JPH0880193A - 血管型バソプレシン受容体遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明は、配列番号：１で示される塩基配列を
含む血管型バソプレッシン受容体遺伝子、殊に配列番
号：２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を
含む上記ヒト血管型バソプレッシン受容体遺伝子を提供
する。 【効果】本発明遺伝子は、その利用により、ヒト血管型
バソプレッシン受容体の製造及び組織での該遺伝子発現
の検出等に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血管型バソプレシン受
容体遺伝子、より詳しくは配列番号：１で示される塩基
配列を含むことを特徴とするヒト血管型バソプレシン受
容体遺伝子に関する。

【０００２】

【従来技術とその課題】神経下垂体ホルモンであるアル
ギニンバソプレシン（ＡＶＰ）は、例えば排尿抑制、平
滑筋の収縮、肝臓のグリコゲン異化刺激及び下垂体から
放出される副腎皮質刺激ホルモンの調節等の多様な作用
を有することが知られている。該ＡＶＰは、異なる第２
のメッセンジャーと結合した特定の膜受容体と結合する
ことによりその作用を及ぼす。

【０００３】バソプレシン受容体は、少なくとも３つの
サブタイプ、即ちＶ1A、Ｖ1B及びＶ2 受容体に分類でき
る［Front. Horm. Res.,13, 89-104 (1985) ；Biochem.
Soc. Trans., 7, 861-865 (1979) ］。

【０００４】上記Ｖ1A 受容体は、血管収縮及び肝臓の
グリコゲン異化をメディエートし、Ｖ1B 受容体は、下
垂体前葉からの副腎皮質刺激ホルモンの分泌をメディエ
ートし、またＶ2 受容体は、抗利尿作用をメディエート
する［Neuroendocrinology,39, 186-188 (1984)；Mol.
Pharmacol.,30, 171-177 (1986)］。

【０００５】一般に、Ｖ1 受容体の活性化によればホス
ファチジルイノシトールの加水分解及び細胞内カルシウ
ムの可動化が起こり、Ｖ2 受容体は細胞内サイクリック
ＡＭＰの増加に関連する。

【０００６】最近になって、ラットのバソプレシンＶ1A
受容体及びＶ1B受容体をコードするｃＤＮＡがクローン
化され［Nature, 357, 333-335 (1992) ；同 357, 336-
339(1992)；同 356, 523-526 (1992)］、両受容体共、
７つの推定膜通過ドメインを有するＧ蛋白−結合受容体
のメンバーであることが判った。

【０００７】しかしながら、ヒトにおけるバソプレシン
受容体サブタイプの組織分布及び薬理学的性質に関して
は殆ど役立つ情報がない現状にある。最近の薬理学的研
究によればバソプレシン受容体拮抗剤の効果に顕著な種
間相違が示されている点より［Life Sci.,50, 1953-195
8 (1992)］、ヒトバソプレシン受容体、特にＶ1 受容体
のｃＤＮＡに関する研究が非常に重要な課題であると考
えられる。

【０００８】この点、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーか
らのヒトバソプレシンＶ1A受容体をコードするｃＤＮＡ
のクローン化が、最近報告されている［J. Biol. Che
m., 269, 3304-3310 (1994) ］。しかしながら、かかる
ｃＤＮＡにおいては、５’非翻訳領域の情報が欠けてい
る。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、新規なヒトバソプレシン受容体遺伝子、殊にヒト血
管型バソプレシン受容体遺伝子を提供する点にある。

【００１０】本発明者らは、ヒト腸間膜動脈のｃＤＮＡ
プールから５’−及び３’−レース（ＲＡＣＥ：Rapid
Amplification of cDNA Ends）法を利用してヒトバソプ
レシン受容体遺伝子のクローニング及び機能的発現に成
功し、ここに本発明を完成するに至った。

【００１１】即ち、本発明は配列番号：１で示される新
規な塩基配列を含むことで特徴付けられるヒト血管型バ
ソプレシン受容体遺伝子、殊に配列番号：２で示される
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するものである
当該遺伝子に係わる。

【００１２】以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチ
ド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡ
Ｃ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む
明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及
び当該分野における慣用記号に従うものとする。

【００１３】本発明により提供される遺伝子、代表的に
は配列番号：３で示される塩基配列を有するクローン
（ＨＶ−ＲＡＣＥ）、によりコードされるアミノ酸配列
は、上記配列番号：２に示されるとおりである。かかる
４１８アミノ酸からなる配列は、ラットＶ1Aバソプレシ
ン受容体と高い相同性を有しており、また前記したヒト
肝臓型Ｖ1Aバソプレシン受容体のそれと同一である。

【００１４】本発明によれば、ヒト血管型バソプレシン
受容体遺伝子の全体が明らかにされ、特にその５’非翻
訳領域がここに新規な情報として提供される。かかる特
定領域の塩基配列は、配列番号：１に示されるとおりで
あり、この配列情報により、ヒト血管型バソプレシン受
容体遺伝子の各種組織レベルでの遺伝子発現の検出と確
認が可能とされた。

