JP2002320482A - 新規ルシフェラーゼおよび発光蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 十脚類（Decapoda）ヒオドシエビ由来のルシ
フェラーゼ、これをコードするポリヌクレオチド、その
発光蛋白質の製造法を提供する。 【解決手段】 ヒオドシエビから発光活性を有する分泌
型ルシフェラーゼを単離・精製し、本分泌型ルシフェラ
ーゼが分子量１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋白質で構
成されていることを明らかにした。そして、該ルシフェ
ラーゼの構成蛋白質である１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ
蛋白質をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子の塩基配
列および該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を決
定した。さらに、該遺伝子を含む組換えベクターを作製
し、該ベクターを用いる無細胞発現系または該ベクター
で形質転換した宿主、例えば大腸菌もしくは動物培養細
胞を用いる蛋白質発現系によって前記蛋白質を製造し
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、十脚類（Decapod
a）由来のルシフェラーゼ、具体的にはヒオドシエビ（O
plophorus gracilirostris）由来の分泌型ルシフェラー
ゼに関する。詳細には、１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの
蛋白質から構成される該ルシフェラーゼ、１９ｋＤａお
よび３５ｋＤａの蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝
子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクター
で形質転換した宿主、並びに該宿主を培養するまたは該
組換えベクターを用いてインビトロ−トランスクリプシ
ョン−トランスレーションを実施することを特徴とする
発光活性を有する蛋白質の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、ルシフェラーゼおよび発光蛋白質
をコードする遺伝子は、表１に示される文献に開示され
るもののみが知られている。

【０００３】

【表１】

【０００４】これらの発光蛋白質およびルシフェラーゼ
は、産業上重要な酵素として、例えばレポーター蛋白質
として既に広く利用されている。これら酵素群の発光反
応を利用した種々の検出法の開発に伴い、発光検出装置
が普及し、また、高感度化など該装置も進歩している。
しかし、このような状況下において、これまでに知られ
ている発光蛋白質およびルシフェラーゼの中で、広範囲
の用途に適用し得るルシフェラーゼまたは発光蛋白質は
存在せず、それぞれの目的に適合する酵素を選択する必
要があった。

【０００５】一方、学術論文、特許明細書等に開示され
ている発光基質（ルシフェリンと称される）について、
その構造が決定されているものは下記の式（１）〜式
（８）に示すもののみである。

【化１】

【０００６】

【化２】

【０００７】

【化３】

【０００８】

【化４】

【０００９】

【化５】

【００１０】

【化６】

【００１１】

【化７】

【００１２】

【化８】

【００１３】発光基質には生物種特異的であるものと生
物種非特異的なものがあり、更にその他の生体成分（補
酵素、補欠分子等）を必要とする発光反応がある。生物
発光酵素反応のうち最小単位での発光反応は、発光酵素
ルシフェラーゼ、発光基質ルシフェリン、分子状酸素の
３者のみで発光反応が起きる場合である。

【００１４】表１における最小単位での発光反応の例
は、腔腸動物の花虫類（Cindaria）に属するレニラ（Re
nilla）由来ルシフェラーゼ、甲殻類（Ostracoda）に属
するウミホタル（Cypridina）由来のルシフェラーゼと
鞭毛藻類（Flagellata）に属するゴニオラックス（Gony
aulax）由来のルシフェラーゼであるが、これらに対応
する発光基質ルシフェリンの構造は、例えば前記式
（４）および（５）に示すように非常に複雑である。例
えば、ウミホタルおよびゴニオラックスルシフェリンの
合成法は知られているが、その複雑な合成工程のために
収率が悪く、天然抽出ルシフェリンが使用されている。
このため、価格が非常に高価であり、産業用としての実
用性は乏しい。これに対し、セレンテラジンとして知ら
れているレニラルシフェリンは種々の方法が確立されて
いるため、セレンテラジンおよびその誘導体は安価に販
売されており、容易に取得することができる。

【００１５】また、表１の発光蛋白質群において、天然
に存在する分泌型ルシフェラーゼは、ウミホタルルシフ
ェラーゼのみであり、その遺伝子構造はThompson, E.
M., et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6567-6
571 (1989年）に、その使用例は、Inouye, S., et.al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 9584-9587 (1992
年) に開示されている。

【００１６】分泌型ルシフェラーゼの産業上有効な点
は、ドラッグスクリーニングシステム等のバイオアッセ
イ系を構築する場合、細胞外分泌するルシフェラーゼを
レポーター分子として用いることにより、細胞破砕せ
ず、生細胞においてその活性を容易に検出できることで
ある。また、本来分泌性の蛋白質を製造することは、宿
主−ベクター系を適切に選別すればさほど困難でなく、
培養液中からの組換え蛋白質の精製は容易である。この
ため、分泌型ルシフェラーゼを大量に製造する場合、そ
の製造・精製のコストを押さえることができるという利
点がある。

【００１７】さらに、発光反応が最小単位、即ち発光酵
素ルシフェラーゼ、発光基質ルシフェリンおよび分子状
酸素の３者のみで起こり、且つ発光基質ルシフェリンが
取得が容易なセレンテラジンまたはその誘導体であり、
該ルシフェラーゼが分泌型蛋白質である発光反応系が特
に有利である。しかし、そのような分泌型のルシフェラ
ーゼの遺伝子単離および生細胞での発現は報告されてい
ない。このような分泌型ルシフェラーゼおよびその遺伝
子は学術基礎、応用研究の領域に留まらず、診断薬や検
査薬等、産業上有用である。

【００１８】発明者は、先行技術文献等を調査・検討し
た結果、これまで確認されているセレンテラジンを発光
基質とした分泌型ルシフェラーゼは、十脚類（Decapod
a）に属する発光エビ由来のルシフェラーゼのみである
ことを知った。発光エビは分泌性のルシフェラーゼ（酵
素）を有し、これをルシフェリン（発光基質）および分
子状酸素と反応させると青色に発光する。世界中に生息
する発光エビ分類の詳細は、Herring, P.J., J. Mar. B
iol. Ass. U.K., 56, 1029-1067 (1976年)に開示されて
いる。そして、発光エビのルシフェラーゼに関する唯一
の生化学的研究としては、静岡県の駿河湾に生息する深
海発光エビであるヒオドシエビ（Oplophorus graciliro
stris）についてのShimomura, O., Masugi, T., Johnso
n, F.H. &Haneda, Y., Biochemistry, 17, 994-998(197
8年)である。前記先行技術は、分子量３１,０００のモ
ノマーの４量体からなる分子量約１３０,０００を有す
るルシフェラーゼを開示しており、さらに当該ルシフェ
ラーゼの２２℃における光子収量が０.３２であり、高
発光活性（１.７５×１０¹⁵Ｐｈｏｔｏｎ／ｓ.mg）を有
し、最適発光温度は４０℃で熱安定性にすぐれ、幅広い
ｐＨで反応が進むことを記載している。

【００１９】このヒオドシエビル由来のシフェラーゼの
発光反応におけるルシフェリンは前記の式（２）に示さ
れるセレンテラジンである。セレンテラジンはレニラ
（Renilla）ルシフェラーゼ反応、および発光蛋白質イ
クオリン（Aequorin）の発光反応の発光基質でもある。
これらの酵素群とヒオドシエビのルシフェラーゼの最大
の相違点は、レニラルシフェラーゼや発光蛋白質イクオ
リンの発光基質特異性と比較して、ヒオドシエビのルシ
フェラーゼは非常に幅広い基質特異性を示す点にある。
即ち、ヒオドシエビのルシフェラーゼは、発光基質セレ
ンテラジン誘導体として安価に合成できるビスデオキシ
セレンテラジンを使用することができ、他のルシフェラ
ーゼ酵素と比較して有利である。

【００２０】しかしながら、分泌型ヒオドシエビ由来の
ルシフェラーゼについて、上記先行技術に記載されてい
ること以外について、例えばその蛋白質構造および遺伝
子構造に関する情報は全く得られていない。発光エビの
多くは深海に生息するため実験材料としての生個体の大
量入手が非常に困難であることがその理由と考えられ
る。また、近年の環境変化の影響等により個体が減少
し、少量の生固体の入手さえも困難になってきている状
況である。このため、生物資源の一つであるヒオドシエ
ビの遺伝子ライブラリーの構築とともに、早急なヒオド
シエビルシフェラーゼ遺伝子の単離が望まれている。

【００２１】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、深海に生息するヒオドシエビ由来のルシフェラーゼ
遺伝子を単離し、該遺伝子を用いて高純度の組換え分泌
型ルシフェラーゼ蛋白質を提供することである。また、
本発明の目的は、該遺伝子を含む組換えベクター、該組
換えベクターで形質転換した宿主細胞、例えば微生物お
よび動物培養細胞、並びに高純度の組換え分泌型ルシフ
ェラーゼ蛋白質の製造方法を提供することである。

【００２２】

【課題を解決するための手段】ヒオドシエビから発光活
性を有する分泌型ルシフェラーゼを単離・精製した結
果、分子量１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋白質から構
成される分泌型ルシフェラーゼを見出した。そして、各
々の蛋白質のアミノ酸配列を部分的に決定し、これに基
づきルシフェラーゼの構成蛋白質である１９ｋＤａおよ
び３５ｋＤａ蛋白質をコードする遺伝子を単離し、該遺
伝子の塩基配列および該遺伝子によりコードされるアミ
ノ酸配列を決定した。さらに、該遺伝子を含む組換えベ
クターを作製し、該ベクターを用いる無細胞発現系およ
び該ベクターで形質転換した宿主、例えば大腸菌や酵母
などの微生物または動物培養細胞を用いる蛋白質発現系
によって前記蛋白質を製造した。

【００２３】即ち、本発明は、十脚類（Decapoda）由来
のルシフェラーゼに関する。具体的には、１９ｋＤａお
よび３５ｋＤａの蛋白質から構成される該ルシフェラー
ゼに関する。詳細には、ヒオドシエビ（Oplophorus gra
cilirostris）由来の１９ｋＤａおよび３５ｋＤａの蛋
白質から構成される分泌型ルシフェラーゼルに関する。

【００２４】本発明はまた、該ルシフェラーゼを構成す
る１９ｋＤａの蛋白質であって、発光活性を有する蛋白
質に関する。具体的には、前記発光蛋白質は、SEQ ID N
O：２に示されるアミノ酸配列の２８〜１９６番のアミ
ノ酸配列、またはそのアミノ酸配列において１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列を有し、且つ発光活性を有する蛋白質である。

