JP3228751B2 - プロスタグランジン受容体ｆｐ及び該受容体をコードするｄｎａ - Google Patents
プロスタグランジン受容体ｆｐ及び該受容体をコードするｄｎａInfo
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Description
発明の背景 プロスタグランジン（PG）Ｆ２αの生理的作用は、プ
ロスタグランジンＦ２α（FP）受容体との相互作用を介
して発揮される。この受容体はこれまでに単離又は精製
されていない。FPをコードするDNA及びFP受容体タンパ
ク質のアミノ酸配列も知られていなかった。FP受容体は
通常、ヒト及び他の動物の小腸、黄体、胎盤、卵巣、
脳、子宮筋層、肺、腎臓、胃、筋肉、目、子宮及び気管
を含む広範な細胞上に存在する。FP受容体タンパク質が
プロスタグランジンと結合すると、細胞内カルシウムの
濃度が増加する。組織はこのシグナルに基づいて例えば
筋肉収縮により応答し、目では間接的に眼圧が低下す
る。PGF２αは強力な黄体分解剤（luteolytic agent）
であるため、主に黄体組織を使用してPGF２α結合部位
（FP受容体）の研究が実施されてきた［Powellら,1974
Lancet,１,pp.1120;Powello,1974,Eur.J.Biochem.,4
1,pp.103−107］。EP受容体の機能活性は、ウサギの空
腸並びにネコ、去勢雄ウシ及びイヌの虹彩括約筋組織の
ような組織調製物を用いて研究されてきた［Dong及びJo
nes,1982,Br.J.Pharmac.,76,pp.149−155;Welburm及びJ
ones,1978,Prostaglandins,15,pp.287］。FP受容体の活
性を調べるための前述の方法は、異なるリガンド結合特
性を有する、互いに異なるが相関している複数の受容体
集団を含む組織調製物を必要とし、従って絶対的能力及
び選択性が得られないため、不都合な点がある。また、
組織のFP受容体含量が極めて低く、且つ組織試料が必要
とされるため、各化合物のヒトFP受容体に対する作用物
質としての性能を十分に検査することができない。 発明の概要 FPと称する新規のプロスタグランジン受容体タンパク
質がヒト細胞から同定された。完全長FPタンパク質をコ
ードするDNA分子を単離し、精製し、ヌクレオチド配列
を決定した。FPをコードするDNAを発現ベクター内にク
ローニングし、これらの発現ベクターを組換え宿主細胞
内に導入すると、組換え宿主細胞が機能的FP受容体タン
パク質を発現した。これらの新規のFPタンパク質、FPを
コードするDNA、組換えFPを発現する発現ベクター及び
組換え宿主細胞は、FP受容体活性の調節因子の選定に有
用である。 組換えFP発現宿主細胞を使用するFP受容体調節因子の
同定方法も開示する。FP活性調節因子は、プロスタグラ
ンジン関連疾患の治療及びFP受容体に対するプロスタグ
ランジンの作用の調節に有用である。 図面の簡単な説明 第１図Ａ及びＢは、FP受容体タンパク質をコードする
DNAの完全配列を示している。 第２図は、FP受容体タンパク質の推定アミノ酸完全配
列を示している。 第３図Ａ及び第３図Ｂは、FP−cDNAを注入したアフリ
カツメガエル卵母細胞内でのプロスタグランジンＦ２α
受容体の発現を示している。第３図A:20nM PGF２αの
浴潅流（bath perfusion）で生起した内向Ca2+依存Cl-
流（下方への偏位として示される）。第３図B:10nMのフ
ルプロステノール（fluprostenol）の浴潅流で生起した
内向Ca2+依存Cl-流（下方への偏位として示される）。
卵母細胞には1ngのFP cDNAを注入し、−60mVに電圧を
固定した。 第４図Ａ〜Ｃは、組換えFP受容体を発現するエクオリ
ン導入卵母細胞内でのPGF２α誘発光応答であり、各PGF
２α濃度で検査した５個の卵母細胞の個々の応答を重ね
合わせて示している。10秒の時点で記録キュベット内に
リガンドを加えた。エクオリン発光は相対単位で示され
ており、バックグラウンド発光は典型的には0.5〜0.7単
位である。 第５図は、種々の濃度のPGF２α、フルプロステノー
ル及びPGE2で生起した光応答の平均値を示している。各
縦グラフは同一ドナーに由来する５個の卵母細胞の応答
の平均値を示し、各縦グラフの上方の数字は応答する卵
母細胞の数を示している。別の５匹のドナーに由来する
卵母細胞についても類似の結果が得られた。 第６図は、pcDNAIamp−hFPトランスフェクションCOS
−M6膜への［3H］PGF２αの特異的結合の競合を示して
いる。［3H］PGF２α結合アッセイは、0.03nM〜10μＭ
PGF2（■）、フルプロステノール（●）、PGD
2（□）、PGE2（○）、U46619（△）及びイロプロスト
（iloprost）（◇）の存在下で、「方法」の説明に記載
のように実施した。 発明の詳細な説明 本発明は、FPとここに命名する新規のプロスタグラン
ジン受容体をコードするcDNAに関する。本発明は、組換
え発現プラスミド内に含まれているクローン化FPコーデ
ィングDNAを発現する組換え宿主細胞にも関する。本発
明は、FP受容体活性を調節する物質のスクリーニング方
法にも関する。本発明のDNAは、FP産生細胞から単離さ
れる。本明細書で使用するFPという用語は、プロスタグ
ランジン分子に特異的に結合できるＧタンパク質結合受
容体を意味する。 FPを産生することができる哺乳動物細胞の非限定的具
体例としては、小腸、腎臓、胃、筋肉、目、胎盤、子宮
及び気管に由来する細胞が挙げられる。FPを産生する形
質転換哺乳動物細胞系の非限定的具体例としては、3T3
線維芽細胞が挙げられる。本発明のために好ましい細胞
は例えばヒト正常腎臓細胞及び胎盤細胞であり、最も好
ましい細胞はヒト黄体細胞である。 他の細胞及び細胞系もFPcDNAの単離に使用するのに適
当であり得る。適当な細胞の選択は、細胞表面のFPのス
クリーニングによって実施し得る。FP活性検出方法は当
業者によく知られており、受容体に特異的な放射性標識
リガンドの結合を測定する。このアッセイでFP活性を示
す細胞は、FPcDNAの単離に適当であり得る。 FPcDNAのクローニングには、種々の方法のうちの任意
のものを使用し得る。これらの方法の非限定的具体例と
しては、適当な発現ベクター系内でFP含有cDNAライブラ
リーを構築した後、FPcDNAを直接機能発現させる方法が
挙げられる。別の方法として、バクテリオファージ又は
プラスミドシャトルベクター内で構築したFP含有cDNAラ
イブラリーを、FPタンパク質のアミノ酸配列から設計し
た標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングす
る方法もある。好ましい方法は、バクテリオファージ又
はプラスミドシャトルベクター内で構築したFP含有cDNA
ライブラリーを、FPタンパク質をコードする部分的cDNA
でスクリーニングすることからなる。前記部分的cDNA
は、プロスタグランジンFP受容体と相関している別のＧ
タンパク質結合受容体について知られているアミノ酸配
列から縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計して、
FP DNAフラグメントの特異的PCR増幅を行うことにより
得る。 当業者には容易に理解されるように、別の種類のライ
ブラリー、並びに別の細胞もしくは細胞種類から構築し
たライブラリーも、FPをコードするDNAの単離に有用で
あり得る。別の種類のライブラリーの非限定的具体例と
しては、別の細胞又は細胞系に由来するcDNAライブラリ
ー、及びゲノムDNAライブラリーが挙げられる。 当業者には明らかなように、適当なcDNAライブラリー
は、FP活性を有する細胞又は細胞系から製造し得る。FP
cDNAを単離するためのcDNAライブラリーの製造で使用す
る細胞又は細胞系の選択は、本発明で使用する前述の公
知の標識リガンド結合アッセイを用いて、事前に細胞結
合FP活性を測定することにより実施し得る。 cDNAライブラリーの製造は、当業者によく知られてい
る標準的方法で実施できる。よく知られているcDNAライ
ブラリー構築方法は、例えばManiatis,T.,Fritsch,E.
F.,Sambrook,J.,Molecular Cloning:A Laboratory M
anual（Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spri
ng Harbor,New York,1982）に記載されている。 これも当業者には明らかであろうが、FPをコードする
DNAは適当なゲノムDNAライブラリーからも単離し得る。
ゲノムDNAライブラリーの構築は、当業者によく知られ
ている標準的方法で実施できる。よく知られているゲノ
ムDNAライブラリー構築方法は、例えばManiatisらの前
出の文献に記載されている。 好ましい方法のいずれかによってFP遺伝子をクローニ
ングするためには、FP又は相同タンパク質のアミノ酸配
列又はDNA配列の情報が必要である。そのためには、FP
タンパク質又は相同タンパク質を精製し、自動配列決定
器で部分的アミノ酸配列を決定し得る。完全長のアミノ
酸配列を決定する必要はなく、部分的FP DNA断片のPCR
増幅のためには、アミノ酸６〜８個分の二つの領域の直
鎖配列を決定するとよい。 適当なアミノ酸配列が同定されたら、これらをコード
することができるDNA配列を合成する。遺伝子コードは
縮重であるため、特定のアミノ酸をコードするため２個
以上のコドンを使用し得ることがあり、従ってアミノ酸
配列は、一組の類似のDNAオリゴヌクレオチドのうちの
いずれかでコードされる。前記一組のDNAオリゴヌクレ
オチドのうち一つだけがFP配列と同じであるが、その組
の残りも不適正状態を伴うものの、DNAオリゴヌクレオ
チドの存在下でFP DNAにハイブリダイズすることがで
きる。不適正DNAオリゴヌクレオチドでも、FPをコード
するDNAの同定及び単離を可能にするのに十分な程度にF
P DNAにハイブリダイズし得る。 好ましい方法のいずれかを用いて、ポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）ベースの技術及びcDNAライブラリースクリ
ーニングを使用する２段階方法で、FPをコードするcDNA
クローンを単離する。第１段階では、精製FP又は相同タ
ンパク質からのNH2末端及び内部アミノ酸配列情報を用
いて、FP特異的DNA断片の増幅のための縮重オリゴヌク
レオチドプライマーを設計する。第２段階では、前記断
片をクローニングして、cDNAライブラリーから完全長cD
NAを単離するためのプローブとして使用する。 FPをコードするほぼ完全長のcDNAの配列を表１に示
し、これをクローンFPと名付けた。クローン化cDNAに基
づくFPの推定アミノ酸配列を表２に示す。決定されたcD
NA配列を調べると、アミノ酸359個のタンパク質をコー
ドする単一の大きな読取り枠の存在が明らかになる。 前述の方法で得たクローン化FPcDNAは、組換えFPを産
生するために、適当なプロモーターと他の適当な転写調
節エレメントとを含む発現ベクター内への分子クローニ
ングにより組換え的に発現し、原核又は真核宿主細胞内
にトランスファーし得る。この種の操作の方法は、前出
のManiatisらの文献に記載されており、当業者によく知
られている。 本明細書では、発現ベクターは、クローン化DNAの転
写と、適当な宿主内で対応するmRNAの翻訳とに必要なDN
A配列であると定義される。この種のベクターは、種々
の宿主、例えば細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞及び動
物細胞内で真核生物DNAを発現させるのに使用し得る。 特別に設計したベクターは、細菌−酵母間又は細菌−
動物細胞間のような宿主間のDNAシャトリングを可能に
する。適当に構築した発現ベクターは、宿主細胞内での
自律複製のための複製起点と、選択可能マーカーと、限
定数の有用な制限酵素部位と、高コピー数の可能性と、
活性プロモーターとを含んでいなければならない。プロ
モーターは、RNAポリメラーゼをDNAに結合させてRNA合
成を開始させるDNA配列であると定義される。強力なプ
ロモーターは、mRNAを高頻度で開始させるプロモーター
である。発現ベクターの非限定的具体例としては、クロ
ーニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に
設計したプラスミド又はウイルスが挙げられる。 哺乳動物細胞内で組換えFPを発現するためには種々の
哺乳動物発現ベクターを使用し得る。組換えFPの発現に
適当であり得る市販の哺乳動物発現ベクターの非限定的
具体例としては、pMC1neo（Stratagene）、pXT1（Strat
agene）、pSG5（Stratagene）、pcDNAI、pcDNAIamp（In
vitrogen）、EBO−pSV2−neo（ATCC 37593）、pBPV−
１（８−２）（ATCC 37110）、pdBPV−MMTneo（342−1
2）（ATCC 37224）、pRSVgpt（ATCC 37199）、pRSVne
