DE69737476T2

DE69737476T2 - Neuer galaninrezeptor

Info

Publication number: DE69737476T2
Application number: DE69737476T
Authority: DE
Inventors: Shi-Hsiang Beaconsfield SHEN; Sultan Dorval AHMAD; Claes Montreal WAHLESTEDT; Philippe Montreal WALKER
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 1996-07-19
Filing date: 1997-07-04
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2017-07-05
Also published as: US20060235202A1; US7528229B2; WO1998003548A1; ES2283024T3; EP0912610B1; US7407761B2; US6562945B1; SE9602822D0; AU3711597A; US7375207B2; DE69737476D1; US20060234281A1; CA2260745A1; US20060234282A1; US7510846B2; ATE356831T1; EP0912610A1; US20030187222A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem allgemeinen Sektor der biologischen Rezeptoren und der verschiedenen Verwendungen, die diese Rezeptoren haben können. Die Erfindung betrifft insbesondere Nukleinsäuren, die einen neuen Galaninrezeptor kodieren, und das Rezeptorprotein selbst.
Hintergrund und Stand der Technik
Galanin ist ein kleines (29 bis 30 Aminosäuren) neuroendokrines Peptid, das zu keiner bekannten Peptidfamilie gehört (Bedecs et al., Int. J. Biochem. Cell. Biol. 27: 337–349 (1995)). Es kommt weitverbreitet im zentralen Nervensystem und anderen Geweben vor, und Berichten zufolge hat es eine große Zahl an unterschiedlichen biologischen und pharmakologischen Aktivitäten. Es ist berichtet worden, dass Galanin: (a) die Freisetzung des Wachstumshormons fördert (Bauer et al., The Lancet 2:192–195 (1986)); (b) die Glucose-induzierte Insulinausschüttung inhibiert (Ahren et al., FEBS Lett. 255:233–237 (1988)); (c) die Motilität des Gastrointestinaltrakts reguliert (Fox-Thelkeld et al., Gastroenterology 101:1471–1476 (1991)); (d) das Fütterungsverhalten stimuliert (Crawley et al., J. Neurosci 10:3695–3700 (1990)), und (e) die kognitive Funktion beeinträchtigt (Mastropaolo et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85:9841–9845 (1988)).
Von besonderem pharmakologischen Interesse sind die analgetischen Wirkungen von Galanin (Post et al., Acta Physiol. Scand. 132: 583–584 (1988)). Galanin inhibiert im Rückenmark Schmerzreflexe und potenziert die analgetische Wirkung von Morphin (Wiesenfeld-Hallin et al., Neurosci. Lett. 1705:149–154 (1989)). Es ist berichtet worden, dass die gezielte Verabreichung von Galanin die Neuronen des dorsalen Horns hyperpolarisiert und dass die chronische Verabreichung eines Galaninrezeptorantagonisten nach Axothomie die Autonomie bei Ratten deutlich erhöht (Verge et al., Neurosci. Lett. 149:193–197 (1993)). Diese Beobachtungen zeigen, dass Galanin, wie Morphin, in vivo starke Antischmerzwirkungen aufweist. Die bekannten pharmakologischen Wirkungen von Galanin legen somit potentielle therapeutische Anwendungen als Anästhetikum oder Analgetikum bei Tieren und Menschen nahe.
Galanin übt seine Wirkungen durch Bindung an membrangebundene Rezeptoren aus. Die cDNA aus einem derartigen Rezeptor ("GAL-R1") sowohl von Menschen als auch von Ratten ist geklont worden (Habert-Ortoliet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:9780–9783 (1994); Burgevin et al., J. Mol. Neurosci. 6:33–41 (1995)). Im ventralen Hippocampus, im Thalamus, der Amygdala und Medulla oblongata des Hirns und im dorsalen Horn des Rückenmarks sind hohe Gehalte an Ratten-GAL-R1-mRNA gefunden worden (Burgevin et al., supra). Pharmakologische Daten, die unter Verwendung von Galaninfragmenten, Agonisten und Antagonisten erhalten wurden, haben nahegelegt, dass für die Wirkungen von Galanin möglicherweise mehr als ein Rezeptortyp verantwortlich ist (siehe für eine Übersicht Valkna et al., Neurosci. Lett. 187:75–78 (1995)). Die Isolierung und Charakterisierung neuer Galaninrezeptoren wäre hoch erwünscht, um die Entdeckung und Entwicklung therapeutischer Mittel zur Veränderung der Galaninaktivität in vivo zu entwickeln.
Kurzfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung eines neuen Galaninrezeptors ("GAL-R2"), der sich von den Rezeptoren, über die zuvor berichtet wurde, hinsichtlich der Struktur, der Gewebeverteilung und der Bindungscharakteristika unterscheidet. Rezeptoren von sowohl der Ratte als auch dem Menschen sind isoliert und sequenziert worden. Der Begriff "GAL-R2" bezieht sich hier auf den Rezeptor von einer dieser Spezies, wenn nicht ausdrücklich der Text oder der Kontext etwas anderes angibt.
Die Erfindung betrifft gemäß ihrem ersten Aspekt Proteine, die im Wesentlichen frei von verunreinigenden zellulären Komponenten sind und die Aminosäuresequenz von humanem GAL-R2 umfassen (wie in 2 gezeigt ist). Die Erfindung umfasst ferner Antikörper, die spezifisch an GAL-R2 binden (d. h. die mindestens eine 100-fach größere Affinität zu GAL-R2 als zu irgendeinem anderen Protein haben) und Antikörper, die nach einem Verfahren hergestellt sind, das die Injektion pharmazeutisch annehmbarer Präparationen dieser Proteine in ein Tier umfasst, das in der Lage ist, den Antikörper zu produzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird monoklonaler Antikörper von GAL-R2 produziert, indem die pharmazeutisch annehmbare Zubereitung von GAL-R2 einer Maus injiziert wird und danach Milzzellen der Maus mit Myelomzellen verschmolzen werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Polynukleotid, das im Wesentlichen frei von verunreinigenden zellulären Komponenten ist und ein Protein kodiert, umfassend die Aminosäuresequenz der Sequenz von humanem GAL-R2 (wie in 2 gezeigt ist). Dieser Aspekt der Erfindung beinhaltet Polynukleotide, die Proteine kodieren, die aus den Aminosäuresequenzen in den Figuren bestehen, Expressionsvektoren, umfassend diese Polynukleotide, und Wirtszellen, die mit derartigen Vektoren transformiert sind. Ebenfalls eingeschlossen sind die rekombinanten humanen GAL-R2-Proteine, die durch auf diese Weise hergestellte Wirtszellen hergestellt werden. Das Polynukleotid, das humanes GAL-R2 kodiert, hat vorzugsweise die in 2 gezeigte Nukleotidsequenz. Es ist bevorzugt, dass die Vektoren und Wirtszellen, die zur Expression von GAL-R2 verwendet werden, diese speziellen Polynukleotide verwenden.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Assayverfahren zur Untersuchung einer Textverbindung auf ihre Fähigkeit zur Bindung an GAL-R2. Dieses Verfahren wird durchgeführt, indem man eine Quelle für GAL-R2 mit einem Liganden, der bekanntermaßen an den Rezeptor bindet, und mit der Testverbindung inkubiert. Die Quelle für GAL-R2 sollte im Wesentlichen frei von andere Typen von Galaninrezeptoren sein, d. h. mehr als 90% der vorhandenen Galaninrezeptoren sollten GAL-R2 entsprechen. Nach Beendigung der Inkubierung wird die Fähigkeit der Testverbindung zur Bindung an GAL-R2 durch das Ausmaß bestimmt, in dem die Ligandenbindung verdrängt worden ist. Eine bevorzugte Quelle für GAL-R2 zur Verwendung in dem Assay ist eine Zelle, die mit einem Vektor transformiert ist, um den Rezeptor zu exprimieren, und die ein Polynukleotid umfasst, das ein Protein kodiert, das aus der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz besteht (humanes GAL-R2). Anstatt in dem Assay Zellen zu verwenden, kann aus den Zellen eine Membranpräparation hergestellt werden, und diese kann als Quelle für GAL-R2 verwendet werden. Der Assay kann, wenn dies auch nicht wesentlich ist, von der Bestimmung der Aktivierung eines Second-Messenger-Wegs begleitet werden, wie des Adenylcyclase-Wegs. Hierdurch sollte die Bestimmung, ob eine Verbindung, die an GRL-R2 bindet, als Agonist oder Antagonist für Galanin wirkt, erleichtert werden.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Assayverfahren zur Untersuchung einer Testverbindung auf ihre Fähigkeit zur Expression von GAL-R2. Dieses Verfahren wird durchgeführt, indem Zellen, die GAL-R2 exprimieren, jedoch im Wesentlichen frei von anderen Galaninrezeptoren sind, in Gegenwart der Testverbindung gezüchtet werden. Dann werden die Zellen gesammelt und die Expression von GAL-R2 mit der Expression in Kontrollzellen verglichen, die unter im Wesentlichen identischen Bedingungen, jedoch in Abwesenheit der Testverbindung gezüchtet wurden. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Zellen, die GAL-R2 exprimieren, Zellen, die mit einem Expressionsvektor transformiert sind, der eine Polynukleotidsequenz umfasst, die ein Protein kodiert, das aus der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz besteht (humanes GAL-R2). Eine bevorzugte Testverbindung ist ein Oligonukleotid von mindestens 15 Nukleotiden Länge und umfasst eine Sequenz, die zu einer in SEQ. ID. Nr. 3 gezeigten Sequenz komplimentär ist. Das bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Rezeptorexpression ist mittels eines Rezeptorbindungsassays.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Gezeigt sind die zusammengesetzte Nukleotidsequenz und entsprechende Translation unterzogene Aminosäuresequenz (in Einbuchstabencode) von Ratten-GAL-R2. Die Nukleinsäuresequenz hat die Bezeichnung SEQ ID Nr. 1 und die Aminosäuresequenz die Bezeichnung SEQ ID Nr. 2 erhalten.
