JP3090472B2 - プロスタグランジン受容体ｅｐ▲下１▼をコードするｄｎａ - Google Patents
プロスタグランジン受容体ｅｐ▲下１▼をコードするｄｎａInfo
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Description
発明の背景 プロスタグランジン（PG）E2の生理的作用は、プロス
タグランジンＥ受容体との相互作用を介して発揮され
る。EP受容体には３つのサブタイプ、EP1、EP2及びEP3
がある（Colemanら,1989の総説参照）。これら３つのサ
ブタイプはいずれもPGE2に対して大きな親和性を示す
が、種々のアゴニスト及びアンタゴニストに対する各サ
ブタイプの親和性には差異が見られ、その作用はそれぞ
れ異なる二次形質導入メカニズムを介して発揮される。
例えば、EP1受容体の活性化はIP3及び細胞内カルシウム
の増加に関連しており、EP2受容体の活性化は細胞内環
状AMPを増加させ、EP3受容体の活性化は細胞内環状AMP
を減少させ、次いで細胞内カルシウムを増加させる。こ
れまでにクローニングされたこの種のものは、マウスEP
2（Hondaら,1993）並びにマウスEP３α及びEP３β（Sug
imotoら,1992;Sugimotoら,1993）サブタイプだけであ
る。EP1受容体は通常、ヒト及び他の動物の小腸、腎
臓、胃、筋肉、目、子宮及び気管を含む広範な細胞上に
存在する。EP1受容体タンパク質がプロスタグランジン
と結合すると、細胞内カルシウムの濃度が増加する。組
織はこのシグナルに基づいて、例えば筋肉収縮により応
答する。 発明の概要 EP1と称する新規のプロスタグランジン受容体タンパ
ク質がヒト細胞から同定された。完全長EP1タンパク質
をコードするDNA分子を単離し、精製し、ヌクレオチド
配列を決定した。EP1をコードするDNAを発現ベクター内
にクローニングし、これらの発現ベクターを組換え宿主
細胞内に導入すると、組換え宿主細胞が機能的EP1受容
体タンパク質を発現した。これらの新規のEP1タンパク
質、EP1をコードするDNA、発現ベクター及び組換えEP1
を発現する組換え宿主細胞は、EP1受容体活性のモジュ
レーターの選定に有用である。 組換えEP1発現宿主細胞を使用するEP1受容体モジュレ
ーターの同定方法も開示する。EP1活性モジュレーター
は、プロスタグランジン関連の疾患の治療及びEP1受容
体に対するプロスタグランジンの作用の調節に有用であ
る。 図面の簡単な説明 第１図は、EP1受容体タンパク質をコードするDNAの完
全配列を示している。 第２図は、EP1受容体タンパク質の推定アミノ酸完全
配列を示している。 第３図Ａ及び第３図Ｂは、pcDNA−EP1トランスフェク
ションCOS−M6膜への［3H］PGE2結合の競合を示してい
る。［3H］PGE2結合アッセイは、第３図A:0.03nM〜10μ
Ｍ PGE2（△）,PGE1（■）,PGE２α（□）,PGD
2（●）、第３図B:3nM〜100μＭ AH6809（○）,SC1922
0（▲）及びButaprost（◇）の存在下で、「方法」の説
明に記載のように実施した。Butaprost及びAH6809はMil
es Inc.及びGlaxo Group Research Ltd.の好意によ
るものである。 第４図Ａ〜第４図Ｅは、アフリカツメガエル卵母細胞
内でのプロスタグランジンE2受容体の発現を示してい
る。第４図A:1μＭのPGE2の浴潅流（bath perfusion）
で生起した内向Ca2依存Cl-流（下方への偏位として示さ
れる）。卵母細胞に5ngのpcDNA−EP1（Bam）を注入し、
−60mVで電圧クランプした。第４図Ｂ〜D:エクオリンを
導入した卵母細胞内でのPGE2誘発光応答。エクオリン発
光の強度は相対単位で示されており、バックグラウンド
発光は典型的には0.5〜0.7単位であった。PGE2は各実験
毎に示されている最終濃度で10秒の時点で記録キュベッ
ト内に注入した。第４図E:光応答を種々の濃度のPGE2及
びPGF２αで誘起した。各縦グラフは、４個のドナーに
由来する10〜15個の卵母細胞のデータの平均値±s.e.m.
を示している。データは、１μＭのPGE2を使用した時に
観察された応答に対する百分率で表されている。 発明の詳細な説明 本発明は、EP1とここに命名する新規のプロスタグラ
ンジン受容体をコードするcDNAに関する。本発明は、組
換え発現プラスミド内に含まれているクローン化EP1コ
ーディングDNAを発現する組換え宿主細胞にも関する。
本発明は、EP1受容体活性を調節する物質のスクリーニ
ング方法にも関する。本発明のDNAは、EP1産生細胞から
単離される。本明細書で使用するEP1という用語は、プ
ロスタグランジン分子に特異的に結合できるＧタンパク
質結合受容体を意味する。本発明は、EP1産生細胞から
単離され、やはりEP1と称する特定のプロスタグランジ
ン受容体タンパク質にも関する。本明細書で使用するEP
1受容体タンパク質という用語は、プロスタグランジン
分子に特異的に結合できるＧタンパク質結合型受容体を
意味する。 EP1を産生することができる哺乳動物細胞の非限定的
具体例としては、小腸、腎臓、胃、筋肉、目、子宮及び
気管に由来する細胞が挙げられる。EP1を産生する形質
転換哺乳動物細胞系の非限定的具体例としては、HEL細
胞が挙げられる。本発明のために好ましい細胞は例えば
ヒト正常腎臓細胞であり、最も好ましい細胞はヒト赤白
血病細胞である。 他の細胞及び細胞系もEP1cDNAの単離に使用するのに
適当であり得る。適当な細胞の選択は、細胞表面のEP1
のスクリーニングによって実施し得る。EP1活性検出方
法は当業者によく知られており（ ）、受容体に特異的
な放射性標識リガンドの結合を測定する。このアッセイ
でEP1活性を示す細胞は、EP1cDNAの単離に適当であり得
る。 EP1cDNAのクローニングには、種々の方法のうちの任
意のものを使用し得る。これらの方法の非限定的具体例
としては、適当な発現ベクター系内でEP1含有cDNAライ
ブラリーを構築した後、EP1cDNAを直接機能発現させる
方法が挙げられる。別の方法として、バクテリオファー
ジ又はプラスミドシャトルベクター内で構築したEP1含
有cDNAライブラリーを、EP1タンパク質のアミノ酸配列
から設計した標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリ
ーニングする方法もある。好ましい方法は、バクテリオ
ファージ又はプラスミドシャトルベクター内で構築した
EP1含有cDNAライブラリーを、EP1タンパク質をコードす
る部分的cDNAでスクリーニングすることからなる。前記
部分的cDNAは、プロスタグランジンEP1受容体と相関し
ている別のＧタンパク質結合受容体について知られてい
るアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライマー
を設計して、EP1DNAフラグメントの特異的PCR増幅を行
うことにより得る。 当業者には容易に理解されるように、別の種類のライ
ブラリー、並びに別の細胞もしくは細胞種類から構築し
たライブラリーも、EP1をコードするDNAの単離に有用で
あり得る。別の種類のライブラリーの非限定的具体例と
しては、ヒト赤白血病細胞以外の細胞又は細胞系に由来
するcDNAライブラリー、及びゲノムDANライブラリーが
挙げられる。 当業者には明らかなように、適当なcDNAライブラリー
は、EP1活性を有する細胞又は細胞系から製造し得る。E
P1cDNAを単離するためのcDNAライブラリーの製造で使用
する細胞又は細胞系の選択は、本発明で使用する前述の
公知の標識リガンド結合アッセイを用いて、事前に細胞
結合EP1活性を測定することにより実施し得る。 cDNAライブラリーの製造は、当業者によく知られてい
る標準的方法で実施できる。よく知られているcDNAライ
ブラリー構築方法は、例えばManiatis,T.,Fritsch,E.
F.,Sambrook,J.,Molecular Cloning:A Laboratory M
anual（Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spri
ng Harbor,New York,1982）に記載されている。 これも当業者には明らかであろうが、EP1をコードす
るDNAは適当なゲノムDNAライブラリーからも単離し得
る。 ゲノムDNAライブラリーの構築は、当業者によく知ら
れている標準的方法で実施できる。よく知られているDN
Aライブラリー構築方法は、例えばManiatisら，前出に
記載されている。 好ましい方法のいずれかによってEP1遺伝子をクロー
ニングするためには、EP1又は相同タンパク質のアミノ
酸配列又はDNA配列が必要である。そのためには、EP1タ
ンパク質又は相同タンパク質を精製し、自動配列決定器
で部分的アミノ酸配列を決定し得る。完全なアミノ酸配
列を決定する必要はないが、部分的EP1DNAフラグメント
のPCR増幅のためには、アミノ酸６〜８個の二つの領域
の直鎖配列を決定するとよい。 適当なアミノ酸配列が同定されたら、これらをコード
することができるDNA配列を合成する。遺伝子コードは
縮重であるため、特定のアミノ酸をコードするためには
１個以上のコドンを使用し得、従ってアミノ酸配列は、
一組の類似のDNAオリゴヌクレオチドのうち任意のもの
でコードできる。前記一組のDNAオリゴヌクレオチドの
うち一つだけがEP1配列と同じであるが、その組の残り
も不適性状態のDNAオリゴヌクレオチドの存在下でもEP1
DNAにハイブリダイズすることができる。不適性DNAオリ
ゴヌクレオチドでも、EP1をコードするDNAの同定及び単
離を可能にするのに十分な程度にEP1DNAにハイブリダイ
ズし得る。 好ましい方法のいずれかを用いて、ポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）ベースの技術及びcDNAライブラリースクリ
ーニングを使用する２段階方法で、EP1をコードするcDN
Aクローンを単離する。第１段階では、精製EP1又は相同
タンパク質からのNH2末端及び内部アミノ酸配列情報を
用いて、EP1特異的DNAフラグメントの増幅のための縮重
オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。第２段階で
は、前記フラグメントをクローニングして、ヒト赤白血
病細胞由来のcDNAライブラリーから完全長cDNAを単離す
るためのプローブとして使用する。 EP1をコードするほぼ完全長のcDNAの配列を表１に示
し、これをクローンEP1と名付けた。クローン化cDNAに
基づくEP1の推定アミノ酸配列を表２に示す。決定され
たcDNA配列を調べると、アミノ酸402個のタンパク質を
コードする単一の大きな読取り枠の存在が明らかにな
る。 前述の方法で得たクローン化EP1cDNAは、組換えEP1を
産生するために、適当なプロモーターと他の適当な転写
調節エレメントとを含む発現ベクター内への分子クロー
ニングにより組換え的に発現し、原核又は真核宿主細胞
内にトランスファーし得る。この種の操作の方法は、前
出のManiatisらの文献に記載されており、当業者によく
知られている。 本明細書では、発現ベクターは、クローン化DNAの転
写と、適当な宿主内で対応するmRNAの翻訳とに必要なDN
A配列であると定義される。この種のベクターは、種々
の宿主、例えば細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞及び動
物細胞内で真核生物DNAを発現させるのに使用し得る。 特異的に設計したベクターは、細菌−酵母間又は細菌
−動物細胞間のような宿主間のDNAシャトリングを可能
にする。適当に構築した発現ベクターは、宿主細胞内で
の自立複製のための複製起点と、選択可能マーカーと、
限定数の有用な制限酵素部位と、高コピー数の可能性
と、活性プロモーターとを含んでいなければならない。
プロモーターは、RNAポリメラーゼをDNAに結合させてRN
A合成を開始させるDNA配列であると定義される。強力な
プロモーターは、mRNAを高頻度で開始させるプロモータ
ーである。発現ベクターの非限定的具体例としては、ク
ローニングベクター、修飾クローニングベクター、特異
的に設計したプラスミド又はウイルスが挙げられる。 哺乳動物細胞内で組換えEP1を発現するためには種々
の哺乳動物発現ベクターを使用し得る。組換えEP1の発
現に適当であり得る市販の哺乳動物発現ベクターの非限
定的具体例としては、pMC1neo（Stratagene）、pXT1（S
tratagene）、pSG5（Stratagene）、pcDNAI、pcDNAIamp
（Invitrogen）、EBO−pSV2−neo（ATCC 37593）、pBP
V−１（８−２）（ATCC 37110）、pdBPV−MMTneo（342
−12）（ATCC 37224）、pRSVgpt（ATCC 37199）、pRS
Vneo（ATCC 37198）、pSV2−dhfr（ATCC 37146）、pU
CTag（ATCC 37460）及びIZD35（ATCC 37565）が挙げ
られる。 EP1をコードするDNAは、宿主細胞内での発現のために
発現ベクター内にクローニングしてもよい。宿主細胞は
原核細胞又は真核細胞であり得、非限定的具体例として
は細菌、酵母、哺乳動物細胞、例えばヒト、ウシ、ブ
タ、サル及び齧菌類の細胞系、並びに昆虫細胞、例えば
ショウジョウバエ由来細胞系が挙げられる。適当であり
得る市販の哺乳動物由来細胞系の非限定的具体例として
は、CV−１（ATCC CCL 70）、COS−１（ATCC CRL 1
650）、COS−７（ATCC CRL 1651）、CHO−K1（ATCC
CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92）、NIH/3T3（ATCC CR
L 1658）、HeLa（ATCC CCL ２）、C127I（ATCCCCRL
1616）、BS−Ｃ−１（ATCC CCL 26）及びMRC−５
（ATCC CCL 171）が挙げられる。 発現ベクターは、非限定的具体例として例えば形質転
換、トランスフェクション、プロトプラスト融合法及び
電気穿孔法のような種々の方法のいずれかを用いて、宿
主細胞内に導入し得る。発現ベクター含有細胞を個々に
分析して、その細胞がEP1タンパク質を産生するか否か
を決定する。EP1発現細胞の同定は、幾つかの方法、例
えば非限定的具体例として抗EP1抗体に対する免疫学的
反応性、及び宿主細胞結合EP1活性の存在等により実施
し得る。 EP1DNAの発現は、in vitroで製造した合成mRNAを用
いて実施してもよい。合成mRNAは、種々の無細胞系、非
限定的具体例として例えばコムギ胚芽抽出物及び網状赤
血球抽出物中で効率的に翻訳できると共に、細胞ベース
の系、非限定的具体例として例えばカエル卵母細胞内へ
のマイクロインジェクションでも効率的に翻訳できる。
好ましいのはカエル卵母細胞へのマイクロインジェクシ
ョンである。 受容体活性及び／又はEP1タンパク質を最適レベルに
するEP1cDNA配列を決定するために、例えば下記のよう
なEP1cDNA分子を構築し得る:EP1cDNAの完全長読取り
枠、並びに受容体タンパク質の特定ドメインのみもしく
は該タンパク質の再構成ドメイン（rearranged domai
n）をコードするcDNAの一部を含む種々の構築物。総て
の構築物は、EP1cDNAの５′及び／又は３′非翻訳領域
を全く含まないか、総て含むか、又は一部含むように設
計し得る。EP1活性及びタンパク質発現レベルは、これ
らの構築物を単独で又は組合わせて適当な宿主細胞内に
導入した後で決定し得る。過渡アッセイ（transient a
ssay）での最適発現を生起させるEP1cDNAカセットの決
定に次いで、このEP1cDNA構築物を種々の発現ベクター
（組換えウイルスを含む）、例えば哺乳動物細胞、植物
細胞、昆虫細胞、卵母細胞、大腸菌及び酵母細胞用の発
現ベクターにトランスファーする。 哺乳動物細胞トランスフェクタントを、EP1受容体活
性レベル及びEP1タンパク質濃度の両方について、下記
の方法でアッセイする。EP1受容体活性の測定では、標
識リガンドを細胞に直接導入し、EP1発現細胞へのリガ
ンドの特異的結合の量を決定する。受容体活性に関する
結合アッセイは当業者に公知である（Freyら,1993,Eur.