【００１５】本発明遺伝子は、上記配列番号：１に示さ
れるように一本鎖ＤＮＡ配列で表されるが、本発明はか
かる一本鎖ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列や之等の両
者を含むコンポーネントもまた包含するものである。
尚、上記配列番号：３に示す本発明遺伝子を表すＤＮＡ
配列は、配列番号：２に示すコード領域であるアミノ酸
配列に従う各アミノ酸残基をコードするコドンの一つの
組合わせ例であり、本発明遺伝子はこれに限らず、上記
アミノ酸配列を変えることなく各アミノ酸残基に対して
任意のコドンを組合わせ選択したＤＮＡ塩基配列を有す
ることも勿論可能である。該コドンの選択は常法に従う
ことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考
慮することができる［Nucleic Acids Research, 9, 43-
74 (1981)］。

【００１６】更に本発明遺伝子には、上記配列番号：１
で示される塩基配列を含む限りにおいて、上記で示され
るコード領域のアミノ酸配列の一部のアミノ酸乃至アミ
ノ酸配列を欠失、付加等により改変してなり、ヒト血管
型バソプレシン受容体と同様の生物活性を保持する同効
物をコードする塩基配列を含むものもまた包含される。
之等同効物の製造、改変（変異）等は天然に生じること
もあり、また翻訳後の修飾により、或は遺伝子工学的手
法により天然の遺伝子（本発明遺伝子）を、例えばサイ
トスペシフィック・ミュータゲネシス等の方法［Method
s in Enzymology, 154, p350, 367-382 (1987)；同 10
0, p468 (1983) ；Nucleic Acids Research, 12, p9441
(1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、
日本生化学会編, p105 (1986) ］等の方法により改変し
たり、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法等の
化学合成手段［J. Am. Chem. Soc.,89, p4801 (1967)；
同91, p3350 (1969)；Science, 150, p178 (1968) ；Te
trahedron Lett.,22, p1859(1981)；同24, p245 (1983)
］により変異させたＤＮＡを合成したり、それらの組
合せにより収得することができる。

【００１７】本発明遺伝子は、これを利用して、即ち例
えばこれを微生物のベクターに組込み、形質転換された
微生物を培養することによって、血管型バソプレシン受
容体を容易にかつ安定して発現できる。これは前述した
バソプレシン或はその拮抗薬についての各種薬理試験に
好適に利用でき、各種の疾患の発生機序等や病態の解
明、更には各種疾患の治療及び予防等の研究に役立つも
のである。

【００１８】また本発明の遺伝子を利用して得られる血
管型バソプレッシン受容体は、これを用いて、血管型バ
ソプレッシン受容体に特異的な抗体を作成することもで
きる。ここで抗原として用いられるコンポーネントは、
上記遺伝子工学的手法に従って大量に産生される蛋白を
用いることができ、得られる抗体はポリクローナル抗体
及びモノクローナル抗体のいずれでもよく、之等抗体は
蛋白の精製、測定、識別等に有利に利用できる。

【００１９】殊に、本発明遺伝子は、その一部又は全部
の塩基配列を利用することによって、特に配列番号：１
で示される塩基配列の一部又は全部を含むように任意設
定することにより、各種ヒト組織におけるヒト血管型バ
ソプレッシン受容体遺伝子の発現を検出する上で極めて
良好に使用できる点で特徴付けられる。

【００２０】本発明遺伝子の製造は、本発明によって開
示された本発明遺伝子についての配列情報によれば、一
般的遺伝子工学的手法により容易に実施できる［Molecu
larCloning 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory P
ress (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、Ｉ
Ｉ、ＩＩＩ」、日本生化学会編 (1986) 等参照］。

【００２１】これは例えばヒトｃＤＮＡライブラリー
（ヒト血管型バソプレッシン受容体をコードする遺伝子
を含む適当な起源細胞より常法に従い調製されたもの）
から、本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用
いて所望クローンを選択することにより実施できる［Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, p6613 (1981) ; Scien
ce, 222, p778 (1983)等］。

【００２２】上記方法において、起源細胞としては、ヒ
ト血管型バソプレッシン受容体遺伝子を発現する各種の
細胞、組織や之等に由来する培養細胞等が例示され、こ
れからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤ
ＮＡへの変換（合成）とそのクローニング等はいずれも
常法に従い実施できる。また、ｃＤＮＡライブラリーは
市販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡラ
イブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab.
Inc.）より市販の各種ｃＤＮＡライブラリー等、を用い
ることもできる。

【００２３】ｃＤＮＡライブラリーからの本発明遺伝子
のスクリーニングは、前記通常の方法に従い実施するこ
とができる。該スクリーニング方法としては、例えばｃ
ＤＮＡの産生する蛋白質に対して、ヒト血管型バソプレ
ッシン受容体特異抗体を使用した免疫学的スクリーニン
グにより、対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、
目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いた
プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダ
イゼーション等及び之等の組合せを例示できる。ここで
用いられるプローブとしては、本発明遺伝子の塩基配列
に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡ等を用
いるのが一般的であり、勿論既に取得された本発明遺伝
子やその断片もかかるプローブとして利用できる。

【００２４】また、本発明遺伝子の取得に際しては、Ｐ
ＣＲ法［Science, 230, 1350-1354(1985) ］によるＤＮ
Ａ／ＲＮＡ増幅法も好適に利用できる。殊にヒト血管型
バソプレッシン受容体遺伝子においては、ライブラリー
から全長のｃＤＮＡが得られにくく、このような場合に
レース法［実験医学、12(6), 35-38 (1994) ］の採用が
好適であり、後述するように本発明においても当初遺伝
子はかかるレース法の採用によってはじめて全長ｃＤＮ
Ａとして収得できたものである。かかるＰＣＲ法の採用
に際して使用されるプライマーは、既に本発明によって
明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜
設定することができ、これは常法に従い合成することが
できる。

