TWI827570B - 雙特異性抗體產品之連續製造製程 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了用於生產雙特異性抗體產品的連續上游製造製程，該雙特異性抗體產品包含至少兩個結合結構域。該製程至少包括以下步驟：(i) 在灌注生物反應器中提供能夠表現雙特異性抗體產品的至少一種哺乳動物細胞培養物，(ii) 以第一灌注速率培養該哺乳動物細胞培養物直至達到活細胞密度設定點，以及 (iii) 以第二灌注速率維持灌注培養，其中該生物反應器中的雙特異性抗體產品濃度保持低於閾值。然後將該雙特異性抗體產品進行後續下游加工。此外，本發明提供了藉由該連續上游製造製程生產的雙特異性抗體產品。

Description

雙特異性抗體產品之連續製造製程
本發明涉及生物技術之方法，具體涉及製造雙特異性抗體之連續製造製程。
最快速和最有前景地發展中的治療劑係基於蛋白質之藥物，它已經在幾乎所有醫學領域中發揮重要作用，並且是臨床(前)開發中且作為商業產品增長最快的治療劑(Leader[前導序列], Nature Reviews Drug Discovery[藥物發現自然評論] 2008年1月7日, 21-39)。與小化學藥物相比，蛋白質藥物在相對低的濃度下具有高特異性和活性，並且通常提供諸如各種癌症、自身免疫疾病和代謝障礙等高影響疾病之療法(Roberts, Trends Biotechnol.[生物技術趨勢] 2014年7月;32(7):372-80，Wang, Int J Pharm.[國際藥劑學雜誌] 1999年8月20日;185(2):129-88)。
由於商業規模純化製程的進展，現在可以在首次製造時以高純度獲得基於蛋白質的藥物如重組蛋白質。然而，蛋白質僅略微穩定，並且即使在上游製造過程中也極易經受化學和物理降解。化學降解係指涉及共價鍵的修飾，如脫醯胺基、氧化、裂解或新二硫鍵的形成、水解、異構化或去糖基化。物理降解包括蛋白質解折疊、不希望的表面吸附和聚集。應對這些物理和化學不穩定性係蛋白質藥物開發中最具挑戰性的任務之一(Chi等人，Pharm Res[藥學研究], 第20卷, 第9期, 2003年9月, 第1325-1336頁，Roberts, Trends Biotechnol.[生物技術趨勢] 2014年7月;32(7):372-80)。
因此，儘管製造方面取得了進展，但新的基於蛋白質的藥物需要新的優化製造製程，以避免產品品質影響如蛋白質聚集。蛋白質聚集會影響上游製造、下游製造、儲存和應用。
這種新的基於蛋白質的藥物包括例如雙特異性(單株)抗體。雙特異性抗體係可以同時結合兩種不同類型的抗原的人工蛋白質。已知它們具有幾種結構形式，並且目前已經探索了用於癌症免疫療法和藥物遞送的應用(Fan, Gaowei; Wang, Zujian; Hao, Mingju; Li, Jinming (2015). “Bispecific antibodies and their applications”[雙特異性抗體及其應用]. Journal of Hematology & Oncology[血液學和腫瘤學雜誌]. 8: 130)。
通常，雙特異性抗體可以是IgG樣即全長雙特異性抗體或非IgG樣雙特異性抗體，這些非IgG樣雙特異性抗體不是全長抗體構建體。全長雙特異性抗體通常保留兩個Fab臂和一個Fc區的傳統單株抗體(mAb)結構，但兩個Fab位點結合不同抗原。非全長雙特異性抗體缺乏整個Fc區。這些非全長雙特異性抗體包括化學連接的Fab，這些化學連接的Fab僅由Fab區以及各種類型的二價和三價單鏈可變片段(scFv)組成。還存在模擬兩種抗體的可變結構域的融合蛋白。可能最大程度開發的這些更新形式係雙特異性T細胞銜接物(BiTE® )(Yang, Fa; Wen, Weihong; Qin, Weijun (2016). “Bispecific Antibodies as a Development Platform for New Concepts and Treatment Strategies”[雙特異性抗體作為用於新概念和治療策略的開發平台]. International Journal of Molecular Sciences[國際分子科學雜誌]. 18 (1): 48)。
雙特異性分子如BiTE® 抗體構建體係由兩個柔性連接的抗體衍生的結合結構域製成的重組蛋白構建體。BiTE® 抗體構建體的一個結合結構域對靶細胞上選擇的腫瘤相關表面抗原具有特異性；第二結合結構域對CD3具有特異性，CD3係T細胞上T細胞受體複合物的亞基。藉由其特定設計，BiTE® 抗體構建體特別適合於使T細胞與靶細胞暫態連接，並且同時有效活化T細胞對靶細胞的固有細胞溶解潛力。以AMG 103和AMG 110的形式開發到臨床中的第一代BiTE® 抗體構建體(參見WO 99/54440和WO 2005/040220)的重要進一步開發係提供在CD3ε鏈的N-末端結合背景獨立表位的雙特異性抗體構建體(WO 2008/119567)。與該選擇的表位結合的BiTE® 抗體構建體不僅顯示對人和白鬢狨、棉冠獠狨或松鼠猴CD3ε鏈的跨物種特異性，而且由於識別該特異性表位而非先前所述在雙特異性T細胞銜接分子中對於CD3結合物的表位，這些抗體構建體不會非特異性地活化T細胞，其程度與對於上一代T細胞銜接抗體所觀察到的程度相同。T細胞活化的這種減少與患者中較少或減少的T細胞再分佈有關，這被認為係副作用的風險。
目前，藉由補料分批培養製造製程生產雙特異性抗體。補料分批培養作為生物技術製程中的操作技術係眾所周知的，其中在培養期間將一種或多種營養素(底物)進料(供應)至生物反應器中並且其中一種或多種產品保留在生物反應器中直到運行結束(Tsuneo Yamanè, Shoichi Shimizu: Fed-batch Techniques in Microbial Processes[微生物製程中的補料分批技術]. (1984) Advances in Biochem Eng./Biotechnol[生物化學工程/生物技術進展], 30:147-194)。因此，雙特異性抗體產品在補料分批製程期間積累並且易於出現產品品質損失，例如由於聚集、剪切(clipping)或某些化學降解反應引起的產品品質損失。另外，在運行結束之前無法獲得產品。此外，在補料分批製程期間，製程相關的雜質如宿主細胞蛋白質(HCP)同樣在生物反應器中積累。在下游去除這些雜質通常是具有挑戰性的，並且需要額外的措施和資源來確保最終產品品質。由於每次新的運行都需要新的細胞培養生長階段，因此補料分批的總體生產力會被所述需要的重複生長階段減弱。此外，為了獲得由補料分批設施生產的足夠產品量，需要使用大量空間和能量的大型生物反應器。因此，需要一種特別用於生產雙特異性抗體的改進的上游製造製程，其既增加了產品數量又提高了產品品質以在商業規模上提供如下品質的足夠產品量，所述品質使得在下游加工中需要丟棄較少的產品。考慮到大規模細胞培養製程的費用以及對提供給具有嚴重未滿足的醫療需求的患者的生物產品的更大數量和更低成本的不斷增長的需求，提供了重組蛋白質生產和回收的漸進式改進的新製程方法係有價值的。
出人意料的是，本發明可以提供適應連續製造製程，其確保了改善的雙特異性抗體產品數量和產品品質。即使本身已知用於生產蛋白質如抗體的連續製造製程(例如Cattaneo等人，US 2017/0204446 A1)，此類製程也不適合於先前在上游製造製程步驟中具有聚集、剪切和化學降解傾向從而導致較低的產品數量和品質的雙特異性抗體的特定需要。
因此，在一方面，設想在本發明的上下文中提供用於生產至少包含第一和第二結合結構域的雙特異性抗體產品的連續上游製造製程，其中與該第二結合結構域相比，該第一結合結構域結合不同的靶標，該製程包括以下步驟： (i)在灌注生物反應器中提供包含至少一種哺乳動物細胞培養物的液體細胞培養基，其中該哺乳動物細胞培養物能夠表現該雙特異性抗體產品，並且其中這些細胞在該灌注生物反應器中接種時具有至少0.5×10^6個細胞/mL的濃度， (ii)藉由應用灌注速率(D)以便以較佳的是連續方式更換該液體細胞培養基、而不從生物反應器中移除細胞來培養該哺乳動物細胞培養物，其中該灌注速率最初對應於至少0.4個容器體積/天(vvd)，然後當達到生物量設定點時連續地、逐漸地或增量式地增加至至少1個生物反應器體積，該生物反應器體積在本文中也理解為容器體積/天(vvd)，其中該生物量設定點等於至少35 × 10^6個細胞/mL的活細胞密度(VCD)， (iii)當達到該生物量設定點時，藉由應用灌注速率(D)以連續地或增量式地更換該液體細胞培養基、較佳的是不從生物反應器中移除細胞來維持灌注培養，其中步驟 (iii) 中的灌注速率對應於至少1個生物反應器體積，該生物反應器體積在本文中也理解為容器體積/天(vvd)，並且 (iv)視情況從該生物反應器排出額外細胞以維持該生物量設定點， 其中藉由在步驟 (ii) 至 (iv) 從該液體細胞培養基連續收穫該雙特異性抗體產品和/或藉由針對VCD調節D，將該生物反應器中的雙特異性抗體產品濃度保持為低於3.5 g/L。
根據所述方面，在步驟 (i) 中還設想這些細胞在生物反應器中接種時具有至少1 × 10^6個細胞/mL的濃度，
根據所述方面，在步驟 (ii) 中進一步設想生物量設定點等於至少65 × 10^6個細胞/mL的VCD。
根據所述方面，在步驟 (ii) 中甚至更多地設想生物量設定點等於至少71 × 10^6個細胞/mL的VCD。
根據所述方面，在步驟 (ii) 中還設想細胞培養物的培養進行至少4天、較佳的是至少7天、較佳的是至少12天。
根據所述方面，在步驟 (ii) 中進一步設想灌注速率(D)在0.4至7 vvd的範圍內。
根據所述方面，在步驟 (ii) 中進一步設想灌注速率(D)連續地增加，即非離散地增加。
根據所述方面，在步驟 (iii) 中甚至更多地設想灌注速率(D)在1至7 vvd的範圍內。
根據所述方面，在步驟 (iii) 中還設想灌注速率(D)在2至6.4 vvd的範圍內、較佳的是2 vvd、最較佳的是2.01 vvd。
根據所述方面，在步驟 (iii) 中進一步設想灌注速率(D)係在0.01至0.15 nL/細胞-天(每個細胞每天nL)範圍內、較佳的是在0.015至0.0315 nL/細胞-天的範圍內或在0.05至0.1 nL/細胞-天的範圍內的細胞特異性灌注速率(CSPR)。
根據所述方面，在步驟 (ii) 至 (iv) 中還設想雙特異性抗體產品濃度保持低於1.2 g/L、較佳的是低於0.5 g/L、最較佳的是低於0.12 g/L。
根據所述方面，還設想在步驟 (iii) 或 (iv) 之後收穫前雙特異性抗體產品在生物反應器中的平均停留時間分別為至多2天、較佳的是至多1天、最較佳的是至多0.5天。
根據所述方面，還設想最終IVCD為至少10 × 10^6個細胞-天/mL、較佳的是至少12、20或50 × 10^6個細胞-天/mL、更較佳的是至少100、500或甚至1000 × 10^6個細胞-天/mL。
根據所述方面，還設想平均HCCF生產力為至少2 g/L生物反應器體積，較佳的是至少5、10或15 g/L生物反應器體積。
根據所述方面，還設想平均HCCF日生產力為每天至少10 g/L生物反應器體積、較佳的是每天至少50 g/L生物反應器體積、更較佳的是每天至少100或甚至至少250 g/L生物反應器體積。
根據所述方面，進一步設想分離的雙特異性抗體產品的單體含量百分比為至少50%、較佳的是至少60%、更較佳的是至少70%、80%、90%、93%或甚至95%。
根據所述方面，進一步設想分離的雙特異性抗體產品的高分子量(HMW)種類含量百分比為至多50%、較佳的是至多40%、更較佳的是至多30%、20%、10%、7%或甚至5%。
根據所述方面，根據本發明產生的雙特異性抗體產品的特徵在於，與源自補料分批製程的相同池相比在第一或第二純化池中宿主細胞蛋白質含量降低至少60%、較佳的是至少65%、通常至少68%或甚至75%至86%。
根據所述方面，根據本發明產生的雙特異性抗體產品的特徵在於，與源自補料分批製程的相同池相比在第一或第二純化池中剪切的蛋白質水平降低至少40%、較佳的是至少44%、通常至少75%或甚至97%。
根據所述方面，受剪切影響的根據本發明產生的產品的百分量為至多15%或10%、較佳的是至多7%、更較佳的是至多6%、5%、4%、3%、2%或1%以及最較佳的是至多0.3%。後者較佳的是適用於根據本發明的雙特異性抗體，其不是全長抗體，並且較佳的是包含含有SEQ ID NO: 202的胺基酸序列的第二結構域。
根據所述方面，根據本發明產生的雙特異性抗體產品的特徵在於，與源自補料分批製程的相同池相比，例如在第一或第二純化池中化學修飾的胺基酸水平降低至少50%，在產品如脫醯胺化或異構化產品種類中化學修飾的胺基酸水平較佳的是降低至少65%、更較佳的是至少68%或甚至至少80%。
根據所述方面，根據本發明產生的雙特異性抗體產品的特徵在於，與所有產品種類相比脫醯胺化或異構化產品種類的含量百分比為至多2%、較佳的是至多1%、更較佳的是至多0.5%或甚至0.1%。
根據所述方面，根據本發明產生的雙特異性抗體產品的特徵在於，與來自補料分批製程的相同池相比，在第一或第二純化池中高分子量種類即具有比純產品單體更高分子量的構建體降低至少25%，高分子量種類較佳的是降低至少50%或甚至約70%。
根據所述方面，根據本發明產生的雙特異性抗體產品的特徵在於，當與源自補料分批製程的相同池相比時，通常在第一或第二純化池中酸性種類水平降低、較佳的是降低至少30%、較佳的是至少35%、通常約38%至49%。
根據所述方面，根據本發明產生的雙特異性抗體產品的特徵在於，與所有產品種類相比，酸性產品種類的含量百分比為至多15%、較佳的是至多12%、更較佳的是至多10%。
根據所述方面，還設想雙特異性抗體產品係雙特異性全長抗體，即通常是包含2個重鏈和2個輕鏈的抗體；或者非全長雙特異性抗體構建體，包括單鏈雙特異性抗體構建體。
根據所述方面，設想了雙特異性全長抗體，其中雙特異性抗體構建體的第一和/或第二結合結構域結合靶標和/或效應細胞。
根據所述方面，設想了雙特異性全長抗體，其中雙特異性抗體構建體的第一和/或第二結合結構域結合T11A和/或TNF-α。
根據所述方面，還設想雙特異性抗體構建體包含半衰期延長部分、較佳的是源自IgG抗體的基於Fc的半衰期延長部分、最較佳的是scFc半衰期延長部分。
根據所述方面，進一步設想雙特異性抗體構建體係雙特異性T細胞銜接物(BiTE®)。
根據所述方面，設想雙特異性抗體產品的第一結合結構域結合選自以下群組的至少一種靶細胞表面抗原，該群組由以下各項組成：CD19、CD33、EGFRvIII、MSLN、CDH19、FLT3、DLL3、CDH3、BCMA和PSMA。
根據所述方面，進一步設想雙特異性抗體構建體的第二結合結構域結合CD3結合結構域。
根據所述方面，還設想第二結合結構域包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH區和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL區，該CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3以及CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3選自由以下組成的群組： (a) 如SEQ ID NO: 1所示的CDR-H1、如SEQ ID NO: 2所示的CDR-H2、如SEQ ID NO: 3所示的CDR-H3、如SEQ ID NO: 4所示的CDR-L1、如SEQ ID NO: 5所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO: 6所示的CDR-L3， (b) 如SEQ ID NO: 29所示的CDR-H1、如SEQ ID NO: 30所示的CDR-H2、如SEQ ID NO: 31所示的CDR-H3、如SEQ ID NO: 34所示的CDR-L1、如SEQ ID NO: 35所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO: 36所示的CDR-L3， (c) 如SEQ ID NO: 42所示的CDR-H1、如SEQ ID NO: 43所示的CDR-H2、如SEQ ID NO: 44所示的CDR-H3、如SEQ ID NO: 45所示的CDR-L1、如SEQ ID NO: 46所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO: 47所示的CDR-L3， (d) 如SEQ ID NO: 53所示的CDR-H1、如SEQ ID NO: 54所示的CDR-H2、如SEQ ID NO: 55所示的CDR-H3、如SEQ ID NO: 56所示的CDR-L1、如SEQ ID NO: 57所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO: 58所示的CDR-L3， (e) 如SEQ ID NO: 62所示的CDR-H1、如SEQ ID NO: 63所示的CDR-H2、如SEQ ID NO: 64所示的CDR-H3、如SEQ ID NO: 65所示的CDR-L1、如SEQ ID NO: 66所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO: 67所示的CDR-L3， (f) 如SEQ ID NO: 83所示的CDR-H1、如SEQ ID NO: 84所示的CDR-H2、如SEQ ID NO: 85所示的CDR-H3、如SEQ ID NO: 86所示的CDR-L1、如SEQ ID NO: 87所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO: 88所示的CDR-L3， (g) 如SEQ ID NO: 94所示的CDR-H1、如SEQ ID NO: 95所示的CDR-H2、如SEQ ID NO: 96所示的CDR-H3、如SEQ ID NO: 97所示的CDR-L1、如SEQ ID NO: 98所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO: 99所示的CDR-L3， (h) 如SEQ ID NO: 105所示的CDR-H1、如SEQ ID NO: 106所示的CDR-H2、如SEQ ID NO: 107所示的CDR-H3、如SEQ ID NO: 109所示的CDR-L1、如SEQ ID NO: 110所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO: 111所示的CDR-L3， (i) 如SEQ ID NO: 115所示的CDR-H1、如SEQ ID NO: 116所示的CDR-H2、如SEQ ID NO: 117所示的CDR-H3、如SEQ ID NO: 118所示的CDR-L1、如SEQ ID NO: 119所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO: 120所示的CDR-L3， (j) 如SEQ ID NO: 126所示的CDR-H1、如SEQ ID NO: 127所示的CDR-H2、如SEQ ID NO: 128所示的CDR-H3、如SEQ ID NO: 129所示的CDR-L1、如SEQ ID NO: 130所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO: 131所示的CDR-L3， (k) 如SEQ ID NO: 137所示的CDR-H1、如SEQ ID NO: 138所示的CDR-H2、如SEQ ID NO: 139所示的CDR-H3、如SEQ ID NO: 140所示的CDR-L1、如SEQ ID NO: 141所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO: 142所示的CDR-L3， (l) 如SEQ ID NO: 152所示的CDR-H1、如SEQ ID NO: 153所示的CDR-H2、如SEQ ID NO: 154所示的CDR-H3、如SEQ ID NO: 155所示的CDR-L1、如SEQ ID NO: 156所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO: 157所示的CDR-L3，以及 (m) 如SEQ ID NO: 167所示的CDR-H1、如SEQ ID NO: 168所示的CDR-H2、如SEQ ID NO: 169所示的CDR-H3、如SEQ ID NO: 170所示的CDR-L1、如SEQ ID NO: 171所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO: 172所示的CDR-L3。
根據所述方面，設想收穫的雙特異性抗體產品被包含在收穫的細胞培養液(HCCF)中。
根據所述方面，設想HCCF從步驟 (ii) 和 (iii) 獲得或僅從步驟 (iii) 獲得。
根據所述方面，設想在室溫下例如以1、2、3、4、5、6、12、24、36、48、72、96、120和/或144小時增量或連續地收集HCCF，並傳遞至下游步驟以進行進一步加工，例如捕獲該雙特異性抗體產品。
根據所述方面，設想下游步驟包括捕獲層析、病毒滅活和/或精製步驟。
根據所述方面，設想藉由以限定的細胞特異性灌注速率進料並從該生物反應器排出額外細胞以維持該生物量設定點，而使該灌注培養連續運行至少7天，較佳的是至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天，最較佳的是至少35天。
在本發明的另一個方面，設想提供一種用於執行如圖1所示的本發明的連續製造方法的設置或裝置，其包含至少具有生物量控制設備、DO控制設備和液位控制設備的灌注生物反應器，和具有灌注流速調節設備的入口，以及具有細胞截留設備和HCCF流速調節設備的出口。該設置可以包含灌注培養基，其以受控制的灌注流速(灌注速率)泵入生物反應器中。其中控制含氧量(DO)、溫度、pH、生物量(電容)和液位(水平)。過量細胞可以作為細胞排出而分離。收穫的細胞培養液(HCCF)藉由使流體藉由細胞截留設備從生物反應器中分離而獲得，該細胞截留設備可以包含0.2 μm過濾器。較佳的是，無細胞HCCF可以在被傳遞至進一步的下游加工之前收集在儲存容器中。
在本發明的另一個方面，設想了藉由本發明的連續上游製造製程產生的雙特異性抗體產品。
在本發明的另一個方面，設想了補料分批和灌注的混合方法，但該混合方法在比CM更短的時間內有利地提供了與本文所呈現的品質相當的產品特徵。進而，產品數量較低，且與FB大致相當。較佳的是，生物反應器中較低的產品濃度導致類似於在根據本發明的CM製程中的更好的產品品質。然而，最小化了細胞培養持續時間。根據本發明的這種混合製程包括以下製程步驟：(i) 自接種進行補料分批至約第7天，(ii) 隨後較佳的是使用交變切向流(ATF)過濾系統進行短時間的灌注培養(與CM相當)以供收穫。較佳的是以與根據本發明的CM製程類似的方式進行產品的去除，以降低產品濃度和提高產品品質。
本文提供了製造治療性蛋白質特別是雙特異性抗體的連續製程。設想本發明使上游製程適合於製造雙特異性抗體的特定需要。與本領域已知的標準補料分批製造解決方案相比，所述上游製程不僅僅有助於提高生產力和減少對空間的需求。更進一步，本發明的連續製造製程-較佳的是連續上游製造製程-特別適用於雙特異性抗體，並且被設想導致更高的產品品質，即在更高的單體含量方面相對於補料分批製造而言更少聚集的雙特異性抗體。另外，本發明的連續製造製程有利地提供比技術人員已知的補料分批製造製程更少的化學修飾、更少的剪切、更少的製程相關的雜質。作為特定的製造優勢，基於相同的細胞類型的隨時間的輸出在本文中也稱為平均HCCF日生產力，其與技術人員已知的補料分批製程相比較佳的是增加至少2倍、較佳的是至少3倍、更較佳的是至少4倍以及甚至更較佳的是至少6倍。
發現生物反應器中特定的低產品濃度決定性地有助於避免聚集體，即有助於產品的更高的相對和/或絕對單體濃度。這對於確保產品品質和提高整個製程的經濟效益至關重要。上游產生的聚集體越少，下游需要去除的非品質產品就越少。產品濃度低於3.5 g/l與聚集的可能性較小有關。如果在整個上游製程中最大產品濃度保持為低於1.2 g/l，則產品品質甚至會更好。甚至更較佳的是產品濃度低於0.5或甚至0.3 g/L。藉由確保1 vvd或更較佳的是至少2 vvd或更高的足夠高的灌注速率，可以實現較佳的是無聚集體產品的經濟有利的生產率。這適用於所有雙特異性抗體產品，不論是全長抗體還是非全長抗體如(單鏈)雙特異性抗體構建體。
在本發明的上下文中另一個出人意料的方面係以下事實：對於雙特異性抗體產品，灌注速率關於VCD的適應性係較佳的，以獲得有利的產品品質和數量。在這一方面，接種後灌注速率連續地、逐漸地或增量式地增加，直至達到較佳的設定點。通常，當生物量設定點等於至少35 × 10^6個細胞/mL、較佳的是至少65 × 10^6個細胞/mL、更較佳的是至少71 × 10^6個細胞/mL以及最較佳的是至少85 × 10^6個細胞/mL的平均活細胞密度(VCD)時，達到所述設定點。通常，灌注速率設置為低的值，只要VCD低於同一製程中達到的最大VCD。例如，當VCD等於約0.5 × 10^6個細胞時，灌注速率可低至約0.4 vvd。然而，隨著VCD由於生物反應器中的細胞生長而增加，當達到例如35 × 10^6個細胞/mL的生物量設定點時，灌注速率可以例如連續地、逐漸地或增量式地從0.4 vvd增加至2 vvd。較佳的是，灌注速率增加越多，生物量設定點越高。例如，當生物量設定點為例如至少65 × 10^6個細胞/mL、更較佳的是至少71 × 10^6個細胞/mL以及最較佳的是至少85 × 10^6個細胞/mL時，vvd可設置為至少2、較佳的是至少2.01、3、4、5、6或甚至6.4。
還較佳的是，在本發明的步驟 (iii) 中達到生物量設定點之後，VCD保持恒定，因此灌注速率同樣較佳的是保持恒定。在本發明的上下文中還設想，在整個連續製造製程中根據連續測量的VCD調節灌注速率。VCD被理解為易於訪問且可靠的參數。綜合活細胞密度(IVCD)在本文中被理解為隨時間變化的VCD的曲線下面積。由此，例如可以較佳的是維持恒定的細胞特異性灌注速率(CSPR，每個細胞每天nL)，這進而可有助於生物反應器中受控制的產品濃度，以避免對產品品質產生負面影響。
因此，在整個連續上游製造製程中確保受控制的且較佳的是低的產品濃度，例如對於全長雙特異性抗體較佳的是低於1.2 g/l，對於HLE雙特異性抗體構建體較佳的是低於0.4 g/l，並且對於根據本發明的非HLE雙特異性抗體構建體較佳的是低於0.12 g/l，該連續上游製造製程導致較少的產品受聚集、剪切或其他化學降解的影響。
在本發明的上下文中，CSPR被理解為灌注速率D(生物反應器體積/天)與平均VCD(CV ，即平均活細胞數/毫升)的比率：
在本發明的上下文中還應理解，無論細胞密度如何，較佳的是向細胞培養物中的細胞提供均勻的微環境。因此，較佳的是以與細胞密度成正比的速率更換培養基。藉由應用基於較佳的是CSPR的灌注速率，灌注速率與細胞密度相適應。
在本發明的上下文中，CSPR可以藉由具有線上生物量測量的控制站自動應用。這較佳的是允許響應於CV 變化對D進行微小和/或穩定的調節。可較佳的是這種穩定的即連續的響應，而不是逐步的即增量式的或離散的D的變化。最小CSPR係遞送滿足細胞需要的最小量的營養素並支持高生產力的速率。在高細胞密度下例如在高細胞密度培養物(HCDC)中應用最小CSPR或接近最小CSPR的CSPR具有特別重要的實踐意義。在本發明的上下文中，HCDC例如涉及具有至少65 × 10^6個細胞/mL、較佳的是至少71 × 10^6個細胞/mL或甚至至少85 × 10^6個細胞/mL的VCD的細胞培養。還設想HCDC可具有至少100 × 10^6個細胞/mL的VCD。
在本發明的上下文中，典型的最小CSPR係0.01 nl/細胞-天。在所有雙特異性抗體共有的較佳的邊界內，一些雙特異性抗體確實具有甚至更較佳的值以獲得最佳產品品質。例如，在本發明的上下文中，CD19 x CD3 BiTE®抗體構建體的CSPR較佳的是低於0.04 nl/細胞-天、更較佳的是等於或低於0.028 nl/細胞-天。對於包含靶向CD3的I2C結構域(SEQ ID NO 26)的雙特異性抗體構建體如CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體，CSPR較佳的是等於或低於0.028 nl/細胞-天或至少0.051 nl/細胞-天、更較佳的是0.06至0.1 nl/細胞-天。對於全長雙特異性抗體如TNF-α x TL1A雙特異性抗體，CSPR較佳的是等於或低於0.028 nl/細胞-天或至少0.051 nl/細胞-天、更較佳的是0.06-0.1 nl/細胞-天。
在本發明的上下文中，“細胞培養”或“培養”意指細胞在多細胞生物或組織外的生長和繁殖。對於哺乳動物細胞的合適培養條件係本領域已知的。參見例如Animal cell culture: A Practical Approach[動物細胞培養：一實用的方法], D. Rickwood, 編輯, Oxford University Press[牛津大學出版社], 紐約 (1992)。哺乳動物細胞可以在懸浮液中培養或附著至固體基質時培養。
術語“哺乳動物細胞”意指來自或源自任何哺乳動物(例如人、倉鼠、小鼠、綠猴、大鼠、豬、牛或兔)的任何細胞。例如，哺乳動物細胞可以是永生化細胞。在一些實施方式中，哺乳動物細胞係分化細胞。在一些實施方式中，哺乳動物細胞係未分化的細胞。本文描述了哺乳動物細胞的非限制性實例。在本發明的上下文中，較佳的哺乳動物細胞類型係GS-KO細胞。哺乳動物細胞的其他實例係本領域已知的。
如本文所用，術語“細胞培養基”(也稱為“培養基”、“細胞培養基”、“組織培養基”)係指用於培養細胞例如動物或哺乳動物細胞的任何營養液，並且其通常提供以下至少一種或多種組分：能源(通常為碳水化合物形式，如葡萄糖)；全部必需胺基酸且通常是二十種鹼性胺基酸以及半胱胺酸中的一種或多種；通常所需的低濃度下的維生素和/或其他有機化合物；脂質或游離脂肪酸；以及微量元素，例如通常所需的在極低濃度下(通常在微莫耳範圍內)的無機化合物或天然存在的元素。
細胞培養基包括通常用於和/或已知用於任何細胞培養製程(例如但不限於細胞的分批、延長分批、補料分批和/或灌注或連續培養)的那些培養基。
“生長”細胞培養基或加料培養基係指這樣一種細胞培養基，其通常用於指數生長期間(“生長階段”)的細胞培養中，並且足以完全在該階段期間支持細胞培養。生長細胞培養基還可含有選擇劑，其賦予對摻入宿主細胞系中的可選擇標誌物的抗性或存活。這些選擇劑包括但不限於遺傳黴素(G4118)、新黴素(neomycin)、潮黴素B(hygromycin B)、嘌呤黴素(puromycin)、博萊黴素(zeocin)、甲硫胺酸亞碸亞胺(methionine sulfoximine)、甲胺喋呤(methotrexate)、無穀胺醯胺的細胞培養基、缺乏甘胺酸的細胞培養基、次黃嘌呤和胸苷、或單獨的胸苷。
“生產”細胞培養基或加料培養基係指這樣一種細胞培養基，其通常用於當指數生長即將結束時的轉變過程中以及隨後的轉變過程和/或蛋白質生產結束時的生產階段中的細胞培養中。這種細胞培養基足以完全維持該階段中所需的細胞密度、活力和/或產品滴度。
“灌注”細胞培養基或加料培養基係指這樣一種細胞培養基，其通常用於藉由灌注或連續培養方法維持的細胞培養物中，並且在該製程中足以完全支持細胞培養。灌注細胞培養基製劑可以比基礎細胞培養基製劑更豐富或更濃縮，以適應於用於去除廢培養基的方法。灌注細胞培養基可在生長和生產階段期間使用。
術語“0.5×體積”意指體積的約50%。術語“0.6×體積”意指體積的約60%。同樣地，0.7×、0.8×、0.9×和1.0×分別意指體積的約70%、80%、90%或100%。
術語“培養”或“細胞培養”意指在一組受控制的物理條件下哺乳動物細胞的維持或增殖。
術語“哺乳動物細胞的培養物”意指含有在一組受控制的物理條件下維持或增殖的多個哺乳動物細胞的液體培養基。
術語“液體培養基”意指含有足夠營養素以允許細胞(例如哺乳動物細胞)在體外生長或增殖的流體。例如，液體培養基可含有以下各項中的一種或多種：胺基酸(例如，20種胺基酸)、嘌呤(例如，次黃嘌呤)、嘧啶(例如，胸苷)、膽鹼、肌醇、硫胺素、葉酸、生物素、鈣、煙醯胺、吡哆醇、核黃素、胸苷、氰鈷胺、丙酮酸、硫辛酸、鎂、葡萄糖、鈉、鉀、鐵、銅、鋅和碳酸氫鈉。在一些實施方式中，液體培養基可含有來自哺乳動物的血清。在一些實施方式中，液體培養基不含有來自哺乳動物的血清或其他提取物(確定的液體培養基)。在一些實施方式中，液體培養基可含有微量金屬、哺乳動物生長激素和/或哺乳動物生長因子。液體培養基的另一個實例係基本培養基(例如，僅含有無機鹽、碳源和水的培養基)。本文描述了液體培養基的非限制性實例。液體培養基的其他實例係本領域已知的並且是可商購的。液體培養基可含有任何密度的哺乳動物細胞。例如，如本文所用，從生物反應器中移取的一定體積的液體培養基可以基本上不含哺乳動物細胞。
在本發明的上下文中，“生物反應器”係指適於進行灌注細胞培養的容器，其中至少進行本發明的步驟 (i) 至 (iii)。生物反應器可以是一次性容器，例如，由塑膠材料或可重複使用的容器製成，例如由不銹鋼製成。
術語“攪動”意指在生物反應器中攪拌或以其他方式移動一部分液體培養基。進行攪動的目的是例如增加生物反應器中液體培養基中溶解的O2濃度。攪動可以使用任何本領域已知的方法例如工具或螺旋槳來進行。可用於在生物反應器中進行一部分液體培養基的攪動的示例性設備和方法係本領域已知的。
術語“連續製程”意指藉由系統的至少一部分連續供給流體的製程。例如，在本文所述的任何示例性連續生物製造系統中，在系統運行時含有重組治療性蛋白質的液體培養基連續進料至該系統中，並且治療性蛋白質藥品從該系統中運出。
術語“補料分批生物反應器”係本領域的術語，意指在第一液體培養基中含有多種細胞(例如哺乳動物細胞)的生物反應器，其中生物反應器中存在的細胞的培養包括向第一液體培養基中定期或連續添加第二液體培養基，而不從細胞培養物中大量或顯著去除第一液體培養基或第二液體培養基。第二液體培養基可以與第一液體培養基相同。在補料分批培養的一些實例中，第二液體培養基係第一液體培養基的濃縮形式。在補料分批培養的一些實例中，第二液體培養基作為乾粉加入。
術語“剪切”意指通常藉由蛋白質水解部分切割表現的蛋白質。
術語“降解”通常是指將較大的實體如肽或蛋白質分解成至少兩個較小的實體，其中一個實體可以顯著大於另一個實體。
術語“脫醯胺化”意指其中胺基酸側鏈中的醯胺官能基(通常為天冬醯胺或穀胺醯胺)被去除或轉化為另一官能基的任何化學反應。通常，天冬醯胺被轉化為天冬胺酸或異天冬胺酸。
術語“聚集”通常是指分子之間的直接相互吸引，例如通經由凡得瓦力或化學鍵合。特別地，聚集被理解為蛋白質積聚和凝聚在一起。聚集體可包括無定形聚集體、寡聚體和澱粉樣蛋白原纖維，並且通常被稱為高分子量(HMW)種類，即具有比作為非聚集分子的純產品分子更高分子量的分子，其在本文中通常也稱為低分子量(LMW)種類或單體。
本文通常將酸性種類理解為包含在藉由基於帶電的分離技術(如等電聚焦(IEF)凝膠電泳、毛細管等電聚焦(cIEF)凝膠電泳、陽離子交換層析法(CEX)和陰離子交換層析法(AEX))分析抗體時通常所觀察到的變體中。與主要種類相比，這些變體被稱為酸性或鹼性種類。當使用基於IEF的方法分析抗體時，酸性種類通常是具有較低表觀pI的變體，而鹼性種類係具有較高表觀pI的變體。
術語“停留時間”通常是指特定產品分子存在於生物反應器中的時間，即從其生物技術生成到其從生物反應器內腔分離的時間。
通常藉由剪切、降解、脫醯胺化和/或聚集的存在或不存在來評估“產品品質”。例如，包含低於40%、較佳的是低於35%或甚至30%、25%或20%的HMW種類的含量百分比的產品(分子)可被認為係產品品質較佳的。另外，較佳的產品品質伴隨著基本不存在殘留宿主細胞蛋白(HCP)和基本不存在剪切、降解和脫醯胺化，或伴隨著與藉由不同於本發明製程的製程(如補料分批製程)製造的產品相比HCP濃度、剪切、降解和/或脫醯胺化的顯著降低。本領域已知的用於評估本發明上下文中的產品品質的方法包括用於電荷變體分析的陽離子交換-高效液相層析法(CEX-HPLC)、用於化學修飾的胰蛋白酶消化肽圖譜、宿主細胞蛋白(HCP)ELISA還原毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉(RCE-SDS)和尺寸排阻-高效液相層析法(SE-HPLC)。
術語“抗體產品”係指“分泌性蛋白”或“分泌性重組蛋白”，並且意指當在哺乳動物細胞內翻譯並且藉由至少部分地酶促切割哺乳動物細胞中的分泌訊號序列而至少部分地分泌至細胞外空間(例如，液體培養基)中時最初含有至少一個分泌訊號序列的蛋白質(例如，重組蛋白質)。技術人員將理解“分泌性”蛋白不需要完全從細胞中解離才被認為係分泌性蛋白。
術語雙特異性抗體產品包括雙特異性抗體如全長抗體，例如基於IgG的抗體及其片段，該基於IgG的抗體及其片段通常在本文中稱為雙特異性抗體構建體。
術語“抗體構建體”係指一種分子，其中結構和/或功能基於抗體例如全長或整個免疫球蛋白分子(通常由兩個未被截短的重鏈和兩個輕鏈組成)的結構和/或功能，和/或從抗體或其片段的可變重鏈(VH)和/或可變輕鏈(VL)結構域中提取。因此，抗體構建體能夠與其特異性靶標或抗原結合。此外，根據本發明結合其結合配偶體的結構域在本文中理解為根據本發明的抗體構建體的結合結構域。通常，根據本發明的結合結構域包含允許靶標結合的抗體的最低結構要求。該最低要求可以是例如藉由至少三個輕鏈CDR(即VL區的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三個重鏈CDR(即VH區的CDR1、CDR2和CDR3)、較佳的是全部六個CDR的存在來確定的。用於確定抗體的最低結構要求的替代性方法係特異性靶標的結構內抗體表位(分別係構成表位區域(表位簇)的靶蛋白的蛋白質結構域)的確定，或參考特異性抗體與確定的抗體表位的競爭。根據本發明的構建體所基於的抗體包括例如單株、重組、嵌合、去免疫、人源化和人抗體。
根據本發明的抗體構建體的結合結構域可以例如包括以上提到的CDR組。較佳的是，那些CDR包含在抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)的框架中；但是，二者不必均包含。例如，Fd片段具有兩個VH區並且通常保留完整抗原結合結構域的一些抗原結合功能。抗體片段、抗體變體或結合結構域的形式的附加實例包括 (1) Fab片段，一種具有VL、VH、CL和CH1結構域的單價片段； (2) F(ab')2 片段，一種具有在鉸鏈區藉由二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(3) 具有兩個VH和CH1結構域的Fd片段；(4) 具有抗體單臂的VL和VH結構域的Fv片段，(5) dAb片段(Ward等人，(1989) Nature[自然] 341 :544-546)，其具有VH結構域；(6) 分離的互補決定區(CDR)，以及 (7) 單鏈Fv(scFv)，後者係較佳的(例如，源自scFV文庫)。根據本發明的抗體構建體的實施方式的實例例如描述在以下參考文獻中：WO 00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、WO 2014/144722、WO 2014/151910和WO 2015/048272。
