JP2001525178A - ヒト１１ｃｂスプライス変異体に対するアゴニストおよびアンタゴニストの探索方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト11ｃｂスプライス変異体ポリペプチドおよび前記11ｃｂスプライス変異体をコードするＤＮＡ(ＲＮＡ)ならびに前記ポリペプチドの組換え技法による製造方法が開示されている。また、そのような11cbスプライス変異体を、特に感染症（例えば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼痛、癌、糖尿病、肥満、飲食異常(feeding and drinking abnormalities)(例えば、拒食症、過食症)、喘息、パーキンソン病、急性およびうっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大ならびに精神および神経障害（不安、精神分裂、躁うつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常、例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群を含む）を治療するために使用する方法が開示されている。さらに、感染症（例えば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼痛、癌、糖尿病、肥満、飲食異常(feeding and drinking abnormalities)(例えば、拒食症、過食症)、喘息、パーキンソン病、急性およびうっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大ならびに精神および神経障害（不安、精神分裂、躁うつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常、例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群を含む）を治療するための、前記11cbスプライス変異体のアンタゴニストならびに治療薬としてのその使用も開示されている。核酸配列における突然変異および前記ポリペプチドの変更された濃度に関連した疾病を検出するための診断アッセイもまた開示されている。また、11cbスプライス変異体をコードするポリヌクレオチドにおける突然変異を検出するための診断アッセイ、ならびに宿主内の前記ポリペプチドの変更された濃度を検出するための診断アッセイも開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、一部には、新たに同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド
、前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体および誘導体、前記ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドならびにそれらの変異体および誘導体の作製方法
、前記ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト、前記ポリヌクレオチド
、ポリペプチド、変異体、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストの使用に関
する。特に、この点および他の点に関して、本発明はヒト11cbスプライス変異体
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。

【０００２】発明の背景 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、
ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に関する。より具体
的には、本発明のポリペプチドはヒト７回膜貫通(7-transmembrane)受容体であ る。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害または活性化すること
に関する。

【０００３】 医学的に重要な生物学的プロセスの多くが、Ｇタンパク質を含めたシグナル伝
達経路に関与しているタンパク質および／または第二メッセンジャー（例えば、
ｃＡＭＰ）により媒介されることはよく知られている (Lefkowitz, Nature, 199
1, 351:353-354) 。本明細書中では、これらのタンパク質はＧタンパク質を含む
経路に関与しているタンパク質、すなわちＰＰＧタンパク質と称される。これら
のタンパク質のいくつかの例として、アドレナリン作動薬やドーパミンの受容体
(Kobilka, B.K.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1987), 84:46-50; Kobilka,
B.K.ら, Science, (1987), 238:650-656; Bunzow, J.R.ら, Nature, (1988), 3
36:783-787)、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパク質（例：ホスホリ パーゼＣ、アデニルシクラーゼ、ホスホジエステラーゼ）、およびアクチュエー
タータンパク質（例：プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ）(Simon,
M.I.ら, Science, 252:802-8,(1991)) の受容体のようなＧＰＣ受容体を挙げる ことができる。

【０００４】 例えば、シグナル伝達の１つの形態では、ホルモンの結合の結果として細胞内
で酵素アデニル酸シクラーゼが活性化される。この酵素のホルモンによる活性化
はヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、このＧＴＰもホルモンの結合に影響を及
ぼす。Ｇタンパク質はホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼと結びつけている
。ホルモン受容体により活性化されると、Ｇタンパク質は結合していたＧＤＰを
ＧＴＰと交換することが見いだされた。その後、ＧＴＰ担持形態が活性化された
アデニル酸シクラーゼと結合する。ＧＴＰがＧＤＰへ加水分解されると（この加
水分解はＧタンパク質自体により触媒される）、Ｇタンパク質はその不活性な基
底形態へと戻る。こうして、Ｇタンパク質は二重の役割を果たしており、すなわ
ち、受容体からのシグナルをエフェクターに中継する中間体として、さらにシグ
ナルの持続時間を制御する時計として機能している。

【０００５】 Ｇタンパク質共役受容体の膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは、７つの
推定上の膜貫通ドメインを有すると特性付けられた。これらのドメインは細胞外
または細胞質ループにより接続された膜貫通αヘリックスに相当すると考えられ
る。Ｇタンパク質共役受容体には、ホルモン、ウイルス、増殖因子、神経の受容
体などの多くの生物学的に活性な受容体が含まれる。

【０００６】 Ｇタンパク質共役受容体は、少なくとも８つの異なる親水性ループをつなぐ、
約２０〜３０個のアミノ酸からなるこれら７つの保存された疎水性領域を含むと
特性付けられてきた。Ｇタンパク質共役受容体のファミリーには、精神疾患およ
び神経疾患の治療に用いられる神経弛緩薬と結合するドーパミン受容体が含まれ
る。このファミリーに含まれるメンバーのその他の例としては、カルシトニン、
アドレナリン、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン、アセチルコ
リン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプ
シン、内皮細胞分化遺伝子−１、ロドプシン、におい物質、サイトメガロウイル
スの受容体が挙げられるが、これらに限らない。

【０００７】 大部分のＧタンパク質共役受容体は、機能性タンパク質の構造を安定化させる
と考えられるジスルフィド結合を形成する保存されたシステイン残基を、最初の
２つの細胞外ループのそれぞれに１個もっている。７つの膜貫通領域はＴＭ１、
ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と呼ばれる。ＴＭ３がシ
グナル伝達に係わっている。

【０００８】 システイン残基のリン酸化およびリピド化（パルミチル化またはファルネシル
化）は、いくつかのＧタンパク質共役受容体のシグナル伝達に影響を与えること
ができる。Ｇタンパク質共役受容体はその第三細胞質ループおよび／またはカル
ボキシ末端に潜在的なリン酸化部位を含むことが多い。βアドレナリン受容体の
ような数種のＧタンパク質共役受容体においては、プロテインキナーゼＡおよび
／または特異的な受容体キナーゼによるリン酸化が受容体の脱感受性を媒介して
いる。

【０００９】 いくつかの受容体では、Ｇタンパク質共役受容体のリガンド結合部位はＧタン
パク質共役受容体の数個の膜貫通ドメインにより形成される親水性ソケット(soc
ket)を含み、このソケットがＧタンパク質共役受容体の疎水性残基によりとり囲
まれていると考えられている。Ｇタンパク質共役受容体のそれぞれの膜貫通ヘリ
ックスの親水側は、内側に面して極性のリガンド結合部位を形成していると仮定
される。いくつかのＧタンパク質共役受容体では、ＴＭ３がＴＭ３のアスパラギ
ン酸残基のようなリガンド結合部位をもつとしてリガンドの結合に関与してきた
。ＴＭ５のセリン、ＴＭ６のアスパラギン、さらにＴＭ６やＴＭ７のフェニルア
ラニンまたはチロシンもリガンドの結合に関与している。

【００１０】 Ｇタンパク質共役受容体は、ヘテロ三量体のＧタンパク質により、種々の細胞
内酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合することがで
きる (Johnson ら, Endoc. Rev., (1989), 10:317-331 を参照のこと) 。個々の
Ｇタンパク質のαサブユニットが特定のエフェクターを優先的に刺激して細胞の
さまざまな生物学的機能をモジュレートする。Ｇタンパク質共役受容体の細胞質
側の残基のリン酸化は、一部のＧタンパク質共役受容体のＧタンパク質共役を調
節するための重要な作用機構として同定された。Ｇタンパク質共役受容体は哺乳
動物宿主のいろいろな部位で見いだされている。

【００１１】 ここ１５年の間に、細胞膜を７回貫通する（７ＴＭ）受容体をターゲットとす
る１５０種類ほどの治療薬が市場に導入され、成功を収めてきた。このことは、
こうした受容体に治療標的としての確立され実証された歴史があることを示して
いる。明らかに、感染症（例えば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる
感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼痛、癌、糖
尿病、肥満、飲食異常(feeding and drinking abnormalities)(例えば、拒食症 、過食症)、喘息、パーキンソン病、急性およびうっ血性心不全、低血圧、高血 圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥
大ならびに精神および神経障害（不安、精神分裂、躁うつ、せん妄、痴呆、重症
の精神遅滞および運動異常、例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツ
レット症候群を含む）を含むがこれらに限らない、機能障害または疾病を予防し
、改善し、治療する上で何らかの役割を果たすさらなる受容体を同定して特性付
ける必要性が存在している。

【００１２】 本発明のポリペプチドは、保存された７つの膜貫通残基を有し、それらは既知
のＧタンパク質共役受容体に対するアミノ酸配列相同性を有する。

【００１３】 最初のヒト11cbクローンは、本出願人らによりPCT WO96/18651(1996年6月20日
公開)において既に開示されている。

【００１４】発明の概要 これら等の目的に関し、本発明の課題はポリペプチド、特に図１に記載したア
ミノ酸配列(配列番号２)と他のタンパク質(例えば、マウスｃＤＮＡ、ラット・ カルシトニン受容体Ａ、ラット・カルシトニン受容体Ｂ、およびホルモン受容体
EMR1)の公知のアミノ酸配列との間の相同性により新たなヒト11cbスプライス変 異体として同定されたポリペプチドを提供することである。

【００１５】 本発明のさらなる課題は、さらに、前記11cbスプライス変異体をコードするポ
リヌクレオチド、特に本明細書中で11cbスプライス変異体と名付けたポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを提供することである。

【００１６】 本発明のこの態様の特に好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドは図１
に記載した配列(配列番号１)中に前記11cbスプライス変異体をコードする領域を
含む。

【００１７】 本発明のこの態様によれば、この11cbスプライス変異体をコードする単離され
た核酸分子(mRNA、cDNA、ゲノムDNAを含む)が提供され、また本発明のこの態様 の別の実施形態では、生物学上、診断上、臨床上または治療上有用な変異体、そ
の類似体もしくは誘導体、またはその断片(前記変異体、類似体および誘導体の 断片を含む)が提供される。

【００１８】 本発明のこの態様の特に好ましい実施形態においては、ヒト11cbスプライス変
異体の天然に存在するアレル変異体が挙げられる。

【００１９】 本発明のもう１つの課題は、11cbスプライス変異体ポリペプチド、特に治療目
的で、例えば感染症（例えば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染
症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼痛、癌、糖尿病
、肥満、飲食時の異常(例えば、拒食症、過食症)、喘息、パーキンソン病、急性
およびうっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗
塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神および神経障害（不安、精神分裂
、躁うつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常、例えばハンチントン
舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群等を含む）を治療するために使用し
うる11cbスプライス変異体ポリペプチドを提供することである。

【００２０】 本発明のこの態様によれば、本明細書中で11cbスプライス変異体と呼ぶ新たな
ポリペプチド、ならびに生物学上、診断上、臨床上または治療上有用なその断片
、その変異体および誘導体、前記断片の変異体および誘導体、前記の全ての類似
体が提供される。

【００２１】 本発明のこの態様の特に好ましい実施形態においては、11cbスプライス変異体
遺伝子の天然に存在するアレルによりコードされる、該11cbスプライス変異体の
変異体が挙げられる。

【００２２】 本発明の別の態様によれば、本発明の受容体ポリペプチドに結合して活性化す
る化合物(アゴニスト)またはその活性化を阻害する化合物(アンタゴニスト)およ
び受容体リガンドについてスクリーニングする方法が提供される。

【００２３】 特に、本発明の受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する好ましい
方法は、 受容体への化合物の結合に応答して検出可能なシグナルを提供しうる第２成分
と結合している前記受容体をその表面に発現している細胞とスクリーニングしよ
うとする前記化合物とを、前記受容体への結合が生じうる条件下で接触させ、そ
して 前記化合物と前記受容体との相互作用により生じたシグナルのレベルを測定す
ることにより前記化合物が前記受容体に結合してこの受容体を活性化または阻害
したかを決定する、 ことを含んでなる。

【００２４】 さらに好ましい実施形態において、前記方法はさらに、標識または非標識MCH の存在下でアゴニストまたはアンタゴニストを同定することを含む。

【００２５】 本発明の受容体のアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法の他の実施形態
は、 前記受容体を表面上に有する細胞または前記受容体を含有する細胞膜へのリガ
ンドの結合の阻害を、候補化合物の存在下で該受容体への結合が生じうる条件下
で該受容体に結合したリガンドの量を測定し、それによりリガンドの結合を減少
させうる化合物をアゴニストまたはアンタゴニストであると決定する、 ことを含んでなる。好ましくはこのリガンドはMCHであり、さらにより好ましく はMCHは標識されている。

【００２６】 本発明の別の課題は、前記ポリペプチド、ポリペプチド断片、変異体および誘
導体、前記変異体および誘導体の断片、ならびに前記全ての類似体を提供するこ
とである。本発明のこの態様の好ましい実施形態では前記11cbスプライス変異体
ポリペプチドを生産する方法が提供され、該方法は外因的に誘導した11cbスプラ
イス変異体をコードするポリヌクレオチドを発現の為に取り込ませた宿主細胞を
該宿主中で11cbスプライスを発現させるための条件下で培養し、次いで発現され
たポリペプチドを回収することを含む。

【００２７】 本発明の別の課題によれば、特に調査、生物学上、臨床上および治療上の目的
のために前記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する、産物、組成物、
工程および方法が提供される。

【００２８】 本発明のこの態様の特定の好ましい実施形態においては、産物、組成物および
方法が提供され、中でも特に、11cbスプライス変異体ポリペプチドまたは11cbス
プライス変異体コードmRNAを測定することにより11cbスプライス変異体の細胞に
おける発現を評価するもの；感染症（例えば、細菌、真菌、原生動物およびウイ
ルスによる感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼
痛、癌、糖尿病、肥満、飲食時の異常(例えば、拒食症、過食症)、喘息、パーキ
ンソン病、急性およびうっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、
狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神および神経障害（
不安、精神分裂、躁うつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常、例え
ばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群を含む）を治療する
ためのもの；特に本明細書に開示したようにin vitro、ex vivoまたはin vivoで
細胞を11cbスプライス変異体ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに曝すことに
よるもの；11cbスプライス変異体遺伝子における欠損のような、遺伝的変異およ
び異常を分析することによるもの；ならびに生物に11cbスプライス変異体ポリペ
プチドまたはポリヌクレオチドを投与して11cbスプライス変異体の機能を増大さ
せるかまたは11cbスプライス変異体の機能障害を治療する(remediate)ことによ るもの、が提供される。

【００２９】 本発明のさらに別の実施形態によれば、11cbスプライス変異体の過小発現に関
連する症状の治療のための、そのような活性化化合物を使用して本発明の受容体
ポリペプチドを刺激する手法が提供される。

