일부 측면에서, 단백질 혼합물은 로딩 완충제와 함께 공급 탱크에 첨가된다. 일부 측면에서, 로딩 완충제는 아미노산, 약산, 약염기 및/또는 당을 포함한다.
III. 관심 단백질
일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 임의의 단백질 생성물 (예를 들어, 관심 단백질)에 적용될 수 있다. 일부 측면에서, 단백질 생성물은 치료 단백질이다. 일부 측면에서, 치료 단백질은 항체 또는 그의 항원-결합 단편, Fc 융합 단백질, 항응고제, 혈액 응고 인자, 골 형태발생 단백질, 조작된 단백질 스캐폴드, 효소, 성장 인자, 호르몬, 인터페론, 인터류킨 및 혈전용해제로부터 선택된다. 일부 측면에서, 단백질 생성물은 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 측면에서, 단백질은 재조합 단백질이다.
일부 측면에서, 단백질 생성물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 일부 측면에서, 단백질 생성물은 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드이다. 일부 측면에서, 단백질 생성물은 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편 ("mAb")이다. 항체는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 일부 측면에서, 단백질 생성물은 이중특이적 항체이다.
일부 측면에서, 단백질 생성물 및 오염물을 포함하는 혼합물은 이전 정제 단계의 생성물을 포함한다. 일부 측면에서, 혼합물은 이전 정제 단계의 미정제 생성물이다. 일부 측면에서, 혼합물은 이전 정제 단계의 미정제 생성물 및 완충제, 예를 들어 출발 완충제를 포함하는 용액이다. 일부 측면에서, 혼합물은 출발 완충제에서 재구성된 이전 정제 단계의 미정제 생성물을 포함한다.
일부 측면에서, 단백질 생성물의 공급원은 벌크 단백질이다. 일부 측면에서, 단백질 생성물의 공급원은 단백질 생성물 및 비-단백질 성분을 포함하는 조성물이다. 비-단백질 성분은 DNA 및 다른 오염물을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 단백질 생성물의 공급원은 동물로부터의 것이다. 일부 측면에서, 동물은 포유동물, 예컨대 비-영장류 (예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 또는 영장류 (예를 들어, 원숭이 또는 인간)이다. 일부 측면에서, 공급원은 인간으로부터의 조직 또는 세포이다. 특정 측면에서, 이러한 용어는 비-인간 동물 (예를 들어, 비-인간 동물, 예컨대 돼지, 말, 소, 고양이 또는 개)을 지칭한다. 일부 측면에서, 이러한 용어는 애완동물 또는 가축을 지칭한다. 일부 측면에서, 이러한 용어는 인간을 지칭한다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 방법에 의해 정제된 단백질 생성물은 융합 단백질이다. "융합" 또는 "융합 단백질"은 자연에서는 자연적으로 연결되지 않는 것인 제2 아미노산 서열에 인 프레임으로 연결된 제1 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로 별개의 단백질에 존재하는 아미노산 서열이 융합 폴리펩티드에서 합쳐질 수 있거나, 또는 일반적으로 동일한 단백질에 존재하는 아미노산 서열이 융합 폴리펩티드에서 새로운 배열로 배치될 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어 화학적 합성에 의해, 또는 펩티드 영역이 목적하는 관계로 코딩된 폴리뉴클레오티드를 생성하고 번역함으로써 생성된다. 융합 단백질은 공유, 비-펩티드 결합 또는 비-공유 결합에 의해 제1 아미노산 서열과 회합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 전사/번역 시, 단일 단백질이 제조된다. 이러한 방식으로, 다수의 단백질 또는 그의 단편이 단일 폴리펩티드 내로 혼입될 수 있다. "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 요소 사이의 기능적 연결을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 2개의 폴리펩티드 사이의 작동가능한 연결은 두 폴리펩티드를 인 프레임으로 함께 융합시켜 단일 폴리펩티드 융합 단백질을 생산한다. 특정한 측면에서, 융합 단백질은 추가로 아래에서 상세히 논의되는 바와 같이 링커 서열을 포함할 수 있는 제3 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 방법에 의해 정제된 단백질은 항체이다. 항체는, 예를 들어 모노클로날 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 단일특이적 항체, 다중특이적 항체 (이중특이적 항체 포함), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이뮤노글로불린, 합성 항체, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 분자를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 인트라바디, 이종접합체 항체, 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단일 쇄 항체 또는 단일-쇄 Fv (scFv), 낙타화 항체, 아피바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, 디술피드-연결된 Fv (sdFv), 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 항-항-Id 항체 포함), 및 상기 중 임의의 것의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 항체는 폴리클로날 항체 집단을 지칭한다. 항체는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY), 임의의 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2), 또는 임의의 하위부류 (예를 들어, IgG2a 또는 IgG2b)의 것일 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 항체는 IgG 항체, 또는 그의 부류 (예를 들어, 인간 IgG1 또는 IgG4) 또는 하위부류이다. 한 측면에서, 항체는 인간화 모노클로날 항체이다. 일부 측면에서, 항체는 바람직하게는 이뮤노글로불린인 인간 모노클로날 항체이다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 항체는 IgG1 또는 IgG4 항체이다.
일부 측면에서, 단백질은 항-LAG3 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-NKG2a 항체, 항-ICOS 항체, 항-CD137 항체, 항-KIR 항체, 항-TGFβ 항체, 항-IL-10 항체, 항-B7-H4 항체, 항-Fas 리간드 항체, 항-메소텔린 항체, 항-CD27 항체, 항-GITR 항체, 항-CXCR4 항체, 항-CD73 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-IL8 항체, 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 측면에서, 단백질은 아바타셉트 NGP이다. 다른 측면에서, 단백질은 벨라타셉트 NGP이다.
일부 측면에서, 단백질은 항-PD-1 항체이다.
관련 기술분야에 공지된 항-PD-1 항체가 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 고친화도로 PD-1에 특이적으로 결합하는 다양한 인간 모노클로날 항체가 미국 특허 번호 8,008,449에 개시되어 있다. 미국 특허 번호 8,008,449에 개시된 항-PD-1 인간 항체는 다음 특징 중 하나 이상을 나타내는 것으로 입증되었다: (a) 비아코어 바이오센서 시스템을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같이, 1 x 10-7 M 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합함; (b) 인간 CD28, CTLA-4 또는 ICOS에 실질적으로 결합하지 않음; (c) 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정에서 T-세포 증식을 증가시킴; (d) MLR 검정에서 인터페론-γ 생산을 증가시킴; (e) MLR 검정에서 IL-2 분비를 증가시킴; (f) 인간 PD-1 및 시노몰구스 원숭이 PD-1에 결합함; (g) PD-1에 대한 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합을 억제함; (h) 항원-특이적 기억 반응을 자극함; (i) 항체 반응을 자극함; 및 (j) 생체내 종양 세포 성장을 억제함. 본 개시내용에 사용가능한 항-PD-1 항체는 인간 PD-1에 특이적으로 결합하고 상기 특징 중 적어도 1개, 일부 측면에서, 적어도 5개를 나타내는 모노클로날 항체를 포함한다.
