JPH10508752A - ｐａｒａカチオンチャンネルの機能発現方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 電位活性化カチオンチャンネルをコードするＤＮＡをクローニングおよび特性決定した。活性組換え蛋白質を産生する組換え宿主細胞で、そのｃＤＮＡを発現させた。さらに、組換え蛋白質を組換え宿主細胞から精製する。

Description

【発明の詳細な説明】 para カチオンチャンネルの機能発現方法 発明の背景 電位活性化ナトリウムチャンネルは、ニューロン、筋肉その他の電気的に興奮 し得る細胞における電気信号伝達の基礎となる活動電位の迅速な脱分極相を担当 する（Hille による総説（1992年）、Ionic Channels of Excitable Membranes （Sinauer，Sunderland，MA））。各種組織からの電位活性化ナトリウムチャン ネルの生化学的特性決定は、それらがいずれも分子量２３万〜３０万の単一のα サブユニットを含むことを示す（Catterall による総説(1992)、Cellular and M olecular Biology of Voltage-gated Sodium Channels．Physiological Reviews ，82:S15-S48）。Electrophorus electricusの電位活性化ナトリウムチャンネル のαサブユニットは、生化学的方法および分子遺伝学的方法を用いてクローニン グされている（Noda et al.，1984 Primary structure of Electrophorus elect ricus sodium channel deduced from cDNA sequence．Nature，312:121-127）。 精製Electrophorus electricusナトリウムチャンネルα−サブユニットは、単一 のαサブユニット として機能性電位活性化ナトリウムチャンネルを形成している(Rosenberg，R.L. ，et al.，1984，Proc.Natn.Acad.Sci.U.S.A.81:1239-1243)。Electrophorus el ectricus 電位活性化ナトリウムチャンネルをコードするｃＤＮＡを用いて、３つ の異なっているが相同性の高いラット脳電位活性化ナトリウムチャンネル遺伝子 をコードするｃＤＮＡが単離されている（Kayano et al.，1988，Primary struc ture of rat brain sodium channel III deduced from the cDNA sequence，FEB S Lett．228:187-194; Noda et al.1986，Nature 320:188-192）。ラット脳から の電位活性化ナトリウムチャンネルの生化学的分析は、αサブユニットが非共有 結合的にβ１サブユニット（３６０００ｋＤａ）と会合しており、チャンネル活 性に必要ないβ２サブユニット（３３０００ｋＤａ）に結合したジスルフィドで あることを示している（Hartshorne and Catterall，1981，Purification of th e saxitoxin receptor of the sodium channel from rat brain．Proc.Natl.Aca d.Sci.U.S.A．78:4620-4624; Hartshorne and Catterall 1984，The sodium cha nnel from rat brain．Purification and subunit composition．J.Biol.Chem． 259:1667-1675；Hartshorne et al.，1982，The saxitoxin receptor of the sodium channel from rat brain．Evidence for two nonident ical beta subunits．J．Biol．Chem．257:13888-13891; Messsner and Cattera ll，1985，The sodium channel from rat brain．Separation and characteriza tion of subunits．J．Biol．Chem．260:10597-10604）。哺乳動物電位活性化ナ トリウムチャンネルのαサブユニットをコードするｃＤＮＡから転写されたＲＮ Ａは、ツメガエル卵母細胞に注射した場合、機能性ナトリウムチャンネルの合成 を指示するのに十分である（Auld et al.，1988，A rat brain Na+ channel alp ha subunit with novel gating properties．Neuron 1:448ー461; Moorman et al .，1990，Changes in sodium channel gating produced by point mutations in a cytoplasmic linker．Science 250:688-691; Noda et al.，1986，Expressio n of functional sodium channels from cloned cDNA．Nature 322:826-828; Su zuki et al,，1988，Functional expression of cloned cDNA encoding sodium channel III．FEBS Lett.228:195-200）。哺乳動物電位活性化ナトリウムチャン ネルのαサブユニットは、ツメガエル卵母細胞における機能性ナトリウムチャン ネルをコードするには十分であるが、それらの生物 物理学的性質は完全状態の細胞で認められるものと同一ではない。ツメガエル卵 母細胞でのラット脳電位活性化ナトリウムチャンネルβ１サブユニットとラット 脳ＩＩａ型αサブユニットとの同時発現により、完全状態の細胞で認められる正 常な生物物理学的性質が回復する（Isom et al.，1992，Primary structure and functional expression of the B1 subunit of the rat brain sodium channel ．Science 256:839-842）。 昆虫ニューロンのナトリウムチャンネルの生化学的特性決定から、それらが分 子量２４万〜２８万のαサブユニットを有するが、共有結合的に結合したβサブ ユニットを欠いていることが明らかになっている（Gordon et al.，1993，Bioch emical Characterization of Insect Neuronal Sodium Channels．Archives of Insect Biohemistry and Physiology 22:41-53）。電位活性化ナトリウムチャン ネルをコードすると予想されているショウジョウバエであるキイロショウジョウ バエからの部分的ＤＮＡ配列が初めて確認されたのは、脊椎動物電位活性化ナト リウムチャンネルαサブユニットとの相同性に基づいてであった（Salkoff et a l.，1987，Genomic organization and deduced amino acid sequence of a puta tive sodium channel genes in Drosophila ．Science 237.744-749; Okamoto et al.，1987，Isolatio n of Drosophila genomic clones homologous to the eel sodium channel gene ．Proc.Jpn.Acad.63(B)：284-288; Ramaswami and Tanouye，1989，Two sodium- channel gene in Drosophila; Implications for channel diversity．Proc.Nat n.Acad.Sci.U,S.A．86:2079-2082）。分子遺伝学的アプローチにより、ショウジ ョウバエにおける麻痺（para）座（paralytic Iocus）が電位活性化ナトリウム チャンネルαサブユニットをコードすることが明らかになり、paraｃＤＮＡ配列 の全体が決定された（Loughney et al.，1989，Molecular analysis of the par a locus，a sodium channel gene in Drosophila．Cell 58:1143-1154; Thacker ay and Ganetzky 1994，Developmentally regulated alternative splicing gen erates a complex array of Drosophila para sodium channel isoforms．J,Neu roscience 14:2569-2578）。 ショウジョウバエtipE座が電位活性化ナトリウムチャンネルの調節要素または 構造要素をコードすることが提案されているが、それは以下の根拠による。すな わち、（１）電位活性化ナトリウムチャンネルに対する［³Ｈ］サキシトキシン がtipE突 然変異体では３０〜４０％低減していること(Jackson et al.，1986，The tipE mutation of Drosophila decreases saxitox in binding and interacts with o ther mutations affecting nerve membrane excitability．J.of Neurogenetics ，3:1-17)、（２）ナトリウム電流密度がtipE突然変異体からの胎仔ニューロン を培養したものでは４０〜５０％低減していること（O′Dowd and Aldrich，198 8，Voltage-Clamp Analysis of Sodium Channels in wild-type and Mutant Dro sophila Neurons．