JPH10262687A - 新規ヒト１１ｃｂスプライス変種 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 機能不全または疾患の予防、改善または矯正
において役割を果たす、７−トランスメンブラン（７−
ＴＭ）レセプターと異なるさらなるレセプターの同定お
よび特徴付けが望まれている。 【解決手段】 本発明は、配列番号２のアミノ酸からな
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して
少なくとも９１％の同一性を有するポリヌクレオチド；
配列番号２と同じアミノ酸をコードする遺伝コードの重
複性によるポリヌクレオチド；上記のポリヌクレオチド
と相補性のポリヌクレオチド；上記のポリヌクレオチド
の少なくとも１５個の連続した塩基からなるポリヌクレ
オチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドから
なる単離されたポリヌクレオチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一部、新たに同定
されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、このよう
なポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘
導体、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチド
ならびにそれらの変種および誘導体の産生法、このよう
なポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト、な
らびにこのようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、変
種、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストの使用に
関する。特に、これらおよびその他の点で、本発明は、
ヒト１１ｃｂスプライス変種のポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】本発
明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このような
ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そ
のようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、
ならびにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの製造に関する。さらに詳しくは、本発明のポリペプ
チドはヒト７−トランスメンブランレセプターである。
該発明はまた、かかるポリペプチドの作用を阻害または
活性化することに関する。

【０００３】多くの医学的に重要な生物学的プロセスに
は、Ｇ−タンパク質および／または第二のメッセンジャ
ー、例えば、ｃＡＭＰが関係するシグナル導入経路に関
与するタンパク質が介在することが十分に確立されてい
る［Lefkowitz，Nature，351：353-354(1991)］。本明
細書において、これらのタンパク質を、Ｇ−タンパク質
を伴う経路に関与するタンパク質またはＰＰＧタンパク
質と称する。これらのタンパク質の例は、ＧＰＣレセプ
ター、例えば、アドレナリン作動物質およびドーパミン
に対するもの［Kobilka，B.K.ら，PNAS．USA，84：46-5
0(1987)；Kobilka，B.K.ら，Science, 238：650-656(19
87)；Bunzow，J.R.ら，Nature、336：783-787(198
8)］、Ｇ−タンパク質それ自体、エフェクタータンパク
質、例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニル酸シクラー
ゼ、およびホスホジエステラーゼ、および作動タンパク
質、例えば、蛋白キナーゼＡおよび蛋白キナーゼＣを包
含する［Simon，M.I.，Science，252：802-808(199
1)］。

【０００４】例えば、シグナル導入の一形態において、
ホルモンの結合した結果が、細胞内の酵素、アデニルシ
クラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素活性化は
ヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、ＧＴＰもホルモン
結合に影響を与える。Ｇ−タンパク質はホルモンレセプ
ターをアデニル酸シクラーゼと結合させる。Ｇ−タンパ
ク質はホルモンレセプターにより活性化された場合にＧ
ＴＰと結合ＧＤＰを交換することが判明した。ＧＴＰを
有する形態が今度は活性化アデニル酸シクラーゼと結合
する。Ｇ−タンパク質自身により触媒されるＧＴＰのＧ
ＤＰへの加水分解はＧ−タンパク質をその基底不活性状
態に戻す。このように、Ｇ−タンパク質は、レセプター
からエフェクターへのシグナルを中継する中間体とし
て、またシグナルの存続期間を調節する時計としての２
つの役割を果たす。

【０００５】Ｇ−タンパク質結合レセプターの膜蛋白遺
伝子の超科（スーパーファミリー）は７つの推定トラン
スメンブラン・ドメインを有するものとして特徴付けら
れている。該ドメインは細胞外または細胞質ループによ
り結合するトランスメンブランα−ヘリックスを表すと
考えられている。Ｇ−タンパク質結合レセプターは、ホ
ルモンレセプター、ウイルスレセプター、成長因子レセ
プターおよび神経レセプターのような広範な生物学的に
活性なレセプターを包含する。

【０００６】Ｇ−タンパク質結合レセプターは、約２０
ないし３０個のアミノ酸のこれら７個の保存疎水性鎖を
有し、少なくとも８個の分岐する親水性ループと結合す
ることで特徴付けられる。結合レセプターのＧ−タンパ
ク質科は精神病および神経学的障害の治療に用いられる
神経弛緩薬と結合するドーパミンレセプターを包含す
る。この科に属する構成要素の他の例は、限定するもの
ではないが、カルシトニン、アドレナリン、エンドセリ
ン、 ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン、アセチルコ
リン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、
卵巣刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−１レセ
プター、ロドプシン、臭物質、サイトメガロウイルスレ
セプターなどを包含する。

【０００７】ほとんどのＧ−タンパク質結合レセプター
は、機能的タンパク質構造を安定化させると考えられる
ジスルフィド結合を形成する最初の２個の細胞外ループ
のそれぞれに１個の保存システイン残基を有する。７個
のトランスメンブラン領域は、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ
３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と命名されて
いる。ＴＭ３はシグナル導入に関与する。システイン残
基のホスホリル化および脂質化（パルミチル化またはフ
ァルネシル化）はいくつかのＧ−タンパク質結合レセプ
ターのシグナル導入に影響を与えうる。ほとんどのＧ−
タンパク質結合レセプターは第三の細胞質ループおよび
／またはカルボキシ末端内に潜在的なホスホリル化部位
を含有する。β−アドレノレセプターなどのいくつかの
Ｇ−タンパク質結合レセプターについて、タンパク質キ
ナーゼＡおよび／または特異性レセプターキナーゼによ
るホスホリル化はレセプター脱感作を媒介する。

【０００８】いくつかのレセプターに関して、Ｇ−タン
パク質結合レセプターのリガンド結合部位はいくつかの
Ｇ−タンパク質結合レセプタートランスメンブラン・ド
メインにより形成される親水性ソケットを含み、このソ
ケットはＧ−タンパク質結合レセプターの疎水性残基に
より囲まれている。各Ｇ−タンパク質結合レセプタート
ランスメンブランヘリックスの親水性部位は内側に向
き、極性リガンド結合部位を形成すると考えられる。Ｔ
Ｍ３はＴＭ３アスパラギン酸塩残基を含むなどリガンド
結合部位を有するのでいくつかのＧ−蛋白結合レセプタ
ーに関与する。ＴＭ５セリン、ＴＭ６アスパラギンおよ
びＴＭ６またはＴＭ７フェニルアラニンまたはチロシン
もリガンド結合に関与する。

【０００９】Ｇ−タンパク質結合レセプターは細胞内で
ヘテロトリマーＧ−タンパク質により種々の細胞内酵
素、イオンチャンネルおよびトランスポーターと結合し
うる。Johnson，ら，Endoc.，Rev.，10：317-331(1989)
を参照のこと。異なるＧ−タンパク質α−サブユニット
は特定のエフェクターを優先的に刺激して、細胞内の種
々の生物学的機能を調節する。Ｇ−タンパク質結合レセ
プターの細胞質残基のホスホリル化はいくつかのＧ−タ
ンパク質結合レセプターのＧ−タンパク質結合の調節に
ついての重要なメカニズムと見なされている。Ｇ−タン
パク質結合レセプターは哺乳動物宿主内の多数の部位に
おいて見出される。

【００１０】過去１５年にわたり、７−トランスメンブ
ラン（７−ＴＭ）レセプターを標的とした１５０近くの
治療剤が成功裏に市場で流通している。これは、これら
のレセプターが治療標的としての確立、証明された歴史
を有していることを示している。明らかに、機能不全ま
たは疾患の予防、改善または矯正において役割を果た
す、さらなるレセプターの同定および特徴付についての
必要性がある。これらの機能不全、疾患には、限定する
ものではないが、とりわけ、細菌、糸状菌、原生動物お
よびウイルス感染、特に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２
によって起こる感染症のような感染症、疼痛、癌、糖尿
病、肥満症、食欲不振、病的飢餓、喘息、パーキンソン
病、急性およびうっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿
閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、
良性前立腺肥大症および、不安、分裂症、躁鬱病、せん
妄、痴呆または重度精神薄弱のような精神病および神経
疾患ならびにハンチントン病、ジルドゥラトゥーレット
症候群のような運動異常が包含される。

【００１１】本発明のポリペプチドは保存７−トランス
メンブラン残基を有し、公知のＧ−タンパク質レセプタ
ーに相同なアミノ酸配列を有する。ヒト１１ｃｂクロー
ンは以前に出願人によりＰＣＴ ＷＯ９６／１８６５１
（１９９６年６月２０日公開）に開示されている。

【００１２】

【課題を解決するための手段】かくして、本発明の一つ
の目的は、ポリペプチド、とりわけ、図１および図２
（配列番号２）に示すアミノ酸配列と、マウスｃＤＮ
Ａ、ラット・カルシトニン・レセプターＡ、ラット・カ
ルシトニン・レセプターＢおよびホルモン・レセプター
ＥＭＲ１などの他のタンパク質の公知アミノ酸配列の間
の相同性によって新規ヒト１１ｃｂスプライス変種とし
て同定されたポリペプチドを提供することである。本発
明のさらなる目的は、この１１ｃｂスプライス変種をコ
ードするポリヌクレオチド、特に、本明細書で１１ｃｂ
スプライス変種と命名するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを提供するものである。本発明のこの態
様の特に好ましい具体例は、図１および図２（配列番号
１）に示す配列における１１ｃｂスプライス変種をコー
ドする領域からなるポリヌクレオチドである。

【００１３】本発明のこの態様によれば、ｍＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびそのフラグメンを含め、こ
の１１ｃｂスプライス変種をコードする単離された核酸
分子が提供され、この態様のさらなる具体例では、生物
学的、診断的、臨床的または治療的に有用なそれらの変
種、類縁体または誘導体あるいは変種、類縁体または誘
導体のフラグメンを含むこれらのフラグメントが提供さ
れる。本発明のこの態様の特に好ましい具体例は、ヒト
１１ｃｂスプライス変種の天然の対立遺伝子変種であ
る。

【００１４】また、本発明の目的は、治療目的、例え
ば、とりわけ、細菌、糸状菌、原生動物およびウイルス
感染、特に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２によって起こ
る感染症のような感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満症、
食欲不振、病的飢餓、喘息、パーキンソン病、急性およ
びうっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、
狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大
症および、不安、分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆または
重度精神薄弱のような精神病および神経疾患ならびにハ
ンチントン病、ジルドゥラトゥーレット症候群のような
運動異常が包含される機能不全または疾患の治療に使用
できる１１ｃｂスプライス変種ポリペプチド、特に、１
１ｃｂスプライス変種ポリペプチドを提供することであ
る。

【００１５】本発明のこの態様に従い、本明細書で１１
ｃｂスプライス変種と称される新規ポリペプチドならび
にその生物学的、診断的または治療的に有用なフラグメ
ント、変種および誘導体、フラグメントの変種および誘
導体、これらの類縁体が提供される。本発明のこの態様
の特に好ましい具体例は、１１ｃｂスプライス変種遺伝
子の天然の対立遺伝子によってコードされる１１ｃｂス
プライス変種の変種である。本発明の他の態様において
は、本発明のレセプターポリペプチドと結合し、それを
活性化するかまたは抑制する化合物およびレセプターリ
ガンドのスクリーニング法が提供される。

【００１６】本発明のさらに別の目的は、前記のポリペ
プチド、ポリペプチドフラグメント、変種および誘導
体、変種および誘導体のフラグメントならびに類縁体の
産生法を提供することである。この態様の好ましい具体
例においては、発現可能に組み込まれた外因的に誘導さ
れた１１ｃｂスプライス変種をコードするポリヌクレオ
チドを含む宿主細胞を、宿主中での１１ｃｂスプライス
変種の発現のための条件下で培養し、発現された該ポリ
ペプチドを回収することからなる前記の１１ｃｂスプラ
イス変種ポリペプチドの産生法が提供される。本発明の
さらに別の目的により、前記ポリペプチドおよびポリヌ
クレオチドを、とりわけ、研究、生物学的、臨床的およ
び治療目的に利用する生産物、組成物、プロセスおよび
方法が提供される。

【００１７】本発明のこの態様の好ましい具体例によれ
ば、とりわけ、１１ｃｂスプライス変種ポリペプチドま
たは１１ｃｂスプライス変種コード用ｍＲＮＡの測定に
よる細胞における１１ｃｂスプライス変種発現の評価；
本明細書に開示される１１ｃｂスプライス変種ポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドに細胞を曝すことによる、
とりわけ、細菌、糸状菌、原生動物およびウイルス感
染、特に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２によって起こる
感染症のような感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満症、食
欲不振、病的飢餓、喘息、パーキンソン病、急性および
うっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭
心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大症
および、不安、分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆または重
度精神薄弱のような精神病および神経疾患ならびにハン
チントン病、ジルドゥラトゥーレット症候群のような運
動異常が包含される機能不全または疾患のin vitro、ex
vivoまたはin vivoにおける処置；１１ｃｂスプライス
変種遺伝子における欠損のような遺伝的変形および欠陥
の分析；および生物に１１ｃｂスプライス変種ポリペプ
チドまたはポリヌクレオチドを投与する１１ｃｂスプラ
イス変種機能の増大または１１ｃｂスプライス変種機能
不全の改善のための生産物、組成物および方法が提供さ
れる。

【００１８】本発明のさらに別の具体例により、１１ｃ
ｂスプライス変種の過少発現に関連する症状の治療に、
本発明のレセプターポリペプチドを刺激するための活性
化化合物を用いる方法が提供される。本発明のさらに別
の態様により、１１ｃｂスプライス変種の過剰発現に伴
う症状の治療に、そのための抑制化合物を用いる方法が
提供される。

【００１９】本発明のさらに別の態様により、天然に存
在しない合成、単離および／または組み換え１１ｃｂス
プライス変種レセプターポリペプチドであって、少なく
とも１つの本発明の１１ｃｂスプライス変種の少なくと
も１つのドメインのフラグメント、コンセンサスフラグ
メントおよび／または保存アミノ酸置換を有する配列で
あって、レセプターが１１ｃｂスプライス変種リガンド
と結合するか、または１１ｃｂスプライス変種リガンド
結合を定量的または定性的に調節するようなポリペプチ
ドが提供される。本発明のさらに別の態様により、診
断、治療および／または研究用に用いられる、合成また
は組み換え１１ｃｂスプライス変種ポリペプチド、その
保存的置換および誘導体、それに対する抗体、抗イディ
オタイプ抗体、リガンドと結合させるかまたはその予想
される生物学的性質によりリガンド結合を調節すること
により１１ｃｂスプライス変種機能の潜在的モジュレー
ターとして有用な組成物および方法が提供される。