J.Pharmacol.,244,pp239−250）。 宿主細胞内のEP1タンパク質濃度は、種々の方法、例
えば非限定的具体例としてイムノアフィニティ及び／又
はリガンドアフィニティ法で定量する。EP1特異的アフ
ィニティビーズ又はEP1特異的抗体を用いて、35S−メチ
オニン標識又は非標識EP1タンパク質を単離する。標識E
P1タンパク質はSDS−PAGEで分析する。非標識EP1タンパ
ク質は、EP1特異的抗体を用いて、ウエスタンブロッテ
ィング、ELISA又はRIAアッセイで検出する。 宿主細胞内でのEP1の発現後、EP1特異的リガンドに結
合することができる活性形態のEP1を得るべく、EP1タン
パク質を回収し得る。使用し得るEP1精製操作は幾つか
存在する。組換えEP1は、塩分別、イオン交換クロマト
グラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキ
シルアパタイト吸収クロマトグラフィー及び疎水性相互
作用クロマトグラフィーを単独で又は様々に組合わせて
使用することにより、細胞溶解物及び抽出物から、又は
ならし培養培地から精製し得る。 また、組換えEP1は、完全長発生期EP1又はEP1のポリ
ペプチドフラグメントに特異的なモノクローナル又はポ
リクローナル抗体を用いて形成したイムノアフィニティ
カラムの使用により、別の細胞タンパク質と分離する。 EP1に対する単一特異性抗体は、EP1と反応する抗体を
含む哺乳動物抗血清から精製するか、又はKohler及びMi
lstein,Nature 256:495−497（1975）に記載の方法を
用いて、EP1と反応するモノクローナル抗体として製造
する。本明細書中の単一特異性抗体は、EP1に対して均
一結合特性を示す単一抗体種又は多重抗体種であると定
義される。本明細書で使用する均一結合という用語は、
抗体種が特定の抗原又はエピトープ、例えば前述のよう
にEP1と結合した抗原又はエピトープに結合する能力を
意味する。EP1特異的抗体は、マウス、ラット、テンジ
クネズミ、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物を、免疫
アジュバントを用いて又は用いずに、適当な濃度のEP1
で免疫感作することにより形成する。 最初の免疫感作の前に免疫前血清を採取する。各動物
に、約0.1μｇ〜約1000μｇのEP1を、許容し得る免疫ア
ジュバントと組合わせて投与する。許容し得るアジュバ
ントの非限定的具体例としては、フロイント完全アジュ
バント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン沈
降物、Corynebacterium parvum含有油中水滴エマルジ
ョン及びtRNAが挙げられる。最初の免疫感作は、好まし
くはフロイント完全アジュバント中の酵素を皮下（S
C）、腹腔内（IP）又はこれら両方の経路で複数の部位
に投与することによって実施した。各動物の採血を一定
の時間間隔、好ましくは１週間おきに行い、抗体力価を
測定した。動物には、最初の免疫感作後に、ブースター
注射をしてもよく、又はしなくてもよい。ブースター注
射をする動物には通常、フロイント不完全アジュバント
中の同量のEP1を同一経路で投与する。ブースター注射
は、最大力価が得られるまで約３週間の間隔で行った。
各ブースター免疫感作から約７日後、又は単一免疫感作
から約１週間後に動物の採血を行い、血清を回収し、ア
リコートを約−20℃で貯蔵した。 近交系マウス、好ましくはBalb/cをEP1で免疫感作す
ることにより、EP1に反応するモノクローナル抗体（mA
b）を製造する。マウスは、IP又はSC経路により、同量
の前述のような許容し得るアジュバントに混入した約0.
5mlの緩衝液又は食塩水中の約１μｇ〜約100μｇ、好ま
しくは約10μｇのEP1で免疫感作する。好ましいアジュ
バントはフロイント完全アジュバントである。マウスは
０日目に最初の免疫感作を行い、約３〜約30週間休息さ
せる。免疫マウスに、リン酸緩衝食塩水のような緩衝溶
液中約１〜約100μｇのEP1のブースター免疫を静脈内
（IV）経路で一回以上行う。抗体陽性マウスのリンパ
球、好ましくは脾臓リンパ球を、当業者に公知の標準的
方法で免疫マウスから脾臓を除去することによって得
る。脾臓リンパ球を、安定なハイブリドーマを形成させ
る条件下で、適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞と
混合して、ハイブリドーマ細胞を形成する。融合相手の
非限定的具体例としては、マウス骨髄腫P3/NS1/Ag4−1;
MPC−11;S−194及びSp 2/0が挙げられる。好ましいの
はSp 2/0である。抗体産生細胞及び骨髄腫細胞を分子
量約1000のポリエチレングリコール中約30％〜約50％の
濃度で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞を、当
業者に公知の方法で、ヒポキサンチン、チミジン及びア
ミノプテリン添加ダルベッコ改質イーグル培地（DMEM）
中で増殖させることにより選択する。約14日目、18日目
及び21日目に増殖陽性ウェルから上清を回収し、EP1を
抗原として用いて、固相イムノラジオアッセイ（SPIR
A）のようなイムノアッセイで抗体産生に関するスクリ
ーニングを行う。培養液をOuchterlony沈降アッセイで
も検査して、mAbのイソタイプを調べる。抗体陽性ウェ
ル由来のハイブリドーマ細胞を、Soft Agar Techniqu
es,Tissue Culture Methods and Applications,Kru
se及びPaterson編,Academic Press,1973に記載のMacPh
ersonの軟寒天法のような方法によってクローニングす
る。 マウス当たり約0.5mlのプリスタンで感作したBalb/c
マウスに、約２×106〜約６×106のハイブリドーマ細胞
を感作処理の約４日後に注入することにより、モノクロ
ーナル抗体をin vivoで産生する。細胞トランスファー
の約８〜12日後に腹水を採取し、モノクローナル抗体を
当業者に公知の方法で精製する。 十分な量の特異的mAbを得るために、ハイブリドーマ
を約２％のウシ胎児血清を含むDMEM培地で増殖させるこ
とにより、抗EP1mAbをin vitroで製造する。mAbは当業
者に公知の方法で精製する。 腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を、種々の
血清学的又は免疫学的アッセイ、例えば非限定的具体例
として、沈降、受動凝集、酵素結合イムノソルベント抗
体（ELISA）法及びラジオイムノアッセイ（RIA）法で測
定する。類似のアッセイを使用して、体液又は組織及び
細胞抽出物中のEP1の存在を検出する。 当業者には明らかなように、単一特異性抗体を産生す
るための前述の方法は、EP1ポリペプチドフラグメント
又は完全長EP1ポリペプチドに特異的な抗体の産生に使
用し得る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との間で共有結合
を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルで予備活性化したゲル支持体であるAffgel−10（Bior
ad）に抗体を加えることによりEP1抗体アフィニティカ
ラムを形成する。抗体はスペーサーアームとのアミド結
合を介してゲルに結合する。次いで、残りの活性化エス
テルを1MエタノールアミンHCl（pH8）で失活させる。カ
ラムを水及び0.23MグリシンHCl（pH2.6）で順次洗浄し
て、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。次いで
カラムをリン酸塩緩衝食塩水（pH7.3）中で平衡化し、E
P1又はEP1フラグメントを含む細胞培養上清又は細胞抽
出物をゆっくりとカラムに通す。次いで、カラムを、光
学密度（A280）がバックグラウンドに低下するまでリン
酸塩緩衝食塩水で洗浄し、その後タンパク質を0.23Mグ
リシン−HCl（pH2.6）で溶離する。次いで精製EP1タン
パク質をリン酸塩緩衝食塩水に対して透析する。 本発明のプロスタグランジン受容体をコードするDNA
を単離に適した方法の一つは、別のＧタンパク質結合受
容体から得たアミノ酸及び／又はDNA配列情報を使用す
ることからなる。別のプロスタグランジン受容体はＧタ
ンパク質結合であることが知られているため、トランス
メンブラン及び／又は細胞質ドメインといったような特
定の領域又はドメインは、新規の受容体を単離するため
のプローブを形成するのに十分な程度の相同を有すると
予想される。 プロスタグランジン及びロイコトリエンは、結合した
Ｇタンパク質結合受容体を介して自己のシグナルを形質
導入することが知られている。種々の組織中に存在する
異なるPGH2/トロンボキサン、A2、PGI2、PGE2、PGD2、P
GF２α、LTB4及びLTD4受容体は文献に記述されている。
これらの受容体のうちの一部は可溶化され、部分的に精
製され（Dutta−Roy,A.K.ら，（1987）JBC,262,pp.1268
5;Tsai,A.L.ら，（1989）,JBC,264,pp61;168−Watawab
e,T.ら，（1990）,JBC,265,pp.21237）、ヒト血小板TXA
2受容体は明らかな均質性を示すまで精製された（Ushik
ubi,F.ら，（1989）,JBC,264,pp.16496）。精製トロン
ボキサン受容体は、SDS−ポリアクリルアミドゲル上で
約57kDaを中心とする極めて広いバンドを示した。部分
的配列情報を得るのに十分なタンパク質が得られた。 オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト巨核球細
胞系（MEG−01）cDNAライブラリーがスクリーニングさ
れた（Hirata,M.ら，（1991）,Nature,349,pp.617）。
部分長cDNAクローンが得られた。配列決定の結果、該cD
NAクローンは、推定上のＧタンパク質結合受容体のＣ末
端側の半分をコードすることが判明した。このクローン
を標識し、ヒト胎盤ライブラリーのスクリーニングに使
用した。一つの完全長（約2.9kb）クローンは、５′及
び３′側にそれぞれ広い非コーディング領域と、Mr約37
000の343アミノ酸タンパク質をコードする1029塩基対の
読取り枠とを含んでいた。予測された配列は、推定上の
細胞外アミノ末端（29残基）内の二つのＮ結合グリコシ
ル化部位（Asn−４及びAsn−16）と、細胞外ループ１及
び２内の保存Cys残基（Cys−105及びCys−183）と、小
さいアミン含有リガンドを有する受容体にとって必須で
あることが知られているトランスメンブラン３内に存在
するAsp残基（Strosberg,A.D.（1991）,EJB,196,pp.1）
を除く、トランスメンブラン領域内の他の幾つかの保存
残基とを含む７個のトランスメンブランＧ結合受容体の
特性を示す。この配列は極めて短い予測された第三の細
胞内ループ（27残基）を有する。分子のこの部分はおそ
らく、ホスホリパーゼＣとの相互作用に関与し、その結
果カルシウムイオン流束を変化させるＧタンパク質（Gq
又はより大きいＧタンパク質）に結合し得る（Shenker,
A.ら，（1991）,JBC,266,pp.9309.173−Moran,N.ら，
（1990）,Circulation,Suppl.82,抄録1830）。 トロンボキサン受容体をコードする領域はＧ＋Ｃが極
めて多い（70％）。このcDNAを普通の変性条件下（94〜
95℃）でTaqポリメラーゼを用いて胎盤又は血小板逆転
写RNAから単離することは殆ど不可能であった。しかし
ながら、変性温度を98℃に変え且つVentポリメラーゼ
（New England Biolabs）を使用すると、完全cDNAの
増幅が可能になった。 トロンボキサン受容体はアフリカツメガエル卵母細胞
内で発現された。該受容体は、内在性シグナルトランス
ダクション成分と結合して、カルシウム活性化Cl-流を
発生させることができる。該Cl-流は、Hirata,Mらによ
りNature,349,pp.617（1991）に記載の方法を用いて、
電気生理学的測定により記録される。リガンドＳ−145
を用いてトロンボキサン受容体cDNAでトランスフェクシ
ョンしたCOS−１細胞膜について結合検査が実施された
（Hirata,M.ら，前出）。我々は、トロンボキサン受容
体cDNAでトランスフェクションしたヒト初期腎臓293細
胞及び膜におけるトロンボキサンアンタゴニストSQ−29
548のアフィニティ結合が大きく、最大結合が２〜3pmol
/mgタンパク質であることも明らかにした。この発現レ
ベルは、血小板膜におけるレベルの少なくとも５〜10倍
以上に相当する。トランスフェクション効率を10％とみ
なして細胞当たりのベースで換算すると、約106結合部
位／トランスフェクション細胞となった。これに対し、
血小板上に存在する部位は約1300である（Hourani,S.M.