J.of Neuroscience，8:3633-3643）、（３）para：tipE突然 変異体が対立遺伝子特異的な形で絶対的致死性を示すこと（Ganetzky 1986，Neu rogenetic analysis of Drosophila Mutations affecting Sodium Channels; Sy nergistic Effects on Viabi1ity and Nerve Conduction in Double Mutants in volving tipE J.of Neurogenetics，319-31; Jackson et al.，1986，The tipE mutation of Drosophila decreases saxitoxin binding and interacts with ot her mutations affecting nerve membrane excitabllity．J.of Neurogenetics ，3:1-17）、（４）paraおよびtipEＲＮＡが胎仔ＣＮＳおよびＰＮＳで発現され ること（Hall et al.，1994，Molecular and genetic analysis of t ipE: a mutation affecting sodium channels in Drosophila．１９９４年４月 ２０〜２４日のイリノイ州シカゴでの第３５回Annual Drosophila Research Con ferenceで発表; Hong and Ganetzky 1994，Spatial and temporal expression p atterns of two sodium channel genes in Drosophila. J.Neuroscience，14:5 160-5169）、（５）tipEが２個の推定膜伸張（spanning）ドメインを持つ５０ｋ Ｄａの酸性蛋白質をコードし、膜のトポロジーは他のイオンチャンネルサブユニ ットと共有していること（Hall et al.，1994，Molecular and genetic analysi s of tipE: a mutation affecting sodium channels in Drosophila．１９９４ 年４月２０〜２４日のイリノイ州シカゴでの第３５回Annual Drosophila Resear ch Conferenceで発表; Hall and Feng 1994，The tipE locus defines a novel membrane protein required during development to rescue adull paralysis. １９９４年９月７〜１１日のマサチューセッツ州ウッズホールでのSociety of G eneral Physiologistsの第４８回年会で発表）による。ショウジョウバエのtipE 座はクローニングおよび配列決定されているが、tipEのヌクレオチドおよびアミ ノ酸配列は現在開示されていない（Hall et al.，1994，Molec ular and genetic analysis of tipE: a mutation affecting sodium channels in Drosophila．１９９４年４月２０〜２４日のイリノイ州シカゴでの第３５回A nnual Drosophila Research Conferenceで発表; Hall and Feng 1994，The tipE locus defines a novel membrane protein required during development to r escue adult paralysis(para).１９９４年９月７〜１１日のマサチューセッツ州 ウッズホールでのSociety of General Physiologistsの第４８回年会で発表）。発明の概要 組換え発現系により、ショウジョウバエのpara電位活性化ナトリウムチャンネ ルの機能的発現がparaαサブユニットとショウジョウバエ電位活性化ナトリウム チャンネルβサブユニットと推定されるtipEとの同時発現を必要とすることが明 らかになった。ショウジョウバエpara電位活性化ナトリウムチャンネルの電気生 理学的・薬理学的性質が開示されている。ショウジョウバエpara電位活性化ナト リウムチャンネルを発現する組換え宿主細胞は、para電位活性化カチオンチャン ネル蛋白質を生理活性な形で単離・精製するのに有用である。para電位活性化ナ トリウムチャンネルをコードするＤＮＡ分子は、その遺伝子の 発現を阻害するアンチセンス分子の産生において有用である。他の節足動物から の電位活性化ナトリウムチャンネルpara相同体も、機能発現を行うには、対応す るtipE相同体との同時発現を必要とすると考えられる。図面の簡単な説明 図１は、paraｃＤＮＡ全長のＰＣＲ増幅およびアッセンブリーを示す図である 。 図２は、機能性のparaｃＤＮＡ全長の構築を示す図である。 図３Ａ、ＢおよびＣは、in vitroでの転写によって得られたparaおよびtipEｍ ＲＮＡを注射したツメガエル卵母細胞におけるテトロドトキシン感受性ナトリウ ム電流の発現を示す図である。 図４は、paraナトリウム電流における不活化の定常状態電位依存性を示す図で ある。発明の詳細な説明 本発明は、ショウジョウバエ電位活性化ナトリウムチャンネルをコードするpa raおよびtipEｃＤＮＡの同時発現に関する。本発明はさらに、組換え発現プラス ミドに含まれるＤＮＡをコードするクローン化paraおよびtipEを同時発現する組 換え宿 主細胞に関するものでもある。paraのアミノ酸配列およびparaをコードするＤＮ Ａは公知であり（Loughney et al.，1989，Molecular analysis of the para lo cus，asodium channel gene in Drosphila．Cell 58: 1143-1154; Thackeray an d Ganetzky 1994，Developmentally Regulated alternative splicing generate s a complex array of Drosophila para sodium channel isoforms．J.Neurosci ence 14:2569-2578）、ＰＣＲで形成された全長のparaｃＤＮＡクローンについ て以下に説明する（図１参照）。 電位活性化ナトリウムチャンネルをコードすると推定されている昆虫のキイロ ショウジョウバエからの部分ＤＮＡ配列は最初に、脊椎動物電位活性化ナトリウ ムチャンネルαサブユニットに対する相同性に基づいて確認された（Salkoff et al.，1987，Genomic organization and deduced amino acid sequence of a pu tative sodium channel genes in Drosophila．Science 237;744-749; Okamoto et al.，1987，Isolation of Droso phila genomic Clones homologous to the eel sodium channel gene．Proc.Jpn.Acad,63(B):284-288; Ramaswami and Tano uye，1989，Two sodium-channel gene in Drosophila; Impl ications for channel diversity．Proc.Natn.Acad.Sci.U.S.A.86:2079-2082） 。分子遺伝学的アプローチにより、ショウジョウバエにおけるpara座が電位活性 化ナトリウムチャンネルαサブユニットをコードすることが明らかになり、一連 の重複するｃＤＮＡクローンから、paraｃＤＮＡ配列の全体が決定された（Loug hney et al.，1989，前出，Thackeray and Ganetzky 1994，前出）。多くのアプ ローチによって、全長のparaｃＤＮＡをアッセンブリーして、機能発現を調べる ことができると考えることは、当業者には容易に理解できるものである。そのよ うな方法には、入手可能な部分ｃＤＮＡをアッセンブリーして全長のｃＤＮＡと する方法、既存のｃＤＮＡクローンを用いてショウジョウバエｃＤＮＡライブラ リをスクリーニングすることで全長ｃＤＮＡを単離する方法、発表されている配 列に基づいてプライマーを用いて全長ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する方法などがある が、これらに限定されるものではない。本明細書に記載の本発明に使用される実 際の方法は、図１および図２にまとめてある。 電位活性化ナトリウムチャンネル活性を有するショウジョウバエのいずれかの 発達段階由来の組織あるいは電位活性化ナト リウムチャンネル活性を示すショウジョウバエ細胞系から好適なｃＤＮＡライブ ラリが得られることは、当業者には容易に理解できるものである。paraｃＤＮＡ を単離するためのｃＤＮＡライブラリを得るのに使用する組織または細胞系の選 択は、最初に公知のparaＤＮＡ配列または入手できるparaｃＤＮＡを用いてプロ ーブを形成して、para発現を測定することで行うことができる。 ｃＤＮＡライブラリの取得とpara発現の分析は、当業界で公知の標準的方法に よって行うことができる。公知のｃＤＮＡライブラリ構築方法およびＲＮＡ分析 方法は例えば、マニアティスらの著作に記載されている（Maniatis，T.，Fritsc h，E.F.，Sambrook，J.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Sprin g Harbor Laboralory，Cold Spring Harbor，New York，1982）。ＤＮＡおよび ＲＮＡのＰＣＲ増幅についての公知の方法は、例えばイニスらの著書に記載され ている（Innis,．M..，Gelfand，D.H.，Sninsky，J.J.，White，T.J.，PCR Prot ocols: A Guide to Methods and Applications，Academic Press Inc.，San Die go，California，1990）。 tipEのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列は現在未開示で ある。しかしながら、tipEをコードするＤＮＡについてはクローニングおよび配 列決定が行われており（Hall et al.