o（ATCC 37198）、pSV2−dhfr（ATCC 37146）、pUCTa
g（ATCC 37460）及びIZD35（ATCC 37565）が挙げられ
る。 FPをコードするDNAは、宿主細胞内での発現のために
発現ベクター内にクローニングしてもよい。宿主細胞は
原核細胞又は真核細胞であり得、非限定的具体例として
は細菌、酵母、哺乳動物細胞、例えばヒト、ウシ、ブ
タ、サル及び齧歯類由来の細胞系、並びに昆虫細胞、例
えばショウジョウバエ由来の細胞系が挙げられる。適当
であり得る市販の哺乳動物由来細胞系の非限定的具体例
としては、CV−１（ATCC CCL 70）、COS−１（ATCC
CRL 1650）、COS−７（ATCC CRL 1651）、CHO−K1
（ATCC CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92）、NIH/3T3
（ATCC CRL 1658）、HeLa（ATCC CCL ２）、C127I
（ATCC CRL 1616）、BS−Ｃ−１（ATCC CCL 26）及
びMRC−５（ATCC CCL 171）が挙げられる。 発現ベクターは、非限定的具体例として例えば形質転
換、トランスフェクション、プロトプラスト融合法及び
電気穿孔法のような種々の方法のいずれかを用いて、宿
主細胞内に導入し得る。発現ベクター含有細胞を個々に
分析して、その細胞がFPタンパク質を産生するか否かを
決定する。FP発現細胞の同定は、幾つかの方法、例えば
非限定的具体例として抗FP抗体に対する免疫学的反応
性、及び宿主細胞結合FP活性の存在等により実施し得
る。 FP DNAの発現は、in vitroで製造した合成mRNAを用
いて実施してもよい。合成mRNAは、種々の無細胞系、非
限定的具体例として例えばコムギ胚芽抽出物及び網状赤
血球抽出物中で効率的に翻訳できると共に、細胞ベース
の系、非限定的具体例として例えばカエル卵母細胞内へ
のマイクロインジェクションでも効率的に翻訳できる。
好ましいのはカエル卵母細胞へのマイクロインジェクシ
ョンである。 受容体活性及び／又はFPタンパク質を最適レベルにす
るFPcDNA配列を決定するために、例えば下記のようなFP
cDNA分子を構築し得る:FPcDNAの完全長読取り枠、並び
に受容体タンパク質の特定ドメインのみもしくは該タン
パク質の再構成ドメイン（rearranged domain）をコー
ドするcDNAの一部を含む種々の構築物。総ての構築物
は、FPcDNAの５′及び／又は３′非翻訳領域を全く含ま
ないか、総て含むか、又は一部含むように設計し得る。
FP活性及びタンパク質発現レベルは、これらの構築物を
単独で又は組合わせて適当な宿主細胞内に導入した後で
決定し得る。過渡アッセイ（transient assay）での最
適発現を生起させるFPcDNAカセットの決定に次いで、こ
のFPcDNA構築物を種々の発現ベクター（組換えウイルス
を含む）、例えば哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、
卵母細胞、大腸菌及び酵母細胞用の発現ベクターにトラ
ンスファーする。 哺乳動物細胞トランスフェクタントを、FP受容体活性
レベル及びFPタンパク質濃度の両方について、下記の方
法でアッセイする。FP受容体活性の測定では、標識リガ
ンドを細胞に直接導入し、FP発現細胞へのリガンドの特
異的結合の量を決定する。受容体活性に関する結合アッ
セイは当業者に公知である（Freyら,1993,Eur.J.Pharma
col.,244,pp239−250）。 宿主細胞内のFPタンパク質濃度は、種々の方法、例え
ば非限定的具体例としてイムノアフィニティ及び／又は
リガンドアフィニティ法で定量する。FP特異的アフィニ
ティビーズ又はFP特異的抗体を用いて、35S−メチオニ
ン標識又は非標識FPタンパク質を単離する。標識FPタン
パク質はSDS−PAGEで分析する。非標識FPタンパク質
は、FP特異的抗体を用いて、ウエスタンブロッティン
グ、ELISA又はRIAアッセイで検出する。 宿主細胞内でのFPの発現後、FP特異的リガンドに結合
することができる活性形態のFPを得るべく、FPタンパク
質を回収し得る。使用し得るFP精製操作は幾つか存在す
る。組換えFPは、標準的分離方法、例えば非限定的具体
例として洗剤可溶化、塩分別、イオン交換クロマトグラ
フィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシル
アパタイト吸収クロマトグラフィー及び疎水性相互作用
クロマトグラフィーを単独で又は様々に組合わせて使用
することにより、細胞膜から精製し得る。 また、組換えFPは、完全長発生期FP又はFPのポリペプ
チドフラグメントに特異的なモノクローナル又はポリク
ローナル抗体を用いて形成したイムノアフィニティカラ
ムの使用により、別の細胞タンパク質から分離できる。 FPに対する単一特異性抗体は、FPと反応する抗体を含
む哺乳動物抗血清から精製するか、又はKohler及びMils
tein,Nature 256:495−497（1975）に記載の方法を用
いて、FPと反応するモノクローナル抗体として製造す
る。本明細書中の単一特異性抗体は、FPに対して均一結
合特性を示す単一抗体種又は多重抗体種であると定義さ
れる。本明細書で使用する均一結合という用語は、抗体
種が特定の抗原又はエピトープ、例えば前述のようにFP
と結合した抗原又はエピトープに結合する能力を意味す
る。FP特異的抗体は、マウス、ラット、テンジクネズ
ミ、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物を、免疫アジュ
バントを用いて又は用いずに、適当な濃度のFPで免疫感
作することにより形成する。 最初の免疫感作の前に免疫前血清を採取する。各動物
に、約0.1mg〜約1000mgのFP又はFP関連ペプチドを、許
容し得る免疫アジュバントを組合わせて投与する。許容
し得るアジュバントの非限定的具体例としては、フロイ
ント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバン
ト、ミョウバン沈降物、Corynebacterium parvum含有
油中水滴エマルション及びtRNAが挙げられる。最初の免
疫感作は、好ましくはフロイント完全アジュバント中の
酵素を、皮下（SC）、腹腔内（IP）又はこれら両方の経
路で複数の部位に投与することによって実施した。各動
物の採血を一定の時間間隔、好ましくは１週間おきに行
い、抗体力価を測定する。動物には、最初の免疫感作後
に、ブースター注射をしてもよく、又はしなくてもよ
い。ブースター注射をする動物には通常、フロイント不
完全アジュバント中の同量のFP又はFP関連ペプチドを同
一経路で投与する。ブースター注射は、最大力価が得ら
れるまで約３週間の間隔で行う。各ブースター免疫感作
から約７日後、又は単一免疫感作から約１週間後に動物
の採血を行い、血清を回収し、アリコートを約−20℃で
貯蔵する。 近交系マウス、好ましくはBalb/cをFP又はFP関連ペプ
チドで免疫感作することにより、FP又はFPタンパク質配
列由来ペプチドに反応するモノクローナル抗体（mAb）
を製造する。マウスは、IP又はSC経路により、同量の前
述のような許容し得るアジュバントに混入した約0.5ml
の緩衝液又は食塩水中の約1mg〜約100mg、好ましくは約
10mgのFP又はFP関連ペプチドで免疫感作する。好ましい
アジュバントはフロイント完全アジュバントである。マ
ウスは０日目に最初の免疫感作を行い、約３〜約30週間
休息させる。免疫マウスに、リン酸塩緩衝食塩水のよう
な緩衝溶液中約１〜約100mgのFPのブースター免疫を、
静脈内（IV）経路で一回以上行う。抗体陽性マウスのリ
ンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を、当業者に公知の標
準的方法で免疫マウスから脾臓を除去することによって
得る。脾臓リンパ球を、安定なハイブリドーマを形成さ
せる条件下で、適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞
と混合して、ハイブリドーマ細胞を形成する。融合相手
の非限定的具体例としては、マウス骨髄腫P3/NS1/Ag4−
1;MPC−11;S−194及びSp 2/0が挙げられる。好ましい
のはSp 2/0である。抗体産生細胞及び骨髄腫細胞を分
子量約1000のポリエチレングリコール中約30％〜約50％
の濃度で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞を、
当業者に公知の方法で、ヒポキサンチン、チミジン及び
アミノプテリン添加ダルベッコ改質イーグル培地（DME
M）中で増殖させることにより選択する。約14日目、18
日目及び21日目に増殖陽性ウェルから上清を回収し、FP
又はFP関連ペプチドを抗原として用いて、固相イムノラ
ジオアッセイ（SPIRA）のようなイムノアッセイで抗体
産生に関するスクリーニングを行う。培養液をOuchterl
ony沈降アッセイでも検査して、mAbのイソタイプを調べ
る。抗体陽性ウェル由来のハイブリドーマ細胞を、Soft
Agar Techniques,Tissue Culture Methods and
Applications,Kruse及びPaterson編,Academic Press,1
973に記載のMacPhersonの軟寒天法のような方法によっ
てクローニングする。 マウス当たり約0.5mlのプリスチン注射で感作したBal
b/cマウスに、約２×106〜約６×106のハイブリドーマ
細胞を感作処理の約４日後に与え、モノクローナル抗体
をin vivoで産生する。細胞トランスファーの約８〜12
日後に腹水を採取し、モノクローナル抗体を当業者に公
知の方法で精製する。 十分な量の特異的mAbを得るために、ハイブリドーマ
を約２％のウシ胎児血清を含むDMEM培地で増殖させるこ
とにより、抗FPmAbをin vitroで製造する。このmAbを
当業者に公知の方法で精製する。 腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を、種々の
血清学的又は免疫学的アッセイ、例えば非限定的具体例
として、沈降、受動凝集、酵素結合イムノソルベント抗
体（ELISA）法及びラジオイムノアッセイ（RIA）法で測
定する。類似のアッセイを使用して、体液又は組織及び
細胞抽出物中のFPの存在を検出する。 当業者には明らかなように、単一特異性抗体を産生す
るための前述の方法は、FPポリペプチド断片又は完全長
FPポリペプチドに特異的な抗体の産生に使用し得る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との間で共有結合
を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルで予備活性化したゲル支持体であるAffigel−10（Bio
rad）に抗体を加えることにより、FP抗体アフィニティ
カラムを形成する。抗体はスペーサーアームのアミド結
合を介してゲルに結合する。次いで、残りの活性化エス
テルを1MエタノールアミンHCl（pH8）で失活させる。カ
ラムを水及び0.23MグリシンHCl（pH2.6）で順次洗浄し
て、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。次いで
カラムを、適当な膜可溶化剤、例えば洗剤を含むリン酸
塩緩衝食塩水（pH7.3）中で平衡化し、FP又はFP断片を
含む細胞培養上清又は細胞抽出物をゆっくりとカラムに
通す。次いでカラムを、光学密度（A280）がバックグラ
ウンドに低下するまで、リン酸塩緩衝食塩水及び適当な
膜可溶化剤、例えば洗剤で洗浄し、その後タンパク質
を、0.23Mグリシン−HCl（pH2.6）と洗剤のような適当
な膜可溶化剤とで溶離する。次いで精製FPタンパク質
を、リン酸塩緩衝食塩水と洗剤のような適当な膜可溶化
剤とに対して透析する。 本発明のプロスタグランジン受容体をコードするDNA
の単離に適した方法の一つは、別のＧタンパク質結合受
容体から得たアミノ酸及び／又はDNA配列情報を使用す
ることからなる。別のプロスタグランジン受容体はＧタ
ンパク質結合であることが分かっているため、トランス
メンブラン及び／又は細胞質ドメインといったような特
定の領域又はドメインは、新規の受容体を単離するため
のプローブを形成するのに十分な程度の相同を有すると
予想される。 プロスタグランジン及びロイコトリエンは、Ｇタンパ
ク質結合受容体を介して自己のシグナルを形質導入する
ことが知られている。種々の組織中に存在する異なるPG
H2/トロンボキサンA2、PGI2、PGE2、PGD2、PGF２α、LT
B4及びLTD4受容体は文献に記述されている。これらの受
容体のうちの一部は可溶化され、部分的に精製され（Du
tta−Roy,A.K.ら，（1987）JBC,262,pp.12685;Tsai,A.
L.ら，（1989）,JBC,264,pp61;168−Watawabe,T.ら，
（1990）,JBC,265,pp.21237）、ヒト血小板TXA2受容体
は明らかな均質性を示すまで精製された（Ushikubi,F.