【００２５】尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離
精製は前記のとおり常法であり、例えばゲル電気泳動法
等によればよい。

【００２６】上記で得られる本発明遺伝子或は各種ＤＮ
Ａ断片等の塩基配列の決定も、常法に従うことができ、
例えばジデオキシ鎖法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
74,5463-5467 (1977)］やマキサム−ギルバート法［Met
hods in Enzymology,65, p499 (1980) ］等により行な
うことができる。かかる塩基配列の決定は、市販のシー
クエンスキット等を用いても容易に行ない得る。

【００２７】かくして得られた、本発明遺伝子の一例で
ありクローンＨＶ−ＲＡＣＥと名つけられたｃＤＮＡの
全ＤＮＡ塩基配列は、配列番号：３に示すとおりであ
り、これによってコードされるヒト血管型バソプレッシ
ン受容体のアミノ酸配列は、配列番号：２に示すとおり
であり、そして本発明の特徴点である５’非翻訳領域の
ＤＮＡ塩基配列は、配列番号：１に示すとおりである。

【００２８】本発明遺伝子の利用によれば、通常の遺伝
子組換え技術［例えば、Science, 224, p1431 (1984) ;
Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, p692 (1985) ；
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, p5990 (1983) 及び
前記引用文献等参照］に従うことにより、組換え体ヒト
血管型バソプレッシン受容体を得ることができる。該ヒ
ト血管型バソプレッシン受容体の製造は、より詳細に
は、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮ
Ａを作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該
形質転換体を培養することにより行なわれる。

【００２９】ここで宿主細胞としては、真核生物及び原
核生物のいずれも用いることができる。該真核生物の細
胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細
胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞［Cel
l, 23, 175-182 (1981)］やチャイニーズ・ハムスター
卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株［Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)］等
がよく用いられているが、之等に限定される訳ではな
い。殊に本発明遺伝子は、ヒト血管型バソプレッシン受
容体をコードしこれを発現するものであり、かかる観点
からは、適当なヒト宿主細胞の採用が好適であろう。

【００３０】脊椎動物の発現ベクターとしては、通常発
現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、
ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写
終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要
により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの
例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを保
有するｐＳＶ２dhfr［Mol. Cell. Biol., 1, 854-764］
等を例示できる。

【００３１】また、真核微生物としては、酵母が一般に
よく用いられ、中でもサッカロミセス属酵母を有利に利
用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとして
は、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモー
ターを有するｐＡＭ８２［Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 80, 1-5 (1983)］等を利用できる。

【００３２】原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌
が一般によく用いられる。之等を宿主とする場合、本発
明では、例えば該宿主菌中で複製可能なプラスミドベク
ターを用い、このベクター中に本発明遺伝子が発現でき
るように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シヤ
イン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開
始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現
プラスミドを利用するのが好ましい。上記宿主としての
大腸菌としては、エシエリヒア・コリ（Escherichia co
li）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一般
にｐＢＲ３２２及びその改良ベクターがよく用いられる
が、之等に限定されず公知の各種の菌株及びベクターを
も利用できる。プロモーターとしては、例えばトリプト
ファン（ｔｒｐ）プロモーター、lpp プロモーター、la
c プロモーター、ＰL/R プロモーター等を使用できる。

【００３３】かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿
主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法として
は、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質
転換体は、常法に従い培養でき、該培養により本発明遺
伝子によりコードされる目的のヒト血管型バソプレッシ
ン受容体が生産、発現される。該培養に用いられる培地
としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の
ものを適宜選択利用でき、その培養も宿主細胞の生育に
適した条件下で実施できる。

【００３４】上記により、形質転換体の細胞内、細胞外
乃至は細胞膜上に目的とする組換えヒト血管型バソプレ
ッシン受容体蛋白が発現、生産、蓄積乃至分泌される。

【００３５】組換えヒト血管型バソプレッシン受容体
は、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用
した各種の分離操作［「生化学データーブックＩＩ」、
1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社
東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274-8277
(1986); Eur. J. Biochem., 163, 313-321 (1987) 等参
照］により分離、精製できる。該方法としては、具体的
には例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理
（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破
砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル瀘
過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマト
グラフィー、透析法、之等の組合せ等を例示できる。

【００３６】本発明遺伝子の一部又は全部の塩基配列を
利用する、各種ヒト組織におけるヒト血管型バソプレッ
シン受容体遺伝子の発現の検出もまた、本発明によって
明らかにされた配列情報を基に常法に従い行なうことが
でき、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ［Kawasaki, E.S., Amplif
ication of RNA. In PCR Protocol, A Guide to method
s and applications, Academic Press, Inc., SanDieg
o, 21-27 (1991)］によるＲＮＡ増幅により、またノー
ザンブロッティング解析［Molecular Cloning, Cold Sp
ring Harbor Laboratory (1989) ］等により良好に実施
し得る。

