DE69935159T2

DE69935159T2 - Screening-verfahren

Info

Publication number: DE69935159T2
Application number: DE69935159T
Authority: DE
Inventors: Masaaki Takeda Kasuga Haitsu 702 Mori; Yukio Takeda Yakuhin Matsushiro Shimomura; Shiro Umezono Square B-305 Takekawa; Tsukasa Technotown Tsukuba 301 SUGO; Yoshihiro Ishibashi; Chieko Kitada; Nobuhiro Suzuki
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-12-28
Filing date: 1999-12-27
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2019-12-28
Also published as: EP1143000A4; WO2000040725A1; CN1344321A; DE69935159D1; EP1143000A1; US6991908B1; EP1143000B1; CA2356412A1; AU1802000A; ATE354098T1; KR20020008111A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening eines Antifettsuchtmittels, eines Appetitmodulators oder dgl., das gekennzeichnet ist durch Verwendung von SLC-1 (FEBS Letters 398 (1996), 253–258 etc.), das ein Orphan-Rezeptorprotein oder ein Salz davon ist und von MCH (Melanin konzentrierendes Hormon (Endocrinology, Bd. 125, 1660–1665 (1989), etc.) oder ein Derivat oder Salz davon.
Hintergrund und Stand der Technik
Menschliches SLC-1, das im Humangenom gefunden wurde (FEBS Letters 398 (1996), 253–258) und Ratten-SLC-1, das in einer Rattengehirn-cDNA-Bibliothek gefunden wurde (Biochimica et Biophysica Acta, 140] (1998), 216–220) werden allgemein als G-Protein-gekuppelte Rezeptoren oder Sieben-Transmembranrezeptoren bezeichnet. Sie gehören zu den vielen G-Protein-gekuppelten Rezeptorproteinen, die Orphan-Rezeptoren genannt werden, da ihre Liganden unbekannt sind.
Zur Bestimmung von Liganden dieser Orphan-G-Protein-gekuppelten Rezeptorproteine gab es kein anderes allgemeines Mittel außer dem, Liganden aufgrund ihrer Ähnlichkeit in den Primärstrukturen dieser G-Proteingekuppelten Rezeptorproteine vorherzusagen. Viele G-Protein-gekuppelte Orphan-Rezeptorproteine haben jedoch eine geringe Homologie zu bekannten Rezeptoren. Tatsächlich war es schwierig, die Liganden nur aus der Ähnlichkeit in ihren Primärstrukturen vorherzusagen, außer dass sie Rezeptorunterarten bekannter Liganden waren. Da andererseits viele G-Protein-gekuppelte Orphan-Rezeptorproteine durch Genanalyse gefunden wurden, wird vorhergesagt, dass es immer noch viele weitere unbekannte Liganden gibt, die diesen Proteinen entsprechen. Bis heute wurden jedoch nur wenige Liganden für diese G-Protein-gekuppelten Orphan-Rezeptoren identifiziert. Im Hinblick auf SLC-1 wurde auch noch nicht berichtet, ob ein Ligand hierfür existiert.
Liganden für SLC-1-Orphan-Rezeptorprotein zu untersuchen und ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung zu etablieren etc., das durch Verwendung von SLC-1 und seinen Liganden gekennzeichnet ist, waren daher die zu lösenden Probleme.
Offenbarung der Erfindung
Unter Verwendung von Zellen, die SLC-1 codierende cDNA exprimieren mit geeigneten Mitteln waren die Erfinder der vorliegenden Erfindung erfolgreich darin, ein Polypeptid zu screenen, das von dem Rezeptorprotein als Ligand erkannt wird, indem eine spezifische zellstimulierende (Signaltransduktion) Aktivität etc. als ein Hinweis getestet wurde, und sie haben gefunden, dass das Polypeptid MCH (Melanin konzentrierendes Hormon) ist.
Weiterhin haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass eine Verbindung, die die Bindungseigenschaft zwischen dem Aktivator MCH oder seinem Salz und dem SLC-1 oder seinem Salz, wie oben beschrieben, verändern kann, gescreent werden kann.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben auch gefunden, dass die Aminosäuresequenz von Human-SLC-1 der vorliegenden Erfindung eine neue Sequenz ist, die sich von der Aminosäuresequenz, über die bereits berichtet wurde (FEBS Letters, 398 (1996), 253–258, WO 96/18651), unterscheidet.
Das bedeutet, die vorliegende Erfindung liefert die folgenden Merkmale.

(1) Ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes, die/das die Bindungseigenschaft zwischen einem Melanin konzentrierenden Hormon (MCH) oder einem Salz davon und SLC-1 oder einem Salz davon verändert, das die Verwendung von MCH oder einem Derivat oder einem Salz davon und von SLC-1 oder einem Salz davon umfasst.
(2) Einen Kit zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes, die/das die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und SLC-1 oder einem Salz davon verändert, der MCH oder dessen Derivat oder ein Salz davon und SLC-1 oder ein Salz davon enthält.
(6) Ein Protein, das die in SEQ ID Nr. 11 dargestellte Aminosäuresequenz enthält, oder ein Salz davon.
(7) Eine DNA, die eine DNA enthält, die eine Basensequenz enthält, die das Protein gemäß (6) codiert.
(8) Ein Screening-Verfahren gemäß (1) oder ein Screening-Kit gemäß (2), wobei das MCH ein Peptid ist, das die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz enthält, wie die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz.
(9) Ein Screening-Verfahren gemäß (1) oder ein Screening-Kit gemäß (2), wobei das Derivat ein Peptid ist, das eine Teilsequenz der Reste 5 bis 19 vom N-Ende der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz enthält.
(10) Ein Screening-Verfahren gemäß (1) oder ein Screening-Kit gemäß (2), wobei das Derivat ein mit einem Bolton-Hunter-Reagenz derivatisiertes MCH oder ein mit einem Bolton-Hunter-Reagenz derivatisiertes Peptid ist, das eine Teilsequenz der Reste 5 bis 19 vom N-Ende der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz ist.
(11) MCH, das mit einem Bolton-Hunter-Reagenz derivatisiert wurde, oder ein Peptid, das mit einem Bolton-Hunter-Reagenz derivatisiert wurde, das eine Teilsequenz der Reste 5 bis 19 vom N-Ende der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz enthält oder ein Salz davon.
(12) Eine Verbindung der Formel
oder ein Salz davon. Spezifisch schließt das erfindungsgemäß verwendete SLC-1 das oben beschriebene bekannte SLC-1 oder ein Salz davon ein ebenso wie die folgenden Verbindungen.
(13) SLC-1, das die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz enthält, wie die in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 dargestellte Aminosäuresequenz, oder ein Salz davon.
(14) SLC-1 oder ein Salz gemäß (13), das ein Protein ist, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 gezeigt wird, enthält, wovon 1 bis 30, bevorzugt 1 bis 10 Aminosäuren deletiert sind, die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 gezeigt ist, der (oder in die) 1 bis 30, bevorzugt 1 bis 10 Aminosäuren zugefügt wurden (oder insertiert wurden); oder die die in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 gezeigte Aminosäuresequenz, in der 1 bis 30, bevorzugt 1 bis 10 Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt wurden. Spezifisch schließt das MCH der vorliegenden Erfindung das oben beschriebene bekannte MCH oder ein Salz davon ein ebenso wie die folgenden Verbindungen.
(15) Ein MCH, das die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz enthält, wie die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder ein Derivat oder ein Salz davon.
(16) Ein MCH oder dessen Derivat oder ein Salz davon gemäß (15), wobei das Protein ein Peptid ist, das die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz enthält, von der 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 5 Aminosäuren deletiert sind, die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, der (oder in die) 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 5 Aminosäuren zugefügt wurden (oder insertiert wurden); oder die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, bei der 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 5 Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt wurden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Ergebnisse, die erhalten wurden, indem eine die cAMP-Synthese hemmende Aktivität, die für CHO/SLC-1-Zellen spezifisch ist, an den aus Rattengehirn präparierten HPLC-Fraktionen getestet wurde.
2 zeigt das Verhalten der aus Rattengehirn stammenden HPLC-Fraktion #34 in Referenzbeispiel 1 auf die die cAMP-Synthese hemmende Aktivität, wenn mit Pronase behandelt wurde.
3 zeigt Ergebnisse, die erhalten wurden, als die CHO/SLC-1-zellspezifische cAMP-Synthese hemmende Aktivität an einer über eine ODS-Säule gereinigte Fraktion (Develosil ODS-UG-3) in Referenzbeispiel 3 untersucht wurde.
4 zeigt einen Vergleich der Menge an Genexpression durch in-situ-Hybridisierung bei der Ratten-SLC-1-Genexpressions-CHO-Zelllinie.
5 zeigt eine die cAMP-Synthese hemmende Aktivität von MCH in verschiedenen Konzentrationen auf CHO-SLC-1-Zellen.
6 zeigt eine Arachidonsäuremetaboliten freisetzende Aktivität von MCH in verschiedenen Konzentrationen auf CHO/SLC-1-Zellen.
7 zeigt Ergebnisse, die erhalten wurden, indem eine Agonistaktivität von MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) und MCH(7-19) untersucht wurde unter Verwendung eines GTPγS-Bindungsassays.
8 zeigt Ergebnisse, die erhalten wurden, indem eine Agonistaktivität von MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) und MCH(5-19) untersucht wurde, die mit einem nicht-isotopenhaltigen Bolton-Hunter-Reagenz derivatisiert waren, unter Verwendung eines GTPγS-Bindungsassays.
9 zeigt die spezifische Bindung von [¹²⁵I]-markiertem MCH(4-19), das unter Verwendung eines Bolton-Hunter-Reagenzes hergestellt wurde, an eine Zellmembranfraktion, die aus Human-SLC-1-Expressions-CHO-Zellen hergestellt wurde.
10 zeigt eine bindungshemmende Aktivität von MCH gegenüber [¹²⁵I]-markiertem MCH(4-19), das unter Verwendung eines Bolton-Hunter-Reagenzes hergestellt wurde.
Beste Ausführungsform der Erfindung
In der vorliegenden Beschreibung wird der Ausdruck "im Wesentlichen gleich" so verwendet, dass er bedeutet, dass die Aktivitäten von Polypeptiden etc., z.B. die Bindungseigenschaft zwischen einem Liganden (MCH) und einem Rezeptor (SLC-1), physikalische Aktivitäten etc. im Wesentlichen gleich sind.
Verfahren zur Herstellung von SLC-1 oder seinen Salzen (im Folgenden manchmal insgesamt als SLC-1 bezeichnet) und von MCH oder seinen Derivaten oder Salzen davon (im Folgenden manchmal insgesamt als MCH bezeichnet), die erfindungsgemäß angewendet werden, werden unten genauer beschrieben.
Erfindungsgemäß angewendetes SLC-1 und MCH kann irgendein Polypeptid sein, das aus irgendwelchen Geweben stammt (z.B. Hypophyse, Pankreas, Gehirn, Niere, Leber, Geschlechtsdrüsen, Schilddrüse, Gallenblase, Rückenmark, Nebennieren, Haut, Muskel, Lunge, Verdauungstrakt, Blutgefäß, Herz etc.) oder Zellen etc. von menschlichen oder anderen warmblütigen Tieren (z.B. Meerschweinchen, Ratte, Maus, Schwein, Schaf, Rind, Affe etc.) und Fisch etc., in denen SLC-1 irgendein Polypeptid sein kann, das die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz enthält, wie die in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 gezeigte Aminosäuresequenz, und MCH irgendein Polypeptid sein kann, das die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz enthält, wie die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz. Beispiele für das SLC-1 der vorliegenden Erfindung schließen zusätzlich zu dem Polypeptid oder dgl., das die in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 gezeigte Aminosäuresequenz enthält, ein Polypeptid oder dgl. ein, das eine Aktivität hat, die im Wesentlichen äquivalent ist dem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 gezeigt wird, enthält. Beispiele für die im Wesentlichen äquivalente Aktivität schließen eine Liganden bindende Aktivität, eine Signalübertragungsaktivität und dgl. ein. Der Ausdruck "im Wesentlichen äquivalent" bedeutet, dass die Art der Ligandenbindungsaktivität etc. äquivalent ist. Unterschiede im Ausmaß, z.B. der Grad der Ligandenbindungsaktivität, und quantitative Faktoren, wie Molekulargewicht des Polypeptids, können vorhanden und zulässig sein. Beispiele für das MCH der vorliegenden Erfindung schließen zusätzlich zu dem Polypeptid, das die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz enthält, ein Polypeptid ein, das eine Aktivität hat, die im Wesentlichen äquivalent ist zu dem Polypeptid, das die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz enthält. Beispiele für die im Wesentlichen äquivalente Aktivität schließen eine Rezeptorbindungsaktivität und dgl. ein. Der Ausdruck "im Wesentlichen äquivalent" wird so verwendet, dass er bedeutet, dass die Art der Rezeptorbindungsaktivität etc. äquivalent ist. Daher können Unterschiede im Ausmaß, z.B. dem Grad der Rezeptorbindungsaktivität und in quantitativen Faktoren, wie Molekulargewicht des Polypeptids, vorhanden und zulässig sein.
In der vorliegenden Beschreibung werden SLC-1 und MCH dargestellt, wie es zur Beschreibung von Peptiden üblich ist, d.h. das N-Ende (Aminoende) links und das C-Ende (Carboxylende) rechts. Z.B. ist bei Polypeptiden, die die in SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 gezeigte Aminosäuresequenz enthalten, das C-Ende gewöhnlich in Form einer Carboxylgruppe (-COOH) oder eines Carboxylats (-COO^–), es kann aber auch in Form eines Amids (-CONH₂) oder eines Esters (-COOR) sein. Beispiele der durch R gezeigten Estergruppe schließen eine C₁-C₆-Alkylgruppe, z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl etc.; eine C₃-C₈-Cycloalkylgruppe, wie Cyclopentyl, Cyclohexyl etc.; eine C₆-C₁₂-Arylgruppe, z.B. Phenyl, α-Naphthyl etc.; eine Phenyl-C₁-C₂-alkylgruppe, z.B. Benzyl, Phenethyl, Benzhydryl etc.; eine C₁-C₁₄-Aralkylgruppe, wie α-Naphthyl- C₁-C₂-alkylgruppe, z.B. α-Naphthylmethyl etc. und dgl. ein. Außerdem können Pivaloyloxymethyl oder dgl., die häufig als Ester für die orale Verabreichung verwendet werden, auch eingesetzt werden.
SLC-1 und MCH der vorliegenden Erfindung können in Form von Salzen mit physiologisch annehmbaren Basen (z.B. Alkalimetallen) oder Säuren (z.B. anorganischen Säuren oder organischen Säuren), bevorzugt in Form von physiologisch annehmbaren Säureadditionssalzen verwendet werden. Beispiele für solche Salze sind Salze mit anorganischen Säuren (z.B. Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure), Salze mit organischen Säuren (z.B. Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Citronensäure, Äpfelsäure, Oxasäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure) und dgl.
Erfindungsgemäß verwendetes SLC-1 und MCH können mit modifizierten Methoden von öffentlich bekannten Methoden hergestellt werden (z.B. solche, wie in FEBS Letters, 398 (1996), 253–258, WO 96/18651 beschrieben, d.h. Methoden, die verwendet werden, um Polypeptide aus Geweben oder Zellen von Menschen oder anderen warmblütigen Tieren zu reinigen. Alternativ können SLC-1 und MCH auch hergestellt werden mit Modifikationen der Methoden zur Synthese von Proteinen (Peptiden), die im Folgenden beschrieben werden. Weiterhin können SLC-1 und MCH hergestellt werden, indem ein Transformant, der eine das Protein (Peptid) codierende DNA enthält, gezüchtet wird, was auch später beschrieben wird.
Wenn SLC-1 und MCH aus Geweben oder Zellen von Menschen, anderen warmblütigen Tieren, Fisch etc. hergestellt werden, werden die Gewebe oder Zellen von Menschen, anderen warmblütigen Tieren oder Fisch etc. homogenisiert. Das Homogenisat wird dann mit einer Säure, einem organischen Lösungsmittel oder dgl. extrahiert. Der Extrakt wird gereinigt und aufgetrennt durch Aussalzen, Dialyse, Gelfiltration oder eine Kombination von Chromatographietechniken, z.B. Reverse-Phase-Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie etc.
Wie oben beschrieben, können erfindungsgemäß verwendetes SLC-1 und MCH mit allgemein bekannten Methoden zur Synthese von Proteinen (Peptiden) hergestellt werden oder, indem Proteine (Peptide), die SLC-1 und/oder MCH enthalten, mit einer geeigneten Peptidase gespalten werden. Zur Synthese von Proteinen (Peptiden) kann z.B. entweder Festphasensynthese oder Flüssigphasensynthese verwendet werden. D.h. ein Teilpeptid oder Aminosäuren, die das SLC-1 und/oder MCH bilden können, werden mit dem verbleibenden Teil kondensiert. Wenn das Produkt Schutzgruppen enthält, kann das gewünschte Protein (Peptid) erhalten werden, indem die Schutzgruppen entfernt werden. Die allgemein bekannten Methoden zur Kondensation und solche zur Entfernung von Schutzgruppen schließen die in 1) bis 5) unten beschriebenen ein.

1) M. Bodanszky & M.A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
2) Schroeder & Luebke: The Peptide, Academic Press, New York (1965)
3) Nobuo Izumiya et al.: Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken (Basics and experiments of peptide synthesis), veröffentlicht von Maruzen Co. (1975)
4) Haruaki Yajima & Shunpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experiment) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins) IV, 205 (1977)
5) Haruaki Yajima Herausgeber: Zoku Iyakuhin no Kaihatsu (A sequel to Development of Pharmaceuticals), Bd. 14, Peptide Synthesis, veröffentlicht von Hirokawa Shoten