O.ら，（1991）,Pharmacol.Rev.,43,pp.243）。 ノーザンブロット分析で、MEG−01細胞系、胎盤及び
肺内の2.8kbバンドの存在が明らかにされた。報告され
ている長い暴露時間（12日）及び検出可能シグナルを見
るために導入されたポリ（Ａ）＋RNAの量（20μｇ）に
基づいて推定すると、mRNAはおそらくあまり多くない部
類に入る。 相同スクリーニングによる別のエイコサノイド受容体
遺伝子の単離へのアプローチが、これらの受容体が一次
構造で相関しているという想定のもとに行われた（Sugi
moto,Y.ら，（1992）,JBC,267,pp.6463）。これらの受
容体はＧタンパク質型であるため、トランスメンブラン
領域及び細胞質ドメインに存在すると考えられる相同領
域が存在する。従って、プロスタグランジン受容体と相
関している種々の既知のＧタンパク質結合受容体は、相
同を有すると思われる所期の受容体タンパク質コーディ
ングDNAの領域、例えばトランスメンブラン領域に対す
るDNAプローブに利用し得る。 この受容体のトランスメンブラン５〜７領域の大部分
をコードする0.3kbトロンボキサン受容体cDNAフラグメ
ントを用いて、402アミノ酸受容体をコードする、以後E
P1と称する1.4kb cDNAクローン（EP1）を、ヒト赤白血
病細胞cDNAライブラリーから単離した。このタンパク質
は元々未知の「PGQ受容体」と呼ばれていたものである
が、以後はEP1受容体と称する。該タンパク質は２個の
潜在的Ｎ結合グリコシル化部位（Asn−８及びAsn−25）
を有し、第三の細胞内ループ及びカルボキシ末端と予測
される部分には、塩基性残基（主にアルギニン）及びセ
リン残基の量が極めて多い。 他の多くのＧタンパク質受容体と同様に、EP1受容体
は幾つかの共通の特徴を有する。第一に、推定上の細胞
外アミノ末端に２個の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位
（Asn−８及びAsn−25）が存在する。第二に、エキソフ
ェイシャル（exofacial）ループ１及び２内に保存シス
テイン残基が存在する。第三の細胞質ループは比較的大
きく（約70残基）、塩基性アミノ酸の数が極めて多い
（15Arg、3His）。実際、該タンパク質の非トランスメ
ンブランセグメント全体を通して、塩基性残基への大き
な偏りが見られる。Ｃ末端及び第三の細胞質ループ全体
を通して、複数のセリン残基と、タンパク質キナーゼホ
スホリル化部位となり得る部分とが存在する。EP1受容
体は、カチオンアミノ含有リガンドに結合する受容体の
特徴であるトランスメンブラン３内のアスパラギン酸残
基を含んでいないが、トランスメンブラン７内の総ての
エイコサノイド受容体内に存在する保存アルギニン（位
置338）を有する。この領域は、エイコサノイド受容体
の間で最も高度に保存されている。EP1受容体はヒトト
ロンボキサン受容体及びマウスEP3受容体に非常に近
い。該受容体はまた、同じ大きさ（402アミノ酸）を有
するβ３アドレナリン受容体に対してもある程度の相同
を有する。 本発明の新規のプロスタグランジン受容体は、受容体
活性を調節する化合物を選定するためのアッセイ操作で
使用するのに適している。本明細書中の受容体活性の調
節には受容体の阻害又は活性化が含まれ、また、受容体
活性の正常な調整作用をもたらすような、直接的又は間
接的作用も含まれる。受容体活性を調節する化合物とし
ては、アゴニスト、アンタゴニスト及び受容体活性の調
整に直接又は間接に作用する化合物が挙げられる。 本発明のプロスタグランジン受容体は、受容体モジュ
レーターを選定するためのアッセイ操作で使用すべく、
野生供給源及び組換え供給源の両方から得られる。プロ
スタグランジン受容体モジュレーターを選定するための
アッセイ操作は通常、本発明のプロスタグランジン受容
体と、推定上のプロスタグランジン受容体モジュレータ
ーを含む検査化合物又は試料とを含む。検査化合物又は
試料は、例えば、野生もしくは組換え型の精製受容体タ
ンパク質、野生もしくは組換え型の受容体産生細胞の継
代細胞フラクション、及び／又は野生もしくは組換え型
の受容体発現完全細胞上で直接検査し得る。検査化合物
又は試料は、既知の標識又は非標識受容体リガンドの存
在下又は不在下で受容体に加え得る。検査化合物又は試
料の調節活性は、例えば、検査化合物又は試料が受容体
に結合する能力、受容体を活性化する能力、受容体活性
を阻害する能力、受容体への別の化合物の結合を阻害す
る又は促進する能力を分析し、受容体の調整を修飾し、
又は細胞内活性を修飾することによって測定し得る。 EP1受容体活性のモジュレーターの選定は、EP1受容体
活性が関与する疾患状態の治療に有用である。別の化合
物が、受容体の活性を刺激又は阻害するために有用であ
り得る。これらの化合物は抗炎症剤及び解熱剤として有
用であり得る。この種の化合物は、EP1受容体の活性化
が細胞増殖、細胞悪性形質転換の誘起又は転移性腫瘍成
長を引き起こす疾病の治療に有用であり得、従って結腸
癌のような癌の予防及び／又は治療に有用であり得る。
EP1をコードとするDNA分子の単離及び精製は、EP1受容
体の組織分布の確立、並びにEP1受容体活性を調節する
化合物の選定方法の確立に有用であり得る。 以下の実施例は本発明を明らかにするためのものであ
り、本発明の範囲を限定するためのものではない。 実施例１ トロンボキサン受容体cDNAプローブの製造及びEP1cDNA
のクローニング ヒトトロンボキサン受容体cDNAフラグメントをPCRに
より逆転写胎盤完全DNAから単離した。Perkin Elmer
Cetus反復加熱装置で98℃−30秒;62℃−１分;72℃−１
分を40回繰り返して増幅するために、25pmolの上流プラ
イマー５′CTGTCCTTCCTGCTGAACACGGTCAGCGTG3′（配列
番号１）及び下流プライマー５′−GCGGCGGAACAGGATATA
CACC−３′（配列番号２）を、１μｇのcDNA、dNTP（20
0μＭ）及びVentポリメラーゼ（１単位、New England
Biolabs,Beverly,MA）と共に、50μｌ反応量（10mM
KCl/10mM（NH4）2SO4/20mMトリス−HCl（pH8.8）/2mM
MgSO4/0.1％（v/v）トリトンＸ−100/100μg/mlウシ血
清アルブミン）で加えた。312塩基対生成物（ヌクレオ
チド628−939、Hirataら、1991、前出）がアガロースゲ
ル電気泳動及びGene Clean精製（Biol01,La Jolla,C
A）で単離された。 λgt11ベクター中で構築したヒト赤白血病（HEL）細
胞cDNAライブラリーを、ストリンジェンシーの低い条件
下（30％ホルムアミド/5×SSPE/5×デンハート溶液/0.1
％SDS/100μg/ml音波処理サケ精子DNA）、42℃で一晩に
わたり、32P標識トロンボキサン受容体cDNAフラグメン
トでスクリーニングした。フィルターを0.1％SDS含有２
×SSCで室温で手短に洗浄し、次いで0.1％SDS含有１×S
SCを用いて55℃で洗浄した（２×30分）。一つの正相
（positive phase）クローン（λ−TxR1）をプラーク
精製し、DNAをプレート溶解物法で製造した（Sambrook
ら,1989 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,
第２版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spri
ng harbor,N.Y.）。 cDNAのサブクローニング及び配列決定 クローンλ−TxR1をEcoR Iで消化した結果、4.0kb、
1.7kb及び1.4kbの大きさの３個の挿入物を含んでいるこ
とが判明した。サザンブロット分析で、1.4kb挿入物の
みがトロンボキサン受容体cDNAプローブとハイブリダイ
ズすることが明らかにされた。Taqポリメラーゼ（Gene
ATAQシステム、Pharmacia）を用いて70℃で配列決定
すべく、1.4kb EcoR Iフラグメント（EP1）及び種々の
制限フラグメントをM13mp18及びM13mp19ベクター内にサ
ブクローニングした。DNAは、M13普遍プライマー又は既
知の配列から形成したプライマーを用いて、少なくとも
２回、両方の鎖について別々に完全に配列決定された。
EP1のヌクレオチド配列を表１に示す。コードされたタ
ンパク質のアミノ酸配列を表２に示す。1.4kbフラグメ
ント（EP1;第１図）は、配列決定の結果、ヒトトロンボ
キサン受容体cDNAと大きな配列相同を有することが判明
し、Ｇタンパク質結合受容体の特徴と推測されているヘ
プタヘリカル構造が明らかにされた。予測された相対分
子量41,858を有する402アミノ酸ポリペプチドを形成す
るであろう長い読取り枠（1206塩基対）が決定された。
開始コドンとされるATGは、翻訳開始のためのKozak共通
配列（Kozak,1989,J.Cell.Biol.,108,pp229−241）に適
合する。予想された開始コドンの60塩基対上流に枠内
（inframe）TGA停止コドンを含む74塩基対の５′非翻訳
配列が存在する。これらの配列には更に一つの枠外ATG
も、予想された開始点の直後に終結する48塩基対読取り
枠として存在する。EP1cDNAは、19残基の短いポリ
（Ａ）連鎖の19塩基対上流にポリアデニル化シグナルAA
TAAAを含む約112塩基対の極めて短い３′非翻訳領域を
含む。 実施例２ 発現ベクターの構築 1.4kb EcoR I挿入物をpcDNA1（Invitrogen）のEcoR
I部位にサブクローニングし、方向が正しいことをPst I
消化によって確認した。５′非翻訳領域並びに上流ATG
を除去するために、EP1をApa Iで開裂し、この1.25kb
Apa Iフラグメントを精製した。キナーゼ化オリグヌク
レオチド５′−CTAGCGGATCCCGCCATGAGCCCTTGCGGGCC−３
（配列番号５）及びオリゴヌクレオチド５′−CGCAAGGG
CTCATGGCGGATCCG−３′（配列番号６）をアニーリング
し、Apa Iフラグメントに連結した。連結後、試料をBam
H Iでの開裂にかけ、精製1.3kbバンドをBamH I消化pcDN
A1に連結した。末端変更cDNA及び方向をDNA配列決定に
よって確認した。 実施例３ 大腸菌発現ベクター内へのEP1cDNAのクローニング 非限定的具体例としてpETシリーズ（Novagen）のよう
な大腸菌発現ベクター内にEP1発現カセットをトランス
ファーして、大腸菌内で組換えEP1を産生する。pETベク
ターはEP1を、厳密に調節されたバクテリオファージT7
プロモーターの制御下におく。誘導lacプロモーターに
よって制御されるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体
コピーを含む大腸菌宿主内への該構築物のトランスファ
ーに次いで、適当なlac基質（IPTG）を培養物に加える
と、EP1の発現が誘発される。発現EP1のレベルを前述の
アッセイで測定する。 EP1に関する読取り枠全体をコードするcDNAを、pET
11aのNde I部位に挿入する。正の方向の構築物を配列解
析によって同定し、発現宿主株BL21の形質転換に使用す
る。次いで、形質転換体を用いて、EP1タンパク質を製
造するための培養物に接種する。培養物は、当業者に組
成が知られているM9又はZB培地で増殖させ得る。約OD
600＝1.5まで増殖した後、1mM IPTGを用いて37℃で３
時間にわたりEP1の発現を誘発する。これらの細胞に由
来する不溶性封入体フラクション中に、真のEP1酵素活
性が発見され得る。50mMトリス−HCl（pH8）及び100mM
ジチオトレイトールを含む緩衝液中の5Mグアニジン−HC
lで、封入体フラクションから可溶性EP1を抽出する。10
0倍容の25mM HEPES（pH7.5）、5mMジチオトレイトー
ル、10％スクロースに対する透析後に、前記抽出物から
活性EP1が得られる。 実施例４ アフリカツメガエル卵母細胞マイクロインジェクション
ベクターによるEP1mRNAのin vitro翻訳及び哺乳動物細
胞内での発現 EP1cDNA構築物をin vitro転写ベクター（pGEMシリー
ズ、Promega）に連結して、合成mRNAを製造する。 合成mRNAは、EP1mRNAをコードする二本鎖DNAをバクテ
リオファージプロモーター含有プラスミドベクター内に
クローニングし、クローン化EP1コーディングDNAを含む
プラスミドベクターを鎖状とし、プラスミドベクター上
のバクテリオファージプロモーターを特異的に認識する
バクテリオファージからDNA依存性RNAポリメラーゼを用
いてクローン化DNAをin vitro転写することにより、十
分な量で製造される。 バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼによっ
て認識されるバクテリオファージプロモーターを含むプ
ラスミドベクターは様々なものが存在し、非限定的具体
例としては、プラスミドpSP64、pSP65、pSP70、pSP71、
pSP72、pSP73、pGEM−3Z、pGEM−4Z、pGEM−3Zf、pGEM
−5Zf、pGEM−7Zf、pGEM−9Zf及びpGEM−11Zfが挙げら
れる。これら一連のプラスミドは総てPromegaから市販
されている。 EP1DNAのクローニングに適している、ベクター上の使
用可能な制限エンドヌクレアーゼクローニング部位のう
ちの一つ以上を使用して、EP1をコードする二本鎖DNAを
ベクター含有バクテリオファージプロモーター内に正確
な向きでクローニングする。連結したEP1DNAを有するベ
クターを用いて細菌を形質転換し、正確な向きのEP1DNA
を有するベクターの存在についてクローン単離体を分析
する。 正確な向きのEP1コーディングDNAを含むベクターが同
定され単離されたら、これをEP1転写単位よりも下流の
部位において、該単位を破損しないように制限エンドヌ
クレアーゼで開裂することにより線状化する。線状化プ
ラスミドを単離し、精製し、EP1mRNAのin vitro転写の
鋳型として使用する。 次いで鋳型DNAを、EP1mRNA形成DNA鋳型の転写を可能
にする反応混合物中で、バクテリオファージ特異的DNA
依存性RNAポリメラーゼと混合する。使用可能なバクテ
リオファージ特異的DNA依存性RNAポリメラーゼは幾つか
存在し、非限定的具体例としてT3、T7及びSP6 RNAポリ
メラーゼが挙げられる。次いで、合成EP1mRNAを単離
し、精製する。 mRNAの安定性を改善するために、５′末端キャップ構
造及び３′ポリＡテールを含むmRNAを合成すると有利で
あり得る。キャップ構造、すなわち７−メチルグアノシ
ンは、DNA鋳型との反応混合物に７−メチルグアノシン
を加えるだけでmRNAの５′末端に組込み得る。DNA依存
性RNAポリメラーゼは、mRNAの合成中にキャップ構造を
５′末端に組み込む。ポリＡテールは多くのcDNA中に天
然に存在するが、ポリＡテールをコードするDNA配列をD
NA鋳型の３′末端に挿入することにより、mRNAの３′末
端に簡単に付加できる。 単離し精製したEP1mRNAは、無細胞系、例えば非限定
的具体例としてウサギ網状赤血球溶解物及びコムギ胚芽
抽出物（どちらもPromega及びNew England Nuclearか
ら市販されている）を用いて、又は細胞ベースの系、例
えば非限定的具体例としてアフリカツメガエル卵母細胞
へのマイクロインジェクションを用いて翻訳する。好ま
しくいのはアフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロイ
ンジェクションである。 アフリカツメガエル卵母細胞に、EP1タンパク質の産
生に十分な量の合成EP1mRNAをマイクロインジェクショ
ンする。マイクロインジェクションにかけた卵母細胞を
インキュベートしてEP1mRNAの翻訳を生起させ、EP1タン
パク質を産生させる。 前記合成mRNAは標準的方法［Gurdon,J.B.及びWicken
s,M.D.,Methods in Enzymol.101:370−386（1983）］
でアフリカツメガエル卵母細胞（段階５〜６）内に注入
する。卵母細胞を採取し、後述のようにEP1発現につい
て分析する。 実施例５ アフリカツメガエル卵母細胞内でのpcDNA−EP1発現 標準的外科方法を用いてメス成体Xenopus laevisか
ら卵母細胞を採取した（Colman,A.,1984,Transription
and Translation−Ａ Practical Appraoch,IRL P
ress）。卵胞細胞を除去するために、Ca2+無含有ND96溶
液（NaCl 96mM、KCl 2mM、MgCl2 1mM、HEPES 5mM、
ピルビン酸Na 2.5mM、テオフィリン0.5mM、ゲンタマイ
シン 50mg/ml、＋1.8 CaCl2、pH7.6）中で新しく調製
したコラゲナーゼ（2mg/ml,タイプ2,Worthington Bioc
hemical Corp.,Freehold,NJ）で卵母細胞を２〜３時間
処理した。卵胞除去した段階５〜６の卵母細胞を選択
し、ND96溶液中に維持した。卵母細胞核に１〜5ngのpcD
NA−EP1又はpcDNA−EP1（Bam）を注入し、次いで18℃で
48時間インキュベートし、その後アゴニストを投与し
た。アゴニスト誘導Ca2+依存性Cl-流、又はCa2+特異的
発光タンパク質エクオリン（J.Blinks,Friday Harbor
Photoproteins,WA）注入卵母細胞における発光を測定
することにより、機能活性を決定した（Giladi及びSpin
del 1991 Biotechniques,10,pp744−747）。電気生理
学的アッセイのために、卵母細胞を0.5ml潅流チャンバ
内に配置し、Turbo TEC 01C増幅器（NPI Insrument
s,Germany）を用いて−60mVに電圧を固定した（3M CKl
を充填した抵抗0.5〜2.0MΩの微小電極を使用）。リガ
ンド含有溶液を潅流し、電流応答を記録した。光測定ア
ッセイのために、エクオリン導入卵母細胞（100ng/卵母
細胞）を0.4mlのND96を入れたキュベット内に個々に配
置し、リガンドの添加によって誘起した発光をBio−Orb
it 1251ルミノメーター（Fisher Sci.Ltd.）で記録し
た。 電気生理学的アッセイ及びエクリオン発光アッセイを
用いて、pcDNA−EP1注入卵母細胞内の機能活性を測定し
た。電気生理学的アッセイでは、１μＭ〜10mMのPGE2の
潅流の結果、pcDNA−EP1注入卵母細胞内に明らかな電流
応答が観察された。これは、このクローンが、ホスファ
チジルイノシトール/Ca2+シグナル経路に結合した機能
的EP1受容体をコードすることを示唆するものである
（第４図Ａ）。このような応答は、H2Oを注入した対照
卵母細胞には見られなかった。リガンドに誘発される細
胞内Ca2+の増加も、エクオリン導入卵母細胞内の発光に
よって直接示された（第４図Ｂ）。エクオリン発光アッ
セイで得られた用量応答依存性は、発現された受容体の
アゴニストとしてPGE2がPGF２αより強力であることを
意味するものであった（第４図Ｃ）。 実施例６ 哺乳動物発現ベクター内へのEP1cDNAのクローニング EP1cDNA発現カセットを、適当な制限エンドヌクREア
ーゼ部位で、強力な普遍的哺乳動物プロモーターを含む
下記のベクターに連結する:pBC12BI［Cullen,B.R.,Meth
ods in Enzymol.152:684−704,1988］、並びにpEE12
（CellTech EP 338,841号）及びその誘導体pSZ9016−
１及びp9019。p9019は、hCMVIEプロモーターと、ポリリ
ンカーと、SV40ポリＡエレメントとを含み、SV40初期プ
ロモーターによって操作されるジヒドロ葉酸レゼクター
ゼの突然変異遺伝子（mDHFR）（Simonsen,C.C.及びLevi
nson,A.D.Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:2495−2499［1
983］）からなる選択可能マーカー／増幅システムを有
する哺乳動物発現ベクターの構築を表す。SV40ポリアデ
ニル化配列を、pD5（Berker及びSharp,Nucl.Acid Res.