【００３７】尚、ＰＣＲ法を採用する場合において、プ
ライマーは、本発明遺伝子のみを特異的に増幅できる本
発明遺伝子に特有のものである限りにおいて何等制限は
ないが、本発明によって明らかにされた５’非翻訳領域
を含むように設定することが重要である。かかるプライ
マーは、本発明の配列情報に基づき適宜設定することが
でき、これは常法に従い、通常、１５〜３０ヌクレオチ
ド程度の部分配列を有するものであることができる。か
かるプライマー設定の１例としての好適な具体例は、後
述の実施例に示すとおりである。

【００３８】しかして本発明は、かかるヒト血管型バソ
プレッシン受容体遺伝子の検出に有用なプライマー及び
／又はプローブをも提供するものである。

【００３９】

【発明の効果】本発明によれば、ヒト血管型バソプレッ
シン受容体遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、ヒ
ト血管型バソプレッシン受容体遺伝子の各組織での発現
の検出やヒト血管型バソプレッシン受容体の遺伝子工学
的製造ができ、これらによりバソプレシン或はその拮抗
薬についての各種薬理試験への利用、各種の疾患の発生
機序等や病態の解明、更には各種疾患の治療及び予防等
の研究に役立つものである。

【００４０】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、実
施例を挙げる。

【００４１】

【実施例１】 （１）ヒト血管型バソプレシン受容体ｃＤＮＡのクロー
ニング ヒト腸間膜動脈組織から、セシュームクロライドグラジ
エント法により全細胞ＲＮＡを単離した。

【００４２】図１に示す概略に従い、Ｖｚ−１、Ｖｚ−
２、ｒＶ１−１、ｒＶ１−２及びｒＶ１−４のプライマ
ーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ［Invest. Ophthalmol. Vis.
Sci.,34, 2769-2775 (1993) ; Eur. J. Pharmacol. Mo
lec. Pharmacol., 267, 71-75 (1994) ; Biochem. Biop
hys. Res. Commun., 195, 902-909 (1993)］を行なっ
た。

【００４３】尚、本試験に用いた全てのオリゴヌクレオ
チドプライマーの方向、位置及び塩基配列を下記表１に
示す。

【００４４】

【表１】

【００４５】之等の各プライマーは、ＤＮＡ合成機（モ
デル３９１Ａ、アプライドバイオシステムズ社製：β−
シアノメチルホスホロアミデート誘導体）により合成し
た。

【００４６】上記ＰＣＲ増幅プロフィルは、９４℃、１
分の変性処理、５５℃、３０秒のプライマーアニーリン
グ処理及び７２℃、２分の延長処理である。

【００４７】得られたＰＣＲ生成物を、アガロースゲル
電気泳動後、ＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造社製）により
精製し、次いでＴＡ−クローニング法［Ausubel F.M.,
etal, Current protocols in molecular biology］によ
り、pBluescript ＫＳ（＋）プラスミド（ストラタジェ
ン社製：Stratagene）のＥｃｏＲＩサイトにサブクロー
ンした。

【００４８】ラットＶ1A受容体に相同性の高い５つのク
ローンを選択し、「ＨＶ１−０１」〜「ＨＶ１−０５」
と命名した（図１）。

【００４９】５’−ＲＡＣＥ（プライマー：ｈＶ１−
４）及び３’−ＲＡＣＥ（プライマー：ｈＶ１−３）
は、全ＲＮＡの１μｇを用い、表１に示すＲＡＣＥ、Ｒ
ＡＣＥ−２及びＲＡＣＥ−Ｔプライマーを用いて、ギブ
コ社（GIBCO BRL ）プロトコールに従って行なった。

【００５０】上記のとおり、５’−及び３’−ＲＡＣＥ
法と共にＰＣＲホモロジークローニングストラテジーを
利用することによって、ヒト腸間膜動脈ｃＤＮＡを起源
として、１０個のクローン（ＨＶ１−０１〜−０５、Ｈ
Ｖ５′−０１〜−０３及びＨＶ３′−０１〜−０２、図
１参照）が得られた。ＰＣＲ増幅の誤りをさけるため
に、得られた全クローンを配列決定し、オーバーラップ
領域における同一性を確認した。更に、ＰＣＲアセンブ
リー法［Ausubel F.M., etal, Current protocols in m
olecular biology］に従い、ＨＶ５′−０１、ＨＶ１−
０１及びＨＶ３′−０２の各クローンより全長ｃＤＮＡ
を構築した。

【００５１】かくして得られた構築物をＨＶ−ＲＡＣＥ
と命名した（図１参照）。該ＨＶ−ＲＡＣＥの塩基配列
は、配列番号：３に示されるとおりである。

【００５２】ＨＶ−ＲＡＣＥは、４１８アミノ酸の蛋白
をコードする１２５４ｂｐのオープンリーディングフレ
ームを含んでおり（配列番号：３参照）、５’非翻訳領
域の新規な配列（配列番号：１参照）を含むことによっ
て特徴付けられる。

【００５３】（２）ラットＶ1A受容体のＰＣＲクローニ
ング コード領域の全長を増幅できるｒＶ１−３及びｒＶ１−
４の各プライマーを用いて、ラット肝臓ＲＮＡ由来の合
成ｃＤＮＡを増幅させ、得られる生成物（ｒＶ1A−１
０）をサブクローンし、配列決定した。

【００５４】該ｒＶ1A−１０クローンは、先の報告［Na
ture, 356, 523-526 (1992) ］に係わるラットＶ1A受容
体ｃＤＮＡと同一であることが確認された。

【００５５】（３）ＤＮＡシークエンシング クローン化したｃＤＮＡ、酵素消化した断片及びＰＣＲ
生成物は、pBluescript ＫＳ（＋）プラスミドＫＳＩ
Ｉ（＋）にサブクローンした。核酸配列の分析は、ABI3
73A ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステム
ズ社製：Applied Biosystem, Inc. ）を用いて行なっ
た。

【００５６】（４）ＣＯＳ−７細胞におけるトランジェ
ント発現 ＨＶ−ＲＡＣＥクローン及びｒＶ1A−１０クローンのた
めの発現ベクターを構築するために、それらのＥｃｏＲ
Ｉ−ＸｈｏＩ断片を、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ消化させた
ＳＲαプロモーターを有する哺乳動物発現ベクターｐＭ
Ｅ１８Ｓ［Mol.Cell. Biol., 8, 466-472 (1988) ］に
挿入した。構築されたＨＶ−ＲＡＣＥ発現ベクター「ｐ
ＭＥ−ＨＶ」及びｒＶ1A−１０発現ベクター「ｐＭＥ−
ＲＶ」を、ＤＥＡＥ−デキストラン法により、ＣＯＳ−
７細胞にトランスフェクトし、その後、細胞を４８〜７
２時間培養した。

【００５７】（５）ラット肝細胞膜の調整 ＨＶ−ＲＡＣＥ及びｒＶ1A−１０によってコードされる
受容体と天然型ラットＶ1A受容体との結合性の比較のた
めに、ラット肝臓原形質膜を中村等の方法［J.Biol. Ch
em., 258, 9283-9289 (1983) ］に従って調整した。

【００５８】（６）ラジオリガンド結合分析 ＣＯＳ−７細胞膜を文献［Biochem. Biophys. Res. Com
mun., 195, 902-909 (1993) ］に記載の方法に従って調
整した。

【００５９】即ち、細胞を集め、ブランソンソニケータ
ー（モデルＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０、setting 5 for 8
s）によって破壊した。混合物を次いで遠心分離（３０
００×ｇ、１０分間）し、上清フラクションを遠心分離
（３５０００×２０分間）した。得られたペレットを結
合緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１％（ｗ／
ｖ）牛血清アルブミン（ＢＳＡ））に再懸濁させた。

【００６０】膜成分（５０μｇ蛋白）を、競合リガンド
の存在下又は非存在下に、〔 ³Ｈ〕ＡＶＰ（特異活性＝
７５．８Ｃｉ／ミリモル、ニユーイングランドヌクレア
社製：New England Nuclear)と、最終濃度が２５０μｌ
となる量の結合緩衝液中で、３０℃で３０分間インキュ
ベートした。氷で冷却した緩衝液で希釈後、サンプルを
直ちに、ブランデル細胞ハーベスター（Blandel cell h
arvester) モデル−３０を有するワットマンＧＦ／Ｃグ
ラスファイバーフィルター（Whatmann）を通して濾過し
た。

【００６１】競合的試験は、リガンドのＫｄに相当する
約８．２ｎＭ〔 ³Ｈ〕ＡＶＰ濃度にて行なった。この濃
度において、１μＭ ＡＶＰ（シグマ社製：Sigma ）の
存在下での結合の場合、非特異的結合は全結合の約１０
％以下となる。

【００６２】蛋白濃度はＢＣＡ蛋白分析キット（ピース
社製：PIERCE）を用いて測定した。

【００６３】結合性データーの分析は、ＬＩＧＡＮＤプ
ログラム［Anal. Biochem., 107, 220-239 (1980) ］に
従い常法（nonlinear reiterative technique ）により
行なった。

【００６４】上記競合的試験の結果を第２〜４図に示
す。第２〜４図において、縦軸は、結合した〔 ³Ｈ〕Ａ
ＶＰの最大割合（％Maximum ）を、横軸は共存させた試
薬（ＡＶＰ及びＡＶＰ拮抗剤ＯＰＣ−２１２６８及びＯ
ＰＣ−３１２６０）の濃度（-Log₁₀Ｍ）を示し、図２は
ｐＭＥ−ＨＶでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の
場合、図３はｐＭＥ−ＲＶでトランスフェクトしたＣＯ
Ｓ−７細胞の場合、図４はラット肝細胞膜調製物の場合
の結果をそれぞれ示す。尚、結果は平均値（ｎ＝３〜
４）で示した。

【００６５】図２〜４より、ｐＭＥ−ＨＶ及びｐＭＥ−
ＲＶでトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞及びラッ
ト肝細胞膜調製物と〔 ³Ｈ〕ＡＶＰとの結合は、ＡＶＰ
（Ｋｉ＝２．９ｎＭ）によって強く抑制された。また、
ＡＶＰ及びＡＶＰ拮抗剤ＯＰＣ−２１２６８及びＯＰＣ
−３１２６０のラット肝細胞膜についてのＫｉ値は、い
ずれも先の報告［Science, 252, 572-574 (1992) ; Br.
J. Pharmacol., 105,787-791 (1992) ］に一致してい
た。

【００６６】尚、トランスフェクトされていないＣＯＳ
−７細胞又はプラスミドｐＭＥ１８Ｓでトランスフェク
トされたＣＯＳ−７細胞を同様に用いた場合は、特異的
な〔³Ｈ〕ＡＶＰ結合を示さなかった。

【００６７】（７）ｍＲＮＡ発現の組織分布 ＲＴ−ＰＣＲのために、生検により得た各種ヒト組織か
らの全細胞ＲＮＡを、セシウムクロライドグラジエント
法により分離した。

【００６８】予備試験において、上記方法にて集めた精
製ＲＮＡの完全さを、１％アガロース−ホルムアルデヒ
ド／エチジウムブロマイドゲルによるＲＮＡの電気泳動
後の２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡの可視化により
確認した。

【００６９】ＲＴ−ＰＣＲは前記に準じて行なった。Ｈ
Ｖ−ＲＡＣＥのｃＤＮＡ配列及びβ−アクチンｃＤＮＡ
から、オリゴヌクレオチドプライマーを構築した。β−
アクチンは、ＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ合成の効果を知る
ための内部標準として用いた。これらＨＶ−ＲＡＣＥ
（ｈＶ１−１、ｈＶ１−２）及びβ−アクチン（β−
１、β−２）に特異的なプライマーは、表１に示すとお
りである。

【００７０】増幅されるＨＶ−ＲＡＣＥ及びヒトβ−ア
クチンＰＣＲ生成物の予想される大きさは、それぞれ２
６６及び４２１ｂｐであった。ＰＣＲ増幅プロフィル
は、９４℃、１分の変性処理、５５℃、３０秒のアニー
リング処理、及び７２℃１分の延長処理の３５サイクル
とした。テンプレートなしの負のコントロール反応を、
両プライマーセットを用いたＰＣＲ増幅において常に含
ませた。

【００７１】結果を第５図に示す。第５図中、レーンＡ
は、エチジウムブロマイド染色、レーンＢは、ＨＶ−Ｒ
ＡＣＥによるサザンブロット分析、レーンＣは、内部標
準の結果をそれぞれ示す。

【００７２】ヒトＶ1 受容体の組織分布は、ラットのそ
れ［Eur. J. Pharmacol. Molec. Pharmacol., 267, 71-
75 (1994) ］とは顕著に異なっていた。ｈＶ１−１及び
ｈＶ１−２の特異的プライマーセットを使用した場合、
ＰＣＲ生成物は腸間膜動脈、腎臓、副腎及び大動脈に豊
富に検出され、肺、前立腺及び骨格筋ではより少量であ
った。同様の結果が少なくとも３個体について得られ
た。しかしながら肝臓においては、一つの個体（雄）は
ＰＣＲ生成物が多量検出されたが、他の２つの個体
（雌）では殆どもしくは全くＰＣＲ生成物は検出されな
かった。この知見は、肝臓におけるヒトＶ1 受容体ｍＲ
ＮＡ発現レベルの性別差を示している。

【００７３】更に、縮重プライマー（Ｖｚ−１、Ｖｚ−
２）を用いたＲＴ−ＰＣＲ分析によれば、腸間膜動脈に
おいて、Ｖ1 受容体ＰＣＲ生成物のみが検出された。之
等のプライマーセットは、存在するＶ1 、Ｖ2 及びオキ
シトシン受容体ｃＤＮＡ類の全てを増幅可能であり、従
ってこの結果から、腸間膜動脈においてはＶ1 受容体の
みが唯一発現されると考えられる。

【００７４】いずれにせよ、本発明によってクローン化
されたヒトＶ1 受容体ｃＤＮＡは、ヒト血管に主として
発現され、重要な生理学的役割を演じていることが判
る。

【００７５】

【配列表】

【００７６】配列番号：１ 配列の長さ：１１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：５′ＵＴＲ 配列： GGGGGGGGGA GACCTGCGTT TCGGACGAGG GAGCCCAAGT CCTCCGAGAC GGGGGAGGGA 60 GCGGCCCGCG AGGGCTGGAG CTCCGAAGAG GGCCGAGTAG GAGCTGCATG GACAGA 116

【００７７】配列番号：２ 配列の長さ：４１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：蛋白 配列： Met Arg Leu Ser Ala Gly Pro Asp Ala Gly Pro Ser Gly Asn Ser Ser 1 5 10 15 Pro Trp Trp Pro Leu Ala Thr Gly Ala Gly Asn Thr Ser Arg Glu Ala 20 25 30 Glu Ala Leu Gly Glu Gly Asn Gly Pro Pro Arg Asp Val Arg Asn Glu 35 40 45 Glu Leu Ala Lys Leu Glu Ile Ala Val Leu Ala Val Thr Phe Ala Val 50 55 60 Ala Val Leu Gly Thr Ser Ser Val Leu Leu Ala Leu His Arg Thr Pro 65 70 75 80 Arg Lys Thr Ser Arg Met His Leu Phe Ile Arg His Leu Ser Leu Ala 85 90 95 Asp Leu Ala Val Ala Phe Phe Gln Val Leu Pro Gln Met Cys Trp Asp 100 105 110 Ile Thr Tyr Arg Phe Arg Gly Pro Asp Trp Leu Cys Arg Val Val Lys 115 120 125 His Leu Gln Val Phe Gly Met Phe Ala Ser Ala Tyr Met Leu Val Val 130 135 140 Met Thr Ala Asp Arg Tyr Ile Ala Val Cys His Pro Leu Lys Thr Leu 145 150 155 160 Gln Gln Pro Ala Arg Arg Ser Arg Leu Met Ile Ala Ala Ala Trp Val 165 170 175 Leu Ser Phe Val Leu Ser Thr Pro Gln Tyr Phe Val Phe Ser Met Ile 180 185 190 Glu Val Asn Asn Val Thr Lys Ala Arg Asp Cys Trp Ala Thr Phe Ile 195 200 205 Gln Pro Trp Gly Ser Arg Ala Tyr Val Thr Trp Met Thr Gly Gly Ile 210 215 220 Phe Val Ala Pro Val Val Ile Leu Gly Thr Cys Tyr Gly Phe Ile Cys 225 230 235 240 Tyr Asn Ile Trp Cys Asn Val Arg Gly Lys Thr Ala Ser Arg Gln Ser 245 250 255 Lys Gly Ala Glu Gln Ala Gly Val Ala Phe Gln Lys Gly Phe Leu Leu 260 265 270 Ala Pro Cys Val Ser Ser Val Lys Ser Ile Ser Arg Ala Lys Ile Arg 275 280 285 Thr Val Lys Lys Thr Phe Val Ile Val Thr Ala Tyr Ile Val Cys Trp 290 295 300 Ala Pro Phe Phe Ile Ile Gln Met Trp Ser Val Trp Asp Pro Met Ser 305 310 315 320 Val Trp Thr Glu Ser Glu Asn Pro Thr Ile Thr Ile Thr Ala Leu Leu 325 330 335 Gly Ser Leu Asn Ser Cys Cys Asn Pro Trp Ile Tyr Met Phe Phe Ser 340 345 350 Gly His Leu Leu Gln Asp Cys Val Gln Ser Phe Pro Cys Cys Gln Asn 355 360 365 Met Lys Glu Lys Phe Asn Lys Glu Asp Thr Asp Ser Met Ser Arg Arg 370 375 380 Gln Thr Phe Tyr Ser Asn Asn Arg Ser Pro Thr Asn Ser Thr Gly Met 385 390 395 400 Trp Lys Asp Ser Pro Lys Ser Ser Lys Ser Ile Lys Phe Ile Pro Val 405 410 415 Ser Thr

【００７８】配列番号：３ 配列の長さ：１３８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ 直接の起源 ライプラリー名：ヒト腸間膜動脈 クローン名：ＨＶ−ＲＡＣＥ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：５′ＵＴＲ 存在位置：１．．１１６ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：ＣＤＳ 存在位置：１１７．．１３７０ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：３′ＵＴＲ 存在位置：１３７１．．１３８４ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列： GGGGGGGGGA GACCTGCGTT TCGGACGAGG GAGCCCAAGT CCTCCGAGAC GGGGGAGGGA 60 GCGGCCCGCG AGGGCTGGAG CTCCGAAGAG GGCCGAGTAG GAGCTGCATG GACAGA 116 ATG CGT CTC TCC GCC GGT CCC GAC GCG GGG CCC TCG GGC AAC TCC AGC 164 Met Arg Leu Ser Ala Gly Pro Asp Ala Gly Pro Ser Gly Asn Ser Ser 1 5 10 15 CCA TGG TGG CCT CTG GCC ACC GGC GCT GGC AAC ACA AGC CGG GAG GCC 212 Pro Trp Trp Pro Leu Ala Thr Gly Ala Gly Asn Thr Ser Arg Glu Ala 20 25 30 GAA GCC CTC GGG GAG GGC AAC GGC CCA CCG AGG GAC GTC CGC AAC GAG 260 Glu Ala Leu Gly Glu Gly Asn Gly Pro Pro Arg Asp Val Arg Asn Glu 35 40 45 GAG CTG GCC AAA CTG GAG ATC GCC GTG CTG GCG GTG ACT TTC GCG GTG 308 Glu Leu Ala Lys Leu Glu Ile Ala Val Leu Ala Val Thr Phe Ala Val 50 55 60 GCC GTG CTG GGC ACC AGC AGC GTA CTG CTG GCT CTG CAC CGG ACG CCG 356 Ala Val Leu Gly Thr Ser Ser Val Leu Leu Ala Leu His Arg Thr Pro 65 70 75 80 CGC AAG ACG TCC CGC ATG CAC CTC TTC ATC CGA CAC CTC AGC CTG GCC 404 Arg Lys Thr Ser Arg Met His Leu Phe Ile Arg His Leu Ser Leu Ala 85 90 95 GAC CTG GCC GTG GCA TTC TTC CAG GTG CTG CCG CAA ATG TGC TGG GAC 452 Asp Leu Ala Val Ala Phe Phe Gln Val Leu Pro Gln Met Cys Trp Asp 100 105 110 ATC ACC TAC CGC TTC CGC GGC CCC GAC TGG CTG TGC CGC GTG GTG AAG 500 Ile Thr Tyr Arg Phe Arg Gly Pro Asp Trp Leu Cys Arg Val Val Lys 115 120 125 CAC CTG CAG GTG TTC GGC ATG TTT GCG TCG GCC TAC ATG CTG GTA GTC 548 His Leu Gln Val Phe Gly Met Phe Ala Ser Ala Tyr Met Leu Val Val 130 135 140 ATG ACA GCC GAC CGC TAC ATC GCG GTG TGC CAC CCG CTC AAG ACT CTG 596 Met Thr Ala Asp Arg Tyr Ile Ala Val Cys His Pro Leu Lys Thr Leu 145 150 155 160 CAA CAG CCC GCG CGC CGC TCG CGC CTC ATG ATC GCG GCC GCC TGG GTG 644 Gln Gln Pro Ala Arg Arg Ser Arg Leu Met Ile Ala Ala Ala Trp Val 165 170 175 CTG AGC TTC GTG CTG AGC ACG CCG CAG TAC TTC GTC TTC TCC ATG ATC 692 Leu Ser Phe Val Leu Ser Thr Pro Gln Tyr Phe Val Phe Ser Met Ile 180 185 190 GAG GTG AAC AAT GTC ACC AAG GCC CGC GAC TGC TGG GCC ACC TTC ATC 740 Glu Val Asn Asn Val Thr Lys Ala Arg Asp Cys Trp Ala Thr Phe Ile 195 200 205 CAG CCC TGG GGT TCT CGT GCC TAC GTG ACC TGG ATG ACG GGC GGC ATC 788 Gln Pro Trp Gly Ser Arg Ala Tyr Val Thr Trp Met Thr Gly Gly Ile 210 215 220 TTT GTG GCG CCC GTG GTC ATC TTG GGT ACC TGC TAC GGC TTC ATC TGC 836 Phe Val Ala Pro Val Val Ile Leu Gly Thr Cys Tyr Gly Phe Ile Cys 225 230 235 240 TAC AAC ATC TGG TGC AAC GTC CGC GGG AAG ACG GCG TCG CGC CAG AGC 884 Tyr Asn Ile Trp Cys Asn Val Arg Gly Lys Thr Ala Ser Arg Gln Ser 245 250 255 AAG GGT GCA GAG CAA GCG GGT GTG GCC TTC CAA AAG GGG TTC CTG CTC 932 Lys Gly Ala Glu Gln Ala Gly Val Ala Phe Gln Lys Gly Phe Leu Leu 260 265 270 GCA CCC TGT GTC AGC AGC GTG AAG TCC ATT TCC CGG GCC AAG ATC CGC 980 Ala Pro Cys Val Ser Ser Val Lys Ser Ile Ser Arg Ala Lys Ile Arg 275 280 285 ACG GTG AAG AAG ACT TTT GTG ATC GTG ACG GCT TAC ATC GTC TGC TGG 1028 Thr Val Lys Lys Thr Phe Val Ile Val Thr Ala Tyr Ile Val Cys Trp 290 295 300 GCG CCT TTC TTC ATC ATC CAG ATG TGG TCT GTC TGG GAT CCC ATG TCC 1076 Ala Pro Phe Phe Ile Ile Gln Met Trp Ser Val Trp Asp Pro Met Ser 305 310 315 320 GTC TGG ACC GAA TCG GAA AAC CCT ACC ATC ACC ATC ACT GCA TTA CTG 1124 Val Trp Thr Glu Ser Glu Asn Pro Thr Ile Thr Ile Thr Ala Leu Leu 325 330 335 GGT TCC TTG AAT AGC TGC TGT AAT CCC TGG ATA TAC ATG TTT TTT AGT 1172 Gly Ser Leu Asn Ser Cys Cys Asn Pro Trp Ile Tyr Met Phe Phe Ser 340 345 350 GGC CAT CTC CTT CAA GAC TGT GTT CAA AGC TTC CCA TGC TGC CAA AAC 1220 Gly His Leu Leu Gln Asp Cys Val Gln Ser Phe Pro Cys Cys Gln Asn 355 360 365 ATG AAG GAA AAA TTC AAC AAA GAA GAT ACT GAC AGT ATG AGC AGA AGA 1268 Met Lys Glu Lys Phe Asn Lys Glu Asp Thr Asp Ser Met Ser Arg Arg 370 375 380 CAG ACT TTT TAT TCT AAC AAT CGA AGC CCA ACA AAC AGT ACG GGT ATG 1316 Gln Thr Phe Tyr Ser Asn Asn Arg Ser Pro Thr Asn Ser Thr Gly Met 385 390 395 400 TGG AAG GAC TCG CCT AAA TCT TCC AAG TCC ATC AAA TTC ATT CCT GTT 1364 Trp Lys Asp Ser Pro Lys Ser Ser Lys Ser Ile Lys Phe Ile Pro Val 405 410 415 TCA ACT TGAGCCTTGC ATTC 1384 Ser Thr

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＶ1 バソプレシン受容体クローニングの概
略を示す。

【図２】ｐＭＥ−ＨＶでトランスフェクトされたＣＯＳ
−７細胞を用いた競合的試験結果を示すグラフである。

【図３】ｐＭＥ−ＲＶでトランスフェクトされたＣＯＳ
−７細胞を用いた競合的試験結果を示すグラフである。

【図４】ラット肝細胞膜調製物を用いた競合的試験結果
を示すグラフである。

【図５】ＨＶ−ＲＡＣＥクローンの組織分布を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１で示される塩基配列を含むこ
   とを特徴とする血管型バソプレシン受容体遺伝子。
2. 【請求項２】配列番号：２で示されるアミノ酸配列をコ
   ードする塩基配列を含む請求項１に記載の遺伝子。