JP2004500085A - ヒトバニロイドレセプターvr3をコードするdna - Google Patents
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Abstract
ヒトVR1レセプターをコードするDNAがクローン化されかつ特徴づけられた。該組換えタンパク質は生物学的に活性なタンパク質を形成することが可能である。cDNAが組換え宿主細胞中で発現され、それは活性の組換えタンパク質を産生する。該組換えタンパク質は組換え宿主細胞からもまた精製される。加えて、レセプター活性の調節物質の同定方法を確立するのに該組換え宿主細胞が利用され、そしてレセプター調節物質が同定される。
Description
【0001】
(発明の背景)
有害な化学的、熱的および機械的刺激は、知覚神経節(例えば後根、節状および三叉神経節)中の小径知覚ニューロン(侵害受容器)の末梢神経端を興奮させ、そして疼痛として知覚されるシグナルを起こす。これらのニューロンは、炎症性もしくは虚血性の病状の間の細胞外空隙中での変化から生じる有害なもしくは潜在的に有害な刺激(熱)ならびに組織損傷(H+(局所組織アシドーシス)および/もしくは伸長)の検出に決定的である(WallとMelzack、1994)。「辛い」トウガラシ(capsicum pepper)中の主刺激成分、バニロイドカプサイシン(8−メチル−N−バニリル−6−ノネナミド)は、細くもしくは無髄の侵害求心性神経の非常に選択的な活性化物質である(Szolcsanyi、1993;Szolcsanyi、1996)。電気生理学的研究は、バニロイドが陽イオンに対し非選択的に浸透性である原形質膜チャンネルを活性化することにより小知覚ニューロンを興奮させることを示している(BevanとSzolcsanyi、1990;Ohら、1996;Woodら、1988)。ユーホルビア属(Euphorbia)植物からの超強力な三環性ジテルペンレシニフェラトキシン(RTX;(Szolcsanyiら、1991))は、ナノモル濃度の親和性でカプサイシン結合部位で結合し、そして、ラット体性および内臓の第一次感覚ニューロンへのカプサイシンレセプターの非常に局在化された分布を示している(Szallasi、1995)。
【0002】
バニロイドレセプターVR1(Caterinaら、1997)は、その閾値がプロトンもしくはカプサイシンの存在下で低下される熱検出レセプターであると考えられている(Tominagaら、1998)。カプサイシンおよびプロトンは、痛覚および神経原性炎症に関与する第一次感覚ニューロンによりほぼ独占的に発現される特定の膜認識部位(バニロイドレセプター)で相互作用する(BevanとSzolcsanyi、1990)。バニロイド(「カプサイシン」)レセプターVR1はカプサイシンおよびRTXにより活性化され、また、VR1の活性化はアンタゴニスト、カプサゼピン(CPZ;(Bavenら、1992))およびルテニウムレッド(RR;(Caterinaら、1997;Woodら、1988))により封鎖(block)される。
【0003】
VR1のアミノ酸配列のハイドロパシシティ(hydropathicity)分析は、6個の潜在的な膜貫通領域(S1−S6)、およびS5とS6との間の1個の推定の孔ループ領域を示す。大型の細胞内ドメインは3個のアンキリンリピートドメインを含有する。(Caterinaら、1997)。このチャンネルは推定の「貯蔵量に操作される(store−operated)」TRPカルシウムチャンネルファミリーとの有意の構造類似性を有する。VR1は、はっきりした外側への整流を示すリガンド依存性非選択的陽イオンチャンネルである(Caterinaら、1997)。重要なことに、VR1は細胞機能の調節において非常に重要であることが既知のイオン、Ca2+に対し高度に浸透性である((BlackstoneとSheng、1999;GuptaとPushkala、1999;van Haasterenら、1999))。
【0004】
ゲノムデータベースの検索は、VR1に構造上関係したサブユニットVRL−1を示した。ラットおよびヒトのVRL−1(それぞれAF129113およびAF129112)はラットVR1(AF029310))に約49%同一かつ66%類似である(Caterinaら、1999)。Woodらによりクローン化されたヒトVRLタンパク質(AF103906)(未発表)はVRL−1(AF129112)に99%同一である。最近、AF129112にほぼ同一である(唯一の差異はQ418の欠失である)hVRCC(ヒトバニロイドレセプター様陽イオンチャンネル)を記述したPartisetiとRenardによる特許出願が公開された。われわれはこれらの配列をVR2と称することができる。全体として、VR1およびVR2の予測される構造は、元はキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)からクローン化された一過性受容器電位(TRP)チャンネル(光伝導である役割を演じているCa浸透可能なチャンネル)により規定されるイオンチャンネルの一ファミリーに特徴的である(LuとWong、1987;MinkeとSelinger、1996)。このレセプターはまた疼痛を生じさせる熱の知覚にも関与しているようである(Caterinaら、1999)。卵母細胞およびHEK細胞中でのVR2の発現は、通常、侵害温度(>53℃)に対する細胞の感受性を与え、それはCPZに対し感受性でなかったがしかし10μMのルテニウムレッドでほぼ完全に封鎖された。VR2の活性化はCa2+に対する高い浸透性を伴う非選択的陽イオン電流を誘導する。興味深いことに、熱感受性の閾値は侵害刺激の反復適用とともに低下したが、しかし閾値以下の温度でしなかった(Caterinaら、1999)。
【0005】
529アミノ酸によりコードされるラットSIC(伸長阻害性チャンネル;ジェンバンク(Genbank)AB015231)は伸長により阻害されるイオンチャンネルを形成すると考えられる(Suzukiら、1999)。ラットVR1に相同な最初の379アミノ酸。SICはVRファミリーの大型のN末端細胞質ドメインを欠くが、しかし推定のTM1の前のAエキソンに相同な1配列を含有する。ラットSICの推定のTM6の中央で開始する最後の163アミノ酸は本発明のヒトVR3 A+B−の対応するアミノ酸配列に類似である。
【0006】
本発明は新規バニロイドレセプターファミリーメンバーVR3のクローニングおよび機能を記述する。この遺伝子は最低3種のアイソフォームを創製するように選択的にスプライスされるようである。
【0007】
(発明の要約)
ヒトバニロイドレセプター3(hVR3)の3種のアイソフォームをコードするDNA分子がクローン化されかつ特徴づけられた。これらのタンパク質の生物学的および構造的特徴を、アミノ酸およびヌクレオチド配列がそうであるように開示する。該組換えタンパク質はレセプターVR3の調節物質を同定するのに有用である。本明細書で開示されるアッセイで同定される調節物質は治療薬として有用であり、これらは炎症性の病状の治療のため、ならびに、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパシー、乳房摘出後疼痛、複合局所疼痛症候群、関節炎(例えば慢性関節リウマチおよび骨関節炎)、ならびに潰瘍、神経変性性疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、過敏性腸症候群および乾癬に伴う難治性疼痛のための鎮痛薬としての使用のための候補である。用途は、中枢神経系疾患、腸管の疾患、異常増殖、ならびにとりわけ消化器系、前立腺および女性生殖器の癌、潰瘍、肝疾患、腎疾患の治療、後根神経節により刺激される内臓の制御、またはとりわけこれらのhVR3ポリペプチドの異常発現に関連するいかなる障害も診断もしくは治療することを包含する。別の局面において、本発明は、本発明により提供される物質を使用するアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法、ならびにhVR3の不均衡を伴う病状を治療することに関する。組換えDNA分子およびその部分は、DNA分子の相同物の単離、DNA分子のゲノム同等物の同定および単離、ならびに突然変異体の形態のDNA分子の同定、検出もしくは単離に有用である。
【0008】
(詳細な記述)
本発明はVR3と命名されたヒトバニロイドレセプターの3種のアイソフォーム、すなわちVR3A+B−、VR3A−B−およびVR3A+B+を記述する。ヒトVR3レセプターcDNAのヌクレオチド配列は、それぞれヒトVR3 A+B−、A−B−およびA+B+の871(図3)、811(図5)および742(図8)アミノ酸をコードする約2616(図1)、2436(図4)および2229(図6)塩基対の単一の大きいオープンリーディングフレームを示した。VR3 A+B−のcDNAは図2に示されるとおり約337および約547ヌクレオチドの5’および3’非翻訳伸長を有し、ここで5’UTRは1−337であり、コーディング領域は338−2953であり、そして3’UTRは2954−3500である。VR3 A+B+のcDNAは図7に示されるとおり約836および約994ヌクレオチドの5’および3’非翻訳伸長を有し、ここで5’UTRは1−836であり、コーディング領域は837−3065であり、そして3’UTRは3066−4059である。第一の同じフレーム内のメチオニンが、それぞれアイソフォームA+B−、A−B−およびA+B+について約98,242Da、91,294Daおよび83,310Daの推定される分子量(Mr)をもつヒトVR3レセプタータンパク質を予測する1個のオープンリーディングフレームの開始コドンと指定された。A+B−アイソフォームは871アミノ酸の1個のタンパク質をコードする。VR3 A−B−はVR3A+B−のアミノ酸382ないし441からの60アミノ酸の欠失を含有する。VR3 A+B+は、アミノ酸736まで(その後に6個の不一致アミノ酸および1個の終止コドンが存在する)A+B−に同一である。VR3 A+B+アイソフォームは推定のTM6の後20アミノ酸伸長する。
【0009】
予測されたヒトVR3レセプタータンパク質が、ヌクレオチドおよびタンパク質データベースと整列され、そしてバニロイドレセプターファミリー(VR1およびVR2)と関係づけられる。大型の推定のN末端親水性セグメント(約467アミノ酸)、N末端領域中3個の推定のアンキリンリピートドメイン、6個の予測される膜貫通領域および1個の孔領域を包含する、レセプターのこのファミリー中で見出される数種の保存されたモチーフが存在する。VR3 A+B−はヒトVR1に43%同一、ヒトVRL−1(AF129112)およびヒトVRL(AF103906)双方に39%同一である。従って、本明細書に記述されるVR3レセプターは明らかにバニロイドレセプターファミリーの新規遺伝子である。
【0010】
ヒトVR3A+B−およびVR3A−B−の形態はアミノ酸694から終わりまでラットの伸長阻害性チャンネルSIC[ジェンバンク(Genbank)受託AB015231]に類似である。529アミノ酸によりコードされるラットSICは伸長により阻害されるイオンチャンネルを形成すると考えられている。それはVRファミリーの大型のN末端細胞質ドメインを欠くが、しかし推定のTM1の前のAエキソンに相同な1個の配列を含有する。
【0011】
本明細書に記述されるVR3コーディング領域の完全なゲノム配列は、ジェンバンク(Genbank)への380512塩基対配列提出(ヒトクローンRPCI1−7G5(AC007834)、Worley,K.C.による直接提出)中に見出されるようである。このジェンバンク(Genbank)登録は、DNA配列の多くのフラグメントおよび提案された隣接配列を列挙するが、しかし、核酸配列のいかなる分析も欠き、そしてVR3核酸配列の特徴を特徴づけもしくはVR3遺伝子の存在を記述できていない。
ヒトVR3レセプター核酸の単離
本発明は、ヒトVR3レセプター産生細胞から単離されたヒトVR3レセプターをコードするDNAに関する。本明細書で使用されるところのヒトVR3レセプターはヒトバニロイドレセプターとして特異的に機能することができるタンパク質を指す。
【0012】
ヒトVR3レセプターの完全なアミノ酸配列は以前に知られておらず、また、既知のヒトVR3レセプターをコードする完全なヌクレオチド配列も知られていなかった。広範な細胞および細胞型が記述されるヒトVR3レセプターを含有することができることが予測される。
【0013】
他の細胞および細胞系もまたヒトVR3レセプターcDNAを単離するための使用に適するかもしれない。適する細胞の選択は、本明細書に記述される細胞抽出物もしくは全細胞アッセイでヒトVR3レセプター活性についてスクリーニングすることにより行ってよい。これらのアッセイのいずれか1つでヒトVR3レセプター活性を所有する細胞は、ヒトVR3レセプターのDNAもしくはmRNAの単離に適することができる。
【0014】
当該技術分野で既知の多様な手順のいずれかを使用してヒトVR3レセプターDNAを分子クローン化してよい。これらの方法は、限定されるものでないが、適切な発現ベクター系中でのヒトVR3レセプター含有cDNAライブラリーの構築後のヒトVR3レセプター遺伝子の直接機能的発現を挙げることができる。別の方法は、ヒトVR3レセプターサブユニットのアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブで、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクター中で構築されたヒトVR3レセプター含有cDNAライブラリーをスクリーニングすることである。付加的な一方法は、ヒトVR3レセプタータンパク質をコードする部分的cDNAで、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクター中で構築されたヒトVR3レセプター含有cDNAライブラリーをスクリーニングすることより成る。この部分的cDNAは、精製されたヒトVR3レセプタータンパク質のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計によるヒトVR3レセプターDNAフラグメントの特異的PCR増幅により得られる。
【0015】
別の方法は、ヒトVR3レセプター産生細胞からRNAを単離しかつ該RNAをインビトロもしくはインビボ翻訳系を介してタンパク質に翻訳することである。ペプチドタンパク質へのRNAの翻訳はヒトVR3レセプタータンパク質の少なくとも一部分の産生をもたらすことができ、それは例えば抗ヒトVR3レセプター抗体との免疫学的反応性もしくはヒトVR3レセプタータンパク質の生物学的活性により同定することができる。この方法において、ヒトVR3レセプター産生細胞から単離されたRNAのプールを、ヒトVR3レセプタータンパク質の少なくとも一部分をコードするRNAの存在について分析することができる。RNAのプールのさらなる分画を行ってヒトVR3レセプターRNAを非ヒトVR3レセプターRNAから精製することができる。この方法により製造されたペプチドもしくはタンパク質を分析してアミノ酸配列を提供してよく、それを順に使用してヒトVR3レセプターcDNAの製造のためのプライマーを提供するか、もしくは、翻訳に使用されるRNAを分析してヒトVR3レセプターをコードするヌクレオチド配列を提供しかつヒトVR3レセプターcDNAのこの製造のためのプローブを生じさせることができる。この方法は当該技術分野で既知であり、かつ、例えばManiatis,T.、Fritsch,E.F.、Sambrook,J.中、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989中に見出すことができる。
【0016】
他の型のライブラリー、ならびに他の細胞もしくは細胞型から構築されたライブラリーがヒトVR3レセプターをコードするDNAを単離するのに有用であるかもしれないことが当業者に容易に明らかである。他の型のライブラリーは、限定されるものでないが、他の細胞、ヒト以外の生物体のVR3レセプター由来のcDNAライブラリー、ならびにYAC(酵母の人工染色体)を包含するゲノムDNAライブラリーおよびコスミドライブラリーを挙げることができる。
【0017】
適するcDNAライブラリーを、ヒトVR3レセプター活性を有する細胞もしくは細胞系から調製してよいことが当業者に容易に明らかである。ヒトVR3レセプターcDNAを単離するためのcDNAライブラリーの調製での使用のための細胞もしくは細胞系の選択は、最初にヒトVR3レセプター関連の生物学的活性の測定もしくはリガンド結合アッセイを使用して細胞関連のヒトVR3レセプター活性を測定することにより行ってよい。
【0018】
cDNAライブラリーの調製は当該技術分野で公知の標準的技術により実施することができる。公知のcDNAライブラリー構築技術は例えばManiatis,T.、Fritsch,E.F.、Sambrook,J.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(コールド スプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989)中に見出すことができる。
【0019】
ヒトVR3レセプターをコードするDNAもまた、適するゲノムDNAライブラリーから単離してよいこともまた当業者に容易に明らかである。ゲノムDNAライブラリーの構築は当該技術分野で公知の標準的技術により実施することができる。公知のゲノムDNAライブラリー構築技術はManiatis,T.、Fritsch,E.F.、Sambrook,J.中、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(コールド スプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989)中に見出すことができる。
【0020】
上の方法によりヒトVR3レセプター遺伝子をクローン化するために、ヒトVR3レセプターのアミノ酸配列が必要であるかもしれない。これを達成するために、ヒトVR3レセプタータンパク質を精製しそして部分的アミノ酸配列を自動化シークエネーターにより決定してよい。アミノ酸配列全体を決定することは必要でないが、しかし、該タンパク質からの6ないし8アミノ酸の2領域の直鎖状配列を、部分的ヒトVR3レセプターDNAフラグメントのPCR増幅のためのプライマーの製造のため決定する。
【0021】
適するアミノ酸配列が同定されれば、それらをコードすることが可能なDNA配列を合成する。遺伝暗号は縮重であるため、特定の1アミノ酸をコードするのに1種以上のコドンが使用されているかもしれず、そして従って、該アミノ酸配列は一組の類似のDNAオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードされることができる。該組の1メンバーのみが、ヒトVR3レセプター配列に同一であろうが、しかし、不適正をもつDNAオリゴヌクレオチドの存在下でさえヒトVR3レセプターDNAにハイブリダイズすることが可能であろう。不適正にされたDNAオリゴヌクレオチドはなお、ヒトVR3レセプターDNAに十分にハイブリダイズしてヒトVR3レセプターをコードするDNAの同定および単離を可能にするかもしれない。これらの方法により単離されたDNAを使用して、無脊椎動物および脊椎動物の供給源からの多様な細胞型からのDNAライブラリーをスクリーニングしかつ相同な遺伝子を単離することができる。
【0022】
精製された生物学的に活性のヒトVR3レセプターは数種の異なる物理的形態を有するかもしれず、ヒトVR3レセプターは完全長の新生もしくはプロセシングされていないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチドもしくはプロセシングされたポリペプチドの組み合わせとして存在するかもしれない。完全長の新生ヒトVR3レセプターポリペプチドは特異的タンパク質分解性切断事象により翻訳後修飾されてよく、それは完全長の新生ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす。1個のフラグメント、もしくはフラグメントの物理的会合がヒトVR3レセプターに関連する完全な生物学的活性を有するかもしれないが、しかしながら、ヒトVR3レセプター活性の程度は、個々のヒトVR3レセプターフラグメントと物理的に会合されたヒトVR3レセプターポリペプチドフラグメントとの間で変動するかもしれない。
【0023】
遺伝暗号は縮重であるため、特定の1アミノ酸をコードするのに1種以上のコドンが使用されるかもしれず、そして従って、該アミノ酸配列は一組の類似のDNAオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードされることができる。該組の1メンバーのみが、ヒトVR3レセプター配列に同一であろうが、しかし、適切な条件下で、不適正をもつDNAオリゴヌクレオチドの存在下でさえヒトVR3レセプターDNAにハイブリダイズすることが可能であろう。代替の条件下で、不適正にされたDNAオリゴヌクレオチドはなお、ヒトVR3レセプターDNAにハイブリダイズしてヒトVR3レセプターをコードするDNAの同定および単離を可能にするかもしれない。
【0024】
特定の生物体からのヒトVR3レセプターをコードするDNAを使用して、他の生物体からヒトVR3レセプターの相同物を単離かつ精製してもよい。これを達成するために、第一のヒトVR3レセプターDNAを適切なハイブリダイゼーション条件下でヒトVR3レセプターの相同物をコードするDNAを含有するサンプルと混合してよい。ハイブリダイズされたDNA複合体を単離してよく、そして、相同なDNAをコードするDNAをそれから精製してよい。
【0025】
特定のアミノ酸をコードする多様なコドン中にかなりの量の冗長性(redundancy)が存在することが既知である。従って、本発明はまた、同一のアミノ酸の最終的な翻訳をコードする代替コドンを含有するDNA配列にも向けられる。本明細の目的上、1個もしくはそれ以上の置き換えられたコドンを担持する配列を縮重変異(degenerate variation)と定義することができる。発現されるタンパク質の最終的な物理特性を実質的に変えないDNA配列もしくは翻訳されたタンパク質いずれか中の突然変異もまた本発明の範囲内に包含される。例えば、ロイシンの代わりにバリン、リシンの代わりにアルギニン、もしくはグルタミンの代わりにアスパラギンの置換はポリペプチドの機能性の変化を引き起こさないかもしれない。こうした置換は公知であり、そして例えばWatosonらによるMolecular Biology of the Gene、第4版、ベンジャミン カミングス パブリッシング カンパニー(Benjamin Cummings Pub.Co.)中に記述される。
【0026】
ペプチドをコードするDNA配列を、天然に存在するペプチドのものと異なる特性を有するペプチドをコードするように変えてもよいことが既知である。DNA配列を変える方法は、限定されるものでないが部位特異的突然変異誘発、キメラ置換および遺伝子融合を挙げることができる。部位特異的突然変異誘発はサイレント突然変異、保存的突然変異、もしくは非保存的突然変異を生じるかも知れない1個もしくはそれ以上のDNA残基を変えるのに使用する。キメラ遺伝子は、類似のもしくは異なる遺伝子のドメインを交換してヒトVR3レセプター遺伝子中の類似のドメインを置き換えることにより調製する。同様に、遺伝子の同定および単離を助長するための親和性標識のようなドメインをヒトVR3レセプター遺伝子に付加する融合遺伝子を調製してよい。例えば膜貫通ドメインを除去するもしくは該タンパク質の正常な輸送を変えるためのターゲッティング配列を付加する、またはヒトVR3レセプター遺伝子に新たな翻訳後修飾配列を付加することにより、該タンパク質の可溶性バージョンを創製するように、ヒトVR3レセプター遺伝子の領域を置き換える融合遺伝子を調製してもよい。変えられる特性の例は、限定されるものでないが基質に対する酵素もしくはリガンドに対するレセプターの親和性の変化を挙げることができる。
【0027】
本明細書で使用されるところのヒトVR3レセプターの「機能的誘導体」は、ヒトVR3レセプターの生物学的活性に実質的に類似である生物学的活性(機能的もしくは構造上のいずれか)を所有する化合物である。「機能的誘導体」という用語は、ヒトVR3レセプターの「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似物」および「相同物」もしくは「化学的誘導体」を包含することを意図している。「フラグメント」という用語はヒトVR3レセプターのいかなるポリペプチドサブセットも指すことを意味する。「変異体」という用語は、ヒトVR3レセプター分子全体もしくはそのフラグメントのいずれかに構造および機能が実質的に類似の分子を指すことを意味する。分子は、双方の分子が実質的に類似の構造を有する場合もしくは双方の分子が類似の生物学的活性を所有する場合に、ヒトVR3レセプターに「実質的に類似」である。従って、2種の分子が実質的に類似の活性を所有する場合、それらはそれらの分子の一方の構造が他方で見出されない場合であっても、もしくは2種のアミノ酸配列が同一でない場合であっても変異体であるとみなされる。「類似物」という用語は、ヒトVR3レセプター分子全体もしくはそのフラグメントのいずれかに機能が実質的に類似の分子を指す。
ヒトVR3レセプターの組換え発現
本明細書に記述される方法により得られたクローン化されたヒトVR3レセプターDNAは、適するプロモーターおよび他の適切な転写調節因子を含有する発現ベクター中への分子クローニングにより組換え的に発現させかつ原核生物もしくは真核生物宿主細胞に移入して組換えヒトVR3レセプタータンパク質を産生させてよい。こうした操作の技術はManiatis,T.ら、上記に完全に記述され、また、当該技術分野で公知である。
【0028】
発現ベクターは、本明細書で、適切な宿主中での遺伝子のクローン化されたコピーの転写およびそれらのmRNAの翻訳に必要とされるDNA配列と定義する。こうしたベクターは、大腸菌(E.coli)を包含する細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を包含する真菌細胞および動物細胞のような多様な宿主中で真核生物遺伝子を発現するのに使用することができる。
【0029】
特別に設計されたベクターは、細菌−酵母もしくは細菌−動物細胞、または細菌−真菌細胞もしくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のDNAの運搬を可能にする。適切に構築された発現ベクターは:宿主細胞中での自律複製のための複製開始点、選択可能なマーカー、制限された数の有用な制限酵素部位、高コピー数のための潜在能力および活性のプロモーターを含有すべきである。プロモーターは、RNAポリメラーゼがDNAに結合しそしてRNA合成を開始することを指図するDNA配列と定義する。強力なプロモーターはmRNAを高頻度で開始させるものである。発現ベクターは、限定されるものでないがクローニングベクター、改変クローニングベクター、とりわけ設計されたプラスミドもしくはウイルスを挙げることができる。
【0030】
哺乳動物細胞中で組換えヒトVR3レセプターを発現させるのに多様な哺乳動物発現ベクターを使用してよい。組換えヒトVR3レセプター発現に適することができる商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターは、限定されるものでないがpMAMneo(クロンテック(Clontech))、pcDNA3(インヴィトロジェン(InVitrogen))、pMC1neo(ストラタジーン(Stratagene))、pXT1(ストラタジーン(Stratagene))、pSG5(ストラタジーン(Stratagene))、EBO−pSV2−neo(ATCC 37593)pBPV−1(8−2)(ATCC 37110)、pdBPV−MMTneo(342−12)(ATCC 37224)、pRSVgpt(ATCC 37199)、pRSVneo(ATCC 37198)、pSV2−dhfr(ATCC 37146)、pUCTag(ATCC 37460)およびIZD35(ATCC 37565)を挙げることができる。
【0031】
細菌細胞中で組換えヒトVR3レセプターを発現させるのに多様な細菌発現ベクターを使用してよい。組換えヒトVR3レセプター発現に適することができる商業的に入手可能な細菌発現ベクターは、限定されるものでないがpETベクター(ノヴァジェン(Novagen))およびpQEベクター(キアゲン(Qiagen))を挙げることができる。
【0032】
酵母のような真菌細胞中で組換えヒトVR3レセプターを発現させるのに多様な真菌細胞発現ベクターを使用してよい。組換えヒトVR3レセプター発現に適することができる商業的に入手可能な真菌細胞発現ベクターは、限定されるものでないがpYES2(インヴィトロジェン(InVitrogen))およびピキア(Pichia)発現ベクター(インヴィトロジェン(InVitrogen))を挙げることができる。昆虫細胞中で組換えヒトVR3レセプターを発現させるのに多様な昆虫細胞発現ベクターを使用してよい。ヒトVR3レセプターの組換え発現に適することができる商業的に入手可能な昆虫細胞発現ベクターは、限定されるものでないがpBlueBacII(インヴィトロジェン(InVitrogen))を挙げることができる。
【0033】
ヒトVR3レセプターをコードするDNAを、組換え宿主細胞中での発現のため発現ベクターにクローン化してよい。組換え宿主細胞は、限定されるものでないが大腸菌(E.coli)のような細菌、酵母のような真菌細胞、限定されるものでないがヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞系を挙げることができる哺乳動物細胞、ならびに限定されるものでないがショウジョウバエおよびカイコ由来細胞系を挙げることができる昆虫細胞を挙げることができる原核生物もしくは真核生物であってよい。適することができかつ商業的に入手可能である哺乳動物種由来の細胞系は、限定されるものでないがCV−1(ATCC CCL 70)、COS−1(ATCC CRL 1650)、COS−7(ATCC CRL 1651)、CHO−K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS−C−1(ATCC CCL 26)、MRC−5(ATCC CCL 171)、L−細胞およびHEK−293(ATCC CRL1573)を挙げることができる。