13:841−857［1985］）を鋳型として用いて、プライマ
ー13978−120及び139778−121により決定されるPCR反応
で形成する。得られた0.25Kb PCR生成物をCla I及びSp
e Iで消化し、同様に消化したpEE12の6.7Kbフラグメン
トに連結する。得られたプラスミドをBgl II及びSfi I
で消化して、SV40初期プロモーターの３′部分とGScDNA
とをベクターから切り離す。プラスミドpFR400（Simons
en,C.C.及びLevinson,A.D.,Proc.Natl.Sci.USA 80:249
5−2499［1983］）から分離した0.73Kb Sfi I−Xho II
フラグメントを前述の5.6Kbベクターに連結し、SV40初
期プロモーターを再構築し、mdHFR遺伝子を挿入する。
このプラスミドをp9019と名付ける。pSZ9016−１は、HI
V LTRがhuCMVIEプロモーターにとって代わっている以
外は、p9019と同じである。このベクターは、p9019をXb
a I及びMlu Iで消化してhuCMVIEプロモーターを除去す
ることにより構築される。残基−117〜＋80（HIV−１
LTRの部分を含むベクターpCD23内に存在する（Cullen,C
ell 46:973［1986］）のHIV LTRプロモーターを、生
成物の末端に５′側のMlu I及びSpe I制限部位を付加し
たオリグヌクレオチドプライマーを用いて、プラスミド
pCD23からPCR増幅する。Hind III及びXba I部位は３′
側に付加されている。得られた0.2kb PCR生成物を酵素
Mlu I及びXba Iで消化した後、フラグメントをアガロー
スゲルで精製し、プロモーターを含まない4.3Kb DNAフ
ラグメントに連結して、ベクターpSZ9016−１を形成す
る。 プロモーターに対して正しい向きにあるEP1cDNAを含
むカセットをプロモーターの適当な制限部位３′に連結
し、制限部位マッピング及び／又は配列決定によって同
定する。これらのcDNA発現ベクターを種々の宿主細胞、
例えば非限定的具体例としての［COS−７（ATCC＃CRL16
51）、CV−1tat［Sackevitzら,Science 238:1575（198
7）］,293,L（ATCC＃CRL6362）］に、標準的方法、例え
ば非限定的具体例として電気穿孔法又は化学的処理（カ
チオンリポソーム、DEAEデキストラン、リン酸カルシウ
ム）によって導入する。トランスフェクションした細胞
及び細胞培養抽出物を回収して、後述のようにEP1発現
について分析し得る。 哺乳動物過渡的発現に使用した総てのベクターは、EP
1を発現する安定な細胞系の確立に使用できる。発現ベ
クター内にクローニングした変更していないEP1cDNA構
築物は、宿主細胞を細胞内EP1タンパク質を作るように
プログラムすると推測される。トランスフェクション宿
主細胞の非限定的具体例としては、CV−１−Ｐ［Sackev
itzら,Science 238:1575（1987）］、tk−Ｌ［Wigler
ら,Cell 11:223（1977）］、NS/0及びdHFr−CHO［Kauf
man及びSharp,J.Mol.Biol.159:601（1982）］が挙げら
れる。 EP1cDNAを含む任意のベクターと、薬剤選択性プラス
ミド、例えば非限定的具体例としてG418、アミノグリコ
シドホスホトランスフェラーゼ、pLNCX［Miller,A.D.及
びRosman,G.J.,Biotech News 7:980−990（198
9）］；ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂホス
ホトランスフェアーゼ,pLG90［Gritz,L.及びDavies,J.,
GENE 25:179（1983）］、APRT、キサンチン−グアニ
ン、ホスホリボシル−トランスフェラーゼ、pMAM（Clon
tech）［Murrayら,Gene 31:233（1984）］との同時ト
ランスフェクションは、安定にトランスフェクションし
たクローンの選択を可能にする。EP1レベルは前述のア
ッセイによって定量する。 可能な限り高いレベルのEP1を合成する哺乳動物細胞
クローンを製造するために、増幅可能薬剤耐性マーカー
を含むベクター内にEP1cDNA構築物を連結する。これら
の構築物を細胞内に導入した後、プラスミドを含むクロ
ーンを適当な物質を用いて選択し、プラスミドのコピー
数が多い過剰発現クローンの単離を、前記物質の用量増
加の選択によって実施する。下記のシステムを使用す
る：突然変異DHFR遺伝子を含む9016又は9019プラスミド
［Simonsenら，前出］、DHFR−CHO細胞内にトランスフ
ェクションし、メトトレキサート中で選択；グルタミン
シンセターゼ遺伝子を含むpEE12プラスミド、NS/O細胞
内にトランスフェクションし、メチオニンスルホキシミ
ン中で選択（CellTech国際特許出願第2089/10404号）；
及びAPRT及びTK欠失Ｌ細胞内のチミジンキナーゼ遺伝子
［Colbere及びGaropin,F.,Proc.Natl.Acad.Sci.76:3755
（1979）］を含むpDLAT−３と同時トランスフェクショ
ンした9016又は他のCMVプロモーターベクター、APRT
（0.05mMアザセリン、0.1mMアデニン、４μg/mlアデノ
シン）中で選択し、HAT（100μＭヒポキサンチン、0.4
μＭアミノプテリン、16μＭチミジン）で増幅。 実施例７ COS−M6細胞内でのpcDNA−EP1発現及び［3H］PGE2結合
アッセイ DEAE−デキストラン方法を用いて、pcDNA−EP1プラス
ミドをCOS−M6細胞内にトランスフェクションした。細
胞を72時間培地に維持し、次いで回収し、窒素キャビテ
ーション（Freyら,1993）による細胞溶解後に、示差的
遠心分離（1000×ｇで10分間、次いで100,000×ｇで30
分間）にかけて膜を製造した。1mM EDTA、0.5M［3H］P
GE2（154Ci/mmol;DuPont−New England Nuclear）及
び100,000×ｇ膜フラクション由来タンパク質60〜100μ
ｇを含む10mMリン酸カリウム（pH6.0）中で、［3H］プ
ロスタグランジンE2（［3H］PGE2）結合アッセイを行っ
た。前述のように高速濾過で結合及び遊離放射性リガン
ドを分離する前に、室温で１時間インキュベーションを
実施した（Freyら,1993 Eur.J.Mol.Pharmacol.,244,pp
239−250）。フィルターに結合している残りの［3H］PG
E2を液体シンチレーション計数で定量した。特異的結合
は、１μＭ PGE2の存在下で測定した総ての結合と非特
異的結合との間の差として定義した。 PGE2を投与したpcDNA−EP1注入卵母細胞の細胞内カル
シウムの用量依存性増加を示すデータは、この受容体
が、サブタイピングされたプロスタグランジンＥ受容体
EP1であることを示唆するものであった。これを確認す
るために、pcDNA−EP1及びpcDNA−EP1（Bam）トランス
フェクションCOS−M6細胞から製造した膜を用いて
［3H］PGE2結合アッセイを実施した。［3H］PGE2はこれ
らの細胞膜に特異的に結合したが、pcDNAのみでトラン
スフェクションしたCOS M6細胞から製造した膜には結
合しなかった。分散分析は、pcDNA−EP1トランスフェク
ションCOS−M6細胞膜への［3H］PGE2の特異的結合が大
きな親和性を有し、飽和可能であることを明らかにし
た。平衡解離係数（KD）は1nM、特異的結合部位の最大
数（Bmax）は約360fmol/mgタンパク質である。また、プ
ロスタグランジンは、EP1サブタイプで競合に予想され
る活性順序、PGE2＞PGE1＞PGF２α＞＞PGD2で、［3H］P
GE2の特異的結合に関して競合した（第４図）。更に、
選択制EP1アンタゴニストAH6809及びSC19220は、約0.5
μＭ及び6.7μＭのIC50値で［3H］PGE2特異的結合に関
して競合した。これは、平滑筋収縮アッセイ（Coleman
ら,1985 Br.J.Pharmacol.,85,pp.286P）で測定された
これらの化合物の能力と合致している。また、強力なEP
2アゴニストであるブタプロストは特異的結合部位で比
較的不活性であり、IC50値が50μＭであった。第４図参
照。これらの放射性リガンド結合データは、EP1受容体
が、サブタイピングされたEP1の特性を有することを示
す。 実施例８ 昆虫細胞内発現のためのバキュロウイルス発現ベクター
内へのEP1cDNAのクローニング AcNPVウイルスのゲノムに由来するバキュロウイルス
ベクターを、Sf9系昆虫細胞（ATCC CRL＃1711）内でcD
NAを高レベル発現させるように設計する。EP1cDNAを発
現する組換えバキュロウイルスを以下の標準的方法で製
造する（In Vitrogen Maxbac Manual）:EP1cDNA構築
物を種々のバキュロウイルストランスファーベクター、
例えばpAC360及びBlueBacベクター（In Vitrogen）内
のポリヘドリンプロモーターの下流に連結する。バキュ
ロウイルストランスファーベクター及び線状化AcNPVゲ
ノムDNA［Kitts,P.A.,Nuc.Acid Res.18:5667（199
0）］のSf9細胞内への同時トランスフェクションに次ぐ
相同組換えによって、組換えバキュロウイルスを形成す
る。組換えpAC360ウイルスは感染細胞内の封入体の不在
によって同定され（Summers,M.D.及びSmith,G.E.,Texas
Agriculture Exp.Station Bulletin No.1555）、
組換えpBlueBacウイルスはβ−ガラクトシダーゼ発現に
基づいて同定される（Vialardら,1990,J.Virol.,64,pp3
7−50）。プラーク精製及びEP1組換えバキュロウイルス
でのsf9細胞の感染後に、前述のアッセイでEP1発現を測
定する。 EP1に関する読取り枠全体をコードするcDNAをpBlueBa
c IIのBamH I部位に挿入する。ポリヘドリンプロモータ
ーに対して正の向きにある構築物を配列決定によって同
定し、線状AcNPVマイルドタイプDNAの存在下でSf9細胞
をトランスフェクションするために使用する。 真正の活性EP1は、感染細胞の膜に結合している。膜
調製物を標準的方法で感染細胞から製造する。 実施例９ 酵母発現ベクター内へのEP1cDNAのクローニング 外来性タンパク質の細胞内発現を制御するように設計
した発現ベクター内に最適EP1cDNA構築物を挿入した
後、酵母S.cerevisiae内で組換えEP1を産生する。細胞
内発現のために、EmBLyex4等のようなベクターをEP1シ
ストロンに連結する［Rinas,U.ら,Biotechnology 8:54
3−545（1990）;Horowitz B.ら,J.Biol.Chem.265:4189
−4192（1989）］。発現されたEP1のレベルは前述のア
ッセイで測定する。 実施例10 組換えEP1の精製 組換え技術によって製造したEP1は、抗体アフィニテ
ィクロマトグラフィーによって精製し得る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との間で共有結合
を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルで予め活性化したゲル支持体であるAffigel−10（Bio
rad）に抗EP1抗体を加えることによって、EP1抗体アフ
ィニティカラムを形成する。抗体はスペーサーアームと
のアミド結合を介してゲルに結合する。次いで、残りの
活性化エステルを1MエタノールアミンHCl（pH8）で失活
する。カラムを水及び0.23MグリシンHCl（pH2.6）で順
次洗浄して、非結合抗体又は外来タンパク質を除去す
る。次いでカラムを、適当な膜可溶化剤、例えば洗剤と
共にリン酸塩緩衝食塩水（pH7.3）中で平衡化し、可溶
化EP1もしくはEP1サブユニットを含む細胞培養上清又は
細胞抽出物をカラムにゆっくり通す。次いでカラムを光
学密度（A280）がバックグラウンドに低下するまでリン
酸塩緩衝食塩水及び洗剤で洗浄し、その後タンパク質を
0.23Mグリシン−HCl（pH2.6）及び洗剤で溶離する。次
いで、精製したEP1タンパク質をリン酸塩緩衝食塩水に
対して透析する。
タグランジンＥ受容体との相互作用を介して発揮され
る。EP受容体には３つのサブタイプ、EP1、EP2及びEP3
がある（Colemanら,1989の総説参照）。これら３つのサ
ブタイプはいずれもPGE2に対して大きな親和性を示す
が、種々のアゴニスト及びアンタゴニストに対する各サ
ブタイプの親和性には差異が見られ、その作用はそれぞ
れ異なる二次形質導入メカニズムを介して発揮される。
例えば、EP1受容体の活性化はIP3及び細胞内カルシウム
の増加に関連しており、EP2受容体の活性化は細胞内環
状AMPを増加させ、EP3受容体の活性化は細胞内環状AMP
を減少させ、次いで細胞内カルシウムを増加させる。こ
れまでにクローニングされたこの種のものは、マウスEP
2（Hondaら,1993）並びにマウスEP３α及びEP３β（Sug
imotoら,1992;Sugimotoら,1993）サブタイプだけであ
る。EP1受容体は通常、ヒト及び他の動物の小腸、腎
臓、胃、筋肉、目、子宮及び気管を含む広範な細胞上に
存在する。EP1受容体タンパク質がプロスタグランジン
と結合すると、細胞内カルシウムの濃度が増加する。組
織はこのシグナルに基づいて、例えば筋肉収縮により応
答する。 発明の概要 EP1と称する新規のプロスタグランジン受容体タンパ
ク質がヒト細胞から同定された。完全長EP1タンパク質
をコードするDNA分子を単離し、精製し、ヌクレオチド
配列を決定した。EP1をコードするDNAを発現ベクター内
にクローニングし、これらの発現ベクターを組換え宿主
細胞内に導入すると、組換え宿主細胞が機能的EP1受容
体タンパク質を発現した。これらの新規のEP1タンパク
質、EP1をコードするDNA、発現ベクター及び組換えEP1
を発現する組換え宿主細胞は、EP1受容体活性のモジュ
レーターの選定に有用である。 組換えEP1発現宿主細胞を使用するEP1受容体モジュレ
ーターの同定方法も開示する。EP1活性モジュレーター
は、プロスタグランジン関連の疾患の治療及びEP1受容
体に対するプロスタグランジンの作用の調節に有用であ
る。 図面の簡単な説明 第１図は、EP1受容体タンパク質をコードするDNAの完
全配列を示している。 第２図は、EP1受容体タンパク質の推定アミノ酸完全
配列を示している。 第３図Ａ及び第３図Ｂは、pcDNA−EP1トランスフェク
ションCOS−M6膜への［3H］PGE2結合の競合を示してい
る。［3H］PGE2結合アッセイは、第３図A:0.03nM〜10μ
Ｍ PGE2（△）,PGE1（■）,PGE２α（□）,PGD
2（●）、第３図B:3nM〜100μＭ AH6809（○）,SC1922
0（▲）及びButaprost（◇）の存在下で、「方法」の説
明に記載のように実施した。Butaprost及びAH6809はMil
es Inc.及びGlaxo Group Research Ltd.の好意によ
るものである。 第４図Ａ〜第４図Ｅは、アフリカツメガエル卵母細胞
内でのプロスタグランジンE2受容体の発現を示してい
る。第４図A:1μＭのPGE2の浴潅流（bath perfusion）
で生起した内向Ca2依存Cl-流（下方への偏位として示さ
れる）。卵母細胞に5ngのpcDNA−EP1（Bam）を注入し、
−60mVで電圧クランプした。第４図Ｂ〜D:エクオリンを
導入した卵母細胞内でのPGE2誘発光応答。エクオリン発
光の強度は相対単位で示されており、バックグラウンド
発光は典型的には0.5〜0.7単位であった。PGE2は各実験
毎に示されている最終濃度で10秒の時点で記録キュベッ
ト内に注入した。第４図E:光応答を種々の濃度のPGE2及
びPGF２αで誘起した。各縦グラフは、４個のドナーに
由来する10〜15個の卵母細胞のデータの平均値±s.e.m.
