JPH0956380A - アシアロ糖蛋白質受容体誘導体及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗−アシアロ糖蛋白質受容体（ＡＧＰＲ）抗
体の新規な測定方法及びそのための試薬、並びに該試薬
のためのＡＧＰＲ誘導体の提供。 【解決手段】 ＡＧＰＲ Ｈ１及びＬ−Ｈ２の細胞質膜
外領域から成る誘導体、並びにＡＧＰＲ Ｈ１及びＬ−
Ｈ２の細胞質膜内領域及び細胞質膜外領域から成る誘導
体；これらの誘導体、並びにＡＧＰＲ Ｈ１及びＡＧＰ
Ｒ Ｌ−Ｈ２の製造方法；並びにこれらを用いる抗ＡＧ
ＰＲ抗体測定方法、そのための試薬及びキット。 【効果】 本発明によれば、品質の安定した試薬が容易
に得られ、正確な測定を行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アシアロ糖蛋白質
受容体Ｈ１及びＬ−Ｈ２（ＡＧＰＲ Ｈ１及びＡＧＰＲ
Ｌ−Ｈ２）の誘導体、並びにこれらのＡＧＰＲ誘導体
又はＡＧＰＲの製造方法、及びそれらの使用に関する。
本発明のＡＧＰＲ誘導体は、抗ＡＧＰＲ抗体の検出、特
に臨床検査のために有用である。

【０００２】

【従来の技術】自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）は活動性の慢
性肝炎であり、しばしば肝硬変に移行し、適切な処置
（免疫抑制剤等）を施さないかぎり死に至る難治性肝炎
である。現在、診断は厚生省の定める規準（高ガンマグ
ロブリン血漿、抗核抗体など）に照らし合わせて行なっ
ているが、他の臓器特異的な自己免疫性疾患のような確
定診断に用いることの出来るマーカーは存在しない。ま
たＡＩＨの診断規準を満たさない患者でも、ＡＩＨと判
断される患者が多く存在していることから、現在の診断
規準では十分でないことは明らかであり、より確実で適
切な処置を行なうためにも、自己免疫性肝炎の確定診断
用のマーカーの確立が望まれていた。

【０００３】自己免疫性肝炎の診断の困難さを示す例は
多数報告されている。例えば今日Ｃ型肝炎患者の診断が
行われるようになったことから、それ以前では自己免疫
性肝炎と診断されていた患者の多くはＣ型肝炎と分類さ
れうる事が以下に示す文献に報告されている（Lenzi et
al., Lancet 335： 258-259, 1990； Lunel et al.,He
patology 16： 630-636, 1992；Cassani, et al. Gut 3
3： 1260-1263, 1992；Pawlotsky et al. Gut：S66-S6
8, 1993)。Ｃ型肝炎に於てはそれが活動性のもの（Ｃ型
肝炎ウィルスの増殖が起こっているのか、過去にＨＣＶ
が感染し現在は治癒しているのか）であるのか否かの判
定方法として簡便な方法が未だ無く、また上記のように
自己免疫性肝炎の的確な診断方法が確立されていないた
め、これらの疾患を的確に診断することは困難である。

【０００４】しかし両者を区別することは臨床上重要な
意義を持つ。即ちＡＩＨでは免疫抑制剤（ステロイド剤
等）が効果を示すことが分かっているが、もしＡＩＨ様
の病態を示す患者がＣ型肝炎ウィルス感染者であった場
合には、免疫抑制剤の投与はＣ型肝炎ウィルスの増殖を
促進する事になり、治療には逆効果である。一方ＨＣＶ
治療で用いられるインターフェロンは逆に免疫応答力を
増強させてしまうため、もしＡＩＨ患者がＨＣＶ抗体陽
性だからといってインターフェロンを投与されてしまう
と、逆にＡＩＨ症状を悪化させてしまい治療には逆効果
である。このことから両者を判別することは今日の臨床
上の重要な課題である。

【０００５】自己免疫性疾患は本来ならば自己として認
識されるべき抗原が非自己として認識される事により、
異物を攻撃すべき免疫系により自己が攻撃されてしまう
ことにより起こる症状である。自己免疫性疾患の場合、
この非自己として認識されるようになってしまった抗原
に対する抗体を検出することが有効な診断基準の一つと
なる。

【０００６】ＡＩＨの場合にはルポイド肝炎の様な１型
に分類されるものでは抗核抗体、抗平滑筋抗体が検出さ
れるが、２型の場合には抗腎ミクロソーム抗体、抗可溶
性肝臓抗原抗体等が検出され、これらの検出が診断の一
つの基準となっている。しかしこれらの抗体の検出は他
の自己免疫性疾患でも観察され、臓器特異性が見られな
い。そのため、これらの抗体の検出のみでは自己免疫性
肝炎であるという確定診断をすることは出来ず、他の症
状であるとか、肝臓の生検（肝臓にリンパロ胞様の浸潤
が見られる等）と合わせ総合的に診断が行われている。
例えば今日肝臓の生検技術は進歩しているが患者への負
担は大きく、血清検査のような簡便な方法を取ることが
出来ることが好ましい。このような状況の下、ＡＩＨ特
異的な自己抗体検出系の確立が望まれていた。

【０００７】アシアロ糖蛋白質受容体（以下ＡＧＰＲと
略す）は肝実質細胞特異的に発現する膜蛋白質であり、
血清中のアシアロ糖蛋白質を、肝臓に於て分解するため
に取り込む機能を持つ。ＡＧＰＲは肝硬変、肝癌や再生
肝などの肝臓病態に応じその発現が減少することが報告
されている（Stadalnik et al., J.Nucl.Med. 26：1233
-1242, 1985)。また一部血清中にＡＧＰＲそれ自体が存
在していることも報告されており（勝木等、アルコール
代謝と肝：第１２巻ｐ６５〜ｐ６８，１９９２）血清中
のＡＧＰＲを測定する意義の検討が進められている。更
にＡＧＰＲに結合する標識化合物を用いて肝臓の機能を
示す良い指標となり得ることも報告されている（工藤
等、日本消化器病学会雑誌：第８９巻ｐ１３４９〜ｐ１
３５９，１９９２）。

【０００８】McFarlane等は、活発性のＡＩＨ患者の中
に高頻度に、ウサギの肝臓から精製したＡＧＰＲに反応
する抗体が検出されることを報告し、ＡＧＰＲがＡＩＨ
の標的である可能性を示唆した（McFarlane et al., J.
Hepatol. 3：196-205, 1986)。この結果はTreichel等に
よって確認された。すなわちヒトの肝臓から精製したＡ
ＧＰＲに反応する抗体が、ＡＩＨ患者及び原発性胆汁性
肝硬変患者に高頻度に見いだされることから、ＡＧＰＲ
に対する自己抗体の出現はＡＩＨの一つの指標となり得
ることにより裏づけられた（Treichel et al. Hepatol
11：606-612, 1990)。さらに本発明者らも参加したマル
チセンターで行われた検討でも裏付けられた (Treichel
et al., Gastroenterology 107 : 799-804, 1994)。さ
らに，この抗体産生はＴ細胞依存的であることも示され
た（Loehr et al. Hepatol. 12：1314-1320, 1990)。

【０００９】Treichel等は前記の論文の中でウサギやラ
ットから精製したＡＧＰＲと、ヒトの肝臓から精製した
ＡＧＰＲとの、ＡＩＨ患者血清との反応性を比較検討し
ているが、ヒトのものと他の動物種から精製したもので
は反応性に違いがあることを報告している。つまりＡＧ
ＰＲに対する抗体を測定するためにはヒトのＡＧＰＲを
用いる必要がある。

【００１０】前述のようにＡＧＰＲは肝硬変、肝癌や再
生肝などの肝臓病態に応じその発現が減少するため（St
adalnik et al., J.Nucl.Med. 26：1233-1242, 1985)、
ＡＧＰＲを得るためには正常な肝臓を用いなければなら
ない。しかしヒトの正常な肝臓は入手困難であることか
ら、大量にかつ簡便にＡＧＰＲを調整する方法の確立が
望まれていた。また肝臓から精製した場合には他の肝臓
由来の抗原による汚染の危険性があり、肝臓から精製し
たものを抗原として、抗原抗体反応を利用し抗ＡＧＰＲ
抗体を検出する場合には、ＡＧＰＲに対する以外の抗体
をも検出してしまう危険性がある。

【００１１】肝実質細胞由来の樹立された細胞株のう
ち、ＨｅｐＧ２細胞株やＨｕＨ７細胞株においてＡＧＰ
Ｒが発現していることが報告されているから、これを材
料にＡＧＰＲを調整することも考えられるが、ＨｅｐＧ
２株と正常な肝臓で主要に発現しているＡＧＰＲとは種
類が異なっており（Paietta et al. Hepatol. 15：359-
402, 1992)、樹立細胞株から調整したものでは正常な肝
臓から調整したものにおきかわる事が出来ないことが予
想される。また前述のように他の動物種のものでは完全
にヒトのものに置き換えることは出来ない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明に於ては
人の正常な肝臓で発現している型のＡＧＰＲ及びＡＧＰ
Ｒポリペプチドの誘導体を大量に生産する方法を提供す
る。またこれを用いた、特異的な抗原抗体反応を利用し
た抗ＡＧＰＲ自己抗体の検出方法、及び自己抗体の検出
によるＡＩＨの診断のための試薬及びキットを提供す
る。

【００１３】

【課題を解決するための手段】従って本発明は、アシア
ロ糖蛋白質受容体（ＡＧＰＲ）の誘導体（ＡＧＰＲ誘導
体）、すなわちアシアロ糖蛋白質受容体Ｈ１（ＡＧＰＲ
Ｈ１）の細胞質外領域から成るＡＧＰＲ Ｈ１誘導
体、アシアロ糖蛋白質Ｌ−Ｈ２（ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２）
の細胞質膜外領域から成るＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２誘導体、
ＡＧＰＲ Ｈ１の細胞質膜内領域及び細胞質膜外領域
（細胞膜貫通領域が除去されている）から成るＡＧＰＲ
Ｈ１誘導体、並びにＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２の細胞質膜内
領域及び細胞質膜外領域（細胞膜貫通領域が除去されて
いる）から成るＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２誘導体を提供する。
なお、本明細書において、上記誘導体を、「誘導体」な
る語を省略して単にＡＧＰＲ，ＡＧＰＲ Ｈ１，ＡＧＰ
Ｒ Ｌ−Ｈ２等と記載する場合がある。

【００１４】本発明はさらに、上記ＡＧＰＲ誘導体の製
造方法において、該誘導体のポリペプチドをコードする
ＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形質転換された
宿主細胞を培養し、該培養物を採取するか、又は該培養
物からさらに前記ＡＧＰＲ誘導体を採取する、ことを特
徴とする方法を提供する。本発明はさらに、ＡＧＰＲ
Ｈ１又はＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２の製造方法において、当該
ＡＧＰＲのポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿
主細胞を培養し、そして該培養物を採取するか、又は該
培養物から前記ＡＧＰＲを採取することを特徴とする方
法を提供する。

【００１５】本発明はさらに、ＡＧＰＲ Ｈ１及びＡＧ
ＰＲ Ｌ−Ｈ２の同時製造方法において、当該ＡＧＰＲ
のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ及び
当該ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２のポリペプチドのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形
質転換された宿主を培養し、そして該培養物を採取する
か、又は該培養物からＡＧＰＲ Ｈ１及びＡＧＰＲ Ｌ
−Ｈ２を採取することを特徴とする方法を提供する。

【００１６】本発明はまた、ＡＧＰＲに対する抗体（抗
ＡＧＰＲ抗体）の検出又は測定方法において、抗ＡＧＰ
Ｒ抗体の存否又はその量を測定すべき被験試料と、前記
ＡＧＰＲ誘導体又は前記の方法により製造されたＡＧＰ
Ｒの少なくとも１種とを接触せしめ、そして抗原−抗体
反応が生じたか否かを検出し、又はその量を測定するこ
とを特徴とする方法を提供する。本発明はさらに、前記
ＡＧＰＲ誘導体又は前記の方法により製造されたＡＧＰ
Ｒの少なくとも１種を含んで成る、抗ＡＧＰＲ抗体測定
用試薬を提供する。本発明はさらに、前記ＡＧＰＲ誘導
体又は前記の方法により製造されたＡＧＰＲの少なくと
も１種、及び標準としての抗ＡＧＰＲ抗体を含んで成
る、抗ＡＧＰＲ抗体測定用キットを提供する。

【００１７】

【具体的な説明】正常な肝臓で発現しているＡＧＰＲは
Ｈ１とＨ２及びＬ−Ｈ２である。一方ＨｅｐＧ２細胞で
はＨ１と、Ｌ−Ｈ２と同じ遺伝子からAlternative spli
cingによって出来ると考えられるＨ２とＨ２′が発現し
ている（Paietta et al. Hepatol. 15：359-402, 199
2)。すなわち、本発明で製造しようとするものは正常な
肝臓で発現しているＡＧＰＲを反映するものであるか
ら、目的とするものはＨ１及びＬ−Ｈ２の誘導体であ
る。

【００１８】ＡＧＰＲ Ｈ１及びＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２の
一次構造を図１に示す。本発明のＡＧＰＲ誘導体の１つ
はＡＧＰＲ Ｈ１のおよそ細胞質膜外領域から成るもの
である。その具体的な１例として配列番号：１９に示す
アミノ酸配列の６０位のアミノ酸Ｇｌｙから２９１位の
アミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列を有する誘導体が挙
げられる。また、本発明の誘導体の他の１つにＡＧＰＲ
Ｈ１のおよそ細胞質膜内領域と細胞質膜外領域とから
成るものである。その具体的な１例として配列番号：１
９に示すアミノ酸配列の１位のアミノ酸Ｍｅｔから４２
位のアミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列を有する細胞質
膜内領域と、６０位のアミノ酸Ｇｌｙから２９１位のア
ミノ酸Ｌｅｕまでのアミノ酸配列から成る細胞質膜外領
域から成るものが挙げられる。

