DE69836873T2

DE69836873T2 - Für den menschlichen h3 histamin-rezeptor kodierendes isoliertes dna

Info

Publication number: DE69836873T2
Application number: DE69836873T
Authority: DE
Inventors: W. Timothy San Diego LOVENBERG; Mark Encinitas ERLANDER; Arne Santee HUVAR; Jayashree San Diego PYATI
Original assignee: Ortho McNeil Pharmaceutical Inc
Current assignee: Janssen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-10-07
Filing date: 1998-10-07
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2018-10-08
Also published as: AU757749B2; EP1035856A4; AU1069299A; JP4231627B2; ES2279584T3; CA2312274A1; EP1035856B1; HK1028566A1; DE69836873D1; DK1035856T3; JP2002526049A; EP1035856A1; CA2312274C; WO2000020011A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Histamin ist ein multifunktionaler chemischer Transmitter, der über Zelloberflächenrezeptoren Signale übermittelt, die mit intrazellulären Reaktionswegen über Guanin-Nukleotidbindende Proteine verknüpft sind. Diese Klasse von Zelloberflächenrezeptoren wird als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren oder GPCRs bezeichnet. Es gibt gegenwärtig drei Subtypen von Histaminrezeptoren, die pharmakologisch definiert worden sind und in H1-, H2- und H3-Klassifikationen eingeteilt worden sind (Hill, et al. 1997). Der H1-Histaminrezeptor ist kloniert worden (Yamashita, et al. 1991) und ist das Ziel von Wirkstoffen, wie etwa Diphenhydramin, um die Effekte von Histamin in allergischen Antworten zu blockieren. Der H2-Histaminrezeptor ist kloniert worden (Gantz, et al. 1991) und ist das Ziel von Wirkstoffen, wie etwa Ranitidin, um die Effekte von Histamin auf die Säuresekretion im Magen zu blockieren. Die Hypothese, daß ein dritter Subtyp Histaminrezeptor existiert, wurde im Jahr 1983 aufgestellt (Arrang, et al. 1983). Man glaubt, daß er als ein präsynaptischer Autorezeptor in Histamin-enthaltenden Neuronen im Zentralnervensystem und als ein präsynaptischer Heterorezeptor in nicht-Histamin-enthaltenden Neuronen fungiert. Eine der Funktionen des H3-Rezeptors ist es, die Neurotransmitter-Freisetzung an der präsynaptischen Stelle zu regulieren. Histamin-H3-Rezeptoren werden daher im Zentralnervensystem exprimiert, sind aber ebenso in Herz, Lunge und Magen pharmakologisch identifiziert worden, und es ist die Hypothese aufgestellt worden, daß sie in anderen Geweben existieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung und Charakterisierung einer humanen cDNA, die für einen Histamin-H3-Rezeptor kodiert, und die Verwendungen davon.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein DNA-Molekül, das für einen humanen Histamin-H3-Rezeptor kodiert, ist kloniert und charakterisiert worden, und es stellt ein neues Mitglied der Rezeptorenklasse dar, die an G-Proteine koppeln. Unter Verwendung eines rekombinanten Expressionssytems sind funktio nelle DNA-Moleküle, die für den humanen Histamin-H3-Rezeptor kodieren, isoliert worden. Die biologischen und strukturellen Eigenschaften dieser Proteine werden offenbart, ebenso wie die Aminosäure- und Nukleotid-Sequenz. Das rekombinante Protein ist für eine Vielzahl von Zwecken nützlich, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, die Identifizierung von Modulatoren des humanen Histamin-H3-Rezeptors. Modulatoren, die in den hierin offenbarten Assays identifiziert werden, sind zum Beispiel als therapeutische Mittel und diagnostische Mittel nützlich. Indikationen für diese therapeutischen Mittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Krankheiten des Zentralnervensystems, zum Beispiel Depression, Angst, Psychosen (zum Beispiel Schizophrenie), tardive Dyskinesie, Parkinson, Fettleibigkeit, Bluthochdruck, Tourette-Syndrom, sexuelle Dysfunktion, Drogenabhängigkeit, Drogenmißbrauch, kognitive Störungen, Alzheimer, senile Demenz, obsessives Zwangsverhalten, Panikattacken, Schmerz, soziale Phobien, Eßstörungen und Anorexie, kardiovaskuläre und zerebrovaskuläre