JPH11505701A - プロスタグランジン受容体ｆｐ及び該受容体をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規のプロスタグランジン受容体を同定し、該受容体をコードするＤＮＡを単離し、精製し、配列決定し、宿主細胞内で発現させた。新規のプロスタグランジン受容体をコードする前記ＤＮＡ及び前記受容体を発現する宿主細胞を用いて、プロスタグランジン受容体の調節因子を同定する。

Description

【発明の詳細な説明】 プロスタグランジン受容体ＦＰ及び該受容体をコードするＤＮＡ発明の背景 プロスタグランジン（ＰＧ）Ｆ_{2 α}の生理的作用は、プロスタグランジンＦ_{2 α} （ＦＰ）受容体との相互作用を介して発揮される。この受容体はこれまでに単離 又は精製されていない。ＦＰをコードするＤＮＡ及びＦＰ受容体タンパク質のア ミノ酸配列も知られていなかった。ＦＰ受容体は通常、ヒト及び他の動物の小腸 、黄体、胎盤、卵巣、脳、子宮筋層、肺、腎臓、胃、筋肉、目、子宮及び気管を 含む広範な細胞上に存在する。ＦＰ受容体タンパク質がプロスタグランジンと結 合すると、細胞内カルシウムの濃度が増加する。組織はこのシグナルに基づいて 例えば筋肉収縮により応答し、目では間接的に眼圧が低下する。ＰＧＦ_{2 α}は強 力な黄体分解剤（ｌｕｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｇｅｎｔ）であるため、主に黄体組 織を使用してＰＧＦ_{2 α}結合部位（ＦＰ受容体）の研究が実施されてきた［Ｐｏ ｗｅｌｌら，１９７４ Ｌａｎｃｅｔ，１，ｐｐ．１１２０；Ｐｏｗｅｌｌｏ， １９７４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４１， ｐｐ．１０３−１０７］。ＦＰ受容体の機能活性は、ウサギの空腸並びにネコ、 去勢雄ウシ及びイヌの虹彩括約筋組織のような組織調製物を用いて研究されてき た［Ｄｏｎｇ及びＪｏｎｅｓ，１９８２，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ．，７６， ｐｐ．１４９−１５５；Ｗｅｌｂｕｒｍ及びＪｏｎｅｓ，１９７８，Ｐｒｏｓｔ ａｇｌａｎｄｉｎｓ，１５，ｐｐ．２８７］。ＦＰ受容体の活性を調べるための 前述の方法は、異なるリガンド結合特性を有する、互いに異なるが相関している 複数の受容体集団を含む組織調製物を必要とし、従って絶対的能力及び選択性が 得られないため、不都合な点がある。また、組織のＦＰ受容体含量が極めて低く 、且つ組織試料が必要とされるため、各化合物のヒトＦＰ受容体に対する作用物 質としての性能を十分に検査することができない。発明の概要 ＦＰと称する新規のプロスタグランジン受容体タンパク質がヒト細胞から同定 された。完全長ＦＰタンパク質をコードするＤＮＡ分子を単離し、精製し、ヌク レオチド配列を決定した。ＦＰをコードするＤＮＡを発現ベクター内にクローニ ングし、これらの発現ベクターを組換え宿主細胞 内に導入すると、組換え宿主細胞が機能的ＦＰ受容体タンパク質を発現した。こ れらの新規のＦＰタンパク質、ＦＰをコードするＤＮＡ、組換えＦＰを発現する 発現ベクター及び組換え宿主細胞は、ＦＰ受容体活性の調節因子の選定に有用で ある。 組換えＦＰ発現宿主細胞を使用するＦＰ受容体調節因子の同定方法も開示する 。ＦＰ活性調節因子は、プロスタグランジン関連疾患の治療及びＦＰ受容体に対 するプロスタグランジンの作用の調節に有用である。図面の簡単な説明 第１図Ａ及びＢは、ＦＰ受容体タンパク質をコードするＤＮＡの完全配列を示 している。 第２図は、ＦＰ受容体タンパク質の推定アミノ酸完全配列を示している。 第３図Ａ及び第３図Ｂは、ＦＰ−ｃＤＮＡを注入したアフリカツメガエル卵母 細胞内でのプロスタグランジンＦ_{2 α}受容体の発現を示している。第３図Ａ：２ ０ｎＭ ＰＧＦ_{2 α}の浴潅流（ｂａｔｈ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）で生起した内向 Ｃａ²⁺依存Ｃｌ^-流（下方への偏位として示される）。第３図Ｂ：１０ｎＭのフ ルプロステノール（ｆｌｕｐｒｏ ｓｔｅｎｏｌ）の浴潅流で生起した内向Ｃａ²⁺依存Ｃｌ^-流（下方への偏位とし て示される）。卵母細胞には１ｎｇのＦＰ ｃＤＮＡを注入し、−６０ｍＶに電 圧を固定した。 第４図Ａ〜Ｃは、組換えＦＰ受容体を発現するエクオリン導入卵母細胞内での ＰＧＦ_{2 α}誘発光応答であり、各ＰＧＦ_{2 α}濃度で検査した５個の卵母細胞の個々 の応答を重ね合わせて示している。１０秒の時点で記録キュベット内にリガンド を加えた。エクオリン発光は相対単位で示されており、バックグラウンド発光は 典型的には０．５〜０．７単位である。 第５図は、種々の濃度のＰＧＦ_{2 α}、フルプロステノール及びＰＧＥ₂で生起し た光応答の平均値を示している。各縦グラフは同一ドナーに由来する５個の卵母 細胞の応答の平均値を示し、各縦グラフの上方の数字は応答する卵母細胞の数を 示している。別の５匹のドナーに由来する卵母細胞についても類似の結果が得ら れた。 第６図は、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ−ｈＦＰトランスフェクションＣＯＳ−Ｍ６膜 への［³Ｈ］ＰＧＦ_{2 α}の特異的結合の競合を示している。［³Ｈ］ＰＧＦ_{2 α}結合 アッセイは、 ０．０３ｎＭ〜１０μＭ ＰＧＦ₂（■）、フルプロステノール（●）、ＰＧＤ₂ （□）、ＰＧＥ₂（○）、Ｕ４６６１９（△）及びイロプロスト（ｉｌｏｐｒｏ ｓｔ）（◇）の存在下で、「方法」の説明に記載のように実施した。発明の詳細な説明 本発明は、ＦＰとここに命名する新規のプロスタグランジン受容体をコードす るｃＤＮＡに関する。本発明は、組換え発現プラスミド内に含まれているクロー ン化ＦＰコーディングＤＮＡを発現する組換え宿主細胞にも関する。本発明は、 ＦＰ受容体活性を調節する物質のスクリーニング方法にも関する。本発明のＤＮ Ａは、ＦＰ産生細胞から単離される。本明細書で使用するＦＰという用語は、プ ロスタグランジン分子に特異的に結合できるＧタンパク質結合受容体を意味する 。 ＦＰを産生することができる哺乳動物細胞の非限定的具体例としては、小腸、 腎臓、胃、筋肉、目、胎盤、子宮及び気管に由来する細胞が挙げられる。ＦＰを 産生する形質転換哺乳動物細胞系の非限定的具体例としては、３Ｔ３線維芽細胞 が挙げられる。本発明のために好ましい細胞は例えばヒト正常腎臓細胞及び胎盤 細胞であり、最も好ましい 細胞はヒト黄体細胞である。 他の細胞及び細胞系もＦＰｃＤＮＡの単離に使用するのに適当であり得る。適 当な細胞の選択は、細胞表面のＦＰのスクリーニングによって実施し得る。ＦＰ 活性検出方法は当業者によく知られており、受容体に特異的な放射性標識リガン ドの結合を測定する。このアッセイでＦＰ活性を示す細胞は、ＦＰｃＤＮＡの単 離に適当であり得る。 ＦＰｃＤＮＡのクローニングには、種々の方法のうちの任意のものを使用し得 る。これらの方法の非限定的具体例としては、適当な発現ベクター系内でＦＰ含 有ｃＤＮＡライブラリーを構築した後、ＦＰｃＤＮＡを直接機能発現させる方法 が挙げられる。別の方法として、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベ クター内で構築したＦＰ含有ｃＤＮＡライブラリーを、ＦＰタンパク質のアミノ 酸配列から設計した標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングする方法 もある。好ましい方法は、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクター 内で構築したＦＰ含有ｃＤＮＡライブラリーを、ＦＰタンパク質をコードする部 分的ｃＤＮＡでスクリーニングすることからなる。前記部分的ｃＤＮＡは、プロ スタグランジンＦＰ受容体と相関 している別のＧタンパク質結合受容体について知られているアミノ酸配列から縮 重オリゴヌクレオチドプライマーを設計して、ＦＰ ＤＮＡフラグメントの特異 的ＰＣＲ増幅を行うことにより得る。 当業者には容易に理解されるように、別の種類のライブラリー、並びに別の細 胞もしくは細胞種類から構築したライブラリーも、ＦＰをコードするＤＮＡの単 離に有用であり得る。別の種類のライブラリーの非限定的具体例としては、別の 細胞又は細胞系に由来するｃＤＮＡライブラリー、及びゲノムＤＮＡライブラリ ーが挙げられる。 当業者には明らかなように、適当なｃＤＮＡライブラリーは、ＦＰ活性を有す る細胞又は細胞系から製造し得る。ＦＰｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライ ブラリーの製造で使用する細胞又は細胞系の選択は、本発明で使用する前述の公 知の標識リガンド結合アッセイを用いて、事前に細胞結合ＦＰ活性を測定するこ とにより実施し得る。 