CN115867572A

CN115867572A - 用于增加治疗剂在犬中的半衰期的组合物和使用方法

Info

Publication number: CN115867572A
Application number: CN202180048682.1A
Authority: CN
Inventors: W·布朗迪克; B·谢瓦利埃; J·霍恩; M·纳塔拉扬
Original assignee: Invitex
Current assignee: Invitex
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2021-05-11
Publication date: 2023-03-28
Also published as: US20240327497A1; US11434276B2; KR20230034954A; BR112022022922A2; US20210347854A1; WO2021231464A1; AU2021270564A1; EP4149969A1; MX2022014150A; JP2023526225A; CA3178123A1; US20230127241A1

Abstract

提供了用于增加一种或多种多肽在犬中的半衰期的组合物及它们的使用方法。所述组合物涉及变体犬IgG Fc区。

Description

用于增加治疗剂在犬中的半衰期的组合物和使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年5月11日提交的美国临时申请号63/023,083和2020年12月7日提交的美国临时申请号63/122,417的优先权，这些美国临时申请各自的内容以引用的方式整体并入。

技术领域

本公开总体上涉及与它们的野生型对应物相比在犬中具有增加的半衰期的多肽(例如，融合多肽诸如多肽-Fc区融合物；或结合分子(诸如抗体或受体-Fc融合物的配体结合部分))。

通过EFS-WEB提交的序列表

在MPEP§1730II.B.2(a)中授权和阐述的以下通过USPTO EFS-WEB服务器电子提交的序列表的全部内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。序列表在如下标识的电子存档文本文件中：

文件名称：47406-0015WO1_Sequence_Listing.txt

创建日期：2021年5月6日

大小(字节)：34,000字节

背景技术

抗体的Fc区起许多功能作用，包括但不限于保护抗体免于通过溶酶体途径降解和介导抗体效应子功能。随着犬抗体作为治疗剂的用途渐增，不仅选择最佳的Fab，而且将其与合适的Fc组合以获得期望的半衰期和效应子功能的关注已经增加。

本领域几乎没有关于增加用于狗的多肽治疗剂(例如抗体)的半衰期的指导。本公开通过提供改善多肽(例如抗体)在犬中的血清持久性的Fc区变体来补救该缺失。

发明内容

本文提供了可用于治疗性多肽的犬Fc(例如，犬IgG Fc区变体)或其犬FcRn结合片段。本公开的特征在于如下多肽，所述多肽与对照多肽(例如，野生型对应物IgG犬Fc区)相比与犬FcRn的结合增加。在一些情况下，在pH 5.5、pH 6.0和/或pH 6.5下，这些多肽与对照多肽相比与犬FcRn的结合增加。在一些情况下，与在中性pH(例如，pH 7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5)下相比，这些多肽可以例如在酸性pH(例如，pH 5.5、pH 6.0或pH 6.5)下以更高的水平结合犬FcRn。在一些情况下，与在pH 7.4下相比，这些多肽在pH 5.5和/或6.0下以更高的水平结合犬FcRn。本公开部分地涉及与其野生型对应物相比在犬中具有增加的半衰期的多肽。例如，提供了结合分子(例如，抗体或受体的配体结合部分)，其相对于本文所公开的不与Fc区或其犬FcRn结合区连接的这些结合分子的版本具有增加的半衰期。还提供了酶-Fc区融合物、配体-Fc区融合物、纳米抗体-Fc融合物和肽-Fc区融合物，其中所述融合物与其野生型对应物相比具有增加的半衰期。除了具有增加半衰期的一个或多个取代(相对于野生型犬Fc区)之外，Fc区还可以包括其他取代，所述其他取代例如增加效应子功能、降低效应子功能、增加与蛋白A的结合和/或降低多肽的异质性(例如，通过去除Fc区中的一个或多个翻译后修饰)。犬Fc区序列可以来自任何犬抗体。在一些情况下，犬Fc区序列来自犬IgG(例如，IgGA、IgGB、IgGC或IgGD)。

本公开的特征在于重组蛋白，所述重组蛋白包含(1)特异性结合配体或蛋白质表位的结合结构域或其片段，其中所述结合结构域连接至(2)如本文所公开的包含Fc区(CH2+CH3区)或其犬FcRn结合区的结构域。在一些情况下，结合结构域包含(i)犬或人/人源化抗体的六个互补决定区(CDR)；(ii)纳米抗体；(iii)结合配体的可溶性受体结合结构域或其配体结合片段，和(iv)犬受体蛋白的细胞外结构域。

本公开还提供了组合物，所述组合物包含：(1)包含第一Fc区(例如，CH2区、CH3区、CH2+CH3区)的第一多肽，所述第一Fc区包含本文所述的犬IgG Fc区变体；和(2)包含第二Fc区的第二多肽，所述第二Fc区包含本文所述的犬IgG Fc区变体。第一多肽和第二多肽可以通过所述第一Fc区和所述第二Fc区缔合。在一些情况下，第一Fc区和第二Fc区的氨基酸序列是相同的。在其他情况下，第一Fc区和第二Fc区的氨基酸序列是不同的(例如，有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸不同)。在一些情况下，Fc区变体是犬IgGB抗体Fc区的变体。在一些情况下，Fc区变体是犬IgGA抗体Fc区的变体。在一些情况下，Fc区变体是犬IgGC抗体Fc区的变体。在一些情况下，Fc区变体是犬IgGD抗体Fc区的变体。

还公开了包含本文所公开的犬IgG Fc区变体和多肽的融合分子。在一些情况下，犬IgG Fc区变体与多肽共价连接(例如，通过铰链区或接头)。在一些情况下，多肽是犬受体蛋白的配体结合结构域、犬受体蛋白的细胞外结构域或抗原结合结构域。在一些情况下，多肽选自犬IL-13Rα1或IL-13Rα2、犬EPO、犬CTLA4、犬LFA3、犬VEGFR1/VEGFR3、犬IL-1R、犬GLP-1受体激动剂和犬血小板生成素结合肽的配体结合结构域或细胞外结构域。在一些情况下，多肽是scFv、纳米抗体或单结构域抗体。在一些情况下，IgG Fc区变体是犬IgGB抗体Fc区的变体。在一些情况下，IgG Fc区变体是犬IgGA抗体Fc区的变体。在一些情况下，IgGFc区变体是犬IgGC抗体Fc区的变体。在一些情况下，IgG Fc区变体是犬IgGD抗体Fc区的变体。

在一些方面，本公开提供了包含犬IgG Fc区变体或其犬FcRn结合区的多肽，其中所述多肽包含在选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸取代：

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置；

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置312对应的位置；

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的位置；以及

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的位置，

其中在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置处的氨基酸取代选自由Tyr、Phe、Leu和Trp组成的组，其中所述氨基酸位置基于EU编号，并且其中当与野生型犬IgG的Fc结构域相比时，所述多肽对犬FcRn的结合亲和力增加。

在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包括在与野生型犬IgG的氨基酸位置312对应的位置处的氨基酸取代。

在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置312对应的氨基酸位置处包含Pro。

在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包括在与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的氨基酸位置处包含Tyr、His或Phe。在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的氨基酸位置处包含Tyr。在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的氨基酸位置处包含His。在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的氨基酸位置处包含Phe。

在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包括与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的氨基酸位置处包含His。

在一些实施方案中，多肽包含与选自由SEQ ID NO:9至12组成的组的氨基酸序列至少80％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，多肽包含在选自由以下组成的组的位置处的至少一个另外的氨基酸取代：

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置250对应的氨基酸位置，

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置251对应的氨基酸位置，

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置，

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置，

(v)与野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置，

(vi)与野生型犬IgG的氨基酸位置285对应的氨基酸位置，

(vii)与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置，

(viii)与野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置，

(ix)与野生型犬IgG的氨基酸位置308对应的氨基酸位置，

(x)与野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置，

(xi)与野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置，

(xii)与野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置，

(xiii)与野生型犬IgG的氨基酸位置378对应的氨基酸位置，

(xiv)与野生型犬IgG的氨基酸位置380对应的氨基酸位置，

(xv)与野生型犬IgG的氨基酸位置428对应的氨基酸位置，

(xvi)与野生型犬IgG的氨基酸位置430对应的氨基酸位置，

(xvii)与野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置，

(xviii)与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置，和

(xix)与野生型犬IgG的氨基酸位置435对应的氨基酸位置。

在一些实施方案中，多肽包含：

(i)在与野生型犬IgG的氨基酸位置250对应的氨基酸位置处的Glu或Gln，

(ii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置251对应的氨基酸位置处的Asp或Glu，

(iii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置处的Tyr或Met，

(iv)在与野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置处的Thr或Ser，

(v)在与野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置处的Asp、Glu或Phe，

(vi)在与野生型犬IgG的氨基酸位置285对应的氨基酸位置处的Asn或Asp，

(vii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处的Asp、Tyr、Phe、Leu或Trp，

(viii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置处的Arg、Gln或Ala，

(ix)在与野生型犬IgG的氨基酸位置308对应的氨基酸位置处的Pro，

(x)在与野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置处的Pro，

(xi)在与野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置处的Val，

(xii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置处的Asp，

(xiii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置378对应的氨基酸位置处的Val，

(xiv)在与野生型犬IgG的氨基酸位置380对应的氨基酸位置处的Ala，

(xv)在与野生型犬IgG的氨基酸位置428对应的氨基酸位置处的Leu，

(xvi)在与野生型犬IgG的氨基酸位置430对应的氨基酸位置处的Ala或Lys，

(xvii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置处的Lys，

(xviii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、His、Ser、Ala或Phe，和/或

(xix)在与野生型犬IgG的氨基酸位置435对应的氨基酸位置处的Tyr。

在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包括在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处包含Tyr。在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处包含Phe。在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处包含Leu。在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处包含Trp。

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置250对应的氨基酸位置，

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置251对应的氨基酸位置，

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置，

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置，

(v)与野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置，

(vi)与野生型犬IgG的氨基酸位置285对应的氨基酸位置，

(vii)与野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置，

(viii)与野生型犬IgG的氨基酸位置308对应的氨基酸位置，

(ix)与野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置，

(x)与野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置，

(xi)与野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置，

(xii)与野生型犬IgG的氨基酸位置378对应的氨基酸位置，

(xiii)与野生型犬IgG的氨基酸位置380对应的氨基酸位置，

(xiv)与野生型犬IgG的氨基酸位置428对应的氨基酸位置，

(xv)与野生型犬IgG的氨基酸位置430对应的氨基酸位置，

(xvi)与野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置，

(xvii)与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置，和

(xviii)与野生型犬IgG的氨基酸位置435对应的氨基酸位置。

在一些实施方案中，多肽包含：

(vii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置处的Arg、Gln或Ala，

(viii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置308对应的氨基酸位置处的Pro，

(ix)在与野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置处的Pro，

(x)在与野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置处的Val，

(xi)在与野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置处的Asp，

(xii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置378对应的氨基酸位置处的Val，

(xiii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置380对应的氨基酸位置处的Ala，

(xiv)在与野生型犬IgG的氨基酸位置428对应的氨基酸位置处的Leu，

(xv)在与野生型犬IgG的氨基酸位置430对应的氨基酸位置处的Ala或Lys，

(xvi)在与野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置处的Lys，

(xvii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、His、Ser、Ala或Phe，和/或

(xviii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置435对应的氨基酸位置处的Tyr。

在一些实施方案中，至少一个另外的氨基酸取代位于选自由以下组成的组的位置：

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置250对应的氨基酸位置，

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置，

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置，

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置，

(v)与野生型犬IgG的氨基酸位置285对应的氨基酸位置，

(vi)与野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置，

(vii)与野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置，

(viii)与野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置，

(ix)与野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置，

(x)与野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置，和

(xi)与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置。

在一些实施方案中，多肽包含：

(ii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置处的Tyr或Met，

(iii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置处的Thr或Ser，

(iv)在与野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置处的Asp、Glu或Phe，

(v)在与野生型犬IgG的氨基酸位置285对应的氨基酸位置处的Asn或Asp，

(vi)在与野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置处的Arg、Gln或Ala，

(vii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置处的Pro，

(viii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置处的Val，

(ix)在与野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置处的Asp，

(x)在与野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置处的Lys，和

(xi)在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、His、Ser、Ala或Phe。

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置，

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置，

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置，和

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置。

在一些实施方案中，多肽包含：

(i)在与野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置处的Tyr或Met，

(ii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置处的Thr或Ser，

(iii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置处的Asp、Glu或Phe，和/或

(iv)在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、His、Ser、Ala或Phe。

在一些实施方案中，多肽包含：

(i)在与野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置处的Tyr，

(ii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置处的Thr，

(iii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置处的Glu，和/或

(iv)在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg或His。

在一些实施方案中，多肽还包含以下中的至少一项：

(i)氨基酸位置252处的Tyr、氨基酸位置254处的Thr和氨基酸位置256处的Glu；

(ii)氨基酸位置428处的Leu和氨基酸位置434处的Ser；

(iii)氨基酸位置256处的Asp、氨基酸位置307处的Arg和氨基酸位置311处的Val；

(iv)氨基酸位置256处的Asp、氨基酸位置315处的Asp和氨基酸位置378处的Val；

(v)氨基酸位置256处的Asp、氨基酸位置286处的Asp、Tyr、Phe、Leu或Trp、氨基酸位置307处的Arg和氨基酸位置311处的Val；

(vi)氨基酸位置285处的Asn、氨基酸位置307处的Gln和氨基酸位置315处的Asp；

(vii)氨基酸位置256处的Asp、氨基酸位置307处的Arg、氨基酸位置311处的Val和氨基酸位置378处的Val；

(viii)氨基酸位置285处的Asp、氨基酸位置311处的Val和氨基酸位置378处的Val；

(ix)氨基酸位置256处的Asp、氨基酸位置285处的Asp和氨基酸位置378处的Val；

(x)氨基酸位置256处的Asp、氨基酸位置311处的Val和氨基酸位置378处的Val；

(xi)氨基酸位置256处的Asp、氨基酸位置285处的Asp、氨基酸位置286处的Asp、Tyr、Phe、Leu或Trp、氨基酸位置307处的Arg和氨基酸位置378处的Val；

(xii)氨基酸位置256处的Asp、氨基酸位置286处的Asp、Tyr、Phe、Leu或Trp、氨基酸位置307处的Arg、氨基酸位置311处的Val和位置378处的Val；

(xiii)氨基酸位置307处的Gln、氨基酸位置311处的Val和氨基酸位置378处的Val；

(xiv)氨基酸位置285处的Asp、氨基酸位置307处的Gln和氨基酸位置378处的Val；

(xv)氨基酸位置256处的Asp、氨基酸位置285处的Asp、氨基酸位置307处的Arg、氨基酸位置311处的Val和氨基酸位置378处的Val；

(xvi)氨基酸位置307处的Gln、氨基酸位置380处的Ala、氨基酸位置434处的Ser或Ala；

(xvii)氨基酸位置428处的Leu和氨基酸位置434处的Ser或Ala；或

(xviii)氨基酸位置250处的Gln和氨基酸位置428处的Leu。

在一些方面，本公开提供了包含犬IgG Fc区变体或其犬FcRn结合区的多肽，其中所述多肽在选自由以下组成的组的两个或更多个位置处包含氨基酸取代：

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置；

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置312对应的位置；

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的位置；

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的位置；以及

(v)与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的位置，

其中所述氨基酸位置基于EU编号，并且其中当与野生型犬IgG的Fc结构域相比时，所述多肽对犬FcRn的结合亲和力增加。

在一些实施方案中，在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置处的氨基酸取代选自T286L、T286Y和任何前述的保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，如权利要求1所述的多肽，其中在与野生型犬IgG的氨基酸位置312对应的位置处的氨基酸取代是D312P或其保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，在与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的位置处的氨基酸取代选自A426Y、A426H和任何前述的保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的位置处的氨基酸取代是N434R或其保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，在与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的位置处的氨基酸取代是Y436H或其保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，多肽包含在与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的位置处的氨基酸取代。

在一些实施方案中，多肽在选自由以下组成的组的两个或更多个位置处包含氨基酸取代：

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置426和286对应的位置；

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置426和312对应的位置；

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置426和434对应的位置；

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置426和436对应的位置；以及

(v)与野生型犬IgG的氨基酸位置286、426和436对应的位置。

在一些实施方案中，多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：

(i)A426Y和T286L；

(ii)A426Y和D312P；

(iii)A426Y和Y436H；

(iv)A426H和T286L；

(v)A426H和T286Y；

(vi)A426H和D312P；和

(vii)T286L、A426Y和Y436H。

在一些实施方案中，两个或更多个氨基酸取代选自由以下组成的组：

(i)A426Y与T286L、D312P、N434R和Y436H中的一个或多个的组合；

(ii)A426H与T286L、T286Y、D312P、N434R和Y436H中的一个或多个的组合；以及

(iii)N434R与T286L、T286Y、D312P和Y436H中的一个或多个的组合。

在一些实施方案中，野生型犬IgG是包含具有与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列的Fc结构域的犬IgGA，包含具有与SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列的Fc结构域的犬IgGB，包含具有与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列的Fc结构域的犬IgGC，或包含具有与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列的Fc结构域的犬IgGD。