を示している。データは、１μＭのPGE2を使用した時に
観察された応答に対する百分率で表されている。 発明の詳細な説明 本発明は、EP1とここに命名する新規のプロスタグラ
ンジン受容体をコードするcDNAに関する。本発明は、組
換え発現プラスミド内に含まれているクローン化EP1コ
ーディングDNAを発現する組換え宿主細胞にも関する。
本発明は、EP1受容体活性を調節する物質のスクリーニ
ング方法にも関する。本発明のDNAは、EP1産生細胞から
単離される。本明細書で使用するEP1という用語は、プ
ロスタグランジン分子に特異的に結合できるＧタンパク
質結合受容体を意味する。本発明は、EP1産生細胞から
単離され、やはりEP1と称する特定のプロスタグランジ
ン受容体タンパク質にも関する。本明細書で使用するEP
1受容体タンパク質という用語は、プロスタグランジン
分子に特異的に結合できるＧタンパク質結合型受容体を
意味する。 EP1を産生することができる哺乳動物細胞の非限定的
具体例としては、小腸、腎臓、胃、筋肉、目、子宮及び
気管に由来する細胞が挙げられる。EP1を産生する形質
転換哺乳動物細胞系の非限定的具体例としては、HEL細
胞が挙げられる。本発明のために好ましい細胞は例えば
ヒト正常腎臓細胞であり、最も好ましい細胞はヒト赤白
血病細胞である。 他の細胞及び細胞系もEP1cDNAの単離に使用するのに
適当であり得る。適当な細胞の選択は、細胞表面のEP1
のスクリーニングによって実施し得る。EP1活性検出方
法は当業者によく知られており（ ）、受容体に特異的
な放射性標識リガンドの結合を測定する。このアッセイ
でEP1活性を示す細胞は、EP1cDNAの単離に適当であり得
る。 EP1cDNAのクローニングには、種々の方法のうちの任
意のものを使用し得る。これらの方法の非限定的具体例
としては、適当な発現ベクター系内でEP1含有cDNAライ
ブラリーを構築した後、EP1cDNAを直接機能発現させる
方法が挙げられる。別の方法として、バクテリオファー
ジ又はプラスミドシャトルベクター内で構築したEP1含
有cDNAライブラリーを、EP1タンパク質のアミノ酸配列
から設計した標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリ
ーニングする方法もある。好ましい方法は、バクテリオ
ファージ又はプラスミドシャトルベクター内で構築した
EP1含有cDNAライブラリーを、EP1タンパク質をコードす
る部分的cDNAでスクリーニングすることからなる。前記
部分的cDNAは、プロスタグランジンEP1受容体と相関し
ている別のＧタンパク質結合受容体について知られてい
るアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライマー
を設計して、EP1DNAフラグメントの特異的PCR増幅を行
うことにより得る。 当業者には容易に理解されるように、別の種類のライ
ブラリー、並びに別の細胞もしくは細胞種類から構築し
たライブラリーも、EP1をコードするDNAの単離に有用で
あり得る。別の種類のライブラリーの非限定的具体例と
しては、ヒト赤白血病細胞以外の細胞又は細胞系に由来
するcDNAライブラリー、及びゲノムDANライブラリーが
挙げられる。 当業者には明らかなように、適当なcDNAライブラリー
は、EP1活性を有する細胞又は細胞系から製造し得る。E
P1cDNAを単離するためのcDNAライブラリーの製造で使用
する細胞又は細胞系の選択は、本発明で使用する前述の
公知の標識リガンド結合アッセイを用いて、事前に細胞
結合EP1活性を測定することにより実施し得る。 cDNAライブラリーの製造は、当業者によく知られてい
る標準的方法で実施できる。よく知られているcDNAライ
ブラリー構築方法は、例えばManiatis,T.,Fritsch,E.
F.,Sambrook,J.,Molecular Cloning:A Laboratory M
anual（Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spri
ng Harbor,New York,1982）に記載されている。 これも当業者には明らかであろうが、EP1をコードす
るDNAは適当なゲノムDNAライブラリーからも単離し得
る。 ゲノムDNAライブラリーの構築は、当業者によく知ら
れている標準的方法で実施できる。よく知られているDN
Aライブラリー構築方法は、例えばManiatisら，前出に
記載されている。 好ましい方法のいずれかによってEP1遺伝子をクロー
ニングするためには、EP1又は相同タンパク質のアミノ
酸配列又はDNA配列が必要である。そのためには、EP1タ
ンパク質又は相同タンパク質を精製し、自動配列決定器
で部分的アミノ酸配列を決定し得る。完全なアミノ酸配
列を決定する必要はないが、部分的EP1DNAフラグメント
のPCR増幅のためには、アミノ酸６〜８個の二つの領域
の直鎖配列を決定するとよい。 適当なアミノ酸配列が同定されたら、これらをコード
することができるDNA配列を合成する。遺伝子コードは
縮重であるため、特定のアミノ酸をコードするためには
１個以上のコドンを使用し得、従ってアミノ酸配列は、
一組の類似のDNAオリゴヌクレオチドのうち任意のもの
でコードできる。前記一組のDNAオリゴヌクレオチドの
うち一つだけがEP1配列と同じであるが、その組の残り
も不適性状態のDNAオリゴヌクレオチドの存在下でもEP1
DNAにハイブリダイズすることができる。不適性DNAオリ
ゴヌクレオチドでも、EP1をコードするDNAの同定及び単
離を可能にするのに十分な程度にEP1DNAにハイブリダイ
ズし得る。 好ましい方法のいずれかを用いて、ポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）ベースの技術及びcDNAライブラリースクリ
ーニングを使用する２段階方法で、EP1をコードするcDN
Aクローンを単離する。第１段階では、精製EP1又は相同
タンパク質からのNH2末端及び内部アミノ酸配列情報を
用いて、EP1特異的DNAフラグメントの増幅のための縮重
オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。第２段階で
は、前記フラグメントをクローニングして、ヒト赤白血
病細胞由来のcDNAライブラリーから完全長cDNAを単離す
るためのプローブとして使用する。 EP1をコードするほぼ完全長のcDNAの配列を表１に示
し、これをクローンEP1と名付けた。クローン化cDNAに
基づくEP1の推定アミノ酸配列を表２に示す。決定され
たcDNA配列を調べると、アミノ酸402個のタンパク質を
コードする単一の大きな読取り枠の存在が明らかにな
る。 前述の方法で得たクローン化EP1cDNAは、組換えEP1を
産生するために、適当なプロモーターと他の適当な転写
調節エレメントとを含む発現ベクター内への分子クロー
ニングにより組換え的に発現し、原核又は真核宿主細胞
内にトランスファーし得る。この種の操作の方法は、前
出のManiatisらの文献に記載されており、当業者によく
知られている。 本明細書では、発現ベクターは、クローン化DNAの転
写と、適当な宿主内で対応するmRNAの翻訳とに必要なDN
A配列であると定義される。この種のベクターは、種々
の宿主、例えば細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞及び動
物細胞内で真核生物DNAを発現させるのに使用し得る。 特異的に設計したベクターは、細菌−酵母間又は細菌
−動物細胞間のような宿主間のDNAシャトリングを可能
にする。適当に構築した発現ベクターは、宿主細胞内で
の自立複製のための複製起点と、選択可能マーカーと、
限定数の有用な制限酵素部位と、高コピー数の可能性
と、活性プロモーターとを含んでいなければならない。
プロモーターは、RNAポリメラーゼをDNAに結合させてRN
A合成を開始させるDNA配列であると定義される。強力な
プロモーターは、mRNAを高頻度で開始させるプロモータ
ーである。発現ベクターの非限定的具体例としては、ク
ローニングベクター、修飾クローニングベクター、特異
的に設計したプラスミド又はウイルスが挙げられる。 哺乳動物細胞内で組換えEP1を発現するためには種々
の哺乳動物発現ベクターを使用し得る。組換えEP1の発
現に適当であり得る市販の哺乳動物発現ベクターの非限
定的具体例としては、pMC1neo（Stratagene）、pXT1（S
tratagene）、pSG5（Stratagene）、pcDNAI、pcDNAIamp
（Invitrogen）、EBO−pSV2−neo（ATCC 37593）、pBP
V−１（８−２）（ATCC 37110）、pdBPV−MMTneo（342
−12）（ATCC 37224）、pRSVgpt（ATCC 37199）、pRS
Vneo（ATCC 37198）、pSV2−dhfr（ATCC 37146）、pU
CTag（ATCC 37460）及びIZD35（ATCC 37565）が挙げ
られる。 EP1をコードするDNAは、宿主細胞内での発現のために
発現ベクター内にクローニングしてもよい。宿主細胞は
原核細胞又は真核細胞であり得、非限定的具体例として
は細菌、酵母、哺乳動物細胞、例えばヒト、ウシ、ブ
タ、サル及び齧菌類の細胞系、並びに昆虫細胞、例えば
ショウジョウバエ由来細胞系が挙げられる。適当であり
得る市販の哺乳動物由来細胞系の非限定的具体例として
は、CV−１（ATCC CCL 70）、COS−１（ATCC CRL 1
650）、COS−７（ATCC CRL 1651）、CHO−K1（ATCC
CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92）、NIH/3T3（ATCC CR
L 1658）、HeLa（ATCC CCL ２）、C127I（ATCCCCRL
1616）、BS−Ｃ−１（ATCC CCL 26）及びMRC−５
（ATCC CCL 171）が挙げられる。 発現ベクターは、非限定的具体例として例えば形質転
換、トランスフェクション、プロトプラスト融合法及び
電気穿孔法のような種々の方法のいずれかを用いて、宿
主細胞内に導入し得る。発現ベクター含有細胞を個々に
分析して、その細胞がEP1タンパク質を産生するか否か
を決定する。EP1発現細胞の同定は、幾つかの方法、例
えば非限定的具体例として抗EP1抗体に対する免疫学的
反応性、及び宿主細胞結合EP1活性の存在等により実施
し得る。 EP1DNAの発現は、in vitroで製造した合成mRNAを用
いて実施してもよい。合成mRNAは、種々の無細胞系、非
限定的具体例として例えばコムギ胚芽抽出物及び網状赤
血球抽出物中で効率的に翻訳できると共に、細胞ベース
の系、非限定的具体例として例えばカエル卵母細胞内へ
のマイクロインジェクションでも効率的に翻訳できる。
好ましいのはカエル卵母細胞へのマイクロインジェクシ
ョンである。 受容体活性及び／又はEP1タンパク質を最適レベルに
するEP1cDNA配列を決定するために、例えば下記のよう
なEP1cDNA分子を構築し得る:EP1cDNAの完全長読取り
枠、並びに受容体タンパク質の特定ドメインのみもしく
は該タンパク質の再構成ドメイン（rearranged domai
n）をコードするcDNAの一部を含む種々の構築物。総て
の構築物は、EP1cDNAの５′及び／又は３′非翻訳領域
を全く含まないか、総て含むか、又は一部含むように設
計し得る。EP1活性及びタンパク質発現レベルは、これ
らの構築物を単独で又は組合わせて適当な宿主細胞内に
導入した後で決定し得る。過渡アッセイ（transient a
ssay）での最適発現を生起させるEP1cDNAカセットの決
定に次いで、このEP1cDNA構築物を種々の発現ベクター
（組換えウイルスを含む）、例えば哺乳動物細胞、植物
細胞、昆虫細胞、卵母細胞、大腸菌及び酵母細胞用の発
現ベクターにトランスファーする。 哺乳動物細胞トランスフェクタントを、EP1受容体活
性レベル及びEP1タンパク質濃度の両方について、下記
の方法でアッセイする。EP1受容体活性の測定では、標
識リガンドを細胞に直接導入し、EP1発現細胞へのリガ
ンドの特異的結合の量を決定する。受容体活性に関する
結合アッセイは当業者に公知である（Freyら,1993,Eur.
J.Pharmacol.,244,pp239−250）。 宿主細胞内のEP1タンパク質濃度は、種々の方法、例
えば非限定的具体例としてイムノアフィニティ及び／又
はリガンドアフィニティ法で定量する。EP1特異的アフ
ィニティビーズ又はEP1特異的抗体を用いて、35S−メチ
オニン標識又は非標識EP1タンパク質を単離する。標識E
P1タンパク質はSDS−PAGEで分析する。非標識EP1タンパ
ク質は、EP1特異的抗体を用いて、ウエスタンブロッテ
ィング、ELISA又はRIAアッセイで検出する。 宿主細胞内でのEP1の発現後、EP1特異的リガンドに結
合することができる活性形態のEP1を得るべく、EP1タン
パク質を回収し得る。使用し得るEP1精製操作は幾つか
存在する。組換えEP1は、塩分別、イオン交換クロマト
グラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキ
シルアパタイト吸収クロマトグラフィー及び疎水性相互
作用クロマトグラフィーを単独で又は様々に組合わせて
使用することにより、細胞溶解物及び抽出物から、又は
ならし培養培地から精製し得る。 また、組換えEP1は、完全長発生期EP1又はEP1のポリ
ペプチドフラグメントに特異的なモノクローナル又はポ
リクローナル抗体を用いて形成したイムノアフィニティ
カラムの使用により、別の細胞タンパク質と分離する。 EP1に対する単一特異性抗体は、EP1と反応する抗体を
含む哺乳動物抗血清から精製するか、又はKohler及びMi
lstein,Nature 256:495−497（1975）に記載の方法を
用いて、EP1と反応するモノクローナル抗体として製造
する。本明細書中の単一特異性抗体は、EP1に対して均
一結合特性を示す単一抗体種又は多重抗体種であると定
義される。本明細書で使用する均一結合という用語は、
抗体種が特定の抗原又はエピトープ、例えば前述のよう
にEP1と結合した抗原又はエピトープに結合する能力を
意味する。EP1特異的抗体は、マウス、ラット、テンジ
クネズミ、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物を、免疫
アジュバントを用いて又は用いずに、適当な濃度のEP1
で免疫感作することにより形成する。 最初の免疫感作の前に免疫前血清を採取する。各動物
に、約0.1μｇ〜約1000μｇのEP1を、許容し得る免疫ア
ジュバントと組合わせて投与する。許容し得るアジュバ
ントの非限定的具体例としては、フロイント完全アジュ
バント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン沈
降物、Corynebacterium parvum含有油中水滴エマルジ
ョン及びtRNAが挙げられる。最初の免疫感作は、好まし
くはフロイント完全アジュバント中の酵素を皮下（S
C）、腹腔内（IP）又はこれら両方の経路で複数の部位
に投与することによって実施した。各動物の採血を一定
の時間間隔、好ましくは１週間おきに行い、抗体力価を
測定した。動物には、最初の免疫感作後に、ブースター
注射をしてもよく、又はしなくてもよい。ブースター注
射をする動物には通常、フロイント不完全アジュバント
中の同量のEP1を同一経路で投与する。ブースター注射
は、最大力価が得られるまで約３週間の間隔で行った。
各ブースター免疫感作から約７日後、又は単一免疫感作
から約１週間後に動物の採血を行い、血清を回収し、ア
リコートを約−20℃で貯蔵した。 近交系マウス、好ましくはBalb/cをEP1で免疫感作す
ることにより、EP1に反応するモノクローナル抗体（mA
b）を製造する。マウスは、IP又はSC経路により、同量
の前述のような許容し得るアジュバントに混入した約0.