Nach Abschluss der Reaktion kann das Protein (Peptid) durch eine Kombination üblicher Reinigungsmethoden, wie Lösungsmittelextraktion, Destillation, Säulenchromatographie, Flüssigchromatographie, Umkristallisation etc. gereinigt und isoliert werden. Wenn das mit den obigen Methoden erhaltene Protein (Peptid) in freier Form ist, kann das Protein (Peptid) in ein geeignetes Salz mit bereits bekannten Methoden umgewandelt werden; wenn das Protein (Peptid) in Salzform erhalten wird, kann es in eine freie Form mit allgemein bekannten Methoden umgewandelt werden.
Um die Amide von SLC-1 und MCH zu synthetisieren, können im Handel erhältliche Harze, die geeigneterweise für die Amidbildung verwendet werden, eingesetzt werden. Beispiele für solche Harze schließen Chlormethylharz, Hydroxymethylharz, Benzhydrylaminharz, Aminomethylharz, 4-Benzyloxybenzylalkoholharz, 4-Methylbenzhydrylaminharz, PAM-Harz, 4-Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethylharz, Polyacrylamidharz, 4-(2',4'-Dimethoxyphenylhydroxymethyl)phenoxyharz, 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminoethyl)phenoxyharz etc. ein. Bei Verwendung dieser Harze werden Aminosäuren, bei denen die α-Aminogruppen und funktionellen Gruppen an den Seitenketten in geeigneter Weise geschützt sind, an dem Harz kondensiert gemäß der Reihenfolge der Sequenz des jeweiligen Peptids, mit verschiedenen Kondensationsmethoden, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind. Am Ende der Reaktion wird das Protein (Peptid) von dem Harz geschnitten und gleichzeitig werden die verschiedenen Schutzgruppen entfernt. Dann wird, falls notwendig, eine intramolekulare Disulfidbindungen bildende Reaktion in hochverdünnter Lösung durchgeführt, um das jeweilige Protein (Peptid) zu erhalten.
Zur Kondensation der oben beschriebenen geschützten Aminosäuren kann eine Vielzahl von aktivierenden Reagenzien, die für Proteinsynthesen (Peptidsynthesen) verwendet werden können, auch eingesetzt werden. Insbesondere werden bevorzugt Carbodiimide angewendet. Beispiele für solche Carbodiimide schließen DCC, N,N'-Diisopropylcarbodiimid, N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid etc. ein. Zur Aktivierung mit diesen Reagenzien werden die geschützten Aminosäuren in Kombination mit einem die Racemisierung hemmenden Mittel (z.B. HOBt, HOOBt etc.) direkt dem Harz zugefügt oder die geschützten Aminosäuren werden vorher aktiviert zu den entsprechenden symmetrischen Säureanhydriden, HOBt-Estern oder HOOBt-Estern und anschließend werden die so aktivierten geschützten Aminosäuren dem Harz zugefügt. Lösungsmittel, die geeigneterweise verwendet werden, um die geschützten Aminosäuren zu aktivieren oder mit dem Harz zu kondensieren, können in geeigneter Weise ausgewählt werden aus Lösungsmitteln, von denen bekannt ist, dass sie für Kondensationsreaktionen von Proteinen (Peptiden) nützlich sind. Beispiele für solche Lösungsmittel schließen Säureamide, wie N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon etc.; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform etc.; Alkohole, wie Trifluorethanol etc., Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid etc.; tertiäre Amine, wie Pyridin etc.; Ether, wie Dioxan, Tetrahydrofuran etc.; Nitrile, wie Acetonitril, Propionitril etc.; Ester, wie Methylacetat, Ethylacetat etc. und geeignete Mischungen dieser Lösungsmittel ein. Die Reaktionstemperatur wird in geeigneter Weise ausgewählt aus dem Bereich, wie er für peptidbindungsbildende Reaktionen angewendet wird und wird gewöhnlich ausgewählt aus dem Bereich von ungefähr –20 bis 50°C. die aktivierten Aminosäurederivate werden allgemein in einem 1,5- bis 4-fachen Überschuss verwendet. Die Kondensation wird getestet unter Verwendung der Ninhydrinreaktion; wenn der Test anzeigt, dass die Kondensation unzureichend ist, kann die Kondensation abgeschlossen werden, indem die Kondensationsreaktion wiederholt wird ohne Entfernung der Schutzgruppen. Wenn die Kondensation immer noch unzureichend ist auch nach Wiederholen der Reaktion, werden nicht umgesetzte Aminosäuren mit Essigsäureanhydrid oder Acetylimidazol acetyliert, um jegliche negative Wirkung auf die nachfolgende Reaktion zu vermeiden.
Beispiele für Schutzgruppen, die verwendet werden, um die Ausgangsaminosäuren zu schützen, schließen Z, Boc, t-Pentyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, Formyl, 2-Nitrophenylsulfenyl, Diphenylphosphinothioyl, Fmoc etc. ein. Beispiele für die Schutzgruppe R für eine Carboxylgruppe schließen zusätzlich zu den Beispielen für die C₁-C₆-Alkylgruppe, C₃-C₈-Cycloalkylgruppe und C₇-C₁₄-Aralkylgruppe, die oben beschrieben wurden, 2-Adamantyl, 4-Nitrobenzyl, 4-Methoxybenzyl, 4-Chlorbenzyl, Phenacyl und Benzyloxycarbonylhydrazid, t-Butoxycarbonylhydrazid, Tritylhydrazid und dgl. ein.
Die Hydroxylgruppe von Serin und Threonin kann z.B. durch Veresterung oder Veretherung geschützt werden. Beispiele für Gruppen, die in geeigneter Weise zur Veresterung verwendet werden, schließen eine Niedrigalkanoylgruppe, wie Acetyl etc., eine Aroylgruppe, wie eine Benzoylgruppe, und eine Gruppe, die von Kohlenstoff abstammt, wie Benzyloxycarbonylgruppe und Ethoxycarbonylgruppe ein. Beispiele für Gruppen, die in geeigneter Weise zur Veretherung verwendet werden, schließen die Benzylgruppe, Tetrahydropyranylgruppe, t-Butylgruppe etc. ein.
Beispiele für Gruppen zum Schutz der phenolischen Hydroxylgruppe von Tyrosin schließen Bzl, Cl₂-Bzl, 2-Nitrobenzyl, Br-Z, t-Butyl etc. ein.
Beispiele für Gruppen, die verwendet werden, um den Imidazolanteil von Histidin zu schützen, schließen Tos, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl, DNP, Benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc etc. ein.
Beispiele der aktivierten Carboxylgruppen in den Ausgangsmaterialien schließen die entsprechenden Säureanhydride, Azide, aktivierten Ester [Ester mit Alkoholen (z.B. Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanomethylalkohol, p-Nitrophenol, HONB, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid, HOBt)] ein. Als aktivierte Aminogruppen im Ausgangsmaterial werden die entsprechenden Phosphorsäureamide angewendet.
Um die Schutzgruppen zu entfernen (abzuspalten), werden katalytische Hydrierung in einem Wasserstoffgasstrom in Gegenwart eines Katalysators, wie Pd-Ruß oder Pd-Kohlenstoff; eine Behandlung mit einer Säure, z.B. wasserfreiem Fluorwasserstoff, Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure, Trifluoressigsäure, einer Mischung davon etc.; eine Behandlung mit einer Base, z.B. Diisopropylethylamin, Triethylamin, Piperidin, Piperazin etc.; Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak und dgl. angewendet. Die Eliminierung der Schutzgruppen durch Säurebehandlung, wie oben beschrieben, wird im Allgemeinen bei einer Temperatur von ungefähr –20 bis 40°C durchgeführt. Bei der Säurebehandlung ist die Zugabe eines Kationenfängers, wie Anisol, Phenol, Thioanisol, m-Kresol, p-Kresol, Dimethylsulfid, 1,4-Butandithiol, 1,2-Ethandithiol oder dgl. wirksam. Auch wird die 2,4-Dinitrophenylgruppe, die zum Schutz des Imidazols von Histidin verwendet wird, durch Behandlung mit Thiophenol entfernt. Die Formylgruppe, die zum Schutz der Indolschutzgruppe von Trypthophan verwendet wird, wird mit der vorher erwähnten Säurebehandlung in Gegenwart von 1,2-Ethandithiol oder 1,4-Butandithiol entfernt ebenso wie durch Behandlung mit einem Alkali, wie verdünnter Natriumhydroxidlösung, verdünntem Ammoniak etc.
Allgemein bekannte Gruppen und Mittel können in geeigneter Weise ausgewählt werden zum Schutz einer funktionellen Gruppe, die nicht an der Reaktion des Ausgangsmaterials und seiner Schutzgruppe teilnehmen sollte ebenso wie zur Entfernung der Schutzgruppe, Aktivierung einer funktionellen Gruppe, die an der Reaktion teilnimmt und dgl.
Bei einer weiteren Methode, um die Amide von SLC-1 und MCH zu erhalten, wird zuerst die α-Carboxylgruppe der carboxyterminalen Aminosäure amidiert; die Peptidkette wird dann hin zu der Aminogruppenseite auf die gewünschte Kettenlänge verlängert. Dann wird nur die Schutzgruppe der N-terminalen α-Aminogruppe des entstehenden Peptids entfernt, um ein Protein zu erhalten. In gleicher Weise wird ein weiteres Peptid (oder eine Aminosäure) hergestellt, indem nur die Schutzgruppe der C-terminalen Carboxylgruppe entfernt wird. Die beiden Peptide werden miteinander in einer Lösungsmittelmischung, wie oben beschrieben, kondensiert. Die Details der Kondensationsreaktion sind die gleichen, wie oben beschrieben. Nachdem das durch Kondensation erhaltene geschützte Peptid gereinigt worden ist, werden alle Schutzgruppen mit den oben beschriebenen Methoden entfernt, was das gewünschte rohe Protein (Peptid) ergibt. Nach Reinigung des rohen Proteins (Peptids) mit verschiedenen bekannten Mitteln zur Reinigung wird die Hauptfraktion lyophilisiert, was das Amid des gewünschten Proteins (Peptids) ergibt.
Um die Ester von SLC-1 und MCH herzustellen, wird die α-Carboxylgruppe der carboxyterminalen Aminosäure mit dem gewünschten Alkohol kondensiert, um den Aminosäureester herzustellen, der dann auf gleiche Art und Weise behandelt wird, wie bei der Herstellung der Amide des Proteins (Peptids), was die Ester des gewünschten Proteins (Peptids) ergibt.
Das für die vorliegende Erfindung verwendete MCH-Derivat kann irgendein Peptid ➀ eines Teilpeptids von MCH, ➁ eines Peptids, bei dem MCH bildende Aminosäuren deletiert sind, andere Aminosäuren den MCH bildenden Aminosäuren zugefügt wurden oder die dieses bildende Aminosäuren durch andere Aminosäuren substituiert wurden oder ➂ MCH, das Teilpeptid, wie in ➀ beschrieben oder das in ➁ beschriebene Peptid, die markiert sind etc. sein, solange es an SLC-1 binden kann.
Spezifische Beispiele des Teilpeptids von MCH schließen ein Peptid ein, das eine Teilsequenz der Reste 5 bis 19 vom N-Ende der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz enthält oder dessen Amide oder Ester oder Salze davon. Genauer kann ein Teilpeptid ein Peptid sein, das die in SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 20, SEQ ID Nr. 21, SEQ ID Nr. 22, SEQ ID Nr. 23 oder SEQ ID Nr. 24 gezeigte Aminosäuresequenz enthält oder Amide oder Ester oder Salze davon.
Wenn das später beschriebene Screening unter Verwendung von SLC-1 durchgeführt wird, werden bevorzugt ein Peptid, das besonders bevorzugt die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 21 gezeigt ist, enthält, dessen Amide oder Ester, oder Salze davon verwendet.
Beispiele der Peptide, bei denen MCH aufbauende Aminosäuren deletiert sind, andere Aminosäuren den bildenden Aminosäuren zugefügt wurden oder bildende Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt wurden, schließen solche ein, wie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt, wobei mindestens eine oder zwei (bevorzugt etwa 1 bis etwa 10, bevorzugter mehrere (1 oder 2)) Aminosäuren deletiert sind; mindestens eine oder zwei (bevorzugt etwa 1 bis etwa 10, bevorzugter etwa 1 bis etwa 5 und am meisten bevorzugt mehrere (1 oder 2)) Aminosäuren der Aminosäuresequenz zugefügt wurden oder mindestens eine oder zwei (bevorzugt etwa 1 bis etwa 10, bevorzugter etwa 1 bis etwa 5 und am meisten bevorzugt mehrere (1 oder 2)) Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt wurden, und dgl. ein.
Im Wesentlichen die gleiche Substitution einer Aminosäure in der Aminosäuresequenz kann ausgewählt werden aus anderen Aminosäuren der Klasse, zu der die Aminosäure gehört. Beispiele für nichtpolare (hydrophobe) Aminosäuren schließen Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin und dgl. ein. Beispiele für polare (neutrale) Aminosäuren sind Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin und dgl. Beispiele für positiv geladene (basische) Aminosäuren sind Arginin, Lysin, Histidin und dgl. Beispiele für negativ geladene (saure) Aminosäuren schließen Asparaginsäure, Glutaminsäure und dgl. ein.
Der Ort, an dem die anderen Aminosäuren deletiert oder substituiert sind, wie oben beschrieben, ist jedoch bevorzugt ein anderer als Cys in den MCH bildenden Aminosäuren.
Als markierte Formen von MCH, dem in ➀ beschriebenen Peptid oder dem in ➁ beschriebenen Peptid, gibt es mit Isotopen markierte Formen, fluoreszenzmarkierte Formen (Fluoreszenzmarkierung z.B. mit Fluorescein), biotinylierte Formen, enzymmarkierte Formen etc., die mit bekannten Methoden durchgeführt werden.
Spezifisch kann MCH, das mit [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] etc. markiert ist, und mit bekannten Methoden hergestellt wurde, verwendet werden. Insbesondere können markierte Formen von MCH oder seinen Derivaten, die mit einer allgemein bekannten Methode unter Verwendung eines Bolton-Hunter-Reagenzes hergestellt wurden, ebenso verwendet werden.
Spezifische Beispiele der markierten Form des MCH oder seiner Derivate schließen die folgenden Verbindungen ein: (1) [¹²⁵I]-[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Asp¹]-MCH
(2) [¹²⁵I]-[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Phe²]-MCH (2-19)
(3) [¹²⁵I]-[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Asp³]-MCH (3-19)
(4) [¹²⁵I]-[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Met⁴]-MCH (4-19)
(5) [¹²⁵I]-[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Leu⁵]-MCH (5-19)
(6) [¹²⁵I]-[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Arg⁶]-MCH (6-19)
(7) [¹²⁵I]-[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Cys⁷]-MCH (7-19)
und dgl.
Von diesen wird insbesondere [¹²⁵I]-[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Met⁴]-MCH (4-19) bevorzugt angewendet.
Als Salze von MCH oder seinen Derivaten sind Beispiele die gleichen, wie die, die für die Salze von SLC-1 und MCH, wie oben beschrieben, angegeben wurden.
Die DNA, die das SLC-1, das erfindungsgemäß verwendet wird, codiert, kann irgendeine DNA sein, solange sie DNA enthält, die eine DNA mit einer Basensequenz enthält, die ein Protein codiert, das die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz enthält, wie in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 dargestellt. Die DNA, die das erfindungsgemäß verwendete MCH codiert, kann irgendeine DNA sein, solange sie eine DNA enthält, die eine DNA mit einer Basensequenz enthält, die ein Peptid codiert, das die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz enthält, wie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt. Auch kann die DNA irgendeine genomische DNA, genomische DNA-Bibliothek, aus Zellen oder Geweben, wie oben beschrieben, abgeleitete cDNA, eine cDNA-Bibliothek, die aus Zellen oder Geweben stammt, wie oben beschrieben, und synthetische DNA sein. Der für die Bibliothek verwendete Vektor kann irgendein Bakteriophage, Plasmid, Cosmid, Phagemid etc. sein. Außerdem kann die DNA direkt durch reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (im Folgenden abgekürzt als RT-PCR-Technologie) amplifiziert werden unter Verwendung einer RNA-Fraktion, die aus den oben beschriebenen Zellen oder Geweben präpariert wurde.
Genauer wird (1) eine DNA angewendet, die unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz, die eine DNA besitzt, die eine DNA enthält mit einer Basensequenz, die ein Protein oder Peptid codiert, das die gleiche oder im Wesentlichen gleiche Aminosäuresequenz enthält, wie die in SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 dargestellte Aminosäuresequenz hybridisieren kann, (2) eine DNA, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes nicht mit der Sequenz hybridisierbar ist, die eine DNA besitzt, die eine DNA enthält mit einer Basensequenz, die ein Protein oder Peptid codiert mit der gleichen oder im Wesentlichen gleichen Aminosäuresequenz, wie die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 dargestellt ist und mit der in (1) definierten Sequenz, aber ein Protein oder Peptid codiert mit der gleichen Aminosäuresequenz etc. Die Hybridisierung kann mit allgemein bekannten Methoden oder mit modifizierten bekannten Methoden durchgeführt werden. Die stringenten Bedingungen, die oben beschrieben wurden, sind z.B. die Bedingungen von 42°C, 50% Formamid, 4 × SSPE (1 × SSPE = 150 mM NaCl, 10 mM NaH₂PO₄·H₂O, 1 mM EDTA, pH 7,4), 5 × Denhardt's Lösung und 0,1% SDS.
Die DNA, die das SLC-1 oder MCH, das erfindungsgemäß verwendet wird, codiert, kann auch mit den folgenden gentechnischen Verfahren hergestellt werden.
Als Mittel zur Klonierung der DNA, die das SLC-1 oder MCH der vorliegenden Erfindung vollständig codiert, kann die jeweilige DNA entweder durch Amplifikation der DNA aus der DNA-Bibliothek etc., wie oben mit der allgemein bekannten PCR unter Verwendung eines synthetischen DNA-Primers, der eine Teilbasensequenz des SLC-1 oder MCH der vorliegenden Erfindung enthält, ausgewählt werden oder Hybridisierung der DNA, die in einen geeigneten Vektor insertiert wurde, z.B. mit einem markierten DNA-Fragment mit der gesamten Region der Basensequenz, die das SLC-1 oder MCH codiert oder einem Teil davon oder einer markierten synthetischen DNA. Die Hybridisierung kann z.B. mit der Methode durchgeführt werden, die in Molecular Cloning (2. Auflage; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) beschrieben wird. Wenn eine im Handel erhältliche Bibliothek verwendet wird, kann die Hybridisierung nach dem in der beigefügten Anleitung beschriebenen Protokoll durchgeführt werden.
Die klonierte DNA, die SLC-1 oder MCH codiert, die erfindungsgemäß verwendet wird, kann so verwendet werden, wie sie ist, abhängig von dem Zweck, oder, falls erwünscht, nach Verdau mit einem Restriktionsenzym oder nach Anfügung eines Linkers. Die DNA kann ATG als Translationsstartcodon am 5'-Ende davon enthalten und TAA, TGA oder TAG als Translationsterminationscodon am 3'-Ende. Diese Translationsstart- und Terminationscodons können auch der DNA zugefügt werden unter Verwendung eines geeigneten synthetischen DNA-Adapters.
Der Expressionsvektor von SLC-1 oder MCH, der erfindungsgemäß verwendet wird, kann z.B. hergestellt werden, indem (a) das jeweilige DNA-Fragment aus der DNA, die SLC-1 oder MCH codiert, die erfindungsgemäß verwendet wird, ausgeschnitten wird und dann (b) das DNA-Fragment mit einem geeigneten Expressionsvektor stromabwärts eines Promotors in den Vektor ligiert wird.
Beispiele des Vektors schließen Plasmide ein, die von E. coli stammen (z.B. pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Plasmide, die von Bacillus subtilis stammen (z.B: pUB110, pTP5, pC194), Plasmide, die aus Hefe stammen (z.B. pSH19, pSH15), Bakteriophagen, wie λ-Phage etc., Tierviren, wie Retrovirus, Vacciniavirus, Baculovirus etc. Der verwendete Promotor kann irgendein Promotor sein, solange er gut zu einem für die Genexpression zu verwendenden Wirt passt.
Wenn Tierzellen als Wirt für die Transformation verwendet werden, kann ein von SV40 abgeleiteter Promotor, Retroviruspromotor, Metallothioneinpromotor, Hitzeschockpromotor, Cytomegaloviruspromotor, SRα-Promotor etc. verwendet werden. Wenn der Wirt ein Bakterium ist aus der Gattung Escherichia, schließen bevorzugte Beispiele Trp-Promotor, T7-Promotor, lac-Promotor, recA-Promotor, λPL-Promotor, lpp-Promotor etc. ein. Wenn Bakterien der Gattung Bacillus als Wirt verwendet werden, sind bevorzugte Beispiele SP01-Promotor, SP02-Promotor, penP-Promotor etc. Wenn Hefe als Wirt verwendet wird, sind bevorzugte Beispiele PHO5-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor, ADH1-Promotor, GAL-Promotor etc. Wenn Insektenzellen als Wirt verwendet werden, schließen bevorzugte Beispiele Polyhedrinpromotor, P10-Promotor etc. ein.
Zusätzlich zu den vorher erwähnten Beispielen kann der Expressionsvektor weiterhin gegebenenfalls einen Enhancer, ein Spleißsignal, ein polyA-Additionssignal, einen Selektionsmarker, einen SV40-Replikationsursprung (im Folgenden manchmal abgekürzt als SV40ori) etc. enthalten. Beispiele für den Selektionsmarker schließen Dihydrofolatreduktase-(im Folgenden manchmal abgekürzt als dhfr)-Gen [Methotrexat-(MTX)-Resistenz], Ampicillinresistenzgen (im Folgenden manchmal abgekürzt als Amp^r), Neomycinresistenzgen (im Folgenden manchmal abgekürzt als Neo; G418-Resistenz) etc. ein. Insbesondere wenn DHFR-Gen als Selektionsmarker verwendet wird unter Verwendung von CHO (dhfr^–), kann die Selektion auch in einem thymidinfreien Medium bewirkt werden.
Falls notwendig und erwünscht, wird eine Signalsequenz, die zu einem Wirt passt, an der N-terminalen Seite des Polypeptids oder des Teilpeptids zugefügt. Beispiele für die Signalsequenz, die verwendet werden kann, sind pho-A-Signalsequenz, OmpA-Signalsequenz etc., wenn der Wirt ein Bakterium der Gattung Escherichia ist; α-Amylasesignalsequenz, Subtilisinsignalsequenz etc., wenn der Wirt ein Bakterium der Gattung Bacillus ist; Mating-Faktor α-(MFα)-Signalsequenz, Invertasesignalsequenz etc., wenn der Wirt eine Hefe ist und Insulinsignalsequenz, α-Interferonsignalsequenz, Antikörpermolekülsignalsequenz etc., wenn der Wirt Tierzellen sind.
Unter Verwendung des Vektors, der die so konstruierte DNA enthält, die SLC-1 oder MCH codiert, können Transformanten erstellt werden.
Als Wirt können z.B. Bakterien, die zur Gattung Escherichia gehören, Bakterien, die zur Gattung Bacillus gehören, Hefen, Insekten oder Insektenzellen, Tierzellen etc. angewendet werden.
Spezifische Beispiele für Bakterien, die zu der Gattung Escherichia gehören, schließen Escherichia coli K12 DH1 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 60, 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)), HB101 (Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)), C600 (Genetics, 39, 440 (1954)) etc. ein.
Beispiele für Bakterien, die zur Gattung Bacillus gehören, schließen Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24, 255 (19893)), 207–21 (Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)) etc. ein.
Beispiele für Hefen schließen Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R^–, NA87-11A, DKD-SD, 20B-12 etc. ein.
Als Insekten können z.B. Larven von Bombyx mori verwendet werden (Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)).
Beispiele für Insektenzellen, die verwendet werden, schließen Spodoptera-frugiperda-Zellen (Sf-Zellen), MG1-Zellen, die aus dem mittleren Darmtrakt von Trichoplusia ni stammen, High-Five^TM-Zellen, die aus Ei von Trichoplusia ni stammen, Zellen, die aus Mamestra brassicae stammen, Zellen, die aus Estigmena acrea stammen, etc. für AcNPV-Virus und für BmNPV-Virus Bombyx-mori-N-Zellen (BmN-Zellen) etc. ein. Beispiele für Sf-Zellen, die verwendet werden können, sind Sf9-Zellen (ATCC CRL1711), Sf21-Zellen [beide Zellen werden beschrieben bei J.L. Vaughn et al., In vitro, 13, 213–217 (1977)] etc.
Beispiele für Tierzellen schließen Affen-COS-7-Zellen, Veeozellen, CHO-Zellen vom Chinesischen Hamster, DHFR-gendefiziente CHO-Zellen vom Chinesischen Hamster (dhfr^–-CHO-Zellen), Maus-L-Zellen, Maus-3T3-Zellen, Mausmyelomzellen, Human-HEK293-Zellen, Human-FL-Zellen, 293-Zellen, C127-Zellen, BALB3T3-Zellen, Sp-2/0-Zellen etc. ein.
Bakterien, die zur Gattung Escherichia gehören, können z.B. mit der in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 2110 (1972) oder Gene, 17, 107 (1982) etc. beschriebenen Methode transformiert werden.
Bakterien, die zur Gattung Bacillus gehören, können z.B. mit der in Molecular and General Genetics, 168, 111 (1979) beschriebenen Methode etc. transformiert werden.
Hefen können z.B. mit der in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 1929 (1978) beschriebenen Methode transformiert werden.
Insektenzellen oder Insekten können z.B. mit der in Bio/Technology, 6, 47–55 (1988) beschriebenen Methode etc. transformiert werden.
Tierzellen können z.B. gemäß der in Virology, 52, 456 (1973) beschriebenen Methode transformiert werden.
Methoden zur Einführung der Expressionsvektoren in die Zellen schließen z.B. die Lipofektionsmethode [P.L. Felgner et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84, 7413 (1987)], die Calciumphosphatmethode [F.L. Graham and A.J. van der Eb, Virology, 52, 456–467 (1973)], die Elektroporationsmethode [E. Nuemann et al., EMBO J., 1, 841-845 (1982)] etc. ein.
Wie oben beschrieben, werden Transformanten, die mit dem Expressionsvektor, der eine DNA, die das erfindungsgemäß verwendete SLC-1 oder MCH codiert, transformiert sind, erhalten werden.
Um SLC1 oder MCH, die erfindungsgemäß verwendet werden, in Tierzellen stabil zu exprimieren, ist ein Verfahren anwendbar, um Zellen durch Klonselektion auszuwählen, bei dem die mit Expressionsvektoren transfizierten Tierzellen in Chromosomen eingebaut werden. Spezifisch werden Transformanten ausgewählt unter Verwendung des oben beschriebenen Selektionsmarkers als Index. Indem die Klonselektion an den so erhaltenen Tierzellen wiederholt wird unter Verwendung der Selektionsmarker, können weiterhin stabile Tierzelllinien, die das erfindungsgemäß verwendete SLC-1 oder MCH stark exprimieren können, erhalten werden. Wenn das dhfr-Gen als Selektionsmarker verwendet wird, kann die Kultivierung durchgeführt werden, indem der Gehalt an MTX nach und nach erhöht wird, um resistente Zellen zu selektieren, so dass die DNA, die das erfindungsgemäß verwendete SLC-1 oder MCH codiert, in den Zellen zusammen mit dem dhfr-Gen amplifiziert werden kann, um die Tierzelllinie mit höherer Expression zu erhalten.
Der oben beschriebene Transformant wird unter Bedingungen kultiviert, unter denen die DNA, die das erfindungsgemäß verwendete SLC-1 oder MCH codiert, exprimiert werden kann, um das Polypeptid der vorliegen den Erfindung zu erzeugen und anzusammeln. Somit kann das erfindungsgemäß verwendete SLC-1 oder MCH hergestellt werden.
Wenn der Wirt ein Bakterium ist, das zur Gattung Escherichia oder zur Gattung Bacillus gehört, kann der Transformant in geeigneter Weise in einem flüssigen Medium kultiviert werden, das Materialien enthält, die für das Wachstum des Transformanten erforderlich sind, z.B. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Materialien etc. Beispiele für Kohlenstoffquellen schließen Glucose, Dextrin, lösliche Stärke, Saccharose etc. ein. Beispiele für Stickstoffquellen schließen anorganische oder organische Materialien, wie Ammoniumsalze, Nitrate, Maiseinweichwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojakuchen, Kartoffelextrakt etc. ein. Beispiele für die anorganischen Materialien sind Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat, Magnesiumchlorid etc. Außerdem können auch Hefe, Vitamine, wachstumsfördernde Faktoren etc. dem Medium zugefügt werden. Bevorzugt wird der pH-Wert des Mediums auf etwa 5 bis etwa 8 eingestellt.
Ein bevorzugtes Beispiel des Mediums zur Kultivierung von Bakterien, die zur Gattung Escherichia gehören, ist M9-Medium, das mit Glucose und Casaminosäuren ergänzt ist (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431–433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972). Falls notwendig und erwünscht, kann eine chemische Verbindung, wie 3β-Indolylacrylsäure dem Medium zugefügt werden, um den Promotor effizient zu aktivieren.
Wenn der Wirt ein Bakterium ist, das zur Gattung Escherichia gehört, wird der Transformant gewöhnlich bei etwa 15 bis etwa 43°C etwa 3 bis etwa 24 Stunden lang kultiviert. Falls notwendig und erwünscht, kann die Kultur belüftet oder bewegt werden.
Wenn der Wirt ein Bakterium ist, das zur Gattung Bacillus gehört, wird der Transformant im Allgemeinen bei etwa 30 bis etwa 40°C etwa 6 Stunden bis etwa 24 Stunden lang kultiviert. Falls notwendig und erwünscht, kann die Kultur belüftet oder bewegt werden.
Beispiele für Medien zur Kultivierung des Transformanten, dessen Wirt eine Hefe ist, schließen Burkholder's Minimalmedium [K.L. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4505 (1980)] oder SD-Medium, das 0,5% Casaminosäuren enthält (G.A. Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S:A., 81, 5330 (1984)], ein. Bevorzugt wird der pH-Wert des Mediums auf etwa 5 bis etwa 8 eingestellt. Im Allgemeinen wird der Transformant bei etwa 20 bis etwa 35°C etwa 24 bis etwa 72 Stunden lang kultiviert. Falls notwendig und erwünscht, kann die Kultur belüftet oder bewegt werden.
Beispiele für Medien zur Kultivierung des Transformanten, dessen Wirt eine Insektenzelle ist, schließen Grace's Insektenmedium (T.C.C. Grace, Nature, 195, 788 (1962)), das mit 10% inaktiviertem Rinderserum etc. als geeigneten Additiven ergänzt ist, ein. Bevorzugt wird der pH-Wert des Mediums auf etwa 6,2 bis etwa 6,4 eingestellt. Normalerweise wird der Transformant bei etwa 27°C etwa 3 Tage bis etwa 5 Tage lang kultiviert und, falls notwendig und erwünscht, kann die Kultur belüftet oder bewegt werden.
Beispiele für Medien zur Kultivierung des Transformanten, dessen Wirt eine Tierzelle ist, schließen MEM-Medium, das etwa 5 bis etwa 20% fötales Rinderserum enthält [Science, 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI-1640-Medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199-Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] etc. ein. Bevorzugt wird der pH-Wert des Mediums auf etwa 6 bis etwa 8 eingestellt. Der Transformant wird gewöhnlich bei etwa 30 bis etwa 40°C etwa 15 bis etwa 60 Stunden lang kultiviert, und, falls nötig und erwünscht, kann die Kultur belüftet oder bewegt werden.
Insbesondere, wenn CHO-(dhfr^–)-Zellen angewendet werden und das dhfr-Gen als Selektionsmarker angewendet wird, ist es bevorzugt, im Wesentlichen thymidinfreies DMEM, das mit dialysiertem fötalen Rinderserum ergänzt ist, zu verwenden.
Das erfindungsgemäß verwendete SLC-1 oder MCH kann von der oben beschriebenen Kultur mit den folgenden Verfahren abgetrennt und gereinigt werden.
Um das erfindungsgemäß verwendete SLC-1 oder MCH aus den kultivierten Bakterien oder Zellen zu extrahieren, können allgemein bekannte Methoden in geeigneter Weise angewendet werden, einschließlich einer Methode, bei der Transformanten oder Zellen nach der Kultivierung gesammelt werden, dann in einem geeigneten Puffer suspendiert werden und unter Verwendung von Ultraschall, einer Behandlung mit Lysozym und/oder Einfrier/Auftau-Zyklen aufgerissen werden und anschließend zentrifugiert, filtriert etc. werden. Somit kann der rohe Extrakt des erfindungsgemäß verwendeten SLC-1 oder MCH erhalten werden. Der für das Verfahren verwendete Puffer kann ein Proteindenaturierungsmittel enthalten, wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid oder ein Tensid, wie Triton X-100 (Markenzeichen, im Folgenden manchmal abgekürzt als TM) etc.
Wenn das erfindungsgemäß verwendete SLC-1 oder MCH in die Kulturbrühe ausgeschieden wird, kann nach Abschluss der Kultivierung der Überstand von dem Transformanten oder den Zellen getrennt werden, um den Überstand mit einer allgemein bekannten Methode zu sammeln.
Das erfindungsgemäß verwendete SLC-1 oder MCH, das in dem so erhaltenen Kulturüberstand oder dem Extrakt enthalten ist, kann gereinigt werden, indem in geeigneter Weise die allgemein bekannten Methoden zur Abtrennung und Reinigung kombiniert werden. Solche bekannten Methoden zur Abtrennung und Reinigung schließen eine Methode ein, die Unterschiede in der Löslichkeit verwendet, wie Aussalzen, Lösungsmittelausfällung etc.; eine Methode, die hauptsächlich einen Unterschied im Molekulargewicht ausnutzt, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese etc., eine Methode, die Unterschiede in der elektrischen Ladung ausnutzt, wie Ionenaustauschchromatographie etc.; eine Methode, die die spezifische Affinität ausnutzt, wie Affinitätschromatographie etc.; eine Methode, die einen Unterschied in der Hydrophobizität ausnutzt, wie Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie etc.; eine Methode, die einen Unterschied im isoelektrischen Punkt ausnutzt, wie isoelektrische Fokussierung, Chromatofokussierung etc. und dgl.
Wenn das so erhaltene erfindungsgemäß verwendete SLC-1 oder MCH in freier Form ist, kann es in das Salz umgewandelt werden mit allgemein bekannten Methoden oder Modifikationen davon. Andererseits kann dann, wenn das SLC-1 oder MCH in Salzform erhalten wird, dieses in die freie Form oder eine andere Salzform umgewandelt werden mit allgemein bekannten Methoden oder Modifikationen davon.
Das erfindungsgemäß verwendete SLC-1 oder MCH, das mit einer rekombinanten Methode hergestellt wird, kann mit einem geeigneten Protein modifizierenden Enzym behandelt werden vor oder nach der Reinigung, um das SLC-1 oder MCH in geeigneter Weise zu modifizieren oder teilweise ein Protein (Peptid) davon zu entfernen. Beispiele für das Protein modifizierende Enzym schließen Trypsin, Chymotrypsin, Arginylendopeptidase, Proteinkinase, Glycosidase und dgl. ein. Für die Deletion der N-terminalen Aminosäure können z.B. auch die allgemein bekannte Edman-Methode unter Verwendung von Edman-Reagenz (Phenylisothiocyanat) verwendet werden.
Die Existenz des so gebildeten SLC-1 oder MCH, das erfindungsgemäß verwendet wird, kann durch Enzymimmunoassays getestet werden unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers oder dgl.
(2) Ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes, die/das die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und dem SLC-1 oder seinem Salz verändert, das gekennzeichnet ist dadurch, dass MCH oder ein Derivat oder ein Salz davon verwendet wird und SLC-1 oder ein Salz davon verwendet wird oder ein Kit zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes, die/das die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und dem SLC-1 oder seinem Salz verändert, der dadurch gekennzeichnet ist, dass das MCH oder eine markierte Form oder ein Salz davon und das SLC-1 oder ein Salz davon verwendet werden (im Folgenden nur als Screening-Methoden der vorliegenden Erfindung bzw. Screening-Kits der vorliegenden Erfindung bezeichnet) werden unten im Detail beschrieben.
Unter Verwendung von SLC-1 oder seinem Salz oder durch Konstruktion eines Expressionssystems für rekombinantes SLC-1 und unter Verwendung eines Bindungstestsystems (Ligand/Rezeptor-Testsystem) zwischen MCH oder seinem Derivat oder einem Salz davon unter Verwendung des Expressionssystems, kann eine Verbindung oder ein Salz davon, die/das die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und dem SLC-1 oder seinem Salz verändert (z.B. ein Peptid, ein Protein, eine Nichtpeptidverbindung, eine synthetische Verbindung, ein Fermentationsprodukt etc.) gescreent werden.
Beispiele für solche Verbindungen schließen Verbindungen ein, die SLC-1-vermittelte zellstimulierende Aktivitäten zeigen (z.B. Aktivitäten, die die Freisetzung von Arachidonsäure, die Freisetzung von Acetylcholin, die Freisetzung von intrazellulärem Ca²⁺, die intrazelluläre cAMP-Produktion, die intrazelluläre cGMP-Produktion, die Inositphosphatproduktion, Veränderungen im Zellmembranpotenzial, die Phosphorylierung von intrazellulären Proteinen, die Aktivierung von c-fos, pH-Reduktion etc. beschleunigen oder unterdrücken) (nämlich SLC-1-Agonisten), Verbindungen, die keine solchen zellstimulierenden Aktivitäten haben (nämlich SLC-1-Antagonisten) und dgl. Der Ausdruck "ändert die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und SLC-1 oder seinem Salz" schließen sowohl Fälle ein, bei denen die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und SLC-1 oder seinem Salz gehemmt wird als auch solche, bei denen die Bindung des Liganden beschleunigt wird.
Die vorliegende Erfindung liefert somit ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes, die/das die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und SLC-1 oder seinem Salz, wie oben beschrieben, verändert, das umfasst, dass (i) der Fall, dass das MCH oder sein Derivat oder ein Salz davon in Kontakt mit SLC-1 oder seinem Salz gebracht wird und (ii) der Fall, dass das MCH oder sein Derivat oder ein Salz davon und eine Testverbindung in Kontakt mit dem SLC-1 oder seinem Salz gebracht werden, verglichen werden.
Bei dem Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung wird der Vergleich gemacht, indem z.B. die Menge des an SLC-1 oder sein Salz gebundenen Liganden, die zellstimulierenden Aktivitäten etc. gemessen werden, (i) wenn MCH oder sein Derivat oder ein Salz davon in Kontakt gebracht wird mit dem SLC-1 oder seinem Salz und (ii) wenn das MCH oder sein Derivat oder ein Salz davon und eine Testverbindung in Kontakt mit dem SLC-1 oder seinem Salz gebracht werden und (i) und (ii) verglichen werden.
Genauer liefert das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung die folgenden Merkmale.