另外，在“結合結構域”或“結合……的結構域”的定義內的是全長抗體的片段，如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab’、F(ab')2或“r IgG”(“半抗體”)。根據本發明的抗體構建體還可以包括修飾的抗體片段(也稱為抗體變體，如scFv、二scFv或雙(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉鍊、scFab、Fab2 、Fab3 、雙抗體、單鏈雙抗體、串聯雙抗體(Tandab)、串聯二scFv、串聯三scFv)、“多抗體”如三抗體或四抗體以及僅包含一個可變結構域(它可能是VHH、VH或VL)的單結構域抗體(如奈米抗體或單可變結構域抗體，其可能獨立於其他V區或結構域特異性地結合抗原或表位)。
如本文所用，術語“單鏈Fv”、“單鏈抗體”或“scFv”係指單個多肽鏈抗體片段，其包含來自重鏈和輕鏈的可變區但缺乏恒定區。通常，單鏈抗體進一步包含在VH與VL結構域之間的多肽接頭，該多肽接頭使得該單鏈抗體能夠形成允許抗原結合的所需結構。Pluckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies[單株抗體的藥理學], 第113卷, Rosenburg和Moore編輯 Springer-Verlag[施普林格出版社], 紐約, 第269-315頁 (1994)中詳細討論了單鏈抗體。生成單鏈抗體的多種方法係已知的，包括以下參考文獻中描述的那些方法：美國專利案號4,694,778和5,260,203；國際專利申請公開案號WO 88/01649；Bird (1988) Science[科學] 242:423-442；Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國國家科學院院刊] 85:5879-5883；Ward等人(1989) Nature[自然] 334:54454；Skerra等人(1988) Science[科學] 242:1038-1041。在特定的實施方式中，單鏈抗體也可以是雙特異性的、多特異性的、人的和/或人源化的和/或合成的。
此外，術語“抗體構建體”的定義包括單價、二價和多價(polyvalent/multivalent)構建體，因此，雙特異性構建體僅特異性地結合兩種抗原結構，並且多特異性(polyspecific/multispecific)構建體藉由不同的結合結構域特異性地結合多於兩種抗原結構，例如三種、四種或更多種抗原結構。此外，術語“抗體構建體”的定義包括僅由一個多肽鏈組成的分子以及由多於一個多肽鏈組成的分子，這些鏈可以是相同的(同源二聚體、同源三聚體或同源寡聚體)或不同的(異源二聚體、異源三聚體或異源寡聚體)。上述鑒定的抗體及其變體或衍生物的實例尤其描述在以下參考文獻中：Harlow和Lane, Antibodies a laboratory manual[抗體：實驗室手冊], CSHL Press[冷泉港實驗室出版社] (1988)和Using Antibodies: a laboratory manual[使用抗體：實驗室手冊], CSHL Press[冷泉港實驗室出版社] (1999)，Kontermann和Dübel, Antibody Engineering[抗體工程], Springer[施普林格], 第2版 2010以及Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy[重組抗體用於免疫療法], Cambridge University Press[劍橋大學出版社] 2009。
如本文所用的術語“雙特異性”係指“至少雙特異性”的抗體構建體，即，其包含至少第一結合結構域和第二結合結構域，其中第一結合結構域結合一種抗原或靶標(例如，靶細胞表面抗原)且第二結合結構域結合另一抗原或靶標(例如CD3)。因此，根據本發明的抗體構建體包含對於至少兩種不同抗原或靶標的特異性。例如，第一結構域較佳的是不結合如本文所述的一種或多種物種的CD3ε的細胞外表位。術語“靶細胞表面抗原”係指由細胞表現的抗原結構，其存在於細胞表面，使得其可接近本文所述的抗體構建體。它可以是蛋白質(較佳的是蛋白質的細胞外部分)或碳水化合物結構(較佳的是蛋白質如糖蛋白的碳水化合物結構)。它較佳的是腫瘤抗原。本發明的術語“雙特異性抗體構建體”還包括多特異性抗體構建體如三特異性抗體構建體(後者包括三個結合結構域)或具有多於三種(例如四種、五種......)特異性的構建體。
鑒於根據本發明的抗體構建體係(至少)雙特異性的，它們不是天然存在的，並且它們明顯不同於天然存在的產品。因此，“雙特異性”抗體構建體或免疫球蛋白係含有具有不同特異性的至少兩個不同結合面的人工雜交抗體或免疫球蛋白。雙特異性抗體構建體可以藉由多種方法產生，包括雜交瘤的融合或Fab'片段的連接。參見例如，Songsivilai和Lachmann, Clin. Exp. Immunol.[中國實驗臨床免疫學雜誌] 79:315-321 (1990)。
本發明的抗體構建體的至少兩個結合結構域和可變結構域(VH/VL)可以包括或可以不包括肽接頭(間隔肽)。根據本發明，術語“肽接頭”包括胺基酸序列，本發明抗體構建體的一個(可變和/或結合)結構域和另一個(可變和/或結合)結構域的胺基酸序列藉由該胺基酸序列彼此連接。肽接頭也可用於將第三結構域融合至本發明抗體構建體的其他結構域。這種肽接頭的必要技術特徵係它不包含任何聚合活性。合適的肽接頭係美國專利4,751,180和4,935,233或WO 88/09344中描述的那些肽接頭。肽接頭也可用於將其他結構域或模組或區域(如半衰期延長結構域)附接至本發明的抗體構建體。
本發明的抗體構建體較佳的是“體外生成的抗體構建體”。該術語係指根據上述定義的抗體構建體，其中在非免疫細胞選擇中生成全部或部分可變區(例如，至少一個CDR)，例如體外噬菌體展示、蛋白質片或可以測試候選序列結合抗原的能力的任何其他方法。因此，該術語較佳的是排除僅藉由動物的免疫細胞中的基因組重排生成的序列。“重組抗體”係藉由使用重組DNA技術或基因工程製備的抗體。
如本文使用的，術語“單株抗體”(mAb)或單株抗體構建體係指從基本上均質抗體群體中獲得的抗體，即構成群體的單獨抗體係相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突變和/或翻譯後修飾(例如，異構化、醯胺化)。與通常包括針對不同決定簇(或表位)的不同抗體的常規(多株)抗體製品相反，單株抗體係高度特異性的，其針對抗原上的單個抗原側或決定簇。除了它們的特異性之外，單株抗體的優點還在於它們藉由雜交瘤培養合成，因此不被其他免疫球蛋白污染。修飾語“單株”指示獲得自基本上均質的抗體群體的抗體的特徵，並且不應理解為要求藉由任何具體方法產生抗體。
為了製備單株抗體，可以使用提供藉由連續細胞系培養產生的抗體的任何技術。例如，待使用的單株抗體可藉由Koehler等人，Nature[自然], 256: 495 (1975)首次描述的雜交瘤方法或可以藉由重組DNA方法(參見例如，美國專利案號4,816,567)製備。用於產生人單株抗體的其他技術的實例包括三瘤技術、人B細胞雜交瘤技術(Kozbor, Immunology Today[今日免疫學] 4 (1983), 72)和EBV-雜交瘤技術(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy[單株抗體和癌症療法], Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96)。
然後可以使用標準方法如酶聯免疫吸附測定(ELISA)和表面電漿共振(BIACORE™)分析來篩選雜交瘤，以鑒定產生與特定抗原特異性地結合的抗體的一種或多種雜交瘤。任何形式的相關抗原可用作免疫原，例如重組抗原、天然存在的形式、其任何變體或片段及其抗原肽。BIAcore系統中使用的表面電漿共振可用於提高結合靶標細胞表面抗原表位的噬菌體抗體的效率(Schier, Human Antibodies Hybridomas[人類抗體雜交瘤] 7 (1996), 97-105；Malmborg, J. Immunol. Methods[免疫學方法雜誌] 183 (1995), 7-13)。
製備單株抗體的另一種示例性方法包括篩選蛋白質表現文庫，例如噬菌體展示或核糖體展示文庫。噬菌體展示描述在例如Ladner等人，美國專利案號5,223,409；Smith (1985) Science[科學] 228:1315-1317、Clackson等人，Nature[自然], 352: 624-628 (1991) 以及Marks等人，J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌], 222: 581-597 (1991) 中。
除了使用展示文庫外，相關抗原可用於免疫非人動物，例如齧齒動物(如小鼠、倉鼠、兔或大鼠)。在一個實施方式中，非人動物至少包括人免疫球蛋白基因的一部分。例如，可以採用人Ig(免疫球蛋白)基因座的大片段來工程化在小鼠抗體產生方面有缺陷的小鼠品系。藉由使用雜交瘤技術，可以產生和選擇源自具有所需特異性的基因的抗原特異性單株抗體。參見例如，XENOMOUSE™、Green等人 (1994) Nature Genetics[自然遺傳學] 7:13-21、US 2003-0070185、WO 96/34096以及WO 96/33735。
單株抗體也可以從非人動物獲得，然後使用本領域已知的重組DNA技術進行修飾，例如人源化、去免疫、呈現嵌合等。修飾的抗體構建體的實例包括非人抗體的人源化變體、“親和力成熟的”抗體(參見例如Hawkins等人 J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌] 254, 889-896 (1992)和Lowman等人，Biochemistry[生物化學] 30, 10832- 10837 (1991))和具有一種或多種改變的效應子功能的抗體突變體(參見例如，美國專利5,648,260、在上述引文中的Kontermann和Dübel (2010)以及在上述引文中的Little (2009))。
在免疫學中，親和力成熟係B細胞在免疫應答過程中產生具有對抗原增加的親和力的抗體的製程。藉由反復暴露於相同抗原，宿主將產生相繼更大親和力的抗體。與天然原型一樣， 體外親和力成熟基於突變和選擇的原理。體外親和力成熟已成功用於優化抗體、抗體構建體和抗體片段。使用輻射、化學誘變劑或易錯PCR引入CDR內的隨機突變。此外，藉由鏈改組可以增加遺傳多樣性。使用噬菌體展示等展示方法進行兩輪或三輪突變和選擇通常會產生具有低納莫耳範圍親和力的抗體片段。
抗體構建體的較佳的類型的胺基酸取代變異包括取代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個高變區殘基。通常，選擇用於進一步開發的一種或多種所得變體相對於生成它們的親本抗體將具有改善的生物學特性。用於生成此類取代變體的便利方式包括使用噬菌體展示的親和力成熟。簡而言之，使幾個高變區側(例如6-7側)突變以在每一側生成所有可能的胺基酸取代。由此生成的抗體變體從絲狀噬菌體顆粒以單價方式展示為與每個顆粒內包裝的M13的基因III產物的融合物。然後針對如本文所揭露的噬菌體展示的變體的生物活性(例如結合親和力)對其進行篩選。為了鑒定用於修飾的候選高變區側，可以進行丙胺酸掃描誘變以鑒定顯著有助於抗原結合的高變區殘基。可替代地/另外地，分析抗原-抗體複合物的晶體結構以鑒定結合結構域與例如人靶細胞表面抗原之間的接觸點可能是有益的。根據本文詳述的技術，此類接觸殘基和相鄰殘基係取代的候選物。一旦生成這樣的變體，對變體組進行如本文所述的篩選，並且可以選擇在一種或多種相關測定中具有優異特性的抗體以用於進一步開發。
本發明的單株抗體和抗體構建體特別包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列一致或同源，而一個或多個鏈的其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列一致或同源，以及這些抗體的片段，只要它們展現出所希望的生物活性即可(美國專利案號4,816,567；Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國國家科學院院刊], 81: 6851-6855 (1984))。本文感興趣的嵌合抗體包括“優先化”抗體，其包含源自非人靈長類動物(例如，舊大陸猴、猿等)的可變結構域抗原結合序列和人恒定區序列。已經描述了多種製備嵌合抗體的方法。參見例如，Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.[美國國家科學院院刊] 81:6851 , 1985；Takeda等人，Nature[自然] 314:452, 1985、Cabilly等人，美國專利案號4,816,567；Boss等人，美國專利案號4,816,397；Tanaguchi等人，EP 0171496；EP 0173494；和GB 2177096。
抗體、抗體構建體、抗體片段或抗體變體也可以藉由例如WO 98/52976或WO 00/34317中揭露的方法藉由人T細胞表位的特定缺失(稱為“去免疫”的方法)進行修飾。簡而言之，可以分析抗體的重鏈和輕鏈可變結構域中與MHC II類結合的肽；這些肽表示潛在的T細胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317中所定義)。為了檢測潛在的T細胞表位，可以應用稱為“肽穿線”的電腦建模方法，此外，可以在人MHC Il類結合肽的資料庫中搜索VH和VL序列中存在的基序，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。這些基序與18種主要的MHC Il類DR同種異型中的任何一種結合，因此構成潛在的T細胞表位。檢測到的潛在T細胞表位可以藉由取代可變結構域中的少量胺基酸殘基來消除，或者較佳的是藉由單個胺基酸取代來消除。通常，進行保守取代。通常但非唯一地，可以使用人種系抗體序列中的位置所共有的胺基酸。人種系序列揭露在例如Tomlinson, 等人 (1992) J. MoI. Biol.[分子生物學雜誌] 227:776-798；Cook, G.P. 等人 (1995) Immunol. Today[今日免疫學] 第16卷 (5): 237-242；和Tomlinson等人 (1995) EMBO J.[歐洲分子生物學雜誌] 14: 14:4628-4638中。V BASE目錄提供了人類免疫球蛋白可變區序列的綜合目錄(由英國劍橋Tomlinson, LA. 等人 MRC Centre for Protein Engineering[MRC蛋白質工程中心]編輯)。這些序列可用作例如框架區和CDR的人序列的來源。也可以使用共有的人框架區，例如如美國專利案號6,300,064中所述。
“人源化”抗體、抗體構建體、其變體或片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其他抗原結合子序列)係大多數人序列的抗體或免疫球蛋白，其含有一個或多個源自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多數情況下，人源化抗體係人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的高變區(也稱CDR)的殘基被來自非人(例如齧齒動物)物種(如小鼠、大鼠、倉鼠或兔)的具有所需特異性、親和力和容量的高變區(供體抗體)的殘基替代。在一些情況下，人類免疫球蛋白的Fv框架區(FR)殘基被相應的非人類殘基替代。此外，如本文所用的“人源化抗體”還可以包括受體抗體或供體抗體中不存在的殘基。進行這些修飾以進一步改進和優化抗體性能。人源化抗體還可以包含典型地是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定區(Fc)的至少一部分。對於進一步的細節，參見Jones等人，Nature[自然], 321: 522-525 (1986)；Reichmann等人，Nature[自然], 332: 323-329 (1988)；和Presta, Curr. Op. Struct. Biol.[結構生物學評論], 2: 593-596 (1992)。
可以藉由用來自人Fv可變結構域的等價序列替代不直接參與抗原結合的Fv可變結構域的序列來生成人源化抗體或其片段。用於生成人源化抗體或其片段的示例性方法由以下參考文獻提供：Morrison (1985) Science[科學] 229:1202-1207；Oi等人 (1986) BioTechniques[生物技術] 4:214；和US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；以及US 6,407,213。那些方法包括分離、操作和表現編碼來自重鏈或輕鏈中的至少一種的全部或部分免疫球蛋白Fv可變結構域的核酸序列。這種核酸可以如上所述藉由產生針對預定靶標的抗體從雜交瘤獲得以及從其他來源獲得。然後可以將編碼人源化抗體分子的重組DNA選殖至合適的表現載體中。
人源化抗體也可以使用轉基因動物如表現人重鏈和輕鏈基因但不能表現內源小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的小鼠產生。Winter描述了可用於製備本文所述的人源化抗體的示例性CDR移植方法(美國專利案號5,225,539)。特定人抗體的全部CDR可以用至少一部分非人CDR替代，或者僅一些CDR可以用非人CDR替代。僅需要替代人源化抗體與預定抗原結合所需的CDR數量。
可以藉由引入保守取代、共有序列取代、種系取代和/或回復突變來優化人源化抗體。這種改變的免疫球蛋白分子可以藉由本領域已知的幾種技術(例如，Teng等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.[美國國家科學院院刊], 80: 7308-7312, 1983；Kozbor等人，Immunology Today[今日免疫學], 4: 7279, 1983；Olsson等人，Meth. Enzymol.[酶學方法], 92: 3-16, 1982以及EP 239 400)中的任何一種來製備。
術語“人抗體”、“人抗體構建體”和“人結合結構域”包括抗體、抗體構建體和具有抗體區域(如可變區和恒定區)的結合結構域或基本上對應於本領域已知的人種系免疫球蛋白序列的結構域，該人種系免疫球蛋白序列包括例如Kabat等人 (1991)(在上述引文中)描述的那些。本發明的人抗體、抗體構建體或結合結構域可包括例如在CDR3中，特別是在CDR3中不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，藉由體外隨機或側特異性誘變或藉由體內體細胞突變引入的突變)。人抗體、抗體構建體或結合結構域可以具有至少一個、兩個、三個、四個、五個或更多個被胺基酸殘基替代的位置，該胺基酸殘基不由人種系免疫球蛋白序列編碼。然而，如本文所用的人抗體、抗體構建體和結合結構域的定義也涵蓋“完全人抗體”，其僅包括非人工和/或遺傳改變的人抗體序列，因為那些人抗體序列可藉由使用技術或系統如Xenomouse得到。較佳的是，“完全人抗體”不包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基。
在一些實施方式中，本發明的抗體構建體係“分離的”或“基本上純的”抗體構建體。當用於描述本文揭露的抗體構建體時，“分離的”或“基本上純的”意指已經從其生產環境的組分中鑒定、分離和/或回收的抗體構建體。較佳的是，抗體構建體不含來自其生產環境的所有其他組分或基本上不與來自其生產環境的所有其他組分相關。其生產環境的污染組分(如由重組轉染細胞產生的污染組分)係通常會干擾多肽的診斷或治療用途的物質，並且該物質可包括酶、激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。按重量計，抗體構建體可以例如占給定樣品中總蛋白質的至少約5%或至少約50%。應當理解，按重量計，分離的蛋白質可根據情況占總蛋白質含量的5%至99.9%。可以藉由使用誘導型啟動子或高表現啟動子以製備顯著更高濃度的多肽，使得製備增加的濃度水平的多肽。該定義包括在本領域已知的多種生物和/或宿主細胞中產生抗體構建體。在較佳的實施方式中，將抗體構建體 (1) 純化至足以藉由使用旋轉杯測序儀獲得至少15個N-末端或內部胺基酸序列殘基的程度，或 (2) 藉由SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍或較佳的是銀染色來純化至均勻。然而，通常，分離的抗體構建體藉由至少一個純化步驟來製備。
與本發明有關的術語“結合結構域”表徵了一種結構域，該結構域(特異性地)結合/相互作用/識別靶分子(抗原)上給定的靶表位或給定的靶側，分別例如CD33和CD3。第一結合結構域的結構和功能(識別例如CD33)且較佳的是第二結合結構域的結構和/或功能(識別例如CD3)係基於抗體例如全長或整個免疫球蛋白分子的結構和/或功能，和/或從抗體或其片段的可變重鏈(VH)和/或可變輕鏈(VL)結構域中提取。較佳的是，第一結合結構域的特徵在於三個輕鏈CDR(即VL區的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三個重鏈CDR(即VH區的CDR1、CDR2和CDR3)的存在。第二結合結構域還較佳的是包含允許靶標結合的抗體的最低結構要求。更較佳的是，第二結合結構域包含至少三個輕鏈CDR(即VL區的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三個重鏈CDR(即VH區的CDR1、CDR2和CDR3)。設想第一和/或第二結合結構域由噬菌體展示或文庫篩選方法產生或可藉由噬菌體展示或文庫(library)篩選方法獲得，而不是藉由將CDR序列從預先存在的(單株)抗體移植到支架中產生或獲得。
根據本發明，結合結構域係一種或多種多肽的形式。此類多肽可包括蛋白質部分和非蛋白質部分(例如化學接頭或化學交聯劑，如戊二醛)。蛋白質(包括其片段、較佳的是生物活性片段，以及通常具有少於30個胺基酸的肽)包含經由共價肽鍵彼此偶聯的兩個或更多個胺基酸(產生胺基酸鏈)。
如本文所用的術語“多肽”描述了一組分子，其通常由多於30個胺基酸組成。多肽可以進一步形成多聚體，如二聚體、三聚體和更高級的寡聚體，即由多於一種多肽分子組成。形成這種二聚體、三聚體等的多肽分子可以相同或不同。因此，這種多聚體的相應高序結構稱為同源或異源二聚體、同源或異源三聚體等。異源多聚體的實例係抗體分子，其天然存在的形式由兩條相同的多肽輕鏈和兩條相同的多肽重鏈組成。術語“肽”、“多肽”和“蛋白質”也指天然修飾的肽/多肽/蛋白質，其中修飾例如藉由諸如糖基化、乙醯化、磷酸化等翻譯後修飾來實現。當在本文中提及時，“肽”、“多肽”或“蛋白質”也可以是化學修飾的，如聚乙二醇化的。此類修飾在本領域中是熟知的並且在下文中描述。
較佳的是，結合靶細胞表面抗原的結合結構域和/或結合CD3ε的結合結構域係人結合結構域。包含至少一種人結合結構域的抗體和抗體構建體避免了與具有非人如齧齒動物(例如鼠、大鼠、倉鼠或兔)可變區和/或恒定區的抗體或抗體構建體相關的一些問題。這種齧齒動物來源的蛋白質的存在可以導致抗體或抗體構建體的快速清除，或者可以導致患者生成針對抗體或抗體構建體的免疫應答。為了避免使用齧齒動物來源的抗體或抗體構建體，可以藉由將人抗體功能引入齧齒動物中來生成人或完全人抗體/抗體構建體，使得齧齒動物產生完全人抗體。
在YAC中選殖和重建兆鹼基大小的人類基因座並將它們引入小鼠種系的能力提供了一種強有力的方法，用於闡明非常大或粗略作圖的基因座的功能組分以及生成有用的人類疾病模型。此外，使用這種技術將小鼠基因座取代為其人類等同物可以提供關於對人類基因產物在發育期間的表現和調節、它們與其他系統的交流以及它們參與疾病誘導和進展的獨特見解。
這種策略的一個重要實際應用係小鼠體液免疫系統的“人源化”。將人免疫球蛋白(Ig)基因座引入其中內源Ig基因已經失活的小鼠中提供了研究抗體的程式化表現和組裝的機制以及它們在B細胞發育中的作用的機會。此外，這種策略可以提供產生完全人單株抗體(mAb)的理想來源-這係關於實現抗體治療人類疾病的重要里程碑。預期完全人抗體或抗體構建體使小鼠或小鼠衍生的mAb固有的免疫原性和過敏反應最小化，從而提高給予的抗體/抗體構建體的功效和安全性。可以預期使用完全人抗體或抗體構建體在治療需要重複化合物給予的慢性和復發性人類疾病如炎症、自身免疫和癌症方面提供了顯著優勢。
實現該目標的一種方法係用人Ig基因座的大片段工程化在小鼠抗體產生方面有缺陷的小鼠品系，預期這樣的小鼠在沒有小鼠抗體的情況下會產生大量的人抗體。大的人Ig片段將保留大的可變基因多樣性以及對抗體產生和表現的適當調節。藉由利用小鼠的抗體多樣化和選擇機制以及缺乏對人蛋白質的免疫耐受性，這些小鼠品系中的再生人抗體庫應產生針對任何感興趣的抗原(包括人抗原)的高親和力抗體。藉由使用雜交瘤技術，可以容易地產生和選擇具有所需特異性的抗原特異性人mAb。這種一般策略與第一代XenoMouse小鼠品系有關(參見Green等人 Nature Genetics[自然遺傳學] 7:13-21 (1994))。XenoMouse品系採用分別含有人重鏈基因座和κ輕鏈基因座的245 kb和190 kb大小的種系構型片段的酵母人工染色體(YAC)進行工程化，所述種系構型片段含有核心可變區和恒定區序列。證明含有人Ig的YAC與小鼠系統關於抗體的重排和表現係相容的，並且能夠取代失活的小鼠Ig基因。這藉由它們誘導B細胞發育、產生成人樣的人類完全人抗體庫以及生成抗原特異性人mAb的能力來證明。這些結果還表明，引入含有更多V基因、附加調節元件和人Ig恒定區的更大部分的人Ig基因座可能基本上概括具有感染和免疫的人體液反應特徵的完整庫。Green等人的工作最近擴展到藉由分別引入人重鏈基因座和κ輕鏈基因座的兆鹼基大小的種系構型YAC片段來引入大於約80%的人抗體庫。參見Mendez等人 Nature Genetics[自然遺傳學] 15:146-156 (1997)和美國專利申請序號08/759,620。
XenoMouse小鼠的產生在以下參考文獻中進一步討論和描述：美國專利申請序號07/466,008、序號07/610,515、序號07/919,297、序號07/922,649、序號08/031,801、序號08/112,848、序號08/234,145、序號08/376,279、序號08/430,938、序號08/464,584、序號08/464,582、序號08/463,191、序號08/462,837、序號08/486,853、序號08/486,857、序號08/486,859、序號08/462,513、序號08/724,752和序號08/759,620；和美國專利案號6,162,963；6,150,584；6,114,598；6,075,181和5,939,598以及日本專利案號3 068 180 B2、3 068 506 B2和3 068 507 B2。還參見Mendez等人 Nature Genetics[自然遺傳學] 15:146-156 (1997) 以及Green和Jakobovits J. Exp. Med.[實驗醫學學報] 188:483-495 (1998)、EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310和WO 03/47336。
在替代性方法中，包括GenPharm國際公司在內的其他公司已經採用了“迷你基因座”方法。在迷你基因座方法中，藉由包含來自Ig基因座的碎片(單獨基因)來模擬外源Ig基因座。因此，一個或多個VH基因、一個或多個DH基因、一個或多個JH基因、mu恒定區和第二恒定區(較佳的是γ恒定區)形成用於插入動物中的構建體。該方法描述在以下參考文獻中：Surani等人的美國專利案號5,545,807；以及Lonberg和Kay的美國專利案號5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458；Krimpenfort和Berns的美國專利案號5,591,669和6,023.010；Berns等人的美國專利案號5,612,205、5,721,367和5,789,215；以及Choi和Dunn的美國專利案號5,643,763；以及GenPharm國際美國專利申請序號07/574,748、序號07/575,962、序號07/810,279、序號07/853,408、序號07/904,068、序號07/990,860、序號08/053,131、序號08/096,762、序號08/155,301、序號08/161,739、序號08/165,699、序號08/209,741。還參見EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884以及美國專利案號5,981,175。進一步參見Taylor等人 (1992)、Chen等人 (1993)、Tuaillon等人 (1993)、Choi等人 (1993)、Lonberg等人 (1994)、Taylor等人 (1994)以及Tuaillon等人 (1995)、Fishwild等人 (1996)。
Kirin還證明了從小鼠中生成人抗體，在該小鼠中藉由微細胞融合已經引入了大的染色體碎片或整個染色體。參見歐洲專利申請案號773 288和843 961。Xenerex生物科學正在開發一種可能生成人類抗體的技術。在該技術中，SCID小鼠用人淋巴細胞例如B和/或T細胞重組。然後用抗原免疫小鼠並可以生成針對抗原的免疫應答。參見美國專利案號5,476,996；5,698,767；和5,958,765。
人抗小鼠抗體(HAMA)反應已引導該行業製備嵌合抗體或其他人源化抗體。然而，預期將觀察到特別是在抗體的長期或多劑量利用中某些人抗嵌合抗體(HACA)反應。因此，期望提供抗體構建體，其包含針對靶細胞表面抗原的人結合結構域和針對CD3ε的人結合結構域，以解決HAMA或HACA反應的問題和/或影響。
術語“(特異性地)結合”、“(特異性地)識別”、“(特異性地)針對”和“(特異性地)反應”根據本發明意指結合結構域與靶分子(抗原)上的給定表位或給定靶側相互作用或特異性地相互作用，所述靶分子在此處分別係靶細胞表面抗原和CD3ε。
術語“表位”係指抗原上的一側，該抗原係結合結構域如抗體或免疫球蛋白或者抗體或免疫球蛋白的衍生物、片段或變體所特異性地結合的。“表位”係抗原性的，因此術語表位有時在本文中也稱為“抗原結構”或“抗原決定簇”。因此，結合結構域係“抗原相互作用側”。所述結合/相互作用也被理解為定義為“特異性識別”。
“表位”可以由連續胺基酸或藉由蛋白質的三級折疊並置的非連續胺基酸形成。“線性表位”係表位，其中胺基酸一級序列包含識別的表位。線性表位通常包括獨特序列中的至少3個或至少4個、以及更通常至少5個或至少6個或至少7個例如約8個至約10個胺基酸。
與線性表位相反，“構象表位”係表位，其中包含該表位的胺基酸的一級序列不是識別的表位的唯一限定組分(例如，一表位，其中胺基酸的一級序列不一定由結合結構域識別)。通常，構象表位相對於線性表位包含增加數量的胺基酸。關於構象表位的識別，結合結構域識別抗原的三維結構，較佳的是肽或蛋白質或其片段(在本發明的上下文中，結合結構域的抗原結構包含在靶細胞表面抗原蛋白內)。例如，當蛋白質分子折疊形成三維結構時，形成構象表位的某些胺基酸和/或多肽骨架被並置，使得抗體能夠識別表位。確定表位構象的方法包括但不限於X射線晶體學、二維核磁共振(2D-NMR)光譜和定點自旋標記和電子順磁共振(EPR)光譜。
用於表位作圖的方法描述如下：當人靶細胞表面抗原蛋白中的區域(連續胺基酸序列段)被更換/替代為其非人和非靈長類動物靶細胞表面抗原(例如，小鼠靶細胞表面抗原，但也可以想像諸如雞、大鼠、倉鼠、兔等其他動物靶細胞表面抗原)的相應區域時，預期會發生結合結構域的結合減少，除非結合結構域對於所使用的非人、非靈長類動物靶細胞表面抗原係交叉反應的。與結合人靶細胞表面抗原蛋白中的相應區域相比，所述的減少較佳的是至少10%、20%、30%、40%或50%；更較佳的是至少60%、70%或80%、最較佳的是90%、95%或甚至100%，由此與人靶細胞表面抗原蛋白中的相應區域的結合被設定為100%。設想前述人靶細胞表面抗原/非人靶細胞表面抗原嵌合體在CHO細胞中表現。還設想人靶細胞表面抗原/非人靶細胞表面抗原嵌合體與不同膜結合蛋白如EpCAM的跨膜結構域和/或細胞質結構域融合。
在表位作圖的替代或另外的方法中，可以生成幾種截短形式的人靶細胞表面抗原細胞外結構域，以確定由結合結構域識別的特異性區域。在這些截短形式中，從N-末端開始逐步缺失不同的細胞外靶細胞表面抗原結構域/子結構域或區域。設想截短的靶細胞表面抗原形式可以在CHO細胞中表現。還設想截短的靶細胞表面抗原形式可以與不同膜結合蛋白如EpCAM的跨膜結構域和/或細胞質結構域融合。還設想截短的靶細胞表面抗原形式可以在其N-末端包含訊號肽結構域，例如源自小鼠IgG重鏈訊號肽的訊號肽。進一步設想截短的靶細胞表面抗原形式可以在其N-末端(在訊號肽之後)包含v5結構域，其允許驗證它們在細胞表面上的正確表現。預期那些截短的靶細胞表面抗原形式會發生結合的減少或喪失，所述截短的靶細胞表面抗原形式不再包含結合結構域所識別的靶細胞表面抗原區域。結合的減少較佳的是至少10%、20%、30%、40%、50%，更較佳的是至少60%、70%、80%，且最較佳的是90%、95%或甚至100%，由此與整個人靶細胞表面抗原蛋白(或其細胞外區域或結構域)的結合被設定為100。
確定靶細胞表面抗原的特異性殘基對藉由抗體構建體或結合結構域識別的貢獻的進一步方法係丙胺酸掃描(參見例如Morrison KL和Weiss GA. Cur Opin Chem Biol.[化學生物學新見] 2001年6月;5(3):302-7)，其中待分析的每個殘基例如經由定點誘變被丙胺酸替代。使用丙胺酸係因為它具有非龐大的、化學惰性的甲基官能基，但仍模仿許多其他胺基酸所具有的二級結構參考。有時，在需要保持突變殘基大小的情況下，可以使用龐大的胺基酸如纈胺酸或亮胺酸。丙胺酸掃描係一項已經使用了很長一段時間的成熟技術。
結合結構域與表位或包含該表位的區域之間的相互作用意味著結合結構域對表位/包含特定蛋白質或抗原(此處分別為靶細胞表面抗原和CD3)上的表位的區域顯示出明顯的親和力，並且通常不顯示與除靶細胞表面抗原或CD3之外的蛋白質或抗原顯著的反應性。“明顯的親和力”包括以約10-6 M(KD)或更強的親和力的結合。較佳的是，當結合親和力為約10-12 至10-8 M、10-12 至10-9 M、10-12 至10-10 M、10-11 至10-8 M，較佳的是約10-11 至10-9 M時，結合被認為係特異性的。結合結構域是否與靶標特異性地反應或結合可以尤其藉由以下方式容易地測試：比較所述結合結構域與靶蛋白或抗原的反應與所述結合結構域與除靶細胞表面抗原或CD3之外的蛋白質或抗原的反應。較佳的是，本發明的結合結構域本質上或基本上不結合除靶細胞表面抗原或CD3之外的蛋白質或抗原(即，第一結合結構域較佳的是不能結合除靶細胞表面抗原之外的蛋白質，並且第二結合結構域不能結合除CD3之外的蛋白質。根據本發明的抗體構建體的設想特徵係與其他HLE形式相比具有優異的親和力特徵。因此，這種優異的親和力表明體內延長的半衰期。根據本發明的抗體構建體的較長半衰期可以減少給予的持續時間和頻率，這通常有助於改善患者依從性。這係特別重要的，因為本發明的抗體構建體對高度虛弱或甚至多病態癌症患者特別有益。
術語“本質上/基本上不結合”或“不能結合”意指本發明的結合結構域不結合除靶細胞表面抗原或CD3之外的蛋白質或抗原，即，顯示與除靶細胞表面抗原或CD3之外的蛋白質或抗原的反應性不超過30%、較佳的是不超過20%、更較佳的是不超過10%、特別較佳的是不超過9%、8%、7%、6%或5%，借此與靶細胞表面抗原或CD3的結合被分別設定為100%。
認為特異性結合受結合結構域和抗原的胺基酸序列中的特定基序的影響。因此，由於它們的一級、二級和/或三級結構以及所述結構的二次修飾的結果，實現了結合。抗原相互作用側與其特異性抗原的特異性相互作用可導致所述側與抗原的簡單結合。此外，抗原相互作用側與其特異性抗原的特異性相互作用可以替代地或另外地導致例如由於誘導抗原構象的改變、抗原的寡聚化等引起的訊號的啟動。
術語“可變的”係指抗體或免疫球蛋白結構域的部分，其在序列中顯示出可變性，並且涉及確定特定抗體(即“一種或多種可變結構域”)的特異性和結合親和力。可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)的配對一起形成單個抗原結合側。
可變性不是均勻分佈在抗體的可變結構域中；它集中在重鏈和輕鏈可變區中的每一個的子結構域中。這些子結構域稱為“高變區”或“互補決定區”(CDR)。可變結構域的更保守(即，非高變)部分稱為“框架”區(FRM或FR)，並為三維空間中的六個CDR提供支架以形成抗原結合表面。天然存在的重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FRM區(FR1、FR2、FR3和FR4)，其主要採用β-片層構型，藉由三個高變區連接，這三個高變區形成連接β-片層結構的環，並且在一些情況下形成β-片層結構的一部分。每條鏈中的高變區藉由FRM緊密地保持在一起，並且來自另一條鏈的高變區有助於形成抗原結合側(參見在上述引文中的Kabat等人)。
術語“CDR”及其複數“CDR”係指互補決定區，其中三個組成輕鏈可變區(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)的結合特徵且三個組成重鏈可變區(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的結合特徵。CDR包含負責抗體與抗原的特異性相互作用的大多數殘基，因此有助於抗體分子的功能活性：它們係抗原特異性的主要決定因素。
