JPH09182588A - クラスリン結合タンパク遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＣＫＡＰ１蛋白の発現及び検出に利用でき、
該蛋白の関与する各種の疾患の診断、病態解明、例えば
悪性腫瘍のような疾患の診断等を行ない得、また上記悪
性腫瘍疾患の治療及び予防薬のスクリーニングや評価に
利用できる遺伝子を提供する。 【解決手段】 本発明によれば、配列番号：１で示され
るアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことを特徴
とするヒトＣＫＡＰ１遺伝子が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は，ヒト癌の診断及び
治療に有用なヒト・クラスリン結合タンパク（clathrin
-adaptor protein : ＡＰ）遺伝子、より詳しくはラッ
ト、マウス及び酵母のクラスリン結合短鎖(clathrin-ad
aptor small chains)に高い相同性を有するペプチドを
コードする新規なヒト・クラスリン結合短鎖遺伝子（Ｃ
ＫＡＰ１(clathrin coat assembly protein 22kda)）に
関する。

【０００２】

【従来の技術】真核生物の細胞の小胞輸送システムは小
胞体、ゴルジ装置、エンドゾーム、ライソゾーム、形質
膜のような膜質からなる細胞小器官より形成されてい
る。多くの小胞がこれらの細胞小器官の間を輸送され
る。このシステムの主な構成要素は、クラスリンとその
結合（アダプター）タンパクによって覆われている小胞
である〔Trowbridge I.S., et al., Annu. Rev. Cell B
iol., 9, 129-161 (1993)〕。

【０００３】上記アダプターは膜に対してクラスリン複
合体が結合する際に要求され、種々の膜貫通型・レセプ
ターを膜に固定するのに必要である〔Robinson M.S., A
daptins. Trends Cell Biol., 2, 293-297 (1992)〕。

【０００４】アダプター複合体は、クラスリン被覆され
た小胞の特異的な機能と細胞の局在の両者において重要
であると思われている。しかしながら、これらの機能は
まだ完全には理解されていない。哺乳動物細胞における
成長調節について、クラスリン小胞輸送システムは重大
な役割を演じている。例えば、いくつかのヒト神経膠芽
細胞腫のＥＧＦレセプターは、レセプター・インターナ
リゼーション・シグナルが欠けており、レセプターのダ
ゥンレギュレーションに導くことができなくなっている
こと、そして、最終的に結果として腫瘍に進展すること
が報告されている〔Ekstrand A. J., et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 4309-4313(1992)〕。該報
告から、アダプター複合体のコンポーネントの不足によ
れば類似の結果に至るおそれが想定される。これに合致
する結果として、β−アダプチン・ファミリーの新規な
遺伝子である、ＢＡＭ２２遺伝子が近年、髄膜種に対す
る候補遺伝子として、染色体２２のｑ１２領域からクロ
ーニングされた〔Peyrard M., et al., Hum. Mol. Gene
t., 3, 1393-1399 (1994)〕。該遺伝子は腫瘍抑制遺伝
子として働くと考えられる。もしそうならば、アダプタ
ーの他のコンポーネントは細胞の増殖のダゥン・レギュ
レーションにおいて重大な役割を演じているかもしれな
い。

【０００５】現在、クラスリンに対して、ＡＰ−１、Ａ
Ｐ−２及びＡＰ−３の３つのタイプのアダプター複合体
が特定されている。ＡＰ−１とＡＰ−２の２種のクラス
リン・アダプターは多くの組織に含まれており、３番目
のタイプであるＡＰ−３は脳において報告されている。
各々のアダプターは中鎖及び短鎖の２つのアダプチン分
子からなるタンパクであるが、之等をコードする遺伝子
については尚解明されていないものもある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、新たなヒトの
クラスリン結合タンパク（ＡＰ）遺伝子が提供できれ
ば、各細胞での発現レベルやその構造及び機能を解析で
き、またその発現物の解析等により、之等の関与する疾
患、例えば癌等の病態解明や診断、治療等が可能となる
と考えられ、本発明は、かかる新たなヒトＡＰ遺伝子の
提供を目的としている。

【０００７】本発明者は上記目的より鋭意研究を重ねた
結果、ヒト胎児脳と胎盤のｃＤＮＡライブラリーより、
新たにヒト以外の他種のクラスチン・アダプター短鎖に
高い相同性ペプチドをコードするヒト遺伝子を単離し、
上記目的に合致するヒトＡＰ遺伝子を解明し、ここに本
発明を完成するに至った。

【０００８】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明によれば、
配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基
配列を含むことを特徴とするクラスリン結合タンパク遺
伝子、更には配列番号：２で示される塩基配列を含む上
記クラスリン結合タンパク遺伝子及び配列番号：３で示
される塩基配列の上記クラスリン結合タンパク遺伝子が
提供される。