(1) Ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes, die/das die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und SLC-1 oder seinem Salz verändert, das umfasst, dass die Bindungsmenge des markierten MCH oder eines Derivats davon oder eines Salzes davon, die an das vorher erwähnte SLC-1 oder sein Salz gebunden sind, gemessen und verglichen wird, wenn das markierte MCH oder sein Derivat oder ein Salz davon (wenn das vorher erwähnte "markierte MCH etc. oder sein Salz" als "MCH-Derivat oder sein Salz" verwendet wird, ist keine weitere Markierung notwendig; im Folgenden das Gleiche) in Kontakt gebracht wird mit dem SLC-1 oder seinem Salz und wenn das markiere MCH oder sein Derivat oder ein Salz davon und eine Testverbindung in Kontakt mit dem SLC-1 oder seinem Salz gebracht werden.
(2) Ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes, die/das die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und SLC-1 oder seinem Salz verändert, das umfasst, dass die Bindungsmengen von markiertem MCH oder seinem Derivat oder einem Salz davon, die an SLC-1-haltige Zellen oder eine Membranfraktion der Zellen gebunden sind, gemessen und verglichen werden, wenn das markierte MCH oder sein Derivat oder ein Salz davon in Kontakt gebracht wird mit den SLC-1-haltigen Zellen oder einer Membranfraktion der Zellen und wenn das markierte MCH oder sein Derivat oder ein Salz davon und eine Testverbindung in Kontakt gebracht werden mit den SLC-1-haltigen Zellen oder einer Membranfraktion der Zellen.
(3) Ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes, die/das die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und SLC-1 oder seinem Salz verändert, das umfasst, dass die Bindungsmengen des markiertem MCH oder seines Derivats oder eines Salzes davon, die an SLC-1 gebunden sind, gemessen und verglichen werden, wenn das markierte MCH oder sein Derivat oder ein Salz davon in Kontakt mit dem auf einer Zellmembran exprimierten SLC-1 gebracht werden, indem ein Transformant, der eine DNA enthält, die SLC-1 codiert, gezüchtet wird, und wenn markiertes MCH oder sein Derivat oder ein Salz davon und eine Testverbindung in Kontakt gebracht werden mit dem SLC-1, das auf einer Zellmembran exprimiert wird, indem ein Transformant, der eine DNA enthält, die SLC-1 codiert, gezüchtet wird.
(4) Ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes, die/das die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und SLC-1 oder seinem Salz verändert, das umfasst, dass durch SLC-1 vermittelte zellstimulierende Aktivitäten gemessen und verglichen werden (z.B. Aktivitäten, die die Freisetzung von Arachidonsäure, die Freisetzung von Acetylcholin, die Freisetzung von intrazellulärem Ca²⁺, die intrazelluläre cAMP-Produktion, die intrazelluläre cGMP-Produktion, die Inositphosphatproduktion, die Veränderung des Zellmembranpotenzials, die Phosphorylierung von intrazellulären Proteinen, die Aktivierung von c-fos, eine pH-Reduktion etc. beschleunigen oder unterdrücken), wenn eine Verbindung zur Aktivierung von SLC-1 (z.B. MCH oder sein Derivat oder ein Salz davon) in Kontakt gebracht wird mit einer SLC-1-haltigen Zelle und wenn eine Verbindung zur Aktivierung von SLC-1 und eine Testverbindung in Kontakt gebracht werden mit der SLC-1-haltigen Zelle.
(5) Ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes, die/das die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und SLC-1 oder seinem Salz verändert, das umfasst, dass durch SLC-1 vermit telte zellstimulierende Aktivitäten (z.B. Aktivitäten, die die Freisetzung von Arachidonsäure, die Freisetzung von Acetylcholin, die Freisetzung von intrazellulärem Ca²⁺, die intrazelluläre cAMP-Produktion, die intrazelluläre cGMP-Produktion, die Inositphosphatproduktion, die Veränderung des Zellmembranpotenzials, die Phosphorylierung von intrazellulären Proteinen, die Aktivierung von c-fos, eine pH-Reduktion etc.) gemessen und verglichen werden, wenn eine Verbindung zur Aktivierung von SLC-1 (z.B. MCH oder sein Derivat oder ein Salz davon) in Kontakt gebracht wird mit SLC-1, das auf einer Zellmembran exprimiert wird, indem ein Transformant gezüchtet wird, der die SLC-1 codierende DNA enthält und wenn eine Verbindung zur Aktivierung von SLC-1 und eine Testverbindung in Kontakt gebracht werden mit SLC-1, das auf einer Zellmembran exprimiert wird, indem ein Transformant gezüchtet wird, der eine SLC-1 codierende DNA enthält; und dgl.

Das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung wird spezifisch unten beschrieben.
Als Erstes kann das für das erfindungsgemäße Screening-Verfahren verwendete SLC-1 irgendein Material sein, solange es das vorher erwähnte SLC-1 enthält. Bevorzugtes SLC-1 schließt Membranfraktionen aus Organen von Menschen, warmblütigen Tieren, Fisch etc. ein. Da es sehr schwierig ist, vom Menschen stammende Organe zu erhalten, ist SLC-1, das in großen Mengen exprimiert wird unter Verwendung von Rekombinanten, zur Verwendung im Screening geeignet. Insbesondere kann bei menschlichem SLC-1 die Verwendung von SLC-1, das die Aminosäuresequenz enthält, die in SEQ ID Nr. 11 gezeigt ist, ein Screening mit guter Empfindlichkeit schaffen im Vergleich zu SLC-1, das in der vorher beschriebenen Aminosäuresequenz dargestellt wird (FEBS Letters, 398 (1996), 253–258 etc.).
Zur Herstellung von SLC-1 kann das oben beschriebene Verfahren verwendet werden.
Wenn SLC-1-haltige Zellen oder Zellmembranfraktionen etc. für das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung angewendet werden, können die Zellen oder Zellmembranfraktionen mit dem Verfahren hergestellt werden, das im Folgenden beschrieben wird.
Wenn die SLC-1-haltigen Zellen verwendet werden, können die Zellen unter Verwendung von Glutaraldehyd, Formalin etc. fixiert werden. Die Fixierung kann mit allgemein bekannten Methoden erfolgen.
Die SLC-1-haltigen Zellen beziehen sich auf Wirtszellen, die SLC-1 exprimiert haben. Beispiele für Wirtszellen schließen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefen, Insektenzellen, Tierzellen etc. ein, wie oben beschrieben.
Die Membranfraktion bezieht sich auf eine Fraktion, die reich an Zellmembran ist, die mit allgemein bekannten Methoden nach Zellaufschluss erhalten wird. Nützliche Zellaufschlussmethoden schließen Zell-Squashing unter Verwendung eines Potter-Elvehjem-Homogenisators, Aufschluss unter Verwendung eines Waring-Mischers oder eines Polytrons (hergestellt von Kinematica Inc.), Aufreißen durch Ultraschall und Aufreißen durch Sprühen der Zellen durch dünne Düsen unter erhöhtem Druck unter Verwendung einer French-Presse oder dgl. ein. Zellmembranfraktionierung wird hauptsächlich bewirkt durch Fraktionierung unter Verwendung von Zentrifugalkräften, z.B. Fraktionierungszentrifugation, Zentrifugation mit Dichtegradienten etc. Z.B. wird eine Zellaufschlussflüssigkeit mit geringer Geschwindigkeit (500 U/min bis 3.000 U/min) für kurze Zeit zentrifugiert (normalerweise etwa 1 Minute bis etwa 10 Minuten) und der entstehende Überstand wird mit einer höheren Geschwindigkeit (15.000 U/min bis 30.000 U/min) normalerweise 30 Minuten bis 2 Stunden lang zentrifugiert. Der so erhaltene Niederschlag wird als Membranfraktion verwendet. Die Membranfraktion ist reich an SLC-1, das exprimiert wird und Membrankomponenten, wie aus Zellen stammenden Phospholipiden und Membranproteinen.
Die Menge an SLC-1 in den SLC-1-haltigen Zellen oder Membranfraktionen ist bevorzugt 10³ bis 10⁸ Moleküle pro Zelle, bevorzugter 10⁵ bis 10⁷ Moleküle pro Zelle. Wenn das Ausmaß der Expression ansteigt, erhöht sich die Ligandenbindungsaktivität pro Einheit Membranfraktion (spezifische Aktivität), so dass nicht nur ein hochempfindliches Screening-System konstruiert werden kann, sondern auch große Mengen der Probeflüssigkeiten mit der gleichen Charge getestet werden können.
Um die obigen Verfahren (1) bis (3) zum Screenen der Verbindung durchzuführen, die die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und SLC-1 verändert, werden eine geeignete SLC-1-Fraktion und ein markierter Ligand oder eine Verbindung, die eine Ligandenaktivität aufweist (MCH oder sein Derivat) angewendet. Die SLC-1-Fraktion ist bevorzugt eine natürlich vorkommende SLC-1-Fraktion oder eine rekombinante SLC-1-Fraktion mit einer Aktivität, die der einer natürlichen SLC-1-Fraktion äquivalent ist. Der Ausdruck "äquivalente Aktivität" soll hier eine Ligandenbindungsaktivität oder dgl. bedeuten, die äquivalent der einer natürlichen SLC-1-Fraktion ist. Als markierer Ligand oder Verbindung mit Ligandenaktivität werden ein markierer Ligand und eine Verbindung mit einer Ligandenaktivität (MCH oder sein Derivat) etc. markiert ist, verwendet. Z.B. kann ein Ligand (MCH oder sein Derivat), der mit [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] etc. verwendet werden. Insbesondere kann auch die markierte Form des MCH-Derivats, das mit einer allgemein bekannten Methode hergestellt wurde unter Verwendung eines Bolton-Hunter-Reagenzes, verwendet werden.
Spezifische Beispiele der markierten Form der MCH-Derivate sind Verbindungen, die in (1) bis (7), wie oben beschrieben, angegeben sind.
Spezifisch wird die Verbindung, die die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und SLC-1 verändert, mit den folgenden Verfahren gescreent. Zuerst wird ein Standardrezeptorpräparat hergestellt, indem SLC-1-haltige Zellen oder Membranfraktionen solcher Zellen in einem Puffer, der zum Screening geeignet ist, suspendiert werden. Jeder Puffer kann verwendet werden, solange er nicht die Liganden-Rezeptorbindung stört, wie Puffer, einschließlich Phosphatpuffer, Tris-HCl-Puffer etc., die einen pH-Wert von 4 bis 10 zeigen (wünschenswerter pH 6 bis 8). Um die nichtspezifische Bindung zu reduzieren, kann gegebenenfalls dem Puffer ein Tensid, wie CHAPS, Tween-80^TM (Kao-Atlas Inc.), Digitonin, Desoxycholat etc. zugefügt werden. Um den Abbau von SLC-1 und MCH oder ihren Derivaten zu unterdrücken, der durch eine Protease verursacht wird, kann weiterhin auch ein Proteaseinhibitor, wie PMSF, Leupeptin, E-64 (hergestellt von Peptide Institute Inc.), Pepstatin etc. zugefügt werden. Eine gegebene Menge (5.000 cpm bis 500.000 cpm) des markierten MCHs oder seines Derivats werden zu 0,01 ml bis 10 ml Rezeptorlösung zugegeben und es wird zugelassen, dass gleichzeitig eine Testverbindung in einer Menge von 10^–4 bis 10^–1 μM vorhanden ist. Um die Menge der nichtspezifischen Bindung (NSB) zu bestimmen, wird auch ein Reaktionsröhrchen dem unmarkiertes MCH oder sein Derivat in großem Überschuss zugegeben wird, vorbereitet. Die Reaktion wird 20 Minuten bis 24 Stunden lang, bevorzugt 30 Minuten bis 3 Stunden lang bei ungefähr 0 bis 50°C, bevorzugt 4 bis 37°C, durchgeführt. Nach Abschluss der Reaktion wird die Reaktionsmischung durch ein Glasfaserfilterpapier etc. filtriert und mit einem geeigneten Volumen des gleichen Puffers gewaschen. Die restliche Radioaktivität, die auf dem Glasfaserfilterpapier zurückbleibt, wird darin mit einem Flüssigszintillationszähler oder einem Gammazähler gemessen. Wenn eine Zahl (B-NSB₀), die erhalten wird, indem die nichtspezifische Bindung (NSB) von einer Zahl (B₀) ohne antagonistische Substanz abgezogen wird, als 100% genommen wird, kann die Testverbindung, die eine nichtspezifische Verbindung (B-NSB) von z.B. 50% oder weniger ergibt, als Kandidatensubstanz ausgewählt werden mit einer kompetitiven hemmenden Aktivität.
Um die Bindung zwischen SLC-1 und MCH oder seinem Derivat zu testen, kann auch BIAcore (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech Co.) angewendet werden. Bei dieser Technik wird MCH oder sein Derivat auf einem Sensorchip immobilisiert mit der Aminokupplungsmethode gefolgt von dem der Vorrichtung beigefügten Protokoll. Ein Puffer, wie Phosphatpuffer, Tris-Puffer etc., der SLC-1, das aus den SLC-1-haltigen Zellen gereinigt wurde, oder einen Transformanten, der eine SLC-1 codierende DNA enthält, oder eine Membranfraktion mit SLC-1 oder das gereinigte SLC-1 oder eine Membranfraktion, die SLC-1 und eine Testverbindung enthält, enthält, wird über den Sensorchip geleitet mit einer Durchflussrate von 2 bis 20 μl/min. Indem überwacht wird, ob die Testverbindung, die gleichzeitig vorhanden ist, die Veränderung der Oberflächenplasmonresonanz, die durch Bindung von MCH oder seinem Derivat auf dem Sensorchip an SLC-1 verursacht wird, verändert, kann die Verbindung, die die Bindung zwischen SLC-1 und MCH verändert, gescreent werden. Mit dieser Technik kann die Veränderung in gleicher Weise gemessen werden mit dem Verfahren, das beinhaltet, dass SLC-1 auf einem Sensorchip immobilisiert wird und über den Sensorchip eine Pufferlösung, wie Phosphatpuffer, Tris-Puffer etc. geleitet wird, die MCH oder sein Derivat oder MCH oder sein Derivat eine Testverbindung enthält. Beispiele der Testverbindung sind die gleichen, wie oben angegeben.
Die oben beschriebenen Verfahren (4) oder (5) zum Screenen der Verbindung, die die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Salz und SLC-1 oder seinem Salz verändert, kann wie folgt durchgeführt werden. Die durch SLC-1 vermittelten zellstimulierenden Aktivitäten (z.B. die Aktivitäten, die die Freisetzung von Arachidonsäure, die Freisetzung von Acetylcholin, die Freisetzung von intrazellulärem Ca²⁺, die intrazelluläre cAMP-Produktion, die intrazelluläre cGMP-Produktion, die Inositphosphatproduktion, die Veränderung des Zellmembranpotenzials, die Phosphorylierung von intrazellulären Proteinen, die Aktivierung von c-fos, eine pH-Reduktion etc. fördern oder unterdrücken) können mit einer allgemein bekannten Methode getestet werden oder unter Verwendung eines allgemein verfügbaren Testkits. Spezifisch werden die SLC-1 enthaltenden Zellen zuerst auf einer Mehrnapfplatte etc. gezüchtet. Vor dem Screenen wird das Medium durch ein frisches Medium ersetzt oder durch einen geeigneten nicht cytotoxischen Puffer und anschließend über einen gegebenen Zeitraum in Gegenwart einer Testverbindung etc. inkubiert. Anschließend werden die Zellen extrahiert oder der Überstand gewonnen. Das gebildete Produkt wird quantitativ ausgewertet durch die entsprechenden Verfahren. Wenn es schwierig ist, die Produktion der für die zellstimulierenden Aktivitäten vorhandenen Indexsubstanz (z.B. Arachidonsäure) nachzuweisen aufgrund von abbauenden Enzymen, die in den Zellen enthalten sind, kann ein Inhibitor gegen ein solches Abbauenzym vor dem Test zugefügt werden. Um Aktivitäten, wie die die cAMP-Produktion hemmende Aktivität nachzuweisen, wird die Grundproduktion in den Zellen durch Forskolin oder dgl. erhöht. Dann kann die die erhöhte Grundproduktion unterdrückende Wirkung nachgewiesen werden.
Zum Screenen durch Nachweis der zellstimulierenden Aktivitäten ist eine geeignete Zelle, in der SLC-1 exprimiert worden ist, erforderlich. Eine solche Zelle, in der SLC-1 der vorliegenden Erfindung exprimiert worden ist, ist wünschenswerterweise die vorher erwähnte rekombinante SLC-1-Expressionszelllinie und dgl. Die SLC-1-Expressionszelle kann entweder ein stabil exprimierender Stamm oder ein vorübergehend exprimierender Stamm sein. Auch ist die Art der Tierzellen die gleiche, wie oben angegeben.
Beispiele für die Testverbindung schließen ein Peptid, ein Protein, eine Nichtpeptidverbindung, eine synthetische Verbindung, ein Fermentationsprodukt, einen Zellextrakt, einen Pflanzenextrakt, einen Tiergewebeextrakt und dgl. ein.
Genauer wird das folgende Testsystem, das für das Ligandenrezeptortestsystem oben angewendet wird, unten beschrieben.

(1) Wenn eine Rezeptorexpressionszelle durch einen Rezeptoragonisten stimuliert wird, wird G-Protein in der Zelle aktiviert und GTP daran gebunden. Dieses Phänomen wird auch in einer Membranfraktion der Rezeptorexpressionszelle beobachtet. Gewöhnlich wird GTP zu GDP hydrolysiert. Wenn jedoch GTPγS vorher der Reaktionslösung zugefügt wurde, wird GTPγS an G-Protein gebunden, wie in GTP, aber nicht hydrolysiert, so dass ein Zustand von an G-proteinhaltige Zellmembranen gebundenem GTPγS erhalten wird. Wenn markiertes GTPγS verwendet wird, wird die restliche Radioaktivität an der Zellmembran gemessen, wodurch die die Rezeptorexpression zellstimulierende Aktivität eines Rezeptoragonisten getestet werden kann. Unter Verwendung dieser Reaktion kann die stimulierende Aktivität von MCH oder seinem Derivat auf die SLC-1-Expressionszellen getestet werden. Dies ist eine Testmethode unter Verwendung der SLC-1-haltigen Membranfraktion, wie in (1) bis (3) beschrieben, aber nicht unter Verwendung der SLC-1-haltigen Zellen, wie in (4) und (5) oben beschrieben. Gemäß dieser Methode wird jedoch die zellstimulierende Aktivität getestet wie in (4) und (5). Bei diesem Testsystem ist die Substanz, die eine die GTPγS-Bindung fördernde Aktivität an die SLC-1-Membranfraktion zeigt, ein Agonist. Spezifisch wird der Test ausgeführt nach den Verfahrensschritten der Beispiele 9 und 16, die später beschrieben werden, ebenso wie deren Modifikationen. Die Verbindung, die die Bindungseigenschaft zwischen MCH und SLC-1 verändert, kann hier gescreent werden, indem MCH oder sein Derivat oder MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung zugegeben werden und getestet wird, ob die die GTPγS-Bindung fördernde Aktivität an die SLC-1-Membranfraktion sich verändert im Vergleich zur Verabreichung von MCH oder seinem Derivat allein. In diesem Fall kann die Verbindung, die eine Unterdrückung der GTPγS-bindungsfördernden Aktivität des MCH oder seines Derivats an die SLC-1-Membranfraktion zeigt, als Kandidatensubstanz mit einer kompetitiven hemmenden Aktivität ausgewählt werden. Andererseits kann ein Agonist gescreent werden, indem die Testverbindung allein verabreicht wird und die die GTPγS-Bindung fördernde Aktivität der SLC-1-Membranfraktion überwacht wird.

Ein Beispiel der Screening-Methode ist spezifisch unten beschrieben. Die Zellmembranfraktion, die SLC-1 vom Menschen oder von der Ratte enthält, die mit dem später in Beispiel 9 oder Beispiel 16 beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, wird mit einem Puffer zur Membranverdünnung (50 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 1 μM GDP, 0,1% BSA, pH 7,4) verdünnt. Der Verdünnungsgrad variiert abhängig von der Menge des exprimierten Rezeptors. Die Verdünnung wird mit jeweils 0,2 ml in Falcon 2053 abgegeben, wozu MCH oder sein Derivat oder MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung zugefügt werden. [³⁵S]GTPγS wird zu der Mischung auf eine Endkonzentration von 200 pM zugefügt. Nach 1 Stunde bei 25°C wird eisgekühlter Waschpuffer (50 mM Tris, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% CHAPS, pH 7,4, 1,5 ml) der Mischung zugefügt und anschließend durch ein Glasfaserfilterpapier GF/F filtriert. Nachdem 30 Minuten lang auf 65°C gehalten worden ist, wird die Mischung getrocknet und die Radioaktivität von an die Membranfraktion gebundenem [³⁵S]GTPγS, die auf dem Filterpapier zurückbleibt, mit einem Flüssigszintillationszähler gemessen. Wenn die Radioaktivität in der experimentellen Gruppe, der MCH oder sein Derivat alleine zugegeben wurde, als 100% definiert wird und die Radioaktivität in der experimentellen Gruppe, die weder MCH noch sein Derivat erhielt, als 0% definiert wird, wird eine Wirkung der Testverbindung auf die GTPγS-bindungsfördernde Aktivität durch MCH oder sein Derivat ausgearbeitet. Die Testverbindung, die eine GTPγS-bindungsfördernde Aktivität von z.B. 50% oder weniger zeigt, kann ausgewählt werden als Kandidatenverbindung mit einer kompetitiv hemmenden Aktivität.

(2) In den SLC-1-Expressionszellen reduziert eine Menge an intrazellulärem cAMP die MCH-Stimulierung. Unter Ausnützung dieser Reaktion kann die stimulierende Aktivität von MCH auf die SLC-1-Expressionszellen untersucht werden.

Die Menge der cAMP-Produktion in verschiedenen Tierzellen, in denen SLC-1 exprimiert worden ist, kann mit einem RIA getestet werden unter Verwendung eines Anti-cAMP-Antikörpers, wobei dieser Antikörper aus immunisierten Mäusen, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Rindern etc. erhalten werden kann, und von ¹²⁵I-markiertem cAMP (beide im Handel erhältlich) oder mit einem anderen EIA-System unter Verwendung eines Anti-cAMP-Antikörpers und von markiertem cAMP in Kombination. Die quantitative Auswertung mit der SPA-Technik ist auch möglich, bei der Kügelchen, die Szintillationsmittel enthalten, die Anti-cAMP-Antikörper tragen, die unter Verwendung von Protein A immobilisiert wurden oder Antikörper gegen IgG etc. des zur Herstellung der Anti-cAMP-Antikörper verwendeten Tiers und ¹²⁵I-markiertes cAMP werden verwendet (ein Kit, der von Amersham Pharmacia Biotech hergestellt wird, wird verwendet).
Die Hemmung der cAMP-Produktion wird spezifisch getestet mit dem Verfahren von Beispiel 14, wie später beschrieben, oder einer Modifikation davon. Bei diesem System kann die Verbindung, die die Bindung von MCH an SLC-1 verändert, gescreent werden, indem die Menge an intrazellulärem cAMP durch einen solchen Liganden, wie Forskolin oder Calcitonin, der die Menge an intrazellulärem cAMP erhöhen kann, erhöht wird und überwacht wird, ob die Unterdrückung der intrazellulären cAMP-Produktion durch Verabreichung von MCH oder seinem Derivat alleine verändert wird durch Zugabe von MCH oder seinem Derivat oder MCH oder seinen Derivaten und einer Testverbindung. In diesem Fall kann die Verbindung, die eine Aktivität der Hemmung der cAMP-Produktion hemmenden Aktivität durch MCH oder seinem Derivat zeigt, ausgewählt werden als Kandidatensubstanz mit einer kompetitiv hemmenden Aktivität. Andererseits kann eine Verbindung, die eine Agonistaktivität zeigt, gescreent werden, indem die die cAMP-Produktion hemmende Aktivität überwacht wird, wenn eine Testverbindung alleine zugegeben wird.
Die Screening-Methode wird unten genauer beschrieben. CHO/SLC-1-Zellen werden auf einer 24-Napf-Platte mit 5 × 10⁴ Zellen/Napf beimpft und anschließend 48 Stunden lang kultiviert. Die Zellen werden mit Hank's ausgeglichener Salzlösung (pH 7,4), die 0,2 mM 3-Isobutylmethylxanthin, 0,05% BSA und 20 mM HE-PES (im Folgenden Hank's ausgeglichene Salzlösung) (pH 7,4), die 0,2 mM 3-Isobutylmethylxanthin, 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthält, als Reaktionspuffer bezeichnet) gewaschen. Danach werden 0,5 ml des Reaktionspuffers zu den Zellen zugegeben und die Mischung wird in dem Medium 30 Minuten lang warm gehalten. Der Reaktionspuffer wird entfernt und 0,25 ml eines frischen Reaktionspuffers werden zu den Zellen zugegeben.
Dann werden 1 nM MCH oder sein Derivat oder 1 nM MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung zu 0,25 ml des Reaktionspuffers, der 2 μM Forskolin enthält, zugegeben. Die Mischung wird zu den Zellen zugegeben und anschließend 24 Minuten lang bei 37°C umgesetzt. Die Reaktion wird beendet, indem 100 μl 20% Perchlorsäure zugegeben werden. Die Reaktionsmischung wird dann 1 Stunde lang auf Eis gestellt, um intrazelluläres cAMP zu extrahieren. Die Menge an cAMP in dem Extrakt wird gemessen unter Verwendung eines cAMP-EIA-Kits (Amersham Pharmacia Biotech). Wenn man die durch Forskolinstimulierung erzeugte cAMP-Menge als 100% nimmt und die durch Zugabe von 1 nM MCH oder seinem Derivat gehemmte Menge an cAMP als 0% nimmt, kann die Wirkung der Testverbindung auf die die cAMP-Produktion hemmende Aktivität durch MCH oder sein Derivat berechnet werden. Eine Testverbindung, die die Aktivität des MCH oder seines Derivats, die cAMP-Produktionsaktivität zu vermindern, hemmt, z.B. 50% oder mehr, kann als Kandidatensubstanz ausgewählt werden mit einer kompetitiv hemmenden Aktivität.
Um die die cAMP-Produktion fördernde Aktivität zu bestimmen, wird die Menge an cAMP, die erzeugt wird durch Zugabe einer Testverbindung zu CHL/SLC-1-Zellen ohne Zugabe von Forskolin quantitativ ausgewertet mit dem oben beschriebenen Verfahren.