2: Gezeigt sind die zusammengesetzte Nukleotidsequenz und entsprechende Translation unterzogene Aminosäuresequenz (in Einbuchstabencode) von humanem GAL-R2. Die Nukleinsäuresequenz hat die Bezeichnung SEQ ID Nr. 3 und die Aminosäuresequenz die Bezeichnung SEQ ID Nr. 4 erhalten.
3: Die Aminosäuresequenzen von Ratten-GAL-R2 (RGALR2.PRO), Ratten-GAL-R1 (rGALR1.PRO), humanem GAL- R2 (HGALR2.PRO) und humanem GAL-R1 (hGALR1.PRO) sind Alignment unterzogen, um Homologieregionen zu zeigen. Die Reste in der HGAL-R2-Sequenz, die mit anderen Sequenzen gemeinsam vorliegen, sind umrahmt. Um das Alignment zu optimieren, wurden an mehreren Stellen in den GAL-R2-Sequenzen Lücken erzeugt, und diese Lücken sind durch schwarze Kästchen gezeigt. Die rGALR1.PRO-Sequenz ist als SEQ ID Nr. 5 bezeichnet worden, und die hGALR1.PRO-Sequenz als SEQ ID Nr. 6.
4: Gezeigt ist die Sättigungsisotherme der ¹²⁵I-Galanin-Bindung an Membranen aus Ratten-GAL-R2 exprimierenden HEK-293-Zellen. Zunehmende Konzentrationen von Radiotracer wurden mit den Membranen inkubiert, die Bindung wurde den Gleichgewichtszustand erreichen gelassen, und danach wurde die Reaktion wie unter Beispiel 3 beschrieben filtriert. Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 1 μM unmarkiertem Galanin gemessen und wurde von der Gesamtbindung subtrahiert, um die spezifische Bindung zu erhalten.
5: 4 zeigt die Ergebnisse von Bindungsassays, bei denen unmarkiertes Galanin und mit Galanin verwandte Peptide mit markiertem Galanin um GAL-R2-Stellen konkurrieren gelassen wurden. Die Daten wurden in Prozentsätze umgewandelt, wobei die Bindung in Abwesenheit von Kompetitor als 100 diente. Es wurde keine Inhibierung beobachtet, wenn Bindungsassays in Gegenwart von Peptiden durchgeführt wurden, die nicht mit Galanin verwandt waren.
6: Galanin schwächt die Stimulation von Adenylcyclase durch Forskolin in dosisabhängiger Weise in HEK-293-Zellen, die GAL-R2 exprimieren. Gruppe A zeigt das Basisniveau von cAMP in Zellen, die weder mit Forskolin noch mit Galanin (C) behandelt wurden; die Wirkung von 1 μM Galanin (G); die Wirkung von 0,1 mM Forskolin (F); und die Wirkung von 1 μM Galanin + 0,1 mM Forskolin (F+G). In Gruppe B wurden Zellen in Gegenwart von 0,1 mM Forskolin allein oder in Gegenwart von Forskolin mit verschiedenen Konzentrationen an Galanin inkubiert. Dann wurde intrazelluläres CAMP extrahiert und durch Enzymimmunoassay gemessen, wie in Beispiel 4 beschrieben wird. Die Ergebnisse sind als Prozentsätze ausgedrückt, wobei 100% der Wert ist, der in Gegenwart von Forskolin allein erhalten wird.
Definitionen
Die folgenden Beschreibungen verwenden mehrere Begriffe die sich auf die rekombinante DNA-Technologie beziehen. Um für ein klares und konsistentes Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche einschließlich des diesen Begriffen zugeordneten Umfangs zu sorgen, werden die folgenden Definitionen bereitgestellt:
Klonierungsvektor: Eine Plasmid- oder Phagen-DNA oder andere DNA-Sequenz, die in einer Wirtszelle autonom replizieren kann und durch eine oder eine kleine Anzahl von Restriktionsendonukleaseerkennungsstellen charakterisiert ist. Ein Fremd-DNA-Fragment kann an diesen Stellen in den Vektor gespleißt werden, um die Replikation und Klonierung des Fragments zu bewirken. Der Vektor kann einen Marker enthalten, der zur Verwendung zur Identifizierung der transformierten Zellen geeignet ist. Marker können beispielsweise Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz verleihen.
Expressionsvektor: Ein Vektor ähnlich einem Klonierungsvektor, der jedoch die Expression der DNA, in die er geklont worden ist, nach Transformation in einen Wirt induzieren kann. Die geklonte DNA wird üblicherweise unter der Kontrolle bestimmter Regulierungssequenzen angeordnet (d. h. operativ an diese gelinkt), wie Promotoren oder Verstärkungsmittel (Enhancer). Promotersequenzen können konstituierend, induzierbar oder repressierbar sein.
Im Wesentlichen rein: "Im Wesentlichen rein" bedeutet hier, dass das gewünschte Produkt im Wesentlichen frei von verunreinigenden zellulären Komponenten ist. Zu Verunreinigungen können Proteine, Kohlehydrate oder Lipide gehören, jedoch nicht auf diese begrenzt. Ein Verfahren zur Bestimmung der Reinheit eines Proteins oder einer Nukleinsäure ist durch Elektrophoresebehandlung einer Präparation in einer Matrix, wie Polyacrylamid oder Agarose. Die Reinheit wird durch das Erscheinen einer Einzelbande nach dem Anfärben gezeigt.
Wirt: Jede prokaryontische oder eukaryontische Zelle, die der Empfänger eines replizierbaren Expressionsvektors oder Klonierungsvektor ist, ist der "Wirt" für jenen Vektor. Der Begriff umfasst prokaryontische oder eukaryontische Zellen, die gentechnisch verändert worden sind, um ein gewünschtes Gen in ihr Chromosom oder ihr Genom einzubauen. Beispiele für Zellen, die als Wirte dienen können, sind in der Technik gut bekannt, ebenso wie Techniken zur zellulären Transformation (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor (1989)).
Promoter: Eine DNA-Sequenz, die sich in der Regel in der 5'-Region eines Gens befindet, die proximal zu dem Start-Codon angeordnet ist. Die Transkription wird am Promoter initiiert. Wenn der Promoter zu dem induzierbaren Typ gehört, erhöht sich die Transkriptionsgeschwindigkeit in Reaktion auf ein Induktionsmittel.
Komplementäre Nukleotidsequenz: Eine komplementäre Nukleotidsequenz bezieht sich hier auf die Sequenz, die sich durch normale Basenpaarung ergeben würde. Die Nukleotidsequenz 5'-AGAC-3' hätte beispielsweise die komplementäre Sequenz 5'-GTCT-3'.
Expression: Expression ist der Prozess, nach dem aus DNA ein Polypeptid produziert wird. Der Prozess beinhaltet die Transkription des Gens in mRNA und die Translation dieser mRNA in ein Polypeptid.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft GAL-R2-Rezeptorproteine, Gensequenzen, die die Rezeptoren kodieren, ein Assayverfahren zur Bewertung der Bindung von Verbindungen an GAL-R2 und ein Assayverfahren zur Bewertung der Fähigkeit von Verbindungen, die GAL-R2-Expession zu ändern. Die Rezeptoren und ihre Nukleinsäuren sind durch ihre Strukturen (wie in 1 und 2 gezeigt) sowie ihre Gewebeverteilung und ihre Bindungscharakteristika definiert.
Wir gehen in Bezug auf die Struktur davon aus, dass die vorliegende Erfindung nicht nur Sequenzen umfasst, die identisch mit den in den Figuren gezeigten sind, sondern auch Sequenzen, die im Wesentlichen die gleichen sind, sowie Sequenzen, die anderweitig im Wesentlichen die gleichen sind und zu einem Rezeptor führen, der die grundlegenden Bindungscharakteristika von GAL-R2 beibehält. Es ist beispielsweise gut bekannt, dass Techniken, wie stellengeführte Mutagenese, zur Einführung von Varianten in der Struktur eines Proteins verwendet werden können. Durch dieses oder irgendein ähnliches Verfahren eingeführte Variationen von GAL-R2 sind von der Erfindung abgedeckt, vorausgesetzt, dass der resultierende Rezeptor die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an Galanin oder galaninartige Peptide behält. Die Erfindung betrifft somit Proteine, umfassend Aminosäuresequenzen, die aus der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 4 (human) bestehen.