ｃＤＮＡライブラリーの製造は、当業者によく知られている標準的方法で実施 できる。よく知られているｃＤＮＡライブラリー構築方法は、例えばＭａｎｉａ ｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２）に記載されている 。 これも当業者には明らかであろうが、ＦＰをコードするＤＮＡは適当なゲノム ＤＮＡライブラリーからも単離し得る。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当 業者によく知られている標準的方法で実施できる。よく知られているゲノムＤＮ Ａライブラリー構築方法は、例えばＭａｎｉａｔｉｓらの前出の文献に記載され ている。 好ましい方法のいずれかによってＦＰ遺伝子をクローニングするためには、Ｆ Ｐ又は相同タンパク質のアミノ酸配列又はＤＮＡ配列の情報が必要である。その ためには、ＦＰタンパク質又は相同タンパク質を精製し、自動配列決定器で部分 的アミノ酸配列を決定し得る。完全長のアミノ酸配列を決定する必要はなく、部 分的ＦＰ ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためには、アミノ酸６〜８個分の二つの領 域の直鎖配列を決定するとよい。 適当なアミノ酸配列が同定されたら、これらをコードす ることができるＤＮＡ配列を合成する。遺伝子コードは縮重であるため、特定の アミノ酸をコードするため２個以上のコドンを使用し得ることがあり、従ってア ミノ酸配列は、一組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのうちのいずれかでコー ドされる。前記一組のＤＮＡオリゴヌクレオチドのうち一つだけがＦＰ配列と同 じであるが、その組の残りも不適正状態を伴うものの、ＤＮＡオリゴヌクレオチ ドの存在下でＦＰ ＤＮＡにハイブリダイズすることができる。不適正ＤＮＡオ リゴヌクレオチドでも、ＦＰをコードするＤＮＡの同定及び単離を可能にするの に十分な程度にＦＰ ＤＮＡにハイブリダイズし得る。 好ましい方法のいずれかを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの 技術及びｃＤＮＡライブラリースクリーニングを使用する２段階方法で、ＦＰを コードするｃＤＮＡクローンを単離する。第１段階では、精製ＦＰ又は相同タン パク質からのＮＨ₂末端及び内部アミノ酸配列情報を用いて、ＦＰ特異的ＤＮＡ 断片の増幅のための縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。第２段階で は、前記断片をクローニングして、ｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡを 単離するためのプローブとして使用する。 ＦＰをコードするほぼ完全長のｃＤＮＡの配列を表１に示し、これをクローン ＦＰと名付けた。クローン化ｃＤＮＡに基づくＦＰの推定アミノ酸配列を表２に 示す。決定されたｃＤＮＡ配列を調べると、アミノ酸３５９個のタンパク質をコ ードする単一の大きな読取り枠の存在が明らかになる。 前述の方法で得たクローン化ＦＰｃＤＮＡは、組換えＦＰを産生するために、 適当なプロモーターと他の適当な転写調節エレメントとを含む発現ベクター内へ の分子クローニングにより組換え的に発現し、原核又は真核宿主細胞内にトラン スファーし得る。この種の操作の方法は、前出のＭａｎｉａｔｉｓらの文献に記 載されており、当業者によく知られている。 本明細書では、発現ベクターは、クローン化ＤＮＡの転写と、適当な宿主内で 対応するｍＲＮＡの翻訳とに必要なＤＮＡ配列であると定義される。この種のベ クターは、種々の宿主、例えば細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞内 で真核生物ＤＮＡを発現させるのに使用し得る。 特別に設計したベクターは、細菌−酵母間又は細菌−動 物細胞間のような宿主間のＤＮＡシャトリングを可能にする。適当に構築した発 現ベクターは、宿主細胞内での自律複製のための複製起点と、選択可能マーカー と、限定数の有用な制限酵素部位と、高コピー数の可能性と、活性プロモーター とを含んでいなければならない。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡ に結合させてＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列であると定義される。強力なプ ロモーターは、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモーターである。発現ベクタ ーの非限定的具体例としては、クローニングベクター、修飾クローニングベクタ ー、特別に設計したプラスミド又はウイルスが挙げられる。 哺乳動物細胞内で組換えＦＰを発現するためには種々の哺乳動物発現ベクター を使用し得る。組換えＦＰの発現に適当であり得る市販の哺乳動物発現ベクター の非限定的具体例としては、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ １（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ （ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０） 、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１ ２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐ ＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７ １４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）及びＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）が挙げられる。 ＦＰをコードするＤＮＡは、宿主細胞内での発現のために発現ベクター内にク ローニングしてもよい。宿主細胞は原核細胞又は真核細胞であり得、非限定的具 体例としては細菌、酵母、哺乳動物細胞、例えばヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧 歯類由来の細胞系、並びに昆虫細胞、例えばショウジョウバエ由来の細胞系が挙 げられる。適当であり得る市販の哺乳動物由来細胞系の非限定的具体例としては 、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６ ５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴ ＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）及び ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）が挙げられる。 発現ベクターは、非限定的具体例として例えば形質転換、トランスフェクショ ン、プロトプラスト融合法及び電気穿孔法のような種々の方法のいずれかを用い て、宿主細胞内に導入し得る。発現ベクター含有細胞を個々に分析して、その細 胞がＦＰタンパク質を産生するか否かを決定する。ＦＰ発現細胞の同定は、幾つ かの方法、例えば非限定的具体例として抗ＦＰ抗体に対する免疫学的反応性、及 び宿主細胞結合ＦＰ活性の存在等により実施し得る。 ＦＰ ＤＮＡの発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで製造した合成ｍＲＮＡを用いて実 施してもよい。合成ｍＲＮＡは、種々の無細胞系、非限定的具体例として例えば コムギ胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物中で効率的に翻訳できると共に、細胞ベ ースの系、非限定的具体例として例えばカエル卵母細胞内へのマイクロインジェ クションでも効率的に翻訳できる。好ましいのはカエル卵母細胞へのマイクロイ ンジェクションである。 受容体活性及び／又はＦＰタンパク質を最適レベルにするＦＰｃＤＮＡ配列を 決定するために、例えば下記のようなＦＰｃＤＮＡ分子を構築し得る：ＦＰｃＤ ＮＡの完全長読取り枠、並びに受容体タンパク質の特定ドメインのみも しくは該タンパク質の再構成ドメイン（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｄｏｍａｉｎ） をコードするｃＤＮＡの一部を含む種々の構築物。総ての構築物は、ＦＰｃＤＮ Ａの５’及び／又は３’非翻訳領域を全く含まないか、総て含むか、又は一部含 むように設計し得る。