，1994，Molecular and genetic analysis of tipE amutation affecting sodium channels in Drosophila．１９９４年４ 月２０〜２４日のイリノイ州シカゴでの第３５回Annual Drosophila Research C onferenceで発表; Hall and Feng 1994，The tipE locus defines a novel memb rane protein required during development to rescue adult paralysis.１９ ９４年９月７〜１１日のマサチューセッツ州ウッズホールでのSociety of Gener al Physiologistsの第４８回年会で発表）、それを用いて本発明で使用するtipE ＲＮＡが得られている。 ショウジョウバエtipE座をクローニングするのに多くのアプローチを用い得る ことは、当業者には容易に理解できる。それらの方法には、染色体歩行によって tipE突然変異に関連する染色体再配列を確認し、次に染色体再配列によって破壊 された転写単位に相当するｃＤＮＡを単離する方法（前出のHallらの発表（1994 ）で説明）などがあるが、それに限定されるものではない。別の方法としては、 転移可能要素の挿入によってtipE突然変異を起こし、次に転移可能要素挿入をフ ランキングするＤ ＮＡによるクローニングを行い、そのＤＮＡを用いてニューロンＲＮＡ由来のク ローン豊富なショウジョウバエ頭部特異的ｃＤＮＡライブラリをスクリーニング する方法がある。 ショウジョウバエ遺伝子のクローニングは、当業界で公知の標準的方法によっ て行うことができる。公知のショウジョウバエについての分子遺伝学的方法は、 例えばロバーツの著作に記載されている（Roberts，D.B., Drosophila A Practi cal Approach(IRL Press，Washington，D.C.，1986）。ｃＤＮＡライブラリの取 得は、当業界で公知の標準的方法によって行うことができる。公知のｃＤＮＡラ イブラリ構築方法は例えば、マニアティスらの著作に記載されている（Maniatis ，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.，Molecular Cloning: A Laboratory Manua l，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1982）。 精製された生理活性para電位活性化ナトリウムチャンネルは、いくつかの異な る物理的形態を持ち得る。paraおよびtipEは、全長の新生もしくはプロセシング されていないポリペプチドとして、あるいは部分的にプロセシングされたポリペ プチドまたはプロセシングされたポリペプチドの組み合わせとして存在す ることができる。paraおよび／またはtipEは、異なった形でスプライシングされ たＲＮＡによってコードされて、各種の一次アミノ酸配列を有する各種のparaお よび／またはtipE蛋白質の同体形(isoform)を与え得る。全長の新生paraおよび ／またはtipEポリペプチドは、特異的蛋白質開裂事象によって翻訳後に修飾され て、全長の新生ポリペプチドの断片を形成することができる。断片または断片の 物理的会合は、paraおよびtipEに関連する全ての生理活性（電位活性化ナトリウ ムチャンネル）を持ち得る。しかしながら、ナトリウムチャンネル活性の程度は 、個々のparaおよびtipE断片ならびに物理的に会合したparaおよびtipEポリペプ チド断片間で変わり得るものである。 生理活性のpara電位活性化カチオンチャンネルは、各種の別途スプライシング したｍＲＮＡによってコードすることができる。別途スプライシングしたparaｍ ＲＮＡの発現により、paraチャンネルの各種生理活性同体形を得ることができる （Thackeray and Ganetzky，1994、前出）。それらのparaの同体形は、生理活性 にtipEサブユニットを必要としない場合がある。各種のpara同体形は、そのpara 同体形が本明細書に記載の生理活性を有する場合には、本発明に含まれるもので ある。さらに、生 理活性para電位活性化ナトリウムチャンネルはいくつかの異なる物理的形態を持 ち得る。活性なpara電位活性化ナトリウムチャンネルは、paraおよびtipEの両方 のポリペプチドを含む複合体として存在することができ、あるいは活性なpara電 位活性化ナトリウムチャンネルがparaのみから成ることもできる。 上記の方法によって得られるクローン化paraおよびtipEｃＤＮＡは、好適なプ ロモーターおよび他の適切な転写調節要素を含む発現ベクターへの分子クローニ ングによって組換えで発現することができ、原核生物または真核生物の宿主細胞 に転移させて、組換えparaおよびtipEを形成することができる。そのような操作 の方法は、前出のマニアティスらの著作に記載されており、当業界では公知であ る。 本願において発現ベクターは、クローン化ＤＮＡの転写と適切な宿主でのそれ らのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義される。そのようなベクターを用 いて、細菌、藍藻植物、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞などの各 種宿主で真核ＤＮＡを発現させることができる。 個別に形成したベクターにより、細菌−酵母細胞または細菌−動物細胞などの 宿主間でのＤＮＡのシャトリングを行うこと ができる。適切に構築された発現ベクターには、宿主細胞での自己複製のための 複製の起源、選択可能なマーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー 数の可能性および活性プロモーターがなければならない。プロモーターとは、Ｒ ＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させて、ＲＮＡ合成を開始するＤＮＡ配列と定 義される。強力なプロモーターとは、ｍＲＮＡを高頻度で始動させるものである 。発現ベクターには、クローニングベクター、改変クローニングベクター、個別 に形成されたプラスミドまたはウィルスなどがあるが、これらに限定されるもの ではない。 各種の哺乳動物発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞で組換えparaおよびtipE を発現させることができる。組換えparaおよびtipE発現に好適と考えられる市販 の哺乳動物発現ベクターには、ｐＭＡＭｎｅｏ（Clontech）、ｐＭＣ１ｎｅｏ、 ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Stratagene）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ、ｐｃ ＤＮＡ３（Invitrogen）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、 ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（ ３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９ ）、 ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１ ４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）およびＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７ ５６５）などがあるが、これらに限定されるものではない。 各種の細菌発現ベクターを用いて、細菌細胞で組換えparaおよびtipEを発現さ せることができる。組換え発現に好適と考えられる市販の細菌発現ベクターには 、ｐＥＴベクター（Novagen）およびｐＱＥベクター（Qiagen）などがあるが、 これらに限定されるものではない。 各種の真菌発現ベクターを用いて、酵母などの真菌細胞で組換えparaおよびti pEを発現させることができる。組換え発現に好適と考えられる市販の真菌細胞発 現ベクターには、ｐＹＥＳ２（Invitrogen）およびピキア（Pichia）発現ベクタ ー（Invitrogen）などがあるが、これらに限定されるものではない。 各種の昆虫細胞発現ベクターを用いて、昆虫細胞で組換えparaおよびtipEを発 現させることができる。組換え発現に好適と考えられる市販の昆虫細胞発現ベク ターには、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Invitrogen）などがあるが、これに限定され るものではない。 paraおよびtipEをコードするＤＮＡを発現ベクターにクローニングして、組換 え宿主細胞で発現させることもできる。組換え宿主細胞は、原核生物または真核 生物のものであることができ、大腸菌（これに限定されるものではない）などの 細菌；酵母などの真菌；ヒト、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類由来の細胞系（こ れらに限定されるものではない）などの哺乳動物細胞；ショウジョウバエ（Schn eider-2、Ｋｃなど）およびカイコ由来の細胞系（これらに限定されるものでは ない）などの昆虫細胞などがあり得る。好適であると考えられる市販の哺乳動物 由来の細胞系には、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５８）、Ｈｅｌａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、Ｃ１２７１（ ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ −５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１７１）、Ｌ細胞およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ Ｃ ＲＬ１５７３）などがあるが、これらに限定されるものではない。 