I. Nukleinsäuresequenzen, die für GAL-R2 kodieren
DNA-Sequenzen, die für GAL-R2 kodieren, sind in vielen verschiedenen Geweben vorhanden, von denen jedes als Quelle für die Isolierung von Nukleinsäuren dienen kann, die den Rezeptor kodieren. Bei den Ratten gehören die Rückenmark- und Hirngewebe zu den bevorzugten Quellen, wobei die dorsalen Ganglien des Rückenmarks und der Hippocampus, Corpus mamillare und Cerebellum des Hirns besonders bevorzugt sind. Zellen und Zelllinien, die GAL-R2 exprimieren, können außerdem als eine Quelle für Nukleinsäure dienen. Diese können entweder kultivierte Zellen sein, die keine Transformation erfahren haben, oder Zelllinien, die gentechnisch spezifisch verändert worden sind, damit sie rekombinanten GAL-R2 exprimieren.
Es stehen viele Verfahren zum Isolieren von DNA-Sequenzen zur Verfügung, und sie können für die Isolierung von GAL-R2 Nukleinsäure adaptiert werden (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press (1989)). Ein bevorzugtes Verfahren für Ratten-GAL-R2, das in Beispiel 1 illustriert ist, ist das Screening einer cDNA-Bibliothek, die durch reverse Transkription von mRNA hergestellt worden ist, die aus Geweben oder Zellen isoliert wurden, die bekanntermaßen GAL-R2 exprimieren. Die Bibliothek kann beispielsweise aus dorsalen Stammganglien oder aus Hirngewebe der Ratte hergestellt werden. Es ist gefunden worden, dass eine Rattenhirn-Stamm-Rückenmark-cDNA-Bibliothek in ZAP II geeignete Ergebnisse ergibt. Es kann ein ähnliches Verfahren für humanen GAL-R2 verwendet werden, oder alternativ kann eine humane DNA-Bibliothek wie in Beispiel 7 beschrieben Screening unterzogen werden.
Es wird erwartet, dass viele unterschiedliche Sonden, die für GAL-R2 spezifisch sind, gleichermaßen gut zum Screening von cDNA-Bibliotheken verwendet werden können. Ein Weg, um leicht eine große Menge an Sonden zu produzieren, ist die Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Amplifizierung der gewünschten Sequenz aus einer cDNA-Bibliothek. Die PCR kann beispielsweise mit einer cDNA-Bibliothek aus dorsalen Stammganglien der Ratte unter Verwendung der folgenden Primer durchgeführt werden:
TM2: 5'-GGCCGTCGACTTCATCGTC(A oder T)(A oder C)(T oder C)CTI(G oder T)GI(T oder C)TIGC(A, C, G oder T)GAC-3' (SEQ ID Nr. 7)
TM7: 5' – (A oder G)(C, A oder T)(A oder T)(A oder G)CA(A oder G)TAIATIATIGG(A oder G)TT-3' (SEQ ID Nr. 8)
In den obigen Sequenzen ist der Buchstabe "I" die Abkürzung von Inosin. Amplizierte Fragmente können an einem Agarosegel größenfraktioniert werden, und die gewählten Fragmente (z. B. Fragmente von 400 bis 1000 Basenpaaren Länge) können in einen geeigneten Vektor insertiert werden (z. B. pGEM-T). Der Vektor kann nach jedem der bekannten Verfahren zur Zelltransformation, z. B. durch Calciumphosphatpräzipitation, in kompetente Zellen (z. B. DH5-Zellen) eingeführt werden. Transformierte Zellen, die die interessierende DNA enthalten, können wiederum identifiziert werden, indem PCR mit den TM2- und TM7-Primern durchgeführt wird. Die in diesen Zellen vorhandenen DNA-Inserts werden ausgeschnitten, gereinigt und mit ³²P markiert. Die so produzierten markierten DNA-Fragente werden als Sonden zum Screening einer cDNA-Bibliothek auf GAL-R2 verwendet. Die Anwesenheit der korrekten Sequenz in gewählten Zellen kann durch DNA-Sequenzierung bestätigt werden, und, falls erforderlich, können partielle Klone zusammengespleißt werden, um eine Sequenz in vollständiger Länge herzustellen.
Obwohl das obige Verfahren bekanntermaßen geeignet ist, um die GAL-R2-Nukleinsäure zu erhalten, wird erwartet, dass relativ mühelos alternative Techniken entwickelt werden können. Es können somit cDNA-Bibliotheken unter Verwendung von Sonden Screening unterzogen werden, die basierend auf der GAL-R2-Sequenz synthetisiert wurden, die in 1 für Ratten und in 2 für Menschen gezeigt ist. Sonden sollten allgemein mindestens 14 Nukleotide lang sein und sollten nicht aus Regionen gewählt werden, die bekanntermaßen unter den Proteinen stark konserviert werden, z. B. die Transmembrandomänen von G-Proteingelinkten Rezeptoren. Unter Verwendung der in den Figuren gezeigten Sequenzen sollte es alternativ möglich sein, PCR-Primer zu wählen, die die GAL-R2-Sequenz in voller Länge amplifizieren. Die gleichen Techniken, die sich bei Ratten und Menschen als erfolgreich erwiesen haben, können verwendet werden, um GAL-R2-Sequenzen auch von anderen Spezies zu erhalten.
II. Produktion und Isolierung von GAL-R2-rekombinantem Protein
Um rekombinanten GAL-R2 zu exprimieren, muss die strukturelle Sequenz für das oben beschriebene Protein in einem Vektor positioniert werden, der Transkriptions- und Translationssignale enthält, die von einem geeigneten Wirt erkannt werden können. Die geklonten GAL-R2-Sequenzen werden vorzugsweise in doppelsträngiger Form in einer operativen Bindung in den Expressionsvektor insertiert, d. h. sie werden so positioniert, dass sie sich unter der Kontrolle der Regulierungssequenzen des Vektors und in einer derartigen Weise befinden, dass mRNA produziert wird, die in die GAL-R2-Aminosäuresequenz translatiert wird.
Die Expression des GAL-R2-Rezeptorproteins kann in unterschiedlichen Wirten zu unterschiedlicher nach der Translation erfolgender Modifikation führen, die die Eigenschaften des Rezeptors möglicherweise ändern kann. Nukleinsäure, die GAL-R2 kodiert, wird vorzugsweise in eukaryontischen Zellen, insbesondere Säugerzellen, exprimiert. Diese Zellen sorgen für Modifikationen nach der Translation, die unter anderem das korrekte Falten des Rezeptorproteins unterstützen. In Beispiel 2 werden Beispiele für einen geeigneten Vektor pCDNA3-GAL-R2, und Wirt, HEK293-Zellen, gegeben.
Zu anderen verwendbaren Säugerzellen gehören ohne Einschränkungen NIH-3T3-Zellen, CHO-Zellen, HeLa-Zellen, LM-(tk-) Zellen, usw. Im Stand der Technik sind Vektoren gut bekannt, die zur Verwendung in jedem dieser verschiedenen Zelltypen geeignet sind (siehe z. B. Sambrook et al., supra). Zu bevorzugten eukaryontischen Promotoren gehören jene des Metallothionein I-Gens der Maus, der TK-Promoter des Herpes-Virus; der SV40 Frühpromoter und der Hefe GAL4-Genpromoter. Einige Beispiele für geeignete prokaryontische Promotoren umfassen jene, die T4-Polymerasen erkennen können, die P_R- und P_L-Promoter des Bakteriophagen lambda und die trp, recA, Wärmeschock- und lacZ-Promoter von E. coli.
Expressionsvektoren können nach Verfahren wie Calciumphosphatpräzipitation, Mikroinjektion oder Elektroporation in Wirtszellen eingeführt werden. Zellen, die den GAL-R2-Rezeptor exprimieren, können nach im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren selektiert werden. Ein einfaches Verfahren, um die Anwesenheit der Rezeptornukleinsäure in Zellen zu bestätigen, ist die Durchführung der PCR-Amplifizierung unter Verwendung der oben erörterten Verfahren und Primer. Die Anwesenheit von funktionalem Rezeptor kann bestätigt werden, indem Bindungsassays mit markiertem Galanin durchgeführt werden.
Nachdem die Zellen, die rekombinanten GAL-R2-Rezeptor produzieren, identifiziert worden sind, können sie in Bindungsassays oder Assays, die zur Identifizierung von Mitteln vorgesehen sind, die die GAL-R2-Expression ändern können, verwendet werden. Membranen können alternativ aus den Zellen isoliert und in Rezeptorbindungsassays verwendet werden.