다른 항-PD-1 모노클로날 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 6,808,710, 7,488,802, 8,168,757 및 8,354,509, 미국 공개 번호 2016/0272708, 및 PCT 공개 번호 WO 2012/145493, WO 2008/156712, WO 2015/112900, WO 2012/145493, WO 2015/112800, WO 2014/206107, WO 2015/35606, WO 2015/085847, WO 2014/179664, WO 2017/020291, WO 2017/020858, WO 2016/197367, WO 2017/024515, WO 2017/025051, WO 2017/123557, WO 2016/106159, WO 2014/194302, WO 2017/040790, WO 2017/133540, WO 2017/132827, WO 2017/024465, WO 2017/025016, WO 2017/106061, WO 2017/19846, WO 2017/024465, WO 2017/025016, WO 2017/132825, 및 WO 2017/133540에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 측면에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙 (옵디보(OPDIVO)®, 5C4, BMS-936558, MDX-1106, 및 ONO-4538로도 공지됨), 펨브롤리주맙 (머크; 키트루다 (KEYTRUDA)®, 람브롤리주맙, 및 MK-3475로도 공지됨; WO2008/156712 참조), PDR001 (노파르티스; WO 2015/112900 참조), MEDI-0680 (아스트라제네카; AMP-514로도 공지됨; WO 2012/145493 참조), 세미플리맙 (레게네론; REGN-2810으로도 공지됨; WO 2015/112800 참조), JS001 (타이조우 준시 파마; 토리팔리맙으로도 공지됨; 문헌 [Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)] 참조), BGB-A317 (베이진; 티셀리주맙으로도 공지됨; WO 2015/35606 및 US 2015/0079109 참조), INCSHR1210 (지앙수 헹루이 메디신; SHR-1210으로도 공지됨; WO 2015/085847; 문헌 [Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)] 참조), TSR-042 (테사로 바이오파마슈티칼; ANB011로도 공지됨; WO2014/179664 참조), GLS-010 (욱시/하르빈 글로리아 파마슈티칼스; WBP3055로도 공지됨; 문헌 [Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)] 참조), AM-0001 (아르모), STI-1110 (소렌토 테라퓨틱스; WO 2014/194302 참조), AGEN2034 (아제누스; WO 2017/040790 참조), MGA012 (마크로제닉스, WO 2017/19846 참조), BCD-100 (바이오카드; 문헌 [Kaplon et al., mAbs 10(2):183-203 (2018)]), 및 IBI308 (이노벤트; WO 2017/024465, WO 2017/025016, WO 2017/132825, 및 WO 2017/133540 참조)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 단백질은 항-PD-L1 항체이다. 관련 기술분야에 공지된 항-PD-L1 항체가 본 개시내용의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 방법에 유용한 항-PD-L1 항체의 예는 미국 특허 번호 9,580,507에 개시된 항체를 포함한다. 미국 특허 번호 9,580,507에 개시된 항-PD-L1 인간 모노클로날 항체는 다음 특징 중 하나 이상을 나타내는 것으로 입증되었다: (a) 비아코어 바이오센서 시스템을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정 시, 1 x 10-7 M 이하의 KD로 인간 PD-L1에 결합함; (b) 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정에서 T-세포 증식을 증가시킴; (c) MLR 검정에서 인터페론-γ 생산을 증가시킴; (d) MLR 검정에서 IL-2 분비를 증가시킴; (e) 항체 반응을 자극함; 및 (f) T 세포 이펙터 세포 및/또는 수지상 세포에 대한 T 조절 세포의 효과를 역전시킴. 본 개시내용에 사용가능한 항-PD-L1 항체는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하고 상기 특징 중 적어도 1개, 일부 측면에서, 적어도 5개를 나타내는 모노클로날 항체를 포함한다.
특정 측면에서, 항-PD-L1 항체는 BMS-936559 (12A4, MDX-1105로도 공지됨; 예를 들어, 미국 특허 번호 7,943,743 및 WO 2013/173223 참조), 아테졸리주맙 (로슈; 테센트릭(TECENTRIQ)®으로도 공지됨; MPDL3280A, RG7446; US 8,217,149 참조; 또한, 문헌 [Herbst et al. (2013) J Clin Oncol 31(suppl):3000] 참조), 두르발루맙 (아스트라제네카; 임핀지(IMFINZI)™, MEDI-4736으로도 공지됨; WO 2011/066389 참조), 아벨루맙 (화이자; 바벤시오(BAVENCIO)®, MSB-0010718C로도 공지됨; WO 2013/079174 참조), STI-1014 (소렌토; WO2013/181634 참조), CX-072 (시톰엑스; WO2016/149201 참조), KN035 (3D 메드/알파맙; 문헌 [Zhang et al., Cell Discov. 7:3 (March 2017)] 참조), LY3300054 (일라이 릴리 컴퍼니; 예를 들어, WO 2017/034916 참조), BGB-A333 (베이진; 문헌 [Desai et al., JCO 36 (15suppl):TPS3113 (2018)] 참조), 및 CK-301 (체크포인트 테라퓨틱스; 문헌 [Gorelik et al., AACR:Abstract 4606 (Apr 2016)] 참조)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 단백질은 항-GITR (글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 패밀리-관련 유전자) 항체이다. 일부 측면에서, 항-GITR 항체는 6C8의 CDR 서열, 예를 들어 WO2006/105021에 기재된 바와 같은 6C8의 CDR을 갖는 인간화 항체; WO2011/028683에 기재된 항-GITR 항체의 CDR을 포함하는 항체; JP2008278814에 기재된 항-GITR 항체의 CDR을 포함하는 항체, WO2015/031667, WO2015/187835, WO2015/184099, WO2016/054638, WO2016/057841, WO2016/057846, WO 2018/013818에 기재된 항-GITR 항체의 CDR을 포함하는 항체, 또는 본원에 기재되거나 언급된 다른 항-GITR 항체를 가지며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 포함된다.
다른 측면에서, 단백질은 항-LAG3 항체이다. LAG-3으로도 공지된 림프구-활성화 유전자 3은 인간에서 LAG3 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. LAG3은 1990년에 발견되었고, T 세포 기능에 대해 다양한 생물학적 효과를 갖는 세포 표면 분자이다. 이는 면역 체크포인트 수용체이고, 따라서 암 및 자가면역 장애에 대한 새로운 치료를 개발하고자 하는 제약 회사에 의한 다양한 약물 개발 프로그램의 표적이다. 가용성 형태로 이는 또한 그 자체로 암 약물로서 개발 중에 있다. 항-LAG3 항체의 예는 WO 2017/087901 A2, WO 2016/028672 A1, WO 2017/106129 A1, WO 2017/198741 A1, US 2017/0097333 A1, US 2017/0290914 A1, 및 US 2017/0267759 A1의 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 포함된다.
일부 측면에서, 단백질은 항-CXCR4 항체이다. CXCR4는 G1에 커플링된 7 막횡단 단백질이다. CXCR4는 조혈 기원의 세포 상에서 광범위하게 발현되고, 인간 면역결핍 바이러스 1 (HIV-1)에 대해 CD4+와 함께 주요 보조-수용체이다 (문헌 [Feng, Y., Broeder, C.C., Kennedy, P. E., and Berger, E. A. (1996) Science 272, 872-877] 참조). 항-CXCR4 항체의 예는 WO 2009/140124 A1, US 2014/0286936 A1, WO 2010/125162 A1, WO 2012/047339 A2, WO 2013/013025 A2, WO 2015/069874 A1, WO 2008/142303 A2, WO 2011/121040 A1, WO 2011/154580 A1, WO 2013/071068 A2, 및 WO 2012/175576 A1의 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 포함된다.
일부 측면에서, 단백질은 항-CD73 (엑토-5'-뉴클레오티다제) 항체이다. 일부 측면에서, 항-CD73 항체는 아데노신의 형성을 억제한다. AMP의 아데노신으로의 분해는 암의 발병 및 진행을 촉진하는 종양 미세환경 내의 면역억제된 및 혈관신생촉진 함요(niche)의 생성을 유발한다. 항-CD73 항체의 예는 WO 2017/100670 A1, WO 2018/013611 A1, WO 2017/152085 A1, 및 WO 2016/075176 A1의 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 포함된다.
일부 측면에서, 단백질은 항-TIGIT (Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체) 항체이다. TIGIT는 이뮤노글로빈 단백질의 PVR (폴리오바이러스 수용체) 패밀리의 구성원이다. TIGIT는 여포성 B 헬퍼 T 세포 (TFH)를 비롯한 여러 부류의 T 세포 상에서 발현된다. 상기 단백질은 높은 친화도로 PVR에 결합하는 것으로 나타났고; 이러한 결합은 TFH와 수지상 세포 사이의 상호작용을 보조하여 T 세포 의존성 B 세포 반응을 조절하는 것으로 생각된다. 항-TIGIT 항체의 예는 WO 2016/028656 A1, WO 2017/030823 A2, WO 2017/053748 A2, WO 2018/033798 A1, WO 2017/059095 A1, 및 WO 2016/011264 A1의 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 포함된다.
