JPH09182587A - ヒトｔｃｔｅｘ−１遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトｔｃｔｅｘ−１蛋白の発現、検出に利用
でき、例えば網膜変性等の該蛋白の関与する各種疾患の
診断、病態解明等や網膜形成異常を伴う疾患、男性不妊
症の診断等を行ない得、また上記網膜形成異常に基づく
疾患及び男性不妊症の治療及び予防薬のスクリーニン
グ、評価に利用できる遺伝子を提供する。 【解決手段】 配列番号：１で示されるアミノ酸配列を
コードする塩基配列を含むことを特徴とするヒトｔｃｔ
ｅｘ−１遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、マウスｔｃｔｅｘ
−１及びＲＰ３遺伝子と高い相同性を有するヒトｔｃｔ
ｅｘ−１を発現する新規な遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】マウスのｔ−複合体遺伝子領域は、１７
染色体の中心近辺部にて非重合に逆転した２つの隣接部
分からなっている〔Artzt, K., et al., Cell, 28, 471
-476(1982)〕。また、ｔ−複合体は正常尾部長、胚形
成、精子形成に対して重要であるいくつかの遺伝子を含
んでいる〔Silver, L.M., Annu. Rev. Genet., 19, 179
-208 (1985)〕。この領域にマップされ、ｔ−ホモ接合
体に過剰発現したｔｃｔｅｘ−１は、男子の不妊に対す
る候補遺伝子であると考えられる〔Lader, E., etal.,
Cell, 58, 969-979 (1989); Ha, H., et al., Dev. Gen
et., 12, 318-332(1991)〕。

【０００３】マウス・ゲノムのｔ−複合体領域に局在す
る遺伝子の内には、いくつかのヒト相同物があり、之等
は染色体６の短腕と長腕に位置していることが判ってい
るが、これまで上記マウスｔｃｔｅｘ−１のヒト対応物
は、クローニングされた例がなく、染色体座位も定めら
れていない。

【０００４】一方、色素性網膜炎３（ＲＰ３）、Ｘ連鎖
性円錐ジストロフィー（ＣＯＤ１）及びＸ連鎖性非進行
性夜盲症(ＣＳＮＢＸ）の３つのタイプのヒト網膜疾患
が、Ｘｐ２１．１領域にマップされている〔Denton, M.
J., et al., Hum. Genet.,78, 60-64 (1988); Bartle
y, J., et al., Cell Genet., 51, 959 (1989); Berge
n, A. A. B., et al., Hum. Mol. Genet., 4, 931-935
(1995)〕。

【０００５】網膜変性の疾患には、色素性網膜症のよう
な周辺部の網膜疾患、網膜錐体形成異常のような黄斑の
形成異常、錐体杆状体形成異常のような黄斑及び周辺の
形成異常が知られている。それらの内のいくつかは、染
色体の位置が定められていて、ロドプシン(rhodopsin;
3q)とペリフェリン(peripherin; 6p)の遺伝子異常に原
因がある〔McWilliam, W. R., et al., Genomics, 5, 6
19-622 (1989); Farrar, G. J., et al., Genomics, 1
1, 870-874 (1991)〕。

【０００６】しかしながら、まだ多くの網膜の変性は、
それらの原因となる染色体の位置が決められていない。
ＲＰ３はＸｐ２１．１領域に定められている３つの網膜
の変性の一つ或はそれ以上に対する候補遺伝子であると
考えられる〔Travis, G. H.and Hepler, J. E., Nature
Genet., 3, 191-192 (1993); Evans, K., et al.,Natu
re Genet., 6, 210-213 (1994)〕。

【０００７】上記ＲＰ３は、マウスのｔｃｔｅｘ−１に
似ており、網膜を含む多くの組織で発現されている。従
って、該ＲＰ３とマウスｔｃｔｅｘ−１の間に観察され
た高い相同性の程度は、ｔｃｔｅｘ−１遺伝子が網膜の
機能に関連するかもしれない可能性を示唆している。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記マウス−ｔｃｔｅ
ｘ−１又はＲＰ３遺伝子に相同性な新たなヒトｔｃｔｅ
ｘ−１遺伝子が提供できれば、各細胞でのその発現レベ
ルやその構造及び機能を解析でき、またその発現物の解
析等により、之等の関与する疾患、例えば網膜形成異常
による各種網膜性疾患の病態解明や診断、治療等が可能
となると考えられる。