III. Antikörper für GAL-R2
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper, die spezifisch an GAL-R2 binden, und ein Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper. Antikörper, die "spezifisch an GAL-R2 binden" sind als jene definiert, die mindestens eine 100 Mal größere Affinität zu GAL-R2 als zu GAL-R1 und jeglichem denaturierten Protein haben, das kein Galanin bindet. Bei dem Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper kann entweder das GAL-R2-Protein selbst in ein geeignetes Tier injiziert werden, oder bevorzugt werden kurze Peptide injiziert, die dazu gebracht worden sind, dass sie unterschiedlichen Regionen von GAL-R2 entsprechen. Die Peptide sollten eine Länge von mindestens fünf Aminosäuren haben und sollten aus Regionen gewählt werden, die vermutlich für das GAL-R2-Protein einzigartig sind. Hochkonservierte Transmembranregionen sollten somit allgemein bei der Auswahl von Peptiden für die Erzeugung von Antikörpern vermieden werden. Verfahren zum Herstellen und Detektieren von Antikörpern sind Fachleuten gut bekannt, wie durch die folgenden Standardreferenzarbeiten deutlich wird: Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988)); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (1982); Kennett et al., Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses (1980); und Campbell, "Monoclonal Antibody Technology," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, (1984)).
"Antikörper" soll hier intakte Moleküle sowie Fragmente umfassen, die ihre Fähigkeit zur Bindung an das Antigen behalten (z. B. Fab und F(ab)₂ Fragmente). Diese Fragmente werden in der Regel durch proteolytische Spaltung intakter Antikörper mit Enzymen wie Papain (zur Herstellung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab)₂ Fragmenten) produziert. Der Begriff "Antikörper" bezieht sich sowohl auf monoklonale Antikörper als auch auf polyklonale Antikörper. Polyklonale Antikörper leiten sich aus den Seren der mit dem Antigen immunisierten Tiere ab. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung der Hybridomatechnologie hergestellt werden (Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, M.Y., Seiten 563-681 (1981)). Bei dieser Technik wird allgemein ein Tier, üblicherweise eine Maus, mit entweder intaktem GAL-R2 oder einem von GAL-R2 abgeleiteten Fragment immunisiert. Die Splenozyten der immunisierten Tiere werden extrahiert und mit geeigneten Myelomazellen verschmolzen, z. B. SP₂O-Zellen. Nach dem Verschmelzen werden die resultierenden Hybridomazellen selektiv in HAT-Medium gehalten und danach durch begrenzte Verdünnung kloniert (Wands et al., Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Die durch derartige Selektion erhaltenen Zellen werden danach Assays unterzogen, um Klone zu identifizieren, die Antikörper sekretieren, die in der Lage sind, an GAL-R2 zu binden.
Die Antikörper oder Fragmente von Antikörpern der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von jeglichem von vielen verschiedenen Immunoassays zum Detektieren der Anwesenheit von GAL-R2-Protein verwendet werden. Die Antikörper können beispielsweise in Radioimmunoassays oder in immunometrischen Assays verwendet werden, die auch als "Two-Site" oder "Sandwich"-Assays bekannt sind (siehe T. Chard, "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, North Holland Publishing Co., N.Y. (1978)). Bei einem typischen immunometrischen Assay wird eine Menge an unmarkiertem Antikörper an einen festen Träger gebunden, der in dem zu testenden Fluid unlöslich ist, z. B. Blut, Lymphe, Zellextrakten, usw. Nach der anfänglichen Bindung von Antigen an immobilisierten Antikörper wird eine Menge an detektierbar markiertem zweitem Antikörper (der der gleiche wie der erste sein kann oder nicht) zugegeben, um die Detektion und/oder Quantifizierung von gebundenem Antigen zu ermöglichen, siehe z. B. Radioimmune Assay Method, Herausgeber Kirkham et al., Seiten 199-206, E & S.
Livingstone, Edinburgh (1970)). In der Technik sind viele Varianten dieser Assaytypen bekannt und können zur Detektierung von GAL-R2 verwendet werden.
Antikörper für GAL-R2 können auch zur Reinigung von entweder dem intakten Rezeptor oder Fragmenten des Rezeptors verwendet werden (siehe allgemein Dean et al., Affinity Chromatography, A Practical Approach, IRL Press (1986)). Antikörper wird in der Regel auf einer chromatographischen Matrix immobilisiert, wie Sepharose 4B. Die Matrix wird danach in eine Säule gepackt, und die Präparation, die GAL-R2 enthält, wird unter Bedingungen hindurchgeleitet, die die Bindung fördern, z. B. unter salzarmen Bedingungen. Die Säule wird danach gewaschen, und gebundenes GAL-R2 wird unter Verwendung eines Puffers eluiert, der die Dissoziation von Antikörper fördert, z. B. Puffer mit einem veränderten pH-Wert oder veränderter Salzkonzentration. Der eluierte GAL-R2 kann z. B. durch Dialyse in einen Puffer der Wahl überführt und entweder gelagert oder direkt verwendet werden.
IV. Assay für GAL-R2-Bindung
Eine der Hauptanwendungen für GAL-R2-Nukleinsäuren und rekombinante Proteine ist in den Assays, die von Galanin verschiedene Mittel identifizieren sollen, die in der Lage sind, an GAL-R2-Rezeptoren zu binden. Derartige Mittel können entweder Agonisten sein, welche die Wirkungen von Galanin imitieren, oder Antagonisten, die die Wirkungen von Galanin inhibieren. Die Identifizierung von Mitteln, die an die GRL-R2-Rezeptoren binden und die Adenylcyclaseaktivität in den Zellen modulieren, ist von besonderem Interesse. Diese Mittel haben potentielle therapeutische Verwendung als Analgetika oder Anästhetika.
Ein Beispiel für einen Assay, der zum Detektieren von Verbindungen verwendet werden kann, die an GAL-R2 binden, wird in Beispiel 4 gegeben. Das wesentliche Merkmal dieses Assays ist, dass eine GAL-R2-Quelle zusammen mit einem Liganden, der bekanntermaßen an den Rezeptor bindet, und der Verbindung inkubiert wird, die auf Bindungsaktivität getestet wird. Die bevorzugte Quelle für GAL-R2 ist Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, die transformiert worden sind, um den Rezeptor rekombinant zu exprimieren. Die gewählten Zellen sollten keine wesentliche Menge irgendeines anderen Rezeptors exprimieren, der Galanin bindet, z. B. GAL-R1. Dies kann leicht bestimmt werden, indem Galaninbindungsassays mit Zellen durchgeführt werden, die von dem gleichen Gewebe oder der gleichen Zelllinie abgeleitet sind wie jene, die rekombinant GAL-R2 exprimieren, jedoch keine Transformation eingegangen sind.
Der Assay kann entweder mit intakten Zellen oder vorzugsweise mit Membranen durchgeführt werden, die aus den Zellen hergestellt sind (siehe z. B. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:10230–10234 (1993)). Die Membranen werden mit einem Liganden, der für Galaninrezeptoren spezifisch ist, und mit einer Präparation der zu testenden Verbindung inkubiert. Nachdem die Bindung abgeschlossen ist, wird Rezeptor von der Lösung, welche Ligand und Testverbindung enthält, z. B. durch Filtration getrennt, und die Menge der stattgefundenen Bindung wird bestimmt. Der verwendete Ligand ist vorzugsweise Galanin, das detektierbar mit einem Radioisotop wie ¹²⁵I markiert worden ist.
Gewünschtenfalls können stattdessen jedoch auch Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzmarkierungen verwendet werden. Zu den am häufigsten verwendeten Fluoreszenzmarkierungsverbindungen gehören Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin. Brauchbare Chemilumineszenzverbindungen umfassen Luminol, Isoluminol, Theromatinacridiniumester ("theromatic acridinium ester"), Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester. Jedes dieser Mittel, das zum detektierbaren Markieren von Galanin verwendet werden kann, produziert einen Liganden, der zur Verwendung in dem Assay geeignet ist.
Die unspezifische Bindung kann bestimmt werden, indem die Bindungsreaktion in Gegenwart eines großen Überschusses an unmarkiertem Ligand durchgeführt wird. ¹²⁵I-Galanin kann beispielsweise mit Rezeptor und Testverbindung in Gegenwart eines tausendfachen Überschusses an unmarkiertem Galanin inkubiert werden. Die unspezifische Bindung sollte von der Gesamtbindung subtrahiert werden, d. h, der Bindung in Abwesenheit von unmarkiertem Galanin, um für jede getestete Probe zu der spezifischen Bindung zu kommen. Andere Stufen, wie Waschen, Rühren, Schütteln, Filtrieren und dergleichen, können nach Bedarf in die Assays integriert werden. In der Regel werden nach der Trennung von membrangebundenem Liganden von in der Lösung verbleibendem Liganden sowie vor der Quantifizierung der Menge des gebundenen Liganden, z. B. durch Zählung von radioaktivem Isotop, Waschschritte eingefügt. Die in Gegenwart von Testverbindung erhaltene spezifische Bindung wird mit derjenigen verglichen, die in Gegenwart von markiertem Liganden allein erhalten wurde, um das Ausmaß zu bestimmen, in dem die Testverbindung Galanin verdrängt hat.
