KR20230034954A - 개에서 치료제의 반감기를 증가시키기 위한 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

개에서 치료제의 반감기를 증가시키기 위한 조성물 및 사용 방법 Download PDF

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KR20230034954A
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브레트 슈발리에
위르겐 호른
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Abstract

개에서 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들의 반감기를 증가시키기 위한 조성물 및 이의 사용 방법이 제공된다. 조성물은 변이체 개 IgG Fc 영역을 포함한다.

Description

개에서 치료제의 반감기를 증가시키기 위한 조성물 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2020년 5월 11일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/023,083호 및 2020년 12월 7일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/122,417호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참조에 의해 원용된다.
기술 분야
본 개시내용은 일반적으로 야생형 대응물(counterpart)에 비해 개에서 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드(예를 들어, 폴리펩타이드-Fc 영역 융합과 같은 융합 폴리펩타이드; 또는 수용체-Fc 융합의 항체 또는 리간드-결합 부분과 같은 결합 분자)에 관한 것이다.
EFS-WEB를 통해 제출된 서열 목록
MPEP § 1730 II.B.2(a)에 승인되고 제시된 바와 같이 USPTO EFS-WEB 서버를 통한 서열 목록의 다음 전자 제출의 전체 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 서열 목록은 다음과 같이 식별되는 전자적으로 제출된 텍스트 파일 내에 있다:
파일명: 47406-0015WO1_Sequence_Listing.txt
생성 날짜: 2021년 5월 6일
크기(바이트): 34,000바이트
항체의 Fc 영역은 라이소솜 경로를 통한 분해로부터 항체를 보호하고 항체 효과기 기능을 매개하는 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 많은 기능적 역할을 한다. 치료제로서 개 항체의 사용이 증가함에 따라, 최적의 Fab를 선택하는 것뿐만 아니라 목적하는 반감기 및 효과기 기능을 위해 적절한 Fc와 결합하는 데 중점을 두고 있다.
개에서 사용하기 위한 폴리펩타이드 치료제(예를 들어, 항체)의 반감기를 증가시키는 것과 관련된 당업계의 지침은 거의 없다. 본 개시내용은 개에서 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)의 혈청 지속성을 개선하는 Fc 영역 변이체를 제공함으로써 해당 결점을 해결한다.
치료적 폴리펩타이드에 유용한 개 Fc(예를 들어, 개 IgG Fc 영역 변이체) 또는 이의 개 FcRn 결합 단편이 본 명세서에 제공된다. 본 개시내용은 대조군 폴리펩타이드(예를 들어, 야생형 대응물 IgG 개 Fc 영역)보다 개 FcRn에 대해 증가된 결합을 갖는 폴리펩타이드를 특징으로 한다. 일부 경우에, 이러한 폴리펩타이드는 pH 5.5, pH 6.0 및/또는 pH 6.5에서 대조군 폴리펩타이드보다 증가된 결합을 갖는다. 일부 경우에, 이러한 폴리펩타이드는, 예를 들어, 중성 pH(예를 들어, pH 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 7.5)보다 산성 pH(예를 들어, pH 5.5, pH 6.0 또는 pH 6.5)에서 더 높은 수준으로 개 FcRn에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 폴리펩타이드는 pH 7.4보다 pH 5.5 및/또는 6.0에서 더 높은 수준으로 개 FcRn에 결합한다. 본 개시내용은 부분적으로 야생형 대응물보다 개에서 증가된 반감기를 갖는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 Fc 영역 또는 이의 개 FcRn 결합 영역에 부착되지 않은 이러한 결합 분자의 버전에 비해 증가된 반감기를 갖는 결합 분자(예를 들어, 수용체의 항체 또는 리간드-결합 부분)가 제공된다. 또한, 효소-Fc 영역 융합, 리간드-Fc 영역 융합, 나노바디-Fc 융합 및 펩타이드-Fc 영역 융합이 제공되되, 융합은 야생형 대응물에 비해 증가된 반감기를 갖는다. Fc 영역은 (야생형 개 Fc 영역에 비해) 반감기를 증가시키는 치환 또는 치환들을 갖는 것 외에, 예를 들어, 효과기 기능을 증가시키고, 효과기 기능을 감소시키고, 단백질 A에 대한 결합을 증가시키고/시키거나 폴리펩타이드의 이질성을 감소시키는(예를 들어, Fc 영역에서 하나 이상의 번역 후 변형을 제거함으로써) 다른 치환을 포함할 수 있다. 개 Fc 영역 서열은 임의의 개 항체로부터 유래할 수 있다. 일부 경우에, 개 Fc 영역 서열은 개 IgG(예를 들어, IgGA, IgGB, IgGC 또는 IgGD)로부터 유래할 수 있다.
본 개시내용은 (1) 단백질의 리간드 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 도메인 또는 이의 단편을 포함하되, 결합 도메인은 (2) 본 명세서에 개시된 바와 같은 Fc 영역(CH2+CH3 영역) 또는 이의 개 FcRn 결합 영역을 포함하는 도메인에 부착되는 재조합 단백질을 특징으로 한다. 일부 경우에, 결합 도메인은 (i) 개 또는 인간/인간화된 항체의 6개의 상보성 결정 영역(CDR); (ii) 나노바디; (iii) 리간드 또는 이의 리간드-결합 단편에 결합하는 가용성 수용체-결합 도메인 및 (iv) 개 수용체 단백질의 세포외 도메인을 포함한다.
본 개시내용은 또한 (1) 본 명세서에 기재된 개 IgG Fc 영역 변이체를 포함하는 제1 Fc 영역(예를 들어, CH2 영역, CH3 영역, CH2+CH3 영역)을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (2) 본 명세서에 기재된 개 IgG Fc 영역 변이체를 포함하는 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 제1 및 제2 폴리펩타이드는 제1 및 제2 Fc 영역을 통해 회합될 수 있다. 일부 경우에, 제1 및 제2 Fc 영역의 아미노산 서열은 동일하다. 다른 경우에, 제1 및 제2 Fc 영역의 아미노산 서열은 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 아미노산만큼) 상이하다. 일부 경우에, Fc 영역 변이체는 개 IgGB 항체 Fc 영역의 변이체이다. 일부 경우에, Fc 영역 변이체는 개 IgGA 항체 Fc 영역의 변이체이다. 일부 경우에, Fc 영역 변이체는 개 IgGC 항체 Fc 영역의 변이체이다. 일부 경우에, Fc 영역 변이체는 개 IgGD 항체 Fc 영역의 변이체이다.
또한, 본 명세서에 개시된 개 IgG Fc 영역 변이체 및 폴리펩타이드를 포함하는 융합 분자가 개시된다. 일부 경우에, 개 IgG Fc 영역 변이체는 폴리펩타이드(예를 들어, 힌지 영역 또는 링커를 통해)에 공유적으로 부착된다. 일부 경우에, 폴리펩타이드는 개 수용체 단백질의 리간드 결합 도메인, 개 수용체 단백질의 세포외 도메인 또는 항원-결합 도메인이다. 일부 경우에, 폴리펩타이드는 개 IL-13Rα1 또는 IL-13Rα2, 개 EPO, 개 CTLA4, 개 LFA3, 개 VEGFR1/VEGFR3, 개 IL-1R, 개 GLP-1 수용체 효능제 및 개 트롬보포이에틴 결합 펩타이드의 리간드 결합 도메인 또는 세포외 도메인으로부터 선택된다. 일부 경우에, 폴리펩타이드는 scFv, 나노바디 또는 단일 도메인 항체이다. 일부 경우에, IgG Fc 영역 변이체는 개 IgGB 항체 Fc 영역의 변이체이다. 일부 경우에, IgG Fc 영역 변이체는 개 IgGA 항체 Fc 영역의 변이체이다. 일부 경우에, IgG Fc 영역 변이체는 개 IgGC 항체 Fc 영역의 변이체이다. 일부 경우에, IgG Fc 영역 변이체는 개 IgGD 항체 Fc 영역의 변이체이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 제공하되, 폴리펩타이드는,
(i) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(ii) 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(iii) 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치; 및
(iv) 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치
로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하되, 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 아미노산 치환은 Tyr, Phe, Leu 및 Trp로 이루어진 군으로부터 선택되고, 아미노산 위치는 EU 넘버링에 기초하며, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 Fc 도메인과 비교할 때 개 FcRn에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro를 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr, His 또는 Phe를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 His를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Phe를 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 His를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 9 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(ii) 야생형 개 IgG의 251번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(iii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(iv) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(v) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(vi) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(vii) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(viii) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(ix) 야생형 개 IgG의 308번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(x) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xi) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xii) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xiii) 야생형 개 IgG의 378번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xiv) 야생형 개 IgG의 380번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xv) 야생형 개 IgG의 428번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xvi) 야생형 개 IgG의 430번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xvii) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xviii) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치 및
(xix) 야생형 개 IgG의 435번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Glu 또는 Gln,
(ii) 야생형 개 IgG의 251번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp 또는 Glu,
(iii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr 또는 Met,
(iv) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr 또는 Ser,
(v) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Glu 또는 Phe,
(vi) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asn 또는 Asp,
(vii) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Tyr, Phe, Leu 또는 Trp,
(viii) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Arg, Gln 또는 Ala,
(ix) 야생형 개 IgG의 308번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
(x) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
(xi) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
(xii) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp,
(xiii) 야생형 개 IgG의 378번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
(xiv) 야생형 개 IgG의 380번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Ala,
(xv) 야생형 개 IgG의 428번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Leu,
(xvi) 야생형 개 IgG의 430번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Ala 또는 Lys,
(xvii) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Lys,
(xviii) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg, His, Ser, Ala 또는 Phe 및/또는
(xix) 야생형 개 IgG의 435번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Phe를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Leu를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(ii) 야생형 개 IgG의 251번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(iii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(iv) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(v) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(vi) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(vii) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(viii) 야생형 개 IgG의 308번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(ix) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(x) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xi) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xii) 야생형 개 IgG의 378번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xiii) 야생형 개 IgG의 380번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xiv) 야생형 개 IgG의 428번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xv) 야생형 개 IgG의 430번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xvi) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xvii) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치 및
(xviii) 야생형 개 IgG의 435번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Glu 또는 Gln,
(ii) 야생형 개 IgG의 251번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp 또는 Glu,
(iii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr 또는 Met,
(iv) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr 또는 Ser,
(v) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Glu 또는 Phe,
(vi) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asn 또는 Asp,
(vii) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Arg, Gln 또는 Ala,
(viii) 야생형 개 IgG의 308번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
(ix) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
(x) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
(xi) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp,
(xii) 야생형 개 IgG의 378번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
(xiii) 야생형 개 IgG의 380번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Ala,
(xiv) 야생형 개 IgG의 428번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Leu,
(xv) 야생형 개 IgG의 430번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Ala 또는 Lys,
(xvi) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Lys,
(xvii) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg, His, Ser, Ala 또는 Phe 및/또는
(xviii) 야생형 개 IgG의 435번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 있다:
(i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(ii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(iii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(iv) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(v) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(vi) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(vii) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(viii) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(ix) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(x) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치 및
(xi) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Glu 또는 Gln,
(ii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr 또는 Met,
(iii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr 또는 Ser,
(iv) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Glu 또는 Phe,
(v) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asn 또는 Asp,
(vi) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Arg, Gln 또는 Ala,
(vii) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
(viii) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
(ix) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp,
(x) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Lys 및
(xi) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg, His, Ser, Ala 또는 Phe.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 있다:
(i) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(ii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(iii) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치 및
(iv) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr 또는 Met,
(ii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr 또는 Ser,
(iii) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Glu 또는 Phe 및/또는
(iv) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg, His, Ser, Ala 또는 Phe.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr,
(ii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr,
(iii) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Glu 및/또는
(iv) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg 또는 His.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음 중 적어도 하나를 추가로 포함한다:
(i) 252번 아미노산 위치에 Tyr, 254번 아미노산 위치에 Thr 및 256번 아미노산 위치에 Glu;
(ii) 428번 아미노산 위치에 Leu 및 434번 아미노산 위치에 Ser;
(iii) 256번 아미노산 위치에 Asp, 307번 아미노산 위치에 Arg 및 311번 아미노산 위치에 Val;
(iv) 256번 아미노산 위치에 Asp, 315번 아미노산 위치에 Asp 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(v) 256번 아미노산 위치에 Asp, 286번 아미노산 위치에 Asp, Tyr, Phe, Leu 또는 Trp, 307번 아미노산 위치에 Arg 및 311번 아미노산 위치에 Val;
(vi) 285번 아미노산 위치에 Asn, 307번 아미노산 위치에 Gln 및 315번 아미노산 위치에 Asp;
(vii) 256번 아미노산 위치에 Asp, 307번 아미노산 위치에 Arg, 311번 아미노산 위치에 Val 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(viii) 285번 아미노산 위치에 Asp, 311번 아미노산 위치에 Val 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(ix) 256번 아미노산 위치에 Asp, 285번 아미노산 위치에 Asp 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(x) 256번 아미노산 위치에 Asp, 311번 아미노산 위치에 Val 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(xi) 256번 아미노산 위치에 Asp, 285번 아미노산 위치에 Asp, 286번 아미노산 위치에 Asp, Tyr, Phe, Leu 또는 Trp, 307번 아미노산 위치에 Arg 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(xii) 256번 아미노산 위치에 Asp, 286번 아미노산 위치에 Asp, Tyr, Phe, Leu 또는 Trp, 307번 아미노산 위치에 Arg, 311번 아미노산 위치에 Val 및 378번 위치에 Val;
(xiii) 307번 아미노산 위치에 Gln, 311번 아미노산 위치에 Val 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(xiv) 285번 아미노산 위치에 Asp, 307번 아미노산 위치에 Gln 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(xv) 256번 아미노산 위치에 Asp, 285번 아미노산 위치에 Asp, 307번 아미노산 위치에 Arg, 311번 아미노산 위치에 Val 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(xvi) 307번 아미노산 위치에 Gln, 380번 아미노산 위치에 Ala, 434번 아미노산 위치에 Ser 또는 Ala;
(xvii) 428번 아미노산 위치에 Leu 및 434번 아미노산 위치에 Ser 또는 Ala; 또는
(xviii) 250번 아미노산 위치에 Gln 및 428번 아미노산 위치에 Leu.
일부 양태에서, 본 개시내용은 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 제공하되, 폴리펩타이드는
(i) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(ii) 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(iii) 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(iv) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 위치; 및
(v) 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치
로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 위치에 아미노산 치환을 포함하되, 아미노산 위치는 EU 넘버링에 기초하고, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 Fc 도메인과 비교할 때 개 FcRn에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 아미노산 치환은 T286L, T286Y 및 임의의 전술한 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1항에 있어서, 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 아미노산 치환이 D312P 또는 이의 보존적 아미노산 치환인, 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 아미노산 치환은 A426Y, A426H 및 임의의 전술한 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 아미노산 치환은 N434R 또는 이의 보존적 아미노산 치환이다.
일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 아미노산 치환은 Y436H 또는 이의 보존적 아미노산 치환이다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 위치에 아미노산 치환을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 426번 및 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(ii) 야생형 개 IgG의 426번 및 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(iii) 야생형 개 IgG의 426번 및 434번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(iv) 야생형 개 IgG의 426번 및 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치; 및
(v) 야생형 개 IgG의 286번, 426번 및 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함한다:
(i) A426Y 및 T286L;
(ii) A426Y 및 D312P;
(iii) A426Y 및 Y436H;
(iv) A426H 및 T286L;
(v) A426H 및 T286Y;
(vi) A426H 및 D312P; 및
(vii) T286L, A426Y 및 Y436H.
일부 실시형태에서, 2개 이상의 아미노산 치환은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) T286L, D312P, N434R 및 Y436H 중 하나 이상과 조합된 A426Y;
(ii) T286L, T286Y, D312P, N434R 및 Y436H 중 하나 이상과 조합된 A426H; 및
(iii) T286L, T286Y, D312P 및 Y436H 중 하나 이상과 조합된 N434R.
일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG는 서열번호 9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인을 포함하는 개 IgGA, 서열번호 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인을 포함하는 개 IgGB, 서열번호 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인을 포함하는 개 IgGC 또는 서열번호 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인을 포함하는 개 IgGD이다.
일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG는 개 IgGA이고, 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역은 서열번호 9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG는 개 IgGB이고, 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역은 서열번호 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG는 개 IgGC이고, 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역은 서열번호 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG는 개 IgGD이고, 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역은 서열번호 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG는 개 IgGA이고, 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역은 서열번호 9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG는 개 IgGB이고, 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역은 서열번호 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG는 개 IgGC이고, 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역은 서열번호 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG는 개 IgGD이고, 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역은 서열번호 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 결합 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 도메인은 (i) 면역글로불린 분자의 6개의 상보성 결정 영역(CDR); (ii) 개 수용체 단백질의 리간드 결합 도메인, (iii) 나노바디 또는 (iv) 개 수용체 단백질의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 도메인은 NGF, TrKA, ADAMTS, IL-1, IL-2, IL-4, IL-4R, 안지오텐신 유형 1(AT1) 수용체, 안지오텐신 유형 2(AT2) 수용체, IL-5, IL-12, IL-13, IL-31, IL-33, CD3, CD20, CD47, CD52 및 보체 시스템 복합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 EPO, CTLA4, LFA3, VEGFR1/VEGFR3, IL-1R, IL-4R, GLP-1 수용체 효능제 및 트롬보포이에틴 결합 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 결합 검정에서 중성 pH보다 산성 pH에서 더 높은 수준으로 개 FcRn에 결합한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 결합 검정에서 pH 7.4보다 pH 5.5에서 더 높은 수준으로 개 FcRn에 결합한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 결합 검정에서 pH 7.4보다 pH 6.0에서 더 높은 수준으로 개 FcRn에 결합한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 (1) 대조군 폴리펩타이드 또는 대조군 폴리펩타이드들보다 개에서 증가된 반감기를 갖되, 대조군 폴리펩타이드 또는 대조군 폴리펩타이드들은 IgG Fc 영역 변이체 대신 상응하는 야생형 개 IgG Fc 영역을 갖는 것을 제외하고는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들과 동일하고; 그리고/또는 (2) 대조군 폴리펩타이드보다 개 FcRn에 대해 증가된 결합을 가지며; 아미노산 위치는 EU 넘버링을 기반으로 한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 9와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 10과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 12와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 (i) 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 및 (ii) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 핵산들을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 핵산 또는 핵산들을 포함하는 발현 벡터 또는 발현 벡터들을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 핵산 또는 핵산들 또는 본 명세서에 기재된 발현 벡터 또는 발현 벡터들을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 제조하는 방법을 제공하며, 해당 방법은 다음을 포함한다:
(a) 본 명세서에 기재된 핵산 또는 핵산들을 제공하는 단계;
(b) 숙주 세포 배양물에서 핵산 또는 핵산들을 발현시켜 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및
(c) 숙주 세포 배양물로부터 (b)에서 생산된 폴리펩타이드를 수집하는 단계.
일부 실시형태에서, 방법은 약제학적 제형으로 폴리펩타이드를 제형화하는 단계를 더 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 유효량의 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 개에게 투여하는 단계를 포함하는, 개 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개에서 개 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 유효량의 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 개에게 투여하는 단계를 포함하는, 개 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 개에서 개 질환 또는 장애를 예방하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 개 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개에서 개 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 개 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 개에서 개 질환 또는 장애를 예방하는 방법에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 개 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개에서 개 질환 또는 장애를 치료하기 위한 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 약제의 제조에서의 용도를 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 개 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 개에서 개 질환 또는 장애를 예방하기 위한 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 약제의 제조에서의 용도를 제공한다.