5mlの緩衝液又は食塩水中の約１μｇ〜約100μｇ、好ま
しくは約10μｇのEP1で免疫感作する。好ましいアジュ
バントはフロイント完全アジュバントである。マウスは
０日目に最初の免疫感作を行い、約３〜約30週間休息さ
せる。免疫マウスに、リン酸緩衝食塩水のような緩衝溶
液中約１〜約100μｇのEP1のブースター免疫を静脈内
（IV）経路で一回以上行う。抗体陽性マウスのリンパ
球、好ましくは脾臓リンパ球を、当業者に公知の標準的
方法で免疫マウスから脾臓を除去することによって得
る。脾臓リンパ球を、安定なハイブリドーマを形成させ
る条件下で、適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞と
混合して、ハイブリドーマ細胞を形成する。融合相手の
非限定的具体例としては、マウス骨髄腫P3/NS1/Ag4−1;
MPC−11;S−194及びSp 2/0が挙げられる。好ましいの
はSp 2/0である。抗体産生細胞及び骨髄腫細胞を分子
量約1000のポリエチレングリコール中約30％〜約50％の
濃度で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞を、当
業者に公知の方法で、ヒポキサンチン、チミジン及びア
ミノプテリン添加ダルベッコ改質イーグル培地（DMEM）
中で増殖させることにより選択する。約14日目、18日目
及び21日目に増殖陽性ウェルから上清を回収し、EP1を
抗原として用いて、固相イムノラジオアッセイ（SPIR
A）のようなイムノアッセイで抗体産生に関するスクリ
ーニングを行う。培養液をOuchterlony沈降アッセイで
も検査して、mAbのイソタイプを調べる。抗体陽性ウェ
ル由来のハイブリドーマ細胞を、Soft Agar Techniqu
es,Tissue Culture Methods and Applications,Kru
se及びPaterson編,Academic Press,1973に記載のMacPh
ersonの軟寒天法のような方法によってクローニングす
る。 マウス当たり約0.5mlのプリスタンで感作したBalb/c
マウスに、約２×106〜約６×106のハイブリドーマ細胞
を感作処理の約４日後に注入することにより、モノクロ
ーナル抗体をin vivoで産生する。細胞トランスファー
の約８〜12日後に腹水を採取し、モノクローナル抗体を
当業者に公知の方法で精製する。 十分な量の特異的mAbを得るために、ハイブリドーマ
を約２％のウシ胎児血清を含むDMEM培地で増殖させるこ
とにより、抗EP1mAbをin vitroで製造する。mAbは当業
者に公知の方法で精製する。 腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を、種々の
血清学的又は免疫学的アッセイ、例えば非限定的具体例
として、沈降、受動凝集、酵素結合イムノソルベント抗
体（ELISA）法及びラジオイムノアッセイ（RIA）法で測
定する。類似のアッセイを使用して、体液又は組織及び
細胞抽出物中のEP1の存在を検出する。 当業者には明らかなように、単一特異性抗体を産生す
るための前述の方法は、EP1ポリペプチドフラグメント
又は完全長EP1ポリペプチドに特異的な抗体の産生に使
用し得る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との間で共有結合
を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルで予備活性化したゲル支持体であるAffgel−10（Bior
ad）に抗体を加えることによりEP1抗体アフィニティカ
ラムを形成する。抗体はスペーサーアームとのアミド結
合を介してゲルに結合する。次いで、残りの活性化エス
テルを1MエタノールアミンHCl（pH8）で失活させる。カ
ラムを水及び0.23MグリシンHCl（pH2.6）で順次洗浄し
て、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。次いで
カラムをリン酸塩緩衝食塩水（pH7.3）中で平衡化し、E
P1又はEP1フラグメントを含む細胞培養上清又は細胞抽
出物をゆっくりとカラムに通す。次いで、カラムを、光
学密度（A280）がバックグラウンドに低下するまでリン
酸塩緩衝食塩水で洗浄し、その後タンパク質を0.23Mグ
リシン−HCl（pH2.6）で溶離する。次いで精製EP1タン
パク質をリン酸塩緩衝食塩水に対して透析する。 本発明のプロスタグランジン受容体をコードするDNA
を単離に適した方法の一つは、別のＧタンパク質結合受
容体から得たアミノ酸及び／又はDNA配列情報を使用す
ることからなる。別のプロスタグランジン受容体はＧタ
ンパク質結合であることが知られているため、トランス
メンブラン及び／又は細胞質ドメインといったような特
定の領域又はドメインは、新規の受容体を単離するため
のプローブを形成するのに十分な程度の相同を有すると
予想される。 プロスタグランジン及びロイコトリエンは、結合した
Ｇタンパク質結合受容体を介して自己のシグナルを形質
導入することが知られている。種々の組織中に存在する
異なるPGH2/トロンボキサン、A2、PGI2、PGE2、PGD2、P
GF２α、LTB4及びLTD4受容体は文献に記述されている。
これらの受容体のうちの一部は可溶化され、部分的に精
製され（Dutta−Roy,A.K.ら，（1987）JBC,262,pp.1268
5;Tsai,A.L.ら，（1989）,JBC,264,pp61;168−Watawab
e,T.ら，（1990）,JBC,265,pp.21237）、ヒト血小板TXA
2受容体は明らかな均質性を示すまで精製された（Ushik
ubi,F.ら，（1989）,JBC,264,pp.16496）。精製トロン
ボキサン受容体は、SDS−ポリアクリルアミドゲル上で
約57kDaを中心とする極めて広いバンドを示した。部分
的配列情報を得るのに十分なタンパク質が得られた。 オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト巨核球細
胞系（MEG−01）cDNAライブラリーがスクリーニングさ
れた（Hirata,M.ら，（1991）,Nature,349,pp.617）。
部分長cDNAクローンが得られた。配列決定の結果、該cD
NAクローンは、推定上のＧタンパク質結合受容体のＣ末
端側の半分をコードすることが判明した。このクローン
を標識し、ヒト胎盤ライブラリーのスクリーニングに使
用した。一つの完全長（約2.9kb）クローンは、５′及
び３′側にそれぞれ広い非コーディング領域と、Mr約37
000の343アミノ酸タンパク質をコードする1029塩基対の
読取り枠とを含んでいた。予測された配列は、推定上の
細胞外アミノ末端（29残基）内の二つのＮ結合グリコシ
ル化部位（Asn−４及びAsn−16）と、細胞外ループ１及
び２内の保存Cys残基（Cys−105及びCys−183）と、小
さいアミン含有リガンドを有する受容体にとって必須で
あることが知られているトランスメンブラン３内に存在
するAsp残基（Strosberg,A.D.（1991）,EJB,196,pp.1）
を除く、トランスメンブラン領域内の他の幾つかの保存
残基とを含む７個のトランスメンブランＧ結合受容体の
特性を示す。この配列は極めて短い予測された第三の細
胞内ループ（27残基）を有する。分子のこの部分はおそ
らく、ホスホリパーゼＣとの相互作用に関与し、その結
果カルシウムイオン流束を変化させるＧタンパク質（Gq
又はより大きいＧタンパク質）に結合し得る（Shenker,
A.ら，（1991）,JBC,266,pp.9309.173−Moran,N.ら，
（1990）,Circulation,Suppl.82,抄録1830）。 トロンボキサン受容体をコードする領域はＧ＋Ｃが極
めて多い（70％）。このcDNAを普通の変性条件下（94〜
95℃）でTaqポリメラーゼを用いて胎盤又は血小板逆転
写RNAから単離することは殆ど不可能であった。しかし
ながら、変性温度を98℃に変え且つVentポリメラーゼ
（New England Biolabs）を使用すると、完全cDNAの
増幅が可能になった。 トロンボキサン受容体はアフリカツメガエル卵母細胞
内で発現された。該受容体は、内在性シグナルトランス
ダクション成分と結合して、カルシウム活性化Cl-流を
発生させることができる。該Cl-流は、Hirata,Mらによ
りNature,349,pp.617（1991）に記載の方法を用いて、
電気生理学的測定により記録される。リガンドＳ−145
を用いてトロンボキサン受容体cDNAでトランスフェクシ
ョンしたCOS−１細胞膜について結合検査が実施された
（Hirata,M.ら，前出）。我々は、トロンボキサン受容
体cDNAでトランスフェクションしたヒト初期腎臓293細
胞及び膜におけるトロンボキサンアンタゴニストSQ−29
548のアフィニティ結合が大きく、最大結合が２〜3pmol
/mgタンパク質であることも明らかにした。この発現レ
ベルは、血小板膜におけるレベルの少なくとも５〜10倍
以上に相当する。トランスフェクション効率を10％とみ
なして細胞当たりのベースで換算すると、約106結合部
位／トランスフェクション細胞となった。これに対し、
血小板上に存在する部位は約1300である（Hourani,S.M.
O.ら，（1991）,Pharmacol.Rev.,43,pp.243）。 ノーザンブロット分析で、MEG−01細胞系、胎盤及び
肺内の2.8kbバンドの存在が明らかにされた。報告され
ている長い暴露時間（12日）及び検出可能シグナルを見
るために導入されたポリ（Ａ）＋RNAの量（20μｇ）に
基づいて推定すると、mRNAはおそらくあまり多くない部
類に入る。 相同スクリーニングによる別のエイコサノイド受容体
遺伝子の単離へのアプローチが、これらの受容体が一次
構造で相関しているという想定のもとに行われた（Sugi
moto,Y.ら，（1992）,JBC,267,pp.6463）。これらの受
容体はＧタンパク質型であるため、トランスメンブラン
領域及び細胞質ドメインに存在すると考えられる相同領
域が存在する。従って、プロスタグランジン受容体と相
関している種々の既知のＧタンパク質結合受容体は、相
同を有すると思われる所期の受容体タンパク質コーディ
ングDNAの領域、例えばトランスメンブラン領域に対す
るDNAプローブに利用し得る。 この受容体のトランスメンブラン５〜７領域の大部分
をコードする0.3kbトロンボキサン受容体cDNAフラグメ
ントを用いて、402アミノ酸受容体をコードする、以後E
P1と称する1.4kb cDNAクローン（EP1）を、ヒト赤白血
病細胞cDNAライブラリーから単離した。このタンパク質
は元々未知の「PGQ受容体」と呼ばれていたものである
が、以後はEP1受容体と称する。該タンパク質は２個の
潜在的Ｎ結合グリコシル化部位（Asn−８及びAsn−25）
を有し、第三の細胞内ループ及びカルボキシ末端と予測
される部分には、塩基性残基（主にアルギニン）及びセ
リン残基の量が極めて多い。 他の多くのＧタンパク質受容体と同様に、EP1受容体
は幾つかの共通の特徴を有する。第一に、推定上の細胞
外アミノ末端に２個の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位
（Asn−８及びAsn−25）が存在する。第二に、エキソフ
ェイシャル（exofacial）ループ１及び２内に保存シス
テイン残基が存在する。第三の細胞質ループは比較的大
きく（約70残基）、塩基性アミノ酸の数が極めて多い
（15Arg、3His）。実際、該タンパク質の非トランスメ
ンブランセグメント全体を通して、塩基性残基への大き
な偏りが見られる。Ｃ末端及び第三の細胞質ループ全体
を通して、複数のセリン残基と、タンパク質キナーゼホ
スホリル化部位となり得る部分とが存在する。EP1受容
体は、カチオンアミノ含有リガンドに結合する受容体の
特徴であるトランスメンブラン３内のアスパラギン酸残
基を含んでいないが、トランスメンブラン７内の総ての
エイコサノイド受容体内に存在する保存アルギニン（位
置338）を有する。この領域は、エイコサノイド受容体
の間で最も高度に保存されている。EP1受容体はヒトト
ロンボキサン受容体及びマウスEP3受容体に非常に近
い。該受容体はまた、同じ大きさ（402アミノ酸）を有
するβ３アドレナリン受容体に対してもある程度の相同
を有する。 本発明の新規のプロスタグランジン受容体は、受容体
活性を調節する化合物を選定するためのアッセイ操作で
使用するのに適している。本明細書中の受容体活性の調
節には受容体の阻害又は活性化が含まれ、また、受容体
活性の正常な調整作用をもたらすような、直接的又は間
接的作用も含まれる。受容体活性を調節する化合物とし
ては、アゴニスト、アンタゴニスト及び受容体活性の調
整に直接又は間接に作用する化合物が挙げられる。 本発明のプロスタグランジン受容体は、受容体モジュ
レーターを選定するためのアッセイ操作で使用すべく、
野生供給源及び組換え供給源の両方から得られる。プロ
スタグランジン受容体モジュレーターを選定するための
アッセイ操作は通常、本発明のプロスタグランジン受容
体と、推定上のプロスタグランジン受容体モジュレータ
ーを含む検査化合物又は試料とを含む。検査化合物又は
試料は、例えば、野生もしくは組換え型の精製受容体タ
ンパク質、野生もしくは組換え型の受容体産生細胞の継
代細胞フラクション、及び／又は野生もしくは組換え型
の受容体発現完全細胞上で直接検査し得る。検査化合物
又は試料は、既知の標識又は非標識受容体リガンドの存
在下又は不在下で受容体に加え得る。検査化合物又は試
料の調節活性は、例えば、検査化合物又は試料が受容体
に結合する能力、受容体を活性化する能力、受容体活性
を阻害する能力、受容体への別の化合物の結合を阻害す
る又は促進する能力を分析し、受容体の調整を修飾し、
又は細胞内活性を修飾することによって測定し得る。 EP1受容体活性のモジュレーターの選定は、EP1受容体
活性が関与する疾患状態の治療に有用である。別の化合
物が、受容体の活性を刺激又は阻害するために有用であ
り得る。これらの化合物は抗炎症剤及び解熱剤として有
用であり得る。この種の化合物は、EP1受容体の活性化
が細胞増殖、細胞悪性形質転換の誘起又は転移性腫瘍成
長を引き起こす疾病の治療に有用であり得、従って結腸
癌のような癌の予防及び／又は治療に有用であり得る。
EP1をコードとするDNA分子の単離及び精製は、EP1受容
体の組織分布の確立、並びにEP1受容体活性を調節する
化合物の選定方法の確立に有用であり得る。 以下の実施例は本発明を明らかにするためのものであ
り、本発明の範囲を限定するためのものではない。 実施例１ トロンボキサン受容体cDNAプローブの製造及びEP1cDNA
のクローニング ヒトトロンボキサン受容体cDNAフラグメントをPCRに