発現ベクターの宿主細胞への導入は、形質転換、トランスフ ェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション（lipofection）および電 気穿孔法などの多くの方法を介して行うことができるが、これらに限定されるも のではない。発現ベクターを有する細胞は、クローニングによって増殖させ、個 々に分析して、それらがparaおよびtipE蛋白質を産生するか否かを決定する。pa raおよびtipE発現宿主細胞クローンの確認は、抗paraまたは抗tipE抗体との免疫 反応性および宿主細胞関連の電位活性化ナトリウムチャンネル活性などのいくつ かの手段によって行うことができるが、これらに限定されるものではない。 paraおよびtipEＤＮＡの発現は、in vitroで形成される合成ｍＲＮＡを用いて 行うこともできる。合成ｍＲＮＡまたはpara電位活性化ナトリウムチャンネル産 生細胞から単離されたｍＲＮＡを、小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出物など の細胞を含まない各種系（これらに限定されるものではない）で効果的に翻訳し たり、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションなど（これに限定されるも のではない）の細胞に基づく系で効果的に翻訳することができるが、好ましくは カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションである。 ツメガエル卵母細胞でのparaカチオンチャンネルの機能発現 には、tipEの同時発現が必要であったが、他の組換え宿主細胞での他の発現系は tipEの同時発現を必要としない場合がある。そのような別の発現系および宿主細 胞には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞および細菌細胞などがあるが、これ らに限定されるものではない。 至適レベルの電位活性化ナトリウムチャンネル活性および／またはナトリウム チャンネル蛋白質を与えるparaおよびtipEＤＮＡ配列を決定するためには、以下 のものなどのparaおよびtipEＤＮＡ分子を構築することができるが、これらに限 定されるものではない。すなわち、paraおよびtipEｃＤＮＡの全長読み取り枠や イオンチャンネル蛋白質の特異的ドメインもしくはその蛋白質の再配列ドメイン のみをコードするｃＤＮＡの部分を有する各種構造体、あるいはparaまたはtipE の別のスプライシング体などである。構造体はいずれも、paraおよび／またはti pEｃＤＮＡの５’および／または３’未翻訳領域を全く含まないか、全て含むか または部分的に含むように形成することができる。電位活性化ナトリウムチャン ネル活性および蛋白質発現のレベルは、これら構造体を単独および組み合わせの 両方の形で、適切な宿主細胞に導入することで決定することができる。 一時的アッセイで至適発現を行うparaおよびtipEｃＤＮＡカセットを決定した後 、これらのparaおよびtipEｃＤＮＡ構造体を哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞 、卵母細胞、バキュロウィルス感染昆虫細胞、大腸菌および酵母S.cerevisiaeな ど（これらに限定されるものではない）の発現ベクター（組換えウィルスを含む ）に転移させる。 宿主細胞トランスフェクション体（transfectant）およびマイクロインジェク ションした卵母細胞を、電位活性化ナトリウムチャンネル活性のレベルとparaお よびtipE蛋白質のレベルの両方について、以下の方法によってアッセイすること ができる。組換え宿主細胞の場合、これには、paraおよびtipEＤＮＡを含む１個 または２個以上のプラスミドの同時トランスフェクションが関与する。卵母細胞 の場合、これにはparaおよびtipEについての合成ＲＮＡの同時注射が関与する。 発現を行わせるための適切な期間の後、細胞蛋白質を代謝的に、例えば³⁵Ｓ−メ チオニンで２４時間標識し、その後、細胞溶解物と細胞培養上清を回収し、para および／またはtipE蛋白質に対するポリクローナル抗体により免疫沈殿を行う。 para活性を検出するための他の方法には、paraおよびtipEｃ ＤＮＡによってトランスフェクションされた全細胞または部分細胞あるいはpara およびtipEｍＲＮＡを注射した卵母細胞での電圧活性化ナトリウムチャンネル活 性の直接測定が関与するものである。電位活性化ナトリウムチャンネル活性は、 paraおよびtipEＤＮＡを発現する宿主細胞の膜脱分極および電気生理学的特性に よって測定される。paraおよびtipEを発現する組換え宿主細胞の場合、パッチ電 位クランプ法を用いて、ナトリウムチャンネル活性を測定し、paraおよびtipE蛋 白質を定量することができる。卵母細胞の場合、パッチクランプ法ならびに二電 極電位クランプ法を用いて、ナトリウムチャンネル活性を測定し、paraおよびti pE蛋白質を定量することができる。 宿主細胞におけるparaおよびtipE蛋白質のレベルは、免疫親和力法および／ま たはリガンド親和力法によって定量される。paraおよびtipEを発現する細胞では 、細胞膜に結合する放射活性サキシトキシン（saxitoxin）の量を測定すること で、発現para分子の数についてのアッセイを行うことができる。paraもしくはti pE特異的親和力ビーズ（bead）またはtipE特異的抗体を用いて、例えば³⁵Ｓ−メ チオニン標識または未標識ナトリウムチャンネル蛋白質を単離する。標識したpa raおよびtipE蛋白質 は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。未標識のparaおよびtipE蛋白質は、pa raもしくはtipE特異的抗体を用いるウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡまた はＲＩＡアッセイによって検出する。 組換え宿主細胞におけるparaおよびtipEの発現後、paraおよびtipE蛋白質を回 収して、活性型のparaナトリウムチャンネルを得ることができる。いくつかのpa raナトリウムチャンネル精製法が利用でき、使用に適している。天然起源のpara の精製について本明細書に記した方法に従って、細胞溶解物および抽出物から、 あるいはならし（conditioned）培地から、塩分別、イオン交換クロマトグラフ ィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグ ラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを各種併用して、あるいはそ れらを単独で用いて、組換えparaを精製することができる。 さらに、全長の新生para、paraのポリペプチド断片またはparaのサブユニット に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて得られた免疫アフ ィニティカラムを用いて、組換えparaを他の細胞蛋白質から分離することができ る。 paraまたはtipEに対する単一特異性抗体は、paraまたはtipEに対して反応性の 抗体を含む哺乳動物抗血清から精製するか、 あるいはコーラーらの方法（Kohler and Milstein，Nature 256;495-497(1975) ）を用い、paraまたはtipEと反応性のモノクローナル抗体として得る。本発明に おいて使用する単一特異性抗体とは、paraまたはtipEについて均一(homogenous) 結合特性を有する単抗体種または多重抗体種と定義される。本願で使用される均 一結合とは、前述のように、抗体種が、paraまたはtipEと会合するものなどのよ うな特異的な抗原またはエピトープに結合する能力を指す。paraまたはtipE特異 的抗体の形成は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどの動物 、好ましくはウサギを、免疫アジュバントの存在下または不在下に、適切な濃度 のparaまたはtipEを用いて免疫感作することで行う。 免疫感作前の血清を集めて、最初の免疫感作を行う。各動物には、許容される 免疫アジュバントと会合するparaまたはtipE約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇを投 与する。そのような許容されるアジュバントには、完全フロイントアジュバント 、不完全フロイントアジュバント、ミョウバン沈降物、Corynebacterium parvum を含む水−油乳剤およびｔＲＮＡなどがあるが、これらに限定されるものではな い。最初の免疫感作は、好ましくは完全フロイントアジュバントに入ったparaま たはtipEを皮下投 与（ＳＣ）、腹腔内投与（ＩＰ）またはそれらの併用で、複数の部位に投与する ことから成る。各動物について定期的に（好ましくは週１回）採血を行って、抗 体力価を測定する。動物には、最初の免疫感作後にブースターを注射してもよく 、注射しなくても良い。ブースター注射を受ける動物には通常、同一経路によっ て不完全フロイントアジュバントに入った抗原を同量投与する。ブースター注射 は約３週間間隔で行い、最大力価が得られるまで続ける。各ブースター免疫感作 から約７日後または１回の免疫感作後毎週、動物から採血を行い、血清を回収し 、小分けした検体を約−２０℃で保存する。 paraまたはtipEと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交系マウス、 好ましくはＢａｌｂ／ｃをparaまたはtipEで免疫感作することで得られる。上述 のように、マウスの免疫感作は、約０．５ｍＬの緩衝液または生理食塩水にpara またはtipEを約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ入れ、それに等量 の許容されるアジュバントを加えたものをＩＰまたはＳＣ経路で投与して行う。 完全フロイントアジュバントが好ましい。マウスには、第０日に最初の免疫感作 を行い、約３日〜約３０週間経過させる。免疫感作したマウスに、静脈投与（Ｉ Ｖ） 経路で、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液に入ったpara約０．１〜約１０ｍｇ による１以上のブースター免疫感作を行う。抗体陽性マウスからのリンパ球、好 ましくは脾臓リンパ球を、当業界で公知の標準的手順によって免疫感作マウスか ら脾臓を摘出することで得る。安定なハイブリドーマ形成を可能とする条件下に 、脾臓リンパ球を適切な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞と混和して、ハイブリ ドーマ細胞を得る。融合相手には、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；Ｍ ＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０などがあり（これらに限定されるもの でない）、好ましくはＳｐ２／０である。抗体を産生する細胞および骨髄腫細胞 は、濃度約３０％〜約５０％で、約１０００ｍｏｌ重量のポリエチレングリコー ル中で融合する。融合ハイブリドーマ細胞の選択は、当業界で公知の手順により 、ハイポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを補給したダルベッコの改 良イーグル培地（ＤＭＥＭ）での成長によって行う。約１４、１８および２１日 目に、成長陽性穴から上清液を集め、抗原としてparaまたはtipEを用いる固相イ ムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）などのイムノアッセイによって抗体産生につ いてのスクリーニングを行う。培養液についてはオクタロニー沈 殿アッセイでも調べて、ｍＡｂのアイソタイプを決定する。抗体陽性穴からのハ イブリドーマ細胞を、マクファーソンの軟寒天法（MacPherson，Soft Agar Tech niques，Tissue Culture Methods and Applications，Kruse and Paterson，Eds .，Academic Press，1973）などの方法によってクローニングする。 プリスタンでプライミングしたＢａｌｂ／ｃマウスに、プライミングの約４日 後、ハイブリドーマ細胞約２×１０⁶〜約６×１０⁶を、マウス当たり約０．５ｍ Ｌで注射して、in vivoでモノクローナル抗体を得る。細胞を加えてから約８〜 １２日後、腹水を回収し、当業界で公知の方法によってモノクローナル抗体を精 製する。 約２％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中でハイブリドーマを成長させることに より抗paraまたは抗tipEｍＡｂをin vitroで形成して、十分な量の特異的ｍＡｂ を得る。ｍＡｂは、当業界で公知の方法によって精製する。 腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、沈殿、受動凝集、酵素結合免 疫収着検定（ＥＬＩＳＡ）法およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法などの各 種血清学的または免疫学的アッセイによって決定されるが、これらの方法に限定 されるも のではない。同様のアッセイを行って、体液中あるいは組織および細胞抽出物中 のparaまたはtipEの存在を検出する。 上述の単一特異性抗体取得法を利用して、paraもしくはtipEポリペプチド断片 または全長の新生paraもしくはtipEポリペプチド、あるいは個々のparaもしくは tipEサブユニットに特異的な抗体を得ることができることは、当業者には容易に 理解できる。具体的には、paraもしくはtipEのみあるいは完全に機能性の電位活 性化ナトリウムチャンネルに特異的な単一特異性抗体を形成できることは、当業 者には容易に理解できる。 paraおよびtipE抗体アフィニティカラムの形成は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イ ミドエステルで活性化したゲル担体であるアフィゲル−１０（Affigel-10; Bior ad）に抗体を加えて、抗体がアガロースゲルビーズ担体と共有結合を形成するよ うにして行う。次に、抗体をスペーサー鎖を有するアミド結合を介してゲルに結 合する。次に、残った活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８） で失活させる。カラムを水および続いて０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６ ）で洗浄して、未結合の抗体または無関係の蛋白を除去する。次に、カラムをリ ン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）で平衡とし、paraおよびti pEあるいは一方のサブユニットのみを有する細胞培養上清または細胞抽出物をカ ラムにゆっくり通す。次に、カラムをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄して、光学濃 度（Ａ₂₈₀）をバックグラウンドまで低下させ、０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ ｐＨ２．６）を用いて蛋白質を溶離させる。精製したparaまたはtipE蛋白質をリ ン酸緩衝生理食塩水に対して透析する。 他の節足動物におけるparaおよびtipE関連の遺伝子が電位活性化ナトリウムチ ャンネルのサブユニットをコードし、その動物種での相同性paraナトリウムチャ ンネルの機能発現も相同的tipEサブユニットとの同時発現を必要とすると考えら れる。para相同体は、イエバエMusca domestica （Williamson et al.，1993，K nockdown resistance(kdr)to DDT and pyrethroid insecticides maps to asodi um channel gene locus in the housefly(Musca domestica)．Mol Gen Genet 24 0:17-22; Knipple et al.，1994，Tight genetic linkage between the kdr ins ecticide resistance trait and a voltage-sensitive sodium channel gene in the house fly．Proc.Natn.Acad.Sci.U.S.A．91:2483-2487）およびオオタバコ ガ幼虫Heliothis viresce ns（Taylor et al.，1993，Linkage of pyrethroid i nsec ticide resistance to a sodium channel locus in the tobacco budworm．Inse ct Biochem.Molec.Biol.23:763-775）において部分クローニングおよび特性決定 されている。これらのpara相同体は、キイロショウジョウバエのpara遺伝子とそ れぞれ９２％および８９％で同一部分を有している。これらのpara相同体が共有 する高いアミノ酸同一性は、昆虫間におけるparaナトリウムチャンネルの構造的 ・機能的保存性を示し得るものである。さらに、ピレスロイド系殺虫剤に対する 抵抗性が、これら３つの動物全てのpara座に位置している（Hall，L.and Kasbek ar，D，1989，Insecticide Action，pp.99-114，Narahashi and Chambers(eds.) ，Plenum Press，New York; Willianson et al．、前出; Knipple et al.、前出 ; Taylor et al．、前出）。従って、全ての昆虫のpara電位活性化ナトリウムチ ャンネルの機能発現は、tipEとの同時発現を必要とするものと考えられる。 以下の実施例は、本発明を説明するためのものであるが、本発明はこれらに限 定されるものではない。実施例１ 全長paraｃＤＮＡのクローニング paraｃＤＮＡの３つの重複領域のＰＣＲ増幅と、次に図１に示した複合全長ク ローンのアッセンブリーによって、一連の全長paraｃＤＮＡクローンを得た。使 用している図式の詳細な説明を以下に記載する。１回のＰＣＲ反応で６５００ｂ ｐのparaｃＤＮＡ全体を増幅する試みは奏功しなかった。従って、一連の３つの 重複ＰＣＲ形成断片から多くのparaｃＤＮＡを形成した（図１）。オリゴヌクレ オチドプライマーの構成は、公知のparaｃＤＮＡ配列に基づいて行い（Loughney et al.，Molecular analysis of the para locus，a sodium channel gene in Drosphila ．Cell 58:1143-1154; Thackeray and Ganetzky 1994，Developmental ly Regulated alternative splicing generates a complex array of Drosophil a para sodium channel isoforms．J.Neuroscience 14:2569-2578）、プライマ ー配列は以下の通りとした。 多くの独立のＰＣＲで形成した各部分のparaｃＤＮＡ断片を単離し、ｐＢｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）ベクター（Stratagene）にサブクローニングした。最 初の２個の断片における選択肢のエキソンの組み合わせを各種変えて、これらの paraｃＤＮＡ断片のアッセンブリを行って、５個の異なった全長paraｃＤＮＡク ローンを得た。ただし、各クローンの３’断片は同一とした。 ＰＣＲ形成ｃＤＮＡクローンの配列分析から、それらが多くのＰＣＲ誘発ヌク レオチド置換を持ち、そのためにコードされている蛋白質の変更および切稜を起 こしていることが明らかになった。従って、これらのｃＤＮＡクローンは、機能 発現には使用できなかった。機能発現に好適なｃＤＮＡクローンの構築は、既存 のＰＣＲ形成ｃＤＮＡクローン、ショウジョウバエ頭部特異的ｃＤＮＡライブラ リから単離した既存のｃＤＮＡクロ ーン（Loughney et al.，1989、前出）および図２に示した新規なＰＣＲ形成ｃ ＤＮＡクローンを組み合わせることで行った。ｐＧＨ１９−１３−５へのparaｃ ＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を決定して、それが全長のpara蛋白質をコード していることを確認した。 機能発現に使用される６５１３ｂｐの複合paraｃＤＮＡクローンは以下のヌク レオチド配列を有する。 実施例２ in vitro またはin vivo での翻訳のためのparaおよびtipE合成ｍＲＮＡのin vit ro合成 paraおよびtipE合成ｍＲＮＡ取得のためのプロトコールは同一である。合成ｍ ＲＮＡは、paraおよびtipEｍＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡをバクテリオファ ージプロモーターを有するプラスミドベクターにクローニングし、クローン化pa raコードＤＮＡを有するプラスミドベクターを直線化し、プラスミドベクター上 のバクテリオファージプロモーターを特異的に認識するバクテリオファージから のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー ゼを用いるin vitroでのクローン化ＤＮＡの転写によって、in vitroで十分な量 で得られる。 バクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるバク テリオファージプロモーターを有する各種プラスミドベクターが入手可能であり 、それにはプラスミドｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＳＰ７０、ｐＳＰ７１、ｐＳ Ｐ７２、ｐＳＰ７３、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭ−４Ｚ、ｐＧＥＭ−３Ｚｆ、ｐ ＧＥＭ−５Ｚｆ、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ、ｐＧＥＭ−９ＺｆおよびｐＧＥＭ−１１Ｚ ｆなどがあるが、これらに限定されるものではない。これら一連のプラスミドは プロメガ（Promega）から市販されている。 ５’末端キャップ構造と３’ポリＡテールを有するｍＲＮＡを合成して、ｍＲ ＮＡの安定性を向上させることが有利であると考えられる。キャップ構造すなわ ち７−メチルグアノシンは、単純にＤＮＡ鋳型との反応混合物に７−メチルグア ノシンを加えることでｍＲＮＡの５’末端に組み込むことができる。ＤＮＡ依存 性ＲＮＡポリメラーゼは、それがｍＲＮＡを合成する際に、５’末端にキャップ 構造を組み込む。ポリＡテールは天然に多くのｃＤＮＡで認められるが、ＤＮＡ 鋳型の３’末端に単 純にポリＡテールをコードするＤＮＡ配列を挿入することでｍＲＮＡの３’末端 に付加させることができる。 ６５１３ｂｐの二本鎖paraコードＤＮＡを図２に示したように、ベクターｐＧ Ｈ１９を有するバクテリオファージにサブクローニングした。ｐＧＨ１９ベクタ ーは、ｐＧＥＭＨＥ（Evan Goulding and Steve Siegelbaum，Columbia Univers ity）の特有のユニークなＰｓｔＩ部位とＮｈｅＩ部位の間にＮｏｔＩおよびＸ ｈｏＩ制限酵素部位を挿入することにより、ｐＧＥＭＨＥベクター（Liman et a l.，1992，Subunit stiochiometry of a mammalian K+ Channel determined by construction of multimeric cDNAs．Neuron 9:861-871）から誘導した。クロー ニングparaをコードするＤＮＡを有するプラスミドベクターを制限酵素ＮｏｔＩ によって直線化し、製造業者の説明に従ってｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎ ｅ（Ambion）またはｍＣＡＰ（Stratagene）キットを用いて、５’末端キャップ 構造を有するparaｍＲＮＡをin vitroで合成した。 単離・精製したparaおよびtipEｍＲＮＡを、ウサギ網状赤血球溶解物および小 麦胚芽抽出物（いずれもPromega およびNew England Nuclear から市販）など（ これらに限定されるもので はない）の細胞を含まない系を用いるか、あるいはツメガエル卵母細胞へのマイ クロインジェクションなど（これに限定されるものではない）の細胞に基づく系 で、好ましくはツメガエル卵母細胞へのマイクロインジェクションで翻訳する。 ツメガエル卵母細胞に、十分な量の合成paraおよびtipEｍＲＮＡをマイクロイ ンジェクションして、paraおよびtipE蛋白質を得た。合成paraおよびtipEｍＲＮ Ａを標準法によってツメガエル卵母細胞に注射し、以下に記述のparaおよびtipE 発現についての分析を行った。実施例３ ツメガエル卵母細胞におけるpara電位活性化ナトリウムチャンネルの特性決定 アフリカツメガエル卵母細胞を、既報であって当業界で公知の標準的方法によ って取得し、注射を行った［Arena，J.P.，Liu，K.K.，Paress，P.S．& Cully， D.F.Mol.Pharmacol．40，368-374(1991); Arena，J.P.，Liu，K.K.，Paress，P. S.，Schaeller，J.M．& Cully，D.F.Mol.Brain Res．15，339-348(1992)］。成 体雌アフリカツメガエルに０．１７％トリカインメタンスルホネートによって麻 酔を施し、卵巣を外科的に摘出し、 ＮａＣｌ ８２．５、ＫＣｌ ２、ＭｇＣｌ₂１、ＣａＣｌ₂１．８、ＨＥＰＥＳ ５（ｍＭ単位）からなりＮａＯＨでｐＨ７．５に調節した培地（ＯＲ−２）の 入ったシャーレに入れた。卵巣葉を切開し、数回洗浄し、０．２％でコラゲナー ゼ（Sigma、１Ａ型）を含むＯＲ−２中で２〜５時間ゆっくり振盪した。卵胞層 の約５０％が除去された時点で、Ｖ期およびＶＩ期の卵母細胞を選択し、ＮａＣ ｌ ８６、ＫＣｌ ２、ＭｇＣｌ₂１、ＣａＣｌ₂１．８、ＨＥＰＥＳ ５、ピル ビン酸ナトリウム２．５、テオフィリン０．５、ゲンタマイシン０．１（ｍＭ単 位）からなりＮａＯＨでｐＨ７．５に調節した培地（ＮＤ−９６）に入れ、２４ 〜４８時間経過させてから注射した。卵母細胞に、paraＲＮＡ（５０〜２５０ｎ ｇ）および／またはtipEＲＮＡ（５０〜２５０ｎｇ）５０ｎＬを注射した。対照 卵母細胞には、水５０ｎＬを注射した。卵母細胞をＮＤ−９６中で２〜１０日間 インキュベーションしてから記録を行った。インキュベーションおよびコラゲナ ーゼ消化を１８℃で行った。 注射から２〜１０日後、室温下にＮａＣｌ １１５、ＫＣｌ ２、ＭｇＣｌ₂ １、ＣａＣｌ₂１．８、ＨＥＰＥＳ １０（ｍＭ単位）からなりＮａＯＨでｐＨ ７．５に調節した標準的 カエル生理食塩水中で、記録を行った。標準的な二本微小電極増幅器（Dagan 85 00またはTEV-200，Minneapolis，MN）を用いて卵母細胞の電位クランピングを行 った。ピペットを３Ｍ ＫＣｌで充填したところ、抵抗は０．５〜３．０ＭΩで あった。プレクシグラス（Plexiglas）記録チャンバ（容量２００μＬ）を、Ａ ｇ／ＡｇＣｌ電極によって接地した。ＴＬ−１インターフェースを有するＰＣＬ ＡＭＰソフトウェアパッケージ（Axon Instruments，Foster City,CA）を用いて 、データを取得・分析した。ピーク電位活性化ナトリウム電流の振幅を、一次漏 れ電流を引くことで求めるか、あるいは３０ｎＭのテトロドトキシン存在下の電 流を引くことでテトロドトキシン感受性として求めた。データは２〜５ｋＨｚで フィルターにかけ、１０〜３３ｋＨｚでサンプリングした。 paraおよびtipEについてのin vitroのＲＮＡを注射した卵母細胞は、電位活性 化ナトリウム電流を発現した（図３）。電流は、−１００ｍＶの保持電位から２ ０秒の電圧ステップで誘導した（電圧プロトコールは図３ａに描いてある）。pa raおよびtioE蛋白質を同時に発現する卵母細胞は、急速に活性化・不活化する内 向きの電流を示した（図３ｂ）。電流活性化の閾値は 約−３３±３ｍＶ（ｎ＝６）であり、ピーク電流は−３±２ｍＶ（ｎ＝６）で認 められた。電位活性化電流は、１０ｎＭのテトロドトキシンによって完全に阻害 された（図３のＢおよびＣ）ｎ＝１０）。不活化の電位依存性も調べた（図４） 。０ｍＶまでの試験パルスの前に、横座標に示した電位に対して、５０ｍ秒の前 パルスを加えた（図４）。正規化したピーク電流を、前パルス電位の関数として プロットした。滑らかな曲線は、データが関数Ｉ＝｛１＋ｅｘｐ［（Ｖ_m−Ｖ_1/2 ）／ｋ］｝^-1に適合しているということである。式中、Ｉは正規化電流であり、 Ｖ_mは前パルス電位であり、Ｖ_1/2は半最大不活化点であり、ｋは勾配である。Ｖ_1/2 は−４２±１ｍＶであり、勾配は５．２±０．５（ｎ＝４）であった。 いくつかの系統の証拠が、paraおよびtipEのin vitroＲＮＡの同時注射後に発 現される電流がショウジョウバエの電位活性化ナトリウム電流を表すことを示し ている。第１に、脊椎動物および無脊椎動物の電位活性化ナトリウムチャンネル の強力な選択的阻害剤であるテトロドトキシンによって、その電流は遮断される ［Catterall，W.A．Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.20，15-43(1980)］。卵母細胞 で発現されるparaナトリウム電流同 様、ショウジョウバエ胎仔ニューロンから記録されるナトリウム電流は、１０ｎ Ｍテトロドトキシンによって完全に阻害される［O′Dowd，D.K．and Aldrich，R .W．J.Neurosci.8，3633-3643(1988); Saito，M．and Wu，C.F．J.Neurosci.11 ，2135-2150(1991)］。第２に、非常に迅速な電流の活性化および不活化、活性 化の閾値ならびにピーク電流の電圧依存性は、培地でのショウジョウバエニュー ロンについて既報のデータと一致している［O′Dowd，D.K，and Aldrich，R.W． J.Neurosci.8，3633-3643(1988); Byerly，L．and Leung，H.T．J.Neurosci.8， 4379-4393(1988); Saito，M．and Wu，C.F，J.Neurosci.11，2135-2150(1991)］ 。最後に、定常状態不活化曲線のＶ_1/2および勾配が、ショウジョウバエ胎仔ニ ューロンについて報告されているものと非常に近かった［O′Dowd，D.K．and Al drich，R.W．J.Neurosci.8，3633-3643(1988)］。 個々のサブユニットparaまたはtipEの注射を行っても、機能性ホモメリック（ homomeric）チャンネルは発現しなかった。個々のサブユニットＲＮＡ２００ｎ ｇ〜３００ｎｇを卵母細胞に注射しても、注射８日後まで電位活性化ナトリウム 電流は生じなかった。それとは対照的に、両サブユニット１５０ｎｇを 同時注射すると、３日後には５０％、５日後には９０％の卵母細胞が電位活性化 ナトリウム電流を発現する。実施例４ 大腸菌発現ベクターへのparaおよびtipEｃＤＮＡのクローニング 大腸菌でのparaおよびtipEの発現のプロトコールは同一である。ｐＥＴシリー ズ（Novagen）など（これに限定されるものではない）の大腸菌発現ベクターにp ara発現カセットを転移させることで、組換えparaを大腸菌で産生させる。ｐＥ Ｔベクターは、厳重に調節したバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下に paraを発現する。この構造体を誘発性lac プロモータ−によって駆動されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを有する大腸菌宿主に転写した後、 適切なlac 基質（ＩＰＴＧ）を培地に加えると、paraの発現が誘導される。発現 paraのレベルは、上記のアッセイによって求める。 paraまたはtipEについての読み取り枠全体をコードするｃＤＮＡをｐＥＴ［１ ６］１１ａのＮｄｅＩ部位に挿入する。正の配向の構造体を配列分析によって確 認し、それを用いて発現宿主株ＢＬ２１を形質転換する。次に形質転換細胞を用 いて培養 物に接種して、paraおよびtipE蛋白質の産生を行わせる。培養物は、製剤が当業 者には公知であるＭ９またはＺＢ培地で成長させることができる。ＯＤ₆₀₀が約 １．５となるまで成長させた後、約１ｍＭのＩＰＴＧにより、３７℃で約３時間 かけてparaまたはtipEの発現を誘発する。実施例５ para およびtipEｃＤＮＡの哺乳動物発現ベクターへのクローニング paraおよびtipEｃＤＮＡ発現カセットを、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位 で、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）、ｐＢＣ１２ＢＩ［Cullen，B.R．Methods in Enzymol．152:684-704 1988］およびｐＥＥ１２（CellTech EP O 338841）など （これらに限定されるものではない）の強力で一般的な哺乳動物プロモーター、 あるいはｐＭＡＭｎｅｏ（Clontech）など（これに限定されるものではない）の 強力な誘発性哺乳動物プロモーターを含むベクターに連結する。 プロモーターに関して正の配向のparaおよびtipEｃＤＮＡを有するカセットを 、プロモーターの適切な制限部位３’に連結し、制限部位マッピングおよび／ま たは配列決定することで確 認した。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６ ５１）、ＣＶ−１［Sackevitz et al,，Science 238:1575(1987)］、２９３、Ｌ 細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ６３６２）など（これらに限定されるものではない）の 各種宿主細胞に、電気穿孔法または化学的方法（カチオンリポソーム、ＤＥＡＥ デキストラン、リン酸カルシウム）など（これらに限定されるものではない）の 標準的方法によって導入する。トランスフェクションされた細胞および細胞培養 抽出物を回収し、下記のようにして、paraおよびtipE発現についての分析を行う ことができる。 哺乳動物の一時的発現に使用される全てのベクターを用いて、paraおよびtipE を発現する安定な細胞系を確立することができる。発現ベクターにクローニング した未変化のparaおよびtipEｃＤＮＡ構造体は、宿主細胞をプログラムして、細 胞内paraおよびtipE蛋白質を形成するようにするものと予想される。トランスフ ェクション宿主細胞には、ＣＶ−１［Sackevitz et al.，Science 238: 1575(19 87)］、ｔｋ−Ｌ［Wigler et al.，Cell 11:223(1977)］、ＮＳ／０およびｄＨ Ｆｒ−ＣＨＯ［Kaufman and Sharp，J.Mol.Biol.159:601,(1982)］などがあるが 、こ れらに限定されるものではない。 paraおよびtipEｃＤＮＡを有するベクターとＧ４１８、アミノグリコシドホス ホトランスフェラーゼ、ｐＬＮＣＸ［Miller，A.D.and Rosman G.J,Biotech New s 7:980-990(1989)］；ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂホスホトラン スフェラーゼ、ｐＬＧ９０［Gritz.L and Davies，J.，GENE 25:179(1983)］； ＡＰＲＴ、キサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ、ｐＭＡ Ｍ（Clonetech）［Murray et al.，Gene 31:233(1984)］など（これらに限定さ れるものではない）の薬剤選択プラスミドとの同時トランスフェクションによっ て、安定にトランスフェクションされたクローンを選択することができる。para およびtipEのレベルは、上記のアッセイによって定量される。 paraおよびtipEｃＤＮＡ構造体を、増幅可能な薬剤抵抗性マーカーを有するベ クターに連結して、可能な最も高いレベルのparaおよびtipEを合成する哺乳動物 細胞クローンの生産を行う。これらの構造体を細胞に導入した後、プラスミドを 有するクローンを適切な試薬で選択し、試薬用量を上昇させて選択することによ り、高コピー数のプラスミドを有する過剰発現クローン を単離する。 細胞に、para、tipEまたはparaおよびtipEの両方をトランスフェクションする 。適切な選択性マーカーの存在下に成長させることで、安定な細胞クローンを選 択する。個々の抵抗性クローンを単離し、それが完全なparaもしくはtipE遺伝子 またはpara遺伝子とtipE遺伝子の両方を有することを示す。paraおよびtipEｃＤ ＮＡを有するクローンについて、paraおよびtipE蛋白質に特異的な抗体を用いる 免疫沈殿法、ウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光法などの免疫学的方法を 用いて、発現を分析する。paraおよびtipE配列から予測されるアミノ酸配列から 合成したペプチドを接種したウサギから抗体を得る。パッチクランプ電気生理学 的方法および³Ｈ−サキシトキシン結合アッセイを用いて、発現も分析する。 paraおよびtipEを発現する細胞を、安定にあるいは一時的に使用して、電位活 性化ナトリウムチャンネルの発現およびリガンド結合活性についての検査を行う 。これらの細胞を用い、他の細胞に関して、本明細書に記載のように、para電位 活性化ナトリウムチャンネルを調節、阻害または活性化する能力を確認・調査す る。ショウジョウバエ発現ベクターへのparaおよびtipEｃＤＮＡのクローニング paraおよびtipEｃＤＮＡ発現カセットを、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位 で、ｐＲｍＨａ−１（Bunch et al.，1988，Characterization and use of the Drosophila metallothionein promoter in cultured Drosophila melanogaster cells．Nucleic Acids Research 16:1043-1060）およびｐＣａＳｐｅＲ−ａｃｔ （Thummel et al.，1988，Vectors for Drosophila P-element-mediated transf ormation and tissue culture transfection．Gene 74:445-456）など（これら に限定されるものではない）の構成または誘発性ショウジョウバエプロモーター を有するベクターに連結する。 プロモーターに関して正の配向でparaおよびtipEｃＤＮＡを有するカセットを 、プロモーターの適切な制限部位３’に連結し、制限部位マッピングおよび／ま たは配列決定によって確認する。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを、シュナイダ ー−２（Schneider-2）およびＫｃ細胞など（これらに限定されるものではない ）の各種宿主細胞に、電気穿孔法または化学的方法（カチオンリポソーム、ＤＥ ＡＥデキストラン、リン酸カルシ ウム）など（これらに限定されるものではない）の標準的方法によって導入する 。トランスフェクションされた細胞および細胞培養抽出物を回収し、本明細書に 記載のようにして、paraおよびtipE発現についての分析を行うことができる。 ショウジョウバエの一時的発現に使用される全てのベクターを用いて、paraお よびtipEを発現する安定な細胞系を確認することができる。発現ベクター中にク ローニングした未変化のparaおよびtipEｃＤＮＡ構造体は、宿主細胞をプログラ ムして、細胞内paraおよびtipE蛋白質を形成するようにするものと予想される。 paraおよびtipEｃＤＮＡを有するベクターとＧ４１８、アミノグリコシドホス ホトランスフェラーゼ［Miller，A.D.and Rosman G.J.Biotech News 7:980-990( 1989)］；ならびにハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフ ェラーゼ［Gritz.L and Davies，j.，GENE 25:179(1983)］など（これらに限定 されるものではない）の薬剤選択プラスミドとの同時トランスフェクションによ って、安定にトランスフェクションされたクローンを選択することができる。pa raおよびtipEのレベルは、上記のアッセイによって定量される。 paraおよびtipEｃＤＮＡ構造体を、増幅可能な薬剤抵抗性マーカーを有するベ クターに連結して、可能な最も高いレベルのparaおよびtipEを合成するショウジ ョウバエ細胞クローンの生産を行う。これらの構造体を細胞に導入した後、プラ スミドを有するクローンを適切な試薬で選択し、試薬用量を上昇させて選択する ことにより、高コピー数のプラスミドを有する過剰発現クローンを単離する。 細胞に、para、tipEまたはparaおよびtipEの両方をトランスフェクションする 。適切な選択性マーカーの存在下に成長させることで、安定な細胞クローンを選 択する。個々の抵抗性クローンを単離し、それが完全なparaもしくはtipE遺伝子 またはpara遺伝子とtipE遺伝子の両方を有することを示す。paraおよびtipEｃＤ ＮＡを有するクローンについて、paraおよびtipE蛋白質に特異的な抗体を用いる 免疫沈殿法、ウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光法などの免疫学的方法を 用いて、発現を分析する。paraおよびtipE配列から予測されるアミノ酸配列から 合成したペプチドを接種したウサギから抗体を得る。パッチクランプ電気生理学 的方法および３Ｈ−サキシトキシン結合アッセイを用いて、発現も分析する。 paraおよびtipEを発現する細胞を、安定にあるいは一時的に使用して、電位活 性化ナトリウムチャンネルの発現およびリガンド結合活性についての検査を行う 。これらの細胞を用い、他の細胞に関して、本明細書に記載のように、para電位 活性化ナトリウムチャンネルを調節、阻害または活性化する能力を確認・調査す る。実施例６ 昆虫細胞での発現のためのバキュロウィルス発現ベクターへのparaおよびtipEｃ ＤＮＡのクローニング ＡｃＮＰＶウィルスのゲノムに由来するバキュロウィルスベクターを構築して 、Ｓｆ９系の昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ＃１７１１）でｃＤＮＡを高レベルで 発現する。paraおよび／またはtipEｃＤＮＡを発現する組換えバキュロウィルス を、以下の標準的方法（InVitrogen Maxbac マニュアル）によって得る。paraお よびtipEｃＤＮＡ構造体を、ｐＡＣ３６０およびｐＢｌｕｅＢａｃベクター（In Vitrogen）などの各種バキュロウィルス転移ベクター中のポリヘドリンプロモー ターの下流で連結する。バキュロウィルス転移ベクターと直線化ＡｃＮＰＶゲノ ムＤＮＡ［Kitts，P.A.，Nuc.Acid.Res.18:5667(1990)］のＳｆ ９への同時トランスフェクション後の相同的組換えによって、組換えバキュロウ ィルスを得る。組換えｐＡＣ３６０ウィルスの確認は、感染細胞において封入体 を不在とすることで行い（Summers，M.D．and Smith，G.E.，Texas Agriculture Exp．Station Bulletin No.1555）、組換えｐＢｌｕｅＢａｃウィルスの確認は 、β−ガラクトシダーゼ発現（Vialard,et al.，1990，J.Virol,，64，pp.37-50 ）に基づいて行う。プラーク精製およびｓｆ９細胞のparaおよび／またはtipE組 換えバキュロウィルスによる感染後、paraおよびtipE発現を、本明細書に記載の アッセイによって測定する。 paraまたはtipEに関する全読み取り枠をコードするｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅＢ ａｃＩＩのＢａｍＨＩ部位に挿入する。ポリヘドリンプロモーターに関して正の 配向の構造体を配列分析によって確認し、それを用いて、直線ＡｃＮＰＶ微弱型 ＤＮＡの存在下にＳｆ９細胞をトランスフェクションする。 真正の活性paraおよびtipEは、感染細胞の膜に会合していることが認められる 。膜標本は、標準的方法によって感染細胞から得られる。実施例７ 酵母発現ベクターへのparaおよびtipEｃＤＮＡのクローニング 異種蛋白質の細胞内発現を行うよう形成した発現ベクターに最適なparaおよび tipEｃＤＮＡ構造体を挿入した後、組換えparaおよびtipEを酵母S.cerevisiaeで 産生させる。細胞内発現を行うため、ＥｍＢＬｙｅｘ４などのベクターをparaま たはtipEシストロンに連結する［Rinas，U.et al.，Biotechnology 8:543-545(1 990); Horowitz B.et al.，J.Biol.Chem.265:4189-4192(1989)］。発現paraおよ びtipEのレベルは、本明細書に記載のアッセイによって求める。実施例８ 組換えparaおよびtipEの精製 組換えで得たparaおよびtipEを、抗体アフィニティクロマトグラフィーによっ て精製することができる。paraまたはtipE抗体アフィニティカラムの形成は、Ｎ −ヒドロキシコハク酸イミドエステルで予備活性化したゲル担体アフィゲル−１ ０（Biorad）に抗paraまたは抗tipEの抗体を加えて、抗体がアガロースゲルビー ズ担体と共有結合を形成するようにして行う。次に、抗体をスペーサー鎖とのア ミド結合を介してゲルに結合す る。次に、残った活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で失 活させる。カラムを水および続いて０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で 洗浄して、未結合の抗体または無関係の蛋白質を除去する。次にカラムを、界面 活性剤などの適切な膜可溶化剤とともにリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）で 平衡とし、可溶化paraまたはtipEを含む細胞培養上清または細胞抽出物をカラム にゆっくり通す。次にカラムを、界面活性剤を加えたリン酸緩衝生理食塩水で洗 浄して、光学濃度（Ａ₂₈₀）をバックグラウンドまで低下させ、界面活性剤を加 えた０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）を用いて蛋白質を溶離させる。 精製したparaまたはtipE蛋白質を、界面活性剤を加えたリン酸緩衝生理食塩水に 対して透析する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 リユー，ケン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ファン・デル・プローグ，レオナルダス・ エイチ・テイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ワン，ペイイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ワームケ，ジエフリー・ダブリユー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 アリーナ，ジヨージフ・ピー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ホール，リンダ・エム アメリカ合衆国、ニユーヨーク・14260、 バツフアロー、ホツクステツタ・ホール・ 329 (72)発明者 フエン，グーピング アメリカ合衆国、ミズーリ・63110、セン ト・ルイス、サウス・ユークリツド・アベ ニユー・660

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． αサブユニットおよびβサブユニットを有してなる、組換え生理活性電位 活性化カチオンチャンネル。 ２． 前記αサブユニットがパラ（para）である請求項１に記載の組換え生理活 性電位活性化カチオンチャンネル。 ３． 前記βサブユニットがチップＥ（tipE）である組換え生理活性電位活性化 カチオンチャンネル。 ４． 電位活性化カチオンチャンネル蛋白質または該蛋白質の機能性誘導体をコ ードする１以上の組換えクローン化遺伝子を含む組換え宿主細胞。 ５． 電位活性化カチオンチャンネルをコードする前記クローン化遺伝子がｃＤ ＮＡである請求項４に記載の組換え宿主細胞。 ６． 電位活性化カチオンチャンネルをコードする前記クローン化遺伝子がゲノ ムＤＮＡである請求項４に記載の組換え宿主細胞。 ７． 宿主細胞が生理活性電圧活性化カチオンチャンネルを発現する請求項４に 記載の組換え宿主細胞。 ８． 前記生理活性電位活性化カチオンチャンネルがαサブユ ニットおよびβサブユニットを有してなる請求項７に記載の組換え宿主細胞。 ９． 前記αサブユニットがパラ（para）である請求項８に記載の組換え宿主細 胞。 １０． 前記βサブユニットがチップＥ（tipE）である請求項８に記載の組換え 宿主細胞。 １１． 電位活性化カチオンチャンネルとして機能する実質的に純粋な形の蛋白 質。 １２． 前記電位活性化カチオンチャンネルがαサブユニットおよびβサブユニ ットを有してなる請求項１１に記載の蛋白質。 １３． 前記αサブユニットがパラ（para）である請求項１２に記載の蛋白質。 １４． 前記βサブユニットがチップＥ（tipE）である請求項１２に記載の蛋白 質。 １５． 組換え宿主細胞での電位活性化カチオンチャンネルの発現方法であって 、電位活性化カチオンチャンネル蛋白質をコードする１以上の組換えクローン化 遺伝子を含有する組換え宿主細胞を培養する段階、ならびに生理活性電位活性化 カチオンチャンネルを産生する前記宿主細胞で前記組換えクローン化遺 伝子を発現する段階を含む方法。 １６． 前記チャンネルがαサブユニットおよびβサブユニットを有してなる請 求項１５に記載の方法。 １７． 前記αサブユニットがパラ（para）である請求項１６に記載の方法。 １８． 前記βサブユニットがチップＥ（tipE）である請求項１６に記載の方法 。 １９． 生理活性電位活性化カチオンチャンネルサブユニットをコードする配列 番号７で示したヌクレオチド配列を特徴とする単離・精製ＤＮＡ分子。 ２０． 前記ＤＮＡが電位活性化カチオンチャンネルのαサブユニットをコード する請求項１９に記載の単離・精製ＤＮＡ分子。 ２１． 組換え宿主細胞での前記ＤＮＡ分子の発現のための請求項１９に記載の ＤＮＡ分子を有して成る発現ベクター。 ２２． 請求項２１に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。