【００１９】本発明のＡＧＰＲ誘導体の他の１つは、Ａ
ＧＰＲ Ｌ−Ｈ２のおよそ細胞質外領域から成るもので
ある。その具体的な１例として、配列番号：２０の５９
位のアミノ酸Ｇｌｙから２８７位のアミノ酸Ａｌａまで
のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また、本発
明のＡＧＰＲ誘導体の更に他の１つは、ＡＧＰＲ Ｌ−
Ｈ２のおよそ細胞質膜内領域と細胞質膜外領域とから成
るものである。具体的な１例として、配列番号：２０の
１位のアミノ酸Ｍｅｔから４１位のアミノ酸Ｓｅｒまで
のアミノ酸配列を有する細胞質膜領域と５９位のアミノ
酸Ｇｌｙから２８７位のアミノ酸Ａｌａまでのアミノ酸
配列を有する細胞質膜外領域とから成る誘導体が挙げら
れる。

【００２０】しかしながら、本発明のＡＧＰＲ誘導体
は、上記のアミノ酸配列を有するものに限定されない。
本発明のＡＧＰＲ誘導体は、ＡＧＰＲの抗原決定基が破
壊されない限り、上記のアミノ酸配列において１〜複数
個のアミノ酸、例えば各領域において２０％以下、例え
ば１０％以下のアミノ酸、例えば細胞質膜内領域におい
て６個以下、例えば３個以下のアミノ酸、細胞質膜外領
域において４０個以下、例えば２０個以下、例えば１０
個以下のアミノ酸の、置換、欠失及び／又は付加によっ
て修飾されているＡＧＰＲ誘導体も本発明に含まれる。

【００２１】本発明のＡＧＰＲ誘導体は膜貫通領域を含
有しないため可溶性であり、容易に回収、精製すること
ができ、且つＡＧＰＲの抗原決定基を維持しているので
抗ＡＧＰＲ抗体測定用試薬として極めて有用である。本
発明のＡＧＰＲ誘導体は、糖鎖を有しないポリペプチド
の形でもよく、また糖鎖を有するポリペプチド又は糖蛋
白質の形でもよい。前者は細菌等の原核生物を用いる遺
伝子組換え製造により又は化学合成により得ることがで
き、後者は、動物細胞等の真核細胞を用いる遺伝子組換
え製造により製造することができる。

【００２２】本発明のＡＧＰＲ誘導体は、ポリペプチド
を製造するための常法に従って製造することができ、例
えば化学合成又は遺伝子組換法により製造することがで
きる。しかしながら、その分子量の大きさからして、遺
伝子組換法により製造するのが好ましい。特に、配列番
号：１９又は２０に示すアミノ酸配列の１部分から成る
ＡＧＰＲ誘導体は、ヒト由来のｃＤＮＡを用いて製造す
るのが好ましい。また、配列番号：１９又は２０に示す
アミノ酸配列に対して、１又は複数のアミノ酸配列の置
換、欠失及び／又は付加により修飾されたアミノ酸配列
を有するＡＧＰＲ誘導体は、常用の部位特定変異誘発
（site-specific mutagenesis)により製造することがで
きる。

【００２３】ＡＧＰＲをコードするｃＤＮＡ断片はヒト
肝臓のPolyＡ ＲＮＡを鋳型に合成されたｃＤＮＡから
単離することが出来る。単離する方法としては、報告さ
れているアミノ酸配列から予想される塩基配列（文献：
Spiess et al. J.Biol.Chem.260 ; 1979-1982, 1985,
Spiess et al. Proc.Natl.Acad.Sci. 82 ; 6465-6469,
1985)を、または報告されている塩基配列の一部をプロ
ーブに用い、ヒト肝臓PolyＡ ＲＮＡを鋳型に合成され
たｃＤＮＡライブラリーを慣用の方法（Current protoc
ols in Molecular Biology： edited by Ausubel et a
l., Wiley science； Molecular Cloning：Sambrook et
al., Cold Spring Harbor)に従いスクリーニングする
ことによって得ることが可能である。

【００２４】本発明に於てはＨ１の場合にはSpiess等に
よって報告されている（Spiess etal., J.Biol.Chem.,
260：1979-1982, 1985)塩基配列の一部を持つプライマ
ーを用い、ヒト肝臓PolyＡ ＲＮＡを鋳型に合成された
ｃＤＮＡをポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）により増幅させることにより目的とするｃＤＮＡを
得た。これらのｃＤＮＡをもとにＡＧＰＲポリペプチド
を遺伝子工学的手法により作成するための発現ベクター
を作成した。

【００２５】ここで遺伝子工学的な手法とは、配列番号
１〜４に示されるアミノ酸配列またはその部分配列を有
するペプチドをコードするＤＮＡ断片を、化学的に合成
する過程、及びこれらの技術を組み合わせて得る工程を
含む。また上記ペプチドをコードするＤＮＡ断片を含む
複製可能な発現ベクターを構築する過程、前記発現ベク
ターを宿主細胞に導入し、ペプチドを発現する形質転換
体を得る過程、さらに前記形質転換体を培養し発現産物
を発現させる工程、及び発現したペプチドを回収する工
程を含む。

【００２６】遺伝子工学的な手法に於て発現に用いる発
現ベクターとしては、実施例に示したもの以外にも、大
腸菌を宿主としては、大腸菌トリプトファンオペロン以
外にもＴａｃプロモーター、Ｔｒｃプロモーター、ｌａ
ｃプロモーター、ＰｈｏＡプロモーター、λプロモータ
ー等を利用したベクターを用いることが可能である。ま
た大腸菌以外にも酵母を宿主とし、解糖系遺伝子、たと
えばグリセロアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、
アルコールデヒドロゲナーゼＩ，II、ピルビン酸キナー
ゼ、ホスホグリセリンキナーゼ、トリオースりん酸イソ
メラーゼ等の酵母で慣用に用いられているプロモーター
を利用した発現ベクターを用いて発現させることも可能
である。

【００２７】さらに動物細胞、例えば哺乳類細胞例えば
ＣＨＯ細胞や、ＣＯＳ−１細胞、ＨｅＬａ細胞等を宿主
とし、慣用に用いられる組み込み型発現ベクターやワク
チニアウィルスをベクターとした発現系、アデノウィル
スや慣用に用いられるウィルスをベクターとした発現系
を利用しても発現可能である。さらに遺伝子工学的手法
を用いる場合には、ＡＧＰＲペプチドを他のペプチドと
の融合蛋白質として発現させることも慣用に用いられる
手段である。本発明においては、Ｈ１、Ｌ−Ｈ２ポリペ
プチドは大腸菌ＴｒｐＥ遺伝子産物の一部との融合蛋白
質として発現された。また発現、精製を効率よく行うた
めに、ＡＧＰＲのＨ１およびＬ−Ｈ２それぞれの細胞ド
メインの配列からなるＨ１ＥＭおよびＬ−Ｈ２ＥＭ、並
びにそれぞれの膜貫通領域を除き、細胞内ドメインと細
胞外ドメインを融合させたＨ１ＴＭ（−）およびＬ−Ｈ
２ＴＭ（−）ポリペプチドとして発現させた。

【００２８】またヒト肝臓で発現されているＡＧＰＲと
同様の修飾を受けたものを発現させるために、哺乳類細
胞を宿主として発現系によりＨ１およびＬ−Ｈ２を同時
発現している組換えＣＨＯ細胞株、９８０１株を作成し
た。この株ではＨ１およびＬ−Ｈ２が糖鎖修飾を受けた
形で発現しており、Ｎ−ガラクトースアミンに結合する
ことから、糖のレセプター活性を保持したものとして発
現されていることが確認された。

【００２９】本発明によって作成可能となった組換えＡ
ＧＰＲ誘導体ペプチドまたは組換えＡＧＰＲ誘導体を発
現している細胞を用いることにより、抗ＡＧＰＲ抗体を
検出できることは実施例によって明らかである。さらに
この抗体は自己免疫性肝炎患者にのみ高い抗体価で見い
だされることから、抗ＡＧＰＲ抗体を検出することによ
り自己免疫性肝炎を診断する方法は有効であることは明
らかである。一方これらの患者血清を用い、Treichel等
の報告にしたがったヒト肝臓より調整したＡＧＰＲを用
いた抗ＡＧＰＲ抗体測定法により検討した。その結果は
本発明で得た判別結果と一致し、本発明で作成したペプ
チドを用いた系によりＡＩＨ患者血清が判別できている
ことが裏付けられた。

【００３０】また本発明により、患者血清中の抗ＡＧＰ
Ｒ抗体はＨ１およびＬ−Ｈ２誘導体ポリペプチドの何れ
とも反応し、それがおもに細胞外ドメインに存在するエ
ピトープによるものであることが判明した。この結果は
患者血清中の抗ＡＧＰＲ抗体の検出には、おもに細胞外
ドメインを主たる成分とすることによって達成できるこ
とを意味している。

【００３１】従って本発明は、さらに、前記のＡＧＰＲ
誘導体の少なくとも１種を用いることを特徴とする抗Ａ
ＧＰＲ抗体の検出方法を提供する。この方法は、抗ＡＧ
ＰＲ抗体の存否又は存在量を知ろうとする被験試料、例
えばヒト等の血清、血漿等と、本発明のＡＧＰＲ誘導体
の少なくとも１種とを接触せしめ、そして被験試料の抗
ＡＧＰＲ抗体と抗原としてのＡＧＰＲ誘導体との抗原−
抗体反応が生じたか否か、又は抗原−抗体反応の量を測
定することを含んで成る。この抗原−抗体反応を用いる
測定方式は特に限定されず、任意の常用の免疫測定法を
用いることができる。

【００３２】エンザイム・リンクド・イムノソルベント
・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、間
接蛍光抗体法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法等が
使用される。またこれらの測定法における標識として、
酵素、例えばパーオキシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ、ジゴキシゲナーゼ、β−ガラクトシダーゼ等、放
射性同位元素、例えば ¹²⁵Ｉ，³⁵Ｓ， ³Ｈ，¹⁴Ｃ等；、
蛍光物質、例えばＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッ
ド等が使用される。

【００３３】本発明はまた、前記の抗ＡＧＰＲ抗体測定
法に用いるための試薬であって、前記のＡＧＰＲ誘導体
並びにＡＧＰＲ Ｈ１及びＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２の少なく
とも１種を含んで成る試薬を提供する。この試薬におけ
るＡＧＰＲ誘導体及びＡＧＰＲは、精製もしくは部分精
製されたものでもよく、又はこれらのポリペプチドもし
くは蛋白質を発現し担持している宿主細胞自体であって
もよい。この様な試薬の形態としてはＡＧＰＲ誘導体又
はＡＧＰＲを緩衝液、例えばリン酸緩衝液、炭酸緩衝
液、トリス−塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等に溶解し
たもの、これらの溶液をさらに凍結乾燥等によって乾燥
したもの、これらのポリペプチド又は蛋白質を、固体担
体、例えば、フィルター、ガラススライド、ビーズ等に
固定したもの、さらには、前記のごときポリペプチド又
は蛋白質を発現し、担持する細胞自体を、例えばフィル
ター、ガラススライド等の表面に固定したもの等が使用
される。

【００３４】本発明はまた、少なくとも、上記のごとく
ＡＧＰＲ誘導体又はＡＧＰＲを含んで成る試薬及び標準
用抗ＡＧＰＲ抗体を含んで成る抗ＡＧＰＲ抗体測定用キ
ットに関する。この抗ＡＧＰＲ抗体はポリクローナル抗
体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。こ
のキットはさらに、例えばＥＬＩＳＡ用キットにおいて
は、ヒト免疫グロブリンに対する非−ヒト由来の抗体で
あって、標識されているものを含む場合がある。

【００３５】上記の測定方法、測定試薬又は測定キット
において、抗原としては本発明のＡＧＰＲ誘導体及び組
換製造されたＡＧＰＲの少なくとも１種を用いればよい
が、測定方法によってはそれらの２種又はそれ以上、特
にＡＧＰＲ Ｈ１又はその誘導体とＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２
又はその誘導体との組合わせを用いるのが好ましい場合
がある。この様な場合にはＡＧＰＲ Ｈ１又はその誘導
体とＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２又はその誘導体とを共発現させ
た細胞を用いるのが好ましい。

【００３６】さらに本発明によって製造可能となったＡ
ＧＰＲ又はその誘導体を用いることにより、血液中のア
シアロ糖蛋白質の定量および定性分析が可能となる。さ
らにアシアロ糖蛋白質およびアシアロ化糖の精製が可能
となる。また本発明のペプチドを用いることにより、Ａ
ＧＰＲを受容体とするアシアロ糖蛋白質の取り込みの阻
害剤の開発が可能となる。またＡＧＰＲを受容体とする
ウィルス、ウィルスと他のペプチドとの複合体の肝細胞
への侵入の阻害剤の開発が可能となる。以下実施例によ
り本発明をさらに詳細に説明する。