確切的明確CDR邊界和長度受不同的分類和編號系統的限制。因此，CDR可以藉由Kabat、Chothia、接觸或任何其他邊界定義來指代，包括本文所述的編號系統。儘管邊界不同，但這些系統中的每一個具有在構成可變序列內所謂的“高變區”的一定程度的重疊。因此，根據這些系統的CDR定義可以在長度和相對於相鄰框架區域的邊界區域方面不同。參見例如Kabat(基於跨物種序列可變性的方法)、Chothia(基於抗原抗體複合物的晶體學研究的方法)和/或MacCallum(在上述引文中的Kabat等人；Chothia等人，J. MoI. Biol[分子生物學雜誌], 1987, 196: 901-917；以及MacCallum等人，J. MoI. Biol[分子生物學雜誌], 1996, 262: 732)。用於表徵抗原結合側的又另一個標準係Oxford Molecular的AbM抗體建模軟體所使用的AbM定義。參見例如，Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[抗體可變結構域的蛋白質序列和結構分析].在Antibody Engineering Lab Manual [抗體工程實驗室手冊](編輯：Duebel, S.和Kontermann, R.，施普林格出版社(Springer-Verlag)，海德爾堡)中。就兩種殘基識別技術定義重疊的區域而非相同區域而言，它們可以組合以定義雜交 CDR。但是根據所謂的Kabat系統的編號係較佳的。
通常，CDR形成環結構，其可以被分類為規範結構。術語“規範結構”係指抗原結合(CDR)環所採用的主鏈構象。從比較結構研究中，已發現六個抗原結合環中的五個僅具有有限的可用構象庫。每個規範結構可以藉由多肽骨架的扭轉角來表徵。因此，抗體之間的對應環可能具有非常相似的三維結構，儘管環的大部分區域具有高胺基酸序列可變性(Chothia和Lesk, J. MoI. Biol.[分子生物學雜誌], 1987, 196: 901；Chothia等人，Nature[自然], 1989, 342: 877；Martin和Thornton, J. MoI. Biol[分子生物學雜誌], 1996, 263: 800)。此外，採用的環結構與其周圍的胺基酸序列之間存在關係。特定規範類的構象由環的長度和位於環內以及保守框架內(即環的外部)關鍵位置的胺基酸殘基來決定。因此，可以基於這些關鍵胺基酸殘基的存在來對特定規範類進行分配。
術語“規範結構”還可以包括關於抗體線性序列的考慮，例如如Kabat所編目的(在上述引文中的Kabat等人)。Kabat編號方案(系統)係以一致的方式對抗體可變結構域的胺基酸殘基進行編號的廣泛採用的標準，並且是如本文其他地方所述的本發明中應用的較佳的方案。附加的結構考慮也可用於確定抗體的規範結構。例如，Kotat編號未完全反映的那些差異可以藉由Chothia等人的編號系統來描述和/或藉由其他技術例如晶體學和二維或三維計算建模來揭示。因此，可以將給定的抗體序列置於規範類中，其允許鑒定適當的底盤序列(chassis sequence)(例如，基於在文庫中包括多種規範結構的期望)等。在文獻中描述了上述引文中的Chothia等人描述的抗體胺基酸序列的Kabat編號和結構考慮及其對於構建抗體結構的規範方面的意義。不同類別的免疫球蛋白的亞單元結構和三維構型係本領域熟知的。關於抗體結構的綜述，參見Antibodies: A Laboratory Manual[抗體：實驗室手冊], Cold Spring Harbor Laboratory, eds.[冷泉港實驗室，編輯] Harlow等人，1988。
輕鏈的CDR3，特別是重鏈的CDR3可構成輕鏈和重鏈可變區內抗原結合中最重要的決定簇。在一些抗體構建體中，重鏈CDR3似乎構成抗原與抗體之間的主要接觸區域。其中CDR3單獨變化的體外選擇方案可用於改變抗體的結合特性或確定哪些殘基有助於抗原的結合。因此，CDR3通常是抗體結合側中分子多樣性的最大來源。例如，H3可以短至兩個胺基酸殘基或大於26個胺基酸。
在經典的全長抗體或免疫球蛋白中，每條輕(L)鏈藉由一個共價二硫鍵與重(H)鏈連接，而兩條H鏈藉由一個或多個二硫鍵彼此連接，這取決於H鏈同種型。最接近VH的CH結構域通常稱為CH1。恒定(“C”)結構域不直接參與抗原結合，但顯示出各種效應功能，如抗體依賴性、細胞介導的細胞毒性和補體活化。抗體的Fc區包含在重鏈恒定結構域內，並且例如能夠與位於細胞表面的Fc受體相互作用。
組裝和體細胞突變後的抗體基因序列變化很大，估計這些不同的基因編碼1010 個不同的抗體分子(Immunoglobulin Genes, 2nd ed.[免疫球蛋白基因，第2版], Jonio等人編輯, Academic Press[學術出版社，聖地牙哥，加利福尼亞州], 1995)。因此，免疫系統提供了免疫球蛋白庫。術語“庫”係指至少一種核苷酸序列，其完全或部分源自編碼至少一種免疫球蛋白的至少一種序列。該一種或多種序列可以藉由重鏈的V、D和J區段以及輕鏈的V和J區段在體內重排來生成。可替代地，該一種或多種序列可以由細胞響應於例如體外刺激發生重排來生成。可替代地，該一種或多種序列的部分或全部可藉由DNA剪接、核苷酸合成、誘變和其他方法獲得，參見例如美國專利5,565,332。庫可以僅包含一種序列或可以包含多種序列，包括遺傳多樣化集合中的序列。
與本發明有關的術語“Fc部分”或“Fc單體”意指多肽，其包含至少一種具有CH2結構域功能的結構域和至少一種具有免疫球蛋白分子的CH3結構域功能的結構域。從術語“Fc單體”清楚的是，包含那些CH結構域的多肽係“多肽單體”。Fc單體可以是多肽，其至少包含免疫球蛋白的恒定區的片段的多肽，不包括重鏈的第一恒定區免疫球蛋白結構域(CH1)，但至少保持一個CH2結構域的功能部分和一個CH3結構域的功能部分，其中CH2結構域係CH3結構域的胺基末端。在該定義的較佳的方面，Fc單體可以是包含Ig-Fc鉸鏈區的一部分的多肽恒定區、CH2區和CH3區，其中鉸鏈區係CH2結構域的胺基末端。設想本發明的鉸鏈區促進二聚化。此類Fc多肽分子可藉由例如但不限於免疫球蛋白區域的木瓜蛋白酶消化(當然產生兩個Fc多肽的二聚體)來獲得。在該定義的另一個方面，Fc單體可以是包含CH2區和CH3區的一部分的多肽區。此類Fc多肽分子可藉由例如但不限於免疫球蛋白分子的胃蛋白酶消化來獲得。在一個實施方式中，Fc單體的多肽序列與以下區域的Fc多肽序列基本類似：IgG1 Fc區、IgG2 Fc區、IgG3 Fc區、IgG4 Fc區、IgM Fc區、IgA Fc區、IgD Fc區和IgE Fc區。(參見例如，Padlan, Molecular Immunology[分子免疫學], 31(3), 169-217 (1993))。由於免疫球蛋白之間存在一些變化，並且僅為了清楚起見，Fc單體係指IgA、IgD和IgG的最後兩個重鏈恒定區免疫球蛋白結構域，以及IgE和IgM的最後三個重鏈恒定區免疫球蛋白結構域。如上所述，Fc單體還可以包括這些結構域的柔性鉸鏈N-末端。對於IgA和IgM，Fc單體可包括J鏈。對於IgG，Fc部分包含免疫球蛋白結構域CH2和CH3以及前兩個結構域與CH2之間的鉸鏈。儘管Fc部分的邊界可以變化，但包含功能性鉸鏈、CH2和CH3結構域的人IgG重鏈Fc部分的實例可定義為例如包含殘基D231(鉸鏈結構域的-對應於下表1中的D234)至P476，對應地為CH3結構域的羧基末端的L476(對於IgG4 )，其中編號根據Kabat。經由肽接頭彼此融合的兩個Fc部分或Fc單體限定了本發明的抗體構建體的第三結構域，其也可以定義為scFc結構域。
在本發明的一個實施方式中，設想本文揭露的scFc結構域，即對應地彼此融合的Fc單體僅包含在抗體構建體的第三結構域中。 根據本發明，可以使用表1中列出的Kabat編號藉由類推來鑒定IgG鉸鏈區。與上文一致，設想本發明的鉸鏈結構域/區域包含對應於根據Kabat編號的D234至P243的IgG1 序列段的胺基酸殘基。同樣設想本發明的鉸鏈結構域/區域包含IgG1鉸鏈序列DKTHTCPPCP(SEQ ID NO: 182)或由其組成(還設想了對應於如下表1中所示的序列段D234至P243-所述序列的變體，只要鉸鏈區仍然促進二聚化)。在本發明較佳的實施方式中，抗體構建體的第三結構域中CH2結構域的Kabat位置314處的糖基化位點藉由N314X取代去除，其中X係除Q之外的任何胺基酸。所述取代較佳的是N314G取代。在更較佳的實施方式中，所述CH2結構域另外包含以下取代(根據Kabat的位置)：V321C和R309C(這些取代在Kabat位置309和321處引入結構域內半胱胺酸二硫鍵)。 還設想本發明的抗體構建體的第三結構域以胺基到羧基的順序包含以下各項或由以下各項組成：DKTHTCPPCP(SEQ ID NO: 182)(即鉸鏈)-CH2-CH3-接頭-DKTHTCPPCP(SEQ ID NO: 182)(即鉸鏈)-CH2-CH3。上述抗體構建體的肽接頭在較佳的實施方式中，其特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser即Gly4 Ser(SEQ ID NO: 187)，或其聚合物即(Gly4 Ser)x，其中x係5或更大的整數(例如5、6、7、8等或更大)，較佳的是6((Gly4Ser)6)。所述構建體可以進一步包含上述取代N314X、較佳的是N314G，和/或其他取代V321C和R309C。在如上文所定義的本發明抗體構建體的較佳的實施方式中，設想第二結構域結合人和/或獼猴CD3ε鏈的細胞外表位。 [表1]：鉸鏈區胺基酸殘基的Kabat編號 在本發明的進一步實施方式中，鉸鏈結構域/區域包含以下各項或由以下各項組成：IgG2亞型鉸鏈序列ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO: 183)、IgG3亞型鉸鏈序列ELKTPLDTTHTCPRCP(SEQ ID NO: 184)或ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO: 185)和/或IgG4亞型鉸鏈序列ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO: 186)。IgG1亞型鉸鏈序列可以是以下一種EPKSCDKTHTCPPCP(如表1和SEQ ID NO: 183所示)。因此，在本發明的上下文中也設想了這些核心鉸鏈區。
IgG CH2和IgG CD3結構域的位置和序列可以使用表2中列出的Kabat編號藉由類推來鑒定： [表2]：IgG CH2和CH3區的胺基酸殘基的Kabat編號
在本發明的一個實施方式中，第一或兩個Fc單體的CH3結構域中強調的粗體胺基酸殘基係缺失的。
肽接頭-第三結構域的多肽單體(“Fc部分”或“Fc單體”)經由它彼此融合-較佳的是包含至少25個胺基酸殘基(25、26、27、28、29、30等)。更較佳的是，該肽接頭包含至少30個胺基酸殘基(30、31、32、33、34、35等)。接頭還較佳的是包含多達40個胺基酸殘基、更較佳的是多達35個胺基酸殘基、最較佳的是恰好30個胺基酸殘基。這種肽接頭的較佳的實施方式的特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser即Gly4 Ser(SEQ ID NO: 187)，或其聚合物即(Gly4 Ser)x，其中x係5或更大的整數(例如6、7或8)。該整數較佳的是6或7，該整數更較佳的是6。
如果使用接頭將第一結構域與第二結構域融合或將第一結構域或第二結構域與第三結構域融合，則該接頭較佳的是具有較佳的是足以確保第一和第二結構域中的每一個都能夠彼此獨立地保持其差異結合特異性的長度和序列。對於連接本發明抗體構建體中至少兩個結合結構域(或兩個可變結構域)的肽接頭，較佳的是那些僅包含少量胺基酸殘基例如12個胺基酸殘基或更少的肽接頭。因此，較佳的是具有12、11、10、9、8、7、6或5個胺基酸殘基的肽接頭。設想的具有少於5個胺基酸的肽接頭包含4、3、2或一個胺基酸，其中較佳的是富含Gly的接頭。用於融合第一和第二結構域的肽接頭的較佳的實施方式描述於SEQ ID NO: 1中。用於融合第二和第三結構域的肽接頭的較佳的接頭實施方式係(Gly)4 -接頭，其分別為G4 -接頭。
在上述“肽接頭”之一的上下文中特別較佳的“單一”胺基酸係Gly。因此，所述肽接頭可以由單個胺基酸Gly組成。在本發明的較佳的實施方式中，肽接頭的特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser即Gly4 Ser(SEQ ID NO: 187)，或其聚合物即(Gly4 Ser)x，其中x係1或更大的整數(例如2或3)。較佳的接頭描述於SEQ ID No: 1至12中。包括不存在二級結構的促進作用的所述肽接頭的特徵係本領域已知的，並且描述於例如Dall’Acqua等人(Biochem.[生物化學] (1998) 37, 9266-9273)、Cheadle等人(Mol Immunol[分子免疫學] (1992) 29, 21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB[美國實驗生物學會聯合會] (1995) 9(1), 73-80)。此外，較佳的是不促進任何二級結構的肽接頭。所述結構域彼此的連接可以例如藉由基因工程提供，如實例中所述。製備融合和可操作地連接的雙特異性單鏈構建體並在哺乳動物細胞或細菌中表現它們的方法係本領域熟知的(例如WO 99/54440或Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊], Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港實驗室出版社，紐約冷泉港], 2001)。
在抗體構建體或本發明的較佳的實施方式中，第一和第二結構域以選自由(scFv)2 、scFv單結構域mAb、雙抗體和任何這些形式的寡聚體組成的群組的形式形成抗體構建體。
根據特別較佳的實施方式，並且如所附實例中所述，本發明的抗體構建體的第一和第二結構域係“雙特異性單鏈抗體構建體”、更較佳的是雙特異性“單鏈Fv”(scFv)。儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由獨立基因編碼，但是使用重組方法可以將它們藉由能夠使這兩個結構域作為單條蛋白質鏈產生的合成接頭(如上文所述)連接，在所述單條多肽鏈中VL和VH區配對形成單價分子；參見例如，Huston等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA[美國國家科學院院刊] 85:5879-5883。使用熟悉該項技術者已知的常規技術獲得這些抗體片段，並以按照與完整或全長抗體相同的方式評價片段的功能。因此，單鏈可變片段(scFv)係免疫球蛋白的重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區的融合蛋白，其通常與約10至約25個胺基酸、較佳的是約15至20個胺基酸的短接頭肽連接。接頭通常富含甘胺酸以獲得柔韌性，以及絲胺酸或蘇胺酸以獲得溶解性，並且可以使VH的N-末端與VL的C-末端連接，或反之亦然。儘管去除了恒定區並引入了接頭，但該蛋白質保留了原始免疫球蛋白的特異性。
雙特異性單鏈抗體構建體係本領域已知的，並描述於WO 99/54440、Mack, J. Immunol.[免疫學雜誌] (1997), 158, 3965-3970、Mack, PNAS[美國國家科學院院刊], (1995), 92, 7021-7025、Kufer, Cancer Immunol. Immunother.[癌症免疫與免疫療法], (1997), 45, 193-197、Löffler, Blood[血液], (2000), 95, 6, 2098-2103、Brühl, Immunol.[免疫學], (2001), 166, 2420-2426、Kipriyanov, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌], (1999), 293, 41-56。描述用於產生單鏈抗體的技術(尤其參見美國專利4,946,778、在上述引文中的Kontermann和Dübel (2010)以及在上述引文中的Little (2009))可以適於產生特異性地識別一種或多種所選的靶標的單鏈抗體構建體。
二價(Bivalent或divalent)或雙特異性單鏈可變片段(具有(scFv)2 形式的二scFv或雙scFv)可以藉由連接兩個scFv分子(例如，如上文所述的接頭) 而被工程化。如果這兩種scFv分子具有相同的結合特異性，則所得(scFv)2 分子較佳的是稱為二價(即，對於相同的靶表位，其具有二價)。如果兩種scFv分子具有不同的結合特異性，則所得(scFv)2 分子較佳的是稱為雙特異性。可以藉由產生具有兩個VH區和兩個VL區的單條肽鏈來進行連接，從而產生串聯scFv(參見例如，Kufer P.等人，(2004) Trends in Biotechnology[生物技術趨勢] 22(5):238-244)。另一種可能性係產生具有接頭肽的scFv分子，這些接頭肽對於兩個可變區而言太短(例如約5個胺基酸)而不能折疊在一起，從而迫使scFv二聚化。這種類型稱為雙抗體(參見例如Hollinger, Philipp等人，(1993年7月) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America[美國國家科學院院刊] 90 (14): 6444-8)。
根據本發明，第一、第二或第一和第二結構域可以包含單結構域抗體，其分別為單結構域抗體的可變結構域或至少CDR。單結構域抗體僅包含一種(單體)抗體可變結構域，其能夠獨立於其他V區或結構域選擇性地結合特異性抗原。第一單結構域抗體由駱駝科動物中發現的重鏈抗體進行工程化，並且這些第一單結構與抗體被稱為VH H片段。軟骨魚類也具有重鏈抗體(IgNAR)，從這種重鏈抗體中可以獲得稱為VNAR 片段的單結構域抗體。替代性方法將來自常見免疫球蛋白例如來自人或齧齒動物的二聚體可變結構域分成單體，從而獲得作為單結構域Ab的VH或VL。雖然大多數針對單結構域抗體的研究目前基於重鏈可變結構域，但是也已經顯示源自輕鏈的奈米抗體特異性地結合靶表位。單結構域抗體的實例稱為sdAb、奈米抗體或單可變結構域抗體。
因此，(單結構域mAb)2 係由(至少)兩種單結構域單株抗體構成的單株抗體構建體，所述單結構域單株抗體單獨地選自包含VH 、VL 、VHH 和VNAR 的組。接頭較佳的是肽接頭的形式。類似地，“scFv單結構域mAb”係由如上所述的至少一種單結構域抗體和如上所述的一種scFv分子構成的單株抗體構建體。同樣，接頭較佳的是肽接頭的形式。
可以在競爭測定(如競爭性ELISA或基於細胞的競爭測定)中確定抗體構建體是否競爭與另一給定抗體構建體的結合。也可以使用親和素偶聯的微粒(珠粒)。與親和素包被的ELISA板類似，當與生物素化的蛋白質反應時，這些珠粒中的每一個都可以用作在其上可以進行測定的基底。將抗原包被在珠粒上，然後用第一抗體預包被。加入第二抗體並測定任何附加的結合。讀出的可能手段包括流式細胞術。
T細胞或T淋巴細胞係一種淋巴細胞類型(本身就是一種白細胞類型)，其在細胞介導的免疫中起著重要作用。T細胞有幾個子集，每個子集具有不同的功能。藉由在細胞表面上T細胞受體(TCR)的存在，可以將T細胞與其他淋巴細胞(如B細胞和NK細胞)區分開。TCR負責識別與主要組織相容性複合物(MHC)分子結合的抗原，並由兩條不同的蛋白質鏈構成。在95%的T細胞中，TCR由alpha(α)和beta(β)鏈組成。當TCR與抗原肽和MHC(肽/MHC複合物)結合時，T淋巴細胞藉由由相關酶、共受體、特化銜接分子和活化或釋放的轉錄因子介導的一系列生化事件被活化。
CD3受體複合物係蛋白質複合物，並由四條鏈構成。在哺乳動物中，複合物含有CD3γ(gamma)鏈、CD3δ(delta)鏈和兩條CD3ε(epsilon)鏈。這些鏈與T細胞受體(TCR)和所謂的ζ(zeta)鏈締合，形成T細胞受體CD3複合物，並在T淋巴細胞中產生活化訊號。CD3γ(gamma)、CD3δ(delta)和CD3ε(epsilon)鏈係含有單個細胞外免疫球蛋白結構域的免疫球蛋白超家族的高度相關的細胞表面蛋白。CD3分子的細胞內尾部含有稱為基於免疫受體酪胺酸活化的活化基序或簡稱ITAM的單一保守基序，其對於TCR的訊號傳導能力係必需的。CD3ε分子係人體中由位於11號染色體上的CD3E 基因編碼的多肽。CD3ε的最較佳的是表位包含在人CD3ε細胞外結構域的胺基酸殘基1-27內。設想根據本發明的抗體構建體通常且有利地顯示較少的非特異性T細胞活化，這在特異性免疫療法中是不希望的。這可以降低副作用的風險。
經由藉由多特異性、至少雙特異性抗體構建體募集T細胞的重定向裂解靶細胞包括細胞溶解性突觸形成以及穿孔素和顆粒酶的遞送。所銜接的T細胞能夠連續進行連續的靶細胞裂解，並且不受干擾肽抗原加工和呈遞的免疫逃逸機制或選殖T細胞分化的影響；參見例如，WO 2007/042261。
可以以各種方式測量由本發明的抗體構建體介導的細胞毒性。效應細胞可以是例如刺激的富集的(人)CD8陽性T細胞或未刺激的(人)外周血單核細胞(PBMC)。如果靶細胞係獼猴來源的，或表現由第一結構域結合的獼猴靶細胞表面抗原或採用由第一結構域結合的獼猴靶細胞表面抗原轉染，則效應細胞也應該是獼猴來源的，如獼猴T細胞系，例如4119LnPx。靶細胞應表現靶細胞表面抗原(的至少細胞外結構域)，例如人或獼猴靶細胞表面抗原。靶細胞可以是用靶細胞表面抗原穩定或暫態轉染的細胞系(如CHO)，例如人或獼猴靶細胞表面抗原。可替代地，靶細胞可以是靶細胞表面抗原陽性天然表現細胞系。通常，預計EC50 值較低，其中靶細胞系在細胞表面表現較高水平的靶細胞表面抗原。效應子與靶細胞(E : T)之比通常為約10 : 1，但也可以變化。靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體的細胞毒活性可以在51 Cr釋放測定(孵育時間為約18小時)或基於FACS的細胞毒性測定(孵育時間為約48小時)中測量。測定孵育時間(細胞毒性反應)的修改也是可能的。測量細胞毒性的其他方法係熟悉該項技術者熟知的，並且包括MTT或MTS測定、基於ATP的測定(包括生物發光測定)、磺醯羅丹明B(SRB)測定、WST測定、選殖形成測定和ECIS技術。
由本發明的靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體介導的細胞毒活性較佳的是在基於細胞的細胞毒性測定中測量。它也可以在51 Cr釋放測定中測量。該細胞毒活性由EC50 值表示，其對應於半數最大有效濃度(誘導在基線與最大值中間的細胞毒性反應的抗體構建體的濃度)。較佳的是，靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體的EC50 值 ≤ 5000 pM或 ≤ 4000 pM、更較佳的是 ≤ 3000 pM或 ≤ 2000 pM、甚至更較佳的是 ≤ 1000 pM或 ≤ 500 pM、甚至更較佳的是 ≤ 400 pM或 ≤ 300 pM、甚至更較佳的是 ≤ 200 pM、甚至更較佳的是 ≤ 100 pM、甚至更較佳的是 ≤ 50 pM、甚至更較佳的是 ≤ 20 pM或 ≤ 10 pM以及最較佳的是 ≤ 5 pM。
上述給定的EC50 值可以在不同的測定中測量。技術人員意識到，與未刺激的PBMC相比，當刺激/富集的CD8+ T細胞用作效應細胞時，可以預期EC50 值更低。此外可以預期，與低靶表現大鼠相比，當靶細胞表現大量靶細胞表面抗原時EC50 值較低。例如，當刺激/富集的人CD8+ T細胞用作效應細胞(並且靶細胞表面抗原轉染的細胞如CHO細胞或靶細胞表面抗原陽性人細胞系用作靶細胞)時，靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體的EC50 值較佳的是 ≤ 1000 pM、更較佳的是 ≤ 500 pM、甚至更較佳的是 ≤ 250 pM、甚至更較佳的是 ≤ 100 pM、甚至更較佳的是 ≤ 50 pM、甚至更較佳的是 ≤ 10 pM以及最較佳的是 ≤ 5 pM。當人PBMC用作效應細胞時，靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體的EC50 值較佳的是 ≤ 5000 pM或 ≤ 4000 pM(特別當靶細胞係靶細胞表面抗原陽性人細胞系時)、更較佳的是 ≤ 2000 pM(特別當靶細胞係靶細胞表面抗原轉染的細胞如CHO細胞時)、更較佳的是 ≤ 1000 pM或 ≤ 500 pM、甚至更較佳的是 ≤ 200 pM、甚至更較佳的是 ≤ 150 pM、甚至更較佳的是 ≤ 100 pM以及最較佳的是≤50 pM或更低。當獼猴T細胞系如LnPx4119用作效應細胞，並且獼猴靶細胞表面抗原轉染的細胞系如CHO細胞用作靶細胞系時，靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體的EC50 值較佳的是 ≤ 2000 pM或 ≤ 1500 pM、更較佳的是 ≤ 1000 pM或 ≤ 500 pM、甚至更較佳的是 ≤ 300 pM或 ≤ 250 pM、甚至更較佳的是 ≤ 100 pM以及最較佳的是 ≤ 50 pM。
較佳的是，本發明的靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體不誘導/介導裂解或本質上不誘導/介導靶細胞表面抗原陰性細胞如CHO細胞的裂解。術語“不誘導裂解”、“基本上不誘導裂解”、“不介導裂解”或“基本上不介導裂解”意指本發明的抗體構建體誘導或介導靶細胞表面抗原陰性細胞不超過30%的裂解、較佳的是不超過20%、更較佳的是不超過10%、特別較佳的是不超過9%、8%、7%、6%或5%，由此靶細胞表面抗原陽性人細胞系的裂解被設定為100%。這通常適用於濃度高達500 nM的抗體構建體。技術人員瞭解如何不費周折地測量細胞裂解。此外，本說明書教導了如何測量細胞裂解的具體說明。
單獨靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體的單體和二聚體同種型之間的細胞毒活性的差異被稱為“效力間隙”。這種效力間隙可以例如計算為分子的單體和二聚體形式的EC50 值之間的比。本發明的靶細胞表面抗原xCD3雙特異性抗體構建體的效力間隙較佳的是 ≤ 5、更較佳的是 ≤ 4、甚至更較佳的是 ≤ 3、甚至更較佳的是 ≤ 2以及最較佳的是 ≤ 1。
本發明的抗體構建體的一種或多種第一和/或第二(或任何其他)結合結構域較佳的是對靈長類動物的哺乳動物目成員具有跨物種特異性。跨物種特異性CD3結合結構域例如描述於WO 2008/119567中。根據一個實施方式，第一和/或第二結合域除了分別與人靶細胞表面抗原和人CD3結合外，還將結合靈長類動物的靶細胞表面抗原/CD3，靈長類動物包括(但不限於)新世界靈長類動物(如白鬢狨、棉冠獠狨或松鼠猴)、舊世界靈長類動物(如狒狒和獼猴)、長臂猿和非人類人亞科。
在本發明抗體構建體的一個實施方式中，第一結構域結合人靶細胞表面抗原並進一步結合獼猴靶細胞表面抗原如食蟹猴的靶細胞表面抗原，並且更較佳的是結合在表面獼猴細胞上表現的獼猴靶細胞表面抗原。第一結合結構域對獼猴靶細胞表面抗原的親和力較佳的是 ≤ 15 nM、更較佳的是 ≤ 10 nM、甚至更較佳的是 ≤ 5 nM、甚至更較佳的是 ≤ 1 nM、甚至更較佳的是 ≤ 0.5 nM、甚至更較佳的是 ≤ 0.1 nM以及最較佳的是 ≤ 0.05 nM或甚至 ≤ 0.01 nM。
較佳的是，根據本發明的抗體構建體對於結合獼猴靶細胞表面抗原相對於人靶細胞表面抗原的親和間隙[ma靶細胞表面抗原:hu靶細胞表面抗原](例如藉由BiaCore或藉由Scatchard分析所測定的)＜ 100、較佳的是 ＜ 20、更較佳的是 ＜ 15、進一步較佳的是 ＜ 10、甚至更較佳的是 ＜ 8、更較佳的是 ＜ 6以及最較佳的是 ＜ 2。根據本發明的抗體構建體對於結合獼猴靶細胞表面抗原相對於人靶細胞表面抗原的親和間隙的較佳的範圍為在0.1與20之間、更較佳的是在0.2與10之間、甚至更較佳的是在0.3與6之間、甚至更較佳的是在0.5與3之間或在0.5與2.5之間以及最較佳的是在0.5與2之間或在0.6與2之間。
本發明的抗體構建體的第二(結合)結構域結合人CD3ε和/或獼猴CD3ε。在較佳的實施方式中，第二結構域進一步結合白鬢狨、棉冠獠狨或松鼠猴CD3ε。白鬢狨、Saguinus lyophil 均係屬於狨猴科的新世界靈長類動物，而松鼠猴係屬於卷尾猴科的新世界靈長類動物。
對於本發明的抗體構建體，結合人和/或獼猴CD3的細胞外表位的第二結構域較佳的是包含VL區，該VL區包含選自以下各項的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3： (a) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 27中所示的CDR-L1、WO 2008/119567的SEQ ID NO: 28中所示的CDR-L2以及WO 2008/119567的SEQ ID NO: 29中所示的CDR-L3； (b) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 117中所示的CDR-L1、WO 2008/119567的SEQ ID NO: 118中所示的CDR-L2以及WO 2008/119567的SEQ ID NO: 119中所示的CDR-L3；以及 I WO 2008/119567的SEQ ID NO: 153中所示的CDR-L1、WO 2008/119567的SEQ ID NO: 154中所示的CDR-L2以及WO 2008/119567的SEQ ID NO: 155中所示的CDR-L3。
在本發明抗體構建體的另一個較佳的實施方式中，結合人和/或獼猴CD3ε鏈的細胞外表位的第二結構域包含VH區，該VH區包含選自以下各項的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3： (a) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 12所示的CDR-H1、WO 2008/119567的SEQ ID NO: 13所示的CDR-H2以及WO 2008/119567的SEQ ID NO: 14所示的CDR-H3； (b) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 30所示的CDR-H1、WO 2008/119567的SEQ ID NO: 31所示的CDR-H2以及WO 2008/119567的SEQ ID NO: 32所示的CDR-H3； I WO 2008/119567的SEQ ID NO: 48所示的CDR-H1、WO 2008/119567的SEQ ID NO: 49所示的CDR-H2以及WO 2008/119567的SEQ ID NO: 50所示的CDR-H3； (d) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 66所示的CDR-H1、WO 2008/119567的SEQ ID NO: 67所示的CDR-H2以及WO 2008/119567的SEQ ID NO: 68所示的CDR-H3； I WO 2008/119567的SEQ ID NO: 84所示的CDR-H1、WO 2008/119567的SEQ ID NO: 85所示的CDR-H2以及WO 2008/119567的SEQ ID NO: 86所示的CDR-H3； (f) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 102所示的CDR-H1、WO 2008/119567的SEQ ID NO: 103所示的CDR-H2以及WO 2008/119567的SEQ ID NO: 104所示的CDR-H3； (g) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 120所示的CDR-H1、WO 2008/119567的SEQ ID NO: 121所示的CDR-H2以及WO 2008/119567的SEQ ID NO: 122所示的CDR-H3； (h) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 138所示的CDR-H1、WO 2008/119567的SEQ ID NO: 139所示的CDR-H2以及WO 2008/119567的SEQ ID NO: 140所示的CDR-H3； (i) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 156所示的CDR-H1、WO 2008/119567的SEQ ID NO: 157所示的CDR-H2以及WO 2008/119567的SEQ ID NO: 158所示的CDR-H3；以及 (j) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 174所示的CDR-H1、WO 2008/119567的SEQ ID NO: 175所示的CDR-H2以及WO 2008/119567的SEQ ID NO: 176所示的CDR-H3。
在本發明抗體構建體的較佳的實施方式中，將上述三組VL CDR與第二結合結構域內的上述十組VH CDR組合以形成(30)組，每組包含CDR-L 1-3和CDR-H 1-3。
對於本發明的抗體構建體，結合CD3的第二結構域較佳的是包含選自以下群組的VL區，該群組由以下各項組成：WO 2008/119567的SEQ ID NO: 17、21、35、39、53、57、71、75、89、93、107、111、125、129、143、147、161、165、179或183所示或SEQ ID NO: 200所示的VL區。
結合CD3的第二結構域還較佳的是包含選自以下群組的VH區，該群組由以下各項組成：WO 2008/119567的SEQ ID NO: 15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181所示或SEQ ID NO: 201所示的VH區。
更較佳的是，本發明的抗體構建體的特徵在於結合包含選自以下群組的VL區和VH區的CD3的第二結構域，該群組由以下各項組成： (a) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 17或21所示的VL區和WO 2008/119567的SEQ ID NO: 15或19所示的VH區； (b) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 35或39所示的VL區和WO 2008/119567的SEQ ID NO: 33或37所示的VH區； I WO 2008/119567的SEQ ID NO: 53或57所示的VL區和WO 2008/119567的SEQ ID NO: 51或55所示的VH區； (d) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 71或75所示的VL區和WO 2008/119567的SEQ ID NO: 69或73所示的VH區； I WO 2008/119567的SEQ ID NO: 89或93所示的VL區和WO 2008/119567的SEQ ID NO: 87或91所示的VH區； (f) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 107或111所示的VL區和WO 2008/119567的SEQ ID NO: 105或109所示的VH區； (g) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 125或129所示的VL區和WO 2008/119567的SEQ ID NO: 123或127所示的VH區； (h) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 143或147所示的VL區和WO 2008/119567的SEQ ID NO: 141或145所示的VH區； (i) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 161或165所示的VL區和WO 2008/119567的SEQ ID NO: 159或163所示的VH區；以及 (j) WO 2008/119567的SEQ ID NO: 179或183所示的VL區和WO 2008/119567的SEQ ID NO: 177或181所示的VH區。
關於本發明的抗體構建體還較佳的是結合CD3的第二結構域，該CD3包含SEQ ID NO: 200所示的VL區和SEQ ID NO: 201所示的VH區。
根據本發明抗體構建體的較佳的實施方式，第一和/或第二結構域具有以下形式：VH區和VL區的對為單鏈抗體(scFv)的形式。VH和VL區以VH-VL或VL-VH的順序排列。較佳的是，VH區位於接頭序列的N-末端且VL區位於接頭序列的C-末端。
本發明的上述抗體構建體的較佳的實施方式的特徵在於結合包含選自以下群組的胺基酸序列的CD3的第二結構域，該群組由以下各項組成：WO 2008/119567的SEQ ID No: 23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187所示或SEQ ID NO: 202所示。
抗體構建體的共價修飾也包括在本發明的範圍內，並且通常但不總是在翻譯後進行。例如，藉由使抗體構建體的特定胺基酸殘基與能夠與選擇的側鏈或N-或C-末端殘基反應的有機衍生劑反應，將抗體構建體的幾種類型的共價修飾引入分子中。
半胱胺醯殘基最常見的是與α-鹵代乙酸鹽(和相應的胺)如氯乙酸或氯乙醯胺反應，得到羧甲基或羧醯胺甲基衍生物。半胱胺醯殘基也藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙醯磷酸酯、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物，對氯汞基苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑反應而衍生化。
組胺醯基殘基藉由與pH 5.5-7.0的焦碳酸二乙酯反應而衍生化，因為該試劑對組胺醯基側鏈具有相對特異性。對溴苯甲醯甲基溴也是有用的；反應較佳的是在pH 6.0的0.1 M二甲胂酸鈉中進行。賴胺醯和胺基末端殘基與琥珀酸或其他羧酸酸酐反應。用這些試劑衍生化具有逆轉賴胺醯殘基電荷的作用。用於衍生化含α-胺基的殘基的其他合適試劑包括亞胺酸酯如甲基吡啶亞胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼；三硝基苯磺酸；鄰甲基異脲；2,4-戊二酮；和轉胺酶催化的與乙醛酸反應。
藉由與一種或幾種常規試劑反應來修飾精胺醯基殘基，其中包括苯甲醯甲醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮和茚三酮。由於胍官能基的pKa高，因此精胺酸殘基的衍生化需要在鹼性條件下進行反應。此外，這些試劑可以與賴胺酸基團以及精胺酸ε-胺基基團反應。
可以進行酪胺醯基殘基的特定修飾，特別感興趣的是藉由與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記引入酪胺醯基殘基中。最常見的是，N-乙醯基咪唑和四硝基甲烷分別用於形成鄰乙醯基酪胺醯基種類和3-硝基衍生物。使用125 I或131 I碘化酪胺醯基殘基以製備用於放射免疫測定的標記蛋白質，上述氯胺T方法係合適的。
藉由與碳二亞胺(R’—N=C=N–R’)反應選擇性地修飾羧基側基團(天冬胺醯基或穀胺醯基)，其中R和R'視情況係不同的烷基基團，如1-環己基-3-(2-𠰌啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮雜-4,4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外，天冬胺醯基和穀胺醯基殘基藉由與銨離子反應轉化為天冬醯胺醯基和穀胺醯胺醯基殘基。
用雙功能試劑衍生化可用於將本發明的抗體構建體與水不溶性支持基質或表面交聯以用於多種方法。通常使用的交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯，例如與4-疊氮基水楊酸的酯、同型雙功能亞胺酸酯，該同型雙功能亞胺酸酯包括二琥珀醯亞胺酯如3,3'-二硫代雙(琥珀醯亞胺丙酸酯)以及雙功能馬來醯亞胺如雙-N-馬來醯亞胺基-1,8-辛烷。衍生化試劑如甲基-3-[(對疊氮基苯基)二硫代]丙醯亞胺酯產生可光活化的中間體，其能夠在光的存在下形成交聯。可替代地，反應性水不溶性基質如溴化氰活化的碳水化合物和如美國專利案號3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440中所述的反應性底物用於蛋白質固定。
穀胺醯胺醯基和天冬醯胺醯基殘基通常分別脫醯胺成相應的穀胺醯基和天冬胺醯基殘基。可替代地，這些殘基在溫和的酸性條件下脫醯胺。這些殘基的任何一種形式都屬於本發明的範圍。
其他修飾包括脯胺酸和賴胺酸的羥基化，絲胺醯基或蘇胺醯基殘基的羥基基團的磷酸化，賴胺酸、精胺酸和組胺酸側鏈的α-胺基基團的甲基化(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties[蛋白質：結構和分子特性]、W. H. Freeman公司, 三藩市, 1983, 第79-86頁)，N-末端胺的乙醯化和任何C-末端羧基的醯胺化。
包括在本發明範圍內的另一種類型的抗體構建體的共價修飾包括改變蛋白質的糖基化模式。如本領域所知，糖基化模式可取決於蛋白質的序列(例如，下文討論的特定糖基化胺基酸殘基的存在或不存在)或產生蛋白質的宿主細胞或生物。下面討論特定的表現系統。
多肽的糖基化通常是N-連接的或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基的側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸和天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X係除脯胺酸之外的任何胺基酸)係碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈酶促連接的識別序列。因此，多肽中這些三肽序列中任一個的存在產生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化係指將糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一連接到羥基胺基酸上，最通常為絲胺酸或蘇胺酸，儘管也可以使用5-羥基脯胺酸或5-羥基賴胺酸。
藉由改變胺基酸序列使其含有一種或多種上述三肽序列(對於N-連接的糖基化位點)，可方便地完成向抗體構建體中添加糖基化位點。也可以藉由將一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加至起始序列或被一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代(對於O-連接的糖基化位點)來進行改變。為了方便起見，較佳的是藉由DNA水平的變化來改變抗體構建體的胺基酸序列，特別是藉由使在預選的鹼基處編碼多肽的DNA突變，使得生成將翻譯為所需胺基酸的密碼子。
增加抗體構建體上碳水化合物部分的數量的另一種方法係藉由糖苷與蛋白質的化學或酶促偶聯。這些方法係有利的，因為它們不需要在具有對於N-和O-連接的糖基化的糖基化能力的宿主細胞中產生蛋白質。根據所用的偶聯模式，一種或多種糖可以連接至 (a) 精胺酸和組胺酸、 (b) 游離羧基基團、(c) 游離巰基基團如半胱胺酸的那些巰基基團、(d) 游離羥基基團如絲胺酸、蘇胺酸或羥脯胺酸的那些羥基基團，I 芳香族殘基如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸的那些I芳香族殘基，或 (f) 穀胺醯胺的醯胺基團。這些方法描述於WO 87/05330以及Aplin和Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem.[CRC生物化學評論], 第259-306頁。
存在於起始抗體構建體上的碳水化合物部分的去除可以藉由化學或酶促完成。化學去糖基化需要將蛋白質暴露於化合物三氟甲磺酸或等效的化合物中。該處理導致除連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)之外的大多數或所有糖的裂解，同時使多肽保持完整。化學去糖基化由Hakimuddin等人，1987,Arch. Biochem. Biophys. [生物化學與生物物理學集刊] 259:52和Edge等人，1981,Anal. Biochem. [分析生物化學]118:131描述。多肽上碳水化合物部分的酶促切割可以藉由使用多種內切和外切糖苷酶來實現，如Thotakura等人，1987, Meth. Enzymol.[酶學方法]138:350所述。可以藉由使用化合物衣黴素來防止潛在糖基化位點處的糖基化，如Duskin等人，1982, J. Biol. Chem.[生物化學雜誌]257:3105所述。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷連接的形成。
本文還考慮了抗體構建體的其他修飾。例如，抗體構建體的另一種類型的共價修飾包括以美國專利案號4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中所述的方式將抗體構建體與各種非蛋白質聚合物連接，包括但不限於各種多元醇(例如聚乙二醇、聚丙二醇)、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。另外，如本領域已知的，胺基酸取代可以在抗體構建體內的不同位置進行，例如以便促進聚合物如PEG的添加。
在一些實施方式中，本發明的抗體構建體的共價修飾包括添加一種或多種標記。標記基團可以經由各種長度的間隔臂與抗體構建體偶聯，以減少潛在的空間位阻。用於標記蛋白質的各種方法係本領域已知的，並且可用於實施本發明。術語“標記”或“標記基團”係指任何可檢測的標記。一般而言，根據檢測標記的測定，這些標記屬於各種類別，以下實例包括但不限於： a) 同位素標記，其可以是放射性或重同位素，如放射性同位素或放射性核素(例如，3 H、14 C、15 N、35 S、89 Zr、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I) b) 磁性標記(例如，磁性顆粒) c) 氧化還原活性部分 d) 光學染料(包括但不限於發色團、螢光粉和螢光團)，如螢光基團(例如FITC、玫瑰紅、鑭系元素螢光粉)、化學發光基團和螢光團，所述螢光團可以是“小分子”螢光或蛋白質螢光 e) 酶基團(例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶) f) 生物素化基團 g) 由二級報告物(例如，亮胺酸拉鍊對序列、二級抗體的結合側、金屬結合結構域、表位標記等)識別的預定多肽表位
“螢光標記”意指可經由其固有螢光特性檢測的任何分子。合適的螢光標記包括但不限於螢光素、玫瑰紅、四甲基羅丹明、伊紅、lyophilisat、香豆素、甲基香豆素、芘、Malacite綠、茋、螢光黃、Cascade BlueJ、德克薩斯紅、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC紅640、Cy 5、Cy 5.5、LC紅705、俄勒岡綠、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、級聯藍、級聯黃和R-藻紅蛋白(PE)(分子探針公司，尤金，俄勒岡州)、FITC、羅丹明和德克薩斯紅(Pierce，羅克福德，伊利諾州)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham生命科學公司，匹茲堡，賓夕法尼亞州)。包括螢光團在內的合適的光學染料描述於Richard P. Haugland的Molecular Probes Handbook[分子探針手冊]中。
合適的蛋白質螢光標記還包括但不限於綠色螢光蛋白，包括GFP的海腎、Ptilosarcus或多管水母物種(Chalfie等人，1994,Science [科學] 263:802-805)、EGFP(Clontech實驗室公司，Genbank登錄號U55762)、藍色螢光蛋白(BFP，加拿大H3H 1J9魁北克蒙特利爾，松納夫大道西1801號8層，量子生物技術有限公司(1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9)；Stauber, 1998,Biotechniques [生物技術] 24:462-471；Heim等人，1996,Curr. Biol. [當代生物學] 6:178-182)、增強的黃色螢光蛋白(EYFP，Clontech實驗室公司)、螢光素酶(Ichiki等人，1993,J. Immunol. [免疫學雜誌]150:5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人，1988,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A .[美國國家科學院院刊] 85:2603-2607)和Renilla(WO 92/15673、WO 95/07463、WO 98/14605、WO 98/26277、WO 99/49019；美國專利案號5,292,658、5,418,155、5,683,888、5,741,668、5,777,079、5,804,387、5,874,304、5,876,995、5,925,558)。
本發明的抗體構建體還可以包含附加的結構域，該附加的結構域例如有助於分子的分離或與分子的適應的藥物動力學特徵有關。可以從肽動機或二次引入的部分中選擇有助於分離抗體構建體的結構域，所述肽動機或二次引入的部分可以在分離方法例如分離柱中捕獲。非限制性實施方式的這種附加結構域包括肽動機，其稱為Myc標記、HAT-標記、HA標記、TAP標記、GST標記、幾丁質結合結構域(CBD標記)、麥芽糖結合蛋白(MBP-tag)、Flag標記、Strep標記及其變體(例如StrepII標記)和His標記。本文揭露的所有抗體構建體的特徵在於鑒定的CDR可以包括His標記結構域，其通常被稱為分子的胺基酸序列中的連續His殘基、較佳的是五個且更較佳的是六個His殘基(六組胺酸)的重複序列。His標記可以位於例如在抗體構建體的N-或C-末端，它較佳的是位於C-末端。最較佳的是，六組胺酸標記(HHHHHH)(SEQ ID NO: 199)經由肽鍵與根據本發明的抗體構建體的C-末端連接。另外，PLGA-PEG-PLGA的綴合物系統可以與聚組胺酸標記組合用於持續釋放應用和改善的藥物動力學特徵。
還考慮了本文描述的抗體構建體的胺基酸序列修飾。例如，可能需要改善抗體構建體的結合親和力和/或其他生物學特性。藉由將合適的核苷酸變化引入抗體構建體核酸中或藉由肽合成來製備抗體構建體的胺基酸序列變體。所有下文描述的胺基酸序列修飾應該產生仍然保留未修飾的親本分子的所需生物活性(結合靶細胞表面抗原和CD3)的抗體構建體。
術語“胺基酸”或“胺基酸殘基”通常是指具有其本領域公認定義的胺基酸如選自以下群組的胺基酸，該群組由以下各項組成：丙胺酸(Ala或A)、精胺酸(Arg或R)、天冬醯胺(Asn或N)、天冬胺酸(Asp或D)、半胱胺酸(Cys或C)、穀胺醯胺(Gin或Q)、麩胺酸 (Giu或E)、甘胺酸(Giy或G)、組胺酸(His或H)、異亮胺酸(He或I)、亮胺酸(Leu或L)、賴胺酸(Lys或K)、甲硫胺酸(Met或M)、苯丙胺酸(Phe或F)、脯胺酸(Pro或P)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、色胺酸(Trp或W)、酪胺酸(Tyr或Y)和纈胺酸(Val或V)，儘管可以根據需要使用修飾的、合成的或稀有的胺基酸。通常，胺基酸可以分組為具有非極性側鏈(例如，Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、VaI)；帶負電的側鏈(例如，Asp、Giu)；帶正電的側鏈(例如，Arg、His、Lys)；或不帶電的極性側鏈(例如，Asn、Cys、Gin、Giy、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。
胺基酸修飾包括例如抗體構建體的胺基酸序列內的殘基的缺失、和/或插入和/或取代。進行缺失、插入和取代的任何組合以得到最終構建體，條件係最終構建體具有所需的特徵。胺基酸變化也可以改變抗體構建體的翻譯後製程，如改變糖基化位點的數量或位置。
例如，可以在每個CDR中插入、取代或缺失1、2、3、4、5或6個胺基酸(當然，取決於它們的長度)，而在每個FR中可以插入、取代或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸。較佳的是，抗體構建體中的胺基酸序列插入物包括與含有上百或更多個殘基的多肽的在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基的長度範圍內的胺基酸和/或羧基末端融合物，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入物。相應的修飾也可以在本發明的抗體構建體的第三結構域內進行。本發明的抗體構建體的插入變體包括與酶的抗體構建體的N-末端或C-末端的融合物或與多肽的融合物。
最感興趣的置換誘變位點包括(但不限於)重鏈和/或輕鏈的CDR，特別是高變區，但也考慮重鏈和/或輕鏈中的FR改變。取代較佳的是如本文所述的保守取代。較佳的是，在CDR中可以取代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸，而在框架區(FR)中可以取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸。例如，如果CDR序列包含6個胺基酸，則設想這些胺基酸中的一個、兩個或三個被取代。類似地，如果CDR序列包含15個胺基酸，則設想這些胺基酸中的一個、兩個、三個、四個、五個或六個被取代。
用於鑒定作為誘變較佳的位置的抗體構建體的某些殘基或區域的有用方法稱為“丙胺酸掃描誘變”，如Cunningham和Wells在Science[科學], 244: 1081-1085 (1989)中所述。此處，鑒定抗體構建體內的殘基或靶殘基基團(例如帶電殘基如arg、asp、his、lys和glu)，並將其用中性或帶負電的胺基酸(最較佳的是丙胺酸或聚丙胺酸)替代以影響胺基酸與表位的相互作用。
然後藉由在取代位點處引入或針對取代位點引入另外或其他變體來改進證明對取代具有功能敏感性的那些胺基酸位置。因此，儘管預先確定了用於引入胺基酸序列變異的位點或區域，但突變本身的性質不需要預先確定。例如，為了分析或優化給定位點突變的性能，可以在靶密碼子或區域進行丙胺酸掃描或隨機誘變，並篩選表現的抗體構建體變體以獲得所需活性的最佳組合。在具有已知序列的DNA中的預定位點處進行取代突變的技術係熟知的，例如M13引物誘變和PCR誘變。使用抗原結合活性(例如靶細胞表面抗原或CD3結合)的測定進行突變體的篩選。
通常，如果胺基酸在重鏈和/或輕鏈的一個或多個或所有CDR中被取代，則隨後獲得的“取代的”序列較佳的是與“原始”CDR序列至少60%或65%、更較佳的是70%或75%、甚至更較佳的是80%或85%以及特別較佳的是90%或95%相同。這意味著它與“取代的”序列相同的程度取決於CDR的長度。例如，具有5個胺基酸的CDR較佳的是與其取代的序列80%相同，以具有至少一個胺基酸取代。因此，抗體構建體的CDR可以與它們的取代序列具有不同的一致性程度，例如CDRL1可以具有80%，而CDRL3可以具有90%。
較佳的取代(或替代)係保守取代。然而，如果抗體構建體保留其經由第一結構域結合靶細胞表面抗原以及經由第二結構域結合CD3(分別為CD3ε)的能力，和/或其CDR具有對於隨後取代的序列的一致性(與“原始”CDR序列至少60%或65%、更較佳的是70%或75%、甚至更較佳的是80%或85%以及特別較佳的是90%或95%相同)，則可以設想任何取代(包括非保守取代或來自下表3中列出的“示例性取代”中的一個或多個)。
保守取代示於表3中“較佳的是取代”標題下。如果這樣的置換導致生物活性的變化，則可以將在表3中命名為“示例性取代”的、或如在下文進一步參考胺基酸類別所述的更多實質性改變引入，並且針對所需特徵篩選產品。 [表3]：胺基酸取代
本發明的抗體構建體的生物學特性的實質性修改係藉由選擇取代來實現的，所述取代在其維持以下方面顯著不同： (a) 取代區域中多肽骨架的結構，例如作為片層或螺旋構象，(b) 靶位點處分子的電荷或疏水性，或(c) 側鏈的主體。基於共同的側鏈特性將天然存在的殘基分組：(1) 疏水性：正亮胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2) 中性親水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3) 酸性：asp、glu；(4) 鹼性：his、lys、arg；(5) 影響鏈取向的殘基：gly、pro；以及 (6) 芳香族：trp、tyr、phe。
非保守取代將需要將這些類別之一的成員交換為另一類別。任何不參與維持抗體構建體的適當構象的半胱胺酸殘基可以通常被絲胺酸取代，以改善分子的氧化穩定性並防止異常交聯。相反，可以將半胱胺酸鍵添加至抗體中以改善其穩定性(特別是在抗體係抗體片段如Fv片段的情況下)。
對於胺基酸序列，序列一致性和/或相似性藉由使用本領域已知的標準技術測定，包括但不限於Smith和Waterman, 1981,Adv. Appl. Math. [應用數學進展] 2:482的局部序列一致性演算法、Needleman和Wunsch, 1970,J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌]48:443的序列一致性比對演算法、Pearson和Lipman, 1988,Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 85:2444的相似性搜索方法、這些演算法的電腦實現(Wisconsin Genetics Software Package[威斯康辛州遺傳學套裝軟體], Genetics Computer Group[遺傳學電腦組], 575 Science Drive[科學驅動], Madison, Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、Devereux等人，1984,Nucl. Acid Res. [核酸研究]12:387-395所述的最佳匹配序列演算法，較佳的是使用預設設置或藉由檢查。較佳的是，藉由基於以下參數的FastDB計算一致性百分比：錯配罰分1、空位罰分1、空位大小罰分0.33以及加入罰分30，“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,”[目前序列比較和分析的方法] Macromolecule Sequencing and Synthesis[大分子測序和合成], Selected Methods and Applications[選擇的方法和應用], 第127-149頁 (1988), Alan R. Liss公司。
有用演算法的實例係PILEUP。PILEUP使用漸進式雙序列比對從一組相關序列創建多序列比對。它還可以繪製顯示用於創建比對的聚類關係的樹突。PILEUP使用Feng和Doolittle, 1987,J. Mol. Evol. [分子進化雜誌]35:351-360的漸進式比對方法的簡化方法；該方法類似於Higgins和Sharp, 1989,CABIOS 5:151-153所述的方法。有用的PILEUP參數包括默認空位權重3.00、默認空位長度權重0.10和加權末端空位。
有用演算法的另一個實例係BLAST演算法，其描述在以下參考文獻中：Altschul等人，1990,J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌]215:403-410；Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res. [核酸研究] 25:3389-3402；以及Karin等人，1993,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊]90:5873-5787。特別有用的BLAST程式係WU-BLAST-2程式，其獲自Altschul等人，1996,Methods in Enzymology [酶學方法]266:460-480。WU-BLAST-2使用多個搜索參數，其中大多數都設置為預設值。可調參數設置為以下值：重疊跨度 = 1、重疊分數 = 0.125、詞閾值(T)= II。HSP S和HSP S2參數係動態值，並且由程式自身根據特定序列的組成和特定資料庫(在其中搜索感興趣的序列)的組成建立；但是可以調整這些值以增加靈敏度。
另一種有用的演算法係如Altschul等人，1993,Nucl. Acids Res. [核酸研究]25:3389-3402所報導的有空位的BLAST。有空位的BLAST使用BLOSUM-62取代得分呢；閾值T參數設定為9；觸發無空位擴展的按兩下方法，將k的空位長度記為10+k；Xu設定為16，Xg在資料庫搜索階段設定為40且在演算法的輸出階段設定為67。有空位的比對由對應於約22位的得分觸發。
通常，本文描述的序列的單獨變體 CDR或VH/VL序列之間的胺基酸同源性、相似性或一致性為至少60%，並且通常較佳的是至少65%或70%的漸增的同源性或一致性，更較佳的是至少75%或80%、甚至更較佳的是85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以及幾乎100%。以類似的方式，相對於本文鑒定的結合蛋白的核酸序列的“核酸序列一致性百分比(%)”定義為候選序列中與抗體構建體的編碼序列中的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比。一種特定的方法利用設定為默認參數的WU-BLAST-2的BLASTN模組，其中重疊跨度和重疊分數分別設定為1和0.125。
通常，編碼單獨變體CDR或VH/VL序列的核苷酸序列與本文描述的核苷酸序列之間的核酸序列同源性、相似性或一致性為至少60%，並且更通常較佳的是具有至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以及幾乎100%的漸增的同源性或一致性。因此，“變體CDR”或“變體VH/VL區”與本發明的親本CDR/VH/VL具有特定同源性、相似性或一致性，並且共有生物功能，包括但不限於親本CDR或VH/VL的特異性和/或活性的至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
在一個實施方式中，根據本發明的抗體構建體的人種系的一致性百分比 ≥ 70%或 ≥ 75%、更較佳的是 ≥ 80%或 ≥ 85%、甚至更較佳的是 ≥ 90%以及最較佳的是 ≥ 91%、≥ 92%、≥ 93%、≥ 94%、≥ 95%或甚至 ≥ 96%。與人抗體種系基因產物的一致性被認為係降低治療性蛋白質在治療期間引起患者對藥物的免疫應答風險的重要特徵。Hwang和Foote(“Immunogenicity of engineered antibodies”[工程化抗體的免疫原性]; Methods[方法] 36 (2005) 3-10)表明藥物抗體構建體的非人類部分的減少導致在治療期間誘導患者中抗藥物抗體的風險降低。藉由比較詳盡數量的臨床評估的抗體藥物和相應的免疫原性數據，趨勢顯示抗體V區的人源化使得蛋白質的免疫原性低於(平均5.1%的患者)攜帶未改變的非人V區的抗體(平均23.59%的患者)。因此，對於抗體構建體形式的基於V區的蛋白質治療劑，期望具有與人序列的更高程度的一致性。為了確定種系一致性，VL的V區可以與使用載體NTI軟體的人種系V區段和J區段的胺基酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)和藉由相同胺基酸殘基除以VL的胺基酸殘基總數再乘以百分數計算的胺基酸序列進行比對。對於VH區段(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)也是如此，不同之處在於VH CDR3可能由於其高度多樣性和缺乏現有的人種系VH CDR3比對配偶體而被排除。然後可以使用重組技術增加與人抗體種系基因的序列一致性。
在進一步實施方式中，本發明的雙特異性抗體構建體在標準研究規模條件下，例如在標準的兩步純化製程中表現出高單體產量。較佳的是，根據本發明的抗體構建體的單體產量 ≥ 0.25 mg/L上清液、更較佳的是 ≥ 0.5 mg/L、甚至更較佳的是 ≥ 1mg/ L以及最較佳的是 ≥ 3 mg/L上清液。
同樣地，可以確定二聚體抗體構建體同種型的產量，並且因此可以確定抗體構建體的單體百分比(即單體：(單體 + 二聚體))。單體和二聚體抗體構建體的生產力和計算的單體百分比可以例如在來自滾瓶中的標準化研究規模生產的培養上清液的SEC純化步驟中獲得。在一個實施方式中，抗體構建體的單體百分比 ≥ 80%、更較佳的是 ≥ 85%、甚至更較佳的是 ≥ 90%以及最較佳的是 ≥ 95%。
在一個實施方式中，抗體構建體的較佳的血漿穩定性(具有血漿的EC50與沒有血漿的EC50之比)≤ 5或 ≤ 4、更較佳的是 ≤ 3.5或 ≤ 3、甚至更較佳的是 ≤ 2.5或 ≤ 2以及最較佳的是 ≤ 1.5或 ≤ 1。抗體構建體的血漿穩定性可以藉由在37℃下將構建體在人血漿中孵育24小時，然後在51 鉻釋放細胞毒性測定中進行EC50測定來測試。細胞毒性測定中的效應細胞可以是刺激的富集的人CD8陽性T細胞。靶細胞可以例如係用人靶細胞表面抗原轉染的CHO細胞。效應細胞與靶細胞(E : T)之比可以選擇為10 : 1。用於此目的的人血漿庫來源於藉由EDTA包被的注射器收集的健康供體的血液。藉由離心去除細胞組分，收集上層血漿相並隨後合併。作為對照，在RPMI-1640培養基中的細胞毒性測定之前立即稀釋抗體構建體。血漿穩定性計算為EC50(血漿孵育後)與EC50(對照)的比。
此外，較佳的是本發明抗體構建體的單體到二聚體的低轉化率。可以在不同條件下測量轉化率並藉由高效尺寸排阻層析法分析。例如，抗體構建體的單體同種型的孵育可以在培養箱中在37℃和例如100 μg/ml或250 μg/ml的濃度下進行7天。在這些條件下，較佳的是本發明的抗體構建體顯示二聚體百分比 ≤ 5%、更較佳的是 ≤ 4%、甚至更較佳的是 ≤ 3%、甚至更較佳的是 ≤ 2.5%、甚至更較佳的是 ≤ 2%、甚至更較佳的是 ≤ 1.5%以及最較佳的是 ≤ 1%或 ≤ 0.5%或甚至0%。
還較佳的是，本發明的雙特異性抗體構建體在多次冷凍/解凍循環後呈現非常低的二聚體轉化率。例如，將抗體構建體單體例如，在一般配製緩衝液中調節至250 μg/ml的濃度，並進行三次冷凍/解凍循環(在-80℃下冷凍30 min，然後在室溫下解凍30 min)，然後進行高效SEC以確定已轉化為二聚體抗體構建體的最初單體抗體構建體的百分比。較佳的是，雙特異性抗體構建體的二聚體百分比 ≤ 5%、更較佳的是 ≤ 4%、甚至更較佳的是 ≤ 3%、甚至更較佳的是 ≤ 2.5%、甚至更較佳的是 ≤ 2%、甚至更較佳的是 ≤ 1.5%以及最較佳的是 ≤ 1%或甚至 ≤ 0.5%，例如在三次冷凍/解凍循環後。
本發明的雙特異性抗體構建體較佳的是顯示出良好的熱穩定性，其中聚集溫度45℃或 ≥ 50℃、更較佳的是 ≥ 52℃或 ≥ 54℃、甚至更較佳的是 ≥ 56℃或 ≥ 57℃以及最較佳的是 ≥ 58℃或 ≥ 59℃。關於抗體聚集溫度的熱穩定性參數可以如下確定：將濃度為250 μg/ml的抗體溶液轉移至單次使用的比色杯中並置於動態光散射(DLS)設備中。樣品以0.5℃/min的加熱速率從40℃加熱至70℃，並持續獲取測量的半徑。表明蛋白質的熔化和聚集的半徑的增加用於計算抗體的聚集溫度。
可替代地，熔化溫度曲線可藉由差示掃描量熱法(DSC)測定，以測定抗體構建體的內在生物物理蛋白質穩定性。使用MicroCal LLC(北安普頓，麻塞諸塞州，美國)VP-DSC設備進行這些實驗。與僅含有配製緩衝液的樣品相比，含有抗體構建體的樣品的能量吸收記錄為20℃至90℃。將抗體構建體調節至例如在SEC運行緩衝液中終濃度為250 μg/ml。為了記錄相應的熔化曲線，逐步增加整個樣品溫度。在每個溫度下，記錄樣品和配製緩衝液參考的T能量吸收。將樣品的能量吸收Cp(kcal/mole/℃)減去參考值的差相對於各自的溫度作圖。熔化溫度定義為第一個能量吸收最大值時的溫度。
還設想本發明的靶細胞表面抗原×CD3雙特異性抗體構建體的濁度(在純化的單體抗體構建體濃縮至2.5 mg/ml並且過夜孵育後藉由OD340測量的)≤ 0.2、較佳的是 ≤ 0.15、更較佳的是 ≤ 0.12、甚至更較佳的是 ≤ 0.1以及最較佳的是 ≤ 0.08。
在進一步實施方式中，根據本發明的抗體構建體在生理或略低的pH下係穩定的，即約pH 7.4至6.0。抗體構建體在非生理pH例如約pH 6.0下表現得越耐受，從離子交換柱洗脫的抗體構建體相對於負載蛋白質的總量的回收率越高。在約pH 6.0下來自離子(例如，陽離子)交換柱的抗體構建體的回收率較佳的是 ≥ 30%、更較佳的是 ≥ 40%、更較佳的是 ≥ 50%、甚至更較佳的是 ≥ 60%、甚至更較佳的是 ≥ 70%、甚至更較佳的是 ≥ 80%、甚至更較佳的是 ≥ 90%、甚至更較佳的是 ≥ 95%以及最較佳的是 ≥ 99%。
進一步設想本發明的雙特異性抗體構建體顯示出治療功效或抗腫瘤活性。這可以例如在以下晚期人類腫瘤異種移植模型的實例中揭露的研究中進行評估：
技術人員瞭解如何修改或調整本研究的某些參數，如注射的腫瘤細胞的數量、注射部位、移植的人T細胞的數量、待給予的雙特異性抗體構建體的量以及時間線，同時仍然獲得有意義且可重現的結果。較佳的是，腫瘤生長抑制T/C [%] ≤ 70或 ≤ 60、更較佳的是 ≤ 50或 ≤ 40、甚至更較佳的是 ≤ 30或 ≤ 20以及最較佳的是 ≤ 10或 ≤ 5或甚至 ≤ 2.5。
在本發明抗體構建體的較佳的實施方式中，抗體構建體係單鏈抗體構建體。
此外，在本發明抗體構建體的較佳的實施方式中，所述第三結構域以胺基到羧基的順序包含： 鉸鏈-CH2-CH3-接頭-鉸鏈-CH2-CH3。
此外，在本發明的一個實施方式中，第三結構域的一個或較佳的是每個(兩個)多肽單體的CH2結構域包含結構域內半胱胺酸二硫橋。如本領域所知，術語“半胱胺酸二硫橋”係指具有一般結構R–S–S–R 的官能基。該連接也稱為SS鍵或二硫鍵，並且藉由半胱胺酸殘基的兩個硫醇基團偶聯衍生。對於本發明的抗體構建體，特別較佳的是將在成熟抗體構建體中形成半胱胺酸二硫橋的半胱胺酸引入對應於309和321(Kabat編號)的CH2結構域的胺基酸序列。
在本發明的一個實施方式中，去除CH2結構域的Kabat位置314中的糖基化位點。較佳的是藉由N314X取代實現糖基化位點的去除，其中X係除Q之外的任何胺基酸。所述取代較佳的是N314G取代。在更較佳的實施方式中，所述CH2結構域另外包含以下取代(根據Kabat的位置)：V321C和R309C(這些取代在Kabat位置309和321處引入結構域內半胱胺酸二硫鍵)。
假定本發明的抗體構建體與例如本領域已知的雙特異性異源Fc抗體構建體(圖1b)相比的較佳的特徵可特別涉及在CH2結構域中引入上述修飾。因此，對於本發明的構建體，較佳的是本發明的抗體構建體的第三結構域中的CH2結構域包含Kabat位置309和321處的結構域內半胱胺酸二硫橋和/或Kabat位置314處的糖基化位點如上所述藉由N314X取代去除，較佳的是藉由N314G取代去除。
在本發明的進一步較佳的實施方式中，本發明抗體構建體的第三結構域中的CH2結構域包含Kabat位置309和321處的結構域內半胱胺酸二硫橋，並且Kabat位置314處的糖基化位點藉由N314G取代去除。
在一個實施方式中，本發明提供了抗體構建體，其中： (182)第一結構域包含兩個抗體可變結構域，且第二結構域包含兩個抗體可變結構域； (ii)第一結構域包含一個抗體可變結構域，且第二結構域包含兩個抗體可變結構域； (iii)第一結構域包含兩個抗體可變結構域，且第二結構域包含一個抗體可變結構域；或 (iv)第一結構域包含一個抗體可變結構域，且第二結構域包含一個抗體可變結構域。
因此，第一和第二結構域可以是各自包含兩個抗體可變結構域如VH和VL結構域的結合結構域。這種結合結構域的實例包括兩個上文所述的抗體可變結構域並且包括例如上文所述的Fv片段、scFv片段或Fab片段。可替代地，這些結合結構域中的一個或兩個可以僅包含單個可變結構域。上文所述的這種單結構域結合結構域的實例包括例如奈米抗體或單可變結構域抗體，該奈米抗體或單可變結構域抗體僅包含一個可變結構域，其可以是獨立於其他V區或結構域特異性地結合抗原或表位的VHH、VH或VL。
在本發明抗體構建體的較佳的實施方式中，第一和第二結構域藉由肽接頭與第三結構域融合。較佳的肽接頭已在上文描述，並且其特徵在於胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser即Gly4 Ser(SEQ ID NO: 187)，或其聚合物即(Gly4 Ser)x，其中x係1或更大的整數(例如2或3)。用於融合第一和第二結構域與第三結構域的特別較佳的接頭如SEQ ID No: 1所示。
在較佳的實施方式中，本發明的抗體構建體的特徵在於以胺基到羧基的順序包含： (a)第一結構域； (b)肽接頭，其具有選自由SEQ ID No: 187-189組成的群組的胺基酸序列； I 第二結構域； (d)肽接頭，其具有選自由SEQ ID NO: 187、188、189、195、196、197和198組成的群組的胺基酸序列； I 第三結構域的第一多肽單體； (f)肽接頭，其具有選自由SEQ ID No: 191、192、193和194組成的群組的胺基酸序列；以及 (g)第三結構域的第二多肽單體。
在本發明的一個方面，由第一結構域結合的靶細胞表面抗原係腫瘤抗原、對免疫疾病具有特異性的抗原或病毒抗原。如本文所用的術語“腫瘤抗原”可以理解為存在於腫瘤細胞上的那些抗原。這些抗原可以呈遞在細胞表面的細胞外部分，其通常與分子的跨膜和細胞質部分組合。這些抗原有時只能由腫瘤細胞呈遞，而不能由正常細胞呈遞。與正常細胞相比，腫瘤抗原可以僅僅在腫瘤細胞上表現或者可能表示與正常細胞相比的腫瘤特異性突變。在這種情況下，它們被稱為腫瘤特異性抗原。更常見的是由腫瘤細胞和正常細胞呈遞的抗原，並且它們被稱為腫瘤相關抗原。與正常細胞相比，這些腫瘤相關抗原可以過表現，或者由於與正常組織相比腫瘤組織的結構不那麼緊密，因此腫瘤細胞中可出現抗體結合。本文使用的腫瘤抗原的非限制性實例係CDH19、MSLN、DLL3、FLT3、EGFRvIII、CD33、CD19、CD20、CD70、BCMA和PSMA。
在本發明的上下文中，對於免疫病症特異性的靶細胞表面抗原包括例如TL1A和TNF-α。所述靶標較佳的是藉由本發明的雙特異性抗體構建體來解決，其較佳的是全長抗體。在非常較佳的實施方式中，本發明的抗體係異源IgG抗體。
在本發明抗體構建體的較佳的實施方式中，腫瘤抗原選自由CDH19、MSLN、DLL3、FLT3、EGFRvIII、CD33、CD19、CD20、CD70、BCMA和PSMA組成的群組。
在本發明的一個方面，抗體構建體以胺基到羧基的順序包含： (a)第一結構域，其具有選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下各項組成：SEQ ID No: 7、8、17、27、28、37、38、39、40、41、48、49、50、51、52、59、60、61、62、63、64、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、89、90、91、92、93、100、101、102、103、104、113、114、121、122、123、124、125、131、132、133、134、135、136、143、144、145、146、147、148、149、150、151、158、159、160、161、162、163、164、165、166、173、174、175、176、177、178、179、180、181 (b)肽接頭，其具有選自由SEQ ID No: 187-189組成的群組的胺基酸序列； I 第二結構域，其具有選自以下群組的胺基酸序列，該群組由以下各項組成：WO 2008/119567的SEQ ID No: SEQ ID No: 23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187或SEQ ID NO: 202； (d)肽接頭，其具有選自由SEQ ID No: 187、188、189、195、196、197和198組成的群組的胺基酸序列； I 第三結構域的第一多肽單體，其具有選自由WO 2017/134140的SEQ ID No: 17-24組成的群組的肽序列； (f)肽接頭，其具有選自由SEQ ID No: 191、192、193和194組成的群組的胺基酸序列；以及 (g)第三結構域的第二多肽單體，其具有選自由WO 2017/134140的SEQ ID No: 17-24組成的群組的肽序列。
在一個方面，本發明的雙特異性抗體構建體的特徵在於具有選自以下群組的胺基酸序列並且針對各自的靶細胞表面抗原，該群組由以下各項組成： (a) SEQ ID No: 27、28、37至41； CD33 (b) SEQ ID No: 48至52中的每一個； EGFRvIII (c) SEQ ID No: 59至64中的每一個； MSLN (d) SEQ ID No: 71至82中的每一個 CDH19 (e) SEQ ID No: 100至104中的每一個 DLL3 (f) SEQ ID No: 7、8、17、113和114 CD19 (g) SEQ ID No: 89至93中的每一個 FLT3 (h) SEQ ID No: 121至125中的每一個 CDH3 (i) SEQ ID No: 132至136中的每一個 BCMA以及 (j) SEQ ID No: 143至151、158至166和173至181中的每一個 PSMA
本發明進一步提供了編碼本發明抗體構建體的多核苷酸/核酸分子。多核苷酸係由13個或更多個在鏈中共價鍵合的核苷酸單體構成的生物聚合物。DNA(如cDNA)和RNA(如mRNA)係具有不同生物學功能的多核苷酸的實例。核苷酸係有機分子，其充當核酸分子如DNA或RNA的單體或亞基。核酸分子或多核苷酸可以是雙鏈和單鏈、線性和環狀。它較佳的是包含在載體中，該載體較佳的是包含在宿主細胞中。例如，所述宿主細胞在用本發明的載體或多核苷酸轉化或轉染後能夠表現抗體構建體。為了這個目的，多核苷酸或核酸分子與控制序列可操作地連接。
遺傳密碼係一組規則，藉由這些規則將遺傳物質(核酸)中編碼的資訊翻譯成蛋白質。活細胞中的生物解碼藉由核糖體使用tRNA分子攜帶胺基酸並一次讀取mRNA三個核苷酸來實現，核糖體以mRNA指定的順序連接胺基酸。該密碼規定了這些核苷酸三聯體的序列(稱為密碼子)如何在蛋白質合成期間指定接下來將添加哪種胺基酸。除了一些例外，核酸序列中的三-核苷酸密碼子指定單個胺基酸。因為絕大多數基因用完全相同的密碼編碼，所以這種特定密碼通常被稱為規範或標準遺傳密碼。雖然遺傳密碼決定了給定編碼區的蛋白質序列，但其他基因組區域可以影響這些蛋白質的產生時間和地點。
此外，本發明提供了包含本發明的多核苷酸/核酸分子的載體。載體係用作將(外源)遺傳物質轉移到細胞中的運載體的核酸分子。術語“載體”包括但不限於質粒、病毒、黏粒和人工染色體。一般而言，工程化載體包含複製的起點、多株位點和可選擇標誌物。載體本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入片段(轉基因)的DNA序列和用作載體“骨架”的較大序列。現代載體可以包括除轉基因插入片段和骨架之外的其他特徵：啟動子、基因標誌物、抗生素抗性、報告基因、靶向序列、蛋白質純化標記。稱為表現載體(表現構建體)的載體特異性地用於在靶細胞中表現轉基因，並且通常具有控制序列。
術語“控制序列”係指在特定宿主生物中表現可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。適合於原核生物的控制序列例如包括啟動子、視情況操縱子序列和核糖體結合側。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化訊號和增強子。
當核酸被放置成與另一核酸序列有功能關係時，其為“可操作地連接”。例如，如果前序列或分泌前導序列的DNA表現為參與多肽分泌的前蛋白，則它與多肽的DNA可操作地連接；如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，則它與編碼序列可操作地連接；或者如果核糖體結合側被定位以便於翻譯，則它與編碼序列可操作地連接。通常，“可操作地連接”意指被連接的DNA序列係連續的，並且在分泌前導序列的情況下，係連續的並且處於閱讀相。然而，增強子不必係連續的。藉由在方便的限制性位點接合來完成連接。如果不存在這樣的位點，則根據常規實踐使用合成的寡核苷酸適配子或接頭。
“轉染”係故意將核酸分子或多核苷酸(包括載體)引入靶細胞的製程。該術語主要用於真核細胞中的非病毒方法。轉導通常用於描述病毒介導的核酸分子或多核苷酸的轉移。動物細胞的轉染通常涉及打開細胞膜中的暫態孔或“洞”，以允許吸收物質。轉染可以使用磷酸鈣，藉由電穿孔、藉由細胞擠壓或藉由將陽離子脂質與該物質混合以產生脂質體來進行，這些脂質體與細胞膜融合並將其載荷物沈積在其中。
術語“轉化”用於描述核酸分子或多核苷酸(包括載體)非病毒轉移至細菌中，以及非動物真核細胞(包括植物細胞)中。因此，轉化係由於藉由一個或多個細胞膜從其周圍環境直接吸收並隨後摻入外源遺傳物質(核酸分子)而產生的細菌或非動物真核細胞的遺傳改變。轉化可以藉由人工方式實現。為了發生轉化，細胞或細菌必須處於能力狀態，這可能是對環境條件如饑餓和細胞密度的時間限制性反應。
此外，本發明提供了用多核苷酸/核酸分子或用本發明的載體轉化或轉染的宿主細胞。如本文所用，術語“宿主細胞”或“受體細胞”旨在包括可以是或已經係載體、外源核酸分子和編碼本發明的抗體構建體的多核苷酸的受體；和/或抗體構建體本身的受體的任何單獨細胞或細胞培養物。藉由轉化、轉染等方法將相應材料引入細胞中。術語“宿主細胞”還旨在包括單細胞的後代或潛在後代。由於後代可能會因自然、偶然或刻意突變或因環境影響而發生某些修飾，因此這種後代實際上可能與親本細胞不完全相同(在形態或基因組或總DNA補體中)，但仍包含在本文所用術語的範圍內。合適的宿主細胞包括原核或真核細胞，並且還包括但不限於細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞和動物細胞(如昆蟲細胞和哺乳動物細胞(例如鼠、大鼠、獼猴或人))。
本發明的抗體構建體可以在細菌中產生。表現後，將本發明的抗體構建體從可溶性級分中的大腸桿菌細胞糊中分離，並可藉由例如親和層析法和/或尺寸排阻來純化。最後的純化可以類似於純化例如在CHO細胞中表現的抗體的製程進行。
除原核生物外，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是本發明抗體構建體的合適選殖或表現宿主。釀酒酵母或常見的麵包酵母係低等真核宿主微生物中最常用的。然而，許多其他屬、種和菌株通常可適用於且可用於本文，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )、克魯維酵母屬宿主(Kluyveromyce)(如乳酸克魯維酵母(K. lactis )、脆壁克魯維酵母(K. fragilis)(ATCC 12424)、保加利亞克魯維酵母(ATCC 16045)、K. wickeramii (ATCC 24178)、K. waltii (ATCC 56500)、K. drosophilarum (ATCC 36906)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans )和馬克斯克魯維酵母(K. marxianus ))；耶氏酵母屬(yarrowia)(EP 402 226)；畢赤酵母(Pichia pastoris )(EP 183 070)；假絲酵母屬(Candida)；Trichoderma reesia (EP 244 234)；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa )；許旺酵母屬(Schwanniomyces)如許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis )；和絲狀真菌(filamentous fungi)如脈孢菌屬(Neurospora)、青黴菌屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)和麯黴屬(Aspergillus)宿主(如構巢麯黴(A. nidulans)和黑麯黴(A. niger))。
用於表現本發明的糖基化抗體構建體的合適宿主細胞源自多細胞生物。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。已經鑒定了許多桿狀病毒株和變體以及來自宿主的相應的許可性昆蟲宿主細胞，宿主例如草地貪夜蛾(毛蟲)、埃及伊蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黑腹果蠅(果蠅)和家蠶。用於轉染的多種病毒株係公眾可獲得的，例如苜蓿銀紋夜蛾NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5毒株，並且這些病毒在本文中可以根據本發明用作特別是用於草地貪夜蛾細胞的轉染的病毒。
棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、擬南芥和煙草的植物細胞培養物也可用作宿主。用於在植物細胞培養物中產生蛋白質的選殖和表現載體係熟悉該項技術者已知的。參見例如Hiatt等人，Nature[自然] (1989) 342: 76-78、Owen等人 (1992) Bio/Technology[生物科技] 10: 790-794、Artsaenko等人 (1995) The Plant J[植物學報] 8: 745-750以及Fecker等人 (1996) Plant Mol Biol[植物分子生物學] 32: 979-986。
然而，對脊椎動物細胞的興趣最大，並且脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中的繁殖已成為常規程序。有用的哺乳動物宿主細胞系的實例係由SV40轉化的猴腎CV1細胞系(COS-7, ATCC CRL 1651)；人胚胎腎細胞系(亞選殖用於在懸浮培養物中生長的293或293細胞，Graham, J. Gen Virol.[普通病毒學雜誌] 36 : 59 (1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國國家科學院院刊] 77: 4216 (1980))；小鼠支持細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod.[生殖生物學] 23: 243-251 (1980))；猴腎細胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76, ATCC CRL1587)；人宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK, ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138, ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2,1413 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562, ATCC CCL5 1)；TRI細胞(Mather等人，Annals N. Y Acad. Sci.[紐約科學院年鑒] (1982) 383: 44-68)；MRC 5細胞；FS4細胞；和人肝癌細胞(Hep G2)。
在進一步實施方式中，本發明提供了用於產生本發明抗體構建體的製程，所述製程包括在允許表現本發明抗體構建體的條件下培養本發明的宿主細胞，並從培養物中回收所產生的抗體構建體。
如本文所用，術語“培養”係指細胞在合適條件下在培養基中的體外維持、分化、生長、增殖和/或繁殖。術語“表現”包括涉及產生本發明抗體構建體的任何步驟，包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。
當使用重組技術時，抗體構建體可以在細胞內、在周質空間中產生或直接分泌到培養基中。如果在細胞內產生抗體構建體，那麼作為第一步驟，例如藉由離心或超濾來去除宿主細胞或溶解的片段的顆粒狀碎片。Carter等人，Bio/Technology[生物技術] 10: 163-167 (1992) 描述了用於分離分泌到大腸桿菌周質空間的抗體的程序。簡而言之，細胞糊在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺醯氟(PMSF)的存在下經約30分鐘解凍。可以藉由離心去除細胞碎片。在將該抗體分泌到培養基中的情況下，一般首先使用可商購的蛋白質濃縮過濾器，例如艾美康(Amicon)或佩利康(Millipore Pellicon)超濾單元，對來自這些表現系統的上清液進行濃縮。蛋白酶抑制劑如PMSF可以包括在任何前述步驟中以抑制蛋白水解，並且可以包括抗生素以防止外來污染物的生長。
可以使用例如羥磷灰石層析法、凝膠電泳、透析和親和層析法回收或純化由宿主細胞製備的本發明的抗體構建體。取決於有待回收的抗體，也可使用其他用於蛋白質純化的技術，如在離子交換柱上分級分離、乙醇沈澱、反相HPLC、在二氧化矽上進行層析法、在肝素SEPHAROSETM 上進行的層析法、在陰離子或陽離子交換樹脂(如聚天冬胺酸柱)上進行的瓊脂糖凝膠層析法、親液聚焦(lyophili-focusing)、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。當本發明的抗體構建體包含CH3結構域時，Bakerbond ABX樹脂(J.T. Baker，新澤西菲力浦斯堡)可用於純化。
親和層析法係較佳的純化技術。親和配位基所連接的基質通常是瓊脂糖，但也可以使用其他基質。與瓊脂糖相比，機械穩定的基質如受控制孔徑的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可實現更快的流速和更短的加工時間。
此外，本發明提供了藥物化合物，其包含本發明的抗體構建體或根據本發明的製程產生的抗體構建體。對於本發明的藥物組成物，較佳的是抗體構建體的同質性 ≥ 80%、更較佳的是 ≥ 81%、≥ 82%、≥ 83%、≥ 84%或 ≥ 85%、進一步較佳的是 ≥ 86%、≥ 87%、≥ 88%、≥ 89%或 ≥ 90%、更較佳的是≥ 91%、≥ 92%、≥ 93%、≥ 94%或 ≥ 95%以及最較佳的是 ≥ 96%、≥ 97%、≥ 98%或 ≥ 99%。
如本文所用，術語“藥物組成物”涉及適用於給予患者、較佳的是人類患者的組成物。本發明特別較佳的藥物組成物較佳的是以治療有效量包含一種或多種的一個或多個本發明的抗體構建體。較佳的是，藥物組成物進一步包含一種或多種(藥學上有效的)載體、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑的合適製劑。在所用的劑量和濃度下，組成物的可接受成分較佳的是對受體無毒。本發明的藥物組成物包括但不限於液體、冷凍和凍乾組成物。
本發明的組成物可以包含藥學上可接受的載體。一般而言，如本文所用，“藥學上可接受的載體”意指任何和全部水性和非水性溶液、無菌溶液、溶劑、緩衝液(例如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)溶液)、水、懸浮液、乳液(如油/水乳液)、各種類型的潤濕劑、脂質體、分散介質和塗層，它們與藥物給予特別是與腸胃外給予相容。在藥物組成物中使用這些介質和試劑係本領域熟知的，並且包含這些載體的組成物可以藉由熟知的常規方法配製。
某些實施方式提供了包含本發明的抗體構建體和另外的一種或多種賦形劑(如本章節和本文其他地方說明性地描述的那些賦形劑)的藥物組成物。賦形劑關於這一方面可在本發明中用於多種目的，如調節製劑的物理、化學或生物學特性(如調節黏度)，和或用於提高效力和或穩定這種製劑的製程以及對抗由於例如在製造、運輸、儲存、使用前製備、給予及其後的製程中發生的應力引起的降解和腐敗的製程。
在某些實施方式中，藥物組成物可能含有用於以下目的的配製材料，即用於修改、維持或保留例如pH、莫耳滲透壓濃度、黏度、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌、穩定性、溶解或釋放速率、組成物的吸附或滲透(參見REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18” Edition[雷明頓藥學大全，第18版], (A.R. Genrmo, 編輯), 1990, 麥克出版公司)。在這種實施方式中，合適的配製材料可包括但不限於： ● 胺基酸如甘胺酸、丙胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、蘇胺酸、脯胺酸、2-苯丙胺酸，包括帶電的胺基酸，較佳的是賴胺酸、賴胺酸乙酸鹽、精胺酸、麩胺酸 和/或組胺酸 ● 抗微生物劑，如抗細菌劑和抗真菌劑 ● 抗氧化劑如抗壞血酸、甲硫胺酸、sodium lyophili或亞硫酸氫鈉； ● 緩衝液、緩衝系統和緩沖劑，其用於將組成物維持在生理pH或略低的pH；緩衝液的實例係硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸、琥珀酸鹽、磷酸鹽和組胺酸；例如，pH約7.0-8.5的Tris緩衝液； ● 非水性溶劑如丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射用有機酯如油酸乙酯； ● 水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩衝的介質； ● 可生物降解的聚合物如聚酯； ● 膨脹劑如甘露醇或甘胺酸； ● 螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)； ● 等滲和吸收延遲劑； ● 錯合劑如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精) ● 填充劑； ● 單糖；雙糖；和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；碳水化合物可以是非還原糖，較佳的是海藻糖、蔗糖、八硫酸鹽、山梨醇或木糖醇； ● (低分子量)蛋白質、多肽或蛋白質載體，如人或牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白，較佳的是人來源的； ● 著色劑和調味劑； ● 含硫還原劑，如麩胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、[α]-一硫代甘油和硫代硫酸鈉 ● 稀釋劑； ● 乳化劑； ● 親水性聚合物如聚乙烯吡咯啶酮 ● 成鹽抗衡離子如鈉； ● 防腐劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等；實例係氯化苄烷銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙基醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、洛赫西定、山梨酸或過氧化氫)； ● 金屬錯合物如Zn-蛋白質複合物； ● 溶劑和共溶劑(如lyophilis、丙二醇或聚乙二醇)； ● 糖和糖醇，如海藻糖、蔗糖、硫酸氫鹽、甘露醇、山梨醇或木糖醇、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖，核糖、myoinisitose、半乳糖，乳糖醇、核糖醇、myoinisitol、半乳糖醇、甘油、環醇(如肌醇)、聚乙二醇；和多元糖醇； ● 懸浮劑； ● 表面活性劑或潤濕劑如普朗尼克、PEG、脫水山梨醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、triton、胺丁三醇、卵磷脂、膽固醇、tyloxapal；表面活性劑可以是洗滌劑(較佳的是具有分子量＞1.2 KD)和/或聚醚(較佳的是具有分子量＞3 KD)；較佳的是洗滌劑的非限制性實例係吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80和吐溫85；較佳的是聚醚的非限制性實例係PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000和PEG 5000； ● 穩定性增強劑如蔗糖或山梨醇； ● 張力增強劑如鹼金屬鹵化物(較佳的是氯化鈉或氯化鉀)、甘露糖醇、山梨醇； ● 腸胃外遞送運載體包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer’s)右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或固定油； ● 靜脈內遞送運載體包括流體和營養補充劑、電解質補充劑(例如基於林格氏右旋糖的那些)。
對於熟悉該項技術者清楚的是，藥物組成物的不同成分(例如，上面列出的那些)可以具有不同的作用，例如，胺基酸可以充當緩衝液、穩定劑和/或抗氧化劑；甘露醇可充當膨脹劑和/或張力增強劑；氯化鈉可以充當遞送運載體和/或張力增強劑；等等。
設想本發明的組成物除了本文定義的本發明的多肽外，還可以根據該組成物的預期用途而包含其他生物活性劑。這些試劑可能是作用於胃腸道系統的藥物、充當細胞抑制劑的藥物、防止lyophilisatio的藥物、抑制免疫反應的藥物(例如皮質類固醇)、調節炎性反應的藥物、作用於循環系統的藥物和/或試劑如本領域已知的細胞介素。還設想本發明的抗體構建體應用於聯合療法中，即與另一種抗癌藥物一起應用。
在某些實施方式中，最佳藥物組成將由熟悉該項技術者根據例如給予的預期途徑、遞送形式和所需劑量來確定。參見例如，REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明頓藥學大全], 同上。在某些實施方式中，此類組成物可影響本發明抗體構建體的物理狀態、穩定性、體內釋放速率和體內清除速率。在某些實施方式中，藥物組成物中的主要運載體或載體可以是水性或非水性的。例如，合適的運載體或載體可以是注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊液，其可能補充有腸胃外給予組成物中常見的其他物質。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水係另外的示例性運載體。在某些實施方式中，本發明組成物的抗體構建體可以藉由將選擇的具有所需純度的組成物與視情況的製劑(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明頓藥學大全]，同上)以凍乾餅或水溶液的形式混合來製備以供儲存。此外，在某些實施方式中，可以使用合適的賦形劑如蔗糖將本發明的抗體構建體配製成凍乾物。
當考慮腸胃外給予時，用於本發明的治療組成物可以以包含本發明的所需抗體構建體的無熱原、腸胃外可接受的水溶液的形式提供於藥學上可接受的運載體中。用於腸胃外注射的特別合適的運載體係無菌蒸餾水，在該無菌蒸餾水中將本發明的抗體構建體配製成適當保存的無菌等滲溶液。在某些實施方式中，該製備可以包括用試劑配製所需分子，該試劑如可注射微球、生物可侵蝕顆粒、聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體，它們可提供可經由積存注射遞送的產品的控制釋放或持續釋放。在某些實施方式中，也可以使用透明質酸，其具有促進在循環中的持續時間的作用。在某些實施方式中，可植入的藥物遞送設備可用於引入所需的抗體構建體。
其他藥物組成物對於熟悉該項技術者來說係清楚的，包括將本發明的抗體構建體包含在持續或控制遞送/釋放製劑中的製劑。用於配製各種其他持續或控制遞送方式(如脂質體載體、生物可侵蝕微粒或多孔珠粒和積存注射)的技術也是熟悉該項技術者已知的。參見例如，國際專利申請案號PCT/US93/00829，其描述了用於遞送藥物組成物的多孔聚合物微粒的控制釋放。持續釋放製品可包括成形製品形式的半透性聚合物基質，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚交酯(如美國專利案號3,773,919和歐洲專利申請公開案號EP 058481中所揭露的)、L-麩胺酸 和γ-乙基-L-麩胺酸 的共聚物(Sidman等人，1983, Biopolymers[生物聚合物] 2:547-556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981, J. Biomed. Mater. Res.[生物醫學研究雜誌] 15:167-277和Langer, 1982, Chem. Tech.[化學技術] 12:98-105)、乙酸醋酸乙烯酯(Langer等人，1981, 同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公開案號EP 133,988)。持續釋放組成物還可包括可藉由本領域已知的幾種方法中的任一種製備的脂質體。參見例如，Eppstein等人，1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.[美國國家科學院院刊] 82 :3688-3692；歐洲專利申請公開案號EP 036,676、EP 088,046和EP 143,949。
該抗體構建體也可以例如藉由凝聚技術或藉由介面聚合反應包入在膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒和奈米膠囊)或在粗乳液中製備的微膠囊(例如，分別為羥甲基纖維素或lyophil-微膠囊以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中。這些技術揭露於Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition[雷明頓藥學大全，第16版], Oslo, A., 編輯, (1980)。
用於體內給予的藥物組成物通常作為無菌製品提供。滅菌可以藉由經由無菌濾膜的過濾來完成。在該組成物係凍乾的情況下，可以在凍乾和重構之前或之後使用該方法進行滅菌。用於腸胃外給予的組成物可以以凍乾形式或以溶液儲存。腸胃外組成物通常置於具有無菌進入口的容器中，例如具有可由皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。
本發明的另一方面包括本發明製劑的自緩衝抗體構建體，其如國際專利申請WO 06138181 A2(PCT/US 2006/022599)中所述可用作藥物組成物。關於在這方面有用的蛋白質穩定和配製材料以及方法，可以獲得各種各樣的說明，如Arakawa等人，“Solvent interactions in pharmaceutical formulations,”[藥物製劑中的溶劑相互作用] Pharm Res.[藥學研究] 8(3): 285-91 (1991)；Kendrick等人，“Physical stabilization of proteins in aqueous solution”[蛋白質在水溶液中的物理穩定], RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE[穩定的蛋白質製劑的合理設計：理論與實踐], Carpenter and Manning, 編輯 Pharmaceutical Biotechnology[藥物生物技術]. 13: 61-84 (2002)以及Randolph等人，“Surfactant-protein interactions”[表面活性劑蛋白質相互作用], Pharm Biotechnol.[藥物生物技術] 13: 159-75 (2002)，特別參見關於根據本發明的自緩衝蛋白質製劑的相同賦形劑和方法的部分，尤其是關於獸醫和/或人類醫學用途的蛋白質藥物產品和方法。
根據本發明的某些實施方式鹽類可用於例如調節製劑的離子強度和/或等滲性和/或改善蛋白質或根據本發明的組成物的其他成分的溶解性和/或物理穩定性。眾所周知，離子可以藉由與蛋白質表面上的帶電殘基結合以及藉由遮罩蛋白質中的帶電和極性基團並降低其靜電相互作用、吸引和排斥相互作用的強度來穩定蛋白質的天然狀態。離子還可以藉由結合特別是蛋白質的變性肽鍵(-CONH)來穩定蛋白質的變性狀態。此外，離子與蛋白質中帶電和極性基團的相互作用還可以減少分子間靜電相互作用，從而防止或減少蛋白質聚集和不溶性。
離子種類對蛋白質的影響差異很大。已經開發了離子及其對蛋白質的影響的許多分類排名，所述蛋白質可用於配製根據本發明的藥物組成物。一個實例係Hofmeister系列，其藉由離子和極性非離子溶質對溶液中蛋白質的構象穩定性的影響對該離子和極性非離子溶質進行排名。穩定性溶質被稱為“親液的(kosmotropic)”。去穩定性溶質被稱為“離液的(chaotropic)”。親液劑通常以高濃度(例如 ＞ 1莫耳硫酸銨)使用以從溶液中沈澱蛋白質(“鹽析”)。離液劑通常用於變性和/或溶解蛋白質(“鹽溶”)。離子對“鹽溶”和“鹽析”的相對有效性定義了它們在Hofmeister系列中的位置。
根據本發明的各種實施方式，游離胺基酸作為填充劑、穩定劑和抗氧化劑以及其他標準用途可用於本發明製劑的抗體構建體中。賴胺酸、脯胺酸、絲胺酸和丙胺酸可用於穩定製劑中的蛋白質。甘胺酸可用於冷凍乾燥以確保恰當的餅結構和特性。在液體和凍乾製劑中，精胺酸可用於抑制蛋白質聚集。甲硫胺酸可用作抗氧化劑。
多元醇包括糖(例如甘露醇、蔗糖和山梨醇)和多羥基醇(例如甘油和丙二醇)以及出於本文討論的目的，包括聚乙二醇(PEG)和相關物質)。多元醇係親液的。它們係液體和凍乾製劑中有用的穩定劑，以保護蛋白質免受物理和化學降解過程的影響。多元醇也可用於調節製劑的張力。可用於本發明的選擇實施方式的多元醇係甘露醇，其通常用於確保凍乾製劑中餅的結構穩定性。它確保了對於餅的結構穩定性。甘露醇通常與凍乾保護劑一起使用，例如蔗糖。山梨醇和蔗糖係用於調節張力的較佳的試劑並且用作在運輸期間或製造製程期間製備散劑期間防止凍融應力的穩定劑。還原糖(其含有游離醛或酮基團)如葡萄糖和乳糖可以親液表面賴胺酸和精胺酸殘基。因此，它們通常不是根據本發明使用的較佳的多元醇。此外，形成這種反應性種類的糖如蔗糖在酸性條件下水解成果糖和葡萄糖並因此產生糖化，這種糖在這一方面也不是本發明較佳的多元醇。PEG可用於穩定蛋白質和用作冷凍保護劑，並且在這一方面可用於本發明。
本發明製劑的抗體構建體的實施方式進一步包含表面活性劑。蛋白質分子可能易於在表面上吸附並且易於在氣-液、固-液和液-液介面處變性和隨後聚集。這些效應通常與蛋白質濃度成反比。這些有害的相互作用通常與蛋白質濃度成反比，並且通常藉由物理攪動(如在運輸和處理產品的過程產生的物理攪動)加劇。表面活性劑通常用於防止、最小化或減少表面吸附。在這一方面，本發明中有用的表面活性劑包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脫水山梨醇聚乙氧基化物的其他脂肪酸酯和泊洛沙姆(poloxamer)188。表面活性劑也常用於控制蛋白質構象穩定性。在這一方面，表面活性劑的使用係蛋白質特異性的，因為任何給定的表面活性劑通常會穩定一些蛋白質而使其他蛋白質不穩定。
聚山梨醇酯易受氧化降解的影響，並且通常如所提供的含有足夠量的過氧化物以引起蛋白質殘基側鏈(尤其是甲硫胺酸)的氧化。因此，應小心使用聚山梨醇酯，使用時應使用最低有效濃度。在這一方面，聚山梨醇酯例證了賦形劑應以其最低有效濃度使用的一般規則。
本發明製劑的抗體構建體的實施方式進一步包含一種或多種抗氧化劑。在一定程度上，藉由維持適當水平的環境氧和溫度並避免光照，可以防止藥物製劑中蛋白質的有害氧化。抗氧化賦形劑也可用於防止蛋白質的氧化降解。在這一方面，有用的抗氧化劑係還原劑、氧/自由基清除劑和螯合劑。用於根據本發明的治療性蛋白質製劑的抗氧化劑較佳的是水溶性的並且在產品的整個保質期內保持其活性。在這一方面，EDTA係根據本發明的較佳的抗氧化劑。抗氧化劑可以破壞蛋白質。例如，還原劑如麩胱甘肽特別可以破壞分子內二硫連接。因此，用於本發明的抗氧化劑除其他方面外被選擇用於消除或充分降低它們自身損害製劑中蛋白質的可能性。
根據本發明的製劑可包含金屬離子，其係蛋白質輔因子並且是形成蛋白質配位錯合物所必需的，如形成某些胰島素懸浮液所必需的鋅。金屬離子也可以抑制一些降解蛋白質的過程。然而，金屬離子也催化降解蛋白質的物理和化學過程。鎂離子(10-120 mM)可用於抑制天冬胺酸異構化為異天冬胺酸。Ca+2 離子(高達100 mM)可以增加人去氧核糖核酸酶的穩定性。然而，Mg+2 、Mn+2 和Zn+2 可使rhDNase不穩定。類似地，Ca+2 和Sr+2 可以穩定因子VIII，它可以被Mg+2 、Mn+2 和Zn+2 、Cu+2 和Fe+2 去穩定化，並且該穩定因子的聚集可以藉由Al+3 離子強化。
本發明製劑的抗體構建體的實施方式進一步包含一種或多種防腐劑。當開發涉及從同一容器中多於一次取出的多劑量腸胃外製劑時，防腐劑係必需的。它們的主要功能是在藥物產品的整個保質期或使用期限內抑制微生物生長並確保產品無菌。常用的防腐劑包括苯甲醇、苯酚和間甲酚。雖然防腐劑與小分子腸胃外藥物一起使用已經很長的歷史，但包含防腐劑的蛋白質製劑的開發可能具有挑戰性。防腐劑幾乎總是對蛋白質具有不穩定作用(聚集)，並且這已經成為限制它們在多劑量蛋白質製劑中的使用的主要因素。迄今為止，大多數蛋白質藥物僅配製成一次性使用。然而，當多劑量製劑成為可能時，它們具有使患者方便和增加適銷性的附加優點。一個很好的實例係人類生長激素(hGH)的防腐劑，其中保存製劑的開發已導致更方便、多用途的注射筆呈現的商業化。目前市場上可提供至少四種含有保存的hGH製劑的這種筆設備。Norditropin(液體，諾和諾德公司)、Nutropin AQ(液體，基因泰克公司)和Genotropin(凍乾雙腔盒，法瑪西亞普強公司)含有苯酚，而Somatrope(禮來公司)用間甲酚配製。在保存劑型的配製和開發過程中需要考慮幾個方面。必須優化藥物產品中的有效防腐劑濃度。這需要在劑型中測試給定防腐劑的濃度範圍，該防腐劑的濃度範圍賦予了抗微生物有效性而不損害蛋白質穩定性。
如可以預期的，含有防腐劑的液體製劑的開發比凍乾製劑更具挑戰性。冷凍乾燥的產品可以在沒有防腐劑的情況下凍乾，並在使用時用含有防腐劑的稀釋劑重構。這縮短了防腐劑與蛋白質接觸的時間，從而顯著降低了相關的穩定性風險。在液體製劑的情況下，防腐劑的有效性和穩定性應在整個產品保質期(約18至24個月)內保持。需要注意的一點係，防腐劑的有效性應該在含有活性藥物和所有賦形劑組分的最終製劑中證實。
本文揭露的抗體構建體也可以配製為親液-脂質體。“脂質體”係由各種類型的脂質、磷脂和/或表面活性劑構成的小囊泡，其可用於將藥物遞送至哺乳動物。脂質體的組分通常以雙層形式排列，類似於生物膜的脂質排列。含有抗體構建體的脂質體藉由本領域已知的方法製備，如Epstein等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國國家科學院院刊], 82: 3688 (1985)；Hwang等人，Proc. Natl Acad. Sci. USA[美國國家科學院院刊], 77: 4030 (1980)；美國專利案號4,485,045和4,544,545；以及W0 97/38731中描述的方法。具有增加的循環時間的脂質體在美國專利案號5,013,556中揭露。特別有用的脂質體可以藉由反相蒸發方法用包括磷脂醯膽鹼、膽固醇、以及PEG衍生化磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂類組成物來產生。使脂質體擠出藉由具有限定孔徑的濾器以產生具有所希望的直徑的脂質體。本發明的抗體構建體的Fab'片段可以與如Martin等人 J. Biol. Chem.[生物化學雜誌] 257: 286-288 (1982)中所述的脂質體經由二硫化物互換反應綴和。化學治療劑視情況包含在脂質體內。參見Gabizon等人 J. National Cancer Inst.[國家癌症研究所雜誌] 81 (19) 1484 (1989)。
一旦配製好藥物組成物，它可以作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、晶體或作為脫水或凍乾粉末儲存在無菌小瓶中。此類製劑可以以即用形式或以在給予之前重構的形式(例如，凍乾的)儲存。
本文定義的藥物組成物的生物活性可以例如藉由如WO 99/54440中或Schlereth等人(Cancer Immunol. Immunother.[癌症免疫學與免疫治療] 20 (2005), 1-12)在以下實例中所述的細胞毒性測定來確定。如本文所用的“功效”或“體內功效”係指使用例如標準化的NCI反應標準的對本發明的藥物組成物的療法的反應。使用本發明的藥物組成物的療法的成功或體內功效係指組成物對其預期目的的有效性，即組成物產生其所需效果的能力，即病理細胞例如腫瘤細胞的耗竭。可以藉由針對各個疾病實體的已建立的標準方法監測體內功效，所述標準方法包括但不限於白細胞計數、差異、螢光活化細胞分選、骨髓抽吸。此外，可以使用各種疾病特異性臨床化學參數和其他已建立的標準方法。此外，可以使用電腦輔助斷層攝影、X射線、核磁共振斷層攝影(例如用於基於國家癌症研究所標準的反應評估[Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin’s lymphomas.[標準化非霍奇金淋巴瘤的反應標準的國際研討會報告] NCI Sponsored International Working Group.[NCI贊助的國際工作小組] J Clin Oncol.[臨床腫瘤學雜誌] 1999年4月;17(4):1244])、正電子發射斷層攝影掃描、白細胞計數、差異、螢光活化細胞分選、骨髓抽吸、淋巴結活檢/組織學以及各種淋巴瘤特異性臨床化學參數(例如乳酸脫氫酶)以及其他已建立的標準方法。
開發藥物如本發明的藥物組成物的另一個主要挑戰係藥物動力學特性的可預測的調節。為此，可以建立藥物候選物的藥物動力學曲線，即影響特定藥物治療給定病況的能力的藥物動力學參數的曲線。影響藥物治療某種疾病實體的能力的藥物的藥物動力學參數包括但不限於半衰期、分佈體積、肝臟首過代謝和血清結合程度。給定藥物試劑的功效可受上述每個參數的影響。具有特定FC形式的本發明抗體構建體的設想特徵係它們包括例如藥物動力學行為的差異。與“經典”非HLE形式的所述抗體構建體相比，根據本發明的半衰期延長的靶向抗體構建體較佳的是顯示出出人意料地增加的體內停留時間。
“半衰期”意指50%的給予藥物藉由生物製程(例如代謝、排泄等)消除的時間。“肝臟首過代謝”意指藥物在首次與肝臟接觸時即在其首次藉由肝臟期間代謝的傾向。“分佈體積”意指藥物在身體的全部各個隔室(例如細胞內和細胞外空間、組織和器官等)中的保留程度以及藥物在這些隔室內的分佈。“血清結合程度”意指藥物與血清蛋白如白蛋白相互作用和結合從而導致藥物生物活性的降低或喪失的傾向。
藥物動力學參數還包括給予的給定量的藥物的生物利用度、滯後時間(Tlag)、Tmax、吸收率、更多的起效和/或Cmax。“生物利用度”意指血液隔室中藥物的量。“滯後時間”意指藥物的給予與其在血液或血漿中的檢測和可測量性之間的時間延遲。“Tmax”係達到藥物的最大血液濃度後的時間，且“Cmax”係給定藥物最大程度地獲得的血液濃度。達到其生物效應所需的藥物的血液或組織濃度的時間受所有參數的影響。顯示出跨物種特異性的雙特異性抗體構建體的藥物動力學參數也描述在例如Schlereth等人的出版物(Cancer Immunol. Immunother.[癌症免疫學與免疫療法] 20 (2005), 1-12)中，所述藥物動力學參數可以在如上所述的非黑猩猩靈長類動物的臨床前動物實驗中測定。
在本發明的較佳的方面，藥物組成物在約-20℃下穩定至少四周。從所附實例中清楚的是，可以使用不同的系統測試本發明的抗體構建體的品質與相應的現有抗體構建體的品質。這些測試被理解為符合“ICH Harmonised Tripartite Guideline:Stability Testing of Biotechnological/Biological Products Q5C [ICH協調三方指南：生物技術/生物產品Q5C的穩定性測試]和Specifications: Test procedures and Acceptance Criteria for Biotech Biotechnological/Biological Products Q6B [說明：Biotech生物技術/生物產品Q6B的測試程式和驗收標準]”， 並因此被選擇用於提供穩定性指示曲線，該曲線提供檢測到產品的特性、純度和效力變化的確定性。人們普遍認為術語純度係一個相對術語。由於糖基化、脫醯胺化或其他異質性的影響，生物技術/生物產品的絕對純度通常應藉由多於一種方法評估，並且得到的純度值取決於方法。出於穩定性測試的目的，純度測試應集中於測定降解產品的方法。
為了評估包含本發明的抗體構建體的藥物組成物的品質，可以藉由分析溶液中可溶性聚集體的含量來進行分析(每次尺寸排阻的HMWS)。在約-20℃下至少四周的穩定性的特徵較佳的是在於小於1.5% HMWS的含量，較佳的是小於1% HMWS。
本文較佳的產品品質分析方法係尺寸排阻高效液相層析法(SE-HPLC)。SE-HPLC通常使用尺寸排阻柱和UHPLC系統進行，例如Waters BEH200 尺寸排阻柱(4.6 x 150 mm, 1.7 µm)和Waters UHPLC 系統。將蛋白質樣品純淨地注射並使用例如含有NaCl鹽的磷酸鹽緩衝液在例如0.4 mL/min的流速下等度地分離(流動相為pH 6.8下的100 mM磷酸鈉、250 mM NaCl)，並藉由在280 nm處的UV吸光度監測洗脫液。通常，載入約6 μg的樣品。
在CM製程開始之前，通常將含有表現雙特異性抗體構建體的CHO細胞的小瓶解凍。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於灌注生產生物反應器(例如10 L或50 L規模或更大)。
一旦將細胞以本文規定的濃度範圍接種到生產生物反應器中，存在持續數天的初始細胞生長階段，通常為約7至28天，以使細胞密度和生物量增加至本文所述和藉由電容探針(Hamilton Bonaduz AG，瑞士)所測量的較佳的設定點。將生產生物反應器控制在較佳的pH(通常為約6至7.4，例如pH 6.85)，例如64 mm Hg的溶解氧和約36℃下。在細胞生長階段數天後，通常在第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天或第10天，較佳的是第4天，使用具有過濾器如聚醚碸0.2-μm過濾器(例如通用電氣醫療集團，匹茲堡，賓夕法尼亞州)的交替切向流(ATF)過濾系統(例如，改進技術公司(Refine Technologies)，新澤西漢諾威)和專有化學成分確知的灌注培養基在本文所述的VVD灌注速率下例如在0.4生物反應器VVD灌注速率下開始灌注培養。灌注速率通常逐漸增加，例如從第4天的0.4 VVD增加至第12天的2 VVD。一旦在逐漸增加VVD的最後一天達到生物量設定點，通常將細胞培養溫度降低至例如33.5℃，開始收集HCCF(即，含有雙特異性抗體構建體的無細胞滲透物)，並且藉由以設定的灌注速率(通常為逐漸增加所達到的最高VVD灌注速率(即穩定狀態細胞特異性灌注速率CSPR，例如0.02-0.03 nL/細胞-天))進料並排出額外細胞以維持較佳的生物量設定點，灌注培養如本文所述持續一段時間，例如另外持續至少7、14、28或40天，較佳的是至少28天。通常在整個培養持續時間內測量細胞密度(藉由CDV(例如諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)測量)、代謝物(例如藉由NovaFlex(諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)測量)和滲透物滴度(藉由HPLC分析測量)。較佳的是在室溫下連續地或以例如6、12、24、48、72、96、120或144小時的增量收集HCCF，並加工用於蛋白質L捕獲層析法。例如對在第26、27、34、40天來自蛋白質-L的洗脫液使用分析型陽離子交換層析法(CEX-HPLC)、肽圖譜和/或HCP ELISA分析產品品質屬性和與製程相關的雜質。
用於化學修飾的胰蛋白酶消化肽圖譜 雙特異性抗體構建體蛋白質樣品採用基於過濾器的方法使用例如Millipore Microcon 30K設備進行消化。將蛋白質樣品添加到過濾器上，離心去除樣品基質，然後在例如含有甲硫胺酸的6 M鹽酸胍(GuHCl)(例如賽默飛世爾科技公司，羅克福德，伊利諾州)緩衝液中變性，用例如500 mM二硫蘇糖醇(DTT)(例如Sigma-Aldrich公司，聖路易斯，密蘇里州)在例如37℃下還原30 min，並隨後藉由在室溫下黑暗中與例如500 mM碘乙酸(IAA)(例如Sigma-Aldrich公司，聖路易斯，密蘇里州)孵育例如20 min來進行烷基化。藉由添加DTT淬滅未反應的IAA。上述所有步驟均在過濾器上進行。隨後藉由離心將樣品緩衝更換為消化緩衝液(例如pH 7.8的含有甲硫胺酸的50 mM Tris)以去除任何殘留的DTT和IAA。胰蛋白酶消化使用1 : 20(w/w)的酶與蛋白質的比率在過濾器上37℃下進行例如1 hr。藉由離心收集消化混合物，然後例如藉由在pH 4.7的乙酸鹽緩衝液中加入8 M GuHCl淬滅。
液相層析-質譜(LC-MS)分析使用直接與質譜儀(例如Thermo Scientific Q-Exactive)偶聯的超高效液相層析(UPLC)系統例如Thermo U-3000進行。使用Agilent Zorbax C18 RR HD柱(2.1 × 150 mm，1.8 μm)藉由反相分離蛋白質消化物，其中柱溫保持在50℃。流動相A由在水中的0.020%(v/v)甲酸(FA)組成，且流動相B為在乙腈(I)中的0.018%(v/v)FA。將約5 μg消化的雙特異性抗體構建體注射至柱。使用梯度(例如經145 min從0.5%至36% B)在例如0.2 mL/min的流速下分離肽。藉由MS監測洗脫的肽。
對於肽鑒定和修飾分析，通常使用數據依賴性串聯MS(MS/MS)實驗。通常獲取例如在正離子模式下從200到2000 m/z的完整掃描，然後進行例如6個數據依賴性MS/MS掃描以鑒定肽的序列。定量基於使用以下等式的所選離子監測的質譜數據： 其中修飾%係修飾肽的水平，A修飾 係修飾肽的提取離子層析圖面積，A未修飾 係未修飾肽的提取離子層析圖面積。
宿主細胞蛋白(HCP)ELISA 將微量滴定板用兔抗HCP免疫球蛋白 G(IgG)(安進公司，內部抗體)包被。在洗滌並封閉板後，將測試樣品、對照和HCP校準標準品加入板中並孵育。從板上洗去未結合的蛋白質，並將合併的兔抗HCP IgG生物素(安進公司，內部抗體)加入板中並孵育。在又一次洗滌後，將Streptavidin™辣根過氧化物酶綴合物(HRP綴合物)(例如Amersham-GE，白金漢郡，英國)加入板中並孵育。最後一次洗滌板，並將顯色底物四甲基聯苯胺(TMB)(例如Kirkegaard and Perry Laboratories，蓋瑟斯堡，馬里蘭州)加入板中。用1 M磷酸抑制顯色，並用分光光度計測量光密度。
作為藥物組成物的抗體構建體的較佳的製劑可以例如包含如下所述的製劑組分： ● 製劑： pH 6.0下的磷酸鉀、L-精胺酸鹽酸鹽、海藻糖、聚山梨醇酯80
在所附的實例4-12中提供了評估在藥物組成物形式中的本發明抗體構建體的穩定性的其他實例。在那些實例中，針對不同藥物製劑中的不同應激條件測試本發明抗體構建體的實施方式，並將結果與本領域已知的雙特異性T細胞銜接抗體構建體的其他半衰期延長(HLE)形式進行比較。一般而言，設想與具有不同HLE形式和不具有任何HLE形式的抗體構建體相比，具有根據本發明的特定FC形式的抗體構建體通常均在廣泛範圍的應激條件(如溫度和光應激)下更穩定。所述溫度穩定性可能與降低(低於室溫，包括冷凍)和增加(高於室溫，包括高達或高於體溫的溫度)的溫度有關。如熟悉該項技術者將認識到的，在臨床實踐中難以避免的這種改善的關於應激的穩定性使得抗體構建體更安全，因為在臨床實踐中將出現較少的降解產物。因此，所述增加的穩定性意味著增加的安全性。
一個實施方式提供本發明的抗體構建體或根據本發明的方法產生的抗體構建體，以用於預防、治療或改善增殖性疾病、腫瘤疾病、病毒性疾病或免疫病症。
本文所述的製劑可用作在有需要的患者中治療、改善和/或預防本文所述病理醫學病況的藥物組成物。術語“治療”係指治療性治療和預防性或防範性措施。治療包括將製劑應用或給予至來自具有疾病/病症、疾病/病症的症狀或對疾病/病症的傾向的患者的身體、分離的組織或細胞，目的是治療、治癒、緩解、減輕、改變、補救、減輕、改善或影響疾病、疾病的症狀或向疾病的傾向。
如本文所用的術語“減輕”係指藉由向有需要的受試者給予根據本發明的抗體構建體，對患有如本文所述的腫瘤或癌症或轉移性癌症的患者的疾病狀態的任何改善。這種改善還可以被視為減緩或停止患者的腫瘤或癌症或轉移性癌症的進展。本文所用的術語“預防”意指藉由向有需要的受試者給予根據本發明的抗體構建體，避免患有如下文所述的腫瘤或癌症或轉移性癌症的患者的發病或復發。
術語“疾病”係指將受益於用本文所述的抗體構建體或藥物組成物治療的任何病況。這包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳動物易患所討論的疾病的那些病理狀況。
“贅生物”係組織的異常生長，通常但不總是形成腫塊。當還形成腫塊時，通常將其稱為“腫瘤”。贅生物或腫瘤或可以是良性的、潛在惡性(癌前)或惡性的。惡性腫瘤通常被稱為癌症。它們通常侵入並破壞周圍組織並可形成轉移瘤，即它們擴散到身體的其他部位、組織或器官。因此，術語“轉移癌”包括原始腫瘤之外的其他組織或器官的轉移瘤。淋巴瘤和白血病係淋巴樣腫瘤。出於本發明的目的，它們也包括由術語“腫瘤”或“癌症”涵蓋。
術語“病毒性疾病”描述了疾病，其係受試者的病毒感染的結果。
如本文所用的術語“免疫病症”根據該術語的常見定義描述免疫病症，如自身免疫疾病、過敏症、免疫缺陷。
在一個實施方式中，本發明提供了治療或改善增殖性疾病、腫瘤性疾病、病毒性疾病或免疫病症之方法，包括向有需要的受試者給予本發明或根據本發明的製程產生的抗體構建體的步驟。
術語“有需要的受試者”或“需要治療”的那些術語包括已經患有該病症的那些受試者，以及要預防該病症的那些受試者。有需要的受試者或“患者”包括接受預防性或治療性處理的人和其他哺乳動物受試者。
本發明的抗體構建體通常以生物利用度和持久性的範圍等被設計用於特定的給予途徑和方法、特定的給予劑量和頻率、特定疾病的特定治療。組成物的材料較佳的是以給予部位可接受的濃度配製。
因此，可以根據本發明設計製劑和組成物用於藉由任何合適的給予途徑遞送。在本發明的上下文中，給予途徑包括但不限於 ● 局部途徑(如表皮、吸入、鼻腔、lyophilisa、耳(auricular/aural)、陰道、黏膜)； ● 腸內途徑(如口服、胃腸道、舌下，唇下、口腔、直腸)；以及 ● 腸胃外途徑(如靜脈內、動脈內、骨內、肌肉內、腦內、腦室內、硬膜外、鞘內、皮下、腹膜內、羊膜外、關節內、心內、真皮內、病灶內、子宮內、膀胱內、玻璃體內、透皮、鼻內、經黏膜、滑膜內、管腔內)。
本發明的藥物組成物和抗體構建體特別適用於腸胃外給藥，例如皮下或靜脈內遞送，例如藉由注射如彈丸注射或藉由輸注如連續輸注。可以使用醫療設備給予藥物組成物。用於給予藥物組成物的醫療設備的實例描述於美國專利案號4,475,196、4,439,196、4,447,224、4,447, 233、4,486,194、4,487,603、4,596,556、4,790,824、4,941,880、5,064,413、5,312,335、5,312,335、5,383,851和5,399,163。
特別地，本發明提供了合適組成物的不間斷給予。作為非限制性實例，不間斷或基本上不間斷的，即連續的給予可以藉由患者佩戴的用於計量流入患者體內的治療劑的小泵系統實現。包含本發明的抗體構建體的藥物組成物可以藉由使用所述泵系統給予。這種泵系統在本領域中通常是已知的，並且通常依賴於含有待輸注的治療劑的藥筒的定期更換。當在這種泵系統中更換藥筒時，治療劑不間斷流入患者體內可能會發生暫時中斷。在這種情況下，在更換藥筒之前的給予階段和更換藥筒之後的給予階段仍將被認為係在本發明的藥學手段和方法的含義內，其共同構成這種治療劑的一種“不間斷的給予”。
本發明的抗體構建體的可以藉由流體遞送設備或小泵系統來靜脈內或皮下連續或不間斷給予，所述流體遞送設備或小泵系統包括用於驅動流體離開儲器的流體驅動機構和用於驅使驅動機構的驅使機構。用於皮下給予的泵系統可包括用於穿透患者皮膚並將合適的組成物遞送到患者體內的針或套管。所述泵系統可以獨立於靜脈、動脈或血管直接固定或連接至患者的皮膚，從而允許泵系統與患者皮膚之間的直接接觸。泵系統可以連接至患者的皮膚上24小時至數天。泵系統可以是小尺寸的，其中儲器適用於小體積。作為非限制性實例，待給予的合適藥物組成物的儲器的體積可以為0.1至50 ml。
連續給予也可以藉由佩戴在皮膚上的貼劑進行透皮給予，並且每隔一段時間更換一次。熟悉該項技術者瞭解適用於該目的的用於藥物遞送的貼劑系統。值得注意的是，透皮給予尤其適用於不間斷的給予，因為第一次耗盡的貼劑的更換可以有利地與例如在緊鄰第一次耗盡的貼劑的皮膚表面上放置新的第二貼劑同時地且在去除第一次耗盡的貼劑之前立即完成。不會出現流量中斷或電池故障的問題。
如果藥物組成物已經凍乾，則凍乾材料首先在給予之前在合適的液體中重構。凍乾的材料可以在例如抑菌性注射用水(BWFI)、生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或蛋白質在凍乾之前所存在的相同製劑中重構。
本發明的組成物可以以合適的劑量給予受試者，所述合適的劑量可以例如藉由給予漸增劑量的本發明的抗體構建體(其顯示出對於非黑猩猩靈長類動物例如獼猴的跨物種特異性)的劑量遞增研究來確定。如上所述，顯示出本文所述的跨物種特異性的本發明的抗體構建體可有利地以相同形式用於非黑猩猩靈長類動物的臨床前試驗中以及作為藥物用於人類。劑量方案將由主治醫師和臨床因素確定。如在醫學領域中熟知的，任何一名患者的劑量取決於許多因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、待給予的特定化合物、性別、給予的時間和途徑、一般健康狀況以及同時給予的其他藥物。
術語“有效劑量”(“effective dose”或“effective dosage”)定義為足以達到或至少部分達到所需效果的量。術語“治療有效劑量”定義為足以在已經患有該疾病的患者中治療或至少部分地阻止疾病及其併發症的量。對此用途有效的量或劑量將取決於待治療的病況(適應症)、遞送的抗體構建體、治療背景和目標、疾病的嚴重程度、在先療法、患者的臨床病史和對治療劑的反應、給予的途徑、患者的體型(體重、體表或器官大小)和/或狀況(年齡和一般健康)以及患者自身免疫系統的一般狀態。可以根據主治醫師的判斷調整適當的劑量，使得其可以向患者一次給予或經一系列給藥進行給予，並且目的是獲得最佳治療效果。
根據上述因素，典型的劑量可以為約0.1 μg/kg至最高約30 mg/kg或更高。在特定的實施方式中，劑量可以為1.0 μg/kg至約20 mg/kg，視情況10 μg/kg至約10 mg/kg或100 μg/kg至約5 mg/kg。
治療有效量的本發明的抗體構建體較佳的是導致疾病症狀的嚴重程度降低、疾病無症狀期的頻率或持續時間增加或預防由於疾病痛苦引起的損傷或殘疾。對於治療表現靶細胞抗原的腫瘤，治療有效量的本發明的抗體構建體例如抗靶細胞抗原/抗CD3抗體構建體較佳的是將相對於未治療的患者抑制細胞生長或腫瘤生長至少約20%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。可以在預測功效的動物模型中評估化合物抑制腫瘤生長的能力。
藥物組成物可以作為唯一的治療劑給予，或者根據需要與其他療法如抗癌療法(例如其他蛋白質和非蛋白質藥物)一起給予。這些藥物可以與包含本文所定義的本發明的抗體構建體的組成物同時給予，或者在給予所述抗體構建體之前或之後分別以時間限定的間隔和劑量給予。
如本文所用的術語“有效和無毒劑量”係指耐受劑量的本發明抗體構建體，其足夠高以引起病理細胞耗竭、腫瘤消除、腫瘤縮小或疾病穩定而不具有或本質上不具有主要毒性作用。這樣的有效和無毒劑量可以例如藉由本領域描述的劑量遞增研究來確定，並且該有效和無毒劑量應低於誘導嚴重不良事件的劑量(劑量限制性毒性，DLT)。
如本文所用的術語“毒性”係指在不良事件或嚴重不良事件中表現的藥物的毒性作用。這些副作用可能是指給予後藥物通常缺乏耐受性和/或缺乏局部耐受性。毒性可能還包括由藥物引起的致畸或致癌作用。
本文所用的術語“安全性”、“體內安全性”或“耐受性”定義了在給予後沒有立即引起嚴重不良事件(局部耐受)和在較長的用藥期間不引起嚴重不良事件的情況下藥物的給予。可以例如在治療期間和隨訪期間定期評估“安全性”、“體內安全性”或“耐受性”。測量包括臨床評估(例如器官表現)和實驗室異常篩查。可以進行臨床評估，並根據NCI-CTC和/或MedDRA標準記錄/編碼與正常發現的偏差。器官表現可包括諸如過敏/免疫學、血液/骨髓、心律失常、凝血等標準，如例如在不良事件的通用術語標準v3.0(CTCAE)中所述。可以測試的實驗室參數包括例如血液學、臨床化學、凝血譜和尿液分析以及其他體液(如血清、血漿、淋巴或脊髓液、液體等)的檢查。因此可以評估安全性，例如藉由體檢、成像技術，即超音波、X射線、CT掃描、核磁共振成像(MRI)、採用技術設備的其他措施(即心電圖)、生命體征、藉由測量實驗室參數和記錄不良事件。例如，可以藉由組織病理學和/或組織化學方法檢查非黑猩猩靈長類動物在根據本發明的用途和方法中的不良事件。
上述術語也在例如Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6[生物技術產生的藥物S6的臨床前安全性評估]；ICH Harmonised Tripartite Guideline[ICH協調三方指南]；1997年7月16日舉行的ICH Steering Committee meeting[ICH指導委員會會議]中提及。
最後，本發明提供了包含本發明或根據本發明的方法產生的抗體構建體的套組、本發明的藥物組成物、本發明的多核苷酸、本發明的載體和/或本發明的宿主細胞。
在本發明的上下文中，術語“套組(kit)”意指一起包裝在容器、器皿等中的兩種或更多種組分，其中一種對應於本發明的抗體構建體、藥物組成物、載體或宿主細胞。因此，套組可以被描述為足以實現特定目標的一組產品和/或器具，其可以作為單個單元銷售。
該套組可以包含具有任何適當的形狀、大小和材料(較佳的是防水，例如塑膠或玻璃)的一個或多個器皿(例如小瓶、安瓿、容器、注射器、瓶子、袋子)，該一個或多個器皿含有合適的給予劑量(見上文)的本發明的抗體構建體或藥物組成物。套組可另外包含使用說明書(例如以單頁或安裝手冊的形式)、用於給予本發明的抗體構建體的裝置(如注射器、泵、輸注器等)、用於重構本發明的抗體構建體的裝置和/或用於稀釋本發明的抗體構建體的裝置。
本發明還提供了用於單劑量給予單元的套組。本發明的套組還可以含有包含乾燥/凍乾的抗體構建體的第一器皿和包含水性製劑的第二器皿。在本發明的某些實施方式中，提供了包含單室和多室預填充注射器(例如，液體注射器和凍乾注射器)的套組。
應注意，如在此使用的，單數形式“一/一種/個(a/an)”以及“該”包括複數個指示物，除非上下文中另外明確指明。因此，例如提及“試劑”包括一種或多種這樣的不同試劑，並且對“該方法”的提及包括提及熟悉該項技術者已知的可以修改或替代本文所述方法的等同步驟和方法。
除非另外指明，在一系列元素前面的術語“至少”應被理解為指系列中的每一個元素。使用不超過常規的實驗，熟悉該項技術者應認識到或能夠確認在此所述的本發明的具體實施方式的很多等效物。此類等效物旨在由本發明所涵蓋。
本文使用的術語“和/或”包括“和”、“或”和“由所述術語連接的元素的全部或任何其他組合”的含義。
如本文所用的術語“約”或“大約”意指給定值或範圍的20%內、較佳的是10%內以及更較佳的是5%內。然而，它還包括具體數位，例如約20包括20。
術語“小於”或“大於”包括具體數位。例如，小於20意指小於或等於。類似地，多於或大於分別意指多於或等於，或大於或等於。
貫穿本說明書及其後的申請專利範圍，除非上下文另有要求，否則詞語“包括(comprise)”以及變型諸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”應當被理解成係指包含一個提及的整體或步驟或者多個整體或步驟的組，但不排除任何其他整體或步驟或者多個整體或步驟的組。當在本文中使用時，術語“包含”可以用術語“含有”或“包括”替代，或者有時在本文中替換為術語“具有”。
當在本文中使用時，“由……組成”排除在申請專利範圍中未指定的任何元件、步驟或成分。當在本文中使用時，“基本上由……組成”包括不會實質上影響申請專利範圍的基本和新穎特徵的材料或步驟。
在本文的每個實例中，術語“包括”、“基本上由……組成”和“由……組成”中的人一個可以用其他兩個術語中的任一個替代。
應當理解，本發明不限於本文所述的特定方法、方案、材料、試劑和物質等，並因此可以變化。本文所使用的術語僅是出於描述具體實施方式的目的，而不旨在是限制本發明的範圍，本發明的範圍僅由申請專利範圍限定。
本說明書全文中引用的所有出版物和專利(包括所有專利、專利申請、科學出版物、製造商的說明書、說明書等)，無論是上文還是下文，均藉由引用以其全文併入本文。本文沒有任何內容應解釋為承認本發明無權由於先前發明而早於這些揭露內容。藉由引用併入的材料在一定程度上與本說明書發生衝突或不一致時，本說明書將替代任何此類材料。
藉由僅用於說明目的而提供的以下實例可以更好地理解本發明及其優點。這些實例並不旨在以任何方式限制本發明內容的範圍。
實例 1 ：用於生產 CD19 x CD3 BiTE® 抗體構建體的補料分批與連續生產模式的比較
CD19 x CD3 BiTE®抗體構建體補料分批製程(FB) 藉由解凍含有表現CD19 x CD3 BiTE®抗體構建體的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的小瓶來啟動FB製程。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於生產補料分批生物反應器(2 L或500 L規模)。 一旦將細胞以1.5 × 106 個細胞/mL的細胞密度接種至生產生物反應器中，在第2天、第5天、第7天、第9天、第11天和第13天向培養物中進料限定量的專有化學成分確知的加料培養基。培養物保持在pH 6.85、溶解氧64 mm Hg和36℃，其中在大約第7天溫度變為33.5℃。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滴度(HPLC分析)。生產15天後，經由離心和過濾進行收穫和澄清，以產生收穫的細胞培養液(HCCF)，將其加工用於蛋白質L捕獲層析法，並使用分析型陽離子交換層析法(CEX-HPLC)、肽圖譜和宿主細胞蛋白(HCP)ELISA來分析洗脫液的產品品質屬性和製程相關雜質。
CD19 x CD3 BiTE®抗體構建體連續製造製程(CM) 在開始CM製程之前，解凍含有表現CD19 x CD3 BiTE®抗體構建體的CHO細胞的小瓶。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於灌注生產生物反應器(10 L或50 L規模)。 一旦將細胞以0.7 × 106 個細胞/mL接種至生產生物反應器中，初始細胞生長階段持續12天，以將細胞密度和生物量增加至70 pF/cm的設定點(60-80 × 106 個細胞/mL)，如藉由電容探針(Hamilton Bonaduz AG，瑞士)所測量的。將生產生物反應器控制在pH 6.85、溶解氧64 mm Hg和36℃。在細胞生長階段的第4天，使用具有聚醚碸0.2-μm過濾器(通用電氣醫療集團，匹茲堡，賓夕法尼亞州)的交替切向流(ATF)過濾系統(改進技術公司(Refine Technologies)，漢諾威，新澤西州)和專有化學成分確知的灌注培養基在0.4個生物反應器體積/天(VVD)灌注速率下開始灌注培養。灌注速率逐漸增加，從第4天的0.4 VVD增加至第12天的2 VVD。一旦在第12天達到生物量設定點，將細胞培養溫度降至33.5℃，開始收集HCCF(即，含有CD19 x CD3 BiTE®抗體構建體的無細胞滲透物)，並且藉由以2 VVD灌注速率(穩態細胞特異性灌注速率CSPR為0.02-0.03 nL/細胞-天)進料並排出額外細胞以維持生物量設定點來繼續灌注培養另外28天。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滲透物滴度(HPLC分析)。在室溫下以24小時的增量收集HCCF，並加工用於蛋白質L捕獲層析法。在第26、27、34、40天來自蛋白質-L的洗脫液使用分析型陽離子交換層析法(CEX-HPLC)、肽圖譜和HCP ELISA分析產品品質屬性和與製程相關的雜質。 與CD19 x CD3 BiTE®抗體構建體FB製程相比，CD19 x CD3 BiTE®抗體構建體CM的細胞培養物性能(圖 2 ，表 4 )、產品品質屬性和與製程相關的雜質水平(表 4 )得到改善。CD19 x CD3 BiTE®抗體構建體上游CM製程顯示了更高的體積生產力、更少的化學和物理產物降解以及更低的製程相關雜質。表4中所示的歸一化值對應於所有絕對數的平均值除以FB中所有絕對數的平均值；對於FB，該歸一化值對應於1；對於CM，該歸一化值為對應於所描述的比率的一個數。
產品品質分析方法
用於電荷變體分析的陽離子交換高效液相層析法(CEX-HPLC) 使用Thermo Scientific™ ProPac WCX-10柱(4.0 × 250 mm，10 μm)和Agilent HPLC 1100系列進行弱陽離子交換(CEX)分離。使用配製緩衝液將蛋白質樣品稀釋至22.5 μg/mL，然後在加樣前用2-(N-𠰌啉代)乙磺酸(MES)緩衝液(pH 5.8)調節，並使用漸增的NaCl梯度在設定溫度30℃下分離。流動相A為pH 5.8下的20 mM MES，且流動相B為pH 5.8下的20 mM MES和1.0 M NaCl。在55 min內以0.5 mL/min的流速從7% B至54% B進行線性梯度。注入約1.5 μg的樣品，並用FL檢測(在280 nm處激發，在345 nm處發射)監測訊號。
用於化學修飾的胰蛋白酶消化肽圖譜 CD19 x CD3 BiTE®抗體構建體蛋白質樣品採用基於過濾器的方法使用Millipore Microcon 30K設備進行消化。將蛋白質樣品添加到過濾器上，離心去除樣品基質，然後在含有甲硫胺酸的6 M鹽酸胍(GuHCl)(賽默飛世爾科技公司，羅克福德，伊利諾州)緩衝液中變性，用500 mM二硫蘇糖醇(DTT)(Sigma-Aldrich公司，聖路易斯，密蘇里州)在37℃下還原30 min，並隨後藉由在室溫下黑暗中與500 mM碘乙酸(IAA)(Sigma-Aldrich公司，聖路易斯，密蘇里州)孵育20 min來進行烷基化。藉由添加DTT淬滅未反應的IAA。上述所有步驟均在過濾器上進行。隨後藉由離心將樣品緩衝更換為消化緩衝液(pH 7.8的含有甲硫胺酸的50 mM Tris)以去除任何殘留的DTT和IAA。胰蛋白酶消化使用1:20(w/w)的酶與蛋白質的比率在過濾器上37℃下進行1 hr。藉由離心收集消化混合物，然後藉由在pH 4.7的乙酸鹽緩衝液中加入8 M GuHCl淬滅。 使用直接與Thermo Scientific Q-Exactive質譜儀偶聯的Thermo U-3000超高效液相層析(UPLC)系統進行液相層析-質譜(LC-MS)分析。 使用Agilent Zorbax C18 RR HD柱(2.1×150 mm，1.8 μm)藉由反相分離蛋白質消化物，其中柱溫保持在50℃。流動相A由在水中的0.020%(v/v)甲酸(FA)組成，且流動相B為在乙腈(I)中的0.018%(v/v)FA。將約5 μg消化的CD19 x CD3 BiTE®抗體構建體注射至柱。使用梯度(經145 min從0.5%至36% B)在0.2 mL/min的流速下分離肽。藉由MS監測洗脫的肽。 對於肽鑒定和修飾分析，使用數據依賴性串聯MS(MS/MS)實驗。獲取在正離子模式下從200至2000 m/z的完整掃描，然後進行6個數據依賴性MS/MS掃描以鑒定肽的序列。定量基於使用以下等式的所選離子監測的質譜數據： 其中修飾%係修飾肽的水平，A修飾 係修飾肽的提取離子層析圖面積，A未修飾 係未修飾肽的提取離子層析圖面積。
宿主細胞蛋白(HCP)ELISA 將微量滴定板用兔抗HCP免疫球蛋白 G(IgG)(安進公司，內部抗體)包被。在洗滌並封閉板後，將測試樣品、對照和HCP校準標準品加入板中並孵育。從板上洗去未結合的蛋白質，並將合併的兔抗HCP IgG生物素(安進公司，內部抗體)加入板中並孵育。在又一次洗滌後，將Streptavidin™辣根過氧化物酶綴合物(HRP綴合物)(Amersham-GE，白金漢郡，英國)加入板中並孵育。最後一次洗滌板，並將顯色底物四甲基聯苯胺(TMB)(Kirkegaard and Perry Laboratories，蓋瑟斯堡，馬里蘭州)加入板中。用1 M磷酸抑制顯色，並用分光光度計測量光密度。 [表4]使用源自GS-KO宿主的相同CHO細胞系的CD19 x CD3 BiTE®抗體構建體CM製程與FB製程的比較。IVCD在本文中和在本發明的上下文中被理解為整合的活細胞密度。
實例 2 ： 用於生產 EGFRvIIIxCD3 BiTE® 抗體構建體的補料分批與連續生產模式的比較
EGFRvIIIxCD3 BiTE®抗體構建體補料分批製程(FB) 藉由解凍含有表現EGFRvIIIxCD3 BiTE®抗體構建體的CHO細胞的小瓶來啟動FB製程。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於生產補料分批生物反應器(2 L規模)。 一旦將細胞以1.0×106 個細胞/mL的細胞密度接種至生產生物反應器中，在第3天、第6天和第8天向培養物中進料限定量的專有化學成分確知的加料培養基。培養物保持在pH 6.9、溶解氧64 mm Hg和36℃恒定。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滴度(HPLC分析)。生產12天後，用固定化金屬親和層析法(IMAC)純化細胞培養上清液，並使用尺寸排阻層析法(SE-HPLC)分析洗脫液的產品品質屬性。
EGFRvIIIxCD3 BiTE®抗體構建體連續製造製程(CM) 藉由解凍含有表現EGFRvIIIxCD3 BiTE®抗體構建體的CHO細胞的小瓶來啟動CM製程。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於灌注生產生物反應器(2 L規模)。 一旦將細胞以5–10 × 106 個細胞/mL接種至生產生物反應器中，初始細胞生長階段持續約6天，以將細胞密度和生物量增加至80 pF/cm的設定點(60-80 × 106 個細胞/mL)，如藉由電容探針(Hamilton Bonaduz AG，瑞士)所測量的。將生產生物反應器控制在pH 6.9、溶解氧64 mm Hg和36℃。在細胞生長階段的大約第1天，使用具有聚醚碸0.2-μm過濾器(通用電氣醫療集團，匹茲堡，賓夕法尼亞州)的交替切向流(ATF)過濾系統(改進技術公司(Refine Technologies)，漢諾威，新澤西州)和專有化學成分確知的灌注培養基在每天0.5 VVD灌注速率下開始灌注培養。灌注速率逐漸增加，從第1天的0.5 VVD增加至第4天的2 VVD。一旦在大約第6天達到生物量設定點，開始收集HCCF(即，含有EGFRvIIIxCD3 BiTE®抗體構建體的無細胞滲透物)，並藉由以2 VVD 灌注速率(穩態CSPR為0.02-0.03 nL/細胞-天)進料並排出額外細胞以維持生物量設定點來繼續灌注培養另外29天。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滲透物滴度(HPLC分析)。使用固定化金屬親和層析法(IMAC)純化來自第5天、第10天、第15天、第20天、第25天、第30天和第35天的滲透物樣品，並使用尺寸排阻層析法(SE-HPLC)分析洗脫液的產品品質屬性。表5中所示的歸一化值對應於所有絕對數的平均值除以FB中所有絕對數的平均值；對於FB，該歸一化值對應於1；對於CM，該歸一化值為對應於所描述的比率的一個數。 與使用相同CHO細胞系的EGFRvIIIxCD3 BiTE®抗體構建體FB製程相比，EGFRvIIIxCD3 BiTE®抗體構建體CM製程的細胞培養性能(圖3，表5)和產品品質屬性(表5)得到改善。特別地，與FB製程相比，CM製程滲透物中的較低濃度與較低的高分子量(HMW)種類水平和較高的產品單體相關(圖4)。EGFRvIIIxCD3 BiTE®抗體構建體上游CM製程顯示了更高的體積生產力和更少的物理產物降解。
作為產品品質分析方法
尺寸排阻-高效液相層析法(SE-HPLC) SE-HPLC使用Waters BEH200尺寸排阻柱(4.6 x 150 mm, 1.7 µm)和Waters UHPLC 系統進行。將蛋白質樣品純淨地注射並使用含有NaCl鹽的磷酸鹽緩衝液在0.4 mL/min的流速下等度地分離(流動相為pH 6.8下的100 mM磷酸鈉、250 mM NaCl)，並藉由在280 nm處的UV吸光度監測洗脫液。載入約6 μg的樣品。 [表5].使用源自DHFR缺陷型宿主的相同CHO細胞系的EGFRvIIIxCD3 BiTE®抗體構建體CM製程與FB製程的比較
實例 3 ： 用於生產 TNF- α x TL1A 雙特異性抗體的補料分批與連續生產模式的比較
TNF-α x TL1A雙特異性抗體補料分批製程(FB) 藉由解凍含有表現TNF-α x TL1A雙特異性抗體(全長)的CHO細胞的小瓶來啟動FB製程。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於生產補料分批生物反應器(2 L規模)。 一旦將細胞以1.0×106 個細胞/mL的細胞密度接種至生產生物反應器中，在第3天、第6天和第8天向培養物中進料限定量的專有化學成分確知的加料培養基。培養物保持在pH 6.9、溶解氧64 mm Hg和36℃恒定。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滴度(HPLC分析)。生產12天後，經由離心和過濾進行收穫和澄清以產生收穫的細胞培養液(HCCF)，將其加工用於蛋白-A捕獲層析法，然後採用NaCl梯度洗脫進行強陽離子交換(CEX)層析步驟。使用還原毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉(RCE-SDS)、分析型陽離子交換層析法(CEX-HPLC)、肽圖譜和宿主細胞蛋白(HCP)ELISA分析CEX洗脫液的產品品質屬性和製程相關雜質。 TNF-α x TL1A雙特異性抗體連續製造製程(CM) 藉由解凍含有表現TNF-α x TL1A雙特異性抗體的CHO細胞的小瓶來啟動CM製程。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於灌注生產生物反應器(2 L規模)。 一旦將細胞以5 × 106 個細胞/mL接種至生產生物反應器中，初始細胞生長階段持續6天，以將細胞密度和生物量增加至80 pF/cm的設定點(60-80×106 個細胞/mL)，如藉由電容探針(Hamilton Bonaduz AG，瑞士)所測量的。將生產生物反應器控制在pH 6.9、溶解氧 64 mm Hg和36℃。在細胞生長階段的第1天，使用具有聚醚碸0.2-μm過濾器(通用電氣醫療集團，匹茲堡，賓夕法尼亞州)的交替切向流(ATF)過濾系統(改進技術公司(Refine Technologies)，漢諾威，新澤西州)和專有化學成分確知的灌注培養基在每天0.5 VVD灌注速率下開始灌注培養。灌注速率逐漸增加，從第1天的0.5 VVD增加至第6天的2 VVD。一旦在第6天達到生物量設定點，開始收集HCCF(即，含有TNF-α x TL1A雙特異性抗體的無細胞滲透物)，並且藉由以2 VVD灌注速率(穩態細胞CSPR為0.02-0.03 nL/細胞-天)進料並排出額外細胞以維持生物量設定點來繼續灌注培養另外28天。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滲透物滴度(HPLC分析)。從第8天至第10天以及從第29天至第31天收集HCCF，並加工用於蛋白質A捕獲層析法，然後採用NaCl梯度洗脫進行強陽離子交換(CEX)層析步驟。使用還原毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉(RCE-SDS)、分析型陽離子交換層析法(CEX-HPLC)、肽圖譜和宿主細胞蛋白(HCP)ELISA分析CEX洗脫液的產品品質屬性和製程相關雜質。表6中所示的歸一化值對應於所有絕對數的平均值除以FB中所有絕對數的平均值；對於FB，該歸一化值對應於1；對於CM，該歸一化值為對應於所描述的比率的一個數。 與TNF-α x TL1A雙特異性抗體FB製程相比，TNF-α x TL1A雙特異性抗體CM製程的細胞培養性能(圖 5 ，表 6 )、產品品質屬性和製程相關雜質(表 6 )得到改善。TNF-α x TL1A雙特異性抗體上游CM製程顯示了更高的體積生產力、更少的化學和物理產物降解以及更低的製程相關雜質。
產品品質分析方法
用於電荷變體分析的陽離子交換高效液相層析法(CEX-HPLC) 使用YMC-BioPro SP-F；100 x 4.6 mml.D；5 μm柱和Agilent HPLC 1100系列進行強陽離子交換(CEX)分離。在加樣之前使用流動相A將蛋白質樣品稀釋至3.0 mg/mL，並使用漸增的NaCl梯度在25℃的設定溫度下分離。流動相A係pH 6.9下的20 mM磷酸鈉，且流動相B係pH 6.9下的20 mM磷酸鈉和0.5 M NaCl。在10分鐘內以0.6 mL/min的流速從2% B至25% B進行線性梯度。注入約90 μg的樣品，並用280 nm處的UV檢測監測訊號。
還原毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉(RCE-SDS)
在Beckman Coulter ProteomeLab PA800 PLUS CE系統上進行還原CE-SDS。用水將蛋白質樣品稀釋至0.5 mg/mL，然後在Beckman SDS樣品緩衝液中用β-巰基乙醇(β-ME)在70℃下還原10 min(貝克曼庫爾特公司(Beckman Coulter)，貝瑞阿，加利福尼亞州)。將還原和變性的蛋白質樣品電動注射(5kV，持續20 sec)至裸熔融石英毛細管(50 μm ID × 30.0 cm有效長度)中，使用SDS凝膠緩衝液分離(在15kV下分離30 min)，並藉由光電二極體陣列檢測器使用220 nm處的UV獲得檢測。
胰蛋白酶消化肽圖譜 將TNF-α x TL1A雙特異性抗體蛋白樣品在水中稀釋至3 mg/mL的工作體積，然後在含有乙二胺四乙酸(EDTA)的4 M GuHCl緩衝液中變性，用500 mM DTT在37℃下還原30分鐘，然後藉由在室溫下在黑暗中與500 mM IAA孵育20分鐘進行烷基化。藉由添加DTT淬滅未反應的IAA。將樣品脫鹽並用藉由重力流的NAP-5柱(通用電氣醫療基團，英國)緩衝更換為消化緩衝液(pH 7.8的含有甲硫胺酸的50 mM Tris)。胰蛋白酶消化以1:10的比率進行，並在37℃下孵育35分鐘。使用10%甲酸淬滅消化。 液相層析-質譜(LC-MS)分析使用直接與Thermo-Scientific Q-Exactive以及質譜儀偶聯的配備有二元泵、柱加熱室、帶有溫控的自動注射器和自動進樣器的Waters Acquity系列進行。 使用Agilent Zorbax C18 RR HD柱(2.1 × 150 mm，1.8 um)藉由反相分離蛋白質消化物，其中柱溫保持在50℃。流動相A由在水中的0.1%甲酸組成，且流動相B為在乙腈(I)中的0.1%甲酸。使用梯度(經79分鐘從1%至36% B)在0.25 mL/min的流速下分離肽。藉由MS監測洗脫的肽。 對於肽鑒定和修飾分析，使用數據依賴性串聯MS(MS/MS)實驗。獲取在陽性模式下從200-2000 m/z的完整掃描，然後進行8個數據依賴性MS/MS掃描以鑒定肽的序列。定量基於使用以下等式的所選離子監測的質譜數據： 其中修飾%係修飾肽的水平，A修飾 係修飾肽的提取離子層析圖面積，A未修飾 係未修飾肽的提取離子層析圖面積。
宿主細胞蛋白(HCP)ELISA 將微量滴定板用兔抗HCP免疫球蛋白 G(IgG)(安進公司，內部抗體)包被。在洗滌並封閉板後，將測試樣品、對照和HCP校準標準品加入板中並孵育。從板上洗去未結合的蛋白質，並將合併的兔抗HCP IgG生物素(安進公司，內部抗體)加入板中並孵育。在又一次洗滌後，將Streptavidin™辣根過氧化物酶綴合物(HRP綴合物)(Amersham-GE，白金漢郡，英國)加入板中並孵育。最後一次洗滌板，並將顯色底物四甲基聯苯胺(TMB)(Kirkegaard and Perry Laboratories，蓋瑟斯堡，馬里蘭州)加入板中。用1 M磷酸抑制顯色，並用分光光度計測量光密度。 [表6].TNF-α x TL1A雙特異性抗體CM製程與使用源自DHFR缺陷型宿主的相同CHO細胞系的FB製程的比較
實例 4 ： 用於生產 CD33 x CD3 BiTE® 抗體構建體的補料分批與連續生產模式的比較 CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體補料分批製程(FB) 藉由解凍含有表現CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體的CHO細胞(殖株A)的小瓶來啟動FB製程。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於生產補料分批生物反應器(2 L規模)。 一旦將細胞以1.0×106 個細胞/mL的細胞密度接種至生產生物反應器中，在第3天、第6天、第8天和第10天向培養物中進料限定量的專有化學成分確知的加料培養基。培養物保持在pH 6.9、溶解氧64 mm Hg和36℃恒定。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滴度(HPLC分析)。生產12天後，用固定化金屬親和層析法(IMAC)純化細胞培養上清液，並使用尺寸排阻層析法(SE-HPLC)分析洗脫液的產品品質屬性。
CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體連續製造製程(CM) 藉由解凍含有表現CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體的CHO細胞的小瓶來啟動CM製程。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於灌注生產生物反應器(2 L規模)。 將細胞以1 × 106 個細胞/mL接種至生產生物反應器中，並且用如藉由電容探針(Hamilton Bonaduz AG，瑞士)測量的漸增的生物量設定點(表 7 )研究灌注培養的四個後續階段。將生產生物反應器控制在pH 6.9、溶解氧 64 mm Hg和36℃。在第3天，使用具有聚醚碸750 kDa過濾器(通用電氣醫療集團，匹茲堡，賓夕法尼亞州)的交替切向流(ATF)過濾系統(改進技術公司(Refine Technologies)，漢諾威，新澤西州)和專有化學成分確知的灌注培養基在每天1 VVD灌注速率下開始灌注培養。在灌注培養期間，灌注速率恒定維持在1 VVD，而生物量設定點逐漸增加以實現四種不同的CSPR(表 7 )。HCCF的收集在第4天開始(即，含有CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體的無細胞滲透物)，並且藉由以1 VVD灌注速率進料並排出額外細胞從而維持所述四種生物量組來繼續灌注培養至第25天。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滲透物滴度(HPLC分析)。用固定化金屬親和層析法(IMAC)純化每日滲透物樣品，並使用尺寸排阻層析法(SE-HPLC)分析洗脫液的產品品質屬性。 CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體CM製程的產品濃度低於CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體FB製程(圖 6 )。如在每日單體質量中測量的，CM中增加的VCD增加了產品濃度和體積生產力(表 8 )。然而，較低的產品濃度與較高的單體水平和較低的HMW相關(圖 7 和圖 8 )。相關性可在幾種BiTE產品中找到(圖 9 )。更進一步地，更高的細胞特異性灌注速率和相應的更低產品濃度與CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體聚集減少相關。為了隨著VCD的增加最大化單體和每日單體質量百分比，可以使用更高的灌注速率6.4 VVD和64.8 × 106 個細胞/mL的VCD(表 7 )。
產品品質分析方法 尺寸排阻-高效液相層析法(SE-HPLC) SE-HPLC使用Waters BEH200尺寸排阻柱(4.6 x 150 mm, 1.7 µm)和Waters UHPLC 系統進行。將蛋白質樣品純淨地注射並使用含有NaCl鹽的磷酸鹽緩衝液在0.4 mL/min的流速下等度地分離(流動相為pH 6.8下的100 mM磷酸鈉、250 mM NaCl)，並藉由在280 nm處的UV吸光度監測洗脫液。載入約6 μg的樣品。 [表7].使用源自GS-KO宿主的相同CHO細胞系的CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體FB和CM製程的製程條件 [表8].對於使用源自GS-KO宿主的相同CHO細胞系的FB和CM製程的CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體單體生產力計算。# 基於CM-A中相同產品單體和CM-D中相同的滴度的計算生產力除以6.4；N/A = 不適用
實例 5 ：用於生產 CD33 x CD3 BiTE® 抗體構建體的補料分批與連續生產模式的進一步比較 CD33 x CD3 BiTE抗體構建體補料分批製程(FB) 藉由解凍含有表現CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的小瓶來啟動FB製程(殖株B)。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於生產補料分批生物反應器(3 L規模)。 一旦將細胞以0.8×106 個細胞/mL的細胞密度接種至生產生物反應器中，在第3天、第6天和第8天向培養物中進料限定量的專有化學成分確知的加料培養基。將培養物保持在pH 6.9、溶解氧 48 mm Hg和36℃。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滴度(HPLC分析)。在生產結束時，進行收穫和澄清以產生收穫的細胞培養液(HCCF)，將其加工用於蛋白質L捕獲層析法，並使用尺寸排阻層析法(SE-HPLC)分析洗脫液的產品品質屬性。
CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體連續製造製程(CM) 藉由解凍含有表現CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體的CHO細胞的小瓶來啟動CM製程(殖株B)。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於灌注生產生物反應器(3 L規模)。 一旦將細胞以0.7 × 106 個細胞/mL接種至生產生物反應器中，初始細胞生長階段持續12天，以將細胞密度和生物量增加至70 pF/cm的設定點(70-90 × 106 個細胞/mL)，如藉由電容探針(Hamilton Bonaduz AG，瑞士)所測量的。將生產生物反應器控制在pH 6.85、溶解氧 64 mm Hg和36℃。在細胞生長階段的第4天，使用具有聚醚碸0.2-μm過濾器(通用電氣醫療集團，匹茲堡，賓夕法尼亞州)的交替切向流(ATF)過濾系統(改進技術公司(Refine Technologies)，漢諾威，新澤西州)和專有化學成分確知的灌注培養基在0.5個生物反應器體積/天(VVD)灌注速率下開始灌注培養。灌注速率逐漸增加，從第4天的0.5 VVD增加至第8天的1.8 VVD。一旦達到生物量設定點，將細胞培養溫度降至33.0℃，在第12天開始收集HCCF(即，含有CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體的無細胞滲透物)，並藉由以2 VVD灌注速率(穩態細胞特異性灌注速率CSPR為0.02-0.03 nL/細胞-天)進料並排出額外細胞以維持生物量設定點來繼續灌注培養另外30天。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滲透物滴度(HPLC分析)。在室溫下以24小時的增量收集HCCF，並加工用於蛋白質L捕獲層析法。使用尺寸排阻層析法(SE-HPLC)分析來自蛋白質L的洗脫液的產品品質屬性。表9中所示的歸一化值對應於所有絕對數的平均值除以FB中所有絕對數的平均值；對於FB，該歸一化值對應於1；對於CM，該歸一化值為對應於所描述的比率的一個數。
與CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體FB製程相比，CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體CM的細胞培養性能(圖 10 ，表 9 )和產品品質屬性水平(圖 11 ，表 9 )得到改善。CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體上游CM製程顯示了更高的體積生產力、更少的化學和物理產物降解。 產品品質分析方法 尺寸排阻-高效液相層析法(SE-HPLC) SE-HPLC使用Waters BEH200尺寸排阻柱(4.6 x 150 mm, 1.7 µm)和Waters UHPLC 系統進行。將蛋白質樣品純淨地注射並使用含有NaCl鹽的磷酸鹽緩衝液在0.4 mL/min的流速下等度地分離(流動相為pH 6.8下的100 mM磷酸鈉、250 mM NaCl)，並藉由在280 nm處的UV吸光度監測洗脫液。載入約6 μg的樣品。 [表9]使用源自GS-KO宿主的相同CHO細胞系(殖株B)的CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體CM製程與FB製程的比較。IVCD在本文中和在本發明的上下文中被理解為整合的活細胞密度。
實例 6 ：對於生產 CD33 x CD3 BiTE® 抗體構建體的傳統的 15 天補料分批與混合 10 天補料分批模式的比較 為了從CM製程中獲得較低的產品濃度和更好的產品品質，但最大限度地縮短培養時間，測試了混合補料分批製程。為此，將該製程從接種到第7天進行分批補料，然後使用交替切向流(ATF)過濾系統進行短期灌注培養以供收穫。以與CM製程類似的方式移取產品降低了產品濃度並提高了產品品質。 CD33 x CD3 BiTE®抗體構建傳統的15天補料分批製程(傳統FB) 藉由解凍含有表現CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的小瓶來啟動FB製程(殖株B)。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於生產補料分批生物反應器(3 L規模)。 一旦將細胞以0.8 × 106 個細胞/mL的細胞密度接種至生產生物反應器中，在第3天、第6天和第8天向培養物中進料限定量的專有化學成分確知的加料培養基。將培養物保持在pH 6.9、溶解氧 48 mm Hg和36℃。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滴度(HPLC分析)。在不同的生產持續時間(10天或15天)下，進行基於離心的收穫和澄清以產生收穫的細胞培養液(HCCF)，將其加工用於蛋白質L捕獲層析法並且使用尺寸排阻層析法(SE-HPLC)和陽離子交換層析法(CEX-HPLC)分析洗脫液中的產品品質屬性。
CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體混合10天補料分批製程(混合FB) 混合FB製程使用與傳統FB相同的放大和生產條件和採樣。對於第3天的1 VVD微濾混合FB製程(混合3D-1VVD)，在第3天和第6天向培養物中進料限定量的專有化學成分確知的加料培養基。在第7天，使用具有聚醚碸750 kDa的過濾器(通用電氣醫療集團，匹茲堡，賓夕法尼亞州)的交替切向流(ATF)過濾系統(改進技術公司(Refine Technologies)，新澤西漢諾威)向培養物中以1個容器體積/天(1 VVD)的灌注速率灌注專有化學成分確知的灌注培養基持續3天。將CD33 x CD3 BiTE抗體產品滲透藉由過濾器並在第7天至第10天收集為HCCF。將HCCF加工用於蛋白質L捕獲層析法，並使用尺寸排阻層析法(SE-HPLC)和陽離子交換層析法(CEX-HPLC)分析洗脫液的產品品質屬性。表10中所示的歸一化值對應於所有絕對數的平均值除以FB中所有絕對數的平均值；對於FB，該歸一化值對應於1；對於CM，該歸一化值為對應於所描述的比率的一個數。 與CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體傳統15天FB製程相比，CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體混合3D-1VVD製程的細胞培養性能(圖12，表10)和產品品質屬性水平(表10)得到改善。混合3D-1VVD 10天FB顯示出與傳統的15天FB製程相似的體積生產力，但前者持續時間更短、日體積生產力更高且產品品質更好(表10)。特別地，CD33 x CD3 BiTE抗體構建體混合3D-1VVD 10天FB製程顯示出更低的HCCF濃度、更少的產品聚集以及更少的化學和物理產物降解。
產品品質分析方法 尺寸排阻-高效液相層析法(SE-HPLC) SE-HPLC使用Waters BEH200尺寸排阻柱(4.6 x 150 mm, 1.7 µm)和Waters UHPLC 系統進行。將蛋白質樣品純淨地注射並使用含有NaCl鹽的磷酸鹽緩衝液在0.4 mL/min的流速下等度地分離(流動相為pH 6.8下的100 mM磷酸鈉、250 mM NaCl)，並藉由在280 nm處的UV吸光度監測洗脫液。載入約6 μg的樣品。 用於電荷變體分析的陽離子交換高效液相層析法(CEX-HPLC) 使用Waters Protein-Pak Hi Res CM 4.6×100 mm柱和Waters超高效液相層析(UHPLC)系統進行弱陽離子交換(CEX)分離。在加樣之前，用配製緩衝液10 mM磷酸鉀、8%蔗糖、0.01%(w/v)聚山梨醇酯80、1%(w/v)Captisol(pH 6.1 ± 0.04)預處理蛋白質樣品。在三個流動相(A、B和C)的多個梯度下，在設定溫度26℃、流速為0. mL/min下分離樣品。流動相A係pH 6.0下的50 mM磷酸鈉，流動相B係pH 8.0下的50 mM Tris-HCl、250mM氯化鈉，且流動相C係pH 8.0下的50 mM Tris-HCl、500 mM氯化鈉。注入約8.0 μg的樣品，並用FLD檢測(在280 nm處激發，在345 nm處發射)監測訊號。 [表10]使用CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體傳統的15天FB製程與源自GS-KO宿主的相同CHO細胞系(殖株B)的混合10天FB製程(混合3D-1VVD)的比較。IVCD在本文中和在本發明的上下文中被理解為整合的活細胞密度。
實例 7 ：用於生產 BCMA x CD3 BiTE(R)-HLE 的補料分批與連續生產模式的比較 BCMA X CD3 BITE(R)-HLE補料分批製程(FB) 藉由解凍含有表現BCMA x CD3 BiTE(R)-HLE的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的小瓶來啟動FB製程。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於生產補料分批生物反應器(2 L規模)。 一旦將細胞以1.0 × 106 個細胞/mL的細胞密度接種至生產生物反應器中，在第3天、第6天和第8天向培養物中進料限定量的專有化學成分確知的加料培養基。培養物保持在pH 6.9、溶解氧64 mm Hg和36℃，其中在大約第6天溫度變為34℃。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滴度(HPLC分析)。生產12天後，經由離心和過濾進行收穫和澄清，以產生收穫的細胞培養液(HCCF)，將其加工用於蛋白-A捕獲層析法，並使用分析型陽離子交換層析法(CEX-HPLC)、肽圖譜、還原毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉、還原宿主細胞蛋白(HCP)ELISA和DNA(qPCR)來分析洗脫液的產品品質屬性和製程相關雜質。
BCMA X CD3 BITE(R)-HLE連續製造製程(CM) 藉由解凍含有表現BCMA x CD3 BiTE(R)-HLE的CHO細胞的小瓶來啟動CM製程。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於灌注生產生物反應器(10 L或50 L規模)。 一旦將細胞以0.7 × 106 個細胞/mL接種至生產生物反應器中，初始細胞生長階段持續12天，以將細胞密度和生物量增加至70 pF/cm的設定點(40-60×106 個細胞/mL)，如藉由電容探針(Hamilton Bonaduz AG，瑞士)所測量的。將生產生物反應器控制在pH 6.9、溶解氧 64 mm Hg和36℃。在細胞生長階段的第4天，使用具有聚醚碸0.2-μm過濾器(通用電氣醫療集團，匹茲堡，賓夕法尼亞州)的交替切向流(ATF)過濾系統(改進技術公司(Refine Technologies)，新澤西漢諾威)和專有化學成分確知的灌注培養基在0.4個生物反應器體積/天(VVD)灌注速率下開始灌注培養。灌注速率逐漸增加，從第4天的0.4 VVD增加至第12天的2 VVD。一旦在第12天達到生物量設定點，將細胞培養溫度降至34℃，開始收集HCCF(即，含有BCMA X CD3 BITE(R)-HLE的無細胞滲透物)，並且藉由以2 VVD灌注速率(穩態細胞特異性灌注速率CSPR為0.03-0.05 nL/細胞-天)進料並排出額外細胞以維持生物量設定點來繼續灌注培養另外28天。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滲透物滴度(HPLC分析)。在室溫下以24小時的增量收集HCCF，並加工用於蛋白質A捕獲層析法。使用分析型陽離子交換層析法(CEX-HPLC)、肽圖譜、還原毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉、還原宿主細胞蛋白(HCP)ELISA和DNA(qPCR)，分析第19天和第40天(穩態第7天和第28天)來自蛋白質A的洗脫液的產品品質屬性和製程相關雜質。 與BCMA X CD3 BITE(R)-HLE FB製程相比，BCMA X CD3 BITE(R)-HLE CM的細胞培養物性能(圖 13 ，表 11 )、產品品質屬性和與製程相關的雜質水平(表 11 )得到改善。BCMA X CD3 BITE(R)-HLE上游CM製程顯示了更高的體積生產力、更少的化學和物理產物降解以及更低的製程相關雜質。表11中所示的歸一化值對應於所有絕對數的平均值除以FB中所有絕對數的平均值；對於FB，該歸一化值對應於1；對於CM，該歸一化值為對應於所描述的比率的一個數。
產品品質分析方法 用於電荷變體分析的陽離子交換高效液相層析法(CEX-HPLC) 使用Thermo Scientific™ ProPac WCX-10柱(4.0 × 250 mm，10 μm)和Agilent HPLC 1100系列進行弱陽離子交換(CEX)分離。使用流動相A將蛋白質樣品稀釋至500 µg/mL，並使用漸增的NaCl梯度在30℃的設定溫度下進行分離。流動相A係pH 6.0下的50 mM磷酸鈉，且流動相B係pH 6.0下的50 mM磷酸鈉、500 mM NaCl。在50 min內以0.5 mL/min的流速從10% B至40% B進行線性梯度。注入約50 μg的樣品，並藉由可變波長檢測器用220 nm處的UV檢測監測訊號。
用於化學修飾的胰蛋白酶/彈性蛋白酶肽圖譜 蛋白質樣品採用基於過濾器的方法使用Millipore Microcon 30K設備進行消化。將蛋白質樣品添加到過濾器上，離心去除樣品基質，然後在含有甲硫胺酸的6 M鹽酸胍(GuHCl)(賽默飛世爾科技公司；羅克福德，伊利諾州)緩衝液中變性，用37.5 mM二硫蘇糖醇(DTT)(Sigma-Aldrich公司；聖路易斯，密蘇里州)在37℃下還原30 min，並隨後藉由在室溫下黑暗中與87.5 mM碘乙酸(IAA)(Sigma-Aldrich公司；聖路易斯，密蘇里州)孵育20 min來進行烷基化。藉由添加DTT淬滅未反應的IAA。上述所有步驟均在過濾器上進行。隨後藉由離心將樣品緩衝更換為消化緩衝液(pH 7.8的含有甲硫胺酸的50 mM Tris)以去除任何殘留的DTT和IAA。胰蛋白酶消化使用1 : 20(w/w)的酶與蛋白質的比率在過濾器上37℃下進行1 hr。藉由離心收集小的胰蛋白酶消化物，並在過濾器上在37℃下使用酶與蛋白質比率1 : 20(w/w)進行彈性蛋白酶消化30 min。藉由離心收集消化混合物，然後藉由在pH 4.7的250 mM乙酸鹽緩衝液中加入8 M GuHCl淬滅。 使用直接與Thermo Scientific Q-Exactive 質譜儀偶聯的Agilent 1260 Infinity II高效液相層析(HPLC)系統進行液相層析-質譜(LC-MS)分析。 使用Water Acquity UPLC肽BEH C18柱(2.1×150 mm，1.7 μm)藉由反相分離蛋白質消化物，其中柱溫保持在50℃。流動相A由在水中的0.10%(v/v)甲酸(FA)組成，且流動相B為在乙腈(ACN)中的0.1%(v/v)FA。將約6.25 μg消化的蛋白質注射至柱。使用梯度(經78 min從1%至36% B)在0.25 mL/min的流速下分離肽。藉由MS監測洗脫的肽。 對於肽鑒定和修飾分析，使用數據依賴性串聯MS(MS/MS)實驗。獲取在正離子模式下從200至2000 m/z的完整掃描，然後進行5個數據依賴性MS/MS掃描以鑒定肽的序列。定量基於使用以下等式的所選離子監測的質譜數據： 等式1. 其中修飾%係修飾肽的水平，A 修飾 係修飾肽的提取離子層析圖面積，A 未修飾 係未修飾肽的提取離子層析圖面積。
還原毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉(還原CE-SDS) 在Beckman Coulter ProteomeLab PA800 PLUS CE系統上進行還原CE-SDS。用水將蛋白質樣品稀釋至0.5 mg/mL，然後在Beckman SDS樣品緩衝液中用β-巰基乙醇(β-ME)在70℃下還原10 min(貝克曼庫爾特公司(Beckman Coulter)，貝瑞阿，加利福尼亞州)。將還原和變性的蛋白質樣品電動注射(5kV，持續20 sec)至裸熔融石英毛細管(50 μm ID×30.0 cm有效長度)中，使用SDS凝膠緩衝液分離(在15kV下分離40 min)，並藉由光電二極體陣列檢測器使用220 nm處的UV獲得檢測。 宿主細胞蛋白(HCP)ELISA 將微量滴定板用兔抗HCP免疫球蛋白 G(IgG)(安進公司，內部抗體)包被。在洗滌並封閉板後，將測試樣品、對照和HCP校準標準品加入板中並孵育。從板上洗去未結合的蛋白質，並將合併的兔抗HCP IgG生物素(安進公司，內部抗體)加入板中並孵育。在又一次洗滌後，將Streptavidin™辣根過氧化物酶綴合物(HRP綴合物)(Amersham-GE；白金漢郡，英國)加入板中並孵育。最後一次洗滌板，並將顯色底物四甲基聯苯胺(TMB)(Kirkegaard and Perry Laboratories；蓋瑟斯堡，馬里蘭州)加入板中。用1 M磷酸抑制顯色，並用分光光度計測量光密度。
DNA方法(qPCR) 藉由用蛋白酶K消化，然後進行DNA提取和異丙基醇沈澱來製備樣品。設計引物以擴增CHO細胞特異性重複DNA序列(稱為Rep A)，並設計特異性探針以在它們之間退火。探針在其5'端用螢光報告染料FAM(6-羧基螢光素)標記，在其3'端用淬滅染料TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明)標記。當退火的探針完整時，報告染料的螢光藉由淬滅染料的接近而淬滅。在每個PCR循環的延伸階段期間，Taq DNA聚合酶切割退火的探針，以從探針釋放報告染料，從而導致螢光增加。螢光的這種增加與反應中存在的擴增的靶DNA的量成正比，並且在整個PCR反應中藉由即時PCR儀器連續監測。在擴增的指數期內，產品序列的量與DNA的起始量成正比。將從CHO細胞分離的已知量的基因組DNA的標準曲線用於將螢光水平與原始樣品中的基因組DNA濃度相關聯。 [表11] 使用源自DHFR缺陷型宿主的相同CHO細胞系的BCMA x CD3 BiTE(R)-HLE CM製程與FB製程的比較
實例 8 ：用於生產 DLL3 x CD3 BiTE(R)-HLE 的補料分批與連續生產模式的比較 DLL3 X CD3 BITE(R)-HLE補料分批製程(FB) 藉由解凍含有表現DLL3 x CD3 BiTE(R)-HLE的CHO細胞的小瓶來啟動FB製程。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於生產補料分批生物反應器(2 L規模)。 一旦將細胞以1.0 × 106 個細胞/mL的細胞密度接種至生產生物反應器中，在第3天、第6天和第8天向培養物中進料限定量的專有化學成分確知的加料培養基。培養物保持在pH 6.9、溶解氧64 mm Hg和36℃恒定。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滴度(HPLC分析)。生產12天後，用蛋白質A層析法純化細胞培養上清液，並使用尺寸排阻層析法(SE-HPLC)分析洗脫液的產品品質屬性。
DLL3 X CD3 BITE(R)-HLE連續製造製程(CM) 藉由解凍含有表現DLL3 x CD3 BiTE(R)-HLE的CHO細胞的小瓶來啟動CM製程。在放大期間，將細胞以目標活細胞密度(VCD)重懸於新鮮的選擇生長培養基中。在搖瓶或生物反應器中連續擴大培養物體積以生成足夠的細胞質量，以最終接種於灌注生產生物反應器(2 L規模)。 一旦將細胞以1.5 106 個細胞/mL接種至生產生物反應器中，初始細胞生長階段持續約10天，以將細胞密度和生物量增加至70 pF/cm的設定點(40-60×106 個細胞/mL)，如藉由電容探針(Hamilton Bonaduz AG，瑞士)所測量的。將生產生物反應器控制在pH 6.9、溶解氧64 mm Hg和36℃。在細胞生長階段的大約第3天，使用具有聚醚碸0.2-μm過濾器(通用電氣醫療集團，匹茲堡，賓夕法尼亞州)的交替切向流(ATF)過濾系統(改進技術公司(Refine Technologies)，漢諾威，新澤西州)和專有化學成分確知的灌注培養基在每天0.5 VVD灌注速率下開始灌注培養。灌注速率逐漸增加，從第3天的0.5 VVD增加至第10天的2 VVD。一旦在大約第10天達到生物量設定點，開始收集HCCF(即，含有DLL3 x CD3 BiTE(R)-HLE的無細胞滲透物)，並且藉由以2 VVD灌注速率(穩態細胞CSPR為0.03-0.05 nL/細胞-天)進料並排出額外細胞以維持生物量設定點來繼續灌注培養另外13天。在整個培養持續時間內測量細胞密度(CDV，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)、代謝物(NovaFlex，諾瓦生物醫學公司，沃爾瑟姆，麻塞諸塞州)和滲透物滴度(HPLC分析)。使用蛋白質A層析法純化來自第10天至第23天的滲透物樣品，並使用尺寸排阻層析法(SE-HPLC)分析洗脫液的產品品質屬性。
與使用相同的CHO細胞系的DLL3 X CD3 BITE(R)-HLE FB製程相比，DLL3 X CD3 BITE(R)-HLE CM製程的細胞培養性能(圖 14 ，表 12 )和產品品質屬性(表 12 )得到改善。表12中所示的歸一化值對應於所有絕對數的平均值除以FB中所有絕對數的平均值；對於FB，該歸一化值對應於1；對於CM，該歸一化值為對應於所描述的比率的一個數。DLL3 X CD3 BITE(R)-HLE上游CM製程顯示了更高的體積生產力和更少的物理產物降解或聚集。對於DLL3 X CD3 BITE(R)-HLE CM和其他BiTE® CM製程，ATF過濾收穫製程本身有利於生產與保留在生物反應器中的細胞培養液相比具有較低濃度和較低HMW種類的滲透物HCCF(圖 15 )。
產品品質分析方法 尺寸排阻-高效液相層析法(SE-HPLC) SE-HPLC使用Waters BEH200尺寸排阻柱(4.6 x 150 mm, 1.7 µm)和Waters UHPLC 系統進行。將蛋白質樣品純淨地注射並使用含有NaCl鹽的磷酸鹽緩衝液在0.4 mL/min的流速下等度地分離(流動相為pH 6.8下的100 mM磷酸鈉、250 mM NaCl)，並藉由在220 nm處的UV吸光度監測洗脫液。載入約10 μg的樣品。 還原毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉(還原CE-SDS) 在Beckman Coulter ProteomeLab PA800 PLUS CE系統上進行還原CE-SDS。用配製緩衝液將蛋白質樣品稀釋至1.0 mg/mL，然後在Beckman SDS樣品緩衝液中用β-巰基乙醇(β-ME)在70℃下還原10 min(貝克曼庫爾特公司(Beckman Coulter)，貝瑞阿，加利福尼亞州)，以達到最終濃度0.48 mg/mL。將還原和變性的蛋白質樣品電動注射(10 kV，持續30 sec)至裸熔融石英毛細管(50 μm ID × 20.0 cm有效長度)中，使用SDS凝膠緩衝液分離(在15 kV下分離40 min)，並藉由光電二極體陣列檢測器使用220 nm處的UV獲得檢測。 [表12].使用源自DHFR缺陷型宿主的相同CHO細胞系的DLL3 x CD3 BiTE(R)-HLE CM製程與FB製程的比較 [表13].序列表
[圖1]示出了一種根據本發明的連續製造製程之設置。該設置包含灌注培養基，其以受控制的灌注流速(灌注速率)泵入生物反應器中。其中控制含氧量(DO)、溫度、pH、生物量(電容)和液位(水平)。過量細胞可以作為細胞排出而分離。收穫的細胞培養液(HCCF)藉由使流體藉由細胞截留設備從生物反應器中分離而獲得，該細胞截留設備可以包含0.2 μm過濾器。較佳的是，無細胞HCCF可以在被傳遞至進一步的下游加工之前收集在儲存容器中。
[圖2]分別示出了隨培養時間變化的活細胞密度(VCD)(10^5個細胞/mL)(A)，隨培養時間變化的培養細胞系的細胞的活力百分比(B)，以及隨關於CD19XCD3 BITE(R) 抗體構建體的補料分批(“+”)和連續製造(空心圓)的培養時間變化的產品濃度(mg/L)(C)。對應地，實線表示CM值的平均值，點劃線表示補料分批值的平均值。源自GS-KO宿主的相同CHO細胞系用於兩種製程形式。
[圖3]分別示出了隨培養時間變化的活細胞密度(VCD)(10^5個細胞/mL)(A)，隨培養時間變化的培養細胞系的細胞的活力百分比(B)，以及隨關於EGFRvIIIxCD3 BiTE(R) 抗體構建體的補料分批(“+”)和連續製造(空心圓)的培養時間變化的產品濃度(mg/L)(C)。對應地，實線表示CM值的平均值，點劃線表示補料分批值的平均值。源自DHFR缺陷型宿主的相同CHO細胞系用於兩種製程形式。
[圖4]示出了CM滲透物(空心圓)和FB上清液(“+”)樣品中的EGFRvIIIxCD3 BiTE(R) 抗體構建體產品單體(%)。對應地，實線表示CM值的平均值，點劃線表示補料分批值的平均值。
[圖5]分別示出了隨培養時間變化的活細胞密度(VCD)(10^5個細胞/mL)(A)，隨培養時間變化的培養細胞系的細胞的活力百分比(B)，以及隨關於TNF-α x TL1A雙特異性抗體的補料分批(“+”)和連續製造(空心圓)的培養時間變化的產品濃度(mg/L)(C)。對應地，實線表示CM值的平均值，點劃線表示補料分批值的平均值。源自DHFR缺陷型宿主的相同CHO細胞系用於兩種製程形式。
[圖6]分別示出了隨培養時間變化的活細胞密度(VCD)(10^5個細胞/mL)(A)，隨培養時間變化的培養細胞系的細胞的活力百分比(B)，以及隨關於CD33 x CD3 BiTE(R) 抗體構建體的補料分批(空心三角)和連續製造(CM-A: ™; CM-B: Ç, CM-C: ¯ ; CM-D: Í)的培養時間變化的產品濃度(mg/L)(C)。連續製造下的VCD設定點分別為12.8*10^5(CM-A)、32.0*10^5(CM-B)、49.2*10^5(CM-C)和64.8*10^5(CM-D)個細胞點，以達到四種不同的產品濃度。每個製程的平均值分別用實線、虛線或點劃線表示。源自GS-KO宿主的相同CHO細胞系(殖株A)用於兩種製程形式。
[圖7]示出了隨CM滲透物和FB上清液樣品中產品濃度變化的CD33 x CD3 BiTE(R) 抗體構建體的產品單體(%)。CM製程包括四種不同的生物量設定點(CM-A: ™; CM-B: Ç, CM-C: ¯ ; CM-D: Í)以達到四種不同的產品濃度。
[圖8]示出了藉由補料分批(FB)或藉由分別採用12.8*10^5(CM-A)、32.0*10^5(CM-B)、49.2*10^5(CM-C)和64.8*10^5(CM-D)個細胞的VCD設定點以達到四種不同的濃度的連續製造(CM-x)產生的CD33 x CD3 BiTE(R)抗體構建體(殖株A)的高分子量級分百分比(A)、低分子量級分百分比(B)和主峰級分百分比(C)。源自GS-KO宿主的相同CHO細胞系(殖株A)用於兩種製程形式。
[圖9]示出了對於五種雙特異性抗體產品：CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體、CD19xCD3 HLE BiTE®抗體構建體、EGFRvIIIxCD3 BiTE®抗體構建體、CD19xCD3 HLE BiTE®抗體構建體和DLL3xCD3 BiTE®抗體構建體，增加的高分子量(HMW，%)與增加的產品濃度之間的相關性。
[圖10]示出了CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體(CHO細胞系殖株B)FB和CM製程的比較。(A) 隨培養時間變化的活細胞密度；(B) 隨培養時間變化的活力；(C) 隨培養時間變化的產品濃度。
[圖11]示出了FB和CM製程中CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體(殖株B)SEC高分子量(HMW)和低分子量(LMW)的比較。
[圖12]示出了CD33 x CD3 BiTE®抗體構建體(殖株B)混合-3D-1VVD 10天和傳統FB製程的比較。(A) 隨培養時間變化的活細胞密度；(B) 隨培養時間變化的活力。
[圖13]示出了BCMA x CD3 BiTE®-HLE抗體構建體FB和CM製程的比較。(A) 隨培養時間變化的活細胞密度；(B) 隨培養時間變化的活力；(C) 隨培養時間變化的產品濃度。
[圖14]示出了DLL3 x CD3 BiTE®-HLE FB和CM製程的比較。(A) 隨培養時間變化的活細胞密度；(B) 隨培養時間變化的活力；(C) 隨培養時間變化的產品濃度。
[圖15]示出了來自歷經細胞培養持續時間(天)的三種BiTE®抗體構建體的CM製程的滲透物HCCF和生物反應器上清液樣品(來自細胞培養液)中的產品濃度和SEC HMW水平的比較。從生物反應器上清液(○空心圓)或從過濾器滲透物HCCF(●實心圓)中採集樣品。
<110> 美商安進公司(Amgen Inc.)