ＦＰ活性及びタンパク質発現レベルは、これらの構築物を 単独で又は組合わせて適当な宿主細胞内に導入した後で決定し得る。過渡アッセ イ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｓｓａｙ）での最適発現を生起させるＦＰｃＤＮＡ カセットの決定に次いで、このＦＰｃＤＮＡ構築物を種々の発現ベクター（組換 えウイルスを含む）、例えば哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、大 腸菌及び酵母細胞用の発現ベクターにトランスファーする。 哺乳動物細胞トランスフェクタントを、ＦＰ受容体活性レベル及びＦＰタンパ ク質濃度の両方について、下記の方法でアッセイする。ＦＰ受容体活性の測定で は、標識リガンドを細胞に直接導入し、ＦＰ発現細胞へのリガンドの特異的結合 の量を決定する。受容体活性に関する結合アッセイは当業者に公知である（Ｆｒ ｅｙら，１９９３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２４４，ｐｐ２３９− ２５０） 。 宿主細胞内のＦＰタンパク質濃度は、種々の方法、例えば非限定的具体例とし てイムノアフィニティ及び／又はリガンドアフィニティ法で定量する。ＦＰ特異 的アフィニティビーズ又はＦＰ特異的抗体を用いて、³⁵Ｓ−メチオニン標識又は 非標識ＦＰタンパク質を単離する。標識ＦＰタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分 析する。非標識ＦＰタンパク質は、ＦＰ特異的抗体を用いて、ウエスタンブロッ ティング、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡアッセイで検出する。 宿主細胞内でのＦＰの発現後、ＦＰ特異的リガンドに結合することができる活 性形態のＦＰを得るべく、ＦＰタンパク質を回収し得る。使用し得るＦＰ精製操 作は幾つか存在する。組換えＦＰは、標準的分離方法、例えば非限定的具体例と して洗剤可溶化、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマト グラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸収クロマトグラフィー及び疎水性相互作 用クロマトグラフィーを単独で又は様々に組合わせて使用することにより、細胞 膜から精製し得る。 また、組換えＦＰは、完全長発生期ＦＰ又はＦＰのポリペプチドフラグメント に特異的なモノクローナル又はポリ クローナル抗体を用いて形成したイムノアフィニティカラムの使用により、別の 細胞タンパク質から分離できる。 ＦＰに対する単一特異性抗体は、ＦＰと反応する抗体を含む哺乳動物抗血清か ら精製するか、又はＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６ ：４９５−４９７（１９７５）に記載の方法を用いて、ＦＰと反応するモノクロ ーナル抗体として製造する。本明細書中の単一特異性抗体は、ＦＰに対して均一 結合特性を示す単一抗体種又は多重抗体種であると定義される。本明細書で使用 する均一結合という用語は、抗体種が特定の抗原又はエピトープ、例えば前述の ようにＦＰと結合した抗原又はエピトープに結合する能力を意味する。ＦＰ特異 的抗体は、マウス、ラット、テンジクネズミ、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動 物を、免疫アジュバントを用いて又は用いずに、適当な濃度のＦＰで免疫感作す ることにより形成する。 最初の免疫感作の前に免疫前血清を採取する。各動物に、約０．１ｍｇ〜約１ ０００ｍｇのＦＰ又はＦＰ関連ペプチドを、許容し得る免疫アジュバントと組合 わせて投与する。許容し得るアジュバントの非限定的具体例としては、フロイン ト完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、 ミョウバン沈降物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ含有油中水 滴エマルション及びｔＲＮＡが挙げられる。最初の免疫感作は、好ましくはフロ イント完全アジュバント中の酵素を、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）又はこれら 両方の経路で複数の部位に投与することによって実施した。各動物の採血を一定 の時間間隔、好ましくは１週間おきに行い、抗体力価を測定する。動物には、最 初の免疫感作後に、ブースター注射をしてもよく、又はしなくてもよい。ブース ター注射をする動物には通常、フロイント不完全アジュバント中の同量のＦＰ又 はＦＰ関連ペプチドを同一経路で投与する。ブースター注射は、最大力価が得ら れるまで約３週間の間隔で行う。各ブースター免疫感作から約７日後、又は単一 免疫感作から約１週間後に動物の採血を行い、血清を回収し、アリコートを約− ２０℃で貯蔵する。 近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃをＦＰ又はＦＰ関連ペプチドで免疫感 作することにより、ＦＰ又はＦＰタンパク質配列由来ペプチドに反応するモノク ローナル抗体（ｍＡｂ）を製造する。マウスは、ＩＰ又はＳＣ経路により、同量 の前述のような許容し得るアジュバントに混入し た約０．５ｍｌの緩衝液又は食塩水中の約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは約 １０ｍｇのＦＰ又はＦＰ関連ペプチドで免疫感作する。好ましいアジュバントは フロイント完全アジュバントである。マウスは０日目に最初の免疫感作を行い、 約３〜約３０週間休息させる。免疫マウスに、リン酸塩緩衝食塩水のような緩衝 溶液中約１〜約１００ｍｇのＦＰのブースター免疫を、静脈内（ＩＶ）経路で一 回以上行う。抗体陽性マウスのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を、当業者に 公知の標準的方法で免疫マウスから脾臓を除去することによって得る。脾臓リン パ球を、安定なハイブリドーマを形成させる条件下で、適当な融合相手、好まし くは骨髄腫細胞と混合して、ハイブリドーマ細胞を形成する。融合相手の非限定 的具体例としては、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ −１９４及びＳｐ ２／０が挙げられる。好ましいのはＳｐ ２／０である。抗 体産生細胞及び骨髄腫細胞を分子量約１０００のポリエチレングリコール中約３ ０％〜約５０％の濃度で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞を、当業者に 公知の方法で、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリン添加ダルベッコ改 質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増 殖させることにより選択する。約１４日目、１８日目及び２１日目に増殖陽性ウ ェルから上清を回収し、ＦＰ又はＦＰ関連ペプチドを抗原として用いて、固相イ ムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイで抗体産生に関する スクリーニングを行う。培養液をＯｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ沈降アッセイでも検査 して、ｍＡｂのイソタイプを調べる。抗体陽性ウェル由来のハイブリドーマ細胞 を、Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒ ｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ及びＰａ ｔｅｒｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７３に記載のＭａｃＰｈ ｅｒｓｏｎの軟寒天法のような方法によってクローニングする。 マウス当たり約０．５ｍｌのプリスチン注射で感作したＢａｌｂ／ｃマウスに 、約２×１０⁶〜約６×１０⁶のハイブリドーマ細胞を感作処理の約４日後に与え 、モノクローナル抗体をｉｎ ｖｉｖｏで産生する。細胞トランスファーの約８ 〜１２日後に腹水を採取し、モノクローナル抗体を当業者に公知の方法で精製す る。 十分な量の特異的ｍＡｂを得るために、ハイブリドーマ を約２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で増殖させることにより、抗ＦＰｍ Ａｂをｉｎ ｖｉｔｒｏで製造する。このｍＡｂを当業者に公知の方法で精製す る。 腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を、種々の血清学的又は免疫学的ア ッセイ、例えば非限定的具体例として、沈降、受動凝集、酵素結合イムノソルベ ント抗体（ＥＬＩＳＡ）法及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法で測定する。 類似のアッセイを使用して、体液又は組織及び細胞抽出物中のＦＰの存在を検出 する。 当業者には明らかなように、単一特異性抗体を産生するための前述の方法は、 ＦＰポリペプチド断片又は完全長ＦＰポリペプチドに特異的な抗体の産生に使用 し得る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との間で共有結合を形成するようにＮ−ヒ ドロキシスクシンイミドエステルで予備活性化したゲル支持体であるＡｆｆｉｇ ｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗体を加えることにより、ＦＰ抗体アフィニティ カラムを形成する。抗体はスペーサーアームのアミド結合を介してゲルに結合す る。次いで、残りの活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で 失活させる。カラムを水及び０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐ Ｈ２．６）で順次洗浄して、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。次いで カラムを、適当な膜可溶化剤、例えば洗剤を含むリン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７． ３）中で平衡化し、ＦＰ又はＦＰ断片を含む細胞培養上清又は細胞抽出物をゆっ くりとカラムに通す。次いでカラムを、光学密度（Ａ₂₈₀）がバックグラウンド に低下するまで、リン酸塩緩衝食塩水及び適当な膜可溶化剤、例えば洗剤で洗浄 し、その後タンパク質を、０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）と洗剤の ような適当な膜可溶化剤とで溶離する。次いで精製ＦＰタンパク質を、リン酸塩 緩衝食塩水と洗剤のような適当な膜可溶化剤とに対して透析する。 本発明のプロスタグランジン受容体をコードするＤＮＡの単離に適した方法の 一つは、別のＧタンパク質結合受容体から得たアミノ酸及び／又はＤＮＡ配列情 報を使用することからなる。別のプロスタグランジン受容体はＧタンパク質結合 であることが分かっているため、トランスメンブラン及び／又は細胞質ドメイン といったような特定の領域又はドメインは、新規の受容体を単離するためのプロ ーブを形成するのに十分な程度の相同を有すると予想される。 プロスタグランジン及びロイコトリエンは、Ｇタンパク 質結合受容体を介して自己のシグナルを形質導入することが知られている。種々 の組織中に存在する異なるＰＧＨ₂／トロンボキサンＡ₂、ＰＧＩ₂、ＰＧＥ₂、Ｐ ＧＤ₂、ＰＧＦ_{2 α}、ＬＴＢ₄及びＬＴＤ₄受容体は文献に記述されている。これら の受容体のうちの一部は可溶化され、部分的に精製され（Ｄｕｔｔａ−Ｒｏｙ， Ａ．Ｋ．ら，（１９８７）ＪＢＣ，２６２，ｐｐ．１２６８５；Ｔｓａｉ，Ａ． Ｌ．ら，（１９８９），ＪＢＣ，２６４，ｐｐ６１；１６８−Ｗａｔａｗａｂｅ ，Ｔ．ら，（１９９０），ＪＢＣ，２６５，ｐｐ．２１２３７）、ヒト血小板Ｔ ＸＡ₂受容体は明らかな均質性を示すまで精製された（Ｕｓｈｉｋｕｂｉ，Ｆ． ら，（１９８９），ＪＢＣ，２６４，ｐｐ．１６４９６）。精製トロンボキサン 受容体は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で約５７ｋＤａを中心とする極め て広いバンドを示した。部分的配列情報を得るのに十分なタンパク質が得られた 。 相同スクリーニングによる別のエイコサノイド受容体遺伝子の単離へのアプロ ーチが、これらの受容体が一次構造で相関しているという想定のもとに行われた （Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｙ．ら，（１９９２），ＪＢＣ，２６７，ｐｐ． ６４６３）。これらの受容体はＧタンパク質結合受容体スーパーファミリーであ るため、トランスメンブラン領域及び細胞質ドメインに存在すると考えられる相 同領域が存在する。従って、プロスタグランジン受容体と相関している種々の既 知のＧタンパク質結合受容体は、相同を有すると思われる所期の受容体タンパク 質コーディングＤＮＡの領域、例えばトランスメンブラン領域に対するＤＮＡプ ローブを得るために使用し得る。 この受容体のトランスメンブラン５〜７領域の大部分をコードする推定上のマ ウスＦＰ受容体ｃＤＮＡの０．３７ｋｂ断片を用いて、ヒト腎臓ライブラリーを スクリーニングし、それから部分的ヒトＦＰｃＤＮＡを単離した。次にこれを、 ３５９アミノ酸受容体をコードするＦＰと称する、２．５ｋｂ ｃＤＮＡクロー ンをヒト子宮ｃＤＮＡライブラリーから単離するために使用した。このタンパク 質をＦＰ受容体と命名した。他の多くのＧタンパク質結合受容体と同様に、ＦＰ 受容体は幾つかの共通の特徴を有する。第一に、推定上の細胞外アミノ末端に３ 個の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位（Ａｓｎ−４、Ａｓｎ−１９及びＡｓｎ２７ ７）が存在する。第二に、エキソフェイシャル（ｅｘｏ ｆａｃｉａｌ）ループ１及び２内に保存システイン残基が存在する。Ｃ末端及び 第三の細胞質ループ全体を通して、複数のセリン残基、タンパク質キナーゼホス ホリル化部位となり得る部位が存在する。ＦＰ受容体は、カチオン性アミノ含有 リガンドに結合する受容体の特徴である、トランスメンブラン３内のアスパラギ ン酸残基を含んでいないが、トランスメンブラン７内の総ての既知のエイコサノ イド受容体内に存在する保存アルギニン（位置２９５）を有する。この領域は、 エイコサノイド受容体の間で最も高度に保存されている。 本発明の新規のプロスタグランジン受容体は、受容体活性を調節する化合物を 選定するためのアッセイ操作で使用するのに適している。本明細書中の受容体活 性の調節には受容体の阻害又は活性化が含まれ、また、受容体活性の正常な調整 への直接的又は間接的作用も含まれる。受容体活性を調節する化合物としては、 アゴニスト、アンタゴニスト及び受容体活性の調整に直接又は間接に作用する化 合物が挙げられる。 本発明のプロスタグランジン受容体は、受容体調節因子を選定するためのアッ セイ操作で使用すべく、野生供給源 及び組換え供給源の両方から得られる。プロスタグランジン受容体調節因子を選 定するためのアッセイ操作は通常、本発明のプロスタグランジン受容体と、推定 上のプロスタグランジン受容体調節因子を含む検査化合物又は試料とを含む。検 査化合物又は試料は、例えば、野生もしくは組換え型の精製受容体タンパク質、 野生もしくは組換え型の受容体産生細胞の継代細胞フラクション、及び／又は野 生もしくは組換え型の受容体発現完全細胞上で直接検査し得る。検査化合物又は 試料は、既知の標識又は非標識受容体リガンドの存在下又は不在下で受容体に加 え得る。検査化合物又は試料の調節活性は、例えば、検査化合物又は試料が受容 体に結合する能力、受容体を活性化する能力、受容体活性を阻害する能力、受容 体への別の化合物の結合を阻害する又は促進する能力を分析し、受容体の調整を 修飾し、又は細胞内活性を修飾することによって測定し得る。 ＦＰ受容体活性の調節因子の選定は、ＦＰ受容体活性が関与する疾患状態の治 療に有用である。別の化合物も、受容体の活性を刺激又は阻害するために有用で あり得る。ＦＰ受容体の選択性アゴニストは、眼圧を低下させることができるた め緑内障の治療に有効であり得、また黄体溶解機 能を刺激することができるため家畜の発情周期を一致させるのに有用であり得る 。ＦＰ受容体に拮抗する化合物は、ＦＰ受容体の活性化が細胞増殖、細胞悪性形 質転換の誘起又は転移性腫瘍成長を引き起こす疾病の治療、又はＦＰ受容体の活 性化が、月経困難症に見られる子宮収縮のような平滑筋収縮を引き起こす病理状 態の治療に有用であり得る。ＦＰをコードするＤＮＡ分子の単離及び精製は、Ｆ Ｐ受容体の組織分布の確立、疾患状態におけるＦＰ受容体発現の変化の研究、及 びＦＰ受容体活性を調節する化合物の選定方法の確立に有用であり得る。 以下の実施例は本発明を明らかにするためのものであり、本発明の範囲を限定 するためのものではない。 実施例１ ＦＰｃＤＮＡのクローニング トランスメンブランドメインVII内の９個の保存アミノ酸（ＮＱＩＬＤＰＷＶ Ｙ）（配列番号：２）に基づいて、アンチセンス１６倍縮重２７量体オリゴヌク レオチド［５’−ＡＴＡ（Ａ，Ｃ）ＡＣＣＣＡＧＧＧ（Ａ，Ｇ）ＴＣＣＡ（Ａ， Ｇ）ＧＡＴＣＴＧ（Ｇ，Ａ）ＴＴ−３’］を合成した。最初に³²Ｐ標識オリゴプ ローブを用いて、標準的方法 （Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ ．Ｙ．）でマウス腎臓λｇｔ１０ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をスクリーニングした。推定上のマウスＦＰ部分ｃＤＮＡ（４ ３０塩基対）をクローニングし、配列決定した。次いでＰＣＲを用いて、マウス の配列に基づき、ヒト腎臓ライブラリ−ｇｔ１１ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃ ｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のスクリーニングに使用するための３７３塩基 対ｃＤＮＡプローブ（下記）を形成した。 推定上のマウスＦＰ部分ｃＤＮＡクローンからＰＣＲによって形成した３７３ 塩基対プローブの配列は下記の通りである： この方法で、長さ約１．７及び１．８ｋｂの二つの部分長ヒトＦＰｃＤＮＡク ローンを得た。これらのクローンのうち一方のクローンに由来する１ｋｂ Ｅｃ ｏＲ１５’断片を精製し、³²Ｐ標識し、ヒト子宮ｇｔ１０ライブラリー（Ｃｌｏ ｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をプローブするのに使用した。このス クリーニングから、２．８ｋｂ ｃＤＮＡクローンをプラーク精製し、ＤＮＡを プレート溶解物法で製造した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出文献）。ｃＤＮＡのサブクローニング及び配列決定 ２．５ｋｂ ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化した結果、大きさ１．８ｋｂ及び０ ．７ｋｂの２個の挿入物を含んでいることが判明した。サザンブロット分析で、 １．８ｋｂ挿入物のみがヒト受容体部分ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズする ことが明らかにされた。Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ配列決定キット（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）を用いて配列決定するために、この１．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片（Ｆ Ｐ） をｐＫＳベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内にサブ クローニングした。ＤＮＡは、ＫＳ及びＳＫプライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）又は決定された配列から形成したプライマーを用い て、両鎖とも完全に配列決定された。ＦＰのヌクレオチド配列を表１に示す。コ ードされたタンパク質のアミノ酸配列を表２に示す。１．８ｋｂ断片（ＦＰ；第 １図）は、配列決定の結果、ヒトトロンボキサン受容体ｃＤＮＡに対して配列相 同を有することが判明し、Ｇタンパク質結合受容体の特徴と推測されているヘプ タヘリカル構造が明らかにされた。予想された相対分子質量４０，０６０を有す る３５９アミノ酸ポリペプチドを形成するであろう長い読取り枠（１０７７塩基 対）が決定された。開始コドンとされるＡＴＧは、翻訳開始のためのＫｏｚａｋ 共通配列（Ｋｏｚａｋ，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０８，ｐｐ２ ２９−２４１）に適合する。ＦＰｃＤＮＡは、約１２００塩基対の長い３’非翻 訳領域を含む。 実施例２ ｐｃＤＮＡＩａｍｐ−ＦＰ発現ベクターの構築 １．８ｋｂ ＥｃｏＲＩヒトＦＰｃＤＮＡ断片をｐｃＤ ＮＡＩａｍｐののＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、方向が正しいことをＰ ｓｔＩ消化によって確認した。 実施例３ 大腸菌発現ベクター内へのＦＰｃＤＮＡのクローニング 非限定的具体例としてｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような大腸菌発現 ベクター内にＦＰ発現カセットをトランスファーして、大腸菌内で組換えＦＰを 産生する。ｐＥＴベクターはＦＰ発現を、厳密に調節されたバクテリオファージ Ｔ７プロモーターの制御下におく。誘導ｌａｃプロモーターによって制御される Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む大腸菌宿主内への該構築 物のトランスファーに次いで、適当なｌａｃ基質（ＩＰＴＧ）を培養物に加える と、ＦＰの発現が誘発される。発現ＦＰのレベルを前述のアッセイで測定する。 ＦＰに関する読取り枠全体をコードするｃＤＮＡを、ｐＥＴ １１ａのＮｄｅ Ｉ部位に挿入する。正の方向の構築物を配列解析によって同定し、発現宿主株Ｂ Ｌ２１の形質転換に使用する。次いで、形質転換体を用いて、ＦＰタンパク質を 製造するための培養物に接種する。培養物は、当業者に組成が知られているＭ９ 又はＺＢ培地で増殖させ得る。約ＯＤ₆₀₀＝１．５まで増殖した後、１ｍＭ Ｉ ＰＴＧを用いて３７℃で３時間にわたりＦＰの発現を誘発する。 これらの細胞に由来する膜フラクション中に、ＦＰ受容体結合活性が発見される 。 実施例４ アフリカツメガエル卵母細胞マイクロインジェクションによる合成ＦＰｍＲＮＡ のｉｎ ｖｉｖｏ翻訳及び哺乳動物細胞内での発現 ＦＰｃＤＮＡ構築物をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ベクター（ｐＧＥＭシリーズ、Ｐ ｒｏｍｅｇａ）に連結して、合成ｍＲＮＡを製造する。 合成ｍＲＮＡは、ＦＰｍＲＮＡをコードする二本鎖ＤＮＡをバクテリオファー ジプロモーター含有プラスミドベクター内にクローニングし、クローン化ＦＰコ ーディングＤＮＡを含むプラスミドベクターを線状とし、プラスミドベクター上 のバクテリオファージプロモーターを特異的に認識するバクテリオファージから ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてクローン化ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写することにより、十分な量で製造される。 バクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるバク テリオファージプロモーターを含むプラスミドベクターは様々なものが存在し、 非限定的具体 例としては、プラスミドｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＳＰ７０、ｐＳＰ７１、ｐ ＳＰ７２、ｐＳＰ７３、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭ−４Ｚ、ｐＧＥＭ−３Ｚｆ、 ｐＧＥＭ−５Ｚｆ、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ、ｐＧＥＭ−９Ｚｆ及びｐＧＥＭ−１１Ｚ ｆが挙げられる。これら一連のプラスミドは総てＰｒｏｍｅｇａから市販されて いる。 ＦＰ ＤＮＡのクローニングに適している、ベクター上の使用可能な制限エン ドヌクレアーゼクローニング部位のうちの一つ以上を使用して、ＦＰをコードす る二本鎖ＤＮＡをベクター含有バクテリオファージプロモーター内に正確な向き でクローニングする。連結したＦＰ ＤＮＡを有するベクターを用いて細菌を形 質転換し、正確な向きのＦＰ ＤＮＡを有するベクターの存在についてクローン 単離体を分析する。 正確な向きのＦＰコーディングＤＮＡを含むベクターが同定され単離されたら 、これをＦＰ転写単位よりも下流の部位において、該単位を破損しないように制 限エンドヌクレアーゼで開裂することにより線状化する。線状化プラスミドを単 離し、精製し、ＦＰ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の鋳型として使用する。 次いで鋳型ＤＮＡを、ＦＰｍＲＮＡ形成ＤＮＡ鋳型の転写を可能にする反応混 合物中で、バクテリオファージ特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと混合す る。使用可能なバクテリオファージ特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは幾 つか存在し、非限定的具体例としてＴ３、Ｔ７及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ が挙げられる。次いで、合成ＦＰｍＲＮＡを単離し、精製する。 ｍＲＮＡの安定性を改善するために、５’末端キャップ構造及び３’ポリＡテ ールを含むｍＲＮＡを合成すると有利であり得る。キャップ構造、即ち７−メチ ルグアノシンは、ＤＮＡ鋳型との反応混合物に７−メチルグアノシンを加えるだ けでｍＲＮＡの５’末端に組込み得る。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ｍ ＲＮＡの合成中にキャップ構造を５’末端に組み込む。ポリＡテールは多くのｃ ＤＮＡ中に天然に存在するが、ポリＡテールをコードするＤＮＡ配列をＤＮＡ鋳 型の３’末端に挿入することにより、ｍＲＮＡの３’末端に簡単に付加できる。 単離し精製したＦＰｍＲＮＡは、無細胞系、例えば非限定的具体例としてウサ ギ網状赤血球溶解物及びコムギ胚芽抽出物（どちらもＰｒｏｍｅｇａ及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａ ｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒから市販されている）を用いて、又は細胞ベースの系、例 えば非限定的具体例としてアフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロインジェク ションを用いて翻訳する。好ましくいのはアフリカツメガエル卵母細胞へのマイ クロインジェクションである。 アフリカツメガエル卵母細胞に、ＦＰタンパク質の産生に十分な量の合成ＦＰ ｍＲＮＡをマイクロインジェクションする。マイクロインジェクションにかけた 卵母細胞をインキュベートしてＦＰｍＲＮＡの翻訳を生起させ、ＦＰタンパク質 を産生させる。 前記合成ｍＲＮＡは、標準的方法［Ｇｕｒｄｏｎ，Ｊ．Ｂ．及びＷｉｃｋｅｎ ｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：３７０−３８ ６（１９８３）］でアフリカツメガエル卵母細胞（段階５〜６）内に注入する。 卵母細胞を採取し、後述のようにＦＰ発現について分析する。 実施例５ アフリカツメガエル卵母細胞内でのｐｃＤＮＡＩａｍｐ−ＦＰ発現 標準的外科方法を用いてメス成体Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａ ｅｖｉｓ から卵母細胞を採取した（Ｃｏｌｍａｎ，Ａ．，１９８４，Ｔｒａｎｓ ｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ − Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）。卵胞細胞を除去するために、Ｃ ａ²⁺無含有ＮＤ９６溶液（ＮａＣｌ ９６ｍＭ、ＫＣｌ ２ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ １ｍＭ、ＨＥＰＥＳ ５ｍＭ、ピルビン酸Ｎａ ２．５ｍＭ、テオフィリン ０ ．５ｍＭ、ゲンタマイシン ５０ｍｇ／ｍｌ、＋１．８ ＣａＣｌ₂、ｐＨ７． ６）中で新しく調製したコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ，タイプ２，Ｗｏｒｔｈｉ ｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ） で卵母細胞を２〜３時間処理した。卵胞除去した段階５〜６の卵母細胞を選択し 、ＮＤ９６溶液中に維持した。卵母細胞核に１〜５ｎｇのｐｃＤＮＡＩａｍｐ− ＦＰを注入し、次いで１８℃で４８時間インキュベートし、その後アゴニストで 感作した。アゴニスト誘導Ｃａ²⁺依存性Ｃｌ^-流、又はＣａ²⁺特異的発光タンパ ク質エクオリン（Ｊ．Ｂｌｉｎｋｓ，Ｆｒｉｄａｙ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｈｏｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＷＡ）注入卵母細胞における発光を測定することにより、機 能活性を決定した（Ｇｉｌａｄｉ及 びＳｐｉｎｄｅｌ １９９１ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１０，ｐｐ７４４ −７４７）。電気生理学的アッセイのために、卵母細胞を０．５ｍｌ潅流チャン バ内に配置し、Ｔｕｒｂｏ ＴＥＣ ０１Ｃ増幅器（ＮＰＩ Ｉｎｓｒｕｍｅｎ ｔｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて−６０ｍＶに電圧を固定した（３Ｍ ＫＣｌを 充填した抵抗０．５〜２．０ＭΩの微小電極を使用）。リガンド含有溶液を潅流 し、電流応答を記録した。光測定アッセイのために、エクオリン導入卵母細胞（ １００ｎｇ／卵母細胞）を０．４ｍｌのＮＤ９６を入れたキュベット内に個々に 配置し、リガンドの添加によって誘起した発光をＢｉｏ−Ｏｒｂｉｔ １２５１ ルミノメーター（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．Ｌｔｄ．）で記録した。 電気生理学的アッセイ及びエクオリン発光アッセイを用いて、ｐｃＤＮＡＩａ ｍｐ−ＦＰ注入卵母細胞内の機能活性を測定した。電気生理学的アッセイでは、 １０〜２０ｎＭのＰＧＦ_{2 α}、又は選択性ＦＰ受容体アゴニストであるフルプロ ステノール１０ｎＭの潅流の結果、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ−ＦＰ注入卵母細胞内に 明らかな電流応答が観察された。これは、このクローンが、ホスファチジルイノ シトー ル／Ｃａ²⁺シグナル経路に結合した機能的ＦＰ受容体をコードすることを確認す るものである（第３図）。このような応答は、（Ｈ₂Ｏを注入した）対照卵母細 胞には見られなかった。リガンドに誘発される細胞内Ｃａ²⁺の増加も、エクオリ ン導入卵母細胞内の発光によって直接示された（第４図）。エクオリン発光アッ セイで得られた用量応答依存性は、発現された受容体のアゴニストとして、ＰＧ Ｆ_{2 α}及びフルプロステノールがＰＧＥ₂より強力であることを意味するものであ った（第５図）。この強度の順位は、ＦＰ受容体に関して報告されているものと 合致する［Ｃｏｌｅｍａｎら，１９９１］。 実施例６ 哺乳動物発現ベクター内へのＦＰｃＤＮＡのクローニング ＦＰｃＤＮＡ発現カセットを、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位で、強力な 普遍的哺乳動物プロモーターを含む下記のベクターに連結する：ｐＢＣ１２ＢＩ ［Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２： ６８４−７０４，１９８８］、並びにｐＥＥ１２（ＣｅｌｌＴｅｃｈ ＥＰ ３ ３８，８４１号）及びその誘導体ｐＳＺ９０１６−１及びｐ９０１９。ｐ９０１ ９は、 ｈＣＭＶＩＥプロモーターと、ポリリンカーと、ＳＶ４０ポリＡエレメントとを 含み、ＳＶ４０初期プロモーターによって操作されるジヒドロ葉酸レダクターゼ の突然変異遺伝子（ｍＤＨＦＲ）（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，Ｃ．Ｃ．及びＬｅｖｉｎ ｓｏｎ，Ａ．Ｄ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２４ ９５−２４９９［１９８３］）からなる選択可能マーカー／増幅システムを有す る哺乳動物発現ベクターの構築を表す。ＳＶ４０ポリアデニル化配列を、ｐＤ５ （Ｂｅｒｋｅｒ及びＳｈａｒｐ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１３：８４１− ８５７［１９８５］）を鋳型として用いて、プライマー１３９７８−１２０及び １３９７７８−１２１により決定されるＰＣＲ反応で形成する。得られた０．２ ５Ｋｂ ＰＣＲ生成物をＣｌａＩ及びＳｐｅＩで消化し、同様に消化したｐＥＥ １２の６．７Ｋｂ断片に連結する。得られたプラスミドをＢｇｌII及びＳｆｉＩ で消化して、ＳＶ４０初期プロモーターの３’部分とＧＳｃＤＮＡとをベクター から切り離す。プラスミドｐＦＲ４００（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，Ｃ．Ｃ．ら，前出 文献）から分離した０．７３Ｋｂ ＳｆｉＩ−ＸｈｏII断片を前述の５．６Ｋｂ ベクターに連結し、ＳＶ４０初期プロモー ターを再構築し、ｍＤＨＦＲ遺伝子を挿入する。このプラスミドをｐ９０１９と 名付ける。ｐＳＺ９０１６−１は、ＨＩＶ ＬＴＲがｈｕＣＭＶＩＥプロモータ ーにとって代わっている以外は、ｐ９０１９と同じである。このベクターは、ｐ ９０１９をＸｂａＩ及びＭｌｕＩで消化してｈｕＣＭＶＩＥプロモーターを除去 することにより構築される。