【０００９】従って、本発明の目的は、かかる新たなヒ
トｔｃｔｅｘ−１遺伝子を提供することにある。

【００１０】また、かかる遺伝子が解明されれば、これ
は上述した如く男性不妊に係わる可能性のある遺伝子と
して、男性不妊症の病態解明や診断、治療等が可能とな
るとも考えられ、本発明は、かかる点でも有用なヒトｔ
ｃｔｅｘ−１遺伝子の提供をも目的としている。

【００１１】本発明者らは、上記目的より、マウスｔｃ
ｔｅｘ−１の推定ヒト相同物のクローニング、発現及び
マッピングを行ない、該マウスｔｃｔｅｘ−１遺伝子の
推定ヒト相同物を、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーよ
り単離するに成功し、ここに本発明を完成するに至っ
た。

【００１２】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明によれば、
配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基
配列を含むことを特徴とするヒトｔｃｔｅｘ−１遺伝
子、更には配列番号：２で示される塩基配列を含むこと
を特徴とするヒトｔｃｔｅｘ−１遺伝子及び配列番号：
３で示される塩基配列である上記ヒトｔｃｔｅｘ−１遺
伝子が提供される。

【００１３】以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチ
ド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡ
Ｃ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む
明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及
び当該分野における慣用記号に従うものとする。

【００１４】本発明により提供される遺伝子は、ヒトｔ
ｃｔｅｘ−１に対するものであり、ｈ−ｔｃｔｅｘ−１
と命名され、そのｃＤＮＡは、配列番号：１で示される
通り１１３アミノ酸をコードする３３９塩基のオープン
・リーディング・フレームを含んでいる。該ｈ−ｔｃｔ
ｅｘ−１によりコードされる推定ペプチドは、マウスｔ
ｃｔｅｘ−１とヒトＲＰ３のそれらと、それぞれ９４％
と５５％（１００％と９４％類似性）同一であった。

【００１５】また、ノーザンブロット分析によれば、試
験した全ての組織において０．９キロ塩基対の転写体の
発現が明らかにされ、この０．９ｋｂの転写体がｈ−ｔ
ｃｔｅｘ−１のｃＤＮＡクローンのサイズに一致した。
更に、本発明遺伝子は、網膜変性の原因遺伝子を含んで
いる領域である染色体バンド６ｑ５．２−ｑ２５．３に
ＦＩＳＨによってマップされた。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明遺伝子ｈ−ｔｃｔｅｘ−１
の一具体例としては、後述する実施例に示される「ＧＥ
Ｎ−１０６Ｃ０４」及び「ＧＥＮ−１０６Ｃ０４０８」
とそれぞれ名付けられたクローンの有するＤＮＡ配列か
ら演繹されるものを挙げることができ、その塩基配列
は、配列番号：３に示される通りである。これは配列番
号：１に示す１１３アミノ酸をコードする３３９ヌクレ
オチド（核酸）のオープンリーディングフレームを有し
ており、分子量は１２，４５２ダルトンと計算される。

【００１７】以下、このｈ−ｔｃｔｅｘ−１遺伝子につ
き詳述すれば、該遺伝子は、Ｘ染色体遺伝による錐体形
成異常(ＣＯＤ１)を含む３つの網膜変性に対するひとつ
の候補遺伝子のＲＰ３と高い相同性を示し、また網膜錐
体形成異常１(ＲＣＤ１)の原因遺伝子がある染色体バン
ド６ｑ２５．２−ｑ２５．３に局在している。

【００１８】これらＣＯＤ１とＲＣＤ１は、視覚の感度
の減少した或は異常な色の視覚のような類似の表現型を
示すことが知られていること、及びｈ−ｔｃｔｅｘ−１
が網膜を含む多くの組織においても発現されていたこと
から、本発明ｈ−ｔｃｔｅｘ−１遺伝子は、網膜錐体形
成異常１(ＲＣＤ１)に対する候補遺伝子と考えられる。
更に、いくつかの正常成人組織におけるｈ−ｔｃｔｅｘ
−１ｍＲＮＡの発現がｈ−ｔｃｔｅｘ−１のコード領域
をプローブとしてノーザン・ブロッティングによって測
定され、試験した１６の全ての組織において、０．９キ
ロ塩基の転写体が検出され、該転写体はｈ−ｔｃｔｅｘ
−１のｃＤＮＡクローンのサイズに一致していた。

