JP2002507410A - ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質をコードする核酸および、診断、高処理スクリーニングおよび新規アイテムにおけるその使用 - Google Patents

ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質をコードする核酸および、診断、高処理スクリーニングおよび新規アイテムにおけるその使用

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Abstract

(57)【要約】 Renilla mulleri、GaussiaおよびPleuromamma由来のルシフェラーゼをコードする、単離および精製した核酸分子、ならびにそれらによりコードされるタンパク質を提供する。RenillaおよびPtilosarcus由来の緑色蛍光タンパク質をコードする、単離および精製した核酸分子、ならびにそれらにによりコードされた緑色蛍光タンパク質をも提供する。緑色蛍光タンパク質および／またはルシフェラーゼを含む組成物および組合せを更に提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願） 本出願は、“ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよび蛍光タ
ンパク質をコードする核酸および、診断、高処理スクリーニングおよび新規アイ
テムにおけるその使用”と題し、Bruce Bryan および Christopher Szent-Gyorg
yiにより１９９８年１０月１日に出願された米国仮出願第６０/１０２,９３９に
対する優先権を主張する。また、“GAUSSIAルシフェラーゼ、ルシフェラーゼを コードする核酸およびルシフェラーゼを使用する方法”と題し、Bruce Bryan お
よび Christopher Szent-Gyorgyiにより１９９８年１月１５日に出願された米国
仮出願第６０/０８９,３６７および“RENILLAグリーン蛍光タンパク質組成物お よび方法”と題し、Bruce Bryan および Christopher Szent-Gyorgyiにより１９
９８年３月２７日に出願された米国仮出願第６０/０７９,６２４に対する優先権
も主張する。米国の目的のため、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいてこ
れらの出願各々に対する優先権の利益を享受する。
【０００２】 本出願はまた、“生物発光新規アイテム”と題し、Bruce Bryanにより１９９ ６年１１月２５日に出願された米国出願第０８/７５７,０４６であり、１９９９
年３月２日発行の米国特許第５，８７６，９９５、および“生物発光新規アイテ
ム”と題し、Bruce Bryanにより１９９６年２月６日に出願された米国出願第０ ８/５９７,２７４の内容に関する。本出願はまた、“新生物組織または他の組織
の検出および視覚化”と題し、Bruce Bryanにより１９９７年８月８日に出願さ れた米国出願第０８/９０８,９０９に関する。本出願はまた、“感染因子を検出
および同定する装置および方法”と題し、Bruce Bryanにより１９９７年１２月 １２日に出願された米国出願第０８/９９０,１０３に関する。
【０００３】 上記の米国出願および米国仮出願の各々の内容はすべて、出典明示により本明
細書の一部とする。
【０００４】 （発明の分野） 本発明は、Renilla、Gaussia、Philocarpus および Pleuromamma属からの、単
離および精製された核酸およびコードされたタンパク質に関する。より詳細には
、これらの属種からのルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質をコードする核酸を
提供する。
【０００５】 （発明の背景） 発光は、エネルギーがある分子に特に集中して、励起状態を引き起こす現象で
ある。低エネルギー状態へ戻るには、光量子（ｈｙ）の放射が伴う。発光には、
蛍光発光、リン光、化学発光および生物発光が含まれる。生物発光は、生物が他
の生物に見える光を放射する方法である。発光は次のように表される： Ａ＋Ｂ→Ｘ*＋Ｙ Ｘ*→Ｘ＋ｈｖ 式中、Ｘ*は、電子的に励起された分子であり、ｈｖはＸ*が低エネルギー状態に
戻るときの光放射を表す。発光が生物発光である場合、励起状態の発生は酵素触
媒反応から誘発される。生物発光（または化学発光または他の発光）反応におい
て放射される光の色は、励起された分子の特徴を示し、励起および温度の源と関
係がない。
【０００６】 生物発光の必要条件は、ルシフェラーゼの存在下において結合または遊離して
いる分子状酸素を使用することである。ルシフェラーゼはオキシゲナーゼであり
、分子状酸素の存在下で基質であるルシフェリンに作用し、基質を励起状態に変
える。低エネルギーレベルへ戻ると、エネルギーは光の形態で放出される［概説
には、例えば、McElroy et al. (1966) in Molecular Architecture in Cell Ph
ysiology, Hayashi et al., eds., Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, N
J, pp.63-80; Ward et al., Chapter 7 in Chemi-and Bioluminescence, Burr,
ed., Marcel Dekker, Inc. NY, pp.321-358; Hastings, J.W. in (1995) Cell P
hysiology: Source Book, N. Sperelakis(ed.), Academic Press, pp665-681; L
uminescence, Narcosis and Life in the Deep Sea, Johnson, Vantage Press,
NY, see, esp. pp.50-56を参照］。
【０００７】 全体的には稀であるが、生物発光は陸生生物より海洋生物においてより一般的
である。生物発光は３０もの進化論的に異なる起源から進化し、従って、異なる
生物において生物発光の原因となる生化学的および生理学的メカニズムが異なる
ように、生物発光は様々な方法で現れる。生物発光種は多くの属におよび、細菌
［ビブリオ種を含む原始海洋細菌］、真菌類、藻類および渦鞭毛虫類などの微生
物、節足動物、軟体動物、棘皮動物および脊椎動物を含む海洋生物および環形動
物の虫および昆虫を含む陸生動物までを含む。
【０００８】 生物発光を使用するアッセイ 過去２０年間、研究および医学界において使用される高感度の生化学アッセイ
は、放射性同位元素よりも発光および蛍光発光をますます使用してきた。この変
化は、部分的には放射性同位元素の処理費用の上昇により、および部分的には迅
速かつ便利なアッセイ方法を発見する必要性により余儀なくされた。最近では、
生細胞および全動物においてイン シトゥで生化学アッセイを行う必要があるの で、研究者はタンパク質に基づく発光および蛍光発光を使用する。ＡＴＰアッセ
イのためにホタルルシフェラーゼ、カルシウムリポータとしてエクオリンおよび
オベリン（obelin）、神経生理学的指示薬としてVargulaルシフェラーゼおよび 、追跡子およびｐＨ指示薬としてAequoreaグリーン蛍光タンパク質を使用するこ
とは、研究所における生物発光に基づく方法の可能性を示している。
【０００９】 生物発光はまた、医学および生物工学に直接影響を与え始めている；例えば、
Aequorea ＧＦＰは、マウスモデルシステムにおける細胞を標識するのに用いら れたり、高処理薬物スクリーニングのレポータとして用いられる。Renillaルシ フェラーゼは、診断基準において使用するために開発中である。
【００１０】 生物発光を発生するシステム 生物発光は、他のタイプの化学発光と同様に、生物学および医学において特異
的な物質の定量に使用される。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子は、多くの目的の
ために、多数のアッセイにおいてレポータ遺伝子としてクローン化され、活用さ
れてきた。異なるルシフェラーゼシステムは異なる特異的な必要条件を有するの
で、種々の物質を検出および定量するために使用され得る。工業用生物発光適用
の大部分は、ホタル[Photinus pyralis]ルシフェラーゼに基づいている。最初に
およびさらに広範に使用されるアッセイの一つは、ＡＴＰの存在を検出するのに
ホタルルシフェラーゼの使用を必要とする。また、ホタルルシフェラーゼは、反
応における他の物質または補助因子を検出および定量するのにも使用される。Ｎ
ＡＤ（Ｈ）、ＮＡＤＰ（Ｈ）または長鎖アルデヒドを産生または利用するいかな
る反応も、直接または間接的に、細菌性ルシフェラーゼの光放射反応に結び付き
得る。
【００１１】 分析目的で工業用に使用される別のルシフェラーゼシステムは、エクオリンシ
ステムである。精製クラゲ発光タンパク質であるエクオリンは、細胞内Ｃａ2+お
よび種々の実験条件下でのその変化を検出および定量するのに使用される。エク
オリン発光タンパク質は、比較的小さく［〜２０ｋＤａ］、非毒性で、広い濃度
範囲［３×１０-7から１０-4Ｍ］にわたりカルシウムを検出するのに適切な量で
細胞に注入され得る。
【００１２】 その分析における有用性のため、ルシフェラーゼおよび基質は研究され、充分
に特徴付けられ、市販されている［例えば、ホタルルシフェラーゼはSigma, St.
Louis, MOおよびBoehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, INから入
手可能であり；組換えにより産生されたホタルルシフェラーゼおよびこの遺伝子
に基づいた他の試薬またはこのタンパク質とともに使用するための他の試薬はPr
omega Corporation, Madison, WIから入手可能であり；クラゲからのエクオリン
発光タンパク質ルシフェラーゼおよびRenillaからのルシフェラーゼは、Sealite
Sciences, Bogart, GAから入手可能であり；これらのルシフェラーゼのための 天然基質であるセレンテラジンは、Molecular Probes, Eugene, ORから入手可能
である］。これらのルシフェラーゼおよび関連の試薬は、診断、品質管理、環境
試験および他のこのような分析のための試薬として使用される。
【００１３】 分析システムにおける試薬としてルシフェラーゼが有用であり、高処理スクリ
ーニング系における使用に可能性があるので、現在入手可能なものと比較して改
良されたスペクトル特性または異なるスペクトル特性を有する様々なルシフェラ
ーゼを同定し、単離する必要がある。これらすべての理由のため、Gaussiaおよ び入手可能な様々なRenilla種など、様々な種からのルシフェラーゼを有するこ とは好都合である。
【００１４】 蛍光タンパク質 リポーター遺伝子は、問題の遺伝子を有するレシピエント細胞に同時形質移入
されると、形質移入および他の事象を検出する手段を提供する。蛍光タンパク質
をコードするものはリポーター遺伝子の中にある。本明細書に記載の生物発光を
発生するシステムは、レポータ遺伝子として使用するものの中にある。感度を上
げるために、生物発光を発生するシステムは蛍光化合物およびタンパク質、例え
ば天然蛍光フィコビリンタンパク質などと併用してきた。また、様々な海洋無脊
椎動物に存在する蛍光タンパク質、例えばグリーン蛍光タンパク質およびブルー
蛍光タンパク質、特にAequorea victoriaのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ） は、重要である。
【００１５】 グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、特定の生物発光腔腸動物のあいだでし
か見られないある種類の色素タンパク質を構成する。これらの補助タンパク質は
蛍光であり、酵素結合した励起状態のオキシルシフェリン（oxyluciferin）から
のエネルギーを受け入れることにより、これらの生物において最大の蛍光発光放
出体として機能する（参照、例えばWard et al. (1979) J. Biol. Chem. 254:78
1-788; Ward et al. (1978) Photochem. Photobiol. 27:389-396; Ward et al.
(1982) Biochemistry 21:4535-4540)。
【００１６】 最も特徴的なＧＦＰは、クラゲ種Aequorea、特にAequorea victoria (A. vict
oria)およびAequorea forskaleaから単離されたものである（Ward et al. (1982
) Biochemistry 21:4535-4540; Prendergast et al. (1978) Biochemistry 17:3
448-3453)。精製A.victoria ＧＦＰは、約２７ｋＤａの単量体タンパク質であり
、３９５nmの最大励起波長と４７０nmの最小ピークを有する青い光を吸収し、約
５１０nmの放射波長と５４０nm近くの最小ピークを有するグリーン蛍光発光を放
射する（Ward et al. (1979) Photochem. Photobiol. Rev 4:1-57)。このＧＦＰ
には一定の限度がある。野生型ＧＦＰの最大励起は、標準的フルオレセイン検出
光学の波長範囲内にない。
【００１７】 グリーン蛍光発光の検出は、いかなる外因性の基質または補助因子をも必要と
しない。代わりに、高レベルの蛍光発光は、タンパク質固有の発色団に起因する
。発色団には、ポリペプチド鎖内の修飾アミノ酸残基が含まれる。例えば、A.vi
ctoria ＧＦＰの蛍光発色団は、アミノ酸残基６４−６９を包含するヘキサペプ チド配列、ＦＳＹＧＶＱによりコードされる。発色団は、残基Ｓｅｒ６５および
Ｇｌｙ６７でのポリペプチド要素の分子内環化および残基Ｔｙｒ６６のα−β結
合の酸化により形成される（参照、例えばCody et al. (1993) Biochemistry 32
:1212-1218; Shimomura (1978) FEBS Letters 104:220-222; Ward et al. (1989
) Photochem. Photobiol. 49:62S）。中性ｐＨで単離された発色団および変性し
たタンパク質の放射スペクトルは、天然タンパク質のスペクトルに合わず、発色
団の形成が翻訳後に生じていることを示唆している（参照、例えばCody et al.
(1993) Biochemistry 32:1212-1218)。
【００１８】 さらに、精製A. victoria ＧＦＰの結晶構造が特定された（参照、例えばOrmo
e (1996) Science 273:1392-1395)。タンパク質の優性な構造的特徴は、修飾ｐ −ヒドロキシベンジルイデネイマダキソリジノン発色団を含有する単一の中央α
螺旋を包むほぼ完全な円柱を形成する１１−鎖βバレルである。発色団はバレル
構造内の中央に位置し、バルク溶媒への露出から完全に保護されている。
【００１９】 A. victoria ＧＦＰのアイソタイプをコードするＤＮＡは単離され、そのヌク
レオチド配列が特定された（参照、例えばPrasher (1992) Gene 111:229-233)。
A. victoria ＣＤＮＡは、２６，８８８Ｄａの推定Ｍを有する２３８アミノ酸ポ
リペプチドをコードする７１４ヌクレオチド読み取り枠を含有する。組換えによ
り発現されたA. victoria ＧＦＰは、細菌（参照、例えばChalfie et al. (1994
) Science 263:802-805; Miller et al. (1997) Gene 191:149-153)、イースト 菌および真菌類（Fey et al. (1995) Gene 165:127-130; Straight et al. (199
6) Curr. Biol. 6:1599-1608; Cormack et al. (1997) Microbiology 143: 303-
311)、ショウジョウバエ属（参照、例えばWang et al. (1994) Nature 369:400-
403; Plautz (1996) Gene 173:83-87)、植物（Heinlein et al. (1995); Casper
et al. (1996) Gene 173:69-73)、魚類（Amsterdam et al. (1995))および哺乳
動物（Ikawa et al. (1995)）を含む非常に様々な生物においてインビボで蛍光 発光する能力を保持する。Aequorea ＧＦＰベクターおよび単離されたAequorea
ＧＦＰタンパク質は、遺伝子発現、細胞移入および細胞局在化、微小管の形成お
よび機能的イオンチャネルの集合を測定するためのマーカーとして使用されてき
た（参照、例えばTerry et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 217:2
1-27; Kain et al. (1995) Biotechniques 19: 650-655)。しかしながら、A. vi
ctoria ＧＦＰは、分析および診断方法における使用に理想的ではない。結果と して、ＧＦＰ変異体は、赤色に変化する単一励起スペクトルピークを有する変異
体を同定する可能性をもって選択された。
【００２０】 実際、このような変異体の作成において決められた目的は、A. victoria ＧＦ
ＰをRenillaからのＧＦＰのようにするために試みられており、RenillaからのＧ
ＦＰはこのようにほとんどクローン化されないが、分析ツールとして使用するの
にそれをさらに理想的にする特性を有する。多くの実際の適用について、Renill
a ＧＦＰのスペクトルは、Aequorea ＧＦＰのスペクトルより好ましい。なぜな ら、成分スペクトルが低く、広いというより高く、狭い場合、異なる発蛍光団の
間の波長識別および共鳴エネルギー移動の検出が容易だからである。さらに、Re
nilla ＧＦＰの長い波長励起ピーク（４７５nm）は、フルオレセインフィルター
セットにほぼ理想的であり、光脱色に耐性であるが、３９５nmの短い波長ピーク
より低い振幅を有し、光脱色により敏感である［Chalfie et al. (1994) Scienc
e 263:802-805］。
【００２１】 系統発生的に異なり、充分に調査されていない生物発光タンパク質の範囲が存
在し、将来の開発のために蓄積されている。Renilla ＧＦＰをコードする核酸な
どこれらの多くは、集中的な努力にもかかわらずまだである。
【００２２】 これらの理由により、様々な新規ルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質、特に
A.victoria ＧＦＰの変異体を使用するよりも利用可能なRenilla ＧＦＰを有す ることが望ましい。しかしながら、いかなるRenilla ＧＦＰをもコードする遺伝
子をクローン化することは不可能であった。特定の適用のためのシステムを効果
的にし、現在の方法を改善するために利用可能な種々のＧＦＰおよびルシフェラ
ーゼを有することも望ましい。従って、本明細書における目的は、これまで利用
不可能なルシフェラーゼをコードする単離された核酸とそれによりコードされる
タンパク質を提供することである。本明細書の目的はまた、他の種からRenilla
ＧＦＰ、ＧＦＰをコードする単離された核酸、様々な種からのルシフェラーゼお
よびそれによりコードされるタンパク質を提供することである。本明細書の目的
はまた、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびＧＦＰを含む生物発光を発生する
システムを提供することである。
【００２３】 （発明の要旨） 本発明は、蛍光タンパク質をコードする単離の核酸およびルシフェラーゼをコ
ードする単離の核酸を提供する。Renilla 由来および Ptilosarcus 由来の GFP
をコードする核酸分子を提供する。
【００２４】 本発明は、Renilla mulleri ルシフェラーゼ、Gaussia 種ルシフェラーゼおよ
び Pleuromamma 種ルシフェラーゼをコードする核酸分子を提供する。これから 誘導される核酸プローブも提供する。本発明は、機能的に等価の核酸、例えば、
開示の分子に高度なストリジェンシイ条件でハイブリドする核酸も意図する。
【００２５】 本発明は、各ルシフェラーゼおよび GFP、およびルシフェラーゼと GFP の組 合せをコードする核酸の発現のための宿主細胞（細菌、酵母および哺乳動物の細
胞を含む）およびプラスミドも提供する。これらの遺伝子は、ヒトなどの哺乳動
物の選択された宿主細胞または宿主における発現を最適化するコドンで置換され
て修飾され、または変異生成されて、放出性が変わる。
【００２６】 （ルシフェラーゼ） 本発明は、Renilla mulleri ルシフェラーゼをコードする異型核酸を含有する
組換え宿主細胞、およびこの核酸を提供する。好ましい実施態様において、異型
核酸は、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする。さらに好ましい実施態様に
おいて、異型核酸は配列番号１７のアミノ酸配列をコードする。本発明は、機能
的に等価の核酸、例えば、配列番号１７のヌクレオチド配列に高度なストリジェ
ンシイ条件でハイブリドする核酸分子を提供する。特に、本発明で提供されるプ
ローブを用いるときに、提供する。
【００２７】 本発明は、Gaussia 由来のルシフェラーゼをコードする単離の核酸を提供する
。特に、Gaussia princeps をコードする核酸断片およびそれから誘導される核 酸プローブを提供する。特定の実施態様において、ルシフェラーゼは、配列番号
１９のヌクレオチド配列によりコードされる。また、本発明は、配列番号１９の
ヌクレオチド配列に中程度または高度のストリジェンシイ条件でハイブリドする
核酸分子を提供する。特に、本発明で提供されるプローブを用いるときに提供す
る。本発明は、Gaussia 種由来のルシフェラーゼを単離するために、本発明方法
で使用できる核酸から誘導されるプローブを提供する。この核酸は配列番号２０
のアミノ酸配列をコードする。
【００２８】 本発明は、Pleuromamma ルシフェラーゼをコードする核酸を提供する。特に、
Pleuromamma ルシフェラーゼをコードする核酸分子およびコードされたルシフェ
ラーゼを、それぞれ配列番号２８および２９に明示した。Pleuromamma ルシフェ
ラーゼをコードする核酸の単離も行った。
【００２９】 本発明は、Renilla mulleri、Gaussia または Pleuromamma をコードする DNA
含有の発現ベクターを提供する。この DNA は、ルシフェラーゼの構造的または
誘発的発現を可能にするプロモーター・エレメントと操作的に結合しているもの
である。好ましい実施態様において、ベクターは多様な宿主細胞で Renilla mul
leri ルシフェラーゼを発現できる。本発明はまた、キメラ Renilla mulleri ル
シフェラーゼ融合タンパク質、好ましくはキメラ抗体ルシフェラーゼまたはアセ
チルコリン・エステラーゼ融合タンパク質を提供する。このものは、プロモータ
ー・エレメントおよび複数のクローニング部位（Renilla mulleri をコードする
DNA の上流または下流に位置する）を含有する。
【００３０】 本発明は、Gaussia ルシフェラーゼをコードする異型核酸含有の組換え細胞も
提供する。精製された Gaussia ルシフェラーゼ、および Gaussia ルシフェラー
ゼのみまたは Renilla 緑色蛍光タンパク質などの生物発光生成システムの他の 成分と組み合せた Gaussia ルシフェラーゼを含有する組成物を提供する。この
Gaussia ルシフェラーゼは、例えば、新規の物品の蛍光源を提供するのに使用で
き、または新形成組織などの組織の検出や視覚化の方法、均質免疫アッセイなど
の免疫アッセイ、および多ウエルアッセイ機器でのインビトロ蛍光スクリーニン
グアッセイを用いる感染の検出方法に使用でき、または上記の方法のいずれかを
実施するキットにおいて提供する。特に、Gaussia ルシフェラーゼは、本発明で
提供するアッセイにおいて適当な蛍光タンパク質と共に使用できる。
【００３１】 本発明は、Gaussia や Pleuromamma などの種でのルシフェラーゼコード DNA
の単離およびクローニングのためのプローブを用いる方法も提供する。好ましい
実施態様において、核酸プローブは、少なくとも 14 ヌクレオチド、好ましくは
16-30 ヌクレオチドの変性プローブであり、これらのヌクレオチドは、配列番 号１９のアミノ酸および／または配列番号２９のヌクレオチド配列に基づく。
【００３２】 本発明は、Gaussia ルシフェラーゼまたは Pleuromamma ルシフェラーゼをコ ードする DNA 含有のベクターを提供する。特に、ルシフェラーゼの構造的また は誘発的な発現を可能にするプロモーター・エレメントと操作的に結合している
ルシフェラーゼ・コード DNA を含有する発現ベクターを提供する。好ましい実 施態様において、ベクターは多様な宿主細胞でルシフェラーゼを発現できる。本
発明は、キメラ・ルシフェラーゼ融合タンパク質（参照、例えば、米国特許 5,4
64,745。これはタンパク質結合ドメインを開示している。参照、配列番号２１お
よび２２。これらは、ドメイン−ルシフェラーゼ融合タンパク質結合セルロース
を規定しており、図１および２に表示する）をつくるためのベクターを提供する
。このものは、プロモーター・エレメントおよび複数のクローニング部位（Gaus
sia または Pleuromamma ルシフェラーゼをコードする DNA の上流または下流に
位置する）を含有する。特定の実施態様において、ルシフェラーゼをコードする
DNA は、PET ベクター（Novagen；参照、米国特許 5,719,044、5,738,984、5,6
70,623、5,496,934 および Novagen カタログ；ベクターの購入で提供される各P
ET ベクターの完全な配列）におけるセルロース結合ドメインのＮ末端をコード する DNA（CBDclos；参照、配列番号２１および２２）に連結している。
【００３３】 本発明は、Gaussia または Pleuromamma のルシフェラーゼをコードする核酸 、特に DNA と GFP またはフィコビリタンパク質をコードする DNA との融合も 提供する。また、Renilla ルシフェラーゼと Renilla GFP との融合も提供する 。これらの融合において、ルシフェラーゼと GFP コード DNA は、隣接していて
もよいし、スペーサー・ペプチドで隔てられていてもよい。融合タンパク質をつ
くるのに使用される融合は、ルシフェラーゼと GFP 対の相互作用により多様な 特異的な分析の適用を有する。相互作用の検査は、ルシフェリンおよび適当な結
合因子の存在下でルシフェラーゼ−GFP タンパク質対の放射スペクトルによる。
【００３４】 本発明は、Gaussia または Pleuromamma のルシフェラーゼをコードする異型 核酸を含有の組換え宿主細胞を提供する。ある実施態様において、ルシフェラー
ゼをコードする異型 DNA 含有の組換え細胞は、ルシフェラーゼをコードする DN
A での遺伝子移入により、またはこのタンパク質をコードする DNA の RNA 転写
体導入によりつくる。 DNA は、直線 DNA 断片として導入でき、またはコード D
NA の安定的または一時的な発現のための発現ベクターに組み込むことができる 。
【００３５】 機能的ルシフェラーゼを発現する細胞は、単独で、または生物発光生成システ
ムと共に、本明細書に記載するような、細胞を基にしたアッセイおよびスクリー
ニング方法で使用できる。ルシフェラーゼを発現するための現状で好ましい宿主
細胞は、細菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞である。
【００３６】 本発明は、精製された Gaussia、Pleuromamma、Renilla mulleri のルシフェ ラーゼを提供する。これらのルシフェラーゼを好都合に得るのは、ルシフェラー
ゼ・タンパク質をコードする核酸含有の真核細胞または原核細胞における本発明
核酸の発現、および発現されたタンパク質の単離による。
【００３７】 本発明は、ルシフェラーゼを含有する組成物を提供する。組成物は、利用のた
めの意図された方法に従って、多数の形態のいずれをも取りうる。ある実施態様
において、例えば、組成物は、Gaussia ルシフェラーゼ、Gaussia ルシフェラー
ゼペプチドまたは Gaussia ルシフェラーゼ融合タンパク質を含有し、発光新規 物品、免疫アッセイ、FET（蛍光エネルギー移行）アッセイ、FRET（蛍光共鳴エ ネルギー移行）アッセイ、HTRF（均質時間分解蛍光）アッセイにおける供与体で
の使用のために整備され、または本明細書記載のような総合光検出剤を含有する
多ウエル機器とともに使用される。
【００３８】 さらに好ましい実施態様において、生物発光生成システムは、ルシフェラーゼ
に加えて Renilla mulleri または Ptilosarcus GFP を含む。これらの組成物は
、種々の方法や系で使用できる。例えば、本明細書に記載のような方法、新形成
組織などの組織のインビボ検出のための診断系において使用できる。
【００３９】 本発明は、ルシフェラーゼを含有する第１組成物と生物発光生成システムの１
以上の他の成分を含有する第２組成物を含み、製造品と共に新規の物品をつくる
のに使用される組成物を提供する。この新規物品は、娯楽や気晴らし、アミュー
ズメント用に設計され、限定でないが、次のものを含む：玩具、特に、水鉄砲、
玩具のシガレット、玩具のハロウィーン卵、フットバッグ、ボード／カードゲー
ム；フィンガー・ペイント、粘液性玩具；織物、特に衣類、例えば、シャツ、帽
子、スポーツ用衣服、糸、織糸；泡を作る玩具における泡、泡をつくる玩具；風
船；小像；人体用の物品、例えば、化粧品、浴槽用粉末、ボディ用のローション
、ゲル、末、クリーム、爪光沢剤、メークアップ剤、歯磨きなどの歯科用剤、石
鹸、ボディペイント、泡沫浴；インクや紙などの物品；ゼラチン、アイシング、
フロスティングなどの食品；ルシフェリンおよびトランスジェニック魚を含有す
る魚食品、特にルシフェラーゼを発現するトランスジェニック魚；ルシフェリン
またはルシフェラーゼを含有する植物食品、特にルシフェラーゼを発現するトラ
ンスジェニック植物と用いるルシフェリン；飲物、例えば、ビール、ぶどう酒、
シャンペン、ソフトドリンク、立体状などの形態のアイス；噴出物、例えば、液
体花火、ジェット、スプレー、エアゾルなどの組成物（溶液、混合液、懸濁液、
粉末、パスタ、粒状物などの適当な形態にある）。
【００４０】 本発明で提供され、もって娯楽や気晴らし、アミューズメントを提供する生物
発光生成システムと組み合わされる製造品に、ロゴや商標と結びつけた宣伝用物
および／または宣伝行為などのリクレーションやアトラクション用の物品の使用
がある。このような使用は、これらの物品の通常的または普通の使用に付加して
、と共に、または置き換わって、なされる。組合せの結果、物品は、水鉄砲や噴
出物などにおけるように液体や粒状物の輝く流出またはスプレーをつくる。新規
物品の新規性は生物発光に由来する。
【００４１】 （ GFP ） 本発明は、Renilla 由来の GFP をコードする単離の核酸を提供する。さらに 提供されるものは、多数の Renilla 属の生物発光生成システム成分および緑色 蛍光タンパク質（ GFP ）をコードする単離・精製の核酸、およびコードされた タンパク質である。特に、本発明は、 Renilla 緑色蛍光タンパク質（ GFP ）お
よび Renilla mulleri ルシフェラーゼをコードする核酸断片、およびそれから 誘導される核酸プローブを提供する。
【００４２】 本発明は、Renilla GFP をコードする核酸分子を提供する。本発明は、配列番
号１５のヌクレオチド配列のコード部分を含む Renilla GFPまたは配列番号１５
のヌクレオチド配列に中程度または高度なストリジェンシイ条件でハイブリドす
る Renilla GFP をコードする核酸分子を提供する。特に、本発明で提供される プローブを用いるときに、提供する。この核酸から誘導されたプローブは、本発
明の方法で使用し、Renilla 種から GFP を単離する。例示的な実施態様におい て、本発明は、Renilla mulleri GFP をコードする核酸を提供する。この核酸は
、配列番号１６のアミノ酸配列をコードする。
【００４３】 検出のために核酸プローブを必要に応じて標識できる。このプローブは、 Ren
illa GFP、特に Renilla mulleri をコードする核酸配列について少なくとも約
14、好ましくは少なくとも約 16、さらに好ましくは 20、30 またはそれ以上の 隣接ヌクレオチドを有する。好ましい実施態様において、Renilla GFP のための
核酸プローブを配列番号１５のヌクレオチド配列から選択する。
【００４４】 本発明は、Renilla などの種における GFP コード DNA の単離およびクローニ
ングのためのプローブの使用方法を提供する。好ましい実施態様において、核酸
プローブは、配列番号３の GFP の Renilla 種間の保存領域に基づく変性プロー
ブである。かかる変性プローブは、少なくとも 14 ヌクレオチド、好ましくは 1
6-30 ヌクレオチドを含み、配列番号１６のアミノ酸 51-68、82-98、198-208、 配列番号２４のアミノ酸配列、配列番号２５のアミノ酸 9-20、配列番号２７の アミノ酸 39-53 に基づく。他の好ましい実施態様において、上記の好ましいア ミノ酸領域をコードする核酸プローブを、配列番号１５のこれら領域をコードす
るヌクレオチド配列の中から選択する。あるいは、所望の領域をコードする核酸
、特に配列番号１５の核酸を、選択した Renilla 種のライブラリィの PCR 増幅
のプライマーとして用い得る。これにより Renilla GFP をコードする DNA を単
離する。
【００４５】 Ptilosarcus GFP をコードする核酸を配列番号３１および３２に表示する。コ
ード GFP を配列番号３２に表示する。本発明は、配列番号２８、３０、３１の ヌクレオチド配列に中程度または高度なストリジェンシイ条件でハイブリドする
核酸分子を提供する。
【００４６】 本発明は、Renilla または Ptilosarcus のGFP をコードする DNA 含有の発現
ベクターを提供する。特に、Renilla または Ptilosarcus のGFP をコードする
DNA 含有の発現ベクターは、Renilla または Ptilosarcus のGFP の構造的また は誘発的発現を可能にするプロモーター・エレメントと操作的に結合しているも
のである。天然のRenilla GFP を発現した。
【００４７】 ベクターは多様な宿主細胞で Renilla GFP を発現できる。本発明はまた、キ メラ Renilla GFP 融合タンパク質を提供する。このものは、プロモーター・エ レメントおよび複数のクローニング部位（Renilla GFP をコードする DNA の上 流または下流に位置する）を含有する。
【００４８】 本発明は、Ptilosarcus GFP、Renilla GFP、Renilla mulleri ルシフェラーゼ
、Gaussia ルシフェラーゼ、Pleuromamma ルシフェラーゼをコードする異型核酸
含有の組換え細胞も提供する。精製の Renilla mulleri GFP、Renilla reniform
is GFP ペプチド、および Renilla GFP および GFP ペプチドをこれらのみ、ま たは Renilla mulleri ルシフェラーゼなどの生物発光生成システムの少なくと も１つの成分と共に含有する組成物を提供する。Renilla GFP および GFP ペプ チドの組成物を、例えば、新規の物品の蛍光源を提供するのに使用でき、または
新形成組織などの組織の検出や視覚化の方法、均質免疫アッセイなどの免疫アッ
セイ、および多ウエルアッセイ機器でのインビトロ蛍光スクリーニングアッセイ
を用いる感染の検出方法に使用でき、または上記の方法のいずれかを実施するキ
ットにおいて提供する。特に、これらのタンパク質は、FP（蛍光極性化）アッセ
イ、FET（蛍光エネルギー移行）アッセイ、FRET（蛍光共鳴エネルギー移行）ア ッセイ、HTRF（均質時間分解蛍光）アッセイ、さらにBRETアッセイおよびセンサ
ーで使用できる。
【００４９】 FET、FRET、FP、HTRF アッセイなどの非放射性エネルギー移行反応は、供与発
光標識と受容標識との間に起きるエネルギー移行に基づく均質発光アッセイであ
る（参照、例えば、Cardullo et al. (1988) proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8
3: 8092-8096; 米国特許 4,777,128、米国特許 5,162,508、米国特許 4,927,923
米国特許 5,279,943、国際PCT出願 WO 92/01225)。GFPを使用する非放射性エネ ルギー移行反応は開発されている（参照、国際PCT出願 WO 98/02571 および W0
97/28261）。本発明は、ルシフェラーゼおよびその連結 GFP（またはその多量体
）などの GFP およびルシフェラーゼを融合タンパク質などで用いる非放射性エ ネルギー移行反応を意図する。
【００５０】 本発明は、本発明の核酸と実質的な同一性を有する核酸を意図する。これらの
核酸は、保存アミノ酸をコードするコドンでの置換によりつくられ、少なくとも
約 80%、好ましくは 90−95% の配列同一性を示す。配列同一性とは、製造業者 が提供するような、欠陥ギャップペナルティなどの欠陥を有する標準法を用いて
測定した同一性である。
【００５１】 この核酸は、ルシフェラーゼおよび GFP をつくる機会をもたらす。これはル シフェラーゼ/ルシフェリンおよび GFP が利用されるすべての分野において好都
合な適用がある。この核酸は、保存領域に対応する本明細書記載のプローブを使
用して、GFP および他、特に Renilla 種からの GFP をつくるのに用い得る（参
照、例えば、図３）。これらの GFP は、ルシフェラーゼ/ルシフェリンおよび G
FP が利用されるすべての分野において好都合な適用がある。例えば、GFP は、 生物発光生成システムのアウトプット信号を増幅する手段を提供する。Renilla
GFP は、青色光（および約 498nm )に信号励起吸収ピークおよび約 510nm (540
近辺の肩を有し）に顕著な単一放射ピークを有する。このスペクトルは、GFP が
青色光を吸収し、緑色光に効率的に変える手段を提供する。その結果、アウトプ
ットが増幅する。AequoreaやRenilla、Vargula(Cypridina)などの青色光を出す 生物発光生成システムと共に用いると、診断適用を含む適用のためのアウトプッ
ト信号が増幅される。さらに、この緑色光は、蛍光極性化アッセイ、FET（蛍光 エネルギー移行）アッセイ、FRET（蛍光共鳴エネルギー移行）アッセイ、HTRF（
均質時間分解蛍光）アッセイなどの蛍光によるアッセイにおいてエネルギー供与
体として働く。本発明は、BRET（エネルギーがルシフェラーゼの生物発光反応か
ら蛍光タンパク質に移行される生物発光共鳴エネルギー移行アッセイ）とよぶ特
定のアッセイを提供する。
【００５２】 FET、FRET、FP、HTRF アッセイなどの非放射性エネルギー移行反応は、供与発
光標識と受容標識との間に起きるエネルギー移行に基づく均質発光アッセイであ
る（参照、例えば、Cardullo et al. (1988) proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8
3: 8092-8096; 米国特許 4,777,128、米国特許 5,162,508、米国特許 4,927,923
米国特許 5,279,943、国際PCT出願 WO 92/01225)。GFPを使用する非放射性エネ ルギー移行反応は開発されている（参照、国際PCT出願 WO 98/02571 および W0
97/28261）。
【００５３】 本発明は、GFPの変異導入を含む。特に、赤色シフト励起および放射スペクト ルを有する修飾 GFP を起す変異導入を含む。得た系は、非変異導入形に比べて 高いアウトプットを有する。これらの GFP の選択は、変更スペクトルのある GF
P についてのランダム変異導入および選択、または GFP の発色団領域の選択的 変異導入によってできる。
【００５４】 本発明は、Renilla または Ptilosarcus のGFP をコードする異型核酸含有の 組換え宿主細胞を提供する。ある実施態様において、 Renilla または Ptilosar
cus のGFP をコードする異型 DNA 含有の組換え細胞は、Renilla または Ptilos
arcus のGFP をコードする DNA での遺伝子移入により、または Renilla または
Ptilosarcus のGFP をコードする DNA の RNA 転写体導入によりつくる。DNA は、直線 DNA 断片として導入でき、またはコード DNA の安定的または一時的な
発現のための発現ベクターに組み込むことができる。
【００５５】 ある実施態様において、細胞は、Renilla mulleri GFP または Ptilosarcus G
FP（特に、P.gurneyi 以外の種に由来） をコードし、組換えRenilla mulleri G
FP または Ptilosarcus ペプチドを発現する DNA または RNA を含有する。好ま
しくは、細胞の選択を、蛍光能を保持し、宿主に毒性のない機能的 GFP を発現 するように行う。ある実施態様において、細胞は、生物発光生成システムの成分
、好ましくはホトタンパク質やルシフェラーゼをコードする異型の核酸を含み得
る。 好ましい実施態様において、生物発光生成システム成分をコードする核酸は、Ae
quorea、Vargula、Pleuromamma、Ptilosarcusma または Renilla種 から単離す る。さらに好ましい実施態様において、生物発光生成システム成分は、配列番号
１８のアミノ酸配列を含む Renilla mulleri ルシフェラーゼ、配列番号１８の
Pleuromamma ルシフェラーゼ、配列番号１９の Gaussia ルシフェラーゼである 。
【００５６】 本発明の GFP は、適当な生物発光生成システムと組み合せて使用できる。好 ましい組合せは、Renilla または Aequorea、Pleuromamma または Gaussia のル
シフェラーゼとである。
【００５７】 本発明は、Renilla mulleri GFPまたはGFPタンパク質と、生物発光生成システ
ムの少なくとも１つの成分、好ましくはルシフェラーゼやルシフェリン、あるい
は発光素としてのルシフェラーゼおよびルシフェリンとを含有する組成物を提供
する。好ましい実施態様において、ルシフェラーゼ/ルシフェリン生物発光生成 システムは、次のような単離した系から選択する：すなわち、昆虫系、腔腸動物
系、クラゲ系、細菌系、軟体動物系、甲殻類動物系、魚類系、環形動物系および
ミミズ系である。生物発光生成システムは、Renilla、AequoreaおよびVargula、
GaussiaおよびPleuromammaからの単離した系を含む。
【００５８】 本発明は、Renilla mulleri GFPまたはPtilosarcus GFPあるいはそれらの混合
物を含有する第１組成物と、生物発光生成システムを含有する第２組成物を含み
、無生物による新規物品製造に使用される組成物の組合わせを提供する。これら
の新規物品は製品として、気晴らしやアミューズメント、娯楽用に設計され、限
定ではないが、次の物品を含む：玩具、特に水鉄砲、玩具のシガレット、玩具の
ハロウィーン卵、フットバッグ、ボード/カードゲーム；フィンガー・ペイント 、粘液性玩具；織物、特に衣類、例えば、シャツ、帽子、スポーツ用衣服、糸、
織糸；泡を作る玩具における泡、泡をつくる玩具、風船；小像；人体用の物品、
例えば、化粧品、浴槽用粉末、ボディ用のローション、ゲル、パウダーおよびク
リーム、爪光沢剤、メークアップ剤、歯磨き用の歯科用剤、石鹸、化粧品、ボデ
ィペイント、泡沫浴剤および合成泡沫浴剤、特に、アルブミンその他の無毒性タ
ンパク質を原料とする泡沫浴剤；釣り具用のルアー、特に、これらはの製品は、
蛍光タンパク質および/または生物発光生成システム組成物含有のポリアクリル アミド架橋結合体が使用され、水中で発光する；インクや紙などの物品；ゼラチ
ン、アイシング、フロスティングなどの食品；ルシフェリンおよびトランスジェ
ニック魚を含む釣りエサ、特に、ルシフェラーゼを発現するトランスジェニック
魚、ルシフェリンまたはルシフェラーゼを含有する植物食品、特に、ルシフェラ
ーゼを発現するトランスジェニック植物を用いるルシフェラーゼ；飲み物、例え
ば、ビール、ぶどう酒、シャンペン、ソフトド連結、アイスキューブおよび立体
状などの形態のアイス；噴出物、例えば、液体花火、ジェット、スプレー、エア
ゾルなどの組成物(これらは溶液、混合液、懸濁液、粉末、パスタ、粒状物など の適当な形態を呈する)。
【００５９】 本発明で提供され、それでもって娯楽や気晴らしおよび/またはアミューズメ ントを提供する生物発光生成システムと組合わされる製造品には、ロゴや商標と
結びつけた宣伝用物品および/または宣伝行為などのリクレーションやアトラク ション用に使用するものがある。それらの用途は、通常の用途に対して追加的、
関連的、あるいは代替的使用といえる。組合わせの結果、物品は、例えば、水鉄
砲や噴出物のように、液体や粒状物の輝く流出物またはスプレーを作り出す。
【００６０】 本発明は、本発明が提供するRenilla mulleri GFPおよび/またはRenilla mull
eriルシフェラーゼ含有組成物、あるいはその他のルシフェラーゼおよび/または
GFP含有組成物を使用して、組織をインビボまたはインシトゥで検出や視覚化す る方法を提供する。例えば、インシトゥ組織視覚化にあたって、生物発光に依存
する検出方法系に関連して、Renilla mulleri GFPタンパク質を使用できる。こ の方法系は、例えば非侵襲および侵襲工程において、腫瘍性組織および特殊組織
の視覚化や検出のために特に有用である。この方法系には、標的物に結合した組
織特異的、殊に腫瘍特異的標的剤、Renilla mulleri GFP、ルシフェラーゼまた はルシフェリンを含む共役体含有の組成物が含まれる。この方法系にはまた、生
物発光生成反応物の残余成分および/またはRenilla mulleri GFPを含有する第２
組成物も含まれる。ある実施態様において、活性物は別にして、すべての成分が
単一の組成物に含まれる。これらの成分は、インシトゥで提供されるか、あるい
は身体または組織に存在する。
【００６１】 本発明は、Gaussiaルシフェラーゼ含有組成物を使用して、組織をインビボま たはインシトゥで検出や視覚化する方法を提供する。例えば、インシトゥ組織視
覚化にあたって、生物発光に依存する検出方法系に関連して、Gaussiaルシフェ ラーゼまたはGaussiaルシフェラーゼ・ペプチドを使用できる。この方法系は、 例えば非侵襲および侵襲工程において、腫瘍性組織や特殊組織の視覚化および検
出のために特に有用である。この方法系には、標的物と結合した組織特異的、殊
に腫瘍特異的標的剤、Gaussiaルシフェラーゼ、GFPまたはルシフェリンが含まれ
る。この方法系にはまた、生物発光生成反応物および/またはGaussiaルシフェラ
ーゼの残余成分含有の第２組成物も含まれる。ある実施態様において、活性物は
別にして、すべての成分が単一の組成物に含まれる。これらの成分は、インシト
ゥで提供されるか、あるいは身体または組織に存在する。
【００６２】 本検出方法系は、とりわけ２つの組成物を含む。本発明は、好ましい実施態様
において、生物発光生成反応成分、ルシフェラーゼまたはルシフェリン、好まし
くはルシフェラーゼと共役する腫瘍抗原に対する抗体を含む第１組成物を提供す
る。ある実施態様において、腫瘍特異的標的剤を含有する共役体は、ルシフェラ
ーゼまたはルシフェリンと連結している。別の実施態様において、腫瘍特異的標
的剤は、好ましくは２以上の生物発光生成システム組成物、好ましくは２以上の
ルシフェラーゼ分子と結合したマイクロ運搬体と連結している。
【００６３】 第２の組成物は、典型的には、ルシフェリンまたはルシフェラーゼの基質であ
る生物発光生成システムの残余成分を含む。ある実施態様において、それらの成
分、特にルシフェリンは、血清アルブミンなどの運搬体タンパク質と連結する。
運搬体および時間的放射剤形によって、全身的に投与された成分が、ルシフェリ
ンまたはルシフェラーゼを不活性化するヘモグロビンのような血液細胞成分に妨
げられずに、標的組織に到達し得る。
【００６４】 本発明は、チップ法(参照、例えば、継続中の米国特許出願 No.08/990,103)に
よって、ルシフェラーゼ/ルシフェリン生物発光生成システムおよびRenilla mul
leriまたはPtilosarcus GFPを使用した疾患の診断、特に感染症の診断方法を提 供する。とりわけ、このチップは、生物発光生成システムが放射する光子を検出
する統合的光検出器を含み、特に、本発明の核酸がコードするルシフェラーゼお
よび/またはRenilla mulleriまたはPtilosarcus GFPを使用する。
【００６５】 １つの実施態様において、このチップは、X-Yアレイのようなアレイを有する 光検出器の統合的循環を使用してつくる。この循環の表面を処理して、例えば、
抗体のような連結分子の誘導化によって、意図したチップについての診断アッセ
イの状態に対し表面が不活性化であるようにする。細菌抗原に特異的な抗体のよ
うな選択抗体または抗体パネルを、光検出器ごとの上にあるチップの表面に添付
する。そのチップを、サンプルと接触させた後に、RenillaまたはPluromamm GFP
と連結した第２抗体、キメラ抗体−Renilla GFP融合タンパク質、あるいはルシ フェラーゼまたはルシフェリンのような生物発光生成システム成分と連結した抗
体と接触させる。これらのものは抗原に特異的である。生物発光生成反応の残余
成分を加え、生物発光生成システムの成分と連結した抗体がチップ上にあれば、
光が発生し、させ、光検出器で探知される。光検出器をコンピューターに操作的
に繋げ、連結抗体を同定する情報をプログラム化し、事象を記録し、それによっ
てサンプル中に存在する抗原を同定する。
【００６６】 本発明は、キメラ GFP融合タンパク質生成の方法を提供する。その方法には、
所望の遺伝子またはその一部分をコードするDNAを、それと同一の翻訳解読枠に おける GFPコード領域をコードする DNAに連結することが含まれる。所望のコー
ド領域は、GFPのアミノ末端またはカルボキシル末端と枠内で連結する。次いで 、キメラ・タンパク質をコードする DNAを、適当な発現ベクターのプロモーター
・エレメントと操作的連結で結合させる。あるいは、プロモーター・エレメント
を、所望の標的遺伝子、およびキメラ GFPタンパク質をつくるGFPコード配列の 上流と連結したプロモーター含有断片から直接的に得ることができる。
【００６７】 本発明は、所望の遺伝子のプロモーター・エレメントの制御の下にGFPコード の異種DNAを発現する遺伝子組換え細胞を使用して、化合物の同定方法を提供す る。遺伝子組換え細胞は、GFP媒介の蛍光度を測定することによって、所望のプ ロモーターからの転写体のレベルを調節する新規の化合物またはリガンドを同定
するために使用できる。キメラRenilla または Ptilosarcus GFPを発現する遺伝
子組換え細胞は、また、遺伝子組換え細胞の内での GFP媒介蛍光の局所化領域の
同定によって、遺伝子発現あるいはタンパク質交換のモニターのために、または
、標的タンパク質の細胞内局在化の化決定のために使用し得る。
【００６８】 本発明は、GFPおよび/またはルシフェラーゼを使用した別のアッセイを意図す
。Aequora GFPおよび/またはルシフェラーゼを採用して当業者に使用される既知
のすべてのアッセイまたは診断方法も意図する。
【００６９】 本発明は、本明細書中で記述している方法も含む方法で使用されるGFP含有す るキットを提供する。１つの実施態様において、製造品および生物発光を生成さ
せるような適当な媒介物を含むキットを提供する。本発明は、ルシフェラーゼ、
ルシフェリンおよびGFPを含む、好ましくは中程度のPh [5〜8]の生物発光生成物
を含有する石鹸組成物などを含有するキットを提供する。これらのキットは、例
えば、泡を吹いたり、泡を作り出す玩具に使用できる。これらのキットはまた、
詰換えあるいは交換用カートリッジを備え、食物といっしょに使用できる。
【００７０】 別の実施態様において、これらのキットは、腫瘍性組織およびその他の組織の
検定や視覚化に使用され、第１組成物として、GFPおよび生物発光生成システム の少なくとも１つの成分を有し、第２組成物として、生物発光生成システムの残
余成分および必要な活性化剤をすべて有する。
【００７１】 かくして、これらのキットは、典型的に２つの組成物を含む。すなわち、第１
組成物として、全身的投与(または、ある実施態様においては、局所的または皮 膚的適用)のための GFPを含み、第２組成物として、生物発光生成システムの成 分または残余成分を含み、適応にしたがって、全身的、局所的または皮膚的投与
に定式化される。投与に関する説明も含む。
【００７２】 別の実施態様において、このキットは、疾患特に感染疾患に関する病因の検出
および同定に使用され、複数のウエルを有する多ウエル・アッセイ機器を含む。
各ウエルは、１つ以上の感染物に特異的な抗体もしくは抗体パネルが付加された
総合光検出器、および感染物に特異的な抗体などの第２抗体を含有する組成物を
含む。この感染物は、Renilla mulleriまたはPtilosarcus GFP タンパク質、キ メラ抗体−Renilla mulleri(またはPtilosarcus)GFP融解タンパク質、または、F
(Ab)2抗体断片−Renilla mulleri GFP融解タンパク質に連結するものである。Re
nilla mulleriを励起するのにつき、RenillaまたはAequorea種のようなRenilla
mulleri GFPの励起範囲内において一定の波長の光を発する生物発光生成システ ムを含む第２組成物が、緑色光を発し、それを機器の光検出器が感知し、感染物
の存在を表す。
【００７３】 上述の通り、本発明は、本発明が提供するルシフェラーゼおよび/または GFP をコードする核酸と別のルシフェラーゼおよびGFPとの融合を提供する。Renilla
ルシフェラーゼおよびRenilla GFP(またはRenilla GFPのホモダイマーあるいは 別の複合体)のような一対のルシフェラーゼとGFPとをコードする融合が特に関心
をひく。ルシフェラーゼとGFPとは、結合して蛍光発光を生じる。その発光は、 ルシフェリンが存在する場合、GFPの存在しない場合のルシフェラーゼと比較し て、赤方偏移する。これらの核融合は、GFPおよびルシフェラーゼがペプチドな どの標的によって連結されており、リンカーとの相互作用のすべてを検査する手
段として使用できる。
【００７４】 本発明は、GFPおよびルシフェラーゼのムテインを提供する。特に関心をひく のは、感熱ムテインのようなGFPおよびルシフェラーゼのムテインで、例えば、R
enilla ルシフェラーゼおよびRenilla GFPにおける変異が臨界温度で相互作用の
変異を示すようなムテインである。
【００７５】 本発明は、本発明が提供する核酸でコードされたタンパク質のすべてと特異的
に結合する抗体、ポリクローナルおよびモノクローナルの抗体も提供する。これ
らのポリクローナルおよびモノクローナルの抗体は共に、当業者に既知の標準的
技法を採用して製造できる。本発明は特に、本発明が提供するルシフェラーゼま
たは GFPまたはそのエピトープ含有断片の実質的に純粋な製造物でもって免疫化
した動物の血清から得た免疫グロブリンまたは抗体を提供する。本発明はまた、
モノクローナル抗体も提供する。生成された免疫グロブリンは、それが有するい
ろいろな特性のなかで、GFPまたはルシフェラーゼ、特にRenilla またはPtsiloc
arpus のGFPまたは Pleuromamma、GaussiaまたはRenilla mulleriのルシフェラ ーゼと特異的または優先的に結合し、および／またはの免疫沈降反応を起す効力
を有する。この免疫沈降反応物は生物学的サンプルまたはそのような生物学的サ
ンプル由来の溶液中に存在し得る。
【００７６】 （発明の詳細） 成分に関する表 Ａ.定義 Ｂ．生物発光発生系 １．例示的な生物発光発生系 ａ．一般的説明 １）ルシフェラーゼ ２）ルシフェリン ３）活性化物質 ４）反応 ｂ.有櫛動物系 １）エクオリン a）エクオリンおよび関連の生物発光タンパク質 b）ルシフェリン ２）Renilla系 ｃ．甲殻類、特にCypidina系 １）Vargula ルシフェラーゼ a）Cypidinaからの精製 b）組換え方法による調製 ２）Vargula ルシフェリン ３）反応 ｄ．ホタル、コメツキムシおよび他の昆虫系を含む昆虫の生物発光系 １）ルシフェラーゼ ２）ルシフェリン ３）反応 ｅ．微生物系 １)ルシフェラーゼ ２)ルシフェリン ３)反応 ｆ．他の系 １）渦鞭毛虫生物発光を生じる系 ２）軟体動物類、例えばLatiasおよびニオガイ ３）ミミズおよび他の環形動物 ４）ツチボタル ５）海洋性多毛類蠕虫類（Marine polycheate worm）系 ６）南アメリカのレイル・ウェイ・ビートル（railway beetle） ７）魚 ｇ．蛍光性タンパク質 １）緑および青色蛍光性タンパク質 ２）フィコビリンタンパク質