일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 알레르기 질환, 만성 통증, 급성 통증, 염증성 질환, 자가면역 질환, 내분비 질환, 위장관 질환, 심혈관 질환, 신장 질환, 생식 관련 장애, 감염성 질환 또는 암이다.
일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 골관절성 통증, 관절염, 빈혈 또는 비만이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참조에 의해 원용된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하여 본 출원이 우선한다. 물질, 방법 및 예는 예시일 뿐이며, 제한하려는 의도가 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 개 IgG γ 사슬의 아미노산 서열 정렬이다. 이러한 사슬은 VH, CH1, CH2 및 CH3 도메인 및 CH1과 CH2 사이의 힌지 영역을 포함한다. N-글리코실화 부위는 굵게 표시되고, 블록으로 표시된다. 이들 서열은 각각 서열번호 13, 14, 15 및 16으로 할당된다.
도 2는 IgG γ 사슬의 CH2 영역의 아미노산 서열 정렬이다. 이들 서열은 각각 서열번호 1, 2, 3 및 4로 할당된다. 반감기를 증가시키기 위해 치환된 잔기는 밑줄로 식별된다.
도 3은 개 IgG γ 사슬의 CH3 영역의 아미노산 서열 정렬이다. 이들 서열은 각각 서열번호 5, 6, 7 및 8로 할당된다. 반감기를 증가시키기 위해 치환된 잔기는 밑줄로 식별된다.
도 4는 개 IgG γ 사슬의 Fc 영역의 아미노산 서열 정렬이다. 이들 서열은 각각 서열번호 9, 10, 11 및 12로 할당된다. 반감기를 증가시키기 위해 치환된 잔기는 밑줄로 식별된다.
도 5는 개 IgG의 CH2 영역에 대한 EU 넘버링이 제공되어 있는 표이다.
도 6은 개 IgG의 CH3 영역에 대한 EU 넘버링이 제공되어 있는 표이다.
도 7a 내지 도 7u는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 실험으로부터의 비아코어(Biacore) 센서그램을 도시한다. 각 도면의 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 8a 내지 도 8c는 250번 위치의 NNK 라이브러리로부터의 야생형 및 상이한 변이체에 대한 비아코어 센서그램을 도시한다. 각 도면의 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선이다.
도 9a 내지 도 9c는 252번 위치의 NNK 라이브러리로부터의 야생형 및 상이한 변이체에 대한 비아코어 센서그램을 도시한다. 각 도면의 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선이다.
도 10a 및 도 10b는 야생형 및 변이체 A254T에 대한 비아코어 센서그램을 도시한다. 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 야생형 및 변이체 G309P에 대한 비아코어 센서그램을 도시한다. 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 12a 및 도 12b는 야생형 및 변이체 Q311V에 대한 비아코어 센서그램을 도시한다. 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 13a 및 도 13b는 야생형 및 변이체 D378V에 대한 비아코어 센서그램을 도시한다. 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 14a 및 도 14b는 야생형 및 변이체 E380A에 대한 비아코어 센서그램을 도시한다. 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 15a 내지 도 15f는 434번 위치의 NNK 라이브러리로부터의 야생형 및 상이한 변이체에 대한 비아코어 센서그램을 도시한다. 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 16a 내지 도 16e는 농도 시리즈의 상이한 변이체에 대한 비아코어 센서그램을 도시한다. 사용된 개 FcRn의 농도는 100nM(흰색 원), 200nM(검은색 원), 400nM(검은색 삼각형) 및 800nM(흰색 삼각형)이었다. 각 도면의 밝은 선은 측정된 데이터이고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선이다.
도 17a 내지 도 17b는 상이한 변이체에 대한 비아코어 NNK 라이브러리 센서그램을 도시한다. 사용된 개 FcRn의 농도는 200nM이었다. 각 도면의 밝은 선은 측정된 데이터이고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선이다.
도 18a 내지 도 18b는 농도 시리즈의 상이한 변이체에 대한 비아코어 센서그램을 도시한다. 사용된 개 FcRn의 농도는 각각 100nM, 200nM, 400nM 및 800nM이었다(아래서 위로의 선). 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선이다.
도 19a 내지 도 19c는 pH 6.0에서 개 FcRn에 결합하는 IgGA 야생형, IgGA A426Y 변이체 및 IgGA A426H 변이체에 대한 비아코어 센서그램이다. 사용된 개 FcRn의 농도는 50nM(흰색 정사각형), 100nM(검은색 원), 200nM(흰색 원), 400nM(검은색 삼각형) 및 800nM(흰색 삼각형)이었다. 각 센서그램에서 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 20a 내지 도 20f는 pH 6.0에서 개 FcRn에 결합하는 개 IgGB Fc의 야생형 개 IgGB Fc, 단일(A426Y) 및 조합 변이체에 대한 비아코어 센서그램을 보여준다. 야생형 IgG에 대해 사용된 개 FcRn의 농도는 200nM(흰색 원), 400nM(검은색 삼각형), 800nM(흰색 삼각형), 1600nM(검은색 다이아몬드) 및 3200nM(흰색 다이아몬드)이었다. 나머지 변이체에 대한 개 FcRn의 농도는 50nM(흰색 정사각형), 100nM(검은색 원), 200nM(흰색 원), 400nM(검은색 삼각형) 및 800nM(흰색 삼각형)이었다. 각 센서그램에서 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 21a 내지 도 21f는 pH 6.0에서 개 FcRn에 결합하는 개 IgGB Fc의 단일(A426H) 및 조합 변이체에 대한 비아코어 센서그램을 보여준다. A426H-N434R IgG 변이체에 대해 사용된 개 FcRn의 농도는 200nM(흰색 원), 400nM(검은색 삼각형), 800nM(흰색 삼각형), 1600nM(검은색 다이아몬드) 및 3200nM(흰색 다이아몬드)이었다. 나머지 변이체에 대한 개 FcRn의 농도는 50nM(흰색 정사각형), 100nM(검은색 원), 200nM(흰색 원), 400nM(검은색 삼각형) 및 800nM(흰색 삼각형)이었다. 각 센서그램에서 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 22a 내지 도 22e는 6.0에서 개 FcRn에 결합하는 개 IgGB Fc의 단일(N434R) 및 조합 변이체에 대한 비아코어 센서그램을 보여준다. 변이체에 대해 사용된 개 FcRn의 농도는 50nM(흰색 정사각형), 100nM(검은색 원), 200nM(흰색 원), 400nM(검은색 삼각형) 및 800nM(흰색 삼각형)이었다. 각 센서그램에서 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 23은 pH 6.0에서 개 FcRn에 결합하는 개 IgGB Fc의 N434Y 변이체에 대한 비아코어 센서그램을 보여준다. 변이체에 대해 사용된 개 FcRn의 농도는 50nM(흰색 정사각형), 100nM(검은색 원), 200nM(흰색 원), 400nM(검은색 삼각형) 및 800nM(흰색 삼각형)이었다. 각 센서그램에서 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 24a 내지 도 24f는 pH 7.4에서 개 FcRn에 결합하는 IgGB Fc의 야생형 개 IgGB Fc, 단일(A426Y) 및 조합 변이체에 대한 비아코어 센서그램을 보여준다. 각 센서그램에서 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 25a 내지 도 25f는 pH 7.4에서 개 FcRn에 결합하는 IgGB Fc의 단일(A426H) 및 조합 변이체에 대한 비아코어 센서그램을 보여준다. 각 센서그램에서 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 26a 내지 도 26e는 pH 7.4에서 개 FcRn에 결합하는 IgGB Fc의 단일(N434R) 및 조합 변이체에 대한 비아코어 센서그램을 보여준다. 각 센서그램에서 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 27은 pH 7.4에서 개 FcRn에 결합하는 IgGB Fc의 N434Y 변이체에 대한 비아코어 센서그램을 보여준다. 밝은 선은 측정된 데이터를 나타내고, 어두운 선은 1:1 상호작용 모델을 사용한 피팅된 곡선을 나타낸다.
도 28은 개 IgGB Fc와 인간 IgG1 Fc의 아미노산 서열 정렬이다. 개 Fc 변이체를 생성하기 위해 아미노산 치환이 이루어진 위치(EU 넘버링에 따름)는 밑줄로 표시되어 있다.
도 29는 수컷(M) 및 암컷(F) 비글에게 정맥내 투여 후 단일 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 조합을 보유하는 개 항신경 성장 인자(anti-nerve growth factor: NGF) IgGB Fc 변이체의 말기 반감기(일수; Y-축)를 보여준다. 동물은 각 그룹에 수컷과 암컷이 포함된 8개의 그룹으로 무작위로 분류되었다. 각 동물에게 2 ㎎/㎏ 항체의 단일 정맥내 용량이 투여되고, 대략 1.5㎖의 전혈이 다음 시점에서 수집되었다: 주사 후 0시간(투여 전), 4시간 및 1일, 2일, 4일, 6일, 10일, 14일, 18일, 22일, 30일, 34일, 38일, 42일. 혈청이 전혈로부터 분리되고, ELISA에 의해 항-NGF 항체의 존재에 대해 검정되었다. 비-구획 PK 분석(non-compartmental PK analysis: NCA)은 PKSolver를 사용하여 각 개별 혈청 항체 측정에 대해 수행되었다(Yong Zhang et al., Comput. Methods Programs Biomed.; 2010 Sep;99(3):306-14. doi: 10.1016/j.cmpb.2010.01.007).
도 30a 내지 도 30k는 pH 5.9에서 개 FcRn에 대한 IgGB의 상이한 변이체의 결합에 대한 비아코어 센서그램을 보여준다.
도 31은 비선형 혼합 효과 모델링을 사용하여 선형 제거율(linear clearance)을 보이는 2-구획 약동학(PK) 모델의 개략도이다.
도 32a 및 도 32b는 시간 경과에 따른 IgGB의 상이한 변이체의 혈청 농도를 보여준다.
도 33은 야생형 IgGB Fc 또는 IgGB 변이체 A426Y, A426Y +Y436H, A426Y +Y436H +T286L, N434R, N434Y 및 YTE를 보유하는 항체의 예상 혈청 농도 프로파일을 보여준다.
도 34는 286번, 426번 및 436번 개 Fc 위치의 구조적 모델을 보여준다.
도 35는 A426H의 개 Fc 위치의 구조적 모델을 보여준다. 왼쪽 구조는 FcRn 대형 서브유닛 p51이며, WT 구조는 어두운 회색으로 표시되고, 돌연변이체 구조는 밝은 회색으로 표시된다. 오른쪽 구조는 IgGB Fc이며, WT 구조는 어두운 회색으로 표시되고, 돌연변이체 구조는 밝은 회색으로 표시된다.
도 36은 A426Y의 개 Fc 위치의 구조적 모델을 보여준다. 왼쪽 구조는 FcRn 대형 서브유닛 p51이며, WT 구조는 어두운 회색으로 표시되고, 돌연변이체 구조는 밝은 회색으로 표시된다. 오른쪽 구조는 IgGB Fc이며, WT 구조는 어두운 회색으로 표시되고, 돌연변이체 구조는 밝은 회색으로 표시된다.
도 37은 Y436H의 개 Fc 위치의 구조적 모델을 보여준다. 왼쪽 구조는 FcRn 대형 서브유닛 p51이며, WT 구조는 어두운 회색으로 표시되고, 돌연변이체 구조는 밝은 회색으로 표시된다. 오른쪽 구조는 IgGB Fc이며, WT 구조는 어두운 회색으로 표시되고, 돌연변이체 구조는 밝은 회색으로 표시된다.
도 38은 T286L의 개 Fc 위치의 구조적 모델을 보여준다. 왼쪽 구조(상단)는 베타-2-마이크로글로불린(여기서, WT 구조는 어두운 회색으로 표시되고, 돌연변이체 구조는 밝은 회색으로 표시됨); 그리고 FcRn 대형 서브유닛 p51(하단)(여기서, WT 구조는 어두운 회색으로 표시되고, 돌연변이체 구조는 밝은 회색으로 표시됨)이다. 오른쪽 구조는 IgGB Fc이며, WT 구조는 어두운 회색으로 표시되고, 돌연변이체 구조는 밝은 회색으로 표시된다.
도 39는 T286L, A426Y 및 Y436H의 개 Fc 위치의 구조적 모델을 보여준다. 왼쪽 구조는 베타-2-마이크로글로불린 및 FcRn 대형 서브유닛 p51이다. 오른쪽 구조는 IgGB Fc이다.
매우 다양한 개 질환의 예방 및 치료를 위한 치료제로서 폴리펩타이드(예를 들어, 항체, 수용체의 리간드-결합 도메인, 효소, 리간드, 펩타이드)의 사용이 증가함에 따라, 특히 폴리펩타이드가 반복적으로 투여되어야 하는 만성 질환의 예방 또는 치료를 위해 연장된 반감기를 갖는 폴리펩타이드를 개발하는 것이 중요하다.
따라서, 본 개시내용은 이들 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들의 반감기를 향상시키는 돌연변이를 포함하는 개 면역글로불린 Fc 영역 또는 이의 개 FcRn-결합 영역을 특징으로 한다. 또한, 이들 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법이 개시된다. 이러한 펩타이드는 다양한 치료 및 진단 목적을 위해 사용될 수 있다.
값이 범위의 측면에서 기재되는 경우, 설명은 이러한 범위 내의 가능한 모든 하위 범위뿐만 아니라 특정 수치 또는 특정 하위 범위가 명시적으로 언급되는지 여부에 관계없이 이러한 범위 내에 속하는 특정 수치의 개시를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 범위를 포함하여, 예를 들어, pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량의 모든 숫자의 표기는 적절하게는 1.0 또는 0.1의 증분으로 또는 대안적으로 +/- 15%, 또는 대안적으로 10%, 또는 대안적으로 5% 또는 대안적으로 2%의 변화로 (+) 또는 (-)로 변하는 근사치이다. 항상 명시적으로 언급되는 것은 아니지만, 모든 숫자 표기 앞에 "약"이라는 용어가 붙음을 이해하여야 한다. 또한, 항상 명시적으로 언급되는 것은 아니지만, 본 명세서에 기재된 시약은 단지 예시일 뿐이며, 이의 동등물이 당업계에 공지되어 있음을 이해하여야 한다.
양 또는 농도 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때, 본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 명시된 양의 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5% 또는 심지어 0.1%의 변화를 포함하는 것을 의미한다.
개 항체
개는 A, B, C 및 D로 지칭되는 4개의 IgG 중쇄를 갖는다. 이러한 중쇄는 IgGA, IgGB, IgGC 및 IgGD로 지칭되는 개 IgG의 4개의 상이한 서브클래스를 나타낸다. 이러한 중쇄에 대한 아미노산 및 DNA 서열은 문헌[Tang et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 80: 259-270 (2001)] 및 GENBANK 데이터베이스로부터 이용 가능하다. 예를 들어, IgGA 중쇄의 아미노산 서열은 GENBANK 등록 번호 AAL35301.1을 갖고, IgGB는 GENBANK 등록 번호 AAL35302.1을 갖고, IgGC는 GENBANK 등록 번호 AAL35303.1을 갖고, IgGD는 GENBANK 등록 번호 AAL35304.1을 갖는다. 개 항체는 또한 카파 및 람다의 두 가지 유형의 경쇄도 포함한다. 이들 경쇄의 DNA 및 아미노산 서열도 또한 GENBANK 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 개 카파 경쇄 아미노산 서열은 등록 번호 ABY57289.1을 갖고, 개 람다 경쇄는 등록 번호 ABY55569.1을 갖는다.
개 Fc 영역의 CH2 영역:
개 항체의 CH2 영역은 개 IgG 항체의 237번 내지 340번 아미노산(EU 넘버링에 따름)을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. CH2 영역은 N-말단 및/또는 C-말단에 1개 내지 6개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개)의 추가적인 아미노산 또는 결실을 포함할 수 있음을 이해하여야 한다.
개 IgGA의 CH2 영역의 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
Figure pct00001
개 IgGB의 CH2 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
Figure pct00002
개 IgGC의 CH2 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
Figure pct00003
개 IgGD의 CH2 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
Figure pct00004
개 Fc 영역의 CH3 영역
개 항체의 CH3 영역은 개 IgG 항체의 345번 내지 447번 아미노산(EU 넘버링에 따름)을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. CH3 영역은 N-말단 및/또는 C-말단에 1개 내지 6개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개) 추가적인 아미노산 또는 결실을 포함할 수 있음을 이해하여야 한다.
개 IgGA의 CH3 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
Figure pct00005
개 IgGB의 CH3 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
Figure pct00006
개 IgGC의 CH3 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
Figure pct00007
개 IgGD의 CH3 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
Figure pct00008
개 Fc 영역의 Fc 영역:
개 IgG 항체의 Fc 영역은 개 IgG 항체의 231번 내지 447번 아미노산(EU 넘버링에 따름)을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
개 IgGA의 Fc 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
Figure pct00009
개 IgGB의 Fc 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
Figure pct00010
개 IgGC의 Fc 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
Figure pct00011
개 IgGD의 Fc 도메인의 아미노산 서열이 아래에 제공된다:
Figure pct00012
반감기를 개선시키는 개 IgG Fc의 치환
증가된 혈청 지속성은 치료적 폴리펩타이드에 대한 유익한 특성이다. 본 개시내용은 대조군 폴리펩타이드 또는 대조군 폴리펩타이드들에 비해 개에서 이러한 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들의 반감기를 향상시키는 야생형 개 IgGA, IgGB, IgGC 및 IgGD Fc 영역에서의 치환을 특징으로 하되, 대조군 폴리펩타이드 또는 대조군 폴리펩타이드들은 IgG Fc 영역 변이체 대신 상응하는 야생형 개 IgG Fc 영역을 갖는 것을 제외하고는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들과 동일하다. 반감기를 증가시키기 위한 치환은 개 CH2 영역, 개 CH3 영역 중 하나 이상에서 또는 개 Fc(예를 들어, CH2+CH3) 영역과 관련하여 이루어질 수 있다.
본 개시내용은 개 IgG의 Fc 도메인 또는 이의 개 FcRn-결합 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 제공하되, 폴리펩타이드는
(i) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(ii) 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(iii) 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치; 및
(iv) 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치
로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고; 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 아미노산 치환은 Tyr, Phe, Leu 및 Trp로 이루어진 군으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 EU 넘버링에 기초하고, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 Fc 도메인과 비교할 때 개 FcRn에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 결합 검정에서 야생형 개 IgG의 Fc 도메인과 비교할 때 약 5.0 내지 약 6.5(예를 들어, 약 5.5 또는 약 6.0)의 pH에서 개 FcRn에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 결합 검정은, 예를 들어, 약 5.0 내지 약 6.5의 pH에서 개 FcRn에 대한 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 변이체의 결합 친화도를 동일한 pH(예를 들어, 약 5.0 내지 약 6.5의 pH)에서 개 FcRn에 대한 야생형 개 IgG의 결합 친화도와 비교하는 검정을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 결합 검정은 비슷한 조건을 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 결합 검정은 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance: SPR) 검정이다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro를 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr, His 또는 Phe를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 His를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Phe를 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 His를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 9 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 개 IgG CH2 영역 변이체를 제공한다. 또한, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나로부터 1개 내지 15개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개)만큼의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 개 IgG CH2 영역 변이체가 제공된다.