【００１９】本発明遺伝子は、例えば配列番号：２に示
されるように、一本鎖ＤＮＡ配列で表されるが、本発明
はかかる一本鎖ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列やこれ
らの両者を含むコンポーネントもまた包含する。尚、配
列番号：２に示す本発明遺伝子の配列は、これによりコ
ードされる各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合わ
せ例であり、本発明遺伝子はこれに限らず、各アミノ酸
残基に対して任意のコドンを組合わせ選択したＤＮＡ塩
基配列を有することも勿論可能である。該コドンの選択
は常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン
使用頻度を考慮することができる〔Ncl.Acids Res., 9,
43-74 (1981) 〕。

【００２０】更に本発明遺伝子には、上記で示されるア
ミノ酸配列の一部のアミノ酸乃至アミノ酸配列を置換、
欠失、付加等により改変してなり、同様の機能を有する
同効物をコードするＤＮＡ配列もまた包含される。これ
らポリペプチドの製造、改変（変異）等は天然に生じる
こともあり、また翻訳後の修飾により、或は遺伝子工学
的手法により天然の遺伝子（本発明遺伝子）を、例えば
サイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in
Enzymology, 154, p350, 367-382 (1987)；同100, p46
8 (1983) ；Nucleic Acids Research, 12, p9441 (198
4)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化
学会編, p105 (1986) 〕等の方法により改変したり、リ
ン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法等の化学合成
手段〔J.Am. Chem. Soc., 89, p4801 (1967)；同91, p3
350 (1969)；Science, 150, p178 (1968) ；Tetrahedro
n Lett., 22, p1859 (1981)；同24, p245 (1983) 〕に
より変異させたＤＮＡを合成したり、それらの組合せに
より収得することができる。

【００２１】本発明遺伝子は、これを利用して、即ち例
えばこれを微生物のベクターに組込み、形質転換された
微生物を培養することによって、上記ｈ−ｔｃｔｅｘ−
１を容易にかつ安定して発現できる。

【００２２】また本発明の遺伝子を利用して得られるｈ
−ｔｃｔｅｘ−１蛋白は、これを用いて、特異抗体を作
成することもできる。ここで抗原として用いられるコン
ポーネントは、上記遺伝子工学的手法に従って大量に産
生される蛋白を用いることができ、得られる抗体はポリ
クローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよ
く、之等抗体はｈ−ｔｃｔｅｘ−１蛋白の精製、測定、
識別等に有利に利用できる。

【００２３】本発明遺伝子の製造は、本発明によって開
示された本発明遺伝子についての配列情報によれば、一
般的遺伝子工学的手法により容易に実施できる〔Molecu
larCloning 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory P
ress (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法 Ｉ、I
I、III」、日本生化学会編 (1986) 等参照〕。

【００２４】これは例えばヒトｃＤＮＡライブラリー
（ｈ−ｔｃｔｅｘ−１遺伝子の発現される適当な起源細
胞より常法に従い調製されたもの）から、本発明遺伝子
に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを
選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 78, 6613 (1981) ; Science, 222, 778 (1983)
等〕。

【００２５】上記方法において、起源細胞としては、ｈ
−ｔｃｔｅｘ−１遺伝子を発現する各種の細胞、組織や
之等に由来する培養細胞等が例示され、これからの全Ｒ
ＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡへの変換
（合成）とそのクローニング等はいずれも常法に従い実
施できる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されても
おり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、
例えばクローンテック社（Clontech Lab. Inc.）より市
販の各種ｃＤＮＡライブラリー等を用いることもでき
る。

【００２６】ｃＤＮＡライブラリーからの本発明遺伝子
のスクリーニングは、前記通常の方法に従い実施するこ
とができる。該スクリーニング方法としては、例えばｃ
ＤＮＡの産生する蛋白質に対して、ｈ−ｔｃｔｅｘ−１
特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより、対応
するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配
列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブ
リダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等
や之等の組合せを例示できる。ここで用いられるプロー
ブとしては、本発明遺伝子のＤＮＡ配列に関する情報を
もとにして化学合成されたＤＮＡ配列等を用いるのが一
般的であり、勿論既に取得された本発明遺伝子やその断
片もかかるプローブとして利用できる。

【００２７】また、本発明遺伝子の取得に際しては、Ｐ
ＣＲ法〔Science, 230, 1350-1354(1985)〕によるＤＮ
Ａ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊にライブラリ
ーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合に、レー
ス法（ＲＡＣＥ：Rapid amplification of cDNA ends；
実験医学、12(6), 35-38 (1994))、殊に５′レース（Ｒ
ＡＣＥ）法〔Frohman, M.A., et al., Proc.Natl.Acad.
Sci., USA., 8, 8998-9002(1988)〕の採用が好適であ
る。かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマ
ーは、既に本発明によって明らかにされた本発明遺伝子
の配列情報に基づいて適宜設定することができ、これは
常法に従い合成することができる。