【０００９】以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチ
ド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡ
Ｃ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む
明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及
び当該分野における慣用記号に従うものとする。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明遺伝子の一具体例として
は、後述する実施例に示される「ＧＥＮ−２１９Ａ０
５」及び「ＧＥＮ−２１９Ａ０５０２」とそれぞれ名付
けられたクローンの有するＤＮＡ配列から演繹されるも
のを挙げることができ、その塩基配列は、配列番号：２
に示される通りである。これは配列番号：１に示す１９
３アミノ酸をコードする５７９ヌクレオチド（核酸）の
オープンリーディングフレームを有しており、分子量は
２１，７３１ダルトンと計算される。そのタンパクの推
定分子量は２２ｋｄａであり、ノーザン・ブロット分析
において、試験した全てのヒト組織において、１．３５
キロ塩基の転写体が発現していることが明らかとなり、
この遺伝子は染色体バント１２ｐ１３．２−ｐ１３．１
にマップされた。この本発明遺伝子は、ヒト全組織で発
現していることより、組織特異的なものというよりむし
ろ細胞に必須な機能を有していると考えられる。以下、
上記本発明遺伝子を「ＣＫＡＰ１」ということがある。

【００１１】上述したように従来より、クラスリン結合
タンパク・ファミリーが細胞内での輸送に係わっている
こと及び他の構成要素のβ−アダプチン・ファミリーの
ヒトＢＡＭ２２遺伝子がクローン化され、該遺伝子が髄
膜種に対する候補遺伝子として腫瘍抑制遺伝子として働
くと考えられていることが知られている。

【００１２】本発明ＣＫＡＰ１はラット、マウス及び酵
母のクラスリン結合短鎖(ラットＡＰ１７、マウスＡＰ
１９、酵母ＡＰ１７、酵母ＡＰ１９)に高い相同性を有
していた。即ち、推定されたヒトＣＫＡＰ１ペプチド
は、ＡＰのメンバーとアミノ酸レベルで約４１−３４％
の同一性で高い相同性を示した。

【００１３】本発明遺伝子は、例えば配列番号：２に示
されるように、一本鎖ＤＮＡ配列で表されるが、本発明
はかかる一本鎖ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列やこれ
らの両者を含むコンポーネントもまた包含する。尚、配
列番号：２に示す本発明遺伝子の配列は、これによりコ
ードされる各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合わ
せ例であり、本発明遺伝子はこれに限らず、各アミノ酸
残基に対して任意のコドンを組合わせ選択したＤＮＡ塩
基配列を有することも勿論可能である。該コドンの選択
は常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン
使用頻度を考慮することができる〔Ncl.Acids Res., 9,
43-74 (1981) 〕。

【００１４】更に本発明遺伝子には、上記で示されるア
ミノ酸配列の一部のアミノ酸乃至アミノ酸配列を置換、
欠失、付加等により改変してなり、同様の機能を有する
同効物をコードするＤＮＡ配列もまた包含される。これ
らポリペプチドの製造、改変（変異）等は天然に生じる
こともあり、また翻訳後の修飾により、或は遺伝子工学
的手法により天然の遺伝子（本発明遺伝子）を、例えば
サイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in
Enzymology, 154, p350, 367-382 (1987)；同100, p46
8 (1983) ；Nucleic Acids Research, 12, p9441 (198
4)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化
学会編, p105 (1986) 〕等の方法により改変したり、リ
ン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法等の化学合成
手段〔J.Am. Chem. Soc., 8 9, p4801 (1967)；同91, p3
350 (1969)；Science, 150, p178 (1968) ；Tetrahedro
n Lett., 22, p1859 (1981)；同24, p245 (1983) 〕に
より変異させたＤＮＡを合成したり、それらの組合せに
より収得することができる。

【００１５】本発明遺伝子は、これを利用して、即ち例
えばこれを微生物のベクターに組込み、形質転換された
微生物を培養することによって、上記ＣＫＡＰ１を容易
にかつ安定して発現できる。

【００１６】また本発明の遺伝子を利用して得られるＣ
ＫＡＰ１蛋白は、これを用いて、特異抗体を作成するこ
ともできる。ここで抗原として用いられるコンポーネン
トは、上記遺伝子工学的手法に従って大量に産生される
蛋白を用いることができ、得られる抗体はポリクローナ
ル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよく、之等
抗体はＣＫＡＰ１蛋白の精製、測定、識別等に有利に利
用できる。

【００１７】本発明遺伝子の製造は、本発明によって開
示された本発明遺伝子についての配列情報によれば、一
般的遺伝子工学的手法により容易に実施できる〔Molecu
larCloning 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory P
ress (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、I
I、III」、日本生化学会編 (1986) 等参照〕。

【００１８】これは例えばヒトｃＤＮＡライブラリー
（ＣＫＡＰ１遺伝子の発現される適当な起源細胞より常
法に従い調製されたもの）から、本発明遺伝子に特有の
適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択する
ことにより実施できる〔Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 7
8, 6613 (1981) ; Science, 222, 778 (1983)等〕。