Bei der Durchführung von Bindungsassays muss darauf geachtet werden, Artefakte zu vermeiden, die zu dem Erscheinungsbild führen können, dass eine Testverbindung mit dem GAL-R2-Rezeptor in Wechselwirkung tritt, obwohl die Bindung in der Tat nach irgendeinem anderen Mechanismus inhibiert worden ist. Die getestete Verbindung sollte beispielsweise in einem Puffer vorliegen, der selbst die Bindung von Galanin an GAL-R2 nicht wesentlich inhibiert, und sollte vorzugsweise in mehreren unterschiedlichen Konzentrationen getestet werden. Auch die proteolytische Aktivität von Präparationen der Testverbindung sollte getestet werden, und es ist erwünscht, dass in solchen Assays Antiproteasen enthalten sind. Es ist schließlich hocherwünscht, dass Verbindungen, die als die Bindung von Ligand an GAL-R2-Rezeptor verdrängend identifiziert worden sind, in einem Konzentrationsbereich erneut untersucht werden, der ausreicht, um mit den Ergebnissen eine Scatchard-Analyse durchzuführen. Dieser Analysetyp ist in der Technik wohl bekannt und kann verwendet werden, um die Affinität von Testverbindungen zu einem Rezeptor zu bestimmen (siehe z. B. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 11.2.1–11.2.19 (1993); Laboratory Techniques and Biochemistry and Molecular Biology, Herausgeber Work et al., N.Y. (1978) usw.). Zur Unterstützung der Analyse von Ergebnissen können Computerprogramme verwendet werden (siehe z. B. P. Munson, Methods Enzymol. 92:543–577 (1983); G. A. McPherson, Kinetic, EBDA Ligand, Lowry-A Collection of Radioligand Binding Analysis Programs, Elsevier-Biosoft, U.K. (1985)). Ein Beispiel für Kurventypen, die nach diesem Verfahren erhalten werden können, ist in 5 gezeigt, und Beispiele für Inhibierungskonstanten für mit Galanin verwandte Peptide, die unter Verwendung von Bindungsassays bestimmt wurden, sind in Tabelle 1 gezeigt.
Die Aktivierung eines Second-Messenger-Wegs kann untersucht werden, indem Adenylcyclaseassays für Verbindungen durchgeführt werden, die als an den GAL-R2-Rezeptor bindend identifiziert wurden. Diese Assays können wie in Beispiel 5 erörtert oder nach jedem anderen Verfahren zur Bestimmung der cAMP-Konzentration durchgeführt werden. Adenylcyclaseassays werden in der Regel getrennt von Bindungsassays durchgeführt, es ist jedoch auch möglich, Bindungs- und Adenylcyclaseassays mit einer einzigen Präparation der Zellen durchzuführen.
V. Assay zur Fähigkeit der Modulierung der GAL-R2-Expression
Eine Weise zur Erhöhung oder Herabsetzung der biologischen Wirkungen von Galanin ist die Veränderung des Ausmaßes, in dem GAL-R2 in Zellen exprimiert wird. Assays zur Identifizierung von Verbindungen, die die Expression entweder inhibieren oder verstärken, sind daher von erheblichem Interesse. Diese Assays werden durch Züchten von Zellen, die GAL-R2 exprimieren, in Gegenwart einer Testverbindung und anschließendes Vergleichen der Rezeptorexpression in diesen Zellen mit Zellen, die unter im Wesentlichen identischen Bedingungen, jedoch in Abwesenheit der Testverbindung gezüchtet worden waren, durchgeführt. Es ist wie in den bereits erörterten Bindungsassays erwünscht, dass die verwendeten Zellen im Wesentlichen frei von anderen Galaninrezeptoren als GAL-R2 sind. Scatchard-Analyse von Bindungsassays, die mit markiertem Galanin durchgeführt wurden, kann zur Bestimmung der Rezeptorzahl verwendet werden. Die Bindungsassays können wie oben in Abschnitt IV erörtert durchgeführt werden und verwenden vorzugsweise Zellen, die gentechnisch verändert worden sind, um GAL-R2 rekombinant zu exprimieren, wie in den Abschnitten I und II beschrieben ist.
Eine bevorzugte Gruppe von Testverbindungen, die den GAL-R2-Expressionsassays zugegeben werden kann, besteht aus Oligonukleotiden, die zu verschiedenen Segmenten der GAL-R2-Nukleinsäuresequenz komplementär sind. Diese Oligonukleotide sollten eine Länge von mindestens 15 Basen haben und von nicht konservierten Regionen der Rezeptornukleinsäuresequenz abgeleitet sein.
Oligonukleotide, von denen gefunden wurde, dass sie die Rezeptorexpession reduzieren, können derivatisiert oder konjugiert werden, um ihre Wirksamkeit zu erhöhen. Nukleosidphosphorthioate können beispielsweise ihre natürlichen Gegenstücke ersetzen (siehe J. Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press (1989)). Die Oligonukleotide können einem Patienten in vivo verabreicht werden, um die GAL-R2-Expression zu inhibieren. Wenn dies getan wird, sollte das Oligonukleotid bevorzugt in einer Form verabreicht werden, die seine Aufnahme durch Zellen verbessert. Das Oligonukleotid kann beispielsweise mittels eines Liposoms oder an ein Peptid konjugiert verabreicht werden, das von Zellen aufgenommen wird (siehe z. B. US-A-4,897,355 und US-A-4,394,448; siehe auch die Nicht-US-Patentdokumente WO 8903849 und EP 0 263 740 ). Andere Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit der Oligonukleotidabgabe sind in der Technik wohl bekannt und auch mit der vorliegenden Erfindung kompatibel.
Da nun die Erfindung beschrieben worden ist, wird diese unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele leichter verständlich, die zur Veranschaulichung gegeben werden und den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränken sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Klonen des Ratten-Galaninrezeptors-2 (GAL-R2)
Es wurde eine Homologie-Screening-Strategie auf PCR-Basis verwendet, um neue cDNA-Sequenzen zu isolieren, die G-Protein-gekoppelte Rezeptoren kodieren. Sequenzen, die wahrscheinlich G-Protein-gekoppelte Rezeptoren kodieren, wurden aus mRNA aus dorsalen Stammganglien der Ratte durch reverse Transkription-PCR unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert:
TM2: 5'-GGCCGTCGACTTCATCGTC(A oder T)(A oder C)(T oder C)CTI(G oder T)CI(T oder C)TIGC(A, C, G oder T)GAC-3' (SEQ ID Nr. 5)
TM7: 5' – (A oder G)(C, A oder T)(A oder T)(A oder G)CA(A oder G)TAIATIATIGG(A oder G)TT-3' (SEQ ID Nr. 6)
Die Template für die PCR-Amplifizierung wurde mit einem "First Strand cDNA Synthesis Kit", Pharmacia Biotech, und 400 ng Poly A+ RNA aus dorsalen Stammganglien synthetisiert. Der so hergestellte erste cDNA-Strang wurde zweifach mit destilliertem Wasser verdünnt, 3 Minuten lang auf 95°C erwärmt und rasch auf Eis gekühlt. 5 μl der so produzierten cDNA wurden danach mit 50 pmol von jedem der TM2- und TM7-Primer und 2,5 Einheiten Taq DNA-Polymerase in 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM Tris(HCl) und 200 µM dNTPs, pH 9,0, amplifiziert. Die Reaktionsröhrchen wurden eine Minute auf 95°C erwärmt und danach 40 Zyklen aus Denaturierung (95°C/1 Min), Annealing (45°C/1 Min) und Extension (72°C/1 Min) unterzogen. Die letzte Extension wurde 10 Minuten lang durchgeführt. Die amplifizierten Fragmente wurden analysiert und an einem 1,5% Agarosegel größenfraktioniert. Aus dem Gel wurden Fragmente zwischen 400 bp und 1000 bp Länge ausgeschnitten, mit einem Sephaglas BandPrep-Kit von Pharmacia gereinigt und in einen pGEM-T-Vektor von Promega insertiert. Die so produzierten rekombinanten Plasmide wurden zum Transformieren kompetenter DH5-Zellen verwendet.
Transformierte Zellen wurden auf ampicillinhaltige 2YT-Agarplatten gegeben, und rekombinante pGEM-T-Klone wurden durch Direktkolonie-PCR unter Verwendung von Primern selektiert, die für T7- und SP6-Promoter vorgesehen waren. Die PCR-Bedingungen waren genau die gleichen wie oben, außer dass 50 pmol von jedem der T7- und SP6-Primer anstelle der TM2- und TM7-Primer verwendet wurden. Die Annealing-Temperatur betrug 50°C, und es wurden 30 Zyklen durchgeführt. Aus den Klonen, die rekombinante Plasmide enthielten, wurde mit einem "Wizard Miniprep DNA Purification System" (Promega Corporation) ausgehend von 4 ml Bakterienkultur Plasmid-DMA hergestellt. Die DNA-Sequenz aus diesen Klonen wurde unter Verwendung des Sanger-Dideoxynukleotid-Kettenabbruchverfahrens mit denaturierten doppelsträngigen Plasmidtemplaten unter Verwendung eines T7-Sequenzierkits von Pharmacia bestimmt.