【００２８】尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離
精製は前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電
気泳動法等によればよい。

【００２９】上記で得られる本発明遺伝子或は各種ＤＮ
Ａ断片等の塩基配列の決定も、常法に従うことができ、
例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7
4, 5463-5467 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Met
hod in Enzymology, 65, 499(1980)〕等により行なうこ
とができる。かかる塩基配列の決定は、市販のシークエ
ンスキット等を用いても容易に行ない得る。

【００３０】本発明遺伝子の利用によれば、通常の遺伝
子組換え技術〔例えば、Science, 224, p1431 (1984) ;
Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, p692 (1985) ；
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, p5990 (1983)及び前
記引用文献等参照〕に従うことにより、組換え体ｈ−ｔ
ｃｔｅｘ−１を得ることができる。該ｈ−ｔｃｔｅｘ−
１蛋白の製造は、より詳細には、本発明遺伝子が宿主細
胞中で発現できる組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細
胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養すること
により行なわれる。

【００３１】ここで宿主細胞としては、真核生物及び原
核生物のいずれも用いることができる。該真核生物の細
胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細
胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cel
l, 23, 175-182 (1981)〕やチャイニーズ・ハムスター
卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 7, 4216-4220 (1980)〕等
がよく用いられているが、之等に限定される訳ではな
い。

【００３２】脊椎動物の発現ベクターとしては、通常発
現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、
ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写
終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要
により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの
例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを保
有するｐＳＶ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1, 854 (198
1）〕等を例示できる。また、真核微生物としては、酵
母が一般によく用いられ、中でもサッカロミセス属酵母
を有利に利用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベク
ターとしては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対す
るプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 80, 1-5 (1983)〕等を利用できる。

【００３３】また、本発明遺伝子の発現ベクターとして
は、原核生物遺伝子融合ベクターを好ましく利用するこ
とができ、該ベクターの具体例としては、例えば分子量
２６０００のＧＳＴドメイン（S.Japonicum 由来）を有
するｐＧＥＸ−２ＴＫやｐＧＥＸ−４Ｔ−２等を例示す
ることができる。

【００３４】原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌
が一般によく用いられる。之等を宿主とする場合、本発
明では、例えば該宿主菌中で複製可能なプラスミドベク
ターを用い、このベクター中に本発明遺伝子が発現でき
るように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シヤ
イン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開
始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現
プラスミドを利用するのが好ましい。上記宿主としての
大腸菌としては、エシエリヒア・コリ（Escherichia co
li）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一般
にｐＢＲ３２２及びその改良ベクターがよく用いられる
が、之等に限定されず公知の各種の菌株及びベクターを
も利用できる。プロモーターとしては、例えばトリプト
ファン(trp) プロモーター、lpp プロモーター、lac プ
ロモーター、PL/PR プロモーター等を使用できる。

【００３５】かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿
主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法として
は、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質
転換体は、常法に従い培養でき、該培養により本発明遺
伝子によりコードされる目的のｈ−ｔｃｔｅｘ−１が生
産、発現される。該培養に用いられる培地としては、採
用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選
択利用でき、その培養も宿主細胞の生育に適した条件下
で実施できる。

【００３６】上記により、形質転換体の細胞内、細胞外
乃至は細胞膜上に目的とする組換えｈ−ｔｃｔｅｘ−１
が発現、生産、蓄積乃至分泌される。

【００３７】組換えｈ−ｔｃｔｅｘ−１蛋白は、所望に
より、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の
分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259
頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同
人発行；Biochemistry, 25(25), 8274-8277 (1986); Eu
r. J. Biochem., 163, 313-321 (1987) 等参照〕により
分離、精製できる。該方法としては、具体的には例えば
通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、
遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、
分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析
法、之等の組合せ等を例示でき、特に好ましい上記方法
としてはｈ−ｔｃｔｅｘ−１を結合させたカラムを利用
したアフィニティクロマトグラフィーを例示できる。

【００３８】また、本発明によって明らかにされた本発
明遺伝子の配列情報を基にすれば、例えば該遺伝子の一
部又は全部の塩基配列を利用することにより、各種ヒト
組織における本発明遺伝子の発現の検出を行なうことが
できる。これは常法に従って行なうことができ、例えば
ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse transcribed-Polymerase chain
reaction ）〔Kawasaki, E.S., et al., Amplificatio
n of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and
applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-2
7(1991)〕によるＲＮＡ増幅により、またノーザンブロ
ッティング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Har
bor Laboratory(1989)〕等により、いずれも良好に実施
し得る。