【００１９】上記方法において、起源細胞としては、Ｃ
ＫＡＰ１遺伝子を発現する各種の細胞、組織や之等に由
来する培養細胞等が例示され、これからの全ＲＮＡの分
離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡへの変換（合成）
とそのクローニング等はいずれも常法に従い実施でき
る。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、
本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えば
クローンテック社（Clontech Lab. Inc.）より市販の各
種ｃＤＮＡライブラリー等を用いることもできる。

【００２０】ｃＤＮＡライブラリーからの本発明遺伝子
のスクリーニングは、前記通常の方法に従い実施するこ
とができる。該スクリーニング方法としては、例えばｃ
ＤＮＡの産生する蛋白質に対して、ＣＫＡＰ１特異抗体
を使用した免疫的スクリーニングにより、対応するｃＤ
ＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択
的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼ
ーション、コロニーハイブリダイゼーション等や之等の
組合せを例示できる。ここで用いられるプローブとして
は、本発明遺伝子のＤＮＡ配列に関する情報をもとにし
て化学合成されたＤＮＡ配列等を用いるのが一般的であ
り、勿論既に取得された本発明遺伝子やその断片もかか
るプローブとして利用できる。

【００２１】また、本発明遺伝子の取得に際しては、Ｐ
ＣＲ法〔Science, 230, 1350-1354(1985)〕によるＤＮ
Ａ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊にライブラリ
ーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合に、レー
ス法〔ＲＡＣＥ：Rapid amplification of cDNA ends；
実験医学、12(6), 35-38 (1994)〕、殊に５′−レース
（ＲＡＣＥ）法〔Frohman,M.A., et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA., 8,8998-9002(1988) 〕の採用が好適
である。かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプラ
イマーは、既に本発明によって明らかにされた本発明遺
伝子の配列情報に基づいて適宜設定することができ、こ
れは常法に従い合成することができる。

【００２２】尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離
精製は前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電
気泳動法等によればよい。

【００２３】上記で得られる本発明遺伝子或は各種ＤＮ
Ａ断片等の塩基配列の決定も、常法に従うことができ、
例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7
4, 5463-5467 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Met
hod in Enzymology, 65, 499(1980)〕等により行なうこ
とができる。かかる塩基配列の決定は、市販のシークエ
ンスキット等を用いても容易に行ない得る。

【００２４】本発明遺伝子の利用によれば、通常の遺伝
子組換え技術〔例えば、Science, 224, p1431 (1984) ;
Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, p692 (1985) ；
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, p5990 (1983)及び前
記引用文献等参照〕に従うことにより、組換え体ＣＫＡ
Ｐ１を得ることができる。該ＣＫＡＰ１蛋白の製造は、
より詳細には、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できる
組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入して形質
転換し、該形質転換体を培養することにより行なわれ
る。

【００２５】ここで宿主細胞としては、真核生物及び原
核生物のいずれも用いることができる。該真核生物の細
胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細
胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cel
l, 23, 175-182 (1981)〕やチャイニーズ・ハムスター
卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 7, 4216-4220 (1980)〕等
がよく用いられているが、之等に限定される訳ではな
い。

【００２６】脊椎動物の発現ベクターとしては、通常発
現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、
ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写
終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要
により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの
例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを保
有するｐＳＶ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1, 854 (198
1）〕等を例示できる。また、真核微生物としては、酵
母が一般によく用いられ、中でもサッカロミセス属酵母
を有利に利用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベク
ターとしては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対す
るプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 80, 1-5 (1983)〕等を利用できる。

【００２７】また、本発明遺伝子の発現ベクターとして
は、原核生物遺伝子融合ベクターを好ましく利用するこ
とができ、該ベクターの具体例としては、例えば分子量
２６０００のＧＳＴドメイン（S.japonicum 由来）を有
するｐＧＥＸ−２ＴＫやｐＧＥＸ−４Ｔ−２等を例示す
ることができる。

【００２８】原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌
が一般によく用いられる。之等を宿主とする場合、本発
明では、例えば該宿主菌中で複製可能なプラスミドベク
ターを用い、このベクター中に本発明遺伝子が発現でき
るように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シヤ
イン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開
始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現
プラスミドを利用するのが好ましい。上記宿主としての
大腸菌としては、エシエリヒア・コリ（Escherichia co
li）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一般
にｐＢＲ３２２及びその改良ベクターがよく用いられる
が、之等に限定されず公知の各種の菌株及びベクターを
も利用できる。プロモーターとしては、例えばトリプト
ファン(trp) プロモーター、lpp プロモーター、lac プ
ロモーター、PL/PR プロモーター等を使用できる。