より逆転写胎盤完全DNAから単離した。Perkin Elmer
Cetus反復加熱装置で98℃−30秒;62℃−１分;72℃−１
分を40回繰り返して増幅するために、25pmolの上流プラ
イマー５′CTGTCCTTCCTGCTGAACACGGTCAGCGTG3′（配列
番号１）及び下流プライマー５′−GCGGCGGAACAGGATATA
CACC−３′（配列番号２）を、１μｇのcDNA、dNTP（20
0μＭ）及びVentポリメラーゼ（１単位、New England
Biolabs,Beverly,MA）と共に、50μｌ反応量（10mM
KCl/10mM（NH4）2SO4/20mMトリス−HCl（pH8.8）/2mM
MgSO4/0.1％（v/v）トリトンＸ−100/100μg/mlウシ血
清アルブミン）で加えた。312塩基対生成物（ヌクレオ
チド628−939、Hirataら、1991、前出）がアガロースゲ
ル電気泳動及びGene Clean精製（Biol01,La Jolla,C
A）で単離された。 λgt11ベクター中で構築したヒト赤白血病（HEL）細
胞cDNAライブラリーを、ストリンジェンシーの低い条件
下（30％ホルムアミド/5×SSPE/5×デンハート溶液/0.1
％SDS/100μg/ml音波処理サケ精子DNA）、42℃で一晩に
わたり、32P標識トロンボキサン受容体cDNAフラグメン
トでスクリーニングした。フィルターを0.1％SDS含有２
×SSCで室温で手短に洗浄し、次いで0.1％SDS含有１×S
SCを用いて55℃で洗浄した（２×30分）。一つの正相
（positive phase）クローン（λ−TxR1）をプラーク
精製し、DNAをプレート溶解物法で製造した（Sambrook
ら,1989 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,
第２版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spri
ng harbor,N.Y.）。 cDNAのサブクローニング及び配列決定 クローンλ−TxR1をEcoR Iで消化した結果、4.0kb、
1.7kb及び1.4kbの大きさの３個の挿入物を含んでいるこ
とが判明した。サザンブロット分析で、1.4kb挿入物の
みがトロンボキサン受容体cDNAプローブとハイブリダイ
ズすることが明らかにされた。Taqポリメラーゼ（Gene
ATAQシステム、Pharmacia）を用いて70℃で配列決定
すべく、1.4kb EcoR Iフラグメント（EP1）及び種々の
制限フラグメントをM13mp18及びM13mp19ベクター内にサ
ブクローニングした。DNAは、M13普遍プライマー又は既
知の配列から形成したプライマーを用いて、少なくとも
２回、両方の鎖について別々に完全に配列決定された。
EP1のヌクレオチド配列を表１に示す。コードされたタ
ンパク質のアミノ酸配列を表２に示す。1.4kbフラグメ
ント（EP1;第１図）は、配列決定の結果、ヒトトロンボ
キサン受容体cDNAと大きな配列相同を有することが判明
し、Ｇタンパク質結合受容体の特徴と推測されているヘ
プタヘリカル構造が明らかにされた。予測された相対分
子量41,858を有する402アミノ酸ポリペプチドを形成す
るであろう長い読取り枠（1206塩基対）が決定された。
開始コドンとされるATGは、翻訳開始のためのKozak共通
配列（Kozak,1989,J.Cell.Biol.,108,pp229−241）に適
合する。予想された開始コドンの60塩基対上流に枠内
（inframe）TGA停止コドンを含む74塩基対の５′非翻訳
配列が存在する。これらの配列には更に一つの枠外ATG
も、予想された開始点の直後に終結する48塩基対読取り
枠として存在する。EP1cDNAは、19残基の短いポリ
（Ａ）連鎖の19塩基対上流にポリアデニル化シグナルAA
TAAAを含む約112塩基対の極めて短い３′非翻訳領域を
含む。 実施例２ 発現ベクターの構築 1.4kb EcoR I挿入物をpcDNA1（Invitrogen）のEcoR
I部位にサブクローニングし、方向が正しいことをPst I
消化によって確認した。５′非翻訳領域並びに上流ATG
を除去するために、EP1をApa Iで開裂し、この1.25kb
Apa Iフラグメントを精製した。キナーゼ化オリグヌク
レオチド５′−CTAGCGGATCCCGCCATGAGCCCTTGCGGGCC−３
（配列番号５）及びオリゴヌクレオチド５′−CGCAAGGG
CTCATGGCGGATCCG−３′（配列番号６）をアニーリング
し、Apa Iフラグメントに連結した。連結後、試料をBam
H Iでの開裂にかけ、精製1.3kbバンドをBamH I消化pcDN
A1に連結した。末端変更cDNA及び方向をDNA配列決定に
よって確認した。 実施例３ 大腸菌発現ベクター内へのEP1cDNAのクローニング 非限定的具体例としてpETシリーズ（Novagen）のよう
な大腸菌発現ベクター内にEP1発現カセットをトランス
ファーして、大腸菌内で組換えEP1を産生する。pETベク
ターはEP1を、厳密に調節されたバクテリオファージT7
プロモーターの制御下におく。誘導lacプロモーターに
よって制御されるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体
コピーを含む大腸菌宿主内への該構築物のトランスファ
ーに次いで、適当なlac基質（IPTG）を培養物に加える
と、EP1の発現が誘発される。発現EP1のレベルを前述の
アッセイで測定する。 EP1に関する読取り枠全体をコードするcDNAを、pET
11aのNde I部位に挿入する。正の方向の構築物を配列解
析によって同定し、発現宿主株BL21の形質転換に使用す
る。次いで、形質転換体を用いて、EP1タンパク質を製
造するための培養物に接種する。培養物は、当業者に組
成が知られているM9又はZB培地で増殖させ得る。約OD
600＝1.5まで増殖した後、1mM IPTGを用いて37℃で３
時間にわたりEP1の発現を誘発する。これらの細胞に由
来する不溶性封入体フラクション中に、真のEP1酵素活
性が発見され得る。50mMトリス−HCl（pH8）及び100mM
ジチオトレイトールを含む緩衝液中の5Mグアニジン−HC
lで、封入体フラクションから可溶性EP1を抽出する。10
0倍容の25mM HEPES（pH7.5）、5mMジチオトレイトー
ル、10％スクロースに対する透析後に、前記抽出物から
活性EP1が得られる。 実施例４ アフリカツメガエル卵母細胞マイクロインジェクション
ベクターによるEP1mRNAのin vitro翻訳及び哺乳動物細
胞内での発現 EP1cDNA構築物をin vitro転写ベクター（pGEMシリー
ズ、Promega）に連結して、合成mRNAを製造する。 合成mRNAは、EP1mRNAをコードする二本鎖DNAをバクテ
リオファージプロモーター含有プラスミドベクター内に
クローニングし、クローン化EP1コーディングDNAを含む
プラスミドベクターを鎖状とし、プラスミドベクター上
のバクテリオファージプロモーターを特異的に認識する
バクテリオファージからDNA依存性RNAポリメラーゼを用
いてクローン化DNAをin vitro転写することにより、十
分な量で製造される。 バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼによっ
て認識されるバクテリオファージプロモーターを含むプ
ラスミドベクターは様々なものが存在し、非限定的具体
例としては、プラスミドpSP64、pSP65、pSP70、pSP71、
pSP72、pSP73、pGEM−3Z、pGEM−4Z、pGEM−3Zf、pGEM
−5Zf、pGEM−7Zf、pGEM−9Zf及びpGEM−11Zfが挙げら
れる。これら一連のプラスミドは総てPromegaから市販
されている。 EP1DNAのクローニングに適している、ベクター上の使
用可能な制限エンドヌクレアーゼクローニング部位のう
ちの一つ以上を使用して、EP1をコードする二本鎖DNAを
ベクター含有バクテリオファージプロモーター内に正確
な向きでクローニングする。連結したEP1DNAを有するベ
クターを用いて細菌を形質転換し、正確な向きのEP1DNA
を有するベクターの存在についてクローン単離体を分析
する。 正確な向きのEP1コーディングDNAを含むベクターが同
定され単離されたら、これをEP1転写単位よりも下流の
部位において、該単位を破損しないように制限エンドヌ
クレアーゼで開裂することにより線状化する。線状化プ
ラスミドを単離し、精製し、EP1mRNAのin vitro転写の
鋳型として使用する。 次いで鋳型DNAを、EP1mRNA形成DNA鋳型の転写を可能
にする反応混合物中で、バクテリオファージ特異的DNA
依存性RNAポリメラーゼと混合する。使用可能なバクテ
リオファージ特異的DNA依存性RNAポリメラーゼは幾つか
存在し、非限定的具体例としてT3、T7及びSP6 RNAポリ
メラーゼが挙げられる。次いで、合成EP1mRNAを単離
し、精製する。 mRNAの安定性を改善するために、５′末端キャップ構
造及び３′ポリＡテールを含むmRNAを合成すると有利で
あり得る。キャップ構造、すなわち７−メチルグアノシ
ンは、DNA鋳型との反応混合物に７−メチルグアノシン
を加えるだけでmRNAの５′末端に組込み得る。DNA依存
性RNAポリメラーゼは、mRNAの合成中にキャップ構造を
５′末端に組み込む。ポリＡテールは多くのcDNA中に天
然に存在するが、ポリＡテールをコードするDNA配列をD
NA鋳型の３′末端に挿入することにより、mRNAの３′末
端に簡単に付加できる。 単離し精製したEP1mRNAは、無細胞系、例えば非限定
的具体例としてウサギ網状赤血球溶解物及びコムギ胚芽
抽出物（どちらもPromega及びNew England Nuclearか
ら市販されている）を用いて、又は細胞ベースの系、例
えば非限定的具体例としてアフリカツメガエル卵母細胞
へのマイクロインジェクションを用いて翻訳する。好ま
しくいのはアフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロイ
ンジェクションである。 アフリカツメガエル卵母細胞に、EP1タンパク質の産
生に十分な量の合成EP1mRNAをマイクロインジェクショ
ンする。マイクロインジェクションにかけた卵母細胞を
インキュベートしてEP1mRNAの翻訳を生起させ、EP1タン
パク質を産生させる。 前記合成mRNAは標準的方法［Gurdon,J.B.及びWicken
s,M.D.,Methods in Enzymol.101:370−386（1983）］
でアフリカツメガエル卵母細胞（段階５〜６）内に注入
する。卵母細胞を採取し、後述のようにEP1発現につい
て分析する。 実施例５ アフリカツメガエル卵母細胞内でのpcDNA−EP1発現 標準的外科方法を用いてメス成体Xenopus laevisか
ら卵母細胞を採取した（Colman,A.,1984,Transription
and Translation−Ａ Practical Appraoch,IRL P
ress）。卵胞細胞を除去するために、Ca2+無含有ND96溶
液（NaCl 96mM、KCl 2mM、MgCl2 1mM、HEPES 5mM、
ピルビン酸Na 2.5mM、テオフィリン0.5mM、ゲンタマイ
シン 50mg/ml、＋1.8 CaCl2、pH7.6）中で新しく調製
したコラゲナーゼ（2mg/ml,タイプ2,Worthington Bioc
hemical Corp.,Freehold,NJ）で卵母細胞を２〜３時間
処理した。卵胞除去した段階５〜６の卵母細胞を選択
し、ND96溶液中に維持した。卵母細胞核に１〜5ngのpcD
NA−EP1又はpcDNA−EP1（Bam）を注入し、次いで18℃で
48時間インキュベートし、その後アゴニストを投与し
た。アゴニスト誘導Ca2+依存性Cl-流、又はCa2+特異的
発光タンパク質エクオリン（J.Blinks,Friday Harbor
Photoproteins,WA）注入卵母細胞における発光を測定
することにより、機能活性を決定した（Giladi及びSpin
del 1991 Biotechniques,10,pp744−747）。電気生理
学的アッセイのために、卵母細胞を0.5ml潅流チャンバ
内に配置し、Turbo TEC 01C増幅器（NPI Insrument
s,Germany）を用いて−60mVに電圧を固定した（3M CKl
を充填した抵抗0.5〜2.0MΩの微小電極を使用）。リガ
ンド含有溶液を潅流し、電流応答を記録した。光測定ア
ッセイのために、エクオリン導入卵母細胞（100ng/卵母
細胞）を0.4mlのND96を入れたキュベット内に個々に配
置し、リガンドの添加によって誘起した発光をBio−Orb
it 1251ルミノメーター（Fisher Sci.Ltd.）で記録し
た。 電気生理学的アッセイ及びエクリオン発光アッセイを
用いて、pcDNA−EP1注入卵母細胞内の機能活性を測定し
た。電気生理学的アッセイでは、１μＭ〜10mMのPGE2の
潅流の結果、pcDNA−EP1注入卵母細胞内に明らかな電流
応答が観察された。これは、このクローンが、ホスファ
チジルイノシトール/Ca2+シグナル経路に結合した機能
的EP1受容体をコードすることを示唆するものである
（第４図Ａ）。このような応答は、H2Oを注入した対照
卵母細胞には見られなかった。リガンドに誘発される細
胞内Ca2+の増加も、エクオリン導入卵母細胞内の発光に
よって直接示された（第４図Ｂ）。エクオリン発光アッ
セイで得られた用量応答依存性は、発現された受容体の
アゴニストとしてPGE2がPGF２αより強力であることを
意味するものであった（第４図Ｃ）。 実施例６ 哺乳動物発現ベクター内へのEP1cDNAのクローニング EP1cDNA発現カセットを、適当な制限エンドヌクREア
ーゼ部位で、強力な普遍的哺乳動物プロモーターを含む
下記のベクターに連結する:pBC12BI［Cullen,B.R.,Meth
ods in Enzymol.152:684−704,1988］、並びにpEE12
（CellTech EP 338,841号）及びその誘導体pSZ9016−
１及びp9019。p9019は、hCMVIEプロモーターと、ポリリ
ンカーと、SV40ポリＡエレメントとを含み、SV40初期プ
ロモーターによって操作されるジヒドロ葉酸レゼクター
ゼの突然変異遺伝子（mDHFR）（Simonsen,C.C.及びLevi
nson,A.D.Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:2495−2499［1
983］）からなる選択可能マーカー／増幅システムを有
する哺乳動物発現ベクターの構築を表す。SV40ポリアデ
ニル化配列を、pD5（Berker及びSharp,Nucl.Acid Res.