일부 측면에서, 단백질은 항-OX40 (즉, CD134) 항체이다. OX40은 종양 괴사 인자 (TNF) 리간드 패밀리의 시토카인이다. OX40은 T 세포 항원-제시 세포 (APC) 상호작용에서 기능하고, 활성화된 T 세포의 내피 세포에 대한 부착을 매개한다. 항-OX40 항체의 예는 WO 2018/031490 A2, WO 2015/153513 A1, WO 2017/021912 A1, WO 2017/050729 A1, WO 2017/096182 A1, WO 2017/134292 A1, WO 2013/038191 A2, WO 2017/096281 A1, WO 2013/028231 A1, WO 2016/057667 A1, WO 2014/148895 A1, WO 2016/200836 A1, WO 2016/100929 A1, WO 2015/153514 A1, WO 2016/002820 A1, 및 WO 2016/200835 A1을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 포함된다.
일부 측면에서, 단백질은 항-IL8 항체이다. IL-8은 호중구, 호염기구 및 T-세포를 유인하지만 단핵구를 유인하지 않는 화학주성 인자이다. 이는 또한 호중구 활성화에 관여한다. 이는 염증성 자극에 반응하여 여러 세포 유형으로부터 방출된다.
일부 측면에서, 단백질은 아바타셉트 (오렌시아(ORENCIA)®로서 시판됨)이다. 아바타셉트 (본원에서 Aba로도 약칭됨)는 T 세포의 면역 활성을 방해함으로써 류마티스 관절염과 같은 자가면역 질환을 치료하는 데 사용되는 약물이다. 아바타셉트는 CTLA-4의 세포외 도메인에 융합된 이뮤노글로불린 IgG1의 Fc 영역으로 구성된 융합 단백질이다. T 세포가 활성화되고 면역 반응을 생성하기 위해, 항원 제시 세포는 T 세포에 2가지 신호를 제시해야 한다. 이들 신호 중 하나는 항원과 조합된 주요 조직적합성 복합체 (MHC)이고, 다른 신호는 CD80 또는 CD86 분자 (B7-1 및 B7-2로도 공지됨)이다.
일부 측면에서, 단백질은 벨라타셉트 (상표명 눌로직스(NULOJIX)®)이다. 벨라타셉트는 T 세포 공동자극의 조절에 결정적인 분자인 CTLA-4의 세포외 도메인에 연결된 인간 IgG1 이뮤노글로불린의 Fc 단편으로 구성된 융합 단백질이며, 이는 T-세포 활성화 과정을 선택적으로 차단한다. 이는 표준 면역 억제 요법, 예컨대 칼시뉴린 억제제에 의해 생성된 독성을 제한하면서 연장된 이식편 및 이식 생존을 제공하는 것으로 의도된다. 이는 아바타셉트 (오렌시아®)와 단지 2개의 아미노산만큼 상이하다.
일부 측면에서, 단백질 혼합물은 항체, 항체 단편, 항원-결합 단편, 융합 단백질, 자연 발생 단백질, 키메라 단백질, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 IgM, IgA, IgE, IgD, 및 IgG로부터 선택된 항체를 포함한다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 항체를 포함하고, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터 선택된 IgG 항체이다. 일부 측면에서, 항체는 이중 가변 도메인 이뮤노글로불린을 포함한다. 일부 측면에서, 항체는 3가 항체를 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 항체 단편은 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA4, 항-TIM3, 항-LAG3, 항-NKG2a, 항-ICOS, 항-CD137, 항-KIR, 항-TGFβ, 항-IL-10, 항-B7-H4, 항-GITR, 항-CXCR4, 항-CD73, 항-TIGIT, 항-OX40, 항-IL-8 항체 또는 그의 항체 단편을 포함한다.
일부 측면에서, 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물은 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포 배양물로부터 유래된다. 일부 측면에서, 포유동물 세포 배양물은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양물이다.
일부 측면에서, 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물은 회분식 세포 배양물로부터 수득된다. 일부 측면에서, 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물은 유가식 세포 배양물로부터 수득된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 생물반응기에서 생산된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 단회-사용 생물반응기에서 생산된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 관류 세포 배양물로부터 수득된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 TFF 관류 생물반응기의 관류에서 생산된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 약 1 내지 약 60일 지속되는 세포 배양물에서 생산된다. 일부 측면에서, 단백질 혼합물은 약 25일 지속되는 세포 배양물에서 생산된다.
IV. 제약 조성물
본 개시내용의 방법에 의해 생산된 단백질은 인간 투여에 적합하도록 추가로 제제화될 수 있다 (예를 들어, 제약 조성물). 제약 투여에 허용되는 조성물, 이러한 조성물은 제약 투여에 허용되는 수준을 초과하지 않는 수준으로 불순물인 물질을 포함할 수 있고 (이러한 수준은 이러한 불순물의 부재를 포함함), 임의의 활성제(들) 외에도, 예를 들어 투여의 용이성을 위해 이러한 조성물을 제제화하는 제약상 허용되는 부형제, 비히클, 담체 및 다른 불활성 성분을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 제조된 조성물은 다양한 질환을 치료하는 데 유용하다.
V. 한외여과 시스템
본 개시내용은 관심 단백질의 여과 공정 시간을 감소시키기 위한 시스템을 제공한다. 본 개시내용은 또한 관심 단백질을 농축시키기 위한 시스템을 제공한다.
일부 측면에서, 관심 단백질을 농축하기 위한 시스템은 공급 탱크, 제1 유체 경로에 의해 공급 탱크에 연결된 저장 탱크; 제2 유체 경로에 의해 저장 탱크에 연결된 여과 막; 및 3-방향 밸브를 포함하고, 여기서 3-방향 밸브는 제3 유체 경로에 의해 여과 막에 연결되고, 3-방향 밸브는 제4 유체 경로에 의해 저장 탱크에 연결되고, 3-방향 밸브는 제5 유체 경로에 의해 공급 탱크에 연결되고, 저장 탱크는 제1 유체 경로를 통해 공급 탱크로부터 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물을 수용하고, 여과 막은 제2 유체 경로를 통해 저장 탱크로부터 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물을 수용하고 단백질 혼합물을 여과하고, 3-방향 밸브는 제3 유체 경로를 통해 필터로부터 보유물을 수용하고 보유물을 제4 유체 경로를 통해 저장 탱크로 또는 제5 유체 경로를 통해 공급 탱크로 보낸다.
일부 측면에서, 3-방향 밸브는 시스템 내의 단백질 혼합물의 총 부피가 저장 탱크의 용량보다 작은 경우에 보유물을 저장 탱크로 보내고, 여기서 3-방향 밸브는 시스템 내의 단백질 혼합물의 총 부피가 저장 탱크의 용량보다 큰 경우에 보유물을 공급 탱크로 보낸다.
일부 측면에서, 시스템은 시스템 내의 단백질 혼합물의 총 부피, 중량, 및/또는 농도를 결정하도록 구성된 센서를 추가로 포함하고, 여기서 3-방향 밸브는 센서로부터의 피드백에 기초하여 보유물을 저장 탱크로 또는 공급 탱크로 자동으로 보낸다. 일부 측면에서, 인-라인 UV-가시광선 분광광도계를 사용하여 단백질 혼합물 중 단백질 농도를 실시간으로 모니터링한다. 일부 측면에서, 수준 센서는 공급 탱크 및 저장 탱크 중 어느 하나 또는 둘 다에서 단백질 용액의 부피를 실시간으로 모니터링하는 데 사용된다. 일부 측면에서, 이들 수준 센서는 유도파 레이더 또는 막-기반 압력 수준 센서를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서, 공급 탱크 및 저장 탱크 중 어느 하나 또는 둘 다에서의 단백질 용액의 부피는 중량측정으로 모니터링되며, 여기서 공급 및/또는 저장 탱크에서의 단백질 용액의 질량은 저울을 사용하여 측정되고, 질량은 용액 밀도를 사용하여 부피로 전환된다. 일부 측면에서, 시스템은 하나 이상의 다이어프램 펌프, 회전 로브 펌프, 또는 연동 펌프를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 필터는 인-라인 여과 막을 포함한다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 한외여과 막이다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 이다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 폴리비닐에테르, 폴리비닐알콜, 나일론, 규소, 폴리실리콘, 울트라나노결정질 다이아몬드, 다이아몬드-유사-탄소, 이산화규소, 티타늄, 실리카, 질화규소, 폴리테트라플루오르에틸렌, 실리콘, 폴리메타크릴레이트, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리카르보네이트, 그래핀, 그래핀 옥시드, 폴리사카라이드, 세라믹 입자, 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 개질된 폴리에테르술폰, 폴리아릴술폰, 폴리페닐 술폰, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 폴리락트산, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리피페라진, 폴리아미드-폴리에테르 블록 중합체, 폴리이미드, 폴리에테르이미드, 폴리아미드, 재생 셀룰로스, 복합 재생 셀룰로스, 또는 그의 조합이다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 폴리에테르술폰이다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 셀룰로스이다. 일부 측면에서, 인-라인 여과 막은 폴리에테르술폰 및 셀룰로스의 조합이다. 일부 측면에서, 여과 막은 약 50 kD 내지 약 5 kD 미만의 분자량 컷오프 (MWCO)를 갖는다. 일부 측면에서, 여과 막은 약 5 kD 미만의 MWCO를 갖는다.