【００３７】実施例１．ＡＧＰＲ Ｈ１のｃＤＮＡのク
ローニング ＡＧＰＲのＩ型（Ｈ１）の組み換え体を作成するために
必要な遺伝子は、ヒト肝臓の一本鎖ｃＤＮＡよりＰＣＲ
にてクローニングした。ヒト肝臓の一本鎖ｃＤＮＡは、
ヒト肝臓Poly（Ａ）−ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）０．
５μｇより、FIRST STRAND SYNTHESIS KIT (STRATAGEN
E) を用いて作成した。方法は以下の通りである。ヒト
肝臓Poly（Ａ）−ＲＮＡ ０．５μｇを３２μｌのＤＥ
ＰＣ水に溶解し、０．３μｇ分３μｌのオリゴｄＴプラ
イマーを加えた。これを６５℃で５分間加熱した後、室
温になるまで放置した。

【００３８】これに５μｌの１０×緩衝液、５μｌの
０．１Ｍ ＤＴＴ、１μｌのＲＮａｓｅ Ｂｌｏｃｋ
Ｉ、２μｌの２５mM ｄＮＴＰｓおよび１μｌのＭＭＬ
ＶＲＴ（２０Ｕ／μｌ）を加え、３７℃で１時間インキ
ュベートした後、６５℃で１５分間加熱することによ
り、酵素を失活させてＤＮＡ合成反応を停止した。ＰＣ
Ｒ反応には、ＮｉｃｋカラムによってオリゴｄＴプライ
マーを除去して使用した。ＰＣＲに用いたプライマーに
は、M.Spiessらによって決定されたＡＧＰＲ Ｈ１の塩
基配列（Spiess, M. et al., J.Biol.Chem., 260：1979
-1982, 1985)に基づき合成した、以下に示す配列を持つ
ものを用いた。

【００３９】プライマーＦ１：５′−CACTGAAGAACCTGGG
AATCAGAC−３′（配列番号：１９の１０７−１３０塩基
に相当）（配列番号：１） プライマーＦ１．５：５′−AGCCCTATCATGACCAAGGAG −
３′（配列番号：１９の１６４−１８４塩基に相当）
（配列番号：２） プライマーＢ２．５：５′−CAGGTCGAGGCATTGAAGA −
３′（配列番号：１９の１０７３−１０５５塩基に相
当）（配列番号：３） プライマーＢ９：５′−TTTCAAGCTCCTCACCTTCGG −３′
（配列番号：１９の１１９８−１１７８塩基に相当）
（配列番号：４）

【００４０】ヒト肝臓一本鎖ｃＤＮＡ中の目的遺伝子の
存在量が少なかったため、ＰＣＲ反応を２回行うことに
よってＡＧＰＲ Ｈ１遺伝子をクローニングした。１回
目のＰＣＲ反応は以下の組成で行った。 １０×緩衝液（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ ＰＣＲ ｋｉｔ） １０μｌ ２．５mM ｄＡＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＣＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＧＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＴＴＰ ２μｌ １０pmol／μｌプライマーＦ１ １０μｌ １０pmol／μｌプライマーＢ９ １０μｌ ヒト肝臓一本鎖ｃＤＮＡ ５μｌ 滅菌水 ５６μｌ １０Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ １μｌ

【００４１】反応は、９４℃３０秒間、５０℃１分間お
よび７２℃２分間のサイクルを３５回行った後、７２℃
７分間さらにインキュベートし、次の操作までは４℃で
保存した。１回目のＰＣＲ反応液５０μｌを、１×ＴＡ
Ｅ緩衝液中にて１．２％アガロースゲル電気泳動し、約
１．１kbase の大きさのバンドを切り出した。これより
ＤＮＡをＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ（ＢＩＯ １０１）にて
回収し、回収液１０μｌのうち１μｌを使用して２回目
のＰＣＲ反応を行った。２回目のＰＣＲ反応は以下の組
成で行った。

【００４２】 １０×緩衝液 １０μｌ ２．５mM ｄＡＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＣＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＧＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＴＴＰ ２μｌ １０pmol／μｌプライマーＦ１ １０μｌ １０pmol／μｌプライマーＢ９ １０μｌ １回目のＰＣＲで得られた１．１kbのＤＮＡ断片 １μｌ 滅菌水 ６０μｌ １０Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ １μｌ

【００４３】反応は、１回目と同様に行った。反応液４
μｌを２％アガロースゲル中で電気泳動を行うことによ
って分離し、約１．１kbase の位置にあるもっとも濃い
バンドを切り出し、ＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮで回収した。
回収液１０μｌ中３．５μｌとｐＧＥＭ−Ｔベクター
（Promega)１μｌを、Ligation kit（宝酒造）のＡ液６
０μｌとＢ液７．５μｌを用いてライゲーションし、Ｐ
ＣＲによって得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔのマル
チクローニングサイトへクローニングした。ライゲーシ
ョン反応液４μｌを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル１
００μｌと混合し、４２℃３０秒間加温した後急速に氷
冷することによってＤＨ５αを形質転換した。形質転換
したＤＨ５αは１００μｇ／mlのアンピシリンを含む
１．５％寒天ＬＢプレートにまき、３７℃で一晩培養し
た。

【００４４】アンピシリンを含むＬＢプレートにコロニ
ーを形成したアンピシリン耐性の形質転換体を楊枝で拾
い、２×ＹＴ培地３mlにうえ、３７℃で一晩振とう培養
し、形質転換体を回収してアルカリ法によりプラスミド
ＤＮＡを回収した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵
素によって切断し、アガロースゲル電気泳動にて分離し
て、長さを確認することで、ｐＧＥＭ−Ｔに目的のＡＧ
ＰＲ Ｈ１遺伝子がクローニングされたクローンを選択
した。

【００４５】このクローンを持つ形質転換体をさらに１
００mlの２×ＹＴにうえ、３７℃で一晩培養し、形質転
換体を回収してアルカリ法によって多量のプラスミドＤ
ＮＡを調製した。インサート部分は、蛍光シークエンサ
ー（ＡＢＩ社）によって塩基配列を確認した。こうして
得られたクローンは、クローニングベクターｐＧＥＭ−
Ｔのマルチクローニングサイトに、報告されているＡＧ
ＰＲ Ｈ１のｃＤＮＡの１０７塩基から１１９８塩基に
相当する配列を持つものであり、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｈ１と
した。

【００４６】また、一回目のＰＣＲ反応液１／１００μ
ｌを使用して、上記とは別に２回目のＰＣＲ反応を行っ
た。反応液の組成は以下の通りである。 １０×緩衝液 １０μｌ ２．５mM ｄＡＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＣＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＧＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＴＴＰ ２μｌ １０pmol／μｌプライマーＦ１．５ １０μｌ １０pmol／μｌプライマーＢ２．５ １０μｌ １回目のＰＣＲ反応液の１／１００希釈液 １μｌ 滅菌水 ６０μｌ １０Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ １μｌ

【００４７】反応は９４℃３０秒間、６０℃１分間、７
２℃２分間のサイクルを２０回繰り返した後、７２℃７
分間反応した。反応液４０μｌを２％アガロースゲル電
気泳動にて分離し、約９００塩基の大きさのバンドを切
り出した。ゲル切片よりＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮによって
ＤＮＡを回収し、回収したＤＮＡ溶液１０μｌのうち
３．５μｌとｐＧＥＭ−Ｔ ０．５μｌを宝酒造のライ
ゲーションキットＡ液６０μｌおよびＢ液７．５μｌ中
でライゲーションした。上記の様にしてｐＧＥＭ−Ｔへ
クローニングした報告されているＡＧＰＲ Ｈ１のｃＤ
ＮＡの１６４塩基から１０７３塩基を持つ目的のものを
選択した。

【００４８】得られたｐＧＥＭ−Ｔ−Ｈ１（１６４−１
０７３）はインサートのＰｍａＣＩ制限酵素認識部位と
インサートの３′末側のｐＧＥＭ−Ｔのマルチクローニ
ングサイトにあるＳａｌＩ認識部位を、ｐＧＥＭ−Ｔ−
Ｈ１のＰｍａＣＩ／ＳａｌＩと組み換えることによっ
て、報告されているＡＧＰＲ Ｈ１のｃＤＮＡの１６４
塩基から１１９８塩基までの配列を持つクローンｐＧＥ
Ｍ−Ｔ−Ｈ１−２を作成した。

【００４９】実施例２．ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２のｃＤＮＡ
のクローニング ＡＧＰＲのII型（Ｌ−Ｈ２）の組み換え体を作成するた
めに必要な遺伝子は、実施例１のＨ１と同様に、ヒト肝
臓の一本鎖ｃＤＮＡよりＰＣＲにてクローニングした。
ＰＣＲに用いたプライマーには、M.Spiessらによって決
定されたＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２の塩基配列 (Spiess et a
l. Proc.Natl.Acad.Sci. 82；6465-6469, 1985,Paiett
a, E., et al. Hepatology 15：395-402, 1992)に基づ
き合成した。以下の配列のものを用いた。

【００５０】プライマー１：５′−ATCATGGCCAAGGACTTT
CAA −３′（配列番号：２０の１８８−２０８塩基に相
当）（配列番号：５） プライマー２：５′−ATGGGTTAGCCAGAGGTGTGCT−３′
（配列番号：２０の１０８０−１０５９塩基に相当）
（配列番号：６） プライマー３：５′−ATGGTCTGCTTCAGTCTGCTTGCC−３′
（配列番号：２０の２９９−３２２塩基に相当）（配列
番号：７） プライマー４：５′−CTGTCTCAGTGTTTCTTCCTTTCC−３′
（配列番号：２０の１１４８−１１２５塩基に相当）
（配列番号：８） プライマー７：５′−CCCCAGTTCTCCTGGCTTTAAC−３′
（配列番号：２０の３４−５５塩基に相当）（配列番
号：９） プライマー８：５′−GGCATCGTGATCTGCTTTCAGG−３′
（配列番号：２０の５５３−５３２塩基に相当）（配列
番号：１０）

【００５１】ヒト肝臓一本鎖ｃＤＮＡ中の目的遺伝子の
存在量が少なかったため、ＰＣＲ反応を２回行うことに
よってＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２遺伝子をクローニングした。
ＰＣＲ反応の条件、クローニングについては実施例１と
同様の方法で行った。プライマー１とプライマー２をＰ
ＣＲ反応に用いた際にクローニングした増幅された配列
はＬ−Ｈ２ ｃＤＮＡの１８８−１０８０塩基に相当す
る。プライマー３とプライマー４をＰＣＲ反応に用いた
際にクローニングした増幅された配列はＬ−Ｈ２ ｃＤ
ＮＡの２９９−１１４８塩基に相当する。プライマー７
とプライマー８をＰＣＲ反応に用いた際にクローニング
した増幅された配列はＬ−Ｈ２ ｃＤＮＡの３４−５５
３塩基に相当する。いずれもｐＧＥＭ−Ｔへ同方向にク
ローニングした。ｐＧＥＭ−Ｔへクローニングしたクロ
ーンはそれぞれ、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＬＨ２−１２，ｐＧＥ
Ｍ−Ｔ−ＬＨ２−３４およびｐＧＥＭ−Ｔ−ＬＨ２−
５′とした。

【００５２】ｐＧＥＭ−Ｔ−ＬＨ２−１２（１８８−１
０８０）のＸｈｏ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ（３′側マルチクロ
ーニングサイト）にｐＧＥＭ−Ｔ−ＬＨ２−３４（２９
９−１１４８）のＸｈｏ Ｉ／Ｓｐｈ Ｉ領域を組換え
て、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｌ−Ｈ２（１８８−１１４８）を作
製した。また、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｌ−Ｈ２のＳｐｅ Ｉ
（５′側マルチクローニングサイト）／ＥｃｏＲＶにｐ
ＧＥＭ−Ｔ−ＬＨ２−５′（３４−５５３）のＳｐｈ
Ｉ／ＥｃｏＲＶ領域を組換えて、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｌ−Ｈ
２Ｆを作製した。このクローンは報告されているＬ−Ｈ
２のｃＤＮＡの３４塩基から１１４８塩基までを含む。

【００５３】実施例３．ＡＧＰＲ Ｈ１遺伝子組み換え
大腸菌によるＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質細胞膜外領域の発現 大腸菌でＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質の細胞膜外領域を発現さ
せるために、ＡＧＰＲＨ１遺伝子の細胞膜外領域をクロ
ーニングし、発現ベクターｐＡＴ−ＴｒｐＥに挿入し
た。ＡＧＰＲ Ｈ１遺伝子の細胞膜外領域のクローニン
グは、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｈ１を鋳型としたＰＣＲ反応を行
い、増幅されたＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔへクローニングす
る事によって行った。ＰＣＲのプライマーには以下のも
のを使用した。

【００５４】プライマーＡＧ１ＥｃｏＦ：５′−GAATTC
GGATCCCAAAACTCCCAG−３′（配列番号：１９の３５０−
３６７）（配列番号：１１） プライマーＡＧ１ＳａｌＲ：５′−GTCGACTTAAAGGAGAGG
TGGCTC−３′（配列番号：１９の１０４８−１０３１）
（配列番号：１２） プライマーＡＧ１ＥｃｏＦおよびＡＧ１ＳａｌＲはそれ
ぞれＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位およびＳａｌＩ認識部
位を持ち、この２つのプライマーによって増幅されたＨ
１細胞膜外領域の遺伝子は５′末端にＥｃｏＲＩ認識部
位を、３′末端にＳａｌＩ認識部位を持つ。ＰＣＲ反応
は以下の組成で行った。

【００５５】 １０×緩衝液 １０μｌ ２．５mM ｄＡＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＣＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＧＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＴＴＰ ２μｌ １０pmol／μｌプライマーＡＧ１ＥｃｏＦ １０μｌ １０pmol／μｌプライマーＡＧ１ＳａｌＲ １０μｌ ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｈ１ ０．５μｌ 滅菌水 ６０．５μｌ １０Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ １μｌ

