JPH10507930A

JPH10507930A - プロスタグランジンレセプターｄｐ

Info

Publication number: JPH10507930A
Application number: JP8522517A
Authority: JP
Inventors: アブラモビツツ，マーク; ボワ，イブ; メタース，キヤスリーン; ソーヤー，ニコル; スリペツツ，デボラ・エム
Original assignee: メルクフロストカナダインコーポレーテツド
Priority date: 1995-01-26
Filing date: 1996-01-23
Publication date: 1998-08-04
Anticipated expiration: 2016-01-23
Also published as: US6214972B1; US6395499B1; CA2211204A1; WO1996023066A2; CA2211204C; US5958723A; WO1996023066A3; EP0812353A2; JP3064015B2

Abstract

(57)【要約】新規プロスタグランジンレセプターを同定し、該レセプターをコードするＤＮＡを単離精製し、配列決定し、宿主細胞で発現させた。新規プロスタグランジンレセプターをコードする該ＤＮＡ及びレセプターを発現する宿主細胞使用して、プロスタグランジンレセプターのモジュレーターを同定する。

Description

【発明の詳細な説明】プロスタグランジンレセプターＤＰ発明の背景プロスタグランジンＤ₂（ＰＧＤ₂）は、脳、脾臓、肺、肥満細胞、骨髄、胃、皮膚、及び眼を含む多数の組織で合成される(Negishi M.ら、Prog．Lipid Res． 32:417-434，1993及びその中の引用文献)。ＰＧＤ₂の中枢神経系の作用は、睡眠導入、体温、嗅覚機能、ホルモン放出、炎症、及び無痛覚における効果を含むものと考えられている(Negishi M.ら、上記及びその中の引用文献)。ＰＧＤ₂は血小板凝集の阻害を引起すことができる(Coleman R.A.ら、Pharmacological Revie ws 46:205-229，1994及びその中の引用文献)。ＰＧＤ₂はまた、免疫刺激(challe nge)のときに肥満細胞から放出される主要プロスタノイドであり、それ自体、アレルギー性鼻炎及び気道過反応を含むがそれらに限定されない種々のアレルギー性疾患の仲介物質と考えられている(Ito S.ら、Prostaglandins Leukotrienes a nd Essential Fatty Acids．37:219-234，1989及びその中の引用文献)。それはまた、周での分泌を刺激しうる。局所投与されたＰＧＤ₂はまた、眼圧を下げることが示された(Woodward D.F. ら、European J.Pharmacology 230:327-333,1993及びNakajimaM.ら、Graefe's A rch．Clin．Exp．Ophthalmol．229:411-413，1991)。ＰＧＤ₂の生理的作用は、プロスタノイドＤＰレセプターとの相互作用を介して仲介される。ＤＰレセプターは主に、血液血小板、種々の組織の平滑筋、及び中枢神経系を含む神経組織に分布していると考えられている(Coleman R.A.ら、上記、及びその中の引用文献)。しかし、ＤＰレセプターは、プロスタノイドレセプターのうちで最も偏在し、最も量の少ないレセプターであり、それ自体最も性質が調べられていないレセプターである。ＰＧＤ₂の作用の多く及びこのレセプターの分布がまた種依存的であることが更に事態を複雑にする。ＤＰレセプターの特異的結合部位が、ヒト血小板膜、ラット脳シナプス膜、及びウシ胎仔気管から得られる細胞系列から調製された膜を使用して実験的に研究された(Coleman R.A.ら、上記、及び及びその中の引用文献)。ＤＰレセプター活性の上記研究方法は、以下の点で幾つかの不利な点を有する。即ち、全部ではないにしろ大部分の調製物は、幾つかの異なるが関連のプロスタノイドレセプター集団を含み、その各々が異なるリガンド結合性を有し、そのことが絶対的力価と選択性の測定を予測できないものとしている。更に、種々の組織又は細胞のＤＰレセプターの量の少ないことが、ヒトＤＰレセプターのモジュレーター、エフェクター、アゴニスト、又はアンタゴニストとしての化合物を満足に試験することを非常に困難なものとしている。発明の概要ＤＰと命名した新規プロスタグランジンレセプタータンパク質をヒト細胞から同定した。完全長のＤＰタンパク質をコードするＤＮＡ分子を単離精製し、ヌクレオチド配列を決定した。ＤＰコードＤＮＡを発現ベクターにクローン化し、これらの発現ベクターを組換え宿主細胞に導入すると、これらの発現ベクターは、組換え宿主細胞に、機能するＤＰレセプタータンパク質を発現させる。新規ＤＰタンパク質、ＤＰコードＤＮＡ、発現ベクター、及び組換えＤＰを発現する組換え宿主細胞は、ＤＰレセプター活性のモジュレーターの同定に有用である。組換えＤＰ発現宿主細胞を利用する、ＤＰレセプターのモジュレーターの同定方法をも開示する。ＤＰ活性のモジュレーターは、プロスタグランジン関連疾患の治療とＤＰレセプターでのプロスタグランジン効果の調節に有用である。図面の簡単な説明図１−ヒトＤＰｃＤＮＡ構築物のＤＮＡ配列を示す。図２−ＤＰレセプタータンパク質の完全な演繹アミノ酸配列を示す。図３−ｐｃＤＮＡ３−ｈＤＰでトランスフェクトされたＣＯＳ−Ｍ６膜への［³ Ｈ］ＰＧＤ₂の特異的結合の競合。［³Ｈ］ＰＧＤ₂結合アッセイを、実施例６に記載の通り行った。各競合リガンド濃度での最大［³Ｈ］ＰＧＤ₂特異的結合の割合を、ＰＧＤ₂（）、ＤＰレセプターアゴニストＢＷ２４５Ｃ（）、ＤＰアンタゴニストＢＷ８６８Ｃ（）、ＰＧＥ₂（）、ＰＧＦ_2a（）、イロプロスト（）、及びＴＰ−レセプターアゴニストＵ４６６１９（）を用いて、最大１００μＭの濃度範囲で測定した。図４−ＤＰレセプターを安定に発現しているＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞での細胞内［Ｃａ²⁺］_iの増加を示す。ＤＰ−ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞を回収し、実施例８に記載の通り調製した。その後、ＤＰ−ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞に、ベヒクル（Ｍｅ₂ＳＯ₄、最終０．２ｖ／ｖ％）、又は１０ｎＭ、１００ｎＭ、もしくは１，０００ｎＭＰＧＤ₂を加えた。各実験の最後に、［Ｃａ²⁺］_iの放出のために１μＭイオノマイシンを加え、次に、１ｍＭＥＤＴＡによって［Ｃａ²⁺］_i放出を止めた。図５−ＤＰレセプターを安定に発現しているＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞での細胞内ｃＡＭＰ産生の増加を示す。ｃＡＭＰアッセイを実施例７に記載の通り行った。各リガンド濃度で、１．５×１０⁵細胞当たり産生されたｃＡＭＰのピコモルを、ＰＧＤ₂（ｎ）、ＤＰレセプターアゴニストＢＷ２４５Ｃ（●）、ＤＰアンタゴニストＢＷ８６８Ｃ（ｕ）、ＰＧＥ₂（ｓ）、ＰＧＥ₁（）、ＰＧＦ_2a （ｔ）、イロプロスト（ｏ）、及びＴＰ−レセプターアゴニストＵ４６６１９（Ｏ）を用いて、最大１μＭの濃度範囲で測定した。発明の詳細な説明本発明は、ＤＰと命名した新規プロスタグランジンレセプターをコードするＤＮＡに関する。本発明はまた、組換え発現プラスミドに含まれるクローン化ＤＰコードＤＮＡを発現する組換え宿主細胞に関する。本発明はまた、ＤＰレセプター活性を調節する物質のスクリーニング方法に関する。本発明のＤＮＡはゲノムＤＮＡ及びＤＰ産生細胞からのＤＮＡから単離される。本明細書で使用するＤＰは、特異的にプロスタグランジンと結合できるＧタンパク質共役レセプターを指す。ＤＰを産生できる哺乳動物細胞には、小腸由来の細胞、血管・呼吸器・生殖系などの平滑筋、眼、及び血小板があるがそれらに限定されない。ＤＰを産生する形質転換哺乳動物細胞系列には、ウシ胎仔気管から得られる細胞があるがそれに限定されない。本発明のために好適な細胞には、正常ヒト網膜、血小板があり、最適の細胞はヒト小腸細胞である。その他の細胞及び細胞系列も、ＤＰｃＤＮＡを単離するための使用に適切であろう。適切な細胞の選別を、ノーザンブロット分析、放射性リガンド結合分析、機能分析又は細胞表面のＤＰのスクリーニングによって行いうる。ＤＰ活性の検出方法は当業界周知であり、レセプターに特異的な放射性標識リガンドの結合を測定する。このアッセイでＤＰ活性を有する細胞は、ＤＰｃＤＮＡ単離のために適切であろう。種々の方法の任意のものをＤＰｃＤＮＡをクローンするために使用できる。これらの方法には、適切な発現ベクターシステムでＤＰ含有ｃＤＮＡライブラリーの構築後、ＤＰｃＤＮＡの直接的機能性発現があるが、それには限定されない。別の方法は、ＤＰタンパク質のアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターに構築されたＤＰ含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。好適な方法は、ＤＰタンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡを用いて、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターに構築されたゲノムライブラリー又はＤＰ含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。この部分的ｃＤＮＡは、プロスタグランジンＤＰレセプターに関連しているその他のＧタンパク質共役レセプターとして公知のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計により、ＤＰＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅によって得られる。その他のタイプのライブラリー、及びその他の細胞又は細胞タイプから構築されたライブラリーは、ＤＰコードＤＮＡを単離するのに有用でありうることは、当業者に自明である。その他のライブラリーには、その他の細胞もしくは細胞系列から得られるｃＤＮＡライブラリー及びゲノムＤＮＡライブラリーがあるが、それらに限定されない。適切なｃＤＮＡライブラリーは、ＤＰ活性を有する細胞又は細胞系列から調製できうることは、当業者に自明である。ＤＰｃＤＮＡを単離するためにｃＤＮＡライブラリーを調製する際に使用される細胞又は細胞系列の選別は、上記の、そして本明細書で使用される公知の放射性標識リガンド結合アッセイを用いて、細胞結合ＤＰ活性を最初に測定してなされる。ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当業界周知の標準的技術によってなされうる。周知のｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例えばManiatis,T.，Fritsch,E．F. ，Sambrook，J.