<실시예>
실시예 1
유가식 공정 시간은 다중 시설 적합성 파라미터, 즉 보유물 용기 부피, 시스템 보유 부피, 로드 단백질 농도 및 로드 부피의 함수이다.
로드 물질 부피가 너무 커서 로드가 보유물 용기에 맞지 않는 경우, 로드 물질의 일부는 공급 탱크에 유지되고, 유가식 한외여과 동안 보유물 용기 내로 천천히 공급된다. 보유물 부피가 보유물 용기 내에 전체 단백질 로드 (단백질의 그램)를 함유하기에 충분히 감소한 지점을 교차 농도 (방정식 1)로 지칭한다:
Figure pct00001
여기서 C0 및 V0은 각각 단백질 로드 농도 및 부피이고, Vres는 보유물 용기 부피이고, Vholdup은 시스템 보유 부피이다.
유가식 모드로 단백질을 농축시키는 데 요구되는 공정 시간은 하기 방정식 2c를 사용하여 수적으로 계산될 수 있는 데, 이는 플럭스 방정식 (누적 투과물 부피 V'에 대해 정의된 수학식 2a)을 적분하고, 플럭스에 대한 농도 분극 모델 (방정식 2b)을 가정함으로써 유도되었다. 방정식 2c에서 적분 한계 Vperm,final은 교차 농도에서 예상된 투과물 부피이다. 유가식 작동에서 단백질 농도는 방정식 3에 의해 누적 투과물 부피 V'의 함수로서 정의될 수 있고, 여기서 Vres는 보유물 용기의 충전된 부피이고, 이는 유가식 로딩 동안 일정하게 유지된다. Vperm,final은 따라서 교차 단백질 농도 (방정식 1)를 사용하여 V'에 대한 방정식 3을 풀어 계산할 수 있다.
Figure pct00002
이들 방정식으로부터, 유가식 공정 시간은 다중 시설 맞춤 파라미터, 즉 보유물 용기 부피, 시스템 보유 부피, 로드 단백질 농도 및 로드 부피의 함수임이 명백하다.
실시예 2
전통적인 유가식 TFF 구성은 도 1a에 나타나 있다. 여기서, 로드 물질을 보유하는 공급 탱크는 공급 펌프에 의해 보유물 용기 (예를 들어, 저장소)에 연결되고, 보유물 용기는 TFF 막 장치 및 재순환 펌프를 갖는 재순환 루프에 개별적으로 혼입된다.
본원에 기재된 유사-회분식 구성에서, 유동 경로는 도 1b에 나타낸 바와 같이 공급 탱크를 재순환 루프에 혼입하도록 변형된다. 하기에 설명되는 바와 같이, 3-방향 밸브를 TFF 필터 모듈의 보유물 포트 뒤에 위치시켜 제1 한외여과 단계의 상태에 따라 보유물 유동을 공급 탱크 또는 보유물 용기로 보낸다. 혼합기 (나타내지 않음)가 탱크/용기 둘 다에 사용된다.
제1 한외여과 단계의 초기 로딩 단계 동안, 3-방향 밸브는 보유물 유동을 로드 탱크로 보내고 보유물 용기로의 유동을 차단하도록 설정된다. 로드 물질은 일반적으로 공급 펌프에 의해 공급 탱크로부터 보유물 용기로 공급되지만, TFF 필터 모듈로부터의 보유물은 공급 탱크로 복귀되고 대신에 나머지 로드 물질과 혼합된다. 새로운 로드 물질은 이제 약간 더 농축되고, 보유물 용기에 공급되고, 사이클이 반복된다. 따라서, 로드 물질이 초기 묽은 농도에서 고정된 채로 유지되면서 보유물이 점점 더 농축되는 유가식 로딩과 달리, 로드 탱크 및 보유물 용기 둘 다 내의 단백질 용액은 동일한 속도로 농축된다. 이 구성에서, 공급 탱크는 보유물 용기의 연장으로서 효과적으로 작용하고, 둘은 회분식 설정과 유사하게 재순환 루프에서 단일 저장소로서 작용한다 (도 1c). 따라서, 유사-회분식 구성은 다른 하이브리드-모드 공정을 회분식-유사 공정으로 전환시켜, 제1 한외여과 단계의 유가식 로딩 부분에 대한 시간 페널티 뿐만 아니라 공정 시간의 설비 피트 의존성을 완화시킨다.
로딩 단계가 완료되었을 때 (예를 들어, 총 단백질 용액 부피가 보유물 용기 부피 미만으로 감소되었을 때), 3-방향 밸브는 보유물 유동을 보유물 용기로 다시 보내고 공급 탱크로의 유동을 차단하여, 재순환 루프로부터 공급 탱크를 효과적으로 제거하고 TFF 설정을 진정한 회분식 구성으로 전환시키도록 작동된다. 2개의 용기 사이의 연결 배관 내의 잔류 물질의 (보유물 용기 내로의) 공기 추적을 수행하기 위해 공급 펌프를 약간 더 오래 작동하여 로드 물질의 회수를 최대화할 수 있다.
상기 기재된 유사-회분식 구성의 이점을 입증하기 위한 개념 증명으로서, mAb A의 고농도 용액 (~180 g/L)을 회분식, 하이브리드 및 유사-회분식 구성에서 실험실 규모로 수행된 TFF에 의해 생성하였다. 각각의 여과 단계 (제1 한외여과 (UF1), 투석여과 (DF) 및 제2 한외여과 (UF2))에 대한 공정 시간 뿐만 아니라 회수후 정제된 약물 물질 (PDS)의 품질 속성 (예를 들어, 고분자량 (HMW) 종, 입자 수)을 3가지 구성 사이에서 비교하였다. 모델 2487 이중 파장 검출기 (워터스 코포레이션(Waters Corporation), 미국 매사추세츠주 밀포드) 및 TSK겔 슈퍼SW3000 주요 및 가드 칼럼 (도소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience), 미국 펜실베니아주 킹 오브 프러시아)이 장착된 얼라이언스 2695 HPLC 시스템을 사용하여 고성능 액체 크기 배제 크로마토그래피에 의해 HMW 수준을 측정한 한편, 1 내지 100 μm의 미립자에 대한 입자 수를 MFI 5200 (프로테인 심플(Protein Simple), 미국 캘리포니아주 산호세)을 사용하여 마이크로-플로우 영상화에 의해 정량화하였다. PDS 탁도를 하크(Hach) 2100Q 탁도계를 사용하여 삼중으로 측정하였고, 이는 사용 전에 매일 보정되었다.
콰트로플로우 150 펌프 (하이 퓨리티 뉴 잉글랜드(High Purity New England), 미국 로드아일랜드주 스미스필드) 및 88 cm2 30 kDa 울트라셀 펠리콘 3 D-스크린 막 (밀리포어시그마(MilliporeSigma), 미국 매사추세츠주 벌링턴)이 장착된 펜도테크(PendoTECH) 제어 및 데이터 획득 시스템 (펜도테크, 미국 뉴저지주 프린스턴)을 사용하여 TFF 실험을 수행하였다. 정제된 10 g/L mAb 용액의 단일 배치를 별개의 분취물로 분할하여 3가지 실행에 대해 동일한 로드 물질을 생성하였으며, 여기서 분취물 부피는 대략 600 g/m2의 막 로딩을 달성하도록 규정되었다. 유사-회분식 및 하이브리드 구성 둘 다에 대해, 보유물 용기 + 시스템 보유 부피에 대한 초기 로드 부피의 부피 비를 5로 설정하였다. 각각의 실행에 대해, mAb를 제1 한외여과 단계 동안 50 g/L로 농축시킨 후, 5 투석부피의 투석여과 완충제로 완충제 교환하였다. 이어서, 투석여과된 단백질 용액을 제2 한외여과 단계에서 180 g/L (보유물 및 투과물 질량으로부터 중량측정에 의해 결정되고, 고농도에서 용액 밀도의 변화를 설명함)로 추가로 농축시켰다. 이어서, 완충제를 사용하여 유지 부피로부터 잔류 단백질 용액을 체이싱하여 약물 물질을 회수하였으며, 여기서 사용된 체이싱 완충제의 부피는 시스템 유지 부피의 1.2배였다.
실시예 3
A. 공정 시간
공정 시간의 함수로서 대략적인 보유물 mAb 농도 (시스템 내 단백질의 보유물 부피 및 총 질량으로부터 계산됨)를 도 2a에서 3가지 구성에 대해 나타낸다. 공정의 각각의 단계 (UF1, DF 및 UF2)에 대한 상응하는 공정 시간을 도 2b에 나타낸다. 3가지 실행에 대해 관찰된 상응하는 투과 플럭스를 도 3에서 나타낸다.
도 2b에 나타낸 바와 같이, 하이브리드 (유가식 로딩) 실행의 UF1 단계를 위한 공정 시간은 회분식 실행의 경우보다 60% 더 길었다. 로딩 단계 (UF1의 초기 부분) 동안의 투과 플럭스는 유가식 전략의 사용 시 보다 낮은 것으로 관찰되었으며 (도 3), 이는 또한 하이브리드 실행의 보다 긴 UF1 공정 시간에 기여했을 가능성이 있다. 대조적으로, 유사-회분식 실행에 대한 UF1 공정 시간 (도 2b) 및 투과 플럭스 (도 3) 둘 다는 회분식 실행과 거의 동일하였다. 놀랍게도, DF 및 UF2 단계는 로딩 (UF1) 단계 동안의 시스템 구성과 무관하게 반드시 회분식 구성으로 수행되기 때문에, 투석여과 및 UF2 공정 시간은 3가지 실행 모두에서 거의 동일하였다 (도 2b). 3가지 실행 간 투석여과 공정 시간의 작은 차이는 투석여과 단계 동안의 단백질 농도의 약간의 가변성 (49 - 51 g/L)으로 인한 것이었다. 이들 결과는 총 공정 시간에 대한 초기 샘플 로딩 (UF1) 단계 동안의 시스템 구성의 영향을 설명하고, UF1 단계 동안의 유가식 로딩과 연관된 시간 페널티를 완화시킬 뿐만 아니라 하이브리드 (유가식 로딩) 공정과 연관된 공정 시간 확장성 문제를 제거하는 유사-회분식 구성의 능력을 입증한다.
B. 품질 속성
단백질 용액이 이제 매 재순환 사이클에서 1회 대신 2회 펌프 통과를 겪으므로, 약물 물질 품질 속성에 대한 유사-회분식 구성의 영향을 평가하여 제2 펌프 (예를 들어, 공급 펌프)의 재순환 루프 내로의 혼입이 유해 효과를 갖는지 여부를 결정하였다.
mAb A는 UF/DF 동안 가용성 고분자량 (HMW) 종의 형성과 관련하여 펌프 전단 노출에 비감수성인 것으로 밝혀졌다. HMW 수준은 모든 3가지 구성 전략에 대해 전체 공정 전반에 걸쳐 본질적으로 변하지 않고 유지되었다 (도 4). 따라서, 유사-회분식 구성과 연관된 증가된 펌프 전단 노출은 HMW 형성에 대해 유해 효과를 갖는 것으로 보이지 않았다.
보다 큰 불용성 응집체에 대한 유사-회분식 구성의 영향을 마이크로유체 영상화 (MFI)에 의해 정량화하였다. 3가지 구성을 사용하여 생성된 공정중 풀에 대한 육안으로 보이지 않는 (1 - 100 μm) 입자 수를 도 5a-d에 나타낸다. HMW 형성에 대해 관찰된 것과 달리, mAb A는 시간 경과에 따라 육안으로 보이지 않는 입자 형성의 유의한 증가를 나타냈으며, 여기서 입자의 총 수 및 상대 입자 크기 분포 둘 다는 구성 간에 현저하게 상이하였다.
하이브리드 실행은 일관되게 모든 입자 크기 범위에 대해 회분식 실행보다 더 높은 입자 수를 가졌고, 이는 더 긴 공정 시간 및 상응하는 전단 및 계면 응력에 대한 단백질의 증가된 노출과 일치한다. 대조적으로, 유사-회분식 실행은 50 - 100 μm 크기 범위 (도 5d)를 제외하고는, 1 - 25 μm 크기 범위 (도 5a-c)에서 회분식 실행과 대등하거나 더 적은 양의 입자를 생성하였다. 50-100 μm 크기 범위에 대한 더 높은 입자 수는 다른 2가지 로딩 전략과 비교하여 이중 펌프 통과의 결과로서 UF1 단계 동안 생성되는 (미검출) 응집체 전구체의 증가된 수준에 의해 잠재적으로 야기될 수 있다. 그러나, 50 - 100 μm 크기 범위에 대한 총 입자 수는 더 작은 입자 크기 범위에 대한 입자 수보다 여러 자릿수 더 작음을 주목하는 것이 중요하다. 전체 입자 생성의 관점에서, 유사-회분식 구성은 유가식 구성에 비해 현저한 개선이고, 회분식 구성에 필적하는 품질의 약물 물질을 생성하는 것으로 보인다.
UF2 단계가 전체 공정의 가장 짧은 부분이라는 사실에도 불구하고 (도 2b), 3가지 구성 사이의 입자 수의 가장 큰 차이가 DV5와 UF2 후 사이에 발생한다는 것을 주목하는 것은 흥미롭다. 모든 3가지 구성이 DF 및 UF2 단계 둘 다에 대해 동일한 공정 시간 및 설정을 갖는다는 것을 고려하면, 이들 결과는 SEC/MFI에 의해 검출될 수 없지만 최종 약물 물질의 품질에 영향을 미치는 응집 전구체를 생성하는 데 있어서 UF1 단계의 중요성을 입증한다.
실시예 4
공급 펌프의 유형이 유사-회분식 공정에 영향을 미치는지를 결정하기 위해, 다이어프램 공급 펌프를 연동 공급 펌프로 대체하였다. 실시예 3에서의 유사-회분식 실행과 동일한 공정 파라미터 (예를 들어, 막 로딩, 로드 농도, 투석여과 농도, 교환된 투석부피, 펌프 공급 플럭스, 및 TMP)로 유사-회분식 로딩 구성을 사용하여 mAb A의 ~180 g/L 용액을 생성하였다. 보유물 탱크 부피에 대한 초기 로드 부피의 부피 비는 실시예 3에서와 같이 5로 유지되었다 (즉, 로딩 단계 동안 보유물 탱크 내의 액체 부피는 초기 총 로드 부피의 20%와 동일한 일정한 값으로 유지됨). 이 실행의 공정 성능을 다이어프램 공급 펌프를 사용하는 유사-회분식 실행에 대한 것과 비교하였다.
공정 시간의 함수로서 대략적인 보유물 mAb 농도 (시스템 내 단백질의 보유물 부피 및 총 질량으로부터 계산됨)를 도 6a에서 2가지 유사-회분식 실행에 대해 나타낸다. 공정의 각각의 단계 (UF1, DF 및 UF2)에 대한 상응하는 공정 시간을 도 6b에 나타낸다. 계산된 보유물 농도의 함수로서 투과 플럭스를 도 7에 나타낸다. 2가지 실행에 대한 플럭스 프로파일 및 또한 공정 시간은 UF/DF 공정의 각각의 단계에 대해 거의 동일하며, 이는 공급 펌프를 위한 연동 또는 다이어프램 펌프의 선택이 공정 처리량과 관련하여 유사-회분식 로딩 방법의 성능에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
약물 물질 품질 속성을 또한 평가하여 유사-회분식 구성의 공급 펌프 유형이 UF/DF 공정 동안 단백질 안정성에 유의하게 영향을 미치는지 여부를 결정하였으며, 이는 유사-회분식 방법의 일반적인 실행성에 있어서 결정 인자일 수 있다. 도 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 연동 공급 펌프의 사용은 다이어프램 공급 펌프와 비교하여 (검정 가변성 내에서) UF/DF 동안 HMW 형성의 어떠한 증가도 유발하지 않았다. 따라서, 다이어프램 공급 펌프에 비해 연동 공급 펌프의 사용과 연관된 전단 노출에서의 차이는 HMW 형성에 대해 불리한 효과를 갖는 것으로 보이지 않았다.