(3) Ein DNA-haltiges CRE (cAMP-Response-Element) wird in die Multiklonierungsstelle stromaufwärts eines Luciferasegens in einen PicaGene Basic Vektor oder einen PicaGene Enhancer Vektor (Toyo Ink Mfg. Co. Ltd.) insertiert, was ihn zu einem CRE-Reportergenvektor macht. In einer mit einem CRE-Reportergenvektor transfizierten Zelle induziert die mit dem Anstieg von cAMP assoziierte Stimulierung vermittelt durch CRE die Expression des Luciferasegens und direkt anschließend die Produktion des Luciferaseproteins. Das bedeutet, durch Testen der Luciferaseaktivität kann eine Veränderung der Menge an cAMP in der mit dem CRE-Reportergenvektor transfizierten Zelle nachgewiesen werden. Unter Verwendung der SLC-1-Expressionszelle, die mit dem CRE-Reportergenvektor transfiziert ist, kann eine Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 verändert, gescreent werden. Die Screening-Methode wird spezifisch unten beschrieben.

Mit CRE-Reportergen transfizierte SLC-1-Expressionszellen werden auf einer 24-Napf-Platte mit 5 × 10³ Zellen/Napf beimpft und anschließend 48 Stunden lang kultiviert. Die Zellen werden mit Hank's ausgeglichener Salzlösung (pH 7,4), die 0,2 mM 3-Isobutylmethylxanthin, 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthält, gewaschen (im Folgenden wird Hank's ausgeglichene Salzlösung) (pH 7,4), die 0,2 mM 3-Isobutylmethylxanthin, 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthält, als Reaktionspuffer bezeichnet). Danach werden 0,5 ml des Reaktionspuffers zu den Zellen zugegeben und die Mischung wird 30 Minuten lang in dem Medium warm gehalten. Der Reaktionspuffer wird entfernt und 0,25 ml frischer Reaktionspuffer werden zu den Zellen zugegeben. Dann werden 1 nM MCH oder sein Derivat oder 1 nM MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung ebenso wie 0,25 ml des Reaktionspuffers, der 2 μM Forskolin enthält, zu den Zellen zugegeben und anschließend 24 Minuten lang bei 37°C umgesetzt. Die Zellen werden in einem Zelllysemittel für PicaGene (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) gelöst und ein Lumineszenzsubstrat (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) wird dem Lysat zugegeben. Die von der Luciferase emittierte Lumineszenz wird mit einem Luminometer, einem Flüssigszintillationszähler oder einem Top-Counter gemessen. Eine Wirkung der Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 verändert, kann getestet werden, indem das Ausmaß der Lumineszenz der Luciferase mit dem Fall, wo MCH oder sein Derivat allein verabreicht wurde, verglichen wird. In diesem Fall wird ein Anstieg der Lumineszenzmenge durch Forskolinstimulierung unterdrückt durch Verabreichung von MCH oder seinem Derivat. Die Verbindung, die die Hemmung aufheben kann, kann ausgewählt werden als Kandidatensubstanz mit einer kompetitiv hemmenden Aktivität. Ein Agonist kann andererseits ebenso gescreent werden, indem eine Testverbindung allein verabreicht wird und die Unterdrückung der Lumineszenzmenge, die durch Forskolinstimulierung intensiviert wird, auf gleiche Weise wie bei MCH oder seinem Derivat überwacht wird.
Außer Luciferase können alkalische Phosphatase, Chloramphenicolacetyltransferase oder β-Galactosidase als Reportergen angewendet werden. Die enzymatische Aktivität der Genprodukte von diesen Reportergenen kann leicht getestet werden unter Verwendung von im Handel erhältlichen Testkits. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase, die Aktivität der Chloramphenicolacetyltransferase und die Aktivität der β-Galactosidase können getestet werden, z.B. unter Verwendung von Lumi-Phos 530, FAST CAT Chloramphenicolacetyltransferase-Assaykit bzw. Aurora Gal-XE, die alle von Wako Pure Chemical Industries hergestellt werden.

(4) Die SLC-1-Expressionszellen setzen extrazellulär Arachidonsäuremetaboliten frei als Ergebnis der MCH-Stimulierung. Indem vorher radioaktive Arachidonsäure in die Zellen eingebracht wird, kann die Aktivität überwacht werden, indem die aus den Zellen freigesetzte Radioaktivität gemessen wird. Der Test wird durchgeführt mit dem Verfahren von Beispiel 6, das später beschrieben wird, und einer Modifikation davon. In diesem Fall kann die Verbindung, die die Freisetzungsaktivität des Arachidonsäuremetaboliten durch MCH oder sein Derivat beeinflusst, gescreent werden, indem MCH oder sein Derivat oder MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung zugegeben werden und eine Wirkung des MCHs oder seines Derivats auf die Arachidonsäuremetaboliten freisetzende Aktivität überwacht wird. In diesem Fall kann die Verbindung, die die Arachidonsäuremetabolit freisetzende Aktivität durch MCH oder sein Derivat hemmen kann, ausgewählt werden als Kandidatensubstanz mit einer kompetitiv hemmenden Aktivität. Andererseits kann eine Verbindung, die eine Agonistaktivität zeigt, ebenso gescreent werden, indem eine Testverbindung allein verabreicht wird und die Arachidonsäuremetabolit freisetzende Aktvität durch SLC-1-Expressionszellen überwacht wird mit dem modifizierten Verfahren von Beispiel 6, das später beschrieben wird. Das Verfahren zum Screenen einer Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 beeinflusst, wird unten genauer beschrieben.

CHO/SLC-1-Zellen werden auf eine 24-Napf-Platte mit 5 × 10⁴ Zellen/Napf geimpft. Nach 24-stündiger Kultivierung wird [³H]-Arachidonsäure den Zellen mit 0,25 μCi/Napf zugegeben. 16 Stunden nach der Zugabe der [³H]-Arachidonsäure werden die Zellen mit Hank's ausgeglichener Salzlösung (pH 7,4), die 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthält, gewaschen. Jedem Napf werden 500 μl einer Lösung zugefügt, die erhalten wurde, indem eine 10 nM Endkonzentration von MCH oder seinem Derivat oder eine 10 nM Endkonzentration von MCH oder seinem Derivat und eine Testverbindung in Hank's ausgeglichener Salzlösung (pH 7,4), die 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthält, gelöst werden. Im Folgenden wird Hanks' ausgeglichene Salzlösung (pH 7,4), die 0,5% BSA und 20 mM HEPES enthält, als Reaktionspuffer bezeichnet. Nach 60-minütiger Inkubation bei 37°C werden 400 μl der Reaktionslösung in einen Szintillator gegeben und die Menge an [³H]-Arachidonsäuremetaboliten, die in die Reaktionslösung freigesetzt worden ist, unter Verwendung eines Szintillationszählers gemessen. Wenn die Menge an [³H]-Arachidonsäuremetaboliten im Medium des Reaktionspuffers, dem kein MCH oder ein Derivat davon zugegeben wurde, als 0% genommen wird, und die Menge an [³H]-Arachidonsäuremetaboliten im Medium, dem 10 nM MCH oder sein Derivat zugefügt worden sind, als 100% genommen wird, kann eine Wirkung der Testverbindung auf die Bindung zwischen MCH oder seinem Derivat und SLC-1 berechnet werden. Die Testverbindung, die die Arachidonsäuremetaboliten produzierende Aktivität z.B. um 50% oder weniger vermindert, kann ausgewählt werden als Kandidatensubstanz mit einer kompetitiv hemmenden Aktivität.

(5) Wenn die SLC-1-Expressionszellen mit MCH stimuliert werden, erhöht sich der intrazelluläre Ca-Pegel. Eine Wirkung einer Testverbindung auf die Bindung zwischen MCH und SLC-1 kann unter Verwendung dieses Effekts überwacht werden.

Die SLC-1-Expressionszellen werden auf ein sterilisiertes Deckglas zur Mikroskopie aufgeimpft. Zwei Tage später wird das Kulturmedium durch HBSS ersetzt, in dem 4 mM Fura-2 AM (Dojin Kagaku Kenkyusho) suspendiert sind, und anschließend wird 2 Stunden und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach dem Waschen mit HBSS wird das Deckglas auf eine Küvette aufgesetzt und der erhöhte Anteil der Fluoreszenzintensität bei 505 nm wird mit einem Fluoreszenzspektrophotometer gemessen bei Anregungswellenlängen von 340 nm und 380 nm, wenn MCH oder sein Derivat oder MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung zugegeben worden sind. In diesem Fall kann die Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 beeinflusst, gescreent werden, indem eine Veränderung der Fluoreszenzintensität, die durch eine Zugabe der Testverbindung verursacht wird, gemessen wird im Vergleich zu dem Fall, wo MCH oder sein Derivat allein verabreicht werden. FLIPR (hergestellt von Molecular Device Co.) kann auch, wie unten beschrieben, verwendet werden. D.h., dass Fluo-3 AM (hergestellt von Dojin Kagaku Kenkyusho) zu einer Zellsuspension zugefügt wird, um Fluo-3 AM in die Zellen einzubauen. Der Überstand wird mehrere Male durch Zentrifugation gewaschen und die Zellen werden auf eine 96-Napf-Platte geimpft. Nach Einsetzen in die FLIPR-Vorrichtung werden MCH oder sein Derivat oder MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung wie bei Fura-2 zugegeben. Die Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 beeinflusst, kann gescreent werden, indem eine Veränderung der Fluoreszenzintensität gemessen wird, die durch Zugabe der Testverbindung verursacht wird im Vergleich zu dem Fall, wo MCH oder sein Derivat alleine zugegeben wurden. In diesen Fällen kann die Verbindung, die eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität durch MCH oder sein Derivat hemmt, ausgewählt werden als Kandidatensubstanz mit einer kompetitiv hemmenden Aktivität. Andererseits kann ein Agonist gescreent werden, indem ein Anstieg der Fluoreszenzintensität überwacht wird, wenn die Testverbindung allein zugegeben wird.
Ein Proteingen, wie Äquorin, das Licht im Zusammenhang mit einem Anstieg der intrazellulären Ca-Ionen emittiert, wird in SLC-1-Expressionszellen coexprimiert und Äquorin ändert sich zu Ca-gebundenem Äquorin durch einen Anstieg des intrazellulären Ca-Ionenpegels, um Licht zu emittieren. Unter Verwendung dieser Lichtemission kann die Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 beeinflusst, gescreent werden, indem MCH oder sein Derivat oder MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung zugegeben werden und überwacht wird, ob die Lichtemission, die durch Zugabe der Testverbindung beobachtet wird, sich verändert im Vergleich zu dem Fall, wo MCH oder sein Derivat alleine verabreicht wird. Das Verfahren ist das gleiche, wie oben beschrieben, außer dass die fluoreszierende Substanz nicht in die Zellen eingebaut wird.

(6) Es ist bekannt, dass dann, wenn ein Rezeptoragonist einer Rezeptor exprimierenden Zelle zugefügt wird, der Pegel an intrazellulärem Inosittriphosphat ansteigt. Indem die Reaktion in den SLC-1-Zellen, die durch MCH verursacht wird, überwacht wird, kann die Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 beeinflusst, gescreent werden. Einen Tag nach Beimpfung der Zellen auf eine 24-Napf-Platte wird Myo-[2-³H]-inosit (2,5 μCi/Napf) jedem Napf zugefügt. In diesem Medium werden die Zellen 1 Tag lang gezüchtet. Nach sorgfältigem Waschen werden MCH oder sein Derivat oder MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung den Zellen zugegeben. Die Reaktion wird dann beendet durch Zugabe von 10% Perchlorsäure. Die Reaktionsmischung wird mit 1,5 M KOH und 60 mM HEPES-Lösung neutralisiert und dann über eine Säule geleitet, die mit 0,5 ml Ag 1 × 8 Harz (Bio-Rad) gepackt ist. Nach Waschen mit 5 mM Na₂BO₃ und 60 mM HCOONH₄ wird die Radioaktivität, die mit 1 M HCOONH₄ und 0,1 M HCOOH eluiert, mit einem Flüssigszintillationszähler gemessen. Wenn die Radioaktivität in dem Medium des Reaktionspuffers ohne Zugabe von MCH oder seinem Derivat als 0% genommen wird und die Radioaktivität in dem Medium, dem MCH oder sein Derivat zugefügt wurde, als 100% genommen wird, kann eine Wirkung der Testverbindung auf die Bindung zwischen MCH oder seinem Derivat und SLC-1 berechnet werden. Die Testverbindung, die die Inosittriphosphat-Produktionsaktivität hemmt, z.B. um 50% oder weniger, kann ausgewählt werden als Kandidatensubstanz mit einer kompetitiv hemmenden Aktivität. Ein Agonist kann andererseits ebenso gescreent werden, indem ein Anstieg der Inosittriphosphat-Produktionsaktivität überwacht wird, wenn die Testverbindung allein zugegeben wird.
(7) Ein DNA-haltiges TRE (TPA-Response-Element) wird in eine Multiklonierungsstelle stromaufwärts eines Luciferasegens in einen PicaGene Basic Vektor oder einen PicaGene Enhancer Vektor (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) insertiert, der zu einem TRE-Reportergenvektor wird. In einer mit TRE-Reportergenvektor transfizierten Zelle reduziert die Stimulierung, die von einem Anstieg von intrazellulärem Ca begleitet ist, vermittelt durch TRE die Expression des Luciferasegens und die nachfolgende Luciferaseproteinproduktion. Das bedeutet, dass durch Überwachung der Luciferaseaktivität eine Veränderung der Menge an Calcium in der mit TRE-Reportergenvektor transfizierten Zelle nachgewiesen werden kann. Unter Verwendung von mit TRE-Reportergenvektor transfizierten SLC-1-Expressionszellen kann eine Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 verändert gescreent werden. Die Screening-Methode wird spezifisch unten beschrieben.

Die mit TRE-Reportergen transfizierten SLC-1-Expressionszellen werden auf eine 24-Napf-Platte mit 5 × 10³ Zellen/Napf geimpft und anschließend 48 Stunden lang gezüchtet. Nachdem die Zellen mit Hanks' ausgeglichener Salzlösung (pH 7,4), die 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthält, gewaschen worden sind, werden 10 nM MCH oder sein Derivat oder 10 nM MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung den Zellen zugefügt und anschließend 60 Minuten lang bei 37°C reagieren gelassen. Die Zellen werden in einem Zelllysemittel für Pica-Gene Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) gelöst und ein Lumineszenzsubstrat (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) wird dem Lysat zugegeben. Die durch Luciferase erzeugte Lumineszenz wird mit einem Luminometer, einem Flüssigszintillationszähler oder einem Top-Counter gemessen. Die Wirkung der Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 verändert, kann gemessen werden, indem die durch Luciferase erzeugte Lumineszenz mit dem Fall verglichen wird, in dem MCH oder sein Derivat allein zugegeben worden ist. In diesem Fall steigt die Lumineszenz mit dem Anstieg an intrazellulärem Ca durch Verabreichung von MCH oder seinem Derivat und die Verbindung, die den Anstieg unterdrückt, kann als Kandidatensubstanz mit einer kompetitiv hemmenden Aktivität ausgewählt werden. Ein Agonist kann andererseits ebenso gescreent werden, indem ein Anstieg der Lumineszenz auf gleiche Weise wie bei MCH oder seinem Derivat überwacht wird, wenn die Testverbindung allein verabreicht wird.
Außer Luciferase können alkalische Phosphatase, Chloramphenicolacetyltransferase oder β-Galactosidase als Reportergen angewendet werden. Die enzymatische Aktivität der Genprodukte von diesen Reportergenen kann leicht wie unten beschrieben getestet werden unter Verwendung von im Handel erhältlichen Testkits. Die alkalische Phosphataseaktivität, die Aktivität der Chloramphenicolacetyltransferase und die β-Galactosidaseaktivität können z.B. getestet werden unter Verwendung von Lumi-Phos 530, FAST CAT Chloramphenicolacetyltransferase-Assaykit bzw. Awora Gal-XE, die alle von Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd., hergestellt werden.

(8) In SLC-1-Expressionszellen wird als Antwort auf MCH ein Wachstum durch MAP-Kinase-Aktivierung beobachtet. Dieses Wachstum kann überwacht werden über die MAP-Kinase-Aktivität, Thymidinaufnahme oder Zellzählung (MTT etc.). Die Verbindung, die die Bindung zwischen MCH oder seinem Derivat und dem SLC-1 verändert, kann auf diese Weise gescreent werden.

Die MAP-Kinase-Aktivität kann leicht getestet werden, indem MCH oder sein Derivat oder MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung den Zellen zugegeben werden, eine MAP-Kinase-Fraktion aus einem Zelllysat durch Immunofällung unter Verwendung eines Anti-MAP-Kinase-Antikörpers erhalten wird und dann unter Verwendung z.B. eines MAP-Kinase-Testkits, der von Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd., hergestellt wird und von γ-[³²P]-ATP. Die Thymidinaufnahmeaktivität kann überwacht werden, indem SLC-1-Expressionszellen geimpft werden, MCH oder sein Derivat oder MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung den Zellen zugefügt werden, weiterhin [Methyl-³H]-thymidin zugefügt wird, was eine Zelllyse verursacht, und dann die Radioaktivität des markierten Thymidins, das in die Zellen aufgenommen worden ist, mit einem Flüssigszintillationszähler gezählt wird.
Das Wachstum der SLC-1-Expressionszellen kann ebenso bestimmt werden durch Beimpfung der Expressionszellen, Zugabe von MCH oder seinem Derivat oder MCH oder seinem Derivat und einer Testverbindung, weitere Zugabe von MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid), die MTT-Aufnahme in die Zellen untersucht wird, wodurch MTT in Formazan umgewandelt wird, eine Zelllyse mit Isopropanol verursacht wird, das mit Salzsäure angesäuert worden ist, und dann die Absorption bei 570 nm gemessen wird.
Die Methode zum Screenen der Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 verändert unter Verwendung der Aufnahmeaktivität für markiertes Thymidin wird unten spezifisch beschrieben.
Die SLC-1-Expressionszellen werden auf eine 24-Napf-Platte mit 5000 Zellen/Napf geimpft und anschließend 1 Tag lang inkubiert. Als Nächstes werden die Zellen in einem serumfreien Medium 2 Tage lang inkubiert, um die Zellen in einen Hungerzustand zu bringen. MCH oder sein Derivat oder MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung werden den Zellen zugegeben. Nach 24-stündiger Inkubation wird [Methyl-³H]-thymidin mit 0,015 MBq/Napf zugegeben und anschließend 6 Stunden lang inkubiert. Nach dem Waschen der Zellen mit PBS wird Methanol den Zellen zugegeben. Die Mischung wird 10 Minuten lang stehen gelassen. Als Nächstes wird 5% Trichloressigsäure zugegeben und die Mischung 15 Minuten lang stehen gelassen. Die inmobilisierten Zellen werden viermal mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach der Zelllyse mit 0,3 n Natriumhydroxidlösung wird die Radioaktivität in dem Lysat mit einem Flüssigszintillationszähler gemessen. Eine Wirkung der Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 verändert, kann bestimmt werden, indem ein Anstieg der Radioaktivität durch Thymidinaufnahme verglichen wird, wenn MCH oder sein Derivat allein verabreicht wird. In diesem Fall kann die Verbindung, die einen Anstieg der Radioaktivität durch Verabreichung von MCH oder seinem Derivat unterdrückt, als Kandidatensubstanz ausgewählt werden mit einer kompetitiv hemmenden Aktivität. Andererseits kann ein Agonist gescreent werden, indem ein Anstieg der Radioaktivität auf gleiche Art und Weise wie bei MCH oder seinem Derivat beobachtet wird, wenn die Testverbindung allein verabreicht wird.

(9) Wenn MCH den SLC-1-Expressionszellen zugegeben wird, wird der K-Kanal aktiviert, so dass K-Ionen, die in den Zellen vorhanden sind, aus den Zellen herausfließen. Da Rb-Ionen als verwandte Elemente von K-Ionen aus den Zellen über den K-Kanal herausfließen, ohne von K-Ionen unterscheidbar zu sein, wird markiertes Rb ([⁸⁶Rb]) den Zellen zugegeben, damit eine intrazelluläre Aufnahme des Isotops ermöglicht wird. Dann wird der Efflux von [⁸⁶Rb], das durch MCH-Stimulierung herausfließt, gemessen, um die Wirkung von MCH zu testen. Das Verfahren zum Screening der Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 verändert, unter Ausnutzung der [⁸⁶Rb]-Effluxaktivität wird unten spezifisch beschrieben.

2 Tage nach Beimpfung von 24 Näpfen werden die SLC-1-Expressionszellen 2 Stunden lang in einem Medium, das 1 mCi/ml ⁸⁶RbCl enthält, warm gehalten. Das Medium wird sorgfältig gewaschen, um ⁸⁶RbCl in der äußeren Flüssigkeit vollständig zu entfernen. MCH oder sein Derivat oder MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung werden den Zellen zugegeben. Die äußere Flüssigkeit wird 30 Minuten später gewonnen und die Radioaktivität mit einem Gammazähler gezählt. Eine Wirkung der Verbindung, die die Bindung zwischen MCH oder seinem Derivat und SLC-1 verändert, kann getestet werden, indem der Anstieg der Radioaktivität durch [⁸⁶Rb]-Efflux verglichen wird mit dem Fall, wenn MCH oder sein Derivat alleine verabreicht wird. In diesem Fall kann die Verbindung, die den Anstieg der Radioaktivität durch Verabreichung von MCH oder seinem Derivat unterdrückt, als Kandidatensubstanz mit kompetitiv hemmender Aktivität ausgewählt werden. Andererseits kann ein Agonist ebenso gescreent werden, wenn ein Anstieg der Radioaktivität auf gleiche Weise, wie bei MCH oder seinem Derivat, gefunden wird, wenn die Testverbindung alleine verabreicht wird.

(10) Die MCH-Aktivität kann getestet werden, indem der extrazelluläre pH-Wert (Ansäuerungsrate) gemessen wird, den die SLC-1-Expressionszellen als Antwort auf MCH verändern unter Verwendung einer Cytosensor-Vorrichtung (Molecular Device Co.). Das Verfahren zum Screenen der Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 verändert durch extrazelluläre pH-Messung unter Verwendung der Cytosensor-Vorrichtung wird spezifisch unten beschrieben.

Die SLC-1-Expressionszellen werden über Nacht in einer Kapsel für die Cytosensor-Vorrichtung inkubiert, die in eine Kammer der Vorrichtung eingesetzt wird, um 0,1% BSA-haltiges RPMI-1640-Medium zum Rückfluss zu bringen (hergestellt von Molecular Device Co.), bis der extrazelluläre pH-Wert stabil wird. Nachdem der pH-Wert stabil geworden ist, wird ein Medium, das MCH oder sein Derivat oder MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung enthält, im Rückfluss geführt zu den Zellen, um eine Veränderung des dadurch verursachten pH-Werts zu messen. Eine Wirkung der Verbindung, die die Bindung zwischen MCH oder seinem Derivat und SLC-1 verändert, kann getestet werden, indem eine Veränderung des extrazellulären pH-Werts in den SLC-1-Expressionszellen verglichen wird mit dem Fall, wenn das MCH oder sein Derivat allein verabreicht wird. In diesem Fall kann die Verbindung, die eine Veränderung des extrazellulären pH-Werts in den SLC-1-Expressionszellen durch Verabreichung von MCH oder seinem Derivat unterdrückt, als Kandidatensubstanz ausgewählt werden mit einer kompetitiv hemmenden Aktivität. Andererseits kann ein Agonist gescreent werden durch Überwachung einer Veränderung des extrazellulären pH-Werts auf gleiche Weise, wie bei dem MCH oder seinem Derivat, wenn die Testverbindung allein verabreicht wird.

(11) Bei Saccharomyces cerevisiae wird der Sexpheromonrezeptor STe2 vom Haploid α-Paarungstyp (MATα) an G-Protein Gpa1 gekuppelt, um die MAP-Kinase zu aktivieren als Antwort auf den Geschlechtspheromon-α-Paarungsfaktor, wodurch Far1 (Zellzyklusstopp) und der Transkriptionsaktivator Ste12 aktiviert werden. Ste12 stimuliert die Expression einer Vielzahl von Genen, einschließlich FUS1, das mit der Paarung verbunden ist. Andererseits funktioniert der Regulator Sst2 so, dass er den vorhergehenden Prozess hemmt. Bei diesem System wurde ein Versuch gemacht an einem Testsystem für die Reaktion Rezeptoragonist/Rezeptor, der beinhaltet, dass eine Hefe mit integriertem Rezeptorgen erzeugt wird, das Signalübertragungssystem in Hefezellen aktiviert wird durch Rezeptoragoniststimulierung und das entstehende Wachstum etc. als Index verwendet wird (M.H. Pausch, Trends in Biotechnology, Bd. 15, Seiten 487–494 (1997)). Unter Verwendung eines solchen Systems basierend auf einer Hefe mit integriertem Rezeptorgen kann die Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 verändert, gescreent werden.

Ste2 in MATα-Hefe und ein Gen, das Gpa1 codiert, werden entfernt und stattdessen ein SLC-1-Gen und ein Gen, das ein Fusionsprotein aus Gpa1-Gai2 codiert, eingeführt. Ein Gen, das Far codiert, wird entfernt, damit kein Zellzyklusstopp erfolgt und ein Gen, das Sst1 codiert, wird entfernt, um die Empfindlichkeit als Antwort auf MCH zu erhöhen. Weiterhin wird FUS1-HIS3-Gen eingeführt, das ein FUS1 ligiert mit dem Histidinbiosynthesegen HIS3 ist. Das vorhergehende gentechnische Verfahren kann leicht durchgeführt werden, z.B. mit der von Price et al. angegebenen Methode (L.A. Price et al., Molecular and Cellular Biology, Bd. 15, Seiten 6188–6195 (1995)) unter Verwendung von SLC-1 anstelle von Somatostatinrezeptor-Typ-2-(SSTR2)-Gen. Die so konstruierte transformierte Hefe spricht an auf MCH als Ligand für SLC-1 in hoher Empfindlichkeit, so dass MAP-Kinase aktiviert wird und ein Histidinbiosyntheseenzym synthetisiert wird. Somit kann der Transformant in einem histidindefizienten Medium wachsen. Unter Verwendung dieses Systems kann die Antwort der SLC-1 exprimierenden Hefe auf MCH überwacht werden unter Verwendung eines Indexwachstums der Hefe in einem histidindefizienten Medium. Das Verfahren zum Screenen der Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 hemmt, wird unten beschrieben.
Die so erzeugte transformierte Hefe wird über Nacht in vollständigem Syntheseflüssigmedium inkubiert und in histidinfreies Weichagarmedium mit 2 × 10⁴ Zellen/ml gegeben und anschließend auf eine quadratische Petrischale mit 9 × 9 cm geimpft. Nachdem der Agar sich verfestigt hat, wird ein sterilisiertes Filterpapier, das mit MCH oder seinem Derivat oder MCH oder seinem Derivat und einer Testverbindung imprägniert ist, auf die Agaroberfläche gelegt und anschließend 3 Tage bei 30°C inkubiert. Eine Wirkung der Verbindung, die die Bindung zwischen MCH oder ihrem Derivat und SLC-1 verändert, kann getestet werden, indem das Wachstum der Hefe rund um das Filterpapier verglichen wird mit dem Fall, wenn MCH oder sein Derivat allein verabreicht wird. In diesem Fall kann die Verbindung, die das Wachstum der Hefe durch Verabreichung von MCH oder seinem Derivat unterdrückt, als Kandidatensubstanz mit kompetitiv hemmender Aktivität ausgewählt werden. Andererseits kann ein Agonist auch gescreent werden, wenn das Wachstum der Hefe auf gleiche Weise wie bei MCH oder seinem Derivat festgestellt wird, wenn die Testverbindung allein verabreicht wird. Die Verbindung, die die Bindung zwischen MCH oder seinem Derivat und SLC-1 verändert, kann auch getestet werden, indem vorher MCH oder sein Derivat dem Agarmedium zugegeben wird, ein sterilisiertes Filterpapier mit einer Testverbindung alleine imprägniert wird, inkubiert wird und überwacht wird, ob das Wachstum der Hefe über der gesamten Oberfläche der Petrischale an der Peripherie des Filterpapiers beeinflusst wird.