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989)に記載されている。ＤＰコードＤＮＡが、適切なゲノムＤＮＡライブラリーから単離されうることも当業者に自明である。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当業界周知の標準的技術によってなされうる。周知のゲノムＤＮＡライブラリー構築技術は、Mani atis,T.，Fritsch,E. F., Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laborato ry Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1 989)に記載されている。好適方法の一つによってＤＰ遺伝子をクローンするために、ＤＰ又は相同タンパク質のアミノ酸配列又はＤＮＡ配列が必要である。このことを達成するために、ＤＰタンパク質又は相同タンパク質は精製され、部分アミノ酸配列は自動配列決定機で決定されうる。完全なアミノ酸配列を決定する必要はなく、６〜８個のアミノ酸の２領域の線形配列を決定し、部分ＤＰＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅をすることができる。適切なアミノ酸配列を同定した後、それらをコードできるＤＮＡ配列を合成する。遺伝コードは縮重しているので、二つ以上のコドンを、ある特定のアミノ酸をコードするために使用でき、そのため、類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドの任意のセットによってアミノ酸配列はコードされうる。このセットの一員だけがＤＰ配列と同一であるが、セットのその他のものは、ミスマッチのＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえＤＰＤＮＡにハイブリダイズできるであろう。ミスマッチのＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＤＰＤＮＡに依然として十分にハイブリダイズでき、ＤＰコードＤＮＡの同定と単離ができうる。好適方法の一つを使用して、ＤＰをコードするｃＤＮＡクローンが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をベースとした技術及びｃＤＮＡライブラリースクリーニングを用いる２段階アプローチで単離される。第１段階で、精製ＤＰ又は相同タンパク質からのＮＨ₂末端及び内部アミノ酸配列情報を使用して、ＤＰ特異的ＤＮＡフラグメントの増幅のための縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。第２段階で、これらのフラグメントをクローン化し、ｃＤＮＡライブラリーからの完全長ｃＤＮＡの単離のためのプローブとして使用する。ＤＰをコードするｃＤＮＡの配列を図１に示す。ｃＤＮＡからのＤＰの演繹アミノ酸配列を図２に示す。決定されたｃＤＮＡ配列を調べると、約３５９のアミノ酸タンパク質をコードする唯一の、大きな読取り枠の存在が分かる。上記方法によって得られたクローン化ＤＰｃＤＮＡは、適切なプロモーターとその他の転写調節要素を含み、組換えＤＰを産生させるために原核又は真核宿主細胞に移された発現ベクターに分子クローニングすることによって組換え的に発現されうる。このような操作技術は上記Maniatis,T.,らに記載されており、当業界周知である。発現ベクターとは、適切な宿主中で、クローン化ＤＮＡの転写とそれらのｍＲＮＡの番羽訳のために必要なＤＮＡ配列と本明細書では定義する。このようなベクターを用いて、細菌、ラン藻、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び動物細胞などの種々の宿主で、真核ＤＮＡを発現できる。特別に設計されたベクターは、細菌−酵母、又は細菌−動物細胞などの宿主間でのＤＮＡの行き来が可能である。適切に構築された発現ベクターは以下のものを含むべきである：宿主細胞での自律複製のための複製起点、選別可能なマーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の可能性、及び活性プロモーター。プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとは、高頻度でｍＲＮＡを開始させるプロモーターである。発現ベクターには、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミド又はウイルスがあるが、それらに限定されない。種々の哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞で組換えＤＰを発現できる。組換えＤＰ発現に適切でありうる市販の哺乳動物発現ベクターには、以下のものがあるがそれらに限定されない：ｐＭＣＩｎｅｏ(Stratagene)、ｐＸＴ１ (Stratagene)、ｐＳＧ５(Stratagene)、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３(Invitrogen)、ＥＢＯ−ｐＳＶ２ −ｎｅｏ(ATCC37593)、ｐＢＰＶ−１（８−２）(ATCC37110)、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）(ATCC37224)、ｐＲＳＶｇｐｔ(ATCC37199)、ｐＲＳＶｎｅｏ(ATCC37198)、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ATCC37146）、ｐＵＣＴａｇ(ATCC374 60)、ＩＺＤ３５(ATCC37565)、及びワクシニアウイルストランスファーベクターｐＴＭ１。ＤＰをコードするＤＮＡはまた、宿主細胞での発現のために、発現ベクターにクローン化されうる。宿主細胞は、細菌、酵母、哺乳動物細胞（ヒト、ウシ、ブタ、サル、及びゲッ歯類起源の細胞系列を含むかそれらに限定されない）、及び昆虫細胞（Ｓｆ９及びショウジョウバエ由来細胞系列を含むがそれらに限定されない）を含むがそれらに限定されない原核又は真核細胞でありうる。適切でありえ、市販の哺乳動物種由来の細胞系列には以下のものがふくまれるがそれらに限定されない：ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬｅ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）、及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）。発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融合、及びエレクトロポレーションを含むがそれらに限定されない多数の技術のいずれかにより宿主細胞に導入されうる。発現ベクター含有細胞は個々に分析され、ＤＰタンパク質を産生するかどうかを決定される。ＤＰ発現細胞の同定は、抗ＤＰ抗体との免疫反応性及び宿主細胞に伴われているＤＰ活性の存在を含むがそれらに限定されない幾つかの方法によりなされうる。ＤＰＤＮＡの発現はまた、in vitro産生合成ｍＲＮＡを使用してなされうる。合成ｍＲＮＡは、コムギ胚芽抽出液及び網状赤血球抽出液を含むがそれらに限定されない種々の無細胞系で効率的に翻訳されえ、またカエル卵母細胞への微量注入を含むがそれに限定されない細胞をベースとした系で効率的に翻訳されうるが、カエル卵母細胞への微量注入が好ましい。レセプター活性及び／又はＤＰタンパク質の最適レベルを与えるＤＰｃＤＮＡ配列を決定するために、以下のものを含むがそれらに限定されないＤＰｃＤＮＡ分子を構築できる：ＤＰｃＤＮＡの完全長の読取り枠及びレセプタータンパク質の唯一の特定のドメイン又は該タンパク質の再配置ドメインをコードするｃＤＮＡの一部を含む種々の構築物。全ての構築物は、ＤＰｃＤＮＡの５′及び／又は３′非翻訳領域を全く含まないか、全部を含むか、又は一部を含むように設計できる。ＤＰ活性とタンパク質発現のレベルは、適切な宿主細胞にこれらの構築物の唯一つを、又は組合せて導入した後、測定できる。一過性アッセイで最適発現を与えるＤＰｃＤＮＡカセットの決定後、このＤＰｃＤＮＡ構築物を、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、大腸菌、真菌及び酵母細胞のためのベクターを含むがそれらに限定されない種々の発現ベクター（組換えウイルスを含む）に移す。トランスフェクトされた哺乳動物細胞は、以下の方法によりＤＰレセプター活性のレベルとＤＰタンパク質のレベルの両方をアッセイされる。ＤＰレセプター活性の評価は、細胞に放射性標識リガンドの直接的導入及びＤＰ発現細胞への放射性リガンドの特異的結合量の測定を含む。レセプター活性の結合アッセイは当業界公知である(Freyら、1993,Eur.J.Pharmacol.,244,pp239-250)。宿主細胞でのＤＰタンパク質のレベルは、免疫アフィニティ技術及び／又はリガンドアフィニティ技術を含むがそれらに限定されない種々の技術によって定量される。ＤＰ特異性アフィニティビーズ又はＤＰ特異性抗体を使用して、³⁵Ｓ− メチオニン標識又は非標識ＤＰタンパク質を単離する。標識ＤＰタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。非標識ＤＰタンパク質は、ＤＰ特異性抗体を用いる、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡアッセイで検出する。宿主細胞でのＤＰ発現後、ＤＰタンパク質を回収し、ＤＰ特異性リガンドと結合できる活性型のＤＰを提供する。幾つかのＤＰ精製方法が利用でき、使用のために適切である。組換えＤＰは、以下のものを含むがそれらに限定されない標準的分離技術の種々の組合せ又は個々の適用によって細胞膜から精製されることができうる：界面活性剤可溶化、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー。更に、組換えＤＰは、完全長のナセントＤＰ又はＤＰのポリペプチドフラグメントに特異性のモノクローナル又はポリクローナル抗体で作られた免疫アフィニティカラムを用いて、その他の細胞タンパク質から分離できる。ＤＰに対する単一特異性抗体は、ＤＰに対して反応性の抗体を含む哺乳動物抗血清から精製されるか、又はKohler及びMilstein，Nature 256: 495-497(1975) に記載の技術を用いてＤＰと反応性のモノクローナル抗体として調製される。本明細書で使用する単一特異性抗体は、ＤＰに対して均一の結合特性を有する、単一の抗体種又は複数の抗体種として定義される。本明細書で使用する均一の結合とは、上記のＤＰ連関のものなどの特異的抗原又はエピトープに結合する抗体種の能力を指す。ＤＰ特異性抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどの動物を、免疫アジュバントの有無の両方で、ＤＰ又はＤＰタンパク質配列由来のペプチドの適切な濃度で免疫化することにより作製される。最初の免疫化の前に、免疫前血清を集める。ＤＰ又はＤＰ関連ペプチド約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇを、許容できる免疫アジュバントと一緒に各動物に投与する。このような許容できるアジュバントには、フロイント完全、フロイント不完全、ミヨウバン沈殿、Corynebacterium parvum を含む油中水型エマルション、及びｔＲＮＡなどがあるが、これらに限定されない。最初の免疫化は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、又は両方で、多数部位で、好ましくはフロイント完全アジュバント中で、ＤＰ又はＤＰ関連ペプチドを投与することからなる。各動物から一定の間隔で、好ましくは週ごとに採血し、抗体力価を測定する。最初の免疫化後、動物はブースター注射を受けても受けなくともよい。ブースター注射を受ける動物は、一般的に同一の経路でフロイント不完全アジュバント中の等量のＤＰ又はＤＰ関連ペプチドを受ける。ブースター注射は、最大力価が得られるまで、約３週間の間隔で受ける。各ブースター免疫化後約７日で、又は唯一の免疫化後約１週間で、動物から採血し、血清を集め、アリコートを約−２０ ℃で保存する。ＤＰ又はＤＰタンパク質配列から得られるペプチドと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同系繁殖マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃを、ＤＰ又はＤＰ関連ペプチドで免疫化することにより調製する。上記の、等量の許容できるアジュバントに加えた、約０．５ｍｌ緩衝液又は生理食塩水中の、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇのＤＰ又はＤＰ関連ペプチドを用いて、マウスをＤＰ又はＳＣ経路で免疫化する。フロイント完全アジュバントが好適である。０日目でマウスに最初の免疫化をし、約３〜約３０週間休ませる。免疫化マウスに、静脈内（ＩＶ）経路で、リン酸緩衝化生理食塩水などの緩衝溶液中の約１〜約１００ｍｇのＤＰの１回以上のブースター免疫化をする。当業界公知の標準的方法により、免疫化マウスから脾臓を取得して、抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を得る。安定なハイブリドーマが生成できる条件下で、脾臓リンパ球を、適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と混合してハイブリドーマ細胞を産生させる。融合パートナーには、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ− １９４及びＳｐ２／０などがあるがそれらに限定されない。Ｓｐ２／０が好適である。濃度約３０％〜約５０％の分子量約１０００のポリエチレングリコール中で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合させる。当業界公知の方法で、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリン補充ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で生育させることにより、融合ハイブリドーマ細胞を選別する。約１４、１８、及び２１日で生育陽性ウエルから上清液体を集め、抗原としてＤＰ又はＤＰ関連ペプチドを使用する固相免疫放射アッセイ（ＳＰＩＲＡ）などの免疫アッセイにより抗体産生をスクリーニングする。培養液体をオクタロニー沈殿アッセイでも試験し、ｍＡｂのイソタイプを決定する。抗体陽性ウエルからのハイブリドーマ細胞を、Tissue Culture Methods and Applications，Kru se and paterson編、AcademicPress,1973中のMacPherson,Soft Agar Techniques の軟寒天技術などの技術によってクローン化する。プリスチン初回抗原刺激を受けたＢａｂ／ｃマウスに、初回抗原投与後約４日で約２×１０⁶〜約６×１０⁶ハイブリドーマ細胞を、マウス１匹当たり約０．５ｍｌ注入してモノクローナル抗体を産生させる。細胞移入後、約８−１２日で腹水を集め、モノクローナル抗体を当業界公知の技術により精製する。抗ＤＰｍＡｂのin vitro産生は、約２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭでハイブリドーマを生育させて行い、十分な量の特異性ｍＡｂを得る。ｍＡｂは当業界公知の技術により精製する。腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価は、沈殿、受動凝集、酵素結合イムノソルベント抗体（ＥＬＩＳＡ）技術、及び放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）技術を含むがそれらに限定されない種々の血清学的又は免疫学的アッセイによって測定される。同様のアッセイを使用して、体液又は組織及び細胞抽出液中のＤＰの存在を検出する。単一特異性抗体産生の上記方法を利用して、ＤＰポリペプチドフラグメント又は完全長ＤＰポリペプチドに特異性のある抗体を産生させることは当業者に自明である。抗体がアガロースゲルベッド支持体と共有結合を形成するように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルにより前もって活性化されるゲル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０(Biorad)に抗体を加えることにより、ＤＰ抗体アフィニティカラムを作製する。その後、抗体を、スペーサーアームを有するアミド結合によりゲルに結合させる。その後、残余の活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で消去する。カラムを水、次に０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄し、非結合抗体又は外来タンパク質の全てを除去する。それから、カラムを、界面活性剤などの適切な膜可溶化剤と一緒にリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．３）で平衡化し、ＤＰ又はＤＰフラグメントを含む細胞培養上清又は細胞抽出液をゆっくりとカラムに流す。次に、光学密度（Ａ₂₈₀）がバックグラウンドになるまで、界面活性剤などの適切な膜可溶化剤と一緒にリン酸緩衝化生理食塩水でカラムを洗浄し、次に界面活性剤などの適切な膜可溶化剤と一緒に０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）でタンパク質を溶出する。それから、界面活性剤などの適切な膜可溶化剤と一緒にリン酸緩衝化生理食塩水に対し、精製ＤＰタンパク質を透析する。本発明のプロスタグランジンレセプターをコードするＤＮＡの単離のために適切な一つの方法は、他のＧタンパク質共役レセプターから得られたアミノ酸及び／又はＤＮＡ配列情報を利用することである。他のプロスタグランジンレセプターはＧタンパク質共役であると知られているので、膜貫通及び／又は細胞質ドメインなどのある領域又はドメインは、新規レセプターの単離のためのプローブを産生するのに十分な程度の相同性を有することが期待される。プロスタグランジン及びロイコトリエンは、Ｇタンパク質共役レセプターを介してシグナルを伝達することが知られている。種々の組織に存在するＰＧＨ₂／トロンボキサンＡ₂、ＰＧＩ₂、ＰＧＥ₂、ＰＧＤ₂、ＰＧＦ_2a、ＬＴＢ₄、及びＬＴＤ₄の異なるレセプターが報告されている。レセプターの幾つかが可溶化され、部分精製され（Dutta-Roy,A.K.ら、（1987）JBC，262， pp.12685 ; Tsai,A.L.ら、(1989)，JBC，264，pp61 ; 168-Watanabe,T.ら、(199 0)，JBC，265，pp.21237）、ヒト血小板ＴＸＡ₂レセプターが見かけ上均一まで精製された(Ushikubi,F.ら、(1989)，JBC，264，pp.16496)。精製されたトロンボキサンレセプターはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で約５７ｋＤａが中央の非常に広いバンドを示した。部分配列情報のために十分なタンパク質が得られた。相同性スクリーニングによる他のエイコサノイドレセプターの単離の一つのアプローチを、これらのレセプターが一次構造上関連しているという仮定のもとに行うことができる（Sugimoto,Y.ら、(1992)，JBC，267，pp.6463）。これらのレセプターはＧタンパク質共役レセプタースーパーファミリーに属するので、膜貫通領域及び細胞質ドメインに見出される可能性のある相同性区域がある。それ故、プロスタグランジンレセプターに関連する種々の公知のＧタンパク質共役レセプターを利用して、求めるレセプタータンパク質コードＤＮＡの領域(膜貫通領域のような、相同性を有する可能性のある領域)に対するＤＮＡプローブを得ることもできる。別のアプローチは、哺乳動物種間で、ある特定のレセプターに存在する相同性に基づく。アミノ酸配列のレベルで関連性の程度は、通常、常にではないが、６０〜９５％である。マウスからの一つのレセプターの部分的ｃＤＮＡプローブを使用して、ヒト相同体をスクリーニングできる。上記アプローチを用いて、マウスＤＰレセプターの部分的ＣＤＮＡプローブ（日本、京都大学、成宮周博士によって提出された、マウスＤＰレセプターのアミノ酸配列、the 9^thInternational Conference on Prostaglandins and Related Compounds，フローレンス、イタリア、1994年６月６日−１０日）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、マウスゲノムＤＮＡから５′ＤＮＡフラグメントを増幅することによって作製した。次にこのｃＤＮＡをプローブとして使用して、ヒトＤＰレセプター遺伝子のクローンを得たが、そのクローンは該タンパク質のＣ末端部分をコードする配列を含んでいなかった。完全長ｈＤＰレセプターをコードするｃＤＮＡを得るために、ゲノムクローンの５′末端を、３′ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）ＰＣＲによって産生させた３′フラグメントと結合させた。この構築されたｃＤＮＡは今やヒトＤＰレセプターをコードする大きな読取り枠を含んでいた。多数の他のＧタンパク質と共役したレセプターのように、ＤＰレセプターは幾つかの共通の性質を共有する。第１に、疎水性分析によると、７個の予測される膜貫通ドメインがある。第２に、保存されたシステイン残基が細胞外ループ１とループ２に見出される。第３に、ＤＰレセプターは、膜貫通領域７内に、全ての公知のエイコサノイドレセプターに見出される保存されたアルギニンを有する。本発明の新規プロスタグランジンレセプターは、レセプター活性を調節する化合物の同定のためのアッセイ方法で使用するために適している。本明細書で記載するレセプター活性の調節ということは、レセプターの阻害又は活性化であり、またレセプター活性の正常な調整に直接的に、又は間接的に影響を与えることを含む。レセプター活性を調節する化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、及びレセプター活性の調整に直接的に、又は間接的に影響を与える化合物が含まれる。本発明のプロスタグランジンレセプターは、レセプターモジュレーターを同定するアッセイ方法において使用するために、天然源及び組換え源の両方から得ることができる。一般的に、プロスタグランジンレセプターモジュレーターを同定するアッセイ方法は、本発明のプロスタグランジンレセプター、及び試験化合物又は推定されるプロスタグランジンレセプターモジュレーターを含むサンプルを含む。試験化合物又はサンプルは、例えば、天然であろうと組換えであろうと精製レセプタータンパク質上で、天然であろうと組換えであろうとレセプター産生細胞の細胞下分画上、及び／又は天然であろうと組換えであろうとレセプターを発現している細胞全体上で直接試験することができる。試験化合物又はサンプルは、公知の標識又は非標識レセプターリガンドの存在下又は非存在下、レセプターに加えることができる。試験化合物又はサンプルの調節活性は、例えば、レセプターへの結合、レセプターの活性化、レセプター活性の阻害、他の化合物のレセプターへの結合の阻害もしくは増強、レセプター調整の改変、又は細胞内活性の改変の、試験化合物又はサンプルの能力を分析することによって決定できる。ＤＰレセプター活性のモジュレーターの同定は、ＤＰレセプター活性が関与する疾患状態の治療に有用である。他の化合物が、レセプター活性の刺激又は阻害に有用でありうる。ＤＰレセプターの選択的アゴニスト又はアンタゴニストは、緑内障、アレルギー性鼻炎及び肥満細胞が関与する他のアレルギー性疾患、睡眠病を含むがそれらに限定されない疾患及び疾患状態の治療に有用でありえ、血小板凝集の阻害に有用でありえ、それ故血管疾患、損傷後血液凝固・器官移植の拒絶・バイパス手術の予防、うっ血性心不全、肺高血圧症、壊疽、レイノルド病、骨吸収、ショック、及び胃酸分泌の治療に有用でありうる。モジュレーターはまた、細胞保護剤及び抗炎症剤として有用でありうる。ＤＰをコードするＤＮＡ分子の精製単離は、ＤＰレセプターの組織分布の確立、疾患状態でのＤＰレセプター発現の変化の研究、及びＤＰレセプター活性を調節する化合物の同定方法の確立に有用であろう。本発明はまた、ＤＰレセプターをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現、並びにＤＰレセプタータンパク質の機能をin vivoで調節する化合物をスクリーニングする方法に関する。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、又は非タンパク性有機分子でありうる。化合物は、ＤＰレセプターをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現、あるいはＤＰレセプタータンパク質の機能を増加させ、又は減少させて調節しうる。ＤＰレセプターをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現、あるいはＤＰレセプタータンパク質の機能を調節する化合物は、種々のアッセイで検出できる。発現又は機能に変化があるかを決定するために、アッセイは単純な“ｙｅｓ／ｎｏ”アッセイでありうる。試験サンプルの発現又は機能を、標準サンプルでの発現又は機能のレベルと比較して、アッセイを定量的にすることができる。本方法で同定されるモジュレーターは、治療薬、殺虫剤及び殺寄生虫剤として有用である。ＤＰレセプターＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＰレセプターに対する抗体、又はＤＰレセプタータンパク質を含むキットを製造できる。このようなキットを使用して、例えばサンプル中で、ＤＰレセプターＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡの検出、あるいはＤＰレセプタータンパク質又はペプチドフラグメントの存在の検出、及び／又はその定量をすることができる。このようなキャラクタリゼーションは、法医学解析、治療過程のモニター及び疫学研究を含むがそれらに限定されない種々の目的に有用である。本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質、及び抗体を使用して、ＤＰレセプターＤＮＡ、ＤＰレセプターＲＮＡ、又はＤＰレセプタータンパク質のレベルのスクリーニング及び測定をすることができうる。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、及び抗体によって、ＤＰレセプターの検出、定量、及び型分類に適したキットの製造ができる。このようなキットは、例えば少なくとも一つの容器を厳重な管理下に置くために適した区画分けされた担体を含むであろう。担体は更に、組換えＤＰレセプタータンパク質又はＤＰレセプターの検出に適した抗ＤＰレセプター抗体などの試薬を含むであろう。担体はまた、標識抗原又は酵素基質などの検出手段を含みうる。ＤＰレセプターをコードするＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列は、アンチセンス治療用に合成できる。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートなどの安定なＤＮＡ誘導体、２´−Ｏ−アルキルＲＮＡなどの安定なＲＮＡ誘導体、あるいは他のＤＰレセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド擬似物でありうる。ＤＰレセプターアンチセンス分子を、微量注入、リポソームカプセル化により、又はアンチセンス配列を有するベクターからの発現によるなどの当業界公知の方法で、細胞に導入できる。ＤＰレセプターアンチセンス療法は、ＤＰレセプター活性を減少させることが有用な病気の治療のために特に有用でありうる。ＤＰレセプター遺伝子治療を用いて、標的生物の細胞にＤＰレセプターを導入できうる。ＤＰレセプター遺伝子を、例えばレシピエント宿主細胞の感染により、ＤＰレセプターＤＮＡの移入を仲介するウイルスベクターに連結できる。適切なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどがある。あるいは、リガンド−ＤＮＡ複合体又はアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、リポフェクチン膜融合、又は直接的微量注入を用いるレセプター仲介標的ＤＮＡ移入を含む非ウイルス技術によって遺伝子治療のために、ＤＰレセプターＤＮＡを細胞に転移できる。これらの方法及びそれらの改変法は、ex vivo及びin vivo ＤＰレセプター遺伝子治療に適している。ＤＰレセプター遺伝子治療は特に、ＤＰレセプター活性を上昇させることが有用な疾患の治療に有用でありうる。ＤＰレセプターＤＮＡ、ＤＰレセプターＲＮＡ、もしくはＤＰレセプタータンパク質、又はＤＰレセプター活性のモジュレーターを含む医薬として有用な組成物は、医薬として許容できる担体の混合などの公知の方法によって製造されうる。このような担体と製造方法の例は、RemingtonのPharmaceutical Sciencesに記載されている。有効な投与に適した医薬として許容できる組成物を形成するために、このような組成物は有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はモジュレーターを含むであろう。本発明の治療用又は診断用組成物は、ＤＰレセプター関連活性の調節の兆候のある疾患の治療又は診断に十分な量を各人に投与される。有効量は、各人の状態、体重、性別、及び年齢などの種々の因子により変わりうる。医薬組成物は、皮下、局所、経口、及び筋肉内などの種々の経路で各人に投与されうる。 “化学的誘導体”という用語は、通常はベースとなる分子の一部ではない付加的な化学部分を含む分子を指す。このような部分は、ベース分子の溶解性、半減期、吸収などを改善しうる。あるいは、部分はベース分子の望ましくない副作用を減少させうるか、又はベース分子の毒性を減少させうる。このような部分の例は、RemingtonのPharmaceutical Sciencesなどの種々の書物に記載されている。本明細書で開示した方法によって同定された化合物を単独で、ルーチンな試験で定められる適切な投与量使用して、ＤＰレセプター又はその活性の最適の阻害を達成し、可能性のある毒性を最小化できる。更に、他の薬剤との共投与又は他の薬剤との逐次的投与も望ましいこともありうる。本発明はまた、本発明の治療方法で使用するための適切な局所、経口、全身的、及び非経口医薬組成物を提供するという目的を有する。ＤＰレセプターの調節において使用するための活性成分として本発明により同定された化合物を含む組成物は、通常の投与ベヒクル中の種々の治療投与形態で投与できる。例えば、化合物は、錠剤、カプセル（各々は時間規定放出組成物及び持続放出型組成物を含む）、丸薬、粉末、顆粒、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロップ及びエマルションなどの経口投与形態で、又は注射で投与できる。同様に、化合物はまた、静脈内（ボーラスと輸液の両方）、腹腔内、皮下、閉塞の有無の両方での局所、又は筋肉内形態で投与されうるが、全ての使用形態は製薬業界者が周知である。有効であるが非毒性量の所望の化合物を、ＤＰレセプター調節剤として投与できる。産物の１日の投与量は、１日当たり１人の患者当たり０．０１〜１０００ｍｇの広範囲で変わりうる。経口投与の場合、好ましくは、治療すべき患者に対する投与の、症状に合わせた調整のために、活性成分を０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、及び５０．０ｍｇを含む刻みめのある錠剤又は刻みめのない錠剤の形態で、組成物を投与する。通常、薬剤の有効量は、１日当たり約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与レベルである。より特定的には、投与範囲は１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。所望の効果を達成するために、ＤＰレセプターモジュレーターの投与を組合せて調整する。一方、これらの種々の薬剤は独立に最適化されえ、どちらの薬剤も単独で使用するときよりも症状がより軽くなる相乗効果を達成するために組合せうる。有利には、本発明の化合物は、１日１回投与しうるし、又は１日投与量の合計を、１日につき２回、３回又は４回に分けて投与しうる。更に、本発明の化合物は、適切な鼻内ベヒクルの局所使用を介し鼻内形態で投与できるし、又は経皮経路を介し、当業者周知の経皮皮膚パッチの形態を使用して投与できる。