ら，（1989）,JBC,264,pp.16496）。精製トロンボキサ
ン受容体は、SDS−ポリアクリルアミドゲル上で約57kDa
を中心とする極めて広いバンドを示した。部分的配列情
報を得るのに十分なタンパク質が得られた。 相同スクリーニングによる別のエイコサノイド受容体
遺伝子の単離へのアプローチが、これらの受容体が一次
構造で相関しているという想定のもとに行われた（Sugi
moto,Y.ら，（1992）,JBC,267,pp.6463）。これらの受
容体はＧタンパク質結合受容体スーパーファミリーであ
るため、トランスメンブラン領域及び細胞質ドメインに
存在すると考えられる相同領域が存在する。従って、プ
ロスタグランジン受容体と相関している種々の既知のＧ
タンパク質結合受容体は、相同を有すると思われる所期
の受容体タンパク質コーディングDNAの領域、例えばト
ランスメンブラン領域に対するDNAプローブを得るため
に使用し得る。 この受容体のトランスメンブラン５〜７領域の大部分
をコードする推定上のマウスFP受容体cDNAの0.37kb断片
を用いて、ヒト腎臓ライブラリーをスクリーニングし、
それから部分的ヒトFPcDNAを単離した。次にこれを、35
9アミノ酸受容体をコードするFPと称する、2.5kb cDNA
クローンをヒト子宮cDNAライブラリーから単離するため
に使用した。このタンパク質をFP受容体と命名した。他
の多くのＧタンパク質結合受容体と同様に、FP受容体は
幾つかの共通の特徴を有する。第一に、推定上の細胞外
アミノ末端に３個の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位（As
n−４、Asn−19及びAsn277）が存在する。第二に、エキ
ソフェイシャル（exofacial）ループ１及び２内に保存
システイン残基が存在する。Ｃ末端及び第三の細胞質ル
ープ全体を通して、複数のセリン残基、タンパク質キナ
ーゼホスホリル化部位となり得る部位が存在する。FP受
容体は、カチオン性アミノ含有リガンドに結合する受容
体の特徴である、トランスメンブラン３内のアスパラギ
ン酸残基を含んでいないが、トランスメンブラン７内の
総ての既知のエイコサノイド受容体内に存在する保存ア
ルギニン（位置295）を有する。この領域は、エイコサ
ノイド受容体の間で最も高度に保存されている。 本発明の新規のプロスタグランジン受容体は、受容体
活性を調節する化合物を選定するためのアッセイ操作で
使用するのに適している。本明細書中の受容体活性の調
節には受容体の阻害又は活性化が含まれ、また、受容体
活性の正常な調整への直接的又は間接的作用も含まれ
る。受容体活性を調節する化合物としては、アゴニス
ト、アンタゴニスト及び受容体活性の調整に直接又は間
接に作用する化合物が挙げられる。 本発明のプロスタグランジン受容体は、受容体調節因
子を選定するためのアッセイ操作で使用すべく、野生供
給源及び組換え供給源の両方から得られる。プロスタグ
ランジン受容体調節因子を選定するためのアッセイ操作
は通常、本発明のプロスタグランジン受容体と、推定上
のプロスタグランジン受容体調節因子を含む検査化合物
又は試料とを含む。検査化合物又は試料は、例えば、野
生もしくは組換え型の精製受容体タンパク質、野生もし
くは組換え型の受容体産生細胞の継代細胞フラクショ
ン、及び／又は野生もしくは組換え型の受容体発現完全
細胞上で直接検査し得る。検査化合物又は試料は、既知
の標識又は非標識受容体リガンドの存在下又は不在下で
受容体に加え得る。検査化合物又は試料の調節活性は、
例えば、検査化合物又は試料が受容体に結合する能力、
受容体を活性化する能力、受容体活性を阻害する能力、
受容体への別の化合物の結合を阻害する又は促進する能
力を分析し、受容体の調整を修飾し、又は細胞内活性を
修飾することによって測定し得る。 FP受容体活性の調節因子の選定は、FP受容体活性が関
与する疾患状態の治療に有用である。別の化合物も、受
容体の活性を刺激又は阻害するために有用であり得る。
FP受容体の選択性アゴニストは、眼圧を低下させること
ができるため緑内障の治療に有効であり得、また黄体溶
解機能を刺激することができるため家畜の発情周期を一
致させるのに有用であり得る。FP受容体に拮抗する化合
物は、FP受容体の活性化が細胞増殖、細胞悪性形質転換
の誘起又は転移性腫瘍成長を引き起こす疾病の治療、又
はFP受容体の活性化が、月経困難症に見られる子宮収縮
のような平滑筋収縮を引き起こす病理状態の治療に有用
であり得る。FPをコードするDNA分子の単離及び精製
は、FP受容体の組織分布の確立、疾患状態におけるFP受
容体発現の変化の研究、及びFP受容体活性を調節する化
合物の選定方法の確立に有用であり得る。 以下の実施例は本発明を明らかにするためのものであ
り、本発明の範囲を限定するためのものではない。 実施例１ FPcDNAのクローニング トランスメンブランドメインVII内の９個の保存アミ
ノ酸（NQILDPWVY）（配列番号:2）に基づいて、アンチ
センス16倍縮重27量体オリゴヌクレオチド［５′−ATA
（A,C）ACCCAGGG（A,G）TCCA（A,G）GATCTG（G,A）TT−
３′］を合成した。最初に32P標識オリゴプローブを用
いて、標準的方法（Sambrookら,1989,Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harb
or Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.）でマウス
腎臓λgt10ライブラリー（Clontech,Palo Alto,CA）を
スクリーニングした。推定上のマウスFP部分cDNA（430
塩基対）をクローニングし、配列決定した。次いでPCR
を用いて、マウスの配列に基づき、ヒト腎臓ライブラリ
ーgt11ライブラリー（Clontech,Palo Alto,CA）のスク
リーニングに使用するための373塩基対cDNAプローブ
（下記）を形成した。 推定上のマウスFP部分cDNAクローンからPCRによって
形成した373塩基対プローブの配列は下記の通りであ
る： この方法で、長さ約1.7及び1.8kbの二つの部分長ヒト
FPcDNAクローンを得た。これらのクローンのうち一方の
クローンに由来する1kb EcoR I5′断片を精製し、32P
標識し、ヒト子宮gt10ライブラリー（Clontech,Palo A
lto,CA）をプローブするのに使用した。このスクリーニ
ングから、2.8kb cDNAクローンをプラーク精製し、DNA
をプレート溶解物法で製造した（Sambrookら，前出文
献）。 cDNAのサブクローニング及び配列決定 2.5kb cDNAをEcoR Iで消化した結果、大きさ1.8kb及
び0.7kbの２個の挿入物を含んでいることが判明した。
サザンブロット分析で、1.8kb挿入物のみがヒト受容体
部分cDNAプローブとハイブリダイズすることが明らかに
された。T7 DNAポリメラーゼ配列決定キット（Pharmac
ia）を用いて配列決定するために、この1.8kb EcoR I
断片（FP）をpKSベクター（Stratagene,La Jolla,CA）
内にサブクローニングした。DNAは、KS及びSKプライマ
ー（Stratagene,La Jolla,CA）又は決定された配列か
ら形成したプライマーを用いて、両鎖とも完全に配列決
定された。FPのヌクレオチド配列を表１に示す。コード
されたタンパク質のアミノ酸配列を表２に示す。1.8kb
断片（FP;第１図）は、配列決定の結果、ヒトトロンボ
キサン受容体cDNAに対して配列相同を有することが判明
し、Ｇタンパク質結合受容体の特徴と推測されているヘ
プタヘリカル構造が明らかにされた。予想された相対分
子質量40,060を有する359アミノ酸ポリペプチドを形成
するであろう長い読取り枠（1077塩基対）が決定され
た。開始コドンとされるATGは、翻訳開始のためのKozak
共通配列（Kozak,1989,J.Cell.Biol.,108,pp229−241）
に適合する。FPcDNAは、約1200塩基対の長い３′非翻訳
領域を含む。 実施例２ pcDNAIamp−FP発現ベクターの構築 1.8kb EcoR IヒトFPcDNA断片をpcDNAIampののEcoR I
部位にサブクローニングし、方向が正しいことをPst I
消化によって確認した。 実施例３ 大腸菌発現ベクター内へのFPcDNAのクローニング 非限定的具体例としてpETシリーズ（Novagen）のよう
な大腸菌発現ベクター内にFP発現カセットをトランスフ
ァーして、大腸菌内で組換えFPを産生する。pETベクタ
ーはFP発現を、厳密に調節されたバクテリオファージT7
プロモーターの制御下におく。誘導lacプロモーターに
よって制御されるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体
コピーを含む大腸菌宿主内への該構築物のトランスファ
ーに次いで、適当なlac基質（IPTG）を培養物に加える
と、FPの発現が誘発される。発現FPのレベルを前述のア
ッセイで測定する。 FPに関する読取り枠全体をコードするcDNAを、pET 1
1aのNde I部位に挿入する。正の方向の構築物を配列解
析によって同定し、発現宿主株BL21の形質転換に使用す
る。次いで、形質転換体を用いて、FPタンパク質を製造
するための培養物に接種する。培養物は、当業者に組成
が知られているM9又はZB培地で増殖させ得る。約OD600
＝1.5まで増殖した後、1mM IPTGを用いて37℃で３時間
にわたりFPの発現を誘発する。これらの細胞に由来する
膜フラクション中に、FP受容体結合活性が発見される。 実施例４ アフリカツメガエル卵母細胞マイクロインジェクション
による合成FPmRNAのin vivo翻訳及び哺乳動物細胞内で
の発現 FPcDNA構築物をin vitro転写ベクター（pGEMシリー
ズ、Promega）に連結して、合成mRNAを製造する。 合成mRNAは、FPmRNAをコードする二本鎖DNAをバクテ
リオファージプロモーター含有プラスミドベクター内に
クローニングし、クローン化FPコーディングDNAを含む
プラスミドベクターを線状とし、プラスミドベクター上
のバクテリオファージプロモーターを特異的に認識する
バクテリオファージからDNA依存性RNAポリメラーゼを用
いてクローン化DNAをin vitro転写することにより、十
分な量で製造される。 バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼによっ
て認識されるバクテリオファージプロモーターを含むプ
ラスミドベクターは様々なものが存在し、非限定的具体
例としては、プラスミドpSP64、pSP65、pSP70、pSP71、
pSP72、pSP73、pGEM−3Z、pGEM−4Z、pGEM−3Zf、pGEM
−5Zf、pGEM−7Zf、pGEM−9Zf及びpGEM−11Zfが挙げら
れる。これら一連のプラスミドは総てPromegaから市販
されている。 FP DNAのクローニングに適している、ベクター上の
使用可能な制限エンドヌクレアーゼクローニング部位の
うちの一つ以上を使用して、FPをコードする二本鎖DNA
をベクター含有バクテリオファージプロモーター内に正
確な向きでクローニングする。連結したFP DNAを有す
るベクターを用いて細菌を形質転換し、正確な向きのFP
DNAを有するベクターの存在についてクローン単離体
を分析する。 正確な向きのFPコーティングDNAを含むベクターが同
定され単離されたら、これをFP転写単位よりも下流の部
位において、該単位を破損しないように制限エンドヌク
レアーゼで開裂することにより線状化する。線状化プラ
スミドを単離し、精製し、FP mRNAのin vitro転写の
鋳型として使用する。 次いで鋳型DNAを、FPmRNA形成DNA鋳型の転写を可能に
する反応混合物中で、バクテリオファージ特異的DNA依
存性RNAポリメラーゼと混合する。使用可能なバクテリ
オファージ特異的DNA依存性RNAポリメラーゼは幾つか存
在し、非限定的具体例としてT3、T7及びSP6 RNAポリメ
ラーゼが挙げられる。次いで、合成FPmRNAを単離し、精
製する。 mRNAの安定性を改善するために、５′末端キャップ構
造及び３′ポリＡテールを含むmRNAを合成すると有利で
あり得る。キャップ構造、即ち７−メチルグアノシン
は、DNA鋳型との反応混合物に７−メチルグアノシンを
加えるだけでmRNAの５′末端に組込み得る。DNA依存性R
NAポリメラーゼは、mRNAの合成中にキャップ構造を５′
末端に組み込む。ポリＡテールは多くのcDNA中に天然に
存在するが、ポリＡテールをコードするDNA配列をDNA鋳
型の３′末端に挿入することにより、mRNAの３′末端に
簡単に付加できる。 単離し精製したFPmRNAは、無細胞系、例えば非限定的
具体例としてウサギ網状赤血球溶解物及びコムギ胚芽抽
出物（どちらもPromega及びNew England Nuclearから
市販されている）を用いて、又は細胞ベースの系、例え
ば非限定的具体例としてアフリカツメガエル卵母細胞へ
のマイクロインジェクションを用いて翻訳する。好まし
くいのはアフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロイン
ジェクションである。 アフリカツメガエル卵母細胞に、FPタンパク質の産生
に十分な量の合成FPmRNAをマイクロインジェクションす
る。マイクロインジェクションにかけた卵母細胞をイン
キュベートしてFPmRNAの翻訳を生起させ、FPタンパク質
を産生させる。 前記合成mRNAは、標準的方法［Gurdon,J.B.及びWicke
ns,M.D.,Methods in Enzymol.101:370−386（198
3）］でアフリカツメガエル卵母細胞（段階５〜６）内
に注入する。卵母細胞を採取し、後述のようにFP発現に
ついて分析する。 実施例５ アフリカツメガエル卵母細胞内でのpcDNAIamp−FP発現 標準的外科方法を用いてメス成体Xenopus laevisか
ら卵母細胞を採取した（Colman,A.,1984,Transription
and Translation−Ａ Practical Approach,IRL P
ress）。卵胞細胞を除去するために、Ca2+無含有ND96溶
液（NaCl 96mM、KCl 2mM、MgCl2 1mM、HEPES 5mM、
ピルビン酸Na 2.5mM、テオフィリン 0.5mM、ゲンタマ
イシン 50mg/ml、＋1.8 CaCl2、pH7.6）中で新しく調
製したコラゲナーゼ（2mg/ml,タイプ2,Worthington Bi
ochemical Corp.,Freehold,NJ）で卵母細胞を２〜３時
間処理した。卵胞除去した段階５〜６の卵母細胞を選択
し、ND96溶液中に維持した。卵母細胞核に１〜5ngのpcD
NAIamp−FPを注入し、次いで18℃で48時間インキュベー
トし、その後アゴニストで感作した。アゴニスト誘導Ca
2+依存性Cl-流、又はCa2+特異的発光タンパク質エクオ
リン（J.Blinks,Friday Harbor Photoproteins,WA）
注入卵母細胞における発光を測定することにより、機能
活性を決定した（Giladi及びSpindel 1991 Biotechni
ques,10,pp744−747）。電気生理学的アッセイのため
に、卵母細胞を0.5ml潅流チャンバ内に配置し、Turbo
TEC 01C増幅器（NPI Insruments,Germany）を用いて
−60mVに電圧を固定した（3M KClを充填した抵抗0.5〜
2.0MΩの微小電極を使用）。リガンド含有溶液を潅流
し、電流応答を記録した。光測定アッセイのために、エ
クオリン導入卵母細胞（100ng/卵母細胞）を0.4mlのND9
6を入れたキュベット内に個々に配置し、リガンドの添
加によって誘起した発光をBio−Orbit 1251ルミノメー
ター（Fisher Sci.Ltd.）で記録した。 電気生理学的アッセイ及びエクオリン発光アッセイを
用いて、pcDNAIamp−FP注入卵母細胞内の機能活性を測
定した。電気生理学的アッセイでは、10〜20nMのPGF
２α、又は選択性FP受容体アゴニストであるフルプロス
テノール10nMの潅流の結果、pcDNAIamp−FP注入卵母細
胞内に明らかな電流応答が観察された。これは、このク
ローンが、ホスファチジルイノシトール/Ca2+シグナル
経路に結合した機能的FP受容体をコードすることを確認
するものである（第３図）。このような応答は、（H2O
を注入した）対照卵母細胞には見られなかった。リガン
ドに誘発される細胞内Ca2+の増加も、エクオリン導入卵
母細胞内の発光によって直接示された（第４図）。エク
オリン発光アッセイで得られた用量応答依存性は、発現
された受容体のアゴニストとして、PGF２α及びフルプ
ロステノールがPGE2より強力であることを意味するもの
であった（第５図）。この強度の順位は、FP受容体に関
して報告されているものと合致する［Colemanら,199
1］。 実施例６ 哺乳動物発現ベクター内へのFPcDNAのクローニング FPcDNA発現カセットを、適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位で、強力な普遍的哺乳動物プロモーターを含む下
記のベクターに連結する:pBC12BI［Cullen,B.R.,Method
s in Enzymol.152:684−704,1988］、並びにpEE12（C
ellTech EP 338,841号）及びその誘導体pSZ9016−１
及びp9019。p9019は、hCMVIEプロモーターと、ポリリン
カーと、SV40ポリＡエレメントとを含み、SV40初期プロ
モーターによって操作されるジヒドロ葉酸レダクターゼ
の突然変異遺伝子（mDHFR）（Simonsen,C.C.及びLevins
on,A.D.Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:2495−2499［198
3］）からなる選択可能マーカー／増幅システムを有す
る哺乳動物発現ベクターの構築を表す。SV40ポリアデニ
ル化配列を、pD5（Berker及びSharp,Nucl.Acid Res.1
3:841−857［1985］）を鋳型として用いて、プライマー
13978−120及び139778−121により決定されるPCR反応で
形成する。得られた0.25Kb PCR生成物をCla I及びSpe
Iで消化し、同様に消化したpEE12の6.7Kb断片に連結す
る。得られたプラスミドをBgl II及びSfi Iで消化し
て、SV40初期プロモーターの３′部分とGScDNAとをベク
ターから切り離す。プラスミドpFR400（Simonsen,C.C.