(12) Wenn die RNA für das SLC-1-Gen in Xenopus laevis injiziert wird, werden Oozyten durch MCH stimuliert, ein intrazellulärer Ca-Ionenpegel steigt an, was einen calciumaktivierten Chloridstrom verursacht, der als Fluktuation des Membranpotenzials abgegriffen werden kann (wie in dem Fall, in dem die Fluktuation beim K-Ionengradienten auftritt). Indem die obige durch MCH verursachte Reaktion in Xenopus-laevis-Oozyten, denen SLC-1 zugeführt wurde, beobachtet wird, kann die Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 beeinflusst, gescreent werden.

Ein weibliches Individuum von Xenopus laevis wird anästhesiert, indem es in Eiswasser eingetaucht wird und anatomisiert, um die Oozyten herauszunehmen. Die Oozytencluster werden mit Collagenase (0,5 mg/ml), gelöst in einer MBS-Lösung (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,41 mM CaCl₂, 0,33 mM Ca(NO₃)₂, 0,82 mM MgSO₄, 2,4 mM NaHCO₃, 10 mM HEPES, pH 7,4) 1 bis 6 Stunden lang bei 19°C mit 150 U/min behandelt werden, bis die Oozyten voneinander getrennt sind. Dreimal werden sie gewaschen, indem die äußere Flüssigkeit durch die MBS-Lösung ersetzt wird und anschließend wird Poly(A)⁺-SLC-1-cRNA (50 ng/50 nl) mit einem Mikromanipulator mikroinjiziert. SLC-1-mRNA kann aus Geweben oder Zellen präpariert oder aus Plasmiden in vitro transkribiert werden. Die Oozyten werden in der MBS-Lösung 3 Tage bei 20°C inkubiert. Die Oozyten werden in das Loch einer Spannungsklemmvorrichtung gelegt, die kontinuierlich mit Ringer-Lösung perfundiert wird und mit einer Glasmikroelektrode für die Spannungsmessung und Glasmikroelektroden zur Aufzeichnung belegt, wobei die (–)-Elektrode außerhalb der Oozyten angebracht wird. Wenn sich das Haltepotenzial stabilisiert, wird Ringer-Lösung, die MCH oder sein Derivat oder MCH oder sein Derivat und eine Testverbindung enthält, perfundiert, um eine Veränderung des Potenzials aufzuzeichnen. Eine Wirkung der Verbindung, die die Bindung zwischen MCH und SLC-1 verändert, kann gemessen werden, indem eine Veränderung des Zellmembranpotenzials bei Xenopus-laevis-Oozyten, denen SLC-1 eingeführt wurde, verglichen wird mit dem Fall, wenn MCH oder sein Derivat allein verabreicht wird. In diesem Fall kann die Verbindung, die eine Veränderung des Zellmembranpotenzials unterdrückt, die durch Verabreichung von MCH oder seinem Derivat verursacht wird, als Kandidatensubstanz ausgewählt werden mit einer kompetitiv hemmenden Aktivität. Andererseits kann auch ein Agonist gescreent werden, indem die Veränderung des Zellmembranpotenzials auf gleiche Weise, wie bei MCH oder seinem Derivat festgestellt wird, wenn die Testverbindung allein verabreicht wird.
Bei diesem System kann der Anteil an Veränderung erhöht werden, indem Poly(A)⁺-RNAs verschiedener G-Proteingene eingeführt werden, so dass es leichter wird, die Reaktion zu überwachen. Die Reaktion kann auch getestet werden, indem Poly(A)⁺-RNAs gleichzeitig mit einem Gen eines Proteins injiziert werden, wie Äquorin, das in Gegenwart von Ca Licht emittiert und die Lichtemission überwacht wird, und nicht eine Veränderung des Membranpotenzials.
Kits zum Screenen einer Verbindung oder ihrer Salze, die/das die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinen Salzen und SLC-1 oder seinen Salzen verändert, enthalten SLC-1 oder seine Salze, SLC-1-haltige Zellen oder SLC-1-haltige Zellmembranfraktionen und MCH oder seine Derivate oder Salze davon.
Die Screening-Kits gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten z.B. Folgendes:
1. Reagenzien zum Screenen
(1) Puffer zum Test und zum Waschen

Hank's ausgeglichene Salzlösung (hergestellt von Gibco BRL), ergänzt mit 0,05% Rinderserumalbumin (hergestellt von Sigma Co.).

Die Puffer können durch Filtration durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm sterilfiltriert werden und bei 4°C aufbewahrt werden oder zur Verwendung hergestellt werden.
(2) SLC-1-Präparat
SLC-1 exprimierende CHO-Zellen werden mit 5 × 10⁵ Zellen/Napf auf einer 12-Napf-Platte subkultiviert und anschließend bei 37°C unter 5% CO₂ und 95% Luft 2 Tage lang gezüchtet.
(3) Markierter Ligand
MCH markiert mit [³H], [¹²⁵I], [¹⁴C], [³⁵S] etc. Eine Lösung des markieren Liganden in einem geeigneten Lösungsmittel oder Puffer wird bei 4°C oder bei –20°C aufbewahrt und mit einem Puffer zum Test auf eine Konzentration von 1 μM verdünnt.
(4) Standardligandenlösung
MCH wird in PBS, das 0,1% Rinderserumalbumin (hergestellt von Sigma) enthält, gelöst, was eine Konzentration von 1 mM liefert und die Lösung wird bei –20°C aufbewahrt.
2. Testmethode

(1) SLC-1 exprimierende Zellen, die auf einer 12-Napf-Kulturplatte gezüchtet worden sind, werden zweimal mit 1 ml Testpuffer gewaschen und anschließend wird jedem Napf 490 μl Testpuffer zugegeben.
(2) Nach Zugabe von 5 μl einer 10^–3 bis 10^–10 M Lösung einer Testverbindung werden 5 μl markiertes MCH zugegeben und anschließend bei Raumtemperatur 1 Stunde lang reagieren gelassen. Um die Menge der nichtspezifischen Bindung zu bestimmen, werden 5 μl des Liganden (MCH) mit 10^–3 M anstelle der Testverbindung zugegeben.
(3) Die Reaktionsmischung wird entnommen und die Zellen werden dreimal mit jeweils 1 ml Puffer gewaschen. Der markierte Ligand (MCH), der an die Zellen gebunden ist, wird in 0,2 n NaOH-1% SDS gelöst und die Lösung wird mit 4 ml Flüssigszintillator A (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gemischt.
(4) Die Radioaktivität wird gemessen unter Verwendung eines Szintillationszählers (hergestellt von Beckman). Der Prozentanteil der maximalen Bindung (PMB) wird aus der folgenden Gleichung berechnet [Gleichung 1]

[Gleichung 1]

PMB = [(B – NSB)/(B0 – NSB)] × 100,worin

PMB:

Prozentanteil der maximalen Bindung

B:

Radioaktivität, wenn eine Probenflüssigkeit zugegeben wird

NSB:

nichtspezifische Bindung

B₀:

maximale Bindung

Die Verbindung oder ihr Salz, die durch das Screening-Verfahren oder mit dem Screening-Kit der vorliegenden Erfindung erhältlich sind, sind Verbindungen, die die Bindung zwischen MCH oder seinem Salz und SLC-1 oder seinem Salz verändern (hemmen oder fördern), spezifisch eine Verbindung oder deren Salze mit einer SLC-1-vermittelten zellstimulierenden Aktivität (so genannte SLC-1-Agonisten) oder eine Verbindung mit keiner zellstimulierenden Aktivität (so genannte SLC-1-Antagonisten). Beispiele für die Verbindung schließen ein Peptid, ein Protein, eine Nichtpeptidverbindung, eine synthetische Verbindung, ein Fermentationsprodukt etc. ein und die Verbindung kann entweder eine neue oder bekannte Verbindung sein.
Um zu bestimmen, ob die Verbindung ein SLC-1-Agonist oder -Antagonist ist, ist das folgende spezifische Verfahren (i) oder (ii) verfügbar.

(i) Der oben bei den Screening-Methoden von (l) bis (3) beschriebene Bindungstest wird durchgeführt, um die Verbindung zu erhalten, die die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinen Salzen und SLC-1 oder seinen Salzen verändert (insbesondere die Bindung hemmt), gefolgt von dem Test für die Verbindung, um zu bestimmen, ob die Verbindung die oben beschriebenen SLC-1-vermittelten zellstimulierenden Aktivitäten hat. Die Verbindung mit den zellstimulierenden Aktivitäten oder ihre Salze sind SLC-1-Agonisten, wohingegen die Verbindung ohne eine solche Aktivität oder deren Salze SLC-1-Agonisten sind.
(ii) (a) Eine Testverbindung wird mit SLC-1-haltigen Zellen in Kontakt gebracht, um die durch SLC-1-vermittelten zellstimulierenden Aktivitäten zu untersuchen. Die Verbindung mit zellstimulierenden Aktivitäten oder deren Salze sind SLC-1-Agonisten.
(b) Die SLC-1-vermittelten zellstimulierenden Aktivitäten werden sowohl untersucht, wenn eine Verbindung (z.B. das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein SLC-1-Agonist etc.), die das SLC-1 aktiviert, in Kontakt gebracht wird mit den SLC-1-haltigen Zellen als auch dann, wenn die Verbindung, die SLC-1 aktiviert und eine Testverbindung in Kontakt mit den SLC-1-haltigen Zellen gebracht werden und die zellstimulierenden Aktivitäten in beiden Fällen verglichen werden. Die Verbindung oder ihre Salze, die die zellstimulierenden Aktivitäten der SLC-1 aktivierenden Verbindung vermindern können, sind SLC-1-Antagonisten.

Die SLC-1-Agonisten zeigen Aktivitäten, die den physiologischen Aktivitäten ähnlich sind, die MCH oder seine Salze besitzen und sie sind nützlich als sichere und wenig toxische Wirkstoffe, wie MCH oder seine Salze.
Im Gegensatz dazu sind, da SLC-1-Antagonisten die physiologischen Aktivitäten, die MCH oder seine Salze besitzen, unterdrücken kann, diese nützlich als sichere und wenig toxische Wirkstoffe zur Unterdrückung der Rezeptoraktivität.
Da MCH oder seine Salze an einer Appetit (ess-)fördernden Aktivität, einer Oxytocinsekretion fördernden Aktivität etc. teilnehmen, können MCH oder seine Salze als Appetit (ess-)förderndes Mittel, die Oxytocinsekretion förderndes Mittel etc. eingesetzt werden. In den Verbindungen, die unter Verwendung der oben beschriebenen Screening-Methode oder des oben beschriebenen Screening-Kits erhältlich sind, sind daher SLC-1-Agonisten nicht nur als Appetit (ess-)hemmendes Mittel, sondern auch als prophylaktisches/therapeutisches Mittel für schwache Wehen, atonische Blutung vor und nach Austreibung, Subinvolution des Uterus, Kaiserschnitt, Abtreibung, Galactostasis, Anorexie, wie Anorexia nervosa und davon begleitete Anämie, Hypoproteinose etc. verfügbar und die SLC-1-Agonisten sind nicht nur als Antifettsuchtmittel (Wirkstoff), Appetit-(Ess)-Modulator etc. verfügbar, sondern auch als prophylaktisches/therapeutisches Mittel für Hyperstimulierung, ankylosierende Ge bärmutterkontraktionen, Fetal Distress, Gebärmutterriss, Einreißen des Gebärmuttermundes, Frühgeburt, Prader-Willi-Syndrom, Diabetes mellitus und ihre Komplikationen (diabetische Nephropathie, diabetische Retinopathie, diabetische Neuropathie etc.), Bluthochdruck, Hyperlipämie, Coronarsklerose, Gicht, Atemwegskrankheiten (Pickwick-Syndrom, Schlafapnoe), Fettleber, Sterilität, Osteoarthritis deformans etc. (insbesondere Antifettsuchtmittel, Appetitmodulator etc.).
Als Salze der Verbindungen, die mit dem oben beschriebenen Screening-Verfahren oder Screening-Kit erhältlich sind, werden pharmazeutisch annehmbare Salze angewendet. Beispiele für solche Salze schließen Salze mit anorganischen Basen, Salze mit organischen Basen, Salze mit anorganischen Säuren, Salze mit organischen Säuren und Salze mit basischen oder sauren Aminosäuren etc. ein.
Bevorzugte Beispiele der Salze mit anorganischen Basen schließen Alkalisalze, wie Natriumsalze, Kaliumsalze etc., Erdalkalisalze, wie Calciumsalze, Magnesiumsalze etc., Aluminiumsalze, Ammoniumsalze und dgl. ein.
Bevorzugte Beispiele der Salze mit organischen Basen schließen Salze mit Trimethylamin, Triethylamin, Pyridin, Picolin, 2,6-Lutidin, Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Cyclohexylamin, Dicyclohexylamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin etc. ein.
Bevorzugte Beispiele der Salze mit anorganischen Säuren schließen Salze mit Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure etc. ein.
Bevorzugte Beispiele der Salze mit organischen Säuren schließen Salze mit Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Fumarsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Citronensäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Benzoesäure etc. ein.
Bevorzugte Beispiele der Salze mit basischen Aminosäuren schließen Salze mit Arginin, Lysin, Ornithin etc. ein. Bevorzugte Beispiele der Salze mit sauren Aminosäuren schließen Salze mit Asparaginsäure, Glutaminsäure etc. ein.
In der Beschreibung und den Zeichnungen werden dann, wenn Basen, Aminosäuren etc. durch Abkürzungen dargestellt werden, die Codes für Basen und Aminosäuren gemäß der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature angegeben oder die Codes, die üblicherweise im Stand der Technik verwendet werden, wovon Beispiele unten gezeigt sind. Im Hinblick auf Aminosäuren, die optische Isomeren haben können, ist die L-Form bezeichnet, wenn nicht anders angegeben.

DNA:: Desoxyribonucleinsäure
cDNA:: komplementäre Desoxyribonucleinsäure,
A:: Adenin
T:: Thymin
G:: Guanin
C:: Cytosin
Y:: Thymin oder Cytosin
N:: Thymin, Cytosin, Adenin oder Guanin
R:: Adenin oder Guanin
M:: Cytosin oder Adenin
W:: Thymin oder Adenin
S:: Cytosin oder Guanin
RNA:: Ribonucleinsäure
mRNA:: Messenger-Ribonucleinsäure
dATP:: Desoxyadenosintriphosphat
dTTP:: Desoxythymidintriphosphat
dGTP:: Desoxyguanosintriphosphat
dCTP:: Desoxycytidintriphosphat
ATP:: Adenosintriphosphat
EDTA:: Ethylendiamintetraessigsäure
SDS:: Natriumdodecylsulfat
TFA:: Trifluoressigsäure
EIA:: Enzymimmunoassay
Gly oder G:: Glycin
Ala oder A:: Alanin
Val oder V:: Valin
Leu oder L:: Leucin
Ile oder I:: Isoleucin
Ser oder S:: Serin
Thr oder T:: Threonin
Cys oder C:: Cystein
Met oder M:: Methionin
Glu oder E:: Glutaminsäure
Asp oder D:: Asparaginsäure
Lys oder K:: Lysin
Arg oder R:: Arginin
His oder H:: Histidin
Phe oder F:: Phenylalanin
Tyr oder Y:: Tyrosin
Trp oder W:: Tryptophan
Pro oder P:: Prolin
Asn oder N:: Asparagin
Gln oder Q:: Glutamin
pGlu:: Pyroglutaminsäure
Me:: Methylgruppe
Et:: Ethylgruppe
Bu:: Butylgruppe
Ph:: Phenylgruppe
Tc:: Thiazolidin-4(R)-carboxamidgruppe
Bom:: Benzyloxymethyl
NMP:: N-Methylpyrrolidon
PAM:: Phenylacetamidomethyl

Die Substituenten, Schutzgruppen und Reagenzien, die häufig in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, werden durch die folgenden Symbole dargestellt.

Tos:: p-Toluolsulfonyl
HONB:: N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid
Bzl:: Benzyl
Z:: Benzyloxycarbonyl
Br-Z:: 2-Brombenzyloxycarbonyl
Cl-Z:: 2-Chlorbenzyloxycarbonyl
Boc:: t-Butoxycarbonyl
HOBt:: 1-Hydroxybenztriazol
DCC:: N,N'-Dichlorhexylcarbodiimid
TFA:: Trifluoressigsäure
Fmoc:: N-9-Fluorenylmethoxycarbonyl
DNP:: Dinitrophenol
Bum:: t-Butoxymethyl
Trt:: Trityl
BSA:: Rinderserumalbumin
CHAPS:: 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat
PMSF:: Phenylmethylsulfonylfluorid
E64:: (L-3-trans-Carboxiran-2-carbonyl)-L-leucylagmatin
GDP:: Guanosin-5'-diphosphat
MEMα:: Minimalessentialmedium alpha
Fura-2AM:: Pentacetoxymethyl-1-[6-amino-2-(5-carboxy-2-oxazolyl)-5-benzofuranyloxy]-2-(2-amino- 5-methylphenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraacetat
HBSS:: Hanks' ausgeglichene Salzlösung
Fluo-3AM:: Pentacetoxymethyl-1-[2-amino-5-(2,7-dichlor-6-hydroxy-3-oxy-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2- amino-5-methylphenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraacetat
HEPES:: 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonsäure
MeBzl:: 4-Methylbenzyl
NMP:: N-Methylpyrrolidon