残基−１１７〜＋８０（ＨＩＶ−１ ＬＴＲの部分 を含むベクターｐＣＤ２３内に存在する（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｃｅｌｌ ４６：９７ ３［１９８６］）のＨＩＶ ＬＴＲプロモーターを、生成物の末端に５’側のＭ ｌｕＩ及びＳｐｅＩ制限部位を付加したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて 、プラスミドｐＣＤ２３からＰＣＲ増幅する。ＨｉｎｄIII及びＸｂａＩ部位は ３’側に付加されている。得られた０．２ｋｂ ＰＣＲ生成物を酵素ＭｌｕＩ及 びＸｂａＩで消化した後、この断片をアガロースゲルで精製し、プロモーターを 含まない４．３Ｋｂ ＤＮＡ断片に連結して、ベクターｐＳＺ９０１６−１を形 成する。 プロモーターに対して正の向きにあるＦＰｃＤＮＡを含むカセットをプロモー ターの適当な制限部位３’に連結し、制限部位マッピング及び／又は配列決定に よって同定する。 これらのｃＤＮＡ発現ベクターを種々の宿主細胞、例えば非限定的具体例として ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ♯ＣＲＬ１６５１）、ＣＶ−１ｔａｔ［Ｓａｃｋｅｖｉｔ ｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１５７５（１９８７）］，２９３，Ｌ細胞（Ａ ＴＣＣ♯ＣＲＬ６３６２）に、標準的方法、例えば非限定的具体例として電気穿 孔法又は化学的処理（カチオン性リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カ ルシウム）で導入する。トランスフェクションした細胞及び細胞培養抽出物を回 収して、後述のようにＦＰ発現について分析し得る。 哺乳動物過渡的発現に使用した総てのベクターは、ＦＰを発現する安定な細胞 系の確立に使用できる。発現ベクター内にクローニングした変更していないＦＰ ｃＤＮＡ構築物は、宿主細胞を細胞内ＦＰタンパク質を作るようにプログラムす ると推測される。トランスフェクション宿主細胞の非限定的具体例としては、Ｃ Ｖ−１［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚら，前出文献］、ｔｋ−Ｌ［Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅ ｌｌ １１：２２３（１９７７）］、ＮＳ／Ｏ及びｄＨＦｒ−ＣＨＯ［Ｋａｕｆ ｍａｎ及びＳｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１（１９８２）］ が挙げられる。 ＦＰｃＤＮＡを含む任意のベクターと、薬剤選択性プラスミド、例えば非限定 的具体例としてＧ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ｐＬＮ ＣＸ［Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．及びＲｏｓｍａｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｎｅｗｓ ７：９８０−９９０（１９８９）］；ハイグロマイシン、ハイグロマ イシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ，ｐＬＧ９０［Ｇｒｉｔｚ，Ｌ．及びＤａ ｖｉｅｓ，Ｊ．，ＧＥＮＥ ２５：１７９（１９８３）］、ＡＰＲＴ、キサンチ ン−グアニン、ホスホリボシル−トランスフェラーゼ、ｐＭＡＭ（Ｃｌｏｎｔｅ ｃｈ）［Ｍｕｒｒａｙら，Ｇｅｎｅ ３１：２３３（１９８４）］との同時トラ ンスフェクションは、安定にトランスフェクションしたクローンの選択を可能に する。ＦＰレベルは前述のアッセイによって定量する。 可能な限り高いレベルのＦＰを合成する哺乳動物細胞クローンを製造するため に、増幅可能薬剤耐性マーカーを含むベクター内にＦＰｃＤＮＡ構築物を連結す る。これらの構築物を細胞内に導入した後、プラスミドを含むクローンを適当な 物質を用いて選択し、プラスミドのコピー数が多い過剰発現クローンの単離を、 前記物質の用量増加の選択 によって実施する。下記のシステムを使用する：突然変異ＤＨＦＲ遺伝子を含む ９０１６又は９０１９プラスミド［Ｓｉｍｏｎｓｅｎら，前出］、ＤＨＦＲ−Ｃ ＨＯ細胞内にトランスフェクションし、メトトレキサート中で選択；グルタミン シンセターゼ遺伝子を含むｐＥＥ１２プラスミド、ＮＳ／Ｏ細胞内にトランスフ ェクションし、メチオニンスルホキシミン中で選択（ＣｅｌｌＴｅｃｈ国際特許 出願第２０８９／１０４０４号）；及びＡＰＲＴ及びＴＫ欠失Ｌ細胞内のチミジ ンキナーゼ遺伝子［Ｃｏｌｂｅｒｅ及びＧａｒｏｐｉｎ，Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：３７５５（１９７９）］を含むｐＤＬＡＴ−３ と同時トランスフェクションした９０１６又は他のＣＭＶプロモーターベクター 、ＡＰＲＴ（０．０５ｍＭアザセリン、０．１ｍＭアデニン、４μｇ／ｍｌアデ ノシン）中で選択し、ＨＡＴ（１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプ テリン、１６μＭチミジン）で増幅。 実施例７ ＣＯＳ−Ｍ６細胞内でのＦＰ受容体の発現及び［³Ｈ］ＰＧＦ_{2 α}結合アッセイ 最近クローンニングされたヒトプロスタグランジンＦ_{2 α} （ＦＰ）受容体をｐｃＤＮＡ１ａｍｐプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサ ブクローニングし、これをＤＥＡＥ−デキストラン方法を用いてＣＯＳ−Ｍ６細 胞内にトランスフェクションした。細胞を７２時間培地に維持し、次いで回収し 、窒素キャビテーションによる細胞溶解後に、示差的遠心分離（１０００×ｇで １０分間、次いで１００，０００×ｇで３０分間）にかけて膜を製造した。０． ４ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ₂、０．３ｎＭ ［³Ｈ］ＰＧＦ_{2 α}及び １００，０００×ｇ膜フラクション由来タンパク質６０μｇを含む１０ｍＭ Ｍ ＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６．０）中で、［³Ｈ］プロスタグランジンＦ_{2 α}（［³Ｈ］ ＰＧＦ_{2 α}）結合アッセイを行った。室温で１時間インキュベーションし、次い で洗浄用緩衝液（ウシ血清アルブミンを０．０１％含む１０μＭのＭＥＳ／ＫＯ Ｈ（ｐＨ６．０））中４℃で予備含浸したＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｂフィルター を介する高速濾過で結合及び遊離放射性リガンドを分離した。フィルターを約１ ６ｍｌの洗浄用緩衝液で洗浄して、フィルターに結合している残りの［³Ｈ］Ｐ ＧＦ_{2 α}を液体シンチレーション計数で定量した。特異的結合は、２μＭ ＰＧ Ｆ_{2 α}の存在下で測定した総ての結合と非特異的結合 との間の差として定義した。 クローン化ヒトＦＰ受容体をＣＯＳ−Ｍ６細胞内にトランスフェクションし、 トランスフェクション細胞から製造した膜を用いて［³Ｈ］ＰＧＦ_{2 α}結合アッセ イを実施した。競合アッセイでは、ＰＧＦ_{2 α}が［³Ｈ］ＰＧＦ_{2 α}特異的結合の 最も強力な競合リガンドであり、ＩＣ₅₀値が２．８ｎＭであった（第６図）。関 連した合成ＦＰアゴニストであるフルプロステノールは同等の強さを有し、ＩＣ₅₀ 値が３．５ｎＭであった。プロスタグランジン及び相関類似体の強度の順位は 、ＰＧＦ_{2 α}＝フルプロステノール＞ＰＧＤ₂＞＞ＰＧＥ₂≒Ｕ４６６１９＞イロ プロストであった。Ｕ４６６１９及びイロプロストはトロンボキサン及びプロス タシクリンの安定な類似体であり、それぞれＴＰ及びＩＰ受容体で類似の強度を 示す。この強度順位は、事前に実施された薬理学的研究でＦＰ受容体について予 測されたものであった。 実施例８ 昆虫細胞内発現のためのバキュロウイルス発現ベクター内へのＦＰｃＤＮＡのク ローニング ＡｃＮＰＶウイルスのゲノムに由来するバキュロウイル スベクターを、Ｓｆ９系昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ＃１７１１）内でｃＤＮＡ を高レベル発現させるように設計する。ＦＰｃＤＮＡを発現する組換えバキュロ ウイルスを以下の標準的方法で製造する（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍａｘｂａ ｃ Ｍａｎｕａｌ）：ＦＰｃＤＮＡ構築物を種々のバキュロウイルストランスフ ァーベクター、例えばｐＡＣ３６０及びｐＢｌｕｅＢａｃベクター（Ｉｎ Ｖｉ ｔｒｏｇｅｎ）内のポリヘドリンプロモーターの下流に連結する。