Das Insert-DNA-Fragment von Klon 3B-21 wurde aus dem Vektor unter Verwendung von Sac II und Nde I ausgeschnitten, auf einem Agarosegel isoliert und durch zufällig geprimte Synthese unter Verwendung eines Ready-To-Go DNA-Markierungskits von Pharmacia mit ³²P markiert. Dieses markierte Fragment wurde zum Screening einer Rattenhirn-Stamm-Rückenmark-cDNA-Bibliothek in ZAP II (Stratagene) verwendet. Die Filter wurden 2 Stunden bei 42°C in 50% Formamid, 5 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung, 1% Glycin und 100 μg/ml denaturierter und gescherter Lachssperma-DNA prähybridisiert. Die Hybridisierung mit markierter Sonde wurde 18 Stunden lang bei 42°C in einer Lösung durchgeführt, die 50% Formamid, 5 × SSC, 1 × Denhart's Lösung, 0,3% SDS und 10 μl/ml denaturierte und gescherte Lachssperma-DNA enthielt. Die Filter wurden zwei Mal in 2 × SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur gespült. Sie wurden danach zwei Mal 15 Minuten lang in 2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C, zwei Mal 15 Minuten lang bei 42°C in 0,2 × SSC, 0,1% SDS, zwei Mal mit 0,05 × SSC, 0, 1% SDS bei 55°C und schließlich in der gleichen Waschlösung bei 65°C gewaschen.
Hybridisierungs-positive Phagen wurden gereinigt, und ihre Inserts wurden durch Helferphagenvermitteltes Ausschneiden gewonnen (Rescue unterzogen), um Plasmid-DNAs zu ergeben. Ein Klon, 21RSC4, enthielt die vollständige Kodiersequenz für den Rezeptor außer 51 bp der 5'-Region. Diese Region wurde durch PCR erhalten und danach an der Nukleotidzahl 16 von 21RSC4 mit der Bsu36I-Stelle verbunden. 67 bp am 5'-Ende der Kodierregion des Klons pBS/GALR-2 kamen somit aus einem PCR-generierten Fragment.
Beispiel 2: Strukturelle Charakterisierung des Galaninrezeptors-2 der Ratte
Es wurde gefunden, dass das rekombinante Plasmid pBS/GRLR-2 einen offenen Leserahmen von 372 Aminosäuren enthielt, der von 3'- und 5'-untranslatierten Regionen von 289 beziehungsweise 308 bp flankiert war. Die Sequenz des offenen Leserahmens ist in 1 zusammen mit der Aminosäuresequenz des kodierten Proteins gezeigt. Das Protein hatte ein Molekulargewicht von 40.700 Dalton. Die Hydropathieanalyse des Proteins stimmte mit einer Topographie von sieben Transmembrandomänen überein, die die G-Proteingekoppelte Rezeptorfamilie zeigen (Sprengel et al., "Hormone Receptors" in Handbook of Receptors and Channels: G Protein-Coupled Receptors, Herausgeber S. J. Peroutka, Seiten 153–207, CRC Press (1994)). Sequenzanalyse zeigte außerdem, dass der offene Leserahmen von pBS/GALR-2 mehrere konservierte strukturelle Merkmale/Reste enthielt, die sich innerhalb der Mitglieder der Neuropeptidrezeptorfamilie finden, einschließlich: einem Asparagin in TM1 (Asn43); einem Leucin (Leu67) und einer Asparaginsäure (Asp71) in TM2; und einem Arginin (Arg123) und Tyrosinrest (Tyr124) in TM3. Andere Merkmale dieses GAL-R2-Rezeptorgens sind potentielle Stellen für die N-Glykosylierung in dem Aminoterminus (Asn2, Asn11); die Anwesenheit mehrerer Serine und Threonine in dem Carboxylterminus und die Anwesenheit einer zweiten und dritten intrazellulären Schleife, die als potentielle Stellen für die Phosphorylierung durch Proteinkinasen dienen können.
Ein Vergleich des offenen Leserahmens von GAL-R2 der Ratte mit den Sequenzen der humanen GAL-R2- und GAL-R1-Rezeptoren ist in 3 gezeigt. Insgesamt hatte Ratten-GAL-R2 eine Identität von etwa 53% auf Nukleotidebene und 35,5 auf Aminosäureebene mit dem Ratten-GAL-R1 (Burgevin et al., J. Mol. Neurosci. 6:33-41 (1995)) und 34,8% mit humanem GRL-R1 (Habert-Ortoli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 919780-9783 (1994)). Die Sequenzhomologie ist in den putativen Transmembrandomänen jedoch höher. Die Homologien zwischen dem bekannten Ratten-GAL-R1 und GAL-R2 in TM1 bis TM7 sind 37,5%, 67%, 41,6%, 25%, 50%, 33% und 50%.
Es ist insgesamt offensichtlich, dass GAL-R2 eine einzigartige Sequenz aufweist, die sie von den anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren oder anderen Mitgliedern der Neuropeptidrezeptor-Unterfamilie unterscheidet. Die Aminosäurereste, die für die Bindung von Galanin an den GAL-R1-Rezeptor wesentlich sind, sind als His264, His267, Phe282 und in geringerem Maße Glu271 identifiziert worden. Nur einer dieser Reste, entsprechend His264, ist in GAL-R2 konserviert.
Beispiel 3: Rekombinante Expression des Galaninrezeptors-2 der Ratte
Um einen Säuger-Expressionsvektor zu erzeugen, wurde ein 1,4 Kb Hind III – Bst-XI-Restriktionsfragment aus pBS/GALR-2 isoliert und zwischen den Hind III und BstX-I Stellen von pcDNA3 von In Vitrogen, San Diego, Ca, USA, subkloniert. Dieser Expressionsvektor mit der Bezeichnung pCDNA3/GALR-2 enthielt zusätzlich zu der gesamten Rezeptorkodiersequenz 50 bp der 5'-untranslatierten Sequenz und 288 bp der 3'-untranslatierten Sequenz. Die Plasmid-DNA für die weitere Analyse wurde mit dem Qiaprep-System von Qiagen präpariert.
A. Vorübergehende Transfektion
HEK293s-Zellen wurden vom Cold Spring Harbor-Labor erhalten. Sie wurden bei 37°C, 5% CO₂ in Kulturmedium gehalten und alle 3 Tage 10-fach verdünnt. Die Zellen wurden in 80 cm² Kolben (2 × 10⁶ Zellen pro Kolben) in Dulbeco's Modified Essential Medium (DMEM, Gibco BRL) unter Zusatz von 10% fötalem Kälberserum (FBS), 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Fungizon inokuliert. Am Tag nach der Inokulierung wurden die Zellen vorübergehend unter Verwendung eines modifizierten CaCl₂-Verfahrens (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) und 30 μg Plasmid-DNA pro Kolben transfektiziert. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Transfektion für Ligandenbindungs- oder Signalweiterleitungsexperimente geerntet.
B. Stabile Transfektion
HEK293s-Zellen wurden in 80 cm²-Kolben mit 30 μg pCDNA3/GALR-2 transfektiziert. Nach 21 Tagen der Selektion in Kulturmedium, das 600 μg/ml G418 enthielt, wurden resistente Kolonien gepoolt und für die Radioligandbindungs- und Signalweiterleitungsstudien expandiert.
Beispiel 4: Bindungscharakteristika von rekombinant exprimiertem GAL-R2 der Ratte
A. Verfahren
Mit den Rohmembranen, die aus pcDNA3/GALR-2-transfektizierten Zellen hergestellt worden waren, wurde ein Galanin-Bindungsassay durchgeführt. Die Zellen wurden in 150 mm Petrischalen auf etwa 80% Konfluenz gezüchtet. Die Zellen in den Petrischalen wurden vor der Ernte ein Mal mit kaltem PBS (Gibco BRL) gewaschen. Die Zellen wurden dann in eiskaltem PBS mit einem Teflon-Zellschaber abgeschabt. Die so geernteten Zellen wurde mit 1500 × g bei 4°C gelinde zentrifugiert, in Membranpuffer "MB" (20 mM HEPES pH 7,5, enthaltend 10 μg/ml Benzamidin, 5 μg/ml Leupeptin, 5 μg/ml Sojabohnentrypsininhibitor und 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) erneut suspendiert und mit einem Polytron mit einer Einstellung von etwa 20.000 UpM 30 Sekunden lang zertrümmert. Die zertrümmerte Zellsuspension wurde 60 Minuten lang bei 4°C unter Verwendung eines Festwinkelrotors in einer Beckman L8-70M Ultrazentrifuge mit etwa 100.000 × g zentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wurde in Membranpuffer mit einer Konzentration von 1,0 – 1,5 mg/ml resuspendiert, aliquotiert und bis zum Gebrauch bei –80°C eingefroren.