【００３０】 本発明の別の態様によれば、11cbスプライス変異体の過剰発現に関連する症状
を治療するための、そのような阻害化合物を使用する手法が提供される。

【００３１】 本発明のさらに別の態様によれば、天然には存在しない合成の、単離されたお
よび／または組換え11cbスプライス変異体ポリペプチドが提供される。該ポリペ
プチドは、受容体が11cbスプライス変異体リガンドに結合できるような本発明の
11cbスプライス変異体の少なくとも１つのドメインの断片、共通断片および／ま
たは保存的アミノ酸置換を有する配列であり、または該ポリペプチドは11cbスプ
ライス変異体リガンド結合を量的もしくは質的にモジュレートすることもできる
。

【００３２】 本発明のさらに別の態様によれば、合成または組換え11cbスプライス変異体ポ
リペプチド、その保存的置換体および誘導体、それに対する抗体、抗イディオタ
イプ抗体、それらの期待される生物学的特性のためリガンドへ結合することによ
りまたはリガンド結合をモジュレートすることにより11cbスプライス変異体機能
の潜在的モジュレーターとして有用でありうる組成物および方法が提供され、こ
れらは診断、治療および／または調査への用途に用いることができる。

【００３３】 本発明のさらに別の課題は、受容体のタイプおよびサブタイプとして種々の11
cbスプライス変異体またはその断片を阻害または真似るよう設計された合成、単
離されたまたは組換えポリペプチドを提供することである。

【００３４】 本発明のこの態様および他の態様の特定の好ましい実施形態によれば、ヒト11
cbスプライス変異体配列にハイブリダイズするプローブが提供される。

【００３５】 本発明のこの態様の特定のさらに好ましい実施形態においては、11cbスプライ
ス変異体ポリペプチドに対する抗体が提供される。この点で特に好ましい特定の
実施形態では、前記抗体はヒト11cbスプライス変異体に対して高い選択性を有す
る。

【００３６】 本発明の別の態様によれば、11cbスプライス変異体アゴニストが提供される。
好ましいアゴニストには、11cbスプライス変異体を真似る分子、11cbスプライス
変異体-結合分子または受容体分子に結合する分子、および11cbスプライス変異 体誘導性応答を引き出すまたは増大させる分子が含まれる。また、好ましいアゴ
ニストには、11cbスプライス変異体もしくは11cbスプライス変異体ポリペプチド
、または他の11cbスプライス変異体活性のモジュレーターと相互作用し、それに
より11cbスプライス変異体の１以上の作用を増強または増大させる分子が含まれ
る。

【００３７】 本発明のさらに別の態様によれば、11cbスプライス変異体のアンタゴニストが
提供される。好ましいアンタゴニストには、11cbスプライス変異体を真似て11cb
スプライス変異体受容体または結合分子に結合するが１以上の11cbスプライス変
異体誘導性応答を引き出さないものが含まれる。また、好ましいアンタゴニスト
には、11cbスプライス変異体と結合または相互作用して11cbスプライス変異体の
１以上の作用を抑制する分子、または11cbスプライス変異体の発現を阻止する分
子が含まれる。

【００３８】 本発明のさらなる態様において、細胞にin vitro、ex vivo、in vivoで投与す
るための、もしくは多細胞生物に投与するための、11cbスプライス変異体ポリヌ
クレオチドまたは11cbスプライス変異体ポリペプチドを含む組成物が提供される
。本発明のこの態様の特に好ましい特定の実施形態によれば、前記組成物は、疾
病の治療のために宿主生物中で11cbスプライス変異体ポリペプチドを発現させる
ための11cbスプライス変異体ポリヌクレオチドを含む。この点で特に好ましいの
は、11cbスプライス変異体の異常な内因性活性に関連する機能障害を治療するた
めのヒト患者における発現である。

【００３９】 本発明の他の課題、特徴、利点および態様は、以下の記載から当業者には明ら
かとなろう。しかしながら、以下の記載および具体的な実施例は、本発明の好ま
しい実施形態を示すものであって、単に例示目的で提供されていることが理解さ
れるであろう。開示された発明の精神および範囲内での様々な変更および修飾は
、以下の記載を読むことにより、また本開示の他の部分を読むことにより当業者
には容易に明らかとなろう。

【００４０】図面の簡単な説明 添付の図面は本発明の特定の実施形態を説明するものである。それらの図面は
単なる例示にすぎず、本明細書中で明示しない限り本発明を限定するものではな
い。(図面の簡単な説明については下記参照) 用語 下記の例示的説明は、本明細書中で頻繁に使用される特定の用語を理解しやす
くするためのものである。以下の説明は便宜的に提供されるものであり、本発明
を限定することを意図しない。

【００４１】 「遺伝的エレメント(genetic element)」とは一般に、複製、転写もしくは翻 訳または宿主細胞におけるポリペプチドの発現に重要な他のプロセスを調節する
ポリペプチドまたは領域をコードする領域を含むポリヌクレオチド、またはポリ
ペプチドをコードする領域とそれに機能可能に連結された発現を調節する領域と
の両方を含むポリヌクレオチドを意味する。

【００４２】 遺伝的エレメントは、エピソームエレメントとして、すなわち宿主細胞ゲノム
から物理的に独立した分子として複製するベクター内に含まれていてもよい。そ
れらのエレメントは真核細胞においてメトトレキサート選択によりトランスフェ
クトされたＤＮＡの増幅中に生じるようなミニクロモソーム中に含まれていても
よい。遺伝的エレメントは宿主細胞ゲノム中に含まれていてもよく、この場合、
該エレメントは天然の状態ではなくむしろ特に精製ＤＮＡまたはベクターの形態
で単離、クローニングおよび宿主細胞への導入等の操作が行われている。

【００４３】 「単離された」とは、天然の状態から「人間の手によって」改変されたことを
意味する。すなわち、それが天然に存在するのであれば、それはそのもとの環境
から変化しているかもしくは移動しているか、またはその両方である。例えば、
生存している動物の体内に天然状態で存在する天然のポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離
されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられるように
、「単離された」ものである。

【００４４】 「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ
、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。本明細書中で使用する「
ポリヌクレオチド」には、特に、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本
鎖領域とが混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本
鎖領域とが混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとを含むハイブリッド分子（一
本鎖でも、より典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領域とが混じり
合ったものでもよい）が含まれる。加えて、本明細書中で使用する「ポリヌクレ
オチド」はＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領
域をも指す。そのような領域中の鎖は同一分子または異なる分子に由来するもの
でありうる。この領域は１以上の分子を全て含みうるが、より典型的には幾つか
の分子の１領域のみを包含しうる。「ポリヌクレオチド」という用語はまた、１
個以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。従って、安定性または
他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡもまた本明細書中
で意図するポリヌクレオチドである。さらに、ほんの２つの具体例を挙げると、
特殊な塩基(例えばイノシン)または修飾塩基(例えば、トリチル化された塩基)を
含むＤＮＡまたはＲＮＡはポリヌクレオチドである。ＤＮＡまたはＲＮＡに対し
て、当業者に公知の多くの有用な目的を提示する非常に多様な種の修飾がなされ
てきたことは理解されよう。用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で用いる
場合、ポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、並び
にウイルスや細胞(特に単純細胞や複合細胞等)に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの
化学的形態を包含する。また、用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で用い
る場合、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドも
包含する。

【００４５】 本明細書中で使用する「ポリペプチド」とは、以下に記載する全てのポリペプ
チドを含む。ポリペプチドの基本構造は周知であり、当技術分野で記載されてい
る。本明細書中では、ペプチド結合により互いに連結された２個以上のアミノ酸
を含む任意のペプチドまたはタンパク質を意味するためにこの用語を使用する。
本明細書中で使用する場合、この用語は短鎖（通常は、当技術分野では例えばペ
プチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーという）と長鎖（当技術分野では一般
的にはタンパク質という）の両方をさし、これには多くのタイプがある。ポリペ
プチドは、一般に２０種の天然アミノ酸をさす２０種類のアミノ酸以外のアミノ
酸をしばしば含み、しかも末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸が所与のポリペプ
チドにおいて、プロセシングおよび他の翻訳後修飾のような天然のプロセスで、
または当技術分野で周知の化学的修飾法のいずれかで修飾されていてもよい。ポ
リペプチド中に天然に生じる一般的な修飾でさえ本明細書中に余すところ無く記
載するには多すぎるが、このような修飾は基本的な教科書、より詳細な学術論文
および多数の研究文献に詳述されており、当業者には周知である。本発明のポリ
ペプチド中に存在しうる公知の修飾には、いくつかの例を挙げると、アセチル化
、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の
共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質
誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジス
ルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログル
タメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアン
カー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タン
パク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ア
ルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン
化などがある。そのような修飾は当業者に周知であり、例えば、PROTEINS - STR
UCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 第２版, T.E. Creighton, W.H. Freeman an
d Company, New York, 1993などの多くの基本的な教科書に記載されている。こ の主題に関して、例えばPOSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEIN
S, B.C. Johnson編, Academic Press, New York, 1983中のWold, F., Posttrans
lational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12; S
eifterら, “Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors"
, Meth Enzymol (1990) 182:626-646; および Rattanら, “Protein Synthesis:
Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663:
48-62により提供されるような多くの詳細な評論雑誌が利用可能である。

【００４６】 ポリペプチドは常に完全に直鎖状というわけではない。例えば、ポリペプチド
は、一般に翻訳後の事象(天然のプロセシング事象および天然には生じずヒトの 操作により生じる事象を含む)の結果として、ユビキチン化のために分枝してい ても、分枝のある又はない環状であってもよい。環状の、分枝した、または分枝
した環状のポリペプチドは非翻訳系天然プロセスにより合成してもよく、また、
完全に合成による方法によって製造してもよい。

【００４７】 修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含
めてポリペプチドのどこでも行うことができる。実際、共有結合での修飾による
ポリペプチドのアミノ基もしくはカルボキシル基またはその両方の保護は天然お
よび合成ポリペプチドでは一般的であり、そのような修飾は同様に本発明のポリ
ペプチド中にも存在する。例えば、大腸菌(E.coli)内で産生されたポリペプチド
のアミノ末端残基は、プロセシング前は、ほぼ必ずN-ホルミルメチオニンである
。

【００４８】 ポリペプチド中に生じる修飾は、しばしば該ポリペプチドがどのように産生さ
れたかということの関数でありうる。例えば、宿主中でクローン化遺伝子を発現
させることにより産生されるポリペプチドの場合、修飾の性質および程度は、大
部分は宿主細胞の翻訳後修飾能力および該ポリペプチドのアミノ酸配列中に存在
する修飾シグナルによって決定される。例えば、周知のように、グリコシル化は
大腸菌(E.coli)等の細菌宿主では起こらないことが多い。従って、グリコシル化
が望ましい場合は、グリコシル化を行う宿主、一般には真核細胞中でポリペプチ
ドを発現させる。昆虫細胞ではしばしば哺乳動物細胞と同様の翻訳後グリコシル
化が生じ、このため昆虫細胞の発現系は特に天然のグリコシル化パターンを有す
る哺乳動物のタンパク質を効率的に発現させるために開発されてきた。同様の考
察が他の修飾についても当てはまる。

【００４９】 同じタイプの修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたは様
々に異なる程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの
修飾を含んでいてもよい。

【００５０】 ポリペプチドという用語は全てのそのような修飾、特に宿主細胞中でポリヌク
レオチドを発現させることにより合成されたポリペプチド中に存在する修飾を包
含する。

【００５１】 本明細書中で用いる「変異体」とは、それぞれ基準のポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドと異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことである。この
意味での変異体は、本明細書中の以下および他の箇所においてより詳細に記載さ
れている。（１）別の基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の点で相違する
ポリヌクレオチド。この変異体のヌクレオチド配列の変化はサイレントであって
よく、すなわち、それらの変化は基準ポリヌクレオチドによってコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列を変更しなくてもよい。変更がこのタイプのサイレン
ト変化に限定される場合、変異体は基準ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードする。変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌ
クレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更してもよい。
かかるヌクレオチド変化は、以下で述べるように、基準配列によりコードされる
ポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および末端切断（トラ
ンケーション）を生じさせることができる。（２）別の基準ポリペプチドとアミ
ノ酸配列の点で相違するポリペプチド。一般的には、基準ポリペプチドの配列と
変異体の配列が全般的によく類似しており、多くの領域で同一となるような差異
に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意に組み合わせうる１以上の置換、
付加、欠失、融合および末端切断によりアミノ酸配列が相違していてよい。（３
）変異体は、末端欠失または内部欠失等により基準配列より短くなっている点で
基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と異なる、本発明のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの断片であってもよい。本発明のポリペプチドの変異
体には、本質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチド、例
えば、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを
産生しうる該プロタンパク質等のポリペプチドも含まれる。（４）変異体はまた
以下のものでありうる：（ｉ）１個以上のアミノ酸残基が保存されたまたは保存
されていないアミノ酸残基(好ましくは保存されたアミノ酸残基)で置換されてい
る変異体であって、かかる置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによりコード
されるものであってもそうでなくてもよいもの、または、（ii）１個以上のアミ
ノ酸残基が１個の置換基を含むもの、または（iii）成熟ポリペプチドが別の化 合物、例えば、該ポリペプチドの半減期を増大させる化合物(例えばポリエチレ ングリコール)に融合されているもの、または（iv）成熟ポリペプチドに、リー ダー配列もしくは分泌配列または該成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配
列の精製に使用される配列等のさらなるアミノ酸が融合されているもの。（５）
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は天然に存在する変異体、例えば
天然に存在するアレル変異体であってよく、または天然に存在することが知られ
ていない変異体であってよい。そのようなポリペプチドの天然に存在しない変異
体を、ポリヌクレオチド、細胞もしくは生物に適用されるような突然変異誘発法
により、または組換え手段により作製することができる。これに関するポリヌク
レオチド変異体としては、ヌクレオチドの置換、欠失または付加により上記ポリ
ヌクレオチドと異なる変異体が挙げられる。前記置換、欠失または付加は、１以
上のヌクレオチドを含むものであってよい。変異体をコード領域もしくは非コー
ド領域、またはその両方において改変してもよい。コード領域の改変により、保
存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を生じさせることができる
。上記で定義した全てのそのような変異体は、本明細書中の教示および当技術分
野から当業者の視野範囲内であると考えられる。

【００５２】 「結合分子」(または他に「相互作用分子」もしくは「受容体成分因子」と称され る)とは、本発明の受容体ポリペプチドと特異的に結合するかまたは相互作用す る分子(リガンドを含む)を意味する。かかる結合分子は本発明の一部である。結
合分子は、天然には存在しないもの、例えば本発明のポリペプチドに特異的に結
合する抗体および抗体から誘導した試薬であってもよい。

【００５３】 当技術分野で知られた「同一性」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオ
チド配列の比較により決定された、２以上のかかる配列間の関連性のことである
。当技術分野ではまた、「同一性」はポリペプチド配列またはポリヌクレオチド
配列の鎖間のマッチ(match)により決定された、このような配列間の配列関連性 の程度を意味する。２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドの
アミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換基を２つ目のポリペプチドの配
列と比較することにより決定する。「同一性」および「類似性」は公知の方法に
より難なく算出することができ、こうした方法として、例えば Computational M
olecular Biology, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988;
Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 編, Academic
Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Grif
fin, A.M. and Griffin, H.G. 編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence
Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Se
quence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. 編, M Stockton Pre
ss, New York, 1991; および Carillo, H. and Lipman, D., SIAM J. Applied M
ath., 48: 1073 (1988) に記載された方法があるが、これらに限らない。同一性
を決定するための好ましい方法は、検討する配列間で最大級のマッチが得られる
ように設計される。同一性および類似性を決定する方法は一般に入手可能なコン
ピュータプログラムに編集されている。２配列間の同一性および類似性を決定す
る好適なコンピュータプログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ (De
vereux, J.ら, Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984))、ＢＬＡＳＴＰ、Ｂ
ＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ (Atschul, S.F.ら, J. Molec. Biol. 215:403-410
(1990)) があるが、これらに限らない。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩお
よび他のソースから一般に入手可能である (BLAST Manual, Altschul, S.ら, NC
BI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.ら, J. Mol. Biol. 215: 403-41
0 (1990))。周知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性の決定に使用すること ができる。

【００５４】 ポリペプチド配列を比較するための好適なパラメーターは次のものを含む： １）アルゴリズム：Needleman および Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (19
70)； 比較マトリックス：BLOSSUM62 、Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl
. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919 (1992) ギャップペナルティー：12 ギャップ長ペナルティー：４ これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Genetics Computer Group
(Madison WI)から「ｇａｐ」プログラムとして一般に入手可能である。前記のパ
ラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーター(default parameter
) である（末端ギャップのペナルティーは無し）。

【００５５】 ポリヌクレオチド配列を比較するための好適なパラメーターは次のものを含む
： １）アルゴリズム：Needleman および Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (19
70)； 比較マトリックス：マッチ＝＋10、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：50 ギャップ長ペナルティー：３ これらのパラメーターと共に役に立つプログラムは Genetics Computer Group
(Madison WI)から「ｇａｐ」プログラムとして入手可能である。これらのパラメ
ーターは核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。

【００５６】 好適なポリヌクレオチドの実施形態はさらに、配列番号１の基準配列と少なく
とも50、60、70、80、85、90、95、97または100％の同一性を有するポリヌクレ オチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチド配列
は配列番号１の基準配列と同一であっても、該基準配列に対して、ある整数個ま
でのヌクレオチド変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくとも１個のヌクレ
オチドの欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョンを含む）または
挿入よりなる群から選択され、こうした変異は基準ヌクレオチド配列の5'もしく
は3'末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列
中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループ
として介在することができる。ヌクレオチド変異の数は、配列番号１のヌクレオ
チドの総数に、それぞれの（100で割った）同一性％値を定義する整数を掛け、 その積を配列番号１のヌクレオチドの総数から差し引くことにより、すなわち、
次式：ｎ_ｎ≦ｘ_ｎ−（ｘ_ｎ・ｙ）により求めることができる。式中、ｎ_ｎはヌク
レオチド変異の数であり、ｘ_ｎは配列番号１のヌクレオチドの総数であり、ｙは
50％については0.50、60％については0.60、70％については0.70、80％について
は0.80、85％については0.85、90％については0.90、95％については0.95、また
は100％については1.00であり、・は乗法演算子を表す記号であり、ｘ_ｎとｙの 非整数の積は、その積をｘ_ｎから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。配
列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の改変は、そのコー
ド配列にナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を生じさせ、そ
れにより、こうした変異後に該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチ
ドを改変させることができる。

【００５７】 具体例としては、本発明のポリヌクレオチド配列は配列番号２の基準配列と同
一、すなわち100％の同一性であっても、該基準配列に対して、その同一性％が1
00％未満であるようなある整数個までのアミノ酸変異を含んでいてもよい。前記
変異は少なくとも１個の核酸の欠失、置換（トランジションおよびトランスバー
ジョン含む）または挿入よりなる群から選択され、こうした変異は基準ポリヌク
レオチド配列の5’もしくは3’末端位置、またはこれらの末端位置の間のいずれ
に存在してもよく、基準配列中の核酸の間に個々に、または基準配列内に１以上
の連続するグループとして介在することができる。所定の同一性％についての核
酸変異の数は、配列番号２のアミノ酸の総数に、それぞれの（100で割った）同 一性％値を規定する整数を掛け、その積を配列番号２のアミノ酸の総数から差し
引くことにより、すなわち、次式：ｎ_ｎ≦ｘ_ｎ−（ｘ_ｎ・ｙ）により求めること
ができる。式中、ｎ_ｎはアミノ酸変異の数であり、ｘ_ｎは配列番号２中のアミノ
酸の総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％については0.80、85％に
ついては0.85などであり、・は乗法演算子を表す記号であり、ｘ_ｎとｙの非整数
の積は、その積をｘ_ｎから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。

【００５８】 好適なポリペプチドの実施形態はさらに、配列番号２の基準配列と少なくとも
50、60、70、80、85、90、95、97または100％の同一性を有するポリヌクレオチ ド配列を含む単離されたポリペプチドを含み、該ポリペプチド配列は配列番号２
の基準配列と同一であっても、該基準配列に対して、ある整数個までのアミノ酸
変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（
保存的および非保存的置換を含む）または挿入よりなる群から選択され、こうし
た変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはこ
れらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中のアミノ酸の間に個々
に、または基準配列内に１以上の連続するグループとして介在することができる
。アミノ酸変異の数は、配列番号２のアミノ酸の総数に、それぞれの（100で割 った）同一性％値を規定する整数を掛け、その積を配列番号２のアミノ酸の総数
から差し引くことにより、すなわち、次式：ｎ_a≦ｘ_a −（ｘ_a・ｙ）により求 めることができる。式中、ｎ_aはアミノ酸変異の数であり、ｘ_ｎは配列番号２の アミノ酸の総数であり、ｙは50％については0.50、60％については0.60、70％に
ついては0.70、80％については0.80、85％については0.85、90％については0.90
、95％については0.95、または100％については1.00であり、・は乗法演算子を 表す記号であり、ｘ_aとｙの非整数の積は、その積をｘ_aから引く前に、最も近似
する整数に切り下げる。

【００５９】 例えば、本発明のポリペプチド配列は配列番号２の基準配列と同一、すなわち
100％の同一性であっても、該基準配列に対して、同一性％が100％未満であるよ
うなある整数個までのアミノ酸変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくとも
１個のアミノ酸の欠失、置換（保存的および非保存的置換を含む）または挿入よ
りなる群から選択され、こうした変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくは
カルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のいずれに存在してもよく、
基準配列中のアミノ酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグル
ープとして介在することができる。所定の同一性％についてのアミノ酸変異の数
は、配列番号２のアミノ酸の総数に、それぞれの（100で割った）同一性％値を 規定する整数を掛け、その積を配列番号２のアミノ酸の総数から差し引くことに
より、すなわち、次式：ｎ_a≦ｘ_a −（ｘ_a・ｙ）により求めることができる。 式中、ｎ_aはアミノ酸変異の数であり、ｘ_aは配列番号２中のアミノ酸の総数であ
り、ｙは例えば70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85
などであり、・は乗法演算子を表す記号であり、ｘ_aとｙの非整数の積は、その 積をｘ_aから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。

【００６０】 本明細書中で使用する「相同性」という用語は、同一性および類似性の両方を
包含する。

【００６１】発明の説明 本発明は、特に、マウスcDNAによりコードされる11cbスプライス変異体に対す
るアミノ酸配列の相同性により関連付けられた新たな11cbスプライス変異体のポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は特に図１に記載したヌク
レオチド配列およびアミノ酸配列(配列番号１および２)を有する11cbスプライス
変異体に関する。

【００６２】ポリヌクレオチド 本発明の１つの態様によれば、図１の推定アミノ酸配列(配列番号２)を有する
11cbスプライス変異体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが
提供される。

【００６３】 本発明の11cbスプライス変異体は、cDNAの配列決定結果により示されるように
、７回膜貫通受容体ファミリーの他のタンパク質と構造的に関連している。cDNA
配列は353個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするオープンリーディング フレームを含有する。図１の11cbスプライス変異体のヌクレオチド配列(配列番 号１)はWO96/18651(1996年6月20日公開)に記載の元のヒト11cbクローンとその全
長にわたり約90％の同一性を有する。

【００６４】 本発明のポリヌクレオチドは、クローニングにより得られたもしくは化学合成
法により製造された、またはその組み合わせにより得られた、RNA形態(例えばmR
NA)であってもDNA形態(例えばcDNAおよびゲノムDNA)であってもよい。DNAは二本
鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖DNAはセンス鎖として知られるコー ド鎖であってもよく、またはアンチセンス鎖と称される非コード鎖であってもよ
い。

【００６５】 ポリペプチドをコードするコード配列は、図１に示すポリヌクレオチド(配列 番号１)のコード配列とその全長にわたり同一であってもよく、遺伝子コードの 重複性（縮重）のため、やはり図１のポリペプチド(配列番号２)をコードする異
なる配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。

【００６６】 図１のポリペプチド(配列番号２)をコードする本発明のポリヌクレオチドには
、限定するものではないが、成熟ポリペプチドのコード配列または単独、成熟ポ
リペプチドのコード配列およびリーダー配列もしくは分泌配列のコード配列等の
別のコード配列（例えば、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列を
コードするもの）、ならびに成熟ポリペプチドのコード配列であって、前記別の
コード配列を有しているかまたは有しておらず、さらなる非コード配列(イント ロンならびに5'および3'非コード配列[例えば、転写の際に何らかの役割を果た す、転写されるが翻訳されない配列]、mRNAプロセシングシグナル[例えば、リボ
ソーム結合およびｍＲＮＡ安定化のためのスプライシングおよびポリアデニル化
シグナル]を含むがこれらに限定されない配列)を共に有するものが含まれる。さ
らなる機能を付与するコード配列を前記ポリペプチドに組み込んでもよい。従っ
て、例えば、前記ポリペプチドを、ペプチド等の融合ポリペプチドの精製を容易
にするマーカー配列に融合してもよい。本発明のこの態様の好ましい実施形態で
は、前記マーカー配列は、ｐＱＥベクター(Qiagen, Inc.)により提供されるタグ
等のヘキサ−ヒスチジンペプチドである。Gentzら, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A (1989) 86:821-824に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク 質の簡便な精製を提供する。他の実施形態においては、マーカー配列はＨＡタグ
である。そのような他の多くのタグが市販されている。

【００６７】 前述の用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチド
をコードする１つの連続した領域または不連続の領域(例えばイントロンにより 中断されている領域)を、やはりコードおよび／または非コード配列を含有しう る別の領域と共に含むポリヌクレオチドも包含する。

【００６８】 本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列(配列番号２)を有するポリペプチド
の変異体をコードするポリヌクレオチドの変異体に関する。

【００６９】 本発明の特に好ましい実施形態としては、図１に記載の11cbスプライス変異体
のアミノ酸配列(配列番号２)およびその変異体のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。

【００７０】 さらに好ましい実施形態は、図１の11cbスプライス変異体ポリペプチドのアミ
ノ酸配列(配列番号２)であって、数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、２個
、１個または０個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されて
いるものを有する11cbスプライス変異体の変異体をコードするポリヌクレオチド
である。

【００７１】 本発明のさらに好ましい実施形態は、図１に記載のアミノ酸配列(配列番号２)
を有する11cbスプライス変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとそ
の全長にわたり少なくとも91％の同一性を有するポリヌクレオチド、ならびにか
かるポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。これに関して、図１
に記載のアミノ酸配列(配列番号２)を有する11cbスプライス変異体ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドとその全長にわたり少なくとも95％の同一性を有
するポリヌクレオチドが特に好ましく、少なくとも97〜99％の同一性を有するポ
リヌクレオチドが最も好ましい。

【００７２】 特に好ましい実施形態は、図１のcDNA(配列番号１)によりコードされる成熟ポ
リペプチドと実質的に同様の生物学的機能または活性を保持しているポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドである。

【００７３】 本発明はさらに、前記の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する
。これに関して、本発明は特にストリンジェントな条件下で前記のポリヌクレオ
チドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いる「ス
トリンジェントな条件」とは、配列間に少なくとも95％、好ましくは少なくとも
97％の同一性があるときだけハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。

【００７４】 前記の本発明のポリヌクレオチドは、11cbスプライス変異体をコードする全長
ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、また、11cbスプライス変異体
遺伝子との配列類似性が高い他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離
するために、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブと
して用いることができる。このようなハイブリダイゼーション技法は当業者には
公知である。プローブはたいてい１５個以上のヌクレオチドを含み、好ましくは
３０個以上のヌクレオチドを含み、また５０個以上のヌクレオチドを有していて
もよい。特に好ましいプローブは３０〜５０個の範囲のヌクレオチドを有するも
のである。

【００７５】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ポリヌクレオチドアッセイ
について本明細書中でさらに論じているように、ヒトの疾病に対する治療薬およ
び診断薬を探索するための研究用の試薬および材料として利用することができる
。

【００７６】 本発明のポリヌクレオチドは、成熟たんぱく質、成熟タンパク質およびリーダ
ー配列(プレタンパク質とも称される)、プレタンパク質のリーダー配列ではない
１以上のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、またはプロタンパク質の前
駆体であってリーダー配列および１以上のプロ配列(通常、プロセシング工程の 間に除去されて活性な成熟形態のポリペプチドを生じる)を有するプレプロタン パク質、をコードしうる。

【００７７】ポリペプチド 本発明はさらに図１の推定アミノ酸配列(配列番号２)を有するヒト11cbスプラ
イス変異体ポリペプチドに関する。

【００７８】 本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポ
リペプチドでありうる。特定の好ましい実施形態においては、本発明のポリペプ
チドは組換えポリペプチドである。

【００７９】 特に好ましい実施形態としては、図１に記載の11cbスプライス変異体のアミノ
酸配列(配列番号２)およびその変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙
げられる。本発明の他の好ましい実施形態は、11cbスプライス変異体のアミノ酸
配列およびその変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

【００８０】 好ましい変異体としては、保存的アミノ酸置換により基準と異なる変異体が挙
げられる。そのような置換では、ポリペプチド中の所定のアミノ酸が同様の性質
を有する別のアミノ酸で置換されている。保存的置換として典型的にみられるの
は、脂肪族アミノ酸Ala, Val, Leu および Ile間での１対１の置き換え、ヒドロ
キシル残基Ser とThr の間の交換、酸性残基 AspとGlu の間の交換、アミド残基
Asn とGln の間の置換、塩基性残基 LysとArg の間の交換、ならびに芳香族残基
PheとTyr の間での置き換え、である。

【００８１】 図１の11cbスプライス変異体ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号２)であっ
て、数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、２個、１個または０個のアミノ酸
残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されているものを有する断片の変異
体がさらに好ましい。

【００８２】 これらのうち特に好ましいのはサイレントな置換、付加および欠失であり、そ
れらは11cbスプライス変異体の特性および活性を変更しない。この点でまた特に
好ましいのは保存的置換である。

【００８３】 最も好ましいのは図１のアミノ酸配列(配列番号２)を有し置換の無いポリペプ
チドである。

【００８４】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形態で提供され
ることが好ましく、また均一に精製されていることが好ましい。

【００８５】 本発明のポリペプチドは配列番号２のポリペプチド(特に成熟ポリペプチド)お
よび配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも91％の同一性を有するポリペ
プチドを含む。

【００８６】断片 また、本発明のこの態様の好ましい実施形態としては、11cbスプライス変異体
の断片、最も特定的には図１記載のアミノ酸配列(配列番号２)を有する11cbスプ
ライス変異体の断片、および図１の前記11cbスプライス変異体(配列番号２)の変
異体、である変異体を含むポリペプチドが挙げられる。

【００８７】 この点に関して、断片は、前記11cbスプライス変異体ポリペプチドのアミノ酸
配列およびその変異体と全部ではなく一部が完全に同じであるアミノ酸配列を有
するポリペプチドである。

【００８８】 こうした断片は「フリースタンディング」、すなわち他のアミノ酸もしくはポ
リペプチドの一部ではないかもしくはそれらに融合されていないものであってよ
く、またはより大きいポリペプチド内に含まれていてもよく、つまりその大きい
ポリペプチドの一部または一領域を該断片が構成していてもよい。より大きなポ
リペプチド内に含まれている場合、本明細書中で論じている断片は最も好ましく
は１つの連続領域を構成する。しかしながら、いくつかの断片が１つのより大き
なポリペプチド内に含まれていてもよい。例えば、特定の好ましい実施形態は、
本発明の11cbスプライス変異体ポリペプチドの断片に関し、ここで該断片は、宿
主内での発現のために設計され、11cbスプライス変異体断片のアミノ末端に融合
した異種プレおよびプロポリペプチド領域ならびに該断片のカルボキシ末端に融
合した別の領域を有する前駆体ポリペプチド内に含まれている。従って、本明細
書中で意図する意味での１態様の断片は、11cbスプライス変異体から誘導した融
合ポリペプチドまたは融合タンパク質の１または複数の部分を意味する。

【００８９】 この文脈において、本明細書中でいう「約」とは、特に上記した範囲の一端また
は両端で数個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸が増えたり減った
りした範囲を含めるものとする。

【００９０】 本発明の好ましい断片としては、例えば、11cbスプライス変異体の末端切断(t
runcation)ポリペプチドが含まれる。末端切断ポリペプチドは、アミノ末端を含
む一連の残基(すなわち連続領域、部分もしくは一部)の欠失、またはカルボキシ
ル末端を含む一連の残基の欠失、または、二重のトランケーション突然変異体の
ようなアミノ末端を含むものとカルボキシル末端を含むものとの二連の残基の欠
失以外は図１のアミノ酸配列(配列番号２)を有する11cbスプライス変異体ポリペ
プチドまたはその変異体を含む。「約」と記載したサイズ範囲を有する断片もま
た、通常の断片の中でも特に好ましいトランケーション断片の好ましい実施形態
である。

【００９１】 本発明のこの態様においてやはり好ましいのは、11cbスプライス変異体の構造
的または機能的特性により特徴付けられた断片である。この点での本発明の好ま
しい実施形態は、11cbスプライス変異体のαヘリックスとαヘリックス形成領域
、βシートとβシート形成領域、ターンとターン形成領域、コイルとコイル形成
領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可変性領域
、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を含む断片、ならびその
ような断片の組み合わせを含む。

【００９２】 好ましい領域は11cbスプライス変異体の活性を媒介する領域である。この点で
最も好ましいのは、11cbスプライス変異体の化学的活性、生物学的活性または他
の活性を有する断片であって、それらには同様の活性をもつ断片、その活性が向
上した断片、または望ましくない活性が低下した断片が含まれる。さらに好まし
いポリペプチド断片は、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性がある断
片である。

【００９３】 本発明はまた、特に、前記断片をコードするポリヌクレオチド、前記断片をコ
ードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、特にストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズする前記ポリヌクレオチド、およびPCRプ ライマー等の前記断片をコードするポリヌクレオチドを増幅するためのポリヌク
レオチドにも関することが理解されよう。これに関して、好ましいポリヌクレオ
チドは上記の好ましい断片に対応するポリヌクレオチドである。

【００９４】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを１以上含有するベクター、本発明
のベクターにより遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による本発明のポ
リペプチドの生産に関する。

【００９５】 宿主細胞を遺伝子操作して本発明のポリヌクレオチドを組み入れ、本発明のポ
リペプチドを発現させることができる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は
、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラン
スフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクショ
ン、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質
導入、スクレープローディング(scrape loading)、射出導入(ballistic introdu
ction)感染および他の方法により行うことができる。そのような方法はDavisら,
BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) および Sambrookら, MOLECULAR
CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)などの多くの標準的な実験室マニュアルに
記載されている。

【００９６】 適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフ
ィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、ア
スペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９）、動
物細胞（例：ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ 127、３Ｔ３、ＢＨＫ、293およびB
owes メラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられる。

【００９７】 宿主細胞中のポリヌクレオチド構築物を従来の方法で用いて組換え配列により
コードされる遺伝子産物を製造することができる。あるいは、本発明のポリペプ
チドを従来のペプチド合成機によって合成することにより製造することができる
。

【００９８】 成熟タンパク質を適当なプロモーターの制御下で哺乳動物細胞、酵母細胞、ま
たは他の細胞において発現させることができる。本発明のＤＮＡ構築物から誘導
されたＲＮＡを用いてこの種のタンパク質を生産するための無細胞翻訳系も使用
することができる。真核生物宿主および原核生物宿主と共に使用するのに適した
クローニングベクターおよび発現ベクターはSambrookら, MOLECULAR CLONING: A
LABORATORY MANUAL, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sp
ring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。

【００９９】 本発明のこの態様によれば、ベクターは、例えば、プラスミドベクター、一本
鎖または二本鎖ファージベクター、一本鎖または二本鎖RNAもしくはDNAウイルス
ベクターでありうる。通常、プラスミドは、当業者によく知られている標準的な
ネーミングの慣習に従って、本明細書中では最初に小文字のｐ、ならびに／また
は次に大文字および／もしくは数字で示されている。本明細書中に開示された出
発プラスミドは市販されているか公的に利用可能であり、あるいは公知の公開さ
れた手法をルーチンに適用すること入手可能なプラスミドから構築することもで
きる。本発明に従って利用できる多くのプラスミドならびに他のクローニングベ
クターおよび発現ベクターは公知であり、当業者が容易に利用することができる
。

【０１００】 いくつかの点で好ましいベクターには、本発明のポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの発現のためのベクターが挙げられる。通常、そのようなベクターは発
現させようとするポリヌクレオチドに機能的に連結された、宿主細胞での発現に
有効なシス作用性(cis-acting)制御領域が含まれる。適当なトランス作用性(tra
ns-acting)因子は、宿主細胞により供給されるか、補足用ベクターにより供給さ
れるか、宿主細胞に導入された際にベクター自身により供給されるかのいずれか
である。

【０１０１】 これに関して特定の好ましい実施形態では、ベクターにより特異的な発現が提
供される。そのような特異的な発現は誘導性の発現、特定の細胞型のみにおける
発現、または誘導性発現と細胞特異的発現の両方でありうる。誘導性ベクターの
中で特に好ましいのは、温度および栄養添加物などの操作が容易な環境因子によ
り発現を誘導することのできるベクターである。真核細胞宿主および原核細胞宿
主において使用するための構成的および誘導性の発現ベクターを含む本発明のこ
の態様に適した種々のベクターは公知であり、当業者には日常的に使用されてい
る。

【０１０２】 非常に多種の発現ベクターを本発明のポリペプチドの発現に使用できる。この
ようなベクターは、他にもあるが、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベ
クターを含む。例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トラン
スポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入配列由来、酵母染色体配列由来、バキ
ュロウイルス、SV40のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイ
ルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス
由来のベクターである。さらに、それらの組み合わせから得られるベクター、例
えば、プラスミドとバクテリオファージの遺伝的エレメント由来のもので、コス
ミドおよびファージミドなどである。すべてのベクターは、本発明のこの態様に
従って発現のために使用できる。通常、宿主内でポリペプチドを発現させるため
にポリヌクレオチドを維持、増殖または発現するのに適したベクターはどれでも
この観点で発現のために使用することができる。

【０１０３】 様々な公知およびルーチンの技術のいかなるものによっても、適切なDNA配列 をベクターに挿入できる。例えば、Sambrookら、「分子クローニング、実験マニ
ュアル」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
New York(1989)に記載のような技術である。

【０１０４】 発現ベクター内の該DNA配列は、例えばmRNA転写を指令するプロモーターを含 む適切な発現制御配列に機能的に連結される。これらプロモーターの代表として
、限定するものではないが、ファージλPLプロモーター、大腸菌lac,trpおよびt
acプロモーター、SV40初期および後期プロモーターおよびレトロウイルスLTRの プロモーターが挙げられる。

【０１０５】 通常、発現構築物は、転写開始および転写終結部位を含み、転写された領域に
翻訳のためのリボソーム結合部位を有するであろう。該構築物によって発現され
た成熟転写産物のコード部分は、例えばAUGまたはGUGなどの翻訳開始コドンをそ
の先端部に含み、転写終結コドンを翻訳されるポリペプチド後端部の適切な位置
に含む。

【０１０６】 さらに該構築物は、発現させるだけでなく、発現を調節する制御領域を含んで
いてもよい。通常、多くの一般に実施される手順に従って、このような領域は、
特に転写因子、リプレッサー結合部位、終結のような転写を制御することによっ
て、機能するであろう。

【０１０７】 増殖および発現のためのベクターは通常、例えばSambrookらが記載したような
選択マーカーおよび増幅領域を含むであろう。

【０１０８】 市販されているベクターが例示のために提供される。細菌内で使用するのに好
ましいベクターとしては、Qiagenから入手できるpQE70、pQE60およびpQE-9；Str
ategeneから入手できるpBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクタ ー、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；Pharmaciaから入手できるptrc99a、pKK22
3-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5およびpBR322(ATCC 37017)が挙げられる。好まし
い真核細胞ベクターとしては、Strategeneから入手できるpWLNEO、pSV2CAT、pOG
44、pXT1、pSG、およびPharmaciaから入手できるpSVK3、pBPV、 pMSGおよびpSVL
が挙げられる。これらのベクターは、本発明のこの態様に従って使用するために
、当業者が入手可能な多くの市販のおよび公知のベクターの例示としてリストア
ップされているにすぎない。例えば、宿主内で本発明のポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドの導入、維持、増殖または発現に適した他のあらゆるプラスミドま
たはベクターを本発明のこの態様において使用できることは認識されるであろう
。

【０１０９】 プロモーター領域は候補プロモーター断片（すなわちプロモーターを含む断片
）を導入するための1以上の制限部位の下流に、クロラムフェニコールアセチル トランスフェラーゼ（CAT)転写単位のような、プロモーター領域を欠失したレポ
ーター転写単位を含むベクターを用いて、所望の遺伝子から選択できる。周知で
あるように、プロモーター含有断片をcat遺伝子の上流の制限部位でベクターに 導入することによりCAT活性の生産が生じ、該活性を標準的なCATアッセイによっ
て検出できる。この目的に適したベクターは、公知でかつ容易に入手できる。例
えば、pKK232-8およびpCM7がある。本発明のポリヌクレオチドを発現するための
プロモーターには、公知かつ容易に入手可能なプロモーターだけでなく、レポー
ター遺伝子を用いる前述の技術によって容易に得ることができるプロモーターも
含む。

【０１１０】 既知の原核生物プロモーターの中で、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの発現に適しているのは、大腸菌lacIおよびlacZプロモーター、T3および
T7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPR、PLプロモーターおよびtrpプロモ
ーターである。

【０１１１】 既知の真核生物プロモーターの中でこの関連において適しているのは、CMD前 初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV40プ ロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV)のプロモーターのようなレトロウイルス
LTRのプロモーター、およびマウスメタロチオネイン-Iプロモーターのようなメ タロチオネインプロモーターである。

【０１１２】 組換え発現ベクターは、例えば複製起点、下流の構造配列の転写を指令するた
めの好ましくは高度発現遺伝子由来のプロモーター、およびベクターとの接触後
に、該ベクターを含む細胞の単離を可能にする選択マーカー含むであろう。

【０１１３】 通常、本発明のポリペプチドの異種構造配列をコードする本発明のポリヌクレ
オチドは標準的な技術を用いて、発現のためのプロモーターに機能し得る形で連
結されるように、ベクターに挿入されるであろう。ポリヌクレオチドは、転写開
始部位がリボソーム結合部位の５'側に正確に位置するように配置されるであろ う。リボソーム結合部位は、発現されるポリペプチドの翻訳開始コドン、例えば
AUGまたはGUGの5'側に位置するであろう。通常、開始コドン（通常はAUG)から始
まる他のオープンリーディングフレームは、リボソーム結合部位と開始コドンの
間に存在しない。また通常、ポリペプチドの末端には翻訳停止コドンがあり、真
核生物宿主内で使用する構築物内にはポリアデニル化シグナルがある。転写領域
の3'末端に適切に配置された転写終結シグナルもまた、ポリヌクレオチド構築物
中に含めることができる。

【０１１４】 翻訳されたタンパク質の小胞体内腔、細胞周辺腔または細胞外環境への分泌の
ために、適当な分泌シグナルを発現されるポリペプチドに組み込んでもよい。こ
れらのシグナルはポリペプチドに対して内因性であっても異種シグナルであって
もよい。

【０１１５】 ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現させることが
でき、分泌シグナルだけでなくさらに異種の機能性領域を含み得る。従って、例
えば、付加的なアミノ酸の領域、特に電荷を持つアミノ酸の領域をポリペプチド
のN-またはC-末端に付加して精製中または続いての処理および保存の間の宿主細
胞中での安定性および持続性を改善できる。また、精製を容易にするための領域
をポリペプチドにも付加してもよい。このような領域はポリペプチドの最終的な
調製の前に取り除くことができる。とりわけ分泌または排出のため、安定性の改
善のため、または精製を容易にするためのペプチド成分をポリペプチドに付加す
ることは、当分野においてよく知られたルーチンの技術である。好ましい融合タ
ンパク質は、ポリペプチドを溶解または精製するのに有用なイムノグロブリン由
来の異種領域を含む。例えば、EP-A-O 464533（対応するカナダ特許第2045869号
)には、イムノグロブリン分子の定常領域の様々な部分を他のタンパク質または その一部とともに含む融合タンパク質が記載されている。例えば、薬剤の探索に
おいてアンタゴニストを同定するための高効率スクリーニングアッセイの目的で
、タンパク質が抗体Fc部分と融合されている(D.Bennettら、Journal of Molecul
ar Recognition, 8 : 52-58 (1995)およびK.Johansonら、The Journal of Biolo
gical Chemistry, 270 (16): 9459-9471 (1995))。

【０１１６】 哺乳動物の発現ベクターは発現に必要な、複製起点、適したプロモーターおよ
びエンハンサー、および必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化領域、スプ
ライス供与および受容部位、転写終結配列、および5'隣接非転写配列を有し得る
。

【０１１７】 続いて、細胞を典型的には遠心で回収し、物理的または化学的手段によって破
砕し、得られた粗製抽出物をさらに精製するために保存する。

【０１１８】 タンパク質の発現に用いた微生物の細胞を、冷凍融解サイクル、超音波処理、
機械的な破壊または細胞溶解試薬の使用を含む、いかなる簡便な方法によっても
破砕でき、このような方法は当業者に公知である。

【０１１９】 11cbスプライス変異体ポリペプチドを、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロー
スクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチ
ンクロマトグラフィーを含む公知の方法によって、組換え細胞培養物から回収お
よび精製することができる。最も好ましくは、精製に高速液体クロマトグラフィ
ーを使用する。ポリペプチドが単離中および/または精製中に変性したときには 、タンパク質を再生するための公知の技術を、活性なコンフォメーションを再生
するために用いてもよい。

【０１２０】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明は、例えば診断用試薬として使用する相補的ポリヌクレオチドを検出す
るための、11cbスプライス変異体ポリヌクレオチドの使用にも関する。機能障害
と関連した、11cbスプライス変異体の突然変異形態を検出することによって、11
cbスプライス変異体の過少発現、過剰発現、もしくは変化した発現により生じる
疾患または疾患に対する罹りやすさの診断法を追加し得る、またはその診断を下
し得る診断用ツールが提供されるだろう。ヒト11cbスプライス変異体遺伝子内に
突然変異を有する個体は、種々の技術によりDNAレベルで検出され得る。診断用 の核酸は、患者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料などか
ら得ることができる。ゲノムDNAは直接検出に用いることができ、または解析に 先立ちPCRを用いて酵素的に増幅することもできる。PCR(Saikiら, Nature, 1986
,324:163-166)。同様の方法で、RNAまたはcRNAを用いることもできる。一例とし
て、11cbスプライス変異体の発現と突然変異を同定し解析するために、11cbスプ
ライス変異体をコードする核酸に相補的なPCRプライマーを用いることができる 。例えば、欠失および挿入は、正常遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズ
の変化により検出できる。点突然変異は、放射性標識した11cbスプライス変異体
RNA、または放射性標識した11cbスプライス変異体アンチセンスDNA配列に、増幅
DNAをハイブリダイズすることにより、同定できる。完全に一致した配列は、RN アーゼ Aによる消化または融解温度の差によって、ミスマッチな二本鎖から区別
できる。

【０１２１】 基準遺伝子と突然変異を有する遺伝子との間の配列差異も、直接DNAを配列決 定することによって示されるであろう。さらに、クローン化DNA断片は特定のDNA
断片の検出のためのプローブとして用いることができる。それらの方法の感度は
、PCRまたは他の増幅法を適宜用いることにより、大いに高められ得る。例えば 、配列決定プライマーを、二本鎖PCR産物または改変PCRにより生成された一本鎖
鋳型分子とともに用いる。配列決定は、放射性標識ヌクレオチドを用いた従来手
法、または蛍光標識を用いた自動配列決定手法により行われる。

【０１２２】 DNA配列の差異に基づく遺伝的検査は、変性剤を含む、または含まないゲル中 での、DNA断片の電気泳動移動度の変化を検出することにより行われる。小さな 配列の欠失および挿入は、高分離能ゲル電気泳動によって、可視化することがで
きる。配列の異なるDNA断片は、変性ホルムアミド勾配ゲル上で区別でき、異な るDNA断片の移動度は、その特異的な融解または部分的融解温度によりそのゲル の異なる位置に遅らせられる(例, Myersら, Science, 1985, 230: 1242を参照の
こと)。

【０１２３】 特定の位置での配列変化も、RNアーゼおよびS1プロテクションなどのヌクレア
ーゼプロテクションアッセイ、または化学的開裂法によって明らかにすることが
できる(例えば、Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1985, 85: 4397-440
1)。

【０１２４】 したがって、特定のDNA配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNアーゼプ ロテクション、化学的開裂、直接DNA配列決定または制限酵素の使用(例えば、制
限断片長多型(「RFLP」))、およびゲノムDNAのサザンブロッティングなどの方法
によって行われる。より従来的なゲル電気泳動およびDNA配列決定だけでなく、 突然変異はin situ解析によっても検出できる。

【０１２５】 本発明のさらなる態様によれば、記載した方法により11cbスプライス変異体遺
伝子内の突然変異を検出することによって、細菌感染、真菌感染、原生生物およ
びウイルスの感染を含む感染、特にHIV-1またはHIV-2によって引き起こされる感
染、痛み、癌、糖尿病、肥満症、拒食症および過食症を含む飲食異常、喘息、パ
ーキンソン病、急性およびうっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、
狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに不安、精神分
裂病、躁うつ病、せん妄、痴呆もしくは重度精神遅滞、およびハンチントン病ま
たはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群などの運動異常を含む、精神病および神
経系疾患をを診断し、またはそれらへの罹りやすさを判定するための方法が提供
され、前記の核酸配列を、かかる方法のために用いることができる。

【０１２６】 本発明は、細菌感染、真菌感染、原生生物およびウイルスの感染を含む感染、
特にHIV-1またはHIV-2によって引き起こされる感染、痛み、癌、糖尿病、肥満症
、拒食症および過食症を含む飲食異常、喘息、パーキンソン病、急性およびうっ
血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレ
ルギー、良性前立腺肥大、ならびに不安、精神分裂病、躁うつ病、せん妄、痴呆
もしくは重度精神遅滞、およびハンチントン病またはジル・ド・ラ・トゥーレッ
ト症候群などの運動異常を含む、精神病および神経系疾患などの疾患の診断方法
を提供する。該方法は、患者から得たサンプルから、図1の配列(配列番号1)を有
するポリヌクレオチドの発現レベルの異常な低下または増加を測定することを含
む。ポリヌクレオチドの発現の低下または増加は、当業界で周知の任意のポリヌ
クレオチドの定量法、例えばPCR、RT-PCR、RNアーゼプロテクション、ノーザン ブロッティング、およびその他のハイブリダイゼーション法などを用いて測定す
ることができる。

【０１２７】染色体アッセイ また、本発明の配列は染色体の同定にも有用である。この配列は個々のヒト染
色体上の特定の位置を特異的にターゲッティングし、その特定位置とハイブリダ
イズすることができる。さらに、その染色体上の特定部位を同定することが目下
必要である。現在、実際の配列データ(反復配列多型)に基づくいくつかの染色体
マーキング試薬を、染色体の位置をマークするために使用することができる。本
発明に従ってDNAを染色体上にマッピングすることは、これらの配列と遺伝子関 連疾患とを相関させるうえで重要な第一段階である。ひとたび配列が正確な染色
体位置にマップされたら、その染色体上の配列の物理的位置を遺伝的地図データ
と相関させることができる。この種のデータは、例えば、V. McKusick, Mendeli
an Inheritance in Man (Johns Hopkins University Welch Medical Library か
らオンラインで入手可能) 中に見いだせる。その後、同一の染色体領域にマップ
された遺伝子と疾患との関係を連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝）に
より確認する。

【０１２８】 次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する
必要がある。罹患個体の一部または全部に突然変異が観察され、しかしどの正常
個体にも観察されない場合は、その突然変異が疾患の原因である可能性がある。

【０１２９】ポリペプチドアッセイ 本発明は、細胞および組織中の11cbスプライス変異体タンパク質のレベルを検
出するための、定量的および診断的アッセイを含む診断アッセイにも関する。該
アッセイには正常および異常レベルの測定が含まれる。したがって、例えば、本
発明による診断アッセイは、正常対照の組織サンプルと比較して、11cbスプライ
ス変異体タンパク質の過剰発現を検出することで、細菌感染、真菌感染、原生生
物およびウィルスの感染を含む感染、特にHIV-1またはHIV-2によって引き起こさ
れる感染、痛み、癌、糖尿病、拒食症および過食症を含む飲食異常、喘息、パー
キンソン病、急性およびうっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭
心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに不安、精神分裂
病、躁うつ病、せん妄、痴呆もしくは重度精神遅滞、およびハンチントン病また
はジル・ド・ラ・トゥーレット症候群などの運動異常を含む、精神病および神経
系疾患などの疾患／障害の存在を見出すために用いることができる。被験体サン
プル中の、本発明の11cbスプライス変異体タンパク質のようなタンパク質のレベ
ルを測定するために用いられるアッセイ技術は、当業者に周知である。こうした
アッセイ法として、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロ
ット分析、およびELISAアッセイなどがある。これらの中ではELISAが頻繁に選択
される。ELISAアッセイは、最初に11cbスプライス変異体に特異的な抗体、好ま しくはモノクロナール抗体を調製することを含んでなる。さらに一般的には、モ
ノクロナール抗体に結合するレポーター抗体を調製する。レポーター抗体には、
放射活性、蛍光または酵素的な試薬などの検出用試薬、本実施例では西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ酵素が結合される。

【０１３０】 ELISAを行うために、サンプルを被験体から取り出して固体支持体、例えばポ リスチレンディッシュ上でインキュベートする。該支持体は、サンプル中のタン
パク質と結合する。次いで、ディッシュ上のあらゆる遊離タンパク質結合部位を
、ウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質と共にインキュベートすること
により、覆い隠す。次に、ポリスチレンディッシュに結合した11cbスプライス変
異体タンパク質にモノクロナール抗体が結合する時間中、モノクロナール抗体を
ディッシュ中でインキュベートする。非結合モノクロナール抗体はバッファーで
洗い流す。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したレポーター抗体をディッシュ
に加え、11cbスプライス変異体に結合したモノクロナール抗体に、レポーター抗
体を結合させる。次いで、非結合レポーター抗体を洗い流す。そして、ペルオキ
シダーゼ活性に対する試薬(比色定量基質を含む)をディッシュに加える。一次お
よび二次抗体により11cbスプライス変異体と結合した固定化ペルオキシダーゼは
、有色の反応産物を産生する。一定時間内に生じた色の量は、サンプル中に存在
する11cbスプライス変異体タンパク質の量を示している。定量的な結果は、典型
的には標準曲線の参照により得られる。

【０１３１】 競合アッセイを利用することができ、その場合、固体支持体に結合した11cbス
プライス変異体に特異的な抗体、および標識した11cbスプライス変異体、および
被験体から得られるサンプルを固体支持体上を通過させる。固体支持体に結合す
る検出標識の量は、サンプル中の11cbスプライス変異体の量との相関があり得る
。

【０１３２】抗体 本発明のポリペプチド、その断片もしくは他の誘導体、またはその類似体、ま
たはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生するための免疫原とし
ても用いることができる。これらの抗体は、例えばポリクローナル抗体またはモ
ノクローナル抗体でありうる。本発明は、FabフラグメントまたはFab発現ライブ
ラリーの産物に加え、キメラ抗体、一本鎖抗体、およびヒト化抗体も含む。当技
術分野で公知の種々の手法を用いて、それらの抗体および断片を生成することが
できる。

【０１３３】 本発明の配列に対応するポリペプチドに対する抗体は、動物に直接ポリペプチ
ドを注射するか、または動物、好ましくはヒト以外にポリペプチドを投与するこ
とによって得られる。そのようにして得られた抗体は、ポリペプチドそのものに
結合するであろう。このように、ポリペプチドの断片のみをコードする配列でさ
え、完全な天然ポリペプチドに結合する抗体を作製するために用いることができ
る。そして、それらの抗体は、該ポリペプチドを発現する組織からポリペプチド
を単離するために用いられる。

【０１３４】 モノクローナル抗体の調製には、連続継代性細胞系の培養物から抗体を産生さ
せる任意の技法を用いることができる。例を挙げると、ハイブリドーマ法 (Kohl
erら, Nature (1975), 256:495-497)、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドー マ法 (Kozborら, Immunology Today (1983), 4:72) およびヒトモノクロナール 抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ法 (Coleら, pg. 77-96, MONOCLONAL
ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985))などがある。

【０１３５】 本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体を作製するために、米
国特許第4,946,778号に記載されるような一本鎖抗体の調製法を適用することが できる。また、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現さ
せるために、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含む他の生物を利
用することができる。

【０１３６】 前記の抗体を用いて、該ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定し
たり、アフィニティークロマトグラフィーにより、単離および／または精製のた
めに固体支持体に該抗体を付着させることによって、本発明のポリペプチドを精
製することもできる。

【０１３７】 11cbスプライス変異体に対する抗体を用い、細菌感染、真菌感染、原生生物お
よびウィルスの感染を含む感染、特にHIV-1またはHIV-2によって引き起こされる
感染、痛み、癌、糖尿病、肥満症、拒食症および過食症を含む飲食異常、喘息、
パーキンソン病、急性およびうっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症
、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに不安、精神
分裂病、躁うつ病、せん妄、痴呆もしくは重度精神遅滞、およびハンチントン病
またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群などの運動異常を含む、精神病および
神経系疾患などを抑制することもできる。

【０１３８】11cbスプライス変異体結合分子およびアッセイ 11cbスプライス変異体は、それと相互作用するタンパク質を単離するために用
いることができる。この相互作用は干渉の標的であり得る。11cbスプライス変異
体と他の因子とのタンパク質−タンパク質相互作用のインヒビターは、11cbスプ
ライス変異体活性をモジュレートする医薬学的試薬の開発につながる可能性があ
る。

【０１３９】 したがって、本発明は11cbスプライス変異体に結合する分子の同定法も提供す
る。11cbスプライス変異体に結合する分子であるタンパク質をコードする遺伝子
は、例えばリガンドパンニング(panning)およびFACSソーティング(sorting) などの当業者には公知の多くの技術によって、同定することができる。それらの
手法は多くの研究室マニュアルに記載されており、例えば、Coliganら, Current
Protocols in Immunology 1:Chapter 5 (1991)および Rivett, A. J., Biochem
. (1993), 291:1-10が挙げられる。

【０１４０】 例えば、酵母ツーハイブリッドシステムは、転写活性化因子の活性を再構成す
ることによって、第1被験タンパク質と第2被験タンパク質の間の相互作用をin v
ivoで検出する方法を提供する。この方法は、米国特許第5,283,173号に開示され
ており、試薬はClontechおよびStratageneから入手できる。簡潔に説明すると、
11cbスプライス変異体cDNAをGal4転写因子DNA結合ドメインと融合させ、酵母細 胞内で発現させる。目的の細胞から得たcDNAライブラリーメンバーをGal4のトラ
ンス活性化ドメインと融合させる。11cbスプライス変異体と相互作用し得るタン
パク質を発現するcDNAクローンは、Gal4活性の再構築およびGal1-lacZなどのレ ポーター遺伝子の発現のトランス活性化を引き起こすであろう。

【０１４１】 他の方法はλgt11、λZAP（Stratagene）または同等なcDNA発現ライブラリー の組換え11cbスプライス変異体によるスクリーニングである。組換え11cbスプラ
イス変異体タンパク質またはそれらの断片を、例えばFLAG、HSVまたはGSTのよう
な小ペプチドタグに融合する。ペプチドタグは心筋クレアチンキナーゼのような
キナーゼに対する都合のよいリン酸化部位を有しうるか、またはビオチン化され
うる。組換え11cbスプライス変異体は32[P]でリン酸化されるか、非標識で用い られ、ストレプトアビジンまたはタグに対する抗体を用いて検出することができ
る。λgt11cDNA発現ライブラリーを目的の細胞から作製し、組換え11cbスプライ
ス変異体と共にインキュベートし、洗浄し、11cbスプライス変異体と相互作用す
るcDNAクローンを単離する。この方法は当業者に日常的に用いられている（参照
例：Sambrook（上述））。

【０１４２】 もう一つの方法はcDNAをベクター中の哺乳動物プロモーターおよびポリアデニ
ル化部位の間にクローニングし、一時的にCOSまたは293細胞にトランスフェクト
した、哺乳動物発現ライブラリーのスクリーニングである。48時間後、結合タン
パク質を、固定し洗浄した細胞を標識11cbスプライス変異体と共にインキューベ
ートすることにより検出する。好ましい実施形態においては、11cbスプライス変
異体をヨード化し、任意の結合した11cbスプライス変異体の検出をオートラジオ
グラフィーにより行う（Simsら、Science、(1988)、241:585-589およびMcMahan ら、EMBO J.、(1991)、10:2821-2832を参照のこと）。このようにして、目的の 結合タンパク質をコードするcDNAを含むcDNAのプールを選択し、目的のcDNAを、
各プールのさらなる細分割、続いて一過性のトランスフェクション、結合および
オートラジオグラフィーのサイクルにより単離できる。あるいはまた、目的のcD
NAを、全cDNAライブラリーを哺乳動物細胞にトランスフェクトし、プレートに結
合した11cbスプライス変異体を含むディッシュ上に細胞をパンニングすることに
より単離できる。洗浄後に付着している細胞を溶解し、そのプラスミドDNAを単 離し、細菌中で増幅して、単一cDNAクローンを得るまでトランスフェクションと
パンニングのサイクルを繰り返した（Seedら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、(1
987)、84:3365およびAruffoら、EMBO J.(1987)6:3313を参照のこと）。結合タン
パク質が分泌される場合には、一過性にトランスフェクトした細胞からの上清を
アッセイするための、結合アッセイまたは中和アッセイがいったん確立されてい
れば、そのcDNAは同様のプーリング法によって単離しうる。上清をスクリーニン
グする一般的な方法はWongら、Science、(1985)、228:810-815に開示されている
。

【０１４３】 もう一つの他の方法は、11cbスプライス変異体と相互作用するタンパク質を細
胞から直接的に単離することである。GSTまたは小ペプチドタグと11cbスプライ ス変異体の融合タンパク質を作製し、ビーズに固定する。生合成的に標識したま
たは非標識の、目的の細胞からのタンパク質抽出物を調製し、ビーズと共にイン
キュベートし、バッファーで洗浄する。11cbスプライス変異体と相互作用するタ
ンパク質をビーズから特異的に溶出し、SDS-PAGEで分析する。結合パートナーの
一次アミノ酸配列データをマイクロシークエンシングにより得る。任意に、細胞
を、例えば細胞タンパク質のチロシンリン酸化のような機能的応答を誘導する薬
剤で処理しうる。そのような薬剤の例としてはインターロイキン−2のような増 殖因子またはサイトカインがあるだろう。

【０１４４】 もう一つの他の方法はイムノアフィニティー精製である。組換え11cbスプライ
ス変異体を標識または非標識の細胞抽出物と共にインキュベートし、抗11cbスプ
ライス変異体抗体を用いて免疫沈降する。免疫沈降物をプロテインAセファロー スで回収し、SDS-PAGEで分析する。非標識タンパク質をビオチン化によって標識
し、ストレプトアビジンを用いてSDSゲル上で検出する。結合パートナータンパ ク質をマイクロシークエンシングにより分析する。更に、当業者に公知の標準的
生化学精製工程をマイクロシークエンシングの前に用いることができる。

【０１４５】 さらにもう一つの他の方法は、結合パートナーのためのペプチドライブラリー
のスクリーニングである。タグを付されたまたは標識した組換え11cbスプライス
変異体を用いて11cbスプライス変異体と相互作用するペプチドまたはホスホペプ
チドライブラリーからペプチドを選択する。ペプチドのシークエンシングは相互
作用するタンパク質において見出されうる共通ペプチド配列の同定につながる。

【０１４６】 11cbスプライス変異体の結合パートナー（これらの方法または当業者に公知の
他の方法から任意の方法により同定された）および上述されている推定上の結合
パートナーを本発明のアッセイ法に用いることができる。11cbスプライス変異体
／結合パートナー複合体の存在についてのアッセイは、例えば酵母ツーハイブリ
ッドシステム、複合体に特異的な抗体を用いるELISAまたはイムノアッセイによ り実施する。11cbスプライス変異体／結合パートナー相互作用の形成を妨げるま
たは阻害する試験物質の存在下では、試験物質を欠く対照と比較して、複合体量
が減少することが測定されるだろう。

【０１４７】 遊離11cbスプライス変異体または結合パートナーについてのアッセイを、例え
ば特異的な抗体を用いたELISAまたはイムノアッセイにより、または放射性標識 された11cbスプライス変異体を細胞または細胞膜と共にインキュベートし、続い
て遠心分離または濾過分離する工程により、達成する。11cbスプライス変異体／
結合パートナー相互作用の形成を妨げるまたは阻害する試験物質の存在下では、
試験物質を欠く対照と比較して、遊離11cbスプライス変異体量または遊離結合パ
ートナー量が増加することが測定されるだろう。

【０１４８】 本発明のポリペプチドはまた、細胞または無細胞調製物における11cbスプライ
ス変異体結合分子の11cbスプライス変異体結合能を評価するために用いることが
できる。

【０１４９】アゴニストおよびアンタゴニスト―アッセイおよび分子 本発明の11cbスプライス変異体は、本発明の受容体ポリペプチドを活性化する
化合物（アゴニスト）または活性化阻害する化合物（アンタゴニスト）について
のスクリーニング法に用いることができる。

【０１５０】 一般的に、そのようなスクリーニング法は細胞表面に本発明の受容体ポリペプ
チドを発現する適当な細胞を提供することを含む。この種の細胞には、哺乳動物
、酵母、ショウジョウバエまたは大腸菌由来の細胞が含まれる。特に、本発明の
受容体をコードするポリヌクレオチドを用いて、細胞をトランスフェクトし、そ
れにより11cbスプライス変異体を発現させる。その後発現した受容体を試験化合
物と接触させ、その結合、機能的応答の促進または阻害を観察する。

【０１５１】 この種のスクリーニング法の一つには、本発明の11cbスプライス変異体を発現
するようにトランスフェクトされたメラニン細胞の使用を含む。この種のスクリ
ーニング技術は1992年2月6日に発行されたPCT WO 92/01810に記載されている。 そのようなアッセイを用いて、受容体リガンド（例えばMCH ）およびスクリーニングする化合物の両方と、受容体をコードする該メラニン細
胞を接触させることにより、本発明の受容体ポリペプチドの活性化を阻害する化
合物についてスクリーニングしうる。リガンドにより発生されるシグナルが阻害
されることは、化合物が受容体の潜在的アンタゴニストである、すなわち受容体
の活性化を阻害することを示している。

【０１５２】 該技術はまた、そのような細胞を、スクリーニングすべき化合物と接触させ、
そのような化合物がシグナルを発生する、すなわち受容体を活性化するかどうか
を測定することによって、受容体を活性化する化合物についてのスクリーニング
を行うことができるだろう。

【０１５３】 他のスクリーニング技術は受容体の活性化により生じた細胞外pH変化を測定す
る系において11cbスプライス変異体を発現する細胞（例えばトランスフェクトさ
れたCHO細胞）の使用を含む。この技術においては、化合物を本発明の受容体ポ リペプチドを発現する細胞と接触させる。その後、第2メッセンジャーの応答（ 例えばシグナル伝達またはpH変化）を測定して受容体を活性化または阻害する可
能性のある化合物かどうかを決定する。

【０１５４】 もう一つのスクリーニング技術は11cbスプライス変異体を発現させることを含
み、この場合この受容体はホスフォリパーゼCまたはDと結合している。この種の
細胞の代表例としては、内皮細胞、平滑筋細胞および胎児性腎細胞が含まれるが
これらに限定されるものではない。該スクリーニングは、ホスフォリパーゼ第2 シグナルからの受容体の活性化または受容体活性化の阻害の検出により、本明細
書に記載されているように達成しうる。

【０１５５】 また別の方法として、表面上に受容体を有する細胞または該受容体を含む細胞
膜への標識リガンド（例えばMCH）の結合の阻害を測定することによる、アンタ ゴニストすなわち本発明の受容体ポリペプチドの活性化を阻害する化合物につい
てのスクリーニングを含む。この方法は、細胞がその表面上に受容体を発現する
ように、11cbスプライス変異体をコードするDNAを用いて真核細胞をトランスフ ェクトする。その後、細胞を、標識型リガンド（例えばMCH）の存在下で潜在的 アンタゴニストと接触させる。該リガンドは例えば放射活性により標識されうる
。受容体に結合した標識リガンド量は、例えばトランスフェクトされた細胞また
はそれらの細胞から得た膜に関して放射活性を測定することにより、測定する。
化合物が受容体に結合する場合には、標識リガンドの受容体への結合は阻害され
、これは受容体に結合する標識リガンドの減少により測定される。この方法は結
合アッセイと呼ばれる。

【０１５６】 また別のこの種のスクリーニング法には、目的の受容体を発現するようにトラ
ンスフェクトされた哺乳動物細胞の使用が含まれる。該細胞を、カルシウムと結
合した場合に蛍光シグナルを出す色素指示薬と共にロードし、細胞を試験物質お
よび受容体アゴニスト（例えばMCH）と接触させる。一定の時間にわたり、例え ば蛍光分光計または蛍光画像プレート読み取り器（fluorescence imaging plate
reader）を用いて、蛍光シグナル変化を測定する。リガンドにより生じる蛍光 シグナルパターンの変化は、化合物が受容体に対する潜在的アンタゴニスト（ま
たはアゴニスト）であることを示している。

【０１５７】 もう一つのこの種のスクリーニング法には、目的の受容体を発現するようにト
ランスフェクトされ、さらに受容体の活性化と結び付けられるレポーター遺伝子
構築物（例えば、適当なプロモーターに続けたβ−ガラクトシダーゼまたはルシ
フェラーゼ）でトランスフェクトされた哺乳動物細胞の使用が含まれる。該細胞
を試験物質および受容体アゴニスト（例えばMCH）と接触させ、一定の時間後に レポーター遺伝子により発生されたシグナルを測定する。該シグナルは照度計、
分光光度計、蛍光計または用いた特定のレポーター構築物に対して適当な他の機
器を用いて測定しうる。リガンドにより発生されるシグナルが阻害されることは
、化合物が受容体に対する潜在的アンタゴニストであることを示している。

【０１５８】 もう一つのアンタゴニストまたはアゴニストについてのスクリーニング技術は
、アフリカツメガエル卵母細胞に11cbスプライス変異体をコードするRNAを導入 し、受容体を一過性または安定的に発現させることを含む。その後、受容体を有
する卵母細胞を受容体リガンド（例えばMCH）およびスクリーニングすべき化合 物と接触させる。次いで、受容体の阻害または活性化をシグナル（例えばcAMP、
カルシウム、プロトンまたは他のイオン）の検出により測定する。

【０１５９】 もう一つの方法は、11cbスプライス変異体の介在するcAMPおよび／またはアデ
ニル酸シクラーゼの蓄積または減少の阻害若しくは促進を測定することにより、
11cbスプライス変異体インヒビターをスクリーニングするものである。この方法
は、11cbスプライス変異体受容体を用いて真核細胞を一過性にまたは安定的にト
ランスフェクトし、細胞表面に受容体を発現させることを含む。その後、該細胞
を11cbスプライス変異体リガンド(例えばMHC)の存在下で潜在的アンタゴニスト に曝露する。次いで、cAMPレベルの変化を、例えばラジオイムノアッセイまたは
タンパク質結合アッセイ（例えばフラッシュプレートまたはシンチレーション近
接アッセイを用いる）により、一定の時間にわたって測定する。また、cAMPレベ
ルの変化は、破砕細胞調製物において酵素、アデニル酸シクラーゼの活性を直接
的に測定することにより調べることもできる。潜在的アンタゴニストが受容体に
結合し、それゆえに11cbスプライス変異体の結合を阻害している場合、11cbスプ
ライス変異体が介在するcAMPまたはアデニル酸シクラーゼ活性のレベルは低下ま
たは増加するだろう。

【０１６０】 アゴニストおよびアンタゴニストについてのもう一つのスクリーニング法は、
酵母（Sacchromyces cerevisiae）における内因性フェロモン応答経路に依存す る。酵母の雌雄異型株は２つの有糸分裂上安定な一倍体接合型（MATaおよびMATa
）として存在しうる。各細胞型は、もう一方の接合型細胞上のGタンパク質共役 型受容体に結合する小型のペプチドホルモンを分泌し、このホルモンが細胞融合
の前兆となるG1期停止へと至らせるMAPキナーゼカスケードを誘発させる。フェ ロモン応答経路におけるいくつかの遺伝子の遺伝的改変はフェロモンへの正常な
応答を変化させうる。そして内因性のフェロモン受容体を欠く酵母細胞における
、ヒトGタンパク質共役受容体およびヒト化Gタンパク質サブユニットの異形発現
および結合が、下流のシグナル伝達経路およびレポーター遺伝子に関係しうる（
例えば、米国特許第5,063,154号；第5,482,835号；第5,691,188号）。そのよう な遺伝的改変は：(ｉ)内因性Gタンパク質共役フェロモン受容体をコードするSTE
2またはSTE3遺伝子の欠失；(ii)細胞周期停止へと至らせるサイクリン依存型キ ナーゼと通常関連しているタンパク質をコードするFAR1遺伝子の欠失；および(i
ii)FUS1遺伝子プロモーターに融合したレポーター遺伝子の構築（FUS1は細胞融 合に必要な膜固定化糖タンパク質をコードする）を含むが、それらに限定されな
い。下流レポーター遺伝子は、用いられる特定のリポーター構築物（例えばFUS1
-LacZレポーターを用いるβガラクトシダーゼ誘導）に依存して、陽性増殖選択 （例えば、FUS1-HIS3レポーターを用いるヒスチジン原栄養性）、または比色定 量的、蛍光測定的または分光測定的読み取りのいずれかを可能にする。

【０１６１】 ランダムペプチドライブラリーから、小さいペプチドを発現し、分泌するよう
に酵母細胞をさらに遺伝子工学的に操作することができる。該酵母細胞のうちの
いくつかは、異種発現されたヒト（または哺乳動物）Gタンパク質共役受容体の 自己分泌的な活性化を可能にする（Broach, J.R.及びThorner, J. Nature 384:1
4-16, 1996; Manfrediら、Mol. Cell. Biol. 16:4700-4709, 1996）。これによ り、特徴付けられたまたは孤立した受容体を活性化する代用ペプチドアゴニスト
の素早く直接的な増殖選択（例えば、FUS1-HIS3受容体を用いる）が提供される 。また、レポーター遺伝子リードアウト（例えば、FUS1-LacZ）に結合したヒト （または哺乳動物）Gタンパク質共役受容体を機能的に発現する酵母細胞を、既 知のリガンド、生物抽出物の画分及び天然または代用のリガンドのどちらかの化
合物ライブラリーを高スループットでスクリーニングするための基盤として用い
ることができる。十分な効能を有する機能的なアゴニスト（天然にせよ代用にせ
よ）を、Gタンパク質共役受容体アンタゴニストを同定するための酵母細胞に基 づくアッセイにおけるスクリーニングツールとして用いることができる。この目
的のためには、使用の容易性および受容体バックグラウンドが存在しないこと（
内因性Gタンパク質共役受容体の欠損）により、哺乳動物発現系よりも酵母細胞 系が有利である。該バックグラウンドは、しばしばアゴニストまたはアンタゴニ
ストを同定する能力を阻害する。

【０１６２】 本発明はまた、11cbスプライス変異体受容体に結合できることが知られていな
いリガンドがそのような受容体に結合できるかどうかを決定するための方法であ
って、候補リガンドが11cbスプライス変異体受容体に結合できる条件下で、MCH などのリガンドと、11cbスプライス変異体受容体を発現する哺乳動物細胞とを接
触させ、受容体に結合する候補リガンドの存在を検出することにより、該リガン
ドが11cbスプライス変異体受容体に結合するかどうかを決定することを含む上記
方法も提供する。アゴニスト及び／またはアンタゴニストを決定するための上記
の系はまた、受容体に結合するリガンドを決定するためにも用いることができる
。

【０１６３】 潜在的な11cbスプライス変異体受容体アンタゴニストの例としては、抗体また
は、ある場合にはオリゴヌクレオチドが挙げられ、それらは、受容体に結合する
が、受容体の活性が阻害されるような二次メッセンジャー応答を誘導しない。

【０１６４】 潜在的なアンタゴニストはまた、11cbスプライス変異体受容体のリガンド、す
なわち該リガンドの断片に密接に関与するタンパク質を含み、それらは、生物学
的機能を失っており、11cbスプライス変異体受容体に結合しても何の応答も誘導
しない。

【０１６５】 このように別の態様においては、本発明は、11cbスプライス変異体ポリペプチ
ドに対するアゴニスト、アンタゴニスト及びリガンドを同定するためのスクリー
ニングキットに関し、該キットは、 （a）11cbスプライス変異体ポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプ チドを含み、かつ好ましくは標識された、または標識されていないMCHを含むか ； （b）11cbスプライス変異体ポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプ チドを発現する組換え細胞を含み、かつ好ましくは標識された、または標識され
ていないMCHを含むか； または （c）11cbスプライス変異体ポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプ チドを発現する細胞膜を含み、かつ好ましくは標識された、または標識されてい
ないMCHを含む。

【０１６６】 このようなキットにおいて、（a）、（b）または（c）が実質的な構成成分を 含み得ることが理解されよう。

【０１６７】 潜在的なアンタゴニストはまた、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチ
センス構築物をも含む。アンチセンス技術は、三重らせん形成またはアンチセン
スDNAまたはRNAを介して遺伝子発現を制御するのに用いることができる。該双方
の方法は、ポリヌクレオチドがDNAまたはRNAに結合することに基づく。例えば、
ポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコード
しており、約10〜40塩基長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するの に用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補 的になるように設計され（三重らせん−Leeら、Nucl. Acids Res., 6: 3073 (19
79); Cooneyら、Science, 241: 456 (1988);及びDervanら、Science, 251: 1360
(1991)を参照）、それにより11cbスプライス変異体受容体の転写及び産生を阻 害する。該アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、in vivoでmRNAにハイブリダ
イズし、mRNA分子が11cbスプライス変異体受容体に翻訳されるのを遮断する（ア
ンチセンス−Okano,J., Neurochem., 56: 560 (1991); 遺伝子発現のアンチセン
スインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド、CRC press, Boca Raton,
FL (1988)）。上記オリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスRNAまたはDNAをin
vivoで発現して11cbスプライス変異体受容体の産生を阻害し得るような細胞に 輸送される。

【０１６８】 別の潜在的なアンタゴニストは、11cbスプライス変異体受容体に結合する小分
子であり、該受容体を正常な生物学的活性を阻害するようなリガンドに到達しが
たくする。小分子の例としては、限定されるものではないが、小ペプチドまたは
ペプチド様分子が挙げられる。

【０１６９】 潜在的なアンタゴニストはまた、11cbスプライス変異体受容体の可溶性形態、
例えば該受容体の断片も含み、それらはリガンドに結合し、リガンドが膜結合11
cbスプライス変異体受容体と相互作用するのを妨げる。

【０１７０】 11cbスプライス変異体タンパク質は、哺乳動物宿主に遍在し、多くの病状を含
む多くの生物学的機能を担っている。従って、一方では11cbスプライス変異体を
刺激し、また一方では11cbスプライス変異体の機能を阻害する化合物及び薬剤を
発見することが望まれる。

【０１７１】 一般的には、11cbスプライス変異体受容体に対するアゴニストは、細菌、真菌
、原生動物及びウイルス感染などの感染症、特にHIV-1またはHIV-2が引き起こす
感染症、疼痛、癌、糖尿病、肥満、拒食症及び過食症などの摂食障害、喘息、パ
ーキンソン病、急性及びうっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症
、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大ならびに不安、精神分
裂、躁鬱、譫妄または重度の精神遅滞を含む精神及び神経障害、または特にハン
チントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群などの運動障害の治療及び
予防目的に用いられる。

【０１７２】 11cbスプライス変異体受容体に対するアンタゴニストは、細菌、真菌、原生動
物及びウイルス感染などの感染症、特にHIV-1またはHIV-2が引き起こす感染症、
疼痛、癌、糖尿病、肥満、拒食症及び過食症などの摂食障害、喘息、パーキンソ
ン病、急性及びうっ血性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症
、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大ならびに不安、精神分裂、躁鬱
、譫妄または重度の精神遅滞を含む精神及び神経障害、または特にハンチントン
舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群などの運動障害の多様な治療及び予
防目的に用いられる。

【０１７３】 本発明はさらに、過度の11cbスプライス変異体活性に関与する異常な状態を治
療する方法を提供する。該方法は、リガンドが11cbスプライス変異体に結合する
のを遮断するか、または二次シグナルを阻害することにより活性化を阻害し、異
常な状態を軽減するのに有効な量の上記阻害化合物（アンタゴニスト）を、製薬
上許容される担体と共に被験者に投与することを含む。

【０１７４】 本発明はまた、11cbスプライス変異体活性の過小発現に関与する異常な状態を
治療する方法を提供する。該方法は、製薬上許容される担体と組み合わせて、上
記本発明の受容体ポリペプチド（アゴニスト）を活性化する治療上有効な量の化
合物を被験者に投与することを含む。それにより異常な状態は軽減される。

【０１７５】組成物及びキット 可溶性形態の11cbスプライス変異体及びそのような受容体を活性化または阻害
する化合物を、適当な製薬上の担体と組み合わせて用いることができる。そのよ
うな組成物は、治療上有効な量のポリペプチドまたは化合物を含み、製薬上許容
される担体または賦形剤を含む。そのような担体としては、限定されるものでは
ないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エ
タノール及びそれらを組み合わせたものが含まれる。剤型は投与様式に適合させ
るべきである。

【０１７６】 本発明はさらに、前記本発明の組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器
を含む医薬用パック及びキットに関する。

【０１７７】投与 本発明のポリペプチド及び他の化合物は、単独で用いても、または治療用化合
物などの他の化合物と共に用いてもよい。

【０１７８】 医薬組成物を全身投与する際の好ましい形態は、注入、典型的には静脈注射に
よる注入を含む。皮下、筋肉内または腹腔内などの他の注入経路も用いることが
できる。ごく最近、組成物の全身投与のための別の手段が考案された。該手段は
、胆汁酸塩またはフシジン酸またはその他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経
粘膜及び経皮投与を含む。さらに、腸溶剤またはカプセル剤として適当に製剤化
されていれば、経口投与も可能である。これらの化合物は、軟膏、ペースト、ゲ
ルなどの剤型で局所的に及び／または局部的に投与してもよい。

【０１７９】 必要な投与量の範囲は、ペプチドの選択、投与経路、剤型の性質、患者の症状
の性質及び医師の判断に依る。しかし、適当な投与量の範囲は、被験者の体重１
kgあたり0.1〜100μgの範囲である。しかし、利用可能なペプチドの多様性及び 種々の投与経路により効率が異なることを考慮して、必要な投与量が広範に変動
し得ることが予期される。例えば、経口投与は、静脈注射による投与よりも高い
投与量を必要とすることが予想される。これらの投与量レベルの変動は、当技術
分野でよく理解されているような標準的かつ経験的な最適化の手順を用いて調整
することができる。

【０１８０】遺伝子治療 11cbスプライス変異体のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチドであ
るアンタゴニスト及びアゴニストを、そのようなポリペプチドをin vivoで発現 させることにより、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる治療様式において、本発明
に従って用いることができる。

【０１８１】 このように、例えば、ex vivoでポリペプチドをコードするようにDNAまたはRN
Aなどのポリヌクレオチドで患者から調製した細胞を遺伝子工学的に操作するこ とができる。その後、操作した細胞を該ポリペプチドで治療されるべき患者に付
与することができる。例えば、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレ トロウイルスプラスミドベクターを用いることにより細胞をex vivoで操作する ことができる。そのような方法は、当技術分野でよく知られており、本発明中で
それらを用いることは本明細書の教示から明らかである。

【０１８２】 同様に、当技術分野で知られている方法によりポリペプチドをin vivoで発現 させるために、細胞をin vivoで操作することができる。例えば、本発明のポリ ヌクレオチドを、上述のごとく、複製に欠陥のあるレトロウイルスベクター中で
発現させるために操作することができる。その後、レトロウイルス発現構築物を
単離し、パッケージング細胞中に導入することができる。パッケージング細胞は
、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルスプラスミドベク ターにより形質導入され、目的の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生するよ
うになる。これらの産生細胞を、in vivoで細胞を操作するため、及びin vivoで
ポリペプチドを発現させるために患者に投与することができる。本発明のポリペ
プチドを投与するためのこれらの方法及び他の方法は、本発明の教示から当業者
にとっては自明であるはずである。

【０１８３】 上述のレトロウイルスプラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、限定
されるものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、ラウ
ス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル
白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイ
ルス及び乳癌ウイルスを含む。好ましい実施形態においては、レトロウイルスプ
ラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルスに由来する。

【０１８４】 そのようなベクターは、ポリペプチドを発現する1以上のプロモーターを含む 。用いることができる適当なプロモーターとしては、限定されるものではないが
、レトロウイルスLTR、SV40プロモーター及びMillerら、Biotechniques 7: 980-
990 (1989)に記載されたヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、また は他のプロモーター（例えば、限定されるものではないが、ヒストン、RNAポリ メラーゼIII及びβ−アクチンプロモーターを含む真核細胞性プロモーターなど の細胞性プロモーター）が挙げられる。用いることができる他のウイルスプロモ
ーターとしては、限定されるものではないが、アデノウイルスプロモーター、チ
ミジンキナーゼ（TK）プロモーター及びB19パルボウイルスプロモーターが挙げ られる。適当なプロモーターを選択することは、本明細書に含まれる教示から当
業者にとっては自明であるだろう。

【０１８５】 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を適当なプロモーターの制御下に
置くことができる。用いることができる適当なプロモーターとしては、限定され
るものではないが、アデノウイルス主要後期プロモーターなどのアデノウイルス
プロモーターまたはサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターなどの異種起原 プロモーター、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）プロモーター、MMTプロモーター、
メタロチオネインプロモーターなどの誘導性プロモーター、熱ショックプロモー
ター、アルブミンプロモーター、ApoAIプロモーター、ヒトグロビンプロモータ ー、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジンキナー
ゼプロモーター、レトロウイルスLTR（上述の改変されたレトロウイルスLTRを含
む）、β−アクチンプロモーター及びヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられ
る。該プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する生来の
プロモーターであってもよい。

【０１８６】 レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞系を形質導入して
産生細胞系を形成するのに用いることができる。トランスフェクトされうるパッ
ケージング細胞の例としては、限定されるものではないが、Miller, A., HUMAN
GENE THERAPY 1: 5-14 (1990)に記載されたように、PE501、PA317、Y-2、Y-AM、
PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、YCRE、YCRIP、GP+E-86、GP+envAm12及びDAN細胞 系が挙げられる。該ベクターは、当技術分野で知られている任意の手段を介して
パッケージング細胞中に導入して形質導入させることができる。そのような手段
としては、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、リポソームの
使用及びリン酸カルシウム沈降法が挙げられる。もう一つ別の手段としては、レ
トロウイルスプラスミドベクターをリポソーム中に被包し、または脂質に結合さ
せ、その後宿主に投与してもよい。

【０１８７】 産生細胞系は、感染性のレトロウイルスベクター粒子を生成するが、該粒子に
はポリペプチドをコードする核酸配列群が含まれる。その後、そのようなレトロ
ウイルスベクター粒子を、in vitroまたはin vivoのどちらかにおいて真核細胞 を形質導入するのに用いることができる。形質導入された真核細胞は、ポリペプ
チドをコードする核酸配列群を発現するだろう。形質導入され得る真核細胞とし
ては、限定されるものではないが、造血幹細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞
、ケラチン生成細胞、内皮細胞及び気管支上皮細胞はもちろん、胚性幹細胞、胚
性癌細胞が挙げられる。