在一些实施方案中，野生型犬IgG是犬IgGA，并且犬IgG Fc区变体或其犬FcRn结合区包含与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型犬IgG是犬IgGB，并且犬IgG Fc区变体或其犬FcRn结合区包含与SEQID NO:10至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型犬IgG是犬IgGC，并且犬IgG Fc区变体或其犬FcRn结合区包含与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，野生型犬IgG是犬IgGD，并且犬IgG Fc区变体或其犬FcRn结合区包含与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，野生型犬IgG是犬IgGA，并且犬IgG Fc区变体或其犬FcRn结合区包含与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，野生型犬IgG是犬IgGB，并且犬IgG Fc区变体或其犬FcRn结合区包含与SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，野生型犬IgG是犬IgGC，并且犬IgG Fc区变体或其犬FcRn结合区包含与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，野生型犬IgG是犬IgGD，并且犬IgG Fc区变体或其犬FcRn结合区包含与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，多肽还包含结合结构域。

在一些实施方案中，结合结构域包含(i)免疫球蛋白分子的六个互补决定区(CDR)；(ii)犬受体蛋白的配体结合结构域，(iii)纳米抗体，或(iv)犬受体蛋白的细胞外结构域。

在一些实施方案中，结合结构域特异性结合选自由以下组成的组的抗原：NGF、TrKA、ADAMTS、IL-1、IL-2、IL-4、IL-4R、血管紧张素1型(AT1)受体、血管紧张素2型(AT2)受体、IL-5、IL-12、IL-13、IL-31、IL-33、CD3、CD20、CD47、CD52和补体系统复合物。

在一些实施方案中，多肽还包含选自由以下组成的组的蛋白质：EPO、CTLA4、LFA3、VEGFR1/VEGFR3、IL-1R、IL-4R、GLP-1受体激动剂和血小板生成素结合肽。

在一些实施方案中，在结合测定中，多肽在酸性pH下以比在中性pH下更高的水平结合犬FcRn。在一些实施方案中，在结合测定中，多肽在pH 5.5下以比在pH 7.4下更高的水平结合犬FcRn。在一些实施方案中，在结合测定中，多肽在pH 6.0下以比在pH 7.4下更高的水平结合犬FcRn。

在一些实施方案中，多肽具有：(1)与一种或多种对照多肽相比在狗中增加的半衰期，其中所述一种或多种对照多肽除了具有相应的野生型犬IgG Fc区代替IgG Fc区变体之外与所述一种或多种多肽相同；和/或(2)与对照多肽相比与犬FcRn的结合增加；并且其中所述氨基酸位置基于EU编号。

在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些方面，本公开提供了药物组合物，所述药物组合物包含(i)本文所述的多肽和(ii)药学上可接受的赋形剂。

在一些方面，本公开提供了编码本文所述的多肽的一种或多种核酸。

在一些方面，本公开提供了包含本文所述的一种或多种核酸的一种或多种表达载体。

在一些方面，本公开提供了包含本文所述的一种或多种核酸或本文所述的一种或多种表达载体的宿主细胞。

在一些方面，本公开提供了制备一种或多种多肽的方法，所述方法包括：

(a)提供本文所述的一种或多种核酸；

(b)在宿主细胞培养物中表达所述一种或多种核酸，从而产生所述多肽；以及

(c)从所述宿主细胞培养物收集在(b)中产生的多肽。

在一些实施方案中，方法还包括将所述多肽配制成药物制剂。

在一些方面，本公开提供了治疗有需要的狗的犬疾病或病症的方法，所述方法包括向所述狗施用有效量的包含本文所述的药物组合物的组合物。

在一些方面，本公开提供了预防有需要的狗的犬疾病或病症的方法，所述方法包括向所述狗施用有效量的包含本文所述的药物组合物的组合物。

在一些方面，本公开提供了本文所述的药物组合物，其用于治疗有需要的狗的犬疾病或病症的方法中。

在一些方面，本公开提供了本文所述的药物组合物，其用于预防有需要的狗的犬疾病或病症的方法中。

在一些方面，本公开提供了本文所述的多肽在制造用于治疗有需要的狗的犬疾病或病症的药物中的用途。

在一些方面，本公开提供了本文所述的多肽在制造用于预防有需要的狗的犬疾病或病症的药物中的用途。

在一些实施方案中，疾病或病症是变应性疾病、慢性疼痛、急性疼痛、炎性疾病、自身免疫性疾病、内分泌疾病、胃肠疾病、心血管疾病、肾病、生育相关病症、感染性疾病或癌症。

在一些实施方案中，疾病或病症是特应性皮炎、变应性皮炎、骨关节炎性疼痛、关节炎、贫血或肥胖症。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但下文描述了示例性方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以引用的方式整体并入本文。在冲突的情况下，以本申请(包括定义)为准。所述材料、方法和示例仅是说明性的而不是旨在限制。

本发明的其他特征和优点将从下面的详细描述和权利要求中显而易见。

附图说明

图1是犬IgGγ链的氨基酸序列比对。这些链含有V_H、CH1、CH2和CH3结构域以及在CH1和CH2之间的铰链区。N-糖基化位点以粗体显示并以块标记。这些序列分别被指定为SEQID NO:13、14、15和16。

图2是犬IgGγ链的CH2区的氨基酸序列比对。这些序列分别被指定为SEQ ID NO:1、2、3和4。被取代以增加半衰期的残基由下划线标识。

图3是犬IgGγ链的CH3区的氨基酸序列比对。这些序列分别被指定为SEQ ID NO:5、6、7和8。被取代以增加半衰期的残基由下划线标识。

图4是犬IgGγ链的Fc区的氨基酸序列比对。这些序列分别被指定为SEQ ID NO:9、10、11和12。被取代以增加半衰期的残基由下划线标识。

图5是提供犬IgG的CH2区的EU编号的表格。

图6是提供犬IgG的CH3区的EU编号的表格。

图7A-7U描绘了来自丙氨酸扫描诱变实验的Biacore传感图。每个图中较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图8A-8C描绘了在位置250处来自NNK文库的野生型和不同变体的Biacore传感图。每个图中较亮的线代表测量数据，较暗的线是使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图9A-9C描绘了在位置252处来自NNK文库的野生型和不同变体的Biacore传感图。每个图中较亮的线代表测量数据，较暗的线是使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图10A和10B描绘了野生型和变体A254T的Biacore传感图。较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图11A和11B描绘了野生型和变体G309P的Biacore传感图。较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图12A和12B描绘了野生型和变体Q311V的Biacore传感图。较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图13A和13B描绘了野生型和变体D378V的Biacore传感图。较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图14A和14B描绘了野生型和变体E380A的Biacore传感图。较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图15A-15F描绘了在位置434处来自NNK文库的野生型和不同变体的Biacore传感图。较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图16A-16E描绘了浓度系列中不同变体的Biacore传感图。所用的犬FcRn的浓度为100nM(白色圆圈)、200nM(黑色圆圈)、400nM(黑色三角形)和800nM(白色三角形)。每个图中较亮的线是测量数据，较暗的线是使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图17A-17B描绘了不同变体的Biacore NNK文库传感图。所用的犬FcRn的浓度为200nM。每个图中较亮的线是测量数据，较暗的线是使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图18A-18B描绘了浓度系列中不同变体的Biacore传感图。所用的犬FcRn的浓度分别为(从底部到顶部的线)：100nM、200nM、400nM和800nM。所述线是使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图19A-19C显示了IgGA野生型、IgGA A426Y变体和IgGA A426H变体在pH 6.0下与犬FcRn结合的Biacore传感图。所用的犬FcRn的浓度为50nM(白色正方形)、100nM(黑色圆圈)、200nM(白色圆圈)、400nM(黑色三角形)和800nM(白色三角形)。每个传感图中较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图20A-20F显示了野生型犬IgGB Fc、犬IgGB Fc的单一变体(A426Y)和组合变体在pH 6.0下与犬FcRn结合的Biacore传感图。用于野生型IgG的犬FcRn的浓度为200nM(白色圆圈)、400nM(黑色三角形)、800nM(白色三角形)、1600nM(黑色菱形)和3200nM(白色菱形)。用于其余变体的犬FcRn的浓度为50nM(白色正方形)、100nM(黑色圆圈)、200nM(白色圆圈)、400nM(黑色三角形)和800nM(白色三角形)。每个传感图中较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图21A-21F显示了犬IgGB Fc的单一变体(A426H)和组合变体在pH 6.0下与犬FcRn结合的Biacore传感图。用于A426H-N434R IgG变体的犬FcRn的浓度为200nM(白色圆圈)、400nM(黑色三角形)、800nM(白色三角形)、1600nM(黑色菱形)和3200nM(白色菱形)。用于其余变体的犬FcRn的浓度为50nM(白色正方形)、100nM(黑色圆圈)、200nM(白色圆圈)、400nM(黑色三角形)和800nM(白色三角形)。每个传感图中较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图22A-22E显示了犬IgGB Fc的单一变体(N434R)和组合变体在pH 6.0下与犬FcRn结合的Biacore传感图。用于变体的犬FcRn的浓度为50nM(白色正方形)、100nM(黑色圆圈)、200nM(白色圆圈)、400nM(黑色三角形)和800nM(白色三角形)。每个传感图中较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图23显示了犬IgGB Fc的N434Y变体在pH 6.0下与犬FcRn结合的Biacore传感图。用于变体的犬FcRn的浓度为50nM(白色正方形)、100nM(黑色圆圈)、200nM(白色圆圈)、400nM(黑色三角形)和800nM(白色三角形)。每个传感图中较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图24A-24F显示了野生型犬IgGB Fc、IgGB Fc的单一变体(A426Y)和组合变体在pH7.4下与犬FcRn结合的Biacore传感图。每个传感图中较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图25A-25F显示了IgGB Fc的单一变体(A426H)和组合变体在pH 7.4下与犬FcRn结合的Biacore传感图。每个传感图中较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图26A-26E显示了IgGB Fc的单一变体(N434R)和组合变体在pH 7.4下与犬FcRn结合的Biacore传感图。每个传感图中较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图27显示了IgGB Fc的N434Y变体在pH 7.4下与犬FcRn结合的Biacore传感图。较亮的线代表测量数据，较暗的线代表使用1:1相互作用模型的拟合曲线。

图28是犬IgGB Fc与人IgG1 Fc的氨基酸序列比对。为了产生犬Fc变体而进行的氨基酸取代的位置(根据EU编号)加下划线。

图29显示了携带单个氨基酸取代或氨基酸取代组合的犬抗神经生长因子(NGF)IgGB Fc变体在静脉内施用于雄性(M)和雌性(F)小猎犬后的终末半衰期(天；Y轴)。将动物随机分成八个组，其中每组中有一只雄性和一只雌性。向每只动物施用单次静脉内剂量为2mg/kg的抗体，并且在以下时间点收集大约1.5ml全血：0小时(给药前)、注射后4小时和1天、2天、4天、6天、10天、14天、18天、22天、30天、34天、38天、42天。从全血中分离血清并且通过ELISA测定抗NGF抗体的存在。使用PKSolver对每个单独血清抗体测量进行非房室PK分析(NCA)(Yong Zhang等人,Comput.Methods Prog rams Biomed.；2010年9月；99(3):306-14.doi:10.1016/j.cmpb.2010.01.007)。

图30A-30K显示了IgGB的不同变体在pH 5.9下与犬FcRn结合的Biacore传感图。

图31是使用非线性混合效应建模的具有线性清除率的二房室药代动力学(PK)模型的示意性图示。

图32A-32B显示了IgGB的不同变体随时间推移的血清浓度。

图33显示了携带野生型IgGB Fc或IgGB变体A426Y、A426Y+Y436H、A426Y+Y436H+T286L、N434R、N434Y和YTE的抗体的预测血清浓度曲线。

图34显示了286、426和436的犬Fc位置的结构模型。

图35显示了A426H的犬Fc位置的结构模型。左侧结构是FcRn大亚基p51，其中WT结构以深灰色显示，并且突变体结构以浅灰色显示。右侧结构是IgGB Fc，其中WT结构以深灰色显示，并且突变体结构以浅灰色显示。

图36显示了A426Y的犬Fc位置的结构模型。左侧结构是FcRn大亚基p51，其中WT结构以深灰色显示，并且突变体结构以浅灰色显示。右侧结构是IgGB Fc，其中WT结构以深灰色显示，并且突变体结构以浅灰色显示。

图37显示了Y436H的犬Fc位置的结构模型。左侧结构是FcRn大亚基p51，其中WT结构以深灰色显示，并且突变体结构以浅灰色显示。右侧结构是IgGB Fc，其中WT结构以深灰色显示，并且突变体结构以浅灰色显示。

图38显示了T286L的犬Fc位置的结构模型。左侧结构(上部)为β2微球蛋白，其中WT结构以深灰色显示并且突变体结构以浅灰色显示；和FcRn大亚基p51(下部)，其中WT结构以深灰色显示并且突变体结构以浅灰色显示。右侧结构是IgGB Fc，其中WT结构以深灰色显示，并且突变体结构以浅灰色显示。

图39显示了T286L、A426Y和Y436H的犬Fc位置的结构模型。左侧结构是β2微球蛋白和FcRn大亚基p51。右侧结构是IgGB Fc。

具体实施方式

随着多肽(例如，抗体、受体的配体结合结构域、酶、配体、肽)作为用于预防和治疗多种犬疾病的治疗剂的用途的增加，开发具有延长半衰期的多肽特别是用于预防或治疗其中必须重复施用多肽的慢性疾病很重要。

因此，本公开的特征在于犬免疫球蛋白Fc区或其犬FcRn结合区，所述犬免疫球蛋白Fc区或其犬FcRn结合区包含增强含有这些序列的一种或多种多肽的半衰期的突变。还公开了包含这些结构域的多肽及它们的使用方法。这些肽可以用于各种治疗和诊断目的。

在以范围的形式描述值的情况下，应当理解，所述描述包括在此类范围内的所有可能的子范围的公开内容，以及落入此类范围内的具体数值，而不管具体数值或具体子范围是否被明确地陈述。所有数字指定(例如，pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围)是近似值，其变化(+)或(-)1.0或0.1的增量(视情况而定)或者可替代地变化+/-15％、或者可替代地10％、或者可替代地5％或者可替代地2％。应当理解，尽管并不总是明确指出，但是所有数字指定前面都有术语“约”。还应理解，尽管不总是明确说明，本文所述的试剂仅是示例性的并且此类试剂的等效物是本领域已知的。

如本文所用的术语“约”当是指可测量的值诸如量或浓度等时，意指涵盖指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。

犬抗体

狗具有四条IgG重链，称为A、B、C和D。这些重链代表狗IgG的四个不同亚类，它们被称为IgGA、IgGB、IgGC和IgGD。这些重链的氨基酸和DNA序列可从Tang等人,Vet.Immunol.Immunopathol.,80:259-270(2001)以及GENBANK数据库获得。例如，IgGA重链的氨基酸序列具有GENBANK登录号AAL35301.1，IgGB具有GENBANK登录号AAL35302.1，IgGC具有GENBANK登录号AAL35303.1，并且IgGD具有GENBANK登录号AAL35304.1。犬抗体还包括两种类型的轻链：κ和λ。这些轻链的DNA和氨基酸序列也可以从GENBANK数据库获得。例如，狗κ轻链氨基酸序列具有登录号ABY57289.1，并且狗λ轻链具有登录号ABY55569.1。

犬Fc区的CH2区：

犬抗体的CH2区包含犬IgG抗体的氨基酸237至340(根据EU编号)或由其组成。应理解，CH2区可以在其N和/或C末端包括一个至六个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个)另外的氨基酸或缺失。

犬IgGA的CH2区的氨基酸序列提供如下：

GPSVLI FPPKPKDILR ITRTPEVTCV VLDLGREDPE VQISW FVDGK EVHTAKTQSREQQFNGTYRV VSVLPIEHQD WLTGKE FKCR VNHIDLPSPI ERTISKAR(SEQ ID NO:1)

犬IgGB的CH2结构域的氨基酸序列提供如下：

GPSVFIFPPK PKDTLLIART PEVTCVVVDL DPEDPEVQIS WFVDGKQMQT AKTQPREEQFNGTYRVVSVL PIGHQDWLKG KQFTCKVNNK ALPSPIERTI SKAR(SEQ ID NO:2)

犬IgGC的CH2结构域的氨基酸序列提供如下：

GPSVFIFPP KPKDILVTAR TPTVTCVVVD LDPENPEVQI SWFVDSKQVQ TANTQPREEQSNGTYRVVSV LPIGHQDWLS GKQFKCKVNN KALPSPIEEI ISKTP(SEQ ID NO:3)