【００２０】本発明のさらに別の目的は、レセプタータ
イプおよびサブタイプとして、種々の１１ｃｂスプライ
ス変種またはそのフラグメントを抑制または模倣するよ
うに設計された、合成、単離または組換えポリペプチド
を提供することである。本発明のこれらの、またさらに
別の態様の具体例により、ヒト１１ｃｂスプライス変種
配列にハイブリダイズするプローブが提供される。本発
明のこの態様のさらなる好ましい態様においては、１１
ｃｂスプライス変種ポリペプチドに対する抗体を提供す
る。この点で特に好ましい具体例においては、抗体はヒ
ト１１ｃｂスプライス変種に対して非常に選択的であ
る。

【００２１】本発明のもう一つ別の態様においては、１
１ｃｂスプライス変種アゴニストが提供される。好まし
いアゴニストは、１１ｃｂスプライス変種を模倣する分
子、１１ｃｂスプライス変種結合分子またはレセプター
分子に結合する分子および１１ｃｂスプライス変種誘発
応答を引き出しまたは増大させる分子である。また、好
ましいアゴニストは、１１ｃｂスプライス変種または１
１ｃｂスプライス変種ポリペプチド、または１１ｃｂス
プライス変種活性の他のモジュレーターと相互反応し、
それにより１１ｃｂスプライス変種の１つの効果または
１１ｃｂスプライス変種の１つ以上の効果を発効または
増大させる分子である。

【００２２】本発明の他の態様によれば、１１ｃｂスプ
ライス変種アンタゴニストが提供される。好ましいアン
タゴニストは、１１ｃｂスプライス変種を模倣し、１１
ｃｂスプライス変種レセプターまたは結合分子に結合す
るが、１つまたは１つ以上の１１ｃｂスプライス変種誘
発応答を引き出さないものである。また、好ましいアン
タゴニストは、１１ｃｂスプライス変種と結合し、また
は相互反応し、１つまたは１つ以上の１１ｃｂスプライ
ス変種の効果を阻害するか、１１ｃｂスプライス変種の
発現を防止する分子である。

【００２３】本発明のさらなる態様においては、細胞に
in vitro、ex vivoおよびin vivoで、あるいは多細胞生
物に投与する１１ｃｂスプライス変種ポリヌクレオチド
または１１ｃｂスプライス変種ポリペプチドからなる組
成物を提供する。本発明のこの態様の特に好ましい具体
例においては、該組成物は、疾患の治療のために宿主生
物において１１ｃｂスプライス変種ポリペプチドを発現
させるための１１ｃｂスプライス変種ポリヌクレオチド
からなる。この点で特にこのましいのは、１１ｃｂスプ
ライス変種の異常な内因性活性に伴う機能不全治療用の
ヒト患者における発現である。

【００２４】本発明の他の目的、特徴、利点および態様
は本明細書の以下の記載から当業者に自明である。しか
し、以下の記載、実施例は本発明の好ましい具体例であ
り、例示だけのものである。以下の記載および本明細書
の他の開示から、本明細書に記載の精神および範囲内に
おいて、種々の変形および修正ができることは当業者に
自明であろう。図面も本発明の具体例を示すもので、例
示であり、本明細書に開示の発明をそれに限定するもの
ではない。

【００２５】

【発明の実施の形態】以下の説明は、本明細書でよく使
用する用語、特に実施例で使用する用語の理解を容易に
するためのもので、便宜のためのものであって、発明を
限定するものではない。「遺伝因子」は、一般に、ポリ
ペプチドをコードする領域または、複製、転写または翻
訳を調節する領域からなるポリヌクレオチドまたは宿主
において該ポリペプチドを発現するために重要なその他
の方法、あるいは該ポリペプチドをコードする領域およ
びそれに機能可能に連結した発現を調節する領域からな
るポリヌクレオチドを意味する。遺伝因子は、エピソー
ム要素として、すなわち、宿主細胞ゲノムとは物理的に
独立した分子として複製するベクターに含まれていても
よい。これらは、真核細胞でのメトトレキセート選択に
よるトランスフェクトされたＤＮＡの増幅の間に起こる
ようなミニクロモソームに含まれていてもよい。また、
遺伝因子は、天然状態ではなく、むしろ、単離、クロー
ニングおよび精製されたＤＮＡ、とりわけ、ベクターの
形での宿主細胞への導入のような操作された後の宿主細
胞に含まれていてもよい。

【００２６】「単離」は、その天然の状態から「ヒトの
手により」変えられこと、すなわち、天然に存在する場
合、その最初の環境から変えられ、もしくは取り出さ
れ、または両方を意味する。例えば、生体に天然に存在
するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」さ
れていないが、その天然系における共存物質から分離さ
れた同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明
細書で使用する用語として、「単離」されている。

【００２７】「ポリヌクレオチド」は、一般に、いずれ
ものポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌク
レオチドを言い、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修
飾ＲＮＡまたはＤＮＡでよい。本明細書で使用するポリ
ヌクレオチドは、とりわけ、一本鎖および二本鎖ＤＮ
Ａ、一本鎖および二本鎖領域の混合したＤＮＡ、一本鎖
および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合し
たＲＮＡ、一本鎖でも、典型的には二本鎖でもまたは一
本鎖および二本鎖領域が混合してもよいＤＮＡおよびＲ
ＮＡからなるハイブリッド分子を言う。また、本明細書
で使用するポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡあ
るいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる三本鎖領域も
言う。そのような領域の鎖は同じ分子からでも、異なる
分子からでもよい。該領域には、１つ以上の分子の全て
が含まれてもよいが、より典型的には、いくつかの分子
の領域のみが含まれる。ポリヌクレオチドなる用語に
は、また、１つ以上の修飾塩基を含むＤＮＡおよびＲＮ
Ａが包含される。すなわち、安定性またはその他の理由
で修飾された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明
細書で言うポリヌクレオチドである。さらに、例えば、
イノシンのような通常でない塩基またはトリチル化塩基
のような修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡもポリヌク
レオチドである。明らかなごとく、当業者に公知の多く
の有用な目的に供すことができるように、非常に多くの
修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに加えられている。本明細書
で使用するポリヌクレオチドなる用語には、化学的、酵
素的または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド
や、とりわけ、単純型、および複雑型細胞を包含するウ
イルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特徴の化学的形
態が含まれる。本明細書で用いるポリヌクレオチドなる
語はまた、しばしば、オリゴヌクレオチドと称される比
較的短いポリヌクレオチドを包含する。

【００２８】本明細書で使用する「ポリペプチド」に
は、以下に記載するような全てのポリペプチドが包含さ
れる。ポリペプチドの基本構造はよく知られており、当
該分野にて記載されている。本明細書で用いるこの用語
は、ペプチド結合で相互に結合した２つ以上のアミノ酸
からなるいずれものペプチドまたはタンパク質をも言
う。ここで使用するごとく、この用語は、例えば、ペプ
チドの分野で通常、オリゴペプチドおよびオリゴマーと
称される短鎖および、当該分野でタンパク質と総称され
る多くの型のある長鎖の両方を言う。ポリペプチドは、
しばしば、通常２０個の天然アミノ酸と称される２０個
のアミノ酸以外のアミノ酸を含み、末端アミノ酸を含
め、それらの多くのアミノ酸は、与えられたポリペプチ
ドにおいて、プロセッシングやその他のポスト翻訳修飾
のような天然のプロセスまたは当該分野でよく知られた
化学的修飾技術によって修飾されていてもよい。ポリペ
プチドにおいて天然に起こる普通の修飾ですら、ここに
全て記載するのには多すぎるが、それらは基本的な教科
書、より詳細な論文および多くの研究文献によく記載さ
れており、当該分野でよく知られている。本発明のポリ
ペプチドに存在してもよい公知の修飾のいくつかの名前
を挙げると、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル
化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム基の共有結
合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結
合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイ
ノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合
形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、
ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシ
ル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシ
ル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋
白分解プロセッシング、ホスホリル化、プレニル化、ラ
セミ化、セレノイル化、硫化、アルギニル化のようなタ
ンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ介在付加およびユビ
キチン化がある。このような修飾は当業者によく知られ
ており、例えば、PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULARPR
OPERTIES，2nd Ed.，T．E．Creighton，W．H．Freeman
and Company，New York，1993のような最も基本的な教
科書に記載されている。この主題についての多くの詳細
な総説が入手可能であり、例えば、POSTTRANSLATIONAL
COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B．C．Johnson，
Ed.，Academic Press，New York，1983のWold，F.，”P
osttranslational Protein Modifications：Perspectiv
es andProspects”，pp.1-12；Seifter et al.，”Anal
ysis for protein modifications and nonprotein cofa
ctors”, Meth．Enzymol.，1990，182:626-646；Rattan
et al.，”Protein Synthesis：Posttranslational M
odifications and Aging”，Ann. N.Y．Acad．Sci.，19
92，663:48-62にある。

【００２９】ポリペプチドは必ずしも全部が直鎖状では
ない。例えば、ユビキチン化によるごとく、分岐してい
てもよく、また一般に天然のプロセッシング事象や天然
には生じないヒトの操作によりもたらされた事象を含む
ポスト翻訳事象の結果としての分岐した、または、分岐
しない環状でもよい。環状、分岐および分岐した環状ポ
リペプチドは、非翻訳天然プロセスよっても、全くの合
成法によっても合成できる。

【００３０】ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ
またはカルボキシ末端を含め、修飾は、ポリペプチドの
いずれの部位でも起こり得る。事実、共有修飾によるポ
リペプチドにおけるアミノまたはカルボキシ基または両
方のブロックは天然に、また、合成ポリペプチドに普通
に起きるもので、そのような修飾が本発明のポリペプチ
ドに存在していえてもよい。例えば、プロセッシング前
にイー・コリ（E．coli）で作られるポリペプチドのア
ミノ末端残基は、ほぼ変わりなくＮ−ホルミルメチオニ
ンである。

【００３１】ポリペプチドにしばしば起きる修飾は、そ
れがいかに作られたかの関数となる。例えば、宿主中で
クローンした遺伝子の発現により作られたポリペプチド
について、大部分の修飾の性質および程度は、宿主細胞
のポスト翻訳修飾能およびポリペプチドアミノ酸配列に
存在する修飾シグナルによって決定される。例えば、よ
く知られているごとく、グリコシル化は、イー・コリの
ような細菌宿主においては、しばしば生じない。したが
って、グリコシル化が所望の場合は、ポリペプチドはグ
リコシル化宿主、一般には真核細胞で発現させるべきで
ある。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同様のポ
スト翻訳グリコシル化を行うので、その理由で、とりわ
け、グリコシル化の天然のパターンを有する哺乳動物タ
ンパク質を効率よく発現させるために昆虫細胞発現系が
開発されている。同様な考慮が他の修飾にも適用され
る。

【００３２】明らかなごとく、同じタイプの修飾が、与
えられたポリペプチドにおいて、同じまたは異なる程度
にいくつかの部位に存在してもよい。また、与えられた
ポリペプチドが多くのタイプの修飾を含んでもよい。ポ
リペプチドなる用語は、全てのこのような修飾、特に、
宿主細胞中でポリヌクレオチドの発現により合成された
ポリペプチドに存在する修飾を包含する。

【００３３】本明細書で用いる場合の「変種」なる用語
は、各々、対照となるポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドとは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドで
ある。この感覚での変種は、以下および本明細書のあら
ゆる部分に詳細に記載されている。（１）別の対照ポリ
ヌクレオチドとは塩基配列の異なるポリヌクレオチド。
変種における塩基配列の変化はサイレントでありうる。
すなわち、ポリヌクレオチドによってコードされるアミ
ノ酸を変化させえない。変化がこのタイプのサイレント
変化に限定される場合、変種は対照と同じアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードする。変種の塩基配列の
変化は、対照ポリヌクレオチドによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を変えうる。このようなヌクレ
オチドの変化は、以下に議論するように、対照配列によ
ってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置
換、付加、欠失、融合および短縮をもたらす。（２）別
の対照ポリペプチドとアミノ酸配列の異なるポリペプチ
ド。一般に、対照および変種の配列が全体として非常に
類似しており、多くの領域で同一のなる程に相違が限定
されている。変種および対照ポリペプチドは、１つ以上
の置換、付加、欠失、融合および短縮、またはこれらの
いずれかの組み合わせにより、アミノ酸配列が相違しう
る。（３）変種はまた、末端または開始欠失によるよう
に、対照配列よりも短いことにより対照のポリヌクレオ
チドまたはポリペプチド配列と異なる本発明のポリヌク
レオチドまたはポリペプチドのフラグメントであっても
よい。本発明のポリペプチドの変種はまた、かかるポリ
ペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持
しているポリペプチド、例えば、プロタンパク質部を切
断することにより活性化され、活性な成熟タンパク質を
製造しうるプロタンパク質を包含する。（４）変種はま
た、（ｉ）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存ま
たは非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残
基）で置換されており、かかる置換アミノ酸残基は遺伝
暗号によりコードされているものであっても、なくても
よいもの；または（ｉｉ）１個またはそれ以上のアミノ
酸残基が置換基を含むもの；または（ｉｉｉ）成熟ポリ
ペプチドが別の化合物、例えば、ポリペプチドの半減期
を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコー
ル）と融合しているもの；または（ｉｖ）付加的なアミ
ノ酸、例えば、リーダーもしくは分泌配列または成熟ポ
リペプチドの精製用に利用される配列またはプロタンパ
ク質配列などが、成熟ポリペプチドに融合しているもの
であってもよい。（５）ポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドの変種は、天然の対立遺伝子変種などの天然に存
在しない変種であってもよく、あるいは天然に存在する
ことが知られていない変種であってもよい。該ポリヌク
レオチドのこのような天然に存在しない変種は、ポリヌ
クレオチド、細胞または生物に適用される方法を含め、
突然変異誘発法により製造でき、あるいは組換え手段に
より製造してもよい。この点でポリヌクレオチド変種に
は、ヌクレオチド置換、欠失または付加により前記した
ポリヌクレオチドと異なる変種がある。置換、欠失また
は付加が１またはそれ以上のヌクレオチドに関連してい
てもよい。変種はコーディング領域または非コーディン
グ領域あるいはその両方で変化していてもよい。コーデ
ィング領域における変化は同類または非同類アミノ酸置
換、欠失または付加をもたらすかもしれない。このよう
な前記したすべての変種は、本明細書および当該分野に
おける教示から、当業者の範囲内にあるとみなされる。