보다 큰 불용성 응집체에 대한 공급 펌프 유형의 영향을 마이크로유체 영상화 (MFI)에 의해 정량화하였다. 공급 펌프 유형들을 사용하여 생성된 공정중 풀에 대한 육안으로 보이지 않는 (1 - 100 μm) 입자 수를 도 9a-9d에 나타낸다. HMW 형성에 대해 관찰된 것과 달리, 입자의 총 수 및 상대 입자 크기 분포 둘 다는 펌프 유형 긴에 현저하게 상이하였다. 연동 공급 펌프는 다이어프램 펌프와 비교하여 유의하게 더 작은 입자 (< 25 μm) 및 더 적은 큰 입자 (> 50 μm)의 생성을 유도하였다. 이 프로파일은 단백질 용액이 공급 펌프를 통해 순환할 때 연동 펌프가 더 높은 전단 또는 더 난류 체제를 발생시키고, 이는 더 큰 미립자를 불안정화하고 더 작은 미립자의 비교적 더 높은 집단을 생성한다는 것을 시사한다. 그러나, 미립자 크기 분포의 차이는 상기 기재된 바와 같이 막 플럭스 또는 공정 처리량에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다. 이들 미립자는 UF/DF 단계 후 최종 제제화 및 여과 단계 동안 제거되기 때문에, 2가지 펌프 유형 사이의 미립자 생성에서의 차이는 따라서 최종 제품 품질에 대한 우려가 아닐 것이다.
실시예 5
로딩 단계 동안 보유물 대 총 로드 부피 비가 유사-회분식 성능에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, 로딩 단계 동안 보유물 탱크 내의 액체 부피를 총 로드 부피에 비해 더 낮은 부피로 일정하게 유지하였다. 실시예 4에 기재된 UF/DF 공정 파라미터 및 구성 (연동 공급 펌프)을 사용하는 유사-회분식 로딩 방법을 사용하여 mAb A의 ~180 g/L 용액을 생성하였다. 그러나, 보유물 탱크 내의 액체 부피는 실시예 4에서와 같이 20% 대신에 UF1 단계의 로딩 부분 동안 총 초기 로드 부피의 10%로 유지하였다. 이 실행의 공정 성능을 보유물 탱크 부피가 로딩 단계 동안 총 초기 로드 부피의 20%로 유지되는 유사-회분식 실행에 대한 것과 비교하였다.
공정 시간의 함수로서 대략적인 보유물 mAb 농도 (시스템 내 단백질의 보유물 부피 및 총 질량으로부터 계산됨)를 도 10a에서 2가지 유사-회분식 실행에 대해 나타낸다. 공정의 각각의 단계 (UF1, DF 및 UF2)에 대한 상응하는 공정 시간을 도 10b에 나타낸다. 계산된 보유물 농도의 함수로서 투과 플럭스를 도 11에 나타낸다. 2가지 실행에 대한 플럭스 프로파일 및 또한 UF1 및 UF2 공정 시간은 거의 동일하며, 이는 로딩 단계 동안 보유물 탱크 대 총 로드 부피 비가 단백질을 농축시키는 데 요구되는 공정 시간에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 투석여과 시간의 작은 차이는 50 g/L의 목표 값 부근에서의 실제 투석여과 농도의 경미한 변동으로 인한 것일 수 있다. 이러한 결과는, 실시예 1에서 이전에 설명된 바와 같이, UF1 공정 시간이 보유물 탱크 및 총 로드 부피의 상대 부피 비에 따라 달라지는 유가식 작업과는 다르다. 실시예 4 및 5에서 로딩 단계 동안 상대적 보유물 및 로드 부피 비에 대한 UF1 공정 시간의 독립성은 유사-회분식 방법의 지배 원리와 일치하며, 여기서 UF/DF 재순환 루프에서의 공급 탱크 및 보유물 탱크의 연결은 이들이 단일 저장소로서 효과적으로 기능하고 로딩 단계를 회분식 공정으로 전환시키는 것을 가능하게 한다.
약물 물질 품질 속성을 또한 평가하여 로딩 단계 동안 보유물 대 총 로드 부피 비가 UF/DF 공정 동안 단백질 안정성에 영향을 미치는지 여부를 결정하였다. 도 12로부터 알 수 있는 바와 같이, 보유물 부피가 초기 로드 부피의 10%로 유지된 경우에 수행된 실행은 20%의 부피 비로 수행된 실행과 동일한 HMW 수준을 가졌다. 유사하게, MFI에 의해 정량화된 바와 같은 UF2 후 용액의 입자 크기 분포 (1 - 100 μm)는 도 13a 내지 도 13d에 나타낸 바와 같이 2가지 실행 사이에서 거의 동일하였다. 2가지 실행 사이의 HMW 및 큰 입자 프로파일의 유사성은 동일한 UF1 공정 시간 (도 10b) 및 공정 시간의 함수로서 농도 프로파일 (도 10a)에 부분적으로 기인할 수 있으며, 이는 단백질이 결과적으로 2가지 실행 간에 동일한 펌프 통과의 수 및 기타 응력 인자를 겪기 때문이다.
실시예 6
유사-회분식 방법을 비-mAb 치료 단백질 (MW = ~20 Da)에 대해 수행하였으며, 이를 로드 물질로서 사용하였다. 단백질을 전통적인 유가식 방법 뿐만 아니라 유사-회분식 방법을 사용하여 0.7 내지 15.5 g/L로 농축시켰다. 이들 2가지 실행 동안 완충제 교환은 수행하지 않았다. 모든 다른 공정 파라미터 (막 로딩, 펌프 공급 플럭스, TMP)를 2가지 실행 간에 일정하게 유지하였다. 보유물 탱크 내의 액체 부피를 2가지 실행에 대해 로딩 단계 전반에 걸쳐 총 초기 로드 부피의 30%와 동일한 값으로 일정하게 유지하고, 연동 펌프를 공급 펌프로서 사용하였다.
공정 시간의 함수로서 대략적인 보유물 단백질 농도 (시스템 내 단백질의 보유물 부피 및 총 질량으로부터 계산됨)를 도 14에서 2가지 실행에 대해 나타낸다. 상응하는 공정 시간은 유가식 실행의 경우 3.0시간 및 유사-회분식 실행의 경우 2.9시간이었다. 계산된 보유물 농도의 함수로서 투과 플럭스를 도 15에 나타낸다. 플럭스 대 농도 프로파일은 동일하며, 이는 로딩 방법의 차이가 고유 막 성능에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내고, 이전 실시예로부터의 관찰과 일치한다. 본 실시예에서, 공정의 로딩 단계는 매우 작고 묽은 농도 범위 (0.7 - 2 g/L)에 걸쳐 발생하여, 이러한 농도 범위에 걸친 플럭스 붕괴는 본질적으로 무시할만하고, 이는 로딩 단계 동안 거의 동일한 평균 투과 플럭스 및 결과적으로 2가지 실행 사이의 유사한 공정 시간을 초래한다. 그러나, 유사-회분식 로딩 전략은 유가식 로딩 방법과 비교하여 공정 시간을 감소시키는 이점을 여전히 제공하지만, 이 경우에 로딩 단계가 일어나는 초저농도 범위로 인해 차이는 매우 작다 (~0.1시간).