Die Bindungsreaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 100 μl Bindungspuffer (MB + 0,4% Rinderserumalbumin) durchgeführt, der 5 bis 10 μg Membranprotein und 0,1 nM ¹²⁵I-Galanin (2200 Ci/mmol, Dupont/NEN) mit oder ohne unmarkierte Kompetitoren enthielt. Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 1 µM unmarkiertem Galanin bewertet. Die Bindungsreaktionen liefen 20 Minuten bei Raumtemperatur ab und wurden durch Filtration durch Unifilter-96, GF/B Filter (Canberra Packard), unter Verwendung des 96- Mulden-Filtermate 196-Filtrationssystems von Canberra Packard gestoppt. Die Filter wurden 5 Mal mit 0,5 ml eiskaltem 20 mM HEPES pH 7,5 gewaschen. Die Filter wurden eine Stunde bei 55°C getrocknet, und danach wurden pro Mulde 100 µl μScint-20 (Canberra Packard) zugegeben. Die Filter wurden mit dem Topcount-Mikroplattenzähler von Canberra Packard gezählt.
B. Ergebnisse
pCDNA3/GALR-2 führte, wenn es in HEK293-Zellen transfektiziert wurde, zur Expression spezifischer ¹²⁵I-Galanin-Bindungsstellen. Es wurden durch die Transfektion des Vektors selbst oder durch ein Kontroll-pCDNA3-Expessionskonstrukt, das einen delta-Opioidrezeptor kodierte, keine spezifischen ¹²⁵I-Galanin-Bindungsstellen erzeugt. Ein Pool stabiler HEK293-Zellen, die den GAL-R2-Rezeptor exprimierten, wurde erzeugt, indem pCDNA3/GALR-2 transfektizierte Zellen unter Verwendung von G418 selektiert wurden und mit den Membranen dieser Zellen Bindungsexperimente durchgeführt wurden. Ein Beispiel für die Ergebnisse eines Bindungsexperiments ist in 4 gezeigt.
Es wurde eine Einzelklasse von sättigbarer ¹²⁵I-Galanin-Bindungsstelle mit einer geschätzten Kd für ¹²⁵I-Galain von 1,68 ± 0,43 nM und einer Bmax von 1-2 pmol/mg Rohprotein detektiert. In den kompetitiven Experimenten, die unter Verwendung von ¹²⁵I-Galanin als Tracer durchgeführt wurden, wurden verschiedene mit Galanin verwandte Peptide verwendet. Die Kompetitionskurven dieser Peptide sind in 5 gezeigt, und die Ki-Werte der getesteten Peptide sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1: Die Inhibierungskonstanten von mit Galanin verwandten Peptiden für ¹²⁵I-Galaninbindung an GAL-R2
Die Bindung von unmarkiertem Galanin wurde durch Galanin und mit Galanin verwandte Peptide verdrängt, jedoch nicht durch nicht mit Galanin verwandte Liganden (z. B. Substanz P, vasoaktives intestinales Polypeptid, Angiotensin II und Dynorphin). Der Hauptunterschied zwischen GAL-R1 und GAL-R2 der Ratte liegt jedoch in der Erkennung des chimären Peptids C7, das zu Galanin an dem GAL-R1-Rezeptor äquipotent ist, an GAL-R2 jedoch viel weniger aktiv ist.
Beispiel 5: Aktivierung von cAMP
Stabile Poole transfektizierer Zellen wurden in 24 Muldenplatten inokuliert und über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden vor den Experimenten mit PBS bei 37°C gewaschen und danach mit PBS bedeckt, das 1 mM 3-Isobutyl-l-methylxanthin (IBMX) enthielt. Zellen in Doppelmulden wurden 10 Minuten bei 37°C entweder mit Forskolin (0,1 mM) allein oder in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Galanin oder mit Galanin verwandten Peptiden stimuliert. cAMP wurde in Ethanol extrahiert, lyophilisiert und erneut in 0,5 mM Assaypuffer extrahiert. cAMP-Assays wurden entweder mit dem Biotrack cAMP Enzyme-Immunoassaysystem (Amersham) oder dem Cyclic AMP [³H] Assaysystem (Amersham) durchgeführt.
Es wurde gefunden, dass die Aktivierung von Ratten-GAL-R2 in stabil transfektizierten HEK293-Zellen zu einer signifikanten Inhibierung der forskolinstimulierten Akkumulation von cAMP führten und dass diese Inhibierung in einer konzentrationsabhängigen Weise erfolgte (6). Nicht transfektizierte Zellen zeigten diesen Effekt nicht.
Beispiel 6: In situ-Hybridisierung
A. Verfahren
Ausgewachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (etwa 300 g; Charles River, St. Constant, Quebec, Kanada) wurden durch Enthauptung getötet. Hirn, Hypophyse und Rückenmark wurden sofort entfernt, in Isopentan bei –40°C 20 Sekunden lang schockgefroren und bei –80°C gelagert. Das gefrorene Gewebe wurde in einem Microm HM 500 M Kryostaten (Deutschland) auf 14 μm geschnitten und auf ProbeOn Plus Objektträger (Fisher Scientific, Montreal, Quebec, Kanada) getautaufgebracht. Die Schnitte wurden vor der in situ-Hybridisierung bei –80°C gelagert.
Das Plasmid pCDNA3-GALR-2 wurde unter Verwendung von entweder XbaI oder HindIII-Restriktionsenzymen linearisiert, die an jeder einer Seite der insertierten cDNA in den Polylinker schnitten. Sense- und Antisense-GAL-R2-Ribosonden wurden in vitro unter Verwendung von entweder T7- oder SP6-RNA-Polymerasen (Pharmacia Biotech) in Gegenwart von [³⁵S]UTP (etwa 800 Ci/mmol; Amersham, Oakville, Ontario, Kanada) transkribiert. Das DNA-Templat wurde nach der Transkription mit DNAse I (Pharmacia) verdaut. Die Ribosonden wurden danach durch Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktion gereinigt und in 70% Ethanol ausgefällt, der Ammoniumacetat und tRNA enthielt. Die Qualität der markierten Ribosonden wurde durch Elektrophorese an Polyacrylamid-Harnstoff-Gel verifiziert.
Die Schnitte wurden in 4% Paraformaldehyd (BDH, Poole, England) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) nachfixiert und in drei Chargen von 2 × Standard-Natriumcitratpuffer (SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) gespült. Die Schnitte wurden danach in 0,1 M Triethanolamin äquilibriert, mit 0,25 Essigsäureanhydrid in Triethanolamin behandelt, in 2 × SSC gespült und in einer Ethanolreihe (50 bis 100) dehydratisiert. Die Hybridisierung wurde 18 Stunden lang bei 55°C in einem Puffer, der 75% Formamid, 600 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 × Denhardt's Lösung, 50 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA, 50 mg/ml Hefe-tRNA, 10% Dextransulfat, 20 mM Dithiothreitol und [³⁵S]UTP-markierte cRNA-Sonden (10 × 10⁶ cpm/ml) enthielt, in Feuchtigkeitskammern durchgeführt. Die Objektträger wurden nach der Hybridisierung bei RT in 2 × SSC gespült, 45 Minuten lang bei RT mit 20 mg/ml RNase IA in RNasepuffer (10 mM Tris, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) behandelt und bei 65°C auf eine Endstringenz von 0,1 × SSC gewaschen. Die Schnitte wurden danach dehydratisiert und 10 Tage lang Kodak Biomax MR Film belichtet und/oder in Kodak NTB2-Emulsion getaucht, die 1:1 mit destilliertem Wasser verdünnt war, und 3 bis 4 Wochen bei 4°C belichtet, bevor entwickelt und mit Cresylviolettacetat gegengefärbt wurde. Die neuroanatomischen Strukturen wurden nach dem Rattenhirnatlas von Paxinos und Watson identifiziert (Paxinos et al., The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press, N.Y. (1986)).
B. Ergebnisse
Die höchsten Niveaus der Ratten-GAL-R2-mRNA-Expression wurde in dorsalen Stammganglien beobachtet, wobei Zellen mit großem, mittlerem und kleinem Durchmesser spezifisch markiert waren. Es wurde in den dorsalen und ventralen Hörnern des Rückenmarks nur diffuse Markierung beobachtet. Im Rattenhirn wurden die höchsten Dichten von GAL-R2-mRNA-Markierung im dorsalen Hippocampus, Corpus mamillare und im Cerebellum (insbesondere der Purkinje-Zellschicht) detektiert. Im Nucleus pontis sowie in einem spezifischen Nucleus motorius des Hirns wurde eher mäßige Markierung detektiert. In den Cortizes cerebri wurden nur mäßige bis schwache Hybridisierung detektiert. Andere Kopfbereiche, wie der Thalamus, der restliche Hypothalamus und die Basalganglien, waren allgemein frei von Markierung. Diese Verteilung unterscheidet sich deutlich von derjenigen, die für GALR-1-mRNA angegeben ist, die besonders gut in dem ventralen Hippocampus, der Amygdala, dem Nucleus supropoticus, mehreren Nuklei von Hypothalamus und Thalamus, dem lateralen parabrachialen Nucleus sowie dem Locus coeruleus des Rattenhirns exprimiert wird.