【００３９】尚、前記ＰＣＲ法を採用する場合におい
て、用いられるプライマーは、本発明遺伝子のみを特異
的に増幅できる本発明遺伝子に特有のものである限り何
等限定はなく、本発明遺伝情報に基いてその配列を適宜
設定することができる。通常これは常法に従って２０〜
３０ヌクレオチド程度の部分配列を有するものとするこ
とができる。その好適な１例は、後記実施例に示す通り
である。

【００４０】しかして、本発明はかかるｈ−ｔｃｔｅｘ
−１遺伝子に特有の検出に有用なプライマー及び／又は
プローブをも提供するものである。

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、新規なｈ−ｔｃｔｅｘ
−１遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、該遺伝子
の各種組織での発現の検出や、ｈ−ｔｃｔｅｘ−１の遺
伝子工学的製造が可能となり、これらにより、ｈ−ｔｃ
ｔｅｘ−１の機能の解析や、これが関与する各種疾患、
例えば色素性網膜炎、網膜変性、夜盲症などの視力障害
を起こす疾患の診断、或は男性不妊症の診断等を行なう
ことができ、またこれらの疾患の治療及び予防薬のスク
リーニングや評価等をも行なうことができる。

【００４２】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、実
施例を挙げる。

【００４３】

【実施例１】 （１）クローニング及びＤＮＡシークエンシング ヒト胎児脳と胎盤ｃＤＮＡライブラリー（大塚ＧＥＮリ
サーチ インスティチュート、大塚製薬株式会社）から
任意に選択したｃＤＮＡクローンの配列解析とデータ・
ベースの検索の結果、５００塩基(ポリＡシグナルを除
いて)のｃＤＮＡクローンで、マウスのｔｃｔｅｘ−１
遺伝子及びヒトＲＰ３遺伝子と相同性の高いクローンを
見いだし、これをＧＥＮ−１０６Ｃ０４と名付けた。

【００４４】尚、上記配列解析は、二重鎖テンプレート
からのジデオキシヌクレオチド鎖終結法（自動サイクル
及び自動読取りシークエンスキット、ファルマシア社）
に従い、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマ
シア社）を用いて分析した。また、相同性は、ＵＷＧＣ
ＧのＦＡＳＴＡプログラム〔Pearson W. R. and Lipman
D. J., Proc.Natl.Acad.Sci., USA., 85, 2444-2448
(1988)〕によるデーターベース（GenBank, EMBL ）検索
によった。

【００４５】しかしながら、マウスｔｃｔｅｘ−１遺伝
子と比較した時、このクローンは５’部分を欠いていた
ので、欠けているセグメントを単離するために、以下の
５’レースの技術を用いた〔Frohman M.A., et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 8, 8998-9002 (198
8)〕。

【００４６】（２）５′−レース 本発明遺伝子の５′部分を含むｃＤＮＡクローンの単離
・解析は、製品使用プロトコールの一部修飾させ、市販
キット（5'-Rapid AmpliFinderTM RACE Kit,クローンテ
ック社）を用いた５′レース法により、以下の通り行な
った。ここで用いた遺伝子特異的プライマーＰ１及びア
ンカー・プライマーは常法に従い合成されたものであ
り、その配列は下記表１に示す通りである。

【００４７】

【表１】

【００４８】即ち、ヒト胎盤ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの０．
１μｇを逆転写酵素（SuperscriptTMII RNase H Revers
e Transcriptase,Life Technologies社）を用いたラン
ダムヘキサマーにより逆転写してｃＤＮＡを得、これを
Ｐ１プライマー及びアンカープライマーを用いた以下の
ＰＣＲにより増幅させた。

【００４９】上記ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの０．１μｇに
２．５ｍＭｄＮＴＰ／１ｘＴａｑ緩衝液(宝酒造製）／
０．２μＭ Ｐ１プライマー、０．２μＭ アダプター
・プライマー／ＥｘＴａｑ酵素(宝酒造製）０．２５単
位を併せて全量を５０μｌとした、これにアンカー・プ
ライマーを加えて室温で反応させた後、９４℃１分間、
次いで９４℃４５秒、６０℃４５秒、７２℃２分のサイ
クルを３５サイクル行ない、７２℃で５分間反応させ
た。