【００２５】１９ｋＤａの蛋白質は、さらに当該技術分
野において知られている、蛋白質精製のためのペプチド
配列および／または細胞外分泌シグナルペプチドもしく
は細胞内器官への移行シグナルペプチドを含むことがで
き、そのようなシグナルペプチドは、１９ｋＤａ蛋白質
の前駆体由来のSEQ ID NO：２のアミノ酸配列１〜２７
番に包含されるシグナルペプチド、または他の公知のシ
グナルペプチドとすることができる。細胞外分泌シグナ
ルペプチドとしては、公知の真核生物の分泌シグナルペ
プチド（例えば、von Heijne, G. Eur. J. Biochem 13
3:17-21 (1983年)）および公知の原核生物の分泌シグナ
ルペプチド（例えば、von Heijne, G. &Abrahmsen, L.
FEBS Lett. 244: 439-446(1989年)に記載）を挙げるこ
とができる。また、細胞内器官への移行シグナルペプチ
ドとしては、ミトコンドリアへの移行シグナルペプチド
（例えば、Gavel, Y. ＆ von Heijne, G., Protein Eng
ineering 4: 33-37 (1990年)）、 クロロプラスト移行
シグナルペプチド（例えば、Gavel, Y.＆ von Heijne,
G., FEBS Lett. 261:455-458(1990年)）および核内移行
シグナルペプチド（例えば、Dingwall, C. & Laskey,
R.A., Trends Biochem.Sci. 16:478-481 (1991年)）を
挙げることができる。

【００２６】本発明はまた、該ルシフェラーゼを構成す
る分子量３５ｋＤａの蛋白質に関し、具体的にはSEQ ID
NO：４に示されるアミノ酸配列の４０〜３５９番のア
ミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列において１もしく
は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列を有する蛋白質に関する。前記３５ｋＤａの蛋
白質は、さらに３５ｋＤａ蛋白質の前駆体由来のSEQ ID
NO：４のアミノ酸配列１〜３９番に包含されるシグナ
ルペプチド、または上述のシグナルペプチドを含むこと
ができる。

【００２７】本発明はまた、前記１９ｋＤａの発光蛋白
質をコードするポリヌクレオチドに関する。そのような
ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO：１に示す塩基
配列の４６〜６３３番の塩基配列、（ｂ）前記塩基配列
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ
発光活性を有する蛋白質をコードする塩基配列、および
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩
基配列からなる群から選択される塩基配列を有する。

【００２８】本発明はまた、前記３５ｋＤａの蛋白質を
コードするポリヌクレオチドに関する。そのようなポリ
ヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO：３に示す塩基配列
の７９〜１１５５番の塩基配列、（ｂ）前記塩基配列と
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ発
光活性を有する蛋白質をコードする塩基配列、および
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩
基配列からなる群から選択される塩基配列を有する。

【００２９】前記１９ｋＤａの蛋白質をコードするポリ
ヌクレオチドおよび／または３５ｋＤａの蛋白質をコー
ドするポリヌクレオチドは、さらに公知の上述のペプチ
ド配列をコードするポリヌクレオチド、例えば上記文献
に開示されるシグナルペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを包含することができる。なお、本明細書におい
てポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ，ゲノムＤＮ
Ａ、合成ＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、合成ＲＮ
Ａ）を包含する。

【００３０】本発明はまた、上述したルシフェラーゼ、
前記１９ｋＤａの発光蛋白質、または前記１９ｋＤａお
よび３５ｋＤａの蛋白質に、セレンテラジンまたはその
誘導体を基質として作用させることを特徴とする発光方
法に関する。本発明のルシフェラーゼおよび発光蛋白質
は、酵素である該蛋白質、発光基質ルシフェリンである
セレンテラジンまたはその誘導体、および分子状酸素の
みで発光反応が起きる。その反応条件として、温度は１
０〜５０℃、好ましくは２０〜３５℃の範囲であり、ｐ
Ｈは５.５〜１１の範囲、好ましくは７〜１０の範囲で
ある。

【００３１】本発明はまた、１９ｋＤａの発光蛋白質お
よび／または３５ｋＤａの蛋白質をコードする前記ポリ
ヌクレオチドを挿入物として含有する組換えベクターに
関する。本発明の好ましい態様において、組換えベクタ
ーは、その挿入物を発現させうる組換え発現ベクターで
ある。そのような組換えベクターは、当該技術分野にお
ける公知の任意の方法で作製することができる。

【００３２】本発明において、前記蛋白質を発現させる
ために用いるベクターには、無細胞発現系（インビトロ
トランスクリプション−トランスレーション）に、お
よび宿主細胞、例えば大腸菌、酵母または動物培養細胞
を用いる蛋白質発現系に適するベクターとすることがで
き、そのようなベクターは市販されているかまたは公知
のベクターから容易に作製することができる。例えば、
インビトロトランスレーションおよび動物培養細胞にお
ける発現に用いるベクターは、ヒトサイトメガロウイル
スのimmeadiate-early エンハンサー／プロモター領域
を組込み、その下流域にＴ７のプロモター配列／マルチ
クローニング部位を有するｐＴａｒｇｅｔＴベクターや
ＳＶ４０エンハンサーとＳＶ４０のｅａｒｌｙプロモタ
ーを有するｐＳＩベクター（プロメガ社）、ｐＢＫ−Ｃ
ＭＶ、ＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＭＶ−Ｔａｇおよび
ｐＢＫ−ＲＳＶ（ストラタジーン社）などである。ま
た、大腸菌、酵母などの微生物宿主における発現に適す
るベクターは、例えば大腸菌系のＴ７のプロモターを有
するｐＥＴシリーズベクター発現システム（例えばｐＥ
Ｔ３ａ，ｐＥＴ２７ｂ（＋）やｐＥＴ２８ａ（＋）；ノ
バジェン社）、および酵母系においてはアルコールオキ
シダーゼのプロモターを有するピチア発現系ベクターｐ
ＩＣシリーズベクター（例えばｐＰＩＣ９ＫやＰＩＣ
３.５Ｋ；インビトロゲン社）などである。

【００３３】また、精製のためのペプチド配列として
は、当該技術分野にて用いられているペプチド配列とす
ることができるが、例えばヒスチジン残基が４個以上、
好ましくは６個以上連続したヒスチジンタグ配列、モノ
クローナル抗体への結合能を持つエピトープタグ配列、
グルタチオン Ｓ−トランストランスフェラーゼのグル
タチオンへの結合ドメインまたはプロテインＡをコード
する配列などが包含される。これらペプチド配列をコー
ドするＤＮＡを挿入物として含有するベクターは市販さ
れている。例えば、大腸菌、酵母などの微生物宿主に用
いるベクターは、大腸菌系のＴ７のプロモターを有し、
ヒスチジン残基を１０個をアミノ末端に融合発現ベクタ
ー（例えばｐＥＴ１６ｂ；ノバジェン社）、ヒスチジン
残基を６個をアミノ末端に有する発現ベクター（例えば
ｐＨＢ６；ロッシュダイアグノスチィック社、pＴｒｃ
−Ｈｉｓシリーズベクター；インヴィトロゲン社、ｐＨ
ＡＴベクターシリーズ；クローンテック社）などであ
る。動物培養細胞における発現に用いるベクターは、ヒ
スチジン残基を６個をアミノ末端に融合発現ベクター
（例えば、ｐＨＭ６やｐＶＭ６；ロッシュダイアグノス
チィック社）の使用が可能である。昆虫培養細胞系では
バキュロウイルス系のヒスチジン残基を６個をアミノ末
端に融合発現ベクター（例えば、pＢａｃPＡK−Ｈｉｓ
ベクター；クローンテック社）。また、グルタチオンＳ
−トランスフェラーゼと融合発現するpＧＥＸシリーズ
ベクター（ファルマシア）、プロテインＡを発現するｐ
ＲＩＴ２またはｐＥＺＺ１８ベクター（ファルマシア）
が使用可能である。

【００３４】本発明の蛋白質を製造するためのインビト
ロトランスレーションは、公知の方法、例えばSpirin,
A.S., et.al., Science 242: 1162-1164(1988年)および
Patnaik, R. & Swartz, J.M. Biotechniques 24: 862-
868(1998年)に記載の方法で実施することができ、市販
のインビトロトランスレーションキット（例えば、ＴＮ
Ｔ−インビトロトランスクリプション−トランスレーシ
ョンキット、プロメガ社製）を用いてもよい。

【００３５】本発明または、上述の組換えベクターで形
質転換した、宿主細胞、例えば微生物（大腸菌、酵母な
ど）および動物培養細胞（昆虫培養細胞、哺乳類培養細
胞、例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ７細胞など）に関する。

【００３６】従って、本発明は、１９ｋＤａの発光蛋白
質および／または３５ｋＤａの蛋白質をコードするポリ
ヌクレオチドを挿入物として含有する組換え発現ベクタ
ーを用いてインビトロトランスクリプション−トランス
レーションを実施することからなる、本発明のルシフェ
ラーゼまたはその構成成分である１９ｋＤａの発光蛋白
質および／または３５ｋＤａの蛋白質の製造方法に関す
る。さらに本発明は、前記組換え発現ベクターで形質転
換した宿主細胞を培養し、所望の蛋白質を単離すること
からなる、本発明のルシフェラーゼまたはその構成成分
である１９ｋＤａの発光蛋白質および／または３５ｋＤ
ａの蛋白質の製造方法に関する。

【００３７】本発明の蛋白質の製造方法において、発現
させた蛋白質は、宿主細胞の培養後、その培地からまた
は菌体の可溶性画分から単離することができ、実際に培
養した宿主細胞を破砕し、遠心分離した得られた可溶性
画分に十分な発光活性が検出された。しかし、大腸菌で
発現させた場合に、本発明の蛋白質、例えば１９ｋＤａ
の発光蛋白質が菌体内に封入体（インクルージョンボデ
イ）として大量に蓄積され（菌体の５％〜１０％程
度）、不活性状態にあることが見い出された。故に、封
入体を包含する不溶性画分から発現させた蛋白質を回収
し、再活性化を行うことができれば、発光活性を有する
所望の蛋白質をより多量に製造することが可能となる。

【００３８】故に、本発明の蛋白質の製造方法は、当該
技術分野において知られている蛋白質の可溶化剤でその
不溶性画分を処理することにより、所望の蛋白質を可溶
化して次いで単離・精製し、さらに単離した蛋白質を溶
媒として１つ以上の多価アルコールの存在下にて再生さ
せて、再活性化させることを包含する。

【００３９】発現した蛋白質の可溶化は、当該技術分野
において知られている可溶化剤、例えば尿素および／ま
たはグアニジン塩酸塩を用いて行うことができる。その
濃度は、尿素の場合は２〜８Ｍの範囲、好ましくは８Ｍ
であり、グアニジン塩酸塩の場合は１〜６Ｍの範囲、好
ましくは６Ｍである。またその際のｐＨは通常６〜９の
範囲、好ましくはｐＨ７〜８の範囲であり、処理温度は
通常１０〜６０℃の範囲、好ましくは２０〜３５℃の範
囲である。

【００４０】再生・再活性化において溶媒として用いる
ことができる多価アルコールは、例えばグリセリン、ポ
リエチレングリコール、プロピレングリコール、デキス
トラン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、
キシリトール、ショ糖、果糖およびブドウ糖からなる群
から選択される１つ以上の多価アルコールであり、好ま
しくはグリセリン、ポリエチレングリコールおよび／ま
たはプロピレングリコール、より好ましくはグリセリン
である。また、多価アルコールの濃度範囲は、１０〜９
０％(W／V)、好ましくは３０〜９０％(W／V)、より好ま
しくは５０〜７０％(W／V)である。