【００２９】かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿
主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法として
は、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質
転換体は、常法に従い培養でき、該培養により本発明遺
伝子によりコードされる目的のＣＫＡＰ１が生産、発現
される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿
主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用で
き、その培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施で
きる。

【００３０】上記により、形質転換体の細胞内、細胞外
乃至は細胞膜上に目的とする組換えＣＫＡＰ１が発現、
生産、蓄積乃至分泌される。

【００３１】組換えＣＫＡＰ１蛋白は、所望により、そ
の物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作
〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第１版
第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Bi
ochemistry, 25(25), 8274-8277 (1986); Eur. J. Bioc
hem., 163, 313-321 (1987) 等参照〕により分離、精製
できる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構
成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、
浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロ
マトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、之等の
組合せ等を例示でき、特に好ましい上記方法としてはＣ
ＫＡＰ１を結合させたカラムを利用したアフィニティク
ロマトグラフィーを例示できる。

【００３２】また、本発明によって明らかにされた本発
明遺伝子の配列情報を基にすれば、例えば該遺伝子の一
部又は全部の塩基配列を利用することにより、各種ヒト
組織における本発明遺伝子の発現の検出を行なうことが
できる。これは常法に従って行なうことができ、例えば
ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse transcribed-Polymerase chain
reaction ）〔Kawasaki, E.S., et al., Amplificatio
n of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and
applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-2
7(1991) 〕によるＲＮＡ増幅により、またノーザンブロ
ッティング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Har
bor Laboratory(1989)〕等により、いずれも良好に実施
し得る。

【００３３】尚、前記ＰＣＲ法を採用する場合におい
て、用いられるプライマーは、本発明遺伝子のみを特異
的に増幅できる本発明遺伝子に特有のものである限り何
等限定はなく、本発明遺伝情報に基いてその配列を適宜
設定することができる。通常これは常法に従って２０〜
３０ヌクレオチド程度の部分配列を有するものとするこ
とができる。その好適な１例は、後記実施例に示す通り
である。

【００３４】しかして、本発明はかかるＣＫＡＰ１遺伝
子に特有の検出に有用なプライマー及び／又はプローブ
をも提供するものである。

【００３５】

【発明の効果】本発明によれば、新規なヒトＡＰ遺伝
子、ＣＫＡＰ１遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれ
ば、該遺伝子の各種組織での発現の検出や、ヒトＡＰの
遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより、クラス
リンに基づいて細胞内の輸送に深く関与しているヒトク
ラスリンアダプターのシステム乃至ヒトクラスリンアダ
プター機能の解析や、これが関与する各種疾患、例え
ば、悪性腫瘍の診断等を行なうことができ、また悪性腫
瘍の治療及び予防薬のスクリーニングや評価等をも行な
うことができる。

【００３６】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、実
施例を挙げる。

【００３７】

【実施例１】 （１）クローニング及びＤＮＡシークエンシング ヒト胎児脳と胎盤ｃＤＮＡライブラリー（大塚ＧＥＮリ
サーチ インスティチュート、大塚製薬株式会社）から
任意に選択したｃＤＮＡクローンの配列解析により、１
１３１塩基の配列のマウス、酵母のＡＰ遺伝子と相同性
の高いクローンを見い出し、これをＧＥＮ−２１９Ａ０
５と名付けた。

【００３８】尚、上記配列解析は、二重鎖テンプレート
からのジデオキシヌクレオチド鎖終結法（自動サイクル
及び自動読取りシークエンスキット、ファルマシア社）
に従い、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマ
シア社）を用いて分析した。また、相同性は、ＵＷＧＣ
ＧのＦＡＳＴＡプログラム（Lipman et al., Proc.Nat
l.Acad.Sci., USA., 85, 2444-2448(1988)によるデータ
ーベース（GenBank, EMBL）検索によった。

【００３９】しかしながら、他の種のＡＰ遺伝子との配
列比較解析の結果、該クローンは、本発明遺伝子の５′
部分を欠失すると思われたので、欠けているセグメント
を単離するために以下の５’レースの技術を用いた〔Fr
ohman M.A., et al., Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
8, 8998-9002 (1988)〕。

【００４０】（２）５′−レース 本発明遺伝子の５′部分を含むｃＤＮＡクローンの単離
・解析は、製品使用プロトコールの一部修飾させ、市販
キット（5'-Rapid AmpliFinder RACE Kit, クローンテ
ック社）を用いた５′レース法により、以下の通り単離
した。ここで用いた遺伝子特異的プライマーＰ１、Ｐ２
及びアンカー・プライマーは常法に従い合成されたもの
であり、その配列は下記表１に示す通りである。

【００４１】

【表１】

【００４２】ヒト胎盤ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの０．１μｇ
を逆転写酵素（Superscript TMII RNase H Reverse Tra
nscriptase,Life Technologies社）を用いたランダムヘ
キサマーにより逆転写してｃＤＮＡを得、これをＰ１プ
ライマー及びアンカー・プライマーを用いた第１のＰＣ
Ｒにより増幅させた。

【００４３】即ち、上記ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの０．１μ
ｇに２．５ｍＭｄＮＴＰ／１ｘＴａｑ緩衝液(宝酒造
製）／０．２μＭ Ｐ１プライマー、０．２μＭ アダ
プター・プライマー／ＥｘＴａｑ酵素(宝酒造製）０．
２５単位を併せて全量を５０μｌとした、これにアンカ
ー・プライマーを加えて室温で反応させた後、ＰＣＲに
供した。即ち、９４℃１分間、次いで９４℃４５秒、６
０℃４５秒、７２℃２分のサイクルを３５サイクル行
い、７２℃で５分間反応させた。

【００４４】その後、第１のＰＣＲ反応物５０μｌ中の
１μｌを遺伝子特異的ネスティッドＰ２プライマーとア
ンカー・プライマーを用いる第二のＰＣＲ反応において
増幅させた。第二ＰＣＲ産物は１．５％アガロース・ゲ
ル電気泳動により分析した。アガロース・ゲル電気泳動
により、およそ６５０核酸塩基の大きさを示す単一のバ
ンドを検出し、このバンドの産物をベクター（ｐＴ７Ｂ
ｌｕｅ（Ｒ）Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ，ノバゲン(Novagen)
社）に挿入し、適当なサイズの挿入がみられる複数のク
ローンを選別した。

【００４５】ＰＣＲ反応物から得られた５’レース・ク
ローンのうち、ＧＥＮ−２１９Ａ０５とＧＥＮ−２１９
Ａ０５０２の２つの重なっているｃＤＮＡクローンを配
列決定することによって、全体のコードしている配列
と、５’と３’隣接配列と全長１２１３塩基の配列を決
定し、図１にＣＫＡＰ１の核酸配列と推定アミノ酸配列
を示した。ｃＤＮＡクローンの最初のＡＴＧである推定
されたスタート・コドンの位置は４３−４５塩基である
と思われた。このコドンの回りの配列であるＧＣＣＡＴ
ＧＡ(塩基配列番号４０−４６番目)は最適な前後関係
（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＴＧＧが類似していた〔Kozak, M.,
J. Biol. Chem., 266, 19867-19870 (1991)〕。アスタ
リスクは、ストップ・コドンを示し、２つの最適なポリ
アデニレーションは２重下線、３’末端に直ちに続くポ
リＡテイルは省略されている。５’レースのために用い
られた２つのプライマーを描いている配列は、下線によ
って示される。

【００４６】本発明者らはそのサイズに基づいてｍＲＮ
Ａの５’末端をカバーすると思われる図１中の１２１３
塩基配列より、先にインフレーム・ストップ・コドンが
なかったので、このＡＴＧ(塩基配列番号４３−４５)が
スタート・コドンであるかどうかを確認するため、他の
プライマーのセット(塩基配列１２３−１４６と９０−
１１２)で５’レースを実施したが、更なる５’配列を
延長することはできなかった。従って、上記図１の１２
１３塩基配列が全長であることことを確認した。

【００４７】またストップ・コドン（ＴＧＡ）は６２２
−６２４塩基に位置していた。２つの最適なポリアデニ
レーション・シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）が１０８９−１
０９４塩基と１１８９−１１９４塩基に存在していた。

【００４８】推定されたオープン・リーディング・フレ
ームは、２１，７３１ダルトンと計算された分子量を持
つ１９３アミノ酸をコードする５７９塩基からなってい
る。

【００４９】（２）他のアダプター短鎖に対するＣＫＡ
Ｐ１の類似性 ＣＫＡＰ１の推定アミノ酸配列は、ラットＡＰ１７、マ
ウスＡＰ１９とこれらの酵母の類似物であるＹＡＰ１７
とＹＡＰ１９を含むいくつかのアダプター短鎖と有意に
高い相同性を示した。保存された領域を正確に同定する
ため、これらのアダプター短鎖とＣＫＡＰ１の間の配列
比較を行なった。

【００５０】その結果、ＣＫＡＰ１は、このグループの
ペプチドの全てと有意な相同性を示し（４１％−３４％
同一）、ＹＡＰ１７と最も高い相同性を示した。整列比
較は、領域Ｉと領域IIの２つの高く保存された領域を明
らかにし、これらはアダプター関連機能にとって必須の
ようである。領域Ｉは「クラスリン結合短鎖記号」とし
て前に記載されたように〔Phan H. L., et al., EMBO
J., 13, 1706-1717 (1994)〕、（Leu，Ile，Val，Met）
Tyr，Tyr（Lys，Arg）ｘ４Leu，Tyr，Pheの一致配列が
生じている。更に保存された領域IIは、Pheｘ（Asn，Se
r）Val，Cys，Glu，Leu，Asp（Leu，Ile）（Ile，Val）
Pheの一致配列が生じている。

【００５１】比較においてこれらのタンパクのＮ末端と
中央の領域が比較的よく保存されていて、これらのＣ末
端領域はあまり保存されていなかった。

【００５２】（３）ノーザンブロット分析 正常ヒト組織におけるＣＫＡＰ１ｍＲＮＡの発現を、表
２に示す塩基配列のＣＯＳ１プライマーとＣＯＳ２プラ
イマーにより増幅した産物をプローブとするノーザンブ
ロットにより評価した。

【００５３】

【表２】

【００５４】ノーザンブロット分析は、製品使用法に従
い、ＭＴＮブロット（Human Multiple Tissue Nothern
blot ; クローンテック社）を用いて実施した。即ち、
上記ＣＯＳ１プライマーとＣＯＳ２プライマーの増幅産
物を〔³²Ｐ〕−ｄＣＴＰ（ランダムプライムドＤＮＡラ
ベリングキット、ベーリンガーマンハイム社）により標
識してプローブとした。

【００５５】ブロッティングは５時間プレハイブリダイ
ズ後、４２℃で１８時間、５０％ホルムアミド／５×Ｓ
ＳＣ／１０×デンハルツ溶液／２％ＳＤＳ溶液（１００
μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ含有）の溶液中でハイブ
リダイズした。２×ＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳにて室温
下に１時間、次いで０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳに
て６５℃下に３時間で３回洗浄した。フィルターは−８
０℃下に１４時間露出を与えた。

【００５６】上記に従い、ヒト正常成人組織の１６（心
臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、
甲状腺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸、大腸及び末梢血白
血球からのＲＮＡ、それぞれ約２μｇのポリ（Ａ）＋Ｒ
ＮＡを含む）について、ＣＫＡＰ１の発現の有無を調べ
た結果、試験した全ての組織において、ＣＫＡＰ１の発
現がノーザン・ブロッティングにより測定された。即
ち、試験した全ての組織においてＣＫＡＰ１のｃＤＮＡ
サイズに一致する１．３５Kbの転写体を検出した。尚、
２つのぼんやりとしたバンドの１．０キロ塩基と３．４
キロ塩基の転写体は試験した他の組織より心臓、脳にお
いて有意に高いレベルで発現されていた。

【００５７】（４）ダイレクト・Ｒ−バィンディングＦ
ＩＳＨによるコスミド・クローンと染色体の局在 系統的にコスミドクローンを単離するために９６ウェル
プレートの１６００セットにクローンを登録した(２つ
のヒトゲノムに相等している)。１５プレートの各々上
に登録した１４４０クローンをナイロン膜上に別々に二
重にブロットした。そのうちひとつのシリーズとして１
０７のナイロン膜をドット・ブロットのために使用し
た。他のシリーズから、登録されたクローンを回収し、
培養し、ＰＣＲスクリーニングのための鋳型として調製
した。

【００５８】ＰＣＲスクリーニングにより陽性クローン
を含むメンブランを同定したのち、それらのナイロン膜
は、ノーザン・ブロッティングと同じ条件下でハイブリ
タイズされた。

【００５９】上記方法によって得られた２つの独立した
クローンを、複製されたプロメタフェーズＲ−バンドと
組合わせたＦＩＳＨに基づく技術であるダイレクトＲ−
バィンディング・フルオレッセン・インサイチュー・ハ
イブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)によるマッピングに使
用した〔Takahashi E., et al, Hum. Genet., 86, 14-1
6(1990): Takahashi E., et al, Hum. Genet., 88, 119
-121(1991)〕。

【００６０】尚、これらのクローンに供されている反復
配列の抑制のために、リクター〔Lichter P. et al., P
roc. Natl. Sci. U.S.A., 87, 6634-6638(1990)〕によ
って記載されたように２０倍過度のヒトＣｏｔ−Ｉ Ｄ
ＮＡ(BRL社製)を用いた。

【００６１】プロビア１００フィルム(フジＩＳＯ１０
０；フジ・フィルム社製)を顕微鏡写真のために用いた
(フィルター・コンビネーション、ニコンＢ−２Ａ)。

【００６２】その結果を示すＣＫＡＰ１遺伝子を持つＦ
ＩＳＨ後の部分的なＲ−バンド・メタフェース・プレー
トによれば、シグナルは染色体１２のｐ１３．２−ｐ１
３．１バンドにＣＫＡＰ１が局在していた。