【００５０】ＰＣＲ産物は１．５％アガロース・ゲル電
気泳動により分析した。アガロース・ゲル電気泳動によ
り、およそ３５０核酸塩基の大きさを示す単一のバンド
を検出し、このバンドの産物をベクター（ｐＴ７Ｂｌｕ
ｅ（Ｒ）Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ，ノバゲン(Novagen) 社製）
に挿入し、適当なサイズの挿入がみられる複数のクロー
ンを選別した。

【００５１】ＰＣＲ反応物から得られ５’レース・クロ
ーンの１０が同じ配列を有しているが、異なる長さを有
していることが証明された(３５０−４００塩基)。ＧＥ
Ｎ−１０６Ｃ０４とＧＥＮ−１０６Ｃ０４０８の２つの
重なっているｃＤＮＡクローンをシークェンシングする
ことによって、全体をコードしている配列と新規な遺伝
子の５’と３’隣接配列と全長７０４塩基の配列を決定
した。

【００５２】図１にｈ−ｔｃｔｅｘ−１の核酸配列と推
定アミノ酸配列を示した。ストップ・コドンはアスタリ
スクで、ポリアデニレーション・シグナルは、二重下線
ボックスで、３’末端に直ちに続くポリＡテイルは省略
されている。５’レースのために用いられたプライマー
の位置は下線で示した。

【００５３】ｃＤＮＡクローンの最初のＡＴＧである推
定されたスタート・コドンは１３−１５塩基目であっ
た。このＡＴＧに先行したインフレーム・ストップ・コ
ドンがないので、本発明者らは、このクローンがｍＲＮ
Ａの５’末端をカバーしていなかったという可能性を排
除し得ることができなかった。

【００５４】ＡＡＧＡＴＧＧ（１０−１６塩基）は、−
３（Ａ）＋４（Ｇ）位置で最適の前後関係（Ａ／Ｇ）Ｃ
ＣＡＴＧＧ（Kozak M., J. Biol. Chem., 266, 19867-1
9870(1991))となっていた、そしてそのマウスのｔｃｔ
ｅｘ−１との高い相同性（コード利用域において９１．
１％）は、このＡＴＧが開始コドンであることが強く提
言された。

【００５５】最適のポリアデニレーション・シグナル
は、ポリ（Ａ）開始前の１２塩基によって続いていた。
推定されたオープン・リーディング・フレームは１１３
アミノ酸ペプチドをコードしている３３９塩基からなっ
ており、分子量１２，４５２ダルトンと計算された。

【００５６】（３）他の蛋白とｈ−ｔｃｔｅｘ−１との
類似性 ｈ−ｔｃｔｅｘ−１遺伝子産物と、マウスｔｃｔｅｘ−
１遺伝子産物及びヒトＲＰ３遺伝子との間での類似性整
列を検討した。

【００５７】その結果、ｈ−ｔｃｔｅｘ−１はマウスｔ
ｃｔｅｘ−１の推定される相同物であり、ＲＰ３もまた
ｔｃｔｅｘ−１ファミリーに属するものであることが強
く提言された。４つのシスティン残基がそれら(ｈ−ｔ
ｃｔｅｘ−１のＣｙｓ−６７， ８３，９３，１０４)
の間を保存させた分子内又は分子間ジスルフィド架橋の
形成に関連しているかもしれない。いくつかの翻訳後修
飾部位もまた保存されていた。カゼイン・キナーゼIIと
プロティン・キナーゼＣリン酸化部位も保存されてい
る、リン酸化モチーフは、ｈ−ｔｃｔｅｘ−１において
それぞれ８７−ＳＳＴＤ−９０と９４−ＴＶＲ−９６の
位置に存在していた。

【００５８】（４）ノーザンブロット分析 正常ヒト組織におけるｈ−ｔｃｔｅｘ−１ｍＲＮＡの発
現を、ＧＥＮ−１０６Ｃ０４クローンの増幅したものを
〔³²Ｐ〕−ｄＣＴＰ（ランダムプライムドＤＮＡラベリ
ングキット、ベーリンガーマンハイム社）により標識
し、精製した。

【００５９】ノーザンブロット分析は、常法に従い、Ｍ
ＴＮブロット（HumanMultiple Tissue Nothern blot ;
クローンテック社）を用いて実施した。ブロッティング
は１時間プレハイブリダイズ後、４２℃で１８時間、５
０％ホルムアミド／５×ＳＳＣ／１０×デンハルツ溶液
／２％ＳＤＳ溶液（１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮ
Ａ含有）の溶液中でハイブリダイズした。２×ＳＳＣ／
０．０５％ＳＤＳにて室温下に１時間、次いで０．１×
ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにて６５℃下に３時間洗浄し
た。フィルターは−８０℃下に１２時間露出を与えた。