Die Sequenzidentifizierungsnummern in dem Sequenzprotokoll der Beschreibung zeigen die folgenden Sequenzen.
[SEQ ID Nr. 1]
Dies zeigt eine Aminosäuresequenz, die durch N-terminale Aminosäuresequenzanalyse eines Ligandenpeptids des SLC-1, gereinigt aus Rattenhirn, erhalten wurde.
[SEQ ID Nr. 2]
Dies zeigt eine Aminosäuresequenz eines Ligandenpeptids des SLC-1, das aus Rattengehirn gereinigt wurde, das als Ratten-MCH identifiziert wurde.
[SEQ ID Nr. 3]
Dies zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wurde, um cDNA, die Ratten-SLC-1 codiert, zu screenen.
[SEQ ID Nr. 4]
Dies zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wurde, um cDNA, die Ratten-SLC-1 codiert, zu screenen.
[SEQ ID Nr. 5]
Dies zeigt die Aminosäuresequenz voller Länge von Ratten-SLC-1.
[SEQ ID Nr. 6]
Dies zeigt die Basensequenz voller Länge von Ratten-SLC-1-cDNA, der die Sal-I-Erkennungssequenz am 5'-Ende und die Spe-I-Erkennungssequenz am 3'-Ende zugefügt wurde.
[SEQ ID Nr. 7]
Dies zeigt eine Ribosonde, die verwendet wurde, um die Menge an SLC-1-mRNA zu messen, die in jedem Klon von Ratten-SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen exprimiert wird.
[SEQ ID Nr. 8]
Dies zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wurde, um cDNA, die menschliches SLC-1 codiert, zu finden.
[SEQ ID Nr. 9]
Dies zeigt einen Primer, der verwendet wurde, um cDNA, die menschliches SLC-1 codiert, in Doppelstränge umzuwandeln.
[SEQ ID Nr. 10]
Dies zeigt eine Basensequenz voller Länge der cDNA, die menschliches SLC-1 codiert.
[SEQ ID Nr. 11]
Dies zeigt die Aminosäuresequenz voller Länge von menschlichem SLC-1.
[SEQ ID Nr. 12]
Dies zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wurde, um cDNA, die menschliches SLC-1 (S) codiert, zu screenen.
[SEQ ID Nr. 13]
Dies zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wurde, um cDNA, die menschliches SLC-1 (S) codiert, zu screenen.
[SEQ ID Nr. 14]
Dies zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wurde, um cDNA, die menschliches SLC-1 (L) codiert, zu screenen.
[SEQ ID Nr. 15]
Dies zeigt eine synthetische DNA, die verwendet wurde, um cDNA, die menschliches SLC-1 (L) codiert, zu screenen.
[SEQ ID Nr. 16]
Dies zeigt die Basensequenz voller Länge von menschlicher SLC-1(S)-cDNA, worin die Sal-I- Erkennungssequenz am 5'-Ende zugefügt wurde und die Spe-I-Erkennungssequenz am 3'-Ende zugefügt wurde.
[SEQ ID Nr. 17]
Dies zeigt die Basensequenz voller Länge von menschlicher SLC-1(L)-cDNA, worin die Sal-I-Erkennungssequenz am 5'-Ende zugefügt wurde und die Spe-I-Erkennungssequenz am 3'-Ende zugefügt wurde.
[SEQ ID Nr. 18]
Dies zeigt eine Ribosonde, die verwendet wurde, um die Menge an SLC-1-mRNA zu messen, die in jedem Klon von menschliches SLC-1 (S) exprimierenden CHO-Zellen und menschliches SLC-1 (L) exprimierenden CHO-Zellen exprimiert wird.
[SEQ ID Nr. 19]
Dies zeigt eine Aminosäuresequenz von Des-Asp¹-MCH (MCH (2-19)).
[SEQ ID Nr. 20]
Dies zeigt eine Aminosäuresequenz von Des-[Asp¹, Phe²]-MCH (MCH (3-19)).
[SEQ ID Nr. 21]
Dies zeigt eine Aminosäuresequenz von Des-[Asp¹, Phe², Asp³]-MCH (MCH (4-19)).
[SEQ ID Nr. 22]
Dies zeigt eine Aminosäuresequenz von Des-[Asp¹, Phe², Asp³, Met⁴]-MCH (MCH (5-19)).
[SEQ ID Nr. 23]
Dies zeigt eine Aminosäuresequenz von Des-[Asp¹, Phe², Asp³, Met⁴, Leu⁵]-MCH (MCH (6-19)).
[SEQ ID Nr. 24]
Dies zeigt eine Aminosäuresequenz von Des-[Asp¹, Phe², Asp³, Met⁴, Leu⁵, Arg⁶]-MCH (MCH (7-19)).
Transformierte Escherichia coli DH10B/phSLC1L8, die mit dem Plasmid transformiert waren, das eine DNA enthielt, die die in SEQ ID Nr. 11 gezeigte Basensequenz codiert, die in Beispiel 8 erhalten wurden, wurden beim Ministry of International Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH) mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6632 am 1. Februar 1999 und beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO) mit der Hinterlegungsnummer IFO 16254 am 21. Januar 1999 hinterlegt.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird unten im Detail unter Bezugnahme auf Beispiele und Referenzbeispiele beschrieben, die aber den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung nicht darauf beschränken sollen.
Referenzbeispiel 1
Nachweis der Aktivität, die in Rattenhirnextrakt enthalten ist und die cAMP-Synthese in CHO/SLC-1-Zellen spezifisch hemmt
Fraktionen von Rattenhirnextrakt wurden mit Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) mit der unten beschriebenen Methode hergestellt. Gehirne wurden 100 Wistar-Ratten (männlich, 8 Wochen alt), die von Charles River Co. erworben worden waren, entnommen und sofort in 0,8 l siedendes destilliertes Wasser gegeben und anschließend 10 Minuten lang gekocht. Direkt nach dem Sieden wurden die Gehirne auf Eis gekühlt und 48 ml Essigsäure wurde auf eine Endkonzentration von 1,0 M zugegeben. Unter Verwendung eines Polytrons (20.000 U/min, 6 min) wurden die Zellen aufgeschlossen Die Zellaufschlussflüssigkeit wurde zentrifugiert (8.000 U/min, 30 min). Der Überstand wurde herausgenommen und zu dem Niederschlag wurden 0,8 1 1,0 M Essigsäure zugegeben. Die Zellen wurden wiederum mit cfem Polytron und anschließend mit Zentrifugation (8.000 U/min, 30 min) aufgeschlossen. Es wurde ein Überstand erhalten. Nachdem 0,8 l 1,0 M Essigsäure zu dem Niederschlag zugegeben worden waren, wurde die Mischung wiederum mit dem Polytron aufgeschlossen. Nach Rühren über Nacht wurde eine Zentrifugation (8.000 U/min, 30 min) durchgeführt, um den Überstand zu erhalten. Nachdem ein zweifaches Volumen an gekühltem Aceton tropfenweise langsam zu dem Überstand bei 4°C zugegeben worden war, wurde der bei der ersten Zentrifugation erhaltene Überstand über Nacht gerührt und der durch die zweite Zentrifugation erhaltene Überstand wurde 4 Stunden lang gerührt. Der Extrakt, dem Aceton zugefügt worden war, wurde zentrifugiert (8.000 U/min, 30 min), um den Niederschlag zu entfernen. Das Aceton wurde im Vakuum von dem erhaltenen Überstand abgedampft unter Verwendung eines Verdampfers. Nachdem ein gleiches Volumen an Diethylether zu dem acetonfreien Extrakt zugegeben worden war, wurde die etherische Phase, die Lipide enthielt, abgetrennt unter Verwendung eines Scheidetrichters, um die wässrige Phase zu gewinnen. Die Lipide wurden mit Ether entfernt und der Extrakt wurde im Vakuum eingeengt unter Verwendung eines Verdampfers, um den Ether vollständig zu entfernen. Das Konzentrat wurde durch ein Glasfaserfilterpapier (Advantech, DP70 (90 mm ∅)) filtriert und das Filtrat wurde auf eine Säule aus Glas (20 mm ∅ × 240 mm), die mit C18 (YMC, YMCgel ODS-AM120-S50) gepackt war, geladen. Nach Waschen mit 300 ml 1,0 M Essigsäure wurde die Säule mit 300 ml 60% Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt, um das Lösungsmittel abzudestillieren. Das Konzentrat wurde dann lyophilisiert. Etwa 0,24 g des lyophilisierten Produkts wurden in 5 ml DMSO gelöst und dann wurden 45 ml 1,0 M Essigsäure zu der Lösung zugefügt, um ein Rattenhirnextraktpräparat herzustellen. Das Rattenhirnextraktpräparat wurde über eine SP-Sephadex-C-25-Säule (Amersham Pharmacia Biotech, Gelvolumen: 100 ml) geleitet, die mit 1,0 M Essigsäure equilibriert worden war. Nach Waschen mit 50 ml 1,0 M Essigsäure wurden aufeinander folgend eine Fraktion, die mit 100 ml 2,0 M Pyridin eluierte, und eine Fraktion, die mit 100 ml 2,0 M Pyridin/Essigsäure eluierte, erhalten. Das 2,0 M Pyridin/Essigsäure-Eluat wurde im Vakuum eingeengt, um das Lösungsmittel abzudestillieren und das Konzentrat wurde lyophilisiert. Etwa 100 mg des lyophilisierten Produkts wurden in 10 ml 10% Aceto nitril, das 0,1 % Trifluoressigsäure enthielt, gelöst. Auf die Lösung wurde eine HPLC angewendet mit einer Elution mit Acetonitrildichtegradienten von 10 bis 60% Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt unter Verwendung einer C18-Säule (TOSO, TSKgel ODS-80T_B (21,5 mm ∅ × 300 mm)). Jede Fraktion wurde eingeengt und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 0,2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst.
Die CHO/SLC-1-Zellen, die in Beispiel 4 hergestellt worden waren, und Blind-CHO-Zellen wurden auf eine 24-Napf-Platte mit 5 × 10⁴ Zellen/Napf geimpft. Nach 48-stündiger Inkubation wurden die Zellen mit Hank's ausgeglichener Salzlösung (pH 7,4), die mit 0,2 mM 3-Isobutylmethylxanthin, 0,05% BSA und 20 mM HEPES ergänzt war (im Folgenden wird die Hank's ausgeglichene Salzlösung (pH 7,4), die mit 0,2 mM 3-Isobutylmethylxanthin, 0,05% BSA und 20 mM HEPES ergänzt ist, als Reaktionspuffer bezeichnet) gewaschen. Danach wurden 0,5 ml des Reaktionspuffers zu den Zellen zugefügt, die dann 30 Minuten lang in dem Medium warm gehalten wurden. Der Reaktionspuffer wurde entfernt und 0,25 ml frischer Reaktionspuffer wurde den Zellen zugegeben. Dann wurden 0,25 ml des Reaktionspuffers, der die HPLC-Fraktion und 2 μM Forskolin enthielt, den Zellen zugegeben und anschließend 24 Minuten lang bei 37°C umgesetzt. Indem 100 μl 20% Perchlorsäure zugegeben wurden, wurde die Reaktion beendet. Die Reaktionsmischung wurde dann 1 Stunde auf Eis stehen gelassen, um intrazelluläres cAMP zu extrahieren. Die Menge an cAMP in dem Extrakt wurde gemessen unter Verwendung eines cAMP-EIA-Kits (Amersham Pharmacia Biotech). Als Ergebnis wurde in den Fraktionen #33, #34 und #35 eine die cAMP-Synthese hemmende Aktivität, die für die CHO/SLC-1-Zellen spezifisch ist, nachgewiesen (1). In 1 wurde die Menge, die erhalten wurde, indem die intrazelluläre cAMP-Menge, wenn Reaktionspuffer zugegeben wurde, von der intrazellulären cAMP-Menge, wenn forskolinhaltiger Reaktionspuffer zugegeben wurde, abgezogen wurde, als 100% genommen, und die cAMP-Synthese hemmende Aktivität wurde ausgedrückt in Prozent als intrazelluläre cAMP-Menge, die erhalten wurde, indem die intrazelluläre cAMP-Menge, wenn der Reaktionspuffer zugegeben wurde, von der intrazellulären cAMP-Menge, wenn die HPLC-Fraktion zugegeben wurde, abgezogen wurde (1 μl Aliquot aus jeder Fraktion 100-fach verdünnt mit DMSO, wurde zugegeben).
Referenzbeispiel 2
Inaktivierung der aktiven Substanz, die cAMP-Synthese hemmende Aktivität zeigt, die für SLC-1 exprimierende CHO-Zellen im Rattenhirnextrakt spezifisch ist, mit Pronase
Die HPLC-Fraktion #34, von der gefunden wurde, dass sie eine die cAMP-Synthese hemmende Aktivität auf die CHO/SLC-1-Zellen in Referenzbeispiel 1 hatte, wurde mit einer Pronase (Sigma, Protease Typ XIV (P5147)) behandelt, die ein proteolytisches Enzym ist, um zu untersuchen, ob die aktive Substanz proteinhaltig ist.
Die HPLC-Fraktion (#34), 2 μl, aus dem oben beschriebenen Rattenhirnextrakt wurde zu 100 μl 0,2 M Ammoniumacetat zugefügt und 3 μg Pronase wurden zu der Mischung zugegeben. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37°C wurde die Reaktionsmischung in siedendem Wasser 10 Minuten lang gesiedet, um die Pronase zu inaktivieren. Zu der Reaktionslösung wurden 2 ml destilliertes Wasser, das 0,05 mg BSA und 0,05 mg CHAPS enthielt, zugegeben und anschließend lyophilisiert. Um zu untersuchen, ob die Pronase selbst oder die Erhitzung und Lyophilisierung irgendeine Wirkung auf den Test hatte, wurden Pronase allein, die HPLC-Fraktion allein und eine Mischung von HPLC-Fraktion und Pronase, für die die Pronase allein erhitzt worden war, auf gleiche Art und Weise behandelt und lyophilisiert. Jede so lyophilisierte Probenflüssigkeit wurde in einem Reaktionspuffer, der 2 μM Forskolin enthielt, gelöst. Jede Lösung wurde zu den CHO/SLC-1-Zellen zugegeben mit den in Referenzbeispiel 1 beschriebenen Verfahren und die cAMP-Synthese hemmende Aktivität wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Da die aktive Substanz, die die cAMP-Synthese hemmende Aktivität gegen CHO/SLC-1-Zellen in Rattenhirnextrakt zeigt, völlig inaktiviert wurde, ergab sich, dass die Substanz ein Protein oder Peptid ist.
Referenzbeispiel 3
Reinigung der aktiven Substanz, die eine die cAMP-Synthese hemmende Aktivität zeigt, die spezifisch für die Ratten-SLC-1/CHO-Zellen aus Rattenhirn ist
Ein repräsentatives Beispiel zur Reinigung der aktiven Substanz, die cAMP-Synthese hemmende Aktivität spezifisch für SLC-1/CHO-Zellen zeigt, aus Rattenhirn, wird konkret unten beschrieben.
Die Fraktion #33, von der gefunden wurde, dass sie in Referenzbeispiel 1 wirksam war, wurde wie folgt gereinigt. Nachdem die aktive Fraktion im Vakuum eingeengt worden war, um das Lösungsmittel zu entfernen, wurde das Konzentrat lyophilisiert. Die lyophilisierte aktive Substanz wurde in 5 ml 10 mM Ammoniumformiat (pH 5,25), das 10% Acetonitril enthielt, gelöst. Die Lösung wurde über eine Kationenaustauschersäule (TOSO, TSKgel CM-2SW (4,6 mm ∅ × 150 mm)) geleitet. Anschließend wurde die Säule mit einem Dichtegradienten von 10 nM bis 500 mM Ammoniumformiat (pH 5,25), das 10% Acetonitril enthielt, eluiert. Die Aktivität wurde bei etwa 320 nM Ammoniumformiat gewonnen. Zu 2 ml der aktiven Fraktion wurden 2,5 ml 10% Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, zugegeben. Nachdem die Mischung über eine Diphenylsäule (Separation Group, Vydac 219-TP54) geleitet worden war, wurde die Elution mit einem Dichtegradienten von 27,5% bis 42,5% Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, durchgeführt. Die Aktivität zeigte sich bei ungefähr 31,3% Acetonitril. Nachdem 4,4 ml 10% Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, zu 0,96 ml der aktiven Fraktion zugefügt worden waren, wurde die Mischung über eine ODS-Säule (Nomura Kagaku, Develosil ODS-UG-3) geleitet, die Elution wurde mit einem Dichtegradienten von 27,5% bis 42,5% Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, durchgeführt. Das Eluat wurde manuell für jeden Peak fraktioniert. Die Aktivität zeigte sich bei ungefähr 36,8% Acetonitril (Fraktion Nr. 16) als einzelner Peak (3).
Referenzbeispiel 4
Identifizierung der aktiven Substanzen als Ratten-MCH, das cAMP-Synthese hemmende Aktivität spezifisch bei Ratten-SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen zeigt, die aus Rattenhirn gereinigt wurden
Die aktive Substanz, die eine die cAMP-Synthese hemmende Aktivität spezifisch für Ratten-SLC-1 exprimierende CHO-Zellen zeigte, die in Referenzbeispiel 3 gereinigt wurde, wurde einer Strukturanalyse unterzogen. Da davon ausgegangen wurde, dass die aktive Substanz ein Protein oder Peptid sein könnte, wie in Referenzbeispiel 2 gezeigt, wurde eine aminoterminale Aminosäuresequenzanalyse durchgeführt mit einem LF3400-Proteinsequenzautomaten von Beckman unter Verwendung der Eluate, die den aktiven Peak enthielten. Als Ergebnis wurde die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Sequenz erhalten. Während der Sequenzierungsreaktion wurde ein PTH-Derivat von Dehydroalanin, das aus einem Cys-Rest erzeugt worden war, bei den Resten 7 und 16 nachgewiesen, die als Cys identifiziert wurden. Diese Sequenz stimmte überein mit der Aminosäuresequenz des N-Endes bis Rest 16 eines Rattenmelanin konzentrierenden Hormons (MCH). Wenn diese aktive Substanz an einem Massenspektromotor JEOL HX110 analysiert wurde, wurde ein Signal bei m/z 2387,3 beobachtet, was fast übereinstimmt mit dem Molekulargewicht von Ratten-MCH. Somit wurde die Sequenz von Ratten-MCH (SEQ ID Nr. 2) als wahrscheinliche Aminosäuresequenz der aktiven Substanz bestimmt. Die aktiven Fraktionen #34 und #35, die auch in Referenzbeispiel 3 erhalten wurden, wurden auch gereinigt und ergaben aktive Substanzen. Es wurde bestätigt, dass beide Aktivitäten Ratten-MCHs waren. Weiterhin zeigte gemäß dem Test zum Nachweis einer die cAMP-Produktion hemmenden Aktivität, der durchgeführt wurde gemäß dem Verfahren, das später in Beispiel 5 beschrieben wird, das von Peninsula Co. erworbene Ratten-MCH die hemmende Aktivität dosisabhängig bei Ratten-SLC-1 exprimierenden Zellen.
Beispiel 1
Amplifikation von Ratten-SLC-1-Rezeptor-cDNA mit PCR unter Verwendung von aus Rattenhirn stammender cDNA
Unter Verwendung von aus Rattenhirn stammender Poly(A)⁺-RNA (Clontech Laboratories, Inc.) als Matrize wurde eine reverse Transkription durchgeführt unter Verwendung statistischer Primer. Für die reverse Transkription wurden Reagenzien, die von Takara RNA PCR ver. 2 kit erhältlich sind, verwendet. Als Nächstes wurde unter Verwendung des reversen Transkriptionsprodukts als Matrize die Amplifikation mit PCR durchgeführt unter Verwendung der synthetischen DNA-Primer, die in SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 gezeigt sind. Die synthetischen DNA-Primer wurden konstruiert, um die Gene in dem zu Rezeptorproteinen zu translatierenden Bereich zu amplifizieren. In diesem Fall wurden Erkennungssequenzen der jeweiligen Restriktionsenzyme an den 5'- und 3'-Enden zugefügt, so dass die von dem Restriktionsenzym Sal I erkannte Basensequenz am 5'-Ende des Gens zugefügt wurde und die von dem Restriktionsenzym Spe I erkannte Basensequenz am 3'-Ende zugefügt wurde. Die Reaktionslösung war zusammengesetzt aus 5 μl cDNA-Matrize, jeweils 0,4 μM synthetische DNA-Primer, 0,25 mM dNTPs, 0,5 μl pfu (Stratagene Co.) DNA-Polymerase und einem dem Enzym zugefügten Puffer, die miteinander vermischt wurden, um das Gesamtvolumen auf 50 μl zu bringen. Unter Verwendung einer Wärmewechselvorrichtung (Thermal Cycler) (Perkin Elmer Co.) zur Amplifikation wurde 60 s auf 94°C erhitzt und anschließend 35 Mal ein Zyklus wiederholt, der eingestellt war mit 60 s bei 94°C, 30 s bei 60°C und 150 s bei 72°C und schließlich wurde 10 min bei 72°C umgesetzt. Das amplifizierte Produkt wurde bestätigt mit 0,8% Agarosegelelektrophorese und anschließendem Anfärben mit Ethidiumbromid.
Beispiel 2
Subklonierung des PCR-Produkts in einem Plasmidvektor und Bestätigung der amplifizierten cDNA-Sequenz durch Decodierung einer Basensequenz des insertierten cDNA-Teils
Das mit PCR in Beispiel 1 erhaltene PCR-Produkt wurde aufgetrennt unter Verwendung eines 0,8% Agarosegels mit niedrigem Schmelzpunkt. Der Bandenteil wurde aus dem Gel mit einer Rasierklinge herausgeschnitten, in kleine Stücke geschnitten, mit Phenol und dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und in Ethanol ausge fällt, um DNAs zu gewinnen. Gemäß dem dem PCR-Script^TM Amp SK(⁺) Cloning Kit (Stratagene Co.) beigefügten Protokoll wurden die gewonnenen DNAs in Plasmidvektor pCR Script Amp SK(⁺) subkloniert. Der rekombinante Vektor wurde in Escherichia coli XL-1 Blue (Stratagene Co.) eingeführt, um Transformanten zu erzeugen. Die Klone mit einem darin insertierten cDNA-Fragment wurden in einem LB-Agarmedium selektiert, das Ampicillin und X-gal enthielt. Nur die Klone, die eine weiße Farbe zeigten, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher herausgepickt, um transformierte E. coli-XL-1Blue/Ratten-SLC-1 zu erhalten. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in einem LB-Medium, das Ampicillin enthielt, kultiviert. Plasmid-DNAs wurden erstellt unter Verwendung von QIA prep8 mini prep (Qiagen Co.). Ein Aliquot der so hergestellten DNAs wurde mit den Restriktionsenzymen Sal I und Spe I gespalten, um die Größe des insertierten Rezeptor-cDNA-Fragments zu bestätigen. Die Reaktion zur Basissequenzierung wurde durchgeführt unter Verwendung des DyeDeoxyTerminator Cycle Sequence Kit (Perkin-Elmer Co.), und anschließend mit einem Fluoreszenz-Sequenzautomaten decodiert. Es wurde durch Sequenzanalyse bestätigt, dass die Sequenzen, die von drei Klonen erhalten worden waren, übereinstimmten mit der Gensequenz in der cDNA-Sequenz (B. Lakaye et al., Biochim. Biophys. Acta, Bd. 1401, Seiten 216–220 (1998), Hinterlegungsnummer AF08650), die Ratten-SLC-1-Protein codiert (SEQ ID Nr. 5) mit der darin angegebenen Sequenz voller Länge, wobei die Sal-I-Erkennungssequenz am 5'-Ende zugefügt war und die Spe-I-Erkennungssequenz am 3'-Ende (SEQ ID Nr. 6).
Beispiel 3
Herstellung von Ratten-SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen
Unter Verwendung des Plasmid Midi Kit (Qiagen Co.) wurde ein Plasmid hergestellt aus Klonen von E. coli, die mit dem Plasmid, das die Aminosäuresequenz von aus Rattengehirn stammenden SLC-1 voller Länge codierte, transformiert waren, wobei die Sequenz in Beispiel 2 bestätigt worden war mit der Sal-I-Erkennungssequenz, die am 5'-Ende zugefügt war und der Spe-I-Erkennungssequenz, die am 3'-Ende zugefügt war. Das Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen Sal I und Spe I gespalten, um den Insertteil daraus auszuschneiden. Nach Elektrophorese wurde die insertierte DNA aus dem Agarosegel mit einer Rasierklinge ausgeschnitten, in kleine Stücke geschnitten und mit Phenol und dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und anschließend in Ethanol ausgefällt, um die insertierte DNA zu gewinnen. Die insertierte DNA wurde dem mit Sal I und Spe I gespaltenen Vektorplasmid pAKK0-111H für Tierzellexpression zugefügt (wie Vektorplasmid pAKK01.11H, das bei S. Hinuma et al., Biochim. Biophys. Acta, Bd. 1219, Seiten 251–259 (1994) beschrieben wurde) und anschließend unter Verwendung von T4-Ligase (Takara Shuzo Co.) ligiert. Somit wurde das Plasmid pAKK0-SLC-1 zur Proteinexpression konstruiert.
Nachdem mit pAKK0-SLC-1 transformierter E. coli DH5 (Toyobo Co.) kultiviert worden war, wurde Plasmid-DNA aus pAKK0-SLC-1 hergestellt unter Verwendung von Plasmid Midi Kit (Qiagen Co.). Unter Verwendung des CellPhect Transfection Kits (Amersham Pharmacia Biotech Co.) wurde die Plasmid-DNA in CHO-dhfr^–-Zellen eingeführt gemäß dem dem Kit beigefügten Protokoll. DNA, 10 μg, wurden mit Calciumphosphat in Suspension gleichzeitig ausgefällt. Die Suspension wurde in eine 10-cm-Petrischale gegeben, auf die 5 × 10⁵ oder 1 × 10⁶ CHO-dhfr^–-Zellen 24 Stunden vorher geimpft worden waren. Die Zellen wurden in MEMα-Medium, das 10% fötales Kälberserum enthielt, 1 Tag lang gezüchtet. Nach Passage wurden die Zellen in nucleinsäurefreiem MEMα-Medium, das 10% dialysiertes fötales Kälberserum enthielt, zur Selektion kultiviert und 56 Klone von transformierten SLC-I-Expressions-CHO-Zellen wurden ausgewählt, da diese in dem Selektionsmedium wuchsen.
Beispiel 4
Selektion der CHO/SLC-1-Zelllinie mit hoher Expression von Ratten-SLC-1-Rezeptorprotein-mRNA voller Länge
Die Expressionsmengen der Ratten-SLC-1-Rezeptorprotein-mRNAs voller Länge von 56 Klonen aus dem in Beispiel 3 etablierten CHO/SLC-1-Stamm wurden wie folgt gemessen unter Verwendung einer Cytostar T Plate (Amersham Pharmacia Biotech Co.), gemäß dem beigefügten Protokoll. Jeder Klon des CHO/SLC-I-Stamms wurde auf eine Cytostar T Plate in 2,5 × 10⁴ Zellen/Napf geimpft. Nach 24-stündigem Züchten wurden die Zellen mit 10% Formalin fixiert. Nachdem 0,25% Triton X-100 jedem Napf zugegeben worden war, um die Zellpermeabilität zu erhöhen, wurde mit ³⁵S markierte Ribosonde von SEQ ID Nr. 7 den Zellen zur Hybridisierung zugefügt. Indem 20 mg/ml RNAseA jedem Napf zugefügt wurden, wurde freie Ribosonde verdaut. Nachdem die Platte sorgfältig gewaschen worden war, wurde die Radioaktivität der hybridisierten Ribosonde mit einem Topcounter untersucht. Der Stamm mit hoher Radioaktivität liefert eine hohe Expression der mRNA. Drei Klone (#3, #6 und #44), die eine hohe Expression von mRNA zeigten, wurden für den folgenden Versuch verwendet, insbesondere Klon #44 als Hauptklon (4).
Beispiel 5
cAMP-Synthese hemmende Aktivität von MCH auf Ratten-SLC-1 exprimierende CHO-Zellen
Das synthetische MCH (Peninsula Co.) wurde in verschiedenen Konzentrationen verdünnt und die die cAMP-Synthese hemmende Aktivität wurde an Ratten-SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen mit der folgenden Methode untersucht. Die CHO/SLC-1-Zellen, die in Beispiel 4 selektiert worden waren, wurden auf eine 24-Napf-Platte mit 5 × 10⁴ Zellen/Napf geimpft und anschließend wurde 48 Stunden lang kultiviert. Die Zellen wurden dann mit Hank's ausgeglichener Salzlösung (pH 7,4), die 0,2 mM 3-Isobutylmethylxanthin, 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthielt, gewaschen (im Folgenden wird Hank's ausgeglichene Salzlösung (pH 7,4), die 0,2 mM 3-Isobutylmethylxanthin, 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthält, als Reaktionspuffer bezeichnet). Anschließend wurden 0,5 ml Reaktionspuffer den Zellen zugefügt, die 30 Minuten in dem Medium gehalten wurden. Der Reaktionspuffer wurde entfernt und 0,25 ml frischer Reaktionspuffer wurde den Zellen zugegeben. Dann wurden 0,25 ml Reaktionspuffer, der verschiedene Mengen MCH und 2 μM Forskolin enthielt, den Zellen zugegeben und anschließend 24 Minuten lang bei 37°C umgesetzt. Indem 100 μl 20% Perchlorsäure zugefügt wurden, wurde die Reaktion beendet. Die Reaktionsmischung wurde dann 1 Stunde lang auf Eis stehen gelassen, um intrazelluläres cAMP zu extrahieren. Die Menge an cAMP in dem Extrakt wurde gemessen unter Verwendung eines cAMP-EIA-Kits (Amersham Pharmacia Biotech). Die Ergebnisse zeigen, dass MCH offensichtlich die Menge an intrazellulärem cAMP in der Konzentration von 0,1 nM reduziert. Wenn die Peptidkonzentration anstieg, nahm die Menge an intrazellulärem cAMP dosisabhängig ab (5). Wenn man als 100% die Menge nimmt, die erhalten wird, indem die intrazelluläre cAMP-Menge, wenn Reaktionspuffer zugefügt wurde, von der intrazellulären cAMP-Menge, wenn forskolinhaltiger Reaktionspuffer zugefügt wurde, abzieht, wurde die cAMP-Synthese hemmende Aktivität in 5 ausgedrückt in Prozent im Hinblick auf die intrazelluläre cAMP-Menge, die erhalten wurde, indem die intrazelluläre cAMP-Menge, wenn Reaktionspuffer zugefügt wurde, von der intrazellulären cAMP-Menge, wenn MCH zugefügt wurde, abgezogen wurde.
Beispiel 6
Arachidonsäuremetaboliten freisetzende Aktivität die durch MCH induziert wird bei Ratten-SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen
Die Arachidonsäuremetaboliten freisetzende Aktivität von synthetischem MCH (Peninsula Co.) in verschiedenen Konzentrationen auf Ratten-SLC-1 exprimierende CHO-Zellen wurde mit der folgenden Methode untersucht. Die in Beispiel 4 ausgewählten CHO/SLC-1-Zellen wurden auf eine 24-Napf-Platte mit 5 × 10⁴ Zellen/Napf geimpft. Nach 24-stündiger Inkubation wurde [³H]-Arachidonsäure jedem Napf mit 0,25 μCi/Napf zugefügt. 16 Stunden nach der Zugabe der [³H]-Arachidonsäure wurden die Zellen mit Hank's ausgeglichener Salzlösung (pH 7,4), die 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthielt, gewaschen. Dann wurden 500 μl Lösungen des synthetischen Ratten-MCH gelöst in Hank's ausgeglichener Salzlösung (pH 7,4), die 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthielt, in verschiedenen Konzentrationen jedem Napf zugegeben. Im Folgenden wird Hank's ausgeglichene Salzlösung (pH 7,4), die 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthält, als Reaktionspuffer bezeichnet. Nach 60-minütiger Inkubation bei 37°C wurden 400 ml Reaktionslösung in einen Szintillator gegeben und die Menge an [³H]-Arachidonsäuremetaboliten, die in die Reaktionslösung freigesetzt wurden, wurde unter Verwendung eines Szintillationszählers gemessen. Die offensichtliche Freisetzung von Arachidonsäuremetaboliten erfolgte mit 3 nM synthetischem Ratten-MCH und wenn die Peptidkonzentration weiter anstieg, wurden Arachidonsäuremetaboliten dosisabhängig in das Medium freigesetzt (6). In 6 wurde die Arachidonsäuremetaboliten freisetzende Aktivität ausgedrückt als relative Menge der [³H]-Arachidonsäuremetaboliten im Medium, wenn synthetisches Ratten-MCH dem Reaktionspuffer zugefügt wurde, wobei die Menge der [³H]-Arachidonsäuremetaboliten im Reaktionspuffer, dem kein synthetisches Ratten-MCH zugefügt worden war, als 100% genommen wurde.
Beispiel 7
Isolierung von plasmidhaltiger Human-SLC-1-cDNA
Unter Verwendung einer aus menschlichem fötalem Gehirn abgeleiteten cDNA-Bibliothek (SUPERSCRIPT^TM cDNA Library, GIBCO BRL) wurde DNA aufgebrochen unter Verwendung von Phagen-F1-Endonuclease und anschließend mit Escherichia coli Exonuclease III verdaut gemäß dem Handbuch von Genetrapper cDNA positive selection system (GIBCO BRL). Somit wurde eine einzelsträngige cDNA-Bibliothek von menschlichem fötalem Gehirn erzeugt.
Basierend auf dem Bericht von Kolakowski Jr. et al. (Kolakowski Jr. et al. (1996), FEBS Lett., Bd. 398, Seiten 253–258) wurde das synthetische Oligonucleotid, das in SEQ ID Nr. 8 gezeigt ist (das 1434–1451 von Hinterlegungsnummer U71092 entspricht) hergestellt. Unter Verwendung einer terminalen Desoxynucleotidyltransferase wurde Biotin-14-dCTP dem synthetischen Oligonucleotid am 3'-Ende zugefügt, um biotinyliertes Oligonucleotid herzustellen. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung und die Reaktionszeit wurden eingestellt, wie in dem Handbuch vorgeschrieben.
Nachdem 4 μg der einzelsträngigen aus menschlichem fötalem Gehirn abgeleiteten cDNA-Bibliothek 1 Minute lang auf 95°C gehalten worden waren, wurde die cDNA-Bibliothek auf Eis abgeschreckt und 20 ng biotinyliertes Oligonucleotid wurden zugegeben und anschließend 1 Stunde lang in einem Hybridisierungspuffer bei 37°C hybridisiert. Nach Zugabe von Streptoavidinkügelchen wurde die einzelsträngige aus menschlichem fötalem Gehirn abgeleitete cDNA, die mit dem biotinylierten Oligonucleotid hybridisiert war, unter Verwendung von MAGNA-SEP Magnetic Particle Separator (GIBCO BRL) isoliert. Unter Verwendung von 50 ng des in SEQ ID Nr. 9 gezeigten synthetischen Oligonucleotids als Primer (das 1011–1028 der Hinterlegungsnummer U71092 entspricht), das basierend auf dem Bericht von Kolakowski Jr. et al. (Kolakowski Jr. et al. (1996), FEBS Lett., Bd. 398, Seiten 253–258) hergestellt wurde, wurde der komplementäre Strang gemäß dem Handbuch hergestellt, was ein doppelsträngiges Plasmid erzeugte.
Beispiel 8
Bestimmung der Basensequenz des isolierten Plasmids, das die menschliche SLC-1-cDNA enthält
Das in Beispiel 7 erhaltene Plasmid wurde in ELECTROMAX^TM-DH10B^TM-Zellen zur Transformation durch Elektroporation eingeführt. Die Klone mit einem insertierten cDNA-Fragment wurden in einem LB-Agarmedium, das mit Ampicillin und X-gal ergänzt war, ausgewählt. Nur die Klone, die eine weiße Farbe aufwiesen, wurden voneinander getrennt, indem die Klone mit einem sterilisierten Zahnstocher herausgepickt wurden, um transformierte E. coli DH10B/hSLC-1 zu erhalten. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in LB-Medium, das Ampicillin enthielt, gezüchtet und Plasmid-DNAs wurden gereinigt unter Verwendung von QIAprep8miniprep (Qiagen Co.). Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde durchgeführt unter Verwendung eines DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kits (Perkin-Elmer Co.) und anschließend wurde mit einem Fluoreszenzsequenzautomaten decodiert. Somit wurde die in SEQ ID Nr. 10 gezeigte Sequenz erhalten. Die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 11), die von der hier erhaltenen Basensequenz codiert wurde, unterscheidet sich von der angenommenen menschlichen SLC-1-Aminosäuresequenz als Sequenz, die von der Ratten-SLC-1 abgeleitet ist, über die von Lakaye et al. berichtet wurde (B. Lakaye et al. (1998), Biochem. Biophys. Acta, Bd. 1401, Seiten 216–220), basierend auf der menschlichen Chromosomen-DNA-Sequenz, die die menschliche SLC-1-Sequenz enthält (Hinterlegungsnummer Z86090), was darauf hindeutet, dass ein Startcodon ATG an der mRNA weiter stromaufwärts der 69. und 64. Aminosäuren der angenommenen Sequenz vorhanden ist. Transformierte Escherichia coli DH10B/phSLC1L8, die mit dem Plasmid transformiert waren, das eine DNA trägt, die diese Sequenz codiert, wurden bei IFO und NIBH hinterlegt.
Beispiel 9
Test auf GTPyS-Bindungsaktivität für eine Ratten-SLC-1-Expressions-CHO-Zellmembranfraktion, induziert durch MCH
Die bindungsfördernde Aktivität von [³⁵S]-Guanosin-5'-(γ-thio)triphosphat durch MCH an einer SLC-1-CHO-Zellmembranfraktion wurde mit der folgenden Methode untersucht. Zuerst wird die Herstellung der Memb ranfraktion beschrieben. Zu 1 × 10⁸ CHO/SLC-1-Zellen wurden 10 ml eines Homogenisatpuffers (10 mM NaH-CO₃, 5 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 1 μg/ml Pepstatin, 4 μg/ml E64, 20 μg/ml Leupeptin) zugegeben und anschließend die Zellen mit einem Polytron (12.000 U/min, 1 min) aufgeschlossen. Die aufgeschlossenen Zellen wurden dann zentrifugiert (1.000 g, 15 min), was den Überstand ergab. Als Nächstes wurde der Überstand einer Ultrazentrifugation (Beckman, Typ 30 Rotor, 30.000 U/min, 1 h) unterzogen. Der entstehende Niederschlag wurde als Ratten-SLC-I-Expressions-CHO-Zellmembran verwendet.
Die GTPγS-Bindungsaktivität wurde wie folgt untersucht. Die Ratten-SLC-1-Expressions-CHO-Zellmembranfraktion wurde mit einem Puffer für Membranverdünnung (50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,4), 5 mM MgCl₂, 150 nM NaCl, 1 μM GDP) verdünnt, um eine Zellmembranfraktionslösung zum Test mit einer Proteinkonzentration von 30 mg/ml zu erstellen. Zu 200 μl der Zellmembranfraktionslösung für den Test wurden 2 μl 51,5 nM [^3SS]-Guanosin-5'-(γ-thio)triphosphat (NEN Co.) und 2 μl MCH (Peninsula Co.) in verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Die entstehende Lösungsmischung wurde 1 Stunde lang auf 25°C gehalten. Die Mischung wurde durch ein Filter filtriert. Nach dem zweimaligen Waschen mit 1,5 ml Waschpuffer (50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,4), 5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 0,1% BSA), wurde die Radioaktivität des Filters gemessen unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers. Das MCH erhöhte dosisabhängig die Menge an [³⁵S]-Guanosin-5'-(γ-thio)triphosphat, das an die Membranfraktion gebunden war. Das MCH in einer Konzentration von etwa 0,5 nM induzierte eine 50%ige Bindung, was die Gesamtbindung war.
Beispiel 10
Amplifikation von Human-SLC-1-cDNA mit PCR unter Verwendung von aus menschlichem fötalem Gehirn stammender cDNA