【００３４】「結合分子」（あるいは「分子相互反応」
または「レセプター成分因子」）なる用語は、リガンド
以外のものを含め、本発明のレセプターポリペプチドに
特異的に結合するか、相互反応する分子を言う。かかる
結合分子も本発明の一部である。結合分子はまた、本発
明のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体誘
導試薬のような非天然のものでもよい。

【００３５】当該分野にて知られているように、「同一
性」または「類似性」は、配列を比較して決定するよう
に、２またはそれ以上のポリペプチド配列あるいは２ま
たはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係をい
う。２つのポリペプチドの「類似性」は、１つのポリペ
プチドのアミノ酸配列およびその保存構成アミノ酸を第
２のポリペプチドの配列と比較することにより決定され
る。「同一性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ド配列間の、場合によっては、それら配列の鎖の間の対
合によって決定される配列の関連の度合を意味する。
「相同性」なる語は、その語を本明細書にて用いる場
合、同一性および類似性の両方を包含する。同一性およ
び類似性は両方共に、容易に計算できる［COMPUTATIONA
L MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，A．M.，ed.，Oxford，Uni
versity Press，New York,(1988)；BIOCOMPUTING：INFO
RMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith，D．W.，ed.，Ac
ademic Press，New York，(1993)；COMPUTER ANALYSIS
OF SEQUENCE DATA，PART I，Griffin，A．M.，およびGr
iffin，H．G.，eds.，Humana Press，New Jersy，(199
4)；SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von He
inje，G.，Academic Press，(1987)；SEQUENCE ANALYSI
S PRIMER，Gribskov，M．およびDevereux，Ｊ.，eds.，
M Stockton Press，New York，(1991)］。２つのポリヌ
クレオチドまたはポリペプチド間の同一性および類似性
を測定する多くの方法があるが、「同一性」および「類
似性」なる用語は当業者によく知られている［H．Caril
loおよびD．Lipton，SIAM J．Applied Math.，48：1073
(1988)］。２つの鎖間の同一性および類似性の決定に一
般に使用される方法は、限定するものではないが、Guid
e to Huge Computers，Martin J．Bishop，ed.，Academ
ic Press，San Diego，1994およびH．CarilloおよびD．
Lipton，SIAM J．Applied Math.，48：1073(1988)に開
示されているものが挙げられる。同一性決定のための好
ましい方法は、試験する２つの配列の間の最大のマッチ
を与えるように設計されている。同一性および類似性の
決定方法は、コンピュータ・プログラムに組み込むこと
ができる。２つの配列の間の同一性および類似性を決定
する好ましいコンピュータ・プログラム法としては、限
定するものではないが、ＧＣＳプログラム・パッケージ
［J．Devereux et al.，Nucleic Acids Research，12
(1)：387(1984)］、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡ
ＳＴＡ［S．F．Atcshul et al.，J．Molec．Biol.，21
5：403(1990)］が挙げられる。

【００３６】発明の記載 本発明は、とりわけ、マウスｃＤＮＡによりコードされ
る１１ｃｂスプライス変種に対するアミノ酸配列相同性
により関連付けられる、新規な１１ｃｂスプライス変種
のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発
明は、特に、図１および図２（配列番号１および２）に
示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有する１１ｃｂ
スプライス変種に関する。

【００３７】ポリヌクレオチド 本発明の１つの態様により、図１および図２（配列番号
２）の推定アミノ酸配列を有する１１ｃｂスプライス変
種ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチ
ドが提供される。本発明の１１ｃｂスプライス変種は、
ｃＤＮＡの配列決定の結果によって示されるように、７
−トランスメンブラン・レセプターファミリーの他のタ
ンパク質と構造的に関係付けられる。そのｃＤＮＡ配列
は３５３個のアミノ酸のタンパク質をコードするオープ
ン・リーディング・フレームを有する。図１１および図
２（配列番号１）の１１ｃｂスプライス変種のヌクレオ
チド配列は、１９９６年６月２０日公開の、ＷＯ ９６
／１８６５１の当初のヒト１１ｃｂクローンと、その全
体にわたって約９０％の同一性を有する。

【００３８】本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの
ようなＲＮＡまたは、例えば、クローニング、化学合成
技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮ
ＡおよびゲノムＤＮＡを包含するＤＮＡの形態でよい。
ＤＮＡは二本鎖でも、一本鎖でもよい。一本鎖ＤＮＡ
は、センス鎖としても知られるコーディング鎖でも、ア
ンチセンス鎖とも称される非コーディング鎖でもよい。
ポリペプチドをコードするコーディング配列は図１およ
び２（配列番号１）に示すポリヌクレオチドのコーディ
ング配列と全体にわたって同じでよい。また、遺伝コー
ドの重複性（縮重）の結果として、図１および２（配列
番号２）のポリペプチドをコードする異なる配列を有す
るポリヌクレオチドでもよい。

【００３９】図１および２（配列番号２）のポリペプチ
ドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、限定する
ものではないが、それ自体が成熟・ポリペプチドのコー
ディング配列；プレ−、プロ−またはプレプロ−タンパ
ク質配列のような、成熟・ポリペプチドのコード配列
と、リーダーまたは分泌配列をコードする配列のよう
な、付加的コーディング配列；ならびに上記の付加的配
列を有するか、または有しない成熟・ポリペプチドのコ
ーディング配列と、限定するものではないが、転写、ス
プライシングやポリアデニレーション・シグナルを包含
するｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性についての
ｍＲＮＡプロセッシングにおいて役割を果たす、転写さ
れる非翻訳配列のようなイントロンおよび非コーディン
グ５’および３’配列を包含する付加的な非コーディン
グ配列とからなる配列を包含する。さらなる機能性を与
えるコーディング配列も該ポリペプチドに組み込んでよ
い。すなわち、例えば、ポリペプチドは、融合ポリペプ
チドの精製を容易にするような、ペプチドのごときマー
カー配列と融合させてもよい。本発明のこの態様のある
種の好ましい具体例において、マーカー配列はｐＱＥベ
クター（Qiagen，Inc.）に付与されたタグのようなヘキ
サヒスチジンペプチドである。例えば、Gentz etal.，P
roc. Natl. Acad. Sci.，USA，1989，86：821-824に記
載されているように、ヘキサヒスチジンは融合タンパク
質の都合よい精製を提供する。他の具体例において、マ
ーカー配列はＨＡタグである。他の多くのタグが商業的
に入手できる。

【００４０】上記に従って、「ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド」なる語はまた、該ポリペプチドを
コードする単一の連続領域または不連続領域（例えば、
イントロンで中断されている）と、コーディングおよび
／または非コーディング配列を含んでいてよい付加的領
域とを含むポリヌクレオチドも包含する。本発明はさら
に、図１および２（配列番号２）の推定アミノ酸配列を
有するポリペプチドの変種をコードするポリヌクレオチ
ドの変種に関する。本発明の特に好ましい具体例には、
図１および２（配列番号２）に示す１１ｃｂスプライス
変種のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドおよびその変種がある。さらに好まし
い具体例は、図１および２（配列番号１）の１１ｃｂス
プライス変種ポリペプチドのアミノ酸配列において、数
個、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０個のア
ミノ酸残基が置換、欠失または付加あるいはそれらの何
れかの組み合わせでなされている１１ｃｂスプライス変
種の変種をコードするポリヌクレオチドである。

【００４１】本発明のさらに好ましい具体例は、図１お
よび２（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有する１１
ｃｂスプライス変種ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドと、その全長にわたって、少なくとも９１％の
同一性を有するポリヌクレオチドおよびそのようなポリ
ヌクレオチドに相補性のポリヌクレオチドである。この
点で、該ポリヌクレオチドに対し全長にわたって少なく
とも９５％の同一性を有するものが特に好ましく、少な
くとも９７−９９％の同一性を有するものが最も好まし
い。特に好ましい具体例は、図１および２（配列番号
１）のｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチド
と、実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドである。

【００４２】本発明はまた、上記の配列とハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドに関する。この点で、本発明
は、特に、上記のポリヌクレオチドにストリンジェント
な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書で使用する「ストリンジェントな条件」と
は、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも
９７％の同一性がある場合にのみハイブリダイゼーショ
ンが起こることを意味する。本発明のポリヌクレオチド
は、１１ｃｂスプライス変種をコードする完全長ｃＤＮ
Ａおよびゲノムクローンを単離するため、また、ヒト１
１ｃｂスプライス変種遺伝子に対して高い配列類似性を
有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単
離するためのｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリ
ダイゼーション・プローブとして使用できる。そのよう
なプローブは一般に少なくとも１５塩基からなる。好ま
しくは、そのようなハイブリダイゼーション技法は当業
者に公知である。プローブは一般に少なくとも１５個の
ヌクレオチドからなる。好ましくは、かかるプローブは
少なくとも３０個のヌクレオチドを有し、少なくとも５
０個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましい
プローブは３０と５０個の間のヌクレオチドを有するで
あろう。

【００４３】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、本明細書において、ポリヌクレオチド分析に関
してさらに検討するとおり、ヒトの疾患の治療および診
断の発見用の研究試薬および材料として使用できる。本
発明のポリヌクレオチドは成熟タンパク質、成熟タンパ
ク質とリーダー配列（プレタンパク質とも称することが
できる）、プレタンパク質のリーダー配列ではない１つ
以上のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、また
は、ポリペプチドの活性形もしくは成熟形を製造するプ
ロセッシング工程の間に除去されるリーダー配列および
１つ以上のプロ配列を有するプロタンパク質の前駆体で
あるプレプロタンパク質をコードできる。

【００４４】ポリペプチド 本発明はさらに、図１および２（配列番号２）の推定ア
ミノ酸配列を有するヒト１１ｃｂスプライス変種ポリペ
プチドに関する。本発明のポリペプチドは、組換えポリ
ペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチド
でよく、好ましくは組換えポリペプチドである。本発明
の特に好ましい具体例は、図１および２（配列番号２）
に示す１１ｃｂスプライス変種のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドおよびその変種である。本発明の他の好ま
しい具体例は、１１ｃｂスプライス変種のアミノ酸配列
を有するポリペプチドおよびその変種である。

【００４５】好ましい変種は、保存アミノ酸置換によっ
て対象物と変化しているものである。かかる置換は、同
様な特性の他のアミノ酸によってポリペプチドの所定ア
ミノ酸が置換されているものである。典型的な保存置換
は、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌ
ｅ相互の置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの
相互交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド
残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩基残基Ｌｙｓおよ
びＡｒｇ間の交換ならびに芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙ
ｒ間の置換である。

【００４６】さらに好ましいものは、図１および２（配
列番号２）の１１ｃｂスプライス変種ポリペプチドのア
ミノ酸配列において、数個、５〜１０、１〜５、１〜
３、２、１または０個のアミノ酸残基が置換、欠失また
は付加あるいはそれらの何れかの組み合わせてなされて
いるフラグメントの変種である。これらのうちで、特に
好ましいものは、１１ｃｂスプライス変種の性質および
活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失で
ある。また、この点で保存置換も特に好ましい。最も好
ましくは、置換のない図１および２（配列番号２）のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離
された形で、好ましくは均質に精製された形で提供され
る。本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチ
ド（特に、成熟・ポリペプチド）ならびに、配列番号２
のポリペプチドと少なくとも９１％の同一性を有するポ
リペプチドを包含する。

【００４７】フラグメント また、本発明のこの態様の好ましい具体例には、１１ｃ
ｂスプライス変種のフラグメント、最も好ましくは図１
および２（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有する１
１ｃｂスプライス変種のフラグメントである変種および
図１および２（配列番号２）の１１ｃｂスプライス変種
の変種からなるポリペプチドがある。この点で、フラグ
メントは、前記したああｃｂスプライス変種ポリペプチ
ドのアミノ酸配列の一部と同じであるが、完全に同じで
はないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

【００４８】このようなフラグメントは、「自立」、す
なわち、他のアミノ酸またはポリペプチドの一部または
それに融合したものでなくても、大きなポリペプチド内
に含まれ、その一部または領域を形成しているものでも
よい。より大きなポリペプチド内に含まれる場合、ここ
で議論するフラグメントは、最も好ましくは、単一の連
続した領域を形成する。しかし、数個のフラグメント
が、単一のより大きいポリペプチドに含まれていてもよ
い。例えば、ある好ましい具体例は、宿主中での発現用
に設計された前駆体ポリペプチド内に含まれ、１１ｃｂ
スプライス変種フラグメントのアミノ末端に融合した異
種プレおよびプロポリペプチド領域と、当該フラグメン
トのカルボキシ末端に融合した付加的領域を有する本発
明の１１ｃｂスプライス変種ポリペプチドのフラグメン
トである。したがって、本明細書で意図する意味の１つ
の態様におけるフラグメントは、１１ｃｂスプライス変
種から由来する融合ポリペプチドまたは融合タンパク質
の部分を言う。

【００４９】この意味で、本明細書における「約」は、
特に言及した範囲が、一方または両方の極限で、数個、
５、４、３、２または１アミノ酸だけ大きいまたは小さ
い範囲を含むものである。本発明の特に好ましいフラグ
メントは、例えば、１１ｃｂスプライス変種の短縮ポリ
ペプチドである。短縮ポリペプチドには、図１および２
（配列番号２）のアミノ酸配列を有する１１ｃｂスプラ
イス変種ポリペプチドまたはその変種が包含される。た
だし、二重短縮変異体におけるような、アミノ末端を含
む連続した一連の残渣（すなわち、連続領域、部分、部
位）、またはカルボキシ末端を含む連続した一連の残基
のような欠失、１つがアミノ末端を含み、他のものがカ
ルボキシ末端を含むような２つの連続した一連の残基の
欠失は除かれる。上記の範囲のサイズを有するフラグメ
ントもトランケーションフラグメントの好ましい具体例
であり、一般に、フラグメントのうちで特に好ましい。