【0034】
発現ベクターは、限定されるものでないが形質転換、トランスフェクション、原形質融合、リポフェクションおよび電気穿孔法を挙げることができる多数の技術のいずれか1つを介して宿主細胞に導入してよい。発現ベクター含有細胞をクローン的に繁殖させ、そして別個に分析してそれらがヒトVR3レセプタータンパク質を産生するかどうか決定する。ヒトVR3レセプターを発現する宿主細胞クローンの同定は、限定されるものでないが抗ヒトVR3レセプター抗体との免疫学的反応性および宿主細胞関連のヒトVR3レセプター活性の存在を挙げることができるいくつかの手段により行ってよい。
【0035】
ヒトVR3レセプターDNAの発現はまた、インビトロで産生された合成mRNAを使用して実施してもよい。合成mRNAもしくはヒトVR3レセプター産生細胞から単離されたmRNAは、限定されるものでないが小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を挙げることができる多様な細胞を含まない系で効率的に翻訳することができ、ならびに、限定されるものでないがカエル卵母細胞への微小注入法を挙げることができる細胞に基づく系で効率的に翻訳することができ、カエル卵母細胞への微小注入法が一般に好ましい。
【0036】
至適レベルのヒトVR3レセプター活性および/もしくはヒトVR3レセプタータンパク質を生じるヒトVR3レセプターDNA配列(1種もしくは複数)を決定するために、限定されるものでないが以下:
遺伝子名 開始コドン 終止コドン 総塩基対
VR3A+B+ 837 3065 2229
VR3A+B− 338 2953 2616
VR3A−B− 1 2436 2436
(これらの数字は第一のメチオニンの最初のヌクレオチドおよび最初の終止コドンの前の最後のヌクレオチドに対応する)ならびにヒトVR3レセプタータンパク質をコードするcDNAの部分を含有する数種の構築物を挙げることができるヒトVR3レセプターDNA分子を構築することができる。全部の構築物は、ヒトVR3レセプターcDNAの5’もしくは3’非翻訳領域の何も含有しないか、全部もしくは部分を含有するよう設計することができる。ヒトVR3レセプター活性およびタンパク質発現のレベルは適切な宿主細胞へのこれらの構築物の単独および組み合わせの双方での導入後に決定することができる。一過性アッセイでの至適の発現を生じるヒトVR3レセプターDNAカセットの決定後に、このヒトVR3レセプターDNA構築物を、限定されるものでないが哺乳動物細胞、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、大腸菌(E.coli)および酵母ビール酵母菌(S.cerevisiae)を挙げることができる宿主細胞中での発現のため、多様な発現ベクターに移す。
ヒトVR3レセプターのアッセイ方法
宿主細胞トランスフェクション体および微小注入された卵母細胞を使用して、以下の方法により機能的ヒトVR3レセプター活性のレベルおよび総ヒトVR3レセプタータンパク質のレベルの双方をアッセイしてよい。組換え宿主細胞の場合、これは1種もしくはそれ以上のフラグメントをコードするヒトVR3レセプターDNA、サブユニットまたは他の機能的遺伝子を含有する1種またはおそらく2種もしくはそれ以上のプラスミドのコトランスフェクションを必要とする。卵母細胞の場合、これはヒトVR3レセプタータンパク質の合成RNAの共注入を必要とする。発現を見込むのに適切な時間の期間の後に、細胞タンパク質を例えば35S−メチオニンで24時間代謝的に標識し、その後細胞ライセートおよび細胞培養上清を収穫し、そしてヒトVR3レセプタータンパク質に対し向けられたポリクローナル抗体を用いる免疫沈降にかける。
【0037】
宿主細胞中のヒトVR3レセプタータンパク質のレベルは、免疫親和性および/もしくはリガンド親和性技術により定量する。ヒトVR3レセプター特異的親和性ビーズもしくはヒトVR3レセプター特異的抗体を使用して、例えば35S−メチオニン標識もしくは非標識ヒトVR3レセプタータンパク質を単離する。標識されたヒトVR3レセプタータンパク質はSDS−PAGEにより分析する。非標識ヒトVR3レセプタータンパク質は、ヒトVR3レセプター特異的抗体を使用するウェスタンブロッティング、ELISAもしくはRIAアッセイにより検出する。
【0038】
ヒトVR3レセプター活性を検出するための他の方法は、ヒトVR3レセプターcDNAでトランスフェクトされた全細胞もしくはヒトVR3レセプターmRNAを注入された卵母細胞中でのヒトVR3レセプター活性の直接測定を必要とする。ヒトVR3レセプター活性は、ヒトVR3レセプターDNAを発現する宿主細胞の特異的リガンド結合もしくは生物学的特徴により測定する。ヒトVR3レセプターを発現する組換え宿主細胞の場合、パッチボルテージクランプ技術を使用してチャンネル活性を測定しかつヒトVR3レセプタータンパク質を定量することができる。卵母細胞の場合、パッチクランプ法ならびに二電極膜電位固定技術を使用してカルシウムチャンネル活性を測定しかつヒトVR3レセプタータンパク質を定量することができる。
細胞に基づくアッセイ
本発明はヒトVR3レセプターの化合物調節を検出する全細胞の方法を提供する。該方法は、段階:
1)化合物、および機能的ヒトVR3レセプターを含有する細胞を接触させること、ならびに
2)化合物による改変されたヒトVR3レセプター機能に応答しての細胞中の変化を測定すること
を含んで成る。
【0039】
化合物との細胞の接触に必要な時間の量は、例えば既知のヒトVR3レセプター調節物質との時間経過を実施すること、および細胞の変化を時間の関数として測定することにより経験的に決定する。
【0040】
本発明の方法の測定手段は、化合物に曝露された細胞を該化合物に同様に曝露されていない同一の細胞と比較することによりさらに規定することができる。あるいは、2種の細胞、すなわち機能的ヒトVR3レセプターを含有する1種および第一のものに同一しかし機能的ヒトVR3レセプターを欠く第二の細胞を、双方を同一の化合物と接触させかつ2種の細胞間の差異を比較することができる。この技術はこれらのアッセイのバックグラウンドノイズの確立においてもまた有用である。当業者は、これらの制御機構が機能的ヒトVR3レセプターの調節に応答する細胞の変化の容易な選択もまた可能にすることを認識するであろう。
【0041】
「細胞」という用語は最低1個の細胞を指すが、しかし検出方法の感度に適切な複数の細胞を包含する。本発明に適する細胞は細菌、酵母もしくは真核生物であってよい。
【0042】
機能的ヒトVR3レセプターの化合物調節を決定するためのアッセイ方法は、慣習的な実験室の形式にあることができるか、もしくは高スループットに適合させることができる。「高スループット」という用語は、同時に複数のサンプルの容易な分析およびロボット操作の受容能力を可能にするアッセイの設計を指す。高スループットアッセイの別の所望の特徴は、所望の分析を達成するための試薬の使用を減少させるもしくは操作の数を最小限にするよう最適化されるアッセイの設計である。アッセイ形式の例は、限定されるものでないが、液体を取り扱う実験に使用される96穴もしくは384穴プレート、浮遊液滴および「実験室チップ(lab on a chip)」マイクロチャンネルチップを挙げることができる。プラスチック型および液体取扱い装置の小型化が進歩しているため、もしくは改良されたアッセイ装置が設計されているため、本発明の設計を使用してより多数のサンプルを実施してもよいことが当業者により公知である。
【0043】
本発明の方法に適する細胞の変化は、ヒトVR3レセプターの活性、機能もしくは量の変化を直接測定すること、あるいはヒトVR3レセプター機能の下流の影響を測定することにより、例えば二次メッセンジャー濃度もしくは転写の変化を測定することにより、またはヒトVR3レセプターにより転写的に影響される遺伝子のタンパク質レベルの変化により、または細胞中の表現型の変化を測定することによりを含んで成る。好ましい測定手段は、ヒトVR3レセプタータンパク質の量の変化、ヒトVR3レセプターの機能的活性の変化、mRNAの量の変化、細胞内タンパク質の変化、細胞表面タンパク質もしくは分泌型タンパク質の変化、またはCa+2、cAMPもしくはGTP濃度の変化を包含する。ヒトVR3レセプターの量もしくは機能的活性の変化を本明細書に記述する。mRNAのレベルの変化は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)もしくは示差的遺伝子発現により検出する。免疫親和性、リガンド親和性、もしくは酵素的測定は、宿主細胞中での特定のタンパク質のレベルのVR3に誘導される変化を定量する。タンパク質が酵素である場合、タンパク質の誘導は蛍光発生的もしくは比色分析の基質の切断によりモニターされる。
【0044】
細胞表面タンパク質のための好ましい検出手段はフローサイトメトリーもしくは統計学的細胞画像化を包含する。双方の技術において、目的のタンパク質は細胞表面に局在化されており、特異的蛍光プローブで標識され、そして細胞の蛍光の程度を介して検出される。フローサイトメトリーにおいては細胞を溶液中で分析する一方、細胞画像化技術においては細胞の野を相対的蛍光について比較する。
【0045】
本発明はまた、ヒトVR3レセプターをコードするDNAもしくはRNAの発現ならびにインビボでヒトVR3レセプタータンパク質の機能を調節する化合物のスクリーニング方法にも向けられる。
【0046】
化合物は、ヒトVR3レセプターをコードするDNAもしくはRNAの発現またはヒトVR3レセプタータンパク質の機能を増大もしくは減弱させることによりにより調節するかもしれない。ヒトVR3レセプターをコードするDNAもしくはRNAの発現またはヒトVR3レセプタータンパク質の機能を調節する化合物は多様なアッセイにより検出してよい。アッセイは、発現もしくは機能の変化が存在するかどうかを決定する単純な「はい/いいえ(yes/no)」アッセイであってよい。アッセイは、試験サンプルの発現もしくは機能を標準サンプル中の発現もしくは機能のレベルと比較することにより定量的にしてもよい。この方法で同定された調節物質は治療薬として有用であり、そしてヒトVR3レセプターである。
ヒトVR3レセプタータンパク質の精製
組換え宿主細胞中でのヒトVR3レセプターの発現後に、精製されたヒトVR3レセプターを提供するためにヒトVR3レセプタータンパク質を回収してよい。組換えヒトVR3レセプターは、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーならびに抗体/リガンドアフィニティークロマトグラフィーの多様な組み合わせもしくは個別の応用により、細胞ライセートおよび抽出物から精製してよい。
【0047】
組換えヒトVR3レセプターは、完全長の新生ヒトVR3レセプター、ヒトVR3レセプターのポリペプチドフラグメントもしくはヒトVR3レセプターサブユニットに特異的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を用いて作成された免疫親和性カラムの使用により他の細胞タンパク質から分離することができる。親和性樹脂はその場合、適する緩衝液、例えばリン酸緩衝生理的食塩水(pH7.3)中で平衡化し、そして、ヒトVR3レセプターもしくはヒトVR3レセプターサブユニットを含有する細胞培養上清もしくは細胞抽出物をゆっくりとカラムを通過させる。その後、光学密度(A280)がバックグラウンドに下落するまでカラムを該緩衝液で洗浄し、その後、0.23Mグリシン−HCl(pH2.6)のような緩衝液を使用してpHを低下させることによるような緩衝条件を変えることによりタンパク質を溶出する。精製されたヒトVR3レセプタータンパク質をその後、リン酸緩衝生理的食塩水のような適する緩衝液に対して透析する。
ヒトVR3レセプターに結合する抗体の産生および使用
ヒトVR3レセプターに対する単一特異性抗体は、ヒトVR3レセプターに対し反応性の抗体を含有する哺乳動物抗血清から精製するか、もしくは元はKohlerとMilstein、Nature 256:495−497(1975)により記述された技術を使用してヒトVR3レセプターと反応性のモノクローナル抗体として調製する。免疫学的技術は当該技術分野で公知であり、そして、例えばコールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス(Cold SpringHarbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーにより出版されたAntibodies:A laboratory manual、ISBN 0879693142中に記述される。本明細書で使用されるところの単一特異性抗体は、ヒトVR3レセプターに対する均一の結合の特徴をもつ単一の抗体種もしくは複数の抗体種と定義する。本明細書で使用されるところの均一の結合は、上述されるところのヒトVR3レセプターに関連するもののような特定の抗原もしくはエピトープに結合する抗体種の能力を指す。ヒトVR3レセプター特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどのような動物(ウサギが好ましい)を、免疫アジュバントを伴うかもしくは伴わないかのいずれかで適切な濃度のヒトVR3レセプターで免疫化することにより生じさせる。
【0048】
免疫前血清を最初の免疫感作前に収集する。各動物は許容できる免疫アジュバントを伴う約0.001mgと約100mgとの間のヒトVR3レセプターを受領する。こうした許容できるアジュバントは、限定されるものでないがフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、明礬沈降物、ざ瘡プロピオンバクテリウム(Corynebacterium parvum)およびrRNAを含有する油中水型乳剤を挙げることができる。初期免疫感作は、皮下(SC)、腹腔内(IP)もしくは双方のいずれかで複数の部位での好ましくはフロイントの完全アジュバント中のヒトVR3レセプターより成る。各動物から定期的間隔で、好ましくは毎週採血して抗体力価を測定する。動物は初期免疫感作後に追加免疫の注入を受領してももしくはしなくてもよい。追加免疫の注入を受領する動物には、一般に、同一経路によりフロイントの不完全アジュバント中の等量の抗原を投与する。追加免疫の注入は最大力価が得られるまで約3週間隔で投与する。各追加免疫の免疫感作後約7日もしくは単回免疫感作後約1週間に、動物から採血し、血清を収集し、そしてアリコートを約−20℃で保存する。
【0049】
ヒトVR3レセプターと反応性のモノクローナル抗体(mAb)を、近交系マウス、好ましくはBalb/cをヒトVR3レセプターで免疫化することにより調製する。マウスは、等量の上で論考されたところの許容できるアジュバント中に組み込まれた約0.1mlの緩衝液もしくは生理的食塩水中の約0.001mgないし約1.0mg、好ましくは約0.1mgのヒトVR3レセプターを用いてIPもしくはSC経路により免疫化する。フロイントのアジュバントが好ましく、フロイントの完全アジュバントを初期免疫感作に使用し、そしてフロイントの不完全アジュバントをその後使用する。マウスは第0日に初期免疫感作を受領し、そして約2ないし約30週間休ませる。免疫化されたマウスに、静脈内(IV)経路によりリン酸緩衝生理的食塩水のような緩衝液溶液中の約0.001ないし約1.0mgのヒトVR3レセプターの1回もしくはそれ以上の追加免疫の免疫感作を投与する。抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは脾リンパ球を、当該技術分野で既知の標準的手順により免疫化されたマウスから脾を取り出すことにより得る。脾リンパ球を適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と、安定なハイブリドーマの形成を可能にすることができる条件下で混合することにより、ハイブリドーマ細胞を生じさせる。融合パートナーは、限定されるものでないが:マウス骨髄腫P3/NS1/Ag 4−1;MPC−11;S−194およびSp2/0を挙げることができ、Sp2/0が一般に好ましい。抗体産生細胞および骨髄腫細胞を、約30%から約50%までの濃度のポリエチレングリコール(分子量約1000)中で融合させる。融合されたハイブリドーマ細胞を、当該技術分野で既知の手順により、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン補充されたダルベッコの改変イーーグル培地(DMEM)中での成長により選択する。上清液を、ほぼ第14、18および21日に成長陽性のウェルから収集し、そして抗原としてヒトVR3レセプターを使用する固相免疫放射アッセイ(SPIRA)のようなイムノアッセイにより抗体産生についてスクリーニングする。培養液はオークターロニー沈降アッセイでもまた試験してmAbのアイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞を、Tissue Culture Methods and Applications、KruseとPaterson編、アカデミック プレス(Academic Press)、1973中のMacPherson、Soft Agar Techniquesの軟寒天技術のような技術、もしくは限界希釈の技術によりクローン化する。
【0050】
モノクローナル抗体を、初回抗原刺激後最低約4日に、プリスタンで初回免疫刺激されたBalb/cマウスの約1×106ないし約6×106個のハイブリドーマ細胞を含むマウスあたりおよそ0.5mlの注入によりインビボで産生させる。細胞移入後およそ8〜12日に腹水を収集し、そしてモノクローナル抗体を当該技術分野で既知の技術により精製する。
【0051】
抗ヒトVR3レセプターmAbのインビトロ産生は、当該技術分野で公知の組織培地中でハイブリドーマを成長させることにより実施する。当該技術分野で公知の中空糸培養技術、エア・リフト反応器、ローラーボトル、もしくはスピナーフラスコ培養技術を使用して高密度のインビトロ細胞培養を実施して、大量の抗ヒトVR3レセプターMAbを製造してよい。mAbは当該技術分野で既知の技術により精製する。
【0052】
腹水もしくはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、限定されるものでないが沈降法、受動凝集、酵素結合免疫吸着抗体(ELISA)技術およびラジオイムノアッセイ(RIA)技術を挙げることができる多様な血清学的もしくは免疫学的アッセイにより測定する。体液もしくは組織および細胞抽出物中のヒトVR3レセプターの存在を検出するのに類似のアッセイを使用する。
【0053】
単一特異性抗体の上述された産生方法を利用してヒトVR3レセプターポリペプチドフラグメントもしくは完全長の新生ヒトVR3レセプターポリペプチドもしくは個々のヒトVR3レセプターサブユニットに特異的な抗体を産生してよいことが当業者に容易に明らかである。とりわけ、唯一のヒトVR3レセプターサブユニットもしくは完全に機能的なヒトVR3レセプタータンパク質に特異的である単一特異性抗体を生じさせてよいことが当業者に容易に明らかである。ヒトVR3レセプタータンパク質の正常な機能を阻害する単一特異性抗体を生じさせてよいこともまた当業者に明らかである。
【0054】
ヒトVR3レセプター抗体アフィニティーカラムは、抗体がゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようなゲル支持体に抗体を付加することにより作成する。好ましい共有結合は抗体上に含有されるアミン、アルデヒドもしくはスルフヒドリル残基により作成される。抗体上でのアルデヒドもしくは遊離スルフヒドリル基の生成方法は当該技術分野で公知であり;アミン基は例えばN−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応性である。
ヒトVR3レセプター特異的試薬を含有するキット組成物
ヒトVR3レセプターのDNAもしくはRNA、ヒトVR3レセプターに対する抗体、またはヒトVR3レセプタータンパク質を含有するキットを製造してよい。ヒトVR3レセプターDNAにハイブリダイズするDNAを検出するか、またはサンプル中のヒトVR3レセプタータンパク質もしくはペプチドフラグメントの存在を検出するのにこうしたキットを使用する。こうした特徴づけは、限定されるものでないが法廷分析、診断の応用および疫学的研究を挙げることができる多様な目的上有用である。
【0055】
本発明は診断試薬としての使用のためのヒトVR3ポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全に関連する突然変異された形態のヒトVR3遺伝子の検出は、ヒトVR3の過小発現もしくは過剰発現から生じる疾患もしくはこうした疾患に対する感受性の診断に追加するもしくはそれを定義することができる診断ツールを提供することができる。ヒトVR3遺伝子中に突然変異を担持する個体は、当該技術分野で公知かつ本明細書に記述される多様な技術によりDNAレベルで検出してよい。
【0056】
ヒトVR3レセプターDNA、ヒトVR3レセプターRNAもしくはヒトVR3レセプタータンパク質をスクリーニングしかつそのレベルを測定するのに、本発明のDNA分子、RNA分子、組換えタンパク質および抗体を使用してよい。該組換えタンパク質、DNA分子、RNA分子および抗体は、ヒトVR3レセプターの検出および型分類に適するキットの処方にそれら自身を適合させる。こうしたキットは、緊密な制限、最低1個の容器中に保持するのに適する区画化された担体を含むことができる。該担体は、ヒトVR3レセプターを検出するのに適する組換えヒトVR3レセプタータンパク質もしくは抗ヒトVR3レセプター抗体のような試薬をさらに含むことができる。該担体はまた、標識された抗原もしくは酵素基質などのような検出のための手段も含有してよい。
遺伝子治療
ヒトVR3レセプターをコードするDNA配列に相補的であるヌクレオチド配列をアンチセンス治療のため合成することができる。これらのアンチセンス分子はDNA、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートのようなDNAの安定誘導体、RNA、2’−O−アルキルRNAのようなRNAの安定誘導体、または他のヒトVR3レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド模倣物であってよい。ヒトVR3レセプターアンチセンス分子は、微小注入法、リポソーム被包化もしくはアンチセンス配列をもつベクターからの発現により細胞に導入してよい。ヒトVR3レセプターアンチセンス治療は、ヒトVR3レセプター活性を低下させることが有益である疾患の治療にとりわけ有用であるかもしれない。
【0057】
ヒトVR3レセプター遺伝子治療を使用して、標的生物体の細胞中にヒトVR3レセプターを導入してよい。ヒトVR3レセプター遺伝子は、レシピエント宿主細胞の感染によりヒトVR3レセプターDNAの移入を媒介するウイルスベクターに連結することができる。適するウイルスベクターはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどを包含する。あるいは、ヒトVR3レセプターDNAを、リガンド−DNA複合体(conjugate)もしくはアデノウイルス−リガンド−DNA複合体を使用するレセプターに媒介される標的を定められたDNA移入、リポフェクション膜融合または直接微小注入法を包含する非ウイルス技術により遺伝子治療のため細胞中に移入することができる。これらの手順およびそれらの変形物はエクスビボならびにインビボのヒトVR3レセプター遺伝子治療に適する。ヒトVR3レセプター遺伝子治療は、ヒトVR3レセプター活性を上昇させることが有益である疾患の治療にとりわけ有用であるかもしれない。ヒトVR3レセプター遺伝子とともにの使用に適する遺伝子治療の分子方法論のプロトコルは、Gene Therapy Protocols、Paul D.Robbins編、ヒューマン プレス(Human press)、ニュージャージー州トタワ、1996に記述されている。
製薬学的組成物
ヒトVR3レセプターDNA、ヒトVR3レセプターRNAもしくはヒトVR3レセプタータンパク質、またはヒトVR3レセプター活性の調節物質を含んで成る製薬学的に有用な組成物を、製薬学的に許容できる担体の混合状態によるような既知の方法に従って処方してよい。こうした担体および処方方法の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesで見出すことができる。有効な投与に適する製薬学的に許容できる組成物を形成するために、こうした組成物は有効量のタンパク質、DNA、RNAもしくは調節物質を含有することができる。
【0058】
本発明の治療的もしくは診断的組成物は、ヒトVR3レセプターに関する活性の調節が指示される障害を治療もしくは診断するのに十分な量で個体に投与する。有効量は、個体の病状、体重、性別および齢のような多様な因子に従って変動するかもしれない。他の因子は投与の様式を包含する。該製薬学的組成物は皮下、局所、経口および筋肉内のような多様な経路により個体に提供してよい。
【0059】
「化学的誘導体」という用語は、通常は基礎分子の一部でない付加的な化学的部分を含有する分子を記述する。こうした部分は基礎分子の溶解性、半減期、吸収などを改良するかもしれない。あるいは、該部分は、基礎分子の望ましくない副作用を減弱するもしくは基礎分子の毒性を減少させるかもしれない。こうした部分の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesのような多様な教科書に記述されている。
【0060】
本明細書に開示される方法により同定された化合物は、いかなる潜在的な毒性も最小限にしつつヒトVR3レセプターもしくはその活性の至適の阻害を得るために、慣例の試験により定義される適切な投薬量で単独で使用してよい。加えて、他の作用物質の共投与もしくは連続投与が望ましいかもしれない。
【0061】
本発明はまた、本発明の新規治療方法での使用のための適する局所、経口、全身および非経口の製薬学的製剤を提供するという目的も有する。ヒトVR3レセプターの調節での使用のための有効成分として本発明で同定される化合物もしくは調節物質を含有する組成物は、投与のための慣習的ベヒクル中の広範な治療的投薬形態で投与することができる。例えば、化合物もしくは調節物質は、錠剤、カプセル剤(それぞれ調時放出および持続性放出製剤を包含する)、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁剤、シロップ剤および乳剤のような経口の投薬形態で、もしくは注入により投与することができる。同様に、それらはまた静脈内(ボーラスおよび注入(infusion)の双方)、腹腔内、皮下、閉塞を伴うもしくは伴わない局所、または筋肉内の形態でも投与してよく、全部は製薬学的技術の当業者に公知の形態を使用する。有効しかし非毒性量の所望の化合物をヒトVR3レセプター調節剤として使用することができる。
【0062】
生成物の1日投薬量は1日あたり患者あたり0.01から1,000mgまでの広範な範囲にわたって変動してよい。経口投与のためには、組成物は好ましくは、治療されるべき患者に対する投薬量の症候的調整のため、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0および50.0ミリグラムの有効成分を含有する割線付きもしくは割線を付けられない錠剤の形態で提供する。薬物の有効量は、通常、1日あたり約0.0001mg/kgから約100mg/kg体重までの投薬量レベルで供給する。該範囲は、より具体的には1日あたり約0.001mg/kgから10mg/kg体重までである。ヒトVR3レセプター調節物質の投薬量は、所望の効果を達成するために組み合わせられる場合に調整される。他方、これらの多様な作用物質の投薬量は相乗的結果を達成するために独立して至適化しかつ組み合わせてよく、ここで病状はいずれかの作用物質を単独で使用する場合にそうであろうよりも抑制される。
【0063】
有利には、本発明の化合物もしくは調節物質は単一の1日用量で投与してよいか、または総1日投薬量を1日2、3もしくは4回の分割された用量で投与してよい。さらに、本発明の化合物もしくは調節物質は、適する鼻内ベヒクルの局所使用を介するもしくは経皮経路を介する鼻内の形態で、当業者に公知の経皮皮膚貼付剤のそれらの形態を使用して投与することができる。経皮送達系の形態で投与されるためには、投薬量の投与はもちろん投薬レジメンの間中間欠的よりむしろ連続的であることができる。
【0064】
有効成分が別個の投薬製剤中にある1種以上の有効成分を用いる組み合わせ治療のためには、有効成分を同時に投与することができるか、もしくはそれらはそれぞれ別個のずらされた時点で投与することができる。
【0065】
本発明の化合物もしくは調節物質を利用する投薬レジメンは、患者の型、種、齢、体重、性別および医学的状態;治療されるべき病状の重症度;投与経路;患者の腎および肝機能;ならびに使用されるその特定の化合物を包含する多様な因子に従って選択する。通常の熟練の医師もしくは獣医師は、該病状の進行を予防、対抗もしくは停止するのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定かつ処方することができる。毒性なしに有効性を生じる範囲内の薬物の濃度の達成における最適精度は、標的部位への薬物の生物学的利用性の動力学に基づくレジメンを必要とする。これは、薬物の分布、平衡および排泄の考慮を必要とする。
【0066】
本発明の方法において、本明細書に詳細に記述される化合物もしくは調節物質は有効成分を形成することができ、そして、典型的には、意図される投与形態、すなわち経口の錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに関してかつ慣習的製薬学的実務と矛盾せず適して選択された適する製薬学的希釈剤、賦形剤もしくは担体(本明細書で集合的に「担体」物質と称される)との混合状態で投与される。
【0067】
例えば、錠剤もしくはカプセル剤の形態での経口投与のために、有効薬物成分を、エタノール、グリセロール、水などのような経口の非毒性の製薬学的に許容できる不活性担体と組み合わせることができる。さらに、所望のもしくは必要な場合は、適する結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色料もまた混合物中に組み込むことができる。適する結合剤は、制限なしにデンプン、ゼラチン、ブドウ糖もしくはβ−乳糖のような天然の糖、トウモロコシ甘味料、アラビアゴム、トラガカントもしくはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成のガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、蝋などを包含する。これらの投薬形態で使用される滑沢剤は、制限なしにオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを包含する。崩壊剤は、制限なしにデンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどを包含する。
【0068】
液体の形態のためには、有効薬物成分は合成および天然のガム、例えばトラガカント、アラビアゴム、メチルセルロースなどのような適して風味をつけられた懸濁化剤もしくは分散剤中で組み合わせることができる。使用してよい他の分散剤はグリセリンなどを包含する。非経口投与のためには、滅菌の懸濁剤および溶液が望ましい。適する保存剤を一般に含有する等張の製剤を、静脈内投与が望ましい場合に使用する。
【0069】
有効薬物成分を含有する局所製剤は、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンAおよびE油、鉱物油、PPG2ミリスチルプロピオネートなどのような当該技術分野で公知の多様な担体物質と混合して例えばアルコール性溶液、局所清浄剤、浄化クリーム剤、皮膚ゲル剤、皮膚ローション剤、およびクリームもしくはゲル製剤のシャンプー剤を形成することができる。
【0070】
本発明の化合物もしくは調節物質はまた、小型単層状小胞、大型単層状小胞および多層状小胞のようなリポソーム送達系の形態でも投与することができる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンもしくはホスファチジルコリンのような多様なリン脂質から形成することができる。
【0071】
本発明の化合物はまた、化合物分子が結合される個別の担体としてのモノクローナル抗体の使用により送達してもよい。本発明の化合物もしくは調節物質はまた、標的を定めることができる薬物担体としての可溶性ポリマーと結合してもよい。こうしたポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、もしくはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを包含することができる。さらに、本発明の化合物もしくは調節物質は、薬物の制御放出の達成で有用な生物分解性ポリマーの一分類、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋もしくは両親媒性ブロックコポリマーに結合してもよい。
【0072】
経口投与のために、該化合物もしくは調節物質は、カプセル剤、錠剤もしくはボーラスの形態で投与してよいか、あるいはそれらは動物飼料に混合することができる。カプセル剤、錠剤およびボーラスは、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウムもしくはリン酸二カルシウムのような適切な担体ベヒクルと組み合わせの有効成分から構成される。これらの単位投与剤形は、均一な混合物が得られるような、希釈剤、増量剤、崩壊剤および/もしくは結合剤を包含する適する微細に粉末にされた不活性成分と有効成分を緊密に混合することにより製造する。不活性成分は該化合物もしくは調節物質と反応することができずかつ治療されている動物に対し非毒性であるものである。適する不活性成分は、デンプン、乳糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物性のガムおよび油などを包含する。これらの製剤は、治療されるべき動物種の大きさおよび型、ならびに感染の型および重症度のような多数の因子に依存して広範に変動する量の有効および不活性成分を含有してよい。有効成分はまた、飼料と化合物を単純に混合することにより、もしくは飼料の表面に化合物を塗布することにより、飼料への添加物として投与してもよい。あるいは、有効成分は不活性担体と混合してよく、そして生じる組成物をその後飼料と混合するかもしくは動物に直接給餌するかのいずれかであってよい。適する不活性担体は、コーンミール、シトラスミール、醗酵残渣、粗挽きダイズ、乾燥穀物などを包含する。有効成分は、最終組成物が0.001から5重量%までの有効成分を含有するような、粉砕(griding)、攪拌、微粉砕(milling)もしくは混転することによりこれらの不活性担体と緊密に混合する。
【0073】
該化合物もしくは調節物質は、あるいは、不活性液体担体中に溶解された有効成分より成る製剤の注入を介して非経口で投与してもよい。注入は筋肉内、第一胃内、気管内もしくは皮下のいずれかであってよい。注入可能な製剤は適切な不活性液体担体と混合された有効成分より成る。許容できる液体担体は、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油などのような植物油、ならびにソルケタール、グリセロールホルマルなどのような有機溶媒を包含する。一代替として、水性非経口製剤もまた使用してよい。植物油は好ましい液体担体である。該製剤は、最終製剤が0.005から10重量%までの有効成分を含有するような、液体担体中に有効成分を溶解もしくは懸濁することにより製造する。
【0074】
該化合物もしくは調節物質の局所適用は、本化合物もしくは調節物質を水性溶液もしくは懸濁液として含有する液体の飲薬もしくはシャンプー剤の使用により可能である。これらの製剤は一般にベントナイトのような懸濁化剤を含有し、そして通常は消泡剤もまた含有することができる。0.005から10重量%までの有効成分を含有する製剤が許容できる。好ましい製剤は0.01から5重量%までの本化合物もしくは調節物質を含有するものである。
【0075】
以下の実施例はどのような方法でもそれをそれに制限することなく本発明を具体的に説明する。
【0076】
実施例1 ヒト前立腺および下垂体cDNAライブラリーの生成
cDNA合成:
第1鎖合成:ヒト前立腺もしくは下垂体mRNA(Clontech)約5μgを、cDNA合成キット(Life Technologies)を用いてcDNAを合成するために使用した。NotIプライマーアダプター2μlを、mRNA5μgに添加し、そして混合液を10分間70℃に加熱し、そして氷上に置いた。次の試薬を氷上で添加した:5x第1鎖バッファー(250mM TRIS−HCl(pH8.3),375mM KCl,15mM MgCl2)4μl、0.1M DTT2μl、10mMdNTP(ヌクレオチド3リン酸)混合液およびDEPC処理水1μl。反応は、42℃で5分間インキュベートした。最後に、SuperscriptRTII 5μlを添加し、そして42℃でさらに2時間インキュベートした。反応を氷上で終結した。
【0077】
第2鎖合成:第1鎖生成物を水で93μlに調整し、そして次の試薬を氷上で添加した:5x第2鎖バッファー(100mM TRIS−HCl(pH6.9),450mM KCl,23mM MgCl2)30μl,0.75mMβ−NAD+,50mM(NH4)2SO4,10mMdNTP(ヌクレオチド3リン酸)3μl、大腸菌(E.coli)DNAリガーゼ(10ユニット)1μl、RNアーゼH(2ユニット)1μl、DNApol I(10ユニット)4μl。反応は、16℃で2時間インキュベートした。第2鎖合成からのDNAは、T4DNAポリメラーゼで処理し、そして16℃に置いてDNA末端を平滑にした。二本鎖cDNAをフェノールおよびクロロホルム(1:1,v:v)混合液150μlで抽出し、そして7.5M NH4OAc0.5容量および無水エタノール2容量で沈殿させた。ペレットを70%エタノールで洗浄し、そして37℃で乾燥して残留エタノールを除去した。二本鎖DNAペレットは、水25μlに再懸濁し、そして次の試薬を添加した:5xT4DNAリガーゼバッファー10μl、SalIアダプター10μlおよびT4DNAリガーゼ5μl。成分を静かに混合し、そして16℃で一夜連結した。連結混合液をフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールで抽出し、徹底的に撹拌し、そして室温で14,000xgで5分間遠心して相を分離した。水相を新しいチューブに移し、そして容量を水で100mlに調整した。精製DNAは、chromaspin1000カラム(Clontech)上でサイズ選択して、比較的小さいcDNA分子を除去した。二本鎖DNAは37℃で3−4時間NotI制限酵素で消化した。制限消化物は0.8%低融点アガロースゲルで電気泳動した。範囲1−5kbのcDNAを切り離し、そしてGelzyme(InVitrogen)を用いて精製した。生成物をフェノール:クロロホルムで抽出し、そしてNH4OAcおよび無水エタノールで沈殿させた。ペレットを70%エタノールで洗浄し、そして水10mlに再懸濁した。
【0078】
cDNAのベクターへの連結:cDNAを5本のチューブに分配し(各2μl)、そして連結反応液を水4.5μl、5x連結バッファー2μl、p−SportベクターDNA(SalI/NotIで切断し、ホスファターセ処理した)1μlおよびT4DNAリガーゼ0.5μlを添加することによって組み立てた。連結反応は40℃で一夜インキュベートした。
【0079】
エレクトロポレーションによる連結cDNAの大腸菌への導入:
連結反応液容量は、水によって総容量20μlに調整した。酵母tRNA5ml、7.5MNH4OAc12.5mlおよび無水エタノール(−20℃)70mlを添加した。混合液を十分に撹拌し、そして直ちに室温で14000xg20分間遠心した。ペレットを70%エタノール中で洗浄し、そして各ペレットを水5mlに再懸濁した。全5個の連結物(25ml)をプールし、そしてDH10Bエレクトロ・コンピテント細胞(Life Technologies)100μlをDNA1mlによりエレクトロポレーション処理し(全20回のエレクトロポレーション)、次いで、アンピシリン平板に塗布して、1μl当たりの組み換え体数(cfu)を決定した。全ライブラリーをSuper Broth2リッター中に接種し、そしてmaxiprepをPromega Maxi Prepキットを用いて作成し、そして塩化セシウム勾配で精製した。
【0080】
実施例2: ライブラリースクリーニング/ヒトVR3A+B+生成
ヒト下垂体ライブラリーのスクリーニング:
ヒト下垂体ライブラリーの1μl分量をElectromaxDH10B細胞(Life Technologies)中にエレクトロポレートした。容量をSOC媒質により1mlに調整し、そして振盪しつつ37℃で45分間インキュベートした。次いで、ライブラリーを、LBを含有する150cm2平板に塗布して1プレート当たり密度20000コロニーにした。これらの培養物を37℃で一夜増殖させた。
【0081】
ヒトVR3受容体プローブは、次のプライマーペアを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって生成された:
5’オリゴ(配列番号:1):5’ACCGGCCTATCCTCTTTGACATCGTG
3’オリゴ(配列番号:2):5’TGTCCGCCTTCTTGTGGGGGTTCTC
プローブは、5’および3’プローブオリゴ(各100ng)および希釈miniprepDNA10ngを用いる正規のPCR条件を使用するPCRによって生成された。得られる493bpフラグメントを1%アガロースゲル上で移動させ、そしてQUIAquick Gel抽出キット(Quiagen)を用いる精製した。精製プローブ約100ngを、Pharmacia製オリゴ標識キットを用いてα32Pで標識し、標識したDNAをS−200カラム(Pharmacia)により精製した。
【0082】
ライブラリーコロニーを、Protranニトロセルロースフィルター(Scheicher & Schuel)上に拾い上げ(lift)、そしてDNAを1.5MNaCl,0.5MNaOH中で変性した。フィルターディスクを1.5MNaCl,1.0MTris−HCl,pH7.5で中性にして、次にUV−Stratalinker(Stratagene)を使用してメンブランにUV架橋結合した。フィルターを42℃の洗浄溶液(1MTris−HCl,pH8.0;5MNaCl;0.5MEDTA;20%SDS)中で数回洗浄した。次いで、ディスクを50%ホルムアミドおよびせん断サケ精子DNA(5’−3’Inc)100ug/mlを含有する1xサザン・プレハイブリダイゼーションバッファー(5’−3’Inc)中で42℃6時間インキュベートした。最後に、ハイブリダイゼーションは、50%ホルムアミド,標識プローブ(5x105〜1x106cmp/mlハイブリダイゼーションバッファー)の存在下のせん断サケ精子DNA100ngを含有する1xハイブリダイゼーションバッファー(5’−3’)中で42℃で一夜行った。
【0083】
ディスクを、室温で2xSSC,0.2%SDS中で2回(各20分)、そして30分間50℃で0.2xSSC、0.1%SDS中で1回洗浄した。次いで、メンブランを濾紙シート上に置き、プラスチックラップ中に包み、そして−20℃で一夜フィルムに露光した。
【0084】
ポジティブクローンを同定し、そして元のプレートからのコロニーを抜き取ることによって回収した。コロニーは、37℃で1時間LB中でインキュベートした。培養液の希釈液をLB寒天プレート上に置き、そしてフィルター・リフティング、ハイブリダイゼーション、洗浄、コロニー採取操作を繰り返した。2次スクリーニングから個々のコロニーを採取し、そしてSalI/NotIで消化してインサートのサイズを決定し、そしてそのインサートを配列決定した。
【0085】
全長クローンは、鋳型で、KpnI(FL5’オリゴ配列番号:3)およびNotI(FL3’オリゴ配列番号:4)部位をもつ全長オリゴとして配列決定されたライブラリークローン10ngを使用するPfuポリメラーゼによるPCRによって生成した。
【0086】
FL5’オリゴ(配列番号:3):AACGTTGGTACCGCCACCATGGCGGATTCCAGCGAAGGCCCCCGCGCG
FL3’オリゴ(配列番号:4):TAAAGCGGCCGCTTCAGGAGGGACATCGGTGAGCCTCAC
PCR生成物をKpnIおよびNotI酵素によって消化し、そしてpSP64T.GC発現ベクター中にクローン化した。DNAの大規模調製は、MEGAprepキット(Quiagen)を使用して行った。
【0087】
実施例3: ライブラリースクリーニング/ヒトVR3A+B−およびヒトVR3A−B−生成
ヒト前立腺ライブラリーのスクリーニング:
ヒト前立腺ライブラリーの1μl分量をElectromaxDH10B細胞(Life Technologies)中にエレクトロポレートした。容量をSOC媒質により1mlに調整し、そして振盪しつつ37℃で45分間インキュベートした。次いで、ライブラリーを、LBを含有する150cm2平板に塗布して1プレート当たり密度20000コロニーにした。これらの培養物を37℃で一夜増殖させた。
【0088】
ヒトVR3受容体プローブは、次のプライマーペアを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって生成された:
5’オリゴ(配列番号:13):5’CTACCTGACGGAGAACCCCCACAAG
3’オリゴ(配列番号:14):5’GTAGTAGGCGGTGAGACTGAAGATGA
プローブは、5’および3’プローブオリゴ(各100ng)および希釈miniprepDNA10ngを用いる正式のPCR条件を使用するPCRによって生成された。得られる387bpフラグメントを1%アガロースゲル上で移動させ、そしてQUIAquick Gel抽出キット(Quiagen)を用いる精製した。精製プローブ約100ngを、Pharmacia製オリゴ標識キットを用いてα32Pで標識し、標識したDNAをS−200カラム(Pharmacia)により精製した。
【0089】
ライブラリーコロニーを、Protranニトロセルロースフィルター(Scheicher & Schuel)上に拾い上げ(lift)、そしてDNAを1.5MNaCl,0.5MNaOH中で変性した。フィルターディスクを1.5MNaCl,1.0MTris−HCl,pH7.5で中性にして、次にUV−Stratalinker(Stratagene)を使用してメンブランにUV架橋結合した。フィルターを42℃の洗浄溶液(1MTris−HCl,pH8.0;5MNaCl;0.5MEDTA;20%SDS)中で数回洗浄した。次いで、ディスクを50%ホルムアミドおよびせん断サケ精子DNA(5’−3’Inc)100ug/mlを含有する1xサザン・プレハイブリダイゼーションバッファー(5’−3’Inc)中で42℃6時間インキュベートした。最後に、ハイブリダイゼーションは、50%ホルムアミド,標識プローブ(5x105〜1x106cmp/mlハイブリダイゼーションバッファー)の存在下のせん断サケ精子DNA100ngを含有する1xハイブリダイゼーションバッファー(5’−3’)中で42℃で一夜行った。
【0090】
ディスクを、室温で2xSSC,0.2%SDS中で2回(各20分)、そして30分間50℃で0.2xSSC、0.1%SDS中で1回洗浄した。次いで、メンブランを濾紙シート上に置き、Saranラップ中に包み、そして−20℃で一夜フィルムに露光した。
【0091】
ポジティブクローンを同定し、そして元のプレートからのコロニーを抜き取ることによって回収した。コロニーは、37℃で1時間LB中でインキュベートした。培養液の希釈液をLB寒天プレート上に置き、そしてフィルター・リフティング、ハイブリダイゼーション、洗浄、コロニー採取操作を繰り返した。2次スクリーニングから個々のコロニーを採取し、そしてEcoRI/NotIで消化してインサートのサイズを決定し、そしてそのインサートを配列決定した。
【0092】
全長クローンは、鋳型で、NotI(FL5’オリゴ配列番号:15)およびXbaI(FL3’オリゴ配列番号:16)部位をもつ全長オリゴとして配列決定されたライブラリークローン10ngを使用するPfuポリメラーゼによるPCRによって生成した。
【0093】
FL5’オリゴ(配列番号:15):5’AACGTTGGCGGCCGCGCCACCATGGCGGATTCCAGCGAAGGCCCCCGCGCG
FL3’オリゴ(配列番号:16):5’AACGTTTCTAGACTGGGCTGCAGTCCCTAG
PCR生成物をNotIおよびXbaI酵素によって消化し、そしてpGemHE発現ベクター中にクローン化した。DNAの大規模調製は、MEGAprepキット(Quiagen)を使用して行った。
【0094】
実施例4−哺乳動物発現ベクター中へのヒトVR3受容体cDNAのクローニング
ヒトVR3受容体cDNA(集団としてhVR3と呼ばれる)を哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1/Zeo(+)中にクローン化した。クローン化PCR生成物をカラム(Promega製Wizard PCR DNA精製キット)で精製し、そしてNotIおよびEcoRI(NEB)で消化して付着末端を生成した。生成物を低融点アガロースゲルで電気泳動によって精製した。pcDNA3.1/Zeo(+)ベクターをNotIおよびXbaI(BamHI/NotI部位中にクローン化したhVR3A+B+を除く)酵素で消化し、続いて低融点アガロースゲルで精製した。線状ベクターを使用してヒトVR3cDNAインサートに連結した。組み換え体を単離し、ヒトVR3受容体を指定し、そしてトランスフェクションキットに基づくEffectene非リポソーム性脂質(Quiagen)を用いて哺乳動物細胞(HEK293、COS−7またはCHO−K1細胞)をトランスフェクションするために使用した。安定な細胞クローンをゼオシン存在下の増殖によって選択した。単一のゼオシン耐性クローンを単離し、そしてインタクトのヒトVR3受容体遺伝子を含有することが示された。ヒトVR3受容体cDNAを含有するクローンをhVR3タンパク質発現について解析した。ヒトVR3コーディングDNAを含有する組み換えプラスミドを使用して、哺乳動物COSもしくはCHO細胞またはHEK293細胞を形質転換した。
【0095】
安定にまたは一時的に、ヒトVR3受容体を発現する細胞は、ヒトVR3受容体の発現および3H−RTX結合活性について試験するために使用される。これらの細胞は、ヒトVR3受容体を調節、阻害または活性化する能力および放射性3H−RTX結合と競合する能力について、他の化合物を特定し、そして試験するために使用される。
【0096】
プロモーターに関して正方向にヒトVR3受容体cDNAを含有するカセットは、プロモーターの適当な制限部位3’中に連結され、そして制限部位マッピングおよび/または配列決定によって同定される。これらのcDNA発現ベクターは、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、または化学的操作(陽イオン性リポソーム、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム)を含む標準的方法によって、繊維芽細胞性宿主細胞、例えばCOS−7(ATCC#CRL1651)、およびCV−1 tat[Sackevitz et al.,Science 238:1575(1987)]、293.L(ATCC#CRL6362)中に導入される。トランスフェクション細胞および細胞培養上澄液が収穫され、そして前記のようにヒトVR3受容体発現について解析される。 哺乳動物の一過性発現のために使用されるベクターのすべては、ヒトVR3受容体を発現する安定な細胞系を確立するために使用できる。発現ベクター中にクローン化された未改変ヒトVR3受容体cDNA構築物は、ヒトVR3受容体タンパク質を生成する宿主細胞を計画するために期待される。トランスフェクション宿主細胞は、限定されるものではないがCV−1−P[Sackevitz et al.,Science 238:1575(1987)]、tK−L[Wigler,et al.,Cell 11:223(1977)]、NS/0、およびdHFr−CHO[Kaufman and Shap,J.Mol.Biol.159:601,(1982)]を含む。
【0097】
限定されるものではないがG418、アミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ;ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Bホスホトランスフェラーゼ;APRT,キサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼを含む薬物選択プラスミドと、ヒトVR3受容体cDNAを含有するすべてのベクターとのコ・トランスフェクションは、安定にトランスフェクションされたクローンの選択を可能にするであろう。ヒトVR3受容体のレベルは、前記アッセイによって定量化される。
【0098】
また、ヒトVR3受容体cDNA構築物は、最高可能レベルのヒトVR3受容体を合成する哺乳動物細胞クローンの作成のために、増幅可能な薬物耐性マーカーを含有するベクター中に連結される。これらの構築物の細胞への導入後、プラスミドを含有するクローンは適当な薬剤により選択され、そして高いコピー数のプラスミドをもつ過発現クローンの単離は、薬剤用量の増加における選択によって達成される。
【0099】
組み換えヒトVR3受容体の発現は、哺乳動物宿主細胞への全長ヒトVR3受容体cDNAのトランスフェクションによって達成される。
【0100】
実施例5−アフリカツメガエル(Xenopus)卵母細胞におけるpVR3Rによってコードされている機能性タンパク質の特性決定
キセノパス・レエビス(Xenopus laevis)卵母細胞は、既に記述され、そして当該技術分野において既知である(Fraser et al.,1993)標準的方法を用いて調製され、そして注射された。成メスのキセノパス・レエビスからの卵巣葉(Nasco,Fort Atkinson,WI)を切り離し(teased apart)、名目上Ca不含の生理食塩水(82.5mMNaCl,2.5mMKCl,1mMMgCl2,5mMHEPESを含有し、NaOHでpH7.0に調整した)(OR−2)で数回洗浄し、そして0.2%コラゲナーゼ1型(ICN Biomedicals,Aurora,Ohio)を含有するOR−2中で2.5時間静かに振盪した。胞状層の約50%を除去した場合、VおよびVI期の卵母細胞が選択され、そして75%OR−2および25%ND−96からなる媒質中で洗浄された。ND−96は、100mMNaCl,2mMKCl,1mMMgCl2,1.8mMCaCl2,5mMHEPES,2.5mMピルビン酸Na,ゲンタマイシン(50ug/ml)を含有し、NaOHでpH7.0に調整された。細胞外Ca+2を徐々に増加し、そして細胞は注射前2−24時間ND−96中に維持した。イン・ビトロ転写では、ヒトVR3を含有するpGEM HE(Liman et al.,1992)を、NheIで直線化し、そしてキャップ類似体m7G(5’)ppp(5’)Gの存在下、T7RNAポリメラーゼを用いて転写した。合成されたcDNAは、酢酸アンモニウムで沈殿させ、そしてヌクレアーゼ不含の水50μl中に再懸濁した。cDNAをホルムアルデヒドゲル(1%アガロース、1xMOPS,3%ホルムアルデヒド)を用いてRNAマーカー(Gibco BRL,0.24−9.5kb)1.2および5μlに対して定量した。
【0101】
卵母細胞は、VR1(2−3ng)の同時注射の有無の下でヒトVR3受容体RNA(0.3−5ng)50nlを注射された。対照卵母細胞は水50nlを注射された。卵母細胞は、ヒトVR3の発現について解析する前に、ND−96中で1−13日間インキュベートされた。インキュベーションおよびコラゲナーゼ消化を室温で実施した。注射された卵母細胞は、18℃において48穴細胞培養クラスター(Costar,Cambridge,MA)中で維持された。全細胞の作動剤−誘導電流が、注射後1−14日目に、既に記述され、そして当該技術分野において既知である標準方法(Dascal,1987)を使用して、慣用の2電極電圧クランプ(GeneClamp500,Axon Instruments,Fosyer City,CA)を用いて測定された。微小電極を3MKClで満たしたが、これは抵抗1および2MΩをもっていた。細胞は、指示されない限り室温で〜10ml/minにおいてND−96を連続的に潅流された。膜電圧は、指示されない限り−70mVで固定した。
【0102】
卵母細胞は、種々のリガンド、低pH、および減極ならびに超分極電圧段階によりチャレンジされたが、ヒトVR3を発現している卵母細胞と対照卵母細胞との間の膜コンダクタンスにおいては検出可能な差はなかった[表1参照]。しかしながら、ヒトVR3を注射した卵母細胞は、4つの点において対照とは異なる性質をもっていた。第1は、VR3A+B−cRNAの注射は卵母細胞を死滅させた。AインサートをもつVR3イソ型を注射された卵母細胞の生存度は、注射後3−4日目のシスター対照に比べて有意に低下した(図9)。第2に、VR3の全3種のイソ型は、熱−誘導応答を増進した(図10)。第3は、ヒトVR1を同時に注射されたA+B−は、ルテニウム・レッド感受性潅流−誘導電流(1perfusion)を生じた(図11)。第4に、ヒトVRcRNAとヒトVR3A+B−cRNA同時注射は、カプサイシン、VR1受容体の作動剤、1uMに対する卵母細胞の応答性を変化した(図12)。
【0103】
【表1】
【0104】
【表2】
【0105】
生存度
アフリカツメガエル卵母細胞におけるヒトVR3イソ型の機能的発現が示される:
2Ca2+を含有するND−96において維持された卵母細胞の生存度は、VR3A+B−(3.25ng)およびVR3A+B+(5ng)では注射後4−6日に有意に低下したが、VR3A−B−(1.5ng)cRNAでは低下しなかった。VR3A+B−および対照の水を注射された卵母細胞のデータは、5回の別々の実験において類似しており、そして合体された。死滅卵母細胞は、Bauch and Lomb解剖顕微鏡を使用して肉眼的に決定された。データは、カイ二乗解析を用いて解析された。VR3A+B−注射卵母細胞は、最低生存度であった:約9%の卵母細胞のみが注射後4−6日目に生き残っていた。ヒトVR3A+B+を注射された卵母細胞の約33%が注射後4−6日目に生き残っていた。シスター水注射対照卵母細胞の約67%が、本質的に同じ条件下で同じ期間生き残った。VR3A−B−注射卵母細胞は、水注射対照と類似の生存度を示した。類似のデータは、cRNAの2つの別々のバッチから得られた。
【0106】
熱応答性
アフリカツメガエル卵母細胞におけるヒトVR3イソ型の機能的発現が示される:
熱による活性化。a).25℃〜46℃の熱ランプ(ramp)によって誘起され、そして46℃において少なくとも15秒間維持される平均ピーク電流が示される。電圧ランプは、サンプリング速度2秒において−120〜+80mVを400msecにわたって印加された。示される電流は、+80mVにおいて誘起される初発電流を超える電流の増大であった((b)において示される電流電圧曲線における最も右の点)。卵母細胞は、VR3A+B−、A−B−およびA+B+cRNA、それぞれ3.25,1.5および5ngを注射され、そして6日後まで記録された。黒色バー:水注射の対照(n=8);白色バー:VR3A+B−イソ型(n=11);斜線バー:VR3A−B−イソ型(n=8);点彩バー:VR3A+B+イソ型(n=5)。すべてのイソ型が水対照以上に有意な増加を示した(それぞれp=0.001,0.03および0.007)。熱誘導応答は、他の2つのイソ型に比べてA+B−イソ型では約2倍大きかったが、差異は有意ではなかった(それぞれA−B−およびA+B+に比べてA+B−ではp=0.051およびp=0.16)。データは、注射された卵母細胞2組から得られた。示されるデータは、平均値および平均値の標準誤差である。(b).電圧ランプで誘導される電流は、水(上段)、VR3A+B−(上から2つ目)、VR3A−B−(上から3つ目)およびVR3A+B+(下段)を注射された卵母細胞に対する増加する熱の適用中に記録された。卵母細胞は、Ca2+ND−96を一定に潅流され、そして溶液はインライン(inline)ヒーター器具(SH−27Aラインヒーターと結合されたTC−324B;Warner Instruments Corp.)によって加熱された。温度37℃〜46℃において得られるランプ誘導電流(y軸に示されるようにミクロアンペアの)が表される;より高い温度における電流トレース(trace)のみが、対応する温度で標識される。
【0107】
潅流誘導電流(I perfusion :図11):
バス潅流の開始は、図11に示されるように、VR3A+B−受容体cDNAから転写されたRNAの有無の下、クローン化ヒトVR1から転写されたRNAを注射された卵母細胞において膜コンダクタンスの増加を誘起した。VR1cRNA(a)を注射された卵母細胞は、−120〜+80mV間の電圧ランプにより400msecにわたってチャレンジされた。ランプ誘導電流は、速度10ml/minにおける卵母細胞の潅流開始後増加された。まだ細胞外生理食塩水中にある卵母細胞からの対照ランプ誘導電流(C)は、Ca2+ND−96のバス潅流の開始前に記録された。潅流の間、ランプ誘導電流は増加し、これはコンダクタンスにおける増加を示す(P)。10uMルテニウムレッド(RR)は、VR1発現卵母細胞における潅流誘導電流(P)をブロックしなかった。かくして、VR1のみを発現する卵母細胞において観察された潅流誘導電流は、10uMルテニウムレッドには非感受性であった(A,「RR」)。しかしながら、VR3A+B−およびVR1を発現する卵母細胞において誘起される潅流誘導電流は、10uMルテニウムレッドによって劇的にブロックされた(B,「RR」)。この違いは、6個の卵母細胞において観察された。ブロックは部分的には可逆的であった(未掲載)。(b).VR3A+B−とともにVR1cRNAを注射された卵母細胞は、−120〜+80mV間の電圧ランプにより400msecにわたってチャレンジされた。ランプ誘導電流は、速度10ml/minにおける卵母細胞の潅流開始後増加された。潅流活性化電流は、卵母細胞の両セットにおいて類似の大きさを有した。RR阻止電流についてのVrevは約−13mVであった(矢印)。両作動剤によって誘導される電流は、ラットVR1について既に報告されたように(Caterina et al.,1997)、強く外向きに整流していた。
【0108】
ヒトVR3A+B−の存在または不在下でヒトVR1を発現する卵母細胞におけるカプサイシン誘導電流(図12)
応答は、カプサイシン誘導電流の十分な外向きの整流のために、この電圧において最大であったので(Caterina et al.,1997)、1uMカプサイシンによって誘起される電流(図12)が、+50mVの保持電圧において測定された。VR1および水(VR3注射についての対照)を注射された卵母細胞(a)ならびにVR1cRNAおよびVR3A+B−cRNAを注射された卵母細胞(b)の3例が示される。カプサイシンは、黒色の水平バーによって指示される時間中、バス(bath)適用された。1uMカプサイシンに対する1次応答の大きさは、VR1cRNAがVR3A+B−cRNAとともに同じ比率で(各2.9ng)同時発現された場合は減少された。もっとも注目すべき差異は、2次応答、カプサイシンの洗浄開始において通常得られる第2次ハンプ(hump)、の大きさと減少速度であった。
【0109】
実施例6 哺乳動物細胞系におけるヒトVR3の特性決定
ヒトHEK293、CHO−K1およびCOS−7細胞が、ヒトVR3イソ型pVR3A+B−R、pVR3A−B−RもしくはpVR3A+B+Rによりトランスフェクションされる。100mmディッシュ当たり106細胞当たりpVR3R 1μgの一時的トランスフェクションが、Effecteneトランスフェクションキット(Quiagen:301425)を用いて実施される。トランスフェクション3日後、細胞は96穴プレート(Biocoat,ポリ−D−リジン被覆ブラック/クリアプレート;Becton Dickinson part#354640)上に塗布される。1日後、ウェルをF12/DMEMにより洗浄し、次いで、室温で1時間、Pluronic F−127(20%,総容量20ml中使用される40μl)を含むFluo−4(2μM)中でインキュベートする。プレートは、FLIPR(Molecular Devices,FL−101)を用いてアッセイされる。細胞は、種々の浸透圧の溶液でチャレンジされる(50μl/secの速度において80μlに添加された40μl)。若干のウェルは、細胞外溶液による細胞の潅流増加を促進するために激しく混合される。ベクターのみのトランスフェクションが対照として使用される。
【0110】
3日後、細胞はネオマイシン(200μg/ml)の存在下で選択され、そして約2週間、3回の1:10希釈継代をとおして増殖される。個々のコロニーを採取し、そして6穴ディッシュにおいて増殖させる。次いで、細胞を96穴プレート(Biocoat,ポリ−D−リジン被覆ブラック/クリアプレート;Becton Dickinson part#354640)上に塗布し、そして3日間集密まで増殖させる。ウェルをF12/DMEMにより洗浄し、次いで、室温で1時間、Pluronic acid(20%,総容量20ml中使用される40μl)を含むFluo−4(2μM)中でインキュベートする。プレートは、FLIPR(Molecular Devices,FL−101)を用いてアッセイされる。細胞は、作動剤(50μl/secの速度において80μlに添加された40μl中3倍濃度において)でチャレンジされる。
【0111】
全細胞パッチ・クランプ(patch clamp)技術(Hamill et al.,1981)を使用して、12mmカバースリップ(coverslip)上で>2日間維持されたヒトVR1受容体を安定して発現するHEK293からのリガンド誘導電流を記録する。細胞は、DIC Nomarski opticsを有するNikon Diaphot 300を用いて可視化される。細胞は、別に指示しない限り、生理食塩水中で連続的に潅流される(〜0.5ml/min)。標準生理食塩水(「Tyrodes」)は、130mMNaCl、4mMKCl、1mMCaCl2、1.2mMMgCl2および10mMhemi−Na−HEPESを含有する(pH7.3,Wescor5500 vaper−pressure(Wescor,Inc.,Logan,UT)を用いて測定される295−300mOsm)。記録用電極は、ボロシリケートキャピラリーチューブ(R6;Garner Glass Claremont,CA)から製作され、チップは、歯科用ペリフェリーワックス(Miles Laboratories,South Bend,IN)でコーティングされ、そして細胞内食塩水:100mMK−グルコン酸、25mMKCl、0.483mMCaCl2、3mMMgCl2、10mMhemi−Na−HEPESおよび1mMK4−BAPTA(100nMフリーCa+2);pH7.4(290mOsmに達するまで添加されたデキストローズを有する)を含有する場合に1−2MΩの抵抗を有する。液間電位差は、両方とも経験的に決定された標準ピペットおよびバス溶液を用い、そしてコンピュータープログラムJPCalc(Barry,1994)を用いて−18mVである。示されるすべての電圧が液間電位差について補正される。電流および電圧シグナルが検出され、そしてAxopatch 1Dパッチ・クランプ増幅器(AXon Instruments,Foster City,CA)により2kHZにおいて濾過され、DigiData 1200Bラボラトリーインターフェース(AXon Instruments)およびPC対応コンピューターシステムによりデジタルに記録され、そしてオフ・ライン解析のために磁気ディスクに保存される。データ取得および解析は、PClampソフトウェアにより行われる。保持電流におけるゆっくりした変化が検出され、そして2kHZにおいて濾過され、そしてLPF202ADC増幅器(Warner,Hamden,CT)およびVR10Bデジタルデータ記録機(Instrutech,Great Neck,NY)によりビデオテープに記録される。シグナルは、その後、Axotapeソフトウェアを用いて10HZにおいて解析される。
【0112】
総膜キャパシタンス(Cm)は、−68mVからの30mV超分極電圧ランプが速度10mV/msにおいて生成した後の最大電流と、最終電位(−98mV)における定常状態電流との間の差異として決定される(Dubin et al.,1999)。
【0113】
リガンド誘導コンダクタンス変化の見かけの反転電位(Vrev)は電圧・ランププロトコール(Dubin et al.,1999)を用いて決定される。電圧ランプが1秒毎に印加され、そして得られる全細胞のランプ誘導電流が記録された。通常、電圧は、ネガティブからポジティブないしネガティブ値までランプされた。−68mVにおいて細胞をクランプするために必要な電流が連続的に追跡される。リガンド−誘導コンダクタンスは、リガンドの存在および不在下で電圧ランププロトコールによって誘起される全細胞電流から決定される。リガンド前(対照)およびリガンド存在下で測定された電圧ランプ誘導電流が比較されて、チャンネル電流出力を調節するためにチャンネルに及ぼすリガンドの影響を示す。正味のリガンド誘導電流が存在しない電圧が決定される(Vrev)。
【0114】
実施例7−ヒトVR3受容体タンパク質の1次構造
本発明は、hVR3の3種のイソ型:A+B−、A−B−およびA+B+を記述している。ヒトVR3受容体cDNAのヌクレオチド配列は、VR3A+B−、A−B−およびA+B+それぞれについて871,811および742アミノ酸をコードしている約2616,2436および2229塩基対の単一の大きい読み枠を示す。VR3A+B−のcDNAは、約337および約547ヌクレオチドの5’および3’−非翻訳エクステンションを有する。VR3A+B+のcDNAは、約836および約994ヌクレオチドの5’および3’−非翻訳エクステンションを有する。最初の枠内メチオニンは、イソ型A+B−、A−B−およびA+B+それぞれについて約98,242Da、91,294Daおよび83,310Daの概算分子質量(Mr)をもつヒトVR3受容体タンパク質を予測する読み枠のための開始コドンとして指定された。A+B−イソ型は871アミノ酸のタンパク質をコードしてイル。VR3A−B−はVR3A+B−のアミノ酸382〜441の60アミノ酸の欠失を含む。VR3A+B+は、アミノ酸736まではA+B−と同一であり、この後に、6個の相違するアミノ酸および終止コドンが存在する。VR3A+B+イソ型は、推定TM6後に20アミノ酸を延ばす。
【0115】
予想されるヒトVR3受容体タンパク質が、ヌクレオチドおよびタンパク質データベースにより整列され、そしてヴァニロイド受容体ファミリー(VR1およびVR3)に関連していることが分かった。大きい推定N末端親水性セグメント(約467アミノ酸)、N末端領域における3個の推定アンキリン反復ドメイン、6個の予想トランスメンブランドメインおよびポア領域を含む、この受容体ファミリーにおける数種の保存モチーフが見いだされる。VR3A+B−は、ヒトVR1と43%同一、両ヒトVRL−1(AF129112)およびヒトVRL(AF103906)と39%同一である。かくして、本明細書に記述されるVR3受容体は、明らかに、ヴァニロイド受容体ファミリーの新規な遺伝子である。 VR3A+B−およびVR3A−B−型は、アミノ酸694から末端までラットの緊張阻害性チャンネルSIC[genbank accession AB015231]に非常に類似している。529アミノ酸によってコードされているSICは、緊張によって阻害されるイオンチャンネルを形成すると考えられる。それは、VRファミリーの大きいN末端細胞質ドメインを欠くが、推定TM1の前にAエクソンに相同な配列を含有する。
【0116】
本明細書に記述されるVR3コーディング領域の完全ゲノム配列は、ジーンバンクへの380512塩基対配列寄託(ホモサピエンスクローンRPC11−7G5(AC007834)、Worley,K.C.による直接付託)において見いだされるようである。このジーンバンク登録は、DNA配列の多くのフラグメントおよび提案される隣接配列を列挙しているが、核酸配列のいかなる解析をも欠き、そしてVR3核酸配列の特徴を特性決定することも、またVR3遺伝子の存在を記述することもしていない。
1 本発明の配列およびゲノム配列の比較は、VR3遺伝子が少なくとも15エクソンからなることを示している。「A」は、両下垂体および前立腺cDNAライブラリーから得られるcDNA中に見いだされる推定N末端細胞質ドメインにおける60アミノ酸インサートである。AおよびBインサートにおいてイントロン/エクソン・ボーダー配列が存在する。
【0117】
A+B−およびA+B+イソ型は、アンキリン反復ドメイン保存配列に対して相同性をもつN末端推定細胞質領域におけるドメインを含有する。かくして、VR3A+イソ型は、VR1について予想されるものと類似の構成を有するようである。第1のドメインは、共通配列に有意に類似している(E=2.6e−5)。次の2ドメインは、それ自体では有意ではない(e=37およびE=2.7)が、全体として見ると、この領域は、3つのアンキリン結合ドメイン含有するようである。A−イソ型は、推定第3アンキリン反復ドメインの20アミノ酸を欠失しており、そして併置された配列はアンキリン反復ドメインと適合しない。
【0118】
VR3A+B−イソ型は、N末端中およびTM4とTM5の間に2個の潜在的なミリストイル化部位:[GPGGE]をもつ。推定リン酸化部位は、7個のPKCリン酸化部位:T112,S134,T175,T190,T380,S403,S688[しかし、S688は推定細胞外領域中にある];1個の潜在的PKAおよびPKGリン酸化部位:T181;12個の潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位:T89,S162,T181,T395,S416,S422,S432,T426,S432,S441,T740,S836;3個の潜在的乳腺カゼインキナーゼリン酸化部位(SxE):S4,S726,S758;1個の潜在的チロシンキナーゼリン酸化部位:Y411[「A」インサート中に存在する];および1個の潜在的N結合グリコシル化部位:N651[N201,N207は、推定細胞内N末端ドメイン中にあり、そしてグリコシル化されそうもない]を含む。本発明において記述されるいかなるイソ型中にも推定CaM結合ドメインは存在しない。
【0119】
「A」インサート2PKCリン酸化部位を欠いているA−イソ型では、6個のカゼインキナーゼIIリン酸化部位および唯一の推定チロシンキナーゼリン酸化部位が欠失している。
【0120】
A+B+イソ型は、C末端の推定細胞内領域において2個のカゼインキナーゼIIリン酸化部位を欠く推定タンパク質をコードしている。
【0121】
実施例8−組織におけるヒトVR3の発現
DNAアレー(Luo et al.,1999)を用いる発現、DNAアレー分布解析は、ヒトVR3mRNAが種々の組織で発現され、そして全組織レベルにおいてVR1と若干の発現の重複があることを示している[図13]。左欄において示される組織タイプからのcRNAは、ヒトVR3をコードしている配列を含有した(中欄)。ヒトVR1の発現は、右欄において示され、そしてほとんどの場合、VR3発現と重複した。註:NSはヒトVR1の有意な発現がなかった。DNAアレー上に固定されたヒトVR3DNAの配列は、(配列番号:17)CCACCATCCTGGACATTGAGCGCTCCTTCCCCGTATTCCTGAGGAAGGCCTTCCGCTCTGGGGAGATGGTCACCGTGGGCAAGAGCTCGGACGGCACTCCTGACCGCAGTGGTGCTTCAGGGTGGATGAGGTGAACTGGTCTCACTGGAACCAGAACTTGGGCATCATCAACGAGGACCCGGGCAAGAATGAGACCTACCAGTATTATGGCTTCTCGCATACCGTGGGCCGCCであった。
このDNA配列は、A+B+、A+B−およびA−B−イソ型には存在しない。cDNA種は前立腺からはクローン化されたことに注目(*;図13)。
ノザンブロット解析は、全脳、胎盤、肺、腎臓、膵臓および前立腺においてVR3の発現を表した。
【0122】
実施例9−大腸菌発現ベクター中へのヒトVR3受容体cDNAのクローニング
組み換えヒトVR3受容体を、限定するものではないがpETシリーズ(Novagen)を含む、大腸菌発現ベクター中へのヒトVR3受容体発現カセットのトランスファー後に、大腸菌において生産する。pETベクターは、緊密に調節されるバクテリオファージT7プロモーターの制御下にヒトVR3受容体を発現させる。誘導性lacプロモーターによって作動するT7RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含有する大腸菌宿主へのこの構築物のトランスファー後、ヒトVR3受容体の発現は、適当なlac基質(IPTG)が培養物に添加される場合に誘導される。発現されるヒトVR3受容体のレベルは本明細書に記述されるアッセイによって決定される。
【0123】
ヒトVR3受容体の完全な読み枠をコードしているcDNAがpET[16]11aのNdeI部位中に挿入される。正方向における構築物は、配列解析によって同定され、そして発現宿主株BL21を形質転換するために使用される。次に、形質転換株が使用されてヒトVR3受容体タンパク質の生産のための培養物に接種される。培養物は、製法が当業者には既知であるM9もしくはZB培地において増殖されてもよい。OD600=1.5まで増殖後、ヒトVR3受容体の発現が、37℃で3時間1mMIPTGを用いて誘導される。
【0124】
実施例10−昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス発現ベクター中へのヒトVR3受容体cDNAのクローニング
AcNPVウイルスのゲノムから得られるバキュロウイルスベクターが、昆虫細胞のSf9系(ATCC CRL#1711)において高レベル発現を与えるために設計される。ヒトVR3受容体cDNAを発現する組み換えバキュロウイルスは、次の標準方法(Invitrogen Maxbac Manual)によって作成される:ヒトVR3受容体cDNA構築物が、pAC360およびBlueBacベクターを含む、種々のバキュロウイルストランスファーベクター(Invitrogen)におけるポリヘドリン遺伝子中に連結される。組み換えバキュロウイルスは、バキュロウイルストランスファーベクターおよび直線化したAcNPVゲノムDNA[Kitts,P.A.,Nuc.Acid.Res.18:5667(1990)]のSf9細胞中への同時トランスフェクション後の相同組み換えによって生成される。組み換えpAC360ウイルスは、感染細胞における封入体の不在によって同定され、そして組み換えpBlueBacウイルスは、β−ガラクトシダーゼ発現に基づいて同定される(Summers,M.D.and Smith,G.E.,Texas Agriculture Exp.Station Bulletin No.1555)。プラーク精製に続いて、ヒトVR3受容体発現が、本明細書に記述されるアッセイによって測定される。
【0125】
ヒトVR3受容体の完全な読み枠をコードしているcDNAがpBlueBacIIのBamHI部位中に挿入される。正方向における構築物は、配列解析によって同定され、そして線状AcNPVマイルドタイプDNAの存在下でSf9細胞をトランスフェクションするために使用される。
【0126】
真の、活性ヒトVR3受容体が感染細胞の細胞質中に見い出される。活性ヒトVR3受容体は、低浸透圧または洗剤溶解によって感染細胞から抽出される。
【0127】
実施例11−酵母発現ベクター中へのヒトVR3受容体cDNAのクローニング
組み換えヒトVR3受容体を、異種タンパク質の細胞内または細胞外発現を導くために設計された発現ベクター中への最適なヒトVR3受容体cDNAシストロンの挿入後に、酵母S.セレビシエ(S.cerevisiae)において生産する。細胞内発現の場合、ベクター、例えばEmBLyex4または類似のものは、ヒトVR3受容体シストロンに連結される[Rinas,U.et al.,Biotechnology 8:543−545(1990);Horowitz B.et al.,J.Biol.Chem.265:4189−4192(1989)]。細胞外発現では、ヒトVR3受容体シストロンは、分泌シグナル(酵母または哺乳動物ペプチド)をヒトVR3受容体タンパク質のNH2末端に融合する酵母発現ベクター中に連結される[Jacobson,M.A.,Gene 85:511−516(1989);Riett L.and Bellon N.Biochem.28:2941−2949(1989)]。
【0128】
これらのベクターは、限定されるものではないが、発現されるcDNAにヒト血清アルブミンシグナルを融合しているpAVE1>6[Steep O.Biotechnology 8:42−46(1990)]、および発現されるcDNAにヒト・リゾチームシグナルを融合しているベクターpL8PL[Yamamoto.Y.,Biochem.28:2728−2732)]を含む。さらに、ヒトVR3受容体は、ベクターpVEPを利用してユビキチンに複合された融合タンパク質として酵母において発現される[Ecker,D.J.Biol.Chem.264:7715−7719(1989),Sabin,E.A.,Biotechnology 7:705−709(1989)、McDonnell D.P.,Bol.Cell Biol.9:5517−5523(1989)]。発現されるヒトVR3受容体のレベルは本明細書に記述されるアッセイによって決定される。
【0129】
実施例12−組み換えヒトVR3受容体の精製
組み換え法により生産されるヒトVR3受容体は、抗体アフィニティークロマトグラフィーによって精製されてもよい。
【0130】
ヒトVR3受容体抗体アフィニティーカラムは、Affigel−10(bio−Rad)、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにN−ヒドロキシスクシンイミドエステルにより予め活性化されているゲル支持体、に抗ヒトVR3受容体抗体を付加することによって作成される。次いで、抗体はスペースアームをもつアミド結合をとおしてゲルに結合される。次いで、残りの活性エステルが1MエタノールアミンHCl(pH8)により失活される。カラムは水、続いて0.23MグリシンHCl(pH2.6)で洗浄されて、すべての非複合抗体または外来のタンパク質を除去する。次いで、カラムは、適当な膜可溶化剤、例えば洗剤とともにリン酸バッファー食塩水(pH7.3)において平衡化され、そして可溶化されたヒトVR3受容体を含有する細胞培養上澄液または細胞抽出物が徐々にカラムを通過される。次いで、カラムを、光学濃度(A280)がバックグラウンドまで落ちるまで洗剤とともにリン酸バッファー食塩水により洗浄し、次いで、タンパク質を洗剤とともに0.23Mグリシン−HCl(pH2.6)で溶出する。精製されたヒトVR3受容体タンパク質は、次に、リン酸バッファー食塩水に対して透析される。
【0131】
【表3】
【0132】
【表4】
【0133】
【表5】
【図面の簡単な説明】
【図1】発明にかかる、配列番号5。コーディング領域のヒトVR3A+B−ヌクレオチド配列(2616bp)。
【図2】発明にかかる、配列番号6。ヒトVR3A+B−のヌクレオチド配列を、337bpの5’非翻訳領域(UT)および547bpの3’UTを包含して示す(3500bp)。
【図3】発明にかかる、配列番号7。ヒトVR3A+B−のコーディング配列(871アミノ酸)
【図4】発明にかかる、配列番号8。コーディング領域のヒトVR3A−B−ヌクレオチド配列(2436bp)。
【図5】発明にかかる、配列番号9。ヒトVR3A−B−のコーディング配列(811アミノ酸)
【図6】発明にかかる、配列番号10。コーディング領域のヒトVR3A+B+ヌクレオチド配列(2229bp)。
【図7】発明にかかる、配列番号11。ヒトVR3A+B+のヌクレオチド配列を、836bpの5’UTおよび994bpの3’UTを包含して示す(4059bp)。
【図8】発明にかかる、配列番号12。ヒトVR3A+B+のコーディング配列(742アミノ酸)
【図9】発明にかかる、ツメガエル(Xenopus)卵母細胞中でのVR3アイソフォームの機能的発現を示す。すなわち、2 Ca2+を含むND−96中で維持された卵母細胞の生存率は、3.25ngのVR3 A+B−およびVR3 A+B+(5ng)の注入4〜6日後に有意に減少したが、しかしVR3 A−B−(1.5ng)cRNAではしなかった。VR3 A+B−および水を注入された卵母細胞のデータは5回の異なる実験から得た。死亡卵母細胞は視覚的に決定した。データはχ2解析を使用して解析した。
【図10】発明にかかる、卵母細胞中での機能。すなわち、VR3アイソフォームは熱により活性化される。A.25℃から46℃までの熱傾斜により導き出されかつ46℃で最低15秒間維持される平均ピーク電流を示す。電流は+80mVで初期電流を上回る増加である。電圧の傾斜を2秒ごとに400m秒にわたって−120から+80mVまで適用した。卵母細胞に、3.25、1.5および5ngのそれぞれVR3 A+B−、A−B−およびA+B+ cRNAを注入し、そして6日後まで記録した。黒色の棒:水を注入された対照(n=8);白色の棒:VR3 A+B−アイソフォーム(n=11);斜線を付けられた棒:VR3 A−B−アイソフォーム(n=8);点を付けられた棒:VR3 A+B+アイソフォーム(n=5)。全部のアイソフォームは水対照を上回る有意の増加を示す(それぞれp=0.001、0.03および0.007;スチューデントのt検定)。熱に誘導された応答は、A+B−アイソフォームにおいて他の2アイソフォームに比較して約2倍より大きいが、しかし差異は有意でない(A−B−およびA+B+に比較してA+B−についてそれぞれp=0.051およびp=0.16)。データは2組の注入された卵母細胞から得た。示されるデータは平均および平均の標準誤差である。B.電圧傾斜に誘導された電流を、水(上)、VR3A+B−(上から2番目)、VR3 A−B−(上から3番目)およびVR3A+B+(一番下)を注入した卵母細胞への増大する熱の適用の間に記録した。卵母細胞はCa2+ ND−96で絶えず灌流し、また、溶液はインライン加熱装置(SH−27AインラインヒーターとともにのTC−324B;ワーナー インストゥルメント コーポレーション(Warner Instrument Corp.))により加熱した。37℃から46℃までの温度で得られた傾斜に誘導された電流(y軸上で示されるとおりμAで)を表し;より高温での電流の軌跡のみを対応する温度で印をつける。
【図11】発明にかかる、卵母細胞中での機能。すなわち、VR3A+B−は、細胞外生理的食塩水溶液による細胞灌流により誘導されるVR1を発現する卵母細胞にて観察される灌流活性化電流(Iperfusion)に、10μMルテニウムレッドに対する感受性を与える。増大された灌流によるIperfusionの活性化は、VR3 A+B− cRNAを注入されたVR1を発現する卵母細胞中でのみルテニウムレッドにより封鎖され、そしてVR1のみを発現する卵母細胞中でされなかった。(a).VR1 cRNA[4ng]を注入された卵母細胞を、−70mVの保持電位から400m秒にわたって−120と+80mVとの間の電圧傾斜で攻撃した。傾斜に誘導された電流は卵母細胞の灌流開始後に10ml/分の速度で増大した。0.5分間の10μMルテニウムレッドでの前インキュベーションは電流を封鎖した。この封鎖は部分的に可逆的であった(示されない)。(b).VR3 A+B−[1.3ng]と一緒にVR1 cRNA[4ng]を注入された卵母細胞を、−70mVの保持電位から400m秒にわたって−120と+80mVとの間の電圧傾斜で攻撃した。傾斜に誘導された電流は卵母細胞の灌流の開始後に10ml/分の速度で増大した。0.5分間の10μMルテニウムレッドとの前インキュベーションはIperfusionに対しほとんど影響を有しなかった。Iperfusionは双方の組の卵母細胞で類似の大きさを有した。RR阻害電流についてのVrevは約−13mV(矢印)であった。
【図12】発明にかかる、卵母細胞中での機能。すなわち、VR1と一緒のVR3A+B−。1μMカプサイシンに対する応答の大きさおよび減衰の動力学は、VR1 cRNAを等しい比[それぞれ2.9ng]でVR3 A+B− cRNAと共発現させた場合に減少した。
【図13】発明にかかる、DNAアレイ分布分析は、hVR3 mRNAが多様な組織中で発現され、また、全組織レベルでVR1との発現の若干の重なり合いが存在することを示す。DNAアレイ上で使用されたDNA配列はA+B+中に存在せず、A+B−およびA−B−アイソフォームのみに存在する。これらのcDNA種が下垂体および前立腺からクローン化されたことに注意されたい。
(発明の背景)
有害な化学的、熱的および機械的刺激は、知覚神経節(例えば後根、節状および三叉神経節)中の小径知覚ニューロン(侵害受容器)の末梢神経端を興奮させ、そして疼痛として知覚されるシグナルを起こす。これらのニューロンは、炎症性もしくは虚血性の病状の間の細胞外空隙中での変化から生じる有害なもしくは潜在的に有害な刺激(熱)ならびに組織損傷(H+(局所組織アシドーシス)および/もしくは伸長)の検出に決定的である(WallとMelzack、1994)。「辛い」トウガラシ(capsicum pepper)中の主刺激成分、バニロイドカプサイシン(8−メチル−N−バニリル−6−ノネナミド)は、細くもしくは無髄の侵害求心性神経の非常に選択的な活性化物質である(Szolcsanyi、1993;Szolcsanyi、1996)。電気生理学的研究は、バニロイドが陽イオンに対し非選択的に浸透性である原形質膜チャンネルを活性化することにより小知覚ニューロンを興奮させることを示している(BevanとSzolcsanyi、1990;Ohら、1996;Woodら、1988)。ユーホルビア属(Euphorbia)植物からの超強力な三環性ジテルペンレシニフェラトキシン(RTX;(Szolcsanyiら、1991))は、ナノモル濃度の親和性でカプサイシン結合部位で結合し、そして、ラット体性および内臓の第一次感覚ニューロンへのカプサイシンレセプターの非常に局在化された分布を示している(Szallasi、1995)。
【0002】
バニロイドレセプターVR1(Caterinaら、1997)は、その閾値がプロトンもしくはカプサイシンの存在下で低下される熱検出レセプターであると考えられている(Tominagaら、1998)。カプサイシンおよびプロトンは、痛覚および神経原性炎症に関与する第一次感覚ニューロンによりほぼ独占的に発現される特定の膜認識部位(バニロイドレセプター)で相互作用する(BevanとSzolcsanyi、1990)。バニロイド(「カプサイシン」)レセプターVR1はカプサイシンおよびRTXにより活性化され、また、VR1の活性化はアンタゴニスト、カプサゼピン(CPZ;(Bavenら、1992))およびルテニウムレッド(RR;(Caterinaら、1997;Woodら、1988))により封鎖(block)される。
【0003】
VR1のアミノ酸配列のハイドロパシシティ(hydropathicity)分析は、6個の潜在的な膜貫通領域(S1−S6)、およびS5とS6との間の1個の推定の孔ループ領域を示す。大型の細胞内ドメインは3個のアンキリンリピートドメインを含有する。(Caterinaら、1997)。このチャンネルは推定の「貯蔵量に操作される(store−operated)」TRPカルシウムチャンネルファミリーとの有意の構造類似性を有する。VR1は、はっきりした外側への整流を示すリガンド依存性非選択的陽イオンチャンネルである(Caterinaら、1997)。重要なことに、VR1は細胞機能の調節において非常に重要であることが既知のイオン、Ca2+に対し高度に浸透性である((BlackstoneとSheng、1999;GuptaとPushkala、1999;van Haasterenら、1999))。
【0004】
ゲノムデータベースの検索は、VR1に構造上関係したサブユニットVRL−1を示した。ラットおよびヒトのVRL−1(それぞれAF129113およびAF129112)はラットVR1(AF029310))に約49%同一かつ66%類似である(Caterinaら、1999)。Woodらによりクローン化されたヒトVRLタンパク質(AF103906)(未発表)はVRL−1(AF129112)に99%同一である。最近、AF129112にほぼ同一である(唯一の差異はQ418の欠失である)hVRCC(ヒトバニロイドレセプター様陽イオンチャンネル)を記述したPartisetiとRenardによる特許出願が公開された。われわれはこれらの配列をVR2と称することができる。全体として、VR1およびVR2の予測される構造は、元はキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)からクローン化された一過性受容器電位(TRP)チャンネル(光伝導である役割を演じているCa浸透可能なチャンネル)により規定されるイオンチャンネルの一ファミリーに特徴的である(LuとWong、1987;MinkeとSelinger、1996)。このレセプターはまた疼痛を生じさせる熱の知覚にも関与しているようである(Caterinaら、1999)。卵母細胞およびHEK細胞中でのVR2の発現は、通常、侵害温度(>53℃)に対する細胞の感受性を与え、それはCPZに対し感受性でなかったがしかし10μMのルテニウムレッドでほぼ完全に封鎖された。VR2の活性化はCa2+に対する高い浸透性を伴う非選択的陽イオン電流を誘導する。興味深いことに、熱感受性の閾値は侵害刺激の反復適用とともに低下したが、しかし閾値以下の温度でしなかった(Caterinaら、1999)。
【0005】
529アミノ酸によりコードされるラットSIC(伸長阻害性チャンネル;ジェンバンク(Genbank)AB015231)は伸長により阻害されるイオンチャンネルを形成すると考えられる(Suzukiら、1999)。ラットVR1に相同な最初の379アミノ酸。SICはVRファミリーの大型のN末端細胞質ドメインを欠くが、しかし推定のTM1の前のAエキソンに相同な1配列を含有する。ラットSICの推定のTM6の中央で開始する最後の163アミノ酸は本発明のヒトVR3 A+B−の対応するアミノ酸配列に類似である。
【0006】
本発明は新規バニロイドレセプターファミリーメンバーVR3のクローニングおよび機能を記述する。この遺伝子は最低3種のアイソフォームを創製するように選択的にスプライスされるようである。
【0007】
(発明の要約)
ヒトバニロイドレセプター3(hVR3)の3種のアイソフォームをコードするDNA分子がクローン化されかつ特徴づけられた。これらのタンパク質の生物学的および構造的特徴を、アミノ酸およびヌクレオチド配列がそうであるように開示する。該組換えタンパク質はレセプターVR3の調節物質を同定するのに有用である。本明細書で開示されるアッセイで同定される調節物質は治療薬として有用であり、これらは炎症性の病状の治療のため、ならびに、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパシー、乳房摘出後疼痛、複合局所疼痛症候群、関節炎(例えば慢性関節リウマチおよび骨関節炎)、ならびに潰瘍、神経変性性疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、過敏性腸症候群および乾癬に伴う難治性疼痛のための鎮痛薬としての使用のための候補である。用途は、中枢神経系疾患、腸管の疾患、異常増殖、ならびにとりわけ消化器系、前立腺および女性生殖器の癌、潰瘍、肝疾患、腎疾患の治療、後根神経節により刺激される内臓の制御、またはとりわけこれらのhVR3ポリペプチドの異常発現に関連するいかなる障害も診断もしくは治療することを包含する。別の局面において、本発明は、本発明により提供される物質を使用するアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法、ならびにhVR3の不均衡を伴う病状を治療することに関する。組換えDNA分子およびその部分は、DNA分子の相同物の単離、DNA分子のゲノム同等物の同定および単離、ならびに突然変異体の形態のDNA分子の同定、検出もしくは単離に有用である。
【0008】
(詳細な記述)
本発明はVR3と命名されたヒトバニロイドレセプターの3種のアイソフォーム、すなわちVR3A+B−、VR3A−B−およびVR3A+B+を記述する。ヒトVR3レセプターcDNAのヌクレオチド配列は、それぞれヒトVR3 A+B−、A−B−およびA+B+の871(図3)、811(図5)および742(図8)アミノ酸をコードする約2616(図1)、2436(図4)および2229(図6)塩基対の単一の大きいオープンリーディングフレームを示した。VR3 A+B−のcDNAは図2に示されるとおり約337および約547ヌクレオチドの5’および3’非翻訳伸長を有し、ここで5’UTRは1−337であり、コーディング領域は338−2953であり、そして3’UTRは2954−3500である。VR3 A+B+のcDNAは図7に示されるとおり約836および約994ヌクレオチドの5’および3’非翻訳伸長を有し、ここで5’UTRは1−836であり、コーディング領域は837−3065であり、そして3’UTRは3066−4059である。第一の同じフレーム内のメチオニンが、それぞれアイソフォームA+B−、A−B−およびA+B+について約98,242Da、91,294Daおよび83,310Daの推定される分子量(Mr)をもつヒトVR3レセプタータンパク質を予測する1個のオープンリーディングフレームの開始コドンと指定された。A+B−アイソフォームは871アミノ酸の1個のタンパク質をコードする。VR3 A−B−はVR3A+B−のアミノ酸382ないし441からの60アミノ酸の欠失を含有する。VR3 A+B+は、アミノ酸736まで(その後に6個の不一致アミノ酸および1個の終止コドンが存在する)A+B−に同一である。VR3 A+B+アイソフォームは推定のTM6の後20アミノ酸伸長する。
【0009】
予測されたヒトVR3レセプタータンパク質が、ヌクレオチドおよびタンパク質データベースと整列され、そしてバニロイドレセプターファミリー(VR1およびVR2)と関係づけられる。大型の推定のN末端親水性セグメント(約467アミノ酸)、N末端領域中3個の推定のアンキリンリピートドメイン、6個の予測される膜貫通領域および1個の孔領域を包含する、レセプターのこのファミリー中で見出される数種の保存されたモチーフが存在する。VR3 A+B−はヒトVR1に43%同一、ヒトVRL−1(AF129112)およびヒトVRL(AF103906)双方に39%同一である。従って、本明細書に記述されるVR3レセプターは明らかにバニロイドレセプターファミリーの新規遺伝子である。
【0010】
ヒトVR3A+B−およびVR3A−B−の形態はアミノ酸694から終わりまでラットの伸長阻害性チャンネルSIC[ジェンバンク(Genbank)受託AB015231]に類似である。529アミノ酸によりコードされるラットSICは伸長により阻害されるイオンチャンネルを形成すると考えられている。それはVRファミリーの大型のN末端細胞質ドメインを欠くが、しかし推定のTM1の前のAエキソンに相同な1個の配列を含有する。
【0011】
本明細書に記述されるVR3コーディング領域の完全なゲノム配列は、ジェンバンク(Genbank)への380512塩基対配列提出(ヒトクローンRPCI1−7G5(AC007834)、Worley,K.C.による直接提出)中に見出されるようである。このジェンバンク(Genbank)登録は、DNA配列の多くのフラグメントおよび提案された隣接配列を列挙するが、しかし、核酸配列のいかなる分析も欠き、そしてVR3核酸配列の特徴を特徴づけもしくはVR3遺伝子の存在を記述できていない。
ヒトVR3レセプター核酸の単離
本発明は、ヒトVR3レセプター産生細胞から単離されたヒトVR3レセプターをコードするDNAに関する。本明細書で使用されるところのヒトVR3レセプターはヒトバニロイドレセプターとして特異的に機能することができるタンパク質を指す。
【0012】
ヒトVR3レセプターの完全なアミノ酸配列は以前に知られておらず、また、既知のヒトVR3レセプターをコードする完全なヌクレオチド配列も知られていなかった。広範な細胞および細胞型が記述されるヒトVR3レセプターを含有することができることが予測される。
【0013】
他の細胞および細胞系もまたヒトVR3レセプターcDNAを単離するための使用に適するかもしれない。適する細胞の選択は、本明細書に記述される細胞抽出物もしくは全細胞アッセイでヒトVR3レセプター活性についてスクリーニングすることにより行ってよい。これらのアッセイのいずれか1つでヒトVR3レセプター活性を所有する細胞は、ヒトVR3レセプターのDNAもしくはmRNAの単離に適することができる。
【0014】
当該技術分野で既知の多様な手順のいずれかを使用してヒトVR3レセプターDNAを分子クローン化してよい。これらの方法は、限定されるものでないが、適切な発現ベクター系中でのヒトVR3レセプター含有cDNAライブラリーの構築後のヒトVR3レセプター遺伝子の直接機能的発現を挙げることができる。別の方法は、ヒトVR3レセプターサブユニットのアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブで、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクター中で構築されたヒトVR3レセプター含有cDNAライブラリーをスクリーニングすることである。付加的な一方法は、ヒトVR3レセプタータンパク質をコードする部分的cDNAで、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクター中で構築されたヒトVR3レセプター含有cDNAライブラリーをスクリーニングすることより成る。この部分的cDNAは、精製されたヒトVR3レセプタータンパク質のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計によるヒトVR3レセプターDNAフラグメントの特異的PCR増幅により得られる。
【0015】
別の方法は、ヒトVR3レセプター産生細胞からRNAを単離しかつ該RNAをインビトロもしくはインビボ翻訳系を介してタンパク質に翻訳することである。ペプチドタンパク質へのRNAの翻訳はヒトVR3レセプタータンパク質の少なくとも一部分の産生をもたらすことができ、それは例えば抗ヒトVR3レセプター抗体との免疫学的反応性もしくはヒトVR3レセプタータンパク質の生物学的活性により同定することができる。この方法において、ヒトVR3レセプター産生細胞から単離されたRNAのプールを、ヒトVR3レセプタータンパク質の少なくとも一部分をコードするRNAの存在について分析することができる。RNAのプールのさらなる分画を行ってヒトVR3レセプターRNAを非ヒトVR3レセプターRNAから精製することができる。この方法により製造されたペプチドもしくはタンパク質を分析してアミノ酸配列を提供してよく、それを順に使用してヒトVR3レセプターcDNAの製造のためのプライマーを提供するか、もしくは、翻訳に使用されるRNAを分析してヒトVR3レセプターをコードするヌクレオチド配列を提供しかつヒトVR3レセプターcDNAのこの製造のためのプローブを生じさせることができる。この方法は当該技術分野で既知であり、かつ、例えばManiatis,T.、Fritsch,E.F.、Sambrook,J.中、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989中に見出すことができる。
【0016】
他の型のライブラリー、ならびに他の細胞もしくは細胞型から構築されたライブラリーがヒトVR3レセプターをコードするDNAを単離するのに有用であるかもしれないことが当業者に容易に明らかである。他の型のライブラリーは、限定されるものでないが、他の細胞、ヒト以外の生物体のVR3レセプター由来のcDNAライブラリー、ならびにYAC(酵母の人工染色体)を包含するゲノムDNAライブラリーおよびコスミドライブラリーを挙げることができる。
【0017】
適するcDNAライブラリーを、ヒトVR3レセプター活性を有する細胞もしくは細胞系から調製してよいことが当業者に容易に明らかである。ヒトVR3レセプターcDNAを単離するためのcDNAライブラリーの調製での使用のための細胞もしくは細胞系の選択は、最初にヒトVR3レセプター関連の生物学的活性の測定もしくはリガンド結合アッセイを使用して細胞関連のヒトVR3レセプター活性を測定することにより行ってよい。
【0018】
cDNAライブラリーの調製は当該技術分野で公知の標準的技術により実施することができる。公知のcDNAライブラリー構築技術は例えばManiatis,T.、Fritsch,E.F.、Sambrook,J.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(コールド スプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989)中に見出すことができる。
【0019】
ヒトVR3レセプターをコードするDNAもまた、適するゲノムDNAライブラリーから単離してよいこともまた当業者に容易に明らかである。ゲノムDNAライブラリーの構築は当該技術分野で公知の標準的技術により実施することができる。公知のゲノムDNAライブラリー構築技術はManiatis,T.、Fritsch,E.F.、Sambrook,J.中、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(コールド スプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989)中に見出すことができる。
【0020】
上の方法によりヒトVR3レセプター遺伝子をクローン化するために、ヒトVR3レセプターのアミノ酸配列が必要であるかもしれない。これを達成するために、ヒトVR3レセプタータンパク質を精製しそして部分的アミノ酸配列を自動化シークエネーターにより決定してよい。アミノ酸配列全体を決定することは必要でないが、しかし、該タンパク質からの6ないし8アミノ酸の2領域の直鎖状配列を、部分的ヒトVR3レセプターDNAフラグメントのPCR増幅のためのプライマーの製造のため決定する。
【0021】
適するアミノ酸配列が同定されれば、それらをコードすることが可能なDNA配列を合成する。遺伝暗号は縮重であるため、特定の1アミノ酸をコードするのに1種以上のコドンが使用されているかもしれず、そして従って、該アミノ酸配列は一組の類似のDNAオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードされることができる。該組の1メンバーのみが、ヒトVR3レセプター配列に同一であろうが、しかし、不適正をもつDNAオリゴヌクレオチドの存在下でさえヒトVR3レセプターDNAにハイブリダイズすることが可能であろう。不適正にされたDNAオリゴヌクレオチドはなお、ヒトVR3レセプターDNAに十分にハイブリダイズしてヒトVR3レセプターをコードするDNAの同定および単離を可能にするかもしれない。これらの方法により単離されたDNAを使用して、無脊椎動物および脊椎動物の供給源からの多様な細胞型からのDNAライブラリーをスクリーニングしかつ相同な遺伝子を単離することができる。
【0022】
精製された生物学的に活性のヒトVR3レセプターは数種の異なる物理的形態を有するかもしれず、ヒトVR3レセプターは完全長の新生もしくはプロセシングされていないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチドもしくはプロセシングされたポリペプチドの組み合わせとして存在するかもしれない。完全長の新生ヒトVR3レセプターポリペプチドは特異的タンパク質分解性切断事象により翻訳後修飾されてよく、それは完全長の新生ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす。1個のフラグメント、もしくはフラグメントの物理的会合がヒトVR3レセプターに関連する完全な生物学的活性を有するかもしれないが、しかしながら、ヒトVR3レセプター活性の程度は、個々のヒトVR3レセプターフラグメントと物理的に会合されたヒトVR3レセプターポリペプチドフラグメントとの間で変動するかもしれない。
【0023】
遺伝暗号は縮重であるため、特定の1アミノ酸をコードするのに1種以上のコドンが使用されるかもしれず、そして従って、該アミノ酸配列は一組の類似のDNAオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードされることができる。該組の1メンバーのみが、ヒトVR3レセプター配列に同一であろうが、しかし、適切な条件下で、不適正をもつDNAオリゴヌクレオチドの存在下でさえヒトVR3レセプターDNAにハイブリダイズすることが可能であろう。代替の条件下で、不適正にされたDNAオリゴヌクレオチドはなお、ヒトVR3レセプターDNAにハイブリダイズしてヒトVR3レセプターをコードするDNAの同定および単離を可能にするかもしれない。
【0024】
特定の生物体からのヒトVR3レセプターをコードするDNAを使用して、他の生物体からヒトVR3レセプターの相同物を単離かつ精製してもよい。これを達成するために、第一のヒトVR3レセプターDNAを適切なハイブリダイゼーション条件下でヒトVR3レセプターの相同物をコードするDNAを含有するサンプルと混合してよい。ハイブリダイズされたDNA複合体を単離してよく、そして、相同なDNAをコードするDNAをそれから精製してよい。
【0025】
特定のアミノ酸をコードする多様なコドン中にかなりの量の冗長性(redundancy)が存在することが既知である。従って、本発明はまた、同一のアミノ酸の最終的な翻訳をコードする代替コドンを含有するDNA配列にも向けられる。本明細の目的上、1個もしくはそれ以上の置き換えられたコドンを担持する配列を縮重変異(degenerate variation)と定義することができる。発現されるタンパク質の最終的な物理特性を実質的に変えないDNA配列もしくは翻訳されたタンパク質いずれか中の突然変異もまた本発明の範囲内に包含される。例えば、ロイシンの代わりにバリン、リシンの代わりにアルギニン、もしくはグルタミンの代わりにアスパラギンの置換はポリペプチドの機能性の変化を引き起こさないかもしれない。こうした置換は公知であり、そして例えばWatosonらによるMolecular Biology of the Gene、第4版、ベンジャミン カミングス パブリッシング カンパニー(Benjamin Cummings Pub.Co.)中に記述される。
【0026】
ペプチドをコードするDNA配列を、天然に存在するペプチドのものと異なる特性を有するペプチドをコードするように変えてもよいことが既知である。DNA配列を変える方法は、限定されるものでないが部位特異的突然変異誘発、キメラ置換および遺伝子融合を挙げることができる。部位特異的突然変異誘発はサイレント突然変異、保存的突然変異、もしくは非保存的突然変異を生じるかも知れない1個もしくはそれ以上のDNA残基を変えるのに使用する。キメラ遺伝子は、類似のもしくは異なる遺伝子のドメインを交換してヒトVR3レセプター遺伝子中の類似のドメインを置き換えることにより調製する。同様に、遺伝子の同定および単離を助長するための親和性標識のようなドメインをヒトVR3レセプター遺伝子に付加する融合遺伝子を調製してよい。例えば膜貫通ドメインを除去するもしくは該タンパク質の正常な輸送を変えるためのターゲッティング配列を付加する、またはヒトVR3レセプター遺伝子に新たな翻訳後修飾配列を付加することにより、該タンパク質の可溶性バージョンを創製するように、ヒトVR3レセプター遺伝子の領域を置き換える融合遺伝子を調製してもよい。変えられる特性の例は、限定されるものでないが基質に対する酵素もしくはリガンドに対するレセプターの親和性の変化を挙げることができる。
【0027】
本明細書で使用されるところのヒトVR3レセプターの「機能的誘導体」は、ヒトVR3レセプターの生物学的活性に実質的に類似である生物学的活性(機能的もしくは構造上のいずれか)を所有する化合物である。「機能的誘導体」という用語は、ヒトVR3レセプターの「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似物」および「相同物」もしくは「化学的誘導体」を包含することを意図している。「フラグメント」という用語はヒトVR3レセプターのいかなるポリペプチドサブセットも指すことを意味する。「変異体」という用語は、ヒトVR3レセプター分子全体もしくはそのフラグメントのいずれかに構造および機能が実質的に類似の分子を指すことを意味する。分子は、双方の分子が実質的に類似の構造を有する場合もしくは双方の分子が類似の生物学的活性を所有する場合に、ヒトVR3レセプターに「実質的に類似」である。従って、2種の分子が実質的に類似の活性を所有する場合、それらはそれらの分子の一方の構造が他方で見出されない場合であっても、もしくは2種のアミノ酸配列が同一でない場合であっても変異体であるとみなされる。「類似物」という用語は、ヒトVR3レセプター分子全体もしくはそのフラグメントのいずれかに機能が実質的に類似の分子を指す。
ヒトVR3レセプターの組換え発現
本明細書に記述される方法により得られたクローン化されたヒトVR3レセプターDNAは、適するプロモーターおよび他の適切な転写調節因子を含有する発現ベクター中への分子クローニングにより組換え的に発現させかつ原核生物もしくは真核生物宿主細胞に移入して組換えヒトVR3レセプタータンパク質を産生させてよい。こうした操作の技術はManiatis,T.ら、上記に完全に記述され、また、当該技術分野で公知である。
【0028】
発現ベクターは、本明細書で、適切な宿主中での遺伝子のクローン化されたコピーの転写およびそれらのmRNAの翻訳に必要とされるDNA配列と定義する。こうしたベクターは、大腸菌(E.coli)を包含する細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を包含する真菌細胞および動物細胞のような多様な宿主中で真核生物遺伝子を発現するのに使用することができる。
【0029】
特別に設計されたベクターは、細菌−酵母もしくは細菌−動物細胞、または細菌−真菌細胞もしくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のDNAの運搬を可能にする。適切に構築された発現ベクターは:宿主細胞中での自律複製のための複製開始点、選択可能なマーカー、制限された数の有用な制限酵素部位、高コピー数のための潜在能力および活性のプロモーターを含有すべきである。プロモーターは、RNAポリメラーゼがDNAに結合しそしてRNA合成を開始することを指図するDNA配列と定義する。強力なプロモーターはmRNAを高頻度で開始させるものである。発現ベクターは、限定されるものでないがクローニングベクター、改変クローニングベクター、とりわけ設計されたプラスミドもしくはウイルスを挙げることができる。
【0030】
哺乳動物細胞中で組換えヒトVR3レセプターを発現させるのに多様な哺乳動物発現ベクターを使用してよい。組換えヒトVR3レセプター発現に適することができる商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターは、限定されるものでないがpMAMneo(クロンテック(Clontech))、pcDNA3(インヴィトロジェン(InVitrogen))、pMC1neo(ストラタジーン(Stratagene))、pXT1(ストラタジーン(Stratagene))、pSG5(ストラタジーン(Stratagene))、EBO−pSV2−neo(ATCC 37593)pBPV−1(8−2)(ATCC 37110)、pdBPV−MMTneo(342−12)(ATCC 37224)、pRSVgpt(ATCC 37199)、pRSVneo(ATCC 37198)、pSV2−dhfr(ATCC 37146)、pUCTag(ATCC 37460)およびIZD35(ATCC 37565)を挙げることができる。
【0031】
細菌細胞中で組換えヒトVR3レセプターを発現させるのに多様な細菌発現ベクターを使用してよい。組換えヒトVR3レセプター発現に適することができる商業的に入手可能な細菌発現ベクターは、限定されるものでないがpETベクター(ノヴァジェン(Novagen))およびpQEベクター(キアゲン(Qiagen))を挙げることができる。
【0032】
酵母のような真菌細胞中で組換えヒトVR3レセプターを発現させるのに多様な真菌細胞発現ベクターを使用してよい。組換えヒトVR3レセプター発現に適することができる商業的に入手可能な真菌細胞発現ベクターは、限定されるものでないがpYES2(インヴィトロジェン(InVitrogen))およびピキア(Pichia)発現ベクター(インヴィトロジェン(InVitrogen))を挙げることができる。昆虫細胞中で組換えヒトVR3レセプターを発現させるのに多様な昆虫細胞発現ベクターを使用してよい。ヒトVR3レセプターの組換え発現に適することができる商業的に入手可能な昆虫細胞発現ベクターは、限定されるものでないがpBlueBacII(インヴィトロジェン(InVitrogen))を挙げることができる。
【0033】
ヒトVR3レセプターをコードするDNAを、組換え宿主細胞中での発現のため発現ベクターにクローン化してよい。組換え宿主細胞は、限定されるものでないが大腸菌(E.coli)のような細菌、酵母のような真菌細胞、限定されるものでないがヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞系を挙げることができる哺乳動物細胞、ならびに限定されるものでないがショウジョウバエおよびカイコ由来細胞系を挙げることができる昆虫細胞を挙げることができる原核生物もしくは真核生物であってよい。適することができかつ商業的に入手可能である哺乳動物種由来の細胞系は、限定されるものでないがCV−1(ATCC CCL 70)、COS−1(ATCC CRL 1650)、COS−7(ATCC CRL 1651)、CHO−K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS−C−1(ATCC CCL 26)、MRC−5(ATCC CCL 171)、L−細胞およびHEK−293(ATCC CRL1573)を挙げることができる。
【0034】
発現ベクターは、限定されるものでないが形質転換、トランスフェクション、原形質融合、リポフェクションおよび電気穿孔法を挙げることができる多数の技術のいずれか1つを介して宿主細胞に導入してよい。発現ベクター含有細胞をクローン的に繁殖させ、そして別個に分析してそれらがヒトVR3レセプタータンパク質を産生するかどうか決定する。ヒトVR3レセプターを発現する宿主細胞クローンの同定は、限定されるものでないが抗ヒトVR3レセプター抗体との免疫学的反応性および宿主細胞関連のヒトVR3レセプター活性の存在を挙げることができるいくつかの手段により行ってよい。
【0035】
ヒトVR3レセプターDNAの発現はまた、インビトロで産生された合成mRNAを使用して実施してもよい。合成mRNAもしくはヒトVR3レセプター産生細胞から単離されたmRNAは、限定されるものでないが小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を挙げることができる多様な細胞を含まない系で効率的に翻訳することができ、ならびに、限定されるものでないがカエル卵母細胞への微小注入法を挙げることができる細胞に基づく系で効率的に翻訳することができ、カエル卵母細胞への微小注入法が一般に好ましい。
【0036】
至適レベルのヒトVR3レセプター活性および/もしくはヒトVR3レセプタータンパク質を生じるヒトVR3レセプターDNA配列(1種もしくは複数)を決定するために、限定されるものでないが以下:
遺伝子名 開始コドン 終止コドン 総塩基対
VR3A+B+ 837 3065 2229
VR3A+B− 338 2953 2616
VR3A−B− 1 2436 2436
(これらの数字は第一のメチオニンの最初のヌクレオチドおよび最初の終止コドンの前の最後のヌクレオチドに対応する)ならびにヒトVR3レセプタータンパク質をコードするcDNAの部分を含有する数種の構築物を挙げることができるヒトVR3レセプターDNA分子を構築することができる。全部の構築物は、ヒトVR3レセプターcDNAの5’もしくは3’非翻訳領域の何も含有しないか、全部もしくは部分を含有するよう設計することができる。ヒトVR3レセプター活性およびタンパク質発現のレベルは適切な宿主細胞へのこれらの構築物の単独および組み合わせの双方での導入後に決定することができる。一過性アッセイでの至適の発現を生じるヒトVR3レセプターDNAカセットの決定後に、このヒトVR3レセプターDNA構築物を、限定されるものでないが哺乳動物細胞、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、大腸菌(E.coli)および酵母ビール酵母菌(S.cerevisiae)を挙げることができる宿主細胞中での発現のため、多様な発現ベクターに移す。
ヒトVR3レセプターのアッセイ方法
宿主細胞トランスフェクション体および微小注入された卵母細胞を使用して、以下の方法により機能的ヒトVR3レセプター活性のレベルおよび総ヒトVR3レセプタータンパク質のレベルの双方をアッセイしてよい。組換え宿主細胞の場合、これは1種もしくはそれ以上のフラグメントをコードするヒトVR3レセプターDNA、サブユニットまたは他の機能的遺伝子を含有する1種またはおそらく2種もしくはそれ以上のプラスミドのコトランスフェクションを必要とする。卵母細胞の場合、これはヒトVR3レセプタータンパク質の合成RNAの共注入を必要とする。発現を見込むのに適切な時間の期間の後に、細胞タンパク質を例えば35S−メチオニンで24時間代謝的に標識し、その後細胞ライセートおよび細胞培養上清を収穫し、そしてヒトVR3レセプタータンパク質に対し向けられたポリクローナル抗体を用いる免疫沈降にかける。
【0037】
宿主細胞中のヒトVR3レセプタータンパク質のレベルは、免疫親和性および/もしくはリガンド親和性技術により定量する。ヒトVR3レセプター特異的親和性ビーズもしくはヒトVR3レセプター特異的抗体を使用して、例えば35S−メチオニン標識もしくは非標識ヒトVR3レセプタータンパク質を単離する。標識されたヒトVR3レセプタータンパク質はSDS−PAGEにより分析する。非標識ヒトVR3レセプタータンパク質は、ヒトVR3レセプター特異的抗体を使用するウェスタンブロッティング、ELISAもしくはRIAアッセイにより検出する。
【0038】
ヒトVR3レセプター活性を検出するための他の方法は、ヒトVR3レセプターcDNAでトランスフェクトされた全細胞もしくはヒトVR3レセプターmRNAを注入された卵母細胞中でのヒトVR3レセプター活性の直接測定を必要とする。ヒトVR3レセプター活性は、ヒトVR3レセプターDNAを発現する宿主細胞の特異的リガンド結合もしくは生物学的特徴により測定する。ヒトVR3レセプターを発現する組換え宿主細胞の場合、パッチボルテージクランプ技術を使用してチャンネル活性を測定しかつヒトVR3レセプタータンパク質を定量することができる。卵母細胞の場合、パッチクランプ法ならびに二電極膜電位固定技術を使用してカルシウムチャンネル活性を測定しかつヒトVR3レセプタータンパク質を定量することができる。
細胞に基づくアッセイ
本発明はヒトVR3レセプターの化合物調節を検出する全細胞の方法を提供する。該方法は、段階:
1)化合物、および機能的ヒトVR3レセプターを含有する細胞を接触させること、ならびに
2)化合物による改変されたヒトVR3レセプター機能に応答しての細胞中の変化を測定すること
を含んで成る。
【0039】
化合物との細胞の接触に必要な時間の量は、例えば既知のヒトVR3レセプター調節物質との時間経過を実施すること、および細胞の変化を時間の関数として測定することにより経験的に決定する。
【0040】
本発明の方法の測定手段は、化合物に曝露された細胞を該化合物に同様に曝露されていない同一の細胞と比較することによりさらに規定することができる。あるいは、2種の細胞、すなわち機能的ヒトVR3レセプターを含有する1種および第一のものに同一しかし機能的ヒトVR3レセプターを欠く第二の細胞を、双方を同一の化合物と接触させかつ2種の細胞間の差異を比較することができる。この技術はこれらのアッセイのバックグラウンドノイズの確立においてもまた有用である。当業者は、これらの制御機構が機能的ヒトVR3レセプターの調節に応答する細胞の変化の容易な選択もまた可能にすることを認識するであろう。
【0041】
「細胞」という用語は最低1個の細胞を指すが、しかし検出方法の感度に適切な複数の細胞を包含する。本発明に適する細胞は細菌、酵母もしくは真核生物であってよい。
【0042】
機能的ヒトVR3レセプターの化合物調節を決定するためのアッセイ方法は、慣習的な実験室の形式にあることができるか、もしくは高スループットに適合させることができる。「高スループット」という用語は、同時に複数のサンプルの容易な分析およびロボット操作の受容能力を可能にするアッセイの設計を指す。高スループットアッセイの別の所望の特徴は、所望の分析を達成するための試薬の使用を減少させるもしくは操作の数を最小限にするよう最適化されるアッセイの設計である。アッセイ形式の例は、限定されるものでないが、液体を取り扱う実験に使用される96穴もしくは384穴プレート、浮遊液滴および「実験室チップ(lab on a chip)」マイクロチャンネルチップを挙げることができる。プラスチック型および液体取扱い装置の小型化が進歩しているため、もしくは改良されたアッセイ装置が設計されているため、本発明の設計を使用してより多数のサンプルを実施してもよいことが当業者により公知である。
【0043】
本発明の方法に適する細胞の変化は、ヒトVR3レセプターの活性、機能もしくは量の変化を直接測定すること、あるいはヒトVR3レセプター機能の下流の影響を測定することにより、例えば二次メッセンジャー濃度もしくは転写の変化を測定することにより、またはヒトVR3レセプターにより転写的に影響される遺伝子のタンパク質レベルの変化により、または細胞中の表現型の変化を測定することによりを含んで成る。好ましい測定手段は、ヒトVR3レセプタータンパク質の量の変化、ヒトVR3レセプターの機能的活性の変化、mRNAの量の変化、細胞内タンパク質の変化、細胞表面タンパク質もしくは分泌型タンパク質の変化、またはCa+2、cAMPもしくはGTP濃度の変化を包含する。ヒトVR3レセプターの量もしくは機能的活性の変化を本明細書に記述する。mRNAのレベルの変化は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)もしくは示差的遺伝子発現により検出する。免疫親和性、リガンド親和性、もしくは酵素的測定は、宿主細胞中での特定のタンパク質のレベルのVR3に誘導される変化を定量する。タンパク質が酵素である場合、タンパク質の誘導は蛍光発生的もしくは比色分析の基質の切断によりモニターされる。
【0044】
細胞表面タンパク質のための好ましい検出手段はフローサイトメトリーもしくは統計学的細胞画像化を包含する。双方の技術において、目的のタンパク質は細胞表面に局在化されており、特異的蛍光プローブで標識され、そして細胞の蛍光の程度を介して検出される。フローサイトメトリーにおいては細胞を溶液中で分析する一方、細胞画像化技術においては細胞の野を相対的蛍光について比較する。
【0045】
本発明はまた、ヒトVR3レセプターをコードするDNAもしくはRNAの発現ならびにインビボでヒトVR3レセプタータンパク質の機能を調節する化合物のスクリーニング方法にも向けられる。
【0046】
化合物は、ヒトVR3レセプターをコードするDNAもしくはRNAの発現またはヒトVR3レセプタータンパク質の機能を増大もしくは減弱させることによりにより調節するかもしれない。ヒトVR3レセプターをコードするDNAもしくはRNAの発現またはヒトVR3レセプタータンパク質の機能を調節する化合物は多様なアッセイにより検出してよい。アッセイは、発現もしくは機能の変化が存在するかどうかを決定する単純な「はい/いいえ(yes/no)」アッセイであってよい。アッセイは、試験サンプルの発現もしくは機能を標準サンプル中の発現もしくは機能のレベルと比較することにより定量的にしてもよい。この方法で同定された調節物質は治療薬として有用であり、そしてヒトVR3レセプターである。
ヒトVR3レセプタータンパク質の精製
組換え宿主細胞中でのヒトVR3レセプターの発現後に、精製されたヒトVR3レセプターを提供するためにヒトVR3レセプタータンパク質を回収してよい。組換えヒトVR3レセプターは、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーならびに抗体/リガンドアフィニティークロマトグラフィーの多様な組み合わせもしくは個別の応用により、細胞ライセートおよび抽出物から精製してよい。
【0047】
組換えヒトVR3レセプターは、完全長の新生ヒトVR3レセプター、ヒトVR3レセプターのポリペプチドフラグメントもしくはヒトVR3レセプターサブユニットに特異的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を用いて作成された免疫親和性カラムの使用により他の細胞タンパク質から分離することができる。親和性樹脂はその場合、適する緩衝液、例えばリン酸緩衝生理的食塩水(pH7.3)中で平衡化し、そして、ヒトVR3レセプターもしくはヒトVR3レセプターサブユニットを含有する細胞培養上清もしくは細胞抽出物をゆっくりとカラムを通過させる。その後、光学密度(A280)がバックグラウンドに下落するまでカラムを該緩衝液で洗浄し、その後、0.23Mグリシン−HCl(pH2.6)のような緩衝液を使用してpHを低下させることによるような緩衝条件を変えることによりタンパク質を溶出する。精製されたヒトVR3レセプタータンパク質をその後、リン酸緩衝生理的食塩水のような適する緩衝液に対して透析する。
ヒトVR3レセプターに結合する抗体の産生および使用
ヒトVR3レセプターに対する単一特異性抗体は、ヒトVR3レセプターに対し反応性の抗体を含有する哺乳動物抗血清から精製するか、もしくは元はKohlerとMilstein、Nature 256:495−497(1975)により記述された技術を使用してヒトVR3レセプターと反応性のモノクローナル抗体として調製する。免疫学的技術は当該技術分野で公知であり、そして、例えばコールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス(Cold SpringHarbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーにより出版されたAntibodies:A laboratory manual、ISBN 0879693142中に記述される。本明細書で使用されるところの単一特異性抗体は、ヒトVR3レセプターに対する均一の結合の特徴をもつ単一の抗体種もしくは複数の抗体種と定義する。本明細書で使用されるところの均一の結合は、上述されるところのヒトVR3レセプターに関連するもののような特定の抗原もしくはエピトープに結合する抗体種の能力を指す。ヒトVR3レセプター特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどのような動物(ウサギが好ましい)を、免疫アジュバントを伴うかもしくは伴わないかのいずれかで適切な濃度のヒトVR3レセプターで免疫化することにより生じさせる。
【0048】
免疫前血清を最初の免疫感作前に収集する。各動物は許容できる免疫アジュバントを伴う約0.001mgと約100mgとの間のヒトVR3レセプターを受領する。こうした許容できるアジュバントは、限定されるものでないがフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、明礬沈降物、ざ瘡プロピオンバクテリウム(Corynebacterium parvum)およびrRNAを含有する油中水型乳剤を挙げることができる。初期免疫感作は、皮下(SC)、腹腔内(IP)もしくは双方のいずれかで複数の部位での好ましくはフロイントの完全アジュバント中のヒトVR3レセプターより成る。各動物から定期的間隔で、好ましくは毎週採血して抗体力価を測定する。動物は初期免疫感作後に追加免疫の注入を受領してももしくはしなくてもよい。追加免疫の注入を受領する動物には、一般に、同一経路によりフロイントの不完全アジュバント中の等量の抗原を投与する。追加免疫の注入は最大力価が得られるまで約3週間隔で投与する。各追加免疫の免疫感作後約7日もしくは単回免疫感作後約1週間に、動物から採血し、血清を収集し、そしてアリコートを約−20℃で保存する。
【0049】
ヒトVR3レセプターと反応性のモノクローナル抗体(mAb)を、近交系マウス、好ましくはBalb/cをヒトVR3レセプターで免疫化することにより調製する。マウスは、等量の上で論考されたところの許容できるアジュバント中に組み込まれた約0.1mlの緩衝液もしくは生理的食塩水中の約0.001mgないし約1.0mg、好ましくは約0.1mgのヒトVR3レセプターを用いてIPもしくはSC経路により免疫化する。フロイントのアジュバントが好ましく、フロイントの完全アジュバントを初期免疫感作に使用し、そしてフロイントの不完全アジュバントをその後使用する。マウスは第0日に初期免疫感作を受領し、そして約2ないし約30週間休ませる。免疫化されたマウスに、静脈内(IV)経路によりリン酸緩衝生理的食塩水のような緩衝液溶液中の約0.001ないし約1.0mgのヒトVR3レセプターの1回もしくはそれ以上の追加免疫の免疫感作を投与する。抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは脾リンパ球を、当該技術分野で既知の標準的手順により免疫化されたマウスから脾を取り出すことにより得る。脾リンパ球を適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と、安定なハイブリドーマの形成を可能にすることができる条件下で混合することにより、ハイブリドーマ細胞を生じさせる。融合パートナーは、限定されるものでないが:マウス骨髄腫P3/NS1/Ag 4−1;MPC−11;S−194およびSp2/0を挙げることができ、Sp2/0が一般に好ましい。抗体産生細胞および骨髄腫細胞を、約30%から約50%までの濃度のポリエチレングリコール(分子量約1000)中で融合させる。融合されたハイブリドーマ細胞を、当該技術分野で既知の手順により、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン補充されたダルベッコの改変イーーグル培地(DMEM)中での成長により選択する。上清液を、ほぼ第14、18および21日に成長陽性のウェルから収集し、そして抗原としてヒトVR3レセプターを使用する固相免疫放射アッセイ(SPIRA)のようなイムノアッセイにより抗体産生についてスクリーニングする。培養液はオークターロニー沈降アッセイでもまた試験してmAbのアイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞を、Tissue Culture Methods and Applications、KruseとPaterson編、アカデミック プレス(Academic Press)、1973中のMacPherson、Soft Agar Techniquesの軟寒天技術のような技術、もしくは限界希釈の技術によりクローン化する。
【0050】
モノクローナル抗体を、初回抗原刺激後最低約4日に、プリスタンで初回免疫刺激されたBalb/cマウスの約1×106ないし約6×106個のハイブリドーマ細胞を含むマウスあたりおよそ0.5mlの注入によりインビボで産生させる。細胞移入後およそ8〜12日に腹水を収集し、そしてモノクローナル抗体を当該技術分野で既知の技術により精製する。
【0051】
抗ヒトVR3レセプターmAbのインビトロ産生は、当該技術分野で公知の組織培地中でハイブリドーマを成長させることにより実施する。当該技術分野で公知の中空糸培養技術、エア・リフト反応器、ローラーボトル、もしくはスピナーフラスコ培養技術を使用して高密度のインビトロ細胞培養を実施して、大量の抗ヒトVR3レセプターMAbを製造してよい。mAbは当該技術分野で既知の技術により精製する。
【0052】
腹水もしくはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、限定されるものでないが沈降法、受動凝集、酵素結合免疫吸着抗体(ELISA)技術およびラジオイムノアッセイ(RIA)技術を挙げることができる多様な血清学的もしくは免疫学的アッセイにより測定する。体液もしくは組織および細胞抽出物中のヒトVR3レセプターの存在を検出するのに類似のアッセイを使用する。
【0053】
単一特異性抗体の上述された産生方法を利用してヒトVR3レセプターポリペプチドフラグメントもしくは完全長の新生ヒトVR3レセプターポリペプチドもしくは個々のヒトVR3レセプターサブユニットに特異的な抗体を産生してよいことが当業者に容易に明らかである。とりわけ、唯一のヒトVR3レセプターサブユニットもしくは完全に機能的なヒトVR3レセプタータンパク質に特異的である単一特異性抗体を生じさせてよいことが当業者に容易に明らかである。ヒトVR3レセプタータンパク質の正常な機能を阻害する単一特異性抗体を生じさせてよいこともまた当業者に明らかである。
【0054】
ヒトVR3レセプター抗体アフィニティーカラムは、抗体がゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようなゲル支持体に抗体を付加することにより作成する。好ましい共有結合は抗体上に含有されるアミン、アルデヒドもしくはスルフヒドリル残基により作成される。抗体上でのアルデヒドもしくは遊離スルフヒドリル基の生成方法は当該技術分野で公知であり;アミン基は例えばN−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応性である。
ヒトVR3レセプター特異的試薬を含有するキット組成物
ヒトVR3レセプターのDNAもしくはRNA、ヒトVR3レセプターに対する抗体、またはヒトVR3レセプタータンパク質を含有するキットを製造してよい。ヒトVR3レセプターDNAにハイブリダイズするDNAを検出するか、またはサンプル中のヒトVR3レセプタータンパク質もしくはペプチドフラグメントの存在を検出するのにこうしたキットを使用する。こうした特徴づけは、限定されるものでないが法廷分析、診断の応用および疫学的研究を挙げることができる多様な目的上有用である。
【0055】
本発明は診断試薬としての使用のためのヒトVR3ポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全に関連する突然変異された形態のヒトVR3遺伝子の検出は、ヒトVR3の過小発現もしくは過剰発現から生じる疾患もしくはこうした疾患に対する感受性の診断に追加するもしくはそれを定義することができる診断ツールを提供することができる。ヒトVR3遺伝子中に突然変異を担持する個体は、当該技術分野で公知かつ本明細書に記述される多様な技術によりDNAレベルで検出してよい。
【0056】
ヒトVR3レセプターDNA、ヒトVR3レセプターRNAもしくはヒトVR3レセプタータンパク質をスクリーニングしかつそのレベルを測定するのに、本発明のDNA分子、RNA分子、組換えタンパク質および抗体を使用してよい。該組換えタンパク質、DNA分子、RNA分子および抗体は、ヒトVR3レセプターの検出および型分類に適するキットの処方にそれら自身を適合させる。こうしたキットは、緊密な制限、最低1個の容器中に保持するのに適する区画化された担体を含むことができる。該担体は、ヒトVR3レセプターを検出するのに適する組換えヒトVR3レセプタータンパク質もしくは抗ヒトVR3レセプター抗体のような試薬をさらに含むことができる。該担体はまた、標識された抗原もしくは酵素基質などのような検出のための手段も含有してよい。
遺伝子治療
ヒトVR3レセプターをコードするDNA配列に相補的であるヌクレオチド配列をアンチセンス治療のため合成することができる。これらのアンチセンス分子はDNA、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートのようなDNAの安定誘導体、RNA、2’−O−アルキルRNAのようなRNAの安定誘導体、または他のヒトVR3レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド模倣物であってよい。ヒトVR3レセプターアンチセンス分子は、微小注入法、リポソーム被包化もしくはアンチセンス配列をもつベクターからの発現により細胞に導入してよい。ヒトVR3レセプターアンチセンス治療は、ヒトVR3レセプター活性を低下させることが有益である疾患の治療にとりわけ有用であるかもしれない。
【0057】
ヒトVR3レセプター遺伝子治療を使用して、標的生物体の細胞中にヒトVR3レセプターを導入してよい。ヒトVR3レセプター遺伝子は、レシピエント宿主細胞の感染によりヒトVR3レセプターDNAの移入を媒介するウイルスベクターに連結することができる。適するウイルスベクターはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどを包含する。あるいは、ヒトVR3レセプターDNAを、リガンド−DNA複合体(conjugate)もしくはアデノウイルス−リガンド−DNA複合体を使用するレセプターに媒介される標的を定められたDNA移入、リポフェクション膜融合または直接微小注入法を包含する非ウイルス技術により遺伝子治療のため細胞中に移入することができる。これらの手順およびそれらの変形物はエクスビボならびにインビボのヒトVR3レセプター遺伝子治療に適する。ヒトVR3レセプター遺伝子治療は、ヒトVR3レセプター活性を上昇させることが有益である疾患の治療にとりわけ有用であるかもしれない。ヒトVR3レセプター遺伝子とともにの使用に適する遺伝子治療の分子方法論のプロトコルは、Gene Therapy Protocols、Paul D.Robbins編、ヒューマン プレス(Human press)、ニュージャージー州トタワ、1996に記述されている。
製薬学的組成物
ヒトVR3レセプターDNA、ヒトVR3レセプターRNAもしくはヒトVR3レセプタータンパク質、またはヒトVR3レセプター活性の調節物質を含んで成る製薬学的に有用な組成物を、製薬学的に許容できる担体の混合状態によるような既知の方法に従って処方してよい。こうした担体および処方方法の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesで見出すことができる。有効な投与に適する製薬学的に許容できる組成物を形成するために、こうした組成物は有効量のタンパク質、DNA、RNAもしくは調節物質を含有することができる。
【0058】
本発明の治療的もしくは診断的組成物は、ヒトVR3レセプターに関する活性の調節が指示される障害を治療もしくは診断するのに十分な量で個体に投与する。有効量は、個体の病状、体重、性別および齢のような多様な因子に従って変動するかもしれない。他の因子は投与の様式を包含する。該製薬学的組成物は皮下、局所、経口および筋肉内のような多様な経路により個体に提供してよい。
【0059】
「化学的誘導体」という用語は、通常は基礎分子の一部でない付加的な化学的部分を含有する分子を記述する。こうした部分は基礎分子の溶解性、半減期、吸収などを改良するかもしれない。あるいは、該部分は、基礎分子の望ましくない副作用を減弱するもしくは基礎分子の毒性を減少させるかもしれない。こうした部分の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesのような多様な教科書に記述されている。
【0060】
本明細書に開示される方法により同定された化合物は、いかなる潜在的な毒性も最小限にしつつヒトVR3レセプターもしくはその活性の至適の阻害を得るために、慣例の試験により定義される適切な投薬量で単独で使用してよい。加えて、他の作用物質の共投与もしくは連続投与が望ましいかもしれない。
【0061】
本発明はまた、本発明の新規治療方法での使用のための適する局所、経口、全身および非経口の製薬学的製剤を提供するという目的も有する。ヒトVR3レセプターの調節での使用のための有効成分として本発明で同定される化合物もしくは調節物質を含有する組成物は、投与のための慣習的ベヒクル中の広範な治療的投薬形態で投与することができる。例えば、化合物もしくは調節物質は、錠剤、カプセル剤(それぞれ調時放出および持続性放出製剤を包含する)、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁剤、シロップ剤および乳剤のような経口の投薬形態で、もしくは注入により投与することができる。同様に、それらはまた静脈内(ボーラスおよび注入(infusion)の双方)、腹腔内、皮下、閉塞を伴うもしくは伴わない局所、または筋肉内の形態でも投与してよく、全部は製薬学的技術の当業者に公知の形態を使用する。有効しかし非毒性量の所望の化合物をヒトVR3レセプター調節剤として使用することができる。
【0062】
生成物の1日投薬量は1日あたり患者あたり0.01から1,000mgまでの広範な範囲にわたって変動してよい。経口投与のためには、組成物は好ましくは、治療されるべき患者に対する投薬量の症候的調整のため、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0および50.0ミリグラムの有効成分を含有する割線付きもしくは割線を付けられない錠剤の形態で提供する。薬物の有効量は、通常、1日あたり約0.0001mg/kgから約100mg/kg体重までの投薬量レベルで供給する。該範囲は、より具体的には1日あたり約0.001mg/kgから10mg/kg体重までである。ヒトVR3レセプター調節物質の投薬量は、所望の効果を達成するために組み合わせられる場合に調整される。他方、これらの多様な作用物質の投薬量は相乗的結果を達成するために独立して至適化しかつ組み合わせてよく、ここで病状はいずれかの作用物質を単独で使用する場合にそうであろうよりも抑制される。
【0063】
有利には、本発明の化合物もしくは調節物質は単一の1日用量で投与してよいか、または総1日投薬量を1日2、3もしくは4回の分割された用量で投与してよい。さらに、本発明の化合物もしくは調節物質は、適する鼻内ベヒクルの局所使用を介するもしくは経皮経路を介する鼻内の形態で、当業者に公知の経皮皮膚貼付剤のそれらの形態を使用して投与することができる。経皮送達系の形態で投与されるためには、投薬量の投与はもちろん投薬レジメンの間中間欠的よりむしろ連続的であることができる。
【0064】
有効成分が別個の投薬製剤中にある1種以上の有効成分を用いる組み合わせ治療のためには、有効成分を同時に投与することができるか、もしくはそれらはそれぞれ別個のずらされた時点で投与することができる。
【0065】
本発明の化合物もしくは調節物質を利用する投薬レジメンは、患者の型、種、齢、体重、性別および医学的状態;治療されるべき病状の重症度;投与経路;患者の腎および肝機能;ならびに使用されるその特定の化合物を包含する多様な因子に従って選択する。通常の熟練の医師もしくは獣医師は、該病状の進行を予防、対抗もしくは停止するのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定かつ処方することができる。毒性なしに有効性を生じる範囲内の薬物の濃度の達成における最適精度は、標的部位への薬物の生物学的利用性の動力学に基づくレジメンを必要とする。これは、薬物の分布、平衡および排泄の考慮を必要とする。
【0066】
本発明の方法において、本明細書に詳細に記述される化合物もしくは調節物質は有効成分を形成することができ、そして、典型的には、意図される投与形態、すなわち経口の錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに関してかつ慣習的製薬学的実務と矛盾せず適して選択された適する製薬学的希釈剤、賦形剤もしくは担体(本明細書で集合的に「担体」物質と称される)との混合状態で投与される。
【0067】
例えば、錠剤もしくはカプセル剤の形態での経口投与のために、有効薬物成分を、エタノール、グリセロール、水などのような経口の非毒性の製薬学的に許容できる不活性担体と組み合わせることができる。さらに、所望のもしくは必要な場合は、適する結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色料もまた混合物中に組み込むことができる。適する結合剤は、制限なしにデンプン、ゼラチン、ブドウ糖もしくはβ−乳糖のような天然の糖、トウモロコシ甘味料、アラビアゴム、トラガカントもしくはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成のガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、蝋などを包含する。これらの投薬形態で使用される滑沢剤は、制限なしにオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを包含する。崩壊剤は、制限なしにデンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどを包含する。
【0068】
液体の形態のためには、有効薬物成分は合成および天然のガム、例えばトラガカント、アラビアゴム、メチルセルロースなどのような適して風味をつけられた懸濁化剤もしくは分散剤中で組み合わせることができる。使用してよい他の分散剤はグリセリンなどを包含する。非経口投与のためには、滅菌の懸濁剤および溶液が望ましい。適する保存剤を一般に含有する等張の製剤を、静脈内投与が望ましい場合に使用する。
【0069】
有効薬物成分を含有する局所製剤は、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンAおよびE油、鉱物油、PPG2ミリスチルプロピオネートなどのような当該技術分野で公知の多様な担体物質と混合して例えばアルコール性溶液、局所清浄剤、浄化クリーム剤、皮膚ゲル剤、皮膚ローション剤、およびクリームもしくはゲル製剤のシャンプー剤を形成することができる。
【0070】
本発明の化合物もしくは調節物質はまた、小型単層状小胞、大型単層状小胞および多層状小胞のようなリポソーム送達系の形態でも投与することができる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンもしくはホスファチジルコリンのような多様なリン脂質から形成することができる。
【0071】
本発明の化合物はまた、化合物分子が結合される個別の担体としてのモノクローナル抗体の使用により送達してもよい。本発明の化合物もしくは調節物質はまた、標的を定めることができる薬物担体としての可溶性ポリマーと結合してもよい。こうしたポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、もしくはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを包含することができる。さらに、本発明の化合物もしくは調節物質は、薬物の制御放出の達成で有用な生物分解性ポリマーの一分類、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋もしくは両親媒性ブロックコポリマーに結合してもよい。
【0072】
経口投与のために、該化合物もしくは調節物質は、カプセル剤、錠剤もしくはボーラスの形態で投与してよいか、あるいはそれらは動物飼料に混合することができる。カプセル剤、錠剤およびボーラスは、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウムもしくはリン酸二カルシウムのような適切な担体ベヒクルと組み合わせの有効成分から構成される。これらの単位投与剤形は、均一な混合物が得られるような、希釈剤、増量剤、崩壊剤および/もしくは結合剤を包含する適する微細に粉末にされた不活性成分と有効成分を緊密に混合することにより製造する。不活性成分は該化合物もしくは調節物質と反応することができずかつ治療されている動物に対し非毒性であるものである。適する不活性成分は、デンプン、乳糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物性のガムおよび油などを包含する。これらの製剤は、治療されるべき動物種の大きさおよび型、ならびに感染の型および重症度のような多数の因子に依存して広範に変動する量の有効および不活性成分を含有してよい。有効成分はまた、飼料と化合物を単純に混合することにより、もしくは飼料の表面に化合物を塗布することにより、飼料への添加物として投与してもよい。あるいは、有効成分は不活性担体と混合してよく、そして生じる組成物をその後飼料と混合するかもしくは動物に直接給餌するかのいずれかであってよい。適する不活性担体は、コーンミール、シトラスミール、醗酵残渣、粗挽きダイズ、乾燥穀物などを包含する。有効成分は、最終組成物が0.001から5重量%までの有効成分を含有するような、粉砕(griding)、攪拌、微粉砕(milling)もしくは混転することによりこれらの不活性担体と緊密に混合する。
【0073】
該化合物もしくは調節物質は、あるいは、不活性液体担体中に溶解された有効成分より成る製剤の注入を介して非経口で投与してもよい。注入は筋肉内、第一胃内、気管内もしくは皮下のいずれかであってよい。注入可能な製剤は適切な不活性液体担体と混合された有効成分より成る。許容できる液体担体は、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油などのような植物油、ならびにソルケタール、グリセロールホルマルなどのような有機溶媒を包含する。一代替として、水性非経口製剤もまた使用してよい。植物油は好ましい液体担体である。該製剤は、最終製剤が0.005から10重量%までの有効成分を含有するような、液体担体中に有効成分を溶解もしくは懸濁することにより製造する。
【0074】
該化合物もしくは調節物質の局所適用は、本化合物もしくは調節物質を水性溶液もしくは懸濁液として含有する液体の飲薬もしくはシャンプー剤の使用により可能である。これらの製剤は一般にベントナイトのような懸濁化剤を含有し、そして通常は消泡剤もまた含有することができる。0.005から10重量%までの有効成分を含有する製剤が許容できる。好ましい製剤は0.01から5重量%までの本化合物もしくは調節物質を含有するものである。
【0075】
以下の実施例はどのような方法でもそれをそれに制限することなく本発明を具体的に説明する。
【0076】
実施例1 ヒト前立腺および下垂体cDNAライブラリーの生成
cDNA合成:
第1鎖合成:ヒト前立腺もしくは下垂体mRNA(Clontech)約5μgを、cDNA合成キット(Life Technologies)を用いてcDNAを合成するために使用した。NotIプライマーアダプター2μlを、mRNA5μgに添加し、そして混合液を10分間70℃に加熱し、そして氷上に置いた。次の試薬を氷上で添加した:5x第1鎖バッファー(250mM TRIS−HCl(pH8.3),375mM KCl,15mM MgCl2)4μl、0.1M DTT2μl、10mMdNTP(ヌクレオチド3リン酸)混合液およびDEPC処理水1μl。反応は、42℃で5分間インキュベートした。最後に、SuperscriptRTII 5μlを添加し、そして42℃でさらに2時間インキュベートした。反応を氷上で終結した。
【0077】
第2鎖合成:第1鎖生成物を水で93μlに調整し、そして次の試薬を氷上で添加した:5x第2鎖バッファー(100mM TRIS−HCl(pH6.9),450mM KCl,23mM MgCl2)30μl,0.75mMβ−NAD+,50mM(NH4)2SO4,10mMdNTP(ヌクレオチド3リン酸)3μl、大腸菌(E.coli)DNAリガーゼ(10ユニット)1μl、RNアーゼH(2ユニット)1μl、DNApol I(10ユニット)4μl。反応は、16℃で2時間インキュベートした。第2鎖合成からのDNAは、T4DNAポリメラーゼで処理し、そして16℃に置いてDNA末端を平滑にした。二本鎖cDNAをフェノールおよびクロロホルム(1:1,v:v)混合液150μlで抽出し、そして7.5M NH4OAc0.5容量および無水エタノール2容量で沈殿させた。ペレットを70%エタノールで洗浄し、そして37℃で乾燥して残留エタノールを除去した。二本鎖DNAペレットは、水25μlに再懸濁し、そして次の試薬を添加した:5xT4DNAリガーゼバッファー10μl、SalIアダプター10μlおよびT4DNAリガーゼ5μl。成分を静かに混合し、そして16℃で一夜連結した。連結混合液をフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールで抽出し、徹底的に撹拌し、そして室温で14,000xgで5分間遠心して相を分離した。水相を新しいチューブに移し、そして容量を水で100mlに調整した。精製DNAは、chromaspin1000カラム(Clontech)上でサイズ選択して、比較的小さいcDNA分子を除去した。二本鎖DNAは37℃で3−4時間NotI制限酵素で消化した。制限消化物は0.8%低融点アガロースゲルで電気泳動した。範囲1−5kbのcDNAを切り離し、そしてGelzyme(InVitrogen)を用いて精製した。生成物をフェノール:クロロホルムで抽出し、そしてNH4OAcおよび無水エタノールで沈殿させた。ペレットを70%エタノールで洗浄し、そして水10mlに再懸濁した。
【0078】
cDNAのベクターへの連結:cDNAを5本のチューブに分配し(各2μl)、そして連結反応液を水4.5μl、5x連結バッファー2μl、p−SportベクターDNA(SalI/NotIで切断し、ホスファターセ処理した)1μlおよびT4DNAリガーゼ0.5μlを添加することによって組み立てた。連結反応は40℃で一夜インキュベートした。
【0079】
エレクトロポレーションによる連結cDNAの大腸菌への導入:
連結反応液容量は、水によって総容量20μlに調整した。酵母tRNA5ml、7.5MNH4OAc12.5mlおよび無水エタノール(−20℃)70mlを添加した。混合液を十分に撹拌し、そして直ちに室温で14000xg20分間遠心した。ペレットを70%エタノール中で洗浄し、そして各ペレットを水5mlに再懸濁した。全5個の連結物(25ml)をプールし、そしてDH10Bエレクトロ・コンピテント細胞(Life Technologies)100μlをDNA1mlによりエレクトロポレーション処理し(全20回のエレクトロポレーション)、次いで、アンピシリン平板に塗布して、1μl当たりの組み換え体数(cfu)を決定した。全ライブラリーをSuper Broth2リッター中に接種し、そしてmaxiprepをPromega Maxi Prepキットを用いて作成し、そして塩化セシウム勾配で精製した。
【0080】
実施例2: ライブラリースクリーニング/ヒトVR3A+B+生成
ヒト下垂体ライブラリーのスクリーニング:
ヒト下垂体ライブラリーの1μl分量をElectromaxDH10B細胞(Life Technologies)中にエレクトロポレートした。容量をSOC媒質により1mlに調整し、そして振盪しつつ37℃で45分間インキュベートした。次いで、ライブラリーを、LBを含有する150cm2平板に塗布して1プレート当たり密度20000コロニーにした。これらの培養物を37℃で一夜増殖させた。
【0081】
ヒトVR3受容体プローブは、次のプライマーペアを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって生成された:
5’オリゴ(配列番号:1):5’ACCGGCCTATCCTCTTTGACATCGTG
3’オリゴ(配列番号:2):5’TGTCCGCCTTCTTGTGGGGGTTCTC
プローブは、5’および3’プローブオリゴ(各100ng)および希釈miniprepDNA10ngを用いる正規のPCR条件を使用するPCRによって生成された。得られる493bpフラグメントを1%アガロースゲル上で移動させ、そしてQUIAquick Gel抽出キット(Quiagen)を用いる精製した。精製プローブ約100ngを、Pharmacia製オリゴ標識キットを用いてα32Pで標識し、標識したDNAをS−200カラム(Pharmacia)により精製した。
【0082】
ライブラリーコロニーを、Protranニトロセルロースフィルター(Scheicher & Schuel)上に拾い上げ(lift)、そしてDNAを1.5MNaCl,0.5MNaOH中で変性した。フィルターディスクを1.5MNaCl,1.0MTris−HCl,pH7.5で中性にして、次にUV−Stratalinker(Stratagene)を使用してメンブランにUV架橋結合した。フィルターを42℃の洗浄溶液(1MTris−HCl,pH8.0;5MNaCl;0.5MEDTA;20%SDS)中で数回洗浄した。次いで、ディスクを50%ホルムアミドおよびせん断サケ精子DNA(5’−3’Inc)100ug/mlを含有する1xサザン・プレハイブリダイゼーションバッファー(5’−3’Inc)中で42℃6時間インキュベートした。最後に、ハイブリダイゼーションは、50%ホルムアミド,標識プローブ(5x105〜1x106cmp/mlハイブリダイゼーションバッファー)の存在下のせん断サケ精子DNA100ngを含有する1xハイブリダイゼーションバッファー(5’−3’)中で42℃で一夜行った。
【0083】
ディスクを、室温で2xSSC,0.2%SDS中で2回(各20分)、そして30分間50℃で0.2xSSC、0.1%SDS中で1回洗浄した。次いで、メンブランを濾紙シート上に置き、プラスチックラップ中に包み、そして−20℃で一夜フィルムに露光した。
【0084】
ポジティブクローンを同定し、そして元のプレートからのコロニーを抜き取ることによって回収した。コロニーは、37℃で1時間LB中でインキュベートした。培養液の希釈液をLB寒天プレート上に置き、そしてフィルター・リフティング、ハイブリダイゼーション、洗浄、コロニー採取操作を繰り返した。2次スクリーニングから個々のコロニーを採取し、そしてSalI/NotIで消化してインサートのサイズを決定し、そしてそのインサートを配列決定した。
【0085】
全長クローンは、鋳型で、KpnI(FL5’オリゴ配列番号:3)およびNotI(FL3’オリゴ配列番号:4)部位をもつ全長オリゴとして配列決定されたライブラリークローン10ngを使用するPfuポリメラーゼによるPCRによって生成した。
【0086】
FL5’オリゴ(配列番号:3):AACGTTGGTACCGCCACCATGGCGGATTCCAGCGAAGGCCCCCGCGCG
FL3’オリゴ(配列番号:4):TAAAGCGGCCGCTTCAGGAGGGACATCGGTGAGCCTCAC
PCR生成物をKpnIおよびNotI酵素によって消化し、そしてpSP64T.GC発現ベクター中にクローン化した。DNAの大規模調製は、MEGAprepキット(Quiagen)を使用して行った。
【0087】
実施例3: ライブラリースクリーニング/ヒトVR3A+B−およびヒトVR3A−B−生成
ヒト前立腺ライブラリーのスクリーニング:
ヒト前立腺ライブラリーの1μl分量をElectromaxDH10B細胞(Life Technologies)中にエレクトロポレートした。容量をSOC媒質により1mlに調整し、そして振盪しつつ37℃で45分間インキュベートした。次いで、ライブラリーを、LBを含有する150cm2平板に塗布して1プレート当たり密度20000コロニーにした。これらの培養物を37℃で一夜増殖させた。
【0088】
ヒトVR3受容体プローブは、次のプライマーペアを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって生成された:
5’オリゴ(配列番号:13):5’CTACCTGACGGAGAACCCCCACAAG
3’オリゴ(配列番号:14):5’GTAGTAGGCGGTGAGACTGAAGATGA
プローブは、5’および3’プローブオリゴ(各100ng)および希釈miniprepDNA10ngを用いる正式のPCR条件を使用するPCRによって生成された。得られる387bpフラグメントを1%アガロースゲル上で移動させ、そしてQUIAquick Gel抽出キット(Quiagen)を用いる精製した。精製プローブ約100ngを、Pharmacia製オリゴ標識キットを用いてα32Pで標識し、標識したDNAをS−200カラム(Pharmacia)により精製した。
【0089】
ライブラリーコロニーを、Protranニトロセルロースフィルター(Scheicher & Schuel)上に拾い上げ(lift)、そしてDNAを1.5MNaCl,0.5MNaOH中で変性した。フィルターディスクを1.5MNaCl,1.0MTris−HCl,pH7.5で中性にして、次にUV−Stratalinker(Stratagene)を使用してメンブランにUV架橋結合した。フィルターを42℃の洗浄溶液(1MTris−HCl,pH8.0;5MNaCl;0.5MEDTA;20%SDS)中で数回洗浄した。次いで、ディスクを50%ホルムアミドおよびせん断サケ精子DNA(5’−3’Inc)100ug/mlを含有する1xサザン・プレハイブリダイゼーションバッファー(5’−3’Inc)中で42℃6時間インキュベートした。最後に、ハイブリダイゼーションは、50%ホルムアミド,標識プローブ(5x105〜1x106cmp/mlハイブリダイゼーションバッファー)の存在下のせん断サケ精子DNA100ngを含有する1xハイブリダイゼーションバッファー(5’−3’)中で42℃で一夜行った。
【0090】
ディスクを、室温で2xSSC,0.2%SDS中で2回(各20分)、そして30分間50℃で0.2xSSC、0.1%SDS中で1回洗浄した。次いで、メンブランを濾紙シート上に置き、Saranラップ中に包み、そして−20℃で一夜フィルムに露光した。
【0091】
ポジティブクローンを同定し、そして元のプレートからのコロニーを抜き取ることによって回収した。コロニーは、37℃で1時間LB中でインキュベートした。培養液の希釈液をLB寒天プレート上に置き、そしてフィルター・リフティング、ハイブリダイゼーション、洗浄、コロニー採取操作を繰り返した。2次スクリーニングから個々のコロニーを採取し、そしてEcoRI/NotIで消化してインサートのサイズを決定し、そしてそのインサートを配列決定した。
【0092】
全長クローンは、鋳型で、NotI(FL5’オリゴ配列番号:15)およびXbaI(FL3’オリゴ配列番号:16)部位をもつ全長オリゴとして配列決定されたライブラリークローン10ngを使用するPfuポリメラーゼによるPCRによって生成した。
【0093】
FL5’オリゴ(配列番号:15):5’AACGTTGGCGGCCGCGCCACCATGGCGGATTCCAGCGAAGGCCCCCGCGCG
FL3’オリゴ(配列番号:16):5’AACGTTTCTAGACTGGGCTGCAGTCCCTAG
PCR生成物をNotIおよびXbaI酵素によって消化し、そしてpGemHE発現ベクター中にクローン化した。DNAの大規模調製は、MEGAprepキット(Quiagen)を使用して行った。
【0094】
実施例4−哺乳動物発現ベクター中へのヒトVR3受容体cDNAのクローニング
ヒトVR3受容体cDNA(集団としてhVR3と呼ばれる)を哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1/Zeo(+)中にクローン化した。クローン化PCR生成物をカラム(Promega製Wizard PCR DNA精製キット)で精製し、そしてNotIおよびEcoRI(NEB)で消化して付着末端を生成した。生成物を低融点アガロースゲルで電気泳動によって精製した。pcDNA3.1/Zeo(+)ベクターをNotIおよびXbaI(BamHI/NotI部位中にクローン化したhVR3A+B+を除く)酵素で消化し、続いて低融点アガロースゲルで精製した。線状ベクターを使用してヒトVR3cDNAインサートに連結した。組み換え体を単離し、ヒトVR3受容体を指定し、そしてトランスフェクションキットに基づくEffectene非リポソーム性脂質(Quiagen)を用いて哺乳動物細胞(HEK293、COS−7またはCHO−K1細胞)をトランスフェクションするために使用した。安定な細胞クローンをゼオシン存在下の増殖によって選択した。単一のゼオシン耐性クローンを単離し、そしてインタクトのヒトVR3受容体遺伝子を含有することが示された。ヒトVR3受容体cDNAを含有するクローンをhVR3タンパク質発現について解析した。ヒトVR3コーディングDNAを含有する組み換えプラスミドを使用して、哺乳動物COSもしくはCHO細胞またはHEK293細胞を形質転換した。
【0095】
安定にまたは一時的に、ヒトVR3受容体を発現する細胞は、ヒトVR3受容体の発現および3H−RTX結合活性について試験するために使用される。これらの細胞は、ヒトVR3受容体を調節、阻害または活性化する能力および放射性3H−RTX結合と競合する能力について、他の化合物を特定し、そして試験するために使用される。
【0096】
プロモーターに関して正方向にヒトVR3受容体cDNAを含有するカセットは、プロモーターの適当な制限部位3’中に連結され、そして制限部位マッピングおよび/または配列決定によって同定される。これらのcDNA発現ベクターは、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、または化学的操作(陽イオン性リポソーム、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム)を含む標準的方法によって、繊維芽細胞性宿主細胞、例えばCOS−7(ATCC#CRL1651)、およびCV−1 tat[Sackevitz et al.,Science 238:1575(1987)]、293.L(ATCC#CRL6362)中に導入される。トランスフェクション細胞および細胞培養上澄液が収穫され、そして前記のようにヒトVR3受容体発現について解析される。 哺乳動物の一過性発現のために使用されるベクターのすべては、ヒトVR3受容体を発現する安定な細胞系を確立するために使用できる。発現ベクター中にクローン化された未改変ヒトVR3受容体cDNA構築物は、ヒトVR3受容体タンパク質を生成する宿主細胞を計画するために期待される。トランスフェクション宿主細胞は、限定されるものではないがCV−1−P[Sackevitz et al.,Science 238:1575(1987)]、tK−L[Wigler,et al.,Cell 11:223(1977)]、NS/0、およびdHFr−CHO[Kaufman and Shap,J.Mol.Biol.159:601,(1982)]を含む。
【0097】
限定されるものではないがG418、アミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ;ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Bホスホトランスフェラーゼ;APRT,キサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼを含む薬物選択プラスミドと、ヒトVR3受容体cDNAを含有するすべてのベクターとのコ・トランスフェクションは、安定にトランスフェクションされたクローンの選択を可能にするであろう。ヒトVR3受容体のレベルは、前記アッセイによって定量化される。
【0098】
また、ヒトVR3受容体cDNA構築物は、最高可能レベルのヒトVR3受容体を合成する哺乳動物細胞クローンの作成のために、増幅可能な薬物耐性マーカーを含有するベクター中に連結される。これらの構築物の細胞への導入後、プラスミドを含有するクローンは適当な薬剤により選択され、そして高いコピー数のプラスミドをもつ過発現クローンの単離は、薬剤用量の増加における選択によって達成される。
【0099】
組み換えヒトVR3受容体の発現は、哺乳動物宿主細胞への全長ヒトVR3受容体cDNAのトランスフェクションによって達成される。
【0100】
実施例5−アフリカツメガエル(Xenopus)卵母細胞におけるpVR3Rによってコードされている機能性タンパク質の特性決定
キセノパス・レエビス(Xenopus laevis)卵母細胞は、既に記述され、そして当該技術分野において既知である(Fraser et al.,1993)標準的方法を用いて調製され、そして注射された。成メスのキセノパス・レエビスからの卵巣葉(Nasco,Fort Atkinson,WI)を切り離し(teased apart)、名目上Ca不含の生理食塩水(82.5mMNaCl,2.5mMKCl,1mMMgCl2,5mMHEPESを含有し、NaOHでpH7.0に調整した)(OR−2)で数回洗浄し、そして0.2%コラゲナーゼ1型(ICN Biomedicals,Aurora,Ohio)を含有するOR−2中で2.5時間静かに振盪した。胞状層の約50%を除去した場合、VおよびVI期の卵母細胞が選択され、そして75%OR−2および25%ND−96からなる媒質中で洗浄された。ND−96は、100mMNaCl,2mMKCl,1mMMgCl2,1.8mMCaCl2,5mMHEPES,2.5mMピルビン酸Na,ゲンタマイシン(50ug/ml)を含有し、NaOHでpH7.0に調整された。細胞外Ca+2を徐々に増加し、そして細胞は注射前2−24時間ND−96中に維持した。イン・ビトロ転写では、ヒトVR3を含有するpGEM HE(Liman et al.,1992)を、NheIで直線化し、そしてキャップ類似体m7G(5’)ppp(5’)Gの存在下、T7RNAポリメラーゼを用いて転写した。合成されたcDNAは、酢酸アンモニウムで沈殿させ、そしてヌクレアーゼ不含の水50μl中に再懸濁した。cDNAをホルムアルデヒドゲル(1%アガロース、1xMOPS,3%ホルムアルデヒド)を用いてRNAマーカー(Gibco BRL,0.24−9.5kb)1.2および5μlに対して定量した。
【0101】
卵母細胞は、VR1(2−3ng)の同時注射の有無の下でヒトVR3受容体RNA(0.3−5ng)50nlを注射された。対照卵母細胞は水50nlを注射された。卵母細胞は、ヒトVR3の発現について解析する前に、ND−96中で1−13日間インキュベートされた。インキュベーションおよびコラゲナーゼ消化を室温で実施した。注射された卵母細胞は、18℃において48穴細胞培養クラスター(Costar,Cambridge,MA)中で維持された。全細胞の作動剤−誘導電流が、注射後1−14日目に、既に記述され、そして当該技術分野において既知である標準方法(Dascal,1987)を使用して、慣用の2電極電圧クランプ(GeneClamp500,Axon Instruments,Fosyer City,CA)を用いて測定された。微小電極を3MKClで満たしたが、これは抵抗1および2MΩをもっていた。細胞は、指示されない限り室温で〜10ml/minにおいてND−96を連続的に潅流された。膜電圧は、指示されない限り−70mVで固定した。
【0102】
卵母細胞は、種々のリガンド、低pH、および減極ならびに超分極電圧段階によりチャレンジされたが、ヒトVR3を発現している卵母細胞と対照卵母細胞との間の膜コンダクタンスにおいては検出可能な差はなかった[表1参照]。しかしながら、ヒトVR3を注射した卵母細胞は、4つの点において対照とは異なる性質をもっていた。第1は、VR3A+B−cRNAの注射は卵母細胞を死滅させた。AインサートをもつVR3イソ型を注射された卵母細胞の生存度は、注射後3−4日目のシスター対照に比べて有意に低下した(図9)。第2に、VR3の全3種のイソ型は、熱−誘導応答を増進した(図10)。第3は、ヒトVR1を同時に注射されたA+B−は、ルテニウム・レッド感受性潅流−誘導電流(1perfusion)を生じた(図11)。第4に、ヒトVRcRNAとヒトVR3A+B−cRNA同時注射は、カプサイシン、VR1受容体の作動剤、1uMに対する卵母細胞の応答性を変化した(図12)。
【0103】
【表1】
【0104】
【表2】
【0105】
生存度
アフリカツメガエル卵母細胞におけるヒトVR3イソ型の機能的発現が示される:
2Ca2+を含有するND−96において維持された卵母細胞の生存度は、VR3A+B−(3.25ng)およびVR3A+B+(5ng)では注射後4−6日に有意に低下したが、VR3A−B−(1.5ng)cRNAでは低下しなかった。VR3A+B−および対照の水を注射された卵母細胞のデータは、5回の別々の実験において類似しており、そして合体された。死滅卵母細胞は、Bauch and Lomb解剖顕微鏡を使用して肉眼的に決定された。データは、カイ二乗解析を用いて解析された。VR3A+B−注射卵母細胞は、最低生存度であった:約9%の卵母細胞のみが注射後4−6日目に生き残っていた。ヒトVR3A+B+を注射された卵母細胞の約33%が注射後4−6日目に生き残っていた。シスター水注射対照卵母細胞の約67%が、本質的に同じ条件下で同じ期間生き残った。VR3A−B−注射卵母細胞は、水注射対照と類似の生存度を示した。類似のデータは、cRNAの2つの別々のバッチから得られた。
【0106】
熱応答性
アフリカツメガエル卵母細胞におけるヒトVR3イソ型の機能的発現が示される:
熱による活性化。a).25℃〜46℃の熱ランプ(ramp)によって誘起され、そして46℃において少なくとも15秒間維持される平均ピーク電流が示される。電圧ランプは、サンプリング速度2秒において−120〜+80mVを400msecにわたって印加された。示される電流は、+80mVにおいて誘起される初発電流を超える電流の増大であった((b)において示される電流電圧曲線における最も右の点)。卵母細胞は、VR3A+B−、A−B−およびA+B+cRNA、それぞれ3.25,1.5および5ngを注射され、そして6日後まで記録された。黒色バー:水注射の対照(n=8);白色バー:VR3A+B−イソ型(n=11);斜線バー:VR3A−B−イソ型(n=8);点彩バー:VR3A+B+イソ型(n=5)。すべてのイソ型が水対照以上に有意な増加を示した(それぞれp=0.001,0.03および0.007)。熱誘導応答は、他の2つのイソ型に比べてA+B−イソ型では約2倍大きかったが、差異は有意ではなかった(それぞれA−B−およびA+B+に比べてA+B−ではp=0.051およびp=0.16)。データは、注射された卵母細胞2組から得られた。示されるデータは、平均値および平均値の標準誤差である。(b).電圧ランプで誘導される電流は、水(上段)、VR3A+B−(上から2つ目)、VR3A−B−(上から3つ目)およびVR3A+B+(下段)を注射された卵母細胞に対する増加する熱の適用中に記録された。卵母細胞は、Ca2+ND−96を一定に潅流され、そして溶液はインライン(inline)ヒーター器具(SH−27Aラインヒーターと結合されたTC−324B;Warner Instruments Corp.)によって加熱された。温度37℃〜46℃において得られるランプ誘導電流(y軸に示されるようにミクロアンペアの)が表される;より高い温度における電流トレース(trace)のみが、対応する温度で標識される。
【0107】
潅流誘導電流(I perfusion :図11):
バス潅流の開始は、図11に示されるように、VR3A+B−受容体cDNAから転写されたRNAの有無の下、クローン化ヒトVR1から転写されたRNAを注射された卵母細胞において膜コンダクタンスの増加を誘起した。VR1cRNA(a)を注射された卵母細胞は、−120〜+80mV間の電圧ランプにより400msecにわたってチャレンジされた。ランプ誘導電流は、速度10ml/minにおける卵母細胞の潅流開始後増加された。まだ細胞外生理食塩水中にある卵母細胞からの対照ランプ誘導電流(C)は、Ca2+ND−96のバス潅流の開始前に記録された。潅流の間、ランプ誘導電流は増加し、これはコンダクタンスにおける増加を示す(P)。10uMルテニウムレッド(RR)は、VR1発現卵母細胞における潅流誘導電流(P)をブロックしなかった。かくして、VR1のみを発現する卵母細胞において観察された潅流誘導電流は、10uMルテニウムレッドには非感受性であった(A,「RR」)。しかしながら、VR3A+B−およびVR1を発現する卵母細胞において誘起される潅流誘導電流は、10uMルテニウムレッドによって劇的にブロックされた(B,「RR」)。この違いは、6個の卵母細胞において観察された。ブロックは部分的には可逆的であった(未掲載)。(b).VR3A+B−とともにVR1cRNAを注射された卵母細胞は、−120〜+80mV間の電圧ランプにより400msecにわたってチャレンジされた。ランプ誘導電流は、速度10ml/minにおける卵母細胞の潅流開始後増加された。潅流活性化電流は、卵母細胞の両セットにおいて類似の大きさを有した。RR阻止電流についてのVrevは約−13mVであった(矢印)。両作動剤によって誘導される電流は、ラットVR1について既に報告されたように(Caterina et al.,1997)、強く外向きに整流していた。
【0108】
ヒトVR3A+B−の存在または不在下でヒトVR1を発現する卵母細胞におけるカプサイシン誘導電流(図12)
応答は、カプサイシン誘導電流の十分な外向きの整流のために、この電圧において最大であったので(Caterina et al.,1997)、1uMカプサイシンによって誘起される電流(図12)が、+50mVの保持電圧において測定された。VR1および水(VR3注射についての対照)を注射された卵母細胞(a)ならびにVR1cRNAおよびVR3A+B−cRNAを注射された卵母細胞(b)の3例が示される。カプサイシンは、黒色の水平バーによって指示される時間中、バス(bath)適用された。1uMカプサイシンに対する1次応答の大きさは、VR1cRNAがVR3A+B−cRNAとともに同じ比率で(各2.9ng)同時発現された場合は減少された。もっとも注目すべき差異は、2次応答、カプサイシンの洗浄開始において通常得られる第2次ハンプ(hump)、の大きさと減少速度であった。
【0109】
実施例6 哺乳動物細胞系におけるヒトVR3の特性決定
ヒトHEK293、CHO−K1およびCOS−7細胞が、ヒトVR3イソ型pVR3A+B−R、pVR3A−B−RもしくはpVR3A+B+Rによりトランスフェクションされる。100mmディッシュ当たり106細胞当たりpVR3R 1μgの一時的トランスフェクションが、Effecteneトランスフェクションキット(Quiagen:301425)を用いて実施される。トランスフェクション3日後、細胞は96穴プレート(Biocoat,ポリ−D−リジン被覆ブラック/クリアプレート;Becton Dickinson part#354640)上に塗布される。1日後、ウェルをF12/DMEMにより洗浄し、次いで、室温で1時間、Pluronic F−127(20%,総容量20ml中使用される40μl)を含むFluo−4(2μM)中でインキュベートする。プレートは、FLIPR(Molecular Devices,FL−101)を用いてアッセイされる。細胞は、種々の浸透圧の溶液でチャレンジされる(50μl/secの速度において80μlに添加された40μl)。若干のウェルは、細胞外溶液による細胞の潅流増加を促進するために激しく混合される。ベクターのみのトランスフェクションが対照として使用される。
【0110】
3日後、細胞はネオマイシン(200μg/ml)の存在下で選択され、そして約2週間、3回の1:10希釈継代をとおして増殖される。個々のコロニーを採取し、そして6穴ディッシュにおいて増殖させる。次いで、細胞を96穴プレート(Biocoat,ポリ−D−リジン被覆ブラック/クリアプレート;Becton Dickinson part#354640)上に塗布し、そして3日間集密まで増殖させる。ウェルをF12/DMEMにより洗浄し、次いで、室温で1時間、Pluronic acid(20%,総容量20ml中使用される40μl)を含むFluo−4(2μM)中でインキュベートする。プレートは、FLIPR(Molecular Devices,FL−101)を用いてアッセイされる。細胞は、作動剤(50μl/secの速度において80μlに添加された40μl中3倍濃度において)でチャレンジされる。
【0111】
全細胞パッチ・クランプ(patch clamp)技術(Hamill et al.,1981)を使用して、12mmカバースリップ(coverslip)上で>2日間維持されたヒトVR1受容体を安定して発現するHEK293からのリガンド誘導電流を記録する。細胞は、DIC Nomarski opticsを有するNikon Diaphot 300を用いて可視化される。細胞は、別に指示しない限り、生理食塩水中で連続的に潅流される(〜0.5ml/min)。標準生理食塩水(「Tyrodes」)は、130mMNaCl、4mMKCl、1mMCaCl2、1.2mMMgCl2および10mMhemi−Na−HEPESを含有する(pH7.3,Wescor5500 vaper−pressure(Wescor,Inc.,Logan,UT)を用いて測定される295−300mOsm)。記録用電極は、ボロシリケートキャピラリーチューブ(R6;Garner Glass Claremont,CA)から製作され、チップは、歯科用ペリフェリーワックス(Miles Laboratories,South Bend,IN)でコーティングされ、そして細胞内食塩水:100mMK−グルコン酸、25mMKCl、0.483mMCaCl2、3mMMgCl2、10mMhemi−Na−HEPESおよび1mMK4−BAPTA(100nMフリーCa+2);pH7.4(290mOsmに達するまで添加されたデキストローズを有する)を含有する場合に1−2MΩの抵抗を有する。液間電位差は、両方とも経験的に決定された標準ピペットおよびバス溶液を用い、そしてコンピュータープログラムJPCalc(Barry,1994)を用いて−18mVである。示されるすべての電圧が液間電位差について補正される。電流および電圧シグナルが検出され、そしてAxopatch 1Dパッチ・クランプ増幅器(AXon Instruments,Foster City,CA)により2kHZにおいて濾過され、DigiData 1200Bラボラトリーインターフェース(AXon Instruments)およびPC対応コンピューターシステムによりデジタルに記録され、そしてオフ・ライン解析のために磁気ディスクに保存される。データ取得および解析は、PClampソフトウェアにより行われる。保持電流におけるゆっくりした変化が検出され、そして2kHZにおいて濾過され、そしてLPF202ADC増幅器(Warner,Hamden,CT)およびVR10Bデジタルデータ記録機(Instrutech,Great Neck,NY)によりビデオテープに記録される。シグナルは、その後、Axotapeソフトウェアを用いて10HZにおいて解析される。
【0112】
総膜キャパシタンス(Cm)は、−68mVからの30mV超分極電圧ランプが速度10mV/msにおいて生成した後の最大電流と、最終電位(−98mV)における定常状態電流との間の差異として決定される(Dubin et al.,1999)。
【0113】
リガンド誘導コンダクタンス変化の見かけの反転電位(Vrev)は電圧・ランププロトコール(Dubin et al.,1999)を用いて決定される。電圧ランプが1秒毎に印加され、そして得られる全細胞のランプ誘導電流が記録された。通常、電圧は、ネガティブからポジティブないしネガティブ値までランプされた。−68mVにおいて細胞をクランプするために必要な電流が連続的に追跡される。リガンド−誘導コンダクタンスは、リガンドの存在および不在下で電圧ランププロトコールによって誘起される全細胞電流から決定される。リガンド前(対照)およびリガンド存在下で測定された電圧ランプ誘導電流が比較されて、チャンネル電流出力を調節するためにチャンネルに及ぼすリガンドの影響を示す。正味のリガンド誘導電流が存在しない電圧が決定される(Vrev)。
【0114】
実施例7−ヒトVR3受容体タンパク質の1次構造
本発明は、hVR3の3種のイソ型:A+B−、A−B−およびA+B+を記述している。ヒトVR3受容体cDNAのヌクレオチド配列は、VR3A+B−、A−B−およびA+B+それぞれについて871,811および742アミノ酸をコードしている約2616,2436および2229塩基対の単一の大きい読み枠を示す。VR3A+B−のcDNAは、約337および約547ヌクレオチドの5’および3’−非翻訳エクステンションを有する。VR3A+B+のcDNAは、約836および約994ヌクレオチドの5’および3’−非翻訳エクステンションを有する。最初の枠内メチオニンは、イソ型A+B−、A−B−およびA+B+それぞれについて約98,242Da、91,294Daおよび83,310Daの概算分子質量(Mr)をもつヒトVR3受容体タンパク質を予測する読み枠のための開始コドンとして指定された。A+B−イソ型は871アミノ酸のタンパク質をコードしてイル。VR3A−B−はVR3A+B−のアミノ酸382〜441の60アミノ酸の欠失を含む。VR3A+B+は、アミノ酸736まではA+B−と同一であり、この後に、6個の相違するアミノ酸および終止コドンが存在する。VR3A+B+イソ型は、推定TM6後に20アミノ酸を延ばす。
【0115】
予想されるヒトVR3受容体タンパク質が、ヌクレオチドおよびタンパク質データベースにより整列され、そしてヴァニロイド受容体ファミリー(VR1およびVR3)に関連していることが分かった。大きい推定N末端親水性セグメント(約467アミノ酸)、N末端領域における3個の推定アンキリン反復ドメイン、6個の予想トランスメンブランドメインおよびポア領域を含む、この受容体ファミリーにおける数種の保存モチーフが見いだされる。VR3A+B−は、ヒトVR1と43%同一、両ヒトVRL−1(AF129112)およびヒトVRL(AF103906)と39%同一である。かくして、本明細書に記述されるVR3受容体は、明らかに、ヴァニロイド受容体ファミリーの新規な遺伝子である。 VR3A+B−およびVR3A−B−型は、アミノ酸694から末端までラットの緊張阻害性チャンネルSIC[genbank accession AB015231]に非常に類似している。529アミノ酸によってコードされているSICは、緊張によって阻害されるイオンチャンネルを形成すると考えられる。それは、VRファミリーの大きいN末端細胞質ドメインを欠くが、推定TM1の前にAエクソンに相同な配列を含有する。
【0116】
本明細書に記述されるVR3コーディング領域の完全ゲノム配列は、ジーンバンクへの380512塩基対配列寄託(ホモサピエンスクローンRPC11−7G5(AC007834)、Worley,K.C.による直接付託)において見いだされるようである。このジーンバンク登録は、DNA配列の多くのフラグメントおよび提案される隣接配列を列挙しているが、核酸配列のいかなる解析をも欠き、そしてVR3核酸配列の特徴を特性決定することも、またVR3遺伝子の存在を記述することもしていない。
1 本発明の配列およびゲノム配列の比較は、VR3遺伝子が少なくとも15エクソンからなることを示している。「A」は、両下垂体および前立腺cDNAライブラリーから得られるcDNA中に見いだされる推定N末端細胞質ドメインにおける60アミノ酸インサートである。AおよびBインサートにおいてイントロン/エクソン・ボーダー配列が存在する。
【0117】
A+B−およびA+B+イソ型は、アンキリン反復ドメイン保存配列に対して相同性をもつN末端推定細胞質領域におけるドメインを含有する。かくして、VR3A+イソ型は、VR1について予想されるものと類似の構成を有するようである。第1のドメインは、共通配列に有意に類似している(E=2.6e−5)。次の2ドメインは、それ自体では有意ではない(e=37およびE=2.7)が、全体として見ると、この領域は、3つのアンキリン結合ドメイン含有するようである。A−イソ型は、推定第3アンキリン反復ドメインの20アミノ酸を欠失しており、そして併置された配列はアンキリン反復ドメインと適合しない。
【0118】
VR3A+B−イソ型は、N末端中およびTM4とTM5の間に2個の潜在的なミリストイル化部位:[GPGGE]をもつ。推定リン酸化部位は、7個のPKCリン酸化部位:T112,S134,T175,T190,T380,S403,S688[しかし、S688は推定細胞外領域中にある];1個の潜在的PKAおよびPKGリン酸化部位:T181;12個の潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位:T89,S162,T181,T395,S416,S422,S432,T426,S432,S441,T740,S836;3個の潜在的乳腺カゼインキナーゼリン酸化部位(SxE):S4,S726,S758;1個の潜在的チロシンキナーゼリン酸化部位:Y411[「A」インサート中に存在する];および1個の潜在的N結合グリコシル化部位:N651[N201,N207は、推定細胞内N末端ドメイン中にあり、そしてグリコシル化されそうもない]を含む。本発明において記述されるいかなるイソ型中にも推定CaM結合ドメインは存在しない。
【0119】
「A」インサート2PKCリン酸化部位を欠いているA−イソ型では、6個のカゼインキナーゼIIリン酸化部位および唯一の推定チロシンキナーゼリン酸化部位が欠失している。
【0120】
A+B+イソ型は、C末端の推定細胞内領域において2個のカゼインキナーゼIIリン酸化部位を欠く推定タンパク質をコードしている。
【0121】
実施例8−組織におけるヒトVR3の発現
DNAアレー(Luo et al.,1999)を用いる発現、DNAアレー分布解析は、ヒトVR3mRNAが種々の組織で発現され、そして全組織レベルにおいてVR1と若干の発現の重複があることを示している[図13]。左欄において示される組織タイプからのcRNAは、ヒトVR3をコードしている配列を含有した(中欄)。ヒトVR1の発現は、右欄において示され、そしてほとんどの場合、VR3発現と重複した。註:NSはヒトVR1の有意な発現がなかった。DNAアレー上に固定されたヒトVR3DNAの配列は、(配列番号:17)CCACCATCCTGGACATTGAGCGCTCCTTCCCCGTATTCCTGAGGAAGGCCTTCCGCTCTGGGGAGATGGTCACCGTGGGCAAGAGCTCGGACGGCACTCCTGACCGCAGTGGTGCTTCAGGGTGGATGAGGTGAACTGGTCTCACTGGAACCAGAACTTGGGCATCATCAACGAGGACCCGGGCAAGAATGAGACCTACCAGTATTATGGCTTCTCGCATACCGTGGGCCGCCであった。
このDNA配列は、A+B+、A+B−およびA−B−イソ型には存在しない。cDNA種は前立腺からはクローン化されたことに注目(*;図13)。
ノザンブロット解析は、全脳、胎盤、肺、腎臓、膵臓および前立腺においてVR3の発現を表した。
【0122】
実施例9−大腸菌発現ベクター中へのヒトVR3受容体cDNAのクローニング
組み換えヒトVR3受容体を、限定するものではないがpETシリーズ(Novagen)を含む、大腸菌発現ベクター中へのヒトVR3受容体発現カセットのトランスファー後に、大腸菌において生産する。pETベクターは、緊密に調節されるバクテリオファージT7プロモーターの制御下にヒトVR3受容体を発現させる。誘導性lacプロモーターによって作動するT7RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含有する大腸菌宿主へのこの構築物のトランスファー後、ヒトVR3受容体の発現は、適当なlac基質(IPTG)が培養物に添加される場合に誘導される。発現されるヒトVR3受容体のレベルは本明細書に記述されるアッセイによって決定される。
【0123】
ヒトVR3受容体の完全な読み枠をコードしているcDNAがpET[16]11aのNdeI部位中に挿入される。正方向における構築物は、配列解析によって同定され、そして発現宿主株BL21を形質転換するために使用される。次に、形質転換株が使用されてヒトVR3受容体タンパク質の生産のための培養物に接種される。培養物は、製法が当業者には既知であるM9もしくはZB培地において増殖されてもよい。OD600=1.5まで増殖後、ヒトVR3受容体の発現が、37℃で3時間1mMIPTGを用いて誘導される。
【0124】
実施例10−昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス発現ベクター中へのヒトVR3受容体cDNAのクローニング
AcNPVウイルスのゲノムから得られるバキュロウイルスベクターが、昆虫細胞のSf9系(ATCC CRL#1711)において高レベル発現を与えるために設計される。ヒトVR3受容体cDNAを発現する組み換えバキュロウイルスは、次の標準方法(Invitrogen Maxbac Manual)によって作成される:ヒトVR3受容体cDNA構築物が、pAC360およびBlueBacベクターを含む、種々のバキュロウイルストランスファーベクター(Invitrogen)におけるポリヘドリン遺伝子中に連結される。組み換えバキュロウイルスは、バキュロウイルストランスファーベクターおよび直線化したAcNPVゲノムDNA[Kitts,P.A.,Nuc.Acid.Res.18:5667(1990)]のSf9細胞中への同時トランスフェクション後の相同組み換えによって生成される。組み換えpAC360ウイルスは、感染細胞における封入体の不在によって同定され、そして組み換えpBlueBacウイルスは、β−ガラクトシダーゼ発現に基づいて同定される(Summers,M.D.and Smith,G.E.,Texas Agriculture Exp.Station Bulletin No.1555)。プラーク精製に続いて、ヒトVR3受容体発現が、本明細書に記述されるアッセイによって測定される。
【0125】
ヒトVR3受容体の完全な読み枠をコードしているcDNAがpBlueBacIIのBamHI部位中に挿入される。正方向における構築物は、配列解析によって同定され、そして線状AcNPVマイルドタイプDNAの存在下でSf9細胞をトランスフェクションするために使用される。
【0126】
真の、活性ヒトVR3受容体が感染細胞の細胞質中に見い出される。活性ヒトVR3受容体は、低浸透圧または洗剤溶解によって感染細胞から抽出される。
【0127】
実施例11−酵母発現ベクター中へのヒトVR3受容体cDNAのクローニング
組み換えヒトVR3受容体を、異種タンパク質の細胞内または細胞外発現を導くために設計された発現ベクター中への最適なヒトVR3受容体cDNAシストロンの挿入後に、酵母S.セレビシエ(S.cerevisiae)において生産する。細胞内発現の場合、ベクター、例えばEmBLyex4または類似のものは、ヒトVR3受容体シストロンに連結される[Rinas,U.et al.,Biotechnology 8:543−545(1990);Horowitz B.et al.,J.Biol.Chem.265:4189−4192(1989)]。細胞外発現では、ヒトVR3受容体シストロンは、分泌シグナル(酵母または哺乳動物ペプチド)をヒトVR3受容体タンパク質のNH2末端に融合する酵母発現ベクター中に連結される[Jacobson,M.A.,Gene 85:511−516(1989);Riett L.and Bellon N.Biochem.28:2941−2949(1989)]。
【0128】
これらのベクターは、限定されるものではないが、発現されるcDNAにヒト血清アルブミンシグナルを融合しているpAVE1>6[Steep O.Biotechnology 8:42−46(1990)]、および発現されるcDNAにヒト・リゾチームシグナルを融合しているベクターpL8PL[Yamamoto.Y.,Biochem.28:2728−2732)]を含む。さらに、ヒトVR3受容体は、ベクターpVEPを利用してユビキチンに複合された融合タンパク質として酵母において発現される[Ecker,D.J.Biol.Chem.264:7715−7719(1989),Sabin,E.A.,Biotechnology 7:705−709(1989)、McDonnell D.P.,Bol.Cell Biol.9:5517−5523(1989)]。発現されるヒトVR3受容体のレベルは本明細書に記述されるアッセイによって決定される。
【0129】
実施例12−組み換えヒトVR3受容体の精製
組み換え法により生産されるヒトVR3受容体は、抗体アフィニティークロマトグラフィーによって精製されてもよい。
【0130】
ヒトVR3受容体抗体アフィニティーカラムは、Affigel−10(bio−Rad)、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにN−ヒドロキシスクシンイミドエステルにより予め活性化されているゲル支持体、に抗ヒトVR3受容体抗体を付加することによって作成される。次いで、抗体はスペースアームをもつアミド結合をとおしてゲルに結合される。次いで、残りの活性エステルが1MエタノールアミンHCl(pH8)により失活される。カラムは水、続いて0.23MグリシンHCl(pH2.6)で洗浄されて、すべての非複合抗体または外来のタンパク質を除去する。次いで、カラムは、適当な膜可溶化剤、例えば洗剤とともにリン酸バッファー食塩水(pH7.3)において平衡化され、そして可溶化されたヒトVR3受容体を含有する細胞培養上澄液または細胞抽出物が徐々にカラムを通過される。次いで、カラムを、光学濃度(A280)がバックグラウンドまで落ちるまで洗剤とともにリン酸バッファー食塩水により洗浄し、次いで、タンパク質を洗剤とともに0.23Mグリシン−HCl(pH2.6)で溶出する。精製されたヒトVR3受容体タンパク質は、次に、リン酸バッファー食塩水に対して透析される。
【0131】
【表3】
【0132】
【表4】
【0133】
【表5】
【図面の簡単な説明】
【図1】発明にかかる、配列番号5。コーディング領域のヒトVR3A+B−ヌクレオチド配列(2616bp)。
【図2】発明にかかる、配列番号6。ヒトVR3A+B−のヌクレオチド配列を、337bpの5’非翻訳領域(UT)および547bpの3’UTを包含して示す(3500bp)。
【図3】発明にかかる、配列番号7。ヒトVR3A+B−のコーディング配列(871アミノ酸)
【図4】発明にかかる、配列番号8。コーディング領域のヒトVR3A−B−ヌクレオチド配列(2436bp)。
【図5】発明にかかる、配列番号9。ヒトVR3A−B−のコーディング配列(811アミノ酸)
【図6】発明にかかる、配列番号10。コーディング領域のヒトVR3A+B+ヌクレオチド配列(2229bp)。
【図7】発明にかかる、配列番号11。ヒトVR3A+B+のヌクレオチド配列を、836bpの5’UTおよび994bpの3’UTを包含して示す(4059bp)。
【図8】発明にかかる、配列番号12。ヒトVR3A+B+のコーディング配列(742アミノ酸)
【図9】発明にかかる、ツメガエル(Xenopus)卵母細胞中でのVR3アイソフォームの機能的発現を示す。すなわち、2 Ca2+を含むND−96中で維持された卵母細胞の生存率は、3.25ngのVR3 A+B−およびVR3 A+B+(5ng)の注入4〜6日後に有意に減少したが、しかしVR3 A−B−(1.5ng)cRNAではしなかった。VR3 A+B−および水を注入された卵母細胞のデータは5回の異なる実験から得た。死亡卵母細胞は視覚的に決定した。データはχ2解析を使用して解析した。
【図10】発明にかかる、卵母細胞中での機能。すなわち、VR3アイソフォームは熱により活性化される。A.25℃から46℃までの熱傾斜により導き出されかつ46℃で最低15秒間維持される平均ピーク電流を示す。電流は+80mVで初期電流を上回る増加である。電圧の傾斜を2秒ごとに400m秒にわたって−120から+80mVまで適用した。卵母細胞に、3.25、1.5および5ngのそれぞれVR3 A+B−、A−B−およびA+B+ cRNAを注入し、そして6日後まで記録した。黒色の棒:水を注入された対照(n=8);白色の棒:VR3 A+B−アイソフォーム(n=11);斜線を付けられた棒:VR3 A−B−アイソフォーム(n=8);点を付けられた棒:VR3 A+B+アイソフォーム(n=5)。全部のアイソフォームは水対照を上回る有意の増加を示す(それぞれp=0.001、0.03および0.007;スチューデントのt検定)。熱に誘導された応答は、A+B−アイソフォームにおいて他の2アイソフォームに比較して約2倍より大きいが、しかし差異は有意でない(A−B−およびA+B+に比較してA+B−についてそれぞれp=0.051およびp=0.16)。データは2組の注入された卵母細胞から得た。示されるデータは平均および平均の標準誤差である。B.電圧傾斜に誘導された電流を、水(上)、VR3A+B−(上から2番目)、VR3 A−B−(上から3番目)およびVR3A+B+(一番下)を注入した卵母細胞への増大する熱の適用の間に記録した。卵母細胞はCa2+ ND−96で絶えず灌流し、また、溶液はインライン加熱装置(SH−27AインラインヒーターとともにのTC−324B;ワーナー インストゥルメント コーポレーション(Warner Instrument Corp.))により加熱した。37℃から46℃までの温度で得られた傾斜に誘導された電流(y軸上で示されるとおりμAで)を表し;より高温での電流の軌跡のみを対応する温度で印をつける。
【図11】発明にかかる、卵母細胞中での機能。すなわち、VR3A+B−は、細胞外生理的食塩水溶液による細胞灌流により誘導されるVR1を発現する卵母細胞にて観察される灌流活性化電流(Iperfusion)に、10μMルテニウムレッドに対する感受性を与える。増大された灌流によるIperfusionの活性化は、VR3 A+B− cRNAを注入されたVR1を発現する卵母細胞中でのみルテニウムレッドにより封鎖され、そしてVR1のみを発現する卵母細胞中でされなかった。(a).VR1 cRNA[4ng]を注入された卵母細胞を、−70mVの保持電位から400m秒にわたって−120と+80mVとの間の電圧傾斜で攻撃した。傾斜に誘導された電流は卵母細胞の灌流開始後に10ml/分の速度で増大した。0.5分間の10μMルテニウムレッドでの前インキュベーションは電流を封鎖した。この封鎖は部分的に可逆的であった(示されない)。(b).VR3 A+B−[1.3ng]と一緒にVR1 cRNA[4ng]を注入された卵母細胞を、−70mVの保持電位から400m秒にわたって−120と+80mVとの間の電圧傾斜で攻撃した。傾斜に誘導された電流は卵母細胞の灌流の開始後に10ml/分の速度で増大した。0.5分間の10μMルテニウムレッドとの前インキュベーションはIperfusionに対しほとんど影響を有しなかった。Iperfusionは双方の組の卵母細胞で類似の大きさを有した。RR阻害電流についてのVrevは約−13mV(矢印)であった。
【図12】発明にかかる、卵母細胞中での機能。すなわち、VR1と一緒のVR3A+B−。1μMカプサイシンに対する応答の大きさおよび減衰の動力学は、VR1 cRNAを等しい比[それぞれ2.9ng]でVR3 A+B− cRNAと共発現させた場合に減少した。
【図13】発明にかかる、DNAアレイ分布分析は、hVR3 mRNAが多様な組織中で発現され、また、全組織レベルでVR1との発現の若干の重なり合いが存在することを示す。DNAアレイ上で使用されたDNA配列はA+B+中に存在せず、A+B−およびA−B−アイソフォームのみに存在する。これらのcDNA種が下垂体および前立腺からクローン化されたことに注意されたい。
Claims (22)
- ヒトVR3レセプタータンパク質をコードする単離かつ精製されたDNA分子。
- (配列番号5);(配列番号6);(配列番号8);(配列番号10)および(配列番号11)より成る群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項1記載の単離かつ精製されたDNA分子。
- 前記DNA分子がゲノムDNAである、請求項1記載の単離かつ精製されたDNA分子。
- ベクターがヒトVR3レセプタータンパク質をコードするDNA配列を含んで成る、組換え宿主中でのヒトVR3レセプタータンパク質の発現のための発現ベクター。
- ヒトVR3レセプタータンパク質をコードするDNA配列が:(配列番号5);(配列番号6);(配列番号8);(配列番号10)および(配列番号11)より成る群から選択される、請求項4記載の発現ベクター。
- 発現ベクターが、ヒトVR3レセプタータンパク質をコードするゲノムDNAを含有する、請求項4記載の発現ベクター。
- 請求項4記載の発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞。
- 発現ベクターが:(配列番号5);(配列番号6);(配列番号8);(配列番号10)および(配列番号11)より成る群から選択されるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項7記載の組換え宿主細胞。
- 発現ベクターが、ヒトVR3レセプターをコードするゲノムDNAを含んで成る、請求項7記載の組換え宿主細胞。
- ヒトVR3レセプタータンパク質として機能する、実質的に純粋な形態のタンパク質。
- (配列番号7)(配列番号9)および(配列番号12)より成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項10記載のタンパク質。
- ヒトVR3レセプタータンパク質と免疫学的に反応性の単一特異性抗体。
- 抗体がヒトVR3レセプターの活性を封鎖する、請求項12記載の抗体。
- (a)請求項4記載の発現ベクターを適する宿主細胞に移入すること;および
(b)発現ベクターからのヒトVR3レセプタータンパク質の発現を可能にする条件下で段階(a)の宿主細胞を培養すること
を含んで成る、組換え宿主細胞中でのヒトVR3レセプタータンパク質の発現方法。 - (a)ヒトVR3レセプタータンパク質活性の調節物質をヒトVR3レセプタータンパク質と組み合わせること、および
(b)ヒトVR3レセプタータンパク質に対する調節物質の影響を測定することを含んで成る、ヒトVR3レセプタータンパク質活性を調節する化合物の同定方法。 - タンパク質に対する調節物質の影響が、ヒトVR3レセプターリガンドの結合を阻害するもしくは高めることである、請求項15記載の方法。
- ヒトVR3レセプタータンパク質に対する調節物質の影響が、ヒトVR3レセプター活性タンパク質の刺激もしくは阻害である、請求項15記載の方法。
- 請求項15記載の方法で活性な化合物。
- 化合物がヒトVR3レセプターのアゴニストもしくはアンタゴニストである、請求項15記載の方法で活性な化合物。
- 化合物がヒトVR3レセプターの発現の調節物質である、請求項15記載の方法で活性な化合物。
- 請求項15記載の方法で活性な化合物を含んで成る製薬学的組成物。
- 請求項15記載の方法で活性な化合物の投与を含んで成る、ヒトVR3レセプターにより媒介される病状に対するような治療が必要な患者の治療方法。
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