ら，前出文献）から分離した0.73Kb Sfi I−Xho II断
片を前述の5.6Kbベクターに連結し、SV40初期プロモー
ターを再構築し、mDHFR遺伝子を挿入する。このプラス
ミドをp9019を名付ける。pSZ9016−１は、HIV LTRがhu
CMVIEプロモーターにとって代わっている以外は、p9019
と同じである。このベクターは、p9019をXba I及びMlu
Iで消化してhuCMVIEプロモーターを除去することにより
構築される。残基−117〜＋80（HIV−１ LTRの部分を
含むベクターpCD23内に存在する（Cullen,Cell 46:973
［1986］）のHIV LTRプロモーターを、生成物の末端に
５′側のMlu I及びSpe I制限部位を付加したオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて、プラスミドpCD23からPCR
増幅する。Hind III及びXba I部位は３′側に付加され
ている。得られた0.2kb PCR生成物を酵素Mlu I及びXba
Iで消化した後、この断片をアガロースゲルで精製し、
プロモーターを含まない4.3Kb DNA断片に連結して、ベ
クターpSZ9016−１を形成する。 プロモーターに対して正の向きにあるFPcDNAを含むカ
セットをプロモーターの適当な制限部位３′に連結し、
制限部位マッピング及び／又は配列決定によって同定す
る。これらのcDNA発現ベクターを種々の宿主細胞、例え
ば非限定的具体例としてCOS−７（ATCC＃CRL1651）、CV
−1tat［Sackevitzら,Science 238:1575（1987）］,29
3,L細胞（ATCC＃CRL6362）に、標準的方法、例えば非限
定的具体例として電気穿孔法又は化学的処理（カチオン
性リポソーム、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム）
で導入する。トランスフェクションした細胞及び細胞培
養抽出物を回収して、後述のようにFP発現について分析
し得る。 哺乳動物過渡的発現に使用した総てのベクターは、FP
を発現する安定な細胞系の確立に使用できる。発現ベク
ター内にクローニングした変更していないFPcDNA構築物
は、宿主細胞を細胞内FPタンパク質を作るようにプログ
ラムすると推測される。トランスフェクション宿主細胞
の非限定的具体例としては、CV−１［Sackevitzら，前
出文献］、tk−Ｌ［Wiglerら,Cell 11:223（197
7）］、NS/0及びdHFr−CHO［Kaufman及びSharp,J.Mol.B
iol.159:601（1982）］が挙げられる。 FPcDNAを含む任意のベクターと、薬剤選択性プラスミ
ド、例えば非限定的具体例としてG418、アミノグリコシ
ドホスホトランスフェラーゼ、pLNCX［Miller,A.D.及び
Rosman,G.J.,Biotech News 7:980−990（1989）］；
ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂホスホトラン
スフェラーゼ,pLG90［Gritz,L.及びDavies,J.,GENE 2
5:179（1983）］、APRT、キサンチン−グアニン、ホス
ホリボシル−トランスフェラーゼ、pMAM（Clontech）
［Murrayら,Gene 31:233（1984）］との同時トランス
フェクションは、安定にトランスフェクションしたクロ
ーンの選択を可能にする。FPレベルは前述のアッセイに
よって定量する。 可能な限り高いレベルのFPを合成する哺乳動物細胞ク
ローンを製造するために、増幅可能薬剤耐性マーカーを
含むベクター内にFPcDNA構築物を連結する。これらの構
築物を細胞内に導入した後、プラスミドを含むクローン
を適当な物質を用いて選択し、プラスミドのコピー数が
多い過剰発現クローンの単離を、前記物質の用量増加の
選択によって実施する。下記のシステムを使用する：突
然変異DHFR遺伝子を含む9016又は9019プラスミド［Simo
nsenら，前出］、DHFR−CHO細胞内にトランスフェクシ
ョンし、メトトレキサート中で選択；グルタミンシンセ
ターゼ遺伝子を含むpEE12プラスミド、NS/O細胞内にト
ランスフェクションし、メチオニンスルホキシミン中で
選択（CellTech国際特許出願第2089/10404号）；及びAP
RT及びTK欠失Ｌ細胞内のチミジンキナーゼ遺伝子［Colb
ere及びGaropin,F.,Proc.Natl.Acad.Sci.76:3755（197
9）］を含むpDLAT−３と同時トランスフェクションした
9016又は他のCMVプロモーターベクター、APRT（0.05mM
アザセリン、0.1mMアデニン、４μg/mlアデノシン）中
で選択し、HAT（100μＭヒポキサンチン、0.4μＭアミ
ノプテリン、16μＭチミジン）で増幅。 実施例７ COS−M6細胞内でのFP受容体の発現及び［3H］PGF２α結
合アッセイ 最近クローンニングされたヒトプラスタグランジンF
2a（FP）受容体をpcDNA1ampプラスミド（Invitrogen）
にサブクローニングし、これをDEAE−デキストラン方法
を用いてCOS−M6細胞内にトランスフェクションした。
細胞を72時間培地に維持し、次いで回収し、窒素キャビ
テーションによる細胞溶解後に、示差的遠心分離（1000
×ｇで10分間、次いで100,000×ｇで30分間）にかけて
膜を製造した。0.4mM EDTA、10mM MnCl2、0.3nM ［3
H］PGF２α及び100,000×ｇ膜フラクション由来タンパ
ク質60μｇを含む10mM MES/KOH（pH6.0）中で、［3H］
プロスタグランジンF2a（［3H］PGF２α）結合アッセイ
を行った。室温で１時間インキュベーションし、次いで
洗浄用緩衝液（ウシ血清アルブミンを0.01％含む10μＭ
のMES/KOH（pH6.0））中４℃で予備含浸したWhatman G
F/Bフィルターを介する高速濾過で結合及び遊離放射性
リガンドを分離した。フィルターを約16mlの洗浄用緩衝
液で洗浄して、フィルターに結合している残りの［3H］
PGF２αを液体シンチレーション計数で定量した。特異
的結合は、２μＭ PGF２αの存在下で測定した総ての
結合と非特異的結合との間の差として定義した。 クローン化ヒトFP受容体をCOS−M6細胞内にトランス
フェクションし、トランスフェクション細胞から製造し
た膜を用いて［3H］PGF２α結合アッセイを実施した。
競合アッセイでは、PGF２αが［3H］PGF２α特異的結合
の最も強力な競合リガンドであり、IC50値が2.8nMであ
った（第６図）。関連した合成FPアゴニストであるフル
プロステノールは同等の強さを有し、IC50値が3.5nMで
あった。プロスタグランジン及び相関類似体の強度の順
位は、PGF２α＝フルプロステノール＞PGD2＞＞PGE2≒U
46619＞イロプロストであった。U46619及びイロプロス
トはトロンボキサン及びプロスタシクリンの安定な類似
体であり、それぞれTP及びIP受容体で類似の強度を示
す。この強度順位は、事前に実施された薬理学的研究で
FP受容体について予測されたものであった。 実施例８ 昆虫細胞内発現のためのバキュロウイルス発現ベクター
内へのFPcDNAのクローニング AcNPVウイルスのゲノムに由来するバキュロウイルス
ベクターを、Sf9系昆虫細胞（ATCC CRL＃1711）内でcD
NAを高レベル発現させるように設計する。FPcDNAを発現
する組換えバキュロウイルスを以下の標準的方法で製造
する（In Vitrogen Maxbac Manual）:FPcDNA構築物
を種々のバキュロウイルストランスファーベクター、例
えばpAC360及びpBlueBacベクター（In Vitrogen）内の
ポリヘドリンプロモーターの下流に連結する。バキュロ
ウイルストランスファーベクター及び線状化AcNPVゲノ
ムDNA［Kitts,P.A.,Nuc.Acid Res.18:5667（1990）］
のSf9細胞内への同時トランスフェクションに次ぐ相同
組換えによって、組換えバキュロウイルスを形成する。
組換えpAC360ウイルスは感染細胞内の封入体の不在によ
って同定され（Summers,M.D.及びSmith,G.E.,Texas Ag
riculture Exp.Station Bulletin No.1555）、組換
えpBlueBacウイルスはβ−ガラクトシダーゼ発現に基づ
いて同定される（Vialardら,1990,J.Virol.,64,pp37−5
9）。プラーク精製及びFP組換えバキュロウイルスでのs
f9細胞の感染後に、前述のアッセイでFP発現を測定す
る。 FPに関する読取り枠全体をコードするcDNAをpBlueBac
IIのBamH I部位に挿入する。ポリヘドリンプロモータ
ーに対して正の向きにある構築物を配列決定によって同
定し、線状AcNPV野生型DNAの存在下でSf9細胞をトラン
スフェクションするために使用する。 真正の活性FPは、感染細胞の膜に結合している。膜調
製物を標準的方法で感染細胞から製造する。 実施例９ 酵母発現ベクター内へのFPcDNAのクローニング 外来性タンパク質の細胞内発現を制御するように設計
した発現ベクター内に最適FPcDNA構築物を挿入した後、
酵母S.cerevisiae内で組換えFPを産生する。細胞内発現
のために、EmBLyex4等のようなベクターをFPシストロン
に連結する［Rinas,U.ら,Biotechnology 8:543−545
（1990）;Horowitz B.ら,J.Biol.Chem.265:4189−4192
（1989）］。発現されたFPのレベルは前述のアッセイで
測定する。 実施例10 組換えFPの精製 組換え技術によって製造したFPは、抗体アフィニティ
クロマトグラフィーによって精製し得る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との間で共有結合
を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルで予め活性化したゲル支持体であるAffigel−10（Bio
rad）に抗FP抗体を加えることによって、FP抗体アフィ
ニティカラムを形成する。抗体はスペーサーアームのア
ミド結合を介してゲルに結合する。次いで、残りの活性
化エステルを1MエタノールアミンHCl（pH8）で失活す
る。カラムを水及び0.23MグリシンHCl（pH2.6）で順次
洗浄して、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。
次いでカラムを、リン酸塩緩衝食塩水（pH7.3）及び適
当な膜可溶化剤、例えば洗剤の中で平衡化し、可溶化FP
もしくはFPサブユニットを含む細胞培養上清又は細胞抽
出物をカラムにゆっくり通す。次いでカラムを、光学密
度（A280）がバックグラウンドに低下するまでリン酸塩
緩衝食塩水及び洗剤で洗浄し、その後タンパク質を0.23
Mグリシン−HCl（pH2.6）及び洗剤で溶離する。次い
で、精製したFPタンパク質をリン酸塩緩衝食塩水及び洗
剤に対して透析する。
ロスタグランジンＦ２α（FP）受容体との相互作用を介
して発揮される。この受容体はこれまでに単離又は精製
されていない。FPをコードするDNA及びFP受容体タンパ
ク質のアミノ酸配列も知られていなかった。FP受容体は
通常、ヒト及び他の動物の小腸、黄体、胎盤、卵巣、
脳、子宮筋層、肺、腎臓、胃、筋肉、目、子宮及び気管
を含む広範な細胞上に存在する。FP受容体タンパク質が
プロスタグランジンと結合すると、細胞内カルシウムの
濃度が増加する。組織はこのシグナルに基づいて例えば
筋肉収縮により応答し、目では間接的に眼圧が低下す
る。PGF２αは強力な黄体分解剤（luteolytic agent）
であるため、主に黄体組織を使用してPGF２α結合部位
（FP受容体）の研究が実施されてきた［Powellら,1974
Lancet,１,pp.1120;Powello,1974,Eur.J.Biochem.,4
1,pp.103−107］。EP受容体の機能活性は、ウサギの空
腸並びにネコ、去勢雄ウシ及びイヌの虹彩括約筋組織の
ような組織調製物を用いて研究されてきた［Dong及びJo
nes,1982,Br.J.Pharmac.,76,pp.149−155;Welburm及びJ
ones,1978,Prostaglandins,15,pp.287］。FP受容体の活
性を調べるための前述の方法は、異なるリガンド結合特
性を有する、互いに異なるが相関している複数の受容体
集団を含む組織調製物を必要とし、従って絶対的能力及
び選択性が得られないため、不都合な点がある。また、
組織のFP受容体含量が極めて低く、且つ組織試料が必要
とされるため、各化合物のヒトFP受容体に対する作用物
質としての性能を十分に検査することができない。 発明の概要 FPと称する新規のプロスタグランジン受容体タンパク
質がヒト細胞から同定された。完全長FPタンパク質をコ
ードするDNA分子を単離し、精製し、ヌクレオチド配列
を決定した。FPをコードするDNAを発現ベクター内にク
ローニングし、これらの発現ベクターを組換え宿主細胞
内に導入すると、組換え宿主細胞が機能的FP受容体タン
パク質を発現した。これらの新規のFPタンパク質、FPを
コードするDNA、組換えFPを発現する発現ベクター及び
組換え宿主細胞は、FP受容体活性の調節因子の選定に有
用である。 組換えFP発現宿主細胞を使用するFP受容体調節因子の
同定方法も開示する。FP活性調節因子は、プロスタグラ
ンジン関連疾患の治療及びFP受容体に対するプロスタグ
ランジンの作用の調節に有用である。 図面の簡単な説明 第１図Ａ及びＢは、FP受容体タンパク質をコードする
DNAの完全配列を示している。 第２図は、FP受容体タンパク質の推定アミノ酸完全配
列を示している。 第３図Ａ及び第３図Ｂは、FP−cDNAを注入したアフリ
カツメガエル卵母細胞内でのプロスタグランジンＦ２α
受容体の発現を示している。第３図A:20nM PGF２αの
浴潅流（bath perfusion）で生起した内向Ca2+依存Cl-
流（下方への偏位として示される）。第３図B:10nMのフ
ルプロステノール（fluprostenol）の浴潅流で生起した
内向Ca2+依存Cl-流（下方への偏位として示される）。
卵母細胞には1ngのFP cDNAを注入し、−60mVに電圧を
固定した。 第４図Ａ〜Ｃは、組換えFP受容体を発現するエクオリ
ン導入卵母細胞内でのPGF２α誘発光応答であり、各PGF
２α濃度で検査した５個の卵母細胞の個々の応答を重ね
合わせて示している。10秒の時点で記録キュベット内に
リガンドを加えた。エクオリン発光は相対単位で示され
ており、バックグラウンド発光は典型的には0.5〜0.7単
位である。 第５図は、種々の濃度のPGF２α、フルプロステノー
ル及びPGE2で生起した光応答の平均値を示している。各
縦グラフは同一ドナーに由来する５個の卵母細胞の応答
の平均値を示し、各縦グラフの上方の数字は応答する卵
母細胞の数を示している。別の５匹のドナーに由来する
卵母細胞についても類似の結果が得られた。 第６図は、pcDNAIamp−hFPトランスフェクションCOS
−M6膜への［3H］PGF２αの特異的結合の競合を示して
いる。［3H］PGF２α結合アッセイは、0.03nM〜10μＭ
PGF2（■）、フルプロステノール（●）、PGD
2（□）、PGE2（○）、U46619（△）及びイロプロスト
（iloprost）（◇）の存在下で、「方法」の説明に記載
のように実施した。 発明の詳細な説明 本発明は、FPとここに命名する新規のプロスタグラン
ジン受容体をコードするcDNAに関する。本発明は、組換
え発現プラスミド内に含まれているクローン化FPコーデ
ィングDNAを発現する組換え宿主細胞にも関する。本発
明は、FP受容体活性を調節する物質のスクリーニング方
法にも関する。本発明のDNAは、FP産生細胞から単離さ
れる。本明細書で使用するFPという用語は、プロスタグ
ランジン分子に特異的に結合できるＧタンパク質結合受
容体を意味する。 FPを産生することができる哺乳動物細胞の非限定的具
体例としては、小腸、腎臓、胃、筋肉、目、胎盤、子宮
及び気管に由来する細胞が挙げられる。FPを産生する形
質転換哺乳動物細胞系の非限定的具体例としては、3T3
線維芽細胞が挙げられる。本発明のために好ましい細胞
は例えばヒト正常腎臓細胞及び胎盤細胞であり、最も好
ましい細胞はヒト黄体細胞である。 他の細胞及び細胞系もFPcDNAの単離に使用するのに適
当であり得る。適当な細胞の選択は、細胞表面のFPのス
クリーニングによって実施し得る。FP活性検出方法は当
業者によく知られており、受容体に特異的な放射性標識
リガンドの結合を測定する。このアッセイでFP活性を示
す細胞は、FPcDNAの単離に適当であり得る。 FPcDNAのクローニングには、種々の方法のうちの任意
のものを使用し得る。これらの方法の非限定的具体例と
しては、適当な発現ベクター系内でFP含有cDNAライブラ
リーを構築した後、FPcDNAを直接機能発現させる方法が
挙げられる。別の方法として、バクテリオファージ又は
プラスミドシャトルベクター内で構築したFP含有cDNAラ
イブラリーを、FPタンパク質のアミノ酸配列から設計し
た標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングす
る方法もある。好ましい方法は、バクテリオファージ又
はプラスミドシャトルベクター内で構築したFP含有cDNA
ライブラリーを、FPタンパク質をコードする部分的cDNA
でスクリーニングすることからなる。前記部分的cDNA
は、プロスタグランジンFP受容体と相関している別のＧ
タンパク質結合受容体について知られているアミノ酸配
列から縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計して、
FP DNAフラグメントの特異的PCR増幅を行うことにより
得る。 当業者には容易に理解されるように、別の種類のライ
ブラリー、並びに別の細胞もしくは細胞種類から構築し
たライブラリーも、FPをコードするDNAの単離に有用で
あり得る。別の種類のライブラリーの非限定的具体例と
しては、別の細胞又は細胞系に由来するcDNAライブラリ
ー、及びゲノムDNAライブラリーが挙げられる。 当業者には明らかなように、適当なcDNAライブラリー
は、FP活性を有する細胞又は細胞系から製造し得る。FP
cDNAを単離するためのcDNAライブラリーの製造で使用す
る細胞又は細胞系の選択は、本発明で使用する前述の公
知の標識リガンド結合アッセイを用いて、事前に細胞結
合FP活性を測定することにより実施し得る。 cDNAライブラリーの製造は、当業者によく知られてい
る標準的方法で実施できる。よく知られているcDNAライ
ブラリー構築方法は、例えばManiatis,T.,Fritsch,E.
F.,Sambrook,J.,Molecular Cloning:A Laboratory M
anual（Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spri
ng Harbor,New York,1982）に記載されている。 これも当業者には明らかであろうが、FPをコードする
DNAは適当なゲノムDNAライブラリーからも単離し得る。
ゲノムDNAライブラリーの構築は、当業者によく知られ
ている標準的方法で実施できる。よく知られているゲノ
ムDNAライブラリー構築方法は、例えばManiatisらの前
出の文献に記載されている。 好ましい方法のいずれかによってFP遺伝子をクローニ
ングするためには、FP又は相同タンパク質のアミノ酸配
列又はDNA配列の情報が必要である。そのためには、FP
タンパク質又は相同タンパク質を精製し、自動配列決定
器で部分的アミノ酸配列を決定し得る。完全長のアミノ
酸配列を決定する必要はなく、部分的FP DNA断片のPCR
増幅のためには、アミノ酸６〜８個分の二つの領域の直
鎖配列を決定するとよい。 適当なアミノ酸配列が同定されたら、これらをコード
することができるDNA配列を合成する。遺伝子コードは
縮重であるため、特定のアミノ酸をコードするため２個
以上のコドンを使用し得ることがあり、従ってアミノ酸
配列は、一組の類似のDNAオリゴヌクレオチドのうちの
いずれかでコードされる。前記一組のDNAオリゴヌクレ
オチドのうち一つだけがFP配列と同じであるが、その組
の残りも不適正状態を伴うものの、DNAオリゴヌクレオ
チドの存在下でFP DNAにハイブリダイズすることがで
きる。不適正DNAオリゴヌクレオチドでも、FPをコード
するDNAの同定及び単離を可能にするのに十分な程度にF
P DNAにハイブリダイズし得る。 好ましい方法のいずれかを用いて、ポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）ベースの技術及びcDNAライブラリースクリ
ーニングを使用する２段階方法で、FPをコードするcDNA
クローンを単離する。第１段階では、精製FP又は相同タ
ンパク質からのNH2末端及び内部アミノ酸配列情報を用
いて、FP特異的DNA断片の増幅のための縮重オリゴヌク
レオチドプライマーを設計する。第２段階では、前記断
片をクローニングして、cDNAライブラリーから完全長cD
NAを単離するためのプローブとして使用する。 FPをコードするほぼ完全長のcDNAの配列を表１に示
し、これをクローンFPと名付けた。クローン化cDNAに基
づくFPの推定アミノ酸配列を表２に示す。決定されたcD
NA配列を調べると、アミノ酸359個のタンパク質をコー
ドする単一の大きな読取り枠の存在が明らかになる。 前述の方法で得たクローン化FPcDNAは、組換えFPを産
生するために、適当なプロモーターと他の適当な転写調
節エレメントとを含む発現ベクター内への分子クローニ
ングにより組換え的に発現し、原核又は真核宿主細胞内
にトランスファーし得る。この種の操作の方法は、前出
のManiatisらの文献に記載されており、当業者によく知
られている。 本明細書では、発現ベクターは、クローン化DNAの転
写と、適当な宿主内で対応するmRNAの翻訳とに必要なDN
A配列であると定義される。この種のベクターは、種々
の宿主、例えば細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞及び動
物細胞内で真核生物DNAを発現させるのに使用し得る。 特別に設計したベクターは、細菌−酵母間又は細菌−
動物細胞間のような宿主間のDNAシャトリングを可能に
する。適当に構築した発現ベクターは、宿主細胞内での
自律複製のための複製起点と、選択可能マーカーと、限
定数の有用な制限酵素部位と、高コピー数の可能性と、
活性プロモーターとを含んでいなければならない。プロ
モーターは、RNAポリメラーゼをDNAに結合させてRNA合
成を開始させるDNA配列であると定義される。強力なプ
ロモーターは、mRNAを高頻度で開始させるプロモーター
である。発現ベクターの非限定的具体例としては、クロ
ーニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に
設計したプラスミド又はウイルスが挙げられる。 哺乳動物細胞内で組換えFPを発現するためには種々の
哺乳動物発現ベクターを使用し得る。組換えFPの発現に
適当であり得る市販の哺乳動物発現ベクターの非限定的
具体例としては、pMC1neo（Stratagene）、pXT1（Strat
agene）、pSG5（Stratagene）、pcDNAI、pcDNAIamp（In
vitrogen）、EBO−pSV2−neo（ATCC 37593）、pBPV−
１（８−２）（ATCC 37110）、pdBPV−MMTneo（342−1
2）（ATCC 37224）、pRSVgpt（ATCC 37199）、pRSVne
o（ATCC 37198）、pSV2−dhfr（ATCC 37146）、pUCTa
g（ATCC 37460）及びIZD35（ATCC 37565）が挙げられ
る。 FPをコードするDNAは、宿主細胞内での発現のために
発現ベクター内にクローニングしてもよい。宿主細胞は
原核細胞又は真核細胞であり得、非限定的具体例として
は細菌、酵母、哺乳動物細胞、例えばヒト、ウシ、ブ
タ、サル及び齧歯類由来の細胞系、並びに昆虫細胞、例
えばショウジョウバエ由来の細胞系が挙げられる。適当
であり得る市販の哺乳動物由来細胞系の非限定的具体例
としては、CV−１（ATCC CCL 70）、COS−１（ATCC
CRL 1650）、COS−７（ATCC CRL 1651）、CHO−K1
（ATCC CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92）、NIH/3T3
（ATCC CRL 1658）、HeLa（ATCC CCL ２）、C127I
（ATCC CRL 1616）、BS−Ｃ−１（ATCC CCL 26）及
びMRC−５（ATCC CCL 171）が挙げられる。 発現ベクターは、非限定的具体例として例えば形質転
換、トランスフェクション、プロトプラスト融合法及び
電気穿孔法のような種々の方法のいずれかを用いて、宿
主細胞内に導入し得る。発現ベクター含有細胞を個々に
分析して、その細胞がFPタンパク質を産生するか否かを
決定する。FP発現細胞の同定は、幾つかの方法、例えば
非限定的具体例として抗FP抗体に対する免疫学的反応
性、及び宿主細胞結合FP活性の存在等により実施し得
る。 FP DNAの発現は、in vitroで製造した合成mRNAを用
いて実施してもよい。合成mRNAは、種々の無細胞系、非
限定的具体例として例えばコムギ胚芽抽出物及び網状赤
血球抽出物中で効率的に翻訳できると共に、細胞ベース
の系、非限定的具体例として例えばカエル卵母細胞内へ
のマイクロインジェクションでも効率的に翻訳できる。
好ましいのはカエル卵母細胞へのマイクロインジェクシ
ョンである。 受容体活性及び／又はFPタンパク質を最適レベルにす
るFPcDNA配列を決定するために、例えば下記のようなFP
cDNA分子を構築し得る:FPcDNAの完全長読取り枠、並び
に受容体タンパク質の特定ドメインのみもしくは該タン
パク質の再構成ドメイン（rearranged domain）をコー
ドするcDNAの一部を含む種々の構築物。総ての構築物
は、FPcDNAの５′及び／又は３′非翻訳領域を全く含ま
ないか、総て含むか、又は一部含むように設計し得る。
FP活性及びタンパク質発現レベルは、これらの構築物を
単独で又は組合わせて適当な宿主細胞内に導入した後で
決定し得る。過渡アッセイ（transient assay）での最
適発現を生起させるFPcDNAカセットの決定に次いで、こ
のFPcDNA構築物を種々の発現ベクター（組換えウイルス
を含む）、例えば哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、
卵母細胞、大腸菌及び酵母細胞用の発現ベクターにトラ
ンスファーする。 哺乳動物細胞トランスフェクタントを、FP受容体活性
レベル及びFPタンパク質濃度の両方について、下記の方
法でアッセイする。FP受容体活性の測定では、標識リガ
ンドを細胞に直接導入し、FP発現細胞へのリガンドの特
異的結合の量を決定する。受容体活性に関する結合アッ
セイは当業者に公知である（Freyら,1993,Eur.J.Pharma
col.,244,pp239−250）。 宿主細胞内のFPタンパク質濃度は、種々の方法、例え
ば非限定的具体例としてイムノアフィニティ及び／又は
リガンドアフィニティ法で定量する。FP特異的アフィニ
ティビーズ又はFP特異的抗体を用いて、35S−メチオニ
ン標識又は非標識FPタンパク質を単離する。標識FPタン
パク質はSDS−PAGEで分析する。非標識FPタンパク質
は、FP特異的抗体を用いて、ウエスタンブロッティン
グ、ELISA又はRIAアッセイで検出する。 宿主細胞内でのFPの発現後、FP特異的リガンドに結合