Das höchste Niveau der GAL-R2-Expession, das in den sensorischen Neuronen der dorsalen Stammganglien beobachtet wurde, und die eher mäßige Niveaus, die im dorsalen Horn des Rückenmarks beobachtet wurden, sind in Übereinstimmung mit der Rolle von Galanin bei der Schmerzweiterleitung. Die Anwesenheit hoher Niveaus von GAL-R2 im dorsalen Hippocampus und Corpus mamillare ist in Übereinstimmung mit einer Rolle in der kognitiven Funktion.
Beispiel 7: Klonen und strukturelle Merkmale des humanen Galaninrezeptors-2
Eine aus humaner Plazenta (Clonetech) hergestellte Humangenom-DNA-Bibliothek in EMBL-3-Vektor wurde Screening mit einem statistisch markiertem Fragment (markiert mit T7-Quick-Prime Markierungskit, Katalog Nr. 27-9252-01, Pharmacia Biotech.) unterzogen, welches den vollständigen Kodierbereich von Ratten-GALR-2-cDNA enthielt. Die Prähybridisierungs- und Hybridisierungsbedingungen waren wie folgt:
Prähybridisierung: 50% Formamid, 5 × Denhardt's Lösung, 5 × SSC, 1% Glycin, 100 g/ml gescherte und denaturierte Lachssperma-DNA bei 42°C für 5 Stunden.
Hybridisierung: 50% Formamid, 1 × Denhardt's Lösung, 5 × SSC, 0,3% SDS, 100 g/ml gescherte und denaturierte Lachssperma-DNA über Nacht bei 42°C.
Waschen: Eine Waschstufe wurde von der niedrigen Stringenz von 2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C bis zu der höchsten Stringenz von 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 60°C (für Souther Blots 65°C) durchgeführt.
Es wurden acht positive Klone identifiziert, die für ein Sekundärscreening unter Hybridisierungs- und Waschbedingungen bearbeitet wurden, die mit den ersten identisch waren. Das Sekundärscreening führte zur Identifizierung von vier Klonen; die anderen vier Klone wurden als falsch-positiv angesehen. Die vier positiven Klone wurden für tertiäres und quarternäres Screening bearbeitet, um reine Klone zu erhalten.
Aus den vier oben erörterten reinen Klonen wurde DNA gereinigt und für Restriktionsanalyse und Southern Blot-Hybridisierung bearbeitet, um kleinere Fragmente zu identifizieren, die ein positives Signal ergaben. Drei positiv hybridisierende Banden (mit geschätzten Größen von ∼5 kb, ∼32 kb und ∼0,7 kb), die durch die Spaltung mit Sac I- und Rsa I-Restriktionsendonukleasen (Pharmacia Biotech.) erhalten wurden, wurden durch Southern Blot-Hybridisierung identifiziert. Aus dem Gel wurden drei Banden ausgeschnitten und in entweder Sac I- oder Eco RV-verdautes pBlueScript KS(–)-Plasmid subkloniert. Die Plasmidkonstrukte wurden nach dem Sanger Dideoxy-Sequenzierverfahren (T7 Sequencing Kit, Pharmacia Biotech. Katalog Nr. 27-1682-01) und dem ABI Prizm Cycle Sequencing Kit (Katalog Nummer 402079, Perkin-Elmer) Sequenzierung unterzogen, und es wurde die zusammengesetzte Sequenz aufgebaut.
Die Nukleotidsequenz für humanes GALR-2-Gen ist in 2 gezeigt. Es ist ein offener Leserahmen von 1155 Nukleotiden vorhanden, der vermutlich ein Protein mit 385 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 41478 kD kodiert. Es gibt ein mutmaßliches Intron von mehr als 1000 Nukleotiden Länge nach Basenzahl 420. Die Intronsequenz ist aus der in 2 reproduzierten fertiggestellten Sequenz entfernt worden. Die Exon-Intron-Grenzen wurden basierend auf den Consensus-Sequenzen um die 5'- und 3'-Spleißstellen in Prä-mRNAs von Wirbeltieren bestimmt (Lodish et al. Molecular Cell Biology, 3. Auflage. Scientific American Books, Seite 500; 4.) Auf der Proteinebene sind 84,4% der Aminosäuren zwischen Ratten- und humanem GALR-2 identisch, die Identität zwischen humanem GALR-2 und dem Ratten- oder humanem GALR-1 betrug etwa 34%.
Da wir nun die Erfindung vollständig beschrieben haben, wird es für den Fachmann offensichtlich sein, dass die Erfindung unter einem weiten und äquivalenten Bereich von Bedingungen, Parametern und dergleichen durchgeführt werden kann.
HINTERLEGUNG VON BIOLOGISCHEM MATERIAL
Das Plasmid HUMAN GALR-2 ist gemäß dem Budapester Abkommen bei der "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" (DSMZ), Braunschweig, Deutschland hinterlegt worden. Die Hinterlegungsnummer ist DSM 1632, und das Hinterlegungsdatum ist der 26. Juni 1997. SEQUENZLISTING

Claims

Protein, das im Wesentlichen frei von verunreinigenden zellulären Komponenten ist, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 4.
Polynukleotid, das im Wesentlichen frei von verunreinigenden zellulären Komponenten ist, das ein Protein umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 4 kodiert.
Polynukleotid nach Anspruch 2, wobei das Polynukleotid die Nukleotidsequenz von SEQ. ID. Nr. 3 hat.
Vektor, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 2 oder Anspruch 3.
Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 4 transformiert ist.
Rekombinantes Protein, umfassend SEQ. ID. Nr. 4 oder SEQ. ID. Nr. 4 mit Additionen, Deletionen oder Substitutionen, wobei die qualitativen Bindungseigenschaften von SEQ. ID. Nr. 4 erhalten bleiben.
Antikörper, der spezifisch für ein Protein umfassend SEQ. ID. Nr. 4 oder SEQ. ID. Nr. 4 mit Additionen, Deletionen oder Substitutionen ist, wobei die qualitativen Bindungseigenschaften von SEQ. ID. Nr. 4 erhalten bleiben, wobei der Antikörper nach einem Verfahren hergestellt ist, umfassend die Stufe des Injizierens einer pharmazeutisch annehmbaren Zubereitung, die das Protein nach Anspruch 1 umfasst, in ein Tier, das in der Lage ist, den Antikörper zu produzieren.
Antikörper, der spezifisch an ein Protein nach Anspruch 1 bindet.
Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das in der Lage ist, an das Protein nach Anspruch 1 zu binden, umfassend: a) Inkubieren einer Quelle, die das Protein nach Anspruch 1 enthält, jedoch im Wesentlichen frei von anderen Galaninrezeptoren ist, mit i) einem Liganden, der bekanntermaßen an das Protein nach Anspruch 1 bindet, und ii) einem Testmittel, und b) Bestimmen des Ausmaßes, bis zu dem die Ligandenbindung durch das Testmittel verdrängt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Quelle eine Zelle ist, die mit einem Vektor nach Anspruch 4 transformiert ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Quelle eine Membranpräparation ist, die von einer Zelle abgeleitet ist, die mit einem Vektor nach Anspruch 4 transformiert ist.
Verfahren zur Bewertung der Fähigkeit eines Mittels zur Aktivierung des Proteins nach Anspruch 1, umfassend: a) Inkubieren einer Quelle, die das Protein nach Anspruch 1 enthält, jedoch im Wesentlichen frei von anderen Galaninrezeptoren ist, mit einem Testmittel, und b) Bestimmen der Aktivierung eines Second-Messenger-Reaktionsweges.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die in der Lage ist, die Expression des Proteins nach Anspruch 1 zu modulieren, umfassend: (a) Züchten von Zellen, die das Protein nach Anspruch 1 exprimieren, jedoch im Wesentlichen frei von anderen Galaninrezeptoren sind, in Gegenwart einer Testverbindung, und (b) Vergleichen der Expression des Proteins nach Anspruch 1 in den Zellen, die der Testverbindung ausgesetzt sind, mit Kontrollzellen, die der Testverbindung nicht ausgesetzt sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zellen, die das Protein nach Anspruch 1 exprimieren, Zellen sind, die mit einem Vektor nach Anspruch 4 transformiert sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Testverbindung ein Oligonukleotid ist, das mindestens 15 Nukleotide lang ist und eine Sequenz umfasst, die komplementär zu einer in SEQ. ID. Nr. 3 gezeigten Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Proteinexpression bestimmt wird, indem die Bindung eines Liganden des Proteins nach Anspruch 1 detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Ligand Galanin ist.