약물 물질 품질 속성을 또한 평가하여 유사-회분식 로딩 전략이 단백질이 경험하는 펌프 통과의 수의 증가의 결과로서 UF/DF 동안 비-mAb 단백질의 안정성에 불리한 영향을 미치는지 여부를 결정하였다. 도 16으로부터 알 수 있는 바와 같이, 유사-회분식 및 유가식 방법은 대등한 양의 HMW 종을 생성하였다. 그러나, 두 방법은 MFI에 의해 특징화되는 바와 같이, UF/DF 동안 형성된 보다 큰 입자의 양 및 상대 크기 분포가 상이하였다. 도 17a 내지 도 17d에서 알 수 있는 바와 같이, 유사-회분식 로딩 방법은 보다 작은 입자 (< 25 μm)를 생성하지만 유가식 방법과 대등한 양의 보다 큰 입자 (>50 μm)를 생성한다. 이러한 결과는 실시예 3 내지 5에서 mAb A에 대해 나타난 것과 일치한다. 유사-회분식 로딩 방법에 고유한 추가의 펌프 통과의 수는 보다 작은 미립자의 형성의 증가을 유발하지만, 보다 큰 미립자에 대해서는 그렇지 않다. 제조 생물공정은 전형적으로 UF/DF 단계 후에 최종 제제화 및 여과 단계를 함유하기 때문에, 이들 미립자는 최종 약물 물질로부터 제거될 것으로 예상된다. 따라서, 유사-회분식 방법에 의해 유발된 작은 입자의 증가된 형성은 최종 약물 제품의 품질에 불리한 영향을 미칠 것으로 예상되지 않는다.
본원에 기재된 UF/DF를 위한 유사-회분식 구성은 유가식 설정 (공급 탱크 및 보유물 용기를 사용함)을 회분식-유사 작업 (TFF 재순환 루프에서 단일 용기로서 작용하는 방식으로 2개의 용기를 연결함)으로 전환시킴으로써 유가식 로딩과 연관된 시간 페널티를 완화시킬 수 있다. 이러한 전환은 또한 하이브리드 공정 (예를 들어, 유가식 로딩 + 회분식 농도)과 관련된 공정 시간의 규모-의존성을 제거하여, 공정을 완전히 확장가능하게 한다. 또한, 회분식 구성과 비교하여 2배의 펌프 통과를 유발하는, 재순환 루프 내로의 공급 펌프의 포함은 HMW 형성 및 육안으로 보이지 않는 입자 수에 의해 정량화된 바와 같이 제품 품질에 대한 어떠한 현저한 유해 효과도 유발하지 않았다.
생물제약 산업이 약물 전달을 위한 피하 포맷으로 점점 더 이동함에 따라 하이브리드 UF/DF 공정은 고농도 약물 물질의 생성을 위해 반드시 더욱 보편화될 것이다. 본원에 기재된 유사-회분식 구성은 유가식 로딩과 연관된 시간 페널티를 감소시키고, 하이브리드 공정으로부터 초래된 공정 시간의 규모 의존성을 제거하고, 하이브리드 공정과 비교하여 제품 품질을 잠재적으로 개선시키기 위해 대신 사용될 수 있다. 종합하면, 이들 이점은 공정 처리량 및 수율을 개선시킬 수 있을 뿐만 아니라, 실험실/개발 규모에서 제조 규모로의 보다 간소화된 기술 전달을 위한 UF/DF 공정의 확장성을 개선시킬 수 있다.
상기 구체적 측면의 기재는 본 발명의 일반적 성질을 충분히 밝힐 것이며, 다른 사람들은 관련 기술분야의 기술 내의 지식을 적용함으로써 과도한 실험 없이도 본 발명의 일반적 개념으로부터 벗어나지 않으면서 이러한 구체적 측면을 다양한 적용에 대해 용이하게 변형 및/또는 적합화할 수 있다. 따라서, 이러한 적합화 및 변형은 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 개시된 측면의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본원의 어구 또는 용어는 제한이 아니라 설명을 목적으로 하며, 따라서 본 명세서의 용어 또는 어구는 교시 및 지침에 비추어 통상의 기술자에 의해 해석되어야 한다는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 개시된 본 발명의 명세서 및 실시를 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되며, 본 발명의 진정한 범주 및 취지는 하기 청구범위에 의해 명시되는 것으로 의도된다.

Claims (70)

  1. 적어도 1회 여과된 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물 ("보유물")을 공급 탱크에 연속적으로 로딩하는 것을 포함하며, 여기서 공급 탱크는 주 저장 ("보유물") 탱크로부터 분리된 것인, 관심 단백질의 여과 공정 시간을 감소시키는 방법.
  2. 적어도 1회 여과된 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물 ("보유물")을 공급 탱크에 연속적으로 로딩하는 것을 포함하며, 여기서 공급 탱크는 주 저장 ("보유물") 탱크로부터 분리된 것인, 관심 단백질을 농축시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 공급 탱크가 적어도 1회 여과되지 않은 관심 단백질을 포함하는 초기 단백질 혼합물을 추가로 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 초기 단백질 혼합물 및 보유물을 함께 혼합하는 것인 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 단백질 혼합물 및/또는 보유물을 필터를 통해 여과하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 여과된 단백질 혼합물 및 보유물 ("보유물")이 공급 탱크에 로딩되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩이, 관심 단백질이 적어도 약 1 mg/mL, 적어도 약 10 mg/mL, 적어도 약 20 mg/mL, 적어도 약 30 mg/mL, 적어도 약 40 mg/mL, 적어도 약 50 mg/mL, 적어도 약 60 mg/mL, 적어도 약 70 mg/mL, 또는 적어도 약 80 mg/mL로 농축될 때까지 계속되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩이, 관심 단백질이 약 1 mg/mL 내지 80 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 70 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 60 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 50 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 40 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 30 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 20 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 70 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 60 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 50 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 40 mg/mL, 또는 약 20 mg/mL 내지 30 mg/mL로 농축될 때까지 계속되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 보유물의 로딩이 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 적어도 10회, 적어도 20회, 적어도 30회, 적어도 40회, 적어도 50회, 적어도 60회, 적어도 70회, 적어도 80회, 적어도 90회, 적어도 100회, 적어도 110회, 적어도 120회, 적어도 130회, 적어도 140회, 적어도 150회, 적어도 160회, 적어도 170회, 적어도 180회, 적어도 190회, 적어도 200회, 적어도 210회, 적어도 220회, 적어도 230회, 적어도 240회, 적어도 250회, 적어도 260회, 적어도 270회, 적어도 280회, 적어도 290회, 또는 적어도 300회 반복되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 공급 탱크로의 보유물의 로딩을 중단하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 보유물을 저장 탱크로 보내는 것을 추가로 포함하는 방법.
  12. 공급 탱크, 저장 탱크, 필터, 필터를 공급 탱크에 연결하는 공급 탱크 밸브 및 필터를 저장 탱크에 연결하는 저장 탱크 밸브를 포함하는 3방향 밸브, 및 공급 탱크와 저장 탱크를 연결하는 저장 주입구를 포함하는 여과 시스템에 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물을 로딩하는 것을 포함하는, 관심 단백질의 여과 공정 시간을 감소시키는 방법.
  13. 공급 탱크, 저장 탱크, 필터, 필터를 공급 탱크에 연결하는 공급 탱크 밸브 및 필터를 저장 탱크에 연결하는 저장 탱크 밸브를 포함하는 3방향 밸브, 및 공급 탱크와 저장 탱크를 연결하는 저장 주입구를 포함하는 여과 시스템에 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물을 로딩하는 것을 포함하는, 관심 단백질을 농축시키는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 저장 탱크 밸브가 관심 단백질이 충분히 농축될 때까지 폐쇄되는 것인 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 혼합물을 공급 탱크에 연속적으로 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 혼합물을 공급 탱크에서 저장 탱크로 보내는 것인 방법.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 저장 탱크가 필터에 연결된 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 필터가 인-라인 여과 막을 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 인-라인 여과 막이 한외여과 막인 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 인-라인 여과 막이 폴리비닐에테르, 폴리비닐알콜, 나일론, 규소, 폴리실리콘, 울트라나노결정질 다이아몬드, 다이아몬드-유사-탄소, 이산화규소, 티타늄, 실리카, 질화규소, 폴리테트라플루오르에틸렌, 실리콘, 폴리메타크릴레이트, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리카르보네이트, 그래핀, 그래핀 옥시드, 폴리사카라이드, 세라믹 입자, 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 개질된 폴리에테르술폰, 폴리아릴술폰, 폴리페닐 술폰, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 폴리락트산, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리피페라진, 폴리아미드-폴리에테르 블록 중합체, 폴리이미드, 폴리에테르이미드, 폴리아미드, 재생 셀룰로스, 복합 재생 셀룰로스, 또는 그의 조합인 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 여과 막이 약 50 kD 내지 약 5 kD, 약 50 kD, 약 40 kD, 약 30 kD, 약 20 kD, 약 10 kD, 또는 약 5 kD 미만의 분자량 컷오프 (MWCO)를 갖는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, MWCO가 약 5 kD 미만인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물을 목적하는 여과된 단백질 농도에 도달할 때까지 유동하게 하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 목적하는 여과된 단백질 농도가 약 10 mg/mL 내지 약 300 mg/mL, 예를 들어 약 10 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 100 mg/mL, 약 110 mg/mL, 약 120 mg/mL, 약 130 mg/mL, 약 140 mg/mL, 약 150 mg/mL, 약 160 mg/mL, 약 170 mg/mL, 약 180 mg/mL, 약 190 mg/mL, 약 200 mg/mL, 약 250 mg/mL, 또는 약 300 mg/mL인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 목적하는 여과된 단백질 농도가 약 150 mg/mL인 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 점도가 약 0 cP 내지 약 200 cP인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 단백질 점도가 약 20 cP 내지 약 60 cP인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 공급 탱크의 부피와 저장소의 부피 사이의 부피 비가 약 1:2 내지 약 10:1, 약 1:2 내지 약 1:1, 약 1:1 내지 약 1:2, 약 1:1 내지 약 1:3, 약 1:1 내지 약 1:4, 약 1:1 내지 약 1:5, 약 1:1 내지 약 1:6, 약 1:1 내지 약 1:7, 약 1:1 내지 약 1:8, 약 1:1 내지 약 1:9, 또는 약 1:1 내지 약 1:10인 방법.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 공급 탱크의 부피와 저장소의 부피 사이의 부피 비가 약 1:1, 약 2:1, 또는 약 5:1인 방법.