다른 경우에, 본 개시내용은 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 개 IgG CH3 영역 변이체를 특징으로 한다. 또한, 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나로부터 1개 내지 15개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개)만큼의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 개 IgG CH3 영역 변이체를 특징으로 한다.
소정의 경우에, 본 개시내용은 서열번호 9 내지 12 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 개 IgG Fc 영역 변이체를 특징으로 한다. 또한, 서열번호 9 내지 12 중 어느 하나로부터 1개 내지 20개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개)만큼의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 개 IgG Fc 영역 변이체가 개시된다.
일부 경우에, 개 IgG Fc CH2 영역 변이체에서 다음 영역:
250번 내지 256번 아미노산 위치;
285번 내지 288번 아미노산 위치; 및
307번 내지 315번 아미노산 위치
중 적어도 1개(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개)는 야생형 개 IgG Fc CH2 영역의 상응하는 영역과 동일하되, 아미노산 위치는 EU 넘버링을 기반으로 한다. 일부 경우에, 개 IgG Fc CH2 영역 변이체에서 위의 모든 영역은 야생형 개 IgG Fc CH2 영역의 상응하는 영역과 동일하다.
일부 경우에, 개 IgG Fc CH3 영역 변이체에서 다음 영역:
376번 내지 380번 아미노산 위치; 및
428번 내지 436번 아미노산 위치
중 적어도 1개(예를 들어, 1개 또는 2개)는 야생형 개 IgG Fc CH3 영역의 상응하는 영역과 동일하되, 아미노산 위치는 EU 넘버링을 기반으로 한다. 일부 경우에, 개 IgG Fc CH3 영역 변이체에서 위의 모든 영역은 야생형 개 IgG Fc CH3 영역의 상응하는 영역과 동일하다.
일부 경우에, 개 IgG Fc 변이체에서 다음 영역:
250번 내지 256번 아미노산 위치;
285번 내지 288번 아미노산 위치;
307번 내지 315번 아미노산 위치;
376번 내지 380번 아미노산 위치; 및
428번 내지 436번 아미노산 위치
중 적어도 1개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개)는 야생형 개 IgG Fc의 상응하는 영역과 동일하되, 아미노산 위치는 EU 넘버링을 기반으로 한다. 일부 경우에, 개 IgG Fc 변이체에서 다음 영역은 모두 야생형 개 IgG Fc의 상응하는 영역과 동일하다.
일부 경우에, 개 IgG Fc 변이체에서 다음 영역:
250번 내지 256번 아미노산 위치;
285번, 287번 및 288번 아미노산 위치;
307번 내지 315번 아미노산 위치;
376번 내지 380번 아미노산 위치; 및
428번 내지 436번 아미노산 위치
중 적어도 1개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개)는 야생형 개 IgG Fc의 상응하는 영역과 동일하되, 아미노산 위치는 EU 넘버링을 기반으로 한다. 일부 경우에, 개 IgG Fc 변이체에서 다음 영역은 모두 야생형 개 IgG Fc의 상응하는 영역과 동일하다.
일부 실시형태에서, 개 IgG Fc CH2 영역 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들이 제공되되, CH2 영역 변이체는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 개 IgG Fc CH3 영역 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 특징으로 하되, CH3 영역 변이체는 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 개 IgG Fc 영역 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 특징으로 하되, Fc 영역 변이체는 서열번호 9 내지 12 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro; 및/또는
(ii) 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr, His 또는 Phe; 및/또는
(iii) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr, Phe, Leu 및 Trp.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro; 및/또는
(ii) 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr; 및/또는
(iii) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr, Phe, Leu 및 Trp.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro; 및/또는
(ii) 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 His; 및/또는
(iii) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr, Phe, Leu 및 Trp.
다른 곳에서 언급한 바와 같이, 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 250번 내지 256번 아미노산 위치, 285번 내지 288번 아미노산 위치; 307번 내지 315번 아미노산 위치; 376번 내지 380번 아미노산 위치; 또는 428번 내지 436번 아미노산 위치에 상응하는 영역에 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환을 추가로 포함하되, 아미노산 위치는 EU 넘버링에 기초하고, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 Fc 도메인과 비교하여 개 FcRn에 대한 증가된 결합을 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 250번 내지 256번 아미노산 위치, 285번, 287번 및 288번 아미노산 위치; 307번 내지 315번 아미노산 위치; 376번 내지 380번 아미노산 위치; 또는 428번 내지 436번 아미노산 위치에 상응하는 영역에 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환을 추가로 포함하되, 아미노산 위치는 EU 넘버링에 기초하고, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 Fc 도메인과 비교하여 개 FcRn에 대한 증가된 결합을 갖는다. 본 개시내용에 포함되는 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환은 표 1에 개시된 것들 중 1개 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개)을 포함한다.
Figure pct00013
일부 경우에, 본 개시내용에 포함되는 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환은 표 2에 개시된 치환들 중 1개 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)을 포함한다.
Figure pct00014
위에 개시된 치환의 모든 가능한 조합 및 순열은 본 개시내용에 포함된다. 일부 경우에, 폴리펩타이드는
(i) 252번 아미노산 위치에 Tyr, 254번 아미노산 위치에 Thr 및 256번 아미노산 위치에 Glu;
(ii) 428번 아미노산 위치에 Leu 및 434번 아미노산 위치에 Ser;
(iii) 256번 아미노산 위치에 Asp, 307번 아미노산 위치에 Arg 및 311번 아미노산 위치에 Val;
(iv) 256번 아미노산 위치에 Asp, 315번 아미노산 위치에 Asp 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(v) 256번 아미노산 위치에 Asp, 286번 아미노산 위치에 Asp, Tyr, Phe, Leu 또는 Trp, 307번 아미노산 위치에 Arg 및 311번 아미노산 위치에 Val;
(vi) 285번 아미노산 위치에 Asn, 307번 아미노산 위치에 Gln 및 315번 아미노산 위치에 Asp;
(vii) 256번 아미노산 위치에 Asp, 307번 아미노산 위치에 Arg, 311번 아미노산 위치에 Val 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(viii) 285번 아미노산 위치에 Asp, 311번 아미노산 위치에 Val 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(ix) 256번 아미노산 위치에 Asp, 285번 아미노산 위치에 Asp 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(x) 256번 아미노산 위치에 Asp, 311번 아미노산 위치에 Val 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(xi) 256번 아미노산 위치에 Asp, 285번 아미노산 위치에 Asp, 286번 아미노산 위치에 Asp, Tyr, Phe, Leu 또는 Trp, 307번 아미노산 위치에 Arg 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(xii) 256번 아미노산 위치에 Asp, 286번 아미노산 위치에 Asp, 307번 아미노산 위치에 Arg, 311번 아미노산 위치에 Val 및 378번 위치에 Val;
(xiii) 307번 아미노산 위치에 Gln, 311번 아미노산 위치에 Val 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(xiv) 285번 아미노산 위치에 Asp, 307번 아미노산 위치에 Gln 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(xv) 256번 아미노산 위치에 Asp, 285번 아미노산 위치에 Asp, 307번 아미노산 위치에 Arg, 311번 아미노산 위치에 Val 및 378번 아미노산 위치에 Val;
(xvi) 307번 아미노산 위치에 Gln, 380번 아미노산 위치에 Ala, 434번 아미노산 위치에 Ser 또는 Ala;
(xvii) 428번 아미노산 위치에 Leu 및 434번 아미노산 위치에 Ser 또는 Ala;
(xviii) 250번 아미노산 위치에 Gln 및 428번 아미노산 위치에 Leu;
(xix) 250번 아미노산 위치에 Glu 및 251번 아미노산 위치에 Glu;
(xx) 256번 아미노산 위치에 Phe 및 309번 아미노산 위치에 Phe;
(xxi) 430번 아미노산 위치에 Ala 및 433번 아미노산 위치에 Lys;
(xxii) 434번 아미노산 위치에 Phe 및 436번 아미노산 위치에 His; 및
(xxiii) 435번 아미노산 위치에 Tyr 및 436번 아미노산 위치에 His
로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개(예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상)의 추가적인 아미노산 치환을 포함하되; 일부 경우에, 치환은 252번 아미노산 위치에 Tyr, 254번 아미노산 위치에 Thr 및 256번 아미노산 위치에 Glu의 조합을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 있다:
(i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(ii) 야생형 개 IgG의 251번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(iii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(iv) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(v) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(vi) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(vii) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(viii) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(ix) 야생형 개 IgG의 308번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(x) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xi) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xii) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xiii) 야생형 개 IgG의 378번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xiv) 야생형 개 IgG의 380번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xv) 야생형 개 IgG의 428번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xvi) 야생형 개 IgG의 430번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xvii) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xviii) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xix) 야생형 개 IgG의 435번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치 및
(xx) 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Glu 또는 Gln,
(ii) 야생형 개 IgG의 251번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp 또는 Glu,
(iii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr 또는 Met,
(iv) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr 또는 Ser,
(v) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Glu 또는 Phe,
(vi) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asn 또는 Asp,
(vii) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Tyr, Phe, Leu 또는 Trp,
(viii) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Arg, Gln 또는 Ala,
(ix) 야생형 개 IgG의 308번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
(x) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
(xi) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
(xii) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp,
(xiii) 야생형 개 IgG의 378번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
(xiv) 야생형 개 IgG의 380번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Ala,
(xv) 야생형 개 IgG의 428번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Leu,
(xvi) 야생형 개 IgG의 430번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Ala 또는 Lys,
(xvii) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Lys,
(xviii) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg, His, Ser, Ala 또는 Phe,
(xix) 야생형 개 IgG의 435번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr 및/또는
(xx) 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 His.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Phe를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Leu를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(ii) 야생형 개 IgG의 251번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(iii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(iv) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(v) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(vi) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(vii) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(viii) 야생형 개 IgG의 308번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(ix) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(x) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xi) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xii) 야생형 개 IgG의 378번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xiii) 야생형 개 IgG의 380번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xiv) 야생형 개 IgG의 428번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xv) 야생형 개 IgG의 430번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xvi) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xvii) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xviii) 야생형 개 IgG의 435번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치 및
(xix) 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Glu 또는 Gln,
(ii) 야생형 개 IgG의 251번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp 또는 Glu,
(iii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr 또는 Met,
(iv) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr 또는 Ser,
(v) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Glu 또는 Phe,
(vi) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asn 또는 Asp,
(vii) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Arg, Gln 또는 Ala,
(viii) 야생형 개 IgG의 308번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
(ix) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
(x) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
(xi) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp,
(xii) 야생형 개 IgG의 378번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
(xiii) 야생형 개 IgG의 380번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Ala,
(xiv) 야생형 개 IgG의 428번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Leu,
(xv) 야생형 개 IgG의 430번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Ala 또는 Lys,
(xvi) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Lys,
(xvii) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg, His, Ser, Ala 또는 Phe,
(xviii) 야생형 개 IgG의 435번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr 및/또는
(xix) 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 His.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 있다:
(i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(ii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(iii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(iv) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(v) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(vi) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(vii) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(viii) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(ix) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(x) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(xi) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치 및
(xii) 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Glu 또는 Gln,
(ii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr 또는 Met,
(iii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr 또는 Ser,
(iv) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Glu 또는 Phe,
(v) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asn 또는 Asp,
(vi) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Arg, Gln 또는 Ala,
(vii) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
(viii) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
(ix) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp,
(x) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Lys,
(xi) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg, His, Ser, Ala 또는 Phe 및
(xii) 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 His.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 있다:
(i) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(ii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
(iii) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치 및
(iv) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr 또는 Met,
(ii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr 또는 Ser,
(iii) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Glu 또는 Phe 및/또는
(iv) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg, His, Ser, Ala 또는 Phe.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr,
(ii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr,
(iii) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Glu 및/또는
(iv) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg 또는 His.
치환은 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 Fc 도메인의 사슬 중 하나 또는 둘 모두에서 이루어질 수 있다. 일부 경우에, CH2 도메인, CH3 도메인 또는 Fc 도메인의 두 사슬 모두에서 치환은 동일하다. 일부 경우에, CH2 도메인, CH3 도메인 또는 Fc 도메인의 두 사슬 모두에서 치환은 동일하지 않다. 일부 경우에, Fc 영역은 효과기 기능을 증가 또는 감소시키고/시키거나 제품 이질성을 개선시키는 하나 이상의 추가적인 치환을 포함한다.
본 개시내용은 또한 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 제공하되, 폴리펩타이드는
(i) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(ii) 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(iii) 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(iv) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 위치; 및
(v) 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치
로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 위치에 아미노산 치환을 포함하되, 아미노산 위치는 EU 넘버링에 기초하고, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 Fc 도메인과 비교할 때 개 FcRn에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다.
본 명세서에 개시된 치환의 모든 가능한 조합 및 순열은 본 개시내용에 포함된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 아미노산 치환은 전술한 2개 이상의 아미노산 치환 중 하나만을 포함하는 폴리펩타이드와 비교할 때 폴리펩타이드가 개 FcRn에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는 한 상승적 효과를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 286번, 312번, 426번, 434번 및 436번 위치에 상응하는 위치 이외의 위치에 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드는 개 IgG의 약 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 내지 약 30개 이하의 추가적인 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 Fc 도메인과 비교할 때 약 5.0 내지 약 6.5(예를 들어, 약 5.5 또는 약 6.0)의 pH에서 개 FcRn에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다. FcRn 결합 친화도를 결정하는 방법은 당업자에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 본 명세서의 다른 곳에 기술되어 있다.
FcRn 결합 활성의 차이는 각각의 변수(예를 들어, pH 값, 아미노산 치환의 수, 아미노산 치환의 위치, 아미노산 치환의 유형 등)에 대해 비슷하거나 또는 유사한 검정을 사용하여 적절하게 결정될 수 있다. 이러한 맥락에서 비교 가능한 검정은 검정이 수행되는 방식 및 평가되는 변수와 독립적인 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있는 불필요한 변수를 최소화하거나 또는 그렇지 않으면 피하기 위해 실질적으로 동일하거나 또는 유사한 방식으로 작동하는 검정을 지칭한다. 그러나, 예를 들어, pH 6.0에서 FcRn 결합을 결정하기 위한 검정을 수행하는 데 필요한 조건은, 예를 들어, 검정이 수행되는 방식에 대한 pH의 영향을 고려하여 pH 7.4에서 유사한 검정을 수행하는 데 필요한 조건과 상이할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 비슷한 검정을 사용하여 야생형 개 IgG의 Fc 도메인과 비교할 때 약 5.0 내지 약 6.5(예를 들어, 약 5.5 또는 약 6.0)의 pH에서 개 FcRn에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 비슷한 검정에서 중성 pH보다 산성 pH에서 더 높은 수준으로 개 FcRn에 결합한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 비슷한 검정에서 pH 7.4보다 pH 5.5에서 더 높은 수준으로 개 FcRn에 결합한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 비슷한 검정에서 pH 7.4보다 pH 6.0에서 더 높은 수준으로 개 FcRn에 결합한다.
일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 아미노산 치환은 T286L, T286Y 및 임의의 전술한 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1항에 있어서, 상기 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환은 D312P 또는 이의 보존적 아미노산 치환인, 폴리펩타이드.
일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 아미노산 치환은 A426Y, A426H 및 임의의 전술한 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 아미노산 치환은 N434R 또는 이의 보존적 아미노산 치환이다.
일부 실시형태에서, 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 아미노산 치환은 Y436H 또는 이의 보존적 아미노산 치환이다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 전하, 소수성 및 크기와 같은 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은 또 다른 아미노산 치환과 유사한 특성 또는 기능을 초래하는 치환을 지칭한다. 예를 들어, A426Y의 보존적 아미노산 치환은 A426F 또는 A426T일 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 위치에 아미노산 치환을 포함한다:
(i) 야생형 개 IgG의 426번 및 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(ii) 야생형 개 IgG의 426번 및 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
(iii) 야생형 개 IgG의 426번 및 434번 아미노산 위치에 상응하는 위치; 및
(iv) 야생형 개 IgG의 426번 및 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치.
일부 실시형태에서, 2개 이상의 아미노산 치환은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) T286L, T286Y, D312P, N434R 및 Y436H 중 하나 이상과 조합된 A426Y;
(ii) T286L, T286Y, D312P, N434R 및 Y436H 중 하나 이상과 조합된 A426H; 및
(iii) T286L, T286Y, D312P 및 Y436H 중 하나 이상과 조합된 N434R.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함한다:
(i) A426Y 및 T286L;
(ii) A426Y 및 D312P;
(iii) A426Y 및 Y436H;
(iv) A426H 및 T286L;
(v) A426H 및 T286Y; 및
(vi) A426H 및 D312P.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 9 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 개 IgG CH2 영역 변이체를 제공한다. 또한, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나로부터 1개 내지 15개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개)만큼의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 개 IgG CH2 영역 변이체가 제공된다.
다른 경우에, 본 개시내용은 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 개 IgG CH3 영역 변이체를 특징으로 한다. 또한, 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나로부터 1개 내지 15개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개)만큼의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 개 IgG CH3 영역 변이체를 특징으로 한다.
소정의 경우에, 본 개시내용은 서열번호 9 내지 12 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 개 IgG Fc 영역 변이체를 특징으로 한다. 또한, 서열번호 9 내지 12 중 어느 하나로부터 1개 내지 20개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개)만큼 아미노산이 다른 아미노산 서열을 포함하는 개 IgG Fc 영역 변이체가 개시된다.
일부 경우에, 개 IgG Fc CH2 영역 변이체에서 다음 영역:
250번 내지 256번 아미노산 위치; 및
307번 내지 311번 아미노산 위치
중 적어도 1개(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개)는 야생형 개 IgG Fc CH2 영역의 상응하는 영역과 동일하되, 아미노산 위치는 EU 넘버링을 기반으로 한다. 일부 경우에, 개 IgG Fc CH2 영역 변이체에서 위의 모든 영역은 야생형 개 IgG Fc CH2 영역의 상응하는 영역과 동일하다.
일부 경우에, 개 IgG Fc CH3 영역 변이체에서 다음 영역:
376번 내지 380번 아미노산 위치; 및
428번 내지 433번 아미노산 위치,
중 적어도 1개(예를 들어, 1개 또는 2개)는 야생형 개 IgG Fc CH3 영역의 상응하는 영역과 동일하되, 아미노산 위치는 EU 넘버링을 기반으로 한다. 일부 경우에, 개 IgG Fc CH3 영역 변이체에서 위의 모든 영역은 야생형 개 IgG Fc CH3 영역의 상응하는 영역과 동일하다.
일부 경우에, 개 IgG Fc 변이체에서 다음 영역:
250번 내지 256번 아미노산 위치;
307번 내지 311번 아미노산 위치;
376번 내지 380번 아미노산 위치; 및
428번 내지 433번 아미노산 위치,
중 적어도 1개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개)는 야생형 개 IgG Fc의 상응하는 영역과 동일하되, 아미노산 위치는 EU 넘버링을 기반으로 한다. 일부 경우에, 개 IgG Fc 변이체에서 다음 영역은 모두 야생형 개 IgG Fc의 상응하는 영역과 동일하다.
일부 경우에, 개 IgG Fc 변이체에서 다음 영역:
250번 내지 256번 아미노산 위치;
285번, 287번 및 288번 아미노산 위치;
307번 내지 311번 아미노산 위치;
376번 내지 380번 아미노산 위치; 및
428번 내지 433번 아미노산 위치,
중 적어도 1개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개)는 야생형 개 IgG Fc의 상응하는 영역과 동일하되, 아미노산 위치는 EU 넘버링을 기반으로 한다. 일부 경우에, 개 IgG Fc 변이체에서 다음 영역은 모두 야생형 개 IgG Fc의 상응하는 영역과 동일하다.
일부 실시형태에서, 개 IgG Fc CH2 영역 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들이 제공되되, CH2 영역 변이체는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 개 IgG Fc CH3 영역 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 특징으로 하되, CH3 영역 변이체는 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 개 IgG Fc 영역 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 특징으로 하되, Fc 영역 변이체는 서열번호 9 내지 12 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
반감기를 향상시키는 치환과 조합될 수 있는 다른 치환
치료적 폴리펩타이드/단백질(예를 들어, 단일클론 항체)의 개발은 목적하는 폴리펩타이드/단백질을 생성하기 위한 복잡한 활성 환경의 조정을 수반하는 복잡한 과정이다. 이는 특이도, 친화도, 기능적 활성, 조작된 세포주에서의 발현 수준, 장기 안정성, 효과기 기능의 제거 또는 향상 및 상업적으로 실행 가능한 제조 및 정제 방법의 개발의 최적화를 포함한다. 본 개시내용은 위의 목적 중 임의의 하나 이상을 용이하게 하는 Fc 영역 변이체의 하나 이상의 추가적인 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역 변이체는 효과기 기능을 증가 또는 감소시키고/시키거나 제품 이질성을 개선하는 하나 이상의 추가적인 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 치환은 개 Fc 영역의 효과기 기능을 감소시키기 위해 도입된다. 이러한 치환은 개 IgG의 다음 위치(EU 넘버링에 따른 넘버링) 중 1개 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개)에 있을 수 있다: 238번, 265번, 297번, 298번, 299번, 327번 및 329번. 치환(들)은 다른 19개의 아미노산 중 임의의 것일 수 있다. 일부 경우에, 치환은 보존적이다. 소정의 비제한적인 경우에, 238번 위치에서 치환된 아미노산은 Ala이고; 265번 위치에서 치환된 아미노산은 Ala이고; 297번 위치에서 치환된 아미노산은 Ala 또는 Gln이고; 298번 위치에서 치환된 아미노산은 Pro이고; 299번 위치에서 치환된 아미노산은 Ala이고; 327번 위치에서 치환된 아미노산은 Gly이고; 329번 위치에서 치환된 아미노산은 Ala이다. 일부 경우에, 변이체 Fc 영역은 개 IgGB 또는 IgGC 항체로부터 유래한다.
일부 실시형태에서, 치환은 단백질 A 크로마토그래피에 의한 정제를 용이하게 하기 위해 단백질 A에 대한 결합을 향상시키기 위해 야생형 개 IgG Fc 영역에 도입된다. 이러한 치환은 개 IgG의 다음 위치(EU 넘버링에 따른 넘버링) 중 하나 또는 둘 모두(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개)에 있을 수 있다: 252 및 254. 치환(들)은 다른 19개의 아미노산 중 임의의 것일 수 있다. 일부 경우에, 치환은 보존적이다. 소정의 비제한적인 경우에, 252번 위치에서 치환된 아미노산은 Met이고; 254번 위치에서 치환된 아미노산은 Ser이다.
일부 실시형태에서, 치환은 모 폴리펩타이드 또는 야생형 폴리펩타이드와 비교하여 FcRn에 대한 결합 친화도를 변경시키기 위해(예를 들어, FcRn과의 결합 친화도를 증가 또는 감소시키기 위해) 이루어진다. 일부 변형에서, 변형은 308F, 428L, 434M 및 434S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 변형일 수 있되, 넘버링은 EU 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, Fc 변이체는 252Y/428L, 428L/434H, 428L/434F, 428L/434Y, 428L/434A, 428L/434M 및 428L/434S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함하되, 넘버링은 EU 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, Fc 변이체는 428L/434S, 308F/428L/434S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함하되, 넘버링은 EU 넘버링에 따른다. 일부 실시형태에서, Fc 변이체는 259I/434S, 308F/434S, 308F/428L/434S, 259I/308F/434S, 307Q/308F/434S, 250I/308F/434S 및 308F/319L/434S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함하되, 넘버링은 EU 넘버링에 따른다. 이러한 변형에 대한 상세한 설명은, 예를 들어, US8883973B2에 기술되어 있으며, 이는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 개 항체의 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형은 반감기를 증가시키기 위해 개 항체의 힌지 영역에 대해 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형은 EU 넘버링에 따른 228P이다.
일부 실시형태에서, FcRn과의 결합은 pH-의존적이다. H310 및 H435(EU 넘버링)는 pH-의존적 결합에 중요할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 310번 위치(EU 넘버링)에 있는 아미노산은 히스티딘이다. 일부 실시형태에서, 435번 위치(EU 넘버링)에 있는 아미노산은 히스티딘이다. 일부 실시형태에서, 두 위치 모두에 있는 아미노산은 히스티딘이다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 LALA 돌연변이(EU 넘버링에서 L234A 및 L235A 돌연변이) 또는 LALA-PG 돌연변이(EU 넘버링에서 L234A, L235A, P329G 돌연변이)를 갖는다. 일부 실시형태에서, LALA 돌연변이는 P234A, M234A 또는 S234A이다. 일부 실시형태에서, 234번 위치(EU 넘버링)에 있는 아미노산 잔기는 Ala이다. 일부 실시형태에서, 234번 위치(EU 넘버링)에 있는 아미노산 잔기는 Ala이다. 일부 실시형태에서, 234번 및 235번 위치(EU 넘버링)에 있는 아미노산 잔기는 Ala이다.
개 IgG Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드
본 개시내용은 개에서 증가된 반감기를 갖는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 반감기를 증가시키기 위해, 이러한 폴리펩타이드는 위에 개시된 Fc 영역 변이체(예를 들어, CH2 영역, CH3 영역, CH2+CH3 영역)를 포함하도록 설계된다.
예시적인 폴리펩타이드는 전체 항체, scFv, 나노바디, 수용체의 리간드-결합 부분, 사이토카인, 성장 인자, 효소 및 펩타이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 위에 개시된 CH3 도메인 변이체는 scFv 나노바디, 수용체의 리간드-결합 부분(예를 들어, 개 IL-13Rα1 또는 IL-13Rα2의 리간드-결합 부분), 사이토카인, 성장 인자, 효소 또는 펩타이드에 부착될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "나노바디", "VHH", "VHH 항체 단편" 및 "단일 도메인 항체"는 전형적으로 자연에서 발견되는 경쇄가 결여되어 있는 낙타과에서 발견되는 유형의 항체의 단일 중쇄의 가변 도메인을 나타내기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 적합한 나노바디는 당업자에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 낙타, 단봉 낙타, 라마 및 알파카의 나노바디를 포함한다. 대안적으로, 위에 개시된 Fc 영역 변이체는 이러한 폴리펩타이드에 부착될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 개 또는 개화된 항체는 본 명세서에 개시된 Fc 영역 변이체를 포함하도록 변형된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드는 항체 힌지 영역을 포함한다. 힌지 영역은 폴리펩타이드의 항원 또는 리간드-결합 도메인과 Fc 영역 변이체 사이에 위치할 수 있다. 일부 경우에, 힌지 영역은 사이토카인, 성장 인자, 효소 또는 펩타이드의 C-말단에 부착되고, 힌지 영역은 Fc 영역 변이체의 N-말단에 부착된다. 예시적인 힌지 영역 서열은 아래에 제공된다.
IgGA: FNECRCTDTPPCPVPEP(서열번호 17);
IgGB: PKRENGRVPRPPDCPKCPAPEM(서열번호 18);
IgGC: AKECECKCNCNNCPCPGCGL(서열번호 19);
IgGD: PKESTCKCISPCPVPES(서열번호 20); 및
IgGDmut: PKESTCKCIPPCPVPES(서열번호 21).
사용되는 경우, 본 개시내용의 재조합 단백질에서 힌지 영역은 서열번호 17 내지 21 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 0개 내지 6개(즉, 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 재조합 단백질에 사용되는 힌지 영역은 서열번호 17 내지 21 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다.
일부 실시형태에서, 링커 서열은 폴리펩타이드(예를 들어, 항체, 수용체, 효소, 리간드, 펩타이드의 리간드-결합 도메인)를 본 명세서에 개시된 개 Fc 영역 변이체에 연결시키기 위해 항체 힌지 서열 대신에 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 링커는 펩타이드 결합에 의해 연결된 1개 내지 20개의 아미노산으로 구성되되, 아미노산은 20개의 자연 발생적 아미노산으로부터 선택된다. 이러한 아미노산 중 일부는 당업계에 의해 잘 이해되는 바와 같이 글리코실화될 수 있다. 다른 실시형태에서, 1개 내지 20개의 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민 및 라이신으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 링커는 글리신 및 알라닌과 같이 입체적으로 방해받지 않는 대부분의 아미노산으로 구성된다. 펩타이드 링커의 예는 Gly, Ser; Gly Ser; Gly Gly Ser; Ser Gly Gly; Gly Gly Gly Ser(서열번호 22); Ser Gly Gly Gly(서열번호 23); Gly Gly Gly Gly Ser(서열번호 24); Ser Gly Gly Gly Gly(서열번호 25); Gly Gly Gly Gly Gly Ser(서열번호 26); Ser Gly Gly Gly Gly Gly(서열번호 27); Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(서열번호 28); Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(서열번호 29); (Gly Gly Gly Gly Ser)n(서열번호 24)n(여기서, n은 1 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5)의 정수임); 및 (Ser Gly Gly Gly Gly)n(서열번호 25)n(여기서, n은 1 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5)의 정수임)을 포함한다.
비-펩타이드 링커는 또한 관심 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 본 명세서에 개시된 Fc 영역 변이체에 연결하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, -NH(CH2)nC(O)-(여기서, n = 2 내지 20)와 같은 알킬 링커가 사용될 수 있다. 이러한 알킬 링커는 저급 알킬(예를 들어, C1-C6), 저급 아실, 할로겐(예를 들어, Cl, Br), CN, NH2, 페닐 등과 같은 임의의 비입체 장애기에 의해 추가로 치환될 수 있다.
본 개시내용의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 결합 도메인을 포함할 수 있다. 결합 도메인은 본 명세서에 기재된 선택된 표적의 단백질, 서브유닛, 도메인, 모티프 및/또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들(예를 들어, 융합 폴리펩타이드)은 단백질을 포함할 수 있되, 단백질은 본 명세서에 기재된 치료적 단백질이다. 일부 실시형태에서, 표적(예를 들어, 결합 도메인의 표적에 대한) 또는 치료적 단백질(예를 들어, 융합 폴리펩타이드에 대한)은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-케토-PGF1a, 8-아이소-PGF2a, 8-옥소-dG, A1 아데노신 수용체, A33, ACE, ACE-2, 액티빈, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAMS, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, 어드레신, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, 알파-1-항트립신처리, 알파-V/베타-1 길항제, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, IgE, 안지오텐신 유형 1(AT1) 수용체, 안지오텐신 유형 2(AT2) 수용체, ARC, ART, 아르테민, 항-Id, ASPARTIC, 심방 나트륨이뇨인자, av/b3 인테그린, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-림프구 자극제(BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 오스테오게닌, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7(OP-1), BMP-8(BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA(ALK-3), BMPR-IB(ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II(BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, 봄베신, 뼈 유래 신경영양 인자, BPDE, BPDE-DNA, BTC, 보체 인자 3(C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, 칼시토닌, cAMP, 암배아 항원(CEA), 암종-관련 항원, 카텝신 A, 카텝신 B, 카텝신 C/DPPI, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 H, 카텝신 L, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 V, 카텝신 X/Z/P, CBL, CC1, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33(p67 단백질), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD47, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80(B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, 클로스트리디움 보툴리눔 독소, 클로스트리디움 퍼프린겐스 독소, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 사이토케라틴 종양-관련 항원, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, 붕괴 촉진 인자, des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-1), Dhh, 디곡신, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR(ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, 엔도텔린 수용체, 엔케팔리네이스, eNOS, Eot, 에오탁신1, EpCAM, 에프린 B2/EphB4, EPO, ERCC, E-셀렉틴, ET-1, 인자 IIa, 인자 VII, 인자 VIIIc, 인자 IX, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), Fas, FcR1, FEN-1, 페리틴, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, 피브린, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, 여포 자극 호르몬, 프랙탈카인, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3(Vgr-2), GDF-5(BMP-14, CDMP-1), GDF-6(BMP-13, CDMP-2), GDF-7(BMP-12, CDMP-3), GDF-8(미오스타틴), GDF-9, GDF-15(MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-알파1, GFR-알파2, GFR-알파3, GITR, GLP1, GLP2, 글루카곤, Glut 4, 당단백질 IIb/IIIa(GP IIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, GnRH, 성장 호르몬 방출 인자, 합텐(NP-캡 또는 NIP-캡), HB-EGF, HCC, HCMV gB 외피 당단백질, HCMV) gH 외피 당단백질, HCMV UL, 조혈 성장 인자(HGF), Hep B gp120, 헤파라네이스, Her2, Her2/neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4(ErbB-4), 단순 헤르페스 바이러스(HSV) gB 당단백질, HSV gD 당단백질, HGFA, 고분자량 흑색종-관련 항원(HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp120 V3 루프, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, 심장의 마이오신, 사이토메갈로바이러스(CMV), 성장 호르몬(GH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA 수용체, IgE, IGF, IGF 결합 단백질, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, 인터류킨 수용체(예를 들어, IL-1R, IL-2R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-8R, IL-9R, IL-10R, IL-12R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-21R, IL-22R, IL-23R, IL-25R, IL-31R, IL-33R), 인터페론(INF)-알파, INF-베타, INF-감마, 인히빈, iNOS, 인슐린 A-사슬, 인슐린 B-사슬, 인슐린-유사 성장 인자 1, 인테그린 알파2, 인테그린 알파3, 인테그린 알파4, 인테그린 알파4/베타1, 인테그린 알파4/베타7, 인테그린 알파5(알파V), 인테그린 알파5/베타1, 인테그린 알파5/베타3, 인테그린 알파6, 인테그린 베타1, 인테그린 베타2, 인터페론 감마, IP-10, I-TAC, JE, 칼리크레인 2, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 11, 칼리크레인 12, 칼리크레인 14, 칼리크레인 15, 칼리크레인 L1, 칼리크레인 L2, 칼리크레인 L3, 칼리크레인 L4, KC, KDR, 케라틴세포 성장 인자(KGF), 라미닌 5, LAMP, LAP, LAP(TGF-1), 잠복성 TGF-1, 잠복성 TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, 좌선성 루이스-Y 항원, 루이스-Y 관련 항원, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, 지방단백질, LIX, LKN, Lptn, L-셀렉틴, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, 폐 계면활성제, 황체형성 호르몬, 림프독소 베타 수용체, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, 금속LOPROTEASES, MGDF 수용체, MGMT, MHC(HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-알파, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, 뮤신(Muc1), MUC18, 뮐러관-인히비틴 물질, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NAV 1.7, NCAD, N-카드헤린, NCA 90, NCAM, NCAM, 네프릴리신, 뉴로트로핀-3, -4 또는 -6, 뉴투린, 신경 성장 인자(NGF), NGFR, NGF-베타, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, 부갑상선 호르몬, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-카드헤린, PCNA, PD1, PDL1,PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, 태반 알칼리 포스파테이스(PLAP), P1GF, PLP, PP14, 프로인슐린, 프로렐락신, 단백질 C, PS, PSA, PSCA, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, 렐락신 A-사슬, 렐락신 B-사슬, 레닌, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) F, RSV Fgp, Ret, 류마티스성 인자, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, 세린, 혈청 알부민, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72(종양-관련 당단백질-72), TARC, TCA-3, T-세포 수용체(예를 들어, T-세포 수용체 알파/베타), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, 고환 PLAP-유사 알칼리 포스파테이스, TfR, TGF, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 범 특이적, TGF-베타 R1(ALK-5), TGF-베타 R11, TGF-베타 RIIb, TGF-베타 RIII, TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타4, TGF-베타5, 트롬빈, 흉선 Ck-1, 갑상선 자극 호르몬, Tie, TIMP, TIQ, 조직 인자, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-알파, TNF-알파 베타, TNF-베타2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A(TRAIL R1Apo-2, DR4), TNFRSF10B(TRAIL R2DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C(TRAIL R3DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A(RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B(OPG OCIF, TR1), TNFRSF12(TWEAK R FN14), TNFRSF13B(TACI), TNFRSF13C(BAFF R), TNFRSF14(HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF17(BCMA), TNFRSF18(GITR AITR), TNFRSF19(TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L(RELT), TNFRSF1A(TNF R1CD120a, p55-60), TNFRSF1B(TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26(TNFRH3), TNFRSF3(LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4(OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5(CD40 p50), TNFRSF6(Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B(DcR3M68, TR6), TNFRSF7(CD27), TNFRSF8(CD30), TNFRSF9(4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21(DR6), TNFRSF22(DCTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23(DCTRAIL R1TNFRH1), TNFRSF25(DR3Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10(TRAIL Apo-2 리간드, TL2), TNFSF11(TRANCE/RANK 리간드 ODF, OPG 리간드), TNFSF12(TWEAK Apo-3 리간드, DR3리간드), TNFSF13(APRIL TALL2), TNFSF13B(BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14(LIGHT HVEM 리간드, LTg), TNFSF15(TL1A/VEGI), TNFSF18(GITR 리간드 AITR 리간드, TL6), TNFSF1A(TNF-a 커넥틴, DIF, TNFSF2), TNFSF1B(TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3(LTb TNFC, p33), TNFSF4(OX40 리간드 gp34, TXGP1), TNFSF5(CD40 리간드 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6(Fas 리간드 Apo-1 리간드, APT1 리간드), TNFSF7(CD27 리간드 CD70), TNFSF8(CD30 리간드 CD153), TNFSF9(4-1BB 리간드 CD137 리간드), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, 트렌스페린 수용체, TRF, Trk(예를 들어, TrkA), TROP-2, TSG, TSLP, 종양-관련 항원 CA 125, 종양-관련 항원 발현 루이스 Y 관련 탄수화물, TWEAK, TXB2, Ung, UPAR, uPAR-1, 유로카이네이스, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-카드헤린, VE-카드헤린-2, VEFGR-1(fit-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3(flt-4), VEGI, VIM, 바이러스 항원, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR 인테그린, 폰 빌레브란트 인자, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD 및 호르몬과 성장 인자에 대한 수용체.
일부 실시형태에서, 결합 도메인은 개에서 ACE, ACE-2, 액티빈, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAMS, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, ANG, Ang, 안지오텐신 유형 1(AT1) 수용체, 안지오텐신 유형 2(AT2) 수용체, 심방 나트륨이뇨 인자, av/b3 인테그린, b-ECGF, CD19, CD20, CD30, CD34, CD40, CD40L, CD47, COX, CTLA-4, EGFR(ErbB-1), EPO, 여포 자극 호르몬, GDF-8(미오스타틴), GLP1, GLP2, GnRH, 성장 호르몬 방출 인자, IgE, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, 인터류킨 수용체(예를 들어, IL-1R, IL-2R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-8R, IL-9R, IL-10R, IL-12R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-21R, IL-22R, IL-23R, IL-25R, IL-31R, IL-33R), LAP(TGF-1), 잠복성 TGF-1, 잠복성 TGF-1 bp1, LFA-1, 신경 성장 인자(NGF), NGFR, NGF-베타, OX40L, OX40R, PD1, PDL1, TGF, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 범 특이적, TGF-베타 R1(ALK-5), TGF-베타 R11, TGF-베타 RIIb, TGF-베타 RIII, TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타4, TGF-베타5, TNF, TNF-알파, TNF-알파 베타, TNF-베타2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF9(4-1BB CD137, ILA), VEFGR-1(fit-1), VEGF, VEGFR 및 VEGFR-3(flt-4)와 같지만 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 치료적 표적 또는 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 단백질을 포함할 수 있되, 단백질은 치료적 단백질, 예를 들어, EPO, CTLA4, LFA3, VEGFR1/VEGFR3, IL-1R, IL-4R, GLP-1 수용체 효능제 또는 트롬보포이에틴 결합 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 치료적 단백질은 ACE, ACE-2, 액티빈, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAMS, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, ANG, Ang, 안지오텐신 유형 1(AT1) 수용체, 안지오텐신 유형 2(AT2) 수용체, 심방 나트륨이뇨 인자, av/b3 인테그린, b-ECGF, CD19, CD20, CD30, CD34, CD40, CD40L, CD47, COX, CTLA-4, EGFR(ErbB-1), EPO, 여포 자극 호르몬, GDF-8(미오스타틴), GLP1, GLP2, GnRH, 성장 호르몬 방출 인자, IgE, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, 인터류킨 수용체(예를 들어, IL-1R, IL-2R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-8R, IL-9R, IL-10R, IL-12R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-21R, IL-22R, IL-23R, IL-25R, IL-31R, IL-33R), LAP(TGF-1), 잠복성 TGF-1, 잠복성 TGF-1 bp1, LFA-1, 신경 성장 인자(NGF), NGFR, NGF-베타, OX40L, OX40R, PD1, PDL1, TGF, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 범 특이적, TGF-베타 R1(ALK-5), TGF-베타 R11, TGF-베타 RIIb, TGF-베타 RIII, TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타4, TGF-베타5, TNF, TNF-알파, TNF-알파 베타, TNF-베타2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF9(4-1BB CD137, ILA), VEFGR-1(fit-1), VEGF, VEGFR 또는 VEGFR-3(flt-4)이다.
일부 실시형태에서, 치료적 단백질은 본 명세서에 기재된 임의의 단백질이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 본 명세서에 기재된 바와 같은 개 IgG CH2 도메인, IgG CH3 도메인 또는 IgG Fc 영역을 추가로 포함한다. 변형된 개 IgG CH2 도메인, IgG CH3 도메인 또는 IgG Fc 영역은 생체내에서 치료적 단백질의 반감기를 향상시킬 수 있다.
약제학적 조성물
본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들의 약제학적 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 혼합될 수 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984)] 참조).
치료제 및 진단제의 제형은, 예를 들어, 동결건조된 분말, 슬러리, 수용액 또는 현탁액의 형태로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.] 참조). 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 소듐 아세테이트 용액(pH 5 내지 6)에 적절한 농도로 희석되고, NaCl 또는 수크로스가 등장성을 위해 첨가된다. 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80과 같은 추가적인 작용제가 안정성을 향상시키기 위해 첨가될 수 있다.
단독으로 또는 또 다른 작용제와 조합하여 투여되는 폴리펩타이드 조성물의 독성 및 치료적 효능은, 예를 들어, 결정 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료적 효과 사이의 용량 비는 치료 지수(LD50/ED50)이다. 특정 양상에서, 높은 치료 지수를 나타내는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들이 바람직하다. 이러한 세포 배양물 검정 및 동물 연구에서 얻어진 데이터는 개에서 사용하기 위한 투여량의 범위를 제형화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 다양한 순환 농도 내에 있다. 투여량은 사용되는 투약 형태 및 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다.
투여 방식은 다를 수 있다. 적합한 투여 경로는 경구, 직장, 경점막, 장, 비경구; 근육내, 피하, 피내, 골수내, 척추강내, 직접 심실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 안구내, 흡입, 취입, 국소, 피부, 경피 또는 동맥내를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 주사와 같은 침습적 경로에 의해 투여될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 정맥내로, 피하로, 근육내로, 동맥내로, 종양내로 또는 흡입, 에어로졸 전달에 의해 투여된다.
본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 또한 주입에 의해 투여될 수 있다. 약제학적 조성물을 투여하는 잘 알려진 이식물 및 모듈 형태의 예는 제어된 속도로 약물을 분배하기 위한 이식형 미세 주입 펌프를 개시하고 있는 미국 특허 제4,487,603호; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 개시하고 있는 미국 특허 제4,447,233호; 연속 약물 전달을 위한 가변 흐름 이식형 주입 기구를 개시하고 있는 미국 특허 제4,447,224호; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하고 있는 미국 특허 제4,439,196호를 포함한다. 이러한 많은 이식물, 전달 시스템 및 모듈은 당업자에게 잘 알려져 있다.
대안적으로, 예를 들어, 종종 데포 또는 서방성 제형으로 면역병리를 특징으로 하는 관절염성 관절 또는 병원체-유도성 병변 내로의 항체의 직접 주사를 통해 전신 방식보다는 국부적으로 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 투여할 수 있다. 또한, 표적화된 약물 전달 시스템, 예를 들어, 면역병리를 특징으로 하는 관절염성 관절 또는 병원체-유도성 병변을 표적화하는, 예를 들어, 조직-특이적 항체로 코팅된 리포솜으로 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 투여할 수 있다. 리포솜은 병든 조직에 대해 표적화되고, 이에 의해 선택적으로 흡수될 것이다.
투여 양생법은 제한 없이 치료되는 개의 연령, 체중 및 신체적 병태, 치료 항체의 혈청 또는 조직 전환율, 증상의 수준, 치료적 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들의 면역원성 및 생물학적 매트릭스에서 표적 세포의 접근성을 포함하는 여러 인자에 의존한다. 바람직하게는, 투여 양생법은 표적 질환 상태의 개선을 달성하는 동시에 바람직하지 않은 부작용을 최소화하기에 충분한 치료적 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 전달한다. 따라서, 전달되는 생물학적 제제의 양은 특정 치료적 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들 및 치료되는 병태의 중증도에 부분적으로 의존한다. 치료 항체의 적절한 용량을 선택하기 위한 지침이 이용 가능하다(예를 들어, 문헌[Wawrzynczak Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK (1996); Milgrom et al. New Engl. J. Med. 341:1966-1973 (1999); Slamon et al. New Engl. J. Med. 344:783-792 (2001); Beniaminovitz et al. New Engl. J. Med. 342:613-619 (2000); Ghosh et al. New Engl. J. Med. 348:24-32 (2003); Lipsky et al. New Engl. J. Med. 343:1594-1602 (2000)] 참조).
폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들의 적절한 용량의 결정은, 예를 들어, 치료에 영향을 미치는 것으로 당업계에 알려져 있거나 또는 의심되는 매개변수 또는 인자를 사용하여 당업자에 의해 이루어진다. 일반적으로, 용량은 최적의 용량보다 다소 적은 양으로 시작하고, 이후에 임의의 부정적인 부작용에 대해 목적하는 또는 최적의 효과가 달성될 때까지 적은 증분으로 증가된다. 중요한 진단적 측정은, 예를 들어, 염증의 증상 또는 생성된 염증성 사이토카인의 수준의 측정을 포함한다.
핵산, 벡터, 숙주 세포 및 제조 방법
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 암호화하는 핵산 또는 핵산들, 핵산 또는 핵산들을 포함하는 벡터 또는 벡터들 및 핵산 또는 핵산들 또는 벡터 또는 벡터들을 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 세균 또는 진핵생물 세포에서 생산될 수 있다. 예를 들어, Fab의 일부 폴리펩타이드는 세균 세포, 예를 들어, 대장균 세포에서 생산될 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 진핵생물 세포, 예컨대, 형질전환된 세포주(예를 들어, CHO, 293E, COS, 293T, Hela)에서 생산될 수 있다. 또한, 폴리펩타이드(예를 들어, scFv의)는 피키아(Pichia)(예를 들어, 문헌[Powers et al., J Immunol Methods. 251:123-35 (2001)] 참조), 한세눌라(Hanseula) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces)와 같은 효모 세포에서 발현될 수 있다. 관심 항체를 생산하기 위해, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들이 작제되고, 발현 벡터 또는 발현 벡터들에 도입된 다음, 적합한 숙주 세포에서 발현된다. 발현을 개선시키기 위해, 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 아미노산 서열을 변경하지 않고(또는 최소한으로 변경 - 예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 C-말단 잔기의 제거) 재코딩될 수 있다. 잠재적인 재코딩을 위한 영역은 번역 개시, 코돈 사용 및 의도하지 않은 mRNA 스플라이싱 가능성과 관련된 영역을 포함한다. 본 명세서에 기재된 Fc 영역 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드들은 당업자에 의해 쉽게 구상될 것이다.
표준 분자 생물학 기법을 사용하여 재조합 발현 벡터(들)를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질감염체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 및 recover 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)를 회수할 수 있다.
폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들이 세균 세포(예를 들어, 대장균)에서 발현되는 경우, 발현 벡터는 세균 세포에서 벡터의 증폭을 가능하게 하는 특성을 가져야 한다. 추가적으로, JM109, DH5α, HB101 또는 XL1-Blue와 같은 대장균이 숙주로서 사용되는 경우, 벡터는 대장균에서 효율적인 발현을 허용할 수 있는 프로모터, 예를 들어, lacZ 프로모터(Ward et al., 341:544-546 (1989)), araB 프로모터(Better et al., Science, 240:1041-1043(1988)) 또는 T7 프로모터를 가져야 한다. 이러한 벡터의 예는, 예를 들어, M13-시리즈 벡터, pUC-시리즈 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script, pGEX-5X-1(파마시아(Pharmacia)), "QIAexpress 시스템"(퀴아젠(QIAGEN)), pEGFP 및 pET(이 발현 벡터가 사용되는 경우, 숙주는 바람직하게는 T7 RNA 폴리머레이스를 발현하는 BL21임)를 포함한다. 발현 벡터는 항체 분비를 위한 신호 서열을 포함할 수 있다. 대장균의 주변질 세포로의 생산을 위해, pelB 신호 서열(Lei et al., J. Bacteriol., 169:4379 (1987))이 항체 분비를 위한 신호 서열로 사용될 수 있다. 세균 발현을 위해, 염화칼슘 방법 또는 전기천공 방법을 사용하여 발현 벡터를 세균 세포에 도입할 수 있다.
폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들이 CHO, COS 및 NIH3T3 세포와 같은 동물 세포에서 발현되는 경우, 발현 벡터는 이러한 세포에서의 발현에 필요한 프로모터, 예를 들어, SV40 프로모터(Mulligan et al., Nature, 277:108 (1979))(예를 들어, 초기 유인원 바이러스 40 프로모터), MMLV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(Mizushima et al., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)) 또는 CMV 프로모터(예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스 급초기 프로모터)를 포함한다. Fc 영역 변이체를 암호화하는 핵산 서열 이외에, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기점) 및 선별 마커 유전자와 같은 추가적인 서열을 보유할 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 전형적으로 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여한다. 선별 마커가 있는 벡터의 예는 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 포유동물 세포에서 생산된다. 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 발현하기 위한 예시적인 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들어, 문헌[Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601 621]에 기술되어 있는 바와 같은 DHFR 선별 마커와 함께 사용되는 문헌[Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기술되어 있는 dhfr- CHO 세포를 포함), 인간 배아 신장 293 세포(예를 들어, 293, 293E, 293T), COS 세포, NIH3T3 세포, 림프구성 세포주, 예를 들어, NS0 골수종 세포 및 SP2 세포 및 형질전환 동물, 예를 들어, 형질전환 포유동물로부터의 세포를 포함한다. 예를 들어, 세포는 포유동물 상피 세포이다.
항체 발현을 위한 예시적인 시스템에서, 항체의 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 다를 모두 암호화하는 재조합 발현 벡터는 칼슘 포스페이트-매개성 형질감염에 의해 dhfr- CHO 세포에 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 높은 수준의 유전자 전사를 유도하기 위해 인핸서/프로모터 조절 요소(예를 들어, CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소 또는 SV40 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소와 같은 SV40, CMV, 아데노바이러스 등으로부터 유래된 것)에 작동 가능하게 연결된다. 재조합 발현 벡터는 또한 DHFR 유전자를 운반할 수 있으며, 이는 메토트렉세이트 선택/증폭을 사용하여 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 가능하게 한다. 선택된 형질감염체 숙주 세포는 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 가능하게 하기 위해 배양되고, 항체는 배양 배지로부터 회수된다.
치료 방법
본 명세서에 개시된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 임의의 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개에서 임의의 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 반복된 투여가 필요한 만성 병태의 치료에 특히 유용하다. 단백질 치료제의 증가된 반감기 때문에, 투여의 빈도가 낮고/낮거나 감소된 용량 수준이 가능할 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료 또는 예방되는 질환, 장애, 병태 또는 증상은 알레르기 질환, 만성 통증, 급성 통증, 염증성 질환, 자가면역 질환, 내분비 질환, 위장관 질환, 골격/근골격 질환, 심혈관 질환, 신경 질환, 신장 질환, 대사 질환, 면역학적 질환, 유전(genetic/inherited) 질환, 생식 관련 장애, 감염성 질환 또는 암이다. 소정의 실시형태에서, 치료 또는 예방될 질환 또는 장애는 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 음식 알레르기, 골관절성 통증, 수술 전후 통증, 치통, 암 통증, 관절염, 빈혈, 비만 또는 당뇨병이다.
항체는 질환을 치료 또는 예방할 뿐만 아니라 정상적인 생물학적 기능을 조절, 예를 들어, 생식력 또는 행동을 관리하는 데 사용될 수 있다.
진단
본 명세서에 개시된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 또한 다양한 진단적 목적, 예를 들어, 개가 임의의 특정 질환 또는 장애를 갖는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 결합 도메인을 포함할 수 있다. 결합 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질, 서브유닛, 도메인, 모티프 및/또는 에피토프(예를 들어, 암 세포에 대한 마커)에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 표지 그룹을 추가로 포함한다. 일반적으로, 표지 그룹은 이들이 검출되는 검정에 따라서 다양한 클래스에 속한다: a) 방사성 또는 무거운 동위원소일 수 있는 동위원소 표지; b) 자성 표지(예를 들어, 자성 입자); c) 산화환원 활성 모이어티; d) 광학 염료; 효소 그룹(예를 들어, 고추냉이 과산화효소, β-갈락토시데이스, 루시퍼레이스, 알칼리 포스파테이스); e) 바이오티닐화된 그룹; 및 f) 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩타이드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등). 일부 실시형태에서, 표지 그룹은 잠재적인 입체 장애를 줄이기 위해 다양한 길이의 스페이서 암을 통해 항체에 커플링된다. 단백질을 표지하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표지 그룹은 프로브, 염료(예를 들어, 형광 염료) 또는 방사성 동위원소(예를 들어, 3H, 14C, 22Na, 36Cl, 35S, 33P 또는 125I)이다.
특정 표지는 또한 발색단, 인광체 및 형광단을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 광학 염료를 포함할 수 있으며, 후자는 다수의 예에서 특이적이다. 형광단은 "소분자" 형광체 또는 단백질성 형광체일 수 있다.
형광 표지는 고유의 형광 특성을 통해 검출될 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 적합한 형광 표지는 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라사이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, 캐스케이드 블루J, 텍사스 레드, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC 레드 640, Cy 5, Cy 5.5, LC 레드 705, 오레곤 그린, 알렉사-플루오르 염료(알렉사 플루오르 350, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680), 캐스케이드 블루, 캐스케이드 옐로우 및 R-피코에리트린 (PE)(몰리큘러 프로브스(Molecular Probes), 유진(Eugene), 오리건주 소재), FITC, 로다민 및 텍사스 레드(피어스(Pierce), 일리노이주 록퍼드 소재), Cy5, Cy5.5, Cy7(아머샴 라이프 사이언스(Amersham Life Science), 펜실베니아주 피츠버그 소재)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 형광단을 비롯한 적합한 광학 염료는 그 전문이 참조에 의해 원용되어 있는 문헌[Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland]에 기술되어 있다.
적합한 단백질성 형광 표지는 또한 GFP의 레닐라(Renilla), 프틸로사르쿠스(Ptilosarcus) 또는 에쿼리아(Aequorea) 종을 포함하는 녹색 형광 단백질(Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP(클론테크 래보래토리즈, 인크.(Clontech Laboratories, Inc.), Genbank 등록 번호 U55762), 청색 형광 단백질(BFP, 퀀텀 바이오테크놀로지스, 인크.(Quantum Biotechnologies, Inc.), 캐나다 퀘벡주 몬트리올, 메종뉴브 대로 서부 1801번지, 8층 H3H1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP, 클론테크 래보래토리즈, 인크.), 루시퍼레이스(Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β-갈락토시데이스(Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) 및 레닐라(WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, 미국 특허 제5,292,658호, 제5,418,155호, 제5,683,888호, 제5,741,668호, 제5,777,079호, 제5,804,387호, 제5,874,304호, 제5,876,995호, 제5,925,558호)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이 단락에서 위에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 명시적으로 원용된다.
검정
FcγRI 및 FcγRIII 결합:
FcγRI 및 FcγRIII에 대한 결합은 항체가 ADCC를 매개하는 능력의 척도이다. 항체에 대한 이러한 특성을 평가하기 위해, FcγRI 및 FcγRIII에 대한 항체의 결합을 측정하는 검정이 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
C1q 결합:
보체의 제1 성분인 C1q에 대한 결합은 보체-의존적 세포독성(CDC)을 매개하는 항체의 능력의 척도이다. 항체에 대한 이러한 특성을 평가하기 위해, C1q에 대한 항체의 결합을 측정하는 검정이 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
반감기:
항체의 반감기를 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Booth et al., MAbs, 10(7):1098-1110 (2018)] 참조. 예시적인 동물 모델은 비인간 영장류 모델 및 형질전환 마우스 모델을 포함한다. 형질전환 마우스 모델(예를 들어, Tg32 또는 Tg276 형질전환 마우스)은 마우스 FcRn 알파 사슬에 대해 널(null)일 수 있고, (예를 들어, 구성적 프로모터의 제어하에) 인간 FcRn 알파 이식유전자를 발현할 수 있다. 인간 FcRn 알파 사슬은 기능적 키메라 FcRn 이종이량체를 형성하는 마우스 β2-마이크로글로불린 단백질과 생체내에서 쌍을 이룰 수 있다. 예로서, 개 항체의 반감기는 항체를 개 모델에 주사하고, 일정 기간 동안 혈청 내 항체의 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다.
실시예
실시예 1: 개 IgGB의 CH2 및 CH3 도메인의 알라닌 스캐닝 돌연변이유발
알라닌 스캐닝 돌연변이유발(Morrison and Weiss, Curr. Opin. Chem. Biol. 5: 302-307 (2001))을 CH2 도메인의 250번, 251번, 252번, 254번, 256번, 285번, 286번, 307번, 309번, 311번, 315번 잔기 및 CH3 도메인의 378번, 380번, 428번, 430번, 433번, 434번, 435번 및 436번 잔기에서 완료하였다. 이 실험을 위해, 개 IgGB의 CH2 및 CH3 도메인의 야생형(wt) 서열을 합성하고, 돌연변이유발을 위한 주형으로 사용하였다. 254번 위치를 제외한 각각의 지정된 위치를 변경을 암호화하는 프라이머를 사용하여 PCR 돌연변이유발에 의해 개별적으로 알라닌으로 변경하였다. 254번 위치는 야생형 서열에서 알라닌이며, 세린으로 변형되었다. PCR 산물을 진스크립트 FASEBA 플라스미드에 서브클로닝하고, 대장균에 형질전환시키고, 변이체의 존재에 대해 서열을 확인하였다. CH2 도메인의 상류는 알부민에 대한 pM 친화성을 갖는 SASA(혈청 알부민에 대한 단일-도메인 항체) 태그(예를 들어, US 2013/0129727A1 참조)이다. PelB(펙테이트 라이에이스 B) 신호 펩타이드는 배지로의 Fc 분비를 촉진하기 위해 N-말단에 있다. CH2-CH3 단백질의 발현은 Lac 프로모터에 의해 조절된다. 조건 배지로부터의 상청액을 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 pH 5.5에서 개 FcRn(UniProtKB - E2R0L6 [FcRn] 및 UniProtKB - E2RN10 [개 베타-2-마이크로글로불린])에 대한 결합에 대해 분석하였다.
비아코어 8K를 사용한 SPR 분석을 위해, 소 혈청 알부민(BSA)을 CM5 센서 칩에 고정화하였다. 플로우 셀 1 및 2의 센서 칩 표면을 새로 혼합된 50 m㏖/ℓ N-하이드록시석신이미드 및 200 m㏖/ℓ 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드 하이드로클로라이드로 420초(10 ㎕/분) 동안 활성화하였다. 그 후, 10mM 소듐 아세테이트(pH 4.5)에 희석된 BSA를 플로우 셀 2에 주입하여 접합을 달성하고, 플로우 셀 1은 블랭크로 설정하였다. 아민 커플링 반응 후, 칩 표면의 나머지 활성 커플링 부위를 1mM 에탄올아민 하이드로클로라이드를 420초 동안 주입하여 차단시켰다. 결합 실험을 위한 전개 완충액은 HBS-EP(10mM HEPES, 500mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 5.5)였으며, 이를 25℃에서 전개하였다. 알라닌 변이체로부터의 상청액을 칩 표면에 주입하고, SASA 태그를 통해 고정화된 BSA에 60초 동안 포획하였다. 400nM의 개 FcRn을 120초 동안 주입하고, 전개 완충액으로 120초 동안 해리를 완료하였다. BSA의 고정화 단계에 대한 유속은 10 ㎕/분이었고, 결합 및 해리 단계에 대한 유속은 30 ㎕/분이었다. 모든 데이터는 비아코어 8K 평가 소프트웨어 버전 1.1을 사용하여 처리하였다. 표로 작성한 데이터는 변이체 KD로 나눈 야생형의 평균 KD를 포함하는 마지막 열이 있는 표 3에 나타나 있다. 센서그램은 도 7a 내지 도 7u에 도시되어 있다.
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Figure pct00016
실시예 2: 선택된 위치에서 NNK 포화 돌연변이유발 라이브러리의 생성 및 개별 변이체의 분석
NNK 포화 돌연변이유발 방법은 목적하는 위치에서 가능한 모든 20개의 아미노산을 생성하는 효과적인 방법이다(Hogrefe et al., Biotechniques. 33: 1158-1165 (2002)). 250번, 252번, 254번, 309번, 311번, 378번, 380번 및 434번 위치(EU 넘버링)에서 개별 NNK 라이브러리를 생성하였다. 이 방법을 위해, 지정된 위치의 NNK(N = A/C/G/T, K = G/T) 프라이머를 QuikChange 부위-지정 돌연변이유발 키트(애질런트(Agilent))와 함께 사용하였다. 각 라이브러리로부터의 90개의 개별 형질감염체로부터의 상청액을 실시예 1에 기재된 비아코어 방법을 사용하여 pH 5.5에서 개 FcRn에 대한 결합에 대해 검정하였다. 유일한 차이점은 검정에서 사용된 개 FcRn의 농도가 400nM이 아니라 200nM이라는 것이었다. 모든 NNK 라이브러리 변이체에 대한 센서그램은 도 8 내지 도 15에 도시되어 있다.
250번 위치의 NNK 라이브러리의 경우, 변이체 중 어느 것도 pH 5.5에서 개 FcRn에 대해 증가된 결합을 나타내지 않았다. 변이체 T250E 및 T250Q 및 야생형 Fc로부터의 데이터는 표 4에 나타나 있다. 경쟁적 결합 검정에서, 인간 IgG2의 변이체 T250E 및 T250Q는 야생형 인간 IgG2 Fc와 비교하여 pH 6.0에서 인간 FcRn에 더 단단하게 결합하는 것으로 입증되었다(Hinton et al., J. Biol. Chem. 279: 6213-6216 (2004)).
Figure pct00017
252번 위치의 NNK 라이브러리의 경우, 변이체 L252Y 및 L252M만이 pH 5.5에서 개 FcRn에 대해 명백히 더 높은 친화도를 가졌다(아래 표 5 참조). 90개의 형질감염체에는 L252F 변이체가 존재하지 않았으므로, 이 변이체에 대한 결합 데이터는 얻지 못하였다.
Figure pct00018
254번 위치의 NNK 라이브러리의 경우, 테스트된 변이체 중 어느 것도 pH 5.5에서 개 FcRn에 대해 명백히 더 높은 친화도를 갖지 않았다. A254T 변이체에 대한 데이터는 표 6에 나타나 있고, 인간 IgG1에 상응하는 변이체를 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대해 증가된 친화도를 갖는 YTE 변이체(M252Y/S254T/T256E)에서 사용하였으며(Dall'Acqua et al., J. Immunol. 169: 5171-5180 (2002)), 이는 전임상 모델뿐만 아니라 인간에서 인간 IgG의 반감기를 증가시키는 것으로 입증되었다(Borrok et al., J. Biol. Chem. 290: 4282-4290 (2015); Robbie et al., Antimicrob. Agents Ch. 57: 6147-6153 (2013)). 90개의 형질감염체에는 A254H 변이체가 존재하지 않았으므로, 이 변이체에 대한 데이터는 얻지 못하였다.
Figure pct00019
309번 및 311번 위치의 NNK 라이브러리의 경우, 테스트된 변이체 중 어는 것도 pH 5.5에서 개 FcRn에 대해 명백히 더 높은 친화도를 가졌다. 변이체 G309P 및 Q311V에 대한 데이터는 표 7 및 표 8에 나타나 있고, 다른 변이체와의 여러 조합에서 인간 IgG1의 상응하는 인간 변이체(L309P 및 Q311V)는 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 갖는 것으로 입증되었다(Dall'Acqua et al., J. Immunol. 169: 5171-5180 (2002); Booth et al., MAbs, 10(7):1098-1110 (2018)). 변이체 G309D, G309K 및 Q311D는 NNK 라이브러리에서 확인되지 않았으므로, FcRn 결합에 대해 테스트하지 않았다.
Figure pct00020
Figure pct00021
378번 및 380번 위치의 NNK 라이브러리의 경우, 테스트된 변이체 중 어는 것도 pH 5.5에서 개 FcRn에 대해 명백히 더 높은 친화도를 가졌다. 변이체 D378V에 대한 데이터는 표 9에 나타나 있고, 인간 IgG1의 상응하는 변이체를 다른 IgG 변이체와 조합하여 사용하여 야생형 Fc와 비교하여 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 가지며 형질전환 인간 FcRn 마우스에서 인간 IgG의 반감기가 연장되었음을 입증하였다(Monnet et al., MABS. 6: 422-436 (2014); Booth et al., 2018). 또한, 변이체 E380A에 대한 데이터는 표 10에 나타나 있고, 인간 IgG의 상응하는 변이체는 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 나타났다(Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604(2001)). 변이체 D378E, D378I, D378K 및 E380F는 NNK 라이브러리에 존재하지 않았으므로, 개 FcRn에 대한 결합에 대해 스크리닝하지 않았다.
Figure pct00022
Figure pct00023
434번 위치의 NNK 라이브러리의 경우, 변이체 N434Y, N434W 및 N434R은 표 11에 나타낸 pH 5.5에서 개 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 가졌다. 변이체 N434S 및 N434A는 상응하는 인간 IgG1 변이체와 달리 낮은 pH에서 개 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 갖지 않았다(Petkova et al., Int. Immunol. 18: 1759-1769 (2006); Yeung et al., J. Immunol. 182: 7663-7671 (2009); Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28: 157-159 (2010); Deng et al., Drug Metab. Dispos. 38: 600-605 (2010)). 434번 위치에서 스크리닝된 NNK 라이브러리는 N434F 변이체를 포함하지 않았으므로, 개 FcRn에 대한 이 변이체의 결합은 테스트하지 않았다.
Figure pct00024
실시예 3: L252Y, N434Y, N434W, N434R, N434H 및 YTE(L252Y/A254T/T256E) 변이체 및 야생형 Fc에 대한 결합 동역학.
pH 5.5에서 개 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 나타내는 여러 개 IgGB 변이체를 개 FcRn에 대한 결합 동역학에 대해 추가로 평가하였다. 이 연구에서, pH 5.5 및 pH 7.4에서 개 FcRn에 대한 변이체(L252Y, N434Y, N434W, N434R, N434H), YTE 변이체(L252Y/A254T/T256E) 및 야생형 개 Fc의 결합을 평가하였다. pH 5.5 조건에 대한 비아코어 방법은 FcRn의 4가지 농도(100nM, 200nM, 400nM, 800nM)를 테스트한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 것과 동일하였고, 이는 보다 정확한 결합 동역학을 산출하였다. pH 7.4의 비아코어 조건의 경우, 사용된 전개 완충액은 10mM HEPES, 500mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 7.4였고, 테스트된 개 FcRn의 농도는 200nM이었다. 모든 변이체(YTE 포함)뿐만 아니라 야생형은 pH 7.4에서 개 FcRn에 결합하지 않았다. pH 5.5에서의 결합 동역학은 표 12에 나타나 있고, 센서그램은 도 16a 내지 도 16e에 도시되어 있다. 테스트된 변이체는 야생형 Fc와 비교하여 pH 5.5에서 개 FcRn에 대해 증가된 친화도를 나타내었다.
Figure pct00025
실시예 4: 선택된 위치에서 NNK 포화 돌연변이유발 라이브러리의 생성 및 개별 변이체의 분석.
개 IgGB(서열번호 10)의 CH2 및 CH3 도메인의 야생형(wt) 서열을 합성하고, NNK 돌연변이유발을 위한 주형으로 사용하였다. NNK 포화 돌연변이유발 방법은 목적하는 위치에서 가능한 모든 20개의 아미노산을 생성하는 효과적인 방법이다(Hogrefe et al., Biotechniques. 33: 1158-1165 (2002)). 286번, 312번, 426번 및 436번 위치(EU 넘버링)에서 개별 NNK 라이브러리를 생성하였다. 지정된 위치의 NNK(N = A/C/G/T, K = G/T) 프라이머를 QuikChange 부위-지정 돌연변이유발 키트(애질런트)와 함께 사용하였다. PCR 산물을 진스크립트 FASEBA 플라스미드에 서브클로닝하고, 대장균에 형질전환시키고, 변이체의 존재에 대해 서열을 확인하였다. CH2 도메인의 상류는 알부민에 대한 pM 친화성을 갖는 SASA(혈청 알부민에 대한 단일-도메인 항체) 태그(Zhang, J.; Wu, S.; Liu, J. Methods and systems for increasing protein stability. US 특허 출원, 2013.)이다. SASA 항체는 아래 설명된 센서 칩 표면에 대한 Fc의 포획을 가능하게 한다. PelB(펙테이트 라이에이스 B) 신호 펩타이드는 배지로의 Fc 분비를 촉진하기 위해 N-말단에 있다. CH2-CH3 단백질의 발현은 Lac 프로모터에 의해 조절된다. 조건 배지로부터의 상청액을 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 426번 및 312번 위치의 변이체의 경우 pH 5.5에서 그리고 286번 및 436번 위치의 변이체의 경우 pH 6.0에서 개 FcRn(UniProtKB - E2R0L6 [FcRn] 및 UniProtKB - E2RN10 [개 베타-2-마이크로글로불린])에 대한 결합에 대해 분석하였다.
각 라이브러리로부터의 90개의 개별 형질감염체로부터의 상청액을 아래 설명된 바와 같은 비아코어 방법을 사용하여 426번 및 312번 위치의 변이체의 경우 pH 5.5에서 그리고 286번 및 436번 위치의 변이체의 경우 pH 6.0에서 개 FcRn에 대한 결합에 대해 검정하였다.
비아코어 8K를 사용한 SPR 분석을 위해, 소 혈청 알부민(BSA)을 CM5 센서 칩에 고정화하였다. 플로우 셀 1 및 2의 센서 칩 표면을 새로 혼합된 50 m㏖/ℓ N-하이드록시석신이미드 및 200 m㏖/ℓ 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드 하이드로클로라이드로 420초(10 ㎕/분) 동안 활성화하였다. 그 후, 10mM 소듐 아세테이트(pH 4.5)에 희석된 BSA를 플로우 셀 2에 주입하여 접합을 달성하고, 플로우 셀 1은 블랭크로 설정하였다. 아민 커플링 반응 후, 칩 표면의 나머지 활성 커플링 부위를 1mM 에탄올아민 하이드로클로라이드를 420초 동안 주입하여 차단시켰다. 결합 실험을 위한 전개 완충액은 HBS-EP(10mM HEPES, 500mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 5.5)였으며, 이를 25℃에서 전개하였다. 변이체로부터의 상청액을 칩 표면에 주입하고, SASA 태그를 통해 고정화된 BSA에 60초 동안 포획하였다. 200nM의 개 FcRn을 120초 동안 주입하고, 전개 완충액으로 120초 동안 해리를 완료하였다. BSA의 고정화 단계에 대한 유속은 10 ㎕/분이었고, 결합 및 해리 단계에 대한 유속은 30 ㎕/분이었다. 모든 데이터는 비아코어 8K 평가 소프트웨어 버전 1.1을 사용하여 처리하였다. 비아코어 센서그램에 대해 도 17 참조.
테스트된 변이체는 야생형 개 IgGB Fc(서열번호 10)와 비교할 때 pH 5.5(312번 또는 426번 위치에 아미노산 치환이 있는 변이체의 경우) 및 pH 6.0(286번 또는 436번 위치에 아미노산 치환이 있는 변이체의 경우)에서 개 FcRn에 대해 증가된 결합 친화도를 나타내었다. 결과는 아래 표 13 및 표 14에 요약되어 있다.
Figure pct00026
Figure pct00027
실시예 5: A426Y, A426H, A426F, T286Y, T286F, T286L, T286W, Y436H 및 야생형 Fc에 대한 결합 동역학.
개 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 나타내는 여러 개 IgGB 변이체를 개 FcRn에 대한 결합 동역학에 대해 추가로 평가하였다. 이 연구에서, pH 5.5 또는 pH 6.0 및 pH 7.4에서 개 FcRn에 대한 변이체(A426Y, A426H, A426Y, T286Y, T286F, T286L, T286W, Y436H), YTE 변이체(L252Y/A254T/T256E) 및 야생형 개 IgGB Fc의 결합을 평가하였다. pH 5.5 및 pH 6.0 조건에 대한 비아코어 방법은 FcRn의 4가지 농도(100nM, 200nM, 400nM, 800nM)를 테스트한 것을 제외하고는 위의 실시예 4에 기재된 것과 동일하였고, 이는 보다 정확한 결합 동역학을 산출할 것이다. pH 7.4의 비아코어 조건의 경우, 사용된 전개 완충액은 10mM HEPES, 500mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 7.4였고, 테스트된 개 FcRn의 농도는 200nM이었다. 비아코어 센서그램에 대해 도 18 참조. 야생형 Fc 및 변이체 중 어느 것도 기재된 조건을 사용하여 pH 7.4에서 FcRn에 결합되지 않았다.
결합 친화도 데이터는 아래 표 15 및 표 16에 나타나 있다.
Figure pct00028
Figure pct00029
실시예 6: 개 IgGA Fc의 426번 위치에 아미노산 치환을 보유하는 개 Fc 변이체
426번 위치(EU 넘버링에 의해)에 아미노산 변형을 보유하는 2개의 개 Fc 변이체 및 야생형 개 IgGA Fc(서열번호 9)를 문헌[Gearing DP et al.(2013, BMC Veterinary Research, 9:226)]에 기술되어 있는 가변 도메인을 사용하여 합성하였다. 개 IgGA DNA를 합성하고, pcDNA3.4 벡터(써모피셔(ThermoFisher))에 서브클로닝하고, ExpiCHO 형질감염 방법(써모피셔)을 사용하여 ExpiCHO-S 세포를 형질감염시켰다. 세포를 형질감염시킨 후 제14일에, 진스크립트 단백질 G 수지를 사용하여 조건 배지를 정제하였다.
pH 6.0 결합 실험을 위해, 항체를 CM5 센서 칩에 직접 커플링시킨 다음, 개 FcRn을 HBS-EP(10mM HEPES, 500mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6.0)에 흘려 보냈다. 플로우 셀 1 및 2의 센서 칩 표면을 새로 혼합된 50 m㏖/ℓ N-하이드록시석신이미드(NHS) 및 200 m㏖/ℓ 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC)로 100초(10 ㎕/분)동안 활성화하였다. 항체를 10 m㏖/ℓ NaAC(pH 4.5)에 희석하고, 플로우 셀 2에 주입하여 약 100 반응 단위의 접합을 달성한 반면, 플로우 셀 1은 블랭크로 설정하였다. 아민 커플링 반응 후, 칩 표면의 나머지 활성 커플링 부위를 1 ㏖/ℓ 에탄올아민 하이드로클로라이드를 100초 동안 주입하여 차단시켰다. pH 6.0 결합 실험에 대한 전개 완충액은 HBS-EP(10mM HEPES, 500mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6.0)였으며, 이를 25℃에서 전개하였다. 개 FcRn(UniProtKB - E2R0L6 [FcRn] 및 UniProtKB - E2RN10 [개 베타-2-마이크로글로불린])을 120초 동안 주입하고, 전개 완충액으로 120초 동안 해리를 완료하였다. 유속은 분당 30㎕였다. 센서 칩에 흘려 보낸 개 FcRn의 농도는 50nM, 100nM, 200nM, 400nM 및 800nM이었다. 모든 데이터는 비아코어 8K 평가 소프트웨어 버전 1.1을 사용하여 처리하였다. 각 주기에서 플로우 셀 1 및 완충액 단독 주입을 반응 단위 빼기에 대한 참조로 사용하였다. 아래 표 17은 pH 6.0 결합 실험에 대한 동역학 데이터를 제공한다. 이전에 비아코어 CM5 바이오센서 칩에 대한 IgG의 아민-커플링이 용액-기반 방법 또는 비아코어 C1 칩에 대한 직접 커플링에 의해 결정된 친화도에 비해 FcRn에 대한 친화도를 2-배 내지 3-배 감소시키는 것으로 입증되었다(Abdiche et al., 2015. mAbs, 7:331). 따라서, pH 6.0에서 FcRn에 대한 이들 IgG의 진정한 친화도는 아마도 적어도 2-배 더 높을 것이다. 그러나, 이 방법은 상이한 IgG Fc 변이체의 상대적인 FcRn 결합 친화도를 비교하는 데 유효하다. 비아코어 센서그램은 도 19에 도시되어 있다.
Figure pct00030
실시예 7: 야생형 개 IgGB Fc와 비교하여 FcRn 결합이 증가된 개 IgGB Fc 변이체에 대한 스크리닝
단일 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 조합을 보유하는 개 Fc 변이체를 문헌[Gearing DP et al. (2013, BMC Veterinary Research, 9:226)]에 기술되어 있는 가변 도메인을 사용하여 개 IgGB(서열번호 10) 형식으로 합성하였다. 개 IgGB DNA를 합성하고, pcDNA3.4 벡터(써모피셔)에 서브클로닝하고, ExpiCHO 형질감염 방법(써모피셔)을 사용하여 ExpiCHO-S 세포를 형질감염시켰다. 세포를 형질감염시킨 후 제14일에, Monofinity A 수지(진스크립트(GenScript))를 사용하여 조건 배지를 정제하였다. 개 FcRn에 대한 항체의 결합을 비아코어 8K를 사용하여 pH 6.0 및 pH 7.4 조건 둘 다에서 측정하였다.
pH 6.0 결합 조건의 경우, 플로우 셀 1 및 2의 센서 칩 표면을 새로 혼합된 50 m㏖/ℓ N-하이드록시석신이미드(NHS) 및 200 m㏖/ℓ 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC)로 100초(10 ㎕/분) 동안 활성화하였다. 항체를 10 m㏖/ℓ NaAC(pH 4.5)에 희석하고, 플로우 셀 2에 주입하여 약 100 반응 단위의 접합을 달성한 반면, 플로우 셀 1은 블랭크로 사용하였다. 아민 커플링 반응 후, 칩 표면의 나머지 활성 커플링 부위를 1 ㏖/ℓ 에탄올아민 하이드로클로라이드를 100초 동안 주입하여 차단시켰다. pH 6.0 결합 실험에 대한 전개 완충액은 HBS-EP(10mM HEPES, 500mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6.0)였으며, 이를 25℃에서 전개하였다. 개 FcRn(UniProtKB - E2R0L6 [FcRn] 및 UniProtKB - E2RN10 [개 베타-2-마이크로글로불린])을 120초 동안 주입하고, 전개 완충액으로 120초 동안 해리를 완료하였다. 유속은 분당 30㎕였다. 센서 칩에 흘려 보낸 개 FcRn의 농도는 야생형 IgG 및 A426H-N434R IgG 변이체의 경우 200nM, 400nM, 800nM, 1600nM 및 3200nM이었다. 나머지 변이체에 대해 흘려 보낸 개 FcRn의 농도는 50nM, 100nM, 200nM, 400nM 및 800nM이었다. 모든 데이터는 비아코어 8K 평가 소프트웨어 버전 1.1을 사용하여 처리하였다.
각 주기에서 플로우 셀 1 및 완충액 단독 주입은 반응 단위 빼기에 대한 참조로 사용하였다. 아래 표 18은 pH 6.0 결합 실험에 대한 동역학 데이터를 제시한다. 이전에 비아코어 CM5 바이오센서 칩에 대한 IgG의 아민-커플링은 용액-기반 방법 또는 비아코어 C1 칩에 대한 직접 커플링에 의해 결정된 친화도에 비해 FcRn에 대한 친화도를 2-배 내지 3-배 감소시키는 것으로 입증되었다(Abdiche et al., 2015. mAbs, 7:331). 따라서, pH 6.0에서 FcRn에 대한 이들 IgG의 진정한 친화도는 아마도 적어도 2-배 더 높을 것이다. 그러나, 이 방법은 상이한 IgG Fc 변이체의 상대적인 FcRn 결합 친화도를 비교하는 데 유효하다. 비아코어 센서그램은 도 20 내지 도 23에 도시되어 있다.
Figure pct00031
pH 7.4 결합 조건의 경우, 플로우 셀 1 및 2의 센서 칩 표면을 새로 혼합된 50 m㏖/ℓ N-하이드록시석신이미드(NHS) 및 200 m㏖/ℓ 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC)로 420초(10 ㎕/분) 동안 활성화하였다. 그 후, 10 m㏖/ℓ NaAC(pH 4.5)에 희석된 개 FcRn을 플로우 셀 2에 주입하여 약 2000 반응 단위의 접합을 달성하고, 플로우 셀 1은 블랭크로 설정하였다. 아민 커플링 반응 후, 칩 표면의 나머지 활성 커플링 부위를 1 ㏖/ℓ 에탄올아민 하이드로클로라이드를 420초 동안 주입하여 차단시켰다. pH 7.4 결합 실험에 대한 전개 완충액은 HBS-EP(10mM HEPES, 500mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 7.4)였으며, 이를 25℃에서 전개하였다. 400nM의 상이한 항체를 120초 동안 주입하고, 전개 완충액으로 120초 동안 해리를 완료하였다. 유속은 분당 30㎕였다. 아래 표 19는 pH 7.4 결합 실험에 대한 동역학 데이터를 제시한다. 비아코어 센서그램은 도 24 내지 도 27에 도시되어 있다.
Figure pct00032
pH 7.4에서 개 FcRn과 개 IgG Fc의 상호작용의 친화도는 매우 약하고, 대부분의 방법을 사용하는 SPR에 의해 측정하기 어렵다. 개 FcRn에 대한 다양한 개 Fc 변이체의 pH 7.4 친화도를 비교하기 위해, 센서 칩을 고농도의 개 FcRn으로 코팅하고, 변이체 IgG Fc를 칩에 흘려 보내 상호작용을 측정하였다. 이러한 형식에서는 결합력 효과가 있으므로, 측정된 결합 친화도는 개별 개 IgG Fc 변이체-개 FcRn 상호작용의 정확한 측정이 아니지만, pH 7.4에서 변이체 IgG의 상대적 결합을 비교하는 데 사용할 수 있다. 이는 pH 6.0에서의 결합 친화도와의 직접 비교에 사용해서는 안된다.
실시예 8: 야생형 개 IgGB Fc와 비교하여 FcRn 결합이 증가된 개 IgGB Fc 변이체에 대한 생체내 스크리닝.
16마리의 수컷 및 암컷 비글을 사용하여 약동학(PK) 연구를 수행하였다. 단일 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 조합을 보유하는 개 IgGB Fc 변이체를 문헌[Gearing DP et al. (2013, BMC Veterinary Research, 9:226; 이의 내용은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨)]에 기술되어 있는 항-NGF 가변 도메인을 사용하여 아미노산 치환(들)을 개 IgGB(서열번호 10)에 혼입시킴으로써 제조하였다. 동물을 각 그룹에 수컷과 암컷이 포함된 8개의 그룹으로 무작위로 분류하였다. 비글의 평균 연령은 6개월령 초과였고, 체중은 8㎏ 내지 10kg이었다. 각 동물에 2 ㎎/㎏의 항체를 단일 정맥내 용량으로 투여하였다. 대략 1.5㎖의 전혈을 다음 시점에서 수집하였다: 주사 후 0시간(투여 전), 4시간 및 1일, 2일, 4일, 6일, 10일, 14일, 18일, 22일, 30일, 34일, 38일, 42일. 혈청을 전혈로부터 분리하고, 항-NGF 항체에 특이적인 ELISA에 의해 항체 변이체의 존재에 대해 검정하였다.
약동학 분석을 위해 잘 문서화된 Excel 플러그인 소프트웨어 도구를 사용하여 각 개별 혈청 항체 측정에 대해 비-구획 PK 분석(NCA)을 수행하였다("PKSolver: An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel", Yong Zhang et al., Comput. Methods Programs Biomed.; 2010 Sep;99(3):306-14. doi: 10.1016/j.cmpb.2010.01.007; 이들 내용은 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨). PKSolver는 PK 매개변수의 결정을 위한 다양한 옵션을 제공한다. NCA는 사용의 단순성, 모델-독립성 및 증가된 분석가간 일관성을 위한 선택 방법으로 확인되었다. 특정 분석을 위해, PKSolver의 NCA IV 볼루스를 사용하여 말기 반감기(T½)를 결정하였다. 용량 확인 실험의 초기 설정 후, LLOQ보다 훨씬 높은 측정값은 정맥내 투여 후 제42일까지 측정할 수 있었다. 따라서, 말기 반감기는 항체 측정의 적어도 마지막 4주에서 추정되어 기울기를 확실하게 추정할 수 있었다. 어떤 실험에서도 데이터 포인트를 폐기하거나 제거하지 않았다. 도 29에 도시된 바와 같이, IgG Fc 영역에서 아미노산 치환의 조합은 (i) 야생형 개 IgGB Fc 영역 또는 (ii) 단일 아미노산 치환만을 갖는 개 IgGB Fc 변이체를 보유하는 항-NGF IgGB 항체와 비교할 때, 개 생체내에서 항-NGF IgGB 항체의 말기 반감기를 현저하게 개선시켰다.
실시예 9: C1 바이오센서를 사용한 개 FcRn에 대한 개 IgGB 변이체의 결합 동역학
여러 개 IgGB 변이체(A426Y, A426Y +T286L, A426Y +D312P, A426Y +Y436H, A426Y +T286L +Y436H, A426H, A426H +T286L, A426H +T286Y, A426H +D312P, A426H +Y436H 및 야생형)를 pH 5.9에서 개 FcRn(UniProtKB-E2R0L6[개 대형 서브유닛 FcRn] 및 UniProtKB-E2RN10[개 베타-2-마이크로글로불린])에 대한 결합 동역학에 대해 평가하였다. EU 넘버링을 사용하여 위치를 확인하였다(도 28). 이 연구에서, 단일 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 조합을 보유하는 개 Fc 변이체를 문헌[Gearing DP et al. (2013, BMC Veterinary Research, 9:226)]에 기술되어 있는 가변 도메인을 사용하여 개 IgGB(GENBANK 등록 번호 AAL35302.1) 형식으로 합성하였다. 합성된 개 IgGB DNA를 포유동물 발현 벡터에 서브클로닝하고, CHO 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 조건 배지를 정제하였다.
개 FcRn 결합 실험을 위해, 모든 검정은 25℃에서 비아코어 8K+ 시스템에서 완료하였다. 위의 실시예(예를 들어, 실시예 6 및 실시예 7)에서, 본 발명자들은 시리즈 S C1 바이오센서를 사용할 때와 비교하여 FcRn에 대한 Fc 변이체의 친화도를 과소평가하기 위해 Abdiche 등(2015)(mAb, 7:331)에 의해 입증된 비아코어 CM5 바이오센서 칩에 대한 IgG의 아민-커플링에 의해 개 FcRn에 대한 IgG 변이체의 친화도를 측정하였다. 이 일련의 실험에서, FcRn 친화도를 보다 정확하게 측정하기 위해, 표준 아민 커플링 시약을 사용하여 시리즈 S C1 센서 칩에 모든 항체를 고정화하였다. 200 m㏖/ℓ 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC)와 50 m㏖/ℓ N-하이드록시석신이미드(NHS)의 혼합물을 420초 동안 주입하여 표면을 활성화하였다. 그런 다음, 항체를 10mM 소듐 아세테이트(pH 5.0)에 0.5 ㎍/㎖ 내지 2 ㎍/㎖의 농도로 120초 동안 주입하였다. 마지막으로, 1M 에탄올아민을 420초 동안 주입하였다. 전개 완충액은 pH 5.9로 조정된 1X PBS-P+(사이티바(Cytiva), Cat # 28995084)였다.
pH 5.9에서 개 FcRn에 대한 개 IgGB 변이체의 결합 친화도를 평가하기 위해, 1.56nM 내지 2000nM 농도 범위 개 FcRn을 선택하고, 단일 주기 모드로 주입하였다. 각 변이체에 대해 테스트된 개 FcRn의 농도는 아래 표 20에 나타나 있다.
Figure pct00033
항체당 4가지 농도를 90초 동안 5 ㎕/분으로 주입한 후 180초 동안 해리시켰다. 각 농도 시리즈를 적절한 참조 빼기를 위해 적어도 세 번의 완충액-전용 주기로 이 형식으로 3회 주입하였다. 표면을 30초 동안 1X PBS-P+(pH 7.4)의 2회 주입에 이어 60초 대기 명령(wait command)으로 재생시켰다. 분석 전에 표면을 안정화하기 위해 세 가지 시작 주기를 포함시켰다.
데이터는 1:1 동역학 상호작용 모델에 피팅하거나 또는 정상 상태 친화도에 피팅함으로써 Insight 평가 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. U-값 및 T-값을 포함한 품질 메트릭(Quality metric)을 사용하여 허용되는 매개변수를 선택하였다. 15 미만의 U-값을 동역학 속도 상수에 대해 허용 가능한 것으로 간주한 반면, 100 초과의 T-값을 동역학 속도 상수에 대해 허용 가능한 것으로 간주하였다. 이러한 값을 벗어나는 경우, 정상 상태 친화도 매개변수는 허용 가능한 것으로 간주하였다.
10개의 변이체에 대한 동역학 데이터는 아래 표 21에 나타나 있고, 센서그램은 도 30a 내지 도 30k에 도시되어 있다.
Figure pct00034
실시예 10: FcRn 결합이 증가된 개 IgGB 변이체 및 야생형 개 IgGB의 약동학 연구
3개의 약동학(PK) 연구를 수컷 및 암컷 비글을 사용하여 완료하였다. 단일 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 조합을 보유하는 개 Fc 변이체를 문헌[Gearing DP et al. (2013, BMC Veterinary Research, 9:226)]에 기술되어 있는 항-NGF 가변 도메인을 사용하여 개 IgGB(서열번호 10) 형식으로 합성하였다. 각 연구에 대해, 동물을 각 그룹이 동일한 수의 수컷과 암컷을 포함하도록 무작위로 분류하였다. 각 연구에서 평가된 IgGB 변이체 및 각 그룹의 수컷(M) 및 암컷(F)의 수를 아래에 나타내었다(표 22).
Figure pct00035
개의 평균 연령은 6개월령 초과였으며, 체중은 8㎏ 내지 10kg이었다. 각 동물에 1 ㎎/㎏(연구 1) 또는 2 ㎎/㎏(연구 2 및 3)의 항체를 단일 정맥내 용량으로 주사하였다. 대략 1.5㎖의 전혈을 다음 시점에서 수집하였다: 주사 후 0시간(투여 전), 4시간 및 1일, 2일, 4일, 6일, 10일, 14일, 18일, 22일, 30일, 34일, 38일, 42일. 혈청을 혈액으로부터 추출하고, NGF 항체에 특이적인 ELISA에 의해 항체 변이체에 대해 검정하였다.
비선형 혼합 효과 모델링을 사용하여 선형 소실이 있는 2-구획 약동학(PK) 모델로 혈청 농도를 기술하였다(도 31). 집단 PK 매개변수는 Monolix Suite 2019R1(Monolix 버전 2019R1. 프랑스 앙토니 소재: 릭소프트 에스에이에스(Lixoft SAS), 2019)에서 구현된 확률적 근사 기댓값 최대화(stochastic approximation of expectation-maximization: SAEM) 알고리즘을 사용하여 추정하였다. 개별 매개변수는 로그-정규 분포를 갖는 랜덤 변수로 모델링하였다. 집단 매개변수는 모든 변이체 및 연구를 포함하는 풀링된 데이터로부터 추정하였다. 연구는 제거율에 대한 범주형 공변량(categorical covariate)이었다. mAb 변이체는 제거율, 중앙 및 말초 분포 용적에 대한 범주형 공변량을 사용하여 구별하였다. 범주형 연구 및 변이형 공변량(variant covariate)은 다음과 같이 설명되었다:
Figure pct00036
여기서, 개별 공변량이 범주에 있으면
Figure pct00037
이고, 그렇지 않으면
Figure pct00038
이다. 야생형 IgGB 변이체를 참조로 사용하였다.
연구 2에서 관찰된 야생형, A426Y 및 A426Y +Y436H 변이체에 대한 말기 반감기는 도 29에 도시되어 있다.
3개의 연구 모두로부터의 데이터를 사용하여 각각의 변이체에 대한 추정된 PK 매개변수를 생성하였다(표 23).
Figure pct00039
실험 3으로부터의 야생형, A426Y, A426Y +Y436H 및 A426Y +Y436H +T286L의 개별적으로 관찰된 혈청 농도는 도 32b에 도시되어 있다. 실험 1로부터의 야생형, YTE, N434Y 및 N434R의 개별적으로 관찰된 혈청 농도도 도 32a에 도시되어 있다.
야생형 IgGB Fc 또는 IgGB 변이체 A426Y, A426Y +Y436H, A426Y +Y436H +T286L, N434R, N434Y 및 YTE를 보유하는 항-NGF 항체의 3개월의 기간에 걸친 예상된 혈청 농도 프로파일에 대한 시뮬레이션을 결정하였으며, 이는 도 33에 도시되어 있다. 이 시뮬레이션을 위해, 10㎏의 개에게 2 ㎎/㎏의 단일 정맥내 용량을 사용하였다.
실시예 11: 개 FcRn에 결합하는 개 IgGB Fc 변이체의 모델링
개 FcRn에 결합하는 개 IgGB Fc 변이체의 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하기 위해, 개 FcRn과 복합체를 이루는 개 IgGB Fc의 구조적 모델을 YTE-Fc 도메인(PDB ID:4N0U)과 복합체를 이루는 인간 FcRn의 공결정 구조를 기반으로 하는 MOE 소프트웨어(분자 작동 환경(Molecular Operating Environment: MOE), 2020.09; 캐나다 퀘벡주 몬트리올, 셔브룩 대로 서부, 1010번지, 910동 H3A 2R7, 케미칼 컴퓨팅 그룹 ULC(Chemical Computing Group ULC), 2020)를 사용하여 생성하였다. 돌연변이를 MOE에서 모델링된 구조에 통합시키고, Amber14:EHT 포스필드로 에너지를 최소화하였다. 개 Fc-FcRn 상호작용 거리를 Pymol 소프트웨어(PyMOL 몰리큘러 그래픽 시스템(PyMOL Molecular Graphics System), 버전 1.2r3pre, 슈뢰딩거, 엘엘씨(
Figure pct00040
, LLC)를 사용하여 측정하였다.
낮은 pH에서 개 FcRn에 대한 친화도를 증가시키는 변이체를 갖는 286번, 426번 및 436번 위치의 개 Fc는 도 34에 도시되어 있다.
개 IgGB A426H 변이체는 도 35에 도시되어 있으며, 426번 위치는 FcRn과 직접 상호작용하기에는 너무 멀리 떨어져 있다. 모델은 A426H가 Y436과 입체적 충돌을 일으켜 FcRn에 결합하기 위해 더 유리한 형태로 변위시키는 것으로 예측한다. 개 A426Y는 도 36에 도시되어 있으며, A426H와 유사하게 이는 FcRn과 직접 상호작용하기에는 너무 멀고 FcRn에 결합하기 위해 Y436을 보다 유리한 형태로 이동시킨다.
개 IgGB Y436H 변이체는 도 37에 도시되어 있다. 436번 잔기 위치를 His로 변경하면 인접한 잔기에 대해 약간의 예측되는 변화가 있다. 전하의 차이는 결합을 더 단단하게 만드는 원인일 수 있다. 소수성/방향족 Y436과 유사한 중성 pH에서 H436에 대한 전하의 부족은 인접한 잔기가 결합에 불리한 환경에 남아 있도록 하는 것으로 예측된다. 그러나, 양성자화된 His436의 보다 친수성/양전하 특성은 FcRn 대형 서브유닛의 E135와 같은 잔기에 대해 보다 매력적인 인터페이스를 제공한다.
개 IgGB T286L 변이체는 도 38에 도시되어 있으며, 이는 FcRn에서 개 베타-2-마이크로글로불린과 직접 상호작용하지 않는다. 그러나, 존재하는 임의의 소수성 상호작용은 트레오닌을 류신으로 변경시킴으로써 강화될 것이다. 관찰은 실시예 4 및 실시예 5에 나타낸 바와 같이 낮은 pH에서 개 FcRn에 대한 T286Y, T286F 및 T286W 변이체의 증가된 친화도와 일치한다.
개 IgGB Fc에 대한 A426Y, Y436H 및 T286L 변이체의 조합을 모델링하였다(도 39). A426Y와 Y436H 변이체 사이의 입체 충돌은 436이 결합에 더 유리한 위치로 이동하게 할 것으로 예측된다. 이는 His의 pH 의존적 효과와 함께 부가적일 수 있다. T286L은 426 및 436 돌연변이에 의해 직접적인 영향을 받는 것으로 보기에는 너무 멀리 떨어져 있다. 실시예 9에서의 낮은 pH에서 개 FcRn에 대한 3중 변이체(A426Y, Y436H 및 T286L)의 시험관내 결합 데이터는 3개의 변이체의 조합이 부가적인 방식으로 FcRn 친화도를 증가시키는 모델과 일치한다.
다른 실시형태
본 발명은 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것으로 제한하기 위한 것이 아니다. 다른 양태, 이점 및 수정은 다음 청구범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Invetx Inc. <120> COMPOSITIONS FOR INCREASING HALF-LIFE OF A THERAPEUTIC AGENT IN CANINES AND METHODS OF USE <130> WO 2021/231464 <140> PCT/US2021/031826 <141> 2020-05-11 <150> 63/122,417 <151> 2020-12-07 <150> 63/023,083 <151> 2020-05-11 <160> 31 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 104 <212> PRT <213> Canine <400> 1 Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg 1 5 10 15 Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg 20 25 30 Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val 35 40 45 His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr 50 55 60 Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly 65 70 75 80 Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile 85 90 95 Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg 100 <210> 2 <211> 104 <212> PRT <213> Canine <400> 2 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu 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Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe 35 40 45 Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln 100 105 110 Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu 115 120 125 Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe 130 135 140 Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 180 185 190 Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn His 195 200 205 Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 13 <211> 468 <212> PRT <213> Canine <400> 13 Met Glu Ser Val Phe Cys Trp Val Phe Leu Val Val Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Tyr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Gln Arg Val Ala His Ile Arg Gly Asp Gly Arg Thr Thr His Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ala Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Val Glu Asp Thr Ala Ile 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Lys Asp Ile Tyr Tyr Gly Val Gly Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val 145 150 155 160 Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu His Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Val His 210 215 220 Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Phe Asn Glu Cys Arg 225 230 235 240 Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr 290 295 300 Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu 325 330 335 Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr Val 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile 370 375 380 Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp 385 390 395 400 Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr Pro 405 410 415 Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val 435 440 445 Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 14 <211> 96 <212> PRT <213> Canine <400> 14 Leu Phe Thr Arg Thr Lys Arg Arg Ser Asp Val Ser Trp Gly Asn Thr 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gln Thr Val Ile Arg Ala Ser Val Ala Ser Trp Ser Arg 20 25 30 Asn Gly Asp Leu Tyr Ala Pro Lys Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val 35 40 45 Pro Arg Pro Pro Asp Cys Lys Ala Met Phe Thr Leu Leu Ala Val Asp 50 55 60 Pro Gln Met Gln Pro Glu Gly Lys Gln Thr Lys Asn Lys Ala Gln Gln 65 70 75 80 Arg Glu Lys Asn Leu Phe Ser Tyr Thr Arg Thr Ile Ala His Gln Glu 85 90 95 <210> 15 <211> 105 <212> PRT <213> Canine <400> 15 Leu Tyr Ala Asp Cys Ala Ser Val Ser Pro Trp Thr Tyr Ser Asp Ile 1 5 10 15 Tyr Ser Val Arg Ala Val Ala Ala Pro Tyr Asp Ser His Tyr Met Pro 20 25 30 Ser Leu Phe Gln Ile Val Tyr Ala Thr Ala Lys Glu Lys Cys Asn Cys 35 40 45 Asn Asn Cys Gly Cys Gly Leu Phe Val Thr Ala Thr Val Asp Pro Asn 50 55 60 Ser Gln Gln Asn Pro Glu Ser Gly Ser Gln Lys Asn Lys Ala Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Gln Gln Asn Arg Asp Met Lys Asn Thr Leu Val Phe Glu Ser 85 90 95 Tyr Met Arg Thr Ile Ala His Gln Ile 100 105 <210> 16 <211> 66 <212> PRT <213> Canine <400> 16 Leu Ser Asp Gly Ser Val Ser Trp Ala Val Ser Asn Arg Asp Tyr Ser 1 5 10 15 Lys Ala Ile His Val Thr Gly Val Trp Pro Arg His Met His Asn Ser 20 25 30 Leu Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Thr Lys Cys Ile Ser Pro Glu Ser Phe 35 40 45 Ile Pro Ser Gly Gln Gln Thr Leu Phe Glu Pro Ser Tyr His Thr Ala 50 55 60 Thr Ala 65 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Canine <400> 17 Phe Asn Glu Cys Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu 1 5 10 15 Pro <210> 18 <211> 22 <212> PRT <213> Canine <400> 18 Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys 1 5 10 15 Cys Pro Ala Pro Glu Met 20 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Canine <400> 19 Ala Lys Glu Cys Glu Cys Lys Cys Asn Cys Asn Asn Cys Pro Cys Pro 1 5 10 15 Gly Cys Gly Leu 20 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Canine <400> 20 Pro Lys Glu Ser Thr Cys Lys Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu 1 5 10 15 Ser <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Canine <400> 21 Pro Lys Glu Ser Thr Cys Lys Cys Ile Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu 1 5 10 15 Ser <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 22 Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 23 Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr 1 5 10 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 24 Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 25 Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 26 Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser 1 5 10 15 Glu Arg <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 27 Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly 1 5 10 15 Leu Tyr <210> 28 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 28 Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly 1 5 10 15 Leu Tyr Ser Glu Arg 20 <210> 29 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 29 Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly 1 5 10 15 Leu Tyr Gly Leu Tyr 20 <210> 30 <211> 202 <212> PRT <213> Canine <400> 30 Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg 1 5 10 15 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro 20 25 30 Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala 35 40 45 Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val 50 55 60 Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe 65 70 75 80 Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr 85 90 95 Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu 100 105 110 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys 115 120 125 Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser 130 135 140 Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln 145 150 155 160 Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp 165 170 175 Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His 180 185 190 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu 195 200 <210> 31 <211> 200 <212> PRT <213> human <400> 31 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 1 5 10 15 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 20 25 30 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 35 40 45 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 50 55 60 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 65 70 75 80 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 85 90 95 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 100 105 110 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 115 120 125 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 130 135 140 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 145 150 155 160 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 165 170 175 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 180 185 190 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 195 200

Claims (65)

  1. 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역을 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드는
    (i) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
    (ii) 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
    (iii) 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치; 및
    (iv) 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 상기 아미노산 치환은 Tyr, Phe, Leu 및 Trp로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 아미노산 위치는 EU 넘버링에 기초하며, 상기 폴리펩타이드는 상기 야생형 개 IgG의 Fc 도메인과 비교할 때 개 FcRn에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는, 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro를 포함하는, 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr, His 또는 Phe를 포함하는, 폴리펩타이드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr을 포함하는, 폴리펩타이드.
  7. 제5항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 His를 포함하는, 폴리펩타이드.
  8. 제5항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Phe를 포함하는, 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr을 포함하는, 폴리펩타이드.
  11. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Phe를 포함하는, 폴리펩타이드.
  12. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Leu를 포함하는, 폴리펩타이드.
  13. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp를 포함하는, 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 치환은 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  15. 제14항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 His를 포함하는, 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 9 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (ii) 야생형 개 IgG의 251번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (iii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (iv) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (v) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (vi) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (vii) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (viii) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (ix) 야생형 개 IgG의 308번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (x) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xi) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xii) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xiii) 야생형 개 IgG의 378번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xiv) 야생형 개 IgG의 380번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xv) 야생형 개 IgG의 428번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xvi) 야생형 개 IgG의 430번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xvii) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xviii) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치 및
    (xix) 야생형 개 IgG의 435번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    (i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Glu 또는 Gln,
    (ii) 야생형 개 IgG의 251번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp 또는 Glu,
    (iii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr 또는 Met,
    (iv) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr 또는 Ser,
    (v) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Glu 또는 Phe,
    (vi) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asn 또는 Asp,
    (vii) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Tyr, Phe, Leu 또는 Trp,
    (viii) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Arg, Gln 또는 Ala,
    (ix) 야생형 개 IgG의 308번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
    (x) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
    (xi) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
    (xii) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp,
    (xiii) 야생형 개 IgG의 378번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
    (xiv) 야생형 개 IgG의 380번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Ala,
    (xv) 야생형 개 IgG의 428번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Leu,
    (xvi) 야생형 개 IgG의 430번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Ala 또는 Lys,
    (xvii) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Lys,
    (xviii) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg, His, Ser, Ala 또는 Phe 및/또는
    (xix) 야생형 개 IgG의 435번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr
    을 포함하는, 폴리펩타이드.
  19. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (ii) 야생형 개 IgG의 251번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (iii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (iv) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (v) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (vi) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (vii) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (viii) 야생형 개 IgG의 308번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (ix) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (x) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xi) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xii) 야생형 개 IgG의 378번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xiii) 야생형 개 IgG의 380번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xiv) 야생형 개 IgG의 428번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xv) 야생형 개 IgG의 430번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xvi) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (xvii) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치 및
    (xviii) 야생형 개 IgG의 435번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    (i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Glu 또는 Gln,
    (ii) 야생형 개 IgG의 251번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp 또는 Glu,
    (iii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr 또는 Met,
    (iv) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr 또는 Ser,
    (v) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Glu 또는 Phe,
    (vi) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asn 또는 Asp,
    (vii) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Arg, Gln 또는 Ala,
    (viii) 야생형 개 IgG의 308번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
    (ix) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
    (x) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
    (xi) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp,
    (xii) 야생형 개 IgG의 378번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
    (xiii) 야생형 개 IgG의 380번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Ala,
    (xiv) 야생형 개 IgG의 428번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Leu,
    (xv) 야생형 개 IgG의 430번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Ala 또는 Lys,
    (xvi) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Lys,
    (xvii) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg, His, Ser, Ala 또는 Phe 및/또는
    (xviii) 야생형 개 IgG의 435번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr
    을 포함하는, 폴리펩타이드.
  21. 제17항 또는 제19항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환은
    (i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (ii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (iii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (iv) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (v) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (vi) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (vii) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (viii) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (ix) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (x) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치 및
    (xi) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 있는, 폴리펩타이드.
  22. 제21항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    (i) 야생형 개 IgG의 250번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Glu 또는 Gln,
    (ii) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr 또는 Met,
    (iii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr 또는 Ser,
    (iv) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Glu 또는 Phe,
    (v) 야생형 개 IgG의 285번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asn 또는 Asp,
    (vi) 야생형 개 IgG의 307번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Arg, Gln 또는 Ala,
    (vii) 야생형 개 IgG의 309번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Pro,
    (viii) 야생형 개 IgG의 311번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Val,
    (ix) 야생형 개 IgG의 315번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp,
    (x) 야생형 개 IgG의 433번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Lys, 및
    (xi) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg, His, Ser, Ala 또는 Phe
    를 포함하는, 폴리펩타이드.
  23. 제17항 또는 제19항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 아미노산 치환은
    (i) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (ii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치,
    (iii) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치 및
    (iv) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 있는, 폴리펩타이드.
  24. 제23항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    (i) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr 또는 Met,
    (ii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr 또는 Ser,
    (iii) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Asp, Glu 또는 Phe 및/또는
    (iv) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg, His, Ser, Ala 또는 Phe
    를 포함하는, 폴리펩타이드.
  25. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    (i) 야생형 개 IgG의 252번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Tyr,
    (ii) 야생형 개 IgG의 254번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Thr,
    (iii) 야생형 개 IgG의 256번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Glu 및/또는
    (iv) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 아미노산 위치에 Trp, Tyr, Arg 또는 His
    를 포함하는, 폴리펩타이드.
  26. 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역을 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드는
    (i) 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
    (ii) 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
    (iii) 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
    (iv) 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 위치; 및
    (v) 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 위치에 아미노산 치환을 포함하되, 상기 아미노산 위치는 EU 넘버링에 기초하고, 상기 폴리펩타이드는 상기 야생형 개 IgG의 Fc 도메인과 비교할 때 개 FcRn에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는, 폴리펩타이드.
  27. 제26항에 있어서, 야생형 개 IgG의 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 상기 아미노산 치환은 T286L, T286Y 및 임의의 전술한 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  28. 제26항에 있어서, 야생형 개 IgG의 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 상기 아미노산 치환은 D312P 또는 이의 보존적 아미노산 치환인, 폴리펩타이드.
  29. 제26항에 있어서, 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 상기 아미노산 치환은 A426Y, A426H 및 임의의 전술한 보존적 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  30. 제26항에 있어서, 야생형 개 IgG의 434번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 상기 아미노산 치환은 N434R 또는 이의 보존적 아미노산 치환인, 폴리펩타이드.
  31. 제26항에 있어서, 야생형 개 IgG의 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 있는 상기 아미노산 치환은 Y436H 또는 이의 보존적 아미노산 치환인, 폴리펩타이드.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 야생형 개 IgG의 426번 아미노산 위치에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  33. 제32항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    (i) 야생형 개 IgG의 426번 및 286번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
    (ii) 야생형 개 IgG의 426번 및 312번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
    (iii) 야생형 개 IgG의 426번 및 434번 아미노산 위치에 상응하는 위치;
    (iv) 야생형 개 IgG의 426번 및 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치; 및
    (v) 야생형 개 IgG의 286번, 426번 및 436번 아미노산 위치에 상응하는 위치
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 위치에 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  34. 제32항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는
    (i) A426Y 및 T286L;
    (ii) A426Y 및 D312P;
    (iii) A426Y 및 Y436H;
    (iv) A426H 및 T286L;
    (v) A426H 및 T286Y;
    (vi) A426H 및 D312P; 및
    (vii) T286L, A426Y 및 Y436H
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  35. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 아미노산 치환은
    (i) T286L, D312P, N434R 및 Y436H 중 하나 이상과 조합된 A426Y;
    (ii) T286L, T286Y, D312P, N434R 및 Y436H 중 하나 이상과 조합된 A426H; 및
    (iii) T286L, T286Y, D312P 및 Y436H 중 하나 이상과 조합된 N434R
    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 개 IgG는 서열번호 9와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인을 포함하는 개 IgGA, 서열번호 10과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인을 포함하는 개 IgGB, 서열번호 11과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인을 포함하는 개 IgGC 또는 서열번호 12와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인을 포함하는 개 IgGD인, 폴리펩타이드.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 개 IgG는 개 IgGA이고, 상기 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역은 서열번호 9와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 개 IgG는 개 IgGB이고, 상기 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역은 서열번호 10과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  39. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 개 IgG는 개 IgGC이고, 상기 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역은 서열번호 11과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  40. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 개 IgG는 개 IgGD이고, 상기 개 IgG Fc 영역 변이체 또는 이의 개 FcRn-결합 영역은 서열번호 12와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
  42. 제41항에 있어서, 상기 결합 도메인은 (i) 면역글로불린 분자의 6개의 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR); (ii) 개 수용체 단백질의 리간드 결합 도메인, (iii) 나노바디 또는 (iv) 개 수용체 단백질의 세포외 도메인을 포함하는, 폴리펩타이드.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 결합 도메인은 NGF, TrKA, ADAMTS, IL-1, IL-2, IL-4, IL-4R, 안지오텐신 유형 1(AT1) 수용체, 안지오텐신 유형 2(AT2) 수용체, IL-5, IL-12, IL-13, IL-31, IL-33, CD3, CD20, CD47, CD52 및 보체 시스템 복합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 특이적으로 결합하는, 폴리펩타이드.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, EPO, CTLA4, LFA3, VEGFR1/VEGFR3, IL-1R, IL-4R, GLP-1 수용체 효능제 및 트롬보포이에틴 결합 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 결합 검정에서 중성 pH보다 산성 pH에서 더 높은 수준으로 개 FcRn에 결합하는, 폴리펩타이드.
  46. 제45항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 결합 검정에서 pH 7.4보다 pH 5.5에서 더 높은 수준으로 개 FcRn에 결합하는, 폴리펩타이드.
  47. 제46항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 결합 검정에서 pH 7.4보다 pH 6.0에서 더 높은 수준으로 개 FcRn에 결합하는, 폴리펩타이드.
  48. 약제학적 조성물로서, (i) 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 및 (ii) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  49. 핵산 또는 핵산들로서, 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는, 핵산 또는 핵산들.
  50. 발현 벡터 또는 발현 벡터들로서, 제49항의 핵산 또는 핵산들을 포함하는, 발현 벡터 또는 발현 벡터들.
  51. 숙주 세포로서, 제49항의 핵산 또는 핵산들 또는 제50항의 발현 벡터 또는 발현 벡터들을 포함하는, 숙주 세포.
  52. 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서,
    (a) 제49항의 핵산 또는 핵산들을 제공하는 단계;
    (b) 숙주 세포 배양물에서 상기 핵산 또는 핵산들을 발현시켜 상기 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 숙주 세포 배양물로부터 (b)에서 생산된 상기 폴리펩타이드를 수집하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 약제학적 제형으로서 상기 폴리펩타이드를 제형화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  54. 개 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개에서 개 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 유효량의 제48항의 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 상기 개에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  55. 개 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 개에서 개 질환 또는 장애를 예방하는 방법으로서, 유효량의 제48항의 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 상기 개에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 개 질환 또는 장애는 알레르기 질환, 만성 통증, 급성 통증, 염증성 질환, 자가면역 질환, 내분비 질환, 위장관 질환, 심혈관 질환, 신장 질환, 생식 관련 장애, 감염성 질환 또는 암인, 방법.
  57. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 개 질환 또는 장애는 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 골관절성 통증, 관절염, 빈혈 또는 비만인, 방법.
  58. 제48항에 있어서, 상기 개 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개에서 개 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  59. 제48항에 있어서, 상기 개 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 개에서 개 질환 또는 장애를 예방하는 방법에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 개 질환 또는 장애는 알레르기 질환, 만성 통증, 급성 통증, 염증성 질환, 자가면역 질환, 내분비 질환, 위장관 질환, 심혈관 질환, 신장 질환, 생식 관련 장애, 감염성 질환 또는 암인, 약제학적 조성물.
  61. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 개 질환 또는 장애는 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 골관절성 통증, 관절염, 빈혈 또는 비만인, 약제학적 조성물.
  62. 개 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개에서 개 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드의 용도.
  63. 개 질환 또는 장애의 예방을 필요로 하는 개에서 개 질환 또는 장애의 예방을 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드의 용도.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 개 질환 또는 장애는 알레르기 질환, 만성 통증, 급성 통증, 염증성 질환, 자가면역 질환, 내분비 질환, 위장관 질환, 심혈관 질환, 신장 질환, 생식 관련 장애, 감염성 질환 또는 암인, 용도.
  65. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 개 질환 또는 장애는 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 골관절성 통증, 관절염, 빈혈 또는 비만인, 용도.
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