【００４１】また、本発明の蛋白質の製造方法におい
て、発現させた蛋白質は公知の方法により単離・精製さ
れるが、その精製法としては公知の任意の方法から適宜
選択することができる。例えば、本発明の蛋白質が上述
した精製のためのペプチド配列を包含する場合、これを
用いて精製するのが好ましい。具体的には、ヒスチジン
タグ配列にはニッケルキレートアフィニティークロマト
法、Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへ
の結合ドメインにはグルタチオン結合ゲルによるアフィ
ニティークロマト法、プロテインＡまたは他の蛋白質の
配列の場合には抗体アフィニティークロマト法を用いる
ことができる。

【００４２】さらに本発明は、下記のアミノ酸配列の繰
り返し単位： （Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｘａａ
−（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｘａ
ａ−（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐ
ｒｏ （但し、Ｘａａは任意のアミノ酸を示す。）を有する蛋
白質であって、前記ルシフェラーゼを構成し、且つルシ
フェラーゼを安定化する機能を有する蛋白質に関する。
このようなロイシンリピート構造は、図２に示すよう
に、３５ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列に見出されるも
のである。従って、前記３５ｋＤａ蛋白質と同様に、ル
シフェラーゼを安定化する機能を有することが期待され
る。

【００４３】本発明はまた、抗原として前記ルシフェラ
ーゼ、前記１９ｋＤａもしくは３５ｋＤａの蛋白質また
はそれらの断片を抗原として作製され、且つ前記抗原と
特異的に結合する抗体、例えばポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体に関する。前記抗原として、抽出
した天然の蛋白質、組換え蛋白質、これらの蛋白質の部
分的分解物、または本発明の蛋白質のアミノ酸配列に基
づく合成ペプチドを用いることができる。そのような抗
原は、例えばSEQ ID NO：２に示されるアミノ酸配列の
２８〜１９６番のアミノ酸配列、SEQ ID NO：４に示さ
れるアミノ酸配列の４０〜３５９番のアミノ酸配列、ま
たは前記アミノ酸配列から選択される少なくとも５個の
連続したアミノ酸配列、好ましくは１０〜１５アミノ酸
残基からなるポリペプチドである。本発明にかかる抗体
は、常法（例えば、Harlow, E. &Lane, D, in Antibodi
es-Laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory
Press., pp53-138 (1988年)）に従って作製することが
できる。

【００４４】本発明にかかる抗体は、ヒオドシエビ由来
の分泌型ルシフェラーゼ、またはこれを構成する蛋白質
の検出に用いることができるが、これらと配列相同性が
ある他のルシフェラーゼまたは発光蛋白質の検出および
検索にも使用することができる。従って、本発明はま
た、前記抗体を用いるルシフェラーゼまたは発光蛋白質
の検出および／または検索方法に関し、前記方法によっ
て同定される新規なルシフェラーゼまたは発光蛋白質も
また本発明に包含される。本発明の検出および／または
検索法によれば、分類上に近種ルシフェラーゼを容易に
取得することが可能である。

【００４５】上述のルシフェラーゼまたは発光蛋白質の
検出および／または検索方法は、例えば他の発光エビま
たは発光蛋白質（酵素）を包含している他の生物もしく
はその組織の粗抽出物を試料として、本発明の抗体が結
合する蛋白質を検出・検索することからなる。そのよう
な検出手段としては、例えばイムノブロット、イムノア
フィ二ティクロマトグラフィーを挙げることができる。
また、他の発光エビまたは発光蛋白質（酵素）を包含し
ている他の生物もしくはその組織のＤＮＡライブラリー
について、本発明の抗体を用いてエクスプレッション
クローニング（Sambrook, J., Fritsch,E.F., & Maniat
is,T., Molecular Cloning − a Laboratory Mannual,
second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s. pp12.3-12.44 (1989年)）を実施して、新規なルシフ
ェラーゼまたは発光蛋白質をコードするＤＮＡを直接得
ることができる。

【００４６】本発明はまた、SEQ ID NO：２に示される
本発明の１９ｋＤａ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配
列およびその相補的配列において、少なくとも１０個の
連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマ
ー、詳細にはSEQ ID NO：１の塩基配列またはその相補
的な塩基配列において、少なくとも１０個の連続した塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌ
クレオチドの長さは、好ましくはアミノ酸５個の長さに
対応する１４個であるのが好ましく、アミノ酸７個に対
応する２０個以上であるのがさらに好ましい。そのよう
なプライマーにはその５′末端に適する制限酵素部位を
包含させることができる。

【００４７】本発明はまた、SEQ ID NO：４に示される
本発明の３５ｋＤａ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配
列およびその相補的配列において、少なくとも１０個の
連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマ
ー、詳細にはSEQ ID NO：３の塩基配列またはその相補
的な塩基配列において、少なくとも１０個の連続した塩
基配列からなるオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌ
クレオチドの長さは、上述した通りであり、同様にその
５′末端に適する制限酵素部位を包含させることができ
る。

【００４８】これらオリゴヌクレオチドプライマーは、
本発明のルシフェラーゼを構成する蛋白質をコードする
ＤＮＡおよびＲＮＡの検出に用いるとができ、その手法
としては公知の遺伝子検出法を用いることができるが、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が特に好ましい。

【００４９】また、これらのプライマーを用いて、他の
発光エビまたは発光蛋白質（酵素）を包含している他の
生物もしくはその組織のＤＮＡライブラリー（ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ）から、新規なルシフェラーゼまたは
発光蛋白質をコードするＤＮＡをクローニングすること
もできる。その手段としては、公知の適する方法を用い
ることができるが、ＰＣＲ法が好ましい。

【００５０】従って、本発明はまた、これらオリゴヌク
レオチドプライマーを用いる、ルシフェラーゼを構成す
る蛋白質および発光蛋白質をコードする遺伝子の検出お
よび／または検索法に関し、前記方法によって検索され
る新規ルシフェラーゼ、これを構成する新規蛋白質およ
び発光蛋白質、並びに該蛋白質をコードする新規遺伝子
もまた本発明に包含される。本発明の検出および／また
は検索法によれば、分類上に近種ルシフェラーゼ、具体
的には相同性が５０％程度までのルシフェラーゼ遺伝子
を容易に取得することが可能である。

【００５１】下記の実施例により本発明のルシフェラー
ゼ、これを構成する蛋白質の単離および精製、該蛋白質
をコードする遺伝子の単離ならびにそれらの同定法につ
いてについて説明する。

【００５２】

【実施例】実施例１ 発光エビのルシフェラーゼの精製
と構成蛋白質の同定 材料である発光ヒオドシエビ（学名：Oplophorus graci
lirostris）は、静岡県駿河湾で行われている桜エビ漁
の網に混入するヒオドシエビを採取した。粗精製物は、
Shimomura, O., Masugi, T., Johnson, F.H. & Haneda,
Y., Biochemistry 17:994-998（1978年）に記載の方法
に従って調製した。さらに、精製度をあげるため疎水性
クロマトグラフィーであるブチルセファロース４ファー
ストフロー（ファルマシア社、カラムサイズ：０.７cm
（直径）×３.５cm）を使用し、１.５Ｍ 硫酸アンモニ
ウムを含有する２０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８.５
の緩衝液で平衡化したカラムより、硫酸アンモニウム濃
度を下げることにより溶出し発光活性をもつ画分を集め
た。この画分を５０mM 塩化ナトリウム含有２０mMＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８.５の緩衝液で平衡化したスーパ
ーデックスカラム（ファルマシア社、カラムサイズ：１
cm（直径）×４８cm）に供しゲルろ過を行った。同一カ
ラムでの分子量サイズマーカー（ａ：アミラーゼ（２０
０ｋＤａ），ｂ：アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０
ｋＤａ），ｃ：血清アルブミン（６７ｋＤａ），ｄ：オ
ボアルブミン（４３ｋＤａ），ｅ：カルボニックアンハ
イドラーゼ（３０ｋＤａ）およびｆ：リボヌクレアーゼ
（１３.７ｋＤａ））と比較した結果、ヒオドシエビの
ルシフェラーゼの分子量は、約１０６ｋＤａであった。
その結果を図１に示す。また、精製酵素の比活性は１.
３×１０¹⁵ｑｕａｎｔａ／ｓ.mgであった。

【００５３】精製したサンプルについて、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（１２％アクリルアミドゲル）によって分析した。
その結果、精製画分は、分子量３５ｋＤａと１９ｋＤａ
の蛋白質で構成されていることが明かとなった。更に、
精製した蛋白質（２５μg）を０.１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ
０.３mlに溶解し、ゲルろ過カラムによる高速液体ク
ロマトグラフィーにて分離した。即ち、０.１Ｍの塩化
ナトリウムおよび０.１％のＳＤＳを含む２０mMのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.７の溶媒系で、ゲルろ過用カラ
ムＴＳＫ３０００ＳＷ（東ソー、０.７５cm（直径）×
３０cm）を使用し、分離蛋白質を吸光度２８０nmで検出
した。その結果、２つの主ピークを検出し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ分析の結果、それぞれのピークは分子量３５ｋＤ
ａと１９ｋＤａの蛋白質に対応することが明らかとなっ
た。以上のことより、分子量が約１０６ｋＤａを示すヒ
オドシエビの有する本発明のルシフェラーゼは、分子量
３５ｋＤａと１９ｋＤａの蛋白質それぞれ２個より構成
されることが明らかとなった。

【００５４】実施例２ ルシフェラーゼのアミノ酸配列
の決定 アミノ酸配列の決定は、常法によって気相シークエンサ
ー（アプライドバイオシステム社製のモデル４７０型）
用いて実施した。サンプル調製は以下の通りである。

【００５５】１）精製ルシフェラーゼは、１２％アクリ
ルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量３５ｋ
Ｄａの蛋白質と分子量１９ｋＤａの蛋白質を分離後、エ
レクトロブロット法を用いて、１５０ｍＡ、１時間の条
件でポリビニリデンジフルオライド メンブレン（ＰＶ
ＤＦ膜、ミリポア社製）にトランスファーした。染色
後、分子量１９ｋＤａと３５ｋＤａの蛋白質部分をそれ
ぞれ切り出して、シークエンサーに供し、その部分的ア
ミノ酸配列を決定した。

【００５６】２）精製ルシフェラーゼ（５０μg）を５
Ｃ４カラム（ウオーターズ社製、カラムサイズ：０.３
９cm（直径）×１５cm）を用い逆相系の高速液体クロマ
トグラフィーにて分離した。溶媒系はトリフルオロ酢酸
０.１％を含むアセトニトリル／水で、アセトニトリル
勾配（８０分間で０％から８０％に上ける）によって溶
出し、蛋白質画分を吸光度２２０nmで検出してピーク画
分を集め、減圧下に濃縮して、シークエンサーを用いて
そのアミノ酸配列を決定した。分子量３５ｋＤａの蛋白
は、リジンエンドペプチダーゼ（ベーリンガー社製、シ
ークエンスグレード）を重量比５０分の１にて処理し、
ペプチド断片を５Ｃ８カラム（バイダック社製、カラム
サイズ：０.４６cm（直径）×２５cm）を用い逆相系の
高速液体クロマトグラフィーにて分離した。溶媒系は、
トリフルオロ酢酸０.１％を含むアセトニトリル／水
で、アセトニトリル勾配（８０分間で１５％から５５％
に上げる）によって溶出し、ペプチド断片画分を吸光度
２２０nmで検出してピーク画分を集め、シークエンサー
を用いてその部分的アミノ酸配列を決定した。

【００５７】上述のように決定された酸配列を以下に示
す。 分子量１９ｋＤａの蛋白質について決定したアミノ
酸配列 N-末端配列（SEQ ID NO：５）：Phe-Thr-Leu-Ala-Asp-P
he-Val-Gly-Asp-Trp-Gln-Gln-Thr-Ala-Gly-Tyr-Asn-Gln
-Asp-Gln-Val-Leu-Glu-Gln-Gly-Gly-Leu-Ser 分子量３５ｋＤａの蛋白質について決定したアミノ
酸配列 N-末端配列（SEQ ID NO：６）：Ala-Val-Ala-(x)-Pro-A
la-Ala-Glu-Asp-Ile-Ala-Pro-(x)-Thr-(x)-Lys-Val-Gly
-Glu-Gly-Asp-Val-Met-Asp-Met-Asp-(x)-Ser-Lys （ここで(x)は、未決定アミノ酸を示す。） リジンエンドペプチダーゼ処理により得られたペプ
チド断片の配列： a) Val-Thr-Ser-Asp-Ala-Glu-Leu-Ala-Ser-Ile-Phe-Ser
-Lys-Thr-Phe-Pro（SEQ ID NO：７） b) Asn-Asp-Leu-Ser-Ser-Phe-Pro-Phe-Glu-Glu-Met-Ser
-Gln-Tyr-Thr-Lys（SEQ ID NO：８） c) Leu-Val-Leu-Gly-Tyr-Asn-Gly-Leu-Thr-Ser-Leu-Pro
-Val-Gly-Ala-Ile（SEQ ID NO：９） d) Asn-Leu-Asp-Pro-Ala-Val-Phe-His-Ala-Met-(x)-Gln
（SEQ ID NO：１０）

【００５８】実施例３ ヒオドシエビのｃＤＮＡ遺伝子
ライブラリーの作製およびルシフェラーゼ遺伝子クロー
ニング 駿河湾に生息するヒオドシエビを採取し、直ちにドライ
アイス上で凍結を行い、使用まで−８０℃で保存した。
全ＲＮＡの調製は、Inouye, S. & Tsuji, F.I., FEBS L
ett., 315, 343-346 (1993年) に記載のグアニジンイソ
チオシアネート法により行った。その結果、２尾（体長
４０mm、重さ２.８ｇ）のヒオドシエビから２Ｍ Ｌｉ
Ｃｌを用いて得られた全ＲＮＡの沈澱を回収し、約０.
９mgの全ＲＮＡを得た。続いて、ポリ(Ａ)⁺ＲＮＡをオ
リゴ(ｄＴ)−セルロース スパンカラム（ファルマシア
社製）を用いて精製し、Kakizuka, A., Yu, R., Evans,
R.M. & Umesono, K., in Essential Developmental Bi
ology (Stern, C.D. ed.),IRL Press, Oxford, U.K., p
p223-232 (1993年) に記載の方法に従い、２μｇのポリ
(Ａ)⁺ＲＮＡをｄＴ_12-18をプライマーとして、ｃＤＮＡ
合成キット（タイムセーバーｃＤＮＡ合成キット；ファ
ルマシア−バイオテック社製）を用いてｃＤＮＡを合成
した。合成したｃＤＮＡ（２０ng）にＥｃｏＲＩ／Ｎｏ
ｔＩの制限酵素部位を有するリンカーを付加し、予め１
μgの牛小腸由来アルカリフォスファターゼ処理をした
λＺａｐＩＩベクター（ストラタジーン社製）に全量５
μlを添加し、４℃、１６時間処理してこれらを連結さ
せた。次いで、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＧｏｌｄIII（スト
ラタジーン社製）のパッケージング・キットを用いて、
ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その力価は、１.１
×１０⁶プラーク形成／ユニットであった。

【００５９】実施例４ 合成オリゴヌクレオチドプロー
ブおよびＰＣＲプライマーの調製 スクリーニング用およびＰＣＲ用のオリゴヌクレオチド
は、市販業者へ化学合成による合成を依託して入手し
た。遺伝子ライブラリーから分子量１９ｋＤａおよび３
５ｋＤａ蛋白質に対応するｃＤＮＡを分離するためのオ
リゴヌクレオチドプローブは、実施例２により得られた
上記のアミノ酸配列の情報をもとにそれぞれ作製した。

【００６０】１９ｋＤａ蛋白質については、Ala-Gly-Ty
r-Asn-Gln-Asp-Gln（SEQ ID NO：１１）のアミノ酸配列
に対応するオリゴヌクレオチドプローブＳＯＬ−２
（5′GCN-GGN-TA(T/C)-AA(T/C)-CA(A/G)-GA(T/C)-CA
3′）（SEQ ID NO：１３）を、そして３５ｋＤａ蛋白質
については、Gly-Asp-Val-Met-Asp-Met-Asp（SEQ ID N
O：１２）のアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチ
ドプローブＯＬ−３（5′GTN-GT(T/C)-GTN-ATG-GA(T/C)
-ATG-TC 3′）（SEQ ID NO：１４）を合成した。

【００６１】実施例５ ルシフェラーゼを構成する１９
ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質をコードする遺伝子のク
ローニング 実施例３で得られたｃＤＮＡライブラリーについて、実
施例４で合成したオリゴヌクレオチドプローブを用い
て、Wallace, R.B., et.al., Nucl. Acids Res.,9, 879
-897（1981年）に記載のプラークハイブリダイゼーショ
ン法によって、１９ｋＤａ蛋白質についてはプローブＳ
ＯＬ−２を、３５ｋＤａ蛋白質についてはプローブＯＬ
−３を用いてスクリーニングを実施した。ＳＯＬ−２お
よびＯＬ−３は、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰで５′末端ラベル
して標識プローブとして用いた。ｃＤＮＡライブラリー
から直径１５cmのＬＢ−培地プレート（１.２％ アガ
ロース，水１Ｌ中、バクトトリプトン１０ｇ、イースト
エキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ，pH７.２）
に、３５,０００個のファージプラークが生成するよう
に蒔き、３７℃で８時間培養後、それぞれ２枚のフィル
ターをとり、アルカリＤＮＡ変性、中和、風乾後、紫外
線照射しＤＮＡを固定した。そして、フィルターを２０
mlのハイブリダイゼーション液（９００mM ＮａＣｌ，
９０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８.０），６mM ＥＤＴ
Ａ，０.２％牛血清アルブミン、０.２％ポリビニルピロ
リドン、０.２％フィコール、１％ＳＤＳ、５０μg／ml
熱変性サケ精子ＤＮＡ）に入れ、５０℃で１時間保温し
た。更に新しいハイブリダイゼーション液と入れ替えて
１時間保温後、³²Ｐ−標識プローブを加えて５０℃で一
昼夜ハイブリダイゼーションした。溶液を捨て、室温で
フィルターをＳＳＣ緩衝液（３００mM ＮａＣｌ，３０
mM クエン酸ナトリウム）で３回洗浄後、オートラジオ
グラフィーにかけた。強いシグナルを示すファージ部分
をかき出し、２次スクリーニングを同様に行い、単一の
ポジティブクローンを分離した。クローン化ファージか
らのプラスミドベクターへの変換は、ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ ｐｈａｇｅｍｉｄ系（ストラタジーン社製）を
用いて行った。結果として、ＳＯＬ−２にポジティブな
クローンを、遺伝子ライブラリー３００,０００個から
１個取得し、一方、ＯＬ−３にポジティブなクローンを
７０,０００個から９個得た。

【００６２】実施例６ 組換えベクターの調製 実施例５で得られたクローンを用い、それぞれの組換え
ベクタープラスミドを、常法により大腸菌からアルカリ
法で調製した。分子量１９ｋＤａ蛋白質に由来し、ＳＯ
Ｌ−２にポジティブな１個のクローンから得られた組換
えプラスミドをｐＫＡＺ−４１２と命名した。他方、分
子量３５ｋＤａ蛋白質に由来し、ＯＬ−３にポジティブ
な９個のクローンから得られた組換えプラスミドについ
て制限地図切断試験を行った結果、９個とも同一制限酵
素地図を示したため、最長なクローンを選択し、これを
ｐＯＬ−２３と命名した。

【００６３】実施例７ 遺伝子配列の決定およびルシフ
ェラーゼ遺伝子の同定 塩基配列の決定は、ダイターミネーターサイクルシーク
エンシング法を用いて、アプライドバイオシステム社の
蛍光シークエンサー（ＡＢＩ ３７３および３７７型）
により決定し、SEQ ID NO：１およびSEQ ID NO：３に示
すように遺伝子の塩基配列を明らかにした。

【００６４】その結果、シグナルペプチド配列を含む１
９ｋＤａ蛋白はSEQ ID NO：２に示す１９６アミノ酸か
ら構成され、これはSEQ ID NO：１に示す塩基配列のう
ち４６〜６３３に相当することが分かった。しかし、１
９ｋＤａ蛋白質は、実施例２にて決定されたアミノ末端
のアミノ酸配列から、分泌のために必要なシグナルペプ
チド配列を除いたSEQ ID NO：２の２８〜１９６番アミ
ノ酸により示される１６９アミノ酸よりなる分子量１
８,６８９.５０ダルトン（約１９ｋＤａ）のポリペプチ
ドであって、等電点が４.７０と推定される。

【００６５】同様に、シグナルペプチド配列を含む３５
ｋＤａ蛋白は、SEQ ID NO：４に示す３５９アミノ酸か
ら構成され、これはSEQ ID NO：３に示す塩基配列のう
ち７９〜１１５５に相当することが分かった。そして、
３５ｋＤａ蛋白質は、実施例２にて決定されたアミノ末
端のアミノ酸配列から、分泌のために必要なシグナルペ
プチド配列を除いたSEQ ID NO：４の４０〜３５９番ア
ミノ酸に示される３２０アミノ酸よりなる分子量３４,
８３７.０８ダルトン（約３５ｋＤａ）のポリペプチド
であって、等電点が４.６１と推定される。

【００６６】一方、実施例２にて決定されたペプチド断
片のアミノ配列は全て、塩基配列の情報から得られるSE
Q ID NO：２または SEQ ID NO：４のアミノ酸配列と完
全に一致した。このことより、クローン化されたｐＫＡ
Ｚ−４１２およびｐＯＬ−２３は、ヒオドシエビルシフ
ェラーゼを構成する１９ｋＤａと３５ｋＤａ蛋白質をコ
ードする遺伝子であることが明らかとなった。

【００６７】実施例８ ヒオドシエビルシフェラーゼ由
来のSEQ ID NO：１−４に示される配列のデーターベー
ス検索 SEQ ID NO：１−４に示される配列（アミノ酸配列、ヌ
クレオチド配列）について、相同性等を遺伝子データベ
ース（National Center for Biotechnology informatio
nに登録されている全てのデーターベース）を用いて検
索した。解析ソフトはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等を用い
た。SEQ ID NO：１およびSEQ ID NO：３の塩基配列につ
いては、すべてのエントリー遺伝子に対して、SEQ ID N
O：２およびSEQ ID NO：４のアミノ酸配列については、
エントリーアミノ酸配列およびエントリー遺伝子より翻
訳されるアミノ酸配列に対して行った。その結果、SEQI
D NO：１およびSEQ ID NO：３の塩基配列と著しい相同
性のある遺伝子配列は検出されなかった。また、SEQ ID
NO：２およびSEQ ID NO：４のアミノ酸配列について
も、顕著な相同性を有する配列は検出されなかった。特
に、セレンテラジンを含むイミダゾピラノジン化合物関
連蛋白質であるレニラルシフェラーゼ（３６ｋＤａ；Ｇ
ｅｎＢａｎｋ、Ｍ６３５０１）、イクオリン（２１.５
ｋＤａ；ＧｅｎＢａｎｋ，Ｌ２９５７１）、レニラルシ
フェリン結合蛋白質（２０.５ｋＤａ；ＳＷＩＳＳ−Ｐ
ＲＯ，Ｐ０５９３８）、ウミホタルルシフェラーゼ（５
８.５ｋＤａ；ＧｅｎＢａｎｋ、Ｍ２５６６６）、ホタ
ルルシフェラーゼ、発光細菌ルシフェラーゼとは、全く
相同性は検出できなかった。

【００６８】しかし、SEQ ID NO：２に示される１９ｋ
Ｄａ蛋白質のアミノ酸配列は、大腸菌のアミンオキシダ
ーゼ（登録番号ｐｉｒ １４０９２４）のドメインＤ３
−Ｓ１領域（アミノ酸配列２１７−３９２番）と弱い相
同性（２６％（同一のアミノ酸：４４／１６９），４９
％（類似のアミノ酸：８３／１６９））があり、また脂
肪酸結合蛋白（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｌ２３３２２）のアミ
ノ末端領域（アミノ酸配列１〜４７番）とも弱い相同性
（２８％（同一のアミノ酸：１３／４７），５１％（類
似のアミノ酸：２４／４７））があるが、機能的な相同
性は検出できなかった。

【００６９】また、図２に示すように、SEQ ID NO：４
に示される３５ｋＤａ蛋白質のアミノ酸配列は、下記の
繰り返し単位： (Leu/Ile)-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-(Leu/Ile)-Xaa-Xaa-Asn-Xa
a-(Leu/Ile)-Xaa-Xaa-Xaa-Pro（Xaa：任意のアミノ酸） に示される、ロイシンに富むリピート構造を有すること
が明らかとなった。

【００７０】実施例９ ルシフェラーゼに対する抗体の
作製およびウエスタンブロット法によるルシフェラーゼ
蛋白質の検出法 実施例１により得られた高度に精製したヒオドシエビル
シフェラーゼ（８０μg）を抗原として、常法によりニ
ュージーランドホワイトウサギに免疫を行い、ヒオドシ
エビルシフェラーゼを構成する１９ｋＤａおよび３５ｋ
Ｄａ蛋白質に対する抗体の作製を試みた。Inouye, S.お
よびTsuji, F.I., Anal. Biochem., 201: 114-118 (199
2年)に従って、抗体血清を５００倍希釈で使用したウエ
スタンブロット法にで分析した結果、作製された抗体は
１９ｋＤａおよび３５ｋＤａを特異的に認識した（図
３）。これにより、得られた本抗体を用いれば、ヒオド
シエビルシフェラーゼ、および類似する配列を有し且つ
類似な高次構造を有する他のルシフェラーゼまたは発光
蛋白質の検出または検索が可能となる。

【００７１】実施例１０ ルシフェラーゼ構成蛋白質発
現ベクターの構築 実施例６で得られた組換えベクターｐＫＡＺ−４１２お
よびｐＯＬ−２３を発現ベクターに挿入し、得られた発
現ベクターを用いて大腸菌内および培養細胞内で該蛋白
質を発現させた。用いた発現ベクターの制限酵素地図
を、図４および図５に示す。 （１）大腸菌内での発現ベクターは、１９ｋＤａまたは
３５ｋＤａ蛋白質をコードする、即ちSEQ ID NO：２の
２８〜１９６番のアミノ酸配列またはSEQ ID NO：４の
４０〜３５９番のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ断片を
ＰＣＲ法を用いて調製し、該ＤＮＡ断片を、市販ヒスチ
ジンタグを有するｐＴｒｃＨｉｓ−Ｂベクター（インビ
トロゲン社製）の制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位に挿
入することによって作製することができる。具体的に
は、 １９ｋＤａ蛋白質発現ベクター場合 ｐＫＡＺ−４１２を鋳型として２種のＰＣＲプライマ
ー：ＫＡＺ−３（5′CCGGCTAGC-TTT-ACG-TTG-GCA-GAT-T
TC-GTT-GGA 3′；ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダーライ
ン）（SEQ ID NO：１５）、およびＴ７−ＢｃａＢＥＳ
Ｔ（5′TAATACGACTCACTATAGGG 3′）(SEQ ID NO：１６) を用いて、ＰＣＲキット（日本ジーン社製）にてＰＣＲ
（サイクル条件２５サイクル；１分／９４℃、１分／５
０℃、１分／７２℃）を実施して、所望のＤＮＡ領域を
増幅した。得られた断片をＰＣＲ精製キット（キアゲン
社製）で精製し、常法により制限酵素ＮｈｅＩ／Ｘｈｏ
Ｉ消化した後，ｐＴｒｃＨｉｓ−Ｂの制限酵素ＮｈｅＩ
／ＸｈｏＩ部位に連結することによって、発現ベクター
ｐＨｉｓ−ＫＡＺを構築した。

【００７２】 ３５ｋＤａ蛋白質発現ベクターの場合 ｐＯＬ−２３を鋳型として２種のＰＣＲプライマー：Ｏ
Ｌ−７（5′CCGTCTAGA-GCT-GTT-GCC-TGT-CCT-GCA-GCC
3′；ＸｂａＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SEQ I
D NO：１７）およびＯＬ−８（5′GCCGTCGAC-TTA-TTG-G
CA-CAT-TGC-ATG-GAA 3′；ＳａｌＩ制限酵素部位はアン
ダーライン）（SEQ ID NO：１８） を用いて、ＰＣＲキット（日本ジーン社製）にて（ＰＣ
Ｒ（サイクル条件２５サイクル；１分／９４℃、１分／
５０℃、１分／７２℃）を実施して、所望のＤＮＡ領域
を増幅した。得られた断片をＰＣＲ精製キット（キアゲ
ン社製）で精製し、常法により制限酵素制限酵素Ｘｂａ
Ｉ／ＳａｌＩ消化した後、ｐＴｒｃＨｉｓ−Ｂの制限酵
素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位に連結することによって、発
現ベクターｐＨｉｓ−ＯＬを構築した。

【００７３】（２）動物培養細胞での発現ベクターは、
１９ｋＤａまたは３５ｋＤａ蛋白質をコードする、即ち
SEQ ID NO：２の２８〜１９６番のアミノ酸配列またはS
EQ IDNO：４の４０〜３５９番のアミノ酸配列に対応す
るＤＮＡ断片をＰＣＲ法を用いて調製し、該ＤＮＡ断片
をＮｈｅＩ／ＸｂａＩ消化した後、市販レニラルシフェ
ラーゼ発現ベクターｐＲＬ−ＣＭＶ（プロメガ社製）の
ＮｈｅＩ／ＸｂａＩレニラルシフェラーゼ遺伝子部分と
置き換えることによって作製することができる。 分泌シグナル配列を有する１９ｋＤａ蛋白発現ベク
ターｐＳＫＡＺ−ＣＭＶおよび分泌シグナル配列を欠失
した１９ｋＤａ蛋白発現ベクターｐＫＡＺ−ＣＭＶを、
下記のプライマー： ＫＡＺ−１：5′CCGGCTAGCCACC-ATG-GCG-TAC-TCC-ACT-C
TG-TTC-ATA 3′（ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダーライ
ン）（SEQ ID NO：１９） ＫＡＺ−２：5′CCGGCTAGCCACC-ATG-TTT-ACG-TTG-GCA-G
AT-TTC-GTT-GGA 3′（ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダー
ライン）（SEQ ID NO：２０） ＫＡＺ−５：5′CCGCTCTA-GAA-TTA-GGC-AAG-AAT-GTT-CT
C-GCA-AAG-CCT 3′（ＸｂａＩ制限酵素部位はアンダー
ライン）（SEQ ID NO：２１） を使用して（１）と同様にＰＣＲ法によって構築した。
ここで、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶの構築にはプライマーＫＡ
Ｚ−１とＫＡＺ−５を、またｐＫＡＺ−ＣＭＶの構築に
はプライマーＫＡＺ−２とＫＡＺ−５を使用した。

【００７４】 分泌シグナル配列を有する３５ｋＤａ
蛋白発現ベクターｐＳＯＬ−ＣＭＶおよび分泌シグナル
配列を欠失した３５ｋＤａ蛋白発現ベクターｐＯＬ−Ｃ
ＭＶを、下記プライマー： ＯＬ−４：5′CCGGCTAGCCACC-ATG-GCT-GTC-AAC-TTC-AAG
-TTT 3′（ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダーライン）
（SEQ ID NO：２２） ＯＬ−５：5′CCGGCTAGCCACC-ATG-GCT-GTT-GCC-TGT-CCT
-GCA-GCC 3′（ＮｈｅＩ制限酵素部位はアンダーライ
ン）（SEQ ID NO：２３） ＯＬ−６：5′CCGCTCTAGAA-TTA-TTG-GCA-CAT-TGC-ATG-G
AA 3′（ＸｂａＩ制限酵素部位はアンダーライン）（SE
Q ID NO：２４） を使用して、上記と同様にＰＣＲ法によって構築し
た。ここで、ｐＳＯＬ−ＣＭＶの構築にはプライマーＯ
Ｌ−４とＯＬ−６を、またｐＯＬ−ＣＭＶの構築にはプ
ライマーＯＬ−４とＯＬ−５を使用した。

【００７５】実施例１１ ルシフェラーゼ構成蛋白質の
無細胞系での発現 実施例１０で構築した発現ベクターｐＫＡＺ−ＣＭＶ、
ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶ、ｐＯＬ−ＣＭＶおよびｐＳＯＬ−
ＣＭＶ、並びに陽性コントロールとしてレニラルシフェ
ラーゼを発現するｐＲＬ−ＣＭＶを用いて、無細胞系で
ヒオドシエビルシフェラーゼ構成蛋白質遺伝子を発現さ
せた。無細胞系の遺伝子発現は、組換えプラスミドまた
は該プラスミドより調製したｍＲＮＡから蛋白質を製造
する方法であり、特に検出感度の高い発光系においては
有用である。本実施例においては、市販のインビトロト
ランスレーションキット（ＴＮＴ−インビトロトランス
クリプション−トランスレーションキット、プロメガ社
製）を使用した。また、発現蛋白質の分泌シグナルペプ
チドの存在を確認するため、分泌シグナルペプチド切断
活性を持つマイクロゾーム膜画分を添加した。反応は、
０.５μgのプラスミドＤＮＡ、２０μlのウサギ網状赤
血球、１μlの１mM−メチオニン、２.５μlのマイクロ
ゾーム膜画分を加えて、全量を２５μlとし３０℃で９
０分保温した後、反応溶液の１μＬの発光活性を測定し
た。

【００７６】発光測定のための反応溶液は、全量が１０
０μlでＥＤＴＡを１０mMの濃度で含む５０mM濃度のＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７.６）溶液に基質セレンテラジン
１μgを加え、酵素を添加することにより発光反応を開
始し、発光をルミフォトメーターで検出した。結果を表
２に示す。なお、発光相対値１(ｒｌｕ)＝１.２５×１
０７フォトン／秒である。

【００７７】

【表２】

【００７８】ｐＫＡＺ−ＣＭＶには顕著な活性が見い出
され、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶにマイクロゾーム膜画分添加
することにより、その効率は低いものの活性が約２０倍
上がることから、ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶ発現の１９ｋＤａ
蛋白質のアミノ末端には、分泌シグナルペプチド様配列
の存在が確認された。分泌シグナルペプチド様配列の問
題は、他の効率的に切断される公知の分泌シグナルペプ
チドを付加またはこれと置換することにより解決するこ
とができる。また、実施例５で作製したルシフェラーゼ
抗体を用いて、インビトロトランスレーション産生蛋白
質をウエスタンブロット分析により解析した結果、１９
ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質の発現が確認された。

【００７９】実施例１２ ルシフェラーゼを構成する蛋
白質の大腸菌での発現 実施例１０で構築した発現ベクターｐＨｉｓ−ＫＡＺと
ｐＨｉｓ−ＯＬ、およびコントロールプラスミドとして
ｐＴｒｃＨｉｓ−Ｂを用いて、常法に従って大腸菌ＢＬ
２１株を形質転換した。得られた形質転換株の一晩培養
液０.１mlをアンピシリン（５０μg／ml）含有ＬＢ液体
培地（１０ml）に植菌し、３７℃で２時間振盪培養後、
最終濃度が１mMになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に３時
間培養した。その菌体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供し
て、発現蛋白質を確認した。その結果、分子量２０ｋＤ
ａおよび３６ｋＤａに相当する発現蛋白質のバンドを確
認した。これらの発現蛋白質には、ニッケルキレートカ
ラムで精製可能な６個のヒスチジン配列を含む１４アミ
ノ酸配列を付加しているため、分子量サイズが大きくな
っていると考えられる。また、これらのバンドは、ヒス
チジン配列を特異的に認識するモノクローナル抗体（キ
アゲン社製）および実施例９で作製したポリクローナル
抗体を用いたウエスタンブロット解析では、両方の抗体
により認識されることため、発現蛋白質はアミノ末端に
ヒスチジン配列を有するヒオドシエビルシフェラーゼの
構成蛋白質（分子量１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白
質）であることが確認された。

【００８０】上記ＩＰＴＧで発現誘導処理した培養液１
mlを１０,０００rpmで遠心分離し、集めた菌体を１mlの
緩衝液（３０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０mM ＥＤＴ
Ａ，pH７.６）に懸濁し超音波破砕した。１０,０００rp
m、４℃で遠心分離し、上清を細胞抽出液とした。得ら
れた細胞抽出液に対して、セレンテラジンまたはビスデ
オキシセレンテラジンを基質として１μg添加して、発
光活性をルミフォトメーターで測定した。その結果を表
３に示す。

【００８１】

【表３】

【００８２】この表から各々の活性を比較すると、ｐＨ
ｉｓ−ＫＡＺを保持する菌株の活性は、負の対照である
ｐＴｒｃＨｉｓ−ＢおよびｐＨｉｓ−ＯＬの約一万倍で
ある。従って、ヒオドシエビルシフェラーゼを構成する
１９ｋＤａおよび３５ｋＤａ蛋白質のうち、分子量１９
ｋＤａ蛋白質が発光活性を有することが明らかとなり、
発光反応を１９ｋＤａ単独でも行うことができること、
ビスデオキシセレンテラジンを基質として利用できるこ
とが明らかとなった。このため、３５ｋＤａの蛋白質
は、基質特異性に直接関与せず、発光活性を有する１９
ｋＤａ蛋白質に熱耐性を付与するなど、ルシフェラーゼ
（酵素）の安定性を付与する機能を有していることが示
唆される。

【００８３】実施例１３ ルシフェラーゼを構成する蛋
白質の動物培養細胞での発現 実施例１０で構築した、動物培養細胞での発現ベクター
である、プラスミドｐＫＡＺ−ＣＭＶ、ｐＳＫＡＺ−Ｃ
ＭＶ、ｐＯＬ−ＣＭＶおよびｐＳＯＬ−ＣＭＶ、並びに
正のコントロールとしてレニラルシフェラーゼを発現す
るｐＲＬ−ＣＭＶを、培養細胞ＣＯＳ７細胞にトランス
フェクションすることにより、ヒオドシエビルシフェラ
ーゼ構成蛋白質遺伝子の発現を試みた。ＣＯＳ７細胞
（２×１０ ⁵個）は、１０％（v／v）の熱不活性化胎牛
血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、ペニシリン（１００
単位／ml）、ストレプトマイシン（１００μg／ml）を
含むダルベッコ変型イーグル培地３mlを含有する３５mm
シャーレ中で培養した。２４時間後、細胞を、トランス
フェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ社製）を用
いて２μgのプラスミドＤＮＡで形質転換した。更に３
６時間培養した後、細胞と培地を分離した。得られた細
胞を０.５mlのリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、−８０
℃での凍結と３７℃での融解を繰り返して抽出液を得
た。セレンテラジンおよびビスデオキシセレンテラジン
を基質として１μg添加して、発光活性をルミフォトメ
ーターで測定した。その結果を表４に示す。

【００８４】

【表４】

【００８５】活性を比較した結果、ｐＫＡＺ−ＣＭＶ、
ｐＳＫＡＺ−ＣＭＶおよび正のコントロールｐＲＬ−Ｃ
ＭＶのみに顕著な発光活性が見い出された。ｐＳＫＡＺ
−ＣＭＶの培養液への分泌効率が低いことは、実施例１
１の結果と一致する。一方、ｐＫＡＺ−ＣＭＶの発光強
度が現在レポータープラスミドとして市販されているｐ
ＲＬ−ＣＭＶと同等であることから、ヒオドシエビ由来
のルシフェラーゼの１９ｋＤａ蛋白質遺伝子は、動物培
養細胞系でのレポーター遺伝子として充分使用すること
が可能であることが示された。

【００８６】実施例１４ 大腸菌の封入体からの発現蛋
白質の単離およびその再生 実施例１１にて構築した組換え発現プラスミドｐＨｉｓ
−ＫＡＺで形質転換し、実施例１２で培養した菌体を２
０mlの２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７.５、
に懸濁し、超音波破砕装置（ブランソン社製：モデル２
５０型）で細胞を破壊後、冷却高速遠心機（１２,００
０×ｇ，２０分）により封入体を包含する沈殿不溶性画
分と可溶画分とに分離した。

【００８７】（１）尿素による発現蛋白質の可溶化 不溶性画分を先ず２０mlの２Ｍ尿素（和光純薬社製）を
含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５に超
音波処理により十分に懸濁後、遠心分離（１２,０００
×ｇ，２０分）して不溶性画分を回収し、この操作を２
回繰り返す。２Ｍの濃度では目的の１９ｋＤａ蛋白質は
殆ど（５％以下）可溶化しないが、他の蛋白質不純物は
かなり除去された。回収した不溶性画分に２０mlの８Ｍ
尿素を含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.
５に十分に懸濁後、遠心分離（１２,０００×ｇ，２０
分）して、可溶化画分を回収した。電気泳動分析の結
果、１９ｋＤａ蛋白質の収率は９５％以上であった。こ
の回収画分をニッケルキレートカラムクロマトグラフィ
ーに供した。

【００８８】（２）グアニジン塩酸塩による発現蛋白質
の可溶化 不溶性画分を２０mlの０.５Ｍグアニジン塩酸塩（和光
純薬社製）を含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐ
Ｈ７.５に超音波処理により十分に懸濁後、遠心分離
（１２,０００×ｇ，２０分）して不溶性画分を回収
し、この操作を２回繰り返した。回収した不溶性画分に
２０mlの６Ｍグアニジン塩酸塩を含む２０mMＴｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５に懸濁後、遠心分離（１２,０
００×ｇ，２０分）して、上清の可溶化画分を回収し
た。電気泳動分析の結果、電気泳動分析の結果、１９ｋ
Ｄａ蛋白質の収率は９０％以上であった。この回収画分
を８モル尿素にて１０倍に希釈してニッケルキレートカ
ラムクロマトに供した。

【００８９】（３）グアニジン塩酸塩および尿素による
発現蛋白質の可溶化 上記（２）と同様に不溶性画分を０.５Ｍ グアニジン
塩酸塩で２回処理した。得られた不溶性画分を２０mlの
８Ｍ尿素を含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ
７.５に懸濁後、遠心分離（１２,０００×ｇ，２０分）
して、上清の可溶化画分を回収した。電気泳動分析の結
果、電気泳動分析の結果、１９ｋＤａ蛋白質の収率は９
０％以上であった。この回収画分をニッケルキレートカ
ラムクロマトに供した。

【００９０】（４）ニッケルキレートゲルクロマトグラ
フィーによる精製 ニッケルキレートゲルはキレートゲルファーストフロー
（ファルマシア社）と０.０１Ｍの塩化ニッケル水溶液
を混合することにより調整し、カラム（カラムサイズ：
１cm（直径）×６cm）に充填した。カラムゲルは濃度８
Ｍの尿素を含む、濃度２０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７.５）緩衝液（以下に緩衝液Ａと記載する）で平衡化
したカラムに（１）〜（３）にて調製した可溶性画分を
供した。緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、０.３Ｍのイ
ミダゾール（和光純薬社）で吸着した蛋白質を溶出し
た。溶出画分（約１０ml）を１Ｌの緩衝液Ａ中において
４℃で１８時間透析を行い、イミダゾールを除去した。
透析試料を再度を緩衝液Ａで平衡化した上記カラムに供
し、緩衝液Ａ３０mlで洗浄後、イミダゾールの０〜０.
３Ｍの直線的濃度勾配（全溶出量，１００ml）によりヒ
スチジンを有する１９ｋＤａ蛋白質を溶出した。精製さ
れた蛋白質の純度は９５％であった。バイオラッド社製
の色素結合法による蛋白質定量の結果、４００mlの培養
菌体から６.８mg蛋白質を得た。

【００９１】（５）精製１９ｋＤａ蛋白質の再生・再活
性化 上記（４）にて精製した１９ｋＤａ蛋白質は全く発光活
性を示さない。そこで、多価アルコール溶媒としてグリ
セリン（和光純薬）を用い、精製した蛋白質をグリセリ
ン最終濃度（v／w）０％〜９０％の溶液中に２５℃で、
３０分間放置し、上述のように発光活性を測定した。
（１）の尿素よる可溶化試料についての結果を表５に示
す。

【００９２】

【表５】

【００９３】その結果、尿素を含まない緩衝液で処理す
ることによりわずかに再活性化されるが、グリセリンを
添加することにより再活性化が顕著に増加することが示
された。特にグリセリン濃度が５０〜７０％の場合、グ
リセリンを添加しないものと比較して約５０倍の再活性
化が観察された。その再生の効率は、天然のルシフェラ
ーゼ活性を基準に算出した結果、約６０〜８０％であっ
た。また、（２）および（３）にて可溶化した場合でも
同様な結果が得られた。

【００９４】さらに再生処理した当該蛋白質をグリセリ
ン０％または５０％中にて、４℃で３０日間保存し、そ
の発光活性を測定した。その結果、グリセリン０％では
保存前と比較して発光活性が約１／５に低下したが、グ
リセリン５０％では、−２０℃で保存した場合（データ
は示さない）と同様に、ほとんど活性の低下が認められ
なかった。このことは、再生した活性化１９ｋＤａ蛋白
質は、グリセリン（５０〜７０％）中で安定に保存する
ことが可能でありことを示している。保存試験の結果を
下記の表に示す。

【００９５】

【表６】

【００９６】

【発明の効果】本発明によれば、深海に生息するヒオド
シエビ由来のルシフェラーゼが分子量１９ｋＤａおよび
分子量３５ｋＤａの蛋白質から構成されることが明らか
となり、さらに該蛋白質をコードする遺伝子が単離さ
れ、該遺伝子を用いて高純度の組換え分泌型ルシフェラ
ーゼ蛋白質が提供される。また、該遺伝子を含む組換え
ベクター、該組換えベクターで形質転換した細菌および
動物培養細胞が得られ、これを用いた分泌型ルシフェラ
ーゼ蛋白質の製造方法が提供される。これは、本発明の
ルシフェラーゼおよびその構成蛋白質を大量に調製する
ことができることを意味する。本発明において調製され
たルシフェラーゼおよびその構成蛋白質（特に分子量１
９ｋＤａの蛋白質）は多くの測定・分析法に適用するこ
とができ、また診断薬や検査薬としても有用である。さ
らに、本発明の蛋白質を抗原として作製される抗体、該
蛋白質をコードするＤＮＡから得られるプライマーは、
本発明のルシフェラーゼ、またはこれを構成する蛋白
質、およびこれらと相同性がある他のルシフェラーゼま
たは発光蛋白質の検出、検索およびそのクローニングに
用いることができる。

【００９７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> CHISSO CORPORATION <120> Novel luciferase and photoprotein <130> DOJ-5524 <141> 2001-4-26 <150> JP2000-125053 <151> 2000-04-26 <160> 24 <210> 1 <211> 866 <212> DNA <213> Oplophorus gracilirostris <220> <221> CDS <222> (46)(633) <400> 1 tgtttgggtt ataggtggta tatcattaac tctacttgag agaagatggc gtactccact 60 ctgttcataa ttgcattgac cgccgttgtc actcaagctt cctcaactca aaaatctaac 120 ctaactttta cgttggcaga tttcgttgga gactggcaac agacagctgg atacaaccaa 180 gatcaagtgt tagaacaagg aggattgtct agtctgttcc aagccctggg agtgtcagtc 240 acgcccatac agaaagttgt actgtctggg gagaatgggt taaaagctga tattcatgtc 300 ataatacctt acgagggact cagtggtttt caaatgggtc taattgaaat gatcttcaaa 360 gttgtttacc ccgtggatga tcatcatttc aagattattc tccattatgg tacactcgtt 420 attgacggtg taacacccaa catgattgac tactttggaa gaccttaccc tggaattgct 480 gtatttgacg gcaagcagat cacagttact ggaactctgt ggaacggcaa caagatctat 540 gatgagaggc taatcaaccc tgatggttca ctcctcttca gagttactat caatggagtc 600 acgggatgga ggctttgcga gaacattctt gcctaaatta catctcgaga attgcttaaa 660 gcctttttat gtctataaat tggagtggaa aatgtataat acatatgatt tttaggacag 720 ttattttatt taattgctca cttaaattta aatctgaaga ccactataac tgttcagaat 780 ggaactgtag tcaaactgta ttaaatgcat taaagatctt atcatatgat ttagaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaataaaaa aaaaaa 866 <210> 2 <211> 196 <212> PRT <213> Oplophorus gracilirostris <400> 2 Met Ala Tyr Ser Thr Leu Phe Ile Ile Ala Leu Thr Ala Val Val Thr 16 Gln Ala Ser Ser Thr Gln Lys Ser Asn Leu Thr Phe Thr Leu Ala Asp 32 Phe Val Gly Asp Trp Gln Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Gln Asp Gln Val 48 Leu Glu Gln Gly Gly Leu Ser Ser Leu Phe Gln Ala Leu Gly Val Ser 64 Val Thr Pro Ile Gln Lys Val Val Leu Ser Gly Glu Asn Gly Leu Lys 80 Ala Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser Gly Phe Gln 96 Met Gly Leu Ile Glu Met Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp 112 His His Phe Lys Ile Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly 128 Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Pro Gly Ile 144 Ala Val Phe Asp Gly Lys Gln Ile Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn 160 Gly Asn Lys Ile Tyr Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu 176 Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu 192 Asn Ile Leu Ala 196 <210> 3 <211> 1302 <212> DNA <213> Oplophorus gracilirostris <220> <221> CDS <222> (79)(1155) <400> 3 tagcgtagct gcatcctggt gtcgtcgacc ctctccagca tcatcatctg tggaagttcg 60 aacatctcgc agagcaaaat ggctgtcaac ttcaagttta gcctccttac cataaccatt 120 gttgttaata tcttagtcta ttgcaatgca tcagcaatta aattcgatgt tgatttggag 180 aaggttccct ctaatgctgt tgcctgtcct gcagccgaag atattgcccc ttgcacctgc 240 aaagtgggtg aaggcgacgt tatggatatg gattgctcca aagtaacaag tgacgctgaa 300 cttgcttcca tatttagtaa aacgtttccc tctaacacct tccgtgaatt atttattgaa 360 ttcaatcgcg agattacgac tctgacagct gatagtttgg gagcagcaac atttacaaaa 420 atcgctatta ctagttgtac tcaattgaag accatagaag aaaatgcttt tatggccagt 480 gctgccacac tcgagaaact cgtgctctta aaaaatgatc tttcctcttt tccttttgaa 540 gaaatgtcac aatacacaaa attaaattgg cttgaattat ccgtaaatag cattacagga 600 tggccagctc tctcatcgga tacactagct aaccttattt tgttccgtaa tcctattggt 660 aatattccag ttgatgcctt ccagactctt cctaatatcg aacaattcaa ctgcttcgat 720 tgtagcatca ccgaagtgga agcaggtact tttactagat caccaaaact ccaaaagctt 780 gtgttaggtt ataacggtct gactagcctt cccgtaggcg ccatcaaact ccatggacat 840 ggcccaacca cttccaactt gggtatcacc aataatcaga tcatcagttt ccccgagggt 900 gctgttgaag gcatccaagg catccttgga attgacttta atcgtgtaac atctctaagt 960 gaggaagtgt ggcgaccaat tttagaaaat cttttccaat tcagcttgct taacaaccca 1020 ctagcatgtg tatgtgacgt aatgtggctt attgatagcc cagaattgct ggcaaaaatt 1080 aaaggcaatc cccgatgtgc cggtggaaaa agactcaaga atttggatcc agctgttttc 1140 catgcaatgt gccaataaga agaagaagaa gaattgagtc ctcctgtatc tacttctgaa 1200 gaagaagaag aagaagaatc attaaaataa caactaatat tttttaaata taaatcacaa 1260 tgtatttata cagtgtagtg gcaaatacag ta 1302 <210> 4 <211> 359 <212> PRT <213> Oplophorus gracilirostris <400> 4 Met Ala Val Asn Phe Lys Phe Ser Leu Leu Thr Ile Thr Ile Val Val 16 Asn Ile Leu Val Tyr Cys Asn Ala Ser Ala Ile Lys Phe Asp Val Asp 32 Leu Glu Lys Val Pro Ser Asn Ala Val Ala Cys Pro Ala Ala Glu Asp 48 Ile Ala Pro Cys Thr Cys Lys Val Gly Glu Gly Asp Val Met Asp Met 64 Asp Cys Ser Lys Val Thr Ser Asp Ala Glu Leu Ala Ser Ile Phe Ser 80 Lys Thr Phe Pro Ser Asn Thr Phe Arg Glu Leu Phe Ile Glu Phe Asn 96 Arg Glu Ile Thr Thr Leu Thr Ala Asp Ser Leu Gly Ala Ala Thr Phe 112 Thr Lys Ile Ala Ile Thr Ser Cys Thr Gln Leu Lys Thr Ile Glu Glu 128 Asn Ala Phe Met Ala Ser Ala Ala Thr Leu Glu Lys Leu Val Leu Leu 144 Lys Asn Asp Leu Ser Ser Phe Pro Phe Glu Glu Met Ser Gln Tyr Thr 160 Lys Leu Asn Trp Leu Glu Leu Ser Val Asn Ser Ile Thr Gly Trp Pro 176 Ala Leu Ser Ser Asp Thr Leu Ala Asn Leu Ile Leu Phe Arg Asn Pro 192 Ile Gly Asn Ile Pro Val Asp Ala Phe Gln Thr Leu Pro Asn Ile Glu 208 Gln Phe Asn Cys Phe Asp Cys Ser Ile Thr Glu Val Glu Ala Gly Thr 224 Phe Thr Arg Ser Pro Lys Leu Gln Lys Leu Val Leu Gly Tyr Asn Gly 240 Leu Thr Ser Leu Pro Val Gly Ala Ile Lys Leu His Gly His Gly Pro 256 Thr Thr Ser Asn Leu Gly Ile Thr Asn Asn Gln Ile Ile Ser Phe Pro 272 Glu Gly Ala Val Glu Gly Ile Gln Gly Ile Leu Gly Ile Asp Phe Asn 288 Arg Val Thr Ser Leu Ser Glu Glu Val Trp Arg Pro Ile Leu Glu Asn 304 Leu Phe Gln Phe Ser Leu Leu Asn Asn Pro Leu Ala Cys Val Cys Asp 320 Val Met Trp Leu Ile Asp Ser Pro Glu Leu Leu Ala Lys Ile Lys Gly 336 Asn Pro Arg Cys Ala Gly Gly Lys Arg Leu Lys Asn Leu Asp Pro Ala 352 Val Phe His Ala Met Cys Gln 359 <210> 5 <211> 28 <212> PRT, N-terminal of 19 kDa protein, partial <213> Oplophorus gracilirostris <400> 5 Phe Thr Leu Ala Asp Phe Val Gly Asp Trp Gln Gln Thr Ala Gly Tyr 16 Asn Gln Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Leu Ser 28 <210> 6 <211> 29 <212> PRT, N-terminal of 35 kDa protein, partial <213> Oplophorus gracilirostris <400> 6 Ala Val Ala Xaa Pro Ala Ala Glu Asp Ile Ala Pro Xaa Thr Xaa Lys 14 Val Gly Glu Gly Asp Val Met Asp Met Asp Xaa Ser Lys 29 <210> 7 <211> 16 <212> PRT, partial <213> Oplophorus gracilirostris <400> 7 Val Thr Ser Asp Ala Glu Leu Ala Ser Ile Phe Ser Lys Thr Phe Pro 16 <210> 8 <211> 16 <212> PRT, partial <213> Oplophorus gracilirostris <400> 8 Asn Asp Leu Ser Ser Phe Pro Phe Glu Glu Met Ser Gln Tyr Thr Lys 16 <210> 9 <211> 16 <212> PRT, partial <213> Oplophorus gracilirostris <400>9 Leu Val Leu Gly Tyr Asn Gly Leu Thr Ser Leu Pro Val Gly Ala Ile 16 <210> 10 <211> 12 <212> PRT, partial <213> Oplophorus gracilirostris <400> 10 Asn Leu Asp Pro Ala Val Phe His Ala Met Xaa Gln 12 <210> 11 <211> 7 <212> PRT, 19 kDa protein, partial <213> Oplophorus gracilirostris <400> 11 Ala Gly Tyr Asn Gln Asp Gln <210> 12 <211> 7 <212> PRT, 35 kDa protein, partial <213> Oplophorus gracilirostris <400> 12 Gly Asp Val Met Asp Met Asp <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 13 gcnggntaya aycargayca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 14 gtngtygtna tggayatgtc 20 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 ccggctagct ttacgttggc agatttcgtt gga 33 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 taatacgact cactataggg <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 17 ccgtctagag ctgttgcctg tcctgcagcc 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 18 gccgtcgact tattggcaca ttgcatggaa 30 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 19 ccggctagcc accatggcgt actccactct gttcata 37 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 20 ccggctagcc accatgttta cgttggcaga tttcgttgga 40 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 ccgctctaga attaggcaag aatgttctcg caaagcct 38 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 ccggctagcc accatggctg tcaacttcaa gttt 34 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 23 ccggctagcc accatggctg ttgcctgtcc tgcagcc 37 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 ccgctctaga attattggca cattgcatgg aa 32

【図面の簡単な説明】

【図１】精製ヒオドシエビ由来ルシフェラーゼのゲル濾
過による分子量の決定を示す。

【図２】ヒオドシエビ由来の３５ｋＤａ蛋白質に存在す
るロイシンリピート配列を示す。

【図３】ヒオドシエビ由来のルシフェラーゼに対するポ
リクロナール抗体を用いたウエスタンブロット分析を示
す。

【図４】ヒオドシエビ由来のルシフェラーゼを構成する
１９ｋＤａ蛋白質遺伝子の制限酵素地図と発現ベクター
を模式的に示す図である。

【図５】ヒオドシエビ由来のルシフェラーゼを構成する
３５ｋＤａ蛋白質遺伝子の制限酵素地図と発現ベクター
を模式的に示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/66 ４Ｂ０６５ 9/02 Ｇ０１Ｎ 21/76 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｑ 1/66 21/78 Ｃ Ｇ０１Ｎ 21/76 33/58 Ｚ 21/78 Ｃ１２Ｒ 1:91 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/02 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/66 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 2G045 CB01 FB03 FB07 FB13 GC15 2G054 AA08 CA21 EA02 4B024 AA11 BA80 CA04 DA02 DA05 DA11 DA12 EA04 FA02 FA18 GA11 HA11 HA15 4B050 CC03 DD11 FF09E FF12E LL03 4B063 QA01 QQ06 QQ08 QQ23 QR66 QS02 QX02 4B065 AA26X AA90X AA90Y AB01 AC15 BA02 BA25 CA28 CA46 4H045 AA11 CA50 DA75 EA50 EA65 FA72

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 十脚類（Decapoda）由来であって、分子
   量１９ｋＤａおよび分子量３５ｋＤａの蛋白質から構成
   されるルシフェラーゼ。
2. 【請求項２】 十脚類が、ヒオドシエビ（Oplophorus g
   racilirostris ）である請求項１に記載のルシフェラー
   ゼ。
3. 【請求項３】 請求項１のルシフェラーゼを構成する、
   分子量１９ｋＤａの発光蛋白質。
4. 【請求項４】 前記発光蛋白質が、（ａ）SEQ ID NO：
   ２に示されるアミノ酸配列の２８〜１９６番のアミノ酸
   配列、または（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１も
   しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された
   アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請
   求項３記載の発光蛋白質。
5. 【請求項５】 さらに、精製のためのペプチド配列およ
   び／または細胞外分泌もしくは細胞内器官への移行のた
   めのシグナルペプチド配列を有する、請求項３または４
   に記載の蛋白質。
6. 【請求項６】 請求項３〜５のいずれか１項に記載の発
   光蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 （ａ）SEQ ID NO：１示す塩基配列の４
   ６〜６３３番の塩基配列、（ｂ）（ａ）の塩基配列とス
   トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ発光
   活性を有する蛋白質をコードする塩基配列、および
   （ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列と相補的な塩基配
   列からなる群から選択される塩基配列を有する、請求項
   ６記載のポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項１のルシフェラーゼを構成する、
   分子量３５ｋＤａの蛋白質。
9. 【請求項９】 前記蛋白質が、（ａ）SEQ ID NO：４に
   示されるアミノ酸配列の４０〜３５９番のアミノ酸配
   列、または（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１もし
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたア
   ミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する請求項
   ８記載の蛋白質。
10. 【請求項１０】 さらに、精製のためのペプチド配列お
    よび／または細胞外分泌もしくは細胞内器官への移行の
    ためのシグナルペプチド配列を有する、請求項８または
    ９に記載の蛋白質
11. 【請求項１１】 請求項８〜１０のいずれか１項に記載
    の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
12. 【請求項１２】 （ａ）SEQ ID NO：３に示す塩基配列
    の７９〜１１５５番の塩基配列、（ｂ）（ａ）の塩基配
    列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且
    つ前記ルシフェラーゼを構成する３５ｋＤａ蛋白質をコ
    ードする塩基配列、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）の
    塩基配列と相補的な塩基配列からなる群から選択される
    塩基配列を有する、請求項１１に記載のポリヌクレオチ
    ド。
13. 【請求項１３】 下記のアミノ酸配列の繰り返し単位を
    有する蛋白質であって、ルシフェラーゼを構成し、且つ
    ルシフェラーゼを安定化する機能を有する蛋白質。 （Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｘａａ
    −（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｘａ
    ａ−（Ｌｅｕ／Ｉｌｅ）−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐ
    ｒｏ （但し、Ｘａａは任意のアミノ酸を示す。）
14. 【請求項１４】 請求項１または２に記載のルシフェラ
    ーゼ、請求項３〜５のいずれか１項に記載の発光蛋白質
    またはその断片を抗原として作製され、且つ前記抗原と
    特異的に結合する抗体。
15. 【請求項１５】 請求項１５に記載の抗体と特異的に結
    合するルシフェラーゼまたは発光蛋白質。
16. 【請求項１６】 プロモーターに作動的に連結された、
    請求項６または１１に記載のポリヌクレオチドの少なく
    とも１つを挿入物として含有する組換え発現ベクター。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の発現ベクターで形
    質転換された宿主細胞。
18. 【請求項１８】 動物培養細胞または微生物細胞であ
    る、請求項１７に記載の宿主細胞。
19. 【請求項１９】 請求項１９に記載の組換えベクターを
    用いてインビトロトランスクリプション−トランスレー
    ションを実施して、発現した組換え蛋白質を単離するこ
    とからなる、請求項３または８に記載の蛋白質の少なく
    とも１つを製造する方法。
20. 【請求項２０】 請求項１７または１８に記載の宿主細
    胞を培養し、発現した組換え蛋白質を単離することから
    なる、請求項３または８に記載の蛋白質の少なくとも１
    つを製造する方法。
21. 【請求項２１】 さらに、溶媒として１つ以上の多価ア
    ルコールの存在下にて蛋白質を再生させてその酵素活性
    を再活性化させ、場合により前記溶媒中にて蛋白質を貯
    蔵することを包含する、請求項１９または２０に記載の
    方法。
22. 【請求項２２】 多価アルコールが、グリセリン、ポリ
    エチレングリコール、ポリプロピレングリコール、デキ
    ストラン、マンニトール、ソルビトール、イノシトー
    ル、キシリトール、ショ糖、果糖およびブドウ糖からな
    る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 SEQ ID NO：１の塩基配列またはその
    相補的な塩基配列において、少なくとも１０個の連続し
    た塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
24. 【請求項２４】 SEQ ID NO：３の塩基配列またはその
    相補的な塩基配列において、少なくとも１０個の連続し
    た塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
25. 【請求項２５】 請求項１もしくは２に記載のルシフェ
    ラーゼ、または請求項３〜５のいずれか１項に記載の発
    光蛋白質をレポーターとして用いて検出可能なシグナル
    を発生させることを特徴とする、診断のための分析物の
    検出方法。
26. 【請求項２６】 発光反応の基質としてセレンテラジン
    またはその誘導体を用いることを特徴とする、請求項２
    ５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 請求項６もしくは７に記載のポリヌク
    レオチドまたは請求項１６に記載の組換え発現ベクター
    をレポーターまたはマーカーとして用いて検出可能なシ
    グナルを発生させることを特徴とする、試験試料中の分
    析物を検出するためのバイオアッセイ法。
28. 【請求項２８】 発光反応の基質としてセレンテラジン
    またはその誘導体を用いることを特徴とする、請求項２
    ７に記載の方法。
29. 【請求項２９】 アッセイすべき試料が、生細胞、生組
    織もしくは器官、またはその部分である、請求項２７ま
    たは２８に記載の方法。
30. 【請求項３０】 請求項２５〜２９のいずれか１項に記
    載の方法を実施するためのキット。