【００６０】尚、試験した各臓器はヒト心臓、脳、胎
盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、甲状腺、前
立腺、睾丸、卵巣、小腸、大腸、末梢血白血球であっ
た。

【００６１】その結果、試験した１６の全ての組織にお
いて、０．９キロ塩基対の転写物が検出可能であった。
０．９キロ塩基対の転写物がｈ−ｔｃｔｅｘ−１のｃＤ
ＮＡクローンのサイズに一致していた。

【００６２】（５）ダイレクト・Ｒ−バインディングＦ
ＩＳＨによるコスミド・クローンと染色体の局在 系統的にコスミドクローンを単離するために、９６ウェ
ルプレートの１６００セットにクローンを登録した(２
つのヒトゲノムに相等している)。１５プレートの各々
上に登録した１４４０クローンをナイロン膜上に別々に
二重にブロットした。そのうちひとつのシリーズとして
１０７のナイロン膜をドット・ブロットのために使用し
た。

【００６３】他のシリーズから、登録されたクローンを
回収し、培養し、ＰＣＲスクリーニングのための鋳型と
して調製した。

【００６４】表２に示す塩基配列の２つの遺伝子特異的
プライマー（ＣＯＳ１及びＣＯＳ２）を用いた。

【００６５】

【表２】

【００６６】ＰＣＲスクリーニングにより陽性クローン
を含むメンブランを同定したのち、それらのナイロン膜
は、ノーザン・ブロッティングと同じ条件下でハイブリ
タイズされた。上記方法によって得られた２つの独立し
たクローンを、複製されたプロメタフェーズＲ−バンド
と組合わせたＦＩＳＨに基づく技術であるダイレクトＲ
−バィンディング・フルオレッセン・インサイチュー・
ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)によるマッピングに
使用した〔Takahashi E., et al, Hum. Genet., 86, 14
-16(1990): Takahashi E., et al, Hum. Genet., 88, 1
19-121(1991)〕。

【００６７】尚、これらのクローンに供されている反復
配列の抑制のために、リクター〔Lichter P. et al., P
roc. Natl. Sci. U.S.A., 87, 6634-6638(1990)〕によ
って記載されたように２０倍過度のヒトＣｏｔ−Ｉ Ｄ
ＮＡ(BRL社製)を用いた。

【００６８】プロビア１００フィルム(フジＩＳＯ１０
０；フジ・フィルム社製)を顕微鏡写真のために用いた
(フィルター・コンビネーション、ニコンＢ−２Ａ)。

【００６９】その結果、染色体１２の６ｑ２５．２−ｑ
２５．３バンドにｈ−ｔｃｔｅｘ−１がマップされた。

【００７０】上記実施例の結果から、ｈ−ｔｃｔｅｘ−
１の核酸配列と染色体の局在は、マウスｔｃｔｅｘ−１
遺伝子の推定ヒト相同物であると強く提言されたが、そ
の発現パターンはマウスのそれ〔Lader, E., et al., C
ell, 58, 969-979 (1989); Ha, H., et al., Dev. Gene
t., 12, 318-332 (1991)〕とは区別された。また、ヒト
ＲＰ３とその有意に高い相同性から、それが網膜の機能
に関与していると考えられた。

【００７１】

【配列表】

【００７２】配列番号：１ 配列の長さ：１１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：蛋白 配列： Met Glu Asp Tyr Gln Ala Ala Glu Glu Thr Ala Phe Val Val Asp Glu 1 5 10 15 Val Ser Asn Ile Val Lys Glu Ala Ile Glu Ser Ala Ile Gly Gly Asn 20 25 30 Ala Tyr Gln His Ser Lys Val Asn Gln Trp Thr Thr Asn Val Val Glu 35 40 45 Gln Thr Leu Ser Gln Leu Thr Lys Leu Gly Lys Pro Phe Lys Tyr Ile 50 55 60 Val Thr Cys Val Ile Met Gln Lys Asn Gly Ala Gly Leu His Thr Ala 65 70 75 80 Ser Ser Cys Phe Trp Asp Ser Ser Thr Asp Gly Ser Cys Thr Val Arg 85 90 95 Trp Glu Asn Lys Thr Met Tyr Cys Ile Val Ser Ala Phe Gly Leu Ser 100 105 110 Ile