経皮デリバリーシステムの形態で投与するために、投与は、勿論、投与中断続的よりもむしろ連続的であろう。二つ以上の活性薬剤による組合せ治療の場合、活性薬剤が別の投与組成物中にあるときには、活性薬剤は同時に投与できるし、又は各々は、時間をずらして投与できる。本発明の化合物を使用する投与法は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別、医学的状態；治療する疾病のひどさ；投与経路；患者の腎肝機能；使用する特定の化合物を含む種々の因子に応じて選択される。通常の技術を有する医師又は獣医ならば、病気の進行を防止し、反撃し、又は阻止するのに必要な有効量の薬剤を決定し、処方することが容易にできる。毒性がなく効果的な範囲の薬剤濃度を達成することを最適に決定するには、標的部位への薬剤利用性のキネティクスに基づいた投与法が必要である。このことには、薬剤の分布、平衡、除去を考慮することが必要である。本発明の方法において、本明細書で詳細に記載した化合物は活性成分を形成でき、投与の意図した形態、即ち経口錠剤、カプセル、エリキシル剤、シロップなどに関し適切に選択され、通常の製剤実務と一致する適切な医薬希釈剤、賦形剤、又は担体（本明細書では集合的に“担体”物質という）と混和して投与されるのが典型的である。例えば、錠剤又はカプセルの形態での経口投与の場合、活性薬剤成分を、エタノール、グリセロール、水などの経口、非毒性の医薬として許容可能な不活性の担体と一緒にできる。更に、所望又は必要ならば、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、及び着色剤も混合物に導入できる。適切な結合剤には澱粉、ゼラチン、グルコース又はβ−ラクトースなどの天然の糖、トウモロコシ甘味料、アカシア・トラガカント・アルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成のゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどがあるがそれらに限定されない。これらの投与形態で使用される潤滑剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどがあるがそれらに限定されない。崩壊剤には澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴムなどがあるがそれらに限定されない。液体形態の場合、活性薬剤成分を、例えばトラガカント、アカシア、メチルセルロースなどの合成ゴム及び天然ゴムのような適切にフレーバーのある懸濁剤又は分散剤と一緒にできる。使用できる他の分散剤にはグリセリンなどがある。非経口投与の場合、滅菌懸濁液及び滅菌溶液が望ましい。静脈注射が望まれるときには、一般的に適切な保存剤を含む等張の製剤が望ましい。活性薬剤成分を含む局所用製剤は、当業界周知の種々の担体物質、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥ油、無機油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなどと混和され、例えばアルコール溶液、局所クレンザー、クレンジングクリーム、スキンゲル、スキンローション、及びクリーム組成物又はゲル組成物中のシャンプーを形成できる。本発明の化合物はまた、リポソームデリバリーシステムの形態で、例えば小さな単ラメラ小胞、大きな単ラメラ小胞、多重ラメラ小胞などの形態で投与されうる。リポソームは種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンから形成できる。本発明の化合物分子が結合する個々の担体としてモノクローナル抗体の使用により、本発明の化合物は送達されることもできる。本発明の化合物はまた、標的に向けられる薬剤担体として可溶性ポリマーと結合できる。このようなポリマーとして、ポリビニル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、又はパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを挙げることができる。更に、本発明の化合物は、薬剤の放出制御を達成するのに有用な生分解性ポリマーの一群、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクリレート及びヒドロゲルの架橋性又は両親媒性ブロックコポリマーと結合できる。動物で使用する場合、化合物は、経口的、注射的、又は液体剤もしくはシャンプーとして局所的に内部に投与できる。経口投与の場合、化合物は、カプセル、錠剤、もしくはボーラス形態で投与されうるし、又は動物飼料に混合することができる。カプセル、錠剤、及びボーラスは、澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウム、又はリン酸二カルシウムなどの適切な担体ベヒクルと組み合わせた活性成分からなる。これらの単位投与形態は、均一な混合物が得られるように、希釈剤、充填剤、崩壊剤、及び／又は結合剤を含む適切な細かい粉末の不活性成分と活性成分をよく混合して製造される。不活性成分とは、化合物と反応しないが、治療する動物に非毒性のものである。適切な不活性成分には、澱粉、乳糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物ゴム及び植物油などがある。これらの組成物は、治療する動物種のサイズ及びタイプ並びに感染のタイプ及び程度などの多数の因子によって、活性成分及び不活性成分のかなり変わりうる量を含みうる。活性成分はまた、化合物を飼料と単純に混合することによって、又は化合物を飼料の表面に付けることによって飼料への添加物として投与されうる。あるいは、活性成分は不活性担体と混合され、得られる組成物を飼料と混合しうるし、又は直接動物に投与しうる。適切な不活性担体には、コーンミール、柑橘類ミール、発酵残渣、大豆粉、乾燥穀粒などがある。最終的組成物が活性成分を０.００１〜５重量％含むように、活性成分を、粉ひき、攪拌、すり砕き、又はごちゃごちゃにすることによって不活性担体とよく混合する。あるいは、化合物は、不活性液体担体中に溶解された活性成分からなる組成物の注入によって非経口的に投与されうる。注入は、筋肉内、ルーメン内、気管内、又は皮下でありうる。注射組成物は適切な不活性液体担体と混合した活性成分からなる。許容できる液体担体には、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油などの植物油及びソルケタール、グリセロールフォーマルなどの有機油などがある。代りに、水性非経口組成物も使用しうる。植物油は好適な液体担体である。最終組成物が活性成分を０．００５〜１０重量％含むように、液体担体中に活性成分を溶解又は懸濁させて、組成物を製造する。化合物の局所投与は、水溶液又は懸濁液として本化合物を含む液体剤又はシャンプーを使用することによって可能である。一般的に、これらの組成物はベントナイトなどの懸濁剤を含み、通常また消泡剤を含むであろう。活性成分を０．００５〜１０重量％含む組成物は許容できる。好適な組成物は、本化合物を０．０１〜５重量％含む組成物である。化合物は主に、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、及び家禽などの家畜動物におけるＤＰレセプター媒介疾患の治療及び／又は予防用の薬剤として有用である。このようなＤＰレセプター媒介疾患の治療において、化合物を個々に使用しうるし、又は互いに、もしくは他の無関係の薬剤と組合せて使用しうる。最良の結果をうるために必要な化合物の投与量は、動物の種及びサイズ、感染のタイプ及び程度、投与方法、及び使用化合物などの幾つかの因子による。動物体重１ｋｇ当たり０.０００５〜１０ｍｇの投与レベルでの化合物の経口投与は、１回の投与でも数日間はなれた数回投与でも一般的に良好な結果になる。これらの化合物の、動物への投与技術は、獣医には公知である。以下の実施例は、本発明の実例を示す目的のためであり、本発明を実施例に限定するものではない。実施例１ＤＰｃＤＮＡのクローニングヒトＤＰプロスタノイドレセプターをクローンするために、下記のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用い、マウスＤＰレセプターＤＮＡプローブを最初に産生させた。成宮周博士、京都大学、日本、the 9^th International Conference o n Prostaglanjins and Related Compounds,フローレンス、イタリー、1994年６月６日−10日、によって提出され、次いで出版された（Hirata M.ら、PNAS 91:1 1192-11196，1994）マウスＤＰレセプターアミノ酸配列に基づき、２種の縮重オリゴヌクレオチドが合成された（Research Genetics，Cambridge，Mass.）。５ ′センスオリゴヌクレオチド［５′−ＡＴＧＡＡ（Ｔ，Ｃ）ＧＡ（Ｇ，Ａ）（Ｔ，Ａ）（Ｇ，Ｃ）ＩＴＡ（Ｔ，Ｃ）（Ａ，Ｃ）ＧＩＴＧ（Ｔ，Ｃ）ＣＡ−３′］（配列番号１）は最初の８個のアミノ酸に基づき、３′アンチセンスオリゴヌクレオチド［５′−ＡＡ（Ｇ，Ａ）ＣＡＣＣＡＩＧＴＩＣＣＩＧＧ（Ｇ，Ａ）ＣＡ（Ｇ，Ａ）ＴＡ（Ｔ，Ｃ）ＴＧ−３′］（配列番号２）は、マウスＤＰレセプターの推定膜貫通ドメイン IV の直後の９個のアミノ酸に基づいた。オリゴヌクレオチドを使用し、鋳型としてマウスゲノムＤＮＡを用い５４９塩基対フラグメントを増幅させた。アガロースゲルからフラグメントを単離し、そのフラグメントを³²Ｐで標識し、それを使用し、標準的技術(Sambrookら、1989 Molecular Cloning: A Laborator y Manual,2^ndEd.,Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.) を使用してヒトゲノムライブラリー（Clontech，Palo Alto，CA）をスクリーニングした。陽性ファージクローンをプラーク精製し、プレートライゼート法（Sa mbrookら、1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2^ndEd.，Cold Spri ng Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.）でＤＮＡを調製した。ファージＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、得られた３ｋｂフラグメント（遺伝子の５′末端をコードする）をブルースクリプトベクターｐＫＳ（Stratagene ，La Jolla，CA）にサブクローンした。ＡＢＩ自動配列決定機を使用し、ＫＳ及びＳＫプライマー、又は両鎖の決定配列由来のプライマーを用いて、ＤＮＡの最初の１．５ｋｂを配列決定した。この配列は、６番目の膜貫通ドメインの末端のイントロンまでのコード領域の５′末端を含むことが知見された。ブルースクリプトベクターｐＫＳに４．５ｋｂＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてサブクローンされたゲノムクローンの３′末端を配列決定し、その３′末端は、６番目の膜貫通ドメインの末端から７番目の膜貫通ドメインの末端までのコード領域を含むことが知見された。それ故、失われた３′コード領域を得るために、ヒト小腸ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）で３′ＲＡＣＥ−ＰＣＲを行った。完全長コードｃＤＮＡを以下のように構築した。ゲノムクローンからの５′末端とＲＡＣＥ−ＰＣＲからの３′末端を共通のＰＳｔＩ部位で連結し、ブルースクリプトベクターｐＫＳにサブクローンした。ｈＤＰレセプターのヌクレオチド配列を図１に示す。コードされたタンパク質のアミノ酸配列を図２に示す。１．２ｋｂフラグメント（ＤＰ；図１）は他の全てのプロスタノイドレセプターとある程度の配列相同性を含むことが知見され、Ｇタンパク質共役レセプターの推定の６個のヘリックス配置の特徴が明白であった。約３５９アミノ酸ポリペプチドをコードする長い読取り枠（約１０８０ｂｐ）を同定し、予測された相対的分子量は約４０，２７６であった。実施例２ｐｃＤＮＡ３−ｈＤＰ及びＣＥＰ４−ｈＤＰ哺乳動物発現ベクターの構築ＮｏｔＩとＸｈｏＩによるｐＫＳ−ｈＤＰの消化により、１．２ｋｂｃＤＮＡを得、それをｐｃＤＮＡ３又はｐＣＥＰ４（哺乳動物発現ベクター（Invitrog en，San Diego，CA））の同一部位にサブクローンした。正しい方向性をＢｇｌI I で証明した。実施例３ＤＰｃＤＮＡのE.coli発現ベクターへのクローニングＤＰ発現カセットのE.coli発現ベクター（ｐＥＴシリーズ（Novagen）を含むがそれに限定されない）への移入後、組換えＤＰをE.coliで産生させる。ｐＥＴベクターは、強く制御されたバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下にＤＰ発現を置く。誘導性ｌａｃプロモーターによって御せられるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを有するE.coli宿主へこの構築物を移入した後、適切なｌａｃ基質（ＩＰＴＧ）を培養液に加えると、ＤＰ発現が誘導される。発現されたＤＰのレベルは上記アッセイにより決定される。ＤＰの完全な読取り枠をコードするｃＤＮＡをｐＥＴ１１ａのＮｄｅＩ部位に挿入する。正しい方向性の構築物を、配列分析で同定し、それを使用して発現宿主株ＢＬ２１を形質転換する。その後、形質転換体を使用し、培養液に植菌し、ＤＰタンパク質を産生させる。Ｍ９又はＺＢ培地で増殖できるが、その組成は当業者公知である。約ＯＤ₆₀₀＝１．５に生育後、ＤＰ発現を１ｍＭＩＰＴＧを用い、３７℃で３時間誘導させる。ＤＰレセプター結合活性は、これらの細胞からの膜分画に見出されるであろう。実施例４アフリカツメガエル卵母細胞への微量注入による合成ＤＰｍＲＮＡのin vivo 翻訳及び哺乳動物細胞での発現ＤＰｃＤＮＡ構築物を、in vitro転写ベクター（ｐＧＥＭシリーズ、Promeg a）に連結させ、合成ｍＲＮＡを産生させる。バクテリオファージプロモーターを含むプラスミドベクターにＤＰｍＲＮＡをコードする二重鎖ＤＮＡをクローニングし、クローン化ＤＰコードＤＮＡを含むプラスミドベクターを線状化し、プラスミドベクター上でバクテリオファージプロモーターを特異的に認識する、バクテリオファージ由来ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、in vitroでクローン化ＤＮＡを転写することによって、合成ｍＲＮＡをin vitroで十分量産生させる。バクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるバクテリオファージプロモーターを含む種々のプラスミドベクターが利用できる。これらのプラスミドには、ｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＳＰ７０、ｐＳＰ７１、ｐＳＰ７２、ｐＳＰ７３、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭ−４Ｚ、ｐＧＥＭ−３Ｚｆ、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ、ｐＧＥＭ−９Ｚｆ、及びｐＧＥＭ−１１Ｚｆがあるがそれらに限定されない。プラスミドの完全なシリーズはPromegaから市販されている。ＤＰＤＮＡをクローニングするために便利で適切な、ベクター上の一つ以上の利用できる制限エンドヌクレアーゼクローニング部位を用いて、適切な方向性で、バクテリオファージプロモーター含有ベクターに二重鎖のＤＰコードＤＮＡをクローンする。連結ＤＰＤＮＡを含むベクターを使用して、細菌を形質転換し、クローン化された単離株での、適切な方向性でＤＰＤＮＡを有するベクターの存在を分析する。適切な方向性でＤＰコードＤＮＡを含むベクターが同定され、単離されると、ＤＰ転写単位から下流の部位で、ＤＰ転写単位を破壊することなく、制限エンドヌクレアーゼによる切断で、そのベクターを線状化する。線状化したプラスミドを単離精製し、ＤＰｍＲＮＡのin vitro転写の鋳型として使用する。その後、鋳型ＤＮＡを反応混合液中でバクテリオファージ特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと混合する。そのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ鋳型を転写し、ＤＰｍＲＮＡを生成させる。Ｔ３、Ｔ７、及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを含むがそれらに限定されない、幾つかのバクテリオファージ特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが利用できる。その後、合成ＤＰｍＲＮＡを単離精製する。ｍＲＮＡ安定性を改善するために、５′末端キャップ構造と３′ポリＡテールを含むｍＲＮＡを合成することは利点がありうる。ＤＮＡ鋳型と共に反応混合液に７−メチルグアノシンをただ加えるだけで、キャップ構造、即ち７−メチルグアノシンを、ｍＲＮＡの５′末端に導入できる。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはｍＲＮＡを合成するとき、それは、５′ 末端にキャップ構造を導入する。ポリＡテールは多数のｃＤＮＡ中にもともと在ることがわかっているが、ＤＮＡ鋳型の３′末端にポリＡテールコードＤＮＡ配列をただ挿入するだけでｍＲＮＡの３′末端に加えることができる。単離精製ＤＰｍＲＮＡは、ウサギ網状赤血球ライゼート及びコムギ胚芽抽出液（両方ともPromegaとNew England Nuclearから市販されている）を含むがそれらに限定されない、無細胞システム、又はアフリカツメガエル卵母細胞への微量注入を含むがそれに限定されない、無細胞システムを用いて翻訳される。アフリカツメガエル卵母細胞への微量注入が好ましい。アフリカツメガエル卵母細胞に、十分量の合成ＤＰｍＲＮＡを微量注入し、ＤＰタンパク質を産生させる。微量注入された卵母細胞をインキュベートし、ＤＰｍＲＮＡを翻訳させ、ＤＰタンパク質を生成させる。これらの合成ｍＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞（ステージ５−６）に標準的方法で注入する（Gurdon,J.B.及びWickens,M.D．Methods in Enzymol．101:370-386，(1983)）。卵母細胞を回収し、下記のようにＤＰ発現を分析する。実施例５ＤＰｃＤＮＡの哺乳動物発現ベクターへのクローニングＤＰｃＤＮＡ発現カセットを、強い普遍的哺乳動物プロモーターを含む以下のベクターに適切な制限エンドヌククレアーゼ部位で連結する：ｐＢＣ１２ＢＩ（Cullen,B.R．Methods in Enzymol.152:684-704 1988）、並びにｐＥＥ１２（C ellTech EPO 338,841）及びその誘導体ｐＳＺ９０１６−１及びｐ９０１９。ｐ９０１９は、ｈＣＭＶＩＥプロモーター、ポリリンカー及びＳＶ４０ポリＡ要素、並びにＳＶ４０初期プロモーターによって御されるジヒドロ葉酸還元酵素の変異遺伝子（ｍＤＨＦＲ）（Simonsen,C.C.及びLevinson,A.D.Proc.Natl.Acad.Sci USA 80: 2495-2499(1983)）からなる選択マーカー／増幅システムを含む哺乳動物発現ベクターの構築物を表す。ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、鋳型としてｐＤ５を用いるプライマー13978-120及び139778-121(Berker及びSharp,Nucl.Acid Res.13: 841-857(1985))によって規定されるＰＣＲ反応で産生される。得られた０．２５ＫｂＰＣＲ産物を、ＣｌａＩとＳｐｅＩで消化し、同様に消化したｐＥＥ１２の６．７Ｋｂフラグメントに連結する。得られたプラスミドをＢｇｌIIとＳｆｉＩで消化し、ベクターからＳＶ４０初期プロモーターの３′部分とＧＳｃＤＮＡを除去する。プラスミドｐＦＲ４００から単離された０．７３ＫｂＳｆｉＩ−ＸｈｏIIフラグメント（Simonsen,C.C.及びLevinson,A. D．Proc．Natl．Acad．Sci USA 80: 2495-2499(1983)）を、上記５．６Ｋｂベクターに連結し、ＳＶ４０初期プロモーターを再構成し、ｍｄＨＦＲ遺伝子を挿入する。このプラスミドをｐ９０１９と命名する。ｐＳＺ９０１６−１は、ｈｕＣＭＶＩＥプロモーターの代りにＨＩＶＬＴＲへの置換を除いてｐ９０１９と同じである。このベクターは、ＸｂａＩとＭｌｕＩでｐ９０１９を消化し、ｈｕＣＭＶＩＥプロモーターを除去して構築される。残基−１１７〜＋８０（ＨＩＶ− １ＬＴＲの部分を含むベクターｐＣＤ２３（Cullen，Cell 46: 973(1986)）で見出される）のＨＩＶＬＴＲプロモーターは、５′側で産物の末端にＭｌｕＩとＳｐｅＩ制限部位が付き、３′側でＨｉｎｄIIIとＸｂａＩ部位が付いたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、プラスミドｐＣＤ２３からＰＣＲ増幅する。得られた０．２ｋｂＰＣＲ産物を酵素ＭｌｕＩとＸｂａＩで消化した後、フラグメントをアガロースゲル精製し、４．３ｋｂのプロモーターの無いＤＮＡフラグメントに連結し、ベクターｐＳＺ９０１６−１を産生させる。プロモーターに関し正の方向性でＤＰｃＤＮＡを含むカセットを、プロモーターの３′側の適切な制限部位で連結し、制限部位マッピング及び／又は配列決定により同定する。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを、以下のものを含むがそれらに限定されない種々の宿主細胞に，エレクトロポレーション又は化学的方法（カチオン性リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）を含むがそれらに限定されない標準的方法で導入する：ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１）、ＣＶ−１（Sackevitzら、Science 238: 1575(1987)）、２９３Ｌ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ６３６２）。トランスフェクトされた細胞及び細胞培養抽出物を回収し、下記のようにＤＰ発現を分析することができる。哺乳動物一過性発現のために使用するベクターの全てを用いて、ＤＰを発現する安定な細胞系列を確立できる。発現ベクターにクローンされた改変しないＤＰｃＤＮＡ構築物は、宿主細胞にＤＰタンパク質を作らせることが期待される。トランスフェクション宿主細胞は、ＣＶ−１ (Sackevitzら、Science 238:1575(1987))、ｔｋ−Ｌ（Wiglerら、Cell 11:223(1 977)）、ＮＳ／０、及びｄＨＦｒ−ＣＨＯ（Kaufman及びSharp,J.Mol.Biol．159 : 601(1982)）を含むがそれらに限定されない。ＤＰｃＤＮＡを含むベクターと以下のものを含むがそれらに限定されない薬剤選別プラスミドの共トランスフェクションは、安定にトランスフェクトされたクローンを選別させる：Ｇ４１８，アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ，ｐＬＮＣＸ（Miiler,A.D.及びRosman,G.J．Biotech News 7:980-990(1989)）；ハイグロマイシン，ハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ，ｐＬＧ９０（Gritz.L.及びDavies,J.，GENE 25:179(1983)）；ＡＰＲＴ，キサンチン− グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ，ｐＭＡＭ(Clontech)（Murrayら、 Gene 31: 233(1984)）。ＤＰのレベルは本明細書に記載のアッセイで定量される。ＤＰｃＤＮＡ構築物を、増幅できる薬剤耐性マーカーを含むベクターに転結し、最高の可能性のあるＤＰレベルを合成する哺乳動物細胞クローンを産生する。これらの構築物の細胞への導入後、プラスミド含有クローンを適切な薬剤で選別し、高コピー数のプラスミドを有する超発現クローンを、薬剤の増加してゆく投与での選別によって単離する。以下のシステムを利用する：変異ＤＨＦＲ遺伝子を含む９０１６又は９０１９プラスミド（ Simonson,C.及びLevinson,A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2495(1983)をＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、メトトレキセートで選別する；グルタミン合成酵素遺伝子を含むｐＥＥ１２プラスミドをＮＳ／Ｏ細胞にトランスフェクトし、メチオニンスルホキシミンで選別する（CellTech国際特許出願2089/10404 ）；９０１６又は他のＣＭＶプロモーターベクターを、チミジンキナーゼ遺伝子を含むｐＤＬＡＴ−３（Colbere及びGaropin,F.，Proc．Natl．Acad．Sci．76:3 755(1979)）と、ＡＰＲＴとＴＫ欠陥Ｌ細胞に共トランスフェクトし、ＡＰＲＴで選別し（０．０５ｍＭアザセリン、０．１ｍＭアデニン、４μｇ／ｍｌアデノシン）、ＨＡＴで増幅させる（１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン）。実施例６ＣＯＳ−Ｍ６細胞でのＤＰレセプターの発現及び［³Ｈ］ＰＧＤ₂結合アッセイ最近クローン化されたヒトプロスタグランジンＤ₂（ＤＰ）レセプターをｐｃＤＮＡ３プラスミド（Invitrogen）にサブクローンし、ＬｉｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（GIBCO/BRL）を用いる、カチオン性リポソーム介在ＤＮＡ移入によってＣＯＳ−Ｍ６細胞にトランスフェクトした。細胞を７２時間培養し、その後回収し、窒素キャビテーションによる細胞溶解後、分画遠心法（１０００×ｇ、１０分、それから１００，０００×ｇ、３０分）で膜を調製した。［³Ｈ］ＰＧＤ₂特異的結合アッセイを、ＫＯＨでｐＨ７．０に調製した、１．０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＭｎＣｌ₂、０．８７ｎＭ［³Ｈ］ＰＧＤ₂、１００，０００×ｇ膜分画からのタンパク質３８ｍｇを含む１０ｍＭＢＥＳ中で行った。インキュベーションを３０℃で６０分行い、洗浄緩衝液（０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭＢＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．０））中に４℃で予め浸したワットマンＧＦ／Ｂフィルターでの急速濾過によって結合と遊離放射性リガンドの分離を行った。フィルターを、洗浄緩衝液約１６ｍＬで洗浄し、フィルターに結合した残りの［³Ｈ］ＰＧＤ₂を液体シンチレーション計測で定量化した。特異的結合を、総結合と１ｍＭＰＧＤ₂の存在下で測定した非特異的結合の差として定義した。クローン化ヒトＤＰレセプターを、ＣＯＳ−Ｍ６細胞にトランスフェクトし、［³Ｈ］ＰＧＤ₂結合アッセイを、トランスフェクトした細胞から調製した膜を用いて行った。最大の有効競合リガンドはＤＰ−アゴニストＢＷ２４５Ｃであり、それはＫｉ０．９ｎＭを示した。ＰＧＤ₂とＤＰ−アンタゴニストＢＷ８６８Ｃは強力であり、それぞれＫｉは１．１ｎＭ、１．７ｎＭであった。試験した他のプロスタグランジンと関連アナログは少なくとも１００倍小さい活性であった。ＰＧＥ₂はＫｉ１０１ｎＭを示し、ＰＧＦ_2aとイロプロストは、Ｋｉ値それぞれ５１２ｎＭと６３０ｎＭの同等の活性を有した。最小の活性化合物はＴＰ選択性アゴニストＵ４６６１９であり、Ｋｉ値は約１８５２ｎＭであった。従って、ヒトＤＰレセプターに対するプロスタグランジン及び関連合成アナログのアフィニティのランク順序は、ＢＷ２４５Ｃ＞ＰＧＤ₂＞ＢＷ８６８Ｃ＞ＰＧＥ₂＞ＰＧＦ_2a＝イロプロスト＞Ｕ４６６１９であった。効果のこのランク順序は、以前の薬理学研究からＤＰレセプターで予測されていた。実施例７ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞でのＤＰレセプターの発現及びｃＡＭＰアッセイ最近クローン化されたヒトプロスタグランジンＤ₂（ＤＰ）レセプターをｐＣＥＰ４プラスミド（Invitrogen）にサブクローンし、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ^TM（Gibco/BRL）試薬を用いるカチオン性リポソーム介在ＤＮＡ移入によってＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）にトランスフェクトした。トランスフェクション後、４８時間細胞培養し、次にトリプシン処理し、希釈し、２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（Calbiochem）の存在下のプレートに再度置き、トランスフェクトされた細胞を選別した。ＤＰレセプター発現細胞の均一な集団を確保するために、細胞を３週間選別下に維持した。アゴニスト刺激(challenge)後の細胞内ｃＡＭＰ産生の増加を、ＤＰレセプター発現ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞と対照ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞で実験した。酵素を含まない細胞解離緩衝液（Gibco/BL）中のインキュベーションにより、細胞を約８０％集密度のときに回収し、ＨＥＰＥＳ緩衝化クレブス−リンゲル溶液（１．２５ｍＭＭｇＳＯ₄、１．５ｍＭＣａＣｌ₂、５ｍＭＫＣｌ，１２４ｍＭＮａＣｌ、８ｍＭグルコース、１．２５ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、２５ｍＭＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４））で一度洗浄し、同緩衝液に再懸濁した。ｃＡＭＰアッセイを、ＨＥＰＥＳ緩衝化クレブス−リンゲル溶液及びｃＡＭＰの加水分解を防止するための１００μＭホスホジエステラーゼタイプ IV 阻害剤ＲＯ −２０−１７２４（Biomol）からなる溶液の最終容量０．２ｍＬで行った。ジメチルスルホキシド又はエタノール中のＲＯ−２０−１７２４と評価すべき化合物をインキュベーション混合液に加えた。最終ベヒクル濃度は０．３５％（ｖ／ｖ）であり、それを全てのサンプルで一定にした。インキュベーション当たり１．５×１０⁵細胞の添加で反応を開始させた。サンプルを３７℃で１５分インキュベートし、その後、サンプルを沸騰水に３分間浸して反応を停止させた。細胞生存率は、トリパンブルー排除法で測定して常に９６％以上であった。ｃＡＭＰの測定は、［¹²⁵Ｉ］ｃＡＭＰ（Amersham International）を使用する放射性免疫アッセイで行った。ｃＡＭＰ産生は、ＤＰレセプターを発現しているＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）におけるプロスタノイド及び関連合成アナログの刺激後測定された。ＤＰ選択性アゴニストＢＷ２４５Ｃは、細胞内ｃＡＭＰ産生を増加させる最強力の化合物であり、そのＥＣ₅₀は０．６ｎＭであった。ＰＧＤ₂は１０倍少ない活性を有し、そのＥＣ₅₀値は６．４ｎＭであった。ＤＰ選択的アンタゴニストと推定されるＢＷＡ８６８Ｃは、最大１μＭの濃度で最低のｃＡＭＰ産生増加を示した（２０ｐｍｏｌｃＡＭＰ／１．５×１０⁵細胞対＞１４０ｐｍｏｌｃＡＭＰ／１．５ ×１０⁵細胞（ＰＧＤ₂の場合））。ＰＧＥ₂、ＰＧＥ₁、安定なプロスタサイクリン擬似物イロプロスト、及びトロンボキサンアナログＵ４６６１９は全て５００ｎＭ以上のＥＣ₅₀値を有した。それ故、プロスタグランジン及び関連合成アナログの効力のランク順序は、ＢＷ２４５Ｃ＞ＰＧＤ₂＞＞ＰＧＥ₂＞ＰＧＥ₁＞ＰＧＦ₂ _α＞イロプロスト＝Ｕ４６６１９であった。この効力のランク順序は、以前の薬理学研究からＤＰレセプターについて予測されていた（Colemanら、1994，上記）。対照ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞で試験した全てのプロスタノイド及び合成アナログのうちで、ＰＧＥ₂又はＰＧＥ₁（１μＭ）による刺激だけが６ｐｍｏｌ／１．５×１０⁵細胞のｃＡＭＰ産生増加を示し、同様に刺激されたＤＰ発現ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞で検出されたのより１４倍活性が小さかった。対照細胞で見られるこの増加は、内因性プロスタノイドレセプターの活性化の結果であるらしい。実施例８ＤＰレセプターを発現しているＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞における細胞内カルシウムアッセイＤＰ−ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）安定細胞系列と対照ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞の両方で、細胞内カルシウム［Ｃａ²⁺］_i測定を行った。細胞を、無酵素細胞解離緩衝液で集め、３００×ｇ、５分、２２℃の遠心分離で回収し、Ｇ４１８もハイグロマイシンＢも含まないＤＭＥＭ生育培地中に２×１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁させた。細胞を、２μＭフラ−２ＡＭと共に３７℃、６％ＣＯ₂、４５分間でインキュベートした。非導入フラ−２ＡＭを、ＨＢＳＳ（１．３ｍＭＣａＣｌ₂、５ｍＭＫＣｌ、０．３ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、０．９ｍＭＭｇＣｌ₂、１３８ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＮａＨＣＯ₃、０．３ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、５．６ｍＭＤ−グルコース）で３回洗浄し、３００×ｇ、５分、２２℃の遠心分離で除去した。その後、細胞をＨＢＳＳ中最終濃度１０⁶細胞／ｍＬで再懸濁させた。本質的に（Chanら、1994，Journ al of Pharmacology and Experimental Therapeutics 269(3): 891-896）に記載の通り、パーキンエルマーＬＳ−５分光光度計を用いて、２×１０⁶フラ−２ＡＭ負荷細胞に対するアゴニスト刺激後、［Ｃａ²⁺］_iを測定した。１０〜１０００ｎＭＰＧＤ₂の添加により、濃度依存性にＤＰレセプター発現ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞でのカルシウム移動が増加した。１０ｎＭ未満の濃度では、ベヒクルとは実質的に異なる反応を誘導できなかった。対照細胞への１０００ｎＭＰＧＤ₂の添加によって、ＤＰレセプターを介する［Ｃａ²⁺］_i 増加を証明する［Ｃａ²⁺］_iの変化をなんら引起さなかった。各実験の最後で細胞は生存していた。このことは、０．５μＭカルシウムイオノフォアイオノマイシンによる刺激で観察された［Ｃａ²⁺］_iの大きな増加、次に１ｍＭＥＤＴＡ添加に対する［Ｃａ²⁺］_i反応の抑制によってモニターされた。実施例９昆虫細胞での発現のためのバキュロウイルス発現ベクターへのＤＰｃＤＮＡのクローニングＡｃＮＰＶウイルスゲノム由来バキュロウイルスベクターを、昆虫細胞のＳｆ９系列（ＡＴＣＣＣＲＬ＃１７１１）でのｃＤＮＡの高レベル発現ができるように設計する。ＤＰｃＤＮＡ発現組換えバキュロウイルスを、以下の標準的方法（InVitrogen Maxbac Manual）で産生する：ｐＡＣ３６０及びｐＢｌｕｅＢａｃベクター（InVitrogen）などの種々のバキュロウイルストランスファーベクターにおけるポリヘドリンプロモーターの下流にＤＰｃＤＮＡ構築物を連結する。組換えバキュロウイルスは、バキュロウイルストランスファーベクターと線状化ＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡの、Ｓｆ９細胞への共トランスフェクション後の相同組換えによって産生される（Kitts，P.A.，Nuc.Acid.Res．18:5667(1990)）。組換えｐＡＣ３６０ウイルスを感染細胞での封入体が無いことによって同定し（Su mmers,M.D.及びSmith,G.E.，Texas Agriculture Exp.Station Bulletin No.1555 ）、組換えｐＢｌｕｅＢａｃウイルスをβ−ガラクトシダーゼ発現を基に同定する（Vialardら、 1990，J.Virol.，64，pp37-50）。プラーク精製及びＤＰ組換えバキュロウイルスによるＳｆ９細胞の感染後、ＤＰ発現を、上記アッセイで測定する。ＤＰの完全な読取り枠をコードするｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅＢａｃIIのＢａｍＨＩ部位に挿入する。ポリヘドロンプロモーターに関し正の方向性の構築物を配列分析によって同定し、それを使用して線状ＡｃＮＰＶ野生型ＤＮＡの存在下Ｓｆ９細胞にトランスフェクトする。真正の活性ＤＰは、感染細胞の膜に結合しているのが知見される。膜調製物を、標準的方法で感染細胞から調製する。実施例１０ＤＰｃＤＮＡの酵母発現ベクターへのクローニング異種タンパク質の細胞内発現をさせるように設計した発現ベクターに、最適ＤＰｃＤＮＡ構築物を挿入した後、組換えＤＰを、酵母S.cerevisiae で産生させる。細胞内発現のために、ＥｍＢＬｙｅｘ４などのベクターを、ＤＰシストロンに連結させる（Rinas,U.ら、Biotechnology 8:543-545(1990)；Horowitz B.ら、J.Biol.Chem．265: 4189-4192(1989)）。発現ＤＰのレベルを上記アッセイで測定する。実施例１１組換えＤＰの精製組換え産生ＤＰを抗体アフィニティクロマトグラフィーで精製できる。ＤＰ抗体アフィニティカラムは、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで前もって活性化されたゲル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Biorad）に抗ＤＰ抗体を添加することによって作製される。抗体を、スペーサーアームを有するアミド結合を介しゲルに結合させる。それから残っている活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で消去する。カラムを、水、０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄し、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。その後、カラムを、界面活性剤などの適切な膜可溶化剤と共にリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．３）に平衡化し、可溶化ＤＰを含む細胞培養液上清又は細胞抽出液をカラムにゆっくりと通す。その後、カラムを、リン酸緩衝化生理食塩水プラス界面活性剤で、光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンドになるまで洗浄し、その後タンパク質を０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）プラス界面活性剤で溶出する。その後精製ＤＰタンパク質をリン酸緩衝化生理食塩水プラス界面活性剤に対し透析する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年２月１１日【補正内容】請求の範囲１．配列番号３を有する単離精製されたヒトプロスタグランジンＤＰレセプターであって、該ヒトプロスタグランジンＤＰレセプターが特異的にプロスタグランジンＤ₂と結合することを特徴とするレセプター。２．アミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の単離精製されたプロスタグランジンＤＰレセプタータンパク質。３．請求項２に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とするヒトプロスタグランジンＤＰレセプタータンパク質をコードする単離精製されたＤＮＡ分子。４．ヌクレオチド配列を有することを特徴とする、ヒトプロスタグランジンＤＰレセプタータンパク質をコードする単離精製されたＤＮＡ分子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ // Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ボワ，イブカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者メタース，キヤスリーンカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者ソーヤー，ニコルカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者スリペツツ，デボラ・エムカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711

Claims

【特許請求の範囲】１．単離精製されたヒトプロスタグランジンＤＰレセプターであって、該レセプターが特異的にプロスタグランジンと結合することを特徴とするレセプター。２．アミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の単離精製されたプロスタグランジンＤＰレセプタータンパク質。３．請求項２に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とするヒトプロスタグランジンＤＰレセプタータンパク質をコードする単離精製されたＤＮＡ分子。４．ヌクレオチド配列を有することを特徴とする、ヒトプロスタグランジンＤＰレセプタータンパク質をコードする単離精製されたＤＮＡ分子。５．組換え宿主細胞におけるヒトプロスタグランジンＤＰレセプタータンパク質の発現のための発現ベクターであって、該発現ベクターが請求項４に記載のＤＮＡ分子を含むことを特徴とする発現ベクター。６．組換えヒトプロスタグランジンＤＰレセプタータンパク質を発現する宿主細胞であって、該宿主細胞が請求項５に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。７．組換え宿主細胞でのヒトプロスタグランジンＤＰレセプタータンパク質の発現方法であって、（ａ）適切な宿主細胞に請求項５に記載の発現ベクターをトランスフェクトすること；及び（ｂ）発現ベクターからヒトプロスタグランジンＤＰレセプタータンパク質を発現させることができる条件下で、ステップ（ａ）に記載の宿主細胞を培養すること；を含むことを特徴とする方法。８．ヒトプロスタグランジンＤＰレセプター活性のモジュレーターの同定方法であって、（ａ）プロスタグランジンレセプター活性のモジュレーターを、請求項２に記載のアミノ酸配列を有するプロスタグランジンレセプターの全部又は一部と混合すること；及び（ｂ）プロスタグランジンレセプターに対するモジュレーターの効果を測定すること；を含むことを特徴とする方法。９．請求項１に記載のアミノ酸配列を有するヒトプロスタグランジンＤＰレセプタータンパク質に特異的に結合する抗体。１０．請求項２に記載のアミノ酸配列を有するヒトプロスタグランジンＤＰレセプタータンパク質に特異的に結合する抗体。