Störungen, nicht-Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, Hyperglykämie, Konstipation, Arrhythmie, Störungen des neuroendokrinen Systems, Streß und Spastizität, ebenso wie Säuresekretion, Geschwüre, Atemwegsverengung, Asthma, Allergie, Entzündung und Prostata-Dysfunktion. Die rekombinanten DNA-Moleküle und Teile davon sind zum Isolieren von Homologen der DNA-Moleküle, zum Identifzieren und Isolieren genomischer Äquivalente der DNA-Moleküle und zum Identifizieren, Nachweisen und Isolieren von mutanten Formen der DNA-Moleküle nützlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 – Die vollständige Nukleotidsequenz von humanem Histamin-H3-Rezeptor, einschließlich nicht-translatierter Regionen, wird gezeigt.
2 – Es wird die Nukleotidsequenz der kodierenden Region für den humanen Histamin-H3-Rezeptor gezeigt.
3 – Es wir die Aminosäuresequenz von humanem Histamin-H3-Rezeptor gezeigt.
4 – Es wird die Gewebeverteilung des humanen Histamin-H3-Rezeptors gezeigt.
5 – Es wird die Modulation eines humanen Histamin-H3-Rezeptors durch einen bekannten H3-Agonisten (R-alpha-Methylhistamin) und einen bekannten H3-Antagonisten (Thioperamid) gezeigt.
6 – Es wird die Nukleotidsequenz der pH3R-Sonde gezeigt.
7 – Es wird die Sättigungsbindung von [³H]-N-alpha-Methylhistamin an pH3R-exprimierende L-Zellen gezeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA, die für humanen Histamin-H3-Rezeptor kodiert, der eine Nukleotidsequenz, wie in 1 gezeigt oder wie in 2 gezeigt, hat, wobei der Rezeptor aus einer cDNA-Bibliothek aus humanem Thalamus isoliert worden war. Der humane Histamin-H3-Rezeptor, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Protein, das spezifisch als ein Rezeptor für Histamin der H3-Unterklasse fungieren kann.
Die vollständige Aminosäuresequenz von humanem Histamin-H3-Rezeptor war vorher nicht bekannt, und es war auch nicht die vollständige Nukleotidsequenz, die für humanen Histamin-H3-Rezeptor kodiert, bekannt. Dies ist die erste Klonierung eines Vollängen-DNA-Moleküls, das für humanen Histamin-H3-Rezeptor kodiert, über die berichtet wurde. Es wird vorhergesagt, daß eine große Vielzahl von Zellen und Zelltypen den beschriebenen humanen Histamin-H3-Rezeptor enthalten werden. Vertebraten-Zellen, die in der Lage sind, humanen Histamin-H3-Rezeptor zu erzeugen, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, humane Histamin-H3-Rezeptorzellen, die aus Zellen isoliert worden sind, die eine Empfindlichkeit gegenüber Histamin zeigen oder daran binden.
Andere Zellen und Zellinien können ebenso zur Verwendung geeignet sein, um humane Histamin-H3-Rezeptor-cDNA zu isolieren. Eine Auswahl von geeigneten Zellen kann durch ein Screenen auf die Inhibition von Adenylatzyklase in Antwort auf Histamin erfolgen. Die humane Histamin-H3-Rezeptoraktivität kann durch Durchführung eines ³H-alpha-Methylhistamin-Bindungsassay (Pollard, Moreau et al. 1993) oder durch direkte Messung der Inhibition der Adenylatzyklase aufgrund einer Aktivierung von humanem Histamin-H3-Rezeptor oder mittels Einbau von GTP-gamma-S (Clark, Korte et al. 1993) überwacht wer den. Zellen, die humane Histamin-H3-Rezeptoraktivität in diesem Assay besitzen, können zur Isolierung von humaner Histamin-H3-Rezeptor-DNA oder -mRNA geeignet sein.
Eine beliebige aus einer Vielzahl von Prozeduren, die auf dem Gebiet bekannt sind, kann verwendet werden, um humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA molekular zu klonieren. Diese Verfahren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, direkte funktionale Expression der humanen Histamin-H3-Rezeptorgene nach der Konstruktion einer humanen Histamin-H3-Rezeptor-enthaltenden cDNA-Bibliothek in einem geeigneten Expressionsvektorsystem. Ein anderes Verfahren ist es, eine humane Histamin-H3-Rezeptor-enthaltende cDNA-Bibliothek, die in einem Bakteriophagen- oder einem Plasmid-Shuttle-Vektor konstruiert ist, mit einer markierten Oligonukleotidsonde zu screenen, die aus der Aminosäuresequenz