することができる活性形態のFPを得るべく、FPタンパク
質を回収し得る。使用し得るFP精製操作は幾つか存在す
る。組換えFPは、標準的分離方法、例えば非限定的具体
例として洗剤可溶化、塩分別、イオン交換クロマトグラ
フィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシル
アパタイト吸収クロマトグラフィー及び疎水性相互作用
クロマトグラフィーを単独で又は様々に組合わせて使用
することにより、細胞膜から精製し得る。 また、組換えFPは、完全長発生期FP又はFPのポリペプ
チドフラグメントに特異的なモノクローナル又はポリク
ローナル抗体を用いて形成したイムノアフィニティカラ
ムの使用により、別の細胞タンパク質から分離できる。 FPに対する単一特異性抗体は、FPと反応する抗体を含
む哺乳動物抗血清から精製するか、又はKohler及びMils
tein,Nature 256:495−497（1975）に記載の方法を用
いて、FPと反応するモノクローナル抗体として製造す
る。本明細書中の単一特異性抗体は、FPに対して均一結
合特性を示す単一抗体種又は多重抗体種であると定義さ
れる。本明細書で使用する均一結合という用語は、抗体
種が特定の抗原又はエピトープ、例えば前述のようにFP
と結合した抗原又はエピトープに結合する能力を意味す
る。FP特異的抗体は、マウス、ラット、テンジクネズ
ミ、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物を、免疫アジュ
バントを用いて又は用いずに、適当な濃度のFPで免疫感
作することにより形成する。 最初の免疫感作の前に免疫前血清を採取する。各動物
に、約0.1mg〜約1000mgのFP又はFP関連ペプチドを、許
容し得る免疫アジュバントを組合わせて投与する。許容
し得るアジュバントの非限定的具体例としては、フロイ
ント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバン
ト、ミョウバン沈降物、Corynebacterium parvum含有
油中水滴エマルション及びtRNAが挙げられる。最初の免
疫感作は、好ましくはフロイント完全アジュバント中の
酵素を、皮下（SC）、腹腔内（IP）又はこれら両方の経
路で複数の部位に投与することによって実施した。各動
物の採血を一定の時間間隔、好ましくは１週間おきに行
い、抗体力価を測定する。動物には、最初の免疫感作後
に、ブースター注射をしてもよく、又はしなくてもよ
い。ブースター注射をする動物には通常、フロイント不
完全アジュバント中の同量のFP又はFP関連ペプチドを同
一経路で投与する。ブースター注射は、最大力価が得ら
れるまで約３週間の間隔で行う。各ブースター免疫感作
から約７日後、又は単一免疫感作から約１週間後に動物
の採血を行い、血清を回収し、アリコートを約−20℃で
貯蔵する。 近交系マウス、好ましくはBalb/cをFP又はFP関連ペプ
チドで免疫感作することにより、FP又はFPタンパク質配
列由来ペプチドに反応するモノクローナル抗体（mAb）
を製造する。マウスは、IP又はSC経路により、同量の前
述のような許容し得るアジュバントに混入した約0.5ml
の緩衝液又は食塩水中の約1mg〜約100mg、好ましくは約
10mgのFP又はFP関連ペプチドで免疫感作する。好ましい
アジュバントはフロイント完全アジュバントである。マ
ウスは０日目に最初の免疫感作を行い、約３〜約30週間
休息させる。免疫マウスに、リン酸塩緩衝食塩水のよう
な緩衝溶液中約１〜約100mgのFPのブースター免疫を、
静脈内（IV）経路で一回以上行う。抗体陽性マウスのリ
ンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を、当業者に公知の標
準的方法で免疫マウスから脾臓を除去することによって
得る。脾臓リンパ球を、安定なハイブリドーマを形成さ
せる条件下で、適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞
と混合して、ハイブリドーマ細胞を形成する。融合相手
の非限定的具体例としては、マウス骨髄腫P3/NS1/Ag4−
1;MPC−11;S−194及びSp 2/0が挙げられる。好ましい
のはSp 2/0である。抗体産生細胞及び骨髄腫細胞を分
子量約1000のポリエチレングリコール中約30％〜約50％
の濃度で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞を、
当業者に公知の方法で、ヒポキサンチン、チミジン及び
アミノプテリン添加ダルベッコ改質イーグル培地（DME
M）中で増殖させることにより選択する。約14日目、18
日目及び21日目に増殖陽性ウェルから上清を回収し、FP
又はFP関連ペプチドを抗原として用いて、固相イムノラ
ジオアッセイ（SPIRA）のようなイムノアッセイで抗体
産生に関するスクリーニングを行う。培養液をOuchterl
ony沈降アッセイでも検査して、mAbのイソタイプを調べ
る。抗体陽性ウェル由来のハイブリドーマ細胞を、Soft
Agar Techniques,Tissue Culture Methods and
Applications,Kruse及びPaterson編,Academic Press,1
973に記載のMacPhersonの軟寒天法のような方法によっ
てクローニングする。 マウス当たり約0.5mlのプリスチン注射で感作したBal
b/cマウスに、約２×106〜約６×106のハイブリドーマ
細胞を感作処理の約４日後に与え、モノクローナル抗体
をin vivoで産生する。細胞トランスファーの約８〜12
日後に腹水を採取し、モノクローナル抗体を当業者に公
知の方法で精製する。 十分な量の特異的mAbを得るために、ハイブリドーマ
を約２％のウシ胎児血清を含むDMEM培地で増殖させるこ
とにより、抗FPmAbをin vitroで製造する。このmAbを
当業者に公知の方法で精製する。 腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を、種々の
血清学的又は免疫学的アッセイ、例えば非限定的具体例
として、沈降、受動凝集、酵素結合イムノソルベント抗
体（ELISA）法及びラジオイムノアッセイ（RIA）法で測
定する。類似のアッセイを使用して、体液又は組織及び
細胞抽出物中のFPの存在を検出する。 当業者には明らかなように、単一特異性抗体を産生す
るための前述の方法は、FPポリペプチド断片又は完全長
FPポリペプチドに特異的な抗体の産生に使用し得る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との間で共有結合
を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルで予備活性化したゲル支持体であるAffigel−10（Bio
rad）に抗体を加えることにより、FP抗体アフィニティ
カラムを形成する。抗体はスペーサーアームのアミド結
合を介してゲルに結合する。次いで、残りの活性化エス
テルを1MエタノールアミンHCl（pH8）で失活させる。カ
ラムを水及び0.23MグリシンHCl（pH2.6）で順次洗浄し
て、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。次いで
カラムを、適当な膜可溶化剤、例えば洗剤を含むリン酸
塩緩衝食塩水（pH7.3）中で平衡化し、FP又はFP断片を
含む細胞培養上清又は細胞抽出物をゆっくりとカラムに
通す。次いでカラムを、光学密度（A280）がバックグラ
ウンドに低下するまで、リン酸塩緩衝食塩水及び適当な
膜可溶化剤、例えば洗剤で洗浄し、その後タンパク質
を、0.23Mグリシン−HCl（pH2.6）と洗剤のような適当
な膜可溶化剤とで溶離する。次いで精製FPタンパク質
を、リン酸塩緩衝食塩水と洗剤のような適当な膜可溶化
剤とに対して透析する。 本発明のプロスタグランジン受容体をコードするDNA
の単離に適した方法の一つは、別のＧタンパク質結合受
容体から得たアミノ酸及び／又はDNA配列情報を使用す
ることからなる。別のプロスタグランジン受容体はＧタ
ンパク質結合であることが分かっているため、トランス
メンブラン及び／又は細胞質ドメインといったような特
定の領域又はドメインは、新規の受容体を単離するため
のプローブを形成するのに十分な程度の相同を有すると
予想される。 プロスタグランジン及びロイコトリエンは、Ｇタンパ
ク質結合受容体を介して自己のシグナルを形質導入する
ことが知られている。種々の組織中に存在する異なるPG
H2/トロンボキサンA2、PGI2、PGE2、PGD2、PGF２α、LT
B4及びLTD4受容体は文献に記述されている。これらの受
容体のうちの一部は可溶化され、部分的に精製され（Du
tta−Roy,A.K.ら，（1987）JBC,262,pp.12685;Tsai,A.
L.ら，（1989）,JBC,264,pp61;168−Watawabe,T.ら，
（1990）,JBC,265,pp.21237）、ヒト血小板TXA2受容体
は明らかな均質性を示すまで精製された（Ushikubi,F.
ら，（1989）,JBC,264,pp.16496）。精製トロンボキサ
ン受容体は、SDS−ポリアクリルアミドゲル上で約57kDa
を中心とする極めて広いバンドを示した。部分的配列情
報を得るのに十分なタンパク質が得られた。 相同スクリーニングによる別のエイコサノイド受容体
遺伝子の単離へのアプローチが、これらの受容体が一次
構造で相関しているという想定のもとに行われた（Sugi
moto,Y.ら，（1992）,JBC,267,pp.6463）。これらの受
容体はＧタンパク質結合受容体スーパーファミリーであ
るため、トランスメンブラン領域及び細胞質ドメインに
存在すると考えられる相同領域が存在する。従って、プ
ロスタグランジン受容体と相関している種々の既知のＧ
タンパク質結合受容体は、相同を有すると思われる所期
の受容体タンパク質コーディングDNAの領域、例えばト
ランスメンブラン領域に対するDNAプローブを得るため
に使用し得る。 この受容体のトランスメンブラン５〜７領域の大部分
をコードする推定上のマウスFP受容体cDNAの0.37kb断片
を用いて、ヒト腎臓ライブラリーをスクリーニングし、
それから部分的ヒトFPcDNAを単離した。次にこれを、35
9アミノ酸受容体をコードするFPと称する、2.5kb cDNA
クローンをヒト子宮cDNAライブラリーから単離するため
に使用した。このタンパク質をFP受容体と命名した。他
の多くのＧタンパク質結合受容体と同様に、FP受容体は
幾つかの共通の特徴を有する。第一に、推定上の細胞外
アミノ末端に３個の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位（As
n−４、Asn−19及びAsn277）が存在する。第二に、エキ
ソフェイシャル（exofacial）ループ１及び２内に保存
システイン残基が存在する。Ｃ末端及び第三の細胞質ル
ープ全体を通して、複数のセリン残基、タンパク質キナ
ーゼホスホリル化部位となり得る部位が存在する。FP受
容体は、カチオン性アミノ含有リガンドに結合する受容
体の特徴である、トランスメンブラン３内のアスパラギ
ン酸残基を含んでいないが、トランスメンブラン７内の
総ての既知のエイコサノイド受容体内に存在する保存ア
ルギニン（位置295）を有する。この領域は、エイコサ
ノイド受容体の間で最も高度に保存されている。 本発明の新規のプロスタグランジン受容体は、受容体
活性を調節する化合物を選定するためのアッセイ操作で
使用するのに適している。本明細書中の受容体活性の調
節には受容体の阻害又は活性化が含まれ、また、受容体
活性の正常な調整への直接的又は間接的作用も含まれ
る。受容体活性を調節する化合物としては、アゴニス
ト、アンタゴニスト及び受容体活性の調整に直接又は間
接に作用する化合物が挙げられる。 本発明のプロスタグランジン受容体は、受容体調節因
子を選定するためのアッセイ操作で使用すべく、野生供
給源及び組換え供給源の両方から得られる。プロスタグ
ランジン受容体調節因子を選定するためのアッセイ操作
は通常、本発明のプロスタグランジン受容体と、推定上
のプロスタグランジン受容体調節因子を含む検査化合物
又は試料とを含む。検査化合物又は試料は、例えば、野
生もしくは組換え型の精製受容体タンパク質、野生もし
くは組換え型の受容体産生細胞の継代細胞フラクショ
ン、及び／又は野生もしくは組換え型の受容体発現完全
細胞上で直接検査し得る。検査化合物又は試料は、既知
の標識又は非標識受容体リガンドの存在下又は不在下で
受容体に加え得る。検査化合物又は試料の調節活性は、
例えば、検査化合物又は試料が受容体に結合する能力、
受容体を活性化する能力、受容体活性を阻害する能力、
受容体への別の化合物の結合を阻害する又は促進する能
力を分析し、受容体の調整を修飾し、又は細胞内活性を
修飾することによって測定し得る。 FP受容体活性の調節因子の選定は、FP受容体活性が関
与する疾患状態の治療に有用である。別の化合物も、受
容体の活性を刺激又は阻害するために有用であり得る。
FP受容体の選択性アゴニストは、眼圧を低下させること
ができるため緑内障の治療に有効であり得、また黄体溶
解機能を刺激することができるため家畜の発情周期を一
致させるのに有用であり得る。FP受容体に拮抗する化合
物は、FP受容体の活性化が細胞増殖、細胞悪性形質転換
の誘起又は転移性腫瘍成長を引き起こす疾病の治療、又
はFP受容体の活性化が、月経困難症に見られる子宮収縮
のような平滑筋収縮を引き起こす病理状態の治療に有用
であり得る。FPをコードするDNA分子の単離及び精製
は、FP受容体の組織分布の確立、疾患状態におけるFP受
容体発現の変化の研究、及びFP受容体活性を調節する化
合物の選定方法の確立に有用であり得る。 以下の実施例は本発明を明らかにするためのものであ
り、本発明の範囲を限定するためのものではない。 実施例１ FPcDNAのクローニング トランスメンブランドメインVII内の９個の保存アミ
ノ酸（NQILDPWVY）（配列番号:2）に基づいて、アンチ
センス16倍縮重27量体オリゴヌクレオチド［５′−ATA
（A,C）ACCCAGGG（A,G）TCCA（A,G）GATCTG（G,A）TT−
３′］を合成した。最初に32P標識オリゴプローブを用
いて、標準的方法（Sambrookら,1989,Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harb
or Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.）でマウス
腎臓λgt10ライブラリー（Clontech,Palo Alto,CA）を
スクリーニングした。推定上のマウスFP部分cDNA（430
塩基対）をクローニングし、配列決定した。次いでPCR
を用いて、マウスの配列に基づき、ヒト腎臓ライブラリ
ーgt11ライブラリー（Clontech,Palo Alto,CA）のスク
リーニングに使用するための373塩基対cDNAプローブ
（下記）を形成した。 推定上のマウスFP部分cDNAクローンからPCRによって
形成した373塩基対プローブの配列は下記の通りであ
る： この方法で、長さ約1.7及び1.8kbの二つの部分長ヒト
FPcDNAクローンを得た。これらのクローンのうち一方の
クローンに由来する1kb EcoR I5′断片を精製し、32P
標識し、ヒト子宮gt10ライブラリー（Clontech,Palo A
lto,CA）をプローブするのに使用した。このスクリーニ
ングから、2.8kb cDNAクローンをプラーク精製し、DNA
をプレート溶解物法で製造した（Sambrookら，前出文
献）。 cDNAのサブクローニング及び配列決定 2.5kb cDNAをEcoR Iで消化した結果、大きさ1.8kb及
び0.7kbの２個の挿入物を含んでいることが判明した。
サザンブロット分析で、1.8kb挿入物のみがヒト受容体
部分cDNAプローブとハイブリダイズすることが明らかに
された。T7 DNAポリメラーゼ配列決定キット（Pharmac
ia）を用いて配列決定するために、この1.8kb EcoR I
断片（FP）をpKSベクター（Stratagene,La Jolla,CA）
内にサブクローニングした。DNAは、KS及びSKプライマ
ー（Stratagene,La Jolla,CA）又は決定された配列か
ら形成したプライマーを用いて、両鎖とも完全に配列決
定された。FPのヌクレオチド配列を表１に示す。コード
されたタンパク質のアミノ酸配列を表２に示す。1.8kb
断片（FP;第１図）は、配列決定の結果、ヒトトロンボ
キサン受容体cDNAに対して配列相同を有することが判明
し、Ｇタンパク質結合受容体の特徴と推測されているヘ
プタヘリカル構造が明らかにされた。予想された相対分
子質量40,060を有する359アミノ酸ポリペプチドを形成
するであろう長い読取り枠（1077塩基対）が決定され
た。開始コドンとされるATGは、翻訳開始のためのKozak
共通配列（Kozak,1989,J.Cell.Biol.,108,pp229−241）
に適合する。FPcDNAは、約1200塩基対の長い３′非翻訳
領域を含む。 実施例２ pcDNAIamp−FP発現ベクターの構築 1.8kb EcoR IヒトFPcDNA断片をpcDNAIampののEcoR I
部位にサブクローニングし、方向が正しいことをPst I
消化によって確認した。 実施例３ 大腸菌発現ベクター内へのFPcDNAのクローニング 非限定的具体例としてpETシリーズ（Novagen）のよう
な大腸菌発現ベクター内にFP発現カセットをトランスフ
ァーして、大腸菌内で組換えFPを産生する。pETベクタ
ーはFP発現を、厳密に調節されたバクテリオファージT7
プロモーターの制御下におく。誘導lacプロモーターに
よって制御されるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体
コピーを含む大腸菌宿主内への該構築物のトランスファ
ーに次いで、適当なlac基質（IPTG）を培養物に加える
と、FPの発現が誘発される。発現FPのレベルを前述のア
ッセイで測定する。 FPに関する読取り枠全体をコードするcDNAを、pET 1
1aのNde I部位に挿入する。正の方向の構築物を配列解
析によって同定し、発現宿主株BL21の形質転換に使用す
る。次いで、形質転換体を用いて、FPタンパク質を製造
するための培養物に接種する。培養物は、当業者に組成
が知られているM9又はZB培地で増殖させ得る。約OD600
＝1.5まで増殖した後、1mM IPTGを用いて37℃で３時間
にわたりFPの発現を誘発する。これらの細胞に由来する
膜フラクション中に、FP受容体結合活性が発見される。 実施例４ アフリカツメガエル卵母細胞マイクロインジェクション
による合成FPmRNAのin vivo翻訳及び哺乳動物細胞内で
の発現 FPcDNA構築物をin vitro転写ベクター（pGEMシリー
ズ、Promega）に連結して、合成mRNAを製造する。 合成mRNAは、FPmRNAをコードする二本鎖DNAをバクテ
リオファージプロモーター含有プラスミドベクター内に
クローニングし、クローン化FPコーディングDNAを含む
プラスミドベクターを線状とし、プラスミドベクター上
のバクテリオファージプロモーターを特異的に認識する
バクテリオファージからDNA依存性RNAポリメラーゼを用
いてクローン化DNAをin vitro転写することにより、十
分な量で製造される。 バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼによっ
て認識されるバクテリオファージプロモーターを含むプ
ラスミドベクターは様々なものが存在し、非限定的具体
例としては、プラスミドpSP64、pSP65、pSP70、pSP71、
pSP72、pSP73、pGEM−3Z、pGEM−4Z、pGEM−3Zf、pGEM
−5Zf、pGEM−7Zf、pGEM−9Zf及びpGEM−11Zfが挙げら
れる。これら一連のプラスミドは総てPromegaから市販
されている。 FP DNAのクローニングに適している、ベクター上の
使用可能な制限エンドヌクレアーゼクローニング部位の
うちの一つ以上を使用して、FPをコードする二本鎖DNA
をベクター含有バクテリオファージプロモーター内に正
確な向きでクローニングする。連結したFP DNAを有す
るベクターを用いて細菌を形質転換し、正確な向きのFP
DNAを有するベクターの存在についてクローン単離体
を分析する。 正確な向きのFPコーティングDNAを含むベクターが同
定され単離されたら、これをFP転写単位よりも下流の部
位において、該単位を破損しないように制限エンドヌク
レアーゼで開裂することにより線状化する。線状化プラ
スミドを単離し、精製し、FP mRNAのin vitro転写の
鋳型として使用する。 次いで鋳型DNAを、FPmRNA形成DNA鋳型の転写を可能に
する反応混合物中で、バクテリオファージ特異的DNA依
存性RNAポリメラーゼと混合する。使用可能なバクテリ
オファージ特異的DNA依存性RNAポリメラーゼは幾つか存
在し、非限定的具体例としてT3、T7及びSP6 RNAポリメ
ラーゼが挙げられる。次いで、合成FPmRNAを単離し、精
製する。 mRNAの安定性を改善するために、５′末端キャップ構
造及び３′ポリＡテールを含むmRNAを合成すると有利で
あり得る。キャップ構造、即ち７−メチルグアノシン
は、DNA鋳型との反応混合物に７−メチルグアノシンを
加えるだけでmRNAの５′末端に組込み得る。DNA依存性R
NAポリメラーゼは、mRNAの合成中にキャップ構造を５′
末端に組み込む。ポリＡテールは多くのcDNA中に天然に
存在するが、ポリＡテールをコードするDNA配列をDNA鋳
型の３′末端に挿入することにより、mRNAの３′末端に
簡単に付加できる。 単離し精製したFPmRNAは、無細胞系、例えば非限定的
具体例としてウサギ網状赤血球溶解物及びコムギ胚芽抽
出物（どちらもPromega及びNew England Nuclearから
市販されている）を用いて、又は細胞ベースの系、例え
ば非限定的具体例としてアフリカツメガエル卵母細胞へ
のマイクロインジェクションを用いて翻訳する。好まし
くいのはアフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロイン
ジェクションである。 アフリカツメガエル卵母細胞に、FPタンパク質の産生
に十分な量の合成FPmRNAをマイクロインジェクションす
る。マイクロインジェクションにかけた卵母細胞をイン
キュベートしてFPmRNAの翻訳を生起させ、FPタンパク質
を産生させる。 前記合成mRNAは、標準的方法［Gurdon,J.B.及びWicke
ns,M.D.,Methods in Enzymol.101:370−386（198
3）］でアフリカツメガエル卵母細胞（段階５〜６）内
に注入する。卵母細胞を採取し、後述のようにFP発現に
ついて分析する。 実施例５ アフリカツメガエル卵母細胞内でのpcDNAIamp−FP発現 標準的外科方法を用いてメス成体Xenopus laevisか
ら卵母細胞を採取した（Colman,A.,1984,Transription
and Translation−Ａ Practical Approach,IRL P
ress）。卵胞細胞を除去するために、Ca2+無含有ND96溶
液（NaCl 96mM、KCl 2mM、MgCl2 1mM、HEPES 5mM、
ピルビン酸Na 2.5mM、テオフィリン 0.5mM、ゲンタマ
イシン 50mg/ml、＋1.8 CaCl2、pH7.6）中で新しく調
製したコラゲナーゼ（2mg/ml,タイプ2,Worthington Bi
ochemical Corp.,Freehold,NJ）で卵母細胞を２〜３時
間処理した。卵胞除去した段階５〜６の卵母細胞を選択
し、ND96溶液中に維持した。卵母細胞核に１〜5ngのpcD
NAIamp−FPを注入し、次いで18℃で48時間インキュベー
トし、その後アゴニストで感作した。アゴニスト誘導Ca
2+依存性Cl-流、又はCa2+特異的発光タンパク質エクオ
リン（J.Blinks,Friday Harbor Photoproteins,WA）
注入卵母細胞における発光を測定することにより、機能
活性を決定した（Giladi及びSpindel 1991 Biotechni
ques,10,pp744−747）。電気生理学的アッセイのため
に、卵母細胞を0.5ml潅流チャンバ内に配置し、Turbo
TEC 01C増幅器（NPI Insruments,Germany）を用いて
−60mVに電圧を固定した（3M KClを充填した抵抗0.5〜
2.0MΩの微小電極を使用）。リガンド含有溶液を潅流
し、電流応答を記録した。光測定アッセイのために、エ
クオリン導入卵母細胞（100ng/卵母細胞）を0.4mlのND9
6を入れたキュベット内に個々に配置し、リガンドの添
加によって誘起した発光をBio−Orbit 1251ルミノメー
ター（Fisher Sci.Ltd.）で記録した。 電気生理学的アッセイ及びエクオリン発光アッセイを
用いて、pcDNAIamp−FP注入卵母細胞内の機能活性を測
定した。電気生理学的アッセイでは、10〜20nMのPGF
２α、又は選択性FP受容体アゴニストであるフルプロス
テノール10nMの潅流の結果、pcDNAIamp−FP注入卵母細
胞内に明らかな電流応答が観察された。これは、このク
ローンが、ホスファチジルイノシトール/Ca2+シグナル
経路に結合した機能的FP受容体をコードすることを確認
するものである（第３図）。このような応答は、（H2O
を注入した）対照卵母細胞には見られなかった。リガン
ドに誘発される細胞内Ca2+の増加も、エクオリン導入卵
母細胞内の発光によって直接示された（第４図）。エク
オリン発光アッセイで得られた用量応答依存性は、発現
された受容体のアゴニストとして、PGF２α及びフルプ
ロステノールがPGE2より強力であることを意味するもの
であった（第５図）。この強度の順位は、FP受容体に関
して報告されているものと合致する［Colemanら,199
1］。 実施例６ 哺乳動物発現ベクター内へのFPcDNAのクローニング FPcDNA発現カセットを、適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位で、強力な普遍的哺乳動物プロモーターを含む下
記のベクターに連結する:pBC12BI［Cullen,B.R.,Method
s in Enzymol.152:684−704,1988］、並びにpEE12（C
ellTech EP 338,841号）及びその誘導体pSZ9016−１
及びp9019。p9019は、hCMVIEプロモーターと、ポリリン
カーと、SV40ポリＡエレメントとを含み、SV40初期プロ
モーターによって操作されるジヒドロ葉酸レダクターゼ
の突然変異遺伝子（mDHFR）（Simonsen,C.C.及びLevins
on,A.D.Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:2495−2499［198
3］）からなる選択可能マーカー／増幅システムを有す
る哺乳動物発現ベクターの構築を表す。SV40ポリアデニ
ル化配列を、pD5（Berker及びSharp,Nucl.Acid Res.1
3:841−857［1985］）を鋳型として用いて、プライマー
13978−120及び139778−121により決定されるPCR反応で
形成する。得られた0.25Kb PCR生成物をCla I及びSpe
Iで消化し、同様に消化したpEE12の6.7Kb断片に連結す
る。得られたプラスミドをBgl II及びSfi Iで消化し
て、SV40初期プロモーターの３′部分とGScDNAとをベク
ターから切り離す。プラスミドpFR400（Simonsen,C.C.
ら，前出文献）から分離した0.73Kb Sfi I−Xho II断
片を前述の5.6Kbベクターに連結し、SV40初期プロモー
ターを再構築し、mDHFR遺伝子を挿入する。このプラス
ミドをp9019を名付ける。pSZ9016−１は、HIV LTRがhu
CMVIEプロモーターにとって代わっている以外は、p9019
と同じである。このベクターは、p9019をXba I及びMlu
Iで消化してhuCMVIEプロモーターを除去することにより
構築される。残基−117〜＋80（HIV−１ LTRの部分を
含むベクターpCD23内に存在する（Cullen,Cell 46:973
［1986］）のHIV LTRプロモーターを、生成物の末端に
５′側のMlu I及びSpe I制限部位を付加したオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて、プラスミドpCD23からPCR
増幅する。Hind III及びXba I部位は３′側に付加され
ている。得られた0.2kb PCR生成物を酵素Mlu I及びXba
Iで消化した後、この断片をアガロースゲルで精製し、
プロモーターを含まない4.3Kb DNA断片に連結して、ベ
クターpSZ9016−１を形成する。 プロモーターに対して正の向きにあるFPcDNAを含むカ
セットをプロモーターの適当な制限部位３′に連結し、
制限部位マッピング及び／又は配列決定によって同定す
る。これらのcDNA発現ベクターを種々の宿主細胞、例え
ば非限定的具体例としてCOS−７（ATCC＃CRL1651）、CV
−1tat［Sackevitzら,Science 238:1575（1987）］,29
3,L細胞（ATCC＃CRL6362）に、標準的方法、例えば非限
定的具体例として電気穿孔法又は化学的処理（カチオン
性リポソーム、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム）
で導入する。トランスフェクションした細胞及び細胞培
養抽出物を回収して、後述のようにFP発現について分析
し得る。 哺乳動物過渡的発現に使用した総てのベクターは、FP
を発現する安定な細胞系の確立に使用できる。発現ベク
ター内にクローニングした変更していないFPcDNA構築物
は、宿主細胞を細胞内FPタンパク質を作るようにプログ
ラムすると推測される。トランスフェクション宿主細胞
の非限定的具体例としては、CV−１［Sackevitzら，前
出文献］、tk−Ｌ［Wiglerら,Cell 11:223（197
7）］、NS/0及びdHFr−CHO［Kaufman及びSharp,J.Mol.B
iol.159:601（1982）］が挙げられる。 FPcDNAを含む任意のベクターと、薬剤選択性プラスミ
ド、例えば非限定的具体例としてG418、アミノグリコシ
ドホスホトランスフェラーゼ、pLNCX［Miller,A.D.及び
Rosman,G.J.,Biotech News 7:980−990（1989）］；
ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂホスホトラン
スフェラーゼ,pLG90［Gritz,L.及びDavies,J.,GENE 2
5:179（1983）］、APRT、キサンチン−グアニン、ホス
ホリボシル−トランスフェラーゼ、pMAM（Clontech）
［Murrayら,Gene 31:233（1984）］との同時トランス
フェクションは、安定にトランスフェクションしたクロ
ーンの選択を可能にする。FPレベルは前述のアッセイに
よって定量する。 可能な限り高いレベルのFPを合成する哺乳動物細胞ク
ローンを製造するために、増幅可能薬剤耐性マーカーを
含むベクター内にFPcDNA構築物を連結する。これらの構
築物を細胞内に導入した後、プラスミドを含むクローン
を適当な物質を用いて選択し、プラスミドのコピー数が
多い過剰発現クローンの単離を、前記物質の用量増加の
選択によって実施する。下記のシステムを使用する：突
然変異DHFR遺伝子を含む9016又は9019プラスミド［Simo
nsenら，前出］、DHFR−CHO細胞内にトランスフェクシ
ョンし、メトトレキサート中で選択；グルタミンシンセ
ターゼ遺伝子を含むpEE12プラスミド、NS/O細胞内にト
ランスフェクションし、メチオニンスルホキシミン中で
選択（CellTech国際特許出願第2089/10404号）；及びAP
RT及びTK欠失Ｌ細胞内のチミジンキナーゼ遺伝子［Colb
ere及びGaropin,F.,Proc.Natl.Acad.Sci.76:3755（197
9）］を含むpDLAT−３と同時トランスフェクションした
9016又は他のCMVプロモーターベクター、APRT（0.05mM
アザセリン、0.1mMアデニン、４μg/mlアデノシン）中
で選択し、HAT（100μＭヒポキサンチン、0.4μＭアミ
ノプテリン、16μＭチミジン）で増幅。 実施例７ COS−M6細胞内でのFP受容体の発現及び［3H］PGF２α結
合アッセイ 最近クローンニングされたヒトプラスタグランジンF
2a（FP）受容体をpcDNA1ampプラスミド（Invitrogen）
にサブクローニングし、これをDEAE−デキストラン方法
を用いてCOS−M6細胞内にトランスフェクションした。
細胞を72時間培地に維持し、次いで回収し、窒素キャビ
テーションによる細胞溶解後に、示差的遠心分離（1000
×ｇで10分間、次いで100,000×ｇで30分間）にかけて
膜を製造した。0.4mM EDTA、10mM MnCl2、0.3nM ［3
H］PGF２α及び100,000×ｇ膜フラクション由来タンパ
ク質60μｇを含む10mM MES/KOH（pH6.0）中で、［3H］
プロスタグランジンF2a（［3H］PGF２α）結合アッセイ
を行った。室温で１時間インキュベーションし、次いで
洗浄用緩衝液（ウシ血清アルブミンを0.01％含む10μＭ
のMES/KOH（pH6.0））中４℃で予備含浸したWhatman G
F/Bフィルターを介する高速濾過で結合及び遊離放射性
リガンドを分離した。フィルターを約16mlの洗浄用緩衝
液で洗浄して、フィルターに結合している残りの［3H］
PGF２αを液体シンチレーション計数で定量した。特異
的結合は、２μＭ PGF２αの存在下で測定した総ての
結合と非特異的結合との間の差として定義した。 クローン化ヒトFP受容体をCOS−M6細胞内にトランス
フェクションし、トランスフェクション細胞から製造し
た膜を用いて［3H］PGF２α結合アッセイを実施した。
競合アッセイでは、PGF２αが［3H］PGF２α特異的結合
の最も強力な競合リガンドであり、IC50値が2.8nMであ
った（第６図）。関連した合成FPアゴニストであるフル
プロステノールは同等の強さを有し、IC50値が3.5nMで
あった。プロスタグランジン及び相関類似体の強度の順
位は、PGF２α＝フルプロステノール＞PGD2＞＞PGE2≒U
46619＞イロプロストであった。U46619及びイロプロス
トはトロンボキサン及びプロスタシクリンの安定な類似
体であり、それぞれTP及びIP受容体で類似の強度を示
す。この強度順位は、事前に実施された薬理学的研究で
FP受容体について予測されたものであった。 実施例８ 昆虫細胞内発現のためのバキュロウイルス発現ベクター
内へのFPcDNAのクローニング AcNPVウイルスのゲノムに由来するバキュロウイルス
ベクターを、Sf9系昆虫細胞（ATCC CRL＃1711）内でcD
NAを高レベル発現させるように設計する。FPcDNAを発現
する組換えバキュロウイルスを以下の標準的方法で製造
する（In Vitrogen Maxbac Manual）:FPcDNA構築物
を種々のバキュロウイルストランスファーベクター、例
えばpAC360及びpBlueBacベクター（In Vitrogen）内の
ポリヘドリンプロモーターの下流に連結する。バキュロ
ウイルストランスファーベクター及び線状化AcNPVゲノ
ムDNA［Kitts,P.A.,Nuc.Acid Res.18:5667（1990）］
のSf9細胞内への同時トランスフェクションに次ぐ相同
組換えによって、組換えバキュロウイルスを形成する。
組換えpAC360ウイルスは感染細胞内の封入体の不在によ
って同定され（Summers,M.D.及びSmith,G.E.,Texas Ag
riculture Exp.Station Bulletin No.1555）、組換
えpBlueBacウイルスはβ−ガラクトシダーゼ発現に基づ
いて同定される（Vialardら,1990,J.Virol.,64,pp37−5
9）。プラーク精製及びFP組換えバキュロウイルスでのs
f9細胞の感染後に、前述のアッセイでFP発現を測定す
る。 FPに関する読取り枠全体をコードするcDNAをpBlueBac
IIのBamH I部位に挿入する。ポリヘドリンプロモータ
ーに対して正の向きにある構築物を配列決定によって同
定し、線状AcNPV野生型DNAの存在下でSf9細胞をトラン
スフェクションするために使用する。 真正の活性FPは、感染細胞の膜に結合している。膜調
製物を標準的方法で感染細胞から製造する。 実施例９ 酵母発現ベクター内へのFPcDNAのクローニング 外来性タンパク質の細胞内発現を制御するように設計
した発現ベクター内に最適FPcDNA構築物を挿入した後、
酵母S.cerevisiae内で組換えFPを産生する。細胞内発現
のために、EmBLyex4等のようなベクターをFPシストロン
に連結する［Rinas,U.ら,Biotechnology 8:543−545
（1990）;Horowitz B.ら,J.Biol.Chem.265:4189−4192
（1989）］。発現されたFPのレベルは前述のアッセイで
測定する。 実施例10 組換えFPの精製 組換え技術によって製造したFPは、抗体アフィニティ
クロマトグラフィーによって精製し得る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との間で共有結合
を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルで予め活性化したゲル支持体であるAffigel−10（Bio
rad）に抗FP抗体を加えることによって、FP抗体アフィ
ニティカラムを形成する。抗体はスペーサーアームのア
ミド結合を介してゲルに結合する。次いで、残りの活性
化エステルを1MエタノールアミンHCl（pH8）で失活す
る。カラムを水及び0.23MグリシンHCl（pH2.6）で順次
洗浄して、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。
次いでカラムを、リン酸塩緩衝食塩水（pH7.3）及び適
当な膜可溶化剤、例えば洗剤の中で平衡化し、可溶化FP
もしくはFPサブユニットを含む細胞培養上清又は細胞抽
出物をカラムにゆっくり通す。次いでカラムを、光学密
度（A280）がバックグラウンドに低下するまでリン酸塩
緩衝食塩水及び洗剤で洗浄し、その後タンパク質を0.23
Mグリシン−HCl（pH2.6）及び洗剤で溶離する。次い
で、精製したFPタンパク質をリン酸塩緩衝食塩水及び洗
剤に対して透析する。
配列番号:1 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 ATAMACCCAG GGRTCCARGA TCTGRTT 配列番号:2 配列の長さ:9 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:3 配列の長さ:373 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:4 配列の長さ:1437 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 配列 配列番号:5 配列の長さ:359 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/577 5/00 Ｂ (72)発明者 グリゴルツイク，リシヤール カナダ国、ケベツク・アシユ・９・ア ー・２・ペー・８、ドラール・デ・オル モー、ブレントウツド・27 (72)発明者 メターズ，キヤスリーン カナダ国、ケベツク・アシユ・２・イク ス・１・ドウブレベ・４、モントリオー ル、ミルトン・570、アパートメント・ 18 (72)発明者 グイエン，トウルイエン カナダ国、ケベツク・アシユ・９・ペ ー・１・エル・３、ドーバル、キヤンベ ル・アベニユー・2220 (72)発明者 ラシユモア，トーマス・エイチ カナダ国、ケベツク・アシユ・９・ベ ー・２・エール・９、ドラール・デ・オ ルモー、ドナコナ・プレイス・38 (72)発明者 スリペツ，デボラ カナダ国、ケベツク・アシユ・２・ベ ー・１・ドウブレベ・５、オートレモン ト、バーナード・アベニユー・1465、ア パートメント・９ (56)参考文献 特表 平８−502061（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/705 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (18)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列： を有することを特徴とする、単離し精製されたヒトプロ
スタグランジンFP受容体タンパク質。 - 【請求項２】ヒトプロスタグランジンFP受容体タンパク
質をコードする単離し精製されたDNA分子であって、前
記タンパク質が請求項１に記載のアミノ酸配列を有する
ことを特徴とする前記DNA分子。 - 【請求項３】ヒトプロスタグランジンFP受容体タンパク
質をコードする単離し精製されたDNA分子であって、下
記のヌクレオチド配列： を有することを特徴とする前記DNA分子。 - 【請求項４】組換え宿主細胞内でヒトプロスタグランジ
ンFP受容体タンパク質を発現させるための発現ベクター
であって、請求項３に記載のDNA分子を含む前記発現ベ
クター。 - 【請求項５】組換えヒトプロスタグランジンFP受容体タ
ンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項４に記載
の発現ベクターを含む前記宿主細胞。 - 【請求項６】組換え宿主細胞内でヒトプロスタグランジ
ンFP受容体タンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項４に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞
内にトランスファーし、（ｂ）ステップ（ａ）の宿主細
胞を発現ベクターからのヒトプロスタグランジンFP受容
体タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する操作
を含む前記方法。 - 【請求項７】ヒトプロスタグランジンFP受容体活性の調
節因子を同定する方法であって、（ａ）プロスタグラン
ジン受容体活性の推定上の調節因子を、請求項１に記載
のアミノ酸配列の全体又は部分を有することを特徴とす
るヒトプロスタグランジンFP受容体と混合し、（ｂ）ヒ
トプロスタグランジンFP受容体に対する推定上の調節因
子の作用を測定する操作を含む前記方法。 - 【請求項８】ヒトプロスタグランジンFP受容体タンパク
質に特異的に結合する抗体であって、前記タンパク質が
請求項１に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とす
る前記抗体。 - 【請求項９】以下のａ）乃至ｅ）の工程を含む、ある化
合物がプロスタグランジンFP受容体活性を調節するか否
かを決定する方法； ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むヒトプロス
タグランジンFP受容体を発現する核酸分子によって宿主
細胞を形質導入又は形質転換して、組換FP受容体発現細
胞を得る； ｂ）該FP受容体発現細胞を該化合物に接触させる； ｃ）組換ヒトプロスタグランジンFP受容体タンパク質を
発現しないコントロール宿主細胞を工程ｂ）の該化合物
と接触させる； ｄ）FP受容体発現細胞に存在するヒトプロスタグランジ
ンFP受容体タンパク質に対する該化合物の調節効果及び
コントロール宿主細胞に対する該化合物の調節効果を決
定する； ｅ）該化合物のFP受容体発現細胞に存在するヒトプロス
タグランジンFP受容体タンパク質に対する調節効果とコ
ントロール宿主細胞に対する調節効果とを比較する。 - 【請求項１０】工程ａ）の宿主細胞がアフリカツメガエ
ル卵母細胞である、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】以下のａ）乃至ｇ）の工程を含む、ある
化合物がプロスタグランジンFP受容体への結合について
既知のプロスタグランジンFP受容体リガンドと競合する
か否かを決定する方法； ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むヒトプロス
タグランジンFP受容体を発現する核酸分子発現ベクター
によって宿主細胞を形質導入又は形質転換して、組換FP
受容体発現細胞を得る； ｂ）該FP受容体発現細胞から実質的に純粋な細胞膜調製
物を単離する； ｃ）組換ヒトプロスタグランジンFP受容体タンパク質を
発現しないコントロール宿主細胞から実質的に純粋な細
胞膜調製物を単離する； ｄ）工程ｂ）及び肯定ｃ）の細胞膜調製物を、化合物及
び既知のプロスタグランジンFP受容体リガンドと接触さ
せる； ｅ）工程ｂ）の膜調製物に存在するヒトプロスタグラン
ジンFP受容体タンパク質に対する該化合物の結合を決定
する； ｆ）工程ｃ）の膜調製物に対する該化合物の結合を決定
する； ｇ）該化合物の工程ｂ）の膜調製物に存在するヒトプロ
スタグランジンFP受容体タンパク質に対する結合と工程
ｃ）の膜調製物に対する結合とを比較する。 - 【請求項１２】プロスタグランジンFP受容体リガンド
が、プロスタグランジン受容体タンパク質への結合をPG
F２αと競合したときに約１μＭのリガンド濃度におい
てプロスタグランジンFP受容体タンパク質に対する最大
特異的結合値の50％を示す、請求項11に記載の方法。 - 【請求項１３】プロスタグランジンFP受容体リガンドが
PGF２α、フルプロステロール及びPGD2よりなる群から
選ばれる、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１４】ヒトプロスタグランジンFP受容体をコー
ドするDNA分子によって形質導入又は形質転換された組
換宿主細胞から得られる請求項１に記載のヒトプロスタ
グランジンFP受容体。 - 【請求項１５】ヒトプロスタグランジンFP受容体をコー
ドするDNA分子によって形質導入又は形質転換された組
換宿主細胞から得られる、請求項14に記載のヒトプロス
タグランジンFP受容体を含む膜調製物。 - 【請求項１６】他のヒト由来のタンパク質を含まない、
配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるヒトプロスタ
グランジンFP受容体。 - 【請求項１７】ヒトプロスタグランジンFP受容体をコー
ドするDNA分子によって形質導入又は形質転換された組
換宿主細胞から得られる、請求項16に記載のヒトプロス
タグランジンFP受容体。 - 【請求項１８】ヒトプロスタグランジンFP受容体をコー
ドするDNA分子によって形質導入又は形質転換された組
換宿主細胞から得られる、請求項17に記載のヒトプロス
タグランジンFP受容体を含む膜調製物。
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