【００５０】また、本発明のこの態様で好ましいもの
は、１１ｃｂスプライス変種の構造的または機能的特質
により特徴付けられるフラグメントである。この点で、
本発明の好ましい態様として、１１ｃｂスプライス変種
のα−ヘリックスおよびα−ヘリックス形成領域、β−
シートおよびβ−シート形成領域、ターンおよびターン
形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、
β両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域およ
び高抗原性インデックス領域およびかかるフラグメント
の組み合わせが挙げられる。

【００５１】好ましい領域は、１１ｃｂスプライス変種
の活性を伝達するものである。この点で最も好ましいも
のは、同様なまたは向上した活性あるいは望ましくない
活性の低下したものを含め、１１ｃｂスプライス変種の
化学的、生物学的またはその他の活性を有するフラグメ
ントである。さらに好ましいポリペプチドフラグメント
は、動物、特にヒトにおいて抗原敵または免疫原的であ
るものである。とりわけ、本発明は、上記のフラグメン
トをコードするポリヌクレオチド、該フラグメントをコ
ードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌ
クレオチド、特に、ストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするポリヌクレオチドおよびＰＣＲプライマー
のような、該フラグメントを増幅するポリヌクレオチド
も関する。この点で、好ましいポリヌクレオチドは、上
記の好ましいフラグメントに対応するフラグメントであ
る。

【００５２】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド（複数でも
可）を含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作さ
れる宿主細胞および組換え技法による本発明のポリペプ
チドの製造にも関する。宿主細胞を遺伝子操作して、本
発明のポリヌクレオチドを組み込み、本発明のポリペプ
チドを発現させることができる。ポリヌクレオチドの宿
主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョン、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクショ
ン、トランスベクション、微量注入、カチオン性リピド
介在トラスフェクション、電気穿孔法、トランスダクシ
ョン、スクレープ負荷、弾道導入、インフェクション等
により行うことができる。これらの方法は、Davisら、B
asic Methods in Molecular Biology，（1986）およびS
ambrookら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUA
L、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Co
ld Spring Harbor、N.Y.（１９８９）のような、多くの
標準的実験室マニュアルに記載されている。

【００５３】適当な宿主の代表例として、Streptococc
i、Staphlococci、E.coli、StreptomycesおよびBacillu
s subtilis細胞などの細菌細胞；酵母細胞およびAsperg
illus細胞などの真菌細胞；Drosophila S2およびSpodop
tera Sf9細胞などの昆虫細胞；CHO、COS、HeLa、C127，
3T3、BHK、293およびおBowesメラノーマ細胞などの動物
細胞；および植物細胞が挙げられる。宿主細胞中のポリ
ヌクレオチド構築物を常法にて用い、組換え配列により
コードされる遺伝子産物を産生することができる。別法
として、本発明のポリペプチドは通常のペプチド・シン
セサイザーにより合成できる。

【００５４】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞において適当なプロモーターの調
節下で発現できる。無細胞翻訳系もまた使用して、本発
明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてこのようなタン
パク質を産生することができる。原核および真核宿主に
ついて用いられる適当なクローニングおよび発現ベクタ
ーは、Sambrookら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY
MANUAL、第２版、ColdSpring Harbor Laboratory Pres
s、Cold Spring Harbor、N.Y.（１９８９）に記載され
ている。

【００５５】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えば、プラスミドベクター、一本鎖もしくは二本鎖フ
ァージベクター、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡもしくは
ＤＮＡウイルスベクターでよい。プラスミドは、一般
に、当業者が使いなれた標準的な命名操作に従い、本明
細書では、小文字「ｐ」を前置し、および／またはつづ
いて大文字および／または数字で表す。本明細書に開示
されている出発プラスミドは、市販され、公的に入手可
能であるか、または周知の公開された方法を慣用的に適
用することにより利用可能なプラスミドから構築され得
る。本発明に従って使用することのできる多くのプラス
ミドおよび他のクローニングおよび発現ベクターは、よ
く知られており、当業者に容易に利用され得る。

【００５６】この点で、好ましいベクターは本発明のポ
リヌクレオチドおよびポリペプチド発現用のベクターで
ある。一般に、そのようなベクターは、発現させるべき
ポリヌクレオチドに機能できるように連結した、宿主細
胞における発現に有効なシス−作用調節領域からなる。
適当な、トランス−作用因子は宿主から供給されるか、
相補ベクターによって供給されるか、宿主に組み込んだ
場合にベクター自体によって供給される。この点の好ま
しい具体例においては、ベクターは特異的発現に供され
る。そのような特異的発現は、誘導発現またはある種の
タイプの細胞のみでの発現あるいは誘導および細胞特異
的発現の両方であり得る。誘導ベクターのうちで、特に
好ましいものは、温度や、栄養添加剤のような、操作の
容易な環境因子によって発現が誘導できるベクターであ
る。本発明のこの態様に適した種々のベクターは、原核
および真核宿主において使用するための構成性および誘
導性発現ベクターを含め、よく知られており、当業者に
日常的に使用されている。

【００５７】本発明のポリペプチドの発現には種々の発
現ベクターが使用できる。このようなベクターには、と
りわけ、染色体、エピソームおよびウイルス誘導ベクタ
ー、例えば、細菌性プラスミド、バクテリオファージ、
トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色
体エレメントから誘導されるベクター、バキュロウイル
ス、パポーバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウ
イルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウ
イルス、レトロウイルスのようなウイルスならびにプラ
スミドとバクテリオファージの遺伝因子、例えば、コス
ミドおよびファージミドから由来の遺伝因子などのこれ
らの組み合わせから誘導されるベクターが包含され、こ
れらはすべて本発明の態様に係る発現に用いることがで
きる。一般に、ポリヌクレオチドを維持し、増殖し、発
現させてポリペプチドを発現させるのに適したいずれの
ベクターも発現ベクターとして使用できる。

【００５８】適当なＤＮＡ配列は、例えば、Sambrook
ら、MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL、第２
版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spri
ng Harbor、N.Y.（１９８９）に記載されているよう
な、種々の周知かつ慣用的な方法によりベクター中に挿
入できる。発現ベクター中のＤＮＡ配列を、例えば、ｍ
ＲＮＡ翻訳を指示するプロモーターを包含する適当な発
現調節配列に操作可能に結合させる。このようなプロモ
ーターの代表例として、限定するものではないが、ファ
ージラムダＰＬプロモーター、イー・コリｌａｃ、ｔｒ
ｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期
プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーターが
挙げられる。

【００５９】一般に、発現構築物は、転写開始および終
止部位を有し、翻訳領域には、翻訳のためのリボソーム
結合部位を有する。該構築物によって発現される成熟転
写物のコーディング部分は、翻訳されるポリペプチドの
始めに翻訳開始コドン、例えば、ＡＵＧまたはＧＵＧお
よび終わりに適当に位置する翻訳終止コドンを含む。加
えて、構築物は発現を調節し、起こさせる制御領域を含
んでよい。一般に、多くの共通して実施される操作に従
い、そのような配列は、とりわけ、転写因子、レプレッ
サー結合部位およびターミネーターなどの転写因子を制
御することにより操作される。増殖および発現ベクター
には、一般に、例えば、Sambrookらに記載されているよ
うな選択可能なマーカーおよび増幅領域が含まれるであ
ろう。

【００６０】以下に、商業的に入手可能なベクターを例
示のために挙げる。細菌において使用するのに好ましい
ベクターは、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑ
iagen製）、ｐＢＳベクター、ファージスクリプトベク
ター、ブルースクリプトベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ
１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓtratagene
製）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３
３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐharmacia製）お
よびｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）である。好ま
しい真核細胞用ベクターは、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２Ｃ
ＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓtratagene
製）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐ
harmacia製）である。これらは、多くの商業的に入手可
能な、本発明に使用できるよく知られたベクターの単な
る例示であり、他のプラスミドまたはベクターも、例え
ば、宿主に導入でき、維持、増殖または本発明のポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドを発現するのに適してお
れば、本発明に使用できる。

【００６１】プロモーター領域は、クロラムフェニコー
ルトアセチルランスフェラーゼ（ＣＡＴ）転写ユニッ
ト、候補プロモーターフラグメント導入用の制限部位の
下流、すなわち、プロモーターを含むことのできるフラ
グメントのような、プロモーター領域を欠く、レポータ
ー転写ユニットを含むベクターを用いて、望ましいいず
れの遺伝子からも選択できる。よく知られるごとく、Ｃ
ＡＴ遺伝子の制限部位上流にプロモーターを含有するフ
ラグメントのベクターを導入すると、ＣＡＴ活性の産生
が起こり、標準的なＣＡＴ分析で検出できる。ｐＫＫ２
３２−８およびｐＣＭ７のような、この目的に適したベ
クターはよく知られており、容易に入手できる。本発明
のポリヌクレオチドの発現用のプロモーターは、よく知
られていて、容易に入手可能なものであるばかりでな
く、レポーター遺伝子を用いて上記の方法によって容易
に得られるものでもよい。

【００６２】本発明に従って、ポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの発現に適した公知の細菌性プロモーター
は、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、
Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラ
ムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモーター
である。この点で適当な公知の真核細胞プロモーター
は、ＣＭＶ即時初期型プロモーター、ＨＳＶチミジンキ
ナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモー
ター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲのような
レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオ
ネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロ
モーターである。組換え発現ベクターは、例えば、複製
開始点、下流構造配列の転写を指令する高度発現遺伝子
から由来することが好ましいプロモーター、およびベク
ターへの暴露後、ベクター含有細胞の単離を可能にする
選択可能なマーカーを含む。

【００６３】本発明のポリペプチドのヘテロローガスな
構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチドは、一
般に、発現のために操作可能にプロモーターに連結する
ように、標準的な技術を使用してベクターに挿入され
る。ポリヌクレオチドは、転写開始部位がリボソーム結
合部位に対して適当な５’に存在するように位置され
る。リボソーム結合部位は、発現されるべきポリペプチ
ドの翻訳を開始するコドン、例えば、ＡＵＧまたはＧＵ
Ｇに対して５’にある。一般に、通常ＡＵＧである開始
コドンと共に始まり、リボソーム結合部位と開始コドン
の間に存在する、他のオープンリーディングフレームは
ない。また、一般に、ポリペプチドの最後には翻訳終止
コドンがあり、真核細胞宿主にて用いるための構築物に
はポリアデニレーションシグナルがあるであろう。転写
領域の３’に適宜配置された転写終止シグナルもまた、
ポリヌクレオチド構築物に含まれていてもよい。

【００６４】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、周辺腔ま
たは細胞外環境へ分泌するために、適当な分泌シグナル
を発現するポリペプチドに組み込むことができる。これ
らのシグナルはポリペプチドに対して内在性であっても
よく、あるいは異種性のシグナルでもよい。ポリペプチ
ドは、融合タンパク質のような修飾形で発現されてもよ
く、また、分泌シグナルのみならず、さらなるヘテロロ
ーガスな機能性領域を含んでいてもよい。すなわち、例
えば、付加的なアミノ酸、特に、荷電アミノ酸の領域は
ポリペプチドのＮ−またはＣ−末端に付加して、精製の
間またはその後の取り扱いおよび貯蔵における宿主細胞
での安定性および持続性を改善することができる。精製
を容易にするために領域をポリペプチドに付加すること
もできる。そのような領域は、ポリペプチドの最終製造
前に除去できる。とりわけ、ポリペプチドへペプチド部
分を付加して分泌または遊離を起こさせ、安定性を向上
させるか、精製を容易にすることは、当該分野でよく知
られており、日常的な技術である。好ましい融合タンパ
ク質は、ポリペプチドの可溶化または精製に有用な免疫
グロブリンからのヘテロローガスな領域を有する。例え
ば、ＥＰ-Ａ-０ ４６４ ５３３（対応カナダ国特許２０
４５８６９）は、もう一つ別のタンパク質またはそれの
一部と共に免疫グロブリン分子の不変領域の種々の部分
を含んでなる融合タンパク質を開示する。薬剤デリバリ
ーにおいて、例えば、タンパク質は、アンタゴニストを
同定するための高処理スクリーニングアッセイの目的の
ために抗体Ｆｃ部分と融合されている。D.Bennettら、J
ournal of Molecular Recognition, 8：52−58（1995）
およびK.Johansonら、The Journal of Biological Chem
istry，270（16）：9459−9471（1995）を参照のこと。

【００６５】哺乳動物発現ベクターは、複製の起点、適
当なプロモーターおよびエンハンサーを有していてもよ
く、またはいずれか必要なリボソーム結合部位、ポリア
デニル化領域、スプライスドナーおよびアクセプター部
位、転写終止配列および発現に不可欠な５’フランキン
グ非転写配列を有してもよい。細胞を、典型的には、物
理的または化学的手段により破壊する遠心分離により収
穫し、得られた粗製抽出物をさらなる精製のために保持
する。タンパク質の発現に使用した微生物細胞は、凍結
−解凍の繰り返し、音波処理、機械的破壊または細胞溶
解剤の使用を含む、いずれの通常の方法によっても破壊
できる。そのような方法も当業者によく知られている。

【００６６】１１ｃｂスプライス変種ポリペプチドは、
硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イ
オンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセ
ルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチン
クロマトグラフィーのようなよく知られた方法により、
組換え細胞培養から回収および精製できる。高速液体ク
ロマトグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポ
リペプチドが単離および／または精製中に変性した場
合、再び活性な立体配座にするために、タンパク質再生
のための周知の技法を用いることができる。

【００６７】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、例えば、診断試薬として使用するため
の、相補性ポリヌクレオチド検出のための１１ｃｂスプ
ライス変種ポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全
に伴う１１ｃｂスプライス変種の突然変異形の検出は、
１１ｃｂスプライス変種の発現不足、過剰発現または変
更発現からもたらされる疾患または疾患の罹病しやすさ
の診断または診断に加えることのできる診断道具を提供
する。ヒト１１ｃｂスプライス変種遺伝子に突然変異を
有する個々の人々が、種々の技術によりＤＮＡレベルで
検出できる。診断用の核酸は、血液、尿、唾液、組織生
検または剖検材料のような患者の細胞から得ることがで
きる。ゲノムＤＮＡは直接的に検出するのに使用できる
か、または分析の前にＰＣＲを用いることで酵素的に増
幅させてもよい。ＰＣＲ（Saikiら，Nature，324：163-
166（1986）。同様に、ＲＮＡまたはｃＤＮＡも使用で
きる。一例として、１１ｃｂスプライス変種をコードす
る核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用い、１１ｃｂス
プライス変種の発現および突然変異を同定および分析で
きる。例えば、欠失および挿入は、正常遺伝子型と比較
して増幅生成物の大きさの変化により検出できる。点突
然変異は、増幅ＤＮＡを放射性標識１１ｃｂスプライス
変種ＲＮＡまたは放射性標識アンチセンスＤＮＡ配列に
対してハイブリダイゼーションすることにより同定でき
る。完全に対合した配列はＲＮアーゼＡ消化または融解
温度の差により、誤対合二重螺旋から区別できる。

【００６８】対照遺伝子と突然変異を有する遺伝子の配
列相違も直接ＤＮＡシーケンシングで示すことができ
る。さらに、クローンしたＤＮＡセグメントをプローブ
として、特定的ＤＮＡセグメントを検出できる。これら
の方法の感度はＰＣＲまたは他の増幅方法の適当な使用
により大いに増強できる。例えば、シーケンシングプラ
イマーは、修飾ＰＣＲにより生じた二本鎖ＰＣＲ生成物
または一本鎖鋳型分子と共に使用する。配列決定は、放
射線標識核酸を用いる常法または蛍光タグを用いる自動
シーケンシング操作によって行うことができる。

【００６９】ＤＮＡ配列の差に基づく遺伝的テストは、
変性剤と共にまたは無しでゲル中のＤＮＡフラグメント
の電気泳動の移動度の変化により検出できる。小さな配
列の欠失および挿入は、高分離ゲル電気泳動で明視化で
きる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、異なるＤＮ
Ａフラグメントの移動度が、それらの特異的または部分
的溶融温度に従って、異なる位置のゲル中で遅滞する変
性ホルムアミドグラディエントゲルによって区別できる
（例えば、Myersら，Science，230：1242（1985）参
照）。

【００７０】特異的な位置での配列の変化はまた、ヌク
レアーゼ保護分析、例えば、ＲＮaseおよびＳ１保護ま
たは化学的切断法によっても明らかにすることができる
（例えば、Cottonら，Proc．Natl.Acad.Sci.,USA，85：
4397-4401（1985）参照）。かくして、特定のＤＮＡ配
列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮase保護、
化学的切断、直接シーケンシングまたは制限酵素の使用
（例えば、制限断片長多形（ＲＦＬＰ））およびゲノム
ＤＮＡのサザーンブロッティングにより行うことができ
る。さらに一般的なゲル−電気泳動およびＤＮＡ配列決
定に加えて、突然変異をイン・シテュ分析により検出す
ることもできる。

【００７１】本発明のさらなる態様によれば、記載の方
法による１１ｃｂスプライス変種遺伝子における変異の
検出を介して、細菌、糸状菌、原生動物およびウイルス
感染、特に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２によって起こ
る感染症のような感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満症、
食欲不振、病的飢餓、喘息、パーキンソン病、急性およ
びうっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、
狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大
症および、不安、分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆または
重度精神薄弱のような精神病および神経疾患ならびにハ
ンチントン病、ジルドゥラトゥーレット症候群のような
運動異常に対する疑いを診断または測定する方法が提供
される。前記した核酸配列をかかる方法に用いることも
できる。

【００７２】本発明は、疾患、とりわけ、細菌、糸状
菌、原生動物およびウイルス感染、特に、ＨＩＶ−１お
よびＨＩＶ−２によって起こる感染などの感染症、疼
痛、癌、糖尿病、肥満症、食欲不振、病的飢餓、喘息、
パーキンソン病、急性およびうっ血性心不全、低血圧、
高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、ア
レルギー、良性前立腺肥大症および、不安、分裂症、躁
鬱病、せん妄、痴呆または重度精神薄弱のような精神病
および神経疾患ならびにハンチントン病、ジルドゥラト
ゥーレット症候群のような運動異常を診断する方法であ
って、図１および２（配列番号１）の配列を有するポリ
ヌクレオチドの異常に増加または減少した発現レベルの
患者からの試料から測定することからなる方法を提供す
るものである。ポリヌクレオチドの増加または減少した
発現は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノーザ
ンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション方
法のような、当該分野でよく知られたポリヌクレオチド
の定量方法の何れかを使用して測定できる。

【００７３】染色体アッセイ 本発明の配列はまた、染色体の同定にも有用である。該
配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を特異的に標的
とし、ハイブリダイゼーションできる。さらに、最近、
染色体上の特定の部位の同定が要求されている。現在、
実際の配列データ（繰り返し多形）に基づいて染色体位
置のマーキングに利用できる染色体マーキング試薬はほ
とんどない。本発明による染色体上のＤＮＡマッピング
は、これらの配列を遺伝子に伴う疾患と関連付ける重要
な第一の段階である。一旦、染色体上の正確な位置に配
列がマッピングできたら、染色体上の該配列の物理的位
置を、遺伝的な地図データと関連付けることができる。
そのようなデータは、例えば、V．Mckusick，Mendelian
Inheritance in Man（John Hopkins University Welch
Medical Libraryを通じてオンラインで利用できる）に
ある。ついで、同じ染色体領域上でマッピングされた遺
伝子と疾患の関係を、連鎖分析（物理的に隣接する遺伝
子の共同相続）を介して同定する。ついで、影響された
個体と影響されない個体の間でのｃＤＮＡまたはゲノム
配列における差異を決定することが必要である。影響さ
れた個体の幾つかまたは全部に突然変性が見られるが、
正常な個体には何ら見られない場合は、その突然変性
が、おそらく当該疾患の原因因子である。

【００７４】ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、正常および異常レベルの測定を含め、細
胞および組織における１１ｃｂスプライス変種タンパク
質のレベルを検出するための定量および診断アッセイな
どの診断アッセイにも関する。すなわち、例えば、正常
な対照組織試料に対して１１ｃｂスプライス変種タンパ
ク質の過剰発現を検出する本発明の診断アッセイは、と
りわけ、細菌、糸状菌、原生動物およびウイルス感染、
特に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２によって起こる感染
などの感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満症、食欲不振、
病的飢餓、喘息、パーキンソン病、急性およびうっ血性
心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心
筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大症および、
不安、分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆または重度精神薄
弱のような精神病および神経疾患ならびにハンチントン
病、ジルドゥラトゥーレット症候群のような運動異常な
どの疾患／障害の存在を検出するために使用できる。宿
主から由来する試料中の、本発明の１１ｃｂスプライス
変種タンパク質などのタンパク質のレベルの測定に使用
できるアッセイ技術は、当業者によく知られている。そ
のようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競
合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬ
ＩＳＡアッセイが包含される。とりわけ、ＥＬＩＳＡア
ッセイが好ましい。ＥＬＩＳＡアッセイは、まず、１１
ｃｂスプライス変種に特異的な抗体、好ましくはモノク
ローナル抗体の調製を含む。さらに、該モノクローナル
抗体と結合するリポーター抗体が一般に調製される。該
リポーター抗体は、放射能、蛍光または酵素試薬、例え
ば、ここでは西洋ワサビパーオキシダーゼ酵素のような
検出可能な試薬と結合させる。

【００７５】ＥＬＩＳＡを行うには、宿主から試料を取
り出し、例えば、ポリスチレン皿のような、試料中のタ
ンパク質と結合する固体担体上でインキュベーションす
る。皿上のいずれの遊離タンパク質結合部位も、ウシ血
清アルブミンのような非特異性タンパク質と共にインキ
ュベーションして被覆する。ついで、モノクローナル抗
体を皿中でインキュベーションする。この間に、モノク
ローナル抗体は、ポリスチレン皿に結合したいずれの１
１ｃｂスプライス変種タンパク質とも結合する。結合し
ないモノクローナル抗体を緩衝液で洗い流す。西洋ワサ
ビパーオキシダーゼに結合したリポーター抗体を皿に入
れ、１１ｃｂスプライス変種と結合したいずれものモノ
クローナル抗体と結合させる。ついで、結合しなかった
リポーター抗体を洗い流す。次いで、比色測定用の基質
を含むパーオキシダーゼ活性用の試薬を皿に加える。一
次および二次抗体を介して１１ｃｂスプライス変種に結
合した、固定化されたパーオキシダーゼは呈色反応生成
物を生成する。所定の時間内に発色した色の量が試料中
に存在する１１ｃｂスプライス変種タンパク質の量の指
標となる。定量的結果は、典型的には、標準曲線との対
比により得られる。競合アッセイも使用でき、１１ｃｂ
スプライス変種に特異的な抗体を固体担体に結合させ、
標識した１１ｃｂスプライス変種および宿主から由来す
る試料を該固体担体に通す。その固体担体に結合した検
出したラベルは試料中の１１ｃｂスプライス変種の量と
相関させることができる。

【００７６】抗体 本発明のポリペプチド、それらのフラグメントまたはそ
の他の誘導体、またはそれらのアナログ、またはそれら
を発現する細胞は、これらに対する抗体を産生する免疫
原として用いることができる。これらの抗体は、例え
ば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体である。
本発明にはまた、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、な
らびにＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラリ
ーの生成物が包含される。当該分野に公知の種々の方法
がこのような抗体およびフラグメントの製造に使用でき
る。

【００７７】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生じる抗体は、好ましくはヒト以外の動物に、該ポ
リペプチドを直接注射するか、投与することにより得る
ことができる。得られた抗体はポリペプチドそのものと
結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメン
トのみをコードする配列でさえも、全体の天然ポリペプ
チドと結合する抗体の産生に使用できる。そのような抗
体は、そのポリペプチドを発現する組織から該ポリペプ
チドを単離するのに使用できる。

【００７８】連続的セルライン培養により産生される抗
体を提供する当業者によく知られた技術を用いて、モノ
クローナル抗体を調製することができる。例えば、ハイ
ブリドーマ法（Kohlerら、Nature，256：495-497（197
5））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法
（Kozborら、Immunology Today，4:72（1983））および
ヒト・モノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハ
イブリドーマ法（Coleら、Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy，Alan R Liss,Inc.、77-96頁（198
5））が挙げられる。一本鎖抗体の製造のために記載さ
れた技術（米国特許第４９４６７７８号）を用いて、本
発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生すること
もできる。また、トランスジェニックマウスまたはその
他の生物、例えばその他の哺乳動物を用いて、本発明の
ヒト化抗体を発現させることができる。

【００７９】上記の抗体を用いて該ポリペプチドを発現
するクローンを単離または同定することができ、アフィ
ニティークロマトグラフィーにより、単離および／また
は精製用の固体担体に抗体を結合させて本発明のポリペ
プチドを精製することができる。１１ｃｂスプライス変
種に対する抗体は、細菌、糸状菌、原生動物およびウイ
ルス感染、特に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２によって
起こる感染などの感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満症、
食欲不振、病的飢餓、喘息、パーキンソン病、急性およ
びうっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、
狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大
症および、不安、分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆または
重度精神薄弱のような精神病および神経疾患ならびにハ
ンチントン病、ジルドゥラトゥーレット症候群のような
運動異常の抑制に使用できる。

【００８０】１１ｃｂスプライス変種結合分子およびア
ッセイ １１ｃｂスプライス変種は、相互反応するタンパク質の
単離に使用でき、この相互反応を、干渉の標的とするこ
とができる。１１ｃｂスプライス変種と他の因子との間
のタンパク質−タンパク質相互反応の阻害剤は、１１ｃ
ｂスプライス変種活性調節用の医薬の開発に通じる。か
くして、本発明はまた、１１ｃｂスプライス変種への結
合分子の同定方法も提供する。１１ｃｂスプライス変種
に結合する分子についてのタンパク質をコードする遺伝
子は、例えば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳソー
ティングのような多くの公知の方法により同定できる。
そような方法は、例えば、Coliganら、Current Protoco
ls in Immunology 1(2)：第5章（1991）およびRivett,
A.J.、Biochem.，291：1−10（1993）のような多くの実
験室マニュアルに記載されている。

【００８１】例えば、酵母二ハイブリッドシステムは、
転写アクチベーターの活性の再構築を使用する、第一の
テストタンパク質と第二のテストタンパク質のin vivo
における相互反応検出のための方法を提供する。この方
法は米国特許５２８３１７３号に開示されており、試薬
はClontechおよびStratageneから入手できる。簡単に
は、１１ｃｂスプライス変種ｃＤＮＡをＧａｌ４転写因
子ＤＮＡ結合ドメインと融合させ、酵母細胞で発現させ
る。関心のある細胞から得られたｃＤＮＡライブラリー
メンバーをＧａｌ４のトランス活性化ドメインに融合さ
せる。１１ｃｂスプライス変種と相互反応できるタンパ
ク質を発現するｃＤＮＡクローンは、Ｇａｌ４の再構築
およびＧａｌ１−ｌａｃＺのようなリポーター遺伝子の
トランス活性化をもたらす。

【００８２】別法として、組換え１１ｃｂスプライス変
種によるラムダｇｔ１１、ラムダＺＡＰ（Stratagene）
または均等なｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニン
グがある。組換え１１ｃｂスプライス変種タンパク質ま
たはそのフラグメントを、ＦＬＡＧ、ＨＳＶまたはＧＳ
Ｔのような小さなペプチドタグと融合させる。該ペプチ
ドタグは、心筋クレアチンキナーゼのようなキナーゼに
対する好都合なリン酸化部位を有することができ、また
はビオチニル化できる。組換え１１ｃｂスプライス変種
は、［³²Ｐ］でリン酸化でき、また、ラベルなしで使用
して、ストレプトアビジンまたはタグに対する抗体で検
出できる。ラムダｇｔ１１ｃＤＮＡ発現ライブラリー
は、関心ある細胞から作成され、組換え１１ｃｂスプラ
イス変種と共にインキュベーションし、洗浄し、１１ｃ
ｂスプライス変種と相互反応するｃＤＮＡクローンを単
離する。このような方法は当業者に日常的である。例え
ば、Sambrook（前掲）を参照のこと。

【００８３】他の方法は、ｃＤＮＡを、哺乳動物プロモ
ータとポリアデニレーション部位の間でベクターにクロ
ーンし、一時的にＣＯＳまたは２９３細胞にトランスフ
ェクトする、哺乳動物の発現ライブラリーのスクリーニ
ングである。４８時間後、固定化し、洗浄した細胞をラ
ベルした１１ｃｂスプライス変種と共にインキュベーシ
ョンし、結合するタンパク質を検出する。好ましい具体
例では、１１ｃｂスプライス変種をヨー素化し、結合し
た１１ｃｂスプライス変種の検出はオートラジオグラフ
ィーによるものである。Simsら，Science，1988，241：
585-589およびMcMahanら，EMBO．J.，1991，10：2821-2
831参照。この方法においては、関心ある結合タンパク
質をコードするｃＤＮＡを含むｃＤＮＡのプールを選択
し、さらに各プールを分割し、ついで一時的なトランス
フェクション、結合およびオートラジオグラフィーのサ
イクルを繰り返し、関心あるｃＤＮＡを単離できる。別
法として、全ｃＤＮＡライブラリーを哺乳動物細胞にト
ランスフェクションし、プレートに結合した１１ｃｂス
プライス変種を含む皿で細胞をパンニングすることによ
り関心あるｃＤＮＡを単離できる。洗浄後に結合してい
る細胞を溶解し、プラスミドＤＮＡを単離し、細菌中で
増幅し、単一のｃＤＮＡクローンが得られるまで、トラ
ンスフェクションおよびパンニングのサイクルを繰り返
す。Seedら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1987，84：
3365およびAruffoら，EMBO J.，1987，6：3313参照。結
合タンパク質が分泌される場合、一旦、結合または中和
分析が一時的なトランスフェクション細胞からの上澄液
の分析ように確立されたら、そのｃＤＮＡを同様なプー
ル法で得ることができる。上澄液のスクリーニングの一
般的な方法はWongら，Science，1985，228：810-815に
開示されている。

【００８４】もう一つの別の方法は、細胞からの１１ｃ
ｂスプライス変種と直接、相互反応するタンパク質の単
離である。１１ｃｂスプライス変種とＧＳＴまたは小さ
いタグとの融合タンパク質を製造し、ビーズに固定化す
る。目的とする細胞からの生合成的にラベルした、また
はラベルしないタンパク質の抽出物を調製し、ビーズと
共にインキュベーションし、緩衝液で洗浄する。１１ｃ
ｂスプライス変種と相互反応したタンパク質をビーズか
ら特異的に溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。結合
相手の一次アミノ酸配列データはマイクロシーケンシン
グによって得られる。所望により、細胞タンパク質のチ
ロシンホスホリレーションのような機能的応答を導く試
薬で細胞を処理してもよい。そのような試薬の例は、成
長因子またはインターロイキン−２のようなサイトカイ
ンである。

【００８５】他の方法は、イムノアフィニティー精製で
ある。組換え１１ｃｂスプライス変種をラベルした、ま
たはしない細胞抽出物と共にインキュベーションし、抗
１１ｃｂスプライス変種抗体で免疫沈降させる。免疫沈
降物をプロテインＡ−セファロースで回収し、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分析する。ラベルしないタンパク質は、ビオ
チニル化によりラベルし、ストレプトアビジンでＳＤＳ
ゲル上で検出する。結合相手のタンパク質を、マイクロ
シーケンシングで分析する。さらに、公知の標準的な生
化学精製工程をマイクロシーケンシング前に使用しても
よい。さらに別の方法は、ペプチドライブラリーにおけ
る結合相手のスクリーニングである。タグを付すか、ラ
ベルした組換え１１ｃｂスプライス変種を用い、ペプチ
ドまたはホスホペプチドライブラリーから、１１ｃｂス
プライス変種と相互反応するペプチドを選択する。ペプ
チドのシーケンシングで、相互反応タンパク質に見いだ
され得るコンセンサスペプチド配列の同定できる。

【００８６】これらの方法または他の公知の方法のいず
れかで同定された１１ｃｂスプライス変種結合相手なら
びに上記した推定結合相手は本発明の分析方法に使用で
きる。１１ｃｂスプライス変種／結合相手複合体の存在
の分析は、例えば、酵母二ハイブリッドシステム、ＥＬ
ＩＳＡまたは該複合体に特異的な抗体を使用するイムノ
アッセイにより行うことができる。１１ｃｂスプライス
変種／結合相手複合体の形成を妨害または阻害する試験
物質の存在下、試験物質を欠く対照に対する複合体の量
の減少を測定する。遊離１１ｃｂスプライス変種または
結合相手のアッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡまたは特異
抗体を用いるイムノアッセイにより、または、放射ラベ
ルされてた１１ｃｂスプライス変種を細胞または細胞膜
と共にインキュベーションし、ついで遠心分離またはフ
ィルター分離することにより行える。１１ｃｂスプライ
ス変種／結合相手複合体の形成を妨害または阻害する試
験物質の存在下、試験物質を欠く対照に対する遊離１１
ｃｂスプライス変種または遊離結合相手の量の増加を測
定する。本発明のポリペプチドはまた、細胞中または無
細胞調製物中の１１ｃｂスプライス変種結合分子の１１
ｃｂスプライス変種結合能の評価にも使用できる。

【００８７】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明の１１ｃｂスプライス変種は、本発明のレセプタ
ーポリペプチド作用を活性化（アゴニスト）または阻害
（アンタゴニスト）する化合物をスクリーニングする方
法にも使用できる。一般に、そのようなスクリーニング
操作には、その表面に本発明のレセプターポリペプチド
を発現する適当な細胞の製造を包含する。そのような細
胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエまたはイー
・コリからの細胞が包含される。特に、本発明のレセプ
ターをコードするポリヌクレオチドは、細胞をトランス
フェクトし、それにより１１ｃｂスプライス変種を発現
させるために使用できる。発現されたレセプターを、つ
いで試験化合物と接触させ、結合、刺激または機能性応
答の抑制を観察する。

【００８８】そのようなスクリーニング操作の一つに
は、本発明の１１ｃｂスプライス変種発現のためにトラ
ンスフェクトされるメラニン細胞の使用が含まれる。そ
のようなスクリーニング技術はＰＣＴ ＷＯ９２／０１
８１０［１９９２年２月６日公開］に記載されている。
かかるアッセイは、レセプターをコードするメラニン細
胞をレセプターリガンドとスクリーニングすべき化合物
との両方と接触させて、本発明のレセプターポリペプチ
ドの活性化を阻害する化合物のスクリーニングに使用さ
れる。リガンドによるシグナル発生の阻害は、化合物が
レセプターに対する潜在的なアンタゴニストであるこ
と、すなわち、レセプターの活性化を阻害することを示
す。この技術はまた、そのような細胞をスクリーニング
すべき化合物と接触させ、そのような化合物がシグナル
を発生するか、否か、すなわち、レセプターを活性化す
るか、否かを測定することにより、レセプターを活性化
する化合物のスクリーニングにも使用できる。

【００８９】他のスクリーニング技術には、レセプター
の活性化によって起こった細胞外ｐＨ変化を測定するシ
ステムにおける１１ｃｂスプライス変種を発現する細胞
（例えば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞）の使用
が包含される。この技術においては、化合物を、本発明
のレセプターポリペプチドを発現する細胞と接触させる
ことができる。ついで、第二メッセンジャー応答、例え
ば、シグナルトランスダクションまたはｐＨ変化を測定
し、該潜在的化合物がレセプターを活性化するか阻害す
る測定する。もう一つのスクリーニング技術には、１１
ｃｂスプライス変種をコードするＲＮＡをXenopus卵母
細胞へ導入し、一時的にレセプターを発現させることが
包含される。ついで、レセプター卵母細胞をレセプター
リガンドおよびスクリーニングすべき化合物と接触させ
る。レセプターの活性化阻害を、例えば、レセプターの
活性化を阻害すると考えられる化合物のスクリーニング
の場合には、カルシウム、プロトンまたは他のイオンの
ようなシグナルの検出により測定する。

【００９０】他のスクリーニング技術には、１１ｃｂス
プライス変種の発現が包含され、レセプターはホスホリ
パーゼＣまたはＤと結合する。そのような細胞の代表的
な例には、限定するものではないが、内皮細胞、平滑筋
細胞、胎児性腎臓細胞がある。このスクリーニングは、
上記のごとく、ホスホリパーゼ第二シグナルからレセプ
ターの活性化またはレセプター活性化の阻害を検出する
ことにより行うことができる。他の方法には、表面にレ
セプターを有する細胞に対する標識したリガンドの結合
の阻害を測定することによる、アンタゴニストであり、
したがって、本発明のレセプターポリペプチドの活性化
を阻害する化合物のスクリーニングが包含される。その
ような方法には、真核細胞を、１１ｃｂスプライス変種
をコードするＤＮＡでトランスフェクトし、細胞がその
表面にレセプターを発現できるようにすることが包含さ
れる。細胞を標識化した公知のリガンドの存在下で化合
物と接触させる。リガンドは、例えば、放射能で標識で
きる。レセプターと結合した標識したリガンドの量は、
例えば、トランスフェクトした細胞またはそれからの膜
に伴う放射能を測定する。化合物がレセプターに結合す
ると、標識化したリガンドとレセプターとの結合は、レ
セプターに結合する標識化したリガンドの減少により測
定されるように、阻害される。

【００９１】他の方法には、１１ｃｂスプライス変種介
在ｃＡＭＰおよび／またはアデニレートサイクラーゼの
蓄積の阻害または刺激を測定することによる１１ｃｂス
プライス変種阻害剤のスクリーニングが包含される。こ
のような方法は、真核細胞を１１ｃｂスプライス変種レ
セプターでトランスフェクトし、レセプターを細胞表面
に発現させることが包含される。ついで、細胞を１１ｃ
ｂスプライス変種の存在下、潜在的アンタゴニストに曝
し、ｃＡＭＰ蓄積量を測定する。潜在的アンタゴニスト
がレセプターと結合すると、すなわち、１１ｃｂスプラ
イス変種の結合を阻害すると、１１ｃｂスプライス変種
介在ｃＡＭＰまたはアデニレートサイクラーゼ活性のレ
ベルが減少または増加する。

【００９２】本発明はまた、１１ｃｂスプライス変種レ
セプターに対する結合能が未知のリガンドがそのような
レセプターに結合するか、否かを測定する方法であっ
て、１１ｃｂスプライス変種レセプターを発現する哺乳
動物細胞を、リガンドが１１ｃｂスプライス変種レセプ
ターに結合できる条件下に、リガンドと接触させ、レセ
プターに結合したリガンドの存在を検出し、それによ
り、リガンドが１１ｃｂスプライス変種レセプターと結
合するか、否かを測定することからなる方法を提供す
る。アゴニストおよび／またはアゴニストを測定する上
記したシステムはまた、レセプターへ結合するリガンド
の測定にも使用できる。潜在的１１ｃｂスプライス変種
レセプターアンタゴニストの例には、レセプターに結合
するが、第二メッセンジャー応答によりレセプターの活
性化を妨げない抗体または、ある場合には、オリゴヌク
レオチドが包含される。また、潜在的アンタゴニストに
は、１１ｃｂスプライス変種レセプターのリガンドに密
接に関係するタンパク質、すなわち、リガンドのフラグ
メントも包含され、このようなタンパク質は、生物学的
機能を失い、１１ｃｂスプライス変種レセプターと結合
すると、何の応答も生じない。

【００９３】潜在的アンタゴニストには、アンチセンス
技術を使用して調製したアンチセンス構築物も包含され
る。アンチセンス技術は、三重螺旋形成またはアンチセ
ンスＤＮＡまたはＲＮＡにより遺伝子発現を調節するの
に用いることができ、両方法ともポリヌクレオチドのＤ
ＮＡまたはＲＮＡに対する結合に基づく。例えば、本発
明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配
列の５’コーディング領域は約１０ないし４０ｂｐの長
さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドをデザイン
するのに用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転
写に関与する遺伝子の領域に相補的になるようにデザイ
ンされ（三重螺旋）（Ｌeeら，Nucl.Acids Ｒes.，6：3
073（1979）；Cooneyら，Science，241：456（1988）；
およびDervanら，Science，251：1360（1991）参照）、
これにより１１ｃｂスプライス変種レセプターの転写お
よび産生を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレ
オチドは、in vivoでｍＲＮＡとハイブリッド形成し、
ｍＲＮＡ分子の１１ｃｂスプライス変種レセプター中へ
の転写を遮断する（アンチセンス）（Okano，J．Neuroc
hem.，56：560（1991）；Oligodeoxynucleotides as An
tisense Inhibitorsof Gene Expression，CRC Press，B
oca Raton，FL（1988））。上記オリゴヌクレオチドは
また、細胞から誘導でき、アンチセンスＲＮＡまたはＤ
ＮＡを、１１ｃｂスプライス変種レセプターの産生を抑
制するようにin vivoで発現できる。

【００９４】他の潜在的アンタゴニストは、１１ｃｂス
プライス変種レセプターと結合してリガンドと接近しに
くくなるようにして正常な生物学的活性を防止する小分
子である。小分子の例は、限定するものではないが、小
ペプチドまたはペプチド様分子である。他の潜在的アン
タゴニストには、可溶性形態の１１ｃｂスプライス変種
レセプター、例えば、レセプターのフラグメントが含ま
れ、リガンドと結合させ、リガンドが膜結合１１ｃｂス
プライス変種レセプターと相互反応するのを防止する。
１１ｃｂスプライス変種レセプターは哺乳動物宿主にお
いて遍在し、多くの病理を含む多くの生物学的機能に関
与する。したがって、一方で１１ｃｂスプライス変種レ
セプターを刺激し、他方で１１ｃｂスプライス変種レセ
プターの機能を抑制できる化合物および試薬を見つける
ことが望ましい。

【００９５】一般に、１１ｃｂスプライス変種レセプタ
ーのアゴニストは、とりわけ、細菌、糸状菌、原生動物
およびウイルス感染、特に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−
２によって起こる感染のような感染症、疼痛、癌、糖尿
病、肥満症、食欲不振、病的飢餓、喘息、パーキンソン
病、急性およびうっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿
閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、
良性前立腺肥大症および、不安、分裂症、躁鬱病、せん
妄、痴呆または重度精神薄弱のような精神病および神経
疾患ならびにハンチントン病、ジルドゥラトゥーレット
症候群のような運動異常などの疾患または障害の種々の
治療または予防目的に使用できる。

【００９６】１１ｃｂスプライス変種のアンタゴニスト
は、とりわけ、細菌、糸状菌、原生動物およびウイルス
感染、特に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２によって起こ
る感染のような感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満症、食
欲不振、病的飢餓、喘息、パーキンソン病、急性および
うっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭
心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大症
および、不安、分裂症、躁鬱病、せん妄、痴呆または重
度精神薄弱のような精神病および神経疾患ならびにハン
チントン病、ジルドゥラトゥーレット症候群のような運
動異常などの疾患または障害の種々の治療および予防目
的に用いられる。

【００９７】本発明はさらに過剰の１１ｃｂスプライス
変種活性と関連した異常な状態の治療法であって、患者
に上記阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許容され
る担体とともに、リガンドの１１ｃｂスプライス変種と
の結合を遮断することによるか、または第二のシグナル
を抑制することにより活性化を抑制するのに有効な量で
投与し、それにより異常な症状を軽減することからなう
る方法を提供する。本発明はまた１１ｃｂスプライス変
種活性の発現不足と関連した異常な症状の治療法であっ
て、患者に有効量の上記の本発明のレセプターポリペプ
チドを活性化する化合物（アゴニスト）を医薬上許容さ
れる担体とともに投与して、異常な症状を軽減すること
からなる方法も提供する。

【００９８】組成物およびキット 可溶性形態の１１ｃｂスプライス変種、およびこのよう
なレセプターを活性化または抑制する化合物を適当な医
薬担体と組み合わせて用いることができる。このような
組成物は治療上有効量のポリペプチドまたは化合物と医
薬上許容される担体または賦形剤とを含んでなる。この
ような担体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、
水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせ
を包含するが、これに限定されない。処方は投与方法に
適合するものでなければならない。本発明はまた、１ま
たはそれ以上の上記した本発明の医薬組成物の成分を充
填した１またはそれ以上の容器からなる医薬パックまた
はキットを提供する。

【００９９】投与 本発明のポリペプチドおよびその他の化合物は、単独
で、または薬効を有する他の化合物と組み合わせて使用
できる。医薬組成物を全身投与するための好ましい形態
は、典型的には、静脈内注射による注射である。皮下、
筋肉内または腹腔内などの他の投与経路を用いることも
できる。最近になって、胆汁酸塩またはフシジン酸ある
いは他のデタージェントなどの浸透剤を用いて経粘膜お
よび経皮投与することからなる、組成物を全身投与する
ための別の手段が考案された。加えて、腸溶性またはカ
プセル化製剤に処方する場合、経口投与とすることも可
能である。これら化合物の投与はまた、軟膏、ペース
ト、ゲルなどの形態の局所／局部的であってもよい。

【０１００】必要な投与量範囲は、ペプチドの選択、投
与経路、処方性、患者の症状、および顧問医の判断に依
存する。しかしながら、適当な用量範囲は、対象の体重
１ｋｇ当たり０.１−１００μｇである。しかし、種々
のペプチドを利用できること、および投与経路での効能
の違いを鑑みて、要求される投与量にて大きな違いが予
期される。これらの投与レベルの違いは、当該分野にて
よく理解されているような、最適化のための標準的実験
操作を用いて調節できる。

【０１０１】遺伝子療法 １１ｃｂスプライス変種ポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニス
トは、しばしば「遺伝子療法」と称される治療モダリテ
ィーにおいてそのようなポリペプチドを発現させること
により本発明に従って使用できる。すなわち、例えば、
患者からの細胞をex vivoでポリペプチドをコードす
る、ＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオチドで遺
伝子操作する。遺伝子操作した細胞をついで、ポリペプ
チドで治療すべき患者に与える。例えば、本発明のポリ
ペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス
プラスミドベクターを使用することにより、細胞をex v
ivoで遺伝子操作できる。このような方法は当該分野で
よく知られており、本発明におけるそれらの使用は、本
明細書の記載から明らかであろう。

【０１０２】同様に、細胞をin vivoで遺伝子操作し
て、当該分野で公知の操作によりin vivoでポリペプチ
ドを発現できる。例えば、本発明のポリヌクレオチド
は、上記のごとく、複製欠損レトロウイルスベクター中
で発現するように操作できる。レトロウイルス発現構築
物を単離し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ
を含有するレトロウイルスプラスミドベクターを形質導
入したバッケージング細胞に入れ、パッケージング細胞
が関心のある遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を新
たに産生できるようにする。このような産生細胞を、患
者に投与し、in vivoで細胞を操作し、in vivoでポリペ
プチドを発現させる。本発明のポリペプチドを投与する
ためのこれら、および他の方法は、本発明の教示から当
業者に明らかであろう。

【０１０３】上記のレトロウイルスプラスミドベクター
を誘導できるレトロウイルスには、限定するものではな
いが、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾壊死ウイル
ス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワ
トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト
免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫
ウイルスおよび乳癌ウイルスが包含される。好ましい態
様においては、レトロウイルスプラスミドベクターは、
モロニーネズミ白血病ウイルスから誘導される。

【０１０４】そのようなベクターは、該ポリペプチド発
現用の１つ以上のプロモーターを含む。使用できる適当
なプロモーターには、限定するものではないが、レトロ
ウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーターおよびMiller
ら，Biotechniques，7：980-990（1989）に記載される
ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ま
たはいずれか他の方法（例えば、限定されるものではな
いが、ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびβ−
アクチンプロモーターを包含する真核細胞プロモーター
のような細胞プロモーター）が挙げられる。使用できる
ウイルスプロモーターには、限定するものではないが、
アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）プロモーターおよびＢ１９パルボウイルスプロモー
ターが包含される。適当なプロモーターの選択は本明細
書の教示から当業者に明らかであろう。

【０１０５】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適当なプロモーターの制御下に置かれる。使用で
きる適当なプロモーターには、限定するものではない
が、アデノウイルス主後期プロモーターのようなアデノ
ウイルスプロモーター；サイトメガロウイウス（ＣＭ
Ｖ）プロモーターのようなヘテロローガスプロモータ
ー；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロ
モーター、メタロチオネインプロモーターのような誘導
できるプロモーター；ヒートショックプロモーター；ア
ルブミンプロモーター；ApoAIプロモーター；ヒトグロ
ビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロ
モーターのようなウイルス性チミジンキナーゼプロモー
ター；レトロウイルスＬＴＲ（上記した修飾レトロウイ
ルスＬＴＲを含む）；β−アクチンプロモーターおよび
ヒト成長ホルモンプロモーターが包含される。プロモー
ターはまた、ポリペプチドのコード遺伝子を制御できる
天然のプロモーターでもよい。

【０１０６】レトロウイルスプラスミドベクターを、パ
ッケージングセルラインの形質導入に使用して産生セル
ラインを形成する。トランスフェクトできるパッケージ
ング細胞の例としては、限定するものではないが、ＰＥ
５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ
１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＹＣＲＥ、Ｙ
ＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およ
びMiller,A.、Human Gene Therapy，1990，1：5-14に記
載されるＤＮＡセルラインが挙げられる。ベクターは、
公知のいずれかの方法によりパッケージング細胞に形質
導入できる。そのような方法には、限定するものではな
いが、電気穿孔法、リポソームの使用およぎＣaＰＯ₄沈
殿が包含される。別法の１つとして、レトロウイルスプ
ラスミドベクターは、リポソームに封入するか、脂質に
結合させ、ついで宿主に投与できる。

【０１０７】産生セルラインは、該ポリペプチドをコー
ドする核酸配列を含む感染性のレトロウイルスベクター
粒子を生じさせる。そのようなレトロウイルスベクター
粒子を使用してin vitroまたはin vivoで真核細胞に形
質導入できる。形質導入された真核細胞は、該ポリペプ
チドをコードする核酸配列を発現させる。形質導入され
る真核細胞には、限定するものではないが、胎児性幹細
胞、胎児性癌細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽
細胞、筋芽細胞、角化細胞、内皮細胞および気管支上皮
細胞が包含される。

【０１０８】

【実施例】ここで使用する用語については、上記で既に
説明した。全ての実施例は、特に詳細に説明しない限
り、当業者によく知られた、日常的な標準的技術を用い
て行われる。以下の実施例の日常的な分子生物学技術
は、Sambrookなどの標準的実験室マニュアルの記載に従
って行うことができる。以下の実施例における全ての部
または量は、特に断らない限り、重量基準である。特に
断らない限り、以下の実施例におけるフラグメントのサ
イズ分離は、Sambrookおよび例えば、Goeddelら，Nucle
ic Acids Res. 8：4057のような他の多くの文献に記載
されているアガロースおよびポリアクリルアミドゲルを
用いる標準的な技術を用いて行う。特に断らない限り、
ライゲーションは、標準的な緩衝液、インキュベーショ
ン温度および時間、略等モル量のライゲーションすべき
ＤＮＡフラグメントおよびＤＮＡ０．５μ当たり約１０
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて行
う。

【０１０９】実施例１−ヒト１１ｃｂスプライス変種の
５’−末端のクローニング Life Technologyのプラスミド・ベクターより精製し
た、ヒト全脳由来のＤＮＡ上で、ヒト１１ｃｂスプライ
ス変種の５’末端を、以下のプライマーおよび条件を用
いて増幅させた。次の外部プライマーを用いた：５’ベ
クター−特異的プライマー：５’ＧＣＴＡＴＴＴＡＧＧ
ＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＧＴＡＣＧ３’（配列番
号３）；および３’遺伝子−特異的プライマー：５’Ｃ
ＧＡＧＡＧＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣ３’
（配列番号４）。

【０１１０】以下の物を５０マイクロリットル反応容量
にて用いた：１０ＸＴａｑポリメラーゼ緩衝剤、２００
μＭ ｄＮＴＰ、５％ピコモルの各プライマー、１００
ナノグラムのLife Technologyのプラスミド・ベクター
より精製した、ヒト全脳由来のプラスミドＤＮＡ、１：
１０の容量比のＴａｑポリメラーゼとＰｆｕポリメラー
ゼの混合物。ついで、以下のＰＣＲプログラムを用い
た：９４℃で５分間を１サイクル；９４℃で１分間を２
５サイクル；５５℃で１分間を２５サイクル；７２℃で
２分間を２５サイクル；および７２℃で８．５分間を１
サイクル。

【０１１１】次の収納（nested）または内部プライマー
を用いた：５’ベクター−特異的プライマー：５’ＧＧ
ＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＧＴＡＣＧ３’（配列番
号５）；および３’遺伝子−特異的プライマー：５’Ｇ
ＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＣＧＡＡＣＡＣＣＧＡＡＧＧ３’
（配列番号６）。

【０１１２】収納または内部反応系を外部反応系と同じ
操作にて用いた。ただし、１μＬのプラスミドＤＮＡを
外部反応系の１μＬの代わりに用いた。ついで、ＤＮＡ
を１．２％アガロースゲル上でサイズ−フラクションに
付した。２つの主要バンドがサブクローンされ、そのサ
ブクローンしたフラグメントを配列決定した。その主要
バンドの一方は、１９９６年６月２０日公開のＷＯ９６
／１８６５１に開示されている、元のヒト１１ｃｂクロ
ーンの５’末端であり、他方のバンドはヒト１１ｃｂク
ローンの新規なスプライス変種のクローニングであっ
た。

【０１１３】実施例２−リガンドまたはアンタゴニスト
の同定 実施例１に記載した発現したレセプターを、以下のリガ
ンドまたはアンタゴニストについてスクリーニングす
る。 Ａ．リガンド／組織バンク 発現したレセプターを、化合物バンク、複合生物学的液
体、組み合わせ有機およびペプチドライブライリーなど
のスクリーニングに使用してリガンドまたはアンタゴニ
ストの活性化を同定する。同様に、レセプターをヒト、
他の哺乳動物種の組織、例えば、ブタ組織の組織抽出物
についてスクリーニングする。具体的なそのような組織
抽出物には、肺、肝臓、内臓、心臓、腎臓、副腎、虚血
脳、血漿、尿および胎盤が包含される。これらの組織バ
ンクの形成に使用する抽出技術は公知である。

【０１１４】Ｂ．機能分析 １．アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞アッセイ 細胞表面レセプターの特徴付にはアフリカツメガエル卵
母細胞系を使用する。なぜなら、これらの細胞は、ｍＲ
ＮＡを正確に翻訳し、シグナルペプチド開裂、グリコシ
ル化、ホスホリレーションおよびサブユニットアセンブ
リーを包含する多数のポスト翻訳修飾を行うことができ
るからである。機能分析は以下のようにして行う。in v
itroキャップＲＮＡ転写物を、標準的な方法を用いて、
ＲＮＡポリメラーゼで、１１ｃｂスプライス変種レセプ
ターｃＤＮＡをコードする鎖状化した鋳型プラスミドか
ら調製する。in vitro転写物を最終濃度０．２μｇ／ｍ
ｌで水に懸濁する。卵巣葉を成熟雌カエルから取り出
し、ステージＶ脱嚢卵母細胞を得、ＲＮＡ転写物（１０
ｎｇ／卵母細胞）をDrummondマイクロインジェクション
装置を使用し、５０ｎｌ塊に注射する。２つの電極クラ
ンプ（Warner Instrument）を使用して、個々のアフリ
カツメガエル卵母細胞からの電流を測定する。記録は、
室温にて、Ｃa²⁺フリーのバース培地中で行う。

【０１１５】２．マイクロフィジオメーターアッセイ これらのバンクのスクリーニングを、マイクロフィジオ
メーター（例えば、Molecular Devices，Ltd．から入手
できる）を使用して行う。例えば、二次メッセンジャー
システムの活性化は、大きくは、細胞内シグナリング・
プロセスに燃料を供給するのに必要な代謝活性の増加の
結果、細胞からの少量の酸の押し出しをもたらす。細胞
の周囲の培地のｐＨ変化は小さく、マイクロフィジオメ
ーターによって検出できる。かくして、エネルギー利用
細胞内シグナリング経路に伴ういずれのレセプター
（例、Ｇ−タンパク質共役型受容体）の活性化も検出す
ることができる。

【０１１６】３．カルシウムアッセイ ＨＥＫ２９３細胞中で安定に発現されたレセプターは、
適当なランクオーダーと効力を有するアゴニストに対し
て強いカルシウム応答を示す。レセプター・トランスフ
ェクトまたはベクター制御細胞におけるＨＥＫ２９３細
胞の基底カルシウムレベルは、通常１００ｎＭ〜２００
ｎＭの範囲である。組み換え体レセプターを発現してい
るＨＥＫ２９３細胞をフラ２と共に負荷し、１日で、＞
１５０の選択したリガンドを、アゴニスト誘発カルシウ
ム移動について評価する。一時的カルシウム移動を与え
るアゴニストを、ベクター制御細胞中でテストし、その
カルシウム応答が該一時的レセプター細胞に特異的か否
か決定する。特異的なアゴニスト誘発応答が同定されれ
ば、応答を別の群の細胞において再現し、効能と関連す
るリガンドについての濃度応答曲線で薬理的に特徴付け
る。

【０１１７】実施例３−ノーザン・ブロット分析 使用するノーザンブロットはClontechより入手した。転
写物の大きさは約２.４ｋｂであり、転写物バンドが全
脳、扁桃腺、尾状核、脳梁、海馬、黒質、視床下部核、
視床、心臓および肝臓にて観察された。逆に、転写物の
バンドはノーザンブロット分析により以下の組織：胎
盤、肺、骨格筋、腎臓または膵臓で検出されなかった。

【０１１８】

【配列表】 （１）一般的情報： （i）出願人：バーグズマ，ダーク エリス，キャサリン・エイ （ii）発明の名称： 新規ヒト１１ｃｂスプライス変種 （iii）配列の数：６ （iv）連絡先： （Ａ）名称：ラトナー＆プレスチア （Ｂ）通り名：ピー・オー・ボックス９８０ （Ｃ）都市名：バレイ・フォージ （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９４８２ （v）コンピューター読取り可能な形態： （Ａ）媒体形態：フロッピーデスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：FastＳＥＱ バージョン１.５ （vi）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： (vii) 先の出願データ （A）出願番号：６０／０３２７６３ （Ｂ）出願日：１９９６年１２月１１日 （viii）代理人等の情報： （Ａ）氏名：プレスティア、ポウル・エフ （Ｂ）登録番号：２３,０３１ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０５９９ （ix）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−４０７−０７００ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−４０７−０７０１ （Ｃ）テレックス：８４６１６８

【０１１９】（２） 配列番号１の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１３８５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （iii）ヒポセティカル：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメント： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号１： GGTGACACTA TAGAAGGTAC GCCTGCAGGT ACCGGTCCGG AATTCCCGGG TCGACCCACG 60 CGTCCGGGAG GGCAGTTGGG CTTGGAGGCG GCAGCGGCTG CCAGGCTACG GAGGAAGACC 120 CCCTTCCCGA CTGCGGGGCT TGCGCTCCGG GACAAGGTGG CAGGCGCTGG AGGCTGCCGC 180 AGCCTGCGTG GGTGGAGGGG AGCTCAGCTC GGTTGTGGGA GCAGGCGACC GGCACTGGCT 240 GGATGGACCT GGAAGCCTCG CTGCTGCCCA CTGGTCCCAA TGCCAGCAAC ACCTCTGATG 300 GCCCCGATAA CCTCACTTCG GCAGGATCAC CTCCTCGCAC GGGGAGCATC TCCTACATCA 360 ACATCATCAT GCCTTCGGTG TTCGGCACCA TCTGCCTCCT GGGCATCATC GGGAACTCCA 420 CGGTCATCTT CGCGGTCGTG AAGAAGTCCA AGCTGCACTG GTGCAACAAC GTCCCCGACA 480 TCTTCATCAT CAACCTCTCG GTAGTAGATC TCCTCTTTCT CCTGGGCATG CCCTTCATGA 540 TCCACCAGCT CATGGGCAAT GGGGTGTGGC ACTTTGGGGA GACCATGTGC ACCCTCATCA 600 CGGCCATGGA TGCCAATAGT CAGTTCACCA GCACCTACAT CCTGACCGCC ATGGCCATTG 660 ACCGCTACCT GGCCACTGTC CACCCCATCT CTTCCACGAA GTTCCGGAAG CCCTCTGTGG 720 CCACCCTGGT GATCTGCCTC CTGTGGGCCC TCTCCTTCAT CAGCATCACC CCTGTGTGGC 780 TGTATGCCAG ACTCATCCCC TTCCCAGGAG GTGCAGTGGG CTGCGGCATA CGCCTGCCCA 840 ACCCAGACAC TGACCTCTAC TGGTTCACCC TGTACCAGTT TTTCCTGGCC TTTGCCCTGC 900 CTTTTGTGGT CATCACAGCC GCATACGTGA GGATCCTGCA GCGCATGACG TCCTCAGTGG 960 CCCCCGCCTC CCAGCGCAGC ATCCGGCTGC GGACAAAGAG GGTGACCCGC ACAGCCATCG 1020 CCATCTGTCT GGTCTTCTTT GTGTGCTGGG CACCCTACTA TGTGCTACAG CTGACCCAGT 1080 TGTCCATCAG CCGCCCGACC CTCACCTTTG TCTACTTATA CAATGCGGCC ATCAGCTTGG 1140 GCTATGCCAA CAGCTGCCTC AACCCCTTTG TGTACATCGT GCTCTGTGAG ACGTTCCGCA 1200 AACGCTTGGT CCTGTCGGTG AAGCCTGCAG CCCAGGGGCA GCTTCGCGCT GTCAGCAACG 1260 CTCAGACGGC TGACGAGGAG AGGACAGAAA GCAAAGGCAC CTGATACTTC CCCTGCCACC 1320 CTGCACACCT CCAAGTCAGG GCACCACAAC ACGCCACCGG GAGAGATGCT CTCGTGCCGA 1380 ATTCC 1385

【０１２０】（２） 配列番号２の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３５３アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の型：ペプチド （iii）ヒポセティカル：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメント：Ｎ−末端 （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号２： Met Asp Leu Glu Ala Ser Leu Leu Pro Thr Gly Pro Asn Ala Ser Asn 1 5 10 15 Thr Ser Asp Gly Pro Asp Asn Leu Thr Ser Ala Gly Ser Pro Pro Arg 20 25 30 Thr Gly Ser Ile Ser Tyr Ile Asn Ile Ile Met Pro Ser Val Phe Gly 35 40 45 Thr Ile Cys Leu Leu Gly Ile Ile Gly Asn Ser Thr Val Ile Phe Ala 50 55 60 Val Val Lys Lys Ser Lys Leu His Trp Cys Asn Asn Val Pro Asp Ile 65 70 75 80 Phe Ile Ile Asn Leu Ser Val Val Asp Leu Leu Phe Leu Leu Gly Met 85 90 95 Pro Phe Met Ile His Gln Leu Met Gly Asn Gly Val Trp His Phe Gly 100 105 110 Glu Thr Met Cys Thr Leu Ile Thr Ala Met Asp Ala Asn Ser Gln Phe 115 120 125 Thr Ser Thr Tyr Ile Leu Thr Ala Met Ala Ile Asp Arg Tyr Leu Ala 130 135 140 Thr Val His Pro Ile Ser Ser Thr Lys Phe Arg Lys Pro Ser Val Ala 145 150 155 160 Thr Leu Val Ile Cys Leu Leu Trp Ala Leu Ser Phe Ile Ser Ile Thr 165 170 175 Pro Val Trp Leu Tyr Ala Arg Leu Ile Pro Phe Pro Gly Gly Ala Val 180 185 190 Gly Cys Gly Ile Arg Leu Pro Asn Pro Asp Thr Asp Leu Tyr Trp Phe 195 200 205 Thr Leu Tyr Gln Phe Phe Leu Ala Phe Ala Leu Pro Phe Val Val Ile 210 215 220 Thr Ala Ala Tyr Val Arg Ile Leu Gln Arg Met Thr Ser Ser Val Ala 225 230 235 240 Pro Ala Ser Gln Arg Ser Ile Arg Leu Arg Thr Lys Arg Val Thr Arg 245 250 255 Thr Ala Ile Ala Ile Cys Leu Val Phe Phe Val Cys Trp Ala Pro Tyr 260 265 270 Tyr Val Leu Gln Leu Thr Gln Leu Ser Ile Ser Arg Pro Thr Leu Thr 275 280 285 Phe Val Tyr Leu Tyr Asn Ala Ala Ile Ser Leu Gly Tyr Ala Asn Ser 290 295 300 Cys Leu Asn Pro Phe Val Tyr Ile Val Leu Cys Glu Thr Phe Arg Lys 305 310 315 320 Arg Leu Val Leu Ser Val Lys Pro Ala Ala Gln Gly Gln Leu Arg Ala 325 330 335 Val Ser Asn Ala Gln Thr Ala Asp Glu Glu Arg Thr Glu Ser Lys Gly 340 345 350 Thr

【０１２１】（２） 配列番号３の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （iii）ヒポセティカル：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメント： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号３： GCTATTTAGG TGACACTATA GAAGGTACG 29

【０１２２】（２） 配列番号４の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （iii）ヒポセティカル：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメント： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号４： CGAGAGGTTG ATGATGAAGA TGTC 24

【０１２３】（２） 配列番号５の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （iii）ヒポセティカル：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメント： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号５： GGTGACACTA TAGAAGGTAC G 21

【０１２４】（２） 配列番号６の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （iii）ヒポセティカル：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメント： （vi）起源： （xi）配列の記載：配列番号６： GCAGATGGTG CCGAACACCG AAGG 24

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒト１１ｃｂスプライス変種のヌクレオチド
配列（配列番号１）を示す。

【図２】 ヒト１１ｃｂスプライス変種のヌクレオチド
配列（配列番号１）を示す。

【図３】 ヒト１１ｃｂスプライス変種の推定核酸配列
（配列番号２）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＮ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ＡＢＵ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ ＡＢＶ 33/53 Ｄ ＡＣＤ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ ＡＣＮ ＡＡＮ ＡＣＶ ＡＢＥ ＡＤＰ ＡＢＮ ＡＤＵ ＡＢＵ ＡＤＺ ＡＢＶ 48/00 ＡＤＹ ＡＣＤ Ｃ０７Ｋ 14/705 ＡＣＮ 16/18 ＡＣＶ Ｃ１２Ｎ 5/10 ＡＤＰ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＤＵ Ｇ０１Ｎ 33/15 ＡＤＺ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 キャサリン・イー・エリス アメリカ合衆国08028ニュージャージー州 グラスボーロー、フォーダム・プレイス 831番

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるポリ
   ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なく
   とも９１％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号２と同じアミノ酸をコードする遺伝コー
   ドの重複性によるポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと相補性
   のポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   の少なくとも１５個の連続した塩基からなるポリヌクレ
   オチド；からなる群より選択されるポリヌクレオチドか
   らなる単離されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
   １記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
   １記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号１に示すヌクレオチドからなる
   請求項２記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号２のアミノ酸からなるポリペプ
   チドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項２記載のＤＮＡを含有するベクタ
   ー。
7. 【請求項７】 請求項６のベクターを含む宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項７の宿主を、培地中、１１ｃｂス
   プライス変種ポリペプチドを発現するのに十分な条件下
   で培養し、発現したポリペプチドを回収することからな
   る１１ｃｂスプライス変種ポリペプチドの産生法。
9. 【請求項９】 宿主細胞が、適当な培養条件下、請求項
   ６に記載のベクターに含まれるＤＮＡによってコードさ
   れる１１ｃｂスプライス変種ポリペプチドを発現するよ
   うに、該宿主細胞を該ベクターで形質転換またはトラン
   スフェクションすることからなるポリペプチドを発現す
   る細胞の産生法。
10. 【請求項１０】 配列番号２のアミノ酸配列と少なくと
    も９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペ
    プチド。
11. 【請求項１１】 配列番号２に示すアミノ酸配列からな
    るポリペプチド。
12. 【請求項１２】 請求項１０記載のポリペプチドに対す
    るアゴニスト。
13. 【請求項１３】 請求項１０記載のポリペプチドに対す
    る抗体。
14. 【請求項１４】 請求項１０記載のポリペプチドに対す
    るアンタゴニスト。
15. 【請求項１５】 治療上有効量の請求項１０記載のポリ
    ペプチドを患者に投与することからなる１１ｃｂスプラ
    イス変種の必要性を有する患者の治療法。
16. 【請求項１６】 該ポリペプチドをコードするＤＮＡを
    患者に与え、該ポリペプチドをin vivoで発現させるこ
    とにより該治療上有効量のポリペプチドを投与する請求
    項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 治療上有効量の請求項１４記載のアン
    タゴニストを患者に投与することからなる１１ｃｂスプ
    ライス変種ポリペプチド阻害の必要性を有する患者の治
    療法。
18. 【請求項１８】 請求項１０記載のポリペプチドをコー
    ドする核酸配列における突然変異を測定することからな
    る該ポリペプチドの発現に関係する疾患または疾患の疑
    いを診断する方法。
19. 【請求項１９】 宿主から由来する試料中の請求項１１
    記載のポリペプチドの存在を分析することからなる診断
    方法。
20. 【請求項２０】 請求項１０記載のポリペプチドに対す
    るレセプターと結合し、それを活性化または阻害する化
    合物の同定法であって、 細胞表面にポリペプチドに対するレセプター（化合物の
    該レセプターへの結合に応じて検出可能なシグナルを提
    供できる第二の成分と伴っている）を発現している細胞
    を、該レセプターとの結合を可能とする条件下で、スク
    リーニングすべき化合物と接触させ；該化合物とレセプ
    ターとの相互反応から生じるシグナルの有無を検出し
    て、化合物がレセプターと結合し、そのレセプターを活
    性化するか、阻害するかを測定することからなる方法。