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<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD19 VL CDR1
<400> 1
Figure 107144618-A0305-02-0183-1
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD19 VL CDR2
<400> 2
Figure 107144618-A0305-02-0183-2
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD19 VL CDR3
<400> 3
Figure 107144618-A0305-02-0184-3
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD19 VH CDR1
<400> 4
Figure 107144618-A0305-02-0184-4
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD19 VH CDR2
<400> 5
Figure 107144618-A0305-02-0184-5
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD19 VH CDR3
<400> 6
Figure 107144618-A0305-02-0184-6
<210> 7
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD19 VL
<400> 7
Figure 107144618-A0305-02-0185-7
<210> 8
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD19 VH
<400> 8
Figure 107144618-A0305-02-0185-8
Figure 107144618-A0305-02-0186-9
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD3 VH CDR1
<400> 9
Figure 107144618-A0305-02-0186-10
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD3 VH CDR2
<400> 10
Figure 107144618-A0305-02-0186-11
<210> 11
<211> 10
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD3 VH CDR3
<400> 11
Figure 107144618-A0305-02-0187-12
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD3 VL CDR1
<400> 12
Figure 107144618-A0305-02-0187-13
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD3 VL CDR2
<400> 13
Figure 107144618-A0305-02-0187-14
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD3 VL CDR3
<400> 14
Figure 107144618-A0305-02-0188-15
<210> 15
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD3 VH
<400> 15
Figure 107144618-A0305-02-0188-16
<210> 16
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD3 VL
<400> 16
Figure 107144618-A0305-02-0189-17
<210> 17
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD19xCD3 scFv BLINCYTO包括接頭和his標記
<400> 17
Figure 107144618-A0305-02-0189-18
Figure 107144618-A0305-02-0190-19
Figure 107144618-A0305-02-0191-20
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> I2C的CDR-L1
<400> 18
Figure 107144618-A0305-02-0191-21
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> I2C的CDR-L2
<400> 19
Figure 107144618-A0305-02-0192-22
<210> 20
<211> 9
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> I2C的CDR-L3
<400> 20
Figure 107144618-A0305-02-0192-23
<210> 21
<211> 5
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> I2C的CDR-H1
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Figure 107144618-A0305-02-0192-24
<210> 22
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> I2C的CDR-H2
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Figure 107144618-A0305-02-0192-25
<210> 23
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> I2C的CDR-H3
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Figure 107144618-A0305-02-0193-26
<210> 24
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> I2C的VH
<400> 24
Figure 107144618-A0305-02-0193-27
<210> 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> I2C的VL
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<210> 26
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> I2C的VH-VL
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<210> 27
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> E11的CD33 ccVH
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<210> 28
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> E11的CD33 VH
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Figure 107144618-A0305-02-0196-32
Figure 107144618-A0305-02-0197-33
<210> 29
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> E11的CD33 HCDR1
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> E11的CD33 HCDR2
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> E11的CD33 HCDR3
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<210> 32
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> E11的CD33 CC VL
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Figure 107144618-A0305-02-0198-37
<210> 33
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> E11的CD33 VL
<400> 33
Figure 107144618-A0305-02-0199-38
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> E11的CD33 LCDR1
<400> 34
Figure 107144618-A0305-02-0199-39
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> E11的CD33 LCDR2
<400> 35
Figure 107144618-A0305-02-0200-40
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> E11的CD33 LCDR3
<400> 36
Figure 107144618-A0305-02-0200-41
<210> 37
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> E11的CD33 HL CC
<400> 37
Figure 107144618-A0305-02-0200-42
Figure 107144618-A0305-02-0201-43
<210> 38
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> E11的CD33 HL
<400> 38
Figure 107144618-A0305-02-0201-44
Figure 107144618-A0305-02-0202-45
<210> 39
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD33 CC E11 HL x I2C HL雙特異性分子
<400> 39
Figure 107144618-A0305-02-0203-46
Figure 107144618-A0305-02-0204-47
<210> 40
<211> 511
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD33 E11 HL x I2C HL
<400> 40
Figure 107144618-A0305-02-0205-48
Figure 107144618-A0305-02-0206-49
Figure 107144618-A0305-02-0207-50
<210> 41
<211> 993
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD33 CC x I2C-scFc雙特異性HLE分子
<400> 41
Figure 107144618-A0305-02-0207-51
Figure 107144618-A0305-02-0208-52
Figure 107144618-A0305-02-0209-53
Figure 107144618-A0305-02-0210-54
Figure 107144618-A0305-02-0211-55
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> EGFRvIIIxCD3-scFc VH CDR1
<400> 42
Figure 107144618-A0305-02-0211-56
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> EGFRvIIIxCD3-scFc VH CDR2
<400> 43
Figure 107144618-A0305-02-0211-57
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> EGFRvIIIxCD3-scFc VH CDR3
<400> 44
Figure 107144618-A0305-02-0211-58
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> EGFRvIIIxCD3-scFc VL CDR1
<400> 45
Figure 107144618-A0305-02-0212-59
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> EGFRvIIIxCD3-scFc VL CDR2
<400> 46
Figure 107144618-A0305-02-0212-60
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> EGFRvIIIxCD3-scFc VL CDR3
<400> 47
Figure 107144618-A0305-02-0212-61
<210> 48
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> EGFRvIII_CCxCD3-scFc VH
<400> 48
Figure 107144618-A0305-02-0213-62
<210> 49
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> EGFRvIII_CCxCD3-scFc VL
<400> 49
Figure 107144618-A0305-02-0213-63
Figure 107144618-A0305-02-0214-64
<210> 50
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> EGFRvIII_CCxCD3-scFc scFv
<400> 50
Figure 107144618-A0305-02-0214-65
Figure 107144618-A0305-02-0215-66
<210> 51
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> EGFRvIII_CCxCD3-scFc雙特異性分子
<400> 51
Figure 107144618-A0305-02-0215-67
Figure 107144618-A0305-02-0216-68
Figure 107144618-A0305-02-0217-69
<210> 52
<211> 994
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> EGFRvIII_CCxCD3-scFc雙特異性HLE分子
<400> 52
Figure 107144618-A0305-02-0217-70
Figure 107144618-A0305-02-0218-71
Figure 107144618-A0305-02-0219-72
Figure 107144618-A0305-02-0220-73
Figure 107144618-A0305-02-0221-74
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> MSLN_5 VH CDR1
<400> 53
Figure 107144618-A0305-02-0221-75
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> MSLN_5 VH CDR2
<400> 54
Figure 107144618-A0305-02-0222-76
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> MSLN_5 VH CDR3
<400> 55
Figure 107144618-A0305-02-0222-77
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> MSLN_5 VL CDR1
<400> 56
Figure 107144618-A0305-02-0222-78
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> MSLN_5 VL CDR2
<400> 57
Figure 107144618-A0305-02-0222-79
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> MSLN_5 VL CDR3
<400> 58
Figure 107144618-A0305-02-0223-80
<210> 59
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> MSLN _5 VH
<400> 59
Figure 107144618-A0305-02-0223-81
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> MSLN_5 VL
<400> 60
Figure 107144618-A0305-02-0224-82
<210> 61
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> MSLN_5 scFv
<400> 61
Figure 107144618-A0305-02-0224-83
Figure 107144618-A0305-02-0225-84
<210> 62
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> MSLN_5xI2C0雙特異性分子
<400> 62
Figure 107144618-A0305-02-0225-85
Figure 107144618-A0305-02-0226-86
Figure 107144618-A0305-02-0227-87
<210> 63
<211> 982
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> MSLN_5xCD3-scFc雙特異性HLE分子
<400> 63
Figure 107144618-A0305-02-0228-88
Figure 107144618-A0305-02-0229-89
Figure 107144618-A0305-02-0230-90
Figure 107144618-A0305-02-0231-91
<210> 64
<211> 982
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> MSLN_5_CCxCD3-scFc雙特異性HLE分子
<400> 64
Figure 107144618-A0305-02-0231-92
Figure 107144618-A0305-02-0232-93
Figure 107144618-A0305-02-0233-94
Figure 107144618-A0305-02-0234-95
Figure 107144618-A0305-02-0235-96
<210> 65
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007的CDR-H1
<400> 65
Figure 107144618-A0305-02-0235-97
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007的CDR-H2
<400> 66
Figure 107144618-A0305-02-0236-98
<210> 67
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007的CDR-H3
<400> 67
Figure 107144618-A0305-02-0236-99
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007的CDR-L1
<400> 68
Figure 107144618-A0305-02-0236-100
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007的CDR-L2
<400> 69
Figure 107144618-A0305-02-0237-101
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007的CDR-L3
<400> 70
Figure 107144618-A0305-02-0237-102
<210> 71
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007的VH
<400> 71
Figure 107144618-A0305-02-0237-103
Figure 107144618-A0305-02-0238-104
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007的VL
<400> 72
Figure 107144618-A0305-02-0238-105
<210> 73
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007的VH-VL
<400> 73
Figure 107144618-A0305-02-0238-106
Figure 107144618-A0305-02-0239-107
<210> 74
<211> 507
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007 x I2C
<400> 74
Figure 107144618-A0305-02-0240-108
Figure 107144618-A0305-02-0241-109
Figure 107144618-A0305-02-0242-110
<210> 75
<211> 989
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007 x I2C scFc雙特異性HLE分子
<400> 75
Figure 107144618-A0305-02-0242-111
Figure 107144618-A0305-02-0243-112
Figure 107144618-A0305-02-0244-113
Figure 107144618-A0305-02-0245-114
<210> 76
<211> 987
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007 x I2C scFc_delGK雙特異性HLE分子
<400> 76
Figure 107144618-A0305-02-0246-115
Figure 107144618-A0305-02-0247-116
Figure 107144618-A0305-02-0248-117
Figure 107144618-A0305-02-0249-118
<210> 77
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007_CC x I2C scFc VH
<400> 77
Figure 107144618-A0305-02-0250-119
<210> 78
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007_CC x I2C scFc VL
<400> 78
Figure 107144618-A0305-02-0250-120
Figure 107144618-A0305-02-0251-121
<210> 79
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007_CC x I2C scFc scFv
<400> 79
Figure 107144618-A0305-02-0251-122
Figure 107144618-A0305-02-0252-123
<210> 80
<211> 501
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007_CC x I2C scFc雙特異性分子
<400> 80
Figure 107144618-A0305-02-0252-124
Figure 107144618-A0305-02-0253-125
Figure 107144618-A0305-02-0254-126
<210> 81
<211> 989
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007_CC x I2C scFc雙特異性HLE分子
<400> 81
Figure 107144618-A0305-02-0254-127
Figure 107144618-A0305-02-0255-128
Figure 107144618-A0305-02-0256-129
Figure 107144618-A0305-02-0257-130
Figure 107144618-A0305-02-0258-131
<210> 82
<211> 987
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH19 65254.007_CC x I2C scFc_delGK雙特異性HLE分子
<400> 82
Figure 107144618-A0305-02-0258-132
Figure 107144618-A0305-02-0259-133
Figure 107144618-A0305-02-0260-134
Figure 107144618-A0305-02-0261-135
Figure 107144618-A0305-02-0262-136
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> FLT3_7 A8xCD3-scFc VH CDR1
<400> 83
Figure 107144618-A0305-02-0262-137
<210> 84
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> FLT3_7 A8xCD3-scFc VH CDR2
<400> 84
Figure 107144618-A0305-02-0262-138
<210> 85
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> FLT3_7 A8xCD3-scFc VH CDR3
<400> 85
Figure 107144618-A0305-02-0263-139
<210> 86
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> FLT3_7 A8xCD3-scFc VL CDR1
<400> 86
Figure 107144618-A0305-02-0263-140
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> FLT3_7 A8xCD3-scFc VL CDR2
<400> 87
Figure 107144618-A0305-02-0263-141
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> FLT3_7 A8xCD3-scFc VL CDR3
<400> 88
Figure 107144618-A0305-02-0264-142
<210> 89
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> FLT3_7 A8xCD3-scFc VH
<400> 89
Figure 107144618-A0305-02-0264-143
<210> 90
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> FLT3_ A8-scFc VL
<400> 90
Figure 107144618-A0305-02-0265-144
<210> 91
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> FLT3_7 A8xCD3- scFv
<400> 91
Figure 107144618-A0305-02-0265-145
Figure 107144618-A0305-02-0266-146
<210> 92
<211> 501
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> FLT3_7 A8xCD3雙特異性分子
<400> 92
Figure 107144618-A0305-02-0266-147
Figure 107144618-A0305-02-0267-148
Figure 107144618-A0305-02-0268-150
<210> 93
<211> 989
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> FLT3_7 A8xCD3-scFc雙特異性HLE分子
<400> 93
Figure 107144618-A0305-02-0269-151
Figure 107144618-A0305-02-0270-152
Figure 107144618-A0305-02-0271-153
Figure 107144618-A0305-02-0272-154
<210> 94
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VH CDR1 DLL3_1_CC_delGK
<400> 94
Figure 107144618-A0305-02-0272-155
<210> 95
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VH CDR2 DLL3_1_CC_delGK
<400> 95
Figure 107144618-A0305-02-0273-156
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VH CDR3 DLL3_1_CC_delGK
<400> 96
Figure 107144618-A0305-02-0273-157
<210> 97
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VL CDR1 DLL3_1_CC_delGK
<400> 97
Figure 107144618-A0305-02-0273-158
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VL CDR2 DLL3_1_CC_delGK
<400> 98
Figure 107144618-A0305-02-0274-159
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VL CDR3 DLL3_1_CC_delGK
<400> 99
Figure 107144618-A0305-02-0274-160
<210> 100
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VH DLL3_1_CC_delGK
<400> 100
Figure 107144618-A0305-02-0274-161
Figure 107144618-A0305-02-0275-162
<210> 101
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VL DLL3_1_CC_delGK
<400> 101
Figure 107144618-A0305-02-0275-163
<210> 102
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> DLL3_1_CC_delGK
<400> 102
Figure 107144618-A0305-02-0275-164
Figure 107144618-A0305-02-0276-165
<210> 103
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> DLL3_1_CCxCD3_delGK雙特異性分子
<400> 103
Figure 107144618-A0305-02-0277-166
Figure 107144618-A0305-02-0278-167
<210> 104
<211> 982
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> DLL3_1_CCxCD3-scFc_delGK雙特異性HLE分子
<400> 104
Figure 107144618-A0305-02-0279-168
Figure 107144618-A0305-02-0280-169
Figure 107144618-A0305-02-0281-170
Figure 107144618-A0305-02-0282-171
<210> 105
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VH CDR1 CD19 97-G1RE-C2
<400> 105
Figure 107144618-A0305-02-0283-172
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VH CDR2 CD19 97-G1RE-C2
<400> 106
Figure 107144618-A0305-02-0283-173
<210> 107
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VH CDR3 CD19 97-G1RE-C2
<400> 107
Figure 107144618-A0305-02-0283-174
<210> 108
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VH CD19 97-G1RE-C2 CC
<400> 108
Figure 107144618-A0305-02-0284-175
<210> 109
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VL CDR1 CD19 97-G1RE-C2
<400> 109
Figure 107144618-A0305-02-0284-176
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VL CDR2 CD19 97-G1RE-C2
<400> 110
Figure 107144618-A0305-02-0285-177
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VL CDR3 CD19 97-G1RE-C2
<400> 111
Figure 107144618-A0305-02-0285-179
<210> 112
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VL CD19 97-G1RE-C2 CC
<400> 112
Figure 107144618-A0305-02-0285-180
<210> 113
<211> 525
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD19 97-G1RE-C2 CC x I2C0
<400> 113
Figure 107144618-A0305-02-0286-181
Figure 107144618-A0305-02-0287-182
Figure 107144618-A0305-02-0288-183
<210> 114
<211> 1013
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD19 97-G1RE-C2 CC x I2C0-scFc
<400> 114
Figure 107144618-A0305-02-0288-184
Figure 107144618-A0305-02-0289-185
Figure 107144618-A0305-02-0290-187
Figure 107144618-A0305-02-0291-188
Figure 107144618-A0305-02-0292-189
<210> 115
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VH CDR1 CDH3 G8A 6-B12
<400> 115
Figure 107144618-A0305-02-0292-190
<210> 116
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VH CDR2 CDH3 G8A 6-B12
<400> 116
Figure 107144618-A0305-02-0292-191
<210> 117
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VH CDR3 CDH3 G8A 6-B12
<400> 117
Figure 107144618-A0305-02-0293-192
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VL CDR1 CDH3 G8A 6-B12
<400> 118
Figure 107144618-A0305-02-0293-193
<210> 119
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VL CDR2 CDH3 G8A 6-B12
<400> 119
Figure 107144618-A0305-02-0293-194
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VL CDR3 CDH3 G8A 6-B12
<400> 120
Figure 107144618-A0305-02-0293-195
<210> 121
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VH CDH3 G8A 6-B12
<400> 121
Figure 107144618-A0305-02-0294-196
<210> 122
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> VL CDH3 G8A 6-B12
<400> 122
Figure 107144618-A0305-02-0294-197
Figure 107144618-A0305-02-0295-198
<210> 123
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH3 G8A 6-B12 scFv
<400> 123
Figure 107144618-A0305-02-0295-199
Figure 107144618-A0305-02-0296-200
<210> 124
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH3 G8A 6-B12 x I2C0雙特異性分子
<400> 124
Figure 107144618-A0305-02-0296-201
Figure 107144618-A0305-02-0297-202
Figure 107144618-A0305-02-0298-203
<210> 125
<211> 994
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CDH3 G8A 6-B12 x I2C0雙特異性分子HLE
<400> 125
Figure 107144618-A0305-02-0298-204
Figure 107144618-A0305-02-0299-205
Figure 107144618-A0305-02-0300-206
Figure 107144618-A0305-02-0301-207
Figure 107144618-A0305-02-0302-208
<210> 126
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> BCMA A7 27-C4-G7 CDR1 VH
<400> 126
Figure 107144618-A0305-02-0302-209
<210> 127
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> BCMA A7 27-C4-G7 CDR2 VH
<400> 127
Figure 107144618-A0305-02-0303-210
<210> 128
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> BCMA A7 27-C4-G7 CDR3 VH
<400> 128
Figure 107144618-A0305-02-0303-211
<210> 129
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> BCMA A7 27-C4-G7 CDR1 VL
<400> 129
Figure 107144618-A0305-02-0303-212
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> BCMA A7 27-C4-G7 CDR2 VL
<400> 130
Figure 107144618-A0305-02-0304-213
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> BCMA A7 27-C4-G7 CDR3 VL
<400> 131
Figure 107144618-A0305-02-0304-214
<210> 132
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> BCMA A7 27-C4-G7 CC(44/100)VH
<400> 132
Figure 107144618-A0305-02-0304-215
Figure 107144618-A0305-02-0305-216
<210> 133
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> BCMA A7 27-C4-G7 CC(44/100)VL
<400> 133
Figure 107144618-A0305-02-0305-217
<210> 134
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> BCMA A7 27-C4-G7 CC(44/100)scFv
<400> 134
Figure 107144618-A0305-02-0306-218
<210> 135
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> BCMA A7 27-C4-G7 CC(44/100)x I2C0雙特異性分子
<400> 135
Figure 107144618-A0305-02-0307-219
Figure 107144618-A0305-02-0308-220
Figure 107144618-A0305-02-0309-221
<210> 136
<211> 986
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> BCMA A7 27-C4-G7 CC(44/100)x I2C0-scFc雙特異性分子HLE
<400> 136
Figure 107144618-A0305-02-0309-222
Figure 107144618-A0305-02-0310-223
Figure 107144618-A0305-02-0311-224
Figure 107144618-A0305-02-0312-225
Figure 107144618-A0305-02-0313-226
<210> 137
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC VH CDR1
<400> 137
Figure 107144618-A0305-02-0313-227
<210> 138
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC VH CDR2
<400> 138
Figure 107144618-A0305-02-0313-228
<210> 139
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC VH CDR3
<400> 139
Figure 107144618-A0305-02-0313-229
<210> 140
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC VL CDR1
<400> 140
Figure 107144618-A0305-02-0314-230
<210> 141
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC VL CDR2
<400> 141
Figure 107144618-A0305-02-0314-231
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC VL CDR3
<400> 142
Figure 107144618-A0305-02-0314-232
<210> 143
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC VH
<400> 143
Figure 107144618-A0305-02-0315-233
<210> 144
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC VL
<400> 144
Figure 107144618-A0305-02-0315-234
Figure 107144618-A0305-02-0316-235
<210> 145
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC scFv
<400> 145
Figure 107144618-A0305-02-0316-236
Figure 107144618-A0305-02-0317-237
<210> 146
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC x I2C0雙特異性分子
<400> 146
Figure 107144618-A0305-02-0317-238
Figure 107144618-A0305-02-0318-239
Figure 107144618-A0305-02-0319-240
<210> 147
<211> 986
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC x I2C0-scFc雙特異性HLE分子
<400> 147
Figure 107144618-A0305-02-0319-241
Figure 107144618-A0305-02-0320-242
Figure 107144618-A0305-02-0321-243
Figure 107144618-A0305-02-0322-244
Figure 107144618-A0305-02-0323-245
<210> 148
<211> 984
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC x I2C0-scFc_delGK雙特異性HLE分子
<400> 148
Figure 107144618-A0305-02-0323-246
Figure 107144618-A0305-02-0324-247
Figure 107144618-A0305-02-0325-248
Figure 107144618-A0305-02-0326-249
Figure 107144618-A0305-02-0327-250
<210> 149
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC x I2C0 CC(103/43)-scFc雙特異性分子
<400> 149
Figure 107144618-A0305-02-0327-251
Figure 107144618-A0305-02-0328-252
Figure 107144618-A0305-02-0329-253
<210> 150
<211> 986
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC x I2C0 CC(103/43)-scFc雙特異性HLE分子
<400> 150
Figure 107144618-A0305-02-0329-254
Figure 107144618-A0305-02-0330-255
Figure 107144618-A0305-02-0331-256
Figure 107144618-A0305-02-0332-257
Figure 107144618-A0305-02-0333-258
<210> 151
<211> 984
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.17 CC x I2C0 CC(103/43)-scFc_delGK雙特異性HLE分子
<400> 151
Figure 107144618-A0305-02-0333-259
Figure 107144618-A0305-02-0334-260
Figure 107144618-A0305-02-0335-261
Figure 107144618-A0305-02-0336-262
Figure 107144618-A0305-02-0337-263
<210> 152
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC VH CDR1
<400> 152
Figure 107144618-A0305-02-0337-264
<210> 153
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC VH CDR2
<400> 153
Figure 107144618-A0305-02-0337-265
<210> 154
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC VH CDR3
<400> 154
Figure 107144618-A0305-02-0338-267
<210> 155
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC VL CDR1
<400> 155
Figure 107144618-A0305-02-0338-268
<210> 156
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC VL CDR2
<400> 156
Figure 107144618-A0305-02-0338-269
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC VL CDR3
<400> 157
Figure 107144618-A0305-02-0339-270
<210> 158
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC VH
<400> 158
Figure 107144618-A0305-02-0339-271
<210> 159
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC VL
<400> 159
Figure 107144618-A0305-02-0340-272
<210> 160
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC scFv
<400> 160
Figure 107144618-A0305-02-0340-273
Figure 107144618-A0305-02-0341-274
<210> 161
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0雙特異性分子
<400> 161
Figure 107144618-A0305-02-0341-275
Figure 107144618-A0305-02-0342-276
Figure 107144618-A0305-02-0343-277
<210> 162
<211> 986
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc雙特異性HLE分子
<400> 162
Figure 107144618-A0305-02-0343-278
Figure 107144618-A0305-02-0344-279
Figure 107144618-A0305-02-0345-280
Figure 107144618-A0305-02-0346-281
Figure 107144618-A0305-02-0347-282
<210> 163
<211> 984
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc_delGK雙特異性HLE分子
<400> 163
Figure 107144618-A0305-02-0347-283
Figure 107144618-A0305-02-0348-284
Figure 107144618-A0305-02-0349-285
Figure 107144618-A0305-02-0350-286
Figure 107144618-A0305-02-0351-287
<210> 164
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0 CC(103/43)-scFc雙特異性分子
<400> 164
Figure 107144618-A0305-02-0351-288
Figure 107144618-A0305-02-0352-289
Figure 107144618-A0305-02-0353-290
<210> 165
<211> 986
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0 CC(103/43)-scFc雙特異性HLE分子
<400> 165
Figure 107144618-A0305-02-0353-291
Figure 107144618-A0305-02-0354-292
Figure 107144618-A0305-02-0355-293
Figure 107144618-A0305-02-0356-294
Figure 107144618-A0305-02-0357-295
<210> 166
<211> 984
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0 CC(103/43)-scFc_delGK雙特異性HLE分子
<400> 166
Figure 107144618-A0305-02-0357-296
Figure 107144618-A0305-02-0358-297
Figure 107144618-A0305-02-0359-298
Figure 107144618-A0305-02-0360-299
Figure 107144618-A0305-02-0361-300
<210> 167
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VH CDR1
<400> 167
Figure 107144618-A0305-02-0361-301
<210> 168
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VH CDR2
<400> 168
Figure 107144618-A0305-02-0362-302
<210> 169
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VH CDR3
<400> 169
Figure 107144618-A0305-02-0362-303
<210> 170
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VL CDR1
<400> 170
Figure 107144618-A0305-02-0362-304
<210> 171
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VL CDR2
<400> 171
Figure 107144618-A0305-02-0363-305
<210> 172
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VL CDR3
<400> 172
Figure 107144618-A0305-02-0363-306
<210> 173
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VH
<400> 173
Figure 107144618-A0305-02-0363-307
Figure 107144618-A0305-02-0364-308
<210> 174
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc VL
<400> 174
Figure 107144618-A0305-02-0364-309
<210> 175
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc scFv
<400> 175
Figure 107144618-A0305-02-0364-310
Figure 107144618-A0305-02-0365-311
<210> 176
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc雙特異性分子
<400> 176
Figure 107144618-A0305-02-0366-312
Figure 107144618-A0305-02-0367-313
<210> 177
<211> 986
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc雙特異性HLE分子
<400> 177
Figure 107144618-A0305-02-0368-314
Figure 107144618-A0305-02-0369-315
Figure 107144618-A0305-02-0370-316
Figure 107144618-A0305-02-0371-317
<210> 178
<211> 984
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0-scFc_delGK雙特異性HLE分子
<400> 178
Figure 107144618-A0305-02-0372-318
Figure 107144618-A0305-02-0373-319
Figure 107144618-A0305-02-0374-320
Figure 107144618-A0305-02-0375-321
<210> 179
<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0 CC(103/43)-scFc雙特異性分子
<400> 179
Figure 107144618-A0305-02-0376-322
Figure 107144618-A0305-02-0377-323
<210> 180
<211> 986
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0 CC(103/43)-scFc雙特異性HLE分子
<400> 180
Figure 107144618-A0305-02-0378-325
Figure 107144618-A0305-02-0379-326
Figure 107144618-A0305-02-0380-327
Figure 107144618-A0305-02-0381-328
<210> 181
<211> 984
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> PM 76-B10.11 CC x I2C0 CC(103/43)-scFc_delGK雙特異性HLE分子
<400> 181
Figure 107144618-A0305-02-0382-329
Figure 107144618-A0305-02-0383-330
Figure 107144618-A0305-02-0384-331
Figure 107144618-A0305-02-0385-332
<210> 182
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> IgG1鉸鏈
<400> 182
Figure 107144618-A0305-02-0386-333
<210> 183
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> IgG2亞型鉸鏈
<400> 183
Figure 107144618-A0305-02-0386-334
<210> 184
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> IgG3亞型鉸鏈
<400> 184
Figure 107144618-A0305-02-0386-335
<210> 185
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> IgG3亞型鉸鏈
<400> 185
Figure 107144618-A0305-02-0386-336
Figure 107144618-A0305-02-0387-337
<210> 186
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> IgG4亞型鉸鏈
<400> 186
Figure 107144618-A0305-02-0387-338
<210> 187
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> G4S接頭
<400> 187
Figure 107144618-A0305-02-0387-339
<210> 188
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> (G4S)2接頭
<400> 188
Figure 107144618-A0305-02-0387-340
<210> 189
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> (G4S)3接頭
<400> 189
Figure 107144618-A0305-02-0388-341
<210> 190
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> (G4S)4接頭
<400> 190
Figure 107144618-A0305-02-0388-342
<210> 191
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> (G4S)5接頭
<400> 191
Figure 107144618-A0305-02-0388-343
<210> 192
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> (G4S)6接頭
<400> 192
Figure 107144618-A0305-02-0389-344
<210> 193
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> (G4S)7接頭
<400> 193
Figure 107144618-A0305-02-0389-345
<210> 194
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> (G4S)8接頭
<400> 194
Figure 107144618-A0305-02-0389-346
Figure 107144618-A0305-02-0390-347
<210> 195
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> 肽接頭
<400> 195
Figure 107144618-A0305-02-0390-348
<210> 196
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> 肽接頭
<400> 196
Figure 107144618-A0305-02-0390-349
<210> 197
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> 肽接頭
<400> 197
Figure 107144618-A0305-02-0390-350
<210> 198
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> 肽接頭
<400> 198
Figure 107144618-A0305-02-0391-351
<210> 199
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> 六組氨酸標記
<400> 199
Figure 107144618-A0305-02-0391-352
<210> 200
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD3e結合劑VL
<400> 200
Figure 107144618-A0305-02-0391-353
Figure 107144618-A0305-02-0392-354
<210> 201
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD3e結合劑VH
<400> 201
Figure 107144618-A0305-02-0392-355
<210> 202
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> CD3e結合劑scFv
<400> 202
Figure 107144618-A0305-02-0393-356

Claims (17)

  1. 一種用於生產至少包含第一和第二結合結構域的雙特異性抗體產品的連續上游製造製程，其中與該第二結合結構域相比，該第一結合結構域結合不同的靶標，其中該雙特異性抗體產品為非全長雙特異性抗體構築體，且其中該雙特異性抗體產品為雙特異性T細胞銜接物抗體構築體，該製程包括以下步驟：(i)在灌注生物反應器中提供包含至少一種哺乳動物細胞培養物的液體細胞培養基，其中該哺乳動物細胞培養物能夠表現該雙特異性抗體產品，並且其中這些細胞在該灌注生物反應器中接種時具有至少0.4×10^6個細胞/mL，(ii)藉由應用灌注速率(D)以便以連續方式更換該液體細胞培養基、而不從生物反應器中移除細胞來培養該哺乳動物細胞培養物，其中該灌注速率最初對應於至少0.4個容器體積/天(vvd)，然後當達到生物量設定點時連續地、逐漸地或增量式地增加至至少2 vvd，其中該生物量設定點等於至少65×10^6個細胞/mL的活細胞密度(VCD)，(iii)當達到該生物量設定點時，藉由應用灌注速率(D)以連續地或增量式地更換該液體細胞培養基來維持灌注培養，其中步驟(iii)中的灌注速率為在2至6.4 vvd的範圍內，且其中該灌注速率(D)為在0.01至0.15nL/細胞-天(每天nL/細胞)範圍內的細胞特異性灌注速率(CSPR)，並且(iv)從該生物反應器排出額外細胞以維持該生物量設定點，其中 藉由在步驟(ii)至(iv)從該液體細胞培養基連續收穫該雙特異性抗體產品，將該生物反應器中的雙特異性抗體產品濃度保持為低於0.3g/L。
  2. 如請求項1之製程，其中在步驟(i)中該細胞具有至少1×10^6個細胞/mL的濃度。
  3. 如請求項1之製程，其中在步驟(ii)中該生物量設定點等於至少71×10^6個細胞/mL的VCD。
  4. 如請求項1之製程，其中在步驟(ii)中培養該細胞培養物進行至少4天。
  5. 如請求項1之製程，其中在步驟(ii)中培養該細胞培養物進行12天。
  6. 如請求項1之製程，其中在步驟(ii)中灌注速率(D)在0.4至7 vvd的範圍內。
  7. 如請求項1之製程，其中在步驟(iii)中灌注速率(D)等於2 vvd或2.01 vvd。
  8. 如請求項1之製程，其中在步驟(iii)中該CSPR係在0.015至0.035nL/細胞-天的範圍內或在0.051至0.1nL/細胞-天的範圍內。
  9. 如請求項1之製程，其中在步驟(iv)中收穫前該雙特異性抗體產品在該生物反應器中的停留時間為至多2天。
  10. 如請求項1之製程，其中分離的雙特異性抗體的單體含量百分比為至少50%。
  11. 如請求項1之製程，其中該雙特異性抗體構建體包含源自IgG抗體的基於Fc的半衰期延長部分。
  12. 如請求項1之製程，其中該雙特異性抗體產品的該第一結合結構域結合選自以下群組的至少一種靶細胞表面抗原，該群組由以下各項組成：CD19、CD33、EGFRvIII、MSLN、CDH19、FLT3、DLL3、CDH3、BCMA和PSMA，及/或其中該雙特異性抗體產品的該第二結合結構域結合CD3。
  13. 如請求項1之製程，其中該第一結合結構域包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH區和含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL區，該CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3以及CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3選自由以下組成的群組：(a)如SEQ ID NO：1所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：2所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：3所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：4所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：5所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：6 所示的CDR-L3，(b)如SEQ ID NO：29所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：30所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：31所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：34所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：35所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：36所示的CDR-L3，(c)如SEQ ID NO：42所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：43所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：44所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：45所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：46所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：47所示的CDR-L3，(d)如SEQ ID NO：53所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：54所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：55所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：56所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：57所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：58所示的CDR-L3，(e)如SEQ ID NO：65所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：66所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：67所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：68所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：69所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：70所示的CDR-L3，(f)如SEQ ID NO：83所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：84所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：85所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：86所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：87所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：88所示的CDR-L3，(g)如SEQ ID NO：94所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：95所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：96所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：97所 示的CDR-L1、如SEQ ID NO：98所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：99所示的CDR-L3，(h)如SEQ ID NO：105所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：106所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：107所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：109所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：110所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：111所示的CDR-L3，(i)如SEQ ID NO：115所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：116所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：117所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：118所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：119所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：120所示的CDR-L3，(j)如SEQ ID NO：126所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：127所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：128所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：129所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：130所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：131所示的CDR-L3，(k)如SEQ ID NO：137所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：138所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：139所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：140所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：141所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：142所示的CDR-L3，(l)如SEQ ID NO：152所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：153所示的CDR-H2、如SEQ ID NO：154所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：155所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：156所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：157所示的CDR-L3，以及(m)如SEQ ID NO：167所示的CDR-H1、如SEQ ID NO：168所示 的CDR-H2、如SEQ ID NO：169所示的CDR-H3、如SEQ ID NO：170所示的CDR-L1、如SEQ ID NO：171所示的CDR-L2以及如SEQ ID NO：172所示的CDR-L3。
  14. 如請求項1之製程，其中收穫的雙特異性抗體產品被包含在收穫的細胞培養液(HCCF)中。
  15. 如請求項1之製程，其中該HCCF係從步驟(ii)和(iii)獲得或僅從步驟(iii)獲得。
  16. 如請求項1之製程，其中較佳的是在室溫下以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48、72、96、120和/或144小時增量或連續地收集該HCCF，並傳遞到下游步驟以進行捕獲該雙特異性抗體產品，其中這些下游步驟包括捕獲層析、病毒滅活和/或精製步驟。
  17. 如請求項1之製程，其中藉由以限定的細胞特異性灌注速率進料並從該生物反應器排出額外細胞以維持該生物量設定點，而使該灌注培養連續運行至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天，或至少35天。
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