【０１８８】実施例 本明細書で用いられているいくつかの用語は、前述の解説において説明されて
いる。

【０１８９】 全ての実施例は、特に詳細に記述されている部分を除いては、当業者には公知
でルーチンである標準的な技術により実施した。以下の実施例の、ルーチンの分
子生物学的技術は、Sambrook等の標準的な実験室用のマニュアルに記載されてい
るように実施できる。

【０１９０】 以下の実施例で記述する部または量は、特に特定しない限りは重量による。

【０１９１】 特に断らない限り、以下の実施例での断片のサイズ分離は、アガロースゲル電
気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動（「PAGE」）の標準的な技術を用
いて、Sambrookおよび非常に多数の他の参考文献（例えばGoeddelら、Nucleic A
cids Res.8:4057等）にあるとおりに実施する。

【０１９２】 特に断らない限り、標準的な緩衝液、インキュベーション温度および時間、ほ
ぼ等モル量のライゲーションするDNA断片およびほぼ10ユニット/0.5μｇDNAのT4
DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いてライゲーションを実施した。

【０１９３】実施例１：ヒト11cbスプライス変異体の5’末端のクローニング ： ヒト11cbスプライス変異体の5’末端を、Life Technologyのプラスミドライブ
ラリーから精製したヒト全脳由来のDNAに対して、以下のプライマーおよび条件 を用いて増幅した。

【０１９４】 外側プライマーとして以下のものを使用した。

【０１９５】 5’ベクター特異的プライマー：5’ GCT ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAG GTA CG
3’（配列番号：3）；および 3’遺伝子特異的プライマー：5’ CGA GAG GTT GAT GAT GAA GAT GTC 3’（配列
番号：4） 次のものを50μｌの反応容積で使用した。すなわち10×Taqポリメラーゼ緩衝 液、200μＭ dNTP、5%グリセロール、50ピコモルの各プライマー、Life Technol
ogyのプラスミドライブラリーから精製したヒト全脳由来のプラスミドDNA（100 ｎｇ）、容積比で1:10のTaqポリメラーゼとPfuポリメラーゼとの混合物。

【０１９６】 続いて以下のPCRプログラムを用いた： 94℃で5分間を1サイクル； 94℃で1分間を25サイクル； 55℃で1分間を25サイクル； 72℃で2分間を25サイクル；および 72℃で8.5分間を1サイクル。

【０１９７】 ネステッド（nested）または内側プライマーとしては以下のものを使用した。

【０１９８】 5’ベクター特異的プライマー：5’ GGT GAC ACT ATA GAA GGT ACG 3’（配列番
号：5）；および 3’遺伝子特異的プライマー：5’ GCA GAT GGT GCC GAA CAC CGA AGG 3’（配列
番号：6） ネステッドまたは内側反応は、1μｌのプラスミドDNAを1μｌの外側反応物に より置き換えた以外は、外側反応と同じ手順を用いた。続いてDNAを、1.2%アガ ロースゲル上でサイズにより分画した。2つの主要なバンドをサブクローン化し 、サブクローン化した断片を配列決定した。主要なバンドのうちの1つは、1996 年6月20日に公開されたWO96/18651に記載のもとのヒト11cbクローンの5’末端で
あり、もう1つのバンドが、ヒト11cbクローンの新規スプライス変異体のクロー ニングという結果となった。

【０１９９】実施例2：リガンドまたはアンタゴニストの同定 ： 上記の実施例1に記載された、発現された受容体を、続いてリガンドまたはア ンタゴニストについて以下のようにスクリーニングした。

【０２００】A.リガンド/組織バンク 発現された受容体を、化合物バンク、複合生物学的液体、コンビナトリアル有
機およびペプチドライブラリー等をスクリーニングするために利用し、活性化リ
ガンドまたはアンタゴニストを同定できる。同様に、ヒトおよび他の哺乳類の組
織抽出物（例えばブタ組織）に対して受容体をスクリーニングことができる。特
に、これらの組織抽出物には、肺、肝臓、腸、心臓、腎臓、副腎、虚血性脳、血
漿、尿および胎盤が含まれる。これらの組織バンクの形成において用いられた抽
出技術は当分野で公知である。

【０２０１】B.機能アッセイ 1.ツメガエル卵母細胞アッセイ ツメガエル卵母細胞系を細胞表面受容体の特徴づけに使用したが、これはこれ
らの細胞が、mRNAを正確に翻訳し、多数の翻訳後修飾（シグナルペプチドの開裂
、グリコシル化、リン酸化およびサブユニット集合（assembly）を含む）をする
ことができるからである。機能性アッセイは下記の通り行った。

【０２０２】 11cbスプライス変異体受容体のcDNAをコードする線状プラスミド鋳型から、キ
ャップされたRNA転写物を、標準的な手法に従ってRNAポリメラーゼを用いてin v
itroで調製した。このin vitro転写物を0.2 mg/mlの最終濃度で水中に懸濁した 。成熟雌カエルから卵巣葉(ovarian lobes) を摘出し、卵胞を取り除いた（defo
lliculated）第V期の卵母細胞を得、ドルモンド（Drummond）マイクロインジェ クション装置を使って50 nlボーラスでRNA転写物（卵母細胞につき10 ng)を注入
した。２個の電極電圧クランプ（Warner Instruments）を用いて、個々のツメガ
エル卵母細胞からの電流を測定した。Ca2+不含のBarth培地中で室温にて記録し た。

【０２０３】 2.ミクロフィジオメトリックアッセイ これらのバンクのスクリーニングは、ミクロフィジオメーター(例えばMolecul
ar Devices Ltd.より市販されている)を使用して実施する。例えば、第二メッセ
ンジャー系を活性化すると、細胞から少量の酸が排出される。この酸は主に細胞
内シグナル伝達プロセスを刺激（fuel）するのに必要とされる代謝活性の増強の
結果として生成される。この細胞の周辺培地のｐＨ変化はごくわずかであるが、
ミクロフィジオメーターにより検出可能である。かくして、細胞内シグナル伝達
経路を利用するエネルギーと共役する受容体（例えば、任意のＧタンパク質共役
受容体）の活性化を検出することが可能である。

【０２０４】 3.カルシウムアッセイ ＨＥＫ293 細胞において安定に発現された受容体は、適切なランク順序（rank
order）および効力でもってアゴニストに対して強力なカルシウム応答を示し得
る。受容体−トランスフェクト細胞またはベクター対照細胞におけるＨＥＫ293
細胞での基底カルシウムレベルは、正常な100 nM〜200 nMの範囲である。組換え
受容体を発現しているＨＥＫ293 細胞にfura 2を添加し、一日で150を超える選 択したリガンドをアゴニスト誘導カルシウム動員に関して評価した。カルシウム
の一過性動員を示すアゴニストをベクター対照細胞において試験し、そのカルシ
ウム応答がトランスフェクト受容体細胞に固有なものであるかを調べた。固有の
アゴニスト誘導応答が同定される場合は、該応答を、別の群の細胞において再現
させ、次いで有効なリガンドおよび関連のあるリガンドに関しての濃度応答曲線
で薬理学的に特徴づけした。

【０２０５】実施例2：ノーザンブロット分析 ： 使用したノーザンブロットはClontech社より購入した。転写物のサイズは約2.
4kbで、転写物バンドは全脳、扁桃、尾状核、脳梁、海馬、黒質、視床下核、視 床、心臓および肝臓において観察された。逆に、ノーザンブロット分析によって
は、次の組織、すなわち胎盤、肺、骨格筋、腎臓および膵臓では転写物バンドは
検出されなかった。

【０２０６】実施例3 ： 11cbスプライス変異体で一過性にトランスフェクトされたHEK293細胞は、強力
なカルシウム動員応答を伴って、H-Asp-Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-
Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val-OH（配列番号7）のアミノ酸配列を有す る19アミノ酸ペプチドのメラニン濃縮ホルモン（MCH）に応答した。かくして今 回、MCHは11cbスプライス変異体のリガンドであることが判明した。MCHは脊椎動
物の脳中に存在するペプチドで、魚においては色素細胞アゴニストとして機能し
、メラノサイト増殖およびメラニン合成を制御している。哺乳類においては、飲
食行動の視床下部調節に関与している（be envolved in）と考えられている（Qu
, Dら、Nature 1996, 380:243-7）。MCHはob/obマウスにおいて過剰発現され、 絶食は正常および肥満マウスの両方においてMCH mRNAの発現をさらに増大させた
。MCHをラットの側脳室に注入すると、食物の消費が増加するという結果となる 。他の研究においては、MCHを脳室内注入すると、摂食が阻害されることが示さ れた（Presse, Fら、Neuroscience 1996 71:735-45）。

【０２０７】 本明細書中に引用された、特許および特許出願明細書を含むがこれに限定され
ない全ての刊行物は、あたかも個々の各刊行物が明確にかつ個々に示されている
かのように、その全体を参考としてここに組み入れるものとする。

【０２０８】 上記の説明は、好ましい実施形態を含めて本発明を完全に開示している。本明
細書に特に開示されている実施形態の改変および改良は、以下のクレームの範囲
内である。さらに労力を使うことなく、当業者は、これまでの説明を使い、本発
明を最大限に利用可能であると確信する。故に、本明細書において提供された実
施例は、単に例示的なものとして解されるべきであり、いかなる様式においても
本発明の範囲を制限するものではない。独占的な所有権または特権が請求される
本発明の実施形態は、特許請求の範囲において定義される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１ａおよび１ｂはヒト11ｃｂスプライス変異体のヌクレオチド配列(配列番 号１)および推定アミノ酸配列(配列番号２)を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｈ０４５ 31/00 Ｃ０７Ｈ 21/02 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｈ 21/02 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ９０／０６０，５０４ (32)優先日 平成10年４月15日(1998．4．15) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ (72)発明者 サラウ，ヘンリー，エム． アメリカ合衆国 19438 ペンシルベニア 州，ハーレイスヴィル，メープル アベニ ュー348 (72)発明者 フォーリー，ジェームス，ジェイ． アメリカ合衆国 19087 ペンシルベニア 州，ラッドノア，ティモシー サークル 117 (72)発明者 バーグスマ，デルク アメリカ合衆国 19312 ペンシルベニア 州，バーウィン，アイリッシュ ロード 271 (72)発明者 エリス，キャサリーン，イー． アメリカ合衆国 08028 ニュージャージ ー州，グラスボーロ，フォーダム プレイ ス 831 (72)発明者 チャンバース，ジョン，ケー． イギリス国 ケンブリッジ，ハスリンフィ ールド，バッドコック ロード 32 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG20 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 4C057 BB02 DD01 MM02 MM09 4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 CA53 DC50 NA14 ZA022 ZA122 ZA182 ZA362 ZA422 ZA662 ZA812 ZA972 ZB132 ZB312 ZB332 ZB352 ZC552 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 DA01 EA20 FA74

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次のポリヌクレオチド： (a) 配列番号２のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
   に対して少なくとも91％同一であるポリヌクレオチド、 (b) 遺伝子コードの縮重のため、配列番号２のアミノ酸と同じアミノ酸をコー
   ドするポリヌクレオチド、 (c) (a)または(b)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および (d) (a)、(b)または(c)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続した塩基 を含むポリヌクレオチド、 からなる群より選択されるメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項1記載のポリヌク
   レオチド。
3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項1記載のポリヌク
   レオチド。
4. 【請求項４】 配列番号１に示されるポリヌクレオチドを含む、請求項２記
   載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号２のアミノ酸を含むポリペプチドをコードする、請
   求項２記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項２記載のDNAを含有するベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載のベクターを含有する宿主細胞。
8. 【請求項８】 11cbスプライス変異体ポリペプチドを発現させるのに十分な
   培地および条件下で請求項７記載の宿主細胞を培養し、発現されたポリペプチド
   を回収することを含んでなる、11cbスプライス変異体ポリペプチドの産生方法。
9. 【請求項９】 請求項６記載のベクターを用いて宿主細胞を形質転換または
   トランスフェクションして、該宿主細胞が適当な培養条件下で該ベクター中に含
   まれるDNAによりコードされる11cbスプライス変異体ポリペプチドを発現するよ うにすることを含んでなる、11cbスプライス変異体ポリペプチドを発現する細胞
   の作製方法。
10. 【請求項１０】 配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも91％同一であるア
    ミノ酸配列を含んでなるポリペプチド。
11. 【請求項１１】 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプ
    チド。
12. 【請求項１２】 請求項１０記載のポリペプチドに対するアゴニスト。
13. 【請求項１３】 請求項１０記載のポリペプチドに対する抗体。
14. 【請求項１４】 請求項１０記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト。
15. 【請求項１５】 治療に有効な量の請求項１０記載のポリペプチドを患者に
    投与することからなる、11cbスプライス変異体を必要とする患者の治療方法。
16. 【請求項１６】 治療に有効な量のポリペプチドが、該ポリペプチドをコー
    ドしかつ該ポリペプチドをin vivoで発現するDNAを患者に供することにより投与
    される、請求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 治療に有効な量の請求項１４記載のアンタゴニストを患者
    に投与することからなる、11cbスプライス変異体ポリペプチドを阻害する必要の
    ある患者の治療方法。
18. 【請求項１８】 請求項１０記載のポリペプチドの発現と関連した疾病また
    は該疾病への罹りやすさの診断方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸
    配列中の突然変異を調べることを含む方法。
19. 【請求項１９】 宿主由来のサンプル中に請求項１１記載のポリペプチドが
    存在するか否かを分析することを含む診断方法。
20. 【請求項２０】 請求項１０記載のポリペプチドのアゴニストまたはアンタ
    ゴニストの同定方法であって、 細胞の表面に該ポリペプチドを発現している細胞と、スクリーニングすべき化
    合物とを、該ポリペプチドへの該化合物の結合を可能にする条件下で接触させる
    こと、ただし、該ポリペプチドは該ポリペプチドへの該化合物の結合に応答して
    検出可能なシグナルを発生しうる第2成分と結合しているものであること、およ び 該化合物が該ポリペプチドに結合して該ポリペプチドを活性化するのかまたは
    阻害するのかを、該化合物と該ポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルの
    レベルを測定することにより調べること、 を含んでなる方法。
21. 【請求項２１】 標識したまたは未標識のMCHの存在下でアゴニストまたは アンタゴニストの同定を行うことをさらに含む、請求項２０記載の方法。
22. 【請求項２２】 請求項１０記載のポリペプチドのアゴニストまたはアンタ
    ゴニストの同定方法であって、 候補化合物の存在下で、該ポリペプチドへの結合を可能にする条件下に、細胞
    表面に該ポリペプチドを有する細胞または該ポリペプチドを含む細胞膜へのリガ
    ンドの結合の阻害を調べること、および 該ポリペプチドに結合した該リガンドの量を測定し、その結果、該リガンドの
    結合を低下させることができる化合物がアゴニストまたはアンタゴニストである
    こと、 を含んでなる方法。
23. 【請求項２３】 前記リガンドが標識したまたは未標識のMCHである、請求 項２２記載の方法。