  30. 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 혼합물이 다이어프램 펌프, 회전 로브 펌프, 또는 연동 펌프를 사용하여 저장 탱크 및/또는 필터로 보내지는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1회 여과된 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물 ("보유물")을 공급 탱크에 연속적으로 로딩하기 전에 적어도 1회 여과되지 않은 관심 단백질을 포함하는 초기 단백질 혼합물을 공급 탱크에 로딩하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 초기 단백질 혼합물이 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL의 농도로 공급 탱크에 첨가되는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 초기 단백질 혼합물이 약 5 mg/mL의 농도로 공급 탱크에 첨가되는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 시간이 유가식 농축 공정의 공정 시간과 비교하여 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 감소되는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 공정 시간이 유가식 농축 공정의 공정 시간과 비교하여 약 40% 감소되는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 시간이 유가식 농축 공정의 공정 시간과 비교하여 약 0.2시간, 약 0.4시간, 약 0.5시간, 약 0.6시간, 약 0.8시간, 또는 약 1.0시간 감소되는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 공정 시간이 유가식 농축 공정의 공정 시간과 비교하여 약 0.5시간 감소되는 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 1-2 μm 미립자 수가 유가식 농축 공정의 미립자 수와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 감소되는 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 5-10 μm 미립자 수가 유가식 농축 공정의 미립자 수와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 감소되는 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 10-25 μm 미립자 수가 유가식 농축 공정의 미립자 수와 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 또는 약 50% 감소되는 것인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 혼합물이 항체, 항체 단편, 항원-결합 단편, 융합 단백질, 자연 발생 단백질, 키메라 단백질, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 단백질 혼합물이 IgM, IgA, IgE, IgD 및 IgG로부터 선택된 항체를 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 단백질 혼합물이 항체를 포함하고, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터 선택된 IgG 항체인 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 이중 가변 도메인 이뮤노글로불린을 포함하는 것인 방법.
  45. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 3가 항체를 포함하는 것인 방법.
  46. 제41항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-CTLA4, 항-TIM3, 항-LAG3, 항-NKG2a, 항-ICOS, 항-CD137, 항-KIR, 항-TGFβ, 항-IL-10, 항-B7-H4, 항-GITR, 항-CXCR4, 항-CD73, 항-TIGIT, 항-OX40, 항-IL-8 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는 것인 방법.
  47. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 혼합물이 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포 배양물로부터 유래된 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 포유동물 세포 배양물이 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양물인 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 혼합물이 회분식 세포 배양물로부터 수득된 것인 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 혼합물이 유가식 세포 배양물로부터 수득된 것인 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 혼합물이 생물반응기에서 생산된 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 단백질 혼합물이 단회-사용 생물반응기에서 생산된 것인 방법.
  53. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 혼합물이 관류 세포 배양물로부터 수득된 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 단백질 혼합물이 관류 또는 TFF 관류 생물반응기에서 생산된 것인 방법.
  55. 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 혼합물이 약 1 내지 약 60일 지속되는 세포 배양물에서 생산된 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 단백질 혼합물이 약 25일 지속되는 세포 배양물에서 생산된 것인 방법.
  57. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 혼합물을 로딩 완충제와 함께 공급 탱크에 첨가하는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 로딩 완충제가 아미노산, 약산, 약염기 및/또는 당을 포함하는 것인 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질을 제약 조성물로 제제화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 단백질.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항의 단백질을 포함하는 제약 조성물.
  62. 제61항의 제약 조성물을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법.
  63. 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제61항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법.
  64. 관심 단백질을 농축시키기 위한 시스템으로서,
    공급 탱크;
    제1 유체 경로에 의해 공급 탱크에 연결된 저장 탱크;
    제2 유체 경로에 의해 저장 탱크에 연결된 여과 막; 및
    3-방향 밸브로서, 여기서 3-방향 밸브는 제3 유체 경로에 의해 여과 막에 연결되고, 3-방향 밸브는 제4 유체 경로에 의해 저장 탱크에 연결되고, 3-방향 밸브는 제5 유체 경로에 의해 공급 탱크에 연결된 것인 3-방향 밸브
    를 포함하고,
    여기서 저장 탱크는 제1 유체 경로를 통해 공급 탱크로부터 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물을 수용하고,
    여기서 여과 막은 제2 유체 경로를 통해 저장 탱크로부터 관심 단백질을 포함하는 단백질 혼합물을 수용하고, 단백질 혼합물을 여과하고,
    여기서 3-방향 밸브는 제3 유체 경로를 통해 필터로부터 보유물을 수용하고, 보유물을 제4 유체 경로를 통해 저장 탱크로 또는 제5 유체 경로를 통해 공급 탱크로 보내는 것인
    시스템.
  65. 제64항에 있어서, 시스템 내의 단백질 혼합물의 총 부피가 저장 탱크의 용량보다 작은 경우에 3-방향 밸브가 보유물을 저장 탱크로 보내고, 시스템 내의 단백질 혼합물의 총 부피가 저장 탱크의 용량보다 큰 경우에 3-방향 밸브가 보유물을 공급 탱크로 보내는 것인 시스템.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 시스템 내의 단백질 혼합물의 총 부피 및/또는 농도를 결정하도록 구성된 센서를 추가로 포함하고, 여기서 3-방향 밸브가 센서로부터의 피드백에 기초하여 보유물을 저장 탱크로 또는 공급 탱크로 자동으로 보내는 것인 시스템.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 다이어프램 펌프, 회전 로브 펌프, 또는 연동 펌프를 추가로 포함하는 시스템.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 필터가 인-라인 여과 막을 포함하는 것인 시스템.
  69. 제68항에 있어서, 인-라인 여과 막이 한외여과 막인 시스템.
  70. 제69항에 있어서, 인-라인 여과 막이 폴리비닐에테르, 폴리비닐알콜, 나일론, 규소, 폴리실리콘, 울트라나노결정질 다이아몬드, 다이아몬드-유사-탄소, 이산화규소, 티타늄, 실리카, 질화규소, 폴리테트라플루오르에틸렌, 실리콘, 폴리메타크릴레이트, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리카르보네이트, 그래핀, 그래핀 옥시드, 폴리사카라이드, 세라믹 입자, 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 개질된 폴리에테르술폰, 폴리아릴술폰, 폴리페닐 술폰, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 폴리락트산, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리피페라진, 폴리아미드-폴리에테르 블록 중합체, 폴리이미드, 폴리에테르이미드, 폴리아미드, 재생 셀룰로스, 복합 재생 셀룰로스, 또는 그의 조합인 시스템.
KR1020237014969A 2020-10-05 2021-10-04 단백질을 농축시키는 방법 KR20230080460A (ko)

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