【００６３】

【配列表】

【００６４】配列番号：１ 配列の長さ：１９３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：蛋白 配列： Met Ile Lys Ala Ile Leu Ile Phe Asn Asn His Gly Lys Pro Arg Leu 1 5 10 15 Ser Lys Phe Tyr Gln Pro Tyr Ser Glu Asp Thr Gln Gln Gln Ile Ile 20 25 30 Arg Glu Thr Phe His Leu Val Ser Lys Arg Asp Glu Asn Val Cys Asn 35 40 45 Phe Leu Glu Gly Gly Leu Leu Ile Gly Gly Ser Asp Asn Lys Leu Ile 50 55 60 Tyr Arg His Tyr Ala Thr Leu Tyr Phe Val Phe Cys Val Asp Ser Ser 65 70 75 80 Glu Ser Glu Leu Gly Ile Leu Asp Leu Ile Gln Val Phe Val Glu Thr 85 90 95 Leu Asp Lys Cys Phe Glu Asn Val Cys Glu Leu Asp Leu Ile Phe His 100 105 110 Val Asp Lys Val His Asn Ile Leu Ala Glu Met Val Met Gly Gly Met 115 120 125 Val Leu Glu Thr Asn Met Asn Glu Ile Val Thr Gln Ile Asp Ala Gln 130 135 140 Asn Lys Leu Glu Lys Ser Glu Ala Gly Leu Ala Gly Ala Pro Ala Arg 145 150 155 160 Ala Val Ser Ala Val Lys Asn Met Asn Leu Pro Glu Ile Pro Arg Asn 165 170 175 Ile Asn Ile Gly Asp Ile Ser Ile Lys Val Pro Asn Leu Pro Ser Phe 180 185 190 Lys

【００６５】配列番号：２ 配列の長さ：５７９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA (cDNA) 配列： ＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧ ＣＧＡＴＣＣＴＡＡＴ ＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣ ＣＡＣ
ＧＧＧＡＡＧＣ ＣＧＣＧＧＣＴＣＴＣ ＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣ ６０ ＣＡＧＣＣＣＴＡＣＡ ＧＴＧＡＡＧＡＴＡＣ ＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡ ＡＴＣ
ＡＴＣＡＧＧＧ ＡＧＡＣＴＴＴＣＣＡ ＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴ １２０ ＡＡＧＡＧＡＧＡＴＧ ＡＡＡＡＴＧＴＴＴＧ ＴＡＡＴＴＴＣＣＴＡ ＧＡＡ
ＧＧＡＧＧＡＴ ＴＡＴＴＡＡＴＴＧＧ ＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣ １８０ ＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡ ＴＴＴＡＴＡＧＡＣＡ ＴＴＡＴＧＣＡＡＣＧ ＴＴＡ
ＴＡＴＴＴＴＧ ＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴ ＧＧＡＴＴＣＴＴＣＡ ２４０ ＧＡＡＡＧＴＧＡＡＣ ＴＴＧＧＣＡＴＴＴＴ ＡＧＡＴＣＴＡＡＴＴ ＣＡＡ
ＧＴＡＴＴＴＧ ＴＧＧＡＡＡＣＡＴＴ ＡＧＡＣＡＡＡＴＧＴ ３００ ＴＴＴＧＡＡＡＡＴＧ ＴＣＴＧＴＧＡＧＣＴ ＧＧＡＴＴＴＧＡＴＴ ＴＴＣ
ＣＡＴＧＴＡＧ ＡＣＡＡＧＧＴＴＣＡ ＣＡＡＴＡＴＴＣＴＴ ３６０ ＧＣＡＧＡＡＡＴＧＧ ＴＧＡＴＧＧＧＧＧＧ ＡＡＴＧＧＴＡＴＴＧ ＧＡＧ
ＡＣＡＡＡＴＡ ＴＧＡＡＴＧＡＧＡＴ ＴＧＴＴＡＣＡＣＡＡ ４２０ ＡＴＴＧＡＴＧＣＡＣ ＡＡＡＡＴＡＡＧＣＴ ＧＧＡＡＡＡＡＴＣＴ ＧＡＧ
ＧＣＴＧＧＣＴ ＴＡＧＣＡＧＧＡＧＣ ＴＣＣＡＧＣＣＣＧＴ ４８０ ＧＣＴＧＴＡＴＣＡＧ ＣＴＧＴＡＡＡＧＡＡ ＴＡＴＧＡＡＴＣＴＴ ＣＣＴ
ＧＡＧＡＴＣＣ ＣＡＡＧＡＡＡＴＡＴ ＴＡＡＣＡＴＴＧＧＴ ５４０ ＧＡＣＡＴＣＡＧＴＡ ＴＡＡＡＡＧＴＧＣＣ ＡＡＡＣＣＴＧＣＣＣ ＴＣＴ
ＴＴＴＡＡＡ ５７９