バキュロウイ ルストランスファーベクター及び線状化ＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡ［Ｋｉｔｔｓ， Ｐ．Ａ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８：５６６７（１９９０）］のＳｆ９ 細胞内への同時トランスフェクションに次ぐ相同組換えによって、組換えバキュ ロウイルスを形成する。組換えｐＡＣ３６０ウイルスは感染細胞内の封入体の不 在によって同定され（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．及びＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，Ｔ ｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｅｘｐ．Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉ ｎ Ｎｏ．１５５５）、組換えｐＢｌｕｅＢａｃウイルスはβ−ガラクトシダー ゼ発現に基づいて同定される（Ｖｉａｌａｒｄら，１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ，６４，ｐｐ３７−５０）。プラーク精 製及びＦＰ組換えバキュロウイルスでのｓｆ９細胞の感染後に、前述のアッセイ でＦＰ発現を測定する。 ＦＰに関する読取り枠全体をコードするｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃIIのＢａ ｍＨＩ部位に挿入する。ポリヘドリンプロモーターに対して正の向きにある構築 物を配列決定によって同定し、線状ＡｃＮＰＶ野生型ＤＮＡの存在下でＳｆ９細 胞をトランスフェクションするために使用する。 真正の活性ＦＰは、感染細胞の膜に結合している。膜調製物を標準的方法で感 染細胞から製造する。 実施例９ 酵母発現ベクター内へのＦＰｃＤＮＡのクローニング 外来性タンパク質の細胞内発現を制御するように設計した発現ベクター内に最 適ＦＰｃＤＮＡ構築物を挿入した後、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で組換え ＦＰを産生する。細胞内発現のために、ＥｍＢＬｙｅｘ４等のようなベクターを ＦＰシストロンに連結する［Ｒｉｎａｓ，Ｕ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：５４３−５４５（１９９０）；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｂ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９−４１９２（１９８９）］。発現されたＦＰのレ ベルは前述のアッセイで測定する。 実施例１０ 組換えＦＰの精製 組換え技術によって製造したＦＰは、抗体アフィニティクロマトグラフィーに よって精製し得る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体との間で共有結合を形成するようにＮ−ヒ ドロキシスクシンイミドエステルで予め活性化したゲル支持体であるＡｆｆｉｇ ｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗ＦＰ抗体を加えることによって、ＦＰ抗体アフ ィニティカラムを形成する。抗体はスペーサーアームのアミド結合を介してゲル に結合する。次いで、残りの活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐ Ｈ８）で失活する。カラムを水及び０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で 順次洗浄して、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。次いでカラムを、リ ン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７．３）及び適当な膜可溶化剤、例えば洗剤の中で平衡 化し、可溶化ＦＰもしくはＦＰサブユニットを含む細胞培養上清又は細胞抽出物 をカラムにゆっくり通す。次いでカラムを、光学密度（Ａ₂₈₀）がバックグラウ ンドに低下するまでリン酸塩緩衝食塩水及び洗剤で洗浄し、その後タンパク質を ０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６） 及び洗剤で溶離する。次いで、精製したＦＰタンパク質をリン酸塩緩衝食塩水及 び洗剤に対して透析する。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項 【提出日】１９９４年１２月２３日 【補正内容】 請求の範囲 １． プロスタグランジンに特異的に結合する、単離し精製されたプロスタグラ ンジンヒトＦＰ受容体。 ２． 前記受容体のタンパク質が下記のアミノ酸配列： を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離し精製されたプロスタグラン ジン受容体タンパク質。 ３． プロスタグランジン受容体タンパク質をコードする単離し精製されたＤＮ Ａ分子であって、前記タンパク質が請求項２に記載のアミノ酸配列を有すること を特徴とする前記ＤＮＡ分子。 ４． プロスタグランジン受容体タンパク質をコードする単離し精製されたＤＮ Ａ分子であって、下記のヌクレオチド配列： を有することを特徴とする前記ＤＮＡ分子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｆ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者 グリゴルツイク，リシヤール カナダ国、ケベツク・アシユ・９・アー・ ２・ペー・８、ドラール・デ・オルモー、 ブレントウツド・27 (72)発明者 メターズ，キヤスリーン カナダ国、ケベツク・アシユ・２・イク ス・１・ドウブレベ・４、モントリオー ル、ミルトン・570、アパートメント・18 (72)発明者 グイエン，トウルイエン カナダ国、ケベツク・アシユ・９・ペー・ １・エル・３、ドーバル、キヤンベル・ア ベニユー・2220 (72)発明者 ラシユモア，トーマス・エイチ カナダ国、ケベツク・アシユ・９・ベー・ ２・エール・９、ドラール・デ・オルモ ー、ドナコナ・プレイス・38 (72)発明者 スリペツ，デボラ カナダ国、ケベツク・アシユ・２・ベー・ １・ドウブレベ・５、オートレモント、バ ーナード・アベニユー・1465、アパートメ ント・９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． プロスタグランジンに特異的に結合する、単離し精製されたプロスタグラ ンジンＦＰ受容体。 ２． 前記受容体のタンパク質が下記のアミノ酸配列： を有することを特徴とする、請求項１に記載の単離し精製されたプロスタグラン ジン受容体タンパク質。 ３． プロスタグランジン受容体タンパク質をコードする単離し精製されたＤＮ Ａ分子であって、前記タンパク質が請求項２に記載のアミノ酸配列を有すること を特徴とする前記ＤＮＡ分子。 ４． プロスタグランジン受容体タンパク質をコードする単離し精製されたＤＮ Ａ分子であって、下記のヌクレオチド配列： を有することを特徴とする前記ＤＮＡ分子。 ５． 組換え宿主細胞内でプロスタグランジン受容体タンパク質を発現させるた めの発現ベクターであって、請求項４に記載のＤＮＡ分子を含む前記発現ベクタ ー。 ６． 組換えプロスタグランジン受容体タンパク質を発現する宿主細胞であって 、請求項５に記載の発現ベクターを含む前記宿主細胞。 ７． 組換え宿主細胞内でプロスタグランジン受容体タンパク質を発現させる方 法であって、（ａ）請求項５に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞内にトラン スファーし、（ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞を発現ベクターからのプロスタグ ランジン受容体タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する操作を含む前記 方法。 ８． プロスタグランジン受容体活性の調節因子を同定する方法であって、（ａ ）プロスタグランジン受容体活性の調節因子を、請求項２に記載のアミノ酸配列 の全体又は部分を有することを特徴とするプロスタグランジン受容体と混合し、 （ｂ）プロスタグランジン受容体に対する調節因子の作用を測定する操作を含む 前記方法。 ９． プロスタグランジン受容体タンパク質に特異的に結 合する抗体であって、前記タンパク質が請求項２に記載のアミノ酸配列を有する ことを特徴とする前記抗体。