【００７３】配列番号：２ 配列の長さ：３３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA (cDNA) 配列： ATGGAAGACT ACCAGGCTGC GGAGGAGACT GCTTTTGTTG TTGATGAAGT GAGCAACATT 60 GTAAAAGAGG CTATAGAAAG CGCAATTGGT GGTAACGCTT ATCAACACAG CAAAGTGAAC 120 CAGTGGACCA CAAATGTAGT AGAACAAACT TTAAGCCAAC TCACCAAGCT GGGAAAACCA 180 TTTAAATACA TCGTGACCTG TGTAATTATG CAGAAGAATG GAGCTGGATT ACACACAGCA 240 AGTTCCTGCT TCTGGGACAG CTCTACTGAC GGGAGCTGCA CTGTGCGATG GGAGAATAAG 300 ACCATGTACT GCATCGTCAG TGCCTTCGGA CTGTCTATT 339

【００７４】配列番号：３ 配列の長さ：７０４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA (cDNA) 配列の特徴： 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：１３．．３５２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： GCCGGAGGAA AG ATG GAA GAC TAC CAG GCT GCG GAG GAG ACT GCT TTT 48 Met Glu Asp Tyr Gln Ala Ala Glu Glu Thr Ala Phe 1 5 10 GTT GTT GAT GAA GTG AGC AAC ATT GTA AAA GAG GCT ATA GAA AGC GCA 96 Val Val Asp Glu Val Ser Asn Ile Val Lys Glu Ala Ile Glu Ser Ala 15 20 25 ATT GGT GGT AAC GCT TAT CAA CAC AGC AAA GTG AAC CAG TGG ACC ACA 144 Ile Gly Gly Asn Ala Tyr Gln His Ser Lys Val Asn Gln Trp Thr Thr 30 35 40 AAT GTA GTA GAA CAA ACT TTA AGC CAA CTC ACC AAG CTG GGA AAA CCA 192 Asn Val Val Glu Gln Thr Leu Ser Gln Leu Thr Lys Leu Gly Lys Pro 45 50 55 60 TTT AAA TAC ATC GTG ACC TGT GTA ATT ATG CAG AAG AAT GGA GCT GGA 240 Phe Lys Tyr Ile Val Thr Cys Val Ile Met Gln Lys Asn Gly Ala Gly 65 70 75 TTA CAC ACA GCA AGT TCC TGC TTC TGG GAC AGC TCT ACT GAC GGG AGC 288 Leu His Thr Ala Ser Ser Cys Phe Trp Asp Ser Ser Thr Asp Gly Ser 80 85 90 TGC ACT GTG CGA TGG GAG AAT AAG ACC ATG TAC TGC ATC GTC AGT GCC 336 Cys Thr Val Arg Trp Glu Asn Lys Thr Met Tyr Cys Ile Val Ser Ala 95 100 105 TTC GGA CTG TCT ATT TGACCTGCAG TCCAGCCTAT GGCCTTTCTC CTTTTGTCTC 391 Phe Gly Leu Ser Ile 110 TAGTTCATCC TCTAACCACC AGCCATGAAT TCAGTGAACT CTTTTCTCAT TCTCTTTGTT 451 TTGTGGCACT TTCACAATGT AGAGGAAAAA ACCAAATGAC CGCACTGTGA TGTGAATGGC 511 ACCGAAGTCA GATGAGTATC CCTGTAGGTC ACCTGCAGCC TGCGTTGCCA CTTGTCTTAA 571 CTCTGAATAT TTCATTTCAA AGGTGCTAAA ATCTGAAATC TGCTAGTGTG AAACTTGCTC 631 TACTCTCTGA AATGATTCAA ATACACTAAT TTTCCATACT TTATACTTTT GTTAGAATAA 691 ATTATTCAAA TCT 704

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明遺伝子ｈ−ｔｃｔｅｘ−１の核酸配列と
アミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ // Ｇ０１Ｎ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/531 Ａ 33/531 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコ
   ードする塩基配列を含むことを特徴とするヒトｔｃｔｅ
   ｘ−１遺伝子。
2. 【請求項２】配列番号：２で示される塩基配列を含むこ
   とを特徴とするヒトｔｃｔｅｘ−１遺伝子。
3. 【請求項３】配列番号：３で示される塩基配列である請
   求項２に記載のヒトｔｃｔｅｘ−１遺伝子。