【００５６】反応は、９４℃３０秒間、４５℃１分間お
よび７２℃２分間を２５サイクル行った後、７２℃で７
分間さらに反応を行った。この反応によって得られた約
７００ｂのバンドを切り出し、ライゲーション緩衝液
（宝酒造）によってライゲーション反応を行い、ｐＧＥ
Ｍ−Ｔへクローニングした。このとき得られたプラスミ
ドをｐＧＥＭ−Ｔ−Ｈ１ＥＭとした。制限酵素とシーク
エンスを行うことによって塩基配列を確認した後、ＰＣ
Ｒプライマーによって作製したＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ制
限酵素認識部位で切断し、ｐＡＴ−ＴｒｐＥのＥｃｏＲ
Ｉ／ＳａｌＩ部位へライゲーション反応を行うことによ
って挿入した。この発現ベクターをｐＡＴ−ＴｒｐＥ−
Ｈ１ＥＭとし、制限酵素によって配列を確認した後、Ｘ
Ｌ−１ Ｂｌｕｅコンピテントセルに導入して形質転換
体を得た。

【００５７】ＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質の細胞膜外領域はＴ
ｒｐＥのＮ末１７アミノ酸のポリペプチドとの融合蛋白
質として発現させた。目的蛋白質の発現は次のように確
認した。１００μｇ／mlのアンピシリンを添加したＭ９
−ＣＡ培地に、２％濃度でｐＡＴ−ＴｒｐＥ−Ｈ１ＥＭ
／ＸＬ−１ ｂｌｕｅを植菌し、一晩３７℃で震盪培養
した。一晩培養液より大腸菌を回収後、常法に従って、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い蛋白質を分離した後クマシー液
によって染色を行い、蛋白質を検出した。

【００５８】その結果、ＸＬ−１ ｂｌｕｅでは検出さ
れない蛋白質のバンドがｐＡＴ−ＴｒｐＥ−Ｈ１ＥＭ／
ＸＬ−１ ｂｌｕｅでは検出されており、そのバンドの
濃さより、検出した大腸菌内の他の蛋白質と比較して多
量に発現している物であることが判った。この蛋白質の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量は約３０Ｋであり、これは
計算上のＴｒｐＥ−Ｈ１ＥＭ蛋白質の分子量２８Ｋとお
およそ一致していた。そこで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て検出された主たるバンドはＴｒｐＥ−ＡＧＰＲ Ｈ１
細胞膜外領域融合蛋白質であり目的の蛋白質であると判
断した。この蛋白質をＨ１ＥＭとした。

【００５９】Ｈ１ＥＭ蛋白質を多量に得るために、１Ｌ
スケールで培養を行った。ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−Ｈ１ＥＭ
／ＸＬ−１ ｂｌｕｅのコロニーを２ml ２×ＹＴ／１
００μｇ／mlアンピシリンに植菌し、８時間３７℃で震
盪培養した。これを３０mlの２×ＹＴ／１００μｇ／ml
アンピシリンに１／５０の割合で植菌し、３７℃で一晩
震盪培養を行った。 翌日、１ＬのＭ９−ＣＡ／１００
μｇ／mlアンピシリンに１／５０の割合で培養したｐＡ
Ｔ−ＴｒｐＥ−Ｈ１ＥＭ／ＸＬ−１ ｂｌｕｅを植菌
し、３７℃で一晩震盪培養を行った。Ｈ１ＥＭ蛋白質の
発現を確認後、遠沈によって集菌し、得られた沈殿（大
腸菌）を−２０℃で凍結保存した。

【００６０】Ｈ１ＥＭ蛋白質を以降の実験に用いるため
に精製した。凍結保存状態の大腸菌１ｇにつき５mlの溶
解緩衝液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０／３０
mMＮａＣｌ／５mM ＥＤＴＡ）に懸濁し、ライソザイム
１mgを加えて３７℃で１時間震盪した。これを１５０
Ｗ、９０秒の条件で２回ソニケーションして細胞を破砕
した。細胞の破砕は顕微鏡にて確認した。これを１５
Ｋ、３０分間４℃で遠心分離して得られた沈殿に緩衝液
Ａ（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０）を加えて懸
濁後、１５００rpm 、５strokes の条件でホモジナイズ
した。

【００６１】これを１５Ｋ、１５分間４℃で遠心分離し
て得られた沈殿を緩衝液Ａで洗浄、再び遠心分離を行っ
た。得られた沈殿に２Ｍ尿素を含んだ緩衝液Ａを加えて
懸濁し、１５Ｋ、１５分間４℃で遠心分離して上清と沈
殿を得た。沈殿に対して同様の操作を４Ｍ，６Ｍ尿素に
ついても行った。尿素抽出後、それぞれの操作で得られ
た抽出物についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、Ｃ
ＢＢ染色を行うことによって蛋白質を検出し、ＴｒｐＥ
−Ｈ１ＥＭ融合蛋白質の所在を明らかにした。目的の蛋
白質は夾雑物とともに４−６Ｍ尿素抽出液中に存在し
た。

【００６２】４−６Ｍ尿素抽出液をＱ Sepharose（Phar
macia)（１６／１０）にかけ、０．４ml／分の流速で１
５分間、０−０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出した。Ｏ．Ｄ．
２８０nmの吸収ピークを示した溶出画分をSephacryl Ｓ
−３００（Pharmacia)（２６／９５）にかけ、２ml／分
の流速で緩衝液Ｂ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．
０／６Ｍ尿素／０．１Ｍ ＮａＣｌ／５mM ＤＴＴ）で
溶出した。溶出画分を再びSephacryl Ｓ−３００（Phar
macia)（２６／９５）にかけ、１２０−１６０分にＯ．
Ｄ．２８０nmの吸収を示す溶出画分が得られた。

【００６３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋白質を分離、確認し
たところ、多少の夾雑物は存在するがほぼ１バンドの蛋
白質が得られていた。目的蛋白質の存在する溶出画分
は、マニュアルに従って Sephadex Ｇ２５ fine によっ
て緩衝液よりＤＴＴを除去後、マニュアルに従って Cen
tricon−１０（Amicon) によって濃縮し、マニュアルに
従ってＰＤ−１０カラム(Pharmacia) で緩衝液をＰＢＳ
（−）に置換した。このようにし精製Ｈ１ＥＭペプチド
を得た。

【００６４】実施例４．ＡＧＰＲ Ｈ１遺伝子組み換え
大腸菌によるＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質細胞膜内及び細胞膜
外領域融合蛋白質の発現 大腸菌でＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質の細胞内及び細胞膜外領
域の融合蛋白質を発現させるために、ＡＧＰＲ Ｈ１遺
伝子の細胞膜内領域と細胞膜外領域をクローニングし、
これらを結合する形で発現ベクターｐＴａｃ−ＴｒｐＥ
に挿入した。ＡＧＰＲ Ｈ１遺伝子の細胞膜外領域は、
実施例３でクローニングしたものを使用した。ＡＧＰＲ
Ｈ１遺伝子の細胞膜内領域のクローニングは、ｐＧＥ
Ｍ−Ｔ−Ｈ１を鋳型としたＰＣＲ反応を行い、増幅され
たＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔへクローニングする事によって
行った。ＰＣＲのプライマーには以下のものを使用し
た。

【００６５】プライマーＨ１ＸｈｏＦ：５′−CTCGAGAT
GACCAAGGAGTATCAAG −３′（配列番号：１９の１７３−
１９１）（配列番号：１３） プライマーＨ１ＥｃｏＲ：５′−GAATTCGAGGAGGCGAGGTC
CGGA−３′（配列番号：１９の２９８−２８１）（配列
番号：１４） プライマーＨ１ＸｈｏＦおよびＨ１ＥｃｏＲはそれぞれ
Ｘｈｏ Ｉ制限酵素認識部位およびＥｃｏＲＩ認識部位
を持ち、この２つのプライマーによって増幅されたＨ１
細胞膜外領域の遺伝子は５′末端にＸｈｏ Ｉ認識部位
を、そして３′末端にＥｃｏＲＩ認識部位を持つ。ＰＣ
Ｒ反応は以下の組成で行った。

【００６６】 １０×緩衝液 １０μｌ ２．５mM ｄＡＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＣＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＧＴＰ ２μｌ ２．５mM ｄＴＴＰ ２μｌ １０pmol／μｌプライマーＨ１ＸｈｏＦ １０μｌ １０pmol／μｌプライマーＨ１ＥｃｏＲ １０μｌ ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｈ１ ０．５μｌ 滅菌水 ６０．５μｌ １０Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ １μｌ

【００６７】反応は、９４℃３０秒間、４５℃１分間お
よび７２℃１分間を１０サイクル行った後、７２℃で７
分間さらに反応を行った。この反応によって得られた約
１２７ｂのバンドを切り出し、ライゲーション緩衝液
（宝酒造）によってライゲーション反応を行い、ｐＧＥ
Ｍ−Ｔへクローニングした。この際に得られたプラスミ
ドをｐＧＥＭ−Ｔ−Ｈ１ＩＭとした。制限酵素切断部位
の確認とシークエンスを行うことによって塩基配列を確
認した後、ＰＣＲプライマーによって作製したＸｈｏ
Ｉ／ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位で切断した。

【００６８】このｐＧＥＭ−Ｔ−Ｈ１ＩＭのＸｈｏ Ｉ
／ＥｃｏＲＩ切断断片と、実施例３で得られたｐＧＥＭ
−Ｔ−Ｈ１ＥＭのＥｃｏＲＩ／Ｓｐｅ Ｉ切断断片を、
Ｔａｃプロモーターをもつ大腸菌発現ベクターｐＴａｃ
−ＴｒｐＥのＸｈｏ Ｉ／Ｓｐｅ Ｉ部位へライゲーシ
ョン反応を行うことによって挿入した。この発現ベクタ
ーをｐＴａｃ−Ｈ１ＴＭ（−）とし、制限酵素によって
配列を確認した後、ＸＬ−１ ｂｌｕｅコンピテントセ
ルに導入して形質転換体を得た。

【００６９】Ｈ１の細胞膜内および細胞膜外領域の融合
蛋白質はＴｒｐＥのＮ末１７アミノ酸のポリペプチドと
の融合蛋白質として発現させた。目的蛋白質の発現は次
のように確認した。１００μｇ／mlのアンピシリンを添
加したＬＢ培地に、２％濃度でｐＴａｃ−Ｈ１ＴＭ
（−）／ＸＬ−１ ｂｌｕｅを植菌し、濁度計で４０の
値が得られるまで３７℃で震盪培養した。最終濃度０．
４mMのＩＰＴＧを培養液に添加後、さらに６時間培養を
行い、大腸菌を回収した。大腸菌を回収後、常法に従っ
て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い蛋白質を分離した後クマシ
ー液によって染色を行い、蛋白質を検出した。

【００７０】その結果、ＸＬ−１ ｂｌｕｅでは検出さ
れない蛋白質のバンドがｐＴａｃ−Ｈ１ＴＭ（−）／Ｘ
Ｌ−１ ｂｌｕｅでは検出されており、そのバンドの濃
さより、検出した大腸菌内の他の蛋白質と比較して多量
に発現している物であることが判った。この蛋白質のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量は約３５Ｋであり、これは計
算上のＴｒｐＥ−Ｈ１ＴＭ（−）の蛋白質の分子量３４
Ｋとおおよそ一致していた。そこで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって検出された主たるバンドはＴｒｐＥ−Ｈ１細胞
膜内及び細胞膜外領域融合蛋白質であり目的の蛋白質で
あると判断した。この蛋白質をＨ１ＴＭ（−）とした。

【００７１】Ｈ１ＴＭ（−）蛋白質を多量に得るため
に、２Ｌスケールで培養を行った。ｐＴａｃ−Ｈ１ＴＭ
（−）／ＸＬ−１ ｂｌｕｅのコロニーを３０mlのＬＢ
／１００μｇ／mlアンピシリンに植菌し、３７℃で一晩
震盪培養を行った。翌日、２ＬのＬＢ／１００μｇ／ml
アンピシリンに１／１００の割合で培養したｐＴａｃ−
Ｈ１ＴＭ（−）／ＸＬ−１ ｂｌｕｅを植菌し、３７℃
で２時間震盪培養した後、最終濃度０．４mMのＩＰＴＧ
を加えてさらに一晩培養を行った。Ｈ１ＴＭ（−）蛋白
質の発現を確認後、遠沈によって集菌し、得られた沈殿
（大腸菌）を−２０℃で凍結保存した。

【００７２】Ｈ１ＴＭ（−）蛋白質を以降の実験に用い
るために精製した。尿素抽出は実施例３と同様に行っ
た。緩衝液Ａには１ｇの大腸菌につき５mlの１％ ＮＰ
−４０を加えた。目的の蛋白質は夾雑物とともに６Ｍ尿
素抽出液中に存在した。６Ｍ尿素抽出液に最終濃度５０
mMのＤＴＴを加え、４℃で１時間以上放置した。これ
を、平衡化したＱ− Sepharose（Pharmacia)（１６／１
０）にかけ、２ml／分の流速で緩衝液Ｃ（５０mM Ｂｉ
ｓ−Ｔｒｉｓ／６Ｍ尿素／５mM ＤＴＴ／pH７．０with
ＨＣｌ）で０−０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出した。

【００７３】０．１５−０．２Ｍ ＮａＣｌの溶出画分
がＯ．Ｄ．２８０nmの吸収ピークを示した。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで蛋白質を分離、確認したところ、多少の夾雑物
は存在するがほぼ１バンドの蛋白質が検出された。目的
蛋白質の存在する溶出画分は、マニュアルに従って Ami
con ＹＭ１０で濃縮し、ＤＴＴを除いた緩衝液ＣでＤＴ
Ｔを低濃度化した。このようにしＨ１ＴＭ（−）ペプチ
ドを得た。

【００７４】実施例５．ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２遺伝子組み
換え大腸菌によるＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白質細胞膜外領
域の発現 Ｌ−Ｈ２についても同様に、大腸菌でＬ−Ｈ２蛋白質の
細胞膜外領域を発現させるために、ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２
遺伝子の細胞膜外領域をクローニングし、発現ベクター
ｐＡＴ−ＴｒｐＥに挿入した。ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２遺伝
子の細胞膜外領域のクローニングは、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｌ
−Ｈ２を鋳型としたＰＣＲ反応を行い、Ｈ１細胞膜外領
域のクローニングと同様に行った。ＰＣＲのプライマー
には以下のものを使用した。

【００７５】プライマーＡＧＥｃｏＦ：５′−GAATTCGG
GTCCCAAAGTGCACAG−３′（配列番号：２０の３６５−３
８２）（配列番号：１５） プライマーＡＧＥｃｏＲ：５′−GGATCCTTATCAGGCCACCT
CGCCGGT −３′（配列番号：２０の１０５４−１０３
７）（配列番号：１６） プライマーＡＧＥｃｏＦおよびＡＧＥｃｏＲはそれぞれ
ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位およびＢａｍＨＩ認識部位
を持ち、この２つのプライマーによって増幅されたＬ−
Ｈ２細胞膜外領域の遺伝子は５′末端にＥｃｏＲＩ認識
部位を、そして３′末端にＢａｍＨＩ認識部位を持つ。
ＰＣＲ反応はＨ１と同様に行った。

【００７６】ＰＣＲ反応後の操作もＨ１と同様に行い、
ｐＧＥＭ−ＴベクターにＰＣＲ産物を挿入したプラスミ
ドをｐＧＥＭ−Ｔ−Ｌ−Ｈ２ＥＭとした。ｐＡＴ−Ｔｒ
ｐＥのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩにＬ−Ｈ２の細胞膜外領
域の遺伝子を挿入して、発現ベクターｐＡＴ−ＴｒｐＥ
−Ｌ−Ｈ２ＥＭとした。ＸＬ−１ ｂｌｕｅコンピテン
トセルに導入して形質転換した。ＴｒｐＥのＮ末１７ア
ミノ酸のポリペプチドとＬ−Ｈ２の細胞膜外領域の融合
蛋白質の発現はＴｒｐＥ−Ｈ１ＥＭ融合蛋白質の発現の
際と同様に確認した。

【００７７】その結果、ＸＬ−１ ｂｌｕｅでは検出さ
れない蛋白質のバンドがｐＡＴ−ＴｒｐＥ−Ｌ−Ｈ２Ｅ
Ｍ／ＸＬ−１ ｂｌｕｅでは検出されており、そのバン
ドの濃さより、検出した大腸菌内の他の蛋白質と比較し
て多量に発現している物であることが判った。この蛋白
質のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量は約３０Ｋであり、こ
れは計算上のＴｒｐＥ−Ｌ−Ｈ２ＥＭ蛋白質の分子量２
８Ｋとおおよそ一致していた。そこで、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって検出された主たるバンドはＴｒｐＥ−Ｌ−Ｈ
２細胞膜外領域融合蛋白質であり目的の蛋白質であると
判断した。この蛋白質をＬ−Ｈ２ＥＭとした。

【００７８】Ｌ−Ｈ２ＥＭ蛋白質を多量に得るために、
１Ｌスケールで培養を行った。ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−Ｌ−
Ｈ２ＥＭ／ＸＬ−１ ｂｌｕｅのコロニーを２ml ２×
ＹＴ／１００μｇ／mlアンピシリンに植菌し、８時間３
７℃で震盪培養した。これを３０mlの２×ＹＴ／１００
μｇ／mlアンピシリンに１／５０の割合で植菌し、３７
℃で一晩震盪培養を行った。 翌日、１ＬのＭ９−ＣＡ
／１００μｇ／mlアンピシリンに１／５０の割合で培養
したｐＡＴ−ＴｒｐＥ−Ｌ−Ｈ２ＥＭ／ＸＬ−１ ｂｌ
ｕｅを植菌し、３７℃で一晩震盪培養を行った。Ｌ−Ｈ
２ＥＭ蛋白質の発現を確認後、遠沈によって集菌し、そ
して得られた沈殿（大腸菌）を−２０℃で凍結保存し
た。

【００７９】Ｌ−Ｈ２ＥＭ蛋白質を以降の実験に用いる
ために精製した。尿素抽出は実施例３と同様に行った。
目的の蛋白質は夾雑物とともに４−６Ｍ尿素抽出液中に
存在した。４−６Ｍ尿素抽出液をＱ Sepharose（Pharma
cia)（１６／１０）にかけ、０．４ml／分の流速で１５
分間、０−０．３Ｍ ＮａＣｌで溶出した。Ｏ．Ｄ．２
８０nmの吸収ピークを示した溶出画分をSephacryl Ｓ−
３００（Pharmacia)（２６／９５）にかけ、２ml／分の
流速で緩衝液Ｂで溶出した。溶出画分を Superdex ７５
pg（２６／６０）にかけ、２ml／分の流速で緩衝液Ｄ
（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH８．０／６Ｍ Ｕｒｅ
ａ／０．１Ｍ ＮａＣｌ／５mM ＤＴＴ）で溶出した。

【００８０】目的の蛋白質は、５５−６５分の画分に溶
出された。得られた溶出画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で蛋白質を分離、確認したところ、多少の夾雑物は存在
するがほぼ１バンドの蛋白質が得られていた。目的蛋白
質の存在する溶出画分は、 Sephadex Ｇ２５ fine によ
って緩衝液よりＤＴＴを除去後、 Centricon−１０（Am
icon) によって濃縮し、マニュアルに従ってＰＤ−１０
カラム(Pharmacia) で緩衝液をＰＢＳ（−）に置換し
た。このようにしＬ−Ｈ２ＥＭペプチドを得た。

【００８１】実施例６．ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２遺伝子組み
換え大腸菌によるＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白質細胞膜内及
び細胞膜外領域融合蛋白質の発現 Ｌ−Ｈ２についても同様に、大腸菌でＬ−Ｈ２蛋白質の
細胞膜内及び細胞膜外領域を結合させた蛋白質を発現さ
せるために、ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２遺伝子の細胞膜内及び
細胞膜外領域をクローニングし、発現ベクターｐＴａｃ
−ＴｒｐＥに挿入した。

【００８２】ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２遺伝子の細胞膜内領域
のクローニングは、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｌ−Ｈ２を鋳型とし
たＰＣＲ反応を行い、Ｈ１細胞膜内領域のクローニング
と同様に行った。ＰＣＲのプライマーには以下のものを
使用した。 プライマーＬ−Ｈ２ＸｈｏＦ：５′−CTCGAGATGGCCAAGG
ACTTTCAA−３′（配列番号：２０の１９１−２０８）
（配列番号：１７） プライマーＬ−Ｈ２ＥｃｏＲ：５′−GAATTCACTGAAGCAG
ACCATGGAG −３′（配列番号：２０の３１３−２９５）
（配列番号：１８）

【００８３】プライマーＬ−Ｈ２ＸｈｏＦおよびＬ−Ｈ
２ＥｃｏＲはそれぞれＸｈｏ Ｉ制限酵素認識部位およ
びＥｃｏＲＩ認識部位を持ち、この２つをプライマーに
よって増幅されたＬ−Ｈ２細胞膜外領域の遺伝子は５′
末端にＸｈｏ Ｉ認識部位を、そして３′末端にＥｃｏ
ＲＩ認識部位を持つ。ＰＣＲ反応はＨ１と同様に行っ
た。

【００８４】ＰＣＲ反応後の操作もＨ１と同様に行い、
ｐＧＥＭ−ＴベクターにＰＣＲで得られた断片を挿入し
たプラスミドをｐＧＥＭ−Ｔ−Ｌ−Ｈ２ＴＭ（−）とし
た。ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｌ−Ｈ２ＴＭ（−）よりＸｈｏ Ｉ
／ＥｃｏＲＩ制限酵素によって切断された断片と、ｐＧ
ＥＭ−Ｔ−Ｌ−Ｈ２ＥＭによりＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ
制限酵素によって切断された断片とｐＴａｃ−ＴｒｐＥ
のＸｈｏ Ｉ／ＢａｍＨＩ部位に挿入して、大腸菌発現
ベクターｐＴａｃ−Ｌ−Ｈ２ＴＭ（−）とした。これを
ＸＬ−１ ｂｌｕｅコンピテントセルに導入して形質転
換体を得た。ＴｒｐＥのＮ末１７アミノ酸のポリペプチ
ドとＬ−Ｈ２の細胞膜内と細胞膜外領域の融合蛋白質の
発現はＴｒｐＥ−ＬＨ１ＴＭ（−）融合蛋白質の発現の
際と同様に確認した。

【００８５】その結果、ＸＬ−１ ｂｌｕｅでは検出さ
れない蛋白質のバンドがｐＴａｃ−Ｌ−Ｈ２ＴＭ（−）
／ＸＬ−１ ｂｌｕｅでは検出されており、そのバンド
の濃さより、検出した大腸菌内の他の蛋白質と比較して
多量に発現している物であることが判った。この蛋白質
のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量は約３５Ｋであり、これ
は計算上のＴｒｐＥ−Ｌ−Ｈ２ＴＭ（−）蛋白質の分子
量３３Ｋとおおよそ一致していた。そこで、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって検出された主たるバンドはＴｒｐＥ−Ｌ
−Ｈ２細胞膜内及び細胞膜外領域融合蛋白質であり目的
の蛋白質であると判断した。この蛋白質をＬ−Ｈ２ＴＭ
（−）とした。

【００８６】Ｌ−Ｈ２ＴＭ（−）蛋白質を多量に得るた
めに、２Ｌスケールで培養を行った。ｐＴａｃ−Ｌ−Ｈ
２ＴＭ（−）／ＸＬ−１ ｂｌｕｅのコロニーを３０ml
の２×ＹＴ／１００μｇ／mlアンピシリンに植菌し、３
７℃で一晩震盪培養を行った。翌日、２ＬのＬＢ／１０
０μｇ／mlアンピシリンに１／１００の割合で培養した
ｐＴａｃ−Ｌ−Ｈ２ＴＭ（−）／ＸＬ−１ ｂｌｕｅを
植菌し、３７℃で２時間震盪培養した後、最終濃度０．
４mMのＩＰＴＧを加えてさらに６時間培養を行った。Ｌ
−Ｈ２ＴＭ（−）蛋白質の発現を確認後、遠沈によって
集菌し、得られた沈殿（大腸菌）を−２０℃で凍結保存
した。

【００８７】Ｌ−Ｈ２ＴＭ（−）蛋白質を以降の実験に
用いるために精製した。尿素抽出は実施例３と同様に行
った。緩衝液Ａには１ｇの大腸菌につき５mlの１％ Ｎ
Ｐ−４０を加えた。目的の蛋白質は夾雑物とともに４−
６Ｍ尿素抽出液中に存在した。６Ｍ尿素抽出液に最終濃
度５０mMのＤＴＴを加え、４℃で１時間以上放置した。
これを、平衡化したMonoＱ（Pharmacia)（５／５）にか
け、１ml／分の流速で緩衝液Ｅ（５０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ pH８．０／６Ｍ尿素／５mM ＤＴＴ）で０−０．
３Ｍ ＮａＣｌで溶出した。

【００８８】約０．１Ｍ ＮａＣｌの溶出画分がＯ．
Ｄ．２８０nmの吸収ピークを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で蛋白質を分離、確認したところ、多少の夾雑物は存在
するがほぼ１バンドの蛋白質が得られていた。目的蛋白
質の存在する溶出画分は、緩衝液Ｆ（５０mM Ｔｒｉｓ
pH８．０／６Ｍ尿素／０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中で透
析を行い、ＤＴＴを除去した。このようにしＬ−Ｈ２Ｔ
Ｍ（−）ペプチドを得た。

【００８９】実施例７．抗ＡＧＰＲ Ｈ１抗体及び抗Ａ
ＧＰＲ Ｌ−Ｈ２抗体の作製 上記実施例３及び５において作製した組換えＡＧＰＲ蛋
白質Ｈ１ＥＭ及びＬ−Ｈ２ＥＭの精製品を用いて、抗Ａ
ＧＰＲ Ｈ１抗体及び抗ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２抗体を作製
した。免疫にはウサギ（ニュージーランドホワイト種）
およびマウスを用い、アジュバントにFreuntの完全アジ
ュバント（ＦＣＡ）を用いて、常法に従って免疫を行っ
た。抗体価の測定はＥＬＩＳＡで、反応の特異性の確認
はウエスタンブロット法で行った。

【００９０】ＥＬＩＳＡは以下のような方法で行った。
Ｈ１ＥＭ精製蛋白質またはＬ−Ｈ２ＥＭ精製蛋白質を１
μｇ／mlで室温で２時間、プレート（Ｎｕｎｃ）にコー
トした。血清を適当に希釈後、室温で１時間インキュベ
ートした。２次抗体にパーオキシダーゼ結合抗−ラビッ
トＩｇＧを１０００倍希釈で用い、室温で１時間インキ
ュベートした。発色は、ＯＰＤ１錠（和光純薬）を３５
mlのリン酸クエン酸緩衝液に溶解、６μｌの過酸化水素
水と混合したもので室温で１５分間インキュベートした
ことで行い、１０％硫酸を等量加えることによって反応
を停止した。検出は、マイクロプレートリーダー（東
リ）でＯＤ４９２nmを測定することで行った。

【００９１】ウエスタンブロット法は以下のような方法
で行った。Ｈ１ＥＭまたはＬ−Ｈ２ＥＭを発現している
ＸＬ−１ ｂｌｕｅ、または野生株のＸＬ−１ ｂｌｕ
ｅをサンプルとして常法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行
った。これを、常法に従ってＰＶＤＦ膜（ミリポア）に
転写した。１次抗体にそれぞれの抗血清を１０，０００
倍希釈して、２次抗体にアルカリホスファターゼ結合抗
−ラビットＩｇＧを１，０００倍希釈して用い、常法に
従ってウエスタンブロットを行った。

【００９２】その結果、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロ
ット法でＡＧＰＲ蛋白質を検出できる抗血清を得ること
ができた。ＥＬＩＳＡでは抗Ｈ１抗血清はＨ１ＥＭ抗原
に対し１０⁵ の抗体価を示した。また、抗Ｌ−Ｈ２抗血
清はＬ−Ｈ２ＥＭ抗原に対して１０⁵ の抗体価を示し
た。ウエスタンブロットでは抗Ｈ１抗血清はＡＧＰＲＨ
１蛋白質に強い反応を示し、抗Ｌ−Ｈ２抗血清はＡＧＰ
Ｒ Ｌ−Ｈ２蛋白質に強い反応を示しており、反応が交
差しているものの、それぞれに特異的な抗血清が得られ
ていることがわかった。

【００９３】実施例８〜１２により得られた動物培養細
胞で発現したＡＧＰＲ蛋白質と実施例７で得られたウサ
ギ抗血清との反応についても検討を行った。その結果、
動物培養細胞で発現したＡＧＰＲ蛋白質のウエスタンブ
ロットについては１，０００倍で、間接蛍光抗体法につ
いては５０倍で用いても、それぞれのサブタイプに対す
る抗体は、異なるサブタイプの抗原に対して反応が交差
しないことが示された。

【００９４】実施例８．樹立された哺乳動物細胞である
ＣＯＳ−１細胞でのＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質の発現 樹立された哺乳動物細胞であるＣＯＳ−１細胞に、ＡＧ
ＰＲ Ｈ１遺伝子を挿入した発現ベクターをトランスフ
ェクションする事によって、ＣＯＳ−１細胞でＡＧＰＲ
Ｈ１蛋白質を発現した。以下にＣＯＳ−１細胞でのＡ
ＧＰＲ Ｈ１蛋白質の発現法について示す。

【００９５】ＣＯＳ−１細胞での発現のためのベクター
にはＰａＳＲプラスミドを用いた。５μｇのＰａＳＲ
ＤＮＡをＸｈｏＩ ２５ＵおよびＢａｍＨＩ ２５Ｕで
切断し、常法に従って、Ｋｌｅｎｏｗ断片５Ｕで処理
し、末端を平滑化した。さらに、常法に従って、ＢＡＰ
１０Ｕで処理し、末端を脱リン酸化した。発現ベクタ
ーに挿入するためのＡＧＰＲ Ｈ１遺伝子は、ｐＧＥＭ
−Ｔ−Ｈ１よりＳａｃＩ／ＳａｃIIで切り出したＨ１
（１０７−１１９８塩基）及び、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｈ１−
２よりＳａｃＩ／ＳａｃIIで切り出したＨ１−２（１６
４−１１９８塩基）の２つを用いた。いずれも、プラス
ミド１０μｇをＳａｃＩ ５０ＵおよびＳａｃII ５０
Ｕで切断することによって発現単位を切り出し、ブラン
チングキット（宝酒造）を使用して添付のプロトコール
に従って、末端を平滑化した。

【００９６】上記で用意したベクター並びにＨ１および
Ｈ１−２断片を、ライゲーションキット（宝酒造）を使
用して添付のプロトコールに従ってライゲーションし
た。反応液を、常法に従ってコンピテントセルに導入し
て形質転換し、いくつかのアンピシリン耐性コロニーを
得た。これより、常法に従ってプラスミドを抽出し、制
限酵素で切断して確認することによって、目的の発現ベ
クターＰａＳＲ−Ｈ１及びＰａＳＲ−Ｈ１−２を得た。

【００９７】ＣＯＳ−１細胞への発現ベクターの導入
は、エレクトロポレーションによるトランスフェクショ
ンで行った。一晩培養した増殖期のＣＯＳ−１細胞をＰ
ＢＳ（−）に懸濁して、２．５×１０⁶ cells ／mlの濃
度とした。細胞懸濁液０．６mlをエレクトロポレーショ
ン用キュベット(Bio-Rad) にいれ、発現ベクター１５μ
ｇと混合し、氷中で３０分間放置した。その後、１２５
μＦ、１２５Ｖでエレクトロポレーションを行なった。
細胞は氷中に１０分間放置した後、ＤＭＥＭ １０％
ＦＢＳの入った１００mmφ組織培養用シャーレにまい
た。２４時間培養後に培地を交換し、エレクトロポレー
ション後４８時間で細胞を回収した。

【００９８】発現した蛋白質は、ウエスタンブロット法
を用いて検出した。回収した細胞を常法に従ってＳＤＳ
−サンプルバッファーにて懸濁し、１レーンあたり１×
１０ ⁵ 細胞の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した。常法
に従って、ＰＶＤＦ膜に蛋白質を転写後、実施例６にて
得られた抗Ｈ１血清を１，０００倍希釈で用いて、常法
に従ってウエスタンブロットを行った。検出はＥＣＬウ
エスタンブロッティングビオチンシステム（Amersham）
を用いて行った。

【００９９】その結果、分子量４６Ｋ弱の位置に、ＣＯ
Ｓ−１細胞では検出されないが、トランスフェクション
を行なったＣＯＳ−１細胞では検出される蛋白質のバン
ドがみられた。また、ＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質の計算上の
分子量は３８Ｋであるが、糖鎖が結合した際のＳＤＳ−
ＰＡＧＥでの分子量は約４６Ｋであることが報告されて
いる。そこで、このウエスタンで検出されたバンドを、
糖鎖修飾されたＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質であると判断し
た。以上のような方法で、ＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質をＣＯ
Ｓ−１細胞で発現し、ＣＯＳ−１細胞で発現したＡＧＰ
Ｒ Ｈ１蛋白質を得た。

【０１００】実施例９．樹立された哺乳動物細胞である
ＣＯＳ−１細胞でのＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白質の発現 樹立された哺乳動物細胞であるＣＯＳ−１細胞に、ＡＧ
ＰＲ Ｌ−Ｈ２遺伝子を挿入した発現ベクターをトラン
スフェクションする事によって、ＣＯＳ−１細胞でＡＧ
ＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白質を発現した。ＣＯＳ−１細胞での
ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白質の発現は、実施例８と同様の
方法で行った。

【０１０１】発現ベクターに挿入するためのＡＧＰＲ
Ｌ−Ｈ２遺伝子は、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｌ−Ｈ２よりＳｐｅ
Ｉ／Ｓｐｈ Ｉで切り出したＬ−Ｈ２（１８８−１１
４８塩基）及び、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｌ−Ｈ２ＦよりＳｐｅ
Ｉ／Ｓｆｉ Ｉで切り出したＬ−Ｈ２Ｆ（３４−１１
４８塩基）の２つを用いた。いずれも、プラスミド１０
μｇをＳｐｅＩ ５０Ｕ、ＳｐｈＩ ５０ＵまたはＳｆ
ｉＩ ５０Ｕで切断することによって発現単位を切り出
し、ブランチングキット（宝酒造）を使用して添付のプ
ロトコールに従って、末端を平滑化した。

【０１０２】これらの断片を、実施例８と同様の方法と
同様にライゲーション、大腸菌に形質転換し、いくつか
のアンピシリン耐性コロニーを得た。これより、常法に
従ってプラスミドを抽出し、制限酵素で切断して確認す
ることによって、目的の発現ベクターＰａＳＲ−Ｌ−Ｈ
２及び、ＰａＳＲ−Ｌ−Ｈ２Ｆを得た。ＣＯＳ−１細胞
への発現ベクターの導入は、リポフェクチン（ＧＩＢＣ
Ｏ ＢＲＬ）によるトランスフェクションで行った。５
×１０⁵ 細胞のＣＯＳ−１細胞を１００mmφの組織培養
ディッシュにまき、一晩培養した。これに、ＤＮＡ ２
μｇをリポフェクチンのマニュアルに従って調製したも
のをマニュアルに従って混合し、さらに一晩培養した。
その後、培地に１０％ＦＢＳを加えて４８時間後に細胞
を回収した。

【０１０３】発現した蛋白質は、実施例８のＣＯＳ−１
発現Ｈ１蛋白質と同様に、ウエスタンブロット法を用い
て検出した。１次抗体には抗Ｌ−Ｈ２抗血清を１，００
０倍希釈して用いた。その結果、ＰａＳＲ−Ｌ−Ｈ２，
ＰａＳＲ−Ｌ−Ｈ２ＦとともにＰａＳＲ−Ｈ１をトラン
スフェクションしたものについて、分子量４６Ｋ弱の位
置に、ＣＯＳ−１細胞では検出されないが、トランスフ
ェクションを行なったＣＯＳ−１細胞では検出される蛋
白質のバンドがみられた。また、ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋
白質の計算上の分子量は３８Ｋであるが、糖鎖が結合し
た際のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量は約４６Ｋであるこ
とが報告されている。そこで、このウエスタンで検出さ
れたバンドを、糖鎖修飾されたＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白
質であると判断した。以上のような方法で、ＡＧＰＲ
Ｌ−Ｈ２蛋白質をＣＯＳ−１細胞で発現し、ＣＯＳ−１
細胞で発現したＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白質を得た。

【０１０４】実施例１０．樹立された細胞株であるＣＨ
Ｏ−Ｋ１細胞でのＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質の発現 樹立された動物培養細胞株であるＣＨＯ−Ｋ１細胞にＡ
ＧＰＲ Ｈ１遺伝子を導入することによってＡＧＰＲ
Ｈ１蛋白質を発現した。以下に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞でＡ
ＧＰＲ Ｈ１蛋白質を発現させた方法について記す。

【０１０５】ＣＨＯ−Ｋ１細胞にＡＧＰＲ Ｈ１遺伝子
を導入するための発現ベクターは、マルコス法（斉藤ら
実験医学vol.７ ｐ．１８３−）によって構築した。
実施例８で得た発現ベクターＰａＳＲ−Ｈ１ ３０μｇ
を制限酵素ＳｆｉＩ ２００Ｕで切断し、得られたＤＮ
Ａ断片をＤＮＡ ＣＥＬＬ（第一化学）で回収した。ア
ンピシリン耐性、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を持つ
ベクターであるｐＣＨＤ２Ｌについても１．５μｇをＳ
ｆｉＩ ２０Ｕで切断し、フェノール／クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿後、ＴＥ（pH７．５）に溶解し
た。

【０１０６】Ｓｆｉ Ｉ制限酵素消化したｐＣＨＤ２Ｌ
５０ngとＰａＳＲ−Ｈ１ ＳｆｉＩ断片１μｇを６μ
ｌの１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH７．６／５mM Ｍ
ｇＣｌ₂ ／３００mM ＮａＣｌに溶解し、等量のライゲ
ーション溶液Ｂ（宝酒造）と混合し、１５℃で一晩ライ
ゲーションを行った。この方法によって約４８Ｋのマル
コスＤＮＡが得られた。ｐＣＨＤ２Ｌに存在するＫｐｎ
Ｉによる制限酵素消化、Ｓｆｉ Ｉによる制限酵素消
化とＰａＳＲ−Ｈ１のＳｆｉ Ｉ断片にあるＳｐｅ Ｉ
による制限酵素消化によって、得られたマルコスＤＮＡ
は、１つのｐＣＨＤ２Ｌベクターに対し、ＰａＳＲ−Ｈ
１のＳｆｉ Ｉ断片が同一方向に複数個（約２０個）挿
入されたものであることを確認した。

【０１０７】得られたマルコスＤＮＡクローンのうち、
最も分子量の大きいものを選択し、Quagen tip−５００
（Quagen）にて調製したプラスミド３０μｇをMammalia
n Transfection kit (STRATEGENE) を用いたリン酸カル
シウム法によって５×１０⁵細胞のＣＨＯ−Ｋ１細胞に
導入した。トランスフェクション後４８時間目に５×１
０⁵ 細胞／１００mmφ組織培養用ディッシュにまきなお
し、ハイグロマイシンＢを６００または８００μｇ／ml
添加することによって、外来遺伝子をゲノムに取り込み
ハイグロマイシンＢ耐性を示すようになったＣＨＯ−Ｋ
１株の選択を始めた。この選択はその後約２週間行っ
た。ハイグロマイシンＢ耐性を示すＣＨＯ−Ｋ１細胞の
コロニーをいくつかクローニングし、実施例８で示した
ウエスタンブロット法によってＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質の
発現を確認した。

【０１０８】ＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質の発現が確認された
クローンについては間接蛍光抗体法による確認も行っ
た。間接蛍光抗体法は、以下のように行った。１×１０
⁴ 個の細胞をチャンバースライド上で３日間培養し、Ｐ
ＢＳ（−）で洗浄後、アセトン：メタノール＝１：１で
固定後、風乾した。ＰＢＳ（−）で１００倍希釈した抗
Ｈ１血清と固定した細胞を３０分間３７℃でインキュベ
ートし、ＰＢＳ（−）で洗浄後、抗ウサギＩｇｓ−フル
オレッセインと３０分間３７℃でインキュベートし、Ｐ
ＢＳ（−）で再び洗浄した。蛍光は蛍光顕微鏡で観察し
た。

【０１０９】その結果、ＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質の発現が
ウエスタンブロットで確認され、全細胞をほぼ１００％
でのＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質の発現が間接蛍光抗体法によ
って確認されたクローンを得ることができた。ＡＧＰＲ
Ｈ１蛋白質は細胞表面及び細胞質内に検出された。

【０１１０】実施例１１．樹立された細胞株であるＣＨ
Ｏ−Ｋ１細胞でのＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白質の発現 樹立された動物培養細胞株であるＣＨＯ−Ｋ１細胞にＡ
ＧＰＲ Ｌ−Ｈ２遺伝子を導入することによってＡＧＰ
Ｒ Ｌ−Ｈ２蛋白質を発現した。以下に、ＣＨＯ−Ｋ１
細胞でＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白質を発現させた方法につ
いて記す。ＣＨＯ−Ｋ１細胞にＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２遺伝
子を導入するための発現ベクターは、実施例１０に記し
たＡＧＰＲ Ｈ１と同様にマルコス法によって構築し
た。

【０１１１】発現単位となるＬ−Ｈ２遺伝子は実施例９
で得た発現ベクターＰａＳＲ−Ｌ−Ｈ２ ３０μｇを制
限酵素ＳｆｉＩ ２００Ｕで切断し、得られたＤＮＡ断
片をＤＮＡ ＣＥＬＬ（第一化学）で回収して使用し
た。実施例１０と同様に、この方法によって約４８Ｋの
マルコスＤＮＡが得られた。得られたマルコスＤＮＡに
対してｐＣＨＤ２Ｌに存在し発現単位には存在しないＫ
ｐｎ Ｉ、発現単位の両端に位置するＳｆｉ Ｉ、及び
発現単位にあるＳａｃ Ｉで消化し、制限酵素による確
認を行った。得られたマルコスＤＮＡは、１つのｐＣＨ
Ｄ２Ｌベクターに対し、ＰａＳＲ−Ｌ−Ｈ２のＳｆｉ
Ｉ断片が同一方向に複数個（約２０個）挿入されたもの
であることを確認した。

【０１１２】ＣＨＯ−Ｋ１細胞へのマルコスＤＮＡのト
ランスフェクション、ＤＮＡが導入された細胞の選択、
クローニング、ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白質の発現の確認
についても実施例１０と同様に行った。その結果、ＡＧ
ＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白質の発現がウエスタンブロットで確
認され、全細胞のほぼ１００％でのＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２
蛋白質の発現が間接蛍光抗体法によって確認されたクロ
ーンを得ることができた。ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白質は
細胞表面及び細胞質内に検出された。

【０１１３】実施例１２．樹立された細胞株であるＣＨ
Ｏ−Ｋ１細胞でのＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質とＡＧＰＲ Ｌ
−Ｈ２蛋白質の共発現 樹立された動物培養細胞株であるＣＨＯ−Ｋ１細胞にＡ
ＧＰＲ Ｈ１遺伝子及びＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２遺伝子を導
入することによってＡＧＰＲ Ｈ１蛋白質とＡＧＰＲ
Ｌ−Ｈ２蛋白質を共発現した。以下に、ＣＨＯ−Ｋ１細
胞でＡＧＰＲＨ１蛋白質とＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白質を
共発現させた方法について記す。

【０１１４】ＣＨＯ−Ｋ１細胞にＡＧＰＲ Ｈ１遺伝子
及びＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２遺伝子を導入するための発現ベ
クターは、実施例１０に記したＡＧＰＲ Ｈ１と同様に
マルコス法によって構築した。発現単位となるＨ１遺伝
子及びＬ−Ｈ２遺伝子には実施例１０および実施例１１
と同様に、ＰａＳＲ−Ｈ１及びＰａＳＲ−Ｌ−Ｈ２をＳ
ｆｉ Ｉで消化して得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ ＣＥ
ＬＬ（第一化学）で回収して使用した。ライゲーション
にはＨ１およびＬ−Ｈ２のＳｆｉ Ｉ断片を等量用い
た。この方法によって約４８ＫのマルコスＤＮＡが得ら
れた。

【０１１５】制限酵素による確認も実施例１０および実
施例１１と同様に行い、Ｓｆｉ ＩでＰａＳＲ−Ｈ１及
びＰａＳＲ−Ｌ−Ｈ２のＳｆｉ Ｉに相当する分子量の
断片が検出され、Ｈ１及びＬ−Ｈ２の遺伝子に特異的な
制限酵素切断部位でそれぞれＤＮＡ断片が得られた。ま
た、得られたマルコスＤＮＡを鋳型とし、ＡＧＰＲＨ１
遺伝子に特異的なプライマーＦ１／Ｂ９及びＡＧＰＲ
Ｌ−Ｈ２遺伝子に特異的なプライマー７／４を用いて９
４℃１分間、５５℃１分間、７２℃１分間、２５サイク
ルの条件でＰＣＲを行ったところ、それぞれより、Ｈ１
またはＬ−Ｈ２遺伝子の目的領域に相当する約１．１Ｋ
の増幅断片が検出された。

【０１１６】得られたマルコスＤＮＡは、１つのｐＣＨ
Ｄ２Ｌベクターに対し、発現単位であるＰａＳＲ−Ｈ１
のＳｆｉ Ｉ断片とＰａＳＲ−Ｌ−Ｈ２のＳｆｉ Ｉ断
片が複数個（約２０個）挿入されたものであることが確
認された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞へのマルコスＤＮＡのトラ
ンスフェクション、ＤＮＡが導入された細胞の選択、ク
ローニング、ＡＧＰＲ Ｈ１及びＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋
白質の発現の確認についても実施例１０と同様に行っ
た。

【０１１７】その結果、ＡＧＰＲ Ｈ１及びＡＧＰＲ
Ｌ−Ｈ２蛋白質の共発現がウエスタンブロットで確認さ
れ、全細胞のほぼ１００％でのＡＧＰＲ Ｈ１及びＡＧ
ＰＲＬ−Ｈ２蛋白質の共発現が間接蛍光抗体法によって
確認されたクローンを得ることができた。ＡＧＰＲ Ｈ
１及びＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白質は共に細胞表面及び細
胞質内に検出された。

【０１１８】実施例１３．自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）患
者血清中の抗ＡＧＰＲ抗体の検出 実施例１０，１１および１２で得られたＡＧＰＲ蛋白質
を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いて、間接蛍光抗体法
によって、自己免疫性肝炎患者血清中の抗ＡＧＰＲ抗体
の検出を行った。方法は以下の通りである。

【０１１９】間接蛍光抗体法は、以下のように行った。
１×１０⁴ 個の細胞を８ウェルのガラスチャンバースラ
イド上で３日間培養し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、アセト
ン：メタノール＝１：１で固定後、風乾した。１次抗体
として、ＡＩＨ患者血清及びコントロール血清をＰＢＳ
（−）で１００倍希釈して用い、３７℃で３０分間イン
キュベートした。ＰＢＳ（−）で洗浄後、２次抗体に抗
ヒトＩｇＧ−フルオレッセインを用い、３７℃で３０分
間インキュベートした。ＰＢＳ（−）で洗浄後、風乾
し、グリセロール封入して蛍光顕微鏡で細胞を観察し
た。

【０１２０】１次抗体として用いたＡＩＨ患者血清４検
体中、１検体で、ＡＧＰＲ Ｈ１及びＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ
２蛋白質を共発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞質に
強い蛍光が認められた。ＡＧＰＲ Ｈ１単独またはＡＧ
ＰＲ Ｌ−Ｈ２蛋白質単独を発現しているＣＨＯ−Ｋ１
細胞の細胞質ではわずかに蛍光が認められた。野生株で
あるＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞質ではこの蛍光は認められ
なかった。ＡＩＨ患者血清４検体いずれも、どの細胞と
も核に蛍光が認められた。しかし、３検体については細
胞質での蛍光はどの細胞でも認められなかった。コント
ロール血清４検体ではいずれの細胞でも、細胞質、核共
に蛍光は認められなかった。

【０１２１】実施例１４．ＥＬＩＳＡによる各患者血清
中の抗ＡＧＰＲ抗体の測定 ヒト血清検体の内訳は、自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）：３
８例、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）：３０例、副腎白
質ジストロフィー（ＡＬＤ）：１０例、全身性エリテマ
トーデス（ＳＬＥ）：２例、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨ−
Ｂ）：１６例、健常人：１９例である。これらの血清中
の抗ＡＧＰＲ抗体の測定をＥＬＩＳＡにより行った。方
法は以下の通りである。

【０１２２】組換えＡＧＰＲ蛋白質であるＨ１ＴＭ
（−）、及びＬ−Ｈ２ＴＭ（−）をＰＢＳ（−）で希釈
して１μｇ／１００μｌ／wellとなるように分注し、室
温で２時間放置することによって、ＥＬＩＳＡ用イムノ
モジュールプレート（Nunc, Maxisorp) にコートした。
抗原を洗浄除去後、ブロッキング緩衝液として０．５％
カゼイン／ＰＢＳ（−）を３００μｌ／wellずつ分注
し、４℃で一晩放置した。ブロッキング緩衝液除去後、
ヒト血清検体の希釈サンプルを１００μｌ／wellで加え
３７℃で２時間インキュベーションを行なった。希釈に
は０．０５％カゼイン／１％ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗ
ｅｅｎ２０／ＰＢＳ（−）を用い、希釈倍率は１０００
倍で行なった。

【０１２３】血清を洗浄除去後、ペルオキシダーゼ標識
抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体(Bio Rad) をＨ１ＴＭ
（−）を抗原とした方は１００００倍、Ｌ−Ｈ２ＴＭ
（−）を抗原とした方は５０００倍に０．０５％カゼイ
ン／１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ
（−）で希釈して１００μｌ／wellずつ分注し、３７℃
で２時間インキュベートした。二次抗体の洗浄除去後、
２mg／ml ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）／０．０
５９Ｍクエン酸−０．０３９Ｍリン酸緩衝液（pH３．
４）／６mM Ｈ₂ Ｏ₂ を１００μｌ／wellずつ分注して
室温で１５分間インキュベートすることによって発色
し、１０％硫酸を１００μｌ／wellずつ分注して加えた
後、マイクロプレートリーダー（ＣＯＲＯＮＡ）でＯ．
Ｄ．４９２nmの吸光度を測定した。なお、それぞれの反
応過程における洗浄除去作業では、０．０５％ Ｔｗｅ
ｅｎ２０／ＰＢＳ（−）で４回の洗浄を行なっている。

【０１２４】それぞれの抗原について症例別に値を図示
すると、ＡＩＨ，ＰＢＣ群はＡＬＤ，ＳＬＥ，ＣＨ−
Ｂ、健常人群と比較して高い値の分布を示した。（図
２、図３）この抗ＡＧＰＲ抗体検出系により自己免疫性
肝疾患であるＡＩＨ，ＰＢＣ群は、健常人群、他の自己
免疫性疾患であるＡＬＤ，ＳＬＥ群、及び慢性Ｂ型肝炎
群と区別される。

【０１２５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CACTGAAGAA CCTGGGAATC AGAC 24

【０１２６】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGCCCTATCA TGACCAAGGA G 21

【０１２７】配列番号：３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAGGTCGAGG CATTGAAGA 19

【０１２８】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTTCAAGCTC CTCACCTTCG G 21

【０１２９】配列番号：５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATCATGGCCA AGGACTTTCA A 21

【０１３０】配列番号：６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATGGGTTAGC CAGAGGTGTG CT 22

【０１３１】配列番号：７ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATGGTCTGCT TCAGTCTGCT TGCC 24

【０１３２】配列番号：８ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTGTCTCAGT GTTTCTTCCT TTCC 24

【０１３３】配列番号：９ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CCCCAGTTCT CCTGGCTTTA AC 22

【０１３４】配列番号：１０ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGCATCGTGA TCTGCTTTCA GG 22

【０１３５】配列番号：１１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GAATTCGGAT CCCAAAACTC CCAG 24

【０１３６】配列番号：１２ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTCGACTTAA AGGAGAGGTG GCTC 24

【０１３７】配列番号：１３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTCGAGATGA CCAAGGAGTA TCAAG 25

【０１３８】配列番号：１４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GAATTCGAGG AGGCGAGGTC CGGA 24

【０１３９】配列番号：１５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GAATTCGGGT CCCAAAGTGC ACAG 24

【０１４０】配列番号：１６ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGATCCTTAT CAGGCCACCT CGCCGGT 27

【０１４１】配列番号：１７ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTCGAGATGG CCAAGGACTT TCAA 24

【０１４２】配列番号：１８ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GAATTCACTG AAGCAGACCA TGGAG 25

【０１４３】配列番号：１9 配列の長さ：１２７７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 AGGGCCCTCC TATGGACCCT GCCCGCTCCC CTCCCATTGT CCACGGCTGT CCGCCCACCC 60 CCATTCTCCA AGCTTCAGCC CCCTCCTTAG TTCGGCATCT GCACAGCACT GAAGAACCTG 120 GGAATCAGAC CCTGAGACCC TGAGCAATCC CAGGTCCAGC GCCAGCCCTA TC ATG ACC 178 Met Thr AAG GAG TAT CAA GAC CTT CAG CAT CTG GAC AAT GAG GAG AGT GAC CAC 226 Lys Glu Tyr Gln Asp Leu Gln His Leu Asp Asn Glu Glu Ser Asp His 5 10 15 CAT CAG CTC AGA AAA GGG CCA CCT CCT CCC CAG CCC CTC CTG CAG CGT 274 His Gln Leu Arg Lys Gly Pro Pro Pro Pro Gln Pro Leu Leu Gln Arg 20 25 30 CTC TGC TCC GGA CCT CGC CTC CTC CTG CTC TCC CTG GGC CTC AGC CTC 322 Leu Cys Ser Gly Pro Arg Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Leu Ser Leu 35 40 45 50 CTG CTG CTT GTG GTT GTC TGT GTG ATC GGA TCC CAA AAC TCC CAG CTG 370 Leu Leu Leu Val Val Val Cys Val Ile Gly Ser Gln Asn Ser Gln Leu 55 60 65 CAG GAG GAG CTG CGG GGC CTG AGA GAG ACG TTC AGC AAC TTC ACA GCG 418 Gln Glu Glu Leu Arg Gly Leu Arg Glu Thr Phe Ser Asn Phe Thr Ala 70 75 80 AGC ACG GAG GCC CAG GTC AAG GGC TTG AGC ACC CAG GGA GGC AAT GTG 466 Ser Thr Glu Ala Gln Val Lys Gly Leu Ser Thr Gln Gly Gly Asn Val 85 90 95 GGA AGA AAG ATG AAG TCG CTA GAG TCC CAG CTG GAG AAA CAG CAG AAG 514 Gly Arg Lys Met Lys Ser Leu Glu Ser Gln Leu Glu Lys Gln Gln Lys 100 105 110 GAC CTG AGT GAA GAT CAC TCC AGC CTG CTG CTC CAC GTG AAG CAG TTC 562 Asp Leu Ser Glu Asp His Ser Ser Leu Leu Leu His Val Lys Gln Phe 115 120 125 130 GTG TCT GAC CTG CGG AGC CTG AGC TGT CAG ATG GCG GCG CTC CAG GGC 610 Val Ser Asp Leu Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Leu Gln Gly 135 140 145 AAT GGC TCA GAA AGG ACC TGC TGC CCG GTC AAC TGG GTG GAG CAC GAG 658 Asn Gly Ser Glu Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His Glu 150 155 160 CGC AGC TGC TAC TGG TTC TCT CGC TCC GGG AAG GCC TGG GCT GAC GCC 706 Arg Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Ser Gly Lys Ala Trp Ala Asp Ala 165 170 175 GAC AAC TAC TGC CGG CTG GAG GAC GCG CAC CTG GTG GTG GTC ACG TCC 754 Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu Val Val Val Thr Ser 180 185 190 TGG GAG GAG CAG AAA TTT GTC CAG CAC CAC ATA GGC CCT GTG AAC ACC 802 Trp Glu Glu Gln Lys Phe Val Gln His His Ile Gly Pro Val Asn Thr 195 200 205 210 TGG ATG GGC CTC CAC GAC CAA AAC GGG CCC TGG AAG TGG GTG GAC GGG 850 Trp Met Gly Leu His Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val Asp Gly 215 220 225 ACG GAC TAC GAG ACG GGC TTC AAG AAC TGG AGG CCG GAG CAG CCG GAC 898 Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro Glu Gln Pro Asp 230 235 240 GAC TGG TAC GGC CAC GGG CTC GGA GGA GGC GAG GAC TGT GCC CAC TTC 946 Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala His Phe 245 250 255 ACC GAC GAC GGC CGC TGG AAC GAC GAC GTC TGC CAG AGG CCC TAC CGC 994 Thr Asp Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro Tyr Arg 260 265 270 TGG GTC TGC GAG ACA GAG CTG GAC AAG GCC AGC CAG GAG CCA CCT CTC 1042 Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Asp Lys Ala Ser Gln Glu Pro Pro Leu 275 280 285 290 CTT TAATTTATTT CTTCAATGCC TCGACCTGCC GCAGGGGTCC GGGATTGGGA 1095 Leu ATCCGCCCAT CTGGGGCCTC TTCTGCTTTC TCGGGAATTT TCATCTAGGA TTTTAAGGGA 1155 AGGGGAAGGA TAGGGTGATG TTCCGAAGGT GAGGAGCTTG AAACCCGTGG CGCTTTCTGC 1215 AGTTCACAAT GATAACCTGC AAACTGCAGA AAGCGCCACG GGTTTCAAGC TCCTCACCTT 1275 CG 1277

【０１４４】配列番号：２０ 配列の長さ：１３００ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CTGCACTCTC CTCTCCCCTG TGAGCTCCAC CTGCCCCAGT TCTCCTGGCT TTAACCCCTC 60 CTTGGCCAAG GCCAGGGTTG CCTGCGGGAG CCAGGCGTCC GCTCTCCACA CCTTTCACAG 120 CCCCAGCCCT CAGAGCAACC TCAGCCCAGC CCAGCCCAGC TCCAGCTCCA GCTCCAGCCC 180 GGGCCCCATC ATG GCC AAG GAC TTT CAA GAT ATC CAG CAG CTG AGC TCG 229 Met Ala Lys Asp Phe Gln Asp Ile Gln Gln Leu Ser Ser 5 10 GAG GAA AAT GAC CAT CCT TTC CAT CAA GGG CCA CCT CCT GCC CAG CCC 277 Glu Glu Asn Asp His Pro Phe His Gln Gly Pro Pro Pro Ala Gln Pro 15 20 25 CTG GCA CAG CGT CTC TGC TCC ATG GTC TGC TTC AGT CTG CTT GCC CTG 325 Leu Ala Gln Arg Leu Cys Ser Met Val Cys Phe Ser Leu Leu Ala Leu 30 35 40 45 AGC TTC AAC ATC CTG CTG CTG GTG GTC ATC TGT GTG ACT GGG TCC CAA 373 Ser Phe Asn Ile Leu Leu Leu Val Val Ile Cys Val Thr Gly Ser Gln 50 55 60 AGT GCA CAG CTG CAA GCC GAG CTG CGG AGC CTG AAG GAA GCT TTC AGC 421 Ser Ala Gln Leu Gln Ala Glu Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ala Phe Ser 65 70 75 AAC TTC TCC TCG AGC ACC CTG ACG GAG GTC CAG GCA ATC AGC ACC CAC 469 Asn Phe Ser Ser Ser Thr Leu Thr Glu Val Gln Ala Ile Ser Thr His 80 85 90 GGA GGC AGC GTG GGT GAC AAG ATC ACA TCC CTA GGA GCC AAG CTG GAG 517 Gly Gly Ser Val Gly Asp Lys Ile Thr Ser Leu Gly Ala Lys Leu Glu 95 100 105 AAA CAG CAG CAG GAC CTG AAA GCA GAT CAC GAT GCC CTG CTC TTC CAT 565 Lys Gln Gln Gln Asp Leu Lys Ala Asp His Asp Ala Leu Leu Phe His 110 115 120 125 CTG AAG CAC TTC CCC GTG GAC CTG CGC TTC GTG GCC TGC CAG ATG GAG 613 Leu Lys His Phe Pro Val Asp Leu Arg Phe Val Ala Cys Gln Met Glu 130 135 140 CTC CTC CAC AGC AAC GGC TCC CAA AGG ACC TGC TGC CCC GTC AAC TGG 661 Leu Leu His Ser Asn Gly Ser Gln Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp 145 150 155 GTG GAG CAC CAA GGC AGC TGC TAC TGG TTC TCT CAC TCC GGG AAG GCC 709 Val Glu His Gln Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser His Ser Gly Lys Ala 160 165 170 TGG GCT GAG GCG GAG AAG TAC TGC CAG CTG GAG AAC GCA CAC CTG GTG 757 Trp Ala Glu Ala Glu Lys Tyr Cys Gln Leu Glu Asn Ala His Leu Val 175 180 185 GTC ATC AAC TCC TGG GAG GAG CAG AAA TTC ATT GTA CAA CAC ACG AAC 805 Val Ile Asn Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Ile Val Gln His Thr Asn 190 195 200 205 CCC TTC AAT ACC TGG ATA GGT CTC ACG GAC AGT GAT GGC TCT TGG AAA 853 Pro Phe Asn Thr Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser Asp Gly Ser Trp Lys 210 215 220 TGG GTG GAT GGC ACA GAC TAT AGG CAC AAC TAC AAG AAC TGG GCT GTC 901 Trp Val Asp Gly Thr Asp Tyr Arg His Asn Tyr Lys Asn Trp Ala Val 225 230 235 ACT CAG CCA GAT AAT TGG CAC GGG CAC GAG CTG GGT GGA AGT GAA GAC 949 Thr Gln Pro Asp Asn Trp His Gly His Glu Leu Gly Gly Ser Glu Asp 240 245 250 TGT GTT GAA GTC CAG CCG GAT GGC CGC TGG AAC GAT GAC TTC TGC CTG 997 Cys Val Glu Val Gln Pro Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Phe Cys Leu 255 260 265 CAG GTG TAC CGC TGG GTG TGT GAG AAA AGG CGG AAT GCC ACC GGC GAG 1045 Gln Val Tyr Arg Trp Val Cys Glu Lys Arg Arg Asn Ala Thr Gly Glu 270 275 280 285 GTG GCC TGACCCCAGC ACACCTCTGG CTAACCCATA CCCCACACCT GCCCAGCTCT 1101 Val Ala GGCTTCTCTG TTGAGGATTT TGAGGAAAGG AAGAAACACT GAGACAGGGG TATGGGGAAG 1161 AGCTGAGCAA AGAGAGAAAG GAGGTAGTTT AAGAGTCCCT GACCCTGGAG GACTGAGATC 1221 CCACCTCCTT CTGTAATTCA TTGTAATTAT TATAATCGTC AGCCTCTTCA ATGGCGTAGG 1281 AAAGAAGAAA CAAATGCTT 1300

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＡＧＰＲ Ｈ１（Ａ）及びＡＧＰＲ
Ｌ−Ｈ２（Ｂ）の一次構造の模式図である。

【図２】図２は、膜貫通領域を除去した本発明のＡＧＰ
ＲＨ１誘導体を抗原として、種々の検体をＥＬＩＳＡに
より測定した場合の結果を示すグラフである。

【図３】図３は、膜貫通領域を除去した本発明のＡＧＰ
Ｒ Ｌ−Ｈ２誘導体を抗原として、種々の検体をＥＬＩ
ＳＡにより測定した場合の結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 33/576 Ｚ 33/576 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 大植 千春 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 八木 慎太郎 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 長谷川 明 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 清澤 研道 長野県松本市惣社270−10 (72)発明者 矢野 明彦 長崎県長崎市阪本町12−４ 長崎大学内

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アシアロ糖蛋白質受容体Ｈ１（ＡＧＰＲ
   Ｈ１）の細胞質膜外領域から成るＡＧＰＲ Ｈ１誘導
   体。
2. 【請求項２】 アシアロ糖蛋白質受容体Ｌ−Ｈ２（ＡＧ
   ＰＲ Ｌ−Ｈ２）の細胞質膜外領域から成るＡＧＰＲ
   Ｌ−Ｈ２誘導体。
3. 【請求項３】 ＡＧＰＲ Ｈ１の細胞質膜内領域と細胞
   質膜外領域とから成るＡＧＰＲ Ｈ１誘導体。
4. 【請求項４】 ＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２の細胞質膜内領域と
   細胞質膜外領域とから成るＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２誘導体。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のＡ
   ＧＰＲ誘導体の製造方法において、当該誘導体のポリペ
   プチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んで成る
   発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、
   そして該培養物を採取するか又は該培養物からさらに前
   記ＡＧＰＲ誘導体を採取する、ことを特徴とする方法。
6. 【請求項６】 ＡＧＰＲ Ｈ１又はＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２
   の製造方法において、当該ＡＧＰＲのポリペプチドのア
   ミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクタ
   ーにより形質転換された宿主細胞を培養し、そして該培
   養物を採取するか、又は該培養物から前記ＡＧＰＲを採
   取することを特徴とする方法。
7. 【請求項７】 ＡＧＰＲ Ｈ１及びＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２
   の同時製造方法において、当該ＡＧＰＲのポリペプチド
   のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ及び当該ＡＧＰＲ
   Ｌ−Ｈ２のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤ
   ＮＡを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿
   主を培養し、そして該培養物を採取するか、又は該培養
   物からＡＧＰＲ Ｈ１及びＡＧＰＲ Ｌ−Ｈ２を採取す
   ることを特徴とする方法。
8. 【請求項８】 前記宿主細胞が細菌細胞又は動物細胞で
   ある、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記細菌細胞が大腸菌細胞である請求項
   ８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記動物細胞が哺乳類細胞である、請
    求項８に記載の方法。
11. 【請求項１１】 ＡＧＰＲに対する抗体（抗ＡＧＰＲ抗
    体）の検出又は測定方法において、抗ＡＧＰＲ抗体の存
    否又はその量を測定すべき被験試料と、請求項１〜４に
    記載のＡＧＰＲ誘導体又は請求項６もしくは７に記載の
    方法により製造されたＡＧＰＲの少なくとも１種とを接
    触せしめ、そして抗原−抗体反応が生じたか否かを検出
    し又はその量を測定することを特徴とする方法。
12. 【請求項１２】 前記測定法が、エンザイム・リンクド
    ・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエス
    タンブロット法、間接蛍光抗体法、免疫沈降法、ラジオ
    イムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫拡散法又は免疫電気泳
    動法である、請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 請求項１〜４に記載のＡＧＰＲ誘導体
    又は請求項６もしくは７に記載の方法により得られたＡ
    ＧＰＲの少なくとも１種を含んで成る、抗ＡＧＰＲ抗体
    測定用試薬。
14. 【請求項１４】 抗ＡＧＰＲ抗体測定用キットであっ
    て、請求項１〜４に記載のＡＧＰＲ誘導体又は請求項６
    もしくは７に記載の方法により得られたＡＧＰＲの少な
    くとも１種、及び標準抗ＡＧＰＲ抗体を含んで成るキッ
    ト。