Unter Verwendung eines Plasmids, das menschliche SLC-1-DNA-Sequenz enthielt, die in einer Gene trap kloniert worden war, als Matrize, wurde eine Amplifikation mit PCR durchgeführt unter Verwendung der synthetischen DNA-Primer, die in SEQ ID Nr. 12 und SEQ ID Nr. 13 gezeigt sind bzw. der synthetischen Primer, die in SEQ ID Nr. 14 bzw. SEQ ID Nr. 15 gezeigt sind. Erstere amplifizierte DNA wurde Human-SLC-1(S) benannt und letztere amplifizierte DNA wurde Human-SLC-1(L) genannt. Die synthetischen DNA-Primer wurden konstruiert, um Gene in dem Bereich zu amplifizieren, der in Rezeptorproteine übersetzt werden sollte, wodurch Erkennungssequenzen der jeweiligen Restriktionsenzyme an den 5'- bzw. 3'-Enden zugefügt wurden, so dass die Basensequenz, die von dem Restriktionsenzym Sal I erkannt wird, am 5'-Ende des Gens zugefügt wurde, und die Basensequenz, die durch Restriktionsenzym Spe I erkannt wird, am 3'-Ende zugefügt wurde. Die Reaktionslösung für die Amplifikation von Human-SLC-1(S) war aufgebaut aus 5 μl der Plasmidmatrize, die die Human-SLC-1-DNA-Sequenz enthielt, je 0,4 μM von jedem der synthetischen DNA-Primer, 0,2 mM dNTPs, 0,5 μl pfu-DNA-Polymerase und einem Puffer, der dem Enzym beigefügt war, die zusammengemischt wurden, um das Gesamtvolumen auf 50 μl zu bringen. Unter Verwendung einer Wärmewechselvorrichtung (Perkin-Elmer Co.) zur Amplifikation wurde 60 Sekunden lang auf 94°C erhitzt und dann 25 Mal ein Zyklus wiederholt, der eingestellt war mit 60 s bei 94°C, 60 s bei 57°C und 150 s bei 72°C und schließlich wurde 10 Minuten lang auf 72°C gehalten. Die Reaktionslösung zur Amplifikation von Human-SLC-1(L) war aufgebaut aus 5 μl der Plasmidmatrize, die die menschliche SLC-1-DNA-Sequenz enthielt, jeweils 0,4 μM der synthetischen DNA-Primer, 0,2 mM dNTPs, 0,5 μl pfu-DNA-Polymerase und einem Puffer, der dem Enzym beigefügt war, die miteinander vermischt wurden, um das gesamte Volumen auf 50 μl zu bringen. Unter Verwendung einer Wärmewechselvorrichtung (Perkin-Elmer Co.) zur Amplifikation wurde 60 Sekunden lang auf 94°C erhitzt und 25 Mal ein Zyklus wiederholt mit 60 s bei 94°C, 60 s bei 60°C und 3 min bei 72°C und schließlich wurde 10 Minuten lang auf 72°C gehalten. Die amplifizierten Produkte wurden mit 0,8% Agarosegel-Elektrophorese und anschließendes Anfärben mit Ethidiumbromid bestätigt.
Beispiel 11
Subklonierung der PCR-Produkte in Plasmidvektoren und Bestätigung der amplifizierten cDNA-Sequenzen durch Decodierung von Basensequenzen der insertierten cDNA-Region
Die durch PCR in Beispiel 10 erhaltenen PCR-Produkte wurden getrennt unter Verwendung eines niedrig schmelzenden 0,8%-Agarosegels. Der Bandenteil wurde aus dem Gel mit einer Rasierklinge herausgeschnitten, in kleine Stücke geschnitten und mit Phenol und dann Phenol/Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde in Ethanol ausgefällt, um die DNAs zu gewinnen. Gemäß dem dem PCR-Script^TM Amp SK(⁺) Cloning Kit (Stratagene Co.) beigefügten Protokoll wurden die gewonnenen DNAs in Plasmidvektor pCR Script Amp SK(⁺) subkloniert. Der rekombinante Vektor wurde in Escherichia coli-DH5α-kompetente Zellen (Toyobo) eingeführt, um Transformanten zu erzeugen. Die Klone mit einem insertierten cDNA-Fragment wurden in LB-Agarmedium, das Ampicillin und X-gal enthielt, selektiert. Nur die Klone, die eine weiße Farbe aufwiesen, wurden mit einem sterilisierten Zahnstocher herausgepickt, um transformierte E. coli DH5α/hSLC-1(S) mit menschlichem SLC-1(S) und transformierte E. coli DH5α/hSLC-1(L) mit menschlichem SLC-1(L) zu erhalten. Die einzelnen Klone wurden über Nacht in LB-Medium, das Ampicillin enthielt, gezüchtet. Plasmid-DNAs wurden präpariert unter Verwendung von QIA prep8miniprep (Qiagen Co.). Ein Aliquot der so hergestellten DNAs wurde mit den Restriktionsenzymen Sal 1 und Spe I gespalten, um die Größe des insertierten Rezeptor-cDNA-Fragments zu bestätigen. Die Reaktion zur Basensequenzierung wurde durchgeführt unter Verwendung eines DyeDeoxy Terminator Cycle Sequence Kit (Perkin-Elmer Co.) und anschließend wurde mit einem Fluoreszenzsequenzautomaten decodiert. Die Sequenzen der erhaltenen Klone stimmten überein mit der DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 16), die mit den synthetischen DNA-Primern, die in SEQ ID Nr. 12 und SEQ ID Nr. 13 gezeigt sind, amplifiziert werden sollte unter Verwendung des Human-SLC-1-Gens als Matrize bzw. der DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 17), die mit den synthetischen DNA-Primern, die in SEQ ID Nr. 14 und SEQ ID Nr. 15 gezeigt sind, amplifiziert werden sollte unter Verwendung des Human-SLC-1-Gens als Matrize.
Beispiel 12
Herstellung von Human-SLC-1(S) exprimierenden CHO-Zellen und Human-SLC-1(L) exprimierenden CHO-Zellen
Unter Verwendung von Plasmid Midi Kit (Qiagen Co.) wurden Plasmide hergestellt aus Klonen von E. coli, die mit Human-SLC-1(S)- und Human-SLC-1(L)-haltigen Plasmiden transformiert waren, deren Sequenzen in Beispiel 11 bestätigt wurden. Die Plasmide wurden mit den Restriktionsenzymen Sal I und Spe I gespalten, um das Insert herauszuschneiden. Nach der Elektrophorese wurde die insertierte DNA aus dem Agarosegel mit einer Rasierklinge herausgeschnitten, in kleine Stücke geschnitten und mit Phenol und dann mit Phenol/Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde in Ethanol ausgefällt, um die insertierte DNA zu gewinnen. Die insertierte DNA wurde dem mit Sal I und Spe I gespaltenen Vektorplasmid pAKK0-111H für die Tierzellexpression zugefügt (wie bei dem Vektorplasmid pAKK01.11H, das bei S. Hinuma et al., Biochim. Biophys. Acta, Bd. 1219, Seiten 251–259 (1994) beschrieben wurde) und anschließend unter Verwendung von T4-Ligase (Takara Shuzo Co.) ligiert. Somit wurden die Plasmide pAKK0-hSLC-1(S) und pAKK0-hSLC-1(L) zur Proteinexpression konstruiert.
Nachdem mit pAKK0-hSLC-1(S) und pAKK0-hSLC-1(L) transformierte E. coli DH5α (Toyobo) gezüchtet worden waren, wurden die Plasmid-DNAs von pAKK0-hSLC-1(S) und pAKK0-hSLC-1(L) unter Verwendung von Plasmid Midi Kit (Qiagen Co.) präpariert. Unter Verwendung von CellPhect Transfection Kit (Amersham Pharmacia Biotech Co.) wurden die Plasmid-DNAs in CHO-dhfr^–-Zellen eingeführt gemäß dem dem Kit beigefügten Protokoll. DNA, 10 μg, wurde mit Calciumphosphat in Suspension co-ausgefällt. Die Suspension wurde in eine 10-cm-Petrischale gegeben, auf die 5 × 10⁵ oder 1 × 10⁶ CHO-dhfr^–-Zellen 24 Stunden vorher geimpft worden waren. Die Zellen wurden 1 Tag in MEMα-Medium, das 10% fotales Kälberserum enthielt, gezüchtet. Nach der Passage wurden die Zellen in nucleinsäurefreiem MEMα-Medium, das 10% dialysiertes fötales Kälberserum enthielt, zur Selektion gezüchtet. Als Klone, die in dem Selektionsmedium wuchsen, wurden 56 Klone transformierter mit Human-SLC-1(S) transfizierter CHO-Zellen und 61 Klone transformierter mit Human-SLC-1(L) transfizierter CHO-Zellen ausgewählt.
Beispiel 13
Selektion einer transfizierten Zelllinie mit hoher Expression der mRNAs für Human-SLC-1(S) und Human-SLC-1(L)
Die Expressionsmengen der mRNAs von 56 Klonen aus dem CHO/hSLC-1(S)-Stamm und 61 Klonen aus dem CHO/hSLC-1(L)-Stamm, die in Beispiel 12 etabliert wurden, wurden wie folgt gemessen unter Verwendung einer Cytostar T Plate (Amersham Pharmacia Biotech Co.), gemäß dem beigefügten Protokoll. Jeder Klon des CHO/hSLC-1(S)-Stamms und des CHO/hSLC-1(L)-Stamms wurde in jeden Napf der Cytostar-T-Platte mit 2,5 × 10⁴ Zellen/Napf geimpft. Nach 24-stündiger Kultivierung wurden die Zellen mit 10% Formalin fixiert. Nachdem 0,25% Triton X-100 jedem Napf zugegeben worden war, um die Zellpermeabilität zu erhöhen, wurden mit [³⁵S] markierte Ribosonden von SEQ ID Nr. 18 den Zellen zugefügt, um sie zu hybridisieren. Indem 20 mg/ml RNaseA jedem Napf zugegeben wurden, wurden die freien Ribosonden verdaut. Nachdem die Platte sorgfältig gewaschen worden war, wurde die Radioaktivität der hybridisierten Ribosonde mit einem Topcounter gemessen. Der Stamm mit hoher Radioaktivität lieferte eine hohe Expressionsmenge an mRNA.
Beispiel 14
cAMP-Synthese hemmende Aktivität von MCH bei menschliches SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen
Synthetisches MCH (Peninsula Co.) wurde auf verschiedene Konzentrationen verdünnt und die die cAMP-Synthese hemmende Aktivität wurde an menschliches SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen mit der folgenden Methode untersucht. Der CHO/hSLC-1(S)-Stamm oder der CHO/hSLC-1(L)-Stamm, d.h. menschliches SLC-1 exprimierende CHO-Zellen, die in Beispiel 13 selektiert worden waren, wurden auf eine 24-Napf-Platte mit 5 × 10⁴ Zellen/Napf geimpft und anschließend 48 Stunden lang kultiviert. Die Zellen wurden dann mit Hank's ausgeglichener Salzlösung (pH 7,4), die 0,2 mM 3-Isobutylmethylxanthin, 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthielt, gewaschen (im Folgenden wird Hank's ausgeglichene Salzlösung (pH 7,4), die 0,2 mM 3-Isobutylmethylxanthin, 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthält, als Reaktionspuffer bezeichnet). Anschließend werden 0,5 ml des Reaktionspuffers den Zellen zugegeben, die 30 Minuten lang in dem Medium gehalten wurden. Der Reaktionspuffer wurde entfernt und 0,25 ml frischer Reaktionspuffer wurde den Zellen zugegeben. Dann wurden 0,25 ml des Reaktionspuffer, der verschiedene Mengen an MCH und 2 μM Forskolin enthielt, den Zellen zugegeben und anschließend 24 Minuten lang bei 37°C umgesetzt. Indem 100 μl 20% Perchlorsäure zugegeben wurden, wurde die Reaktion beendet. Als Nächstes wurde die Reaktionsmischung 1 Stunde lang auf Eis stehen gelassen, um intrazelluläres cAMP zu extrahieren. Die Menge an cAMP in dem Extrakt wurde gemessen unter Verwendung eines cAMP-EIA-Kits (Amersham Pharmacia Biotech). Die Ergebnisse zeigen, dass MCH dosisabhängig die Menge an intrazellulärem cAMP in den Human-SLC-1 exprimierenden Zellen senkte.
Beispiel 15
Arachidonsäuremetaboliten freisetzende Aktivität, die durch MCH in Human-SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen induziert wird
Die Arachidonsäuremetaboliten freisetzende Aktivität von synthetischem MCH (Peninsula Co.) in verschiedenen Konzentrationen bei Human-SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen wurde mit der folgenden Methode untersucht. Der CHO/hSLC-1(S)-Stamm oder der CHO/hSLC-1(L)-Stamm, in anderen Worten Human-SLC-1 exprimierende CHO-Zellen, die in Beispiel 13 ausgewählt wurden, wurden in eine 24-Napf-Platte mit 5 × 10⁴ Zellen/Napf geimpft. Nach 24-stündiger Inkubation wurde [³H]-Arachidonsäure mit 0,25 μCi/Napf zugegeben. 16 Stunden nach Zugabe der [³H]-Arachidonsäure wurden die Zellen mit Hank's ausgeglichener Salzlösung (pH 7,4), die 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthielt, gewaschen. Dann wurden 500-μl-Lösungen von verschiedenen Konzentrationen des synthetischen MCHs gelöst in Hank's ausgeglichener Salzlösung (pH 7,4), die 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthielt, jedem Napf zugefügt. Im Folgenden wird Hank's ausgeglichene Salzlösung (pH 7,4), die 0,05% BSA und 20 mM HEPES enthält, als Reaktionspuffer bezeichnet. Nach 60-minütiger Inkubation bei 37°C wurden 400 μl der Reaktionslösung in einen Szintillator gegeben und die Menge an [³H]-Arachidonsäuremetaboliten, die in die Reaktionslösung freigesetzt worden war, wurde mit einem Szintillationszähler gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass synthetisches MCH dosisabhängig eine Aktivität zur Freisetzung von Arachidonsäuremetaboliten bei Human-SLC-1 exprimierenden Zellen zeigte.
Beispiel 16
Test zur GTPγS-Bindungsaktivität unter Verwendung einer Human-SLC-1 exprimierenden CHO-Zellmembranfraktion
Eine Human-SLC-1 exprimierende CHO-Zellmembranfraktion wurde mit dem folgenden Verfahren hergestellt. Human-SLC-1 exprimierende CHO-Zellen (1 × 10⁸ Zellen) wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4), die mit 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) ergänzt war, suspendiert und anschließend zentrifugiert. Nachdem 10 ml eines Homogenisatpuffers (10 mM NaHCO₃, 5 mM EDTA, pH 7,5) den Zellpellets zugegeben worden waren, wurde die Mischung mit einem Polytron Homogenisator homogenisiert. Das Homogenisat wurde dann mit 400 × g 15 Minuten lang zentrifugiert. Der entstehende Überstand wurde weiter mit 100.000 × g 1 Stunde lang zentrifugiert, was Membranfraktionsniederschläge ergab. Die Niederschläge wurden mit 2 ml Testpuffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1% BSA (Rinderserumalbumin), 10 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM GDP (Guanosin-5'-diphosphat), 0,25 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), 1 μg/ml Pepstatin, 20 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Phosphoramidon] suspendiert und die Suspension wurde mit 100.000 × g 1 Stunde lang zentrifugiert. Die aus den Niederschlägen gewonnene Zellmembran wurde wieder in 20 ml Testpuffer suspendiert. Nach der Abgabe wurde die Suspension bei –80°C aufbewahrt und konnte zu jeder Zeit wieder aufgetaut werden.
Die GTPγS-Bindungsaktivität wurde wie folgt untersucht. Die Zellmembranfraktion von Human-SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen wurde mit dem Testpuffer verdünnt. Nach Abgabe von je 173 μl jeder Verdünnung in eine 96-Napf-Platte aus Polypropylen, wurden 2 μl einer DMSO-Lösung von MCH (hergestellt von Bachem Co.) in verschiedenen Konzentrationen und 25 μl [³⁵S]-Guanosin-5'-(γ-thio)triphosphat (hergestellt von Daiichi Kagaku Yakuhin K.K.) jedem Napf gleichzeitig zugegeben (Endkonzentration der Zellmembran: 20 μg/ml, Endkonzentration von [³⁵S]-Guanosin-5'-(γ-thio)triphosphat: 0,33 nM). Nachdem 1 Stunde lang bei 25°C unter Rühren umgesetzt worden war, wurde die Reaktionslösung einer Saugfiltration durch ein Glasfilter (GF-C) unterzogen. Das Filtrat wurde weitere drei Male mit 300 μl Waschflüssigkeit (50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5) gewaschen. Nach Zugabe von 50 μl Flüssigszintillator zu dem Glasfilter wurde die Restradioaktivität gemessen unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers.
Das MCH erhöhte dosisabhängig die Menge an [³⁵S]-Guanosin-5'-(γ-thio)triphosphat, das an die Zellmembranfraktion von menschlichen SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen gebunden war. Der ED₅₀-Wert für MCH für die Membranfraktion von Human-SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen war 0,2 nM.
Beispiel 17
Herstellung von MCH(2-19) MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) und MCH(7-19) (SEQ ID Nr. 19 bis Nr. 24) durch manuell betriebenen Edman-Abbau
In 30 μl 50% Pyridin wurden 0,1 mg MCH (Sigma Co.) gelöst und 1 μl Phenylisothiocyanat (Wako Pure Chemical Industries) wurden zu der Lösung zur Stickstoffsubstitution zugegeben. Die Mischung wurde dann auf 45°C gehalten und alle 10 Minuten gerührt. 1 Stunde später wurde die Mischung nicht mehr warm gehalten und in einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde wiederum in 20 μl Ethanol gelöst. Die Lösung wurde zur Trockene eingedampft, indem das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert wurde. Das Reaktionsprodukt oder Phenylthiocarbamoylderivat wurde in 20 μl Trifluoressigsäure (Wako Pure Chemical Industries) gelöst und anschließend durch Stickstoff ersetzt. Indem 20 Minuten lang auf 45°C warm gehalten wurde, wurde die aminoterminale Aminosäure des Peptids abgespalten zu einem Anilinothiazolinonderivat. Nach Entfernung der Trifluoressigsäure in einem Stickstoffstrom wurden 30 μl Wasser und 100 μl n-Butylacetat der Lösung zugefügt. Die Mischung wurde mit n-Butylacetat extrahiert, um überschüssige Reagenzien und das Anilinothiazolinonderivat zu entfernen. Die Extraktion mit n-Butylacetat wurde dreimal wiederholt. Anschließend wurde die wässrige Phase, die MCH(2-19) enthielt, wobei das Aminoende um einen Rest gekürzt war, im Vakuum in einem Stickstoffstrom zur Trockene eingedampft.
Dieser Abbauprozess wurde nur einmal durchgeführt, so dass MCH(2-19), bei dem nur ein Rest am N-Ende entfernt war, erhalten wurde. Derselbe Abbauprozess wurde zweimal, dreimal, viermal, fünfmal oder sechsmal wiederholt, was MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) und MCH(7-19) ergab, wobei jedes Mal nur ein Rest der N-terminalen Aminogruppen entfernt wurde.
MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) und MCH(7-19), die durch den oben beschriebenen Abbau erhalten worden waren, wurden wie folgt gereinigt und ihre Strukturen wurden durch Massenspektrometrie und Aminosäureanalyse bestätigt. Obwohl die Details sich unten auf MCH(4-19) konzentrieren, wurden andere Derivate fast auf gleiche Weise behandelt. Die so erhaltenen analytischen Daten für MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) und MCH(7-19) sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 Daten für MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) und MCH(7-19) von Massenspektrometrie und Aminosäureanalyse
Unter Verwendung von HPLC wurde MCH(4-19) wie folgt gereinigt. Elutionsmittel A (0,1% Trifluoressigsäure) wurde zuerst über eine Spheri-5-RP-18-Säule für Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie (Brown-Lee Inc., 2,1 mm × 30 mm) mit einer Durchflussrate von 300 μl/min geleitet, um die Säule bei 25°C zu equilibrieren. Das Reaktionsprodukt wurde in 270 μl 0,1% Trifluoressigsäure gelöst. Nachdem ein 50-μl-Aliquot auf die Säule gegossen worden war, wurde die Konzentration von Elutionsmittel B (0,1% Trifluoressigsäure/70% Acetonitril) 30 Minuten lang auf 70% erhöht, während die Durchflussrate auf 300 μl/min gehalten wurde. Das Eluat wurde bezüglich der Extinktion bei 210 nm überwacht und die Peaks wurden manuell fraktioniert. MCH(4-19) eluierte nach 17,1 Minuten. MCH(4-19), das in einem Teströhrchen gesammelt wurde, wurde bis zur Trockene eingeengt und der Rückstand in 100 μl DMSO gelöst.
Die Massenspektrometrie wurde durchgeführt mit der LSIMS-Methode unter Verwendung von JEOL JMS-HX110. Das bedeutet 1 μl einer Matrix von 3-Nitrobenzylalkohol und Glycerin 3:2 wurden mit 1 μl einer Probenflüssigkeit auf einem Probechip vermischt. Die Mischung wurde in eine Ionenquelle eingeführt. Cäsiumionen, die auf 15 kV beschleunigt waren, wurden bestrahlt und positive sekundäre Ionen, die sich bildeten, wurden auf 10 kV beschleunigt und in einen Detektor geführt.
Zur Aminosäureanalyse wurde die Hydrolyse durchgeführt, indem 5 μl Probenflüssigkeit in ein Glasröhrchen gegeben wurden, im Vakuum zu einem Feststoff getrocknet wurden, der Rückstand in ein Gläschen gegeben wurde, 200 μl 6 n azeotrope Salzsäure (Pierce Co., Sequenal Grade) auf den Boden des Gläschens gegeben wurden, entlüftet wurde gemäß dem von Waters Co. empfohlenen Protokoll unter Verwendung einer Pico-Tag Work Station von Waters Co., und dann 24 Stunden auf 110°C gehalten wurde.
Die Salzsäure in dem Reaktionsgläschen wurde im Vakuum über eine Vakuumpumpe entfernt und die Probenflüssigkeit wurde mit 150 μl 20 mM Salzsäure verdünnt. Die Verdünnung wurde in ein Gläschen zur Analyse gegeben, das in einen Aminosäureanalysator gestellt wurde und ein 100-μl-Aliquot wurde zur Analyse bereitgestellt. Unter Verwendung eines Hitachi L-8500 Hochgeschwindigkeitsaminosäureanalysators wurde die Aminosäureanalyse durchgeführt mit Fluorometrie unter Verwendung von ortho-Phthalaldehyd als Reagenz (Wako Pure Chemical Industries) zur Derivatisierung. Die Herstellung eines Puffers zur Fluorometrie, die Herstellung der Reaktionslösung und die Bedingungen zur Analyse entsprachen dem Handbuch des L-8500-Aminosäureanalysators. Ein molares Verhältnis der Messdaten basierend auf Leucin ist in Tabelle 1 angegeben.
MCH oder MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) und MCH(5-19) können auch mit der in den Beispielen 24 bis 28 beschriebenen Festphasensynthese hergestellt werden.
Beispiel 18
Derivatisierung von MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) und MCH(5-19) mit einem nicht-isotopenhaltigen Bolton-Hunter-Reagenz
MCH und MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19) und MCH(6-19), die in Beispiel 17 erhalten wurden, wurden mit einem nicht-isotopenhaltigen Bolton-Hunter-Reagenz derivatisiert. Die Derivatisierung wird hier an MCH(4-19) als Beispiel beschrieben und das Verfahren ist unten ausgeführt.
Nachdem 1 nmol MCH(4-19) in 50 μl Dimethylformamid gelöst worden war, wurden 100 nmol N-Succinimidyl-3-(4-hydroxy-3-iodphenyl)propionat (Wako Pure Chemical Industries) als nicht-isotopenhaltiges Bolton-Hunter-Reagenz und 100 nmol N,N-Diisopropylethylamin (Wako Pure Chemical Industries) zu der Lösung zugegeben. Die Mischung wurde 4 Stunden lang bei 37°C umgesetzt.
Nachdem 450 μl 10% Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, der Reaktionsmischung zugegeben worden waren, wurde die Mischung mit HPLC gereinigt. Die Bedingungen für die Chromatographie sind unten angegeben. Wakosil II 5C18HG (4,6 × 150 mm) wurde als Säule verwendet mit einer Durchflussrate von 1,0 ml/min. Unter Verwendung einer wässrigen Acetonitrillösung, die 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, wurde die Elution durchgeführt, wobei die Acetonitrilkonzentration 2 Minuten auf 10% gehalten wurde und dann über 5 Minuten auf 20% erhöht wurde und dann über 20 Minuten bis zu 50% erhöht wurde.
[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Met⁴]-MCH(4-19), derivatisiert aus MCH(4-19) mit dem nicht-isotopenhaltigen Bolton-Hunter-Reagenz, wurde nach 22,9 Minuten eluiert und manuell fraktioniert. MCH oder MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(5-19) und MCH(6-19) wurden im Wesentlichen auf gleiche Art und Weise derivatisiert, indem die 3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionylgruppe an der Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure eingeführt wurde. Die Derivate wurden mit HPLC fraktioniert. Eine saure Hydrolyse dieser Derivate auf gleiche Weise, wie bei dem in Beispiel 17 beschriebenen Verfahren wurde für die Aminosäureanalyse durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2 Aminosäureanalysedaten an derivatisiertem MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19) und MCH(6-19)
Beispiel 19
Herstellung von mit Radioisotopen markiertem MCH(4-19)
MCH(4-19), das in Beispiel 17 hergestellt worden war, bei dem 3 Reste der N-terminalen Aminosäure von MCH entfernt worden waren, wurden mit einem Radioisotop markiert gemäß der Bolton-Hunter-Methode. In einem Röhrchen wurde trockenes Stickstoffgas in eine Lösung von 9,25 MBq (0,11 nmol) [¹²⁵I]-Bolton-Hunter-Reagenz (N-Succinimidyl-3-(4-hydroxy-3-iodphenyl)propionat (NEN Life Science Products Co., 81,4 TBq/mmol) in Benzol geblasen, um Benzol durch Destillation zu entfernen. In das Röhrchen wurden 18 μl 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5), 2,3 nmol MCH(4-19), gelöst in 1,5 μl Dimethylsulfoxid, und 0,5 μl Dimethylsulfoxid gegeben. Die Mischung wurde sorgfältig gemischt. Nachdem die flüssige Mischung 2 Stunden auf 37°C gehalten worden war, wurde [¹²⁵I]-[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Met⁴]-MCH(4-19) (Strukturformel ist in (4) oben beschrieben), das ein radioaktives Derivat von MCH(4-19) mit dem Bolton-Hunter-Reagenz ist, durch Reverse-Phase-HPLC fraktioniert. [¹²⁵I]-[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Met°]-MCH(4-19) wurde bei einer Acetonitrilkonzentration von etwa 43,6% von einer ODS-Säule (TOSO, ODS-80TM (4,6 mm × 150 mm)) eluiert.
Auf gleiche Art und Weise können mit Radioisotopen markierte Derivate von MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(5-19), MCH(6-19) und MCH(7-19) ((1) bis (3) und (5) bis (7) oben) hergestellt werden, indem die [¹²⁵I]-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Gruppe in die Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure eingeführt wird unter Verwendung eines [¹²⁵I]-Bolton-Hunter-Reagenzes.
Beispiel 20
Herstellung von mit radioaktivem Iod markiertem MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) und MCH(7-19)
Mit Isotopen markiertes MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) und MCH(7-19) können auch wie folgt hergestellt werden, indem Tyr¹³ in der Aminosäuresequenz in radioaktives Iod umgewandelt wird. Das Vorgehen wird unten beschrieben, wobei MCH(4-19) als Beispiel genommen wird, aber die radioaktiven Iodderivate von MCH, MHC(2-19), MCH(3-19), MCH(5-19), MCH(6-19) und MCH(7-19) können hergestellt werden wie MCH(4-19).
In 25 μl 0,4 M Natriumacetat (pH 5,6) wurden 5 μg MCH(4-19) gelöst. Nachdem 200 ng Lactoperoxidase (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) der Lösung zugegeben worden waren, wurden 1 mCi [¹²⁵I]-Natriumiodid (Amersham Pharmacia Biotech Co.) und 200 ng Wasserstoffperoxid (10 μl) der Mischung zugefügt. Nachdem 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen worden war, wurden weitere 200 ng Wasserstoffperoxid (10 μl) der Mischung zugegeben. Die entstehende Mischung wurde dann 10 Minuten stehen gelassen. Die Mischung wurde mit HPLC gereinigt unter Verwendung einer TSKgel-ODS-80Ts-Säule (4,6 mm × 25 cm, TOSO), was [¹²⁵I]-markiertes MCH(4-19) ergab.
Beispiel 21
Test zur Agonistaktivität von MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) und MCH(7-19) unter Verwendung des GTPγS-Bindungstests
Eine Ratten-SLC-1 exprimierende CHO-Zellmembranfraktion wurde hergestellt mit dem folgenden Verfahren. Ratten-SLC-1 exprimierende CHO-Zellen (1 × 10⁸ Zellen) wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4), die mit 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) ergänzt war, suspendiert und anschließend zentrifugiert. Nachdem 10 ml Homogenisatpuffer (10 mM NaHCO₃, 5 mM EDTA, pH 7,5) den Zellpellets zugegeben worden waren, wurde die Mischung mit einem Polytronhomogenisator homogenisiert. Das Homogenisat wurde dann mit 400 × g 15 Minuten lang zentrifugiert. Der entstehende Überstand wurde weiter mit 100.000 × g 1 Stunde lang zentrifugiert, was Membranfraktionsniederschläge ergab. Die Niederschläge wurden in 2 ml Testpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1% BSA (Rinderserumalbumin), 10 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 μM GDP (Guanosin-5'-diphosphat), 0,25 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), 1 μg/ml Pepstatin, 20 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Phosphoramidon) suspendiert. Die Suspension wurde 1 Stunde lang mit 100.000 × g zentrifugiert. Die als Niederschlag gewonnene Zellmembran wurde wieder in 20 ml Testpuffer suspendiert. Nach Verteilung wurde die Suspension bei –80°C aufbewahrt und kann jederzeit bei Verwendung aufgetaut werden.
Die Agonistaktivität von MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) und MCH(7-19) wurde wie folgt untersucht. Die Ratten-SLC-1 exprimierenden CHO-Zellmembranfraktionen wurden mit dem Testpuffer verdünnt. Nach Abgabe von jeweils 173 μl Verdünnung in eine 96-Napf-Platte aus Polypropylen wurden jeweils 2 μl Lösungen von MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19) und MCH(7-19), verdünnt in DMSO-Lösung, in verschiedenen Konzentrationen und gleichzeitig 25 μl [³⁵S]-Guanosin-5'-(γ-thio)triphosphat (hergestellt von Daiichi Kagaku Yakuhin K.K.) in jeden Napf gegeben (die Endkonzentration der Zellmembranen war: 20 μg/ml, Endkonzentration von [³⁵S]-Guanosin-5'-(γ-thio)triphosphat: 0,33 nM). Die Reaktionslösung wurde 1 Stunde lang bei 25°C unter Rühren umgesetzt. Die Mischung wurde dann einer Saugfiltration durch ein Glasfilter (GF-C) unterzogen. Das Filtrat wurde weitere 3 Male mit 300 μl Waschflüssigkeit (50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5) gewaschen. Nach Zugabe von 50 μl Flüssigszintillator auf das Glasfilter wurde die restliche Radioaktivität gemessen unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers.
Die Agonistaktivität von MCH(6-19) und MCH(7-19) nahm um das ungefähr 10-Fache bzw. 200-Fache ab im Vergleich zu MCH, wohingegen MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) und MCH(5-19) fast die gleiche Agonistaktivität zeigten (7).
Beispiel 22
Test zur Agonistaktivität von MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) und MCH(5-19), die mit einem nicht- isotopenhaltigen Bolton-Hunter-Reagenz derivatisiert waren, unter Verwendung des GTPγS-Bindungstests
Die Agonistaktivität der mit dem nicht-isotopenhaltigen Bolton-Hunter-Reagenz derivatisierten MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) und MCH(5-19), die in Beispiel 18 erhalten worden waren, wurden unter Verwendung des GTPγS-Bindungstests auf gleiche Art und Weise, wie in Beispiel 21, untersucht.
Derivatisiertes MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) und MCH(5-19) erhöhte dosisabhängig die Menge an [³⁵S]-Guanosin-5'-(γ-thio)triphosphat, das an Human-SLC-1 exprimierende CHO-Zellmembranfraktionen gebunden war, was bestätigt, dass verschiedene MCHs, die mit einem nicht-isotopenhaltigen Bolton-Hunter-Reagenz derivatisiert waren, Agonistaktivität zeigten (8). In der Figur bezeichnen BH-MCH, BH-MCH(2-19), BH-MCH(3-19), BH-MCH(4-19) und BH-MCH(5-19) MCH, MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19) bzw. MCH(5-19), derivatisiert mit einem nicht-isotopenhaltigen Bolton-Hunter-Reagenz.
Beispiel 23
Rezeptorbindungstest unter Verwendung von [¹²⁵I]-markiertem MCH(4-19), das unter Verwendung eines Bolton-Hunter-Reagenzes hergestellt worden ist
Ein Rezeptorbindungstest wurde durchgeführt unter Verwendung des mit [¹²⁵I]-markierten MCH(4-19) (dessen Struktur in (4) oben beschrieben ist), das in Beispiel 19 hergestellt wurde unter Verwendung eines Bolton-Hunter-Reagenzes und der Zellmembranfraktion, die aus Human-SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen hergestellt wurde.
Die Zellmembranfraktion, die aus Human-SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen hergestellt wurde gemäß Beispiel 16 wurde mit Testpuffer (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), 0,1% BSA (Rinderserumalbumin), 0,25 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), 1 μg/ml Pepstatin, 20 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Phosphoramidon, pH 7,5) in verschiedenen Konzentrationen verdünnt. Anschließend wurden jeweils 173 μl der Verdünnung in eine 96-Napf-Platte abgegeben. Um die gesamte Bindung (TB) zu testen, wurden 2 μl DMSO und 25 μl 100 pM [¹²⁵I]-markiertes MCH(4-19) zugegeben und um die nichtspezifische Bindung (NSB) zu testen, wurden 2 μl einer Lösung von 100 μM MCH in DMSO und 25 μl 100 pM [¹²⁵I]-markiertes MCH(4-19) zu der Membranfraktionslösung zugegeben. Nach 60-minütiger Reaktion bei 25°C wurde die Reaktionslösung durch ein mit Polyethylenimin behandeltes Whatman-Glasfilter (GF-C) saugfiltriert. Nach der Filtration wurde die restliche Radioaktivität von mit [¹²⁵I]-markiertem MCH(4-19), die auf dem Filterpapier zurückblieb, in einem Gammazähler gemessen. Wie in 9 gezeigt, war die spezifische Bindung (SB) von [¹²⁵I]-markiertem MCH(4-19) abhängig von der Konzentration der Membranfraktion.
Indem die Membranfraktionskonzentration auf 2,5 μg/ml eingestellt wurde, wurde auch die 50% hemmende Konzentration (IC₅₀-Wert) von MCH berechnet aus der Hemmrate (%). Als IC₅₀-Wert wurden 0,2 nM gefunden (10).
Ein ähnlicher Bindungstest kann durchgeführt werden unter Verwendung einer Membranfraktion, die aus den Ratten-SLC-1 exprimierenden CHO-Zellen hergestellt wurde und von [¹²⁵I]-markiertem MCH(4-19).
Beispiel 24
Herstellung von MCH
(Asp-Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)
In einen Reaktionstank eines Peptidsyntheseautomaten ABI 430A wurden 0,5 mmol im Handel erhältliches Boc-Val-OCH₂-PAM-Harz (0,77 mmol/g Harz) gegeben. Gemäß der Boc-Strategie-(NMP-HOBt)-Peptidsynthese wurden Boc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Asp(OcHex), Boc-Phe und Boc-Asp(OcHex) dem Harz in dieser Reihenfolge zugefügt, um das gewünschte geschützte Peptidharz zu ergeben. Das entstehende Harz, 0,6 g, wurde 60 Minuten lang bei 0°C in 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff zusammen mit 2 g p-Kresol und 1,2 ml 1,4-Butandithiol gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde dann im Vakuum abdestilliert. Diethylether wurde zu dem Rückstand zugegeben und der Niederschlag wurde filtriert. Wässrige 50%ige Essigsäurelösung wurde dem Niederschlag zur Extraktion zugegeben und unlösliches Material wurde entfernt. Nachdem der Extrakt ausreichend konzentriert war, wurde das Konzentrat auf eine Sephadex-(Markenname)-G-25-Säule (2,0 × 80 cm), die mit 50% wässriger Essigsäurelösung gefüllt war, aufgetragen und mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt. Die Hauptfraktionen wurden gesammelt und auf eine Reverse-Phase-Chromatographiesäule (2,6 × 60 cm), die mit LiChroprep (Markenname) RP-18 gepackt war, aufgetragen und anschließend mit 200 ml Wasser, das 0,1% TFA enthielt, gewaschen. Eine Elution mit einem linearen Dichtegradienten wurde durchgeführt mit 300 ml Wasser, das 0,1% TFA enthielt und 300 ml 40% wässriger Acetonitrillösung, die 0,1 % TFA enthielt. Die Hauptfraktionen wurden gesammelt und eingeengt. Das Konzentrat wurde in ungefähr 4 ml Essigsäure gelöst. Nach Verdünnen der Lösung mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 240 ml wurde der pH-Wert mit Ammoniakwasser auf 7,5 eingestellt. Die Verdünnung wurde gerührt, während vorsichtig Luft eingeblasen wurde. Die Reaktion wurde mit HPLC verfolgt. Nachdem bestätigt worden war, dass die Peaks des Peptids in SH-Form alle in die SS-Form umgewandelt worden waren, wurde Essigsäure zugefügt, um den pH-Wert der Lösung auf 3 einzustellen. Dann wurde die Lösung auf der LiChroprep-(Markenname)-RP-18-Säule, oben, adsorbiert. Nachdem die Säule mit 200 ml Wasser, das 0,1% TFA enthielt, gewaschen worden war, wurde eine Elution mit linearem Dichtegradienten durchgeführt unter Verwendung von 300 ml Wasser, das 0,1% TFA enthielt, und 300 ml 50% wässriger Acetonitrillösung, die 0,1% TFA enthielt. Die Hauptfraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, was das gewünschte Peptid ergab.