犬IgGD的CH2结构域的氨基酸序列提供如下：

GPSV FIFPPKPKDI LRITRTPEIT CVVLDLGRED PEVQISWF VD GKEVHTAKTQPREQQFNSTY RVVSVLPIEH QDWLTGKEF K CRVNHIGLPS PIERTISKAR(SEQ ID NO:4)

犬Fc区的CH3区：

犬抗体的CH3区包含犬IgG抗体的氨基酸345至447(根据EU编号)或由其组成。应理解，CH3区可以在其N和/或C末端包括一个至六个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个)另外的氨基酸或缺失。

犬IgGA的CH3结构域的氨基酸序列提供如下：

KPSVYVLP PSPKELSSSD TVSITCLIKD FYPPDIDVEW QSNGQQEPER KHRMTPPQLDEDGSYFLYSK LSVDKSRWQQ GDPFTCAVMH ETLQNHYTDL SLSHSPGK(SEQ ID NO:5)

犬IgGB的CH3结构域的氨基酸序列提供如下：

QP SVYVLPPSRE ELSKNTVSLT CLIKDFFPPD IDVEWQSNGQ QEPESKYRTT PPQLDEDGSYFLYSKLSVDK SRWQRGDTFI CAVMHEALHN HYTQESLSHS PGK(SEQ ID NO:6)

犬IgGC的CH3结构域的氨基酸序列提供如下：

Q PNVYVLPPSR DEMSKNTVTL TCLVKDFFPP EIDVEWQS NG QQEPESKYRM TPPQLDEDGSYFLYSKLSVD KSRWQRGDT F ICAVMHEALH NHYTQISLSH SPGK(SEQ ID NO:7)

犬IgGD的CH3结构域的氨基酸序列提供如下：

QPSVYV LPPSPKELSS SDTVTLTCLI KDFFPPEIDV EWQSN GQPEP ESKYHTTAPQLDEDGSYFLY SKLSVDKSRW QQGDTF TCAV MHEALQNHYT DLSLSHSPGK(SEQ ID NO:8)

犬Fc区的Fc区：

犬IgG抗体的Fc区包含犬IgG抗体的氨基酸231至447(根据EU编号)或由其组成。

犬IgGA的Fc结构域的氨基酸序列提供如下：

VPEPLGGPSVLI FPPKPKDILR ITRTPEVTCV VLDLGREDPEVQISWFVDGK EVHTAKTQSREQQFNGTYRV VSVLPIEHQDWLTGKEFKCR VNHIDLPSPI ERTISKARGR AHKPSVYVLP PSPKELSSSDTVSITCLIKD FYPPDIDVEW QSNGQQEPER KHRMTPPQLD EDGSYFLYSK LSVDKSRWQQ GDPFTCAVMHETLQNHYTDL SLSHSPGK(SEQ ID NO:9)

犬IgGB的Fc结构域的氨基酸序列提供如下：

APEMLGGPSVFIFPPK PKDTLLIART PEVTCVVVDL DPEDPEVQIS WFVDGKQMQTAKTQPREEQF NGTYRVVSVL PIGHQDWLKG KQFTCKVNNK ALPSPIERTI SKARGQAHQP SVYVLPPSREELSKNTVSLT CLIKDFFPPD IDVEWQSNGQ QEPESKYRTTPPQLDEDGSY FLYSKLSVDK SRWQRGDTFICAVMHEALHN HYTQESLSHS PGK(SEQ ID NO:10)

犬IgGC的Fc结构域的氨基酸序列提供如下：

GCGLLGGPSVFIFPP KPKDILVTAR TPTVTCVVVD LDPENPEVQI SWFVDSKQVQTANTQPREEQ SNGTYRVVSV LPIGHQDWLS GKQFKCKVNN KALPSPIEEI ISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTL TCLVKDFFPP EIDVEWQSNG QQEPESKYRM TPPQLDEDGS YFLYSKLSVDKSRWQRGDTF ICAVMHEALH NHYTQISLSH SPGK(SEQ ID NO:11)

犬IgGD的Fc结构域的氨基酸序列提供如下：

VPESLGGPSV FIFPPKPKDI LRITRTPEIT CVVLDLGRED PEVQISWFVD GKEVHTAKTQPREQQFNSTY RVVSVLPIEH QDWLTGKEFK CRVNHIGLPS PIERTISKAR GQAHQPSVYV LPPSPKELSSSDTVTLTCLI KDFFPPEIDV EWQSNGQPEP ESKYHTTAPQLDEDGSYFLY SKLSVDKSRW QQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK(SEQ ID NO:12)

犬IgG Fc中的提高半衰期的取代

增加的血清持久性是治疗性多肽的有益特性。本公开的特征在于相对于一种或多种对照多肽增加包含这些Fc区的一种或多种多肽在狗中的半衰期的在野生型犬IgGA、IgGB、IgGC和IgGD Fc区中的取代，其中所述一种或多种对照多肽与所述一种或多种多肽相同，除了具有相应的野生型犬IgG Fc区代替IgG Fc区变体。增加半衰期的取代可以在犬CH2区、犬CH3区或在犬Fc(例如，CH2+CH3)区的上下文中的一个或多个中进行。

本公开提供了包含犬IgG的Fc结构域或其犬FcRn结合区的多肽，其中所述多肽包含在选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸取代：

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置；

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置312对应的位置；

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的位置；以及

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的位置；

其中在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置处的氨基酸取代选自由Tyr、Phe、Leu和Trp组成的组，其中所述氨基酸位置基于EU编号，并且其中当与野生型犬IgG的Fc结构域相比时，所述多肽对犬FcRn的结合亲和力增加。在一些实施方案中，当在结合测定中与野生型犬IgG的Fc结构域相比时，所述多肽在约5.0至约6.5(例如，约5.5或约6.0)的pH下对犬FcRn的结合亲和力增加。在一些实施方案中，结合测定是指比较例如本文所述的多肽变体在约5.0至约6.5的pH下对犬FcRn的结合亲和力与野生型犬IgG在相同pH(例如，约5.0至约6.5的pH)下对犬FcRn的结合亲和力的测定。在一些实施方案中，使用相当的条件进行结合测定。在一些实施方案中，结合测定是表面等离子体共振(SPR)测定。

在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包括在与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的氨基酸位置处包含His。

在一些实施方案中，多肽包含与选自由SEQ ID NO:9至12组成的组的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。

在一些情况下，本公开提供了犬IgG CH2区变体，其包含与SEQ ID NO:1至4中任一者所示的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。还提供了犬IgG CH2区变体，其包含与SEQID NO:1至4中的任一者有1个至15个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个)氨基酸不同的氨基酸序列。

在其他情况下，本公开的特征在于犬IgG CH3区变体，其包含与SEQ ID NO:5至8中任一者所示的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。特征还在于犬IgG CH3区变体，其包含与SEQ ID NO:5至8中的任一者有1个至15个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个)氨基酸不同的氨基酸序列。

在某些情况下，本公开的特征在于犬IgG Fc区变体，其包含与SEQ ID NO:9至12中任一者所示的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。还公开了犬IgG Fc区变体，其包含与SEQ ID NO:9至12中的任一者有1个至20个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个)氨基酸不同的氨基酸序列。

在一些情况下，犬IgG Fc CH2区变体中的以下区域中的至少一个(例如，1个、2个或3个)与野生型犬IgG Fc CH2区中的相应区域相同：

氨基酸位置250-256；

氨基酸位置285-288；和

氨基酸位置307-315，

其中所述氨基酸位置基于EU编号。在一些情况下，犬IgG Fc CH2区变体中的所有上述区域与野生型犬IgG Fc CH2区中的相应区域相同。

在一些情况下，犬IgG Fc CH3区变体中的以下区域中的至少一个(例如，1个或2个)与野生型犬IgG Fc CH3区中的相应区域相同：

氨基酸位置376-380；和

氨基酸位置428-436，

其中所述氨基酸位置基于EU编号。在一些情况下，犬IgG Fc CH3区变体中的所有上述区域与野生型犬IgG Fc CH3区中的相应区域相同。

在一些情况下，犬IgG Fc变体中的以下区域中的至少一个(例如，1个、2个、3个、4个或5个)与野生型犬IgG Fc中的相应区域相同：

氨基酸位置250-256；

氨基酸位置285-288；

氨基酸位置307-315；

氨基酸位置376-380；和

氨基酸位置428-436，

其中所述氨基酸位置基于EU编号。在一些情况下，犬IgG Fc变体中的所有下列区域与野生型犬IgG Fc中的相应区域相同。

氨基酸位置250-256；

氨基酸位置285、287和288；

氨基酸位置307-315；

氨基酸位置376-380；和

氨基酸位置428-436，

在一些实施方案中，提供了包含犬IgG Fc CH2区变体的一种或多种多肽，所述CH2区变体包含与SEQ ID NO:1至4中任一者所示的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，特征在于包含犬IgG Fc CH3区变体的一种或多种多肽，所述CH3区变体包含与SEQ ID NO:5至8中任一者所示的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，特征在于包含犬IgG Fc区变体的一种或多种多肽，所述Fc区变体包含与SEQ ID NO:9至12中任一者所示的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，多肽包含：

(i)在与野生型犬IgG的氨基酸位置312对应的氨基酸位置处的Pro；和/或

(ii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的氨基酸位置处的Tyr、His或Phe；和/或

(iii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处的Tyr、Phe、Leu和Trp。

在一些实施方案中，多肽包含：

在与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的氨基酸位置处的Tyr；和/或

在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处的Tyr、Phe、Leu和Trp。

在一些实施方案中，多肽包含：

(ii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的氨基酸位置处的His；和/或

如在别处指出的，在一些实施方案中，多肽还包含在与野生型犬IgG的氨基酸位置250-256、氨基酸位置285-288、氨基酸位置307-315、氨基酸位置376-380或氨基酸位置428-436对应的区域中的至少一个另外的氨基酸取代，其中所述氨基酸位置基于EU编号，并且其中所述多肽与野生型犬IgG的Fc结构域相比与犬FcRn的结合增加。

在一些实施方案中，多肽还包含在与野生型犬IgG的氨基酸位置250-256、氨基酸位置285、287和288、氨基酸位置307-315、氨基酸位置376-380、或氨基酸位置428-436对应的区域中的至少一个另外的氨基酸取代，其中所述氨基酸位置基于EU编号，并且其中所述多肽与野生型犬IgG的Fc结构域相比与犬FcRn的结合增加。本公开涵盖的至少一个另外的氨基酸取代包括表1中公开的那些中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个)。

表1

在一些情况下，本公开涵盖的至少一个另外的氨基酸取代包括表2中公开的那些取代中的一个或多个(例如，1个、2个、3个或4个)。

表2

上文所公开的取代的所有可能组合和排列都由本公开所涵盖。在一些情况下，所述多肽包含选自由以下组成的组的至少一个(例如，两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个)另外的氨基酸取代：

(ii)氨基酸位置428处的Leu和氨基酸位置434处的Ser；

(xii)氨基酸位置256处的Asp、氨基酸位置286处的Asp、氨基酸位置307处的Arg、氨基酸位置311处的Val和位置378处的Val；

(xvii)氨基酸位置428处的Leu和氨基酸位置434处的Ser或Ala；

(xviii)氨基酸位置250处的Gln和氨基酸位置428处的Leu；

(xix)氨基酸位置250处的Glu和氨基酸位置251处的Glu；

(xx)氨基酸位置256处的Phe和氨基酸位置309处的Phe；

(xxi)氨基酸位置430处的Ala和氨基酸位置433处的Lys；

(xxii)氨基酸位置434处的Phe和氨基酸位置436处的His；和

(xxiii)氨基酸位置435处的Tyr和氨基酸位置436处的His；

在一些情况下，所述取代不包括氨基酸位置252处的Tyr、氨基酸位置254处的Thr和氨基酸位置256处的Glu的组合。

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置250对应的氨基酸位置，

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置251对应的氨基酸位置，

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置，

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置，

(v)与野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置，

(vi)与野生型犬IgG的氨基酸位置285对应的氨基酸位置，

(vii)与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置，

(viii)与野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置，

(ix)与野生型犬IgG的氨基酸位置308对应的氨基酸位置，

(x)与野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置，

(xi)与野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置，

(xii)与野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置，

(xiii)与野生型犬IgG的氨基酸位置378对应的氨基酸位置，

(xiv)与野生型犬IgG的氨基酸位置380对应的氨基酸位置，

(xv)与野生型犬IgG的氨基酸位置428对应的氨基酸位置，

(xvi)与野生型犬IgG的氨基酸位置430对应的氨基酸位置，

(xvii)与野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置，

(xviii)与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置，

(xix)与野生型犬IgG的氨基酸位置435对应的氨基酸位置，和

(xx)与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的氨基酸位置。

在一些实施方案中，多肽包含：

(xviii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、His、Ser、Ala或Phe，

(xix)在与野生型犬IgG的氨基酸位置435对应的氨基酸位置处的Tyr，和/或

(xx)在与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的氨基酸位置处的His。

在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包括在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处包含Tyr。在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处包含Phe。在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处包含Leu。在一些实施方案中，多肽在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处包含Trp。在一些实施方案中，多肽包含在选自由以下组成的组的位置处的至少一个另外的氨基酸取代：

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置250对应的氨基酸位置，

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置251对应的氨基酸位置，

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置，

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置，

(v)与野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置，

(vi)与野生型犬IgG的氨基酸位置285对应的氨基酸位置，

(vii)与野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置，

(viii)与野生型犬IgG的氨基酸位置308对应的氨基酸位置，

(ix)与野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置，

(x)与野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置，

(xi)与野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置，

(xii)与野生型犬IgG的氨基酸位置378对应的氨基酸位置，

(xiii)与野生型犬IgG的氨基酸位置380对应的氨基酸位置，

(xiv)与野生型犬IgG的氨基酸位置428对应的氨基酸位置，

(xv)与野生型犬IgG的氨基酸位置430对应的氨基酸位置，

(xvi)与野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置，

(xvii)与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置，

(xviii)与野生型犬IgG的氨基酸位置435对应的氨基酸位置，和

(xix)与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的氨基酸位置。

在一些实施方案中，多肽包含：

(xvii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、His、Ser、Ala或Phe，

(xviii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置435对应的氨基酸位置处的Tyr，和/或

(xix)在与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的氨基酸位置处的His。

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置250对应的氨基酸位置，

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置，

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置，

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置，

(v)与野生型犬IgG的氨基酸位置285对应的氨基酸位置，

(vi)与野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置，

(vii)与野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置，

(viii)与野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置，

(ix)与野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置，

(x)与野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置，

(xi)与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置，和

(xii)与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的氨基酸位置。

在一些实施方案中，多肽包含：

(x)在与野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置处的Lys，

(xi)在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、His、Ser、Ala或Phe，和

(xii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的氨基酸位置处的His。

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置，

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置，

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置，和

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置。

在一些实施方案中，多肽包含：

可以在CH2结构域、CH3结构域或Fc结构域的一条或两条链上进行取代。在一些情况下，在CH2结构域、CH3结构域或Fc结构域的两条链上的取代是相同的。在一些情况下，在CH2结构域、CH3结构域或Fc结构域的两条链上的取代是不相同的。在一些情况下，Fc区包含增加或降低效应子功能和/或改善产物异质性的一个或多个另外的取代。

本公开还提供了包含犬IgG Fc区变体或其犬FcRn结合区的多肽，其中所述多肽在选自由以下组成的组的两个或更多个(例如，两个、三个、四个或五个)位置处包含氨基酸取代：

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置；

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置312对应的位置；

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的位置；

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的位置；以及

(v)与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的位置，

本文所公开的取代的所有可能组合和排列都由本公开所涵盖。在一些实施方案中，两个或更多个氨基酸取代提供了协同效应，因为当与包含前述两个或更多个氨基酸取代中的仅一个的多肽相比时所述多肽对犬FcRn的结合亲和力增加。

在一些实施方案中，本文所述的多肽在除了与野生型犬IgG的位置286、312、426、434和436对应的那些位置之外的位置处包含至少一个另外的氨基酸取代。例如，本文所述多肽可以包括犬IgG的约1个、2个、3个、4个或5个至约30个或更少个另外的氨基酸取代。

在一些实施方案中，当与野生型犬IgG的Fc结构域相比时，所述多肽在约5.0至约6.5(例如，约5.5或约6.0)的pH下对犬FcRn的结合亲和力增加。确定FcRn结合亲和力的方法将是本领域技术人员熟悉的，其说明性示例在本文别处进行了描述。

可以适当地使用针对每个变量(例如，pH值、氨基酸取代的数目、氨基酸取代的位置、氨基酸取代的类型等)的相当或类似的测定来确定FcRn结合活性的差异。在该上下文中相当的测定是指基本上以相同或相似的方式操作以便最小化或以其他方式避免不必要的变量的测定，所述不必要的变量可能对测定进行的方式和独立于所评估的变量的结果具有显著影响。然而，应当理解，考虑到例如pH对测定进行的方式的影响，在例如pH 6.0下进行用于确定FcRn结合的测定所必需的条件可以不同于在pH 7.4下进行类似测定所必需的条件。在一些实施方案中，当使用相当的测定法与野生型犬IgG的Fc结构域相比时，所述多肽在约5.0至约6.5(例如，约5.5或约6.0)的pH下对犬FcRn的结合亲和力增加。

在一些实施方案中，在相当的测定中，多肽在酸性pH下以比在中性pH下更高的水平结合犬FcRn。在一些实施方案中，在相当的测定中，多肽在pH 5.5下以比在pH 7.4下更高的水平结合犬FcRn。在一些实施方案中，在相当的测定中，多肽在pH 6.0下以比在pH 7.4下更高的水平结合犬FcRn。

如本文所用的术语“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被具有类似性质诸如电荷、疏水性和大小的另一个氨基酸残基取代。在一些实施方案中，保守氨基酸取代是指导致与另一个氨基酸取代相似的性质或功能的取代。例如，A426Y的保守氨基酸取代可以是A426F或A426T。

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置426和286对应的位置；

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置426和312对应的位置；

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置426和434对应的位置；以及

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置426和436对应的位置。

(i)A426Y与T286L、T286Y、D312P、N434R和Y436H中的一个或多个的组合；

(iii)N434R与T286L、T286Y、D312P和Y436H中的一个或多个的组合。

(i)A426Y和T286L；

(ii)A426Y和D312P；

(iii)A426Y和Y436H；

(iv)A426H和T286L；

(v)A426H和T286Y；以及

(vi)A426H和D312P。

在一些情况下，本公开提供了犬IgG CH2区变体，其包含与SEQ ID NO:1至4中任一者所示的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。还提供了犬IgG CH2区变体，其包含与SEQID NO:1至4中任一者有1个至15个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个)氨基酸不同的氨基酸序列。

氨基酸位置250-256；以及

氨基酸位置307-311，

氨基酸位置376-380；和

氨基酸位置428-433，

氨基酸位置250-256；

氨基酸位置307-311；

氨基酸位置376-380；和

氨基酸位置428-433，

氨基酸位置250-256；

氨基酸位置285、287和288；

氨基酸位置307-311；

氨基酸位置376-380；和

氨基酸位置428-433，

可以与半衰期增强取代组合的其他取代

治疗性多肽/蛋白质(例如，单克隆抗体)的开发是复杂的过程，其需要协调一组复杂的活性以产生期望的多肽/蛋白质。这些包括对以下的优化：特异性、亲和力、功能活性、工程化细胞系中的表达水平、长期稳定性、效应子功能的消除或增强以及商业上可行的制造和纯化方法的开发。本公开涵盖在Fc区变体的一个或多个另外的氨基酸位置处的取代，其促进上述目标中的任何一个或多个。

在一些实施方案中，Fc区变体包含在一个或多个另外的氨基酸位置处的增加或降低效应子功能和/或改善产物异质性的氨基酸取代。

在一些实施方案中，引入取代以降低犬Fc区的效应子功能。此类取代可以在犬IgG的以下位置中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个)处(根据EU编号进行编号)：238、265、297、298、299、327和329。取代可以是其他19个氨基酸中的任何一个。在一些情况下，取代是保守的。在某些非限制性实例中，位置238处的取代的氨基酸是Ala；位置265处的取代的氨基酸是Ala；位置297处的取代的氨基酸是Ala或Gln；位置298处的取代的氨基酸是Pro；位置299处的取代的氨基酸是Ala；位置327处的取代的氨基酸是Gly；并且位置329处的取代的氨基酸是Ala。在一些情况下，变体Fc区来自犬IgGB或IgGC抗体。

在一些实施方案中，将取代引入野生型犬IgG Fc区以增强与蛋白A的结合，从而促进通过蛋白A色谱法的纯化。此类取代可以在犬IgG的以下位置中的一个或两个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个)处(根据EU编号进行编号)：252和254。取代可以是其他19个氨基酸中的任何一个。在一些情况下，取代是保守的。在某些非限制性实例中，位置252处的取代的氨基酸是Met；并且位置254处的取代的氨基酸是Ser。

在一些实施方案中，进行取代以与亲本多肽或野生型多肽相比改变对FcRn的结合亲和力(例如，以增加或降低与FcRn的结合亲和力)。在一些变化中，修饰可以是选自由308F、428L、434M和434S组成的组的一个、两个、三个或四个修饰，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，Fc变体包括选自由以下组成的组的一个或多个修饰：252Y/428L、428L/434H、428L/434F、428L/434Y、428L/434A、428L/434M和428L/434S，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，Fc变体包括选自由以下组成的组的一个或多个修饰：428L/434S、308F/428L/434S，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，Fc变体包括选自由以下组成的组的一个或多个修饰：259I/434S、308F/434S、308F/428L/434S、259I/308F/434S、307Q/308F/434S、250I/308F/434S和308F/319L/434S，其中编号是根据EU编号。在例如US8883973B2(其以引用的方式整体并入本文)中描述了这些修饰的详细描述。

在一些实施方案中，多肽包含犬抗体的铰链区。在一些实施方案中，可以对犬抗体的铰链区进行修饰以增加半衰期。在一些实施方案中，修饰是根据EU编号的228P。

在一些实施方案中，与FcRn的结合是pH依赖性的。H310和H435(EU编号)对于pH依赖性结合可以是关键的。因此，在一些实施方案中，位置310(EU编号)处的氨基酸是组氨酸。在一些实施方案中，位置435(EU编号)处的氨基酸是组氨酸。在一些实施方案中，两个位置处的氨基酸都是组氨酸。

在一些实施方案中，Fc区具有LALA突变(EU编号中的L234A和L235A突变)或LALA-PG突变(EU编号中的L234A、L235A、P329G突变)。在一些实施方案中，LALA突变是P234A、M234A或S234A。在一些实施方案中，位置234(EU编号)处的氨基酸残基是Ala。在一些实施方案中，位置234(EU编号)处的氨基酸残基是Ala。在一些实施方案中，位置234和235(EU编号)处的氨基酸残基是Ala。

包含犬IgG Fc变体的多肽

本公开涵盖可以受益于在狗中半衰期增加的任何多肽。为了增加半衰期，这些多肽被设计成包括上文所公开的Fc区变体(例如，CH2区、CH3区、CH2+CH3区)。

示例性多肽包括但不限于全抗体、scFv、纳米抗体、受体的配体结合部分、细胞因子、生长因子、酶和肽。例如，上文所公开的CH3结构域变体可以连接至scFv纳米抗体、受体的配体结合部分(例如，犬IL-13Rα1或IL-13Rα2的配体结合部分)、细胞因子、生长因子、酶或肽。如本文所用，术语“纳米抗体”、“VHH”、“VHH抗体片段”和“单结构域抗体”在本文中可互换使用以表示在骆驼科(Camelidae)中发现的那些类型的抗体(其通常天然地发现缺乏轻链)的单重链的可变结构域。本领域技术人员将熟悉合适的纳米抗体，其示例性示例包括骆驼、单峰驼、美洲驼和羊驼的纳米抗体。可替代地，上文所公开的Fc区变体可以与这些多肽连接。在另一个实施方案中，犬或犬源化抗体被修饰以包括本文所公开的Fc区变体。

在一些实施方案中，本公开的多肽包括抗体铰链区。铰链区可以位于多肽的抗原或配体结合结构域和Fc区变体之间。在一些情况下，铰链区连接至细胞因子、生长因子、酶或肽的C末端，并且铰链区连接至Fc区变体的N末端。下面提供了示例性铰链区序列。

IgGA：FNECRCTDTPPCPVPEP(SEQ ID NO:17)；

IgGB：PKRENGRVPRPPDCPKCPAPEM(SEQ ID NO:18)；

IgGC：AKECECKCNCNNCPCPGCGL(SEQ ID NO:19)；

IgGD：PKESTCKCISPCPVPES(SEQ ID NO:20)；和

IgGDmut：PKESTCKCIPPCPVPES(SEQ ID NO:21)。

在本公开的重组蛋白中的铰链区(如果使用的话)包括相对于SEQ ID NO:17-21所示的氨基酸序列的零个至六个(即，0个、1个、2个、3个、4个、5个、或6个)氨基酸取代。在一些情况下，本公开的重组蛋白中使用的铰链区与SEQ ID NO:17-21中任一者所示的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。

在一些实施方案中，可以使用接头序列代替抗体铰链序列以将多肽(例如，抗体、受体的配体结合结构域、酶、配体、肽)与本文所公开的犬Fc区变体连接。在某些实施方案中，接头由通过肽键连接的1个至20个氨基酸组成，其中所述氨基酸选自20个天然存在的氨基酸。如本领域技术人员所熟知的，这些氨基酸中的一些可以是糖基化的。在其他实施方案中，1个至20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在其他实施方案中，接头由大部分空间上不受阻的氨基酸(诸如甘氨酸和丙氨酸)组成。肽接头的示例包括：Gly、Ser；Gly Ser；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:22)；Ser Gly Gly Gly(SEQ ID NO:23)；Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:24)；Ser Gly GlyGly Gly(SEQ ID NO:25)；Gly Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:26)；Ser Gly Gly GlyGly Gly(SEQ ID NO:27)；Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:28)；Ser Gly GlyGly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:29)；(Gly Gly Gly Gly Ser)_n(SEQ IDNO:24)n，其中n是一或更大的整数(例如，1、2、3、4、5)；和(Ser Gly Gly Gly Gly)_n(SEQ ID NO:25)n，其中n是一或更大的整数(例如，1、2、3、4、5)。

非肽接头也可以用于将感兴趣的一种或多种多肽与本文所公开的Fc区变体连接。例如，可以使用烷基接头诸如-NH(CH₂)_nC(O)-，其中n＝2-20。这些烷基接头可以进一步被任何非空间受阻基团取代，所述非空间受阻基团诸如低级烷基(例如，C₁-C₆)低级酰基、卤素(例如，Cl、Br)、CN、NH₂、苯基等。

本公开的一种或多种多肽可以包含结合结构域。结合结构域可以特异性地结合本文所述的所选靶标的蛋白质、亚基、结构域、基序和/或表位。在一些实施方案中，一种或多种多肽(例如，融合多肽)可以包含蛋白质，其中所述蛋白质是本文所述的治疗性蛋白质。在一些实施方案中，靶标(例如，对于结合结构域的靶标)或治疗性蛋白质(例如，对于融合多肽)选自由以下组成的组：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAMS、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、IgE、血管紧张素1型(AT1)受体、血管紧张素2型(AT2)受体、ARC、ART、神经鞘胚素(Artemin)、抗Id、天门冬氨酸(ASPARTIC)、心钠素、av/b3整合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B淋巴细胞刺激剂(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3成骨素、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、铃蟾肽、骨衍生神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CC1、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD47、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒梭菌毒素、产气荚膜梭菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、衰变加速因子、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、DNA酶、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)、ENA、内皮缩血管肽受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)1、EpCAM、肝配蛋白(Ephrin)B2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择素、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、纤维母细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、促卵泡激素、分形趋化因子(Fractalkine)、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生长抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、GLP1、GLP2、胰高血糖素、Glut 4、糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、GnRH、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV)gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep B gp120、类肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp120 V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFGPEM、HRG、Hrk、心肌肌球蛋白、巨细胞病毒(CMV)、生长激素(GH)、HVEM、1-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-31、IL-33、白介素受体(例如，IL-1R、IL-2R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-8R、IL-9R、IL-10R、IL-12R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-21R、IL-22R、IL-23R、IL-25R、IL-31R、IL-33R)、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α4/β1、整合素α4/β7、整合素α5(αV)、整合素α5/β1、整合素α5/β3、整合素α6、整合素β1、整合素β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角蛋白形成细胞生长因子(KGF)、层粘连蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜在的TGF-1、潜在的TGF-1bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性物质、促黄体激素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Muc1)、MUC18、缪勒管抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NAV 1.7、NCAD、N-钙粘蛋白、NCA 90、NCAM、NCAM、肾胰岛素残基溶酶(Neprilysin)、神经营养因子-3、-4或-6、Neurturin、神经元生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙粘蛋白、PCNA、PD1、PDL1,PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、P1GF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原(Prorelaxin)、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体(例如，T细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-βPan特异性、TGF-βR1(ALK-5)、TGF-βR11、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF R1CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DCTRAIL R2TNFRH2)、TNFRST23(DCTRAIL R1TNFRH1)、TNFRSF25(DR3Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a连接素(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、转移受体、TRF、Trk(例如，TrkA)、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA 125、肿瘤相关抗原表达Lewis Y相关碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、UPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙粘蛋白、VE-钙粘蛋白-2、VEFGR-1(fit-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、血管性学友病因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、以及激素和生长因子的受体。

在一些实施方案中，结合结构域特异性地结合犬中的一种或多种治疗性靶标或抗原，诸如但不限于：ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAMS、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、ANG、Ang、血管紧张素1型(AT1)受体、血管紧张素2型(AT2)受体、心钠素、av/b3整合素、b-ECGF、CD19、CD20、CD30、CD34、CD40、CD40L、CD47、COX、CTLA-4、EGFR(ErbB-1)、EPO、促卵泡激素、GDF-8(肌肉生长抑制素)、GLP1、GLP2、GnRH、生长激素释放因子、IgE、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-31、IL-33、白介素受体(例如，IL-1R、IL-2R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-8R、IL-9R、IL-10R、IL-12R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-21R、IL-22R、IL-23R、IL-25R、IL-31R、IL-33R)、LAP(TGF-1)、潜在的TGF-1、潜在的TGF-1bp1、LFA-1、神经元生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、OX40L、OX40R、PD1、PDL1、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-βPan特异性、TGF-βR1(ALK-5)、TGF-βR11、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、VEFGR-1(fit-1)、VEGF、VEGFR和VEGFR-3(flt-4)。

在一些实施方案中，一种或多种多肽可以包含蛋白质，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质，例如，EPO、CTLA4、LFA3、VEGFR1/VEGFR3、IL-1R、IL-4R、GLP-1受体激动剂和血小板生成素结合肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAMS、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、ANG、Ang、血管紧张素1型(AT1)受体、血管紧张素2型(AT2)受体、心钠素、av/b3整合素、b-ECGF、CD19、CD20、CD30、CD34、CD40、CD40L、CD47、COX、CTLA-4、EGFR(ErbB-1)、EPO、促卵泡激素、GDF-8(肌肉生长抑制素)、GLP1、GLP2、GnRH、生长激素释放因子、IgE、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-31、IL-33、白介素受体(例如，IL-1R、IL-2R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-8R、IL-9R、IL-10R、IL-12R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-21R、IL-22R、IL-23R、IL-25R、IL-31R、IL-33R)、LAP(TGF-1)、潜在的TGF-1、潜在的TGF-1bp1、LFA-1、神经元生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、OX40L、OX40R、PD1、PDL1、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-βPan特异性、TGF-βR1(ALK-5)、TGF-βR11、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、VEFGR-1(fit-1)、VEGF、VEGFR或VEGFR-3(flt-4)。

在一些实施方案中，治疗性蛋白质是本文所述的任何蛋白质。在一些实施方案中，一种或多种多肽还包含如本文所述的犬IgG CH2结构域、IgG CH3结构域或IgG Fc区。经修饰的犬IgG CH2结构域、IgG CH3结构域或IgG Fc区可以增强治疗性蛋白质的体内半衰期。

药物组合物

为了制备本文所述的一种或多种多肽的药物或无菌组合物，可以将所述一种或多种多肽与药学上可接受的载体或赋形剂混合。(参见例如，Remington's PharmaceuticalSciences and U.S.Pharmacopeia:National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1984))。

治疗剂和诊断剂的制剂可以以例如冻干粉末、浆液、水溶液或悬浮液的形式通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备(参见例如，Hardman等人(2001)Goodman andGilman's The Pharmacolo gical Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.；Gennar o(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott、Williams和Wilkins,New York,N.Y.；Avis等人(编辑)(1993)PharmaceuticalDosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dek ker,NY；Lieberman等人(编辑)(1990)Pharmaceutical Dosage Form s:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(编辑)(1990)Pharm aceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dek ker,Inc.,NewYork,N.Y.)。在一个实施方案中，将本发明的一种或多种多肽在pH 5-6的乙酸钠溶液中稀释至合适的浓度，并且添加NaCl或蔗糖以调节张力。可以添加另外的药剂(诸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)以增强稳定性。

可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序确定单独施用或与另一种药剂组合施用的多肽组合物的毒性和治疗功效，例如用于确定LD₅₀(使群体的50％致死的剂量)和ED₅₀(在群体的50％中治疗有效的剂量)。在毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数(LD₅₀/ED₅₀)。在特定的方面，一种或多种多肽表现出高治疗指数是令人希望的。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制用于犬的剂量范围。此类化合物的剂量优选地在包括ED₅₀的循环浓度范围内，而毒性很小或没有毒性。剂量可以在该范围内变化，这取决于所用的剂型和施用途径。

施用模式可以变化。合适的施用途径包括口服、直肠、经粘膜、肠、肠胃外；肌内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、经皮或动脉内。在一些实施方案中，一种或多种多肽可以通过侵入性途径诸如通过注射施用。在另外的实施方案中，通过静脉内、皮下、肌内、动脉内、肿瘤内或通过吸入、气雾剂递送来施用。

还可以通过输注施用本文所公开的药物组合物。用于施用药物组合物的熟知的埋植剂和模块的示例包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控速率分配药物的可植入微量输注泵；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流量可植入输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了具有多室隔室的渗透药物递送系统。许多其他的这种植入物、递送系统和模块为本领域技术人员所熟知。

可替代地，人们可以以局部而不是全身的方式施用一种或多种多肽，例如通过将抗体直接注射到关节炎关节或以免疫病理学为特征的病原体诱导的损伤中，通常以储库或持续释放制剂的形式。此外，人们可以在靶向药物递送系统中(例如在包被有组织特异性抗体的脂质体中，靶向例如关节炎关节或以免疫病理学为特征的病原体诱导的病变)施用一种或多种多肽。脂质体将靶向患病组织并被患病组织选择性地吸收。

施用方案取决于若干因素，包括但不限于所治疗的犬的年龄、体重和身体状况、治疗性抗体的血清或组织周转率、症状水平、一种或多种治疗性多肽的免疫原性和靶细胞在生物基质中的可及性。优选地，施用方案递送足够的一种或多种治疗性多肽以实现靶疾病状态的改善，而同时最小化不期望的副作用。因此，生物递送的量部分取决于特定的治疗性多肽和所治疗疾患的严重程度。选择合适剂量的治疗性抗体的指导是可用的(参见例如，Wawrzynczak Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK(1996)；Milgrom等人New Engl.J.Med.341:1966-1973(1999)；Slamon等人New Engl.J.Med.344:783-792(2001)；Beniaminovitz等人New Engl.J.Med.342:613-619(2000)；Ghosh等人NewEngl.J.Med.348:24-32(2003)；Lipsky等人New Engl.J.Med.343:1594-1602(2000))。

本领域技术人员例如使用本领域已知或怀疑影响治疗的参数或因素来确定一种或多种多肽的合适剂量。通常，剂量以稍微小于最佳剂量的量开始，并且此后以小增量增加，直到相对于任何负面副作用实现期望的或最佳的效果。重要的诊断量度包括例如炎症症状或产生的炎性细胞因子水平的那些量度。

核酸、载体、宿主细胞和制备方法

本公开还涵盖编码本文所述的一种或多种多肽的一种或多种核酸、包含所述一种或多种核酸的一种或多种载体、以及包含所述一种或多种核酸或所述一种或多种载体的宿主细胞。

本文所述的一种或多种多肽可以在细菌或真核细胞中产生。一些多肽(例如Fab的)可以在细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)中产生。多肽也可以在真核细胞诸如转化细胞系(例如，CHO、293E、COS、293T、Hela)中产生。此外，多肽(例如，scFv的)可以在酵母细胞诸如毕赤酵母(Pichia)(参见例如，Powers等人,J Immunol Methods.251:123-35(2001))；汉逊酵母(Hanseula)或酵母菌(Saccharomyces)中表达。为了产生感兴趣的抗体，构建编码一种或多种多肽的一种或多种多核苷酸，将其引入一种或多种表达载体中，然后在合适的宿主细胞中表达。为了改善表达，可以在不改变(或最小程度地改变-例如去除重链或轻链的C末端残基)氨基酸序列的情况下再编码基因的核苷酸序列。潜在再编码的区域包括与翻译起始、密码子使用和可能的非预期mRNA剪接相关的区域。编码本文所述的Fc区变体的多核苷酸是普通技术人员容易想到的。

标准分子生物学技术可以用于制备一种或多种重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，培养宿主细胞和回收多肽(例如抗体)。

如果所述一种或多种多肽将在细菌细胞(例如，大肠杆菌)中表达，则表达载体应该具有允许所述载体在所述细菌细胞中扩增的特征。此外，在大肠杆菌(诸如JM109,DH5α,HB101或XL1-Blue)用作宿主时，载体必须具有启动子，例如lacZ启动子(Ward等人,341:544-546(1989))、araB启动子(Better等人,Science,240:1041-1043(1988))或可以允许在大肠杆菌中有效表达的T7启动子。此类载体的示例包括例如M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress系统”(QIAGEN)、pEGFP和pET(当使用这种表达载体时，宿主优选地为表达T7 RNA聚合酶的BL21)。表达载体可以含有用于抗体分泌的信号序列。为了在大肠杆菌的周质中产生，pelB信号序列(Lei等人,J.Bacteriol.,169:4379(1987))可以用作抗体分泌的信号序列。对于细菌表达，可以使用氯化钙方法或电穿孔方法将表达载体引入细菌细胞中。

如果所述一种或多种多肽在动物细胞诸如CHO、COS和NIH3T3细胞中表达，则表达载体包括在这些细胞中表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等人,Nature,277:108(1979))(例如，早期猿猴病毒40启动子)、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人,Nucleic Acids Res.,18:5322(1990))或CMV启动子(例如，人巨细胞病毒立即早期启动子)。除了编码Fc区变体的核酸序列之外，重组表达载体可以携带另外的序列，诸如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择已引入载体的宿主细胞(参见例如，美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，典型地，选择标记基因赋予引入了载体的宿主细胞对药物诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。具有选择标记的载体的示例包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。

在一些实施方案中，一种或多种多肽在哺乳动物细胞中产生。用于表达一种或多种多肽的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中描述的dhfr–CHO细胞，其与例如在Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159:601 621中所述的DHFR选择标记一起使用)、人胚肾293细胞(例如，293、293E、293T)、COS细胞、NIH3T3细胞、淋巴细胞系(例如，NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞)和来自转基因动物(例如，转基因哺乳动物)的细胞。例如，所述细胞是乳腺上皮细胞。

在用于抗体表达的示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体的抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体引入dhfr–CHO细胞中。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自可操作地连接至增强子/启动子调控元件(例如，源自SV40、CMV、腺病毒等，诸如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已经转染上载体的CHO细胞。培养所选择的转化体宿主细胞以允许抗体重链和轻链的表达，并且从培养基中回收所述抗体。

治疗方法

本文所公开的一种或多种多肽可以用于治疗或预防有需要的狗的任何疾病或病症。本发明特别有助于治疗需要重复给药的慢性疾患。由于蛋白质治疗剂的半衰期增加，较不频繁的给药和/或降低的剂量水平可能是可以的。

在一些实施方案中，所治疗或预防的疾病、病症、疾患或症状是变应性疾病、慢性疼痛、急性疼痛、炎性疾病、自身免疫性疾病、内分泌疾病、胃肠疾病、骨骼/肌肉骨骼疾病、心血管疾病、神经疾病、肾病、代谢疾病、免疫性疾病、基因/遗传疾病、生育相关病症、感染性疾病或癌症。在某些实施方案中，所治疗或预防的疾病或病症是特应性皮炎、变应性皮炎、食物过敏、骨关节炎性疼痛、围手术期疼痛、牙痛、癌症疼痛、关节炎、贫血、肥胖症或糖尿病。

抗体不仅可以用于治疗或预防疾病，而且还可以用于调节正常的生物学功能，例如管理生育力或行为。

诊断

本文所公开的一种或多种多肽也可以用于各种诊断目的，例如确定狗是否患有任何特定疾病或病症。在一些实施方案中，一种或多种多肽可以包含结合结构域。结合结构域可以特异性地结合如本文所述的蛋白质、亚基、结构域、基序和/或表位(例如，癌细胞的标志物)。在一些实施方案中，一种或多种多肽还包含标记基团。通常，标记基团根据它们将被检测的测定而分成多种类别：a)同位素标记，其可以是放射性同位素或重同位素；b)磁性标记(例如磁性颗粒)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料；酶基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素化基团；和f)由第二报告分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。在一些实施方案中，标记基团通过各种长度的间隔臂与抗体偶联以减少潜在的空间位阻。标记蛋白质的各种方法是本领域已知的，并且可以用于实施本发明。

在一些实施方案中，标记基团是探针、染料(例如，荧光染料)或放射性同位素(例如，³H、¹⁴C、²²Na、³⁶Cl、³⁵S、³³P或¹²⁵I)。

特定的标记可以包括光学染料，包括但不限于发色团、磷光体和荧光团，后者在许多情况下是特定的。荧光团可以是“小分子”荧光团或蛋白质性质的荧光团。

荧光标记可以是可以通过其固有荧光性质检测到的任何分子。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、芪、萤光黄、级联蓝(Cascade BlueJ)、德克萨斯红(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPYFL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒冈绿、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、AlexaFluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、级联蓝(CascadeBlue)、级联黄和R-藻红蛋白(PE)(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)、FITC、罗丹明和德克萨斯红(Pierce,Rockford,Ill.)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science,Pittsburgh,Pa.)。在Richard P.Haugland的Molecular Probes Handbook(其以引用的方式整体并入本文)中描述了合适的光学染料，包括荧光团。

合适的蛋白质性质的荧光标记还包括但不限于绿色荧光蛋白(包括海肾(Renilla)、Ptilosarcus或Aequorea物种的GFP(Chalfie等人,1994,Science 263:802-805))、EGFP(Clontech Laboratories,Inc.,Genbank登录号U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP，Quantum Biotechnologies,Inc.1801de Maisonneuve Blvd.West,8th Floor,Montreal,Quebec,Canada H3H1J9；Stauber,1998,Biotechniques 24:462-471；Heim等人,1996,Curr.Biol.6:178-182)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP，Clontech Laboratories,Inc.)、荧光素酶(Ichiki等人,1993,J.Immunol.150:5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2603-2607)和海肾(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019；美国专利号5,292,658、5,418,155、5,683,888、5,741,668、5,777,079、5,804,387、5,874,304、5,876,995、5,925,558)。本段中所有上述引用的参考文献全部以引用的方式整体明确地并入本文。

测定

Fc_γRI和FcγRIII结合：

与FcγRI和FcγRIII的结合是抗体介导ADCC的能力的量度。为了评估抗体的这种性质，可以使用本领域已知的方法进行测量抗体与FcγRI和FcγRIII的结合的测定。

C1q结合：

与补体第一组分C1q的结合是抗体介导补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力的量度。为了评估抗体的这种性质，可以使用本领域已知的方法进行测量抗体与C1q的结合的测定。

半衰期：

测量抗体半衰期的方法是本领域熟知的。参见例如Booth等人,MAbs,10(7):1098-1110(2018)。示例性的动物模型包括非人灵长类动物模型和转基因小鼠模型。转基因小鼠模型(例如Tg32或Tg276转基因小鼠)对于小鼠FcRnα链可能是无效的并且表达人FcRnα转基因(例如，在组成型启动子的控制下)。人FcRnα链可以在体内与小鼠β2微球蛋白配对，形成功能性嵌合FcRn异二聚体。例如，可以通过将抗体注射到狗模型中并且在一定时间内测量血清中抗体的水平来测量犬抗体的半衰期。

实施例

实施例1：犬IgGB的CH2和CH3结构域的丙氨酸扫描诱变

丙氨酸扫描诱变(Morrison和Weiss,Curr.Opin.Chem.Biol.5:302-307(2001))在CH2结构域中的残基250、251、252、254、256、285、286、307、309、311、315和CH3结构域中的残基378、380、428、430、433、434、435和436上完成。对于该实验，合成犬IgGB的CH2和CH3结构域的野生型(wt)序列并将其用作诱变的模板。使用编码改变的引物通过PCR诱变将除了位置254之外的每个指定位置单独改变为丙氨酸。野生型序列中位置254是丙氨酸，并且其被修饰为丝氨酸。将PCR产物亚克隆到GenScript FASEBA质粒中，转化到大肠杆菌中，并且测序验证变体的存在。CH2结构域的上游是对白蛋白具有pM亲和力的SASA(针对血清白蛋白的单结构域抗体)标签(参见例如US 2013/0129727A1)。PelB(果胶酸裂合酶B)信号肽位于N末端以促进Fc分泌到培养基中。CH2-CH3蛋白的表达由Lac启动子调控。使用表面等离子体共振(SPR)分析来自条件培养基的上清液在pH 5.5下与犬FcRn(UniProtKB-E2R0L6[FcRn]和UniProtKB-E2RN10[犬β2微球蛋白])的结合。

对于使用Biacore 8K的SPR分析，将牛血清白蛋白(BSA)固定到CM5传感器芯片上。通过新鲜混合的50mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺和200mmol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐来活化流动池1和2的传感器芯片表面，持续420s(10μL/min)。然后，将在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释的BSA注射到流动池2中以实现缀合，同时将流动池1设定为空白。在胺偶联反应后，用420s注射1mM乙醇胺盐酸盐阻断芯片表面上剩余的活性偶联位点。用于结合实验的运行缓冲液是HBS-EP(10mM HEPES、500mM NaCl、3mM EDTA、0.05％Tween 20，pH 5.5)并且在25℃运行。将来自丙氨酸变体的上清液注射到芯片表面上，并且通过SASA标签捕获到固定的BSA上，持续60秒。注射400nM犬FcRn持续120秒，用运行缓冲液完成解离持续120秒。BSA固定相的流速为10μl/min，并且结合和解离相的流速为30μl/min。使用Biacore 8K评价软件1.1版处理所有数据。列表数据显示于表3中，其中最后一列含有野生型平均KD除以变体KD。传感图显示于图7A-7U中。

表3

实施例2：在选定位置的NNK饱和诱变文库的产生和单个变体的分析

NNK饱和诱变方法是在期望的位置产生所有20种可能氨基酸的有效策略(Hogrefe等人,Biotechniques.33:1158-1165(2002))。产生在位置250、252、254、309、311、378、380和434(EU编号)的单个NNK文库。对于该方法，在指定位置的NNK(N＝A/C/G/T，K＝G/T)引物与QuikChange定点诱变试剂盒(Agilent)一起使用。使用实施例1中所述的Biacore方法测定来自每个文库的90个单独转化体的上清液在pH 5.5与犬FcRn的结合。唯一的差异是在测定中使用的犬FcRn的浓度为200nM而不是400nM。所有NNK文库变体的传感图显示于图8-15中。

对于在位置250处的NNK文库，没有一个变体显示在pH 5.5下与犬FcRn的结合增加。来自变体T250E和T250Q以及野生型Fc的数据显示于表4中。在竞争性结合测定中，已证实与野生型人IgG2Fc相比，人IgG2中的变体T250E和T250Q在pH 6.0下与人FcRn的结合更紧密(Hinton等人,J.Biol.Chem.279:6213-6216(2004))。

表4

变体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				T250Q	9.96E+04	2.58E-01	2.59E-06
T250Q	9.43E+04	2.68E-01	2.84E-06
				T250E	1.14E+05	2.84E-01	2.48E-06
T250E	1.72E+05	2.87E-01	1.66E-06
				WT	3.87E+04	3.47E-01	8.99E-06
WT	1.14E+05	3.54E-01	3.11E-06

对于在位置252处的NNK文库，只有变体L252Y和L252M在pH 5.5下对犬FcRn具有明显更高的亲和力(参见下面表5)。在90个转化体中，不存在L252F变体，因此没有获得用该变体的结合数据。

表5

变体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				L252Y	4.02E+05	3.97E-02	9.87E-08
L252Y	3.58E+05	4.10E-02	1.14E-07
				L252M	1.93E+05	1.68E-01	8.69E-07
L252M	2.18E+05	1.69E-01	7.74E-07
				WT	1.68E+05	2.88E-01	1.71E-06
WT	1.23E+05	3.26E-01	2.66E-06

对于在位置254处的NNK文库，没有一个测试的变体在pH 5.5下对犬FcRn具有明显更高的亲和力。A254T变体的数据显示于表6中，并且人IgG1中的相应变体已用于YTE变体(M252Y/S254T/T256E)，其在pH 6.0下对人FcRn具有增加的亲和力(Dall’Acqua等人,J.Immunol.169:5171-5180(2002))并且已经证明在临床前模型中以及在人类中增加人IgG的半衰期(Borrok等人,J.Biol.Chem.290:4282-4290(2015)；Robbie等人,Antimicrob.Agents Ch.57:6147-6153(2013))。在90个转化体中，不存在A254H变体，因此没有获得用该变体的数据。

表6

变体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				A254T	1.63E+05	3.75E-01	2.29E-06
A254T	3.23E+05	4.33E-01	1.34E-06
				WT	1.51E+05	3.10E-01	2.05E-06
WT	1.05E+05	3.15E-01	2.99E-06

对于在位置309和311处的NNK文库，没有一个测试的变体在pH 5.5下对犬FcRn具有明显更高的亲和力。变体G309P和Q311V的数据显示于表7和8中，并且人IgG1中的相应人变体(L309P和Q311V)与其他变体的几种组合已被证明在pH 6.0下对人FcRn具有更高的亲和力(Dall’Acqua等人,J.Immunol.169:5171-5180(2002)；Booth等人,MAbs,10(7):1098-1110(2018))。在NNK文库中没有鉴定出变体G309D、G309K和Q311D，因此没有测试FcRn结合。

表7

变体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				G309P	3.77E+05	2.39E-01	6.35E-07
G309P	5.58E+05	2.42E-01	4.34E-07
				G309P	2.07E+05	1.32E-01	6.37E-07
G309P	2.02E+05	1.45E-01	7.18E-07
				WT	2.37E+05	2.10E-01	8.84E-07
WT	2.53E+05	2.18E-01	8.62E-07

表8

变体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				Q311V	1.52E+06	5.66E-01	3.72E-07
Q311V	1.59E+06	6.96E-01	4.39E-07
				WT	2.67E+05	1.70E-01	6.39E-07
WT	2.47E+05	1.71E-01	6.92E-07

对于在位置378和380处的NNK文库，没有一个测试的变体在pH 5.5下对犬FcRn具有明显更高的亲和力。变体D378V的数据显示于表9中，并且人IgG1中的相应变体已与其他IgG变体组合使用，以证明与野生型Fc相比在pH 6.0下对人FcRn具有更高的亲和力，并且延长人IgG在转基因人FcRn小鼠中的半衰期(Monnet等人,MABS.6:422-436(2014)；Booth等人,2018)。而且，变体E380A的数据显示于表10中，并且人IgG中的相应变体已经显示在pH6.0下对人FcRn具有更高的结合亲和力(Shields等人,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001))。在NNK文库中不存在变体D378E、D378I、D378K和E380F，并且未筛选与犬FcRn的结合。

表9

变体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				D378V	2.29E+05	1.59E-01	6.93E-07
D378V	1.84E+05	1.60E-01	8.73E-07
				WT	3.36E+05	1.69E-01	5.02E-07
WT	2.64E+05	2.07E-01	7.84E-07

表10

变体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				E380A	1.68E+05	2.23E-01	1.32E-06
E380A	1.52E+05	2.39E-01	1.57E-06
				WT	1.15E+05	1.79E-01	1.56E-06
WT	2.42E+05	1.82E-01	7.54E-07

对于在位置434处的NNK文库，变体N434Y、N434W和N434R在pH 5.5下对犬FcRn具有更高的亲和力，如表11所示。变体N434S和N434A在低pH下对犬FcRn不具有更高的亲和力，这与相应的人IgG1变体不同(Petkova等人,Int.Immunol.18:1759-1769(2006)；Yeung等人,J.Immunol.182:7663-7671(2009)；Zalevsky等人,Nat.Biotechnol.28:157-159(2010)；Deng等人,Drug Metab.Dispos.38:600-605(2010))。在位置434处筛选的NNK文库不含有N434F变体，因此没有测试该变体与犬FcRn的结合。

表11

实施例3：L252Y、N434Y、N434W、N434R、N434H和YTE(L252Y/A254T/T256E)变体和野生型Fc的结合动力学

进一步评价了在pH 5.5下对犬FcRn表现出更高亲和力的几种犬IgGB变体对犬FcRn的结合动力学。在该研究中，评价了变体(L252Y、N434Y、N434W、N434R、N434H)、YTE变体(L252Y/A254T/T256E)和野生型犬Fc在pH 5.5和pH 7.4下与犬FcRn的结合。用于pH 5.5条件的Biacore方法与实施例1中所述的相同，例外是测试了产生更精确的结合动力学的四种FcRn浓度(100nM、200nM、400nM、800nM)。对于pH 7.4下的Biacore条件，所使用的运行缓冲液是10mM HEPES、500mM NaCl、3mM EDTA、0.05％ Tween 20、pH 7.4，并且所测试的犬FcRn的浓度为200nM。所有变体(包括YTE)以及野生型在pH 7.4下不结合犬FcRn。在pH 5.5下的结合动力学显示于表12中，并且传感图显示于图16A-16E中。与野生型Fc相比，所测试的变体显示在pH 5.5下对犬FcRn的亲和力增加。

表12

变体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				L252Y	2.75E+05	4.76E-02	1.73E-07
N434Y	5.20E+05	1.51E-02	2.91E-08
				N434W	4.46E+05	4.50E-02	1.01E-07
N434R	4.40E+05	8.01E-02	1.82E-07
				N434H	4.11E+05	1.02E-01	2.47E-07
野生型	1.68E+05	5.27E-01	3.15E-06
				YTE	2.50E+05	4.60E-02	1.84E-07

实施例4：在选定位置的NNK饱和诱变文库的产生和单个变体的分析

合成犬IgGB的CH2和CH3结构域的野生型(wt)序列(SEQ IDNO:10)并且将其用作NNK诱变的模板。NNK饱和诱变方法是在期望的位置产生所有20种可能氨基酸的有效策略(Hogrefe等人,Biotechniques.33:1158-1165(2002))。产生在位置286、312、426和436(EU编号)的单个NNK文库。在指定位置的NNK(N＝A/C/G/T，K＝G/T)引物与QuikChange定点诱变试剂盒(Agilent)一起使用。将PCR产物亚克隆到GenScript FASEBA质粒中，转化到大肠杆菌中，并且测序验证变体的存在。CH2结构域的上游是对白蛋白具有pM亲和力的SASA(针对血清白蛋白的单结构域抗体)标签(Zhang,J.；Wu,S.；Liu,J.Methods and systems forincreasing protein stability.美国专利申请,2013.)。SASA抗体能够将Fc捕获到下文所述的传感器芯片表面上。PelB(果胶酸裂合酶B)信号肽位于N末端以促进Fc分泌到培养基中。CH2-CH3蛋白的表达由Lac启动子调控。对于在位置426和312处的变体在pH 5.5下和对于在位置286和436处的变体在pH6.0下使用表面等离子体共振(SPR)分析来自条件培养基的上清液与犬FcRn(UniProtKB-E2R0L6[FcRn]和UniProtKB-E2RN10[犬β2微球蛋白])的结合。

如下所述，使用Biacore方法，对于在位置426和312处的变体在pH 5.5下和对于在位置286和436处的变体在pH 6.0下测定来自每个文库的90个单独转化体的上清液与犬FcRn的结合。

对于使用Biacore 8K的SPR分析，将牛血清白蛋白(BSA)固定到CM5传感器芯片上。通过新鲜混合的50mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺和200mmol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐来活化流动池1和2的传感器芯片表面，持续420s(10μL/min)。然后，将在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释的BSA注射到流动池2中以实现缀合，同时将流动池1设定为空白。在胺偶联反应后，用420s注射1mM乙醇胺盐酸盐阻断芯片表面上剩余的活性偶联位点。用于结合实验的运行缓冲液是HBS-EP(10mM HEPES、500mM NaCl、3mM EDTA、0.05％Tween 20，pH 5.5)并且其在25℃运行。将来自变体的上清液注射到芯片表面上，并且通过SASA标签捕获到固定的BSA上持续60秒。注射200nM犬FcRn持续120秒，用运行缓冲液完成解离持续120秒。BSA固定相的流速为10μl/min，并且结合和解离相的流速为30μl/min。使用Biacore 8K评价软件1.1版处理所有数据。关于Biacore传感图参见图17。

当与野生型犬IgGB Fc(SEQ ID NO:10)相比时，所测试的变体在pH 5.5下(对于在位置312或426处具有氨基酸取代的变体)和在pH6.0下(对于在位置286或436处具有氨基酸取代的变体)显示对犬FcRn的结合亲和力增加。结果总结于下面表13和14中。

表13：

变体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				A426Y	7.50E+05	1.09E-01	1.46E-07
A426Y	7.85E+05	1.12E-01	1.43E-07
				A426H	8.43E+05	1.35E-01	1.60E-07
A426H	9.15E+05	1.40E-01	1.53E-07
				A426F	7.86E+05	1.43E-01	1.82E-07
A426F	8.11E+05	1.47E-01	1.81E-07
				D312P	3.07E+05	8.94E-02	2.91E-07
D312P	2.51E+05	1.10E-01	4.39E-07
				野生型	1.94E+05	1.95E-01	1.01E-06
野生型	4.42E+05	2.97E-01	6.73E-07

表14：

实施例5：A426Y、A426H、A426F、T286Y、T286F、T286L、T286W、Y436H和野生型Fc的结合动力学。

进一步评价了对犬FcRn表现出更高亲和力的几种犬IgGB变体对犬FcRn的结合动力学。在该研究中，评价了变体(A426Y、A426H、A426Y、T286Y、T286F、T286L、T286W、Y436H)、YTE变体(L252Y/A254T/T256E)和野生型犬IgGB Fc在pH 5.5或pH 6.0下和在pH 7.4下与犬FcRn的结合。用于pH 5.5和pH 6.0条件的Biacore方法与上文实施例4中所述的相同，例外是测试了将产生更精确的结合动力学的四种FcRn浓度(100nM、200nM、400nM、800nM)。对于pH 7.4下的Biacore条件，所使用的运行缓冲液是10mM HEPES、500mM NaCl、3mM EDTA、0.05％ Tween 20、pH 7.4，并且所测试的犬FcRn的浓度为200nM。关于Biacore传感图参见图18。使用所描述的条件，野生型Fc或任何变体在pH 7.4下都不与FcRn结合。

结合亲和力数据显示于下面表15和16中。

表15

表16

实施例6：在犬IgGA Fc的位置426处携带氨基酸取代的犬Fc变体

使用Gearing DP等人(2013,BMC Veterinary Research,9:226)描述的可变结构域合成在位置426(通过EU编号)携带氨基酸修饰的两种犬Fc变体和野生型犬IgGA Fc(SEQID NO:9)。合成犬IgGA DNA并且将其亚克隆到pcDNA3.4载体(ThermoFisher)中并使用ExpiCHO转染方法(ThermoFisher)转染到ExpiCHO-S细胞中。在转染细胞后14天，使用GenScript蛋白G树脂纯化条件培养基。

对于pH 6.0结合实验，将抗体直接偶联到CM5传感器芯片上，然后使犬FcRn在HBS-EP(10mM HEPES、500mM NaCl、3mM EDTA、0.05％ Tween 20，pH 6.0)中流过。通过新鲜混合的50mmol/LN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和200mmol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)来活化流动池1和2的传感器芯片表面，持续100s(10μL/min)。将抗体在10mmol/L NaAC(pH 4.5)中稀释并注射到流动池2中以实现约100个应答单位的缀合，然而将流动池1设置为空白。在胺偶联反应后，用100s注射1mol/L乙醇胺盐酸盐阻断芯片表面上剩余的活性偶联位点。用于pH 6.0结合实验的运行缓冲液是HBS-EP(10mM HEPES、500mMNaCl、3mM EDTA、0.05％Tween 20，pH 6.0)并且其在25℃下运行。注射犬FcRn(UniProtKB-E2R0L6[FcRn]和UniProtKB-E2RN10[犬β2微球蛋白])持续120秒，并且用运行缓冲液完成解离持续120秒。流速为30μL/分钟。流过传感器芯片的犬FcRn的浓度为50nM、100nM、200nM、400nM和800nM。使用Biacore 8K评价软件1.1版处理所有数据。每个循环中的流动池1和单独的缓冲液注射用作应答单位扣除的参考。下面表17提供了pH 6.0结合实验的动力学数据。先前已经证明，与通过基于溶液的方法或直接与Biacore C1芯片偶联确定的亲和力相比，IgG与Biacore CM5生物传感器芯片的胺偶联将对FcRn的亲和力降低了2-3倍(Abdiche等人,2015.mAbs,7:331)。因此，在pH 6.0下这些IgG对FcRn的真实亲和力可能要高至少2倍。然而，该方法对于比较不同IgG Fc变体的相对FcRn结合亲和力是有效的。Biacore传感图显示于图19中。

表17：

实施例7：筛选与野生型犬IgGB Fc相比具有增加的FcRn结合的犬IgGB Fc变体

使用Gearing DP等人(2013,BMC Veterinary Research,9:226)描述的可变结构域，将携带单个氨基酸取代或氨基酸取代组合的犬Fc变体合成为犬IgGB(SEQ ID NO:10)形式。合成犬IgGB DNA并且将其亚克隆到pcDNA3.4载体(ThermoFisher)中并使用ExpiCHO转染方法(ThermoFisher)转染到ExpiCHO-S细胞中。在转染细胞后14天，使用Monofinity A树脂(GenScript)纯化条件培养基。使用Biacore 8K在pH6.0和pH 7.4条件下测量抗体与犬FcRn的结合。

对于pH 6.0结合条件，通过新鲜混合的50mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和200mmol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)来活化流动池1和2的传感器芯片表面，持续100s(10μL/min)。将抗体在10mmol/L NaAC(pH 4.5)中稀释并注射到流动池2中以实现约100个应答单位的缀合，然而将流动池1设置为空白。在胺偶联反应后，用100s注射1mol/L乙醇胺盐酸盐阻断芯片表面上剩余的活性偶联位点。用于pH 6.0结合实验的运行缓冲液是HBS-EP(10mM HEPES、500mM NaCl、3mM EDTA、0.05％ Tween 20，pH 6.0)并且其在25℃下运行。注射犬FcRn(UniProtKB-E2R0L6[FcRn]和UniProtKB-E2RN10[犬β2微球蛋白])持续120秒，并且用运行缓冲液完成解离持续120秒。流速为30μl/分钟。对于野生型IgG和A426H-N434R IgG变体，流过传感器芯片的犬FcRn的浓度为200nM、400nM、800nM、1600nM和3200nM。对于其余变体流过的犬FcRn的浓度为50nM、100nM、200nM、400nM和800nM。使用Biacore 8K评价软件1.1版处理所有数据。

每个循环中的流动池1和单独的缓冲液注射用作应答单位扣除的参考。下面表18列出了pH 6.0结合实验的动力学数据。先前已经证明，与通过基于溶液的方法或直接与Biacore C1芯片偶联确定的亲和力相比，IgG与Biacore CM5生物传感器芯片的胺偶联将对FcRn的亲和力降低了2-3倍(Abdiche等人,2015.mAbs,7:331)。因此，在pH 6.0下这些IgG对FcRn的真实亲和力可能要高至少2倍。然而，该方法对于比较不同IgG Fc变体的相对FcRn结合亲和力是有效的。Biacore传感图显示于图20-23中。

表18：

对于pH 7.4结合条件，通过新鲜混合的50mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和200mmol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)来活化流动池1和2的传感器芯片表面，持续420s(10μL/min)。然后，将在10mmol/L NaAC(pH 4.5)中稀释的犬FcRn注射到流动池2中以实现约2000个应答单位的缀合，同时将流动池1设定为空白。在胺偶联反应后，用420s注射1mol/L乙醇胺盐酸盐阻断芯片表面上剩余的活性偶联位点。用于pH7.4结合实验的运行缓冲液是HBS-EP(10mM HEPES、500mM NaCl、3mM EDTA、0.05％Tween20，pH 7.4)并且其在25℃下运行。将不同的抗体以400nM注射120秒，并且用运行缓冲液完成解离持续120秒。流速为30μl/分钟。下面表19列出了pH 7.4结合实验的动力学数据。Biacore传感图显示于图24-27中。

表19：

犬IgG Fc与犬FcRn在pH 7.4下相互作用的亲和力非常弱，并且使用大多数方法都难以通过SPR测量。为了比较各种犬Fc变体与犬FcRn的pH 7.4亲和力，用高浓度的犬FcRn包被传感器芯片，并且使变体IgG Fc流过芯片以测量相互作用。在该形式中，存在亲合力效应，因此所测量的结合亲和力不是单个犬IgG Fc变体-犬FcRn相互作用的精确测量值，而是可以用于比较变体IgG在pH 7.4下的相对结合。它们不应被用于与pH 6.0下的结合亲和力进行直接比较。

实施例8：体内筛选与野生型犬IgGB Fc相比具有增加的FcRn结合的犬IgGB Fc变体。

用16只雄性和雌性小猎犬进行药代动力学(PK)研究。通过使用Gearing DP等人(2013,BMC Veterinary Research,9:226；其内容以引用的方式整体并入本文)描述的抗NGF可变结构域将氨基酸取代掺入犬IgGB(SEQ ID NO:10)中来制备携带单个氨基酸取代或氨基酸取代组合的犬IgGB Fc变体。将动物随机分成八个组，其中每组中有一只雄性和一只雌性。小猎犬的平均年龄为>6个月，并且它们的体重为8-10kg。向每只动物施用单次静脉内剂量为2mg/kg的抗体。在以下时间点收集大约1.5ml全血：0小时(给药前)、注射后4小时和1天、2天、4天、6天、10天、14天、18天、22天、30天、34天、38天、42天。从全血中分离血清，并且通过对抗NGF抗体特异的ELISA测定抗体变体的存在。

每个单独血清抗体测量的非房室PK分析(NCA)使用用于药代动力学分析的已建立的Excel插件软件工具来进行(“PKSolver:An add-in program for pharmacokinetic andpharmacodynamic data analysisin Microsoft Excel”,Yong Zhang等人,Comput.Methods Program s Biomed.；2010年9月；99(3):306-14.doi:10.1016/j.cmpb.2010.01.007；其内容以引用的方式整体并入本文)。PKSolver为确定PK参数提供了许多选择。为了简化使用、模型独立性和增加分析者与分析者的一致性，NCA被确定为选择的方法。对于具体的分析，PKSolver中的NCA IV Bolus用于确定终末半衰期(T1/2)。在一组初始剂量探索实验之后，远到静脉内施用后42天还可以测量到远高于LLOQ的测量值。因此，在至少最后4周的抗体测量中估计终末半衰期以能够稳健估计斜率。在任何实验中没有数据点被丢弃或排除。如图29所示，当与携带(i)野生型犬IgGB Fc区或(ii)仅具有单个氨基酸取代的犬Ig GB Fc变体的抗NGF IgGB抗体相比时，IgG Fc区中氨基酸取代的组合显著地改善了抗NGF IgGB抗体在犬体内的终末半衰期。

实施例9：使用C1生物传感器时犬IgGB变体与犬FcRn的结合动力学

在pH 5.9下评价了几种犬IgGB变体(A426Y、A426Y+T286L、A426Y+D312P、A426Y+Y436H、A426Y+T286L+Y436H、A426H、A426H+T286L、A426H+T286Y、A426H+D312P、A426H+Y436H和野生型)与犬FcRn(UniProtKB-E2R0L6[犬大亚基FcRn]和UniProtKB-E2RN10[犬β2微球蛋白])的结合动力学。EU编号用于鉴定位置(图28)。在该研究中，使用Gearing DP等人(2013,BMC Veterinary Research,9:226)描述的可变结构域将携带单个氨基酸取代或氨基酸取代组合的犬Fc变体合成为犬IgGB(GENBANK登录号AAL35302.1)形式。将合成的犬IgGB DNA亚克隆到哺乳动物表达载体中并瞬时转染到CHO细胞中。使用蛋白A色谱法纯化条件培养基。

对于犬FcRn结合实验，在25℃下在Biacore 8K+系统上完成所有测定。在上述实施例(例如，实施例6和7)中，我们通过将IgG与Biacore CM5生物传感器芯片的胺偶联测量了IgG变体对犬FcRn的亲和力，Abdiche等人,2015(mAbs,7:331)已经证明与当使用S系列C1生物传感器时相比所述Biacore CM5生物传感器芯片低估了Fc变体对FcRn的亲和力。在这组实验中，为了获得FcRn亲和力的更准确的测量，使用标准胺偶联试剂将所有抗体固定到S系列C1传感器芯片上。将200mmol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和50mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物注射420秒以活化表面。然后，将抗体在10mM乙酸钠pH 5.0中以0.5至2μg/ml的浓度注射120秒。最后，注射1M乙醇胺420秒。运行缓冲液为调节至pH 5.9的1X PBS-P+(Cytiva，目录号28995084)。

为了评价犬IgGB变体在pH 5.9下对犬FcRn的结合亲和力，选择1.56–2000nM浓度范围的犬FcRn并且以单循环模式注射。对每种变体测试的犬FcRn的浓度显示于下面表20中。

表20：用于每种IgGB变体的犬FcRn的浓度

变体	FcRn浓度[nM]
		野生型	31.25，125，500，2000
A426Y	15.625，62.5，250，1000
		A426Y+T286L	7.8125，31.25，125，500
A426Y+D312P	7.8125，31.25，125，500
		A426Y+Y436H	7.8125，31.25，125，500
A426Y+T286L+Y436H	1.56，6.25，25，100
		A426H	15.625，62.5，250，1000
A426H+T286L	3.9，15.625，62.5，250
		A426H+T286Y	3.9，15.625，62.5，250
A426H+D312P	7.8125，31.25，125，500
		A426H+Y436H	15.625，62.5，250，1000

每种抗体四种浓度以5μl/min注射90秒，然后解离180秒。每个浓度系列以该格式注射三次，至少三个仅缓冲液循环用于适当的参考扣除。表面通过两次注射1XPBS-P+(pH7.4)再生30秒，随后是60秒等待命令。包括三个启动循环以在分析之前稳定表面。

使用Insight Evaluation软件通过拟合至1∶1动力学相互作用模型或通过拟合至稳态亲和力来评价数据。使用包括U值和T值的质量度量学来选择接受的参数。对于动力学速率常数，U值小于15被认为是可接受的，而对于动力学速率常数，T值大于100被认为是可接受的。在这些值在所述范围之外的情况下，稳态亲和力参数被认为是可接受的。

10种变体的动力学数据显示在下面表21中，并且传感图显示于图30A-30K中。

表21：犬IgGB变体和犬FcRn结合动力学

变体	ka	kd	K_D	用于拟合数据的方法
					野生型			9.51E-07	稳态亲和力
A426Y	8.78E+05	1.13E-01	1.29E-07	1∶1动力学相互作用模型
					A426Y+T286L	1.03E+06	4.36E-02	4.23E-08	1∶1动力学相互作用模型
A426Y+D312P	1.10E+06	4.97E-02	4.51E-08	1∶1动力学相互作用模型
					A426Y+Y436H	1.06E+06	6.08E-02	5.77E-08	1∶1动力学相互作用模型
A426Y+T286L+Y436H	5.67E+06	4.12E-02	7.26E-09	1∶1动力学相互作用模型
					A426H	1.24E+06	1.42E-01	1.15E-07	1∶1动力学相互作用模型
A426H+T286L	1.16E+06	4.17E-02	3.58E-08	1∶1动力学相互作用模型
					A426H+T286Y	1.34E+06	2.86E-02	2.13E-08	1∶1动力学相互作用模型
A426H+D312P	1.31E+06	5.32E-02	4.05E-08	1∶1动力学相互作用模型
					A426H+Y436H	8.08E+05	1.30E-01	1.61E-07	1∶1动力学相互作用模型

实施例10：FcRn结合增加的犬IgGB变体和野生型犬IgGB的药代动力学研究

用雄性和雌性小猎犬完成了三个药代动力学(PK)研究。使用Gearing DP等人(2013，BMC Veterinary Research，9：226)描述的抗NGF可变结构域，将携带单个氨基酸取代或氨基酸取代组合的犬Fc变体合成为犬IgGB(SEQ ID NO：10)形式。对于每个研究，将动物随机分组，使得每个组含有相同数量的雄性和雌性。每个研究中评价的IgGB变体和每个组中雄性(M)和雌性(F)的数量如下所示(表22)。

表22：每个PK研究中测试的IgGB变体的描述

狗的平均年龄为＞6个月，并且体重在8-10kg之间。向每只动物注射单次静脉内剂量为1mg/kg(研究1)或2mg/kg(研究2和3)的抗体。在以下时间点收集大约1.5ml全血：0小时(给药前)、注射后4小时和1天、2天、4天、6天、10天、14天、18天、22天、30天、34天、38天、42天。从血液中提取血清并且通过对NGF抗体特异的ELISA测定抗体变体。

使用非线性混合效应建模的具有线性清除率的二房室药代动力学(PK)模型描述了血清浓度(图31)。群体PK参数使用Monolix Suite2019R1(Monolix版本2019R1.Antony,France：Lixoft SAS,2019)中实施的最大期望值随机逼近(SAEM)算法来估计。将各个参数建模为具有对数正态分布的随机变量。从包括所有变体和研究的合并数据估计群体参数。研究是关于清除率的分类协变量。通过使用关于清除率的分类协变量、中心和外周分布体积来区分mAb变体。分类研究和变体协变量描述如下：

其中如果单独协变量在类别中，则Ω_i＝1；否则Ω_i＝0。将野生型IgGB变体用作参考。

图29显示了在研究2中观察到的野生型、A426Y和A426Y+Y436H变体的终末半衰期。

将所有3个研究的数据用于产生每种变体的估计PK参数(表23)。

表23：具有10kg体重的狗的PK参数估计

来自实验3的野生型、A426Y、A426Y+Y436H和A426Y+Y436H+T286L的单独观测血清浓度显示于图32B中。来自实验1的野生型、YTE、N434Y和N434R的单独观测血清浓度也显示于图32A中。

确定了携带野生型IgGB Fc或IgGB变体A426Y、A426Y+Y436H、A426Y+Y436H+T286L、N434R、N434Y和YTE的抗NGF抗体在三个月期间内的预测血清浓度曲线的模拟，并且显示于图33中。对于该模拟，使用10kg狗，单次静脉内剂量为2mg/kg。

实施例11：犬IgGB Fc变体与犬FcRn结合的建模

为了提供对犬IgGB Fc变体与犬FcRn结合的分子机制的见解，使用MOE软件(Molecular Operating Environment(MOE)_,2020.09；Chemical Computing Group ULC,1010Sherbrooke St.West,Suite#910,Montreal,QC,Canada,H3A 2R7,2020)基于在与YTE-Fc结构域(PDBID:4N0U)的复合物中的人FcRn的共晶体结构创建了在与犬FcRn的复合物中的犬IgGB Fc的结构模型。在MOE中将突变并入模型的结构中并且用Amber14:EHT力场使能量最小化。使用Pymol软件(The PyMOL Molecular Graphics System,版本1.2r3pre,

LLC)测量犬Fc-FcRn相互作用距离。

具有在低pH下增加对犬FcRn的亲和力的变体的286、426和436的犬Fc位置显示于图34中。

犬IgGB A426H变体显示于图35中，并且位置426太远而不能直接与FcRn相互作用。该模型预测A426H引起与Y436的空间冲突，Y436置换A426H为更有利的结合FcRn的构象。犬A426Y显示于图36中，并且类似于A426H，它太远而不能直接与FcRn相互作用，并且将Y436转变为更有利的结合FcRn的构象。

犬IgGB Y436H变体显示于图37中。将位置436残基改变为His具有对相邻残基预测的轻微改变。电荷的差异可能是驱使更紧密结合的原因。预测类似于疏水性/芳香族Y436在中性pH下H436上缺乏电荷会驱使相邻残基保留在不利的结合环境中。然而，质子化的His436的更亲水/正电荷性质为残基诸如FcRn大亚基中的E135提供更有吸引力的界面。

犬IgGB T286L变体显示于图38中，并且不直接与FcRn中的犬β2微球蛋白相互作用。然而，存在的任何疏水性相互作用将通过将苏氨酸改变为亮氨酸而增强。观察结果与T286Y、T286F和T286W变体在低pH下对犬FcRn的亲和力增加一致，如实施例4和5所示。

犬IgGB Fc上的A426Y、Y436H和T286L变体的组合已建模(图39)。预测A426Y和Y436H变体之间的空间冲突导致436移动到更有利于结合的位置。这可以与His的pH依赖性作用具有加合作用。T286L太远而不能出现受426和436突变的直接影响。实施例9中三重变体(A426Y、Y436H和T286L)在低pH下与犬FcRn的体外结合数据与三种变体的组合以加合的方式增加FcRn亲和力的模型一致。

其他实施方案

虽然已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前面的描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

序列表

<110> 因外泰克斯公司(Invetx Inc.)

<120> 用于增加治疗剂在犬中的半衰期的组合物和使用方法

<130> 47406-0015WO1

<150> 63/122,417

<151> 2020-12-07

<150> 63/023,083

<151> 2020-05-11

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 104

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 1

Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg

1 5 10 15

Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg

20 25 30

Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val

35 40 45

His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr

50 55 60

Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly

65 70 75 80

Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile

85 90 95

Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg

100

<210> 2

<211> 104

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 2

Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu

1 5 10 15

Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro

20 25 30

Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met

35 40 45

Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr

50 55 60

Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly

65 70 75 80

Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile

85 90 95

Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg

100

<210> 3

<211> 104

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 3

Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val

1 5 10 15

Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro

20 25 30

Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Ser Lys Gln Val

35 40 45

Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr

50 55 60

Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Ser Gly

65 70 75 80

Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile

85 90 95

Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro

100

<210> 4

<211> 104

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 4

Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg

1 5 10 15

Ile Thr Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg

20 25 30

Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val

35 40 45

His Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

50 55 60

Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly

65 70 75 80

Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile

85 90 95

Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg

100

<210> 5

<211> 106

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 5

Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser

1 5 10 15

Ser Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro

20 25 30

Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Arg

35 40 45

Lys His Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe

50 55 60

Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp

65 70 75 80

Pro Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr

85 90 95

Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 6

<211> 105

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 6

Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys

1 5 10 15

Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp

20 25 30

Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys

35 40 45

Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu

50 55 60

Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr

65 70 75 80

Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

85 90 95

Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 7

<211> 105

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 7

Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Met Ser Lys

1 5 10 15

Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu

20 25 30

Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys

35 40 45

Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu

50 55 60

Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr

65 70 75 80

Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

85 90 95

Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 8

Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser

1 5 10 15

Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro

20 25 30

Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Ser

35 40 45

Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe

50 55 60

Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp

65 70 75 80

Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr Thr

85 90 95

Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 9

<211> 220

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 9

Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe

35 40 45

Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln

50 55 60

Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile

85 90 95

Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg

100 105 110

Ala His Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu

115 120 125

Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro

145 150 155 160

Glu Arg Lys His Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

180 185 190

Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His

195 200 205

Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 10

<211> 219

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 10

Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe

35 40 45

Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln

100 105 110

Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu

115 120 125

Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro

130 135 140

Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu

145 150 155 160

Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr

165 170 175

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly

180 185 190

Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

195 200 205

Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 11

<211> 219

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 11

Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe

35 40 45

Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly Gln

100 105 110

Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Met

115 120 125

Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe Pro

130 135 140

Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu

145 150 155 160

Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr

165 170 175

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly

180 185 190

Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

195 200 205

Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 12

<211> 220

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 12

Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val

20 25 30

Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe

35 40 45

Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln

100 105 110

Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu

115 120 125

Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe

130 135 140

Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro

145 150 155 160

Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

180 185 190

Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn His

195 200 205

Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 13

<211> 468

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 13

Met Glu Ser Val Phe Cys Trp Val Phe Leu Val Val Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Tyr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Gln Arg Val Ala His Ile Arg Gly Asp Gly Arg Thr Thr His Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ala Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Val Glu Asp Thr Ala Ile

100 105 110

Tyr Tyr Cys Val Lys Asp Ile Tyr Tyr Gly Val Gly Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val

145 150 155 160

Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu His Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Val His

210 215 220

Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Phe Asn Glu Cys Arg

225 230 235 240

Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro

245 250 255

Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr

260 265 270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp

275 280 285

Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr

290 295 300

Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320

Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu

325 330 335

Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg

340 345 350

Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr Val

355 360 365

Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile

370 375 380

Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp

385 390 395 400

Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr Pro

405 410 415

Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val

435 440 445

Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210> 14

<211> 96

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 14

Leu Phe Thr Arg Thr Lys Arg Arg Ser Asp Val Ser Trp Gly Asn Thr

1 5 10 15

Gly Ser Ser Gln Thr Val Ile Arg Ala Ser Val Ala Ser Trp Ser Arg

20 25 30

Asn Gly Asp Leu Tyr Ala Pro Lys Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val

35 40 45

Pro Arg Pro Pro Asp Cys Lys Ala Met Phe Thr Leu Leu Ala Val Asp

50 55 60

Pro Gln Met Gln Pro Glu Gly Lys Gln Thr Lys Asn Lys Ala Gln Gln

65 70 75 80

Arg Glu Lys Asn Leu Phe Ser Tyr Thr Arg Thr Ile Ala His Gln Glu

85 90 95

<210> 15

<211> 105

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 15

Leu Tyr Ala Asp Cys Ala Ser Val Ser Pro Trp Thr Tyr Ser Asp Ile

1 5 10 15

Tyr Ser Val Arg Ala Val Ala Ala Pro Tyr Asp Ser His Tyr Met Pro

20 25 30

Ser Leu Phe Gln Ile Val Tyr Ala Thr Ala Lys Glu Lys Cys Asn Cys

35 40 45

Asn Asn Cys Gly Cys Gly Leu Phe Val Thr Ala Thr Val Asp Pro Asn

50 55 60

Ser Gln Gln Asn Pro Glu Ser Gly Ser Gln Lys Asn Lys Ala Glu Ile

65 70 75 80

Thr Pro Gln Gln Asn Arg Asp Met Lys Asn Thr Leu Val Phe Glu Ser

85 90 95

Tyr Met Arg Thr Ile Ala His Gln Ile

100 105

<210> 16

<211> 66

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 16

Leu Ser Asp Gly Ser Val Ser Trp Ala Val Ser Asn Arg Asp Tyr Ser

1 5 10 15

Lys Ala Ile His Val Thr Gly Val Trp Pro Arg His Met His Asn Ser

20 25 30

Leu Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Thr Lys Cys Ile Ser Pro Glu Ser Phe

35 40 45

Ile Pro Ser Gly Gln Gln Thr Leu Phe Glu Pro Ser Tyr His Thr Ala

50 55 60

Thr Ala

65

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 17

Phe Asn Glu Cys Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu

1 5 10 15

Pro

<210> 18

<211> 22

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 18

Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys

1 5 10 15

Cys Pro Ala Pro Glu Met

20

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 19

Ala Lys Glu Cys Glu Cys Lys Cys Asn Cys Asn Asn Cys Pro Cys Pro

1 5 10 15

Gly Cys Gly Leu

20

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 20

Pro Lys Glu Ser Thr Cys Lys Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu

1 5 10 15

Ser

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 21

Pro Lys Glu Ser Thr Cys Lys Cys Ile Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu

1 5 10 15

Ser

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成肽

<400> 22

Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg

1 5 10

<210> 23

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成肽

<400> 23

Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr

1 5 10

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成肽

<400> 24

Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg

1 5 10 15

<210> 25

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成肽

<400> 25

Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 26

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成肽

<400> 26

Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser

1 5 10 15

Glu Arg

<210> 27

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成肽

<400> 27

Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly

1 5 10 15

Leu Tyr

<210> 28

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成肽

<400> 28

Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly

1 5 10 15

Leu Tyr Ser Glu Arg

20

<210> 29

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工(Artificial)

<220>

<223> 合成肽

<400> 29

Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly

1 5 10 15

Leu Tyr Gly Leu Tyr

20

<210> 30

<211> 202

<212> PRT

<213> 犬(Canine)

<400> 30

Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg

1 5 10 15

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro

20 25 30

Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala

35 40 45

Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val

50 55 60

Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe

65 70 75 80

Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr

85 90 95

Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu

100 105 110

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys

115 120 125

Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser

130 135 140

Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln

145 150 155 160

Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp

165 170 175

Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His

180 185 190

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu

195 200

<210> 31

<211> 200

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 31

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

1 5 10 15

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

20 25 30

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

35 40 45

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

50 55 60

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

65 70 75 80

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

85 90 95

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

100 105 110

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

115 120 125

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

130 135 140

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

145 150 155 160

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

165 170 175

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

180 185 190

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

195 200

Claims

1.一种包含犬IgG Fc区变体或其犬FcRn结合区的多肽，其中所述多肽包含在选自由以下组成的组的位置处的至少一个氨基酸取代：

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置；

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置312对应的位置；

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的位置；以及

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的位置，

其中与所述野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸取代选自由Tyr、Phe、Leu和Trp组成的组，其中所述氨基酸位置基于EU编号，并且其中当与所述野生型犬IgG的Fc结构域相比时，所述多肽对犬FcRn的结合亲和力增加。

2.如权利要求1所述的多肽，其中所述至少一个氨基酸取代包括在与野生型犬IgG的氨基酸位置312对应的位置处的氨基酸取代。

3.如权利要求2所述的多肽，其中所述多肽在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置312对应的氨基酸位置处包含Pro。

4.如权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述至少一个氨基酸取代包括与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的位置处的氨基酸取代。

5.如权利要求4所述的多肽，其中所述多肽在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的氨基酸位置处包含Tyr、His或Phe。

6.如权利要求5所述的多肽，其中所述多肽在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的氨基酸位置处包含Tyr。

7.如权利要求5所述的多肽，其中所述多肽在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的氨基酸位置处包含His。

8.如权利要求5所述的多肽，其中所述多肽在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的氨基酸位置处包含Phe。

9.如权利要求1至8中任一项所述的多肽，其中所述至少一个氨基酸取代包括与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置处的氨基酸取代。

10.如权利要求9所述的多肽，其中所述多肽在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处包含Tyr。

11.如权利要求9所述的多肽，其中所述多肽在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处包含Phe。

12.如权利要求9所述的多肽，其中所述多肽在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处包含Leu。

13.如权利要求9所述的多肽，其中所述多肽在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处包含Trp。

14.如权利要求1至13中任一项所述的多肽，其中所述至少一个氨基酸取代包括与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的位置处的氨基酸取代。

15.如权利要求14所述的多肽，其中所述多肽在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的氨基酸位置处包含His。

16.如权利要求1至15中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:9至12组成的组的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。

17.如权利要求1至16中任一项所述的多肽，所述多肽包含在选自由以下组成的组的位置处的至少一个另外的氨基酸取代：

(i)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置250对应的氨基酸位置，

(ii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置251对应的氨基酸位置，

(iii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置，(iv)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置，(v)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置，

(vi)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置285对应的氨基酸位置，(vii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置，(viii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置，(ix)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置308对应的氨基酸位置，(x)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置，

(xi)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置，(xii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置，(xiii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置378对应的氨基酸位置，(xiv)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置380对应的氨基酸位置，(xv)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置428对应的氨基酸位置，(xvi)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置430对应的氨基酸位置，(xvii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置，

(xviii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置，和

(xix)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置435对应的氨基酸位置。

18.如权利要求17所述的多肽，其中所述多肽包含：

(i)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置250对应的氨基酸位置处的Glu或Gln，

(ii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置251对应的氨基酸位置处的Asp或Glu，

(iii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置处的Tyr或Met，

(iv)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置处的Thr或Ser，

(v)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置处的Asp、Glu或Phe，

(vi)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置285对应的氨基酸位置处的Asn或Asp，

(vii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处的Asp、Tyr、Phe、Leu或Trp，

(viii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置处的Arg、Gln或Ala，

(ix)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置308对应的氨基酸位置处的Pro，

(x)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置处的Pro，

(xi)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置处的Val，

(xii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置处的Asp，

(xiii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置378对应的氨基酸位置处的Val，

(xiv)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置380对应的氨基酸位置处的Ala，

(xv)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置428对应的氨基酸位置处的Leu，

(xvi)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置430对应的氨基酸位置处的Ala或Lys，

(xvii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置处的Lys，

(xviii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、His、Ser、Ala或Phe，和/或

(xix)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置435对应的氨基酸位置处的Tyr。

19.如权利要求9至15中任一项所述的多肽，所述多肽包含在选自由以下组成的组的位置处的至少一个另外的氨基酸取代：

(i)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置250对应的氨基酸位置，

(ii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置251对应的氨基酸位置，

(vi)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置285对应的氨基酸位置，(vii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置，(viii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置308对应的氨基酸位置，(ix)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置，(x)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置，

(xi)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置，(xii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置378对应的氨基酸位置，(xiii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置380对应的氨基酸位置，(xiv)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置428对应的氨基酸位置，(xv)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置430对应的氨基酸位置，(xvi)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置，(xvii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置，和

(xviii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置435对应的氨基酸位置。

20.如权利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含：

(vii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置处的Arg、Gln或Ala，

(viii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置308对应的氨基酸位置处的Pro，

(ix)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置处的Pro，

(x)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置处的Val，

(xi)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置处的Asp，

(xii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置378对应的氨基酸位置处的Val，

(xiii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置380对应的氨基酸位置处的Ala，

(xiv)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置428对应的氨基酸位置处的Leu，

(xv)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置430对应的氨基酸位置处的Ala或Lys，

(xvi)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置处的Lys，

(xvii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、His、Ser、Ala或Phe，和/或

(xviii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置435对应的氨基酸位置处的Tyr。

21.如权利要求17或权利要求19所述的多肽，其中所述至少一个另外的氨基酸取代位于选自由以下组成的组的位置：

(i)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置250对应的氨基酸位置，

(ii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置，

(iii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置，(iv)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置，(v)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置285对应的氨基酸位置，

(vi)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置，(vii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置，(viii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置，(ix)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置，(x)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置，和

(xi)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置。

22.如权利要求21所述的多肽，其中所述多肽包含：

(ii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置处的Tyr或Met，

(iii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置处的Thr或Ser，

(iv)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置处的Asp、Glu或Phe，

(v)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置285对应的氨基酸位置处的Asn或Asp，

(vi)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置307对应的氨基酸位置处的Arg、Gln或Ala，

(vii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置309对应的氨基酸位置处的Pro，

(viii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置311对应的氨基酸位置处的Val，

(ix)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置315对应的氨基酸位置处的Asp，

(x)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置433对应的氨基酸位置处的Lys，和

(xi)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、His、Ser、Ala或Phe。

23.如权利要求17或权利要求19所述的多肽，其中所述至少一个另外的氨基酸取代位于选自由以下组成的组的位置：

(i)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置，

(ii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置，

(iii)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置，和

(iv)与所述野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置。

24.如权利要求23所述的多肽，其中所述多肽包含：

(i)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置处的Tyr或Met，

(ii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置处的Thr或Ser，

(iii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置处的Asp、Glu或Phe，和/或

(iv)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、His、Ser、Ala或Phe。

25.如权利要求24所述的多肽，其中所述多肽包含：

(i)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置252对应的氨基酸位置处的Tyr，

(ii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置254对应的氨基酸位置处的Thr，

(iii)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置处的Glu，和/或

(iv)在与所述野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg或His。

26.一种包含犬IgG Fc区变体或其犬FcRn结合区的多肽，其中所述多肽在选自由以下组成的组的两个或更多个位置处包含氨基酸取代：

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置；

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置312对应的位置；

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的位置；

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的位置；以及

(v)与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的位置，

其中所述氨基酸位置基于EU编号，并且其中当与所述野生型犬IgG的Fc结构域相比时，所述多肽对犬FcRn的结合亲和力增加。

27.如权利要求26所述的多肽，其中在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：T286L、T286Y和任何前述的保守氨基酸取代。

28.如权利要求26所述的多肽，其中在与野生型犬IgG的氨基酸位置312对应的位置处的氨基酸取代是D312P或其保守氨基酸取代。

29.如权利要求26所述的多肽，其中在与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：A426Y、A426H和任何前述的保守氨基酸取代。

30.如权利要求26所述的多肽，其中在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的位置处的氨基酸取代是N434R或其保守氨基酸取代。

31.如权利要求26所述的多肽，其中在与野生型犬IgG的氨基酸位置436对应的位置处的氨基酸取代是Y436H或其保守氨基酸取代。

32.如权利要求26至31中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含在与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的位置处的氨基酸取代。

33.如权利要求32所述的多肽，其中所述多肽在选自由以下组成的组的两个或更多个位置处包含氨基酸取代：

(i)与野生型犬IgG的氨基酸位置426和286对应的位置；

(ii)与野生型犬IgG的氨基酸位置426和312对应的位置；

(iii)与野生型犬IgG的氨基酸位置426和434对应的位置；

(iv)与野生型犬IgG的氨基酸位置426和436对应的位置；以及

(v)与野生型犬IgG的氨基酸位置286、426和436对应的位置。

34.如权利要求32所述的多肽，其中所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸取代：

(i)A426Y和T286L；

(ii)A426Y和D312P；

(iii)A426Y和Y436H；

(iv)A426H和T286L；

(v)A426H和T286Y；

(vi)A426H和D312P；和

(vii)T286L、A426Y和Y436H。

35.如权利要求26至31中任一项所述的多肽，其中所述两个或更多个氨基酸取代选自由以下组成的组：

(i)A426Y与T286L、D312P、N434R和Y436H中的一个或多个的组合；

(iii)N434R与T286L、T286Y、D312P和Y436H中的一个或多个的组合。

36.如权利要求1至35中任一项所述的多肽，其中所述野生型犬IgG是包含具有与SEQID NO:9至少80％相同的氨基酸序列的Fc结构域的犬IgGA、包含具有与SEQ ID NO:10至少80％相同的氨基酸序列的Fc结构域的犬IgGB、包含具有与SEQ ID NO:11至少80％相同的氨基酸序列的Fc结构域的犬IgGC、或包含具有与SEQ ID NO:12至少80％相同的氨基酸序列的Fc结构域的犬IgGD。

37.如权利要求1至36中任一项所述的多肽，其中所述野生型犬IgG是犬IgGA，并且所述犬IgG Fc区变体或所述其犬FcRn结合区包含与SEQ ID NO:9至少80％相同的氨基酸序列。

38.如权利要求1至36中任一项所述的多肽，其中所述野生型犬IgG是犬IgGB，并且所述犬IgG Fc区变体或所述其犬FcRn结合区包含与SEQ ID NO:10至少80％相同的氨基酸序列。

39.如权利要求1至36中任一项所述的多肽，其中所述野生型犬IgG是犬IgGC，并且所述犬IgG Fc区变体或所述其犬FcRn结合区包含与SEQ ID NO:11至少80％相同的氨基酸序列。

40.如权利要求1至36中任一项所述的多肽，其中所述野生型犬IgG是犬IgGD，并且所述犬IgG Fc区变体或所述其犬FcRn结合区包含与SEQ ID NO:12至少80％相同的氨基酸序列。

41.如权利要求1至40中任一项所述的多肽，所述多肽还包含结合结构域。

42.如权利要求41所述的多肽，其中所述结合结构域包含(i)免疫球蛋白分子的六个互补决定区(CDR)；(ii)犬受体蛋白的配体结合结构域，(iii)纳米抗体，或(iv)犬受体蛋白的细胞外结构域。

43.如权利要求41或权利要求42所述的多肽，其中所述结合结构域特异性结合选自由以下组成的组的抗原：NGF、TrKA、ADAMTS、IL-1、IL-2、IL-4、IL-4R、血管紧张素1型(AT1)受体、血管紧张素2型(AT2)受体、IL-5、IL-12、IL-13、IL-31、IL-33、CD3、CD20、CD47、CD52和补体系统复合物。

44.如权利要求1至43中任一项所述的多肽，所述多肽还包含选自由以下组成的组的蛋白质：EPO、CTLA4、LFA3、VEGFR1/VEGFR3、IL-1R、IL-4R、GLP-1受体激动剂和血小板生成素结合肽。

45.如权利要求1至44中任一项所述的多肽，其中在结合测定中，所述多肽在酸性pH下以比在中性pH下更高的水平结合犬FcRn。

46.如权利要求45所述的多肽，其中在结合测定中，所述多肽在pH 5.5下以比在pH 7.4下更高的水平结合犬FcRn。

47.如权利要求46所述的多肽，其中在结合测定中，所述多肽在pH 6.0下以比在pH 7.4下更高的水平结合犬FcRn。

48.一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)如权利要求1至47中任一项所述的多肽和(ii)药学上可接受的赋形剂。

49.一种或多种核酸，所述一种或多种核酸编码如权利要求1至47中任一项所述的多肽。

50.一种或多种表达载体，所述一种或多种表达载体包含如权利要求49所述的一种或多种核酸。

51.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求49所述的一种或多种核酸或如权利要求50所述的一种或多种表达载体。

52.一种制备多肽的方法，所述方法包括：

(a)提供如权利要求49所述的一种或多种核酸；

(c)从所述宿主细胞培养物收集在(b)中产生的所述多肽。

53.如权利要求52所述的方法，所述方法还包括将所述多肽配制成药物制剂。

54.一种治疗有需要的狗的犬疾病或病症的方法，所述方法包括向所述狗施用有效量的包含如权利要求48所述的药物组合物的组合物。

55.一种预防有需要的狗的犬疾病或病症的方法，所述方法包括向所述狗施用有效量的包含如权利要求48所述的药物组合物的组合物。

56.如权利要求54或权利要求55所述的方法，其中所述犬疾病或病症是变应性疾病、慢性疼痛、急性疼痛、炎性疾病、自身免疫性疾病、内分泌疾病、胃肠疾病、心血管疾病、肾病、生育相关病症、感染性疾病或癌症。

57.如权利要求54或权利要求55所述的方法，其中所述犬疾病或病症是特应性皮炎、变应性皮炎、骨关节炎性疼痛、关节炎、贫血或肥胖症。

58.如权利要求48所述的药物组合物，其用于治疗有需要的狗的犬疾病或病症的方法中。

59.如权利要求48所述的药物组合物，其用于预防有需要的狗的犬疾病或病症的方法中。

60.根据权利要求58或权利要求59所述的使用的药物组合物，其中所述犬疾病或病症是变应性疾病、慢性疼痛、急性疼痛、炎性疾病、自身免疫性疾病、内分泌疾病、胃肠疾病、心血管疾病、肾病、生育相关病症、感染性疾病或癌症。

61.根据权利要求58或权利要求59所述的使用的药物组合物，其中所述犬疾病或病症是特应性皮炎、变应性皮炎、骨关节炎性疼痛、关节炎、贫血或肥胖症。

62.如权利要求1至47中任一项所述的多肽在制造用于治疗有需要的狗的犬疾病或病症的药物中的用途。

63.如权利要求1至47中任一项所述的多肽在制造用于预防有需要的狗的犬疾病或病症的药物中的用途。

64.如权利要求62或权利要求63所述的用途，其中所述犬疾病或病症是变应性疾病、慢性疼痛、急性疼痛、炎性疾病、自身免疫性疾病、内分泌疾病、胃肠疾病、心血管疾病、肾病、生育相关病症、感染性疾病或癌症。

65.如权利要求62或权利要求63所述的用途，其中所述犬疾病或病症是特应性皮炎、变应性皮炎、骨关节炎性疼痛、关节炎、贫血或肥胖症。