【００６６】配列番号：３ 配列の長さ：１２１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ （ｃＤＮＡ） 配列の特徴： 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：４３．．６２１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： CCCCGCCTGG CCCCAGTGCC ACCCGGTCGG CCCGGCACAG CC ATG ATC AAG GCG 54 Met Ile Lys Ala 1 ATC CTA ATC TTC AAC AAC CAC GGG AAG CCG CGG CTC TCC AAG TTC TAC 102 Ile Leu Ile Phe Asn Asn His Gly Lys Pro Arg Leu Ser Lys Phe Tyr 5 10 15 20 CAG CCC TAC AGT GAA GAT ACA CAA CAG CAA ATC ATC AGG GAG ACT TTC 150 Gln Pro Tyr Ser Glu Asp Thr Gln Gln Gln Ile Ile Arg Glu Thr Phe 25 30 35 CAT TTG GTA TCT AAG AGA GAT GAA AAT GTT TGT AAT TTC CTA GAA GGA 198 His Leu Val Ser Lys Arg Asp Glu Asn Val Cys Asn Phe Leu Glu Gly 40 45 50 GGA TTA TTA ATT GGA GGA TCT GAC AAC AAA CTG ATT TAT AGA CAT TAT 246 Gly Leu Leu Ile Gly Gly Ser Asp Asn Lys Leu Ile Tyr Arg His Tyr 55 60 65 GCA ACG TTA TAT TTT GTC TTC TGT GTG GAT TCT TCA GAA AGT GAA CTT 294 Ala Thr Leu Tyr Phe Val Phe Cys Val Asp Ser Ser Glu Ser Glu Leu 70 75 80 GGC ATT TTA GAT CTA ATT CAA GTA TTT GTG GAA ACA TTA GAC AAA TGT 342 Gly Ile Leu Asp Leu Ile Gln Val Phe Val Glu Thr Leu Asp Lys Cys 85 90 95 100 TTT GAA AAT GTC TGT GAG CTG GAT TTG ATT TTC CAT GTA GAC AAG GTT 390 Phe Glu Asn Val Cys Glu Leu Asp Leu Ile Phe His Val Asp Lys Val 105 110 115 CAC AAT ATT CTT GCA GAA ATG GTG ATG GGG GGA ATG GTA TTG GAG ACA 438 His Asn Ile Leu Ala Glu Met Val Met Gly Gly Met Val Leu Glu Thr 120 125 130 AAT ATG AAT GAG ATT GTT ACA CAA ATT GAT GCA CAA AAT AAG CTG GAA 486 Asn Met Asn Glu Ile Val Thr Gln Ile Asp Ala Gln Asn Lys Leu Glu 135 140 145 AAA TCT GAG GCT GGC TTA GCA GGA GCT CCA GCC CGT GCT GTA TCA GCT 534 Lys Ser Glu Ala Gly Leu Ala Gly Ala Pro Ala Arg Ala Val Ser Ala 150 155 160 GTA AAG AAT ATG AAT CTT CCT GAG ATC CCA AGA AAT ATT AAC ATT GGT 582 Val Lys Asn Met Asn Leu Pro Glu Ile Pro Arg Asn Ile Asn Ile Gly 165 170 175 180 GAC ATC AGT ATA AAA GTG CCA AAC CTG CCC TCT TTT AAA TAAAAATGTA 631 Asp Ile Ser Ile Lys Val Pro Asn Leu Pro Ser Phe Lys 185 190 AAAAGGCCAC TCCCAGGTAA AATCCAGGGG GAAGAGTCAT CTAAGTTTAC CATGCAGTTG 691 TTTACCAAAA ATAGAGGAGG AGAGTCTTAA CTTTTGCTCT TGGATTTAAG TCAAGGTACT 751 GTATAGAAGT TGTGTAAAAT CAGTATGAAA GTTCAATGTT GCTGTTCTTG CTCAGTGATT 811 TTAAAGAAAT TGAGTAGTTC CTATGTGATT TTTTTTTTTC TTTTCTAAAC TGCATTCCTG 871 TGCCCACCTA CGGCATGCCT CTATGTATTG GCTACTACAG TGTTTTAAAA AGTGTTTCAG 931 ATATTTCTCT AATTATGTAC AACCTAAAAT GTTGGTGTTT TGTATGGATC ACAAGTGCAG 991 CATTCCTTAA TTCCTTCTGC TATATGTCAC ACAGTTGTTA TTTGGAGAAC CAAGTATGTA 1051 TTGCATGAAA ACATTATGAC TTTTTTCTCT TAGTTTAAAT AAACTCCAAG GTAACTGGAC 1111 TTCTAAAGCA CCTTTCTGTT TGCCTGATAT CTACTTTAGC AATAATTTTT TTTACAACCC 1171 TCTGACTCAA CAAAGTAAAT AAAAGTATAT TTTATCACTA TT 1213

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明遺伝子ＣＫＡＰ１の核酸配列とアミノ
酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/574 Ａ 33/574 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコ
   ードする塩基配列を含むことを特徴とするクラスリン結
   合タンパク遺伝子。
2. 【請求項２】配列番号：２で示される塩基配列を含むこ
   とを特徴とするクラスリン結合タンパク遺伝子。
3. 【請求項３】配列番号：３で示される塩基配列である請
   求項２に記載のクラスリン結合タンパク遺伝子。