【００７７】 Ｃ．ルシフェラーゼをコードする核酸の単離および同定 Gaussia ルシフェラーゼをコードする核酸の単離および同定 １．Gaussia属の試料の単離 ２．Gaussia cDNA発現ライブラリーの調製 ３．Gaussia ルシフェラーゼをコードするDNAの単離および同定 Renilla タンパク質をコードする核酸の単離および同定 １．Renilla属の試料の単離 ２．Renilla cDNA発現ライブラリーの調製 a）RNAの単離およびcDNA合成 b）cDNA発現ライブラリーの構築 ３．Renilla GFPをコードするDNAの単離および同定 ４．Renilla ルシフェラーゼをコードするDNAの単離および同定
【００７８】 Ｄ．別の種からルシフェラーゼおよびGFPをコードする核酸の単離およびクロ ーニングするための核酸プロ−ブおよび方法 Gaussia Renillaの別の種からのGFPをコードする核酸の単離およびクローニングするた
めの核酸プロ−ブおよび方法 他の種
【００７９】 Ｅ．タンパク質の組換体の発現 Gaussia １．Gaussiata タンパク質をコードするDNA ２．Gaussiata タンパク質組換体を製造するためのDNA構築物 ３．Gaussiata タンパク質組換体を製造するための宿主生物体 ４．Gaussiata タンパク質組換体を製造するための方法 Renilla １．Renilla タンパク質をコードするDNA ２．Renilla タンパク質組換体を製造するためのDNA構築物 ３．Renilla タンパク質組換体を製造するための宿主生物体 ４．Renilla タンパク質組換体を製造するための方法
【００８０】 Ｆ．ルシフェラーゼおよびGFPをコードする異型核酸を発現する組換え細胞 Gaussia Renlliano緑色蛍光タンパク質および／またはルシフェラーゼおよびGFPをコー
ドする異型核酸を発現する組換え細胞 Ｇ．ルシフェラーゼ Ｈ．RenillaおよびPtilosarcus GFP
【００８１】 Ｉ．組成物 １．Gaussiaルシフェラーゼ組成物 ２．Renllianoルシフェラーゼ組成物 ３．RenllianoGFP組成物 ４．接合体 ａ）リンカー ｂ）標的剤 抗腫瘍抗原抗体 接合体の調製 ５．以下において使用するための組成物の調製 ａ．第一組成物：接合（共役）診断系の調製 ｂ．第二組成物 ｃ．標的剤との組合せにおける反応の実施 Ｊ．組成物 Ｋ．使用方法 １．新生物および他の組織の診断方法 ２．疾病を診断するための方法 ３．キメラRenillaまたはPtilosarcus ＧＦＰ、Renilla mulleriルシ
フェラーゼ、PleuromammaルシフェラーゼおよびGaussiaルシフェラーゼ融合タン
パク質を発生させる方法 ４．化合物を確認する細胞基準アッセイ
【００８２】 Ｌ． キット １．ＧＦＰおよび生物発光システム成分との結合体を調合し且つ包装
する装置 ２．カプセル、ペレット、リポソーム、エンドソーム、液胞、微小化
粒子 ａ．一般的カプセル充てん溶剤 ｂ．カプセル充てん溶剤−リポソーム ｃ．カプセル充てん溶剤−ゼラチンおよび高分子溶剤 ｄ．エンドソームおよび液胞 ｅ．微小化粒子 ３．固定化システム ａ．マトリックス材料 ｂ．固定化および活性化
【００８３】 Ｍ．生物発光共鳴エネルギー移動(ＢＲＥＴ: Bioluminescence Resonance Energ
y Transfer)システム
【００８４】 Ｎ．実施例
【００８５】 Ａ．定義 特記しない限り、ここで用いる全ての専門的および科学的用語はこの発明の属
する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。ここで参
照される全ての特許および刊行物はそのままで参照文献により組み入れられてい
る。
【００８６】 ここで用いる限りでは、化学発光とは、エネルギーを分子に特異的に運んで電
気的に励起させ続いて光子を放射することにより可視光線を放射するところの化
学反応をいう。温度はここで運ばれるエネルギーには寄与しない。よって、化学
発光は化学エネルギーの光エネルギーへの直接変換を伴う。
【００８７】 ここで用いる限りでは、発光(ルミネセンス)とは、検出可能なＥＭ放射線、一
般的には、高エネルギー化学過程の励起生成物が光の放射を伴って基底状態に戻
るときに生成する紫外、赤外、可視のＥＭ放射線をいう。化学発光は化学反応に
起因する発光である。生物発光は、生物分子[またはその合成物または類似体]を
基質および／または酵素として用いる化学反応に起因する化学発光である。
【００８８】 ここで用いる限りでは、化学発光の一つのタイプである生物発光は生物分子、
特にタンパク質による光の放射をいう。生物発光の必須条件は、基質であるルシ
フェリンに作用するところのオキシゲナーゼであるルシフェラーゼの存在下で結
合または遊離している分子状酸素である。生物発光は、分子状酸素の存在下で基
質ルシフェリン[生物発光基質]に作用し、そして、その基質を励起状態に転換し
、それがより低いエネルギーレベルに戻る際に光の形でエネルギーを放出するオ
キシゲナーゼであるところの酵素または他のタンパク質(ルシフェラーゼ)により
発生される。
【００８９】 ここで用いる限りでは、生物発光を生成する基質および酵素とは、各々、ルシ
フェリンおよびルシフェラーゼを一般名的にいう。それらの特定の種をいうとき
には、明確にするために、それが取り出される生物体の名称に一般名用語を付け
て、例えば、細菌ルシフェリンまたはホタルルシフェラーゼのように、用いる。
【００９０】 ここで用いる限りでは、ルシフェラーゼとは、光放射反応を触媒するオキシゲ
ナーゼをいう。例えば、細菌ルシフェラーゼは、光を生成する反応であるところ
のフラビンモノヌクレオシド[ＦＭＮ]および脂肪族アルデヒドの酸化反応を触媒
する。海の節足動物中に見出される一つのクラスのルシフェラーゼはCypridina
[Vargula]ルシフェリンの酸化反応を触媒し、そしてもう一つのクラスのルシフ ェラーゼはColeopteraルシフェリンの酸化反応を触媒する。
【００９１】 よって、ルシフェラーゼとは、生物発光反応[生物発光を生成する反応]を触媒
する酵素または光タンパク質をいう。ホタルおよびGaussiaおよびRenillaルシフ
ェラーゼのようなルシフェラーゼは、触媒的に作用して生物発光発生反応の間に
は変化しない。ルシフェリンが非共有的に結合しているエクオリン光タンパク質
のようなルシフェラーゼ光タンパク質は、例えばルシフェリンの放出により、生
物発光発生反応の間に変化する。ルシフェラーゼは、生物体またはその変異体ま
たは突然変異体、例えば、突然変異誘導により生成し、天然に存在するタンパク
質と異なる耐熱性のような性質を一つまたはそれ以上有する変異体中で天然に存
在するタンパク質である。ルシフェラーゼおよびその修飾された突然変異体また
は変異体形はよく知られている。ここでの目的のために、ルシフェラーゼという
ときには、光タンパク質またはルシフェラーゼをいう。
【００９２】 よって、例えば、“Gaussiaルシフェラーゼ”というのは、Gaussia属のメンバ
ーから単離される酵素または他の関連するとう脚類のような他の起源から得られ
るかまたは合成的に作成される同等の分子を意味する。これは、活性を実質的に
変えない伝統的なアミノ酸置換を持つGaussiaルシフェラーゼを包括することを 意図している。適切な伝統的なアミノ酸置換は当業者に公知であり、且つ、得ら
れる分子の生物活性を変えることなく一般的に作成できる。当業者は、一般的に
は、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は生物活性を実質的
に変えないことを認識している(例えば、Watson et al. Molecular Biology of
the Gene, 4th Edition, 1987, The Bejacmin/Cummings Pub. Co., p. 224を参 照)。
【００９３】 “Renilla ＧＦＰ”とは、Renilla属およびそれの突然変異体または変異体か らのＧＦＰを意味する。これは、活性を実質的に変えない伝統的なアミノ酸置換
を持つRenilla ＧＦＰを包括することを意図している。
【００９４】 そのような置換は下記の表１に表記する置換に従って行うのが好ましい。
【表１】 表１ 他の置換もまた許容され経験的にまたは公知の伝統的置換に従って決定され 得る。
【００９５】 ルシフェラーゼおよびルシフェリン並びにそれらのアクチベーターとは、生物
発光を発生させる試薬または成分をいう。典型的には、これらの試薬の一部の組
が供給されるかまたは製造用品と結合されるであろう。この結合物に残りの試薬
を接触させると生物発光が生成されるであろう。よって、ここで用いる限りでは
、成分のルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびＯ2、Ｍｇ2+、Ｃａ2+の如き他の 因子は、また生物発光を発生させる試薬[または試剤または成分]という。
【００９６】 ここで用いる限りでは、生物発光基質とは、ルシフェラーゼおよびどれか必要
なアクチベーターの存在下に酸化されて光を発生する化合物をいう。これらの基
質は、ここではルシフェリンといい、生物発光反応において酸化を受ける基質で
ある。これらの生物発光基質は、いろんなルシフェリンまたはその類似体若しく
はルシフェラーゼがそれと相互に作用して光を発生するいろんな合成化合物を含
む。好ましい基質は、光発生反応においてルシフェラーゼまたはタンパク質の存
在下に酸化されるものである。生物発光基質は、よって、当業者がルシフェリン
と認める化合物を含む。ルシフェリンは、例えば、ホタルルシフェリン、Cyprid
ina[Vargulaとしても知られている]ルシフェリン[コエレンテラジン(coelentera
zine)]、細菌ルシフェリン並びにこれらの基質の類似体または生物発光を生成す
る反応においてルシフェラーゼの存在下に酸化される他の化合物を含む。
【００９７】 ここで用いる限りでは、生物発光基質に変換し得るとは、生物発光基質を生成
する、酸化または還元の如き、化学反応を受けやすいことを意味する。例えば、
生物発光細菌の発光生成反応は、フラビンモノヌクレオシド基[ＦＭＮ]をフラビ
ンレダクターゼ酵素により還元されたフラビンモノヌクレオシド[ＦＭＮＨ2]に する還元を伴う。この還元されたフラビンモノヌクレオシド[基質]はそれから酸
素[アクチベーター]および細菌ルシフェラーゼと反応して中間体の過酸化フラビ
ンを生成し、これは長鎖アルデヒドの存在下にさらに反応を受けて光を発生する
。この反応に関しては、還元されたフラビンおよび長鎖アルデヒドが基質である
。
【００９８】 ここで用いる限りでは、生物発光発生システムとは、生物発光反応を行うため
に必要な一組の試薬をいう。よって、特異的なルシフェラーゼ、ルシフェリンお
よび他の基質、溶媒および生物発光反応を終了させるために必要となるかも知れ
ない他の試薬が生物発光システムを形成する。よって、生物発光発生システムと
は、適当な反応条件下において、生物発光をもたらす試薬の一つの組をいう。適
当な反応条件とは、ｐＨ、塩濃度および温度の如く、生物発光反応を起すのに必
要な条件をいう。一般的には、生物発光システムは、生物発光基質、ルシフェリ
ン、酵素ルシフェラーゼおよび光タンパク質を含むルシフェラーゼ、並びに一つ
またはそれ以上のアクチベーターを含む。特異的生物発光システムは、それから
ルシフェラーゼが取り出される特異的生物体を参照することにより確認されるで
あろう；例えば、Vargula[Cypridinaとも呼ぶ] 生物発光システム(またはVargul
aシステム)は、貝虫類のVargulaから単離されるかまたはこれらのルシフェラー ゼから組替え手段や修飾を用いて製造するルシフェラーゼの如きVargulaルシフ ェラーゼを含む。このシステムはまた、酸素の如く生物発光反応を終了させるの
に必要な特異的アクチベーターおよびルシフェラーゼが酸素の存在下にこれと反
応して光を生成する基質も含むであろう。
【００９９】 ここで供給されるルシフェラーゼは、生物発光発生システムに取り入れられて
、そして、ここで供給されるＧＦＰまたは他のＧＦＰと共に適宜使用し得る。同
様に、ここで供給されるＧＦＰは公知の生物発光発生システムと共に使用し得る
。
【０１００】 ここで用いる限りでは、ここで現れる種々のアミノ酸配列で出現するアミノ酸
は、よく知られた三文字または一文字の略字に従って確認される。種々のＤＮＡ
断片に出現するヌクレオチドは、この技術分野で日常的に用いられる標準的な単
一の文字名称をもって命名される。
【０１０１】 ここで用いる限りでは、蛍光タンパク質とは、蛍光を放つ能力を有する (例え
ば、一つの波長でエネルギーを吸収し、他の波長でエネルギーを放出する) タン
パク質をいう。これらのタンパク質は、蛍光ラベルまたはマーカーとして用いる
ことができるが更に、このようなラベルが用いる幾らかの応用、例えば、イムノ
アッセイ、ＣＲＥＴ、ＦＲＥＴおよびＦＥＴアッセイに、且つ、ここでＢＲＥＴ
アッセイと名付けているアッセイに用いることができる。例えば、緑色蛍光タン
パク質とは、約５１０ｎｍで発光スペクトルのピークを持つポリペプチドをいう
。
【０１０２】 ここで用いる限りでは、この用語ＢＲＥＴ(Bioluminescence Resonance Energ
y Transfer)とは、非放射性のルシフェラーゼからＦＴへのエネルギー移動をい う。これは蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer)
とは異なり、後者は歴史的に化学蛍光体間のエネルギー移動に用いられたが最近
ではAequorea ＧＦＰスペクトル変異体間のエネルギー移動に応用されている。
【０１０３】 ここで用いる限りでは、ＢＲＥＴシステムとは、共鳴エネルギー移動のための
ＦＰとルシフェラーゼとの結合体をいい、そして、ＢＲＥＴとは、そこでルシフ
ェラーゼがそのとき非放射性的にＦＰへと変換するルシフェリンと反応して光を
発生するのに用いられるところの方法をいう。このエネルギーはＦＰ，特にＧＦ
Ｐ，に移動し、これはエネルギーを集中させシフトさせて、別の波長でそれを放
出する。好ましい形態においては、ＢＲＥＴシステムは、生物発光発生システム
およびこのシステムでルシフェラーゼと同じ起源からのＧＦＰを含む。好ましい
一対はRenillaルシフェラーゼとRenilla ＧＦＰであり、これらは特異的に相互 に作用する。結合における変更は、ルシフェラーゼにより生成する光の発光スペ
クトルの変化に反映されるであろう。その結果、この一対は外部イベントのセン
サーとして機能する。
【０１０４】 ここで用いる限りでは、バイオセンサー(またはセンサー)とは、ＢＲＥＴシス
テムを用いるインビトロまたはインビボの環境における変化を検出するために使
用するＢＲＥＴシステムをいう。
【０１０５】 ここで用いる限りでは、“厳格には触媒的でなく”とは、光タンパク質は触媒
として作用して基質の酸化を促進するが、この反応中に結合した基質は酸化され
、結合した分子状酸素は使われるために、このタンパク質が反応で変化すること
を意味する。このような光タンパク質は、当業者に公知の適当な条件下で基質お
よび分子状酸素の添加により再生される。
【０１０６】 ここで用いる限りでは、核酸プローブは、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり
、これは配列番号、特に、配列番号１５、１９、２１、２８，３０、３１のどれ
かに表示されている１４またはそれ以上の連続した塩基(またはその補体)と同じ
であるところの少なくとも１４の連続した塩基、好ましくは少なくとも１６の連
続した塩基、典型的には約３０、を含むヌクレオチド配列並びに配列番号２３−
２７のどれかをコードする核酸を有する。それからプローブを構築する好ましい
領域は、５’および／または３’コーディング配列を含み、これらの配列はReni
lla属の中で保存されている領域をコード化すると予測されるものである。Renil
la属ＧＦＰの中で保存されている領域からのプローブは、Renillaライブラリー からの核酸をコード化するＧＦＰを単離するためにある。
【０１０７】 好ましい態様では、核酸プローブは少なくとも１４のヌクレオチド、好ましく
は１６から３０のヌクレオチドの縮重プローブであり、これらは、配列番号１６
に表示されているアミノ酸５１から６８，８２から９８および１９８から２０８
、配列番号２４に表示されているアミノ酸配列、配列番号２５に表示されている
アミノ酸９−２０および配列番号２７に表示されているアミノ酸３９−５３に基
づく。他の好ましい態様では、上述の好ましいアミノ酸領域をコード化する核酸
プローブは、配列番号１５に表示されているこれらの領域をコード化するヌクレ
オチド配列の中で選択される。
【０１０８】 好ましい態様では、核酸プローブは少なくとも１４のヌクレオチド、好ましく
は１６から３０のヌクレオチドの縮重プローブであり、これらは、配列番号２０
に表示されているアミノ酸に基づく。他の好ましい態様では、上述の好ましいア
ミノ酸領域をコード化する核酸プローブは、配列番号１９に表示されているこれ
らの領域をコード化するヌクレオチド配列の中で選択される。
【０１０９】 ここで用いる限りでは、ベクター(またはプラスミド)とは、異種のＤＮＡをそ
の発現または複製のどちらかのために細胞中に導入するために用いられる別個の
エレメントをいう。このような伝達体の選択と使用は専門家の技能に十分含まれ
る。発現ベクターは、プロモーター領域の如く、そのようなＤＮＡ断片を発現さ
せることが可能な制御配列と操作的に連結したＤＮＡを発現することが可能であ
るベクターを含む。よって、発現ベクターとは、プラスミド、ファージ、組替え
ビールスまたは他のベクターの如き組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物をいい、こ
れを適当な宿主細胞に導入するとクローン化したＤＮＡの発現をもたらす。適切
な発現ベクターは当業者によく知られており、真核細胞および／または原核細胞
中で複製可能であるものおよびエピソームを残すものまたは宿主細胞中に組込ま
れるものを含む。Gaussiaルシフェラーゼ、Renilla ＧＦＰおよびルシフェラー ゼの発現のために現在好ましいプラスミドは、細菌および酵母中で発現するここ
で記載されているようなものである。
【０１１０】 ここで用いる限りでは、プロモーター領域またはプロモーターエレメントとは
、それと操作的に連結されているＤＮＡまたはＲＮＡの転写を調節するＤＮＡま
たはＲＮＡのセグメントをいう。このプロモーター領域は、ＲＮＡ認識、結合お
よび転写開始に十分な特異的配列を含む。プロモーター領域のこの部分をプロモ
ーターという。更に、このプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結
合および転写開始のこの活性をモジュレートする配列を含む。これらの配列はシ
ス作用性であってもよくトランス作用性ファクターに反応的であってもよい。プ
ロモーターは、調節の本質次第で、構成的であっても調節されていてもよい。原
核生物で用いるように意図された代表的なプロモーターはバクテリオファージＴ
７およびＴ３プロモーター等を含む。
【０１１１】 ここで用いる限りでは、操作的に連結したまたは機能的に結合したとは、ＤＮ
Ａとプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳の停止部位、および他のシグ
ナル配列の如きヌクレオチドの調節およびエフェクター配列との機能的関係をい
う。例えば、ＤＮＡのプロモーターへの操作的に連結とは、ＤＮＡとプロモータ
ーの間の物理的および機能的関係をいうが、そこではＤＮＡのような転写は、Ｄ
ＮＡを特異的に認識し、結合しそして転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモ
ーターから開始される。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために
は、転写および翻訳のどちらかのレベルにおいて発現を邪魔するか減少させる可
能性のあるところの過剰な、潜在的な不適切な代わりの翻訳開始(例えば、出発)
コドンまたは他の配列を除去するために、５’未翻訳部分を取り除き、加えまた
は変化させることが必要になるかもしれない。その代わりに、共通のリボソーム
結合部位(例えば、Kozak (1991) J. Biol. Chem. 266: 19867-19870を参照)を出
発コドンの５’に直ぐ挿入し、発現を強化させることができる。そのような修飾
の望ましさ(必要性)は経験的に決定できる。
【０１１２】 ここで用いる限りでは、ルシフェラーゼのような目標試剤を目標に向けること
とは、その試剤をそのような試剤に結合させることにより選択した受容体または
他の細胞表面タンパク質を発現させる細胞に向けてそれを導くことを意味する。
受容体または細胞表面タンパク質への結合または相互作用で、目標試剤は適当な
基質および活性化試剤と反応することができるので、生物発光の光が生成しそし
て腫瘍性組織または細胞が非腫瘍性組織から区別される。
【０１１３】 ここで用いる限りでは、特定の病気を治療するための化合物の有効量は、その
病気に関連した症状を改善するかまたは何らかの方法で軽減させるのに十分な量
である。そのような量は、有効である限りにおいて、単回投与量として投与して
もよくまたは投薬計画に従って投与してもよい。その量は病気を治療するかもし
れないが、典型的には、その病気の症状を改善するために投与される。症状を望
みどおりに改善するためには繰り返し投与が必要になるかもしれない。
【０１１４】 ここで用いる限りでは、病気を診断するための複合体の有効量は検出可能な組
織に帰するであろう量である。この組織は、人間の眼よりも更に敏感な検出器か
らの助け無しかまたはどの蛍光性生成物も励起する光源を使用するかのどちらか
により視覚化させて検出する。
【０１１５】 ここで用いる限りでは、視覚化とは、正常な手術条件、必要により、特にやや
薄暗い光の下における手術の間に、眼により検出可能なことを意味する。
【０１１６】 ここで用いる限りでは、複合体の製薬的に許容される塩、エステルまたは他の
誘導体は、当業者がそのような誘導体化に公知の方法を用いて容易に作成するこ
とができるところの、そして実質的な毒性作用無しに動物または人間に投与し得
る化合物を製造するところの、且つ、どちらも製薬的に活性であるかまたは前駆
薬剤であるところの全ての塩、エステルまたは誘導体を含む。
【０１１７】 ここで用いる限りでは、治療とは、体調、機能障害または病気の症状を改善す
るかまたは、さもなければ、有益に変える方法を意味する。治療はここでの組成
物の製薬的使用もまた包括する。
【０１１８】 ここで用いる限りでは、特定の製薬的組成物の投与により特定の機能障害の症
状改善とは、その組成物の投与で寄与するか関与し得るところの、永久的または
一時的であっても、緩和し、継続しまたは一過性にすることをいう。
【０１１９】 ここで用いる限りでは、実質的に純粋とは、純度を評価するために当業者によ
り使用される薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、ゲル電気泳動および高速液体ク
ロマトマトグラフィー(ＨＰＬＣ)のような標準的分析方法によって測定するとき
に容易に検出可能な不純物が無いように見えるように十分均一であるか、若しく
は、その物質の酵素的および生物的活性の如き、物理的および化学的性質が更に
精製しても検出されるほどには変化しないように十分純粋であることを意味する
。実質的に化学的に純粋な化合物を製造するための化合物の精製方法は当業者に
公知である。実質的に化学的に純粋な化合物は、然しながら、立体異性体または
異性体の混合物であってもよい。そのような例においては、更に精製すると化合
物の比活性を増加させるかも知れない。
【０１２０】 ここで用いる限りでは、前駆薬剤は、インビボ投与において、この化合物の生
物的に、製薬的にまたは治療的に活性な形に代謝されるか、さもなければ、変換
されるところの化合物である。前駆薬剤を製造するためには、製薬的に活性な化
合物を修飾してその活性な化合物が代謝過程によって再生されるようにする。前
駆薬剤は、薬剤の代謝安定性または伝達特性を変えるように、副作用または毒性
をマスクするように、薬剤の匂いを改善するように、若しくは、薬剤の他の特性
または性質を変えるようにデザインしてもよい。インビボにおける薬動学的な過
程および薬剤代謝の知識のお陰で、当業者は、一旦製薬的に活性な化合物が公知
になると、その化合物の前駆薬剤をデザインすることができる(例えば、Nogrady
(1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Pr
ess, New York, pages 388-392を参照)。
【０１２１】 ここで用いる限りでは、生物活性とは、化合物のインビボ活性または化合物、
組成物または他の混合物のインビボ投与によってもたらされる生理的応答をいう
。生物活性は、よって、そんな化合物、組成物または混合物の治療効果および製
薬的活性を包括する。生物活性はそんな活性を試験するか使用するようにデザイ
ンしたインビボシステムにおいて観察できる。よって、ここでの目的のためには
、ルシフェラーゼの生物活性は、そのオキシゲナーゼ活性であり、これにより基
質を酸化すると光を生成する。
【０１２２】 ここで用いる限りでは、目標試剤とは、結合した目標試剤、ルシフェリンまた
はルシフェラーゼ、を腫瘍性の細胞または組織に向けて特異的にまたは優先的に
目標を定める試剤をいう。
【０１２３】 ここで用いる限りでは、腫瘍抗原とは、腫瘍細胞の表面に発現するか位置する
細胞表面タンパク質をいう。
【０１２４】 ここで用いる限りでは、腫瘍性の細胞とは、いろんな型の形質変換したまたは
変化した細胞を含むが、それは接触抑制の欠如および腫瘍特異的抗原の獲得など
の形質変換した細胞に典型的な特性を示す。そのような細胞は白血病の細胞また
は腫瘍に由来する細胞を含むがこれらに限定するものではない。
【０１２５】 ここで用いる限りでは、腫瘍性の病気は、腫瘍性の細胞がこの病気に悩まされ
ている個人に存在するところの病気である。このような病気はガンを特徴とする
あらゆる病気を含む。
【０１２６】 ここで用いる限りでは、転移性の腫瘍とは、一つの部位に局所化しない腫瘍を
いう。
【０１２７】 ここで用いる限りでは、特殊組織とは、場所に関する情報が望まれる非腫瘍性
の組織を言う。そんな組織は、例えば、子宮内膜組織、異所性妊娠、ある機能障
害に関与する組織および筋障害または病理を含む。
【０１２８】 ここで用いる限りでは、受容体とは、ある配位子に親和性を有する分子をいう
。受容体は天然に存在するかまたは合成の分子でもよい。受容体はこの技術分野
においては抗配位子としてもよい。ここで用いる限りでは、受容体および抗配位
子とは互換性がある。受容体は、そのままの状態または他の種類のものとの凝集
体として使用し得る。受容体は、直接的にまたは間接的に、特異的結合物質また
はリンカーを経由して、共有的にまたは非共有的に、若しくは物理的接触で、結
合メンバーに接着し得る。受容体の例として以下のものを含むが、これらに限定
するものではない：抗体、細胞膜受容体、表面受容体および内在化受容体、特異
的抗原決定因子[例えば、ビールス、細胞または他の物質上での]と反応性のモノ
クローナル抗体および抗血清、薬剤、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因
子、レクチン、糖、多糖、細胞、細胞膜および細胞小器官。
【０１２９】 受容体およびそのような受容体を使用する適用の例として以下のものを含むが
、これらに限定するものではない： ａ)酵素：微生物の生存に必須な特異的輸送タンパク質または酵素で、これら は輸送抗生物質[リガンド]選択用の目標として役立つことができよう； ｂ)抗体：関心のある抗原のエピトープに結合する抗体分子上におけるリガン ド結合部位の確認が調査できる；抗原性エピトープを模擬する配列の決定は、そ
の免疫原が一つまたはそれ以上のそんな配列に基づくワクチンの開発に至るか、
若しくは、自己免疫病に対するような治療で有用な関連の診断薬または化合物の
開発に至るであろう； ｃ)核酸：タンパク質またはＲＮＡのようなリガンドの結合部位の確認； ｄ)触媒性ポリペプチド：高分子、好ましくはポリペプチドで、これらは一つ またはそれ以上の反応物の一つまたはそれ以上の生成物への変換を伴う化学反応
を促進することを可能にする；そのようなポリペプチドは、少なくとも一つの反
応物または反応中間体に対して特異的な結合部位並びに機能が結合した反応物を
化学的に修飾することを可能にする結合部位に隣接した活性機能を一般的に含む
(例えば、米国特許番号5,215,899を参照)； ｅ)ホルモン受容体：高い親和性で受容体に結合するリガンドの決定はホルモ ン補充療法の開発に有用である；例えば、そのような受容体に結合するリガンド
の確認は血圧を調節する薬剤の開発に至るであろう；並びに ｆ)オピエート受容体：脳中でオピエート受容体に結合するリガンドの決定は モルヒネおよび関連薬に対する低中毒性の置換薬の開発に有用である。
【０１３０】 ここで用いる限りでは、抗体はＦａｂ断片のような抗体断片を含み、それらは
軽鎖および重鎖の可変領域から成っている。
【０１３１】 ここで用いる限りでは、抗体複合体とは、目標試剤が抗体であるところの複合
体をいう。
【０１３２】 ここで用いる限りでは、抗体活性化とは活性化された抗体が生産される過程を
いう。抗体は、異質二元機能性試薬のようなリンカーと反応して活性化される。
【０１３３】 ここで用いる限りでは、外科的対面とは、動物の体内で開腹を行う操作を言う
。そのような操作は、腹腔鏡検査法および関節鏡検査操作等の慣習的な手術およ
び診断的操作を含む。
【０１３４】 ここで用いる限りでは、人間化抗体とは、人間への投与が免疫反応を引き起こ
さないように、アミノ酸の“人間”配列を含むように修飾した抗体をいう。その
ような抗体の調製方法は公知である。例えば、モノクローナル抗体を発現するハ
イブリドーマは、非可変領域のアミノ酸構成が人間の抗体に基づくところの抗体
を発現するように組換えＤＮＡ技術によって変えられる。そのような領域を確認
するコンピュータープログラムがデザインされている。
【０１３５】 ここで用いる限りでは、ＡＴＰ、ＡＭＰ、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＨとは、それ
ぞれ、アデノシン三リン酸、アデノシン一リン酸、ニコチンアミドアデニンヂヌ
クレオチド(酸化型)およびニコチンアミドアデニンヂヌクレオチド(還元型)をい
う。
【０１３６】 ここで用いる限りでは、組換えＤＮＡ方法を用いる組換え手段による生産とは
、クローン化したＤＮＡでコード化したタンパク質を発現するために分子生物学
のよく知られた方法を使用することを意味する。
【０１３７】 ここで用いる限りでは、生成物に実質的に同一とは、関心のある性質が十分に
未変化であるように十分類似していることをいい、そのために実質的に同一な生
成物はこの生成物の代わりに用いることができる。
【０１３８】 ここで用いる限りでは、核酸の二つの配列を言うとき、同等とは、問題の二つ
の配列がアミノ酸または同等なタンパク質の同じ配列をコード化することを意味
する。“同等”が二つのタンパク質またはペプチドを指して使われるときには、
これは、二つのタンパク質またはペプチドが、タンパク質またはペプチドの活性
および機能を実質的に変えない伝統的なアミノ酸置換[例えば、上の表１を参照]
だけを持つ実質的に同じアミノ酸配列を有することを意味する。“同等”が性質
をいうときには、その性質が同じ程度に存在することは必要ではないが[例えば 、二つのペプチドは同じタイプの酵素活性を異なる速度で表すことができる]、 その活性は好ましくは実質的に同一である。“相補的”とは、二つのヌクレオチ
ド配列を指すときには、ヌクレオチドの二つの配列が向かい合ったヌクレオチド
の間で、好ましくは２５％以下で、更に好ましくは１５％以下で、より更に好ま
しくは５％以下で、最も好ましくは何も無いミスマッチをもってハイブリッド形
成を可能にすることを意味する。好ましくは、二つの分子は高度な緊縮性の条件
下でハイブリッド形成するであろう。
【０１３９】 ここで用いる限りでは、ミスマッチの百分率を決める際のハイブリッド形成の
緊縮性は以下のようである： １)高度の緊縮性：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃ ２)中程度の緊縮性：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ ３)低度の緊縮性：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ 同等の緊縮性は代わりの緩衝剤、塩および温度を用いて実現され得ると理解され
る。
【０１４０】 “実質的に”同一または相同または同様の用語は、関連の当業者により理解さ
れる状況で変わり、一般的には、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０
％、更に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一
性を意味する。
【０１４１】 ここで用いる限りでは、組成物とはいろんな混合物をいう。溶液、懸濁液、液
体、粉末、ペースト、それらの水性、非水性またはいろんな組み合わせでもよい
。
【０１４２】 ここで用いる限りでは、結合体とは二つの間またはより多くの品目の間におけ
るいろんな結合をいう。
【０１４３】 ここで用いる限りでは、流体とは、流れることができるいろんな組成物をいう
。よって、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、
クリームおよび他のそんな組成物の形にある組成物を包括する。
【０１４４】 受容体およびそのような受容体を使用する適用の例として以下のものを含むが
、これらに限定するものではない： ａ)酵素：微生物の生存に必須な特異的輸送タンパク質または酵素で、これら は輸送抗生物質[リガンド]選択用の目標として役立つことができよう； ｂ)抗体：関心のある抗原性エピトープに結合する抗体分子上におけるリガン ド−結合部位の確認が調査できる；抗原のエピトープを模擬する配列の決定は、
その免疫原が一つまたはそれ以上のそんな配列に基づくワクチンの開発に至るか
、若しくは、自己免疫病に対するような治療で有用な関連の診断薬または化合物
の開発に至るであろう； ｃ)核酸：タンパク質またはＲＮＡのようなリガンドの結合部位の確認； ｄ)触媒性ポリペプチド：高分子、好ましくはポリペプチド、で、これらは一 つまたはそれ以上の反応物の一つまたはそれ以上の生成物への変換を伴う化学反
応を促進することを可能にする；そのようなポリペプチドは、少なくとも一つの
反応物または反応中間体に対して特異的な結合部位並びに機能が結合した反応物
を化学的に修飾することを可能にする結合部位に隣接した活性機能を一般的に含
む(例えば、米国特許番号5,215,899を参照)； ｅ)ホルモン受容体：高い親和性で受容体に結合するリガンドの決定はホルモ ン補充療法の開発に有用である；例えば、そのような受容体に結合するリガンド
の確認は血圧を調節する薬剤の開発に至るであろう；並びに ｆ)オピエート受容体：脳中でオピエート受容体に結合するリガンドの決定は モルヒネおよび関連薬に対する低中毒性の置換薬の開発に有用である。
【０１４５】 ここで用いる限りでは、相補的とは、トポロジー的適合性またはリガンド分子
および受容体の相互に作用する表面を一緒にマッチングすることをいう。よって
、受容体およびそのリガンドは相補的と記述することができ、更に、接触表面特
性はお互いに相補的である。
【０１４６】 ここで用いる限りでは、リガンド−受容体対または複合体は、二つの巨大分子
が分子認識を通じて結合して複合体を生成するときに形成される。
【０１４７】 ここで用いる限りでは、基質とは、化学合成、アッセイおよび他のそんな方法
のための固体担体として直接にまたは適切な誘導化の後で使用されるいろんなマ
トリックスをいう。ここでの好ましい基質は、シリコン基質またはシリコン化基
質であり、これらは、抗リガンドおよびリガンド並びに蛍光タンパク質、フィコ
ビリンタンパク質および他の放射シフターを含む他の巨大分子との連鎖を意図し
て表面上で誘導化される。
【０１４８】 ここで用いる限りでは、マトリックスとはいろんな固体または半固体または不
溶性担体を言い、その上で、関心のある分子、典型的には生物分子、巨大分子、
有機分子または生体特異的リガンドが連結または接触される。典型的には、マト
リックスは硬いかやや硬い表面を持つ基質材である。多くの態様において、基質
の少なくとも一つの表面は実質的に平らであろうが、或る態様においては、種々
の高分子に対する合成領域を、例えば、穴、浮き出し表面、エッチングした溝ま
たはその他の位相でもって物理的に分離することが望ましいかもしれない。マト
リックス材は、化学的および生物的分子の合成および分析のためのアフィニティ
ーマトリックスまたは担体を含み、下記に限定することなく例示される：ポリス
チレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ナイロン、ガラス、デキストラン
、キチン、砂、軽石、ポリテトラフルオロエチレン、アガロース、多糖、デント
リマー、バックボール、ポリアクリルアミド、珪藻土−ポリアクリルアミド非共
有性複合体、ポリスチレン−ポリアクリルアミド共有性複合体、ポリスチレン−
ＰＥＧ[ポリエチレングリコール]複合体、シリコン、ゴムおよび固相合成、アフ
ィニティー分離および精製、ハイブリッド形成反応、イムノアッセイおよび他の
そんな応用のための担体として使用されるその他の材料。
【０１４９】 ここで用いる限りでは、連結層とは、それに分子が連結されるチップ装置の表
面をいう。典型的には、このチップは半導体装置で、分子を連結するために適切
なようにその表面の少なくとも一部分が皮膜され、そして装置が曝されるどんな
反応にも不活性である。分子は直接的にまたは間接的に表面に連結されるが、共
有結合、イオン性相互作用またはどれかの他の相互作用による吸収または吸着に
よって連結を達成することができる。必要に応じて、この連結層は、例えば、分
子を連結させるための誘導化により改造される。
【０１５０】 Ｂ．生物発光発生システムおよび成分 生物発光発生システムおよびその成分の記述を以下に示す。これらのルシフェ
ラーゼおよびルシフェリンおよび蛍光タンパク質はここで供給されるルシフェラ
ーゼおよびＧＦＰと一緒に用いることができる。
【０１５１】 1．代表的な生物発光発生システム 生物発光発生システムとは生物発光を発生させるために必要で十分である成分を
いう。これらはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびいろんな必要な補因子また
は条件を含む。当業者に公知である実際上どんな生物発光システムでも、ここで
供給される装置、システム、結合体および方法において容易に使用できるであろ
う。生物発光発生システムを選択する際に考慮すべき要素は次のものを含むがこ
れらに限定されない：生物発光と組み合わせて使用する目標試剤；反応を行う培
地；温度またはｐＨ感受性のような成分の安定性；成分の有効期限；一定または
間欠的であれ、光放射の継続性；成分の入手の容易さ；要求される光強度；光の
色；および他のそのような要素。
【０１５２】 ａ．一般的記述 一般的には、生物発光とは、エネルギーを発生する化学反応をいい、ここでは特
異的化学基質であるルシフェリンが酵素であるルシフェラーゼを触媒とする酸化
反応を受ける。生物発光反応を維持するのは容易で、反応を継続しまたは回復す
るためには、消費したルシフェリンまたは他の基質または補因子または他のタン
パク質を補充することが単に必要である。生物発光発生反応は当業者によく知ら
れていて、どんなそのような反応もここに記述する製造物品と組み合わせて使用
し易くすることができる。
【０１５３】 生物発光発生システムの生物体および供給源は数多くあって、生物発光を現わす
幾らかの代表的な属および種を以下の表に表示する[部分的にHastings in (1995
) Cell Physiology: Source Book, N. Sperelakis (ed.). Academic Press, pp
665-681から転記]：
【表２】 表２ 代表的発光性生物体
【表３】
【表４】
【０１５４】 ここでの使用を意図する他の生物発光生物体はGonadostomias、Gaussia(とう 脚類)、Watensia、Halisturia、吸血イカ、Glyphus、ハダカイワシ(魚)、Vincig
uerria、Howella、Florenciella、Chaudiodus、Melanocostusおよびウミエラで ある。
【０１５５】 生物発光発生システムは上の表にあるものの如き天然起源から単離してもよくま
たは合成的に製造してもよいと理解される。これに加えて、ここで使用するため
には、これらの成分は、適当な反応条件下において、これらの混合物が外科的操
作の間に細胞および組織が目視できるように光を生成するに足るだけの純度であ
ればよい。
【０１５６】 よって、幾らかの態様においては、粗製のエキスまたは単に生物体をすり潰す
だけでも適切なこともあり得る。一般的には、しかし、実質的に純粋な成分が使
用される。又、成分は天然起源から単離されてはいない合成成分であってもよい
。ＤＮＡをコード化するルシフェラーゼが入手可能であり[例えば、配列番号１ −１３を参照]、且つ修飾されていて [例えば、配列番号３および１０−１３を 参照]、そして合成で代替の基質が創られている。ここでリストされたＤＮＡは 、入手可能なＤＮＡをコード化するルシフェラーゼを単に代表するにすぎない。
【０１５７】 表２やここの何処かに表示されまたは当業者に公知である生物発光発生システム
は、合成であれまたは天然起源からの単離であれ、ここで提供される結合体、シ
ステムおよび方法においての使用を意図している。オキシゲナーゼ[ルシフェラ ーゼ]に頼らない生物発光システムそれ自体はここでは包括されない。
【０１５８】 （１）ルシフェラーゼ 目標試剤はここではルシフェラーゼまたはルシフェリンを含む。ルシフェラー
ゼとは、必要なアクチベーターの存在下において、遊離のまたは結合した分子状
酸素の存在で、生物発光基質(ルシフェリン)を低エネルギー状態から高エネルギ
ー状態へ酸化する反応を触媒するいろんな化合物をいうが、それでその基質は、
低エネルギー状態に戻る際に光を放射する。ここでの目的には、ルシフェラーゼ
は、基質の酸化により光を発生させるために触媒的に作用するタンパク質、並び
に、厳密的には触媒的でないが[そのタンパク質が消費されるので]、分子状酸素
の存在で基質と連携して光を発生させるように作用する、エクオリンのような、
光タンパク質を包括するように広く使用される。エクオリンのような光タンパク
質を含むこれらのルシフェラーゼはここではルシフェラーゼの中に又含まれる。
これらの試薬に含まれるものは、天然に存在するルシフェラーゼ[光タンパク質 を含む]、組替えＤＮＡによって生産されるタンパク質、および、適当な基質、 補因子およびアクチベーターの存在下において光を発生する能力を保持するとこ
ろのそれらの突然変異化または修飾化された変異型、若しくは、基質を酸化する
ための触媒として作用して光を生成するようなその他のタンパク質である。
【０１５９】 一般名的には、生物発光反応を触媒するか開始するタンパク質はルシフェラー
ゼと言われ、且つ、酸化され得る基質はルシフェリンと言われる。酸化された反
応生成物はオキシルシフェリンと命名され、そして或るルシフェリンの前駆物質
はエチオルシフェリンと命名される。よって、ここでの目的のためには、生物発
光は、生体タンパク質または類似体、その誘導体または突然変異体によって触媒
されるか[酵素的に作用するルシフェラーゼの場合]若しくは開始される[反応で 再生されないエクオリンのような光タンパク質の場合]ところの反応により生成 される光を包括する。
【０１６０】 ここで明確にすると、触媒的タンパク質はルシフェラーゼと言われそして光を
放射してオキシルシフェリンを放出するルシフェリンの酸化を触媒するルシフェ
ラーゼのような酵素を含む。ルシフェラーゼの中に又含まれるのは光タンパク質
であり、これはルシフェリンを酸化して光を放射するが、反応中に変化し再び使
用するには再生しなければならない。ルシフェラーゼは天然に存在してもよく又
或る性質を改良したり変化させたりするために遺伝子工学等で修飾してもよい。
ここで得られる分子が生物発光反応を触媒する能力を保持する限り、それはここ
で包括される。
【０１６１】 ルシフェラーゼ活性を持ついろんなタンパク質[ここで定義するように、光を 生成するために分子状酸素の存在下に基質を酸化する反応を触媒するタンパク質
]をここでは使用できる。好ましいルシフェラーゼはここで記載されたものまた は軽度の配列変異型を有するものである。限定的ではないが、そのような軽度の
配列変異型に含まれるのは、軽度の対立遺伝子的または種の変異型および残基、
特にシステイン残基の挿入または欠失である。アミノ酸の適切な伝統的置換は当
業者に公知であり、又、ここで得られる分子の生物的活性を変えることなく一般
的に実施される。そのような置換は、好ましくは、上述の表１に表示されている
ものに従って行われる。
【０１６２】 ルシフェラーゼは商業的に得たり、天然起源から単離したり、ルシフェラーゼ
をコード化するＤＮＡを用いて宿主細胞中に発現させたりまたは当業者に公知の
いろんな様式で得たりすることができる。ここでの目的のためには、選択した起
源の生物体をすり潰して得られる粗エキスで十分である。大量のルシフェラーゼ
が望まれるので、宿主細胞からのルシフェラーゼの単離が好ましい。そのような
目的のためのＤＮＡはその修飾型として広く入手可能である。
【０１６３】 これらに限定するものではないが、ルシフェラーゼの実例にはctenophores（ 有櫛動物）である Mnemiopsis（ムネミオプシン）および Beroe ovata（ベロビ ン）から単離したもの、coelenterate（腔腸動物）である Aequorea（エクオリ ン）、Obelia（オベリン）、Pelagia から単離したもの、Renilla ルシフェラー
ゼ、mollusca（軟体動物）である Pholas（フォラシン）から単離したルシフェ ラーゼ、たとえば Aristostomias、Pachystomias、および Poricthys のような 魚類から単離したルシフェラーゼ、たとえば Cypridina（別名 Vargula）のよう
なostracod（貝虫類）から単離したルシフェラーゼも包含する。本発明で使用す
るために好適なルシフェラーゼはエクオリンタンパク質、Renilla ルシフェラー
ゼおよび Cypridina［別名Vargula］ルシフェラーゼである［たとえば配列番号 １、２および４〜１３を参照］。また、反応によって赤色および／または近赤外
の光を発するルシフェラーゼは好適である。これにはたとえば A. scintillans 、Pachystomias、M. niger などのMalacosteusのような Aristostomia 種に存在
するルシフェラーゼも包含する。
【０１６４】 ［２］ルシフェリン類 本結合体における反応または結合のための基質にはルシフェラーゼと反応して
発光するものであればいかなる分子をも包含する。このような分子には天然起源
の基質、その修飾体、および合成的基質を包含する［たとえば米国特許第537453
4号および米国特許第5098828号参照］。ルシフェリンの例には本明細書に記載す
るものならびにその誘導体、類似体、たとえばジオキセタン類のような合成基質
を包含する［たとえば米国特許第5004565号および米国特許第5455357号参照］お
よび発光反応中にルシフェラーゼによって酸化される他の化合物を包含する［た
とえば米国特許第5374534号、米国特許第5098828号および米国特許第4950588号 参照］。このような基質はまた生物発光反応中に酸化される化合物を選択するこ
とによって実験的に確認してもよい。
【０１６５】 ［３］活性化剤 生物発光を発生する系はまた本明細書で検討するものおよび当技術分野におけ
る熟練者に知られている他の成分を必要とする。生物発光反応は全て溶解酸素ま
たは結合酸素の型における分子状酸素を必要とする。そこで、水に溶解した、ま
たは空気中の、または発光プロテインに結合した、分子状酸素は生物発光反応に
対する活性化剤である。これらに限定されるものではないが、その他の活性化剤
には反応の構成の型に依存して次のようなものを包含する：ＡＴＰ（ホタル）、
ＦＭＮからＦＭＮＨ2を再生するフラビン還元酵素［細菌系］、およびＣａ2+ま たはその他の適当な金属イオン［エクオリン］。
【０１６６】 本明細書が提供する系の殆どはルシフェラーゼとルシフェリンとを混合して空
気または水と接触させる時に発光する。しかしながら、たとえばエクオリンのよ
うに酸素を結合する発光プロテインを利用する系ではＣａ2+［またはその他の適
当な金属イオン］との接触が必要で、これはカルシウム塩の水性組成物の形で供
給することもできる。このような例ではルシフェラーゼ［エクオリン］とルシフ
ェリン［セレンテラジンのような］との混合物へのＣａ2+［またはその他の適当
な金属イオン］の添加が発光をもたらす。Renilla 系およびその他の Anthozoa （花虫類）系でもＣａ2+［またはその他の適当な金属イオン］が必要である。
【０１６７】 たとえば摩砕 Cypridina［小エビ］または摩砕ホタルのような粗製の製品を使
用する時には水を添加することだけが必要なこともある。ホタル［またはホタル
または昆虫のルシフェラーゼ］を利用する例では反応にはＡＴＰの添加のみが必
要なこともある。当技術分野の熟練者には本明細書の開示を参照すれば詳しい構
成成分は明白となるか、または実験で容易に決定されるものである。
【０１６８】 これらの混合物には進行させるべき反応に必要な、いかなる追加的な塩または
緩衝液またはイオンを含有させられることは理解されることとなる。これらの反
応の特性はよく決定されているので、当技術分野の熟練者は正確な比率と必須な
成分とを決定することができることとなろう。この成分の選択は装置、製造技術
およびルシフェラーゼに依存することとなる。本明細書には様々な態様が記載さ
れ、例示されている。これらの記載によればその他の態様も明白となる。
【０１６９】 ［４］反応 全ての態様ではルシフェラーゼかルシフェリンかのどちらか一成分を除いて、
生物発光系の全構成成分は混合し、または包装してもよく、組み合わせてもよい
。残りの成分は標的試薬と結合させ、また動物への投与を意図してもよい。
【０１７０】 外科的手術の前に、結合物はいかなる適当な経路で投与してもよく、それによ
って器官特異的細胞表面タンパク質との特異的相互作用により標的試薬は標的器
官に結合する。外科手術の間に典型的には局所噴霧または局所注射によって組織
で残余の構成成分と接触させると結合体が結合した組織が発光することになる。
この発光は薄暗または必要なら暗黒の下で目視するために十分でなければならな
い。
【０１７１】 一般的に言えば、達成すべき結果は裸眼で見える発光であって、定量的でなく
て定性的な診断が目的であるから生物発光反応の構成成分の正確な比率および量
は厳密に測定したり、調整したりする必要はない。これは発光をするために十分
でなければならない。一般的には可視的発光を生じるために十分な量のルシフェ
リンとルシフェラーゼとの量を使用する。この量は実験によって容易に決定でき
るが、選択した系と選択した利用目的に依存する。定量的測定が必要な場合には
、精度の向上が必要となろう。
【０１７２】 本明細書に記載する目的のためにはこの量は好ましくは少なくとも当技術分野
の熟練者が分析的目的のために用いる濃度および比率である。発光の強さが十分
でなければ濃度を高める。あるいは、シグナルの発生を増加させるためには複数
個のルシフェラーゼ分子を結合させた標的試薬を結合したマイクロキャリアーに
結合させてもよい。また、反応に使用する条件は実験室条件ではなく各成分は貯
蔵するので高濃度を用いてあり得べき活性の低下を克服してもよい。典型的には
この量は反応混合物１リットルについてルシフェラーゼ１mg、好ましくは１０mg
、さらに好ましくは１００mgであるか、または１mg、好ましくは１０mg、さらに
好ましくは１００mgである。組成物には少なくとも約０．０１mg/L、典型的には
０．１mg/L、１mg/L、１０mg/Lまたはそれ以上の各成分をその品目に含有しても
よい。ルシフェリンの量も約０．０１mg/Lと１００mg/Lとの間、好ましくは０．
１mg/Lと１０mg/Lとの間であって、反応持続のためには多くの反応物の場合にル
シフェリンを追加することができる。ルシフェラーゼが触媒的に働いて再生する
必要がない態様では利用するルシフェラーゼの量を減少させることもできる。反
応の間に変化させる場合には追加でき、典型的には高い濃度を選択することにな
る。リットル当り各成分の濃度範囲［または基質をコーティングする量、組成物
と接触する結果］は０．１mgから２０mg、好ましくは０．１mgから１０mg、さら
に好ましくは約１mgと１０mgの間であれば十分となろう。本明細書に記載するよ
うにコーティングされた基質を製造する時には、高濃度のルシフェラーゼまたは
ルシフェリンを含む多量のコーティング組成物を使用してもよい。
【０１７３】 そこで、例えばカルシウム存在下、たとえばセレンテラジンのようなルシフェ
リン５mgを水１Lにとかし、たとえばエクオリン発光プロテインルシフェラーゼ または Renilla からのルシフェラーゼのようなルシフェラーゼ約１０mgを添加 すれば水温に依存して少なくとも１０分から２０分間明るく発光するものである
。ルシフェラーゼ濃度を例えば１００mg/Lまで増加させれば特に明るく輝いた光
を放つ。
【０１７４】 使用する濃度と量とは選択した生物発光発生系に依存することは理解されるが
これは実験的に容易に決定される。特に実験的測定を開始するような時に用いる
比率は分析的目的に一般に使用されるもので、その量または濃度は少なくとも分
析的目的に使用されるものであって、持続的で明るい発光を所望する時には量を
増加できる。
【０１７５】 ２．Renilla 系 ソフトコラル・ウミシイタケとも呼ばれる Renilla は腔腸動物 花虫綱に属し
、これにはたとえば Cavarnularia、Ptilosarcus、Stylatula、Acanthoptilum および Parazoanthus のように他の生物発光をする属を包含する。花虫綱属で生
物発光をするものはルシフェラーゼとルシフェリンを有し、それらは構造的に類
似している［たとえばCormier et al.（1973） J. Cell Physiol. 81：291-298 参照；また、 Ward et al.（1975） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72：2530-
2534参照］。これら 花虫綱属の各生物から得られるルシフェラーゼとルシフェ リンは相互に交差反応を起こして特徴的な青い冷光を発する。
【０１７６】 Renilla のルシフェラーゼとその他の腔腸動物および有櫛動物のルシフェラー
ゼ、たとえばエクオリン発光プロテインのようなものではイミダゾピラジン基質
、特に一般にセレンテラジンと呼ばれる基質を利用する［前記Ｂ．１．ｂの式（
Ｉ）と（ＩＩＩ）を参照］。セレンテラジンを利用するルシフェラーゼを含有す
るその他の属には：Chiroteuthis、Eucleoteuthis、Onychoteuthis、Watasenia 、コウイカおよび Sepiolina のようなイカ；Oplophorus、Acanthophyra、Serge
stesおよび Gnathophausia のようなエビ；Argyropelecus、Yarella、Diaphus、
Gonado-stomiasおよび Neoscopelus のような深海魚；を包含する。
【０１７７】 しかしながら、Renilla のルシフェラーゼは結合酸素を持たないので、適当な
ルシフェリン基質存在下に発光するには溶解酸素を必要とする。Renilla のルシ
フェラーゼは真正酵素［すなわち、再使用するために再構築する必要がない］と
して作用するので得られる冷光は飽和濃度のルシフェリンが存在すれば長時間持
続する。また、Renilla のルシフェラーゼは熱に対して比較的安定である。
【０１７８】 Renilla のルシフェラーゼ、Renilla reniformis のルシフェラーゼをコード
するＤＮＡ、および組換えルシフェラーゼを産生するためのRenilla reniformis
ＤＮＡの使用法、ならびに他の腔腸動物のルシフェラーゼをコードするＤＮＡ はよく知られており、入手可能である［たとえば配列番号１、米国特許第541815
5号および米国特許第5292658号参照；また、Prasher et al.（1985） Biochem.
Biophys. Res. Commun. 126：1259-1268；叢書「Bioluminescense and Chemilum
inescense」中、225-233のCormier （1981） 「Renilla and Aequorea biolumin
escense」；Charbonneau et al.（1979） J. Biol. Chem. 254：769-780；Ward
et al.（1979） J. Biol. Chem. 254：781-788；Lorenz et al. （1981） Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88：4438-4442；Hori et al.（1977） Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 74：4285-4287；Hori et al.（1975） Biochemistry 14：23
71-2376；Hori et al.（1977） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74：4285-4287
；Inouye et al.（1977） Jap. Soc. Chem. Lett. 141-144；およびMatthews et
al.（1979） Biochemistry 16：85-91参照］。Renilla reniformis のルシフェ
ラーゼをコードするＤＮＡおよびこのＤＮＡを有する宿主細胞はたとえば当技術
分野の熟練者に知られているもの［たとえば Renilla reniformis ルシフェラー
ゼの組換え産生法を開示する米国特許第5418155号および米国特許第5292658号参
照］のように多量の Renilla reniformis 酵素を製造するために便利な手段を提
供する。
【０１７９】 本明細書で使用する Renilla ルシフェラーゼは凍結乾燥形にまとめ、それ自 体でまたはルシフェリン基質と組合せて担体中にカプセル化することもできる。
使用前にこの混合物を水性組成物、好ましくは燐酸緩衝液食塩水ｐＨ７〜８と接
触させるが、溶解Ｏ2酸素が反応を活性化する。発光している混合物中のルシフ ェラーゼ最終濃度は０．０１から１mg/Lまたはそれ以上のオーダーになると思わ
れる。ルシフェリン濃度は少なくとも約１０-8Mであるが、長時間持続する生物 発光をさせるためにはその１倍から１００倍またはそれ以上のオーダーの大きさ
とすべきである。
【０１８０】 本発明の態様のあるものでは、約１mgから１０mg、または好ましくは２〜５mg
、さらに好ましくは約３mgのセレンテラジンを Renilla ルシフェラーゼ約１０ ０mgとともに使用することになろう。もちろん正確な量は実験的に決定でき、ま
た究極的な濃度と利用にある程度は依存するものである。特に、適当な検定用緩
衝液１００mLに Renilla を発現する細菌から得られる粗製抽出物約０．２５mL を添加するなら、約０．００５μｇは可視的で持続的な輝きを発光するために十
分である［Renilla reniformis ルシフェラーゼの組換え製造を開示する米国特 許第5418155号および米国特許第5292658号参照］。
【０１８１】 凍結乾燥混合物および Renilla ルシフェラーゼを含む組成物も提供する。ル シフェラーゼまたはルシフェラーゼとルシフェリンとの混合物もたとえばリポソ
ーム、硝子粒、毛細管、薬剤送達材料、ゼラチン、時間放出コーティングまたは
その他の材料のような適当な送達材料中にカプセル化してもよい。このルシフェ
ラーゼはたとえば生物に適合性のある材質のような基質に結合しておいてもよい
。
【０１８２】 ｂ．有櫛動物系 たとえば Mnemiopsis（ムネミオプシン）およびBeroe ovata（ベロビン）のよ
うな有櫛動物およびたとえば Aequorea（エクオリン）、Obelia（オベリン）お よび Pelagia のような腔腸動物は同様な化学反応を利用して生物発光する「た とえば Stephenson et al.（1981） Biochimica et Biophysica Acta 678：65-7
5；Hart et al.（1979） Biochemistry 18：2204-2210；米国特許出願第08/0171
16号、米国特許第5486455号に基づく国際ＰＣＴ出願 WO 94/18342 号および本明
細書に引用するその他の参考文献および特許文献参照」。Aequorin および Reni
lla 系は代表的なものであって本明細書には例示としておよび現時点での好適な
系のものとして詳記する。Aequorin および Renilla 系は同じルシフェリンを使
用でき、同じ化学反応を利用して発光するが、それぞれのルシフェラーゼは違っ
ている。Aequorin ルシフェラーゼはエクオリンであり、ならびに、例えばルシ フェラーゼであるムネミオプシンおよびベロビンは結合酸素および結合ルシフェ
リンを含有し、反応開始のためにＣａ+2を必要とし、再利用のためには再生が必
要な発光プロテインである。一方では Renilla ルシフェラーゼは真正酵素とし て作用する。何故なら反応中に変化がなく、溶解した分子状酸素を必要とするか
らである。
【０１８３】 （１）エクオリン系 エクオリン系についてはよく知られている［たとえば、Tsuji et al.（1986）
「Site-specific mutagenesis of the calcium-binding photoprotein aequori
n」 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83：8107-8111；Prasher et al.（1985）
「Cloning and Expression of the cDNA coding for Aequorin, a Bioluminesce
nt Calcium-Binding Protein」、Biochemical and Biophysical Research Commu
nic-ations 126：1259-1268；Prasher et al.（1986） Methods in Enzymology
133：288-297；Prasher et al.（1987） 「Sequence Comparisons of cDNA Enco
ding for Aequorin Isotypes」、Biochemistry 26：1326-1332；Charbonneau et
al.（1985） 「Amino Acid Sequence of the Calcium-Dependent Photoprotein
Aequorin」、Biochemistry 24：6762-6771；Shimomura et al. （1981） 「Res
istivity to denaturation of the apoprotein of aequorin and reconstitutio
n of the luminescent photoprotein from the partially denatured apoprotei
n」、Biochem. J. 199：825-828；Inouye et al.（1989） J. Biochem. 105：47
3-477；Inouye et al. （1986） 「Expression of Apoaequorin Complementary
DNA in Escherichia coli」、Biochemistry 25：8425-8429；Inouye et al.（19
86） 「Cloning and sequence analysis of cDNA for the luminescent protein
aequorin」、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82：3154-3158；Prendergast et
al.（1978） 「Chemical and Physical Properties of Aequorin and the Gree
n Fluorescent Protein Isolated from Aequorea forskalea」、J. Am. Chem. S
oc. 17：3448-3453；欧州特許出願第0540064A1；欧州特許出願第0226979A2；欧 州特許出願第0245093A1；および欧州特許出願第0245093B1；米国特許第5093240 号；米国特許第5360728号；米国特許第5139937号；米国特許第5422266号；米国 特許第5023181号；米国特許第5162227号；およびアポタンパク質をコードするＤ
ＮＡを示す配列番号５〜１３；および米国特許第5162227号に記載の型、欧州特 許出願第0540064A1参照。また、Sealite Sciences Technical Report 3号（1994
）にはAQUALITEの名前でジョージア州ボガートの Sealite Sciences から購入で
きるものを記載している］。
【０１８４】 この系は本発明で利用する好適な系の一つである。明らかとなるようにエクオ
リン光プロテインには非共有結合ルシフェリンおよび分子状酸素が含まれるので
この形で貯蔵するには凍結乾燥粉末とするか、選択された送達材料でカプセル化
するのが適当である。この系はたとえばリポソームまたはその他の送達材料のよ
うなペレットにカプセル化することができる。使用する時には材料とＣａ2+［ま
たはその他の適当な金属イオン］を含有する組成物（これは生水であってもよい
）とを接触させれば発光混合物が製造される。
【０１８５】 （ａ）エクオリンおよび関連発光プロテイン 発光プロテインであるエクオリンはクラゲである Aequorea から単離されたも
のでＣａ2+またはその他の適当な金属イオンを添加すると光を放射する。エクオ
リン発光プロテインは結合ルシフェリンおよびＣａ2+によって放出される結合酸
素を含有し、溶解酸素を必要としない。冷光放射はカルシウムによって触発され
るが、後者は酸素とルシフェリン基質を放出してアポエクオリンを生成する。 生物発光フォトプロテインであるエクオリンは多種のクラゲ Aequorea から単離
される。これは分子量２２キロダルトン（ｋＤ）の複合ペプタイドである［たと
えば、Shimomura et al.（1962） J.Cellular and Comp. Physiol. 59：233-238
；Shimomura et al.（1969） Biochemistry 8：3991-3997；Kohama et al. （19
71） Biochemistry 10：4149-4152；およびShimomura et al.（1972） Biochemi
stry 11：1602-1608参照］。在来型のタンパク質はこれと非共有結合的に結合し
ている酸素とヘテロ環状化合物であってルシフェリンの一種であるセレンテラジ
ンとを含有する［下記参照］。このタンパク質はカルシウム結合部位３箇所を有
する。痕跡量のＣａ2+［またはたとえばストロンチウムのようなその他の適当な
金属イオン］を発光プロテインに添加すると立体配座が変化し、これがタンパク
質に結合している酸素を利用して結合セレンテラジンの酸化を触媒する。この酸
化のエレルギーは４６９nMに中心を持つ青色光のフラッシュとして放射される。
カルシウムイオンの濃度は１０-6Mまでの低さであってもこの酸化反応を触発す るためには十分である。
【０１８６】 天然起源アポエクオリンは単一化合物ではなく、ミクロヘテロジニアスな分子
種の混合物である。クラゲ Aequorea の抽出物には１２種もの変種タンパク質を
含有する［たとえば、Prasher et al.（187） Biochemistry 26：1326-1332；Bl
inks et al.（1975） Fed. Proc. 34：474参照］。多数の型をコードするＤＮＡ
が分離されている［たとえば、配列番号５〜９および１３を参照］。
【０１８７】 この発光プロテインはたとえば E. coli 中で組換え的に産生されたタンパク 質のようなアポタンパク質とたとえば合成セレンテラジンのようなセレンテラジ
ンと酸素およびたとえば２−メルカプトエタノールのような還元剤［たとえば、
Shimomura et al.（1975） Nature 256：236-238；Shimomura et al. （1981）
Biochemistry J. 199：825-828参照］の存在下にＣａ2+と結合して所望の時点ま
で酸化反応が触発されるのを予防するためのＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ［本発明に
利用するには約５から約１００mMまたはそれ以上の濃度］を混合することによっ
て再構築できる［たとえば米国特許第5023181号参照］。
【０１８８】 再構築のために２−メルカプトエタノールを必要としないアポタンパク質の修
正型をコードするＤＮＡも利用可能である［たとえば米国特許号、第米国特許第
5093240号参照］。この再構築発光プロテインは購入可能である［たとえば米国 特許第5162227号に開示され、AQUALITE（商標）の名前で販売されている］。
【０１８９】 この光反応はキレート化剤の効果を克服し、１０-6M濃度を達成するために十 分な濃度でＣａ2+を添加することによって触発される。このように低濃度なＣａ 2+ でもこの反応を触発できるので、本発明方法における使用のためにはこの発光
プロテイン組成物には高濃度のキレート化剤を添加してもよい。そうすると、カ
ルシウム塩の形での添加すべきＣａ2+は高濃度が必要になろう。正確な量は実験
的に決定してもよい。本発明で使用するには濃縮組成物または凍結乾燥型または
粉末の形で提供される発光プロテインに単に水を添加するのみで十分なこともあ
る。そこで、本発明の目的では燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはその他の適当な
緩衝液または組成物を接触させるべき組織表面の湿気などの中に存在する少量な
Ｃａ2+を添加することが生物発光反応を触発することになる。
【０１９０】 エクオリンアポタンパク質のアイソフォルムは多数が確認され、分離されてい
る。これらのタンパク質をコードするＤＮＡはクローニングされ、このタンパク
質およびその修正型は適当な宿主細胞を利用して産生されている［たとえば米国
特許第5162227号、米国特許第5360728号、米国特許第5093240号；Prasher et al
.（1985） Biochem. Biophys. Res. Commun. 126：1259-1268；Inouye et al.（
1986） Biochemistry 25：8425-8429；米国特許第5093240号；米国特許第536072
8号；米国特許第5139937号；米国特許第5288623号；米国特許第5422266号；米国
特許第5162227号；およびアポタンパク質をコードするＤＮＡを示す配列番号５ 〜１３；参照。またその一型はAQUALITEの名前でジョージア州ボガートの Seali
te Sciences 社から購入できる］。
【０１９１】 アポエクオリンまたはその変種をコードするＤＮＡは多量のアポタンパク質を
組換え生産するために有用である。この発光プロテインはルシフェルリン、好ま
しくは硫酸塩誘導体であるセレンテラジンまたはその類似体、および分子状酸素
を添加して再構築される［たとえば米国特許第5023181号参照］。このアポタン パク質およびその他の発光プロテインおよび生物発光生成反応の構成成分は適当
な条件下に発光プロテインを再生し、同時に発光プロテインに発光させるために
混合することができる。再構築にはたとえばメルカプトエタノールのような還元
剤の存在が必要であるが、以下に検討する通りに還元剤が不要なように設計され
た修正型ではこの点は当てはまらない［たとえば米国特許第5093240号参照］。
【０１９２】 本発明で使用するためにはエクオリンは、たとえば配列番号５〜１３に示し、
当技術分野の熟練者に知られているようなＤＮＡまたはその修飾型のようなもの
を利用して製造するのが好ましい。エクオリンをコードするＤＮＡはたとえば E
. coli のような宿主細胞中で発現し、分離し、再構築される［たとえば、米国 特許第5418155号、米国特許第5292658号、米国特許第5360728号、米国特許第542
2266号、米国特許第5162227号参照］。
【０１９３】 本発明で注目されるものは非修飾アポエクオリンよりも生物発光活性が高くな
るように修飾された型のアポタンパク質である［たとえば、米国特許第5360728 号、配列番号１０〜１２参照］。非修飾アポエクオリンよりも高い生物発光活性
を示すように修飾された型にはアスパラギン酸１２４をセリンに、グルタミン酸
１３５をセリンに、およびグリシン１２９をアラニンにおのおの置換した配列番
号１０〜１２に示す配列を含むタンパク質を包含する。生物発光活性が増大した
その他の修飾型も入手可能である。
【０１９４】 本発明のある態様で利用するためにはエクオリン生物発光発生系のアポタンパ
ク質およびその他の構成成分は包装するかまたは混合物として提供され、所望な
時にはアポタンパク質、ルシフェリンおよび酸素から発光プロテインが再構築さ
れる条件に付す［たとえば、米国特許第5023181号、および米国特許第5093240号
参照］。再構築のためにはたとえば２−メルカプトエタノールのような還元剤を
必要としない型のアポタンパク質は特に好適である。例えば米国特許第5093240 号に記載されているこれらの型は例えばシステイン残基３個の１個またはそれ以
上、好ましくは全部をセリンで置換することによって修飾されている［Tsuji et
al.（1986） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83：8107-8111 も参照］。置換 はたとえば配列番号５に示すようなエクオリンアポタンパク質をコードするＤＮ
Ａの修飾により、およびシステインコドンをセリンで置換することによって行っ
てもよい。
【０１９５】 たとえば Obelia のような関連する種からの発光プロテインおよびルシフェラ
ーゼも本発明での利用が意図されている。ヒドロポリプである Obelia longissi
ma から得られるＣａ2+−活性化発光プロテインであるオベリンをコードするＤ ＮＡは知られており、入手可能である［たとえば、Illarionov et al.（1995）
Gene 153：273-274およびBondar et al.（1995） Biochim. Biophys. Acta 1231
：29-32参照］。この発光プロテインはＭｎ2+によっても活性化できる［たとえ ばVysotski et al.（1995） Arch. Bioch. Biophys. 316：92-93；Vysotski et
al.（1993） J. Biolumin. Chemilumin. 8：301-305参照］。
【０１９６】 本発明に利用するためには一般に生物発光の構成成分は反応を触発させるため
には不十分な量の触発性金属イオンが存在するように包装するかまたは提供する
。利用する時には痕跡量の金属イオン、殊にＣａ2+を他の構成成分と接触させる
。さらに持続的な発光のためにはエクオリンを連続的に再構築するか、または添
加するか、または大過剰に提供する、ことができる。
【０１９７】 (ｂ)ルシフェリン エクオリンルシフェリンは、コエレンテラジンおよびその類似体であり、構造
(式(Ｉ))を含む分子を含む：
【化１】 [式中、Ｒ1は、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5またはＣＨ3であり、Ｒ2は、Ｃ6Ｈ5であり、そして Ｒ3は、ｐ-Ｃ6Ｈ4ＯＨもしくはＣＨ3またはその活性を有する類似体である]。好
ましいコエレンテラジンは、Ｒ1がｐ-ＣＨ2Ｃ6Ｈ4ＯＨであり、Ｒ2がＣ6Ｈ5であ
り、そしてＲ3が既知の方法[例えば、Inouye et al., (1975) Jap. Chem. Soc.,
Chemistry Lttrs. pp 141-144;およびHart et al., (1979) Biochemistry 18:
2204-2210]により調製され得るｐ-Ｃ6Ｈ4ＯＨである構造を有する。好ましい類 似体は、修飾されたものであり、それにより、得られた光のスペクトル周波数が
他の周波数に変換する。
【０１９８】 好ましいコエレンテラジンは、構造(式(II))：
【化２】 およびその硫酸類似体を有する。
【０１９９】 他のコエレンテラジンは、式(Ｖ)：
【化３】 を有する[Hart et al., (1979) Biochemistry 18: 2204-2210参照]。ルシフェラ
ーゼ存在下、この誘導体を用いると、すべての光は、ピーク３９０ｎｍの紫外線
内に含まれる。ＧＦＰの添加において、すべての放射光は、放射光が２００倍増
加するピーク５０９ｎｍの可視範囲内に含まれる。４７０ｎｍカットオフフィル
ターを用い、ＧＦＰ非存在下の光生成では、約０であると観察され、ＧＦＰ存在
下では、検出することができる。これにより、実施例に記述の免疫アッセイの基
礎が提供される。
【０２００】 結合酸素によりエクオリン発光タンパク質に結合するとき、およびＣａ2+存在
下、コエレンテラジンの反応は、以下のように示される：
【化４】 。
【０２０１】 発光タンパク質エクオリン[それは、コエレンテレートルシフェリン分子に結 合するアポエクオリンを含む]およびRenillaルシフェラーゼは、以下に考察する
ように、同じコエレンテレートルシフェリンを使用し得る。エクオリン発光タン
パク質は、コエレンテレートルシフェリン[コエレンテラジン]をオキシルシフェ
リンに、青色[λmax＝４６９ｎｍ]の発光を伴う、酸化するのを触媒する。
【０２０２】 重要なことに、コエレンテレートルシフェリンの硫酸誘導体[ラウリルルシフ ェリン]は、特に水に安定であり、そのため、コエレンテレート様-生物発光性シ
ステムに用いられる。このシステムでは、アデノシン二リン酸(ＡＤＰ)およびサ
ルファキナーゼを用い、コエレンテラジンを硫酸型に変換する。次いで、スルフ
ァターゼを用い、ラウリルルシフェリンを天然コエレンテラジンに再変換する。
そのため、更に安定なラウリルルシフェリンをアイテムに用い、照射され、スル
ファターゼを合せたルシフェラーゼを、照射を望むときに、ルシフェリン混合物
に加える。
【０２０３】 そのため、Aequoreaの生物発光性システムは、特に本明細書中の方法の使用に
適する。特定の量および成分が提供される方法は、視覚化される腫瘍形成または
特定組織の型に依存する。このシステムは、凍結乾燥され、Ｃａ2+の添加により
動き出す(glow)。マイクロビーズのような微小担体に結合させ、溶液または懸濁
液のような組成物として、好ましくは反応の誘発を防ぐ重要なキレート化剤の存
在下、カプセル化し得る。エクオリン発光タンパク質の濃度は変化し、経験的に
決定される。典型的濃度、少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくと
も１ｍｇ／ｌおよびそれ以上、を選択する。ある実施態様では、ルシフェラーゼ
１００ｍｇあたり１-１０ｍｇルシフェリンを、選択した体積で使用し、望まし い濃度で用いる。
【０２０４】 ｃ．甲殻類、特にCyrpidinaシステム Vargula serratta, hilgendorfiiおよびnoctilucaのような、甲皮類は、小さ な海洋甲殻類であり、時折、海のホタルと呼ばれる。これら海のホタルは、日本
の海岸から離れた海域で見られ、ルシフェリンおよびルシフェラーゼを水中に噴
出することにより、光を放ち、明るい青色の夜光雲を生ずる反応が起こる。当該
反応は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよび分子状酸素のみを含み、そのため
、本明細書の適用に非常に適する。
【０２０５】 Vargula生物発光性システムのような、システムは、特に本明細書において好 ましい。当該成分は、乾燥し、粉末状となっても室温で安定であり、そして汚染
されているときでさえも、反応は継続する。更に、生物発光性反応は、１：４０
ｐｐｍから１：１００ｐｐｍぐらい低い濃度のルシフェリン／ルシフェラーゼ成
分のみを必要とし、水および分子状酸素が生ずる。排出システムはルシフェリン
の添加により回復する。
【０２０６】 (１)Vargulaルシフェラーゼ Vargulaルシフェラーゼは、水溶性であり、本明細書の方法の使用に好ましい ものである。Vargulaルシフェラーゼは、５５５アミノ酸ポリペプチドからなり 、Vargulaから単離され、また、組換え技術を用い、適当な細菌および哺乳類宿 主細胞でＤＮＡを発現させることにより、作成する[例えば、Thompson et al. (
1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6567-6571; Inouye et al. (1992) P
roc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:9584-9587; Johnson et al. (1978) Methods
in Enzymology LVII:331-349; Tsuji et al. (1978) Methods Enzymol. 57:364
-72; Tsuji (1974) Biochemistry 13:5204-5209; Japanese Patent Application
No. JP 3-30678 Osaka; および欧州特許出願番号 EP 0 387 355 A1]。
【０２０７】 (ａ)Cypridinaからの精製 Vargula [Cypridina]ルシフェラーゼを精製する方法は既知である。例えば、 活性を有する粗抽出物は、Vargulaエビジャコを磨り潰すか、または破砕するこ とにより容易に調製され得る。他の実施態様では、Cypridina hilgendorfiルシ フェラーゼの製剤は、抽出用に０．５-５．０Ｍ塩、好ましくは０．５-２．０Ｍ
塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、硫酸アンモニウムを含む蒸留水中に、０- ３０℃、好ましくは０-１０℃で、１-４８時間、好ましくは１０-２４時間、保 存した凍結C. hilgendorfiを浸し、その後、疎水性クロマトグラフィーし、次い
でイオン交換またはアフィニティークロマトグラフィーを行い、調製され得る[T
ORAY IND INC, １９９３年９月１４日付け日本国特許出願番号 JP 4258288; ま た他の方法としてTsuji et al. (1978) Methods Enzymol. 57:364-72参照]。
【０２０８】 (ｂ)組換え方法による調製 ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼをコード化するクローン化ＤＮＡ[欧州特 許出願番号 0 387 355 A1; 国際PCT出願番号 WO 95/001542; また日本国特許出 願番号 JP 3-30678 に記載の配列番号５およびThompson et al. (1989) Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6567-6571参照]を発現し、ルシフェラーゼまたは その変異体をコードするＤＮＡを、適当なベクターを用いE. coliに導入し、標 準的な方法を用い単離する。
【０２０９】 (２) Vargulaルシフェリン 天然のルシフェリンは、式(III)：
【化５】 の化合物のような置換イミダゾピライン核である。
【０２１０】 ルシフェリンは、抽出物を過熱し、ルシフェラーゼを破壊し、ルシフェリンは
未処理のまま残すことにより、磨り潰した乾燥Vargulaから単離し得る[例えば、
米国特許番号4,853,327参照]。
【０２１１】 光を生ずる反応においてルシフェラーゼと反応する、その類似体および他の化
合物もまた使用し得る。
【０２１２】 Vargulaルシフェリンと反応し得るルシフェラーゼを有する他の生物発光性生 物には、Apogon, Parapriacanthus および Porichthys属が含まれる。
【０２１３】 (３)反応 酸素との反応におけるルシフェリンは、ジオキサノン中間体(ホタル環状ペル オキシド分子中間体に類似する環状ペルオキシドを含む)を形成する。生物発光 性反応の最終段階では、ペルオキシドは、崩壊し、ＣＯ2および励起カルボニル を生ずる。次いで、励起分子は、青色から青-緑の光を発する。
【０２１４】 反応の最適ｐＨは、約７である。本明細書の目的のために、反応が生ずる任意
のｐＨを使用し得る。試薬の濃度は、通常分析反応に使用する濃度またはそれよ
りも高い濃度である[例えば、Thompson et al. (1990) Gene 96:257-262参照]。
典型的なルシフェラーゼの濃度０．１と１０ｍｇ／ｌの間、好ましくは０．５か
ら２．５ｍｇ／ｌを用いる。同様の濃度のルシフェリンおよびより高い濃度のル
シフェリンを用い得る。
【０２１５】 ｄ．ホタル、コメツキムシ、および他の昆虫システムを含む昆虫生物発光性シス
テム ホタル生物発光の生化学は、特徴的な第一の生物発光性システムであり[例え ば、Wienhausen et al. (1985) Photochemistry and Photobiology 42:609-611;
McElroy et al. (1966) in Molecular Architecture in cell Physiology, Hay
ashi et al., eds. Prentice Hall, Inc., Englewood Cliffs, NJ, pp. 63-80参
照]、それは、商業的に利用できる[例えば、Promega Corporation, Madison, WI
、例えば、Leach et al. (1986) Methods in Enzymology 133:51-70, esp. Tabl
e 1参照]。種々の種のホタルのルシフェラーゼは、抗原的に類似する。これらの
種には、Photinus, Photurins および Luciola属のメンバーが含まれる。更に、
生物発光反応は、２０℃よりも３０℃でより光を生じ、ルシフェラーゼは、少量
のウシアルブミン血清により安定化し、当該反応は、トリシンにより緩衝され得
る。
【０２１６】 (１)ルシフェラーゼ 種々の昆虫からのルシフェラーゼをコードするＤＮＡクローンおよび当該コー
ド化ルシフェラーゼを生ずる使用は、既知である。例えば、Photinus pyralis、
Luciola cruciata からのルシフェラーゼ[例えば de Wet et al. (1985) Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:7870-7873; de We et al. (1986) Methods in Enz
ymology 133:3; U.S. Patent No. 4,968,613参照、また配列番号３参照]をコー ドするＤＮＡクローンが利用できる。当該ＤＮＡはまた、Saccharomyces [例え ば、１９８８年１２月２６日発行の日本国出願番号 JP 63317079、KIKKOMAN COR
P]およびタバコ中で発現する。
【０２１７】 野生型ルシフェラーゼに加えて、修飾した昆虫ルシフェラーゼが調製された。
例えば、ルシフェラーゼを生ずる熱安定性ルシフェラーゼ変異体、ＤＮＡコード
化変異体、ベクターおよび形質転換細胞が利用できる。Photinus pyralis、Luci
ola mingrelica、L. cruciata または L. lateralisからのルシフェラーゼと６ ０％アミノ酸配列相同性を有し、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質が利用
される[例えば、国際PCT出願番号WO 95/25798参照]。それは、３０℃を超える温
度で、天然で生ずる未処理のルシフェラーゼよりも安定であり、また３７℃また
はそれ以上で、高い収量で、産生される。
【０２１８】 修飾されたルシフェラーゼは、種々の波長の光を生じ[天然のルシフェラーゼ と比較したとき]、そのため、その色彩を生ずる特性が選択され得る。例えば、 合成的変異体甲虫ルシフェラーゼ、および野生型ルシフェラーゼとは異なる波長
の生物発光を生ずるルシフェラーゼをコードするＤＮＡが知られている[Promega
Corp、国際PCT出願番号 WO 95/18853、それは、米国出願番号08/177,081に基く
]。変異体甲虫ルシフェラーゼは、１つまたは２つの位置での置換により、相当 する野生型Luciola cruciata [例えば、米国特許番号 5,182,202、5,219,737、5
,352,598参照、また配列番号３参照]とは異なるアミノ酸配列を有する。変異体 ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼにより生ずる場合とは少なくとも１ｎ
ｍ異なるピーク密度の波長を有する生物発光を生ずる。
【０２１９】 他の変異体ルシフェラーゼを作成し得る。野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配
列を有すると共に、アミノ酸番号２３３でバリンがイソロイシンに置換し、２３
９でバリンがイソロイシンで置換し、２８６でセリンがアスパラギンに置換し、
３２６でグリシンがセリンに置換し、４３３でヒスチジンがチロシンに置換し、
４５２でプロリンがセリンに置換した少なくとも１つの変異を有する変異体ルシ
フェラーゼが知られる[例えば、米国特許番号 5,219,737および 5,330,906参照]
。ルシフェラーゼは、E. coli中に各変異体ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ を発現し、タンパク質を単離することにより生ずる。これらルシフェラーゼは野
生型とは異なる色の光を発する。変異体ルシフェラーゼは、ルシフェリンを触媒
し、赤色[λ６０９ｎｍおよび６１２ｎｍ]、橙色[λ５９５および６０７ｎｍ]ま
たは緑[λ５５８ｎｍ]の光を生ずる。変異体ルシフェラーゼの他の物理的または
化学的性質は、天然の野生型ルシフェラーゼと実質的に同一である。変異体ルシ
フェラーゼは、Ser 286をAsnで置換し、Gly 326をSerで置換し、His 433をTyrで
置換し、またはPro 452をSerで置換する中から選択される置換(alernation)を有
するLuciola cruciataルシフェラーゼのアミノ酸配列を有する。熱安定性ルシフ
ェラーゼもまた利用される[例えば、米国特許番号 5,229,285参照; ３５４位の グルタミン酸をリシンで置換したPhotinus ルシフェラーゼおよび３５６のグル タミン酸をリシンで置換したLuciola ルシフェラーゼを提供する国際PCT出願番 号 WO 95/25798も参照]。
【０２２０】 これらルシフェラーゼおよび野生型ルシフェラーゼを、特に、例えば、種々の
色彩が望まれるとき、または高温での安定性が望まれるとき、本明細書のＧＦＰ
と組合せて用いることができる。
【０２２１】 (２)ルシフェリン ホタルのルシフェリンはベンゾチアゾールである：
【化６】 。
【０２２２】 このルシフェリンの類似体および合成ホタルルシフェリンは、当業者に既知で
ある[例えば、米国特許番号5,374,534 および 5,098,828参照]。これらには、式
(IV)が含まれる[米国特許番号5,098,828参照]： [式中、Ｒ1は、ヒドロキシ、アミノ、直鎖状または分枝状Ｃ1-Ｃ20アルコキシ、
Ｃ2-Ｃ20アルキレンオキシ、α-アミノ基を介し結合するＬ-アミノ酸残基、末端
単位のα-アミノ基を介し連結する１０までのＬ-アミノ酸単位を伴うオリゴペプ
チド基であり、 Ｒ2は、水素、Ｈ2ＰＯ3、非置換またはフェニル置換直鎖状または分枝状Ｃ1-Ｃ ２０アルキルまたはＣ2-Ｃ２０アルケニル、６から１８の炭素原子を含むアリー
ル、Ｒ3-Ｃ(Ｏ)-であり、そして、 Ｒ3は、非置換またはフェニル置換直鎖状または分枝状Ｃ1-Ｃ２０ある基るまた はＣ2-Ｃ２０アルケニル、６から１８までの炭素原子を含むアリール、１から３
のリン酸基を有するヌクレオチド基、またはグリコシド化的に結合したモノ-ま たはジサッカライドである。ただし、式(IV)がＤ-ルシフェリンまたはＤ-ルシフ
ェリンメチルエステルのときである。]
【０２２３】 修飾して、周波数が変化した光を生ずる修飾ルシフェリンは当業者に既知であ
る。
【０２２４】 (３)反応 ホタルルシフェラーゼおよび関連の昆虫のルシフェラーゼにより触媒される反
応には、ＡＴＰ、Ｍｇ2+および分子状酸素が必要とされる。ルシフェリンを外来
的に添加しなければならない。ホタルルシフェリンは、ホタルルシフェリン活性
を触媒し、その後の段階により励起産物が生ずる。ルシフェリンは、ＡＴＰと反
応し、アデニル酸ルシフェリル中間体を形成する。次いで、この中間体を酸素と
反応させ、コエレンテレート中間体環状ペルオキシドに類似する環状ルシフェリ
ルペルオキシ種を形成させる。それは、崩壊すると、ＣＯ2および励起状態のカ ルボニル産物を生成する。次いで、励起分子は、黄色の光を放射するが、その色
は、ｐＨの機能である。ｐＨが低いとき、生物発光の色は、黄-緑色から赤色に 変化する。
【０２２５】 様々な種のホタルが、様々な色の生物発光を放射し、当該反応の色は、ルシフ
ェラーゼが得られる種に依存する。加えて、当該反応は、ｐＨ７．８で最適化さ
れる。
【０２２６】 ＡＴＰおよびルシフェリンを、用い尽くされる反応に添加することにより、更
なる光の放射が生ずる。そのため、一旦用い尽くすと、当該システムは、比較的
、容易に維持される。そのため、発光の維持が望まれる本明細書の実施態様での
使用に相当適する。
【０２２７】 ｅ．細菌性システム 発光性の細菌は、典型的に継続的に光を放射し、通常、青-緑色である。強力 に発現するとき、単一の細菌は、秒あたり１０4から１０5の光子を放射し得る。
細菌性生物発光システムには、他に、Photobacterium、Vibrio および Xenorhab
dus属の生物発光性種において見られるシステムが含まれる。これらのシステム はよく知られており、十分特徴付けられている[例えば、Baldwin et al. (1984)
Biochemistry 23:3663-3667; Nicoli et al. (1974) J. Biol. Chem. 249:2393
-2396; Welches et al. (1981) Biochemistry 20:512-517; Engebrecht et al.
(1986) Methods in Enzymology 133:83-99; Frackman et al. (1990) J. of Ba
cteriology 172:5767-5773; Miyamoto et al. (1986) Methods in Enzymology
133:70; 米国特許番号 4,581,335参照]。
【０２２８】 (１)ルシフェラーゼ Vibrio harveyi [EC 1.14.14.3、アルカノール還元ＦＭＮ酸素オキシドレダク
ターゼ１-ヒドロキシル化、ルミネシング]から誘導されるルシフェラーゼにより
例示されるように、細菌性ルシフェラーゼは、混合機能オキシダーゼであり、２
種のサブユニットαおよびβの会合により形成される。α-サブユニットは、明 らかに約４２，０００ｋＤの分子量を有し、β-サブユニットは、明らかに約３ ７，０００ｋＤの分子量を有する[例えば、Cohn et al. (1989) Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A. 90:102-123参照]。これらのサブユニットは会合し、２-鎖複合
ルシフェラーゼ酵素を形成し、Vibrio harveyi [米国特許番号 4,581,335; Bela
s et al. (1982) Science 218:791-793]、Vibrio fischeri [Engebrecht et al.
(1983) Cell 32:773-781; Engebrecht et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 81:4154-4158]および他の海洋性細菌のような生物発光性細菌の光放射 反応を触媒する。
【０２２９】 細菌性ルシフェラーゼ遺伝子はクローニングされている[例えば、米国特許番 号 5,221,623; 米国特許番号 4,581,335; 欧州特許出願番号 EP 386 691 A]。Vi
brio harveyiのような、細菌性ルシフェラーゼを発現するプラスミドには、pFIT
001 (NRRL B-18080)、pPALE001 (NRRL B-18082)が含まれ、pMR19 (NRRL B-18081
)]が知られる。例えば、Vibiro fisheriの全luxレギュロンの配列が決定された[
Baldwin et al. (1984), Biochemistry 23:3663-3667; Baldwin et al. (1981)
Biochem. 20: 512-517; Baldwin et al. (1984) Biochem. 233663-3667; また、
例えば、米国特許番号 5,196,318, 5,221,623、および 4,581,335参照]。このレ
ギュロンには、オートインデューサー合成に必要なタンパク質をコードする[例 えば、Engebrecht et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:4154-415
8参照]luxI遺伝子、アルデヒド基質をルシフェラーゼに提供する酵素をコードす
るluxC、 luxD および luxE遺伝子、ならびにルシフェラーゼのαおよびβサブ ユニットをコードするluxA および luxB 遺伝子が含まれる。
【０２３０】 他の細菌由来のｌｕｘ遺伝子もまたクローニングされており、利用できる[例 えば、Vibrio harveyi 由来のluxA および luxB 遺伝子の融合を提供するCohn e
t al. (1985) J. Biol. Chem. 260:6139-6146参照]。そのため、ルシフェラーゼ
αおよびβサブユニットをコードするＤＮＡを提供し、ルシフェラーゼの生成に
使用し得る。α[1065bp]およびβ[984bp]サブユニットをコードするＤＮＡ、212
4bpのルシフェラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ、αおよびβサブユニットをコ ードするＤＮＡ、両方のサブユニットをコードするＤＮＡを含む組換え体ベクタ
ーおよび発現するための形質転換体E. coliおよび他の細菌性宿主およびコード 化ルシフェラーゼの産生が利用可能である。
【０２３１】 (２)ルシフェリン 細菌性ルシフェリンには、
【化７】 が含まれる[式中、還元フラビンモノヌクレオチドを伴うテトラデカーナルがル シフェリンとみなされる。両方が光放射反応の間に酸化されるからである]。
【０２３２】 (３)反応 還元フラビンに加えて、細菌システムは、生物発光性反応の完了には５つのポ
リペプチドを必要とする：細菌性ルシフェリンの２つのサブユニット、αおよび
βおよび３ユニットの脂肪酸レダクターゼシステム複合体、それらにより、テト
ラデカーナルアルデヒドを提供する。本明細書で提供する装置および方法に有用
な細菌性生物発光システムの例には、Vibrio fisheri および Vibrio harveyiか
ら誘導されるものも含まれる。このシステムんも１つの利点は、低温での操作能
である；ある外科的手法が体を低温にして行われる。
【０２３３】 細菌性ルシフェラーゼは、長鎖のアルデヒドのフラビン仲介加水分解を触媒し
、カルボン酸および励起フラビンを生ずる；フラビンは、青緑色の光の付随放射
を伴う基準状態に減衰する[λmax＝４９０ｎｍ；例えば、Legocki et al. (198
6) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:9080参照;米国特許番号 5,196,524参照]。
【化８】
【０２３４】 当該反応は、還元フラビンモノヌクレオチド[ＦＭＮＨ2]を、細菌性ルシフェ ラーゼ、酸素および長鎖アルデヒド、通常ｎ-デシルアルデヒドの混合物と接触 させることにより開始し得る。
【０２３５】 蛍光性細菌Alteromonas hanedai 由来のルシフェラーゼをコードするＤＮＡが
知られている[CHISSO CORP;また、１９９５年８月２２日発行の日本国特許出願 番号JP 7222590]。還元フラビンモノヌクレオチド[ＦＭＮＨ2；ルシフェリン]を
、細菌性ルシフェラーゼの存在下、酸素と反応させ、中間体ペルオキシフラビン
を生成する。この中間体は、長鎖アルデヒド[テトラデカナール]と反応し、酸お
よび励起状態のルシフェラーゼ結合ヒドロキシフラビンを形成する。次いで、当
該励起ルシフェラーゼ結合ヒドロキシフラビンは、光を放射し、酸化フラビンモ
ノヌクレオチド[ＦＭＮ]としてルシフェラーゼおよび水から解離される。インビ
トロＦＭＮは再び還元され、再利用され、アルデヒドが酸から生ずる。
【０２３６】 フラビンレダクターゼをクローニングした[例えば、米国特許番号5,484,723;
この特許の典型的配列の配列番号１４参照]。これらおよびＮＡＤ(Ｐ)Ｈは、反 応に含まれ、細菌性ルシフェラーゼおよび長鎖アルデヒドによる反応用のＦＭＮ
Ｈ2を再度生ずる反応に含まれる。フラビンレダクターゼは、ルシフェラーゼ反 応であるＦＭＮによるＦＭＮＨ2への反応を触媒し、そのため、ルシフェラーゼ およびレダクターゼが当該反応システムに含まれるならば、生物発光性反応を維
持することができる。すなわち、細菌性ルシフェラーゼが何度も回るため、長鎖
アルデヒドが反応システム中に存在する限り生物発光は続く。
【０２３７】 生物発光性細菌により生ずる光の色は、生物発光反応におけるタンパク質青- 蛍光タンパク質[ＢＦＰ]の関係の結果でもある。よく知られたこのタンパク質[ 例えば、Lee et al. (1978) Methods in Enzymology LVII:226-234参照]はまた 、色彩のシフトの要因となるため、細菌性生物発光性反応に加えられる。
【０２３８】 ｆ．他のシステム (１) 渦鞭毛藻類の、生物発光を生ずるシステム 渦鞭毛藻類では、生物発光は、シンチロン(scintillon)と名付けられたオルガ
ネラで生ずる。これらオルガネラにより、細胞質から細胞液胞中へ膨出する。シ
ンチロンは、渦鞭毛藻類のルシフェラーゼおよびルシフェリン[その結合タンパ ク質を伴う]、幾らか放出される他の細胞質成分のみを含む。渦鞭毛藻類のルシ フェリンは、クロロフィル：
【化９】 またはその類似体に関係するテトラピロールである。
【０２３９】 ルシフェリンは、ｐＨ６．５で活性があるが、ｐＨ８では不活性である１３５
ｋＤ単一鎖タンパク質である[例えば、Hastings (1981) Bioluminescence and C
hemiluminescence, DeLuca et al., eds. Academic Press, NY, pp.343-360参照
]。発光活性は、ｐＨ８で生成した抽出物において、ｐＨを８から６に単にシフ トすることにより、得られる。これは、可溶化中および微粒子画分中で生ずる。
未処理シンチロン内では、発光性のフラッシュは、〜１００ミリ秒生じ、インビ
ボでのフラッシュ時間である。溶液中では、その動力学は、任意の酵素性反応の
ため、希釈に依存する。ｐＨ８では、ルシフェリンは、ルシフェリンとルシフェ
ラーゼとの反応を防止するタンパク質[ルシフェリン結合タンパク質]に結合する
。しかし、ｐＨ６では、ルシフェリンは、放出され、自由に酵素と反応する。
【０２４０】 LatiaおよびPholas軟体動物類由来のシステム 軟体動物Latia neritoidesおよびPholas種は、生物発光性動物である。ルシフ
ェリンは、構造：
【化１０】 を有し、合成される[例えば、 Shimomura et al. (1968) Biochemistry 7:1734-
1738; Shimomura et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69:2086-2089
参照]。ルシフェラーゼおよびルシフェリンの他に、当該反応は、第３の成分、 “パープルプロテイン(purple protein)”を有する。外来性還元剤により開始さ
れ得る当該反応は、以下の概要により表される：
【化１１】 ＸＨ2は還元剤である。
【０２４１】 そのため、本明細書での実施の場合、当該反応は、還元剤同様パープルプロテ
インを必要とする。
【０２４２】 (３)ミミズおよび他の環形動物 Diplocardia longa、Chaetopterus および Harmothoeのようなミミズ種は、生
物発光を示す。当該ルシフェリンは、構造：
【化１２】 を有する。
【０２４３】 当該反応は、ルシフェリンおよびルシフェラーゼに加えて、過酸化水素を必要
とする。ルシフェラーゼは発光タンパク質である。
【０２４４】 (４)発光ミミズ グレートブリテンで、およびオーストラリアおよびニュージーランドの穴で見
つかった発光ミミズ由来のルシフェラーゼ／ルシフェリンもまた本明細書の目的
である。
【０２４５】 (５)海洋性多毛類蠕虫システム Phyxotrix および Chaetopterusのような海洋性多毛類蠕虫の生物発光を生ず るシステムも本明細書での使用を考慮する。
【０２４６】 (６)南アメリカレールウェイビートル 南アメリカレールウェイビートル由来の生物発光を生ずるシステムもまた本明
細書の目的とする。
【０２４７】 (７)魚 本明細書の目的は、ルシフェラーゼおよび赤色の光を生ずる生物発光を生ずる
システムである。これらには、A. scintillansのようなAristostomias[例えば、
O'Day et al. (1974) Vision Res. 14:545-550参照]、Pachystomias、M. niger
のようなMalacosteusが含まれる。
【０２４８】 青／緑放射体には、cyclthone、ハダカイワシ、hatchet fish(agyropelecus) 、vinciguerria、howella、florenciella、およびChauliodusが含まれる。
【０２４９】 ｇ．蛍光タンパク質 AequoreaおよびウミシイタケRenillaの腎臓形は同じ発色団を共有し、また、 エクオレア(Aequorea)ＧＦＰは３９５ｎｍおよび４７５ｎｍの２つの吸収ピーク
を有するが、RenillaＧＦＰは、４９８ｎｍの単一の吸収ピークを有し、エクオ レアタンパク質の主要３９５ｎｍピークよりも約５．５倍大きなモノマーの消衰
係数である[Ward, W. W. in Biohtminescence and Chemiluminescence (eds. De
Luca, M. A. & McElroy, W. D.) 235-242 (Academic Press, New York, 1981)] 。中性ｐＨでの単離発色団および変性タンパク質のスペクトルは、何れかの天然
タンパク質とも一致しない[Cody, C. W. et al. (1993) Biochemistry 32:1212-
1218 ]。
【０２５０】 (１)緑および青蛍光タンパク質 本明細書に記載のように、青色の光は、Ｃａ2+およびコエレンテラジンルシフ
ェリンまたはその類似体の存在下、RenillaルシフェラーゼまたはAequorea発光 タンパク質を用い、生ずる。この光は、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)を反応に加
えるならば、緑の光に変換され得る。精製され[例えば、Prasher et al. (1992)
Gene 111:229-233参照]、またクローニングされた[例えば、米国出願番号08/11
9,678および米国特許出願番号 08/192,274を基礎とする国際PCT出願番号WO 95/0
7463、それらは引用によりこの文書に加える]緑色蛍光タンパク質を、刺胞動物 によるエネルギー転移アクセプターとして使用する。ＧＦＰは、ルシフェラーゼ
オキシルシフェリン励起状態複合体またはＣａ２＋活性化発光タンパク質から得
られるエネルギーにおいてインビトロで蛍光を発する。発色団をポリペプチドの
アミノ酸残基に修飾する。最も特徴的なＧＦＰは、Aequorea および Renilla の
ものである[例えば、Prasher et al. (1992) Gene 111:229-233; Hart, et al.
(1979)Biochemistry 18:2204-2210参照]。例えば、Aequorea victoria由来の緑 色蛍光タンパク質[ＧＦＰ]は、２３８アミノ酸を含み、青色の光を吸収し、そし
て緑色の光を放射する。そのため、このタンパク質が、コエレンテラジンおよび
酸素により電荷を帯びたエクオリン発光タンパク質を含む組成物中に含まれると
、カルシウム存在下、緑色の光を生ずる。そのため、ＧＦＰは、生ずる生物発光
の色を促進または変化させるため、エクオリンまたはRenillaルシフェラーゼま たは他の適当なルシフェラーゼを用いる、生物発光を生ずる反応に含まれ得る。
【０２５１】 ＧＦＰは、青色の光により活性化され、緑色の光を放射し、そのため、本明細
書に記載のように、ルシフェラーゼ非存在下、および新規アイテムを有する外的
光源と共に、使用され得る。同様に、Vibrio fischeri、Vibrio harveyi または
Photobacterium phosphoreum由来のもののような青色の蛍光タンパク質(ＢＦＰ
)もまた、青色の光を生ずる適当な波長の外的光源と共に使用され得る(例えば、
Karatani, et al., "A blue fluorescent protein from a yellow-emitting lum
inous bacterium," Photochem. Photobiol. 55(2):293-299 (1992); Lee, et al
., "Purification of a blue-fluorescent protein from the bioluminescent b
acterium Photobacterium phosphoreum" Methods Enzymol. (Biolumin. Chemilu
min.) 57:226-234 (1978); および Gast, et al. "Separation of a blue fluor
escence protein from bacterial luciferase" Biochem. Biophys. Res. Commun
. 80(1):14-21 (1978)参照、本明細書で引用するそれぞれの参考文献としてを引
用によりこの文書に加える)。特に、ＧＦＰおよび／またはＢＦＰまたは他のそ の蛍光タンパク質を、本明細書で提供の飲料および／または食物の組合せに使用
し、蛍光タンパク質から蛍光を生ずる適当な波長の光で空間を照らす。
【０２５２】 ＧＦＰおよび／またはＢＦＰまたは他の蛍光タンパク質を、飲料および泡形成
玩具、特に泡形成組成物または混合物を含む玩具のような、本明細書で提供する
任意の新規アイテムおよび組合せに使用する。また特定の目的には、化粧、特に
顔料(face paint)または化粧品、髪の毛の染料または髪の毛のコンディショナー
、ムースまたは他の製品中でのこれらタンパク質の使用がある。そのシステムは
、ルシフェラーゼが発光タンパク質の活性化に必要ではなく、当該タンパク質に
毒性がなく、安全に皮膚、髪、目に適用でき、摂取できるのため、特に興味が惹
かれる。これら蛍光タンパク質がまた、生物発光を生ずるシステムに加えて、使
用され、種々の色のアレイを促進するか、または作成する。
【０２５３】 これらタンパク質は、単独でまたは生物発光を生ずるシステムと組合せて使用
され、色のアレイが作成される。それらは、例えば飲料の色が経時的に変化する
か、または種々の色の層を含むため、組合せで使用される。
【０２５４】 (２)フィコビリンタンパク質 フィコビリンタンパク質は、シアノバクテリアおよび真核性藻類から得られた
水溶性蛍光タンパク質である[例えば、Apt et al. (1995) J. Mol. Biol. 238:7
9-96; Glazer (1982) Ann. Rev. Microbiol. 36:173-198; および Fairchild et
al. (1994) J. of Biol. Chem. 269:8686-8694参照]。これらタンパク質は、免
疫アッセイにおいて蛍光標識として使用され[Kronick (1986) J. of Immunolog.
Meth. 92:1-13参照]、当該タンパク質は単離され、それらをコード化するＤＮ Ａをも利用できる[例えば、Pilot et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 81:6983-6987; Lui et al. (1993) Plant Physiol 103:293-294; および Hou
mard et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5512-5521参照; 当該タンパク質は、例
えば、ProZyme, Inc.、San Leandro, CAから商業的に利用可能である]。
【０２５５】 これらの生物では、フィコビリンタンパク質は、フィコビリソームと名付けら
れた細胞よりも小さい構造で配置され、光合成反応において、可視光を吸収し、
直接のエネルギー転移機構を介して誘導エネルギーをクロロフィルに転移するこ
とにより関与する付随色素として機能する。
【０２５６】 ２つのクラスのフィコビリンタンパク質が、その色彩に基づいて知られる：フ
ィコエリトリン(赤色)およびフィコシアニン(青色)であり、それらは、それぞれ
最大４９０から５７０ｎｍの間および６１０から６６５ｎｍの間の吸収があると
報告されている。フィコエリトリンおよびフィコシアニンは、１つまたはそれ以
上のクラスの直鎖状テトラピロール発色団が共有結合する種々の割合のアルファ
およびベータモノマーからなる異種性複合体である。特に、フィコビリンタンパ
ク質には、(αΒ)6凝集タンパク質をしばしば付随する第三のγ-サブユニットも
含まれる。
【０２５７】 すべてのフィコビリンタンパク質には、フィコトロンビィンまたはフィコエリ
トビリン発色団の何れかが含まれ、また、他のビリン(bilin)フィコウロビリン 、クリプトビオリンまたは６９７ｎｍビリンを含む。γ-サブユニットは、Ｂ-お
よびＲ-フィコウロビリンの４９５-５００ｎｍ吸収ピークを生ずるフィコウロビ
リンと共有結合する。そのため、フィコビリンタンパク質のスペクトル特性は、
種々の発色団、アポフィコビリンタンパク質のサブユニット組成物および／また
はフィコビリンタンパク質の三次および四次構造に影響する局所環境の組合せに
より影響を受ける。
【０２５８】 ＧＦＰおよびＢＦＰについて上述したように、フィコビリンタンパク質は、ま
た、適当な波長の可視光により活性化され、そのため、ルシフェラーゼ非存在下
、そして外的光源と共に使用して、本明細書に記載のような新生物および特に組
織を発光させる。更に、フィコビリンタンパク質による固体支持体マトリクスへ
の結合が知られる。(例えば、米国特許番号4,714,682; 4,767,206; 4,774,189 および 4,867,908参照)。上記のとおり、これらタンパク質は、他の蛍光タンパ ク質および／または生物発光を生ずるシステムと共に使用し、色彩のアレイを生
じるか、または経時的に種々の色彩を生ずる。
【０２５９】 上記のとおり、フィコビリンタンパク質による固体支持体マトリクスへの結合
が知られている(例えば、米国特許番号4,714,682; 4,767,206; 4,774,189 およ び 4,867,908参照)。そのため、フィコビリンタンパク質は、生物発光反応、好 ましくは生物発光反応から生ずる光の波長を変換するルシフェラーゼの反応の１
つまたはそれ以上の成分と結合して微小担体に結合し得る。１つまたはそれ以上
のフィコビリンタンパク質に結合する微小担体は、本明細書に提供される任意の
方法に使用され得る。
【０２６０】 青色または緑色の光をより長い波長の光に変換すること、すなわち、赤色また
は殆ど下方の赤色は、本明細書に記載のように、腹腔鏡またはコンピューター断
層画像化システムを用いる新生物または特に組織の可視化に特に好ましい。
【０２６１】 そのため、放射光の周波数の変化が望まれるとき、フィコビリンタンパク質は
、生物発光を生ずる成分中に含まれ得る。
【０２６２】 Ｃ．核酸コード化ルシフェラーゼおよびＧＦＰの単離および同定 ２つの新規緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)および３つのコエレンテラジン使用の
ルシフェラーゼを含む核酸生物発光タンパク質を提供する。多くの提供、好まし
くは分析適用におけるコエレンテラジン使用のルシフェラーゼの利点は、光放射
ルシフェリンおよび分子状酸素を必要とし、ＡＴＰまたはＣａ＋＋のような補因
子は必要とされないことである。
【０２６３】 これらルシフェラーゼおよびＧＦＰをコードする核酸をまた使用し、関連種族
の関連核酸を単離する。また本明細書では、ルシフェラーゼをコード化する付加
遺伝子を単離する方法および、好ましくは、これまでは単離が困難とされてきた
関連種族のＧＦＰを単離する方法も提供する。
【０２６４】 Renilla mulleri、Pleuromamma、Gaussia および Ptilosarcus由来のルシフェ
ラーゼをコードする核酸が単離された。これら核酸を、プラスミドおよび発現ベ
クター中に、および適当な宿主細胞に導入し、または導入し得る。当該宿主細胞
を用い、および用い得、本明細書に記載のまたは当業者に既知の任意の適用に使
用し得るコード化タンパク質を生成する。
【０２６５】 クローニングしたＤＮＡフラグメントは、細菌性細胞、好ましくはE. coli中 で複製可能である。好ましいＤＮＡフラグメントはまた、複製の細菌性オリジン
を含み、細菌の世代から世代へＤＮＡフラグメントを維持する。この方法では、
多量のＤＮＡフラグメントが細菌中で複製により生じ得る。好ましい複製の細菌
のオリジンには、複製のf1-ori および col E1オリジンが含まれるが、これらに
限らない。好ましい宿主には、lacUVプロモーターのような誘導プロモーターに 操作しやすいように連結したＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの千色
体コピーを含む(米国特許番号4,952,496参照)。その宿主には、溶原菌E. coli 株 HMS174(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysS、HMS174(DE3)およびBL21(DE3)が含まれ るが、これらに限らない。株BL21(DE3)が好ましい。pLys株は、低レベルのＴ７ リソチーム、天然のＴ７ＲＮＡポリメラーゼインヒビターを提供する。温度感受
性ムテインのようなムテイン(mutuein)、それら真核性細胞、Saccharomyces の ような酵母細胞が好ましい。
【０２６６】 ルシフェラーゼおよびＧＦＰの融合タンパク質も提供する。それらを使用する
方法も提供する。
【０２６７】 当該方法は、Renilla および Gaussia の核酸およびタンパク質に関して記載 する。同様の方法を用い、本明細書で提供のPtilosarcus および Pleuromamma 核酸およびタンパク質を同定し、単離する。
【０２６８】 Renilla mullereiからクローニングしたＧＦＰは、非常に有用となるスペクト
ル特性を有する。これらの特性には、非常に高い量子効率、高いモル吸収および
一般に利用可能な蛍光フィルターの効果的な使用が含まれる(例えば、Chromaに より販売されているEndo GFPフィルターセット)。Renilla reniformis GFPは、 モルに基づくと、野生型のAequorea GFPよりも６倍明るく、最も明るい変異体よ
りも３倍から４倍明るいことが知られている。本明細書で提供される核酸クロー
ンによりコードされるRenilla mulerei GFPは、同様の機能特性を有し、当該ス ペクトルは、天然のreniformis GFP由来のものと同一であると思われる。
【０２６９】 励起および放射曲線型に基づくと、本明細書で提供されるPtilosarcus GFPは 、R. mullerei GFPのものよりも高いモル吸収を有し、より明るくなる。
【０２７０】 Guassia および Pleuromamma ルシフェラーゼは、第一の２つのカイアシ類の ルシフェラーゼがクローニングされ、両方とも排出され、そして、分泌タンパク
質効果的マーカーとなる。Guassia ルシフェラーゼは、これまでに見つけられた
最も小さなルシフェラーゼである(MW 19,900)。全てのルシフェラーゼは、コエ レンテラジンを使用するルシフェラーゼの典型的出力スペクトルを示す。全て、
陽イオン濃度に強力に依存するが、二価陽イオンを必要としない(データ示さず)
。当該ルシフェラーゼでは、他の種から単離されるルシフェラーゼとは有意な相
同性が全くない。
【０２７１】 しかし、PtilosarcusＧＦＰとR. mulleriＧＦＰとの間にはかなりの相同性（ −８０％）があるが、A. victoriaＧＦＰとの間には少し（−２５％）しかない 。それにもかかわらず、３種の蛋白質は全て長さが２３８ＡＡであり、このこと
は３種の蛋白質全ての構造が類似していることを示唆する。Aequorea victoria 、Renilla mullereiおよびPtilosarcusから単離したＧＦＰ類間の配列の比較か ら、R. mullereiおよびPtilisarcusの染色体配列は同一であり、A. victoriaか らのものと異なっていることが明らかになる。これらの配列の相違は、基本的蛍
光特性に影響を与えることなく修飾されうる蛋白質部位を指示するとともに、こ
れらの特性を変える残基を同定する手段を提供する。
【０２７２】 Gaussiaルシフェラーゼを暗号化している核酸の単離および同定 １．Gaussia属試料の単離 Gaussiaの試料は、メキシコ湾、太平洋および大西洋を含む世界の大洋から容 易に入手できる。例示した核酸の単離のために本書中で使用した種は、サンペド
ロおよびサンクレメンテ湾内において南カリフォルニア沿岸を離れた太平洋から
単離した。生物は、大洋水の試料を暗所でふるいにかけて光を発するとう脚類を
選別することにより同定する。捕獲後、試料は充分洗浄し、発光組織を濃厚化す
るため切断してもよい。ついで生物体全部または切断した組織を急速冷凍し、液
体窒素中に保存する。
【０２７３】 下記の実施例に詳述するように、Gaussiaルシフェラーゼ（例えば、配列番号 １９参照）を暗号化している核酸の単離源としては、Gaussia全体を使用した。
【０２７４】 ２．GaussiaのｃＤＮＡ発現ライブラリー類の調製 GaussiaのｃＤＮＡ発現ライブラリー類は、本書中に記載した方法にしたがっ て、またはその他の当業者に既知の方法（例えば、Sambrook et al. (1989) Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbar, N.Y.; U.S.Patent No. 5,292,658参照）により、インタ クトなＲＮＡから調製することができる。
【０２７５】 典型的には、ｃＤＮＡライブラリー類の調製は、選択した生物体からのポリア
デニル化ＲＮＡの単離と、次いで逆転写酵素を使用した１本鎖ＤＮＡの合成、Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の消化、続いて１本鎖ＤＮＡから２本鎖
ＤＮＡへの変換を含む。
【０２７６】 ａ．ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成 GaussiaのｃＤＮＡ調製のための総細胞質ＲＮＡ源としてGaussia全体を使用し
た。総インタクトＲＮＡは、当業者に周知の標準的技術（例えば、Sambrook et
al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La
boratory Press, Cold Spring Harbar, N.Y.参照）を用いて単離することができ
る。総細胞ＲＮＡを単離後、ポリアデニル化ＲＮＡ分子種は、オリゴデオキシチ
ミジレートセルロースカラム上のアフィニティクロマトグラフィーを用いて（例
えば、Aviv et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69: 1408記載のよ
うに）容易に非ポリアデニル化分子種から分離される。
【０２７７】 次いで、精製したGaussia polyA−ｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成反応に付して、総p
olyA−ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを生成させる。要約すると、逆転写酵
素を使用して、アニールしたpolydTプライマーを伸張しＲＮＡ／ＤＮＡ２重体を
生成させる。次いでＲＮアーゼ、例えばＲＮアーゼＨを用いてＲＮＡ鎖を消化し
、第２鎖合成後、ｃＤＮＡ分子をＳ１ヌクレアーゼまたはその他の適当なヌクレ
アーゼで平滑末端化する。得られる２本鎖ｃＤＮＡ断片は適当な発現ベクターに
直接ライゲートすることができ、また別法として、制限エンドヌクレアーゼ部位
を暗号化しているオリゴヌクレオチドリンカーをｃＤＮＡ分子の５’−末端にラ
イゲートしてｃＤＮＡ断片のクローニングを容易にすることができる。
【０２７８】 ｂ．ｃＤＮＡ発現ライブラリーの構築 ｃＤＮＡ発現ライブラリー類構築のための最良の確認ベクターはラムダベクタ
ー類である。ラムダベースのベクターは約１２ｋｂのｃＤＮＡインサート類に耐
え、標準的プラスミドベクター類に比較してライブラリーのスクリーニング、増
幅および保存により大きな便宜をもたらす。GaussiaのｃＤＮＡ発現ライブラリ ー類（および本書中のその他のライブラリー類）調製に現在好ましいベクターは
、当業者に既知（例えば、U.S.Pat.No. 5,128,256参照）で市販（Stratagene, L
a Jolla, CA）されているLambda、Uni-Zap、Lambda-Zap IIまたはLambda-ZAP Ex
press/EcoRI/XhoIベクター類である。
【０２７９】 一般に、Lambda-ZAPベクター類は、バクテリオファージラムダベクター系の高
い効率とプラスミド系の融通性を結びつけている。これらのベクター類中にクロ
ーンされた断片は、ヘルパーファージを用いて自動的に切断され再環状化されて
サブクローンをｐＢＫ由来ファージミド中に生成する。ｐＢＫファージミドは、
細菌中での選択用アンピシリン耐性遺伝子（ＡＭＰR）および真核細胞中での選 択用Ｇ４１８を担持し、またβ−ラクタマーゼ耐性遺伝子を含んでいてもよい。
組換えポリペプチドの発現は、細菌のlacZプロモーターおよび真核生物のＣＭＶ
プロモーターに制御されている。
【０２８０】 さらに具体的に述べると、これらのラムダベースベクター類は、プラスミド系
、例えばバクテリオファージラムダの右および左アームのブラケットをつけた周
知のｐＢＫブルースクリプト誘導体（Stratageneから入手できる）を含有するイ
ニシエーター・ターミネーターカセットから構成される。ラムダのアームは、複
製したＤＮＡの効率的なパッケージングを可能にし、他方切断できるイニシエー
ター・ターミネーターカセットは、ｃＤＮＡ断片の容易なクローニングおよびプ
ラスミドライブラリー生成を、追加的なサブクローニングなしで可能とする。
【０２８１】 本書中で使用する場合、ｃＤＮＡ断片類は、Lambda-Zapベクターのイニシエー
ター・ターミネーターカセットに含まれる多重クローニング部位に挿入されて１
セットのｃＤＮＡ発現ベクターを作り出す。ｃＤＮＡ発現ベクターのセットは、
適当なE. coli細胞に感染させ、次いで糸状ヘルパーファージを同時感染させる 。細胞内では、ヘルパーファージにより暗号化されたトランスに作用する蛋白質
、例えばM１３の遺伝子ＩＩ蛋白質が、ベクターのラムダアーム内に位置する２ 個の別のドメインを認識し、イニシエーター・ターミネーターカセットに隣接す
る１本鎖ニックを導入する。続くＤＮＡ合成期後、存在するニック鎖を置換する
新規なＤＮＡ鎖が合成され、イニシエーター・ターミネーターカセットを遊離さ
せる。置換された鎖は次いで環状化され、ヘルパー蛋白質により糸状ファージと
してパッケージされ、細胞から排出される。ｃＤＮＡを含有するＢＫプラスミド
は、E. coliのＦ’株に感染させ、感染した細胞をｐＢＫ含有細胞選択用アンピ シリン補足固体培地で培養することにより回収される。
【０２８２】 GaussiaのｃＤＮＡ発現ライブラリーは、当業者に知られた種々の方法を用い てスクリーニングされる。例えば、Gaussiaルシフェラーゼの同定は、青色光の 発光について肉眼でコロニーを観察することによる、または一種もしくはそれ以
上の帯域通過フィルターを用いて発光を観察することによる、機能的スクリーニ
ング法によって達成できる。
【０２８３】 ３．Gaussiaルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡの同定と単離 Gaussiaルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡは、本書中に記載した方法を 用いて、または当業者に既知のその他の方法を用いて、単離することができる。
下記に詳述するように、Gaussia A Uni-ZapのｃＤＮＡ発現プラスミドライブラ リーを調製し、コンピーテントなE. coli細胞に形質転換し、背景蛍光を吸収す るようにカーボンブラックを含有する改良Ｌ−ブロスプレートで培養した（例え
ば、実施例参照）。
【０２８４】 形質転換体にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド：et
al. Nakamura et al. (1979) Cell 18:1109-1117参照）含有溶液を噴霧して異 種ＤＮＡからの組換えGaussiaルシフェラーゼの発現を誘導した。その他の誘導 系を使用してもよい。好ましいプロモーター発現領域は、E. coli中で誘導およ び機能可能なものまたはウイルス起源ベクターの初期遺伝子である。適当な誘導
可能プロモーター類およびプロモーター領域類の例には、イソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ：et al. Nakamura et al. (1979) Cell 1
8:1109-1117参照）に応答するE. coliのlacオペレーター；重金属（例えば、亜 鉛）誘導に応答するメタロチオネインプロモーターの金属調節エレメント類（例
えば、Evans et al. U.S.Patent No. 4,870,009参照）；ＩＰＴＧに応答するフ ァージＴ７のlacプロモーター（例えば、U.S.Patent No. 4,952,496およびStudi
er et al. (1990) Meth. Enzymol. 185:60-89参照）およびＴＡＣプロモーター が含まれるが、これらに限定されるものではない。その他のプロモーターとして
は、Ｔ７ファージプロモーターおよびＴ３、Ｔ５およびＳＰ６プロモーターのよ
うなＴ７様ファージプロモーター類、trp、lppおよびE. coliからのlacUV5のよ うなlacプロモーター類；Ｐ１０またはバキュロウイルス／昆虫細胞発現系類の 多角体遺伝子プロモーター（例えば、U.S.Patent Nos. 5,243,041、5,242,687、
5,266,317、4,745,041、5,169,784参照）およびその他の真核生物発現系からの 誘導可能なプロモーター類が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２８５】 特に好ましいE. coli細胞の形質転換用プラスミドには、pET発現ベクター類（
U.S.Patent No. 4,952,496参照；NOVAGEN, Madison, WIから入手可能；また系を
記載したNovagen発行の文献参照）が含まれる。このようなプラスミド類には、p
ET34（図１参照）、Ｔ７のlacプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導可能なE
. coliのlacオペレーターおよびリプレッサー遺伝子を含有するpET11a；Ｔ７プ ロモーター、Ｔ７ターミネーターおよびE. coliのompT分泌シグナルを含有するp
ET12a-c；Hisカラムによる精製に使用するためのHis-Tag（商標）リーダー配列 およびカラムによる精製後に開裂を可能にするトロンビン開裂部位を含有するpE
T15b（NOVAGEN, Madison, WI）；Ｔ７lacプロモーター領域およびＴ７ターミネ ーターが含まれる。プラスミドpET34は、精製を補助するためにさらにＣＢＤを 含む。
【０２８６】 特に好ましいE. coli細胞の形質転換用プラスミドには、pET発現ベクター類（
U.S.Patent No. 4,952,496参照；NOVAGEN, Madison, WIから入手可能）が含まれ
る。例えば、プラスミドpET34-LICは、バクテリオファージのＴ７プロモーター の下流に異種ＤＮＡテンプレートを挿入するための多重クローニング部位を含有
する真核性発現ベクターである。Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼを発言する細菌性宿
主、例えばE. coliのBL21(DL3)株への形質転換により、高水準の異種蛋白質組換
え体発現がもたらされる。Gaussiaルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡが、 セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ：配列番号２１および２２参照）との融合物と
してpET34ベクターに挿入され、E. coli宿主細胞で発現されている。
【０２８７】 １２０以上の異なるＣＢＤ配列が同定され、配列の類似性に基づいて少なくと
も１0種のファミリーに分類されている（Tommes et al. (1995) in Enzymatic D
egradation of Insoluble Polysaccharides；Saddler,J.M. and Panner,M.,Eds.
: American Chemical Society, Washington, D.C.:pp 142-161）。ＣＢＤのclos
-Tag配列は、Clostrium cellulovoransのセルロース結合プロテインＡ（CbpA） から由来し、結晶セルロースに高い親和性を有する。ルシフェラーゼ発現クロー
ンを同定するため、黒色の寒天上で生育した形質転換体にコエレントラジンを噴
霧した。
【０２８８】 強い青緑色を発光する生成コロニーのため、発現は明らかであった。生育する
コロニーを選択した。青色光を発光する形質転換体のｃＤＮＡインサートのヌク
レオチド配列を決定した（例えば、配列番号１９参照）。本書中に記載するよう
に、７６５ＤＮＡインサートはアミノ酸１８５個のポリペプチドを暗号化してい
る。
【０２８９】 Renilla蛋白質を暗号化している核酸の単離および同定 １．Renilla属試料の単離 Renillaの試料は、メキシコ湾、太平洋および大西洋を含む世界の大洋から容 易に入手できる。Renillaは、約３０ないし１００フィートの深さの大洋底部に 典型的に生活し、掃海により容易に採集することができる。例えば、R.kolliker
iの試料は、カリフォルニア、またはバハ、メキシコの海岸から得ることができ る。別法として、Renillaの生きた試料は、商業的供給業者（たとえば、Gulf Ma
rine Incorporated, panacea, Fla）から購入してもよい。捕獲または受領後、 試料は充分洗浄し、発光組織を濃厚化するため切断してもよい。ついで生物体全
部または切断した組織を急速冷凍し、液体窒素中に保存する。
【０２９０】 下記の実施例に詳述するように、Renilla mulleriＧＦＰおよびルシフェラー ゼ（例えば、それぞれ配列番号１５および配列番号１７参照）を暗号化している
核酸の単離源としては、凍結組織を使用した。
【０２９１】 ２．RenillaのｃＤＮＡ発現ライブラリー類の調製 RenillaのｃＤＮＡ発現ライブラリー類は、本書中に記載した方法にしたがっ て、またはその他の当業者に既知の方法（例えば、Sambrook et al. (1989) Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbar, N.Y.; U.S.Patent No. 5,292,658参照）により、インタ クトなＲＮＡから調製することができる。
【０２９２】 典型的には、ｃＤＮＡライブラリー類の調製は、選択した生物体からのポリア
デニル化ＲＮＡの単離と、次いで逆転写酵素を使用した１本鎖ＤＮＡの合成、Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の消化、続いて１本鎖ＤＮＡから２本鎖
ＤＮＡへの変換を含む。
【０２９３】 ａ．ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成 RenillaのｃＤＮＡ調製のための総細胞質ＲＮＡ源として、Renilla全体または
切断したRenilla組織を使用することができる。総インタクトＲＮＡは、例えば 、当業者に一般的に知られた改良法（例えば、Chirgwin et al. (1970) Biochem
istry 18:5294-5299参照）を用いて、破砕したRenillaの組織から単離すること ができる。総細胞ＲＮＡを単離後、ポリアデニル化ＲＮＡ分子種は、オリゴデオ
キシチミジレートセルロースカラム上のアフィニティクロマトグラフィーを用い
て（例えば、Aviv et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69: 1408記
載のように）容易に非ポリアデニル化分子種から分離される。
【０２９４】 次いで、精製したRenilla polyA−ｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成反応に付して総pol
yA−ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを生成させる。要約すると、逆転写酵素
を使用して、アニールしたpolydTプライマーを伸張しＲＮＡ／ＤＮＡ２重体を生
成させる。次いでＲＮアーゼ、例えばＲＮアーゼＨを用いてＲＮＡ鎖を消化し、
第２鎖合成後、ｃＤＮＡ分子をＳ１ヌクレアーゼまたはその他の適当なヌクレア
ーゼで平滑末端化する。得られる２本鎖ｃＤＮＡ断片は適当な発現ベクターに直
接ライゲートすることができ、また別法として、制限エンドヌクレアーゼ部位を
暗号化しているオリゴヌクレオチドリンカーをｃＤＮＡ分子の５’−末端にライ
ゲートしてｃＤＮＡ断片のクローニングを容易にすることができる。
【０２９５】 ｂ．ｃＤＮＡ発現ライブラリーの構築 ｃＤＮＡ発現ライブラリー類構築のための最良の確認ベクターはラムダベクタ
ー類である。ラムダベースのベクターは約１２ｋｂのｃＤＮＡインサート類に耐
え、標準的プラスミドベクター類に比較してライブラリーのスクリーニング、増
幅および保存により大きな便宜をもたらす。RenillaのｃＤＮＡ発現ライブラリ ー類の調製に現在好ましいベクターは、当業者に既知（例えば、U.S.Pat.No. 5,
128,256参照）で市販（Stratagene, La Jolla, CA）されているLambda、Uni-Zap
、Lambda-Zap IIまたはLambda-ZAP Express/EcoRI/XhoIベクター類である。
【０２９６】 一般に、Lambda-ZAPベクター類は、バクテリオファージラムダベクター系の高
い効率とプラスミド系の融通性を結びつけている。これらのベクター類中にクロ
ーンされた断片は、ヘルパーファージを用いて自動的に切断され再環状化されて
サブクローンをｐＢＫ由来ファージミド中に生成する。ｐＢＫファージミドは、
細菌中での選択用ネオマイシン耐性遺伝子および真核細胞中での選択用Ｇ４１８
を担持し、またβ−ラクタマーゼ耐性遺伝子を含んでいてもよい。組換えポリペ
プチドの発現は、細菌のlacZプロモーターおよび真核生物のＣＭＶプロモーター
に制御されている。
【０２９７】 さらに具体的に述べると、これらのラムダベースベクター類は、プラスミド系
、例えばバクテリオファージラムダの右および左アームのブラケットをつけたｐ
ＢＫブルースクリプト誘導体（Stratagene, San Diego）を含有するイニシエー ター・ターミネーターカセットから構成される。ラムダのアームは、複製したＤ
ＮＡの効率的なパッケージングを可能にし、他方切断できるイニシエーター・タ
ーミネーターカセットは、ｃＤＮＡ断片の容易なクローニングおよびプラスミド
ライブラリー生成を、追加的なサブクローニングなしで可能とする。
【０２９８】 本書中で使用する場合、ｃＤＮＡ断片類は、Lambda-Zapベクターのイニシエー
ター・ターミネーターカセットに含まれる多重クローニング部位に挿入されて１
セットのｃＤＮＡ発現ベクターを作り出す。ｃＤＮＡ発現ベクターのセットは、
適当なE. coli細胞に感染させ、次いで糸状ヘルパーファージを同時感染させる 。細胞内では、ヘルパーファージにより暗号化されたトランスに作用する蛋白質
、例えばM１３の遺伝子ＩＩ蛋白質が、ベクターのラムダアーム内に位置する２ 個の別のドメインを認識し、イニシエーター・ターミネーターカセットに隣接す
る１本鎖ニックを導入する。続くＤＮＡ合成期後、存在するニック鎖を置換する
新規なＤＮＡ鎖が合成され、イニシエーター・ターミネーターカセットを遊離さ
せる。置換された鎖は次いで環状化され、ヘルパー蛋白質により糸状ファージと
してパッケージされ、細胞から排出される。ｃＤＮＡを含有するＢＫプラスミド
は、E. coliのＦ’株に感染させ、感染した細胞をｐＢＫ含有細胞選択用カナマ イシン補足固体培地で培養することにより回収される。
【０２９９】 RenillaのｃＤＮＡ発現ライブラリーは、当業者に知られた種々の方法を用い てスクリーニングされる。例えば、RenillaＧＦＰの同定は、青色光を使用し、 緑色の蛍光発光について肉眼でコロニーを観察すること、または一種もしくはそ
れ以上の帯域通過フィルターを用いて発光を観察することにより、機能的スクリ
ーニング法によって達成できる。
【０３００】 ３．RenillaＧＦＰを暗号化しているＤＮＡの同定と単離 RenillaＧＦＰを暗号化しているＤＮＡは、本書中に記載した方法を用いて、 または当業者に既知のその他の方法を用いて、単離することができる。下記に詳
述するように、R. mulleri A Uni-ZapのｃＤＮＡ発現プラスミドライブラリーを
調製し、コンピーテントなE. coli細胞に形質転換し、背景蛍光を吸収するよう にカーボンブラックを含有する改良Ｌ−ブロスプレートで培養した（例えば、実
施例４参照）。形質転換体にＩＰＴＧ含有溶液を噴霧して異種ｃＤＮＡからの組
換えRenillaＧＦＰの発現を誘導した。ＧＦＰ発現クローンを同定するため、形 質転換体を青色光、好ましくは４７０ないし４９０ｎｍの光中に置き、緑色の蛍
光を発光するコロニーを単離し、純粋培養として成長させた。
【０３０１】 緑色蛍光をもつ形質転換体のｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を決定し
た（例えば、配列番号１５）。実施例４に記載するように、１，０７９ｃＤＮＡ
インサートは、分子レベルで確認されている唯一の他のＧＦＰであるA.victoria
のＧＦＰと僅か２３．５％が同一であるアミノ酸２３８個のポリペプチドを暗号
化している。組換え蛋白質は、生きたRenilla種で報告されたのと類似する励起 および発光スペクトルを示す。
【０３０２】 ４．Renillaルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡの単離および同定 上記したR. mulleriのｃＤＮＡ発現ライブラリーを、Renillaルシフェラーゼ を暗号化しているＤＮＡのクローニングにも使用した（実施例５参照）。基本的
に上記のようにして、単一コロニーの形質転換体をカーボンブラック含有改良Ｌ
−ブロスプレート上で生長させ、異種ＤＮＡからの発現をＩＰＴＧで誘導した。
発現時間経過後、形質転換体にコエレンテラジンを噴霧し、青色光を発光するコ
ロニーをスクリーニングした。発光コロニーを単離し、純粋培養として成育させ
た。
【０３０３】 発光形質転換体に含有されるｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を決定し
た。実施例５に記載するように、１，２１７ｃＤＮＡインサートはアミノ酸３１
１個のポリペプチドを暗号化している。組換え蛋白質は、生きたRenilla種で報 告されたのと類似する励起および発光スペクトルを示す。
【０３０４】 Ｄ．核酸プローブ類、並びにその他の種からのルシフェラーゼおよびＧＦＰを暗
号化している核酸の単離およびクローニング法 Gaussiaのルシフェラーゼを暗号化している本書中に例示した核酸は、その他 のGaussia種からルシフェラーゼを単離するためのプローブ源として使用するこ とができる。例示したヌクレオチド配列に基づく任意の適当なプローブを、任意
の方法で使用できる。このようなプローブは、少なくとも低いストリンジェンシ
ー、より好ましくは中度のストリンジェンシー、最も好ましくは高いストリンジ
ェンシー条件下において、適当なGaussiaのライブラリー中の関連核酸とハイブ リダイズするものでなければならない。
【０３０５】 また本書中に、その他のGaussia種からルシフェラーゼを暗号化している核酸 を単離しクローニングするための特定の核酸プローブ類が提供される。典型的に
は、核酸プローブ類は縮重プローブであり、これは選択したGaussia種から調製 したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして完全長のGaussiaルシフェラー ゼを暗号化しているＤＮＡクローンを得るためのハイブリダイゼーションプロー
ブとして使用される。
【０３０６】 好ましい核酸プローブ類は、保存されたアミノ酸位置に基づいて、少なくとも
１４個のヌクレオチド、好ましくは１６ないし３０個のヌクレオチドからなる縮
重プローブとなるように、設計されている。例えば、プローブの設計に特に好ま
しい領域は、配列番号２０中に示したアミノ酸１ないし１８５に基づくものであ
る。その他の好ましい実施態様において、上記の好ましいアミノ酸領域を暗号化
している核酸プローブは、配列番号１９に示したこれらの領域を暗号化している
ヌクレオチド配列から選択される。
【０３０７】 別法として、これらのアミノ酸位置に対応するペプチドを調製し、当業者に周
知の方法（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbar, N.Y.）を使用し
て、動物を免疫しGaussiaルシフェラーゼに特異的なポリクローナルまたはモノ クローナル抗体を産生させるための免疫源として使用することができる。抗体は
、本書中に記載の方法にしたがって調製したもののようなｃＤＮＡ発現ライブラ
リーをスクリーニングして、部分長または完全長のクローンを発現しているクロ
ーンを同定するために使用することができる。
【０３０８】 核酸プローブ類、並びにその他のRenilla種からのＧＦＰを暗号化している核酸 の単離およびクローニング法 Renilla mulleriのＧＦＰを暗号化している本書中に例示した核酸は、その他 のRenilla種からＧＦＰ類を単離するためのプローブ源として使用することがで きる。例示したヌクレオチド配列に基づく任意の適当なプローブを、任意の方法
で使用できる。このようなプローブは、低いストリンジェンシー条件下において
、適当なRenillaのライブラリー中の関連核酸とハイブリダイズするものでなけ ればならない。
【０３０９】 また本書中に、その他のRenilla種からＧＦＰを暗号化している核酸を単離し クローニングするための特定の核酸プローブ類が提供される。これらのプローブ
類は、Renilla属の構成員間で共通するRenillaＧＦＰ蛋白質の領域に基づくもの
である（図１参照）。典型的には、核酸プローブ類は縮重プローブであり、これ
は選択したRenilla種から調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして 完全長のRenillaＧＦＰを暗号化しているＤＮＡクローンを得るためのハイブリ ダイゼーションプローブとして使用される。
【０３１０】 Renilla種間で共通するＧＦＰ領域を解明するため、生成したRenilla renifor
misＧＦＰを特定の化学的および蛋白質溶解分解、例えば、トリプシンおよびプ ロテイナーゼＱ、に付して分析用の種々の短いペプチドを生成させ、Renilla re
niformisペプチドのアミノ酸配列を決定した。
【０３１１】 図１は、Renilla mulleri緑色蛍光蛋白質の推定アミノ酸配列、および単離し たRenilla reniformisＧＦＰペプチド類に対して決定したアミノ酸配列の整列を
表示する。２個の種は密接に関連するが、Renilla ＧＦＰ類の配列は異なってい
る。しかし、高度に保存された配列が存在するので、この相違を個々のプローブ
の構築に利用することができる。R. mulleriおよびR. reniformisの配列は、満 足な整列を得るに充分な長さのペプチドとして存在する１８７個の残基中１０３
個において同一である。
【０３１２】 ２種のアミノ酸配列のある領域は、高度の保存性を示す。例えば、Renilla mu
lleriの配列の５１ないし６９位に対応する１９個のアミノ酸中１８個が、アミ ノ酸５１ないし６５位に対応する１６個の同一アミノ酸残基の連続範囲を含めて
、２種のRenillaＧＰＳ類間で同一である。また、図１に示すように、Renilla r
eniformisＧＦＰ（例えば、配列番号２０参照）は、R. mulleriの配列のアミノ 酸８１ないし１０６に対応するアミノ酸残基に対しかなり高度の類似性を共有す
る（６０．９％：２６個の同一アミノ酸中１８個）。
【０３１３】 好ましい核酸プローブ類は、保存されたアミノ酸位置に基づいて、少なくとも
１４個のヌクレオチド、好ましくは１６ないし３０個のヌクレオチドからなる縮
重プローブとなるように、設計されている。例えば、プローブの設計に特に好ま
しい領域は、配列番号１６中に示したアミノ酸５１ないし６８、８２ないし９８
および１９８ないし２０８、配列番号２０に示したアミノ酸配列、配列番号２１
に示したアミノ酸９−２０、および配列番号２３に示したアミノ酸３９−５３に
基づくものである。その他の実施態様において、上記の好ましいアミノ酸領域を
暗号化している核酸プローブは、配列番号１５に示したこれらの領域を暗号化し
ているヌクレオチド配列から選択される。これらの縮重核酸プローブは、Renill
a reniformisおよびその他の種におけるＧＦＰを暗号化しているＤＮＡの単離お
よびクローニング用のハイブリダイゼーションプローブとして、使用することが
できる。別法として、これらのプローブは、核酸増幅反応のプライマーとして使
用してもよい。
【０３１４】 別法として、これらのアミノ酸位置に対応するペプチドを調製し、当業者に周
知の方法（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbar, N.Y.）を使用し
て、動物を免疫しRenillaＧＦＰに特異的なポリクローナルまたはモノクローナ ル抗体を産生させるための免疫源として使用することができる。抗体は、本書中
に記載の方法にしたがって調製したもののようなｃＤＮＡ発現ライブラリーをス
クリーニングして、Renilla mulleriＧＦＰのアミノ酸残基５１ないし６９の全 部または一部分を包含する部分長または完全長のクローンを発現しているクロー
ンを同定するために使用することができる（例えば、図１；配列番号１５および
１６参照）。
【０３１５】 その他の種 PtilosarcusおよびPleuromammaの蛋白質を暗号化している本書中に記載の核酸
を用いて、同様な方法を使用することができる。
【０３１６】 Ｅ．蛋白質の組換え体発現 Gaussia １．Gaussiaの蛋白質を暗号化しているＤＮＡ 上記のように、Gaussiaのルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡは、天然源 から単離すること、本書中に記載したGaussiaの核酸配列に基づいて合成するこ と、または数多くの組換えＤＮＡクローニングおよび増幅技術、例えばポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することにより調製することができる。
【０３１７】 好ましい実施態様において、Gaussiaのルシフェラーゼを暗号化しているＤＮ Ａ断片は、配列番号２０に示したアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施態
様において、ＤＮＡ断片は、配列番号１９に示したヌクレオチド配列中のヌクレ
オチド３７−５９１により暗号化されているアミノ酸配列を暗号化している。
【０３１８】 ２．Gaussia蛋白質の組換え体生産用ＤＮＡ構築物 ＤＮＡを、所望の宿主中の発現用プラスミドに導入する。好ましい実施態様に
おいて、宿主は細菌性宿主である。プロモーターおよびオペレーターのような調
節領域であるプラスミド中のヌクレオチド配列は、Gaussiaルシフェラーゼを暗 号化しているヌクレオチド配列の転写のために互いに動作上の関連性をもつ。ま
た、Gaussiaのルシフェラーゼを暗号化しているヌクレオチド配列は、分泌シグ ナルを暗号化しているＤＮＡを含み、それにより生成するペプチドがGaussiaの ルシフェラーゼの前駆体となる。
【０３１９】 好ましい実施態様において、ＤＮＡプラスミドはまた転写終結配列を含む。プ
ロモーター領域および転写終結区は、同一または異なる遺伝子からそれぞれ独立
に選択される。
【０３２０】 異種蛋白質の発現に適当な広範囲の多目的ベクターが当業者に既知であり、市
販されている。調節可能な領域に連結された誘導可能なプロモーターまたは構成
的プロモーターを含む発現ベクターが好ましい。このようなプロモーターには、
Ｔ７ファージプロモーターおよびＴ３、Ｔ５およびＳＰ６プロモーターのような
Ｔ７様ファージプロモーター類、trp、lpp、tetおよびE. coliからのlacUV5のよ
うなlacプロモーター類；ＳＶ４０プロモーター；Ｐ１０またはバキュロウイル ス／昆虫細胞発現系類の多角体遺伝子プロモーター、レトロウイルスの末端反復
配列およびその他の真核生物発現系からの誘導可能なプロモーター類が含まれる
が、これらに限定されるものではない。
【０３２１】 ３．Gaussia蛋白質の組換え体生産用宿主生物 宿主生物は、細菌（例えば、E. coli）、酵母（例えば、Saccharomyces cerev
isiaeおよびPichia pastoris）、真菌、バキュロウイルス／昆虫系、両生類細胞
、哺乳類細胞、植物細胞および昆虫細胞のような、異種蛋白質の組換え体生産が
行われた生物を含むが、これらに限定されるものではない。現在好ましい宿主生
物は、細菌または酵母の株である。最も好ましい宿主生物は、E. coli株およびS
accharomyces cerevisiaeである。
【０３２２】 ４．Gaussia蛋白質の組換え体生産法 Gaussiaのルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡを、選択した宿主生物中に おけるポリペプチド発現のための適当なプロモーターと動作的に結合してプラス
ミドに導入する。Gaussiaのルシフェラーゼを暗号化しているＤＮＡ断片は、成 熟たんぱく質をペリプラズムまたは培地中を指向するように選択した宿主中で機
能する蛋白質分泌シグナルをも含むことができる。生成するルシフェラーゼは、
本書で実施例中に記載した方法を含めて、当業界で日常的に使用される精製法に
より精製することができる。
【０３２３】 適当な宿主細胞、好ましくは細菌細胞、さらに好ましくはE. coli細胞を形質 転換する方法、および異種蛋白質を暗号化している遺伝子を含有する上記細胞の
培養に適用できる方法は、一般的に当業界で知られている。例えば、Sambrook e
t al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbar, N.Y.参照。
【０３２４】 Gaussiaを暗号化している核酸分子が宿主細胞に導入されると、宿主細胞を、 プロモーターが誘導され、それにより動作的に結合したＤＮＡが転写される条件
下におくことにより、目的とする蛋白質が生産される。蛋白質を含有する溶解細
胞の細胞抽出物を製造し、生成する「澄明溶解物」をルシフェラーゼ源として使
用することができる。別法として、溶解物を別の精製工程（例えば、イオン交換
クロマトグラフィーまたはイムノアフィニティクロマトグラフィー）に付すこと
により、さらに溶解物を高濃度にし、または精製酵素の均質源を作ることができ
る（例えば、U.S.Patent Nos. 5,292,658および5,418,155参照）。
【０３２５】 Renilla １．Renillaの蛋白質を暗号化しているＤＮＡ 上記のように、RenillaのＧＦＰまたはRenillaのルシフェラーゼを暗号化して
いるＤＮＡは、天然源から単離すること、本書中に記載したRenillaの核酸配列 に基づいて合成すること、または数多くの組換えＤＮＡクローニングおよび増幅
技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して調製することができる
。
【０３２６】 好ましい実施態様において、RenillaのＧＦＰを暗号化しているＤＮＡ断片は 、配列番号１６に示したアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施態様におい
て、ＤＮＡ断片は、配列番号１５に示したヌクレオチド配列中のヌクレオチド２
５９−９７２により暗号化されているアミノ酸配列を暗号化している。
【０３２７】 好ましい実施態様において、Renillaのルシフェラーゼを暗号化しているＤＮ Ａ断片は、配列番号１８に示したアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施態
様において、ＤＮＡ断片は、配列番号１７に示したヌクレオチド配列中のヌクレ
オチド３１−９６３により暗号化されているアミノ酸配列を暗号化している。
【０３２８】 ２．Renilla蛋白質の組換え体生産用ＤＮＡ構築物 ＤＮＡを、所望の宿主中の発現用プラスミドに導入する。好ましい実施態様に
おいて、宿主は細菌性宿主である。プロモーターおよびオペレーターのような調
節領域であるプラスミド中のヌクレオチド配列は、RenillaＧＦＰまたはルシフ ェラーゼを暗号化しているヌクレオチド配列の転写のために互いに動作上の関連
性をもつ。また、RenillaのＦＧＦ突然変異蛋白質を暗号化しているヌクレオチ ド配列は、分泌シグナルを暗号化しているＤＮＡを含み、それにより生成するペ
プチドがRenillaＧＦＰの前駆体となる。
【０３２９】 好ましい具体例では、ＤＮＡプラスミドには転写ターミネーター配列もまた含
まれる。プロモーター領域および転写ターミネーターは各々独立に同一または異
なる遺伝子から選択される。
【０３３０】 異種タンパク質の発現に好適な広範な多目的ベクターが当業者に公知であり、
商業的に入手可能である。調節領域に連結している誘導プロモーターまたは構成
プロモーターを含む発現ベクターが好ましい。かかるプロモーターとしては、限
定されるものではないが、Ｔ３、Ｔ５およびＳＰ６プロモーターのようなＴ７フ
ァージプロモーターならびにその他のＴ７様ファージプロモーター、大腸菌(E.
coli)由来のｌａｃＵＶ５のようなｔｒｐ、ｌｐｐ、ｔｅｔおよびｌａｃプロモ ーター；ＳＶ４０プロモーター；バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のＰ１０ま
たは多角体遺伝子プロモーター、レトロウイルスの長い末端反復配列および他の
真核生物発現系由来の誘導プロモーターが挙げられる。
【０３３１】 原核生物のレニラ・ムレリ(Renilla mulleri)の組換え発現に特に好ましいベ クターとしては、十分に公知なＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのようなｌａｃ−
およびＴ７プロモーターに基づくベクターがあり、それらは商業的に入手可能で
ある(Stratagene, La, Jolla, CA)。
【０３３２】 ３．レニラタンパク質の組換え産生のための宿主生物 宿主生物としては異種タンパク質の組換え産生が行われた生物、限定されるも
のではないが、細菌（例えば、大腸菌）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレ
ビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびピキア・パストリス(Pichia pastoria
)）、真菌類、バキュロウイルス／昆虫系、両生類細胞、哺乳類細胞、植物細胞 および昆虫細胞などが挙げられる。現在のところ好ましい宿主生物は細菌または
酵母株である。最も好ましい宿主生物は大腸菌またはサッカロミセス・セレビシ
エ株である。
【０３３３】 ４．レニラタンパク質の組換え産生法 レニラＧＦＰまたはレニラ・ムレリルシフェラーゼをコードするＤＮＡを、選
択された宿主生物のポリペプチド発現のための適当なプロモーターへ機能しうる
連結でプラスミドへ導入する。レニラＧＦＰまたはルシフェラーゼをコードする
ＤＮＡ断片にはタンパク質分泌シグナルも含まれ、それが選択された宿主におい
て成熟ポリペプチドを周縁質または培地へ向けるよう機能する。得られたレニラ
ＧＦＰまたはルシフェラーゼは、下記実施例で記載される方法をはじめとする当
技術分野で通常使用される方法によって精製できる。
【０３３４】 好適な宿主細胞、好ましくは細菌細胞、およびさらに好ましくは大腸菌細胞を
形質転換する方法、ならびに異種タンパク質をコードする遺伝子を含む該細胞の
培養に適用できる方法は一般的に当技術分野では公知である。例えば、Sambrook
et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照。
【０３３５】 一度レニラがコードするＤＮＡ断片を宿主細胞へ導入されれば、宿主細胞を、
プロモーターが誘導され、それによって機能しうる形で連結されたＤＮＡが転写
される条件に曝すことによって所望のレニラＧＦＰが産生された。タンパク質を
含む溶解細胞の細胞抽出物を調製してもよく、得られた「清澄溶解物」を組換え
レニラＧＦＰまたはレニラ・ムレリルシフェラーゼ源として使用した。あるいは
、該溶解物をさらなる精製工程（例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは
イムノアフィニティークロマトグラフィー）に付してさらに溶解物を濃縮しても
よいし、または同種起源の精製酵素を提供してもよい（例えば、米国特許第５，
２９２，６５８号および第５，４１８，１５５号を参照）。
【０３３６】 Ｆ．ルシフェラーゼおよびＧＦＰをコードする異種核酸を発現する組換え細胞 これらの細胞、ベクターおよび方法をレニラおよびガウシア(Gaussia)につい て示す。同細胞、ベクターおよび方法をプルロマムマ(Pleuromamma)およびプチ ロサルカス(Ptilosarcus)タンパク質の発現に使用してもよい。
【０３３７】 ガウシア ガウシアルシフェラーゼをコードする異種核酸を含む組換え細胞を提供する。
好ましい具体例では、組換え細胞は細胞に対して機能的かつ無毒のコードされた
ガウシアルシフェラーゼを発現する。さらに好ましい具体例では、ガウシアルシ
フェラーゼには配列番号２０で示されるアミノ酸配列が含まれる。
【０３３８】 ある具体例では、組換え細胞は生物発光系の別の成分、好ましくは蛍光タンパ
ク質をコードする異種核酸を含んでもよい。好ましい具体例では、生物発光系成
分をコードする核酸はエクオリア(Aequorea)、バルグラ(Vargula)またはレニラ 種から単離される。さらに好ましい具体例では、さらなる生物発光系成分はレニ
ラ・ムレリまたはレニフォルミス(reniformis)ＧＦＰである。
【０３３９】 レニラＧＦＰおよびＧＦＰペプチドは天然源から単離することもできるし、ま
たは前記のもののようなレニラＧＦＰおよび／またはＧＦＰペプチドをコードす
る核酸でトランスフェクトした原核細胞または真核細胞から単離することもでき
る。
【０３４０】 細胞の例としては、細菌（例えば、大腸菌）、植物細胞、哺乳類起源の細胞（
例えば、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、アフリカミドリザル細胞および当業者に公知
な他のかかる細胞）、両生類細胞（例えば、ゼノプス・ラエビス(Xenopus laevi
s)卵母細胞）、酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パス
トリス）などが挙げられる。注入したＲＮＡ転写物を発現するための細胞の例と
しては、ゼノプス・ラエビス卵母細胞が挙げられる。ＤＮＡのトランスフェクシ
ョンに好ましい真核細胞は当業者に公知であり、あるいは経験的に同定すること
がき、ＨＥＫ２９３（受託番号＃ＣＲＬ１５７３としてＡＴＣＣから入手可能）
；Ｌｔｋ-細胞（受託番号＃ＣＣＬ１．３としてＡＴＣＣから入手可能）；ＣＯ Ｓ−７細胞（受託番号＃ＣＲＬ１６５１としてＡＴＣＣから入手可能）およびＤ
Ｇ４４細胞（ｄｈｆｒ- ＣＨＯ細胞；例えば、Urlaub et al., (1986) Cell. M
olec. Genet. 12: 555を参照）が挙げられる。現在のところ好ましい細胞として
は細菌および酵母株が挙げられる。
【０３４１】 ガウシアルシフェラーゼをコードする異種ＤＮＡを含んだ組換え細胞は、ガウ
シアルシフェラーゼをコードするＤＮＡによるトランスフェクションによるか、
または当業者に十分に公知な方法を用いてガウシアタンパク質をコードするＤＮ
ＡのＲＮＡ転写物を導入することにより作出される。ＤＮＡは直鎖ＤＮＡ断片と
して導入してもよいし、またはコーディングＤＮＡの安定発現または一時発現の
ための発現ベクターに含まれてもよい。
【０３４２】 異種ＤＮＡは、エピソームエレメントとして細胞内で維持してもよく、または
細胞の染色体ＤＮＡへ組み込んでもよい。次いで得られた組換え細胞は、かかる
培養物またはその二次培養物から培養または二次培養（または哺乳類細胞の場合
には継代）してもよい。またＤＮＡを細胞に安定的に組み込んでもよいし、当技
術分野で公知の方法を用いて一時的に発現させてもよい。
【０３４３】 該組換え細胞は、野生型または改変Ａ．ビクトリア(A. victoria)ＧＦＰもし くはＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞について記載された方法など（例えば
、米国特許第５，６２５，０４８号；国際特許出願公報第ＷＯ９５／２１１９１
号；第ＷＯ９６／２３８１０号；第ＷＯ９６／２７６７５号；第ＷＯ９７／２６
３３３号；第ＷＯ９７／２８２６１号；第ＷＯ９７／４１２２８号；および第Ｗ
Ｏ９８／０２５７１号参照）、細胞に基づいた広範なアッセイ法に使用できる。
【０３４４】 レニラ緑色蛍光タンパク質および／またはルシフェラーゼをコードする異質核
酸を発現する組換え細胞 レニラＧＦＰをコードする異質核酸を含んだ組換え細胞を提供する。好ましい
具体例では、該組換え細胞は細胞に対して機能的かつ無毒のコードされたレニラ
ＧＦＰを発現する。
【０３４５】 ある具体例では、該組換え細胞は生物発光系のある成分、好ましくは光タンパ
ク質またはルシフェラーゼをコードする異種核酸を含んでもよい。好ましい具体
例では、生物発光系成分をコードする核酸はエクオリア、バルグラまたはレニラ
種から単離される。さらに好ましい具体例では、該生物発光系成分は配列番号１
８で示されるアミノ酸配列を有するレニラ・ムレリである。
【０３４６】 レニラ・ムレリルシフェラーゼをコードする異種核酸を含んむ組換え宿主細胞
もまた提供する。好ましい具体例では、該異種核酸は配列番号１８で示されるア
ミノ酸配列をコードする。さらに好ましい具体例では、該異種核酸は配列番号１
７で示されるヌクレオチド配列をコードする。
【０３４７】 細胞の例としては、細菌（例えば、大腸菌）、植物細胞、哺乳類起源の細胞（
例えば、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、アフリカミドリザル細胞および当業者に公知
のその他のかかる細胞）、両生類細胞（例えば、ゼノプス・ラエビス卵母細胞）
、酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス）など
が挙げられる。注入したＲＮＡ転写物を発現するための細胞の例としては、ゼノ
プス・ラエビス卵母細胞が挙げられる。ＤＮＡのトランスフェクションに好まし
い真核細胞は当業者に公知であり、あるいは経験的に同定でき、ＨＥＫ２９３（
受託番号＃ＣＲＬ１５７３としてＡＴＣＣから入手可能）；Ｌｔｋ-細胞（受託 番号＃ＣＣＬ１．３としてＡＴＣＣから入手可能）；ＣＯＳ−７細胞（受託番号
＃ＣＲＬ１６５１としてＡＴＣＣから入手可能）およびＤＧ４４細胞（ｄｈｆｒ - ＣＨＯ細胞；例えば、Urlaub et al. (1986) Cell. Molec. Genet. 12: 555 参照）が挙げられる。現在のところ好ましい細胞としては細菌および酵母株が挙
げられる。
【０３４８】 レニラＧＦＰをコードする異種ＤＮＡを含んだ組換え細胞は、レニラＧＦＰを
コードするＤＮＡによるトランスフェクションによるか、または当業者に十分に
公知な方法を用いてレニラタンパク質をコードするＤＮＡのＲＮＡ転写物を導入
することにより作出される。該ＤＮＡは直鎖ＤＮＡ断片として導入してもよいし
、またはコーディングＤＮＡの安定発現または一時発現のための発現ベクターに
含まれてもよい。
【０３４９】 異種ＤＮＡはエピソームエレメントとして細胞内で維持してもよいし、または
細胞の染色体ＤＮＡへ組み込んでもよい。得られた組換え細胞は、次ぎにかかる
培養物またはその二次培養物から培養または二次培養（または哺乳類の場合には
継代）してもよい。また該ＤＮＡは安定的に組み込んでもよいし、当技術分野で
公知の方法を用いて一時的に発現させてもよい。
【０３５０】 該組換え細胞は、野生型または改変Ａ．ビクトリアＧＦＰもしくはＧＦＰ融合
タンパク質を発現する細胞について記載された方法など（例えば、米国特許第５
，６２５，０４８号；国際特許出願公報第ＷＯ９５／２１１９１号；第ＷＯ９６
／２３８１０号；第ＷＯ９６／２７６７５号；第ＷＯ９７／２６３３３号；第Ｗ
Ｏ９７／２８２６１号；第ＷＯ９７／４１２２８号；および第ＷＯ９８／０２５
７１号参照）、細胞に基づいた広範なアッセイ法に使用できる。
【０３５１】 Ｇ．ルシフェラーゼ 精製ガウシアルシフェラーゼおよびガウシアルシフェラーゼペプチド、ならび
にプルロマムマおよびレニラ・ムレリルシフェラーゼを提供する。該ルシフェラ
ーゼは選択された宿主細胞でタンパク質を発現させ、得られたルシフェラーゼを
単離することによって産生される。
【０３５２】 またレニラ・ムレリルシフェラーゼをコードする核酸も提供する。該核酸を使
用して、コードされたルシフェラーゼを産生する。現在のところ組成物、組合せ
および方法における使用に好ましいレニラ・ムレリルシフェラーゼは配列番号１
８で示されるアミノ酸配列を有している。該ルシフェラーゼは本明細書に記載さ
れるもののような幅広い最終用途へ適用される組成物および組合せに処方できる
。
【０３５３】 Ｈ．レニラおよびプチロサルカスＧＦＰ 精製レニラＧＦＰ、特にレニラ・ムレリＧＦＰおよび精製レニラ・レニフォル
ミスＧＦＰペプチドを提供する。現在のところ本明細書の組成物における使用に
好ましいレニラＧＦＰは配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するレニラ・
ムレリＧＦＰである。現在のところ好ましいレニラ・レニフォルミスＧＦＰペプ
チドとしては、配列番号１９〜２３で示されるアミノ酸配列から選択されたＧＦ
Ｐペプチドを含んだものである。
【０３５４】 レニラＧＦＰおよびＧＦＰペプチドは天然源から単離することもできるし、ま
たは前記Ｆ節に記載されたもののようなレニラＧＦＰおよび／またはＧＦＰペプ
チドをコードする核酸でトランスフェクトした原核または真核生物細胞から単離
することもできる。
【０３５５】 Ｉ．組成物 前記のようにガウシアおよびレニラタンパク質ならびに核酸について組成物お
よびコンジュゲートならびに使用法が記載されている。同組成物ならびにその調
製および使用法はプルロマムマおよびプチロサルカスタンパク質ならびに核酸を
伴う使用を意図したものである。
【０３５６】 １．ガウシアルシフェラーゼ組成物 ガウシアルシフェラーゼを含有する組成物を提供する。該組成物にはまたレニ
ラＧＦＰまたはＧＦＰペプチドも含まれていてよい。該組成物はそのために意図
される使用法に応じていくつかの形態のいずれを採ってもよい。ある具体例では
、該組成物は新規な生物発光製品、イムノアッセイまたはＦＲＥＴおよびＦＥＴ
アッセイに使用するために調製される。該組成物は光検出器内蔵のマルチウェル
アッセイ装置と組み合わせて（例えば、同時係属出の米国出願出願番号０８／９
９０，１０３参照）、腫瘍検出のために（例えば、米国出願出願番号０８／９０
８，９０９参照）または新規な生物発光製品において（米国出願出願番号０８／
５９７，２７４および０８／７５７，０４６参照）使用してもよい。
【０３５７】 これらの組成物は、以下に詳細に記載される方法のような、腫瘍性組織および
他の組織のインビボ検出のための診断系と組み合わせて含むなど、種々の方法お
よび系にて使用できる。これらの方法および産物にはルシフェラーゼが使用され
る当業者に公知のいずれのものも含まれ、限定されるものではないが、米国出願
出願番号０８／７５７，０４６、０８／５９７，２７４および０８／９９０，１
０３、米国特許第５，６２５，０４８号；国際特許出願公報第ＷＯ９５／２１１
９１号；第ＷＯ９６／２３８１０号；第ＷＯ９６／２７６７５号；第ＷＯ９７／
２６３３３号；第ＷＯ９７／２８２６１号；第ＷＯ９７／４１２２８号；および
第ＷＯ９８／０２５７１号が挙げられる。
【０３５８】 ２．レニラルシフェラーゼ組成物 レニラ・ムレリルシフェラーゼをコードするＤＮＡを用いて、コードされるル
シフェラーゼを産生させるが、これは本明細書に記載される生物発光系の成分と
して使用されるとともに、飲料において、腫瘍形成の診断法および本明細書に記
載される診断チップにおいてなど、診断における用途を有する。これらの方法お
よび産物にはルシフェラーゼが使用される当業者に公知のいずれのものも含まれ
、限定されるものではないが、米国出願出願番号０８／７５７，０４６、０８／
５９７，２７４および０８／９９０，１０３、米国特許第５，６２５，０４８号
；国際特許出願公報第ＷＯ９５／２１１９１号；第ＷＯ９６／２３８１０号；第
ＷＯ９６／２７６７５号；第ＷＯ９７／２６３３３号；第ＷＯ９７／２８２６１
号；第ＷＯ９７／４１２２８号；および第ＷＯ９８／０２５７１号が含まれる。
【０３５９】 その他の具体例では、レニラ・ムレリルシフェラーゼと残りの成分は個別の組
成物として包装してもよく、混合時に発光する。例えば、レニラ・ムレリルシフ
ェラーゼを含有する組成物を、生物発光基質および生物発光アクチベーターを含
有する個別の組成物とは別にではあるがともに使用するために提供してもよい。
もう１つの例では、ルシフェラーゼおよびルシフェリン組成物を個別提供し、生
物発光アクチベーターを他の２つの組成物の混合後、または混合と同時に加えて
もよい。
【０３６０】 ３．レニラＧＦＰ組成物 レニラＧＦＰまたはＧＦＰペプチドを含有する組成物を提供する。該組成物は
そのために意図される使用法に応じて多くの形態のうちいずれを採ってもよい。
ある具体例では、例えば、該組成物は新規な生物発光製品、イムノアッセイまた
はＦＲＥＴおよびＦＥＴアッセイに使用するために処方されたレニラＧＦＰまた
はＧＦＰペプチド、好ましくはレニラ・ムレリＧＦＰまたはレニラ・レニフォル
ミスＧＦＰペプチドを含んでいる。また該組成物は本明細書に記載されたものの
ような光検出器内蔵のマルチウェルアッセイ装置と組み合わせて使用してもよい
。
【０３６１】 レニラ・ムレリＧＦＰまたはＧＦＰペプチドおよび生物発光系の少なくとも１
つの成分、好ましくはルシフェラーゼ、ルシフェリンまたはルシフェラーゼとル
シフェリンを含有する組成物を提供する。好ましい具体例では、ルシフェラーゼ
／ルシフェリン生物発光系は昆虫系、腔腸動物系、有櫛動物系、細菌系、軟体動
物系、甲殻類系、魚類系、環形動物系、およびミミズ系から単離されるものから
選択される。現在のところ好ましい生物発光系はレニラ、エクオリア、バルグラ
から単離されるものである。
【０３６２】 さらに好ましい具体例では、生物発光系成分は配列番号１８で示されるアミノ
酸配列を有するレニラ・ムレリルシフェラーゼである。これらの組成物は、以下
に詳細に記載される方法のような、腫瘍性組織および他の組織のインビボ検出の
ための診断系と組み合わせて含む、種々の方法および系において使用できる。
【０３６３】 これらの方法および産物にはルシフェラーゼが使用される当業者に公知のいず
れのものも含まれ、限定されるものではないが、米国出願出願番号０８／７５７
，０４６、０８／５９７，２７４および０８／９９０，１０３、米国特許第５，
６２５，０４８号；国際特許出願公報第ＷＯ９５／２１１９１号；第ＷＯ９６／
２３８１０号；第ＷＯ９６／２７６７５号；第ＷＯ９７／２６３３３号；第ＷＯ
９７／２８２６１号；第ＷＯ９７／４１２２８号；および第ＷＯ９８／０２５７
１号が含まれる。
【０３６４】 ４．コンジュゲート 本明細書で提供されるコンジュゲートには、標的化物質であるレニラＧＦＰ、
レニラ・ムレリもしくはガウシアルシフェラーゼおよびその他のルシフェラーゼ
（光タンパク質またはルシフェラーゼ酵素を含む）またはルシフェリンと直接ま
たはリンカーを介して結合した、組織特異的または腫瘍特異的モノクロナール抗
体もしくはその断片などの標的化剤が含まれる。標的化物質は微粒子担体と組み
合わせてもよい。該結合は、化学的に、標的化物質がタンパク質である場合には
融合タンパク質の組換え発現により、また化学的なものと組換え発現の組合せに
よるいずれでも達成される。該標的化剤は腫瘍細胞表面抗原またはその他の組織
特異的抗原のような選択された組織または細胞種と優先的に結合するものである
。
【０３６５】 コンジュゲートの調製法は当業者に公知である。例えば、コンジュゲート形成
用に設計されたエクオリンおよびかかるエクオリンを含有するコンジュゲートを
製造されている［例えば、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／１８３４２参照；またSm
ith et al. (1995) in American Biotechnology Laboratoryも参照］。エクオリ
ンはスルフヒドリル反応結合剤によって抗体分子と結合させた(Stultz et al. (
1992) Use of Recombinant Biotinylated Apoaequorin from Escherichia coli.
Biochemistry 31, 1433-1442)。かかる方法は、本明細書における使用のために
改変して、標的化剤として有用なタンパク質または他のかかる分子と結合したル
シフェラーゼを得てもよい。またバルグラルシフェラーゼも他の分子と結合させ
た［例えば、日本出願第ＪＰ５０６４５８３、１９９３年３月１９日を参照］。
かかる方法は、本明細書における使用のために改変し、標的化剤として有用な分
子と結合したルシフェラーゼを得てもよい。
【０３６６】 該コンジュゲートを使用し、生物発光反応による発光との直接的相関によって
生物学的サンプル中の特定の抗原の存在を検出または定量することができる。
【０３６７】 別法として、選択された基質との結合に特に好適なアミノ酸残基の付加による
などして、生物発光系の成分を結合に関して改変してもよい。これはＤＮＡを改
変し、かかる改変ＤＮＡを発現させることによって容易に達成され、ＮまたはＣ
末端に付加的残基を有するルシフェラーゼを得ることができる。
【０３６８】 コンジュゲートの調製法は当業者に公知である。例えば、コンジュゲート形成
用に設計されたエクオリンおよびかかるエクオリンを含有するコンジュゲートが
製造されている［例えば、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／１８３４２を参照；また
Smith et al. (1995) in American Biotechnology Laboratoryも参照］。エクオ
リンはスルフヒドリル反応結合剤によって抗体分子と結合させた(Stultz et al.
(1992) Use of Recombinant Biotinylated Apoaequorin from Escherichia col
i. Biochemistry 31, 1433-1442)。かかる方法は本明細書における使用のために
改変し、標的化剤として有用なタンパク質または他のかかる分子と結合したエク
オリンを製造してもよい。またバルグラルシフェラーゼも他の分子と結合させた
［例えば、日本出願第ＪＰ５０６４５８３、１９９３年３月１９日を参照］。か
かる方法は本明細書における使用のために改変し、標的化剤として有用なタンパ
ク質または他のかかる分子と結合したエクオリンを製造してもよい。
【０３６９】 エクオリン抗体コンジュゲートを使用し、生物発光反応による発光との直接的
相関によって生物学的サンプル中の特定の抗原の存在を検出または定量した。
【０３７０】 系の選択は、所望の色および所望の生物発光持続時間、ならびに特定の製品と
いった因子による。標的化剤の選択は、主として視覚化しようとする腫瘍または
組織のタイプおよび特徴、ならびに視覚化を行う設定による。例えば、アリスト
ストミズ(Aristomias)から単離されたルシフェラーゼは赤色光を発するが、これ
は光電子増倍管を用いて組織からの検出が可能であるため、特に術前診断に有益
である。
【０３７１】 ａ．リンカー 本明細書においては当業者に公知のいずれのリンカーを使用してもよい。その
他のリンカーも化学的に製造するコンジュゲートへの組み込みに好適である。化
学的に結合するコンジュゲートに好適なリンカーとして、はジスルフィド結合、
チオエーテル結合、ヒンダードジスルフィド結合、ならびにアミンおよびチオー
ル基のような遊離反応性基間の共有結合が挙げられる。これらの結合はヘテロ二
官能価試薬を用いてポリペプチドの一方または両方に反応性チオール基を生じさ
せ、次いで一方のポリペプチドのチオール基が、他方で反応性マレイミド基また
はチオール基が結合し得る反応性チオール基またはアミン基と反応することによ
ってなされる。その他のリンカーとしては、ビスマレイミデオトキシプロパン、
酸に不安定なトランスフェリンコンジュゲートおよびアジピン酸ジヒドラジドの
ような酸切断可能リンカー（これらはより酸性の細胞内コンパートメントにおい
て切断される）；ＵＶまたは可視光への暴露によって切断される架橋剤および種
々のドメイン（ヒトＩｇＧ1の不変領域由来のＣH１、ＣH２およびＣH３など）の
ようなリンカー（Batra et al. (1993) Molecular Immunol. 30: 379-386を参照
）が挙げられる。いくつかの具体例では、それぞれのリンカーの所望の特性を利
用するよう数種のリンカーが挙げられている。
【０３７２】 化学的リンカーおよびペプチドリンカーをリンカーとＴＡおよび標的化された
物質に共有結合することによって挿入してもよい。下記のヘテロ二官能価剤を使
用してかかる共有結合を達成してもよい。またペプチドリンカーを、融合タンパ
ク質としてリンカーおよびＴＡ、リンカーおよび標的化物質、またはリンカー、
標的化物質およびＴＡをコードするＤＮＡを発現することによって結合してもよ
い。
【０３７３】 可変リンカーおよびコンジュゲートの溶解性を高めるリンカーについての使用
も意図され、本明細書では単独または他のリンカーとの併用のいずれかが考えら
れる。アミノ基およびチオール基間に共有結合を形成して、チオール基をタンパ
ク質に導入するために使用されるいくつかのヘテロ二官能価架橋試薬は当業者に
公知である（例えば、PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Handbook,
1992-1993を参照、これにはかかる試薬の調製および使用法が記載され、かかる
試薬の市販元が示されている；また例えば、Cumberら (1992) Bioconjugate Che
m. 3: 397-401; Thorpe et al. (1987) Cancer Res. 47: 5924-5931; Gordon et
al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 308-312; Walden et al. (1986） J.
Mol. Cell Immunol. 2: 191-197; Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173:
723-737; Mahan et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 163-170; Wawryznaczak e
t al. (1992) Br. J. Cancer 66: 361-366; Fattom et al. (1992) Infection &
Immun. 60: 584-589も参照）。これらの試薬を使用してＴＡおよび標的化物質 間に共有結合を形成してもよい。これらの試薬としては、限定されるものではな
いが、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ；ジスルフェートリンカー）；スルホスクシンイミジル６−［３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ
）；チオ硫酸スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジル（ＳＭＢ
Ｔ、ヒンダードジスルフィドリンカー）；スクシンイミジル６−［３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）；スルホ
スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキ
シレート（スルホ−ＳＭＣＣ）；スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）
ブチレート（ＳＰＤＥ；ヒンダードジスルフィド結合リンカー）；スルホスクシ
ンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル
−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＥＤ）；スルホスクシンイミジル７−
アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート（ＳＡＭＣＡ）；スルホスクシン
イミジル６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノ
エート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）； １，４−ジ−［３’−（２’−ピリジル ジチオ）プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）；４−スクシンイミジルオキ
シカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルチオ）トルエン（ＳＭＰＴ、ヒ
ンダードジスルフェートリンカー）；スルホスクシンイミジル６−［α−メチル
−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−Ｓ
ＭＰＴ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（ＭＢＳ）ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエ
ステル（スルホ−ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミ
ノベンゾエート（ＳＩＡＢ；チオエーテルリンカー）；スルホスクシンイミジル
（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）；スクシンイ
ミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）；スルホスクシ
ンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）；
アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）が挙げられる。
【０３７４】 特に標的化された物質がより容易に反応しやすくなるよう切断する必要がある
場合には酸切断可能リンカー、光切断可能および熱感受性リンカーを使用しても
よい。
【０３７５】 酸切断可能リンカーとしては、限定されるものではないが、ビスマレイミデオ
トキシプロパン；およびアジピン酸ジヒドラジドリンカー（例えば、Fattom et
al. (1992) Infection & Immun. 60: 584-589を参照）、ならびにトランスフェ リンの十分な部分を含んでおり、細胞内トランスフェリン循環経路へ入ることが
許される酸に不安定なトランスフェリンコンジュゲート（例えば、Welhoner et
al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 4309-4314を参照）が挙げられる。
【０３７６】 光切断可能リンカーは露光によって切断されるリンカーであり（例えば、Gold
macher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104-107、このリンカーは参照するこ
とにより本明細書に組み入れられる、を参照）、それにより露光時に標的化され
た物質を遊離する。露光によって切断される光切断可能リンカーは公知であり（
例えば、Hazum et al. (1981) in Pept. Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunf
eldt, K (Ed), pp. 105-110、これにはシステインの光切断可能保護基としての ニトロベンジル基の使用について記載されている； Yen et al. (1989) Makromo
l. Chem 190: 69-82、これにはヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体、
グリシン共重合体、フルオレセイン共重合体およびメチルローダミン共重合体を
含む水溶性光切断可能な共重合体について記載されている； Goldmacher et al.
(1992) Bioconj. Chem. 3: 104-107、これには近紫外線（３５０ｎｍ）への暴 露時に光分解される架橋剤および試薬について記載されている；およびSenter e
t al. (1985) Photochem. Photobiol 42: 231-237、これには光切断可能結合を もたらす塩化ニトロベンジルオキシカルボニル架橋試薬について記載されている
、を参照）、それにより露光時に標的化された物質を遊離する。かかるリンカー
は光ファイバーを用いて露光し得る皮膚病または眼病の治療において特に有用で
ある。該コンジュゲートの投与後、眼または皮膚もしくは他の身体の部分を露光
することができ、その結果該コンジュゲートから標的化成分が遊離する。かかる
光切断可能リンカーは動物の身体からの迅速に浄化すべき標的化剤の除去が望ま
しい診断プロトコールに関して有用である。
【０３７７】 ｂ．標的化剤 標的化剤には、標的化物質を腫瘍または特異化組織［標的化された組織］の細
胞と相互作用し、局在化させる物質のいずれもが含まれる。かかる薬剤には、標
的化された組織において十分に高濃度または高い含量で存在する細胞表面タンパ
ク質または受容体と特異的に相互作用する物質のいずれもが含まれ、それによっ
て適当な生物発光試薬およびアクチベーターと接触した際に光を発する。これら
の物質には、限定されるものではないが、取り込まれないよう選択的に改変され
た成長因子、メトトレキセートおよび抗体、特に腫瘍特異的抗原に対して生じた
抗体が挙げられる。いくつかのヒト腫瘍から多くの腫瘍特異的抗原が確認されて
いる。
【０３７８】 抗腫瘍抗原抗体 ポリクロナールおよびモノクロナール抗体を選択された抗原に対して製造して
もよい。あるいは、かかる多くの抗体は現在入手可能である。抗体およびそれぞ
れが向けられた腫瘍抗原例の一覧は米国出願出願番号に示されており、これは参
照することにより本明細書にそのまま組み入れられる。挙げられた抗体のいずれ
もが本明細書にて提供された方法に従って、生物発光成分と結合すると考えられ
る。
【０３７９】 好ましい抗体のうち、本明細書の方法における使用にはヒト起源のもの、また
はさらに好ましくはヒト化されたモノクロナール抗体である。これらはヒトの診
断に好ましい。
【０３８０】 コンジュゲートの調製 タンパク質結合法としてはいずれの方法を使用してもよい。例えば、ルシフェ
ラーゼを抗体とを結合させる方法については米国特許第５，４８６，４５５号に
記載されている。前記のように、標的化剤およびルシフェリンまたはルシフェラ
ーゼを共有結合、すなわちスルフィドリル結合または他の好適な結合によるｂな
どして直接結合させてもよいし、またはリンカーによって結合させてもよい。標
的化剤当たり１を超えるルシフェラーゼまたはルシフェリン、すなわちルシフェ
ラーゼまたはルシフェリン当たり１を超える標的化剤があってもよい。
【０３８１】 あるいは、抗体、またはそのＦ（Ａｂ）2抗原結合断片もしくは他のタンパク 質標的化剤を組換えＤＮＡ手法を用いてルシフェラーゼと（直接または結合ペプ
チドを介して）融合してもよい。例えば、表３の抗腫瘍抗体のいずれかをコード
するＤＮＡを同一翻訳読み取り枠において、前記ルシフェラーゼ、例えば、配列
番号１〜１４のいずれかをコードするＤＮＡと結合させ、発現ベクターへ挿入し
てもよい。発現のためには、組換え抗体ルシフェラーゼ融合物をコードするＤＮ
Ａを細菌または酵母のような適当な宿主へ導入してもよい。
【０３８２】 ５．診断系における使用のための組成物の処方 多くの具体例では、本明細書にて提供されるレニラ・ムレリルシフェラーゼの
ようなレニラＧＦＰおよび診断系の成分は２つの組成物：コンジュゲートを含有
する第１の組成物；および生物発光系の残りの成分を含有する第２の組成物に処
方する。該組成物は動物、特に哺乳類、さらに特にはヒトへの投与に好適ないず
れかの方法で処方する。かかる製剤には局所、局部、腸、非経口、膀胱内、皮内
、硝子体内(intravitreal)、皮下、筋肉内または静脈内投与に好適なものが含ま
れる。
【０３８３】 例えば、好ましい具体例においてルシフェラーゼ（または光タンパク質）と結
合した標的化剤であるコンジュゲートを全身または局部投与用に処方する。残り
の成分は別の局所または局部用の第２の組成物に処方する。第２の組成物は典型
的には反応に加わるスペクトルシフトレバーのような他の物質のいずれもが含ま
れる。第２の組成物の成分は徐放型または分解および／または血液成分との相互
作用を妨げるいくつか別の様式に処方することが好ましい。
【０３８４】 ａ．第１の組成物：コンジュゲートの処方 前記のように、コンジュゲートにはルシフェラーゼまたはルシフェリンのいず
れかと標的化剤が含まれる。好ましいコンジュゲートは標的化剤とルシフェラー
ゼ、特にガウシア、レニラ・ムレリまたはプルロマムマルシフェラーゼ間で処方
される。該コンジュゲートは局所、局部、静脈内および全身適用に好適な医薬組
成物に処方してもよい。有効濃度の１以上のコンジュゲートを好適な医薬担体ま
たはビヒクルと混合する。有効なコンジュゲートの濃度または量には投与した際
に一定量の送達が必要であり、その結果、標的化された細胞または組織と結合し
た標的化部分は十分量となり、それにより手術処置中に細胞または組織が視覚化
できる。典型的には、組成物は単用量投与用に処方される。有効な濃度および量
はコンジュゲートを、本明細書にて記載されるもののような公知のインビトロお
よびin vivo系において試験することによって経験的に決定すればよく、次ぎに
ヒトまたは他の動物に対する用量そこから推定してよい。
【０３８５】 コンジュゲートとビヒクルの混合または添加の際に得られる混合物は溶液、懸
濁液、またはエマルションなどであってよい。得られる混合物の形態は意図した
投与様式および選択された担体またはビヒクルにおけるコンジュゲートの溶解性
をはじめとするいくつかの因子による。有効濃度は注目される部位に十分量の標
的化物質を標的化し、それにより、残りの試薬と混合すると手術処置中に該部位
が光を放つに十分なものである。かかる濃度または量は、マウス異種移植腫瘍モ
デルまたはウサギ眼病モデルからのデータのようなインビトロおよび／またはイ
ンビボデータに基づいて決定してよい。要すれば、コンジュゲートの医薬上許容
される塩または他の誘導体を調製してもよい。
【０３８６】 本明細書にて提供されるコンジュゲートの投与に好適な医薬担体またはビヒク
ルには、特定の投与様式に好適な当業者に公知のかかる担体のいずれもが含まれ
る。さらに、該コンジュゲートは組成物中の唯一の医薬上成分として処方しても
よいし、または他の有効成分と組み合わせてもよい。
【０３８７】 該コンジュゲートは適当な経路、例えば、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下
、または局所のいずれかによって、液体、半液体、または固体形態で投与でき、
各投与経路に好適な形で処方される。現在のところ、静脈内または局部投与が好
ましい。典型的には、腫瘍および血管増殖疾患は全身、皮内、または筋肉内投与
様式によって視覚化される。
【０３８８】 該コンジュゲートは医薬上許容される担体に、検出可能な組織を作り、患者ま
たは動物に望ましくない副作用を生じないよう十分な量で含まれる。副作用の数
および程度はコンジュゲートが投与される条件によることが理解される。例えば
、腫瘍のような生命を脅かす疾病を診断しようとする場合には、ある有毒で望ま
しくない副作用が許容されるが、あまり重大でない疾患を診断する際には許容さ
れないであろう。
【０３８９】 組成物中のコンジュゲートの濃度はその吸収、不活性化および排泄速度、投与
計画および投与量、ならびに当業者に公知なその他の因子によるであろう。典型
的には有効用量は有効成分の血清濃度において約０．１ｎｇ／ｍｌないし約５０
〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０μｇ／ｍｌとなるべきである。典型的に
は該医薬組成物は選択されたコンジュゲートによって、１日当たり体重キログラ
ム当たりコンジュゲート約０．０１ｍｇないし約１００〜２０００ｍｇの用量を
供すべきである。典型的には静脈内投与には、約０．０５ないし１ｍｇ／ｋｇの
用量が十分であろう。眼病組織の視覚化または関節への局部注入などについての
局部使用では、単用量投与当たり約１ｎｇないし１０００μｇまで、好ましくは
約１μｇないし約１００μｇを提供すべきである。投与する量は選択されるコン
ジュゲート、兆候、および許容される可能性のある副作用の関数であると理解さ
れる。用量は認められたモデルを用い、経験的に決定できる。
【０３９０】 該有効成分は一度に投与してもよいし、またはいくつかの少用量に分けて時間
をおいて投与してもよい。投与についての正確な用量および時間は診断される病
状の関数であり、公知の試験プロトコールを用いるか、またはインビトロまたは
インビボ試験データからの推定により経験的に決定してよいものと理解される。
また濃度および用量値は緩和しようとする病状の重篤度によって変わることにも
注意すべきである。さらに特定の患者いずれに対しても、個々の必要性および投
与するまたは組成物の投与を管理する者の専門的判断によって経時的に特異な用
量計画を調整すべきこと、および本明細書で示された濃度範囲は単に例示的なも
のであり、請求される組成物の範囲または実施を限定するものではないと理解さ
れる。
【０３９１】 非経口、皮内、皮下、または局所適用に使用される溶剤または懸濁液には次の
いずれの成分：注入用の水、塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリ
ン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤のような無菌希釈剤；ベンジル
アルコールおよびメチルパラベンのような抗微生物剤；アスコルビン酸および重
亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）
のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩のようなバッファー
；ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような浸透圧調整剤を含んでもよい
。親製剤をガラス、プラスチックまたはその他の好適な材料で作製されたアンプ
ル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアルに封入してもよい。
【０３９２】 静脈内投与する場合、好適な担体としては生理的食塩水、リン酸緩衝塩水（Ｐ
ＢＳ）およびグルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコ
ール、ならびにその混合物のような増粘剤および可溶化剤を含む溶液が挙げられ
る。またリポソーム懸濁液も医薬上許容される担体として好適である。これらは
当業者に公知な方法に従って調製され得る。
【０３９３】 該コンジュゲートは徐放性製剤またはコーティング剤のように身体からの急速
な排出を防ぐ担体とともに調製してもよい。かかる担体としては、限定されるも
のではないが、埋植片およびマイクロカプセル封入送達系のような制御放出製剤
、および酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエス
テル、ポリ酢酸およびその他のもののような生分解性、生体適合性ポリマーが挙
げられる。
【０３９４】 該コンジュゲートはゲル剤、クリーム剤およびローション剤の形で皮膚および
眼などの粘膜への局部塗布のような局所または局部適用に、および眼への適用に
、または大槽内または髄腔内適用に処方してもよい。かかる水剤、特に眼病用途
のものは適当な塩を用いて０．０１％ないし１０％等張溶液、ｐＨ約５ないし７
として処方してもよい。また眼病用組成物にはヒアルロン酸のようなさらなる成
分を含めてもよい。該コンジュゲートは局部適用のエアゾル剤として処方しても
よい（例えば、米国特許第４，０４４，１２６号、第４，４１４，２０９号、お
よび第４，３６４，９２３号を参照）。
【０３９５】 また手術処置中にインビボで該コンジュゲートを活性化するための組成物もエ
アゾル剤として処方してもよい。これらの組成物にはアクチベーターおよびルシ
フェリン（コンジュゲートがルシフェラーゼを標的化する場合）またはルシフェ
ラーゼ（コンジュゲートが腔腸アジンのようなルシフェリンを標的化する場合）
のような残りの生物発光剤も含まれる。
【０３９６】 経口投与が所望されるならば、該コンジュゲートを胃の酸性環境から保護する
組成物で提供すべきである。例えば、該組成物は胃内ではそれを完全に保持し、
腸内で有効な化合物を放出する腸溶性コーティングにて処方できる。一般に経口
組成物に不活性希釈剤または可食担体を含めて打錠するか、またはゼラチンカプ
セルに封入してもよい。経口投与の目的のためには、該有効化合物または化合物
群に賦形剤を配合し、錠剤、カプセル剤、またはトローチ剤の形で使用できる。
医薬上適合する結合剤およびアジュバント物質を組成物の一部として含めてもよ
い。
【０３９７】 錠剤、ピル、カプセル剤、トローチ剤などは以下の成分、または類似した性質
を持つ化合物のいずれを含んでもよい：微晶質セルロース、トランガカントゴム
およびゼラチンのような結合剤；スターチおよびラクトースのような賦形剤、限
定されるものではないが、アルギン酸およびコーンスターチのような分散剤；限
定されるものではないが、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；限定され
るものではないが、コロイド二酸化珪素のような滑剤；スクロースまたはサッカ
リンのような甘味剤；およびペパーミント、サリチル酸メチルおよび果物香味の
ような香味剤。
【０３９８】 単位投与形がカプセルである場合、それはさらに前記タイプの物質、脂肪油の
ような液体担体を含んでもよい。また単位用量形は投与単位の物理形態を改変す
る他の種々の物質、例えば、糖またはその他の腸溶性薬剤のコーティングを含ん
でもよい。また該コンジュゲートはエリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウエハー
ス、チューインガムなどの成分として投与してもよい。シロップには有効な化合
物とともに、甘味剤としてのスクロース、および少量の防腐剤、染料ならびに着
染料および香味料を含んでもよい。
【０３９９】 また該有効物質は、所望の作用を損なうことのない他の有効物質と、または腫
瘍の治療のためのシスプラチンのような所望の作用を補う物質と混合してもよい
。
【０４００】 最後に、該化合物は、包装材料、包装材料内の本明細書で提供された１以上の
コンジュゲートまたは化合物、および該コンジュゲートが提供される適応症を示
すラベルを含んだ製品として包装してもよい。
【０４０１】 ｂ．第２の組成物 第２の組成物には生物発光反応の残りの成分が含まれる。これらの成分が全身
投与されるという好ましい具体例では、残りの成分にはルシフェリンまたは基質
、および所望によりスペクトルシフターのような添加剤、特に本明細書にて提供
されるＧＦＰが含まれる。ルシフェリンのようなこれらの成分は、コンジュゲー
トについての前記したように処方することができる。いくつかの具体例において
この組成物中のルシフェリンまたはルシフェラーゼはタンパク質担体または他の
担体と結合し、血液細胞または他の細胞成分への分解または溶解が妨げられる。
【０４０２】 第２の組成物が局所または局部的に用いられる具体例では、それをスプレー剤
またはエアゾル剤もしくは局所または局部使用に好適な他の手段に処方できる。
【０４０３】 本明細書に記載されるある具体例では、組織に対して標的化した徐放性製剤と
してカプセル封入するなど、アクチベーターを除く全ての成分を一緒に処方する
。放出される際、該組成物は所望の部位に局在化し、光を放ち始める。
【０４０４】 実施上、２種類の組成物は同時投与しても、連続投与してもよい。典型的には
、コンジュゲートを含む第１の組成物を最初に、一般には手術の１または２時間
前に投与し、次いで第２の組成物を術前または手術中のいずれかに投与する。
【０４０５】 本明細書にて提供されるコンジュゲートには直接、または標的化される物質、
ルシフェラーゼ（光タンパク質またはルシフェラーゼ酵素を含む）またはルシフ
ェリンへのリンカーにより結合する組織特異的または腫瘍特異的モノクロナール
抗体もしくはその断片などの標的化剤が含まれる。標的化される物質は微粒子担
体と組み合わせてもよい。該結合は、化学的に、標的化される物質がタンパク質
である場合には融合タンパク質の組換え発現による、また化学的および組換え発
現の組合せによるなどいずれかにより達成される。標的化剤は腫瘍細胞表面抗原
または他の組織特異的抗原のような選択された組織または細胞種と優先的に結合
するものである。
【０４０６】 コンジュゲートの調製法は当業者に公知である。例えば、コンジュゲート形成
のために設計されたエクオリンおよびかかるエクオリンを含有するコンジュゲー
トが製造されている［例えば、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／１８３４２を参照；
またSmith et al. (1995) in American Biotechnology Laboratoryも参照］。エ
クオリンはスルフヒドリル反応結合剤によって抗体分子と結合させた(Stultz et
al. (1992) Use of Recombinant Biotinylated Apoaequorin from Escherichia
coli. Biochemistry 31, 1433-1442)。かかる方法を本明細書における使用のた
めに改変し、標的化剤として有用なタンパク質または他のかかる分子と結合した
エクオリン製造してもよい。またバルグラルシフェラーゼも他の分子と結合させ
た［例えば、日本出願第ＪＰ５０６４５８３、１９９３年３月１９日を参照］。
かかる方法を本明細書における使用のために改変し、標的化剤として有用なタン
パク質または他のかかる分子と結合したエクオリンを製造してもよい。
【０４０７】 エクオリン抗体コンジュゲートを使用し、生物発光反応による発光との直接手
的相関によって生物学的サンプル中の特定の抗原の存在を検出または定量した。
【０４０８】 別法として、選択された基質との結合に特に好適なアミノ酸残基の付加による
など、レニラＧＦＰまたはレニラ・ムレリもしくはガウシアルシフェラーゼまた
は生物発光系の成分を結合するために改変してもよい。これはＤＮＡを改変し、
かかる改変ＤＮＡを発現させることによって容易に達成され、ＮまたはＣ末端に
付加残基を有するルシフェラーゼを得ることができる。
【０４０９】 系の選択は所望の色および所望の生物発光持続時間、ならびに特定の製品のよ
うな因子による。標的化剤の選択については主として視覚化しようとする腫瘍ま
たは組織のタイプおよび特徴、ならびに視覚化を行う設定による。
【０４１０】 ｃ．標的化剤と組み合わせた反応の実施 各生物発光系と選択された標的化剤が併用される特定の方法は薬剤および視覚
化しようとする腫瘍または組織の関数となる。しかしながら、一般には反応物の
ルシフェリン、レニラＧＦＰまたはレニラ・ムレリ、プルロマムマもしくはガウ
シアルシフェラーゼまたは他のルシフェラーゼと標的化剤とを結合し、術前に動
物へ投与する。手術中に、注目される組織を生物発光系の残りの成分と接触させ
る。標的化剤が作用するいずれの組織も光を放つであろう。
【０４１１】 生物発光系によって生じたいずれの色の可視光も本明細書の方法における使用
について考えられる。可視光は様々な強度および波長をもつ青、緑および／また
は赤色光の組合せであることが好ましい。近赤外光の波長約７００ないし１３０
０ｎｍが柔組織および骨質を透過することが知られているため、組織に深く埋め
込まれた哺乳類組織または腫瘍を通して腫瘍または特異化組織を視覚化するには
、より長い波長の可視光、すなわち赤色および近赤外光が好ましい［例えば、米
国特許第４，２８１，６４５号を参照］。
【０４１２】 他の具体例では、手術中に組織一面に無菌溶液を噴霧し、次いで残りの成分を
塗布することによるなどして該コンジュゲートを組織に塗布してもよい。標的化
された抗原を発現する組織が光を放つ。
【０４１３】 懸濁液、散剤、ペースト剤または他の好適な無菌形態のいずれかのような組成
物において試薬を提供することができる。それらをスプレー剤、エアゾル剤、ま
たはいずれの好適な形態で提供してもよい。該試薬をマトリックス、特にインビ
ボ使用に好適、かつそれらが毛細管を通過するサイズを有するマイクロビーズに
結合させてもよい。典型的には反応に必要な成分の１種以上を除くすべて、好ま
しくは１種を除くずべてが混合され、ともに提供され、Ｃａ2+、レダクターゼを
有するＦＭＮ、ＦＭＮＮＨ2、ＡＴＰ、空気または酸素の添加によるなど、合せ た成分を残りの成分と接触させて反応を誘発する。
【０４１４】 好ましい具体例では、ルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ／ルシフェリンを
患者への投与の前に標的化剤と組み合わせて提供する。次いで標的化剤コンジュ
ゲートを残りの成分とインビボで接触させる。本明細書にて明らかとなるように
、各系を選択された標的化剤と組み合わせる数多くの方法がある。
【０４１５】 Ｊ．組合せ さらに、前記プルロマムマ、ガウシアもしくはレニラルシフェラーゼおよび／
またはレニラおよびプチロサルカスＧＦＰを製品と組み合わせて使用して新規な
製品を製造する。かかる製品および調製法は同時係属出願の米国出願出願番号８
／５９７，２７４および０８／７５７，０４６に詳細に記載されている。同時係
属出願にて提供される方法および製品において本明細書で提供されるルシフェラ
ーゼおよび／またはＧＦＰを使用してもよい。これら新規な製品は工業製品であ
り、エンターテインメント、レクリエーションおよび娯楽に向けて設計されてい
る。これらには限定されるものではないが、玩具、特に水鉄砲、玩具のシガレッ
ト、玩具の「ハロウィーン」卵、フットバッグおよびボード／カードゲーム；フ
ィンガーペイントおよび他のペイント、粘液性玩具；布地、特にシャツ、帽子お
よびスポーツ用具服のような衣類、糸およびヤーン；泡作製玩具および泡を発生
させる他の玩具における泡；風船；小像；バスパウダー、ボディローション、ゲ
ル、パウダーおよびクリーム、ネイルエナメル、化粧品（メーキャップ用品、練
り歯磨きおよび他の磨歯剤を含む）、石鹸、ボディーペイント、および泡立て溶
剤のような身辺細貨；インク、紙のような製品；ゼラチン、アイシングおよびフ
ロスティングのような食べ物；ルシフェリンおよびトランスジェニック魚類、特
にルシフェラーゼを発現するトランスジェニック魚類を含む魚料理；ルシフェリ
ンまたはルシフェラーゼ、好ましくはルシフェラーゼを発現するトランスジェニ
ック植物を使用するためのルシフェリンを含む肥料；および飲料ビール、ワイン
、シャンパン、ソフトドリンク、および角氷ならびに他の形態の氷；液体「花火
」および液剤、混合物、懸濁液、粉剤、ペースト剤、粒剤または他の適当な形の
組成物の他のかかる噴射剤、スプレー剤またはエアゾル剤を含む噴水器が挙げら
れる。
【０４１６】 本明細書で提供される生物発光系と組み合わすことができ、それによってエン
ターテインメント、レクリエーションおよび／または娯楽を提供できるいずれの
製品もレクリエーション用の、またはロゴまたは商標と関連した商品および／ま
たはサービスを広告するためなどの注意を引く製品の使用を含め、本明細書で意
図される。かかる使用は、かかる製品の通常または標準使用に加えて、またはそ
れとともに、もしくはその代わりにというものである。組合せの結果として、水
鉄砲および噴水器の場合のようにその製品は光を放ち、発光液もしくは液体また
は粒子のスプレーを生じる。
【０４１７】 Ｋ．使用法 １．腫瘍および他の組織の診断法 レニラ・ムレリもしくはプチロサルカスＧＦＰおよび／またはレニラ・ムレリ
、プルロマムマもしくはガウシアルシフェラーゼを含む組成物を使用して、イン
ビボまたはイン シトゥにて組織を、好ましくは腫瘍組織を診断および視覚化す る方法を提供する。例えば、レニラ・ムレリＧＦＰタンパク質を、同時係属出願
の出願番号０８／９０８，９０９に記載されるもののようなイン シトゥにおけ る組織の視覚化を生物発光による診断系と併用することができる。該系は非観血
的および侵観血的手法中などの腫瘍組織および特異組織を視覚化および検出する
のに特に有用である。該系にはレニラ・ムレリＧＦＰ、ルシフェラーゼまたはル
シフェリンのような標的化される物質と結合した組織特異的、特に腫瘍特異的標
的化剤を含むコンジュゲートを含有する組成物が含まれる。また該系には生物発
光反応の残りの成分および／またはＧＦＰを含む第２の組成物も含まれる。いく
つかの具体例においてアクチベーターを除くすべての成分はイン シトゥにて提 供されるか、または身体もしくは組織に存在し、単一の組成物に含まれている。
【０４１８】 特に診断系には２つの組成が含まれる。好ましい具体例では、生物発光反応の
成分と結合した腫瘍抗原に対して向けられた抗体、ルシフェラーゼまたはルシフ
ェリン、好ましくはルシフェラーゼを含むコンジュゲートを含む第１の組成物を
提供する。ある具体例では、腫瘍特異的標的化剤含むコンジュゲートをルシフェ
ラーゼまたはルシフェリンと結合させる。他の具体例では、腫瘍特異的標的化剤
を好ましくは１以上の生物発光成分と、好ましくは１以上のルシフェラーゼ分子
と結合した微粒子担体と結合させる。
【０４１９】 第２の組成物は生物発光系の残りの成分、典型的にはルシフェリンまたはルシ
フェラーゼ基質を含む。いくつかの具体例では、これらの成分、特にルシフェリ
ンを血清アルブミンのようなタンパク質、または他のタンパク質担体と結合させ
る。全身投与された成分は担体および徐放性処方によってルシフェリンまたはル
シフェラーゼを失活させるヘモグロビンのような血液細胞成分と相互作用するこ
となく標的化された組織まで移動できる。
【０４２０】 ２．疾患の診断法 チップ方法論、ガウシア、プルロマムマもしくはレニラ・ムレリルシフェラー
ゼおよび／またはプチロサルカスもしくはレニラ・ムレリＧＦＰを含むルシフェ
ラーゼ／ルシフェリン生物発光系を使用して、疾患、特に感染症の診断法を提供
する。特に該チップには生物発光系および／またはＧＦＰによって放射される光
子を検出する内蔵光検出器が含まれる。
【０４２１】 ある具体例では、該チップは同時係属出願の米国出願出願番号０８／９９０，
１０３に記載されたもののように光検出器のＸ−Ｙアレイのようなアレイを有す
る集積回路を使用して作製される。回路の表面を処理して、それをチップが向け
られる目的の診断アッセイの病状に対して不活性にし、抗体のような結合分子の
誘導体化によるなどして改変する。特に細菌抗原に特異的な抗体のような選択さ
れた抗体または抗体のパネルを各光検出器上のチップ表面に付着させる。チップ
を試験サンプルと接触させた後、チップをレニラＧＦＰのようなＧＦＰと結合し
た二次抗体と接触させて、プルロマムマ、ガウシアもしくはＲ．ムレリルシフェ
ラーゼのような生物発光系の成分と結合したキメラ抗体−ＧＦＰ融合タンパク質
または抗体を形成する。抗体は抗原に特異的である。生物発光反応の残りの成分
を加えて、もし生物発光系の成分と結合するいずれかの抗体がチップ上に存在す
るならば、光を発生させ、近接する光検出器によって検出される。光検出器は機
能しうる形でコンピュータに連結され、結合された抗体を確認する情報によって
プログラムが作成され、発生を記録し、それによって試験サンプル内に存在する
抗原を同定する。
【０４２２】 ３．キメラレニラもしくはプチロサルカスＧＦＰ、レニラ・ムレリルシフェラ
ーゼ、プルロマムマルシフェラーゼおよびガウシアルシフェラーゼ融合タンパク
質の生成方法 キメラＧＦＰおよびルシフェラーゼ融合タンパク質の生成方法を提供する。方
法には注目される遺伝子をコードするＤＮＡまたはその一部と、本明細書で提供
されるＧＦＰまたはルシフェラーゼをコードするＤＮＡとの同一翻訳読み取り枠
での結合が含まれる。注目されるコードされたタンパク質はフレーム内でＧＦＰ
またはルシフェラーゼのアミノまたはカルボキシ末端と結合し得る。次いでキメ
ラタンパク質をコードするＤＮＡを好適な発現ベクターのプロモーターエレメン
トと機能しうる形で連結させる。あるいは、該プロモーターエレメントは注目さ
れる標的化遺伝子とＧＦＰまたはルシフェラーゼコード配列から上流に結合した
プロモーター含有断片から直接得られ、キメラＧＦＰタンパク質が産生され得る
。
【０４２３】 例えば、セルロース結合ドメインのＮ末端部分に結合したガウシアルシフェラ
ーゼコードＤＮＡを含むキメラ融合体が提供される（配列番号２１および２２を
参照）。
【０４２４】 ４．化合物を同定するための細胞に基づくアッセイ 注目される遺伝子のプロモーターエレメントの制御下でレニラ・ムレリまたは
プチロサルカスＧＦＰをコードする異種ＤＮＡを発現する組換え細胞を使用して
、化合物を同定するため方法を提供する。組換え細胞を使用して、ＧＦＰが介在
する蛍光性を測定することによって注目されるプロモーターからの転写レベルを
変調させる化合物またはリガンドを同定することができる。またキメラＧＦＰを
発現する組換え細胞を使用し、組換え細胞内におけるＧＦＰ介在蛍光の分布領域
を確認することによって遺伝子発現またはタンパク質の流れをモニターするか、
または標的タンパク質の細胞分布を決定してもよい。
【０４２５】 Ｌ．キット 診断およびイムノアッセイ法において、本明細書で記載されるものを含む新規
な製品とともに使用するためにガウシア、プルロマムマもしくはレニラ・ムレリ
ルシフェラーゼまたはレニラおよびプチロサルカスＧＦＰを含むキットを製造し
てもよい。
【０４２６】 ある具体例では、該キットには製品と組み合わせた適当な試薬と生物発光のた
めの製品が含まれる。例えば、これらのキットは泡吹き込みまたは発生玩具とと
もに、または水鉄砲とともに使用することができる。またこれらのキットは再装
填または投入カートリッジを含んでもよい。
【０４２７】 もう１つの具体例では、該キットを腫瘍組織および他の組織を検出し視覚化す
るために使用することもでき、それにはルシフェラーゼおよび／またはレニラ・
ムレリもしくはプチロサルカスＧＦＰと生物発光系の少なくとも１成分を含む第
１の組成物と生物発光系の残りの成分と必要な活性化剤のいずれもを含んだ活性
組成物を含むの第２の組成物が含まれる。
【０４２８】 他の具体例では、該キットをマルチウェルアッセイ装置の使用により疾患、特
に感染病を検出し確認するために使用し、それにはそれぞれが内蔵光検出器を有
し、１以上の感染原因物質に特異的な抗体または抗体のパネルを付着させる複数
のウェルと、例えば、レニラ・ムレリＧＦＰタンパク質、キメラ抗体−レニラ・
ムレリＧＦＰ融合タンパク質、Ｆ（Ａｂ）2抗体断片−レニラ・ムレリＧＦＰ融 合タンパク質と、または例えば、ガウシアもしくはレニラ・ムレリルシフェラー
ゼを含むかかるコンジュゲートと結合する感染原因物質に特異的な抗体のような
第２の抗体を含む組成物が入ったマルチウェルアッセイ装置が含まれる。第２の
組成物は、レニラ・ムレリルシフェラーゼを励起させ、装置の光検出器によって
検出される緑色光を放射させて原因物質の存在を示すためのレニラまたはエクオ
リア種のようなＧＦＰの励起範囲内の波長光を放射する系などの生物発光系の残
りの成分を含む。
【０４２９】 さらなる具体例では、該キットは診断系の成分を含む。該キットはコンジュゲ
ート含有組成物、好ましくはレニラもしくはプチロサルカスＧＦＰまたはガウシ
ア、またはプルロマムマもしくはレニラ・ムレリルシフェラーゼおよび残りの生
物発光系成分を含んでなる。典型的には該キットの第１の組成物にはＧＦＰまた
はルシフェラーゼと結合した標的化剤が含まれる。第２の組成物には少なくとも
ルシフェリン（基質）および／またはルシフェラーゼが含まれる。両組成物は動
物への全身、局所または局部使用用に処方される。もう１つの具体例では、第１
の組成物には標的化剤と結合したルシフェリンが含まれ、第２の組成物にはルシ
フェラーゼもしくはルシフェラーゼとＧＦＰが含まれる。
【０４３０】 一般に包装材はそこに入れられた組成物とは反応性がなく、要すれば発光反応
の進行にその物質が必要とされる程度まで水および／または空気を排除すべきで
ある。
【０４３１】 診断への適用は、特別な包装を必要とする。生物発光生成試薬は、ペレットで
提供され、マイクロカプセルもしくはマクロカプセルにカプセル化し、マトリッ
クス、好ましくは生物適合性、より好ましくは生物分解性マトリックスに結合さ
せ、そして、製造品中もしくは製造品上に入れ、または、製造品内部の小室また
は他の何らかの形態中の混合物として含有させることができる。例えば、ルシフ
ェラーゼコンジュゲートを含有する組成物は、生物発光基質および生物発光活性
化因子を含有する別個の組成物とは別々に、且つそれらと共に使用するために、
提供されるであろう。
【０４３２】 同様に、RenillaまたはPtilosarcusのGFP、Pleuromamma、Renilla mulleriま たはGaussiaのルシフェラーゼまたはルシフェリンは、残りの成分と別個に、ま たは組み合わせて、但し活性化成分の不在下に、混合物、懸濁液、溶液、粉末、
ペーストである組成物またはその他の適当な組成物の状態で提供することができ
る。選択された組織を標的とするコンジュゲートをこの組成物と接触させると、
反応が開始し、組織が発光する。好ましい態様において、この組織は、510nm付 近の光を放射し緑に発光する。ルシフェラーゼ、GFPおよび生物発光基質は、例 えば、水および／または空気、生物発光活性化因子を排除して包装する。投与お
よび標的部位での放出の際、当該部位における塩類またはその他の因子(外科的 手段の場合は空気を包含する)との反応が、因子を活性化するであろう。
【０４３３】 1．GFPおよび生物発光系構成成分の組み合わせのための分配および包装装置 本明細書に詳細を記載する生物発光系は、少なくとも3つの構成成分：生物発光 基質［例えばルシフェリン］、ルシフェラーゼ［例えばルシフェラーゼまたは発
光蛋白］好ましくはGaussia、PleuromammaまたはRenilla mulleriルシフェラー ゼ、および生物発光活性化因子(群)［例えば分子状酸素またはCa2+］、そして、
所望によりRenillaまたはPtilosarcus GFP、を含んでいる。分配および包装装置
は、この構成成分のうち少なくとも1つが、生物発光の生成が望まれるまでは、 残りの成分と分離して維持されるよう、形作られる。係る装置の詳細な説明は、
同一出願人による同時出願の米国特許出願第08/757046号および08/597274号に記
載されており、これらを引用して本明細書の一部とする。
【０４３４】 2．カプセル、ペレット、リポソーム、エンドソーム、液胞、微細粒子 或る態様においては、本組成物の一つの成分を、使用前に環境から隔離すること
、または成分を粒子形態、例えば微細粒子の形態で供給することが必要であるか
も知れない。係る用途のための好適な手段の例は、例えばカプセル化された材料
の分散または溶解により、内容物の放出を可能にする材料でできた、１個のまた
はマイクロ［大きさが約100μmまで］もしくはマクロ粒子［100μMより大］内に
生物発光生成システムの成分をカプセル化することを包含する。数多くのコンジ
ュゲートを結合させることのできるマイクロ粒子が特に好ましい態様である。こ
のマイクロ粒子は生物適合性であり、好ましくは毛細管壁を通過できる大きさで
ある。
【０４３５】 リポソームおよびその他のカプセル化媒体［例えば、ゼラチン内への化合物の
カプセル化を記載している米国特許第4525306号を参照されたく；米国特許第402
1364号、4225581号、4269821号、4322311号、4324683号、4329332号、4525306号
、4963368号は、種々のポリマー内への生物活性材料のカプセル化を記載してい る］は当業者に知られており、本明細書に論じられているもの、および、当業者
に知られているものを包含する［例えば、可溶性紙。米国特許第3859125号を参 照されたい。］。
【０４３６】 a．一般的なカプセル化媒体 酸素または水またはCa2+を除く生物発光生成システムの成分は、選択される系に
もよるが、内容物を環境中に放出させるような状態に置かれるまでは、内容物を
環境から保護する、リポソームのようなカプセル化材料中に入れることができる
。本発明における使用のために企図されるカプセル化材料は、リポソーム、およ
びドラッグデリバリー媒体のような、化学物質のカプセル化に使用されるその他
のこのような材料を包含する。
【０４３７】 b．カプセル化媒体 − リポソーム 例えば、溶存酸素またはCa2+またはルシフェラーゼ系のためのATPまでをも含有 する、血液のような媒質中に成分を溶解させ徐々に放出するリポソームが、本発
明において企図される。これは、例えば黒色腫を診断または視覚化する方法とい
ったような局所適用のために、溶液、懸濁液、ゲル、ローション、クリーム、お
よび軟膏といった組成物に調合することができる。リポソームおよびその他の徐
放性カプセル化組成物が良く知られており、且つ、生物発光生成成分の徐放性デ
リバリーへの使用に適合させることができる。典型的には、GFP、ルシフェリン および／またはルシフェラーゼを、酸素またはCa2+またはATPまたはその他の活 性化成分の不在下にカプセル化することができる。この成分を適当な濃度で含有
する環境または媒質中に放出されると、反応が進行し、発光が引き起こされるで
あろう。一般に、可視化にとって充分な高い局所濃度を放出時に保証するために
は、カプセル化された成分の濃度は比較的高くなければならず、ことによると0.
1−1mg/mLまたはそれ以上であるべきである。
【０４３８】 リポソームまたはその他の、軟膏もしくは持続放出局所用媒質中に調合される
持続放出デリバリー系は、例えば、ボディーペイント、ローションへの使用に好
適であろう。懸濁液として調合したものは、スプレーとして有用であろう。多数
の軟膏および好適なリポソーム調合物が知られている［例えば、Liposome Techn
ology, Targeted Drug Delivery and Biological Interaction, vol III, G.Gre
goriadis編,CRC Press,Inc.,1984；米国特許第5470881号；5366881号；5296231 号；5272079号；5225212号；5190762号；5188837号；5188837号；4921757号；45
22811号を参照されたい］。例えば、適切な軟膏媒質は、ペトロラタム、鉱油お よび／または無水液体ラノリンを含むであろう。リポソーム、膜またはコンタク
トレンズデリバリー系、またはゲル形成可塑性ポリマーのような持続放出媒質も
また好適なデリバリー媒体であろう。局所デリバリー用リポソームは良く知られ
ている［例えば、米国特許第5296231号；Mezei et al.(1980) “Liposomes - A
selective drug delivery system for the topical route of administration,
I. lotion dosage form" Life Sciences 26:1473-1477; Mezei et al.(1981) “ Liposomes - A selective drug delivery system for the topical route of
administration: gel dosage form" Journal of Pharmacy and Pharmacology 3
4:473-474; Gesztes et al.(1988) “Topical anaesthesia of the skin by lip
osome-encapsulated tetracaine" Anesthesis and Analgesia 67:1079-1081; Pa
tel(1985) “Liposomes as a controlled-release system" Biochemical Soc.Tr
ans. 13:513-516; Wohlrab et al.(1987) “Penetration kinetics of liposoma
l hydrocortisone in human skin" Dermatologica 174:18-22を参照されたい］ 。
【０４３９】 リポソームは、選択された混合物を含有し、その内容物を、持続放出的に徐々
に放出することのできる、マイクロカプセル［典型的には、直径がほぼ0.1ない し20μm未満］である。標的を持つリポソームまたはその他のカプセル、特に、 酸素、空気、水分、可視光もしくは紫外［UV］光または特定のpHもしくは温度に
暴露された時に溶解する、時間放出被覆剤［例えば、米国特許第4882165号；Kus
umi et al.(1989) Chem.Lett. no.3 433-436; Koch Troels et al. (1990) Bioc
onjugate Chem. 4:296-304; 米国特許第5482719号；米国特許第5411730号；米国
特許第4891043号；Straubinger et al. (1983) Cell 32:1069-1079; およびStra
ubinger et al. (1985) FEBS Lttrs. 179:148-154; およびDuzgunes et al. 、 成書CELL FUSION(A.E. Sowers編)11章；Ellens et al. (1984) Biochemistry 23
:1532-1538; Yatvin et al. (1987) Methods in Enzymology 149:77-87を参照さ
れたい］が使用できる。ベーキングにおける使用のためのリポソーム調合物［例
えば米国特許第4999208号を参照されたい］が利用できる。これらは、食された 時または加熱された時に内容物を放出する。このようなリポソームは、静脈内ま
たは局所投与に好適となり得る。
【０４４０】 リポソームは当業者に既知の方法により、製造される［例えば、Kimm et al.(
1983) Bioch. Bioph.Acta 728:339-398; Assil et al. (1987) Arch Ophthalmol
. 105:400; および米国特許第4522811号、ならびに本明細書に記載され当業者に
知られるその他の引用文献を参照されたい］。
【０４４１】 低いpHに対し感受性のリポソーム［例えば、米国特許第5352448号、5296231号
；5283122号；5277913号、4789633号を参照されたい］は、アルカリ物質と共に 使用するのに特に適している。低いpHの洗浄剤または石鹸組成物または高pH組成
物と接触する時、リポソームの内容物が放出される。その他の成分、とりわけCa + または水中の溶存O2の存在は、この成分が放出される際に該成分の発光を惹起 するであろう。温度感受性リポソームもまた、浴槽の温水中への放出のための入
浴剤への使用に好適である。
【０４４２】 c．カプセル化媒体 − ゼラチンおよびポリマー媒質 空気もしくは光との接触または温度変化の時にその内容物を溶解または放出する
、ゼラチンまたはその他のこのようなポリマーでできたマクロもしくはマイクロ
カプセルもまた、生物発光生成システムの成分をカプセル化するために使用でき
る。
【０４４３】 このようなマイクロカプセルまたはマクロカプセルは、さらに、GFPまたはル シフェラーゼおよび生物発光生成成分が該抗体により標的へと運ばれ、次いで発
光を導くため該成分が放出されるように、標的物質、例えば抗体とコンジュゲー
トさせることもできる。
【０４４４】 エクオリン系は、この適用のために特に好適である。これは、生物発光の放射
を防止するためのEDTAのような充分なキレート化剤を伴う緩衝液の懸濁液または
溶液中に、またはペーストもしくはその他の適当な形態としてカプセル化するこ
とができる。緩衝液または血液のような、CA2+を含有する水分にカプセル［マイ
クロカプセルまたはマイクロカプセル］が暴露すると、放出された成分が発光す
るであろう。
【０４４５】 このように、カプセル化された生物発光生成成分は、様々な標的物質と組み合
わせて使用でき、それにより、例えば空気に暴露した時に光る、Renilla muller
i、Pleuromamma、PtilosarcusまたはGaussia系、といったようなルシフェラーゼ
／ルシフェリンを放出する。
【０４４６】 生物発光系と共に使用するための、その他のカプセル化容器または媒体は、水
に充分溶解してその内容物を放出するもの、または、手で圧迫すると容易に開口
するもの、または、水性混合物と混合する時内容物が拡散するものである。これ
らの容器は水を排除して製造することができ、その結果、生物発光系の成分は乾
燥し、その中に入れることができる。例えば水性組成物溶液または大気中といっ
たように、水に暴露される時、この媒体は内容物を溶解またはその他のやり方で
放出し、成分は反応し発光する。同様に、この生物発光生成成分の全体より少な
い幾らかの部分をそれ自身ペレット形態で製造することができる。例えば、この
成分(群)をゼラチンまたは類似の硬化剤と混合し、必要ならば鋳型に注ぎ、乾燥
して、堅い、水溶性のペレットを製造することができる。カプセル化容器または
媒体は、生物適合性のゼラチンまたは類似の水溶性材料で生成することができる
。
【０４４７】 d．エンドソームおよび液胞 媒体は、RenillaまたはPtilosarcus GFPまたはRenilla mulleri、Pleuromammaま
たはGaussiaルシフェラーゼが発現される組換え宿主細胞から、エンドソームま たは液胞を使用して、当業者に知られる方法を用いて製造することができる［例
えば、米国特許第5284646号、5342607号、5352432号、5484589号、5192679号、5
206161号、および5360726号を参照されたい］。例えば、大腸菌のような宿主中 で発現することにより産生されるエクオリンは、蛋白合成後に、エンドソームま
たは液胞といったようなベシクル内部に分離できる。常法を用いて細胞を溶解し
、ベシクルを、その内容物と共に無傷で放出させる。このベシクルは、デリバリ
ーベシクルとしての働きを有する。使用の際、これらには、コエレンテラジンの
ようなルシフェリン、および溶存酸素が、拡散により、または加圧下に、または
その他の適当な手段により、負荷される。
【０４４８】 e．微細粒子 エクオリン発光蛋白、Renilla系、Ptilosarcus、PleuromammaおよびGaussia系と
いったような、凍結乾燥に好適な生物発光生成システムの成分は、微粉化して細
かい粉末とし、乾燥条件下に、例えば乾燥剤と共に、保存することができる。供
給された、または添加された溶液の形の、溶存酸素または空気中もしくはミスト
中のCa2+との接触により、この粒子の溶解および発光が惹起される。
【０４４９】 3．固定化系 a．マトリックス材料 幾つかの態様においては、GFP、または生物発光生成システムのうち少なくとも 一つの成分をマトリックス基質に結合させ、次いでこれを局所投与または全身投
与することが望ましい。このマトリックス基質は生物適合性であろう。所望によ
り、残りの成分を含有する混合物(群)、典型的には液体混合物を、マトリックス
基質上に注ぎ、または噴霧することにより適用して、発光を引き出す。例えば、
コエレンテラジンを包含するエクオリン発光蛋白および酸素を、基質と結合させ
る。所望により、Ca2+を含有する液体、例えば水道水または、好ましくは適当な
緩衝液中にCa2+を含有する液体混合物を、例えば噴霧によって、ルシフェラーゼ
を結合させたマトリックスに接触させる。GFPの存在下で接触すると、この材料 は緑色に発光する。
【０４５０】 別の態様においては、Renilla GFP、Renilla mulleriまたはGaussia、Pleurom
ammaルシフェラーゼまたはその他のルシフェラーゼ、例えばVargulaルシフェラ ーゼを基質材料と結合させ、適当な緩衝液中にルシフェリンを含有する液体混合
物と接触させる。接触は、噴霧、注ぎかけまたはその他の適当なやり方で実施す
ることができる。このマトリックス材料は、外科用海綿のような製造品の中にも
しくはその表面に取り込まれ、または同製造品に形作られ、またはマイクロビー
ズの一部とされる。
【０４５１】 正確な成分、および適用または保存の最適手段は、選択された生物発光系の関
数であることが理解される。実験的に決定できる成分の濃度は重要ではないが、
結合した時に目に見える発光を産むのに充分でなければならない。典型的な濃度
はナノモル/Lまで低く、好ましくはmg/L程度またはそれ以上である。基質上の濃
度は、このような典型的濃度を含有する組成物が材料に適用される時に生み出さ
れる濃度である。さらに、このような理想的な濃度は、第一の組成物を適用し、
それを乾燥し、第二の組成物を噴霧し、そして結果を観察することにより、実験
的に容易に決定することができる。
【０４５２】 本発明により企図されるマトリックス材料基質は一般に、リガンドおよびその
他の分子を固定化するために使用される不溶性材料であり、そして、多くの化学
合成および分離に使用される材料である。このようなマトリックスは、好ましく
は生物適合性の、より好ましくは生物分解性の材料から製造する。マトリックス
とも呼ばれるこのような基質は、例えば親和クロマトグラフィーに、生物活性材
料の固定化に、そして蛋白、アミノ酸およびその他の有機分子およびポリマーを
包含する生体分子の化学合成中に使用される。マトリックスの製造およびその用
途は当業者に良く知られており、このような材料およびその製品は数多く知られ
ている。例えば、アガロースおよびセルロースのような天然に存在するマトリッ
クス材料は、それぞれの供給源から分離し、既知のプロトコルに従って加工する
ことができ、合成材料は、既知のプロトコルに従って製造することができる。本
発明に使用するためのその他のマトリックスは、蛋白、例えばアルブミンのよう
な担体分子を含んでよい。
【０４５３】 基質マトリックスは、典型的には、固体の、多孔性の、変形可能な、または堅
い、そして、ビーズ、ペレット、円板、毛細管、中空繊維、針状物、固体繊維、
不揃いの形、薄膜および膜を包含する、任意の必要な構造および幾何学的配置を
有する、不溶性材料である。したがって、この物品は、全表面もしくはその一部
を被覆し、または粒子を含浸させることにより、マトリックス材料から製造され
、またはそれと合することができる。
【０４５４】 典型的には、マトリックスを粒子化する場合、この粒子は少なくとも約10-200
0μMであるが、選択された適用法に応じてこれより小さくても大きくてもよい。
マトリックスの選択は、少なくとも部分的には、それらの物理的および化学的性
質、例えば溶解性、官能基、機械的安定性、表面領域膨脹傾向、疎水性または親
水性、ならびに意図される用途によって決定されるであろう。本発明に係る使用
のためには、マトリックスは好ましくは生物適合性の、より好ましくは生物分解
性のマトリックスである。
【０４５５】 必要ならば、支持体マトリックス材料を処理して適当な反応性部分を含むよう
に、または、幾つかの場合には、既に反応性部分を含む市販品を入手でき、それ
により、分子が結合する時にマトリックス支持体としての働きをすることができ
る。アミノシラン結合、ヒドロキシ結合またはカルボキシシラン結合といった反
応性表面部分を含む材料は、シラン化反応などを含む十分に確立された表面化学
技術によって製造することができる。これらの材料の例は、γ−アミノプロピル
シランに共有結合した、表面酸化ケイ素部分、およびその他の有機部分を有する
もの；N−[3−(トリエチオキシシリル)プロピル]フテラミン酸；およびビス−(2
−ヒドロキシエチル)アミノプロピルトリエトキシシランである。アミノ基反応 性官能性を含む容易に入手し得る材料の例は、パラ−アミノフェニルトリエチオ
キシシランを包含するが、これに限定される訳ではない。さらに、誘導体化され
たポリスチレン類およびその他のこのようなポリマーが良く知られており、且つ
、当業者にとって容易に入手できる［例えば、多数の官能基を有するTentagel( 商標)樹脂が入手可能であり、これはRapp Polymere(ツービンゲン、ドイツ)によ
り販売されている；米国特許第4908405号および米国特許第5292814号を参照され
たく；また、Butz et al. (1994) Peptide Res. 7:20-23；Kleine et al. (1994
) Immunobiol. 190:53-66をも参照されたい］。
【０４５６】 これらのマトリックス材料は、興味のある分子の結合のための支持マトリック
スとして作用する任意の材料を包含する。係る材料は当業者に知られており、支
持体マトリックスとして使用されるものを包含する。これらの材料は、セルロー
ス、セルロース誘導体、アクリル樹脂、硝子、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラ
チン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドのコポリマー、ジビ
ニルベンゼン等と架橋したポリスチレン［Merrifield(1964) Biochemistry 3:13
85-1390を参照されたい］、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレ ン、デキストラン、ポリアクリルアミド、ゴム、シリコン、プラスチック、ニト
ロセルロース、セルロース、天然海綿を包含し、これらに限定されない無機、天
然ポリマー、および合成ポリマーを包含するが、これらに限定される訳ではない
。このうち特に興味深いものは、高度多孔性の硝子［例えば、米国特許第424472
1号を参照されたい］、ならびにホウケイ酸、アルコールおよび水を混合するこ とにより製造されるその他のものである。
【０４５７】 合成マトリックスは、アクリルアミド、デキストラン誘導体およびデキストラ
ンコポリマー、アガロース−ポリアクリルアミド混和物、種々の官能基を有する
その他のポリマーおよびコポリマー、メタクリレート誘導体およびコポリマー、
ポリスチレンおよびポリスチレンコポリマーを包含するが、これらに限定される
訳ではない［例えば、Merrifield(1964) Biochemistry 3:1385-1390；Berg et a
l. (1990)、Innovation Perspect. Solid Phase Synth. Collect. Pap., 国際シ
ンポジウム、第1回、Epton, Roger(編), 453-459頁；Berg et al. (1989) Pept.
Proc. Eur. Pept. Symp. 第20回、Jung,G et al.(編),196-198頁；Berg et al.
(1989) J.Am. Chem. Soc. 111:8024-8026；Kent et al. (1979) Isr. J. Chem.
17:243-247；Kent et al. (1978) J. Org. Chem. 43:2845-2852；Mitchell et
al. (1976) Tetrahedron Lett. 42:3795-3798；米国特許第4507230号；米国特許
第4006117号；および米国特許第5389449号を参照されたい］。このようなマトリ
ックスの製造方法は当業者に良く知られている。
【０４５８】 合成マトリックスは、ポリマーおよびコポリマー、例えば、ポリビニルアルコ
ール、アクリラートおよびアクリル酸、例えばポリエチレン−コ−アクリル酸、
ポリエチレン−コ−メタクリル酸、ポリエチレン−コ−エチルアクリラート、ポ
リエチレン−コ−メチルアクリラート、ポリプロピレン−コ−アクリル酸、ポリ
プロピレン−コ−メチルアクリル酸、ポリプロピレン−コ−エチルアクリラート
、ポリプロピレン−コ−メチルアクリラート、ポリエチレン−コ−ビニルアセタ
ート、ポリプロピレン−コ−ビニルアセタート、および、酸無水物基を含むもの
、例えば、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリプロピレン−コ−無水マレ
イン酸等から製造されるものを包含する。リポソームもまた、親和精製のための
固体支持体として使用されている［Powell et al. (1989) Biotechnol.Bioeng.
33:173］。
【０４５９】 例えば、米国特許第5403750号は、ポリウレタンを基礎とするポリマーの製造 を記載している。米国特許第4241537号は、鎖を伸長させたポリオールから製造 される親水性ポリウレタンゲル組成物を含有する植物成長培地を記載しており；
酸化プロピレン単位50%までの無作為共重合が好ましく、その結果、プレポリマ ーが室温下で液体となるであろう。米国特許第3939123号は、35%までのポリ(プ ロピレンオキシ)グリコールまたはポリ(ブチレンオキシ)グリコールを伴うポリ(
エチレンオキシ)グリコールを含有する、イソシアナートで終了するプレポリマ ーの、緩く架橋したポリウレタンポリマーを記載している。これらのポリマーを
製造する際には、架橋剤として有機ポリアミンを使用する。その他のマトリック
スおよびその製造は、米国特許第4177038号、4175183号、4439585号、4485227号
、4569981号、5092992号、5334640号、5328603号に記載されている。
【０４６０】 米国特許第4162355号は親和クロマトグラフィーでの使用に好適なポリマーを 記載しており、これは、アミンイミドのポリマー、および、少なくとも1個の垂 下ハロメチル基を有するビニル化合物である。親和クロマトグラフィーにおける
結合部位を与えるアミンリガンドは、この垂下ハロメチル基の一部との反応によ
りポリマーに結合し、そして残りの垂下ハロメチル基は、垂下親水基を含むアミ
ンと反応する。このポリマーを用いて基質を被覆する方法もまた記載されている
。アミンイミドの例は、1,1−ジメチル−1−(2−ヒドロキシオクチル)アミン メ
タクリルイミドであり、ビニル化合物はクロロメチルスチレンである。
【０４６１】 米国特許第4171412号は、好ましくはマクロ細孔性の、親水性ポリマーゲルを 基礎とする特異的マトリックスを記載しており、これは、共有結合したD−アミ ノ酸またはD−アミノ酸単位を含むペプチドを運搬する。基本的な支持体は、架 橋するアクリラートを伴うアクリル酸およびメタクリル酸のヒドロキシアルキル
エステルまたはヒドロキシアルキルアミドの共重合によって製造され、または、
メタクリラートコモノマーを、ジアミン、アミノ酸またはジカルボン酸との反応
により修飾し、そして得られたカルボキシ末端またはアミノ末端基を、アミノ酸
またはペプチドのD−類似体と縮合させる。D−アミノ酸を含むペプチドもまた、
担体表面上で段階的に合成することができる。
【０４６２】 米国特許第4178439号は、陽イオン交換体およびその製造法を記載している。 米国特許第4180524号は、シリカ支持体上での化学合成を記載している。
【０４６３】 固定化した人工膜［IAM；例えば、米国特許第4931498号および4927879号を参 照されたい］もまた使用できる。IAMは細胞膜環境を模しており、細胞膜に専ら 結合する分子の結合に使用することができる［例えば、Pidgeon et al. (1990)
Enzyme Microb.Technol. 12:149を参照されたい］。
【０４６４】 これらの材料はさらに、製造品、外科用海綿、石鹸およびその他の物品の製造
に使用でき、よって、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、両者の混合物のいずれか
の分子の結合に好適である。例えば、マトリックス粒子を物品に含浸させ、次い
でこれを活性化因子に接触させることができる。
【０４６５】 GFPまたは生物発光生成成分の被覆を施したまたは施していないマトリックス 材料を包含する部材、および残りの成分を含む組成物、の入ったキットが提供さ
れる。
【０４６６】 b．固定化および活性化 蛋白およびその他の生体分子を不溶性または液体支持体上に固定化するための数
多くの方法が開発されている［例えば、Mosbach(1976) Methods in Enzymology
44；Weetall(1975) Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies, and Peptide
s；およびKennedy et al.(1983) Solid Phase Biochemistry, Analytical and S
ynthetic Aspects, Scouten(編) 253-391頁を参照されたい；一般的には、Affin
ity Techniques, Enzyme Purification: Part B. Methods in Enzymology, 34巻
、W.B.Jakoby、M.Wilchek(編)、Acad.Press,N.Y.(1974)；Immobilized Biochemi
cals and Affinity Chromatography, Advances in Experimental Medicine and
Biology, 42巻、R.Dunlap編、Prenum Press,N.Y.(1974)を参照されたい］。
【０４６７】 中でも、直接に、またはリンカー、例えば当業者により知られている数多くの
ジスルフィド結合、チオエステル結合、束縛されたジスルフィド結合、および、
遊離の反応性基、例えばアミンおよびチオール基の間の共有結合、を介して支持
体に共有結合させ、または吸収および吸着させることが最も一般的に用いられる
方法である［例えば、PIERCE CATALOG, Immuno Technology Catalog & Handbook
,1992-1993(これは、このような試薬の製造および用途を記載しており、係る試 薬の商業的供給源を提供している)；およびWong(1993) Chemistry of Protein C
onjugation and Cross Linking, CRC Pressを参照されたい。；さらに、Dewitt
et al. (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90:6909；Zuckermann et al. (1992
) J.Am.Chem.Soc. 114:10646；Kurth et al. (1994) J.Am.Chem.Soc. 116:2661 ；Ellman et al. (1994) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 91:4708；Sucholeiki (19
94) Tetrahedron Lttrs. 35:7307；およびSu-Sun Wang (1976) J.Org.Chem. 41:
3258；Padwa et al. (1971) J.Org.Chem. 41:3550およびVedejs et al. (1984)
J.Org.Chem. 49:575(これらは光感受性リンカーを記載している)をも参照された
い。］。
【０４６８】 固定化を実施するためには、蛋白またはその他の生体分子の溶液を、アルミナ
、炭素、イオン交換樹脂、セルロース、硝子またはセラミックのような支持体材
料に接触させる。フルオロカーボンポリマーが支持体として使用されており、生
体分子は吸着によってここに結合する［米国特許第3843443号；公開された国際P
CT出願WO/86 03840を参照されたい］。本発明の目的のため、支持体材料は生物 適合性(即ち、身体への使用に適している)であろう。
【０４６９】 蛋白および核酸を包含する生物学的分子を固体支持体に結合するための多岐に
わたる方法が知られている［例えば、米国特許第5451683号を参照されたい］。 例えば、米国特許第4681870号は、シリカマトリックス上に遊離のアミノまたは カルボキシ基を導入する方法を記載している。引き続きこれらの基は、カルボジ
イミドの存在下に、蛋白または他の抗リガンドのようなその他の基に共有結合さ
せることができる。別法として、シリカマトリックスは、アルカリ条件下に、ハ
ロゲン化シアンと処理することにより活性化することができる。抗リガンドは、
活性化された表面に添加する時、この表面に共有結合する。もう一つの方法は、
ビオチン、アビジンおよび増量剤の多層を連続的に適用することにより、ポリマ
ー表面を修飾することを含み［例えば、米国特許第4282287号を参照されたい］ ；別の方法は、光感受性の非天然アミノ酸基をポリペプチド鎖中に組み込み、こ
の生成物を低エネルギー紫外光に暴露することにより、ポリペプチド鎖を固体基
質に結合させる、光活性化を含んでいる［例えば、米国特許第4762881号を参照 されたい］。オリゴヌクレオチドもまた、ソラレン化合物のような光化学的に活
性な試薬、および、この光試薬を基質に結合させる結合剤を使用して、結合させ
た［例えば、米国特許第4542102号および米国特許第4562157号を参照されたい］
。光試薬の光活性化は、核酸分子を基質に結合させて、表面に結合したプローブ
を生成する。
【０４７０】 化学的に活性化された固体マトリックス支持体、例えば硝子、合成ポリマー、
および架橋した多糖類への、蛋白またはその他の生体分子または有機分子または
生物学的粒子の共有結合は、より頻繁に用いられる固定化技術である。この分子
または生物学的粒子は、マトリックス支持体に直接結合させ、または金属といっ
たようなリンカーを介して結合させることができる［例えば、米国特許第417940
2号、およびSmith et al. (1992) Methods: A Companion to Methods in Enz. 4
:73-78を参照されたい］。この方法の例は、多糖類支持体、例えばアガロースの
、臭化シアン活性化である。酵素の固定化のためのペルフルオロカーボンポリマ
ーを基礎とする支持体および親和クロマトグラフィーの使用が米国特許第488525
0号に記載されている。この方法では、まず、生体分子を、ペルフルオロアルキ ル化剤、例えば米国特許第4954444号に記載のペルフルオロオクチルプロピルイ ソシアナートとの反応により修飾する。次いでこの修飾された蛋白をフルオロカ
ーボン支持体上に吸着させて固定化を実施する。
【０４７１】 マトリックスの活性化および用途は良く知られており、このような既知の方法
により実施することができる［例えば、Hermanson et al. (1992) Immobilized
Affinity Ligand Techniques, Academic Press, Inc.、サンディエゴ、を参照さ
れたい］。例えば、アミノ酸の結合は、当業者に良く知られ、且つ、例えばStew
artおよびYoung、1984、Solid Phase Synthesis第2版、Pierce Chemical Co.、 ロックフォード、に提供されている技術により達成することができる。
【０４７２】 分子を固体支持体に結合させるその他の好適な方法が当業者に良く知られてい
る［例えば、米国特許第5416193号を参照されたい］。これらは、例えば蛋白の ような分子を支持体に化学的に結合させるのに好適なリンカーであり、ジスルフ
ィド結合、チオエステル結合、束縛されたジスルフィド結合、ならびに、アミン
およびチオール基のような遊離の反応性基の間の共有結合を包含するが、これら
に限定される訳ではない。これらの結合は、片方または両方の部分に反応性チオ
ール基を作り、次いで片方の部分にあるチオール基を、他方にある、反応性チオ
ール基と、または、反応性マレイミド基もしくはチオール基が結合することので
きるアミン基と反応させる、ヘテロ二価試薬を使用して生成することができる。
その他のリンカーは、酸で開裂し得るリンカー、例えばビスマレイミデオトキシ
プロパン、酸不安定性トランスフェリンコンジュゲート、および、より酸性の細
胞内コンパートメントにおいて開裂する、アジピン酸ジヒドラジド；UVまたは可
視光への暴露時に開裂する架橋剤、ならびに種々のドメインといったようなリン
カー、例えばヒトIgG1の定常領域由来のCH1、CH2およびCH3を包含する（例えば 、Batra et al. (1993) Molecular Immunol. 30:379-386を参照されたい）。現 在好ましい結合は、分子をマトリックス表面に吸着させることにより行う直接結
合である。その他の結合は、光への暴露により活性化させることのできる光開裂
可能な結合である［例えば、Goldmacher et al.(1992) Bioconi. Chem. 3:104-1
07を参照されたく、そのリンカーは引用により本明細書の一部とする］。光開裂
可能なリンカーは、開裂する波長が結合した部分を損傷しないように選択する。
光開裂可能なリンカーは、光に暴露された時に開裂するリンカーである［例えば
、システインのための光開裂可能な保護基としてのニトロベンジル基の使用を記
載している、Hazum et al.(1981) Pept., Proc.Eur.Pept.Symp.16th、Brunfeldt
,K(編)、105-110頁；ヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマー、グリシ ンコポリマー、フルオレセインコポリマーおよびメチルローダミンコポリマーを
包含する、水溶性光開裂可能コポリマーを記載している、Yen et al.(1989) Mak
romol. Chem. 190:69-82；UV光(350nm)付近に暴露される時、光分解性分解を受 ける試薬および架橋剤を記載している、Goldmacher et al.(1992) Bioconi. Che
m. 3:104-107；および、光開裂可能な結合を生成するニトロベンジルオキシカル
ボニルクロリド架橋剤を記載している、Senter et al.(1985) Photochem. Photo
biol. 42:231-237を参照されたい］。選ばれたリンカーは、その適用に依存し、
そして、必要ならば実験的に選択することができる。
【０４７３】 分子を支持体に結合するこれらの方法は、標的を狙う試薬を標的となっている
試薬に結合させるための用途に適合させることができる。
【０４７４】 M．生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)系 自然界では、コエレンテラジンを使用するルシフェラーゼは、広域バンドの青緑
色光を放射する(最大~480nm)。生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)は、ヒドロ虫
類のObeliaの研究から最初に推論された自然現象であり(Morin & Hastings (197
1) J.Cell Physiol. 77:313-18)、これにより、インビボで観察される緑色の生 物発光の放射が、ルシフェラーゼが非放射的にエネルギーを副次的緑色蛍光蛋白
(GFP)に移動させる結果であることが示された。BRETは、その後まもなく、ヒド ロ虫類Aequorea victoriaおよび花虫綱Renilla reniformsで観察された。精製さ
れたルシフェラーゼおよびGFPとの間のインビトロでのエネルギー移動は、Aequo
rea(Morise et al.(1974) Biochemistry 13:2656-62)およびRenilla(Ward & Cor
mier(1976) J.Phys.Chem. 80:2289-91)系で立証されたが、重要な相違は、溶液 中において有効な無放射エネルギー移動は、明らかに、1個のルシフェラーゼ分 子と1個のGFPホモダイマーとのプレ結合により、Renillaでのみ起こるというこ とである（Ward & Cormier(1978) Photochem. Photobiol. 27:389-96） 。Renil
laルシフェラーゼの青色(486nm)蛍光の放射は、適切な量のRenilla GFPを添加す
ると、狭いバンドの緑色の放射(508nm)へと完全に変換することができる(Ward &
Cormier(1976) J.Phys.Chem. 80:2289-91)。GFPは、励起状態のルシフェラーゼ
-基質複合体からエネルギーを受け取り、この光を狭域バンドの緑色光(~510nm) として再放射する。この非放射エネルギー移動により、ルシフェラーゼの量子収
量が増加する。
【０４７５】 ルシフェラーゼおよび蛍光蛋白は、蛋白標識および転写レポーターとして、数
多くの良く開発され且つ貴重な用途を持っている；BRETは、これらの適用の感度
および範囲を増大させる可能性を持っている。GFPは、量子収量を上げることに より、ルシフェラーゼレポーターの感度を増大させる。幾つかのスペクトル上別
個のGFPに融合させた単一のルシフェラーゼは、単一のルシフェリンの添加によ り活性化された多数のルシフェラーゼレポーターの同時使用を可能にする。同一
のルシフェラーゼに融合させた異なる放射波長を有するGFPをそれぞれ含有する 、2種の融合蛋白を製造することにより、2またはそれ以上のレポーターを、単一
の基質の添加と共に使用することができる。したがって、単一の試薬の添加を用
いて、多数の事象を監視、または多数の検定を実行することができる。ルシフェ
リンの分布が不変または再生産可能であるならば、このようなレポーター系は、
自己供給性である。
【０４７６】 細胞内の幾つかのマクロ分子的事象を簡便に同時監視できるという事は、現行
の生物発光技術に優る、大きな改善である。さらにBRETは、ルシフェラーゼおよ
び蛍光蛋白の結合または方向の変化を利用することにより、全く新しいレポーテ
ィングのやり方を可能にする。融合蛋白を製造することにより、ルシフェラーゼ
-GFP受容体の対が生成し、融合部分の結合またはコンホメーションの変化に応答
し、これによりセンサーとして働く。
【０４７７】 生理学的レポーターとしての二つの蛍光蛋白の間のエネルギー移動(FRET)が報
告されており［Miyawaki et al. (1997) Nature 388:882-7］、ここでは、2つの
異なるGFPをカルモジュリンのカルボキシおよびアミノ末端に融合させた。カル シウムイオン濃度の変化がカルモジュリンに充分なコンホメーションの変化を惹
起し、GFP部分の間のエネルギー移動のレベルを変化させた。供与体の放射にお いて観察された変化は、~10%であり、変化の割合は~1.8であった。
【０４７８】 本明細書に記載される基質ルシフェリン存在下でのルシフェラーゼ-GFPの同様
な用途は、重要な利点を有する。第一に、一次励起光からの受容体のバックグラ
ウンドおよび励起が無い。第二に、ルシフェラーゼの量子収量はGFPへの非放射 的移動により大きく増強されるため、供与体の放射からのバックグラウンドはよ
り小さく、そして受容体からのシグナルは相対的により大きくなる。第三に、ル
シフェラーゼのピーク放射(~480nm)からGFPのピーク放射(典型的には508-510nm)
への波長シフトが大きく、シグナルの重複を最小限とする。これら全ての因子が
結びついてシグナル-ノイズ比を大きくする。GFP受容体の濃度は蛍光を用いて個
別に確認できる。
【０４７９】 幾つかの適用のためには、インビトロ架橋された、またはそれ以外にインビト
ロ修飾された天然蛋白が企図される。遺伝的にコード化された融合蛋白は多くの
優れた利点を有する：A）インビボの用途 − 化学に基づくルミネセンスまた は放射性に基づく検定と異なり、融合蛋白は生体細胞または生体全体の中に遺伝
的に組み込むことができる。この事は、適用の可能性の範囲を著しく増大させる
；B）可撓性のある且つ正確な修飾 − 多数の異なる応答修飾要素を、与えら れたルシフェラーゼ-GFP対の中に再生産的且つ定量的に組み込むことができる；
C）単純な精製 − 精製には一つの試薬が必要であるに過ぎず、その精製は蛍 光蛋白部分を介して監視することができる。リガンド結合モチーフを組み込んで
、親和精製法を容易にすることができる。
【０４８０】 1．BRETに基づくセンサーの設計 二つの発色団の間の共鳴エネルギーの移動は、供与体および受容体発色団の間の
距離およびそれらの空間における相対的方向に、極めて鋭敏である（Wu & Brand
(1984) Anal. Biochem. 218:1-13）。エネルギー移動の効率は、発色団の間隙 の6倍に逆比例する。実際には、有用な距離範囲は約10ないし100Aであって、こ れにより、共鳴エネルギー移動が、生物学的マクロ分子の相互作用を研究するた
めの非常に有用な技術となった。様々な蛍光に基づくFRETバイオセンサーが組み
立てられており、当初は蛋白または膜性分にコンジュゲートさせた化学的蛍光体
を使用していたが、近年は、スペクトル上別個のGFP変異体の対を使用している ［Giuliano & Taylor (1998) Trends Biotech. 16:99-146；Tsien (1988) Annu.
Rev. Biochem. 67:509-44］。
【０４８１】 これらの遺伝的にコード化されたGFP生物発光に基づくバイオセンサーは、よ り簡便性の低い且つより正確性の低い化学的コンジュゲートに基づくバイオセン
サーに優る利点を持っているが、これらは全て設計に制限がある：発色団が最も
近接した位置関係にある場合、エネルギー移動が定量的なバイオセンサーを組み
立てることは一般に困難である。コンジュゲート化したまたは内在する発色団が
最小の間隔且つ最適な向きに安定に位置するよう、蛋白の複雑な立体化学を自由
に操作することは殆ど不可能である。係るバイオセンサーの有効性はまた、しば
しば共鳴エネルギー供与体および受容体の間の化学量論的不均衡によっても制限
される；供与体および受容体であるマクロ分子は、複合体形成していない発色団
から放射されるバックグラウンドシグナルを回避するよう、定量的に複合体化さ
れねばならない。一般的設計におけるこれらの制限は、バイオセンサーが、丈夫
であり、簡便であり且つ安価でなければならない場合、重要となる。候補薬物の
ための高スループットスクリーニング(高スループットスクリーニング(HTS)プロ
トコルを使用)、バイオチップおよび環境監視系といった開発途上の技術は、微 量の標的のシグナルの「ヒット」(例えば、二つのポリペプチド間の複合体形成)
が、大過剰の「非ヒット」と明確に(統計学的に)識別可能である、モジュラー様
式のバイオセンサーから、多大な利益を得るであろう。現在の遺伝的にコード化
されたFRETおよび生物発光に基づくバイオセンサーは、非常にしばしば、非ヒッ
トシグナルの二倍未満、良くて数倍の大きさのヒットシグナルを示すに過ぎない
［Xu et al. (1999) Proc.Natl.Acad.Sci USA 96:151-156；Miyawaki et al. (1
997) Nature 388:882-7］。
【０４８２】 これらの問題を解決するために、本発明において提供される花虫綱のGFP、例 えばRenilla GFPを、それらと同起源のルシフェラーゼと組み合わせて使用する ことができる。花虫綱ルシフェラーゼ-GFP複合体は、与えられたバイオセンサー
に特異的な生物学的性質を付与する蛋白ドメインがそこに結合する時、「骨格」
を提供する。この骨格を基礎とする多くの有用な二成分バイオセンサーを組み立
てることができるが、本発明において企図されるバイオセンサーでは、互いに複
合体形成する可能性のある独立した蛋白ドメインが、それぞれルシフェラーゼお
よびGFPと融合する。
【０４８３】 分離の際、花虫綱ルシフェラーゼは、コエレンテラジン由来の発色団から青色
光を放射し(A)、青緑色光で励起された花虫綱GFPは、その完全なペプチドに基づ
く発蛍光団から緑色光を放射する(B)。ルシフェラーゼおよびGFPがインビボまた
はインビトロで複合体として結合する時、ルシフェラーゼはその反応エネルギー
をGFO発蛍光団に非放射的に移動させ、これが次に緑色を放射する(C)。したがっ
て、ルシフェラーゼ-GFP複合体を破壊するいかなる分子相互作用も、緑色光に対
する青色光の比を観測することによって定量的に監視することができる(D)。
【０４８４】 この主題には多くの可能な変法がある。例えば、三成分系において、ルシフェ
ラーゼまたはGFPのいずれかを、目的とする蛋白またはその他の標的ペプチドま たはその他の目的とする部分由来のリガンド結合ドメインに融合させることがで
きる。この融合蛋白の設計が正しければ、小さな分子または蛋白リガンドの結合
が、ルシフェラーゼ-GFP結合を妨害し、BRETを基礎とするバイオセンサーを得た
ことになる。より複雑な蛋白融合を設計して、数多くの用途のための、二成分BR
ETバイオセンサーを、そして単一成分BRETバイオセンサーでさえ作り出すことが
できる。
【０４８５】 図11は、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)の基礎原理およびセンサーとして
のその使用を示している：A）分離の際、ルシフェラーゼ、好ましくは花虫綱ル シフェラーゼは、コエレンテラジン由来の発色団から青色光を放射する；B）分 離の際、青緑色光で励起されているGFP、好ましくはルシフェラーゼと結合する 花虫綱GFPは、その固有ペプチドに基づく発蛍光団から緑色光を放射する；C）ル
シフェラーゼおよびGFPがインビボまたはインビトロで複合体として結合する時 、ルシフェラーゼはその反応エネルギーをGFP発蛍光団に非放射的に移動させ、 これが次に緑色を放射する；D）ルシフェラーゼ-GFP複合体を破壊するいかなる 分子相互作用も、緑色光から青色光へのスペクトルのシフトを観測することによ
り、定量的に監視することができる。
【０４８６】 本発明に係る核酸、ならびに組み立て物およびプラスミドは、同起源花虫綱ル
シフェラーゼと共に、花虫綱GFP、例えばRenillaを包含する、融合蛋白の様々な
コンフィギュレーションの製造を可能にする。GFPをコード化している核酸は、 ルシフェラーゼをコード化している核酸と隣接させて、または例えば目的蛋白の
リガンド結合ドメインをコード化している核酸の挿入により、その核酸と離して
融合させることができる。GFPおよびルシフェラーゼは結合するであろう。リガ ンド結合ドメインと被験化合物またはその他の部分との相互作用の際、GFPおよ びルシフェラーゼの相互作用が変化し、それにより該複合体の放射シグナルが変
化する。必要ならば、GFPおよびルシフェラーゼを、この相互作用を微調整する ために修飾し、これをコンホメーションの変化または温度もしくはその他のパラ
メータに対してさらに鋭敏にすることができる。
【０４８７】 2．BRETセンサーの利点 本発明において提供されるBRETセンサーには数多くの利点がある。例えば、BRET
センサーは自己供給性である。レポーターおよび標的は一つのポリペプチドに統
合される。この事により、ルシフェラーゼ、GFPおよび標的の間の1:1:1の化学量
論が保証される(または、1以上、典型的にはホモダイマーのGFPがルシフェラー ゼに結合できるならば、1:N:1の化学量論)。GFPの蛍光はセンサーの絶対定量を 可能とする。零の状態は、センサーの機能性を立証するシグナルを与える。定量
可能な零状態は、BRET破壊センサー(DBRET)を促進する。BRETセンサーは、GFP F
RETセンサーより、雑音に対すルシグナルの比が良好である。何故なら、細胞の 自己蛍光が無く、一次励起光からの受容体の励起が無く、ルシフェラーゼの量子
収量が、GFPへの非放射的エネルギー移動により極めて増強され、そして、ルシ フェラーゼの放射とGFPの放射の間のシグナル重複が最小限であるためである。 さらに、花虫綱のGFPは、AequoreaのGFPよりも6倍高い吸光係数を持っている。
【０４８８】 BRETセンサーは、培養細胞および組織ならびに動物を包含する、インビトロま
たはインビボまたはインシトゥのスクリーニング検定において、ヒットの同定お
よび下流評価のために使用することができる。BRETセンサーは熱による終点選択
によって作り出すことができ、それは、DBRET(BRETの破壊)に適しており、標的 の3D構造および機能動力学についての知識の必要性を減じる。存在している、バ
イオセンサーを最適化するためのスクリーニングロボット工学。甚大な遺伝的多
様性のある花虫綱由来のBRETセンサーの利点によって、効率的なルシフェラーゼ
-GFPエネルギー移動系が案出されており、その構成成分は混合し適合させること
ができる。効率の高いヘテロローガスなルシフェラーゼを、より活性の低いルシ
フェラーゼに代えて使用することができる。例えば、橈脚類ルシフェラーゼの活
性部位を、花虫綱ルシフェラーゼGFP結合ドメインに融合させることができる。 多岐にわたる数多くのコエレンテラジン使用ルシフェラーゼがある。
【０４８９】 BRETセンサーは、最適化したセンサーの骨組みを異なる標的と共に使用できる
よう、組み立て式である。また、BRET受容体は、シフトした放射を与えるよう、
多様であってよく、複数情報の同時読み出しを容易にする。例えばエクオリン(C
a++により活性化された)光蛋白、または条件付き活性化を起こさせるための蛍ル
シフェラーゼ(ATPおよび蛍ルシフェリンを必要とする)を使用することにより、 花虫綱GFPは突然変異させることができ、GFPまたはその他の蛋白は相異なる化学
的蛍光体で修飾することができ、高スループットスクリーニング(HTS)蛍光体修 飾FRET受容体は適合させることができ、BRET供与体(ルシフェラーゼ)は多様化さ
せることができる。センサーの骨格は、試薬の容量を減らすことのできる自由フ
ォーマットプレート、再使用可能な微量定量板、微小カラムおよびバイオチップ
を包含する、様々な固定化モチーフに組み入れることができる。最後に、BRETセ
ンサーは、標準化された蛋白生成により生成でき、精製の最終段階に組み込むこ
とができるため、安価で再生産可能な試薬である。遺伝的にコード化されたレポ
ーターは、化学的に修飾されたレポーターよりさらに再生産可能である。BRETモ
ジュールの直線状翻訳はセンサーの完全性を確実とする。
【０４９０】 以下の実施例は説明目的のためにのみ記載するものであり、本発明の範囲を限
定する意図はない。
【０４９１】 実施例１ Ｉ．毒物学 １．コエレンテラジンの溶解性 コエレンテラジンは非刺激性媒体に非常に溶け難い。コエレンテラジンは約０
．８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含む２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４００の溶液に少なくと
も２００マイクログラム／ｍＬの濃度まで可溶である。この溶液はわずかに高張
であるが、媒体を目的とする場合には刺激性ではない。 ２．コエレンテラジンの毒物学
【０４９２】 Ａ．局所投与 上記のコエレンテラジン溶液の毒性学を検討するために、標準手法に従い該溶
液を麻酔したウサギの眼に投与し、結膜の刺激を測定した。動物をジアゼパム（
約２ｍｇ／ｋｇ）で鎮静化させ、コエレンテラジンのＰＥＧ溶液１００μＬを一
方の目に点滴し、他方の目にはＰＥＧ媒体のみを点滴した。動物は３０分間観察
し、次いで、結膜の刺激並びに角膜の潰瘍がないか注意深く検査した。検査は細
隙灯を用い、十分に視覚化することで実施した。媒体による最小の結膜刺激のみ
が両眼に観察された（ｎ＝３）。このように、この溶液中でコエレンテラジン約
２０μｇを眼に直接投与したが、この局所検定では、刺激も潰瘍も、また他の毒
性徴候も生じなかった。
【０４９３】 Ｂ．静脈内投与 第二の実験においては、コエレンテラジン（ｎ＝６）１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．
）または媒体（ｎ＝６）をマウスに７日間投与する。マウスは、その挙動から証
明される毒性の肉眼的な徴候につき、研究の全期間にわたり検査した。一週間経
過の最終日に、屠殺寸前、心臓穿刺により血液を採集する。動物を屠殺し、死後
に１０種の異なる組織サンプルを各動物から取出す。分離した組織を固定し、染
色し、ブロックし、切片化する。組織サンプルの病理分析を実施し、毒性データ
を集めた。コエレンテラジンを３日間毎日投与したが、試験動物に肉眼的な挙動
の変化はなかった。
【０４９４】 Ｃ．コエレンテラジンの安定性 コエレンテラジンの安定性は、コエレンテラジンの存在とそれから誘導される
代謝産物につき生物サンプルを分析することにより決定することができる。この
実験では、血液を採取し、血清を調製するが、この血清はコエレンテラジンおよ
びその代謝産物についてアッセイすることができる。わずかな干渉がコエレンテ
ラジンに必要な発光波長において血清（マウス）から観察された。
【０４９５】 別法として、肝臓の小葉を各動物から切除し、別々にプールし、固定化し、冷
却酸性アセトン中でホモジネートとし、標準的生化学分析法によりコエレンテラ
ジンおよびその代謝産物についてアッセイする。
【０４９６】 Ｄ．コエレンテラジンのアッセイ コエレンテラジンはそれが本来有する蛍光の性質を用い、定量することができ
る。例えば、コエレンテラジンはアルコール溶媒中、特定の波長で蛍光を測定す
ることにより測定し得る。これまでの検出限界は１０ｎｇ／ｍｌ未満である。こ
こで企図した用量であれば、正確な測定のためにはこの感度レベルで十分である
。
【０４９７】 コエレンテラジンの濃度は蛍光検出と組合わせたＨＰＬＣを用いて決定しても
よい。ＨＰＬＣをベースとする検出システムに加えて、コエレンテラジンおよび
その代謝物はガス・クロマトグラフィー（ＧＣ）により、あるいはマス・スペク
トロメトリー分析により同定することも可能である。コエレンテラジンおよびそ
の代謝産物同定の最終確認は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）により実施することができ
る。
【０４９８】 発光タンパク質接合体の調製法 生物発光活性を保持する発光タンパク質接合体の調製法については、記載があ
る（米国特許５，４８６，４５５参照）。一般に、トローツ（Trauts）試薬（２
−イミノチオラン）で発光タンパク質を処理することにより、発光タンパク質に
さらなるスルフヒドリル基を導入し、スルフヒドリル活性化発光タンパク質を生
成させる。スルフヒドリル活性化発光タンパク質はスルフヒドリル反応性結合試
薬に接合させる（例えば、マレイミド−またはスルホ−ＳＭＣＣ、スルホスクシ
ンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロへキサン−１−カルボン酸エ
ステルなど、スルフヒドリル架橋し得るヘテロ二官能性リンカーで化学的に修飾
した高分子）。接合した発光タンパク質は粗製の形状で使用してもよいし、また
はさらに、例えば、イオン交換もしくはアフィニティクロマトグラフィーなど、
当業者既知の方法により精製してもよい。
【０４９９】 実施例２ げっ歯類モデル ヒト腫瘍抗原（例えば、ルイス抗原または癌胎児性抗原［ＣＥＡ］）に対する
モノクローナル抗体またはそのヒト化誘導体を、スルフヒドリル結合法により、
発光タンパク質、好ましくはエクオリンに、またはヴァーギュラ（vargula）ル シフェラーゼに接合し（米国特許５，４８６，４５５参照）、その接合体を精製
する。大よそ１０〜１００マイクログラムの抗体−発光タンパク質接合体を、ヒ
ト腫瘍抗原発現のトランスジェニックマウス尾部血管に静注する。注射は動物が
十分に耐え得るものであるべきである。
【０５００】 抗体結合に十分な時間（２〜４８時間）をとった後、コエレンテラジン約１μ
ｇ、または残りの生物発光生成成分を含む粗製の溶解物１０μＬを、企図した新
生物部分に直接ｉ．ｐ．注射する。あるいは、溶解物１０μＬまたはコエレンテ
ラジン１μｇをｉ．ｐ．注射し、コエレンテラジンが標的の部分に循環する時間
をとる（２５分ないし２日間）。
【０５０１】 次いで、マウスを麻酔し、新生物を含む部分を暗室にて露出する。光度計また
は人の目により判定される発光部分を外科的取出し手術の標的とする。あるいは
、対象の領域を、新生物部位近辺に腹腔鏡を挿入し、次いで、光を観察する位置
に画像カメラを設置して視覚化してもよい。
【０５０２】 実施例３ Renilla mulleriＧＦＰをエンコードするＤＮＡの単離と同定 １．Renilla mulleriｃＤＮＡ発現ライブラリーの調製 R. mulleriｃＤＮＡ発現ライブラリーは市販入手のラムダ−ＵｎｉＺＡＰ Ｘ Ｒベクターキット（ストラタジーン）を用い、提供された指示書に従い調製した
。簡単に述べると、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩアダプターをｃＤＮＡフラグメン
トの５'−末端に結合し、結合したｃＤＮＡフラグメントを残余の未結合アダプ ターから精製した。精製したｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ−とＸｈｏＩ−消化したλＵ
ｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクターに結合し、感応大腸菌ＸＬ−１ブルー細胞に形質転 換し、得られるＤＮＡをλファージ・ヘルパー抽出物（ギガパック・プラス・キ
ット、ストラタジーン）によりウイルス粒子にパッケージ化した。パッケージ化
ラムダライブラリーを大腸菌ＸＬ−１ブルー細胞中で力価測定し、Renilla mull
eri ｃＤＮＡ発現ライブラリーの配列複雑度を計算し、約１．７３×１０6独立 プラークであるとした。
【０５０３】 プラスミドライブラリーはクローン化したRenillaｃＤＮＡを保持するイニシ エーター−ターミネーターカセットの切除によりラムダｃＤＮＡ発現ライブラリ
ーから誘導した。約２×１０8独立プラーク単離体をプールし、大腸菌ＳＯＬＲ 細胞（ストラタジーン）を感染するのに用い、これを次いで繊維状ヘルパーファ
ージＶＣＳＭ１３、Ｒ４０８またはエクサシスト（ExAssist）ヘルパーファージ
（ストラタジーン）により同時感染させた。ｃＤＮＡ含有プラスミドを、切除ｐ
ＢＫプラスミド含有細胞選択用の２００μｇ／ｍｌアンピシリン補填固形培地上
に、感染した細胞を塗付することにより回収した。
【０５０４】 大腸菌ＸＬ−１ブルー細胞において、ｐＢＫプラスミド内のRenilla mulleri ＧＦＰの発現はｌａｃＺプロモーターの制御下にあり、その転写はイソプロピル
チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培地に添加することで誘導さ
れるが、またはスプレーの形態でもしくは他のエーロゾルとして直接コロニーに
適用してもよい。
【０５０５】 ２．ＤＮＡライブラリースクリーニング RenillaＧＦＰを発現するクローンを同定するために、青色光（例えば、４９ ０ｎｍ）を使用する機能的スクリーニング法を用い、RenillaＧＦＰを発現する 蛍光ＧＦＰ形質転換体を同定した。RenillaｃＤＮＡ発現プラスミドライブラリ ーは、感応性大腸菌ＸＬ−１ブルー細胞を形質転換し、その形質転換混合物の一
部をカーボンブラック含有２００μｇ／ｍｌアンピシリン補填Ｌ−ブロスプレー
ト上に塗付することによりスクリーニングしたが、カーボンブラックはバックグ
ランドの蛍光を（例えば、寒天から）完全に吸収させるために加えた。プレート
は４９０ｎｍを中心とする狭いバンド幅の光線で照射し、技術上一般に知られた
方法を用いて、５１０ｎｍの狭いバンドパスフィルターを通して観察した（例え
ば、Ward et al. (1978) J. Biol. Chem. 254: 781-788参照）。
【０５０６】 約３〜４×１０6の個々のコロニーをスクリーニングし、３つの発光コロニー を同定した。上記の株がＧＦＰをエンコードするプラスミドを取込んだことを確
認するために、プラスミド−エンコードタンパク質のスペクトル特性を、細胞溶
解物および部分的に精製した細胞抽出物を用い、評価した（例えば、実施例４参
照）。部分的に精製した組換えRenilla mulleriＧＦＰの蛍光励起スペクトルは 、他の種類のウミシイタケについて報告されたものに類似していた（４９８ｎｍ
近辺の最大値）；しかし、組換えRenilla mulleriＧＦＰの発光スペクトルは５ ０６ｎｍ近辺に波長最大値をもち、この値は天然産のRenillaＧＦＰで得られる 生体外および生体内発光スペクトルよりも僅かに短い波長最大値である（例えば
、５０９ｎｍ；Wampler et al. (1973) Biochem. Biophys. Acta 314: 104-109
参照）。
【０５０７】 ３．Renilla mulleriＧＦＰをエンコードするＤＮＡのヌクレオチド配列の決定 と特性化 プラスミドＤＮＡを蛍光形質転換体の培養物から精製し、RenillaｃＤＮＡプ ラスミド挿入断片のヌクレオチド配列を当業者周知の方法により決定した（例え
ば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sanger et al. Pr
oc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.)。
【０５０８】 完全長Renilla mulleriＧＦＰをエンコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列 を配列番号１５に示す。Renilla mulleriＧＦＰをエンコードするｃＤＮＡフラ グメントは１，０７９ｎｔの長さであり、５'非コーディング配列の２５８ｎｔ 、２３８個のアミノ酸ポリペプチドをエンコードする７１４ｎｔのオープン読み
枠、および３'非コーディング配列の１０７ｎｔを含む。
【０５０９】 RenillaＧＦＰをエンコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、唯一他の種 のＧＦＰであって、その完全なヌクレオチド配列が既知であるA. victoriaＧＦ Ｐのヌクレオチド配列と比較した（例えば、配列番号１参照）。２つの生物体か
ら単離した核酸は同一の長さのタンパク質をエンコードするが、しかし、Renill
a mulleriＧＦＰのアミノ末端１３６アミノ酸残基をエンコードするヌクレオチ ド配列は、A. victoriaに比較して一致するのは４８．８％のみである。さらに 、Renilla mulleriＧＦＰのカルボキシ末端１０２アミノ酸残基をエンコードす るヌクレオチド配列は、さらにより多様であり、一致するのはわずかに３１．４
％である。
【０５１０】 Renilla mulleriＧＦＰとA. victoriaＧＦＰの推定アミノ酸配列を比較すると
、タンパク質の配列もまた高次に多様である。推定アミノ酸配列間の２３８アミ
ノ酸残基の内、５６個のみが一致する（すなわち、２３．５％直接アミノ酸同一
性）。さらに、Renilla mulleriの推定ヘキサペプチド発色団（ＦＱＹＧＮＲ） の推測配列は、６個の同一アミノ酸残基の内、３個のみをもつA. victoriaのも の（ＦＳＹＧＶＱ）とはまったく異なる。また、Renilla mulleriの発色団はA.
victoriaＧＦＰに比べて、ポリペプチド鎖内のわずかに異なる位置に配置されて
いる。Renilla mulleriの発色団はアミノ酸残基６８〜７３によりエンコードさ れるが、A. victoria発色団はアミノ酸残基６４〜６９によりエンコードされて いる。このわずかに異なる位置と変化している発色団配列が２つのタンパク質が
示す異なるスペクトル特性に恐らく寄与している。
【０５１１】 実施例４ Renilla mulleriルシフェラーゼをエンコードするＤＮＡの同定と単離 実施例３に記載したRenilla mulleriｃＤＮＡプラスミドライブラリーを大腸 菌ＸＬ−１ブルー細胞に形質転換し、２００μｇ／ｍｌアンピシリンを補填し、
かつ、バックグランドの蛍光を吸収するカーボンブラックをも補填したＬ−ブロ
スプレート上に、形質転換混合物の一部を塗付することにより、単一のコロニー
を得た。このプレートを３７℃で一夜培養した。アンピシリン耐性形質転換体に
１ｍＭ−ＩＰＴＧ溶液を噴霧し、ルシフェラーゼ発現を誘発した。細胞がルシフ
ェラーゼを発現するための時間をとった後、プレートの表面に２０ｍＭコエレン
テラジン含有溶液を噴霧し、青色光発光コロニーを青バンド幅フィルターにより
可視化した。生物発光形質転換体の培養物からプラスミドＤＮＡを単離し、陽性
クローンｃＤＮＡ挿入断片のヌクレオチド配列を決定した。完全長Renilla mull
eriルシフェラーゼをエンコードするＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミ ノ酸配列を配列番号１７に示す。Renilla mulleriルシフェラーゼをエンコード するｃＤＮＡフラグメントは１，２１７ｎｔの長さであり、５'非コーディング 配列の３０ｎｔ、３１１個のアミノ酸ポリペプチドをエンコードする９３３ｎｔ
のオープン読み枠、および３'非コーディング配列の２５４ｎｔを含む。
【０５１２】 実施例５ Renillaルシフェラーゼの組換え産生 １．ウミシイタケ（Renilla reniformis）ルシフェラーゼの組換え産生 ファージミドｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシア）は多目的ＤＮＡベクターであって
、生体外での転写用に設計され、バクテリアを宿主とする組換えタンパク質の発
現に有用である。このベクターはアンピシリンへの抵抗性による形質転換体の選
択を可能とするｂｌａ遺伝子と、ｌａｃＺ’遺伝子に隣接するポリリンカー部位
を含む。対象の異種遺伝子をポリリンカーに挿入し、例えば、イソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）での誘導によりｌａｃプロモーター
から転写する。
【０５１３】 ウミシイタケ（Renilla reniformis）ルシフェラーゼをエンコードするＤＮＡ
はクローン化されている（例えば、米国特許５，２９２，６５８および５，４１
８，１５５参照）。プラスミドｐＴＺＲＬｕｃ−１は、ｐＴＺ１８ＲのＥｃｏＲ
ＩとＳｓｔＩ部位に挿入された２．２ＫｂｐのＥｃｏＲＩからＳｓｔＩ ＤＮＡ までのフラグメント上にRenillaルシフェラーゼをエンコードする（プラスミド の構築は米国特許５，２９２，６５８および５，４１８，１５５に記載されてい
る；Lorenz et al.(1991) Isolation and Expression of a cDNA encoding Reni
lla reniformis Luciferase（ウミシイタケ・ルシフェラーゼをエンコードする ｃＤＮＡの単離と発現）、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 4438-4442も
参照)。RenillaルシフェラーゼｃＤＮＡの転写開始はｌａｃＺ’プロモーターの
制御下にある。プラスミドｐＴＺＲＬｕｃ−１を取込む大腸菌株は、生物発光ア
ッセイに機能的であるRenillaルシフェラーゼを発現し、本来の酵素の特性を保 持する（例えば、米国特許５，２９２，６５８および５，４１８，１５５参照）
。
【０５１４】 ｐＴＺＲＬｕｃ−１の誘導体、ｐＴＺＲＬｕｃ−３．６は、同じ大腸菌宿主に
形質転換した場合、ｐＴＺＲＬｕｃ−１よりも約７倍高いレベルの組換えRenill
aルシフェラーゼを産生する。感応性大腸菌株ＸＬ−１を、製造業者提供の指示 書に従い、精製したｐＴＺＲＬｕｃ−３．６により形質転換した（ＸＬ−１超感
応性細胞とプロトコール；ストラタジーン、インク、ラ・ホーラ、ＣＡ）。形質
転換体は１００μｇ／ｍｌアンピシリン補填ルリア・ブロス（ＬＢ）上に塗付す
ることにより選択した。
【０５１５】 単一のアンピシリン抵抗性コロニーは１００μｇ／ｍｌアンピシリン補填ＬＢ
培地にて、細胞増殖が中間対数期に達するまで、連続的な振盪により外気温にて
増殖させた（すなわち、細胞培養がＯＤ800nm＝０．６〜０．８単位に達する） 。ｌａｃプロモーターからの転写を１ｍＭのＩＰＴＧ添加により誘発し、細胞培
養物をさらに８時間、外気温にて振盪した。
【０５１６】 細胞は１０，０００×ｇで遠心分離して収獲し、−２０℃にて凍結する。細胞
のペレットを融解し、リゾチーム４ｍｇ／ｍｌ（シグマ・ケミカル・コープ）含
有の１０ｍＭ−ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）に１：５の比（ｗ／ｗ）で再懸濁し
た。細胞を２５℃の水槽に３０分間置き、次いで１時間、氷に移した。この細胞
をウルトラソニック・インク細胞破砕機からの１分間のパルスにより０℃で超音
波処理して溶解した。
【０５１７】 溶解した細胞破片を３０，０００×ｇで３時間遠心分離して取出し、上清はデ
カンテーションし保持した。ペレットは上記の溶液に１：５の比で再懸濁し、次
いで、培養、溶解および遠心工程を繰返した。２つの上清を併合し、−７０℃に
保存した。得られる“浄化溶解物”を組換えルシフェラーゼ源として採用した。
あるいは、溶解物はさらなる精製工程（例えば、イオン交換クロマトグラフィー
または免疫アフィニティクロマトグラフィー）に付してさらに濃縮するか、また
は均一な精製酵素源としてもよい（例えば、米国特許５，２９２，６５８および
５，４１８，１５５参照）。
【０５１８】 別法として、組換えRenilla mulleriルシフェラーゼは、Renilla reniformis ルシフェラーゼをエンコードするＤＮＡを、Renilla mulleriルシフェラーゼを エンコードするＤＮＡ、例えば、配列番号１８に示したアミノ酸配列をエンコー
ドするＤＮＡに置換えて発現させてもよい。
【０５１９】 実施例６ 癌細胞の検出 ルシフェラーゼに基づく生物発光検出法は、癌細胞の可視化と正確な位置づけ
に広く利用し得る。かかる利用において、RenillaＧＦＰ、Renilla mulleriルシ
フェラーゼまたはルシフェリン分子は標的作因、例えば、抗腫瘍抗原抗体であっ
て、その抗原を発現するある種癌細胞を特異的に認識する抗体に接合することが
できる。あるいは、ルシフェラーゼを微小担体に結合し、標的作因をルシフェラ
ーゼおよび／または微小担体に接合する。接合体を、例えば、静脈内、腹腔内ま
たは皮下注射により、または外科手術に際し腹腔鏡もしくはトロカールを用いて
局所投与または直接投与により被験者に導入する。抗体−抗原複合体の形成を経
て、ルシフェラーゼまたはルシフェリンは標的癌細胞に結合し、ルシフェリン基
質（該接合体がルシフェラーゼを含む場合）またはルシフェラーゼ酵素（該接合
体がルシフェリンを含む場合）との相互作用に利用する。このように、基質また
は酵素は、次いで、例えば、注射または塗付により被験者に導入し、抗体接合体
に含まれるパートナー分子と反応させ、接合体が抗体−抗原複合体として安定に
存在する的確な領域のみで容易に検出し得る発光を生じさせる。
【０５２０】 この生物発光検出システムの感度と生物適合性は、新生物がより進行した、ま
た潜在的に生命を脅かす段階にまで生長した後にのみ癌細胞を検出し得る他の感
度の劣る方法に比べて、癌の初期段階、例えば、少数の癌細胞の発見を可能とす
る。加えて、本明細書に開示した診断方法は、浸襲的な外科的処置を必要とせず
に利用することができる。例えば、外科的観察装置、コンピュータートモグラム
または縮小型外科的観察用具など、上に見る、患者組織を通してて放なたれる低
レベルの可視赤光および近赤外光を検出するように修飾されたものを用いて、同
時係属共有の米国特許出願番号０８／９９０，１０３に記載されたように、外科
処置の助けとなる。
【０５２１】 該生物発光検出システムは、特に、癌病巣を取除くための外科的手法に適用可
能である。RenillaＧＦＰ、Renilla mulleriルシフェラーゼおよび／またはルシ
フェリン分子を、例えば、腫瘍に対して標的化すると、病巣の境界描出が正確と
なり、それによって周辺の健康な組織を除去せずに、癌のより確実な切除と完全
な除去を容易なものとする。このことは、神経組織などの複雑な致命的組織での
癌病巣を切除するのに決定的に重要である。また、生物発光生成システムの感度
は、それを術後の評価と転移の同定に非常に適したものとし、その場合の少数の
残存癌細胞を検出する能力は、癌を根絶する手技の有効性についてのより正確な
評価を可能とする。
【０５２２】 該生物発光生成システムは、癌の進行と拡大をモニターするのにさらに使用し
得ることが判明している。かかる情報は、癌患者の治療において、治療法の有効
性、例えば、化学療法および放射線療法の有効性、ならびに薬物を基本とする療
法の効能を評価するのに非常に貴重である。
【０５２３】 子宮頚癌の検出 ルシフェラーゼ・ベースの生物発光検出システムは子宮頚癌の検出に使用する
ことができる。例えば、ルシフェリンまたはルシフェラーゼは、直接またはリン
カーもしくは微小担体を介して、子宮頚癌細胞抗原に特異的な抗体に接合する（
例えば、表３参照）。該接合体は、次いで、適切な製剤として子宮頚部組織に直
接塗付し、次いですすいで未結合の接合体を除去する。生物発光反応の残余の成
分、すなわち、もし接合体がルシフェラーゼを含んでいるならばルシフェリンで
あり、もし接合体がルシフェリンを含んでいるならばルシフェラーゼである成分
を、次いで必要な活性化因子と共に子宮頚部組織に塗付し、結合した接合体と相
互作用させる。次いで、光放射をモニターする。発光は人の目で検出し得る可視
波長であるのがよい。もし認識された抗原を提示する癌細胞が組織中に存在する
ならば、それらの細胞は赤くなり、それによって可視化される。生物発光はより
正確な癌の位置を示すのに役立ち、それが癌病巣の除去において外科医を手引き
する。
【０５２４】 癌胎児抗原（ＣＥＡ）の検出 また、ルシフェラーゼに基いた生物発光検出システムは、ＣＥＡを呈する腫瘍
性細胞、例えば結腸直腸癌に存在する癌細胞の検出においても使用され得る（例
、表３参照）。この適用法では、ルシフェラーゼまたはルシフェリンを、直接的
または間接的にＣＥＡに特異的な抗体へコンジュゲートし、子宮頸癌の検出につ
いて上述した方法と同じ要領で検出を行う。例えば結腸壁、さらにはリンパ管へ
のＣＥＡ担持癌細胞の移動についても、この検出システムでモニターすることが
できる。さらに、強度の低い可視光線でも検出する修正腹腔鏡を用いることによ
り、ＣＥＡ担持癌細胞の検出および視覚化を向上させることができる。
【０５２５】 膀胱癌の検出 膀胱癌を検出するため、ルシフェラーゼまたはルシフェリンを、ターゲッティ
ング剤、例えば、膀胱癌細胞に現れた抗原を認識する抗体にコンジュゲートする
ことは、癌病変部へコンジュゲートを結合させるのに役立つ。コンジュゲートを
、例えばカテーテルにより膀胱へ導入すると、病変部が視覚化され、それに続い
て生物発光反応の残存成分を膀胱へ導入すると、輪郭が明らかにされる。この態
様は膀胱の泌尿器癌に特に有用であり、それらは電気メスを用いた膀胱壁に位置
する腫瘍の経尿道焼灼により手術中に容易に除去される。この技術により、健康
な膀胱組織の焼灼は最小限に抑えられ、転移の可能性がある領域が確認され、さ
らに標的の完全な外科的除去が確実に行われる。
【０５２６】 別の態様において、ルシフェラーゼ結合微粒子に結合されたターゲッティング
剤で腫瘍の存在を検出することにより、腫瘍性膀胱組織の位置および縁が非常に
詳細に明確化され得る。ターゲッティング剤コンジュゲートの投与後、生物発光
反応が開始される（すなわち、ルシフェリンおよび／または何らかの活性化因子
の添加により）。近くの周囲組織に対して指向されるかまたは同一の非腫瘍形成
性組織を優先的に標的とするターゲッティング剤に、第２のＧＦＰ結合微粒子を
共有結合させる。ＧＦＰコンジュゲートを患者に投与する。すなわち、例えば、
腫瘍性組織は、例えばエクオリンまたはRenillaルシフェラーゼ−ターゲッティ ング剤コンジュゲートを用いると、青色光線を放って輝き、ＧＦＰ−結合周囲組
織は青色光線を吸収して緑色光線を放つことによりさらにコントラストを生じさ
せ、手術で摘出されるべき組織の縁が明確に特定される。
【０５２７】 遊走性癌細胞伝播の検出 例えば皮膚黒色腫、深層胸部腫瘍および結腸癌に端を発する肝臓転移からの遊
走性癌細胞によるリンパ系の浸潤は、生物発光検出システムを用いると容易に検
出され得る。ターゲッティング剤、例えば癌細胞抗原を認識する抗体にコンジュ
ゲートされたルシフェラーゼまたはルシフェリンは、遊走プロセスのどこに位置
しておろうと、細胞と特異的に複合体を形成する。次いで、残存生物発光発生成
分を全身に循環させると、それらはコンジュゲートが結合されている細胞のみと
相互作用する。癌細胞が皮膚表面またはその付近の上皮組織を侵している場合、
コンジュゲートおよび／または相手分子を局所適用することにより生じる発光は
、侵襲的方法を用いずとも肉眼で容易に検出できる。さらに、光電子増倍管また
は外科用拡大透視装置を用いても、皮膚を通した光放射量が増幅され得る。この
方法で、手術を試みる前に、腫瘍細胞のリンパ遊走を追跡することが可能となり
得る。
【０５２８】 乳癌の検出 乳癌の早期発見の利点、例えば生存率が増加し、処置に関する選択の幅も広が
ることについては、数多くかつ詳細に立証されている。生物発光検出システムに
より、乳癌の早期診断を容易にする高感度の方法が提供される。例えば、上記適
用において、ルシフェラーゼまたはルシフェリンは、正常乳房組織とは対照的に
乳癌組織で数の多大な増加が見られる分子を標的とする抗エストロゲンまたは抗
プロゲステロン受容体抗体にコンジュゲートされ得る。すなわち、この本質的に
は定量的な検定システムの場合、診断は、例えば胸部組織バイオプシーにおいて
検出される発光レベルに依存する。発光レベルは、光度計、光電子増倍管または
他の適当な手段を用いて定量され得る。
【０５２９】 別法として、ターゲッティング剤は、赤色光線を発するアリストストミアス（
Aristostomias）、マラコステウス（Malacosteus）またはパキストミアス（Pach
ystomias）から単離されたルシフェラーゼに直接的または間接的に結合され得る
［例、Widderら（１９８４）Science ２２５：５１２−５１４］。特に好ましい
のは、アリストストミアス・シンチランス（Aristostomias scintillans）およ びマラコステウス・ニゲル（Malacosteus niger）といった種類から単離された 生物発光成分である。この適用では、ルシフェラーゼ含有ターゲッティング剤を
患者に投与した後、生物発光発生系の残存成分（例、ルシフェリンおよび／また
は活性化因子）を投与する。この波長での光線放射は、光電子増倍管、コンピュ
ーター断層撮影機を用いるかまたは赤色光線に対する感度が高い外科的映像装置
を用いると侵襲的な外科的方法を講じずとも組織を通して直接検出される。別法
として、外科用拡大透視器具が使用され得、その場合、光学検出手段にはＣＣＤ
画像装置または赤色光線放射に特に敏感な蛍光倍増管が含まれる。
【０５３０】 実施例７ RenillaＧＦＰを用いた蛍光放射の増幅 RenillaＧＦＰの存在下において、Renillaルシフェラーゼ−コエレンテラジン
反応の生物発光量子収量は、６.９％から１３％へ高められ、増幅はほぼ２倍で ある。コエレンテラジン構造の１個またはそれ以上の基が置換されたコエレンテ
ラジンの誘導体は公知である（例、Hartら（１９７９）Biochemistry １８：２ ００４参照）。ここで特に興味深いのは、上記で検討された、式（Ｖ）で示され
るコエレンテラジンである。
【化１３】
【０５３１】 注目されるところでは、Renillaルシフェラーゼの存在下におけるこの化合物 の反応により、紫外線、λ最大３９０ｎｍが発生し、その生物発光量子収量は比
較的低い（約０.０１２％）。しかしながら、ＧＦＰを加えると、Renillaルシフ
ェラーゼ／ＧＦＰ複合体は緑色光線を発し、生物発光量子収量は２.３％に高め られる。従って、ＧＦＰを追加することにより、Renillaルシフェラーゼにより 発せられる光線の量は約２００倍増加する。さらに、排除限界が４７０ナノモル
未満の帯域通過フィルターを用いると、４７０ｎｍより大きい波長の光線だけが
観察され得る。これらの条件下では、光線放射の視覚化がＧＦＰの存在に直接依
存的であることにより、光線の青色光子は４７０ｎｍを越えるもの（例，５１０
ｎｍ緑色光線）にシフトされる。
【０５３２】 青色光を放つルシフェラーゼと組み合わせたRenillaＧＦＰおよびこのコエレ ンテラジン誘導体および帯域通過フィルターを使用することにより、検出可能な
光線発生がＧＦＰの存在により異なるイムノアッセイが開発され得る。上記イム
ノアッセイについては若干の立体配置が可能であり、使用される典型的なイムノ
アッセイでは、反応は固体支持体で行われ、例えばマイクロタイター配列方式は
、次の要領で遂行される。
【化１４】
【０５３３】 ここで使用されている場合、標的抗原（複数も可）を含む疑いのある試験試料
を、個々に壁に結合されている標的化抗原（複数も可）に特異的な複数の抗体を
含むマイクロタイタープレートに加える。抗体−抗原複合体を形成後、Renilla ＧＦＰに結合されている、抗原に特異的な第２抗体、またはそのＦ（Ａｂ）2フ ラグメントを含む抗体コンジュゲート、例えば本明細書に記載されているものを
加える。具体的には、結合した第２抗体は、ルシフェラーゼ、好ましくはレニラ
・レニホルミス（Renilla reniformis）またはレニラ・ムレリ（Renilla muller
i）ルシフェラーゼを加えることにより検出され、式（Ｖ）で示される化合物お よび光線発生は４７０ｎｍ帯域通過フィルターを用いて観察される。光線強度は
、当然存在するＧＦＰ−Ａｂ2の尺度であり、Ａｂ1に結合した抗原の量の尺度で
もある。
【０５３４】 このシステムを用いると、抗体が特異性を示す個々の壁について光線を検出す
ることにより、試料中における抗原の存在が確認される。抗体の特異性を知るこ
とにより、試料中に存在する特異抗原が同定され得る。すなわち、当然、ルシフ
ェラーゼ／ルシフェリン添加前の中間洗浄段階を必要としないイムノアッセイを
遂行することが可能である。
【０５３５】 実施例８ ガウシア・ムレリ（Gaussia mulleri）ルシフェラーゼをコードするＤＮＡの 同定および単離 １．ガウシア（Gaussia）ＤＮＡ発現ライブラリーの製造 ガウシア（Gaussia）ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、市販されているラムダ− ＵｎｉＺａｐ ＸＲベクターキット（ストラタジーン）を用い備えられた使用説 明書に従い製造された。簡単に述べると、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩアダプター
を、ｃＤＮＡフラグメントの５'末端に連結させ、連結されたｃＤＮＡフラグメ ントを残りの非連結アダプターから精製した。精製されたｃＤＮＡを、ＥｃｏＲ
Ｉ−およびＸｈｏＩ−消化λ ＵｎｉＺａｐ ＸＲベクターに連結させ、形質転換
能エシェリキア・コリ（E.coli）ＸＬ−１ブルー細胞へ形質転換し、λファージ
ヘルパー抽出物（ギガパック・プラス・キット、ストラタジーン）を用いて、生
成したＤＮＡをウイルス粒子に封入した。封入されたラムダライブラリーを、エ
シェリキア・コリ（E.coli）ＸＬ−１ブルー細胞で滴定し、ｃＤＮＡ発現ライブ
ラリーの配列コンプレキシティーを計算した。
【０５３６】 クローン化ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼエンコードＤＮＡを含むイニ シエーター‐ターミネーターカセットの切除により、プラスミドライブラリーを
ラムダｃＤＮＡ発現ライブラリーから誘導した。約２×１０8の独立プラーク分 離株をプールし、これらを用いてエシェリキア・コリ（E.coli）ＳＯＬＲ細胞（
ストラタジーン）に感染させ、次いで繊維状ヘルパーファージＶＣＳＭ１３、Ｒ
４０８またはＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（ストラタジーン）と共感染さ
せた。切除されたｐＢＫプラスミドを含む細胞を選択するために２００μｇ／ml
アンピシリンを補った固形培地で感染細胞を平板培養することにより、ｃＤＮＡ
含有プラスミドを採取した。
【０５３７】 エシェリキア・コリ（E.coli）ＸＬ−１ブルー細胞において、ｐＢＫプラスミ
ドでルシフェラーゼをコードするＤＮＡの発現は、ｌａｃＺプロモーターの制御
下に置かれており、その転写はイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）を培養培地に加えることにより容易に誘導されるか、または噴霧形
態または他のエーロゾルでコロニーへ直接適用され得る。
【０５３８】 ２．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング ガウシア（Gausia）ルシフェラーゼを発現するクローンを同定するため、機能
的スクリーニング方法を使用した。ｃＤＮＡプラスミドライブラリーをエシェリ
キア・コリ（E.coli）ＸＬ−１ブルー細胞へ形質転換し、２００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを補い、またバックグラウンドの蛍光を吸収するためのカーボンブラ
ックを補ったＬブロスのプレートで形質転換混合物の一部を平板培養することに
より、単一コロニーを得た。プレートを３７℃で一夜インキュベーションした。
アンピシリン耐性形質転換体に１ミリモルのＩＰＴＧ溶液を噴霧することにより
、ルシフェラーゼ発現を誘導した。細胞にルシフェラーゼを発現する時間を与え
た後、プレート表面に２０ミリモルのコエレンテラジンを含む溶液を噴霧し、青
色帯域幅フィルターを用いて青色光を発するコロニーを視覚化した。
【０５３９】 生物発光形質転換体の培養物からプラスミドＤＮＡを単離し、陽性クローンの
ｃＤＮＡ挿入体のヌクレオチド配列を決定した。完全長ガウシア（Gaussia）ル シフェラーゼをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配
列番号１９および２０に示されている。ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼを コード化するｃＤＮＡフラグメントは７６５ｎｔ長であり、５'非コーディング 領域、１８５アミノ酸ポリペプチドをコード化する４５５ｎｔ読み枠、および３
'非コーディング配列を含む。
【０５４０】 実施例９ 追加的ルシフェラーゼおよびＧＦＰタンパク質のクローニング 先行実施例に記載された方法を用いることにより、プティロサルクス（Ptilos
arcus、コルテス海から得られるウミエラ）種に関するＧＦＰをコード化する核 酸、およびプレウロマンマ（Pleuromamma、カイアシ）種からのルシフェラーゼ が得られた。これらの配列は、配列番号２８−３２に示されている。プレウロマ
ンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼは、ガウシア（Gaussia）およびプレウロマ
ンマ（Pleuromamma）の混合カイアシライブラリー（「巨大」カレノイド・カイ アシ類、各々〜６ｍｍおよび〜３ｍｍ）からクローン化された。プレウロマンマ
（Pleuromamma）ルシフェラーゼは、そのさらに鮮明な緑色のインビボ放射によ り同定された。
【０５４１】 コード化タンパク質に関する放射スペクトルおよびｐＨおよび塩曲線は、図４
−６および８−１０に与えられている。
【０５４２】 実施例１０ ガウシア（Gaussia）、レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）およびプレウロマ
ンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼおよびレニラ・ムレリ（Renilla mulleri）
およびプティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰがクローン化された。これらの タンパク質をコード化する核酸を含む様々な核酸構築物およびプラスミドが製造
され、本明細書に記載された診断、分析方法および目新しい項目に使用されるコ
ード化タンパク質の発現に使用されている。
【０５４３】 構築物 Ａ．レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼおよびＧＦＰ−エン コード構築物およびプラスミド 宿主プラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）ファージミド（スト ラタジーン）である。示された構築物は、増幅されたラムダＺＡＰ ｃＤＮＡラ イブラリー（ストラタジーン）の大量切除から誘導されたファージミドの大集団
の機能的スクリーニングにより単離されたものである。ここに記載されているク
ローン化生物発光遺伝子の各々は、多重クローニング部位（ＭＣＳ）のＥｃｏＲ
ＩおよびＸｈｏＩ部位間における挿入体として類似ファージミドで単離された。
各挿入体は、機能的タンパク質の全コーディング領域（ＣＤＳ）、並びにコーデ
ィング領域の可変数のヌクレオチド５'および３'を包含するＤＮＡを含む。天然
タンパク質のアミノ酸に加えて、機能的スクリーニングされた分離株（ここでは
、ｌａｃＺ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼｃＤＮＡ融合 体ＣＤＳまたはｌａｃＺ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ ｃＤＮＡ
融合体ＣＤＳ）で発現されたポリペプチドは、追加のＮ−末端残基を含み得る。
【０５４４】 １）ｐBluescript ＳＫ−（ｒ）（４１４７ｂｐ）におけるレニラ・ムレリ（R
enilla mulleri）ルシフェラーゼ ｌａｃＺ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼコーディング ドメイン配列（ＣＤＳ）融合体を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（ｒ）（ス トラタジーン）へクローン化した。このよく知られた市販ベクターは、特に細菌
性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（アンピシリン）、ファー
ジ複製起点（ｆ１起点）、Ｔ３プライマー配列、Ｔ３ ２０量体配列、ＮＩＨオ リゴ０４９５配列、Ｔ３プロモーター、ＳＫプライマー配列、Ｔ７プロモーター
、ＫＳプライマー配列、Ｔ７プライマー配列、Ｔ７ ２２量体配列、ＮＩＨオリ ゴ０４３６配列、ファージ−プラスミドＰＣＲ１配列、ファージ−プラスミドＰ
ＣＲ２配列、ファージ−プラスミドＰＣＲ２（ｂ）配列および様々な制限クロー
ニング部位を含む。ｌａｃＺ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラ ーゼ融合タンパク質の発現は、ｌａｃＺプロモーターの制御下にある。
【０５４５】 ２）ｐBluescript ＳＫ（４１４７ｂｐ）におけるレニラ・ムレリ（Renilla m
ulleri）ルシフェラーゼ ｌａｃＺ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼコーディング ドメイン配列（ＣＤＳ）融合体を、特に細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細
菌性選択マーカー（アンピシリン）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、Ｔ３プラ
イマー配列、Ｔ３プロモーター、ＳＫプライマー配列、Ｔ７プロモーター、ＫＳ
プライマー配列、Ｔ７プライマー配列および様々な制限クローニング部位を含む
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（ｒ）（ストラタジーン）へクローン化した。 ｌａｃＺ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼ融合タンパク質 の発現は、ｌａｃＺ−プロモーターの制御下にある。
【０５４６】 Ｂ．哺乳類細胞における天然レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰおよ びルシフェラーゼの発現用プラスミド レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰまたはルシフェラーゼコーディン グ領域を、核酸増幅（ＰＣＲ）により増幅し、それぞれコーディング配列に対し
５'および３'に隣接してＥｃｏＲＩ部位およびＸｈｏＩ部位が付加された。ＰＣ
Ｒ産物を、ｐｃＤＮＡ３.１（＋）（インビトロゲン）のポリリンカーにおける ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位間に挿入し、プラスミドＤＮＡの大量生産を目的とし
て細菌（例、ＸＬＩ−ブルー株、ストラタジーン）へ形質転換した。これらのプ
ラスミドは、哺乳類細胞における発現を駆動するためのＣＭＶプロモーター（Ｐ
ｃｍｖ）を含む。
【０５４７】 １）ｐｃＤＮＡ３.１（＋）（６１２２ｂｐ）におけるレニラ・ムレリ（Renil
la mulleri）ＧＦＰ レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ ＣＤＳを、特に細菌性複製起点（
ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ａｍｐ）、哺乳類選択マーカー（Ｎｅ
ｏ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、ウイルス性複製起点（ＳＶ４０起点）お
よび様々な制限クローニング部位を含む、ｐｃＤＮＡ３.１（＋）（インビトロ ゲン、サンディエゴ）へクローン化した。レニラ・ムレリ（Renilla mulleri） ＧＦＰの発現は、ＣＭＶプロモーターの制御下にある。
【０５４８】 ２）ｐｃＤＮＡ３.１（＋）（６３４１ｂｐ）におけるレニラ・ムレリ（Renil
la mulleri）ルシフェラーゼ レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細菌性 複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ａｍｐ）、哺乳類選択マー
カー（Ｎｅｏ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）、ウイルス性複製起点（ＳＶ４
０起点）および様々な制限クローニング部位を含むｐｃＤＮＡ３.１（＋）（イ ンビトロゲン、サンディエゴ）へクローン化した。レニラ・ムレリ（Renilla mu
lleri）ルシフェラーゼの発現は、ＣＭＶプロモーターに制御されている。
【０５４９】 ４．酵母細胞における天然レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰおよび ルシフェラーゼの発現に使用されるプラスミド レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰまたはルシフェラーゼを、ＰＣＲ 増幅し、ｐＹＥＳ２（インビトロゲン）のポリリンカーＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部
位間に挿入した。これらのプラスミドは、ＧＡＬ１プロモーターの調節下酵母に
おいてガラクトース誘導発現が行われるように設計されている。
【０５５０】 １）ｐＹＥＳ２（６５４７ｂｐ）におけるレニラ・ムレリ（Renilla mulleri ）ＧＦＰ レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ ＣＤＳを、特に、細菌性複製起点
（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ａｍｐ）、酵母複製起点（２ミクロ
ン起点）、酵母選択マーカー（ＵＲＡ３）、ファージ複製起点（ｆ１起点）およ
び様々な制限クローニング部位を含む酵母発現プラスミドｐＹＥＳ２（インビト
ロゲン、サンディエゴ）にクローン化した。レニラ・ムレリ（Renilla mulleri ）ＧＦＰの発現は、酵母ＧＡＬ１の制御下に置かれている。このベクターは、サ
ッカロマイシス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞での発現用に設
計されている。
【０５５１】 ２）ｐＹＥＳ２（６７６６ｂｐ）におけるレニラ・ムレリ（Renilla mulleri ）ルシフェラーゼ レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細菌性 複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ａｍｐ）、酵母複製起点（
２ミクロン起点）、酵母選択マーカー（ＵＲＡ３）、ファージ複製起点（ｆ１起
点）および様々な制限クローニング部位を含む、ｐＹＥＳ２（インビトロゲン）
にクローン化した。レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼの発現 は、酵母ＧＡＬ１の制御下に置かれている。
【０５５２】 Ｄ．細菌細胞における天然レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰまたは ルシフェラーゼ発現に使用されるプラスミド 鋳型としてｐＥＴ−３４ ＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフ
ェラーゼまたはｐＥＴ−３４ ＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦ
Ｐプラスミドを使用し、高忠実度の逆ＰＣＲを用いることにより、ＣＢＤおよび
天然レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼまたはＧＦＰ開始コド ンまでの他の全てのコーディング配列５'が正確に欠失された。プラスミドを再 び環状にし、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（ノヴァゲン、マディソン、ウィスコンシ
ン）へ再導入した。これらのプラスミドは、ＩＰＴＧによる誘導後における天然
長ポリペプチドの大量発現用に設計されている。発現されたポリペプチドの性質
により、タンパク質は適切に折りたたまれ、細胞質ゾルに機能的形態で存在する
かまたは培養培地へ放出され得る。この方法で発現されると、ここに記載されて
いる全ての生物発光タンパク質について顕著な機能的活性が観察される。ガウシ
ア（Gaussia）ルシフェラーゼは培養培地中へ放出される。
【０５５３】 １）ｐＥＴ−３４（６０１４ｂｐ）における天然プティロサルクス（Ptilosar
cus）ＧＦＰ ＣＤＳ プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰ ＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（
ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（ｆ１起
点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、リボソーム結合
配列（ｒｂｓ）、ＬＩＣ（連結反応非依存的クローニング）部位、３'ＬＩＣオ ーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配列、Ｔ７ターミネーターお
よび様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン）にクローン
化した。プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰの発現は、ｌａｃオペレータ ーおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５５４】 ２）ｐＥＴ−３４（６０１４ｂｐ）における天然レニラ・ムレリ（Renilla mu
lleri）ＧＦＰ レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ ＣＤＳを、特に、細菌性複製起点
（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（ｆ１
起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂｓ、ＬＩ
Ｃ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配列、 Ｔ７ターミネーターおよび様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノ
ヴァゲン）にクローン化した。レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰの発 現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴ
Ｇにより誘導され得る。
【０５５５】 ３）ｐＥＴ−３４（５８５５ｂｐ）における天然ガウシア（Gaussia）ルシフ ェラーゼ ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細菌性複製起点（Ｃｏ ｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（ｆ１起点）
、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂｓ、ＬＩＣ部位
、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配列、Ｔ７タ ーミネーターおよび様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲ
ン）にクローン化した。ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼの発現は、ｌａｃ オペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧにより誘導
され得る。
【０５５６】 ４）ｐＥＴ−３４（５８９４ｂｐ）における天然プレウロマンマ（Pleuromamm
a）ルシフェラーゼ プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細菌性複製 起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（
ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂｓ、
ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配 列、Ｔ７ターミネーターおよび様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４
（ノヴァゲン）にクローン化した。プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラ ーゼの発現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり
、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５５７】 ５）ｐＥＴ−３４（６２３３ｂｐ）における天然レニラ・ムレリ（Renilla mu
lleri）ルシフェラーゼ レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細菌性 複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起
点（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂ
ｓ、ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標 識配列、Ｔ７ターミネーターおよび様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−
３４（ノヴァゲン）にクローン化した。レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ル シフェラーゼの発現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御
下にあり、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５５８】 ５．細菌細胞からのセルロース結合ドメイン‐レニラ・ムレリ（Renilla mull
eri）ルシフェラーゼまたはＧＦＰ融合タンパク質の精製に使用されるプラスミ ド レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼまたはＧＦＰのコーディ ング領域を、鋳型としてクローン化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドを用い
て高忠実度ポリメラーゼ（Ｐｆｕターボ、ストラタジーン）により増幅し、連結
反応非依存的クローニング（ＬＩＣ）部位をｐＥＴ−３４ ＬＩＣベクター（ノ ヴァゲン）へ挿入した。生成したセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）−ルシフェ
ラーゼまたはＣＢＤ−ＧＦＰ融合タンパク質は、ＩＰＴＧによる誘導後ＢＬＩ（
ＤＥ３）細胞（ノヴァゲン）において高レベルで発現され得る。ＣＢＤ−ｃｌｏ
ｓの性質故に、発現されたタンパク質の主要部分は、不溶性封入体に存する。封
入体は半純粋状態で単離され得、機能的ＣＢＤ−融合タンパク質は復元により採
取され得る。融合タンパク質にトロンビンおよびエンテロキナーゼ（ＥＫ）開裂
部位が含まれていることにより、厳密な分析を目的とする高度精製天然または準
天然タンパク質が単離され得る。
【０５５９】 １）ｐＥＴ−３４（６８２４ｂｐ）におけるＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renill
a mulleri）ルシフェラーゼ ＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に 、細菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファー
ジ複製起点（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレータ
ー、ｒｂｓ、ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、 Ｈｉｓ標識配列、Ｔ７ターミネーター、トロンビン開裂部位、リボヌクレアーゼ
−Ｓ−ペプチド標識（Ｓ標識）ＣＤＳ配列、ＥＫ開裂部位および様々な制限クロ
ーニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン）にクローン化した。ＣＢＤ−レ
ニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼの発現は、ｌａｃオペレータ ーおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５６０】 ２）ｐＥＴ−３４（６４４６ｂｐ）におけるＣＢＤ−ガウシア（Gaussia）ル シフェラーゼ ＣＢＤ−ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細菌性複製起 点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点（ｆ
１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂｓ、Ｌ
ＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ標識配列 、Ｔ７ターミネーター、トロンビン開裂部位、Ｓ標識ＣＤＳ配列、ＥＫ開裂部位
および様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン）にクロー
ン化した。ＣＢＤ−ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼの発現は、ｌａｃオペ レーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧにより誘導され
得る。
【０５６１】 ３）ｐＥＴ−３４（６４８５ｂｐ）におけるＣＢＤ−プレウロマンマ（Pleuro
mamma）ルシフェラーゼ ＣＢＤ−プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼＣＤＳを、特に、細 菌性複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複
製起点（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、
ｒｂｓ配列、ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、 Ｈｉｓ標識配列、Ｔ７ターミネーター、トロンビン開裂部位、Ｓ標識ＣＤＳ配列
、ＥＫ開裂部位および様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァ
ゲン）にクローン化した。ＣＢＤ−プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラ ーゼの発現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり
、ＩＰＴＧにより誘導され得る。
【０５６２】 ４）ｐＥＴ−３４（６６０５ｂｐ）におけるＣＢＤ−プティロサルクス（Ptil
osarcus）ＧＦＰ ＣＢＤ−プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰ ＣＤＳを、特に、細菌性複
製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起点
（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂｓ
配列、ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉｓ 標識配列、Ｔ７ターミネーター、トロンビン開裂部位、Ｓ標識ＣＤＳ配列、ＥＫ
開裂部位および様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン）
にクローン化した。ＣＢＤ−プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰの発現は 、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴＧに
より誘導され得る。
【０５６３】 ５）ｐＥＴ−３４（６６０５ｂｐ）におけるＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renill
a mulleri）ＧＦＰ ＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ ＣＤＳを、特に、細菌性
複製起点（ＣｏｌＥ１起点）、細菌性選択マーカー（Ｋａｎ）、ファージ複製起
点（ｆ１起点）、ｌａｃＩ配列、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレーター、ｒｂ
ｓ配列、ＬＩＣ部位、３'ＬＩＣオーバーラップ配列、Ｈｉｓ標識ＣＤＳ、Ｈｉ ｓ標識配列、Ｔ７ターミネーター、トロンビン開裂部位、Ｓ標識ＣＤＳ配列、Ｅ
Ｋ開裂部位および様々な制限クローニング部位を含むｐＥＴ−３４（ノヴァゲン
）にクローン化した。ＣＢＤ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰの発 現は、ｌａｃオペレーターおよびＴ７プロモーターの同時制御下にあり、ＩＰＴ
Ｇにより誘導され得る。
【０５６４】 Ｆ．レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼ−ＧＦＰ融合タンパ ク質発現用プラスミド 図７に描かれているように、レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰを、 ｐＥＴ−３４ベクター（ノヴァゲン）の連結反応非依存的クローニング部位へ挿
入した。通常ｐＥＴ−３４に存在するセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を、逆
ＰＣＲを用いて欠失した。生成した融合タンパク質の分析用途に関する最適化を
容易にするため（例えばＢＲＥＴの場合）、追加制限部位（示されず）がリンカ
ー領域に導入され、所望の結合および標的タンパク質または部分の挿入が行われ
る。これらの部位の２つを用いて、レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフ ェラーゼＣＤＳを、ＣＢＤの標準位置に挿入した。このプラスミド、またはＣＢ
Ｄを保持する類似構築物において、準天然および天然ＧＦＰは、それぞれトロン
ビンまたはエンテロキナーゼ（ＥＫ）処理により融合タンパク質から開裂され得
る。リボヌクレアーゼＳ−ペプチド標識（Ｓ標識ＣＤＳ）により、ＧＦＰまたは
融合タンパク質の免疫アフィニティー精製が簡易化され、市販のリボヌクレアー
ゼアッセイ（ノヴァゲン）を用いることにより粗抽出物におけるこれらのタンパ
ク質の定量が行われる。ルシフェラーゼが第２の分離プラスミドにおいてＳ標識
に別々に融合される場合、リボヌクレアーゼドメインによるＳ−タンパク質／ル
シフェラーゼおよびＳ−タンパク質／ＧＦＰの会合または共発現により、分子間
ＢＲＥＴ用試験システムが作製される。
【０５６５】 Ｇ．哺乳類細胞におけるレニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰの機能的 発現 ＣＭＶプロモーター（上記構築物番号Ｂ（１））の制御下レニラ・ムレリ（Re
nilla mulleri）ＧＦＰを含むプラスミドｐｃＤＮＡ３.１（＋）により、ヒーラ
細胞をトランスフェクションした。リポフェクタミン（LipofectAMINE）プラス キット（ギブコ）を用いて、１プレート当たり１.５マイクログラムのｐｃＤＮ Ａ３.１によりヒーラ細胞をバーストトランスフェクションした。
【０５６６】 ３０マイクログラムのｐｃＤＮＡ−レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦ Ｐ ＤＮＡによりヒーラ細胞をバーストトランスフェクションし、３７℃で８時 間増殖させると、細胞のある部分集団は高度蛍光性であることが観察された。蛍
光性は、１ラウンドの細胞分裂が行われているか、または最近行われたと見られ
る細胞対に局在していた。この結果は、天然レニラ・ムレリ（Renilla mulleri ）ＧＦＰが、発現され、折りたたまれ、発色団と適当に複合体を形成し、その機
能を保持していることにより、哺乳類細胞において緑色蛍光を発し得ることを示
している。これは、生理学的条件下では機能的形態への折り畳みが不十分である
エクオレア（Aequorea）ＧＦＰの場合とは対照的である。
【０５６７】 ヒーラ細胞におけるレニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ＧＦＰ蛍光の視覚化 に使用されるフィルター（４７０／４０励起フィルター、４９５励起二色フィル
ターおよび５２５／５０放射フィルター）は、クローマ販売のエンド（Endo）Ｇ
ＦＰフィルターセットであった。
【０５６８】 当技術分野に精通した者であれば修飾については明白に理解できるため、この
発明は後記請求の範囲によってのみ制限されるものとする。
【０５６９】 配列リストの要約 １．配列番号１レニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）ルシフェラーゼ
［米国特許第５４１８１５５号］ ２．配列番号２キプリディナ・ヒルゲンドルフィイ（Cypridina hilgendorfii
）ルシフェラーゼ［ＥＰ０３８７３５５］ ３．配列番号３修飾ルシオラ・クルシアタ（Luciola cruciata）ルシフェラー
ゼ［ホタル、米国特許第４９６８６１３号］ ４．配列番号４バルグラ（Vargula）（キプリディナ（Cypridina））ルシフェ
ラーゼ［トンプソンら（１９８９）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.８６：６５ ６７−６５７１およびＪＰ３−３０６７８ Osakaから］ ５．配列番号５アポエクオリンエンコード遺伝子［米国特許第５０９３２４０
号、ＰＡＱ４４０］ ６．配列番号６コード化エクオリン（Aequorin）ＡＥＱ１［Prasherら（１９ ８７）“Sequence Comparisons of CDNAS Encoding for Aequorin Isotypes”Bi
ochemistry ２６：１３２６−１３３２］ ７．配列番号７コード化エクオリン（Aequorin）ＡＥＱ２［Prasherら（１９ ８７）］ ８．配列番号８コード化エクオリン（Aequorin）ＡＥＱ３［Prasherら（１９ ８７）］ ９．配列番号９エクオリン（Aequorin）発光タンパク質［Charbonneauら（１ ９８５）“Amino Acid Sequence of the Calcium-Dependent Photoprotein Aequ
orin” Biochemistry２４：６７６２−６７７１］ １０．配列番号１０生物発光活性が増強されたエクオリン（Aequorin）突然変
異体［米国特許第５３６０７２８号、Asp１２４はSerに変更］ １１．配列番号１１生物発光活性が増強されたエクオリン（Aequorin）突然変
異体［米国特許第５３６０７２８号、Glu１３５はSerに変更］ １２．配列番号１２生物発光活性が増強されたエクオリン（Aequorin）突然変
異体［米国特許第５３６０７２８号、Gly１２９はAlaに変更］ １３．配列番号１３コード化アポエクオリン［シーライト、サイエンシーズ、
ボガート（ジョージア）によりアクアライト（AQUALITE、商標）として販売、再
構成され、エクオリンを形成］ １４．配列番号１４ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fisheri）フラビンレダク
ターゼ［米国特許第５４８４７２３号］ １５．配列番号１５レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）緑色蛍光タンパク質 （ＧＦＰ）をコード化する核酸 １６．配列番号１６コード化レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）緑色蛍光タ ンパク質（ＧＦＰ） １７．配列番号１７レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラーゼをコ ード化する核酸 １８．配列番号１８コード化レニラ・ムレリ（Renilla mulleri）ルシフェラ ーゼ １９．配列番号１９ガウシア（Gausssia）ルシフェラーゼをコード化する核酸 ２０．配列番号２０コード化ガウシア（Gausssia）ルシフェラーゼ ２１．配列番号２１ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼ融合タンパク質をコ ード化する核酸 ２２．配列番号２２コード化ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼ融合タンパ ク質 ２３．配列番号２３レニラ・ムレリ（R.mulleri）ＧＦＰのアミノ末端付近の アミノ酸配列に対応するレニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）ＧＦＰペ
プチド ２４．配列番号２４レニラ・ムレリ（R.mulleri）ＧＦＰのアミノ末端付近の アミノ酸配列に対応するレニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）ＧＦＰペ
プチド ２５．配列番号２５レニラ・ムレリ（R.mulleri）ＧＦＰの中間付近のアミノ 酸配列に対応するレニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）ＧＦＰペプチド ２６．配列番号２６レニラ・ムレリ（R.mulleri）ＧＦＰの中間付近のアミノ 酸配列に対応するレニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）ＧＦＰペプチド ２７．配列番号２７レニラ・ムレリ（R.mulleri）ＧＦＰのカルボキシ末端付 近のアミノ酸配列に対応するレニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）ＧＦ
Ｐペプチド ２８．配列番号２８プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼ＼挿入体 ８６１ｂｐ ２９．配列番号２９コード化プレウロマンマ（Pleuromamma）ルシフェラーゼ １９８ａａ ３０．配列番号３０プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰ＼挿入体Ａ＼１ １０４ｂｐ ３１．配列番号３１プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰ＼挿入体Ｂ＼１ ２７９ｂｐ ３２．配列番号３２プティロサルクス（Ptilosarcus）ＧＦＰ２３８ａａ
【０５７０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、市販のＰＥＴ−３４ベクターの成分（ＥＫはエンテロキ
ナーゼ）を示すものである。
【図２】 図２は、挿入したGaussiasをコードするルシフェラーゼを有する
ベクターの一部を示すものである。
【図３】 図３は、Renilla mulleri緑色蛍光タンパク質の推定アミノ酸配 列および精製したRenilla reniformis GFPのタンパク質分解の消化によって得ら
れ、単離されたRenilla reniformis GFPペプチドのアミノ酸配列を示すものであ
る。直系同一性のアミノ酸配列における位置は、２つのRenilla 種間の縦線（│
）により示される。
【図４】 図４は、506nmでピークの放射を持つRenilla mulleri GFPについ
て蛍光放射および励起スペクトルを示すものである。
【図５】 図５は、508nmでピークの放射を持つPtilosarcus GFPについて蛍
光放射および励起スペクトル示すものである。
【図６】 図６は、Pleuromamma luciferaseに対する塩およびpHの関数とし
ての光電子放出を示すものである。
【図７】 図７は、pET-34におけるRenilla mulleri ルシフェラーゼ-GFP融
合構築物の成分を示す；rbs：リボゾーム結合配列；CDS：コードドメイン配列；
CBD：セルロース結合ドメイン；トロンビン；トロンビン分裂部位；S Tag：RNas
e-S-ペプチドタグ；およびLIC；ライゲーションの独立クローニング部位を示す ものである。
【図８】 図８は、Gaussia lusiferaseについて塩およびｐHの関数として 光電子放出を示すものである。
【図９】 図９は、Gaussia lusiferaseについて光電子放出スペクトルを示
すものである。
【図１０】 図１０は、Pleuromammaのルシフェラーゼについて光電子放出 スペクトルを示すものである。
【図１１】 図１１は、生物発光共鳴エネルギー転移の基礎をなす原理（BR
ET）およびセンサーとしてのその使用を示すものである：A）単離すると、ルシ フェラーゼ、好ましくは花虫綱ルシフェラーゼは、コエレンテラジン誘導発色団
から青色光を放射する：B）単離すると、ルシフェラーゼに結合し、青色光で励 起されているGFP、好ましくは花虫綱GFPは、完全なペプチド基盤の蛍光体から緑
色光を放射する；C）ルシフェラーゼおよびGFPがインビボまたはインビトロで複
合体として結合すると、ルシフェラーゼは非放射的にその反応エネルギーをGFP 蛍光体に移し、これにより緑色光を放射する；D）ルシフェラーゼGFP複合体を崩
壊するいかなる分子の相関関係も、緑色から青色光にシフトするスペクトルを観
察することにより量的に追跡し得る。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年６月１９日（２０００．６．１９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０９Ｋ 11/07 Ｃ１２Ｇ 3/00 ４Ｂ０６４ Ｃ１２Ｇ 1/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｂ０６５ 3/00 1/19 ４Ｃ０８３ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｈ０４５ 1/19 9/02 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 15/02 Ａ２３Ｌ 2/00 Ｍ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ (31)優先権主張番号 ６０／１０２，９３９ (32)優先日 平成10年10月１日(1998．10．1) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 クリストファー・セント−ギオルギ アメリカ合衆国15237ペンシルベニア州ピ ッツバーグ、ダンカン・アベニュー719番 Ｆターム(参考） 4B017 LC01 LL03 LP18 4B024 AA11 AA20 BA08 BA43 BA80 CA04 CA07 CA09 CA11 DA02 DA06 EA03 EA04 GA03 GA11 HA01 HA03 HA12 HA15 4B035 LC16 LE20 LG15 LK19 LP59 4B050 CC03 CC05 DD11 LL02 LL03 4B063 QA01 QQ01 QQ22 QQ42 QR08 QR42 QR55 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA10 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA90Y AB01 AB04 BA02 BA08 BA25 CA24 CA25 CA28 CA41 CA46 CA50 4C083 AC012 AD411 AD412 AD471 AD472 AD512 CC01 CC22 CC23 CC25 CC41 DD08 DD14 DD22 DD45 4H045 AA11 AA20 AA30 CA50 DA86 DA89 EA01 EA15 EA50 FA72 FA74

Claims (99)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Renilla mulleriルシフェラーゼ、Gaussiaルシフェラーゼま
    たはPleuromammaルシフェラーゼをコードするヌクレオチドの配列を含む、単離 核酸フラグメント。
  2. 【請求項２】 Gaussiaがprinceps種のメンバーである、請求項１記載の単 離核酸フラグメント。
  3. 【請求項３】 核酸がＤＮＡである、請求項１記載の単離核酸フラグメント
    。
  4. 【請求項４】 核酸がＲＮＡである、請求項１記載の単離核酸フラグメント
    。
  5. 【請求項５】 配列番号１７、配列番号１９または配列番号２８に示すヌク
    レオチドの配列； 配列番号１８、配列番号２０または配列番号２９に示すアミノ酸配列をコードす
    るヌクレオチドの配列；および 配列番号１７、配列番号１９または配列番号２８に示すヌクレオチドの配列と高
    ストリンジェンシー下でハイブリダイズするヌクレオチドの配列 からなる群から選択されるヌクレオチドの配列を含む、請求項１記載の単離核酸
    フラグメント。
  6. 【請求項６】 配列番号１７、１９または２８のコード部分に示すヌクレオ
    チド配列から選択される少なくとも１４連続配列を含む、核酸プローブまたはプ
    ライマー。
  7. 【請求項７】 配列番号１７、１９または２８のコード部分に示すヌクレオ
    チド配列から選択される少なくとも１６連続ヌクレオチドを含む、請求項６記載
    の核酸プローブまたはプライマー。
  8. 【請求項８】 配列番号１７、１９または２８のコード部分に示すヌクレオ
    チド配列から選択される少なくとも３０連続ヌクレオチドを含む、請求項６記載
    の核酸プローブまたはプライマー。
  9. 【請求項９】 請求項１記載の核酸フラグメントを含む、プラスミド。
  10. 【請求項１０】 発現ベクターである、請求項９記載のプラスミド。
  11. 【請求項１１】 プロモーター領域； Gaussia、PleuromammaまたはRenilla mulleriルシフェラーゼ；および 選択可能マーカー： をコードするヌクレオチドの配列を含み、ルシフェラーゼをコードするヌクレオ
    チドの配列ばプロモーターと操作的にリンクし、それによりルシフェラーゼが発
    現される、請求項１０記載のプラスミド。
  12. 【請求項１２】 緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするヌクレオチドの配 列を更に含む、請求項１０記載のプラスミド。
  13. 【請求項１３】 請求項１０記載のプラスミドを含む、組換え宿主細胞。
  14. 【請求項１４】 細胞が細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細
    胞および動物細胞からなる群から選択される、請求項１３記載の細胞。
  15. 【請求項１５】 請求項１３記載の組換え宿主細胞の生育を含み、ルシフェ
    ラーゼを細胞により発現させ、発現されたルシフェラーゼタンパク質を回収する
    、Gaussia、Renilla mulleriまたはPleuromammaルシフェラーゼタンパク質の製 造法。
  16. 【請求項１６】 単離された実質的に純粋なGaussia、Renilla mulleriまた
    はPleuromammaルシフェラーゼタンパク質。
  17. 【請求項１７】 タンパク質が配列番号１８、２０または２９に示すアミノ
    酸の配列を有する、請求項１６記載の単離タンパク質。
  18. 【請求項１８】 製造品；および 組合わせを新規品目とする生物発光生成システムを含み、生物蛍光生成システム
    が請求項１記載の核酸によりコードされるルシフェラーゼを含む、組合わせ。
  19. 【請求項１９】 更にルシフェリンを含む、請求項１８記載の組合わせ。
  20. 【請求項２０】 更に緑色蛍光タンパク質(GFP)を含む、請求項１８記載の 組合わせ。
  21. 【請求項２１】 GFPがRenilla GFPまたはPtilocarpus GFPである、請求項 ２０記載の組合わせ。
  22. 【請求項２２】 製造品が玩具、化粧品、噴水、パーソナル・ケア・アイテ
    ム、フェアリー・ダスト、飲料、ソフトドリンク、食物、織物製品、泡、風船、
    パーソナル・アイテム、磨歯剤、石鹸、ボディーペイント、泡ぶろ、インクおよ
    び紙製品から選択される、請求項１８記載の組合わせ。
  23. 【請求項２３】 玩具の銃である、請求項２２記載の組合わせ。
  24. 【請求項２４】 食物である、請求項２２記載の組合わせ。
  25. 【請求項２５】 飲料である、請求項２２記載の組合わせ。
  26. 【請求項２６】 化粧品である、請求項２２記載の組合わせ。
  27. 【請求項２７】 製造品が水鉄砲、空気銃、フィンガーペイント、フット
    ・バッグ、グリーティングカード、粘液性玩具、衣類、泡形成玩具、入浴剤、化
    粧品、ボディーローション、ゲル、ボディーパウダー、ボディークリーム、練り
    歯みがき、含嗽剤、石鹸、ボディーペイント、泡ぶろ、インク、包装紙、ゼラチ
    ン、アイシング、フロスティング、グリーティングカード、ビール、ワイン、シ
    ャンペン、ソフトドリンク、角氷、氷、ドライアイスおよび噴水から選択される
    、請求項１８記載の組合わせ。
  28. 【請求項２８】 玩具の銃である、請求項２７記載の組合わせ。
  29. 【請求項２９】 食物である、請求項２７記載の組合わせ。
  30. 【請求項３０】 飲料である、請求項２７記載の組合わせ。
  31. 【請求項３１】 化粧品である、請求項２２記載の組合わせ。
  32. 【請求項３２】 Renilla緑色蛍光タンパク質(GFP)またはPtilocarpus緑色 蛍光タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む、単離核酸フラグメント
    。
  33. 【請求項３３】 Renilla種がRenilla reniformis、Renilla kollokeriおよ
    びRenilla mulleriからなる群から選択される、請求項３２記載の単離核酸フラ グメント。
  34. 【請求項３４】 核酸がＤＮＡである、請求項３２記載の単離核酸フラグメ
    ント。
  35. 【請求項３５】 核酸がＲＮＡである、請求項３２記載の単離核酸フラグメ
    ント。
  36. 【請求項３６】 配列番号１５、配列番号３０または配列番号３１に示すヌ
    クレオチドの配列； 配列番号１６または配列番号３２に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
    の配列；および 配列番号１５、配列番号３０または配列番号３１に示すヌクレオチドの配列と高
    ストリンジェンシー下でハイブリダイズするヌクレオチドの配列 からなる群から選択されるヌクレオチドの配列を含む、緑色蛍光タンパク質(GFP
    )をコードする単離核酸フラグメント。
  37. 【請求項３７】 配列番号１５、配列番号３０または配列番号３１のヌクレ
    オチド配列から選択される少なくとも１４連続配列を含む、核酸プローブまたは
    プライマー。
  38. 【請求項３８】 配列番号１５、配列番号３０または配列番号３１のヌクレ
    オチド配列から選択される少なくとも１６連続ヌクレオチドを含む、請求項３７
    記載の核酸プローブまたはプライマー。
  39. 【請求項３９】 配列番号１５、配列番号３０または配列番号３１のヌクレ
    オチド配列から選択される少なくとも３０連続ヌクレオチドを含む、請求項３７
    記載の核酸プローブまたはプライマー。
  40. 【請求項４０】 請求項３２記載のヌクレオチドの配列を含む、プラスミド
    。
  41. 【請求項４１】 請求項４０記載のプラスミド； プロモーターエレメント； 核酸挿入のための複数個のクローニング部位；および 選択可能マーカー： を含み、複数個のクローニング部位をコードする核酸はプロモーターエレメント
    と緑色蛍光タンパク質をコードする核酸の間に位置し、緑色蛍光タンパク質をコ
    ードする核酸はプロモーターエレメントに操作的に結合している、発現ベクター
    。
  42. 【請求項４２】 プロモーターエレメント； 選択可能マーカー をコードするヌクレオチドの配列を更に含み、緑色蛍光タンパク質をコードする
    ヌクレオチドの配列がプロモーターエレメントと操作的に結合し、それにより緑
    色蛍光タンパク質が発現させる、請求項４０記載のプラスミド。
  43. 【請求項４３】 更にルシフェラーゼをコードするヌクレオチドの配列を含
    む、請求項４２記載のプラスミド。
  44. 【請求項４４】 請求項４０記載のプラスミドを含む、組換え宿主細胞。
  45. 【請求項４５】 細胞が細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細
    胞および動物細胞からなる群から選択される、請求項４４記載の細胞。
  46. 【請求項４６】 単離された実質的に純粋なRenilla mulleri緑色蛍光タン パク質(GFP)またはPtolisarcus GFP。
  47. 【請求項４７】 請求項４６記載の緑色蛍光タンパク質を含む、組成物。
  48. 【請求項４８】 更に生物発光生成システムの少なくとも一つの成分を含む
    、請求項４７記載の組成物。
  49. 【請求項４９】 生物発光生成システムが：昆虫システム、腔腸動物システ
    ム、有櫛動物システム、細菌システム、軟体動物システム、甲殻綱システム、魚
    システム、環形動物システムおよびアースワームシステム単離されたものから選
    択される、請求項４８記載の組成物。
  50. 【請求項５０】 生物発光生成システムが：ホタル、Mnemiopsis、Beroe ov
    ata、Aequorea、Obelia、Vargula、Pelagia、Renilla、Pholas Aristostomias、
    Pachystomias、Porichys、Cypridina、Aristostomia、このようなPachystomias 、Malacosteus、Gonadostomias、Gaussia、Watensia、Halisturia、Vampire squ
    id、Glyphus、Mycotophids、Vinciguerria、Howella、Florenciella、Chaudiodu
    s、Melanocostus、ウミエラ、Chiroteuthis、Eucleoteuthis、Onychoteuthis、W
    atasenia、イカ、Sepiolina、Oplophorus、Acanthophyra、Sergestes、Gnathoph
    ausia、Argyropelecus、Yarella、Diaphus、GonadostomiasおよびNeoscopelusか
    ら単離されたものから選択される、請求項４８記載の組成物。
  51. 【請求項５１】 生物発光生成システムがAequorea、Obelia、Vargulaおよ びRenillaから単離されたものから選択される、請求項５０記載の組成物。
  52. 【請求項５２】 製造品；および RenillaまたはPtilosarcus緑色蛍光タンパク質(GFP)を含む、組合わせ。
  53. 【請求項５３】 更に本組合わせを新規品目とする、少なくとも一つの生物
    発光生成システムの成分を含む、請求項５２記載の組合わせ。
  54. 【請求項５４】 組合わせがルシフェラーゼを含む、請求項５３記載の組合
    わせ。
  55. 【請求項５５】 組合わせがルシフェリンを含む、請求項５３記載の組合わ
    せ。
  56. 【請求項５６】 組合わせがルシフェリンおよびルシフェラーゼを含む、請
    求項５３記載の組合わせ。
  57. 【請求項５７】 製造品が玩具、噴水、パーソナル・ケア・アイテム、化粧
    品、フェアリー・ダスト、飲料、ソフトドリンク、食物、織物製品、泡、風船、
    パーソナル・アイテム、磨歯剤、石鹸、ボディーペイント、泡ぶろ、インクおよ
    び紙製品から選択される、請求項５２記載の組合わせ。
  58. 【請求項５８】 玩具の銃である、請求項５７記載の組合わせ。
  59. 【請求項５９】 食物である、請求項５７記載の組合わせ。
  60. 【請求項６０】 化粧品である、請求項５７記載の組合わせ。
  61. 【請求項６１】 飲料である、請求項５７記載の組合わせ。
  62. 【請求項６２】 製造品が水鉄砲、空気銃、フィンガーペイント、フット・
    バッグ、粘液性玩具、衣類、泡形成玩具、入浴剤、ボディーローション、ゲル、
    ボディーパウダー、ボディークリーム、練り歯みがき、含嗽剤、石鹸、ボディー
    ペイント、泡ぶろ、インク、包装紙、ゼラチン、アイシング、フロスティング、
    ビール、ワイン、シャンペン、ソフトドリンク、角氷、氷、ドライアイスおよび
    噴水から選択される、請求項５２記載の組合わせ。
  63. 【請求項６３】 玩具の銃である、請求項６２記載の組合わせ。
  64. 【請求項６４】 食物である、請求項６２記載の組合わせ。
  65. 【請求項６５】 化粧品である、請求項６２記載の組合わせ。
  66. 【請求項６６】 飲料である、請求項６２記載の組合わせ。
  67. 【請求項６７】 Renilla mulleriルシフェラーゼ、Gaussiaルシフェラーゼ
    またはPleuromammaルシフェラーゼと免疫特異的に結合する抗体または、結合ド メインを含む該抗体のフラグメントまたは誘導体。
  68. 【請求項６８】 モノクローナル抗体である、請求項６７記載の抗体。
  69. 【請求項６９】 Renilla緑色蛍光タンパク質(GFP)またはPtilocarpus GFP と免疫特異的に結合する抗体または、結合ドメインを含む該抗体のフラグメント
    または誘導体。
  70. 【請求項７０】 Renilla GFPがRenilla reniformis、Renilla kollokeriま
    たはRenilla mulleri GFPである、請求項６９記載の抗体。
  71. 【請求項７１】 モノクローナル抗体である、請求項６９記載の抗体。
  72. 【請求項７２】 ルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列および緑色
    蛍光タンパク質(GFP)をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸構築物。
  73. 【請求項７３】 ルシフェラーゼがRenilla mulleriルシフェラーゼ、Gauss
    iaルシフェラーゼまたはPleuromammaルシフェラーゼである、請求項７２記載の 核酸構築物。
  74. 【請求項７４】 GaussiaルシフェラーゼがGaussia princepesルシフェラー
    ゼである、請求項７２記載の核酸構築物。
  75. 【請求項７５】 ルシフェラーゼが： 配列番号１７、配列番号１９または配列番号２８に示すヌクレオチドの配列； 配列番号１８、配列番号２０または配列番号２９に示すアミノ酸配列をコードす
    るヌクレオチドの配列；および 配列番号１７、配列番号１９または配列番号２８に示すヌクレオチドの配列と高
    ストリンジェンシー下でハイブリダイズするヌクレオチドの配列： によりコードされる、請求項７２記載の核酸構築物。
  76. 【請求項７６】 GFPがRenilla緑色蛍光タンパク質(GFP)またはPtilocarpus
    GFPである、請求項７６記載の核酸構築物。
  77. 【請求項７７】 Renilla GFPがRenilla reniformis、Renilla kollokeriま
    たはRenilla mulleri GFPである、請求項７６記載の核酸構築物。
  78. 【請求項７８】 GFPが： 配列番号１５、配列番号３０または配列番号３１に示すヌクレオチドの配列； 配列番号１６または配列番号３２に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
    の配列；および 配列番号１５、配列番号３０または配列番号３１に示すヌクレオチドの配列と高
    ストリンジェンシー下でハイブリダイズするヌクレオチドの配列 によりコードされる、請求項７２記載の核酸構築物。
  79. 【請求項７９】 ルシフェラーゼおよびGFPがRenilla由来のものである、請
    求項７２記載の核酸構築物。
  80. 【請求項８０】 RenillaルシフェラーゼおよびGFPがRenilla mulleri由来 のものである、請求項７９記載の核酸構築物。
  81. 【請求項８１】 ルシフェラーゼおよびGFPをコードするヌクレオチド配列 が隣接して結合している、請求項７２記載の核酸構築物。
  82. 【請求項８２】 ＤＮＡである、請求項７２記載の核酸構築物。
  83. 【請求項８３】 ＲＮＡである、請求項７２記載の核酸構築物。
  84. 【請求項８４】 請求項７２記載の核酸を含む、プラスミド。
  85. 【請求項８５】 プロモーターエレメント； 選択可能マーカー； をコードするヌクレオチドの配列を更に含み、ルシフェラーゼおよびGFPをコー ドする核酸はプロモーターエレメントに操作的に結合しており、それによりルシ
    フェラーゼおよびGFPが発現される、請求項８４記載のプラスミド。
  86. 【請求項８６】 請求項８４記載のプラスミドを含む、組換え宿主細胞。
  87. 【請求項８７】 細胞が細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細
    胞および動物細胞からなる群から選択される、請求項８６記載の細胞。
  88. 【請求項８８】 単離された実質的に純粋なルシフェラーゼおよびGFP融合 タンパク質。
  89. 【請求項８９】 ルシフェラーゼおよびGFPがRenilla由来である、請求項８
    ８記載の融合タンパク質。
  90. 【請求項９０】 RenillaルシフェラーゼおよびGFPがRenilla mulleri由来 である、請求項８９記載の融合タンパク質。
  91. 【請求項９１】 請求項８８記載の融合タンパク質を含む、組成物。
  92. 【請求項９２】 更に生物発光生成システムの少なくとも一つの成分を含む
    、請求項９１記載の組成物。
  93. 【請求項９３】 生物発光生成システムの成分がルシフェリンである、請求
    項９２記載の組成物。
  94. 【請求項９４】 ルシフェラーゼおよびGFPをコードするヌクレオチド配列 が隣接していない、請求項７２記載の核酸構築物。
  95. 【請求項９５】 標的タンパク質のリガンド結合ドメインをコードするヌク
    レオチドの配列を含む、請求項９４記載の核酸構築物。
  96. 【請求項９６】 配列番号１６に示すアミノ酸５１から６８、８２から９８
    および１９８から２０８、配列番号２４に示すアミノ酸配列、配列番号２５に示
    すアミノ酸９−２０または配列番号２７に示すアミノ酸３９−５３に基づいて、
    少なくとも１４ヌクレオチド、好ましくは１６から３０ヌクレオチドを含む、核
    酸プローブまたはプライマー。
  97. 【請求項９７】 アミノ酸の配列をコードする請求項１５記載の核酸配列を
    含む、請求項９６記載のプローブまたはプライマー。
  98. 【請求項９８】 請求項９６記載の一つのプローブまたは複数のプローブで
    のRenilla核酸ライブラリーのスクリーニング；および GFPをコードする核酸の同定および単離 を含む、Renilla緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする核酸の単離法。
  99. 【請求項９９】 請求項９６記載の一つのプローブまたは複数のプローブで
    のRenilla核酸ライブラリーの増幅；および 増幅核酸の単離し、それによりGFPをコードする核酸を同定および単離する ことを含む、Renilla緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする核酸の単離法。
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