13:841−857［1985］）を鋳型として用いて、プライマ
ー13978−120及び139778−121により決定されるPCR反応
で形成する。得られた0.25Kb PCR生成物をCla I及びSp
e Iで消化し、同様に消化したpEE12の6.7Kbフラグメン
トに連結する。得られたプラスミドをBgl II及びSfi I
で消化して、SV40初期プロモーターの３′部分とGScDNA
とをベクターから切り離す。プラスミドpFR400（Simons
en,C.C.及びLevinson,A.D.,Proc.Natl.Sci.USA 80:249
5−2499［1983］）から分離した0.73Kb Sfi I−Xho II
フラグメントを前述の5.6Kbベクターに連結し、SV40初
期プロモーターを再構築し、mdHFR遺伝子を挿入する。
このプラスミドをp9019と名付ける。pSZ9016−１は、HI
V LTRがhuCMVIEプロモーターにとって代わっている以
外は、p9019と同じである。このベクターは、p9019をXb
a I及びMlu Iで消化してhuCMVIEプロモーターを除去す
ることにより構築される。残基−117〜＋80（HIV−１
LTRの部分を含むベクターpCD23内に存在する（Cullen,C
ell 46:973［1986］）のHIV LTRプロモーターを、生
成物の末端に５′側のMlu I及びSpe I制限部位を付加し
たオリグヌクレオチドプライマーを用いて、プラスミド
pCD23からPCR増幅する。Hind III及びXba I部位は３′
側に付加されている。得られた0.2kb PCR生成物を酵素
Mlu I及びXba Iで消化した後、フラグメントをアガロー
スゲルで精製し、プロモーターを含まない4.3Kb DNAフ
ラグメントに連結して、ベクターpSZ9016−１を形成す
る。 プロモーターに対して正しい向きにあるEP1cDNAを含
むカセットをプロモーターの適当な制限部位３′に連結
し、制限部位マッピング及び／又は配列決定によって同
定する。これらのcDNA発現ベクターを種々の宿主細胞、
例えば非限定的具体例としての［COS−７（ATCC＃CRL16
51）、CV−1tat［Sackevitzら,Science 238:1575（198
7）］,293,L（ATCC＃CRL6362）］に、標準的方法、例え
ば非限定的具体例として電気穿孔法又は化学的処理（カ
チオンリポソーム、DEAEデキストラン、リン酸カルシウ
ム）によって導入する。トランスフェクションした細胞
及び細胞培養抽出物を回収して、後述のようにEP1発現
について分析し得る。 哺乳動物過渡的発現に使用した総てのベクターは、EP
1を発現する安定な細胞系の確立に使用できる。発現ベ
クター内にクローニングした変更していないEP1cDNA構
築物は、宿主細胞を細胞内EP1タンパク質を作るように
プログラムすると推測される。トランスフェクション宿
主細胞の非限定的具体例としては、CV−１−Ｐ［Sackev
itzら,Science 238:1575（1987）］、tk−Ｌ［Wigler
ら,Cell 11:223（1977）］、NS/0及びdHFr−CHO［Kauf
man及びSharp,J.Mol.Biol.159:601（1982）］が挙げら
れる。 EP1cDNAを含む任意のベクターと、薬剤選択性プラス
ミド、例えば非限定的具体例としてG418、アミノグリコ
シドホスホトランスフェラーゼ、pLNCX［Miller,A.D.及
びRosman,G.J.,Biotech News 7:980−990（198
9）］；ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂホス
ホトランスフェアーゼ,pLG90［Gritz,L.及びDavies,J.,
GENE 25:179（1983）］、APRT、キサンチン−グアニ
ン、ホスホリボシル−トランスフェラーゼ、pMAM（Clon
tech）［Murrayら,Gene 31:233（1984）］との同時ト
ランスフェクションは、安定にトランスフェクションし
たクローンの選択を可能にする。EP1レベルは前述のア
ッセイによって定量する。 可能な限り高いレベルのEP1を合成する哺乳動物細胞
クローンを製造するために、増幅可能薬剤耐性マーカー
を含むベクター内にEP1cDNA構築物を連結する。これら
の構築物を細胞内に導入した後、プラスミドを含むクロ
ーンを適当な物質を用いて選択し、プラスミドのコピー
数が多い過剰発現クローンの単離を、前記物質の用量増
加の選択によって実施する。下記のシステムを使用す
る：突然変異DHFR遺伝子を含む9016又は9019プラスミド
［Simonsenら，前出］、DHFR−CHO細胞内にトランスフ
ェクションし、メトトレキサート中で選択；グルタミン
シンセターゼ遺伝子を含むpEE12プラスミド、NS/O細胞
内にトランスフェクションし、メチオニンスルホキシミ
ン中で選択（CellTech国際特許出願第2089/10404号）；
及びAPRT及びTK欠失Ｌ細胞内のチミジンキナーゼ遺伝子
［Colbere及びGaropin,F.,Proc.Natl.Acad.Sci.76:3755
（1979）］を含むpDLAT−３と同時トランスフェクショ
ンした9016又は他のCMVプロモーターベクター、APRT
（0.05mMアザセリン、0.1mMアデニン、４μg/mlアデノ
シン）中で選択し、HAT（100μＭヒポキサンチン、0.4
μＭアミノプテリン、16μＭチミジン）で増幅。 実施例７ COS−M6細胞内でのpcDNA−EP1発現及び［3H］PGE2結合
アッセイ DEAE−デキストラン方法を用いて、pcDNA−EP1プラス
ミドをCOS−M6細胞内にトランスフェクションした。細
胞を72時間培地に維持し、次いで回収し、窒素キャビテ
ーション（Freyら,1993）による細胞溶解後に、示差的
遠心分離（1000×ｇで10分間、次いで100,000×ｇで30
分間）にかけて膜を製造した。1mM EDTA、0.5M［3H］P
GE2（154Ci/mmol;DuPont−New England Nuclear）及
び100,000×ｇ膜フラクション由来タンパク質60〜100μ
ｇを含む10mMリン酸カリウム（pH6.0）中で、［3H］プ
ロスタグランジンE2（［3H］PGE2）結合アッセイを行っ
た。前述のように高速濾過で結合及び遊離放射性リガン
ドを分離する前に、室温で１時間インキュベーションを
実施した（Freyら,1993 Eur.J.Mol.Pharmacol.,244,pp
239−250）。フィルターに結合している残りの［3H］PG
E2を液体シンチレーション計数で定量した。特異的結合
は、１μＭ PGE2の存在下で測定した総ての結合と非特
異的結合との間の差として定義した。 PGE2を投与したpcDNA−EP1注入卵母細胞の細胞内カル
シウムの用量依存性増加を示すデータは、この受容体
が、サブタイピングされたプロスタグランジンＥ受容体
EP1であることを示唆するものであった。これを確認す
るために、pcDNA−EP1及びpcDNA−EP1（Bam）トランス
フェクションCOS−M6細胞から製造した膜を用いて
［3H］PGE2結合アッセイを実施した。［3H］PGE2はこれ
らの細胞膜に特異的に結合したが、pcDNAのみでトラン
スフェクションしたCOS M6細胞から製造した膜には結
合しなかった。分散分析は、pcDNA−EP1トランスフェク
ションCOS−M6細胞膜への［3H］PGE2の特異的結合が大
きな親和性を有し、飽和可能であることを明らかにし
た。平衡解離係数（KD）は1nM、特異的結合部位の最大
数（Bmax）は約360fmol/mgタンパク質である。また、プ
ロスタグランジンは、EP1サブタイプで競合に予想され
る活性順序、PGE2＞PGE1＞PGF２α＞＞PGD2で、［3H］P
GE2の特異的結合に関して競合した（第４図）。更に、
選択制EP1アンタゴニストAH6809及びSC19220は、約0.5
μＭ及び6.7μＭのIC50値で［3H］PGE2特異的結合に関
して競合した。これは、平滑筋収縮アッセイ（Coleman
ら,1985 Br.J.Pharmacol.,85,pp.286P）で測定された
これらの化合物の能力と合致している。また、強力なEP
2アゴニストであるブタプロストは特異的結合部位で比
較的不活性であり、IC50値が50μＭであった。第４図参
照。これらの放射性リガンド結合データは、EP1受容体
が、サブタイピングされたEP1の特性を有することを示
す。 実施例８ 昆虫細胞内発現のためのバキュロウイルス発現ベクター
内へのEP1cDNAのクローニング AcNPVウイルスのゲノムに由来するバキュロウイルス
ベクターを、Sf9系昆虫細胞（ATCC CRL＃1711）内でcD
NAを高レベル発現させるように設計する。EP1cDNAを発
現する組換えバキュロウイルスを以下の標準的方法で製
造する（In Vitrogen Maxbac Manual）:EP1cDNA構築
物を種々のバキュロウイルストランスファーベクター、
例えばpAC360及びBlueBacベクター（In Vitrogen）内
のポリヘドリンプロモーターの下流に連結する。バキュ
ロウイルストランスファーベクター及び線状化AcNPVゲ
ノムDNA［Kitts,P.A.,Nuc.Acid Res.18:5667（199
0）］のSf9細胞内への同時トランスフェクションに次ぐ
相同組換えによって、組換えバキュロウイルスを形成す
る。組換えpAC360ウイルスは感染細胞内の封入体の不在
によって同定され（Summers,M.D.及びSmith,G.E.,Texas
Agriculture Exp.Station Bulletin No.1555）、
組換えpBlueBacウイルスはβ−ガラクトシダーゼ発現に
基づいて同定される（Vialardら,1990,J.Virol.,64,pp3
7−50）。プラーク精製及びEP1組換えバキュロウイルス
でのsf9細胞の感染後に、前述のアッセイでEP1発現を測
定する。 EP1に関する読取り枠全体をコードするcDNAをpBlueBa
c IIのBamH I部位に挿入する。ポリヘドリンプロモータ
ーに対して正の向きにある構築物を配列決定によって同
定し、線状AcNPVマイルドタイプDNAの存在下でSf9細胞
をトランスフェクションするために使用する。 真正の活性EP1は、感染細胞の膜に結合している。膜
調製物を標準的方法で感染細胞から製造する。 実施例９ 酵母発現ベクター内へのEP1cDNAのクローニング 外来性タンパク質の細胞内発現を制御するように設計
した発現ベクター内に最適EP1cDNA構築物を挿入した
後、酵母S.cerevisiae内で組換えEP1を産生する。細胞
内発現のために、EmBLyex4等のようなベクターをEP1シ
ストロンに連結する［Rinas,U.ら,Biotechnology 8:54
3−545（1990）;Horowitz B.ら,J.Biol.Chem.265:4189
−4192（1989）］。発現されたEP1のレベルは前述のア
ッセイで測定する。 実施例10 組換えEP1の精製 組換え技術によって製造したEP1は、抗体アフィニテ
ィクロマトグラフィーによって精製し得る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との間で共有結合
を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルで予め活性化したゲル支持体であるAffigel−10（Bio
rad）に抗EP1抗体を加えることによって、EP1抗体アフ
ィニティカラムを形成する。抗体はスペーサーアームと
のアミド結合を介してゲルに結合する。次いで、残りの
活性化エステルを1MエタノールアミンHCl（pH8）で失活
する。カラムを水及び0.23MグリシンHCl（pH2.6）で順
次洗浄して、非結合抗体又は外来タンパク質を除去す
る。次いでカラムを、適当な膜可溶化剤、例えば洗剤と
共にリン酸塩緩衝食塩水（pH7.3）中で平衡化し、可溶
化EP1もしくはEP1サブユニットを含む細胞培養上清又は
細胞抽出物をカラムにゆっくり通す。次いでカラムを光
学密度（A280）がバックグラウンドに低下するまでリン
酸塩緩衝食塩水及び洗剤で洗浄し、その後タンパク質を
0.23Mグリシン−HCl（pH2.6）及び洗剤で溶離する。次
いで、精製したEP1タンパク質をリン酸塩緩衝食塩水に
対して透析する。
配列番号:1 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:2 配列長さ:22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:3 配列の長さ:1394 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:4 配列の長さ:402 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号:5 配列の長さ:32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:6 配列の長さ:23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 フオード−ハツチンソン，アンソニー カナダ国、ケベツク・アシユ・９・ドウ ブルベー・５・エル・７、ビーコンズフ イールド、ハイド・パーク・69 (72)発明者 フアンク，コリン アメリカ合衆国、テネシー・37203、ナ ツシユビル、ウエスト・エンド・サーク ル・3110、アパートメント・16 (72)発明者 グリジヨルジイク，リシヤール カナダ国、ケベツク・アシユ・９・ア ー・１・ペー・８、ドラール・デ・オル モー、ブレントウツド・27 (72)発明者 ミーターズ，キヤスリーン カナダ国、ケベツク・アシユ・２・イク ス・１・ドウブルベー・４、モントリオ ール、ミルトン・570、アパートメン ト・18 (56)参考文献 ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩ ＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ （1993）Ｖｏｌ．268，Ｎｏ．35，ｐ. 26767−26772 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 - 15/28 C07K 14/705 C07K 16/28 C12P 21/02 -21/08 G01N 33/566 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (13)
- 【請求項１】プロスタグランジンに特異的に結合する、
単離し精製されたプロスタグランジンEP1受容体タンパ
ク質であって、下記のアミノ酸配列： を有することを特徴とする、前記タンパク質。 - 【請求項２】プロスタグランジン受容体タンパク質をコ
ードする単離し精製されたDNA分子であって、前記タン
パク質が請求項１に記載のアミノ酸配列を有することを
特徴とする前記DNA分子。 - 【請求項３】プロスタグランジン受容体タンパク質をコ
ードする単離し精製されたDNA分子であって、下記のヌ
クレオチド配列： を有することを特徴とする前記DNA分子。 - 【請求項４】組換え宿主細胞内でプロスタグランジン受
容体タンパク質を発現させるための発現ベクターであっ
て、請求項３に記載のDNA分子を含む前記発現ベクタ
ー。 - 【請求項５】組換えプロスタグランジン受容体タンパク
質を発現する宿主細胞であって、請求項４に記載の発現
ベクターを含む前記宿主細胞。 - 【請求項６】組換え宿主細胞内でプロスタグランジン受
容体タンパク質を発現させる方法であって、（ａ）請求
項４に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞内にトラン
スファーし、（ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞を発現ベ
クターからのプロスタグランジン受容体タンパク質の発
現を可能にする条件下で培養する操作を含む前記方法。 - 【請求項７】プロスタグランジン受容体活性のモジュレ
ーターを選定する方法であって、（ａ）検査化合物を、
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有することを特徴と
するプロスタグランジン受容体と混合し、（ｂ）プロス
タグランジン受容体に対する検査化合物の作用を測定す
る操作を含む前記方法。 - 【請求項８】プロスタグランジン受容体タンパク質に特
異的に結合する抗体であって、前記タンパク質が請求項
１に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする前記
抗体。 - 【請求項９】化合物がプロスタグランジン受容体EP1活
性を調節するかどうかを決定する方法であって、 （ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むプロスタ
グランジンEP1受容体タンパク質の発現を支配する核酸
分子で、宿主細胞をトランスフェクトするかまたはトラ
ンスフォームして組換えEP1受容体発現細胞を得て、 （ｂ）該EP1受容体発現細胞を化合物にさらし、 （ｃ）組換えプロスタグランジンEP1受容体タンパク質
を発現しない対照宿主細胞を（ｂ）の化合物にさらし、 （ｄ）EP1受容体発現細胞中のプロスタグランジンEP1受
容体タンパク質に対する化合物の調節効果および対照細
胞に対する化合物の調節効果を決定し、 （ｅ）EP1受容体発現細胞中のプロスタグランジンEP1受
容体タンパク質と対照宿主細胞に対する化合物の効果を
比較することを含む、方法。 - 【請求項１０】工程（ａ）の宿主細胞がアフリカツメガ
エル卵母細胞である請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】化合物が知られているプロスタグランジ
ンEP1受容体タンパク質との結合に関して、プロスタグ
ランジンEP1受容体リガンドと競合するかどうかを決定
する方法であって、 （ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むプロスタ
グランジンEP1受容体タンパク質の発現を支配する核酸
分子発現ベクターで、宿主細胞をトランスフェクトする
かまたはトランスフォームして組換えEP1受容体発現細
胞を得て、 （ｂ）EP1受容体発現細胞から実質的に精製された細胞
膜調製物を単離し、 （ｃ）組換えプロスタグランジンEP1受容体タンパク質
を発現しない対照宿主細胞からの実質的に精製された細
胞膜調製物を単離し、 （ｄ）工程（ｂ）および工程（ｃ）の膜調製物を化合物
および知られたプロスタグランジンEP1受容体リガンド
にさらし、 （ｅ）工程（ｂ）中のプロスタグランジンEP1受容体タ
ンパク質に対する化合物の結合を決定し、 （ｆ）工程（ｃ）の膜調製物に対する化合物の結合を決
定し、 （ｇ）工程（ｂ）の膜調製物中のプロスタグランジンEP
1受容体タンパク質と工程（ｃ）の膜調製物に対する化
合物の結合を比較することを含む、方法。 - 【請求項１２】プロスタグランジンEP1受容体リガンド
が、プロスタグランジン受容体タンパク質との結合に関
してPGE2と競合したときに、0.5μＭまでのリガンド濃
度でプロスタグランジンEP1受容体タンパク質と50％最
大特異的結合を示すことを特徴とする請求項11に記載の
方法。 - 【請求項１３】プロスタグランジンEP1受容体リガンド
がPGE2、PGE1、PGF２αおよびAH6809からなる群から選
択される請求項12に記載の方法。
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