Massenspektrum (M + H)⁺ 2387,3 (berechnet 2387,9)
Elutionszeit mit HPLC: 20,9 min
Säulenbedingungen:
Säule: Wakosil-II 5C18HG (4,6 × 150 mm)
Elutionsmittel: Elution mit linearem Dichtegradienten mit den Elutionsmitteln A/B = 20/80 bis 80/20 unter Verwendung von 10% wässriger Acetonitrillösung, die 0,1% TFA enthielt, als Eluti onsmittel A und 60% wässriger Acetonitrillösung, die 0,1% TFA enthielt (20 min)
Durchflussrate: 1,0 ml/min

Beispiel 25
Herstellung von Des-Asp¹-MCH
(MCH(2-19), Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tvr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)
In einen Reaktionstank eines Peptidsyntheseautomaten ABI 430A wurden 0,5 mmol im Handel erhältliches Boc-Val-OCH₂-PAM-Harz (0,77 mmol/g Harz) gegeben. Gemäß der Peptidsynthese nach Boc-Strategie (NMP-HOBt) wurden Boc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Asp(OcHex) und Boc-Phe dem Harz in dieser Reihenfolge zugefügt, um das gewünschte geschützte Peptidharz zu ergeben. Das entstehende Harz wurde wie in Beispiel 25 behandelt zur Entfernung der Schutzgruppen, zur Cyclisierung und zur Reinigung, was das gewünschte Peptid ergab.

Massenspektrum (M + H)⁺ 2272,3 (berechnet 2272,1)
Elutionszeit mit HPLC: 20,6 min
Säulenbedingungen:
Säule: Wakosil-II SC18HG (4,6 × 150 mm)
Elutionsmittel: Elution mit linearem Dichtegradienten mit den Elutionsmitteln A/B = 20/80 bis 80/20 unter Verwendung von 10% wässriger Acetonitrillösung, die 0,1% TFA enthielt, als Eluti onsmittel A und 60% wässriger Acetonitrillösung, die 0,1 % TFA enthielt (20 min)
Durchflussrate: 1,0 ml/min

Beispiel 26
Herstellung von Des-[Asp¹, Phe²]-MCH
(MCH(3-19), Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)
In einen Reaktionstank des Peptidsyntheseautomaten ABI 430A wurden 0,5 mmol im Handel erhältliches Boc-Val-OCH₂-PAM-Harz (0,77 mmol/g Harz) gegeben. Gemäß der Peptidsynthese nach Boc-Strategie (NMP- HOBt) wurden Boc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Met und Boc-Asp(OcHex) dem Harz in dieser Reihenfolge zugefügt, um das gewünschte geschützte Peptidharz zu ergeben. Das entstehende Harz wurde wie in Beispiel 24 behandelt zur Entfernung der Schutzgruppen, zur Cyclisierung und zur Reinigung, was das gewünschte Peptid ergab.

Massenspektrum (M + H)⁺ 2124,8 (berechnet 2125,0)
Elutionszeit mit HPLC: 19,2 min
Säulenbedingungen:
Säule: Wakosil-II 5C18HG (4,6 × 150 mm)
Elutionsmittel: Elution mit linearem Dichtegradienten mit den Elutionsmitteln AB = 20/80 bis
80/20 unter Verwendung von 10% wässriger Acetonitrillösung, die 0,1% TFA enthielt, als Eluti onsmittel A und 60% wässriger Acetonitrillösung, die 0,1% TFA enthielt (20 min)
Durchflussrate: 1,0 ml/min

Beispiel 27
Herstellung von Des-[Asp¹, Phe², Asp³]-MCH
(MCH(4-19), Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val)
In einen Reaktionstank des Peptidsyntheseautomaten ABI 430A wurden 0,5 mmol im Handel erhältliches Boc-Val-OCH₂-PAM-Harz (0,77 mmol/g Harz) gegeben. Gemäß der Peptidsynthese nach Boc-Strategie (NMP-HOBt) wurden Boc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu und Boc-Met dem Harz in dieser Reihenfolge zugefügt, um das gewünschte geschützte Peptidharz zu ergeben. Das entstehende Harz wurde wie in Beispiel 24 behandelt zur Entfernung der Schutzgruppen, zur Cyclisierung und zur Reinigung, was das gewünschte Peptid ergab.

Massenspektrum (M + H)⁺ 2009,9 (berechnet 2010,0)
Elutionszeit mit HPLC: 17,9 min
Säulenbedingungen:
Säule: Wakosil-II 5C18HG (4,6 × 150 mm)
Elutionsmittel: Elution mit linearem Dichtegradienten mit den Elutionsmitteln A/B = 20/80 bis 80/20 unter Verwendung von 10% wässriger Acetonitrillösung, die 0,1% TFA enthielt, als Eluti onsmittel A und 60% wässriger Acetonitrillösung, die 0,1 % TFA enthielt (20 min)
Durchflussrate: 1,0 ml/min

Beispiel 28
Herstellung von Des-[Asp¹, Phe², Asp³, Met⁴]-MCH
(MCH(5-19), Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val-OH)
In einen Reaktionstank des Peptidsyntheseautomaten ABI 430A wurden 0,5 mmol im Handel erhältliches Boc-Val-OCH₂-PAM-Harz (0,77 mmol/g Harz) gegeben. Gemäß der Peptidsynthese nach Boc-Strategie (NMP- HOBt) wurden Boc-Gln, Boc-Trp(CHO), Boc-Cys(MeBzl), Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Val, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Leu, Boc-Met, Boc-Cys(MeBzl), Boc-Arg(Tos) und Boc-Leu dem Harz in dieser Reihenfolge zugefügt, um das gewünschte geschützte Peptidharz zu ergeben. Das entstehende Harz wurde wie in Beispiel 24 behandelt zur Entfernung der Schutzgruppen, zur Cyclisierung und zur Reinigung, was das gewünschte Peptid ergab.

Massenspektrum (M + H)⁺ 1878,9 (berechnet 1878,9)
Elutionszeit mit HPLC: 17,4 min
Säulenbedingungen:
Säule: Wakosil-II 5C18HG (4,6 × 150 mm)
Elutionsmittel: Elution mit linearem Dichtegradienten mit den Elutionsmitteln AB = 20/80 bis 80/20 unter Verwendung von 10% wässriger Acetonitrillösung, die 0,1% TFA enthielt, als Elutionsmittel A und 60% wässriger Acetonitrillösung, die 0,1% TFA enthielt (20 min)
Durchflussrate: 1,0 ml/min

(Sequenzprotokoll – freier Text)
SEQ ID Nr. 1
Weitere Information zur Sequenz: Die zwei Cys-Reste 7 und 16 bilden eine intramolekulare Disulfidbindung.
SEQ ID Nr. 2
Weitere Information zur Sequenz: Die zwei Cys-Reste 7 und 16 bilden eine intramolekulare Disulfidbindung.
SEQ ID Nr. 19
Weitere Information zur Sequenz: Die zwei Cys-Reste 6 und 15 bilden eine intramolekulare Disulfidbindung.
SEQ ID Nr. 20
Weitere Information zur Sequenz: Die zwei Cys-Reste 5 und 14 bilden eine intramolekulare Disulfidbindung.
SEQ ID Nr. 21
Weitere Information zur Sequenz: Die zwei Cys-Reste 4 und 13 bilden eine intramolekulare Disulfidbindung.
SEQ ID Nr. 22
Weitere Information zur Sequenz: Die zwei Cys-Reste 3 und 12 bilden eine intramolekulare Disulfidbindung.
SEQ ID Nr. 23
Weitere Information zur Sequenz: Die zwei Cys-Reste 2 und 11 bilden eine intramolekulare Disulfidbindung.
SEQ ID Nr. 24
Weitere Information zur Sequenz: Die zwei Cys-Reste 1 und 10 bilden eine intramolekulare Disulfidbindung.
Industrielle Anwendbarkeit
Das Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder von deren Salzen, die die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder seinem Derivat oder einem Salz davon und SLC-1 oder einem Salz verändern, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das MCH der vorliegenden Erfindung oder sein Derivat oder ein Salz davon und das SLC-1 oder sein Salz verwendet werden, ist nützlich, um SLC-1-Agonisten zu screenen, die nicht nur als Appetit (ess-) fördernde Mittel verwendet werden können, sondern auch als prophylaktische/therapeutische Mittel für schwache Wehen, atonische Blutung, vor und nach Austreibung, Subinvolution des Uterus, Kaiserschnitt, Abtreibung, Galactostasis, etc. und SLC-1-Agonisten, die nicht nur als Antifettsuchtmittel (Wirkstoffe), Appetit-(Ess)-Modulatoren etc. verwendet werden können, sondern auch als prophylaktische/therapeutische Mittel zur Hyperstimulierung, ankylosierende Uteruskontraktionen, Fetal Distress, Gebärmutterriss, Einreißen des Gebärmuttermundes, Frühgeburt, Prader-Willi-Syndrom etc.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder einem Salz davon, die/das die Bindungseigenschaft zwischen einem Melanin konzentrierenden Hormon (MCH) oder einem Salz davon und SLC-1 oder einem Salz davon verändert, das umfasst, dass die Menge von an SLC-1 oder dessen Salz gebundenem MCH oder dessen Derivat gemessen wird, (i) wenn das MCH oder sein Derivat in Kontakt mit dem SLC-1 oder einem Salz davon gebracht wird und (ii) wenn eine Testverbindung und das MCH oder sein Derivat in Kontakt mit dem SLC-1 oder einem Salz davon gebracht werden, und (i) und (ii) verglichen werden.
Kit zum Screenen einer Verbindung oder eines Salzes davon, die/das die Bindungseigenschaft zwischen MCH oder einem Salz davon und SLC-1 oder einem Salz davon verändert, enthaltend MCH oder ein Derivat davon oder ein Salz davon und das SLC-1 oder ein Salz davon.
Screening-Verfahren nach Anspruch 1 oder Screening-Kit nach Anspruch 2, wobei SLC-1 ein Protein ist, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 gezeigt ist, oder ein Protein, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 gezeigt ist, wovon 1 bis 30, bevorzugt 1 bis 10 Aminosäuren deletiert sind, die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 gezeigt ist, der (oder in die) 1 bis 30, bevorzugt 1 bis 10 Aminosäuren zugefügt (oder insertiert) wurden oder die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 11 gezeigt ist, bei der 1 bis 30, bevorzugt 1 bis 10 Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt wurden, enthält.
Screening-Verfahren nach Anspruch 1 oder Screening-Kit nach Anspruch 2, wobei das MCH ein Peptid ist, das die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz enthält, wie die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz.
Screening-Verfahren nach Anspruch 1 oder Screening-Kit nach Anspruch 2, wobei das Derivat ein Peptid ist, das eine Sequenz der 4. bis 19. Aminosäure vom N-Ende der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz enthält.
Screening-Verfahren nach Anspruch 1 oder Screening-Kit nach Anspruch 2, wobei das Derivat ein Peptid ist, das eine Sequenz der 5. bis 19. Aminosäure vom N-Ende der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz enthält.
Screening-Verfahren nach Anspruch 1 oder Screening-Kit nach Anspruch 2, wobei das Derivat MCH ist, das mit einem Bolton-Hunter-Reagenz derivatisiert ist oder ein Peptid, das mit einem Bolton-Hunter-Reagenz derivatisiert ist und eine Sequenz von der 4. bis 19. Aminosäure vom N-Ende der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz enthält.
Screening-Verfahren nach Anspruch 1 oder Screening-Kit nach Anspruch 2, wobei das Derivat MCH ist, das mit einem Bolton-Hunter-Reagenz derivatisiert ist oder ein Peptid, das mit einem Bolton-Hunter-Reagenz derivatisiert ist und eine Sequenz von der 5. bis 19. Aminosäure vom N-Ende der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei MCH oder sein Derivat [¹²⁵I]-[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Met⁴]-MCH(4-19) ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das [¹²⁵I]-[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Met⁴]-MCH(4-19) dargestellt wird durch die folgende Formel:
Kit nach Anspruch 2, wobei das MCH oder sein Derivat [¹²⁵I]-[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Met⁴]-MCH(4-19) ist.
Kit nach Anspruch 11, wobei das [¹²⁵I]-[N-(3-(4-Hydroxy-3-iodphenyl)propionyl)-Met⁴]-MCH(4-19) dargestellt wird durch die folgende Formel:
Protein enthaltend die in SEQ ID Nr. 11 dargestellte Aminosäuresequenz oder ein Salz davon.
DNA enthaltend eine DNA mit einer Basensequenz, die das Protein gemäß Anspruch 13 codiert.
MCH derivatisiert mit einem Bolton-Hunter-Reagenz oder ein Peptid oder ein Salz, das mit einem Bolton-Hunter-Reagenz derivatisiert ist, das eine Sequenz der 4. bis 19. oder 5. bis 19. Aminosäure vom N-Ende der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz enthält.
MCH derivatisiert mit einem Bolton-Hunter-Reagenz oder ein Peptid oder ein Salz, das mit einem Bolton-Hunter-Reagenz derivatisiert ist gemäß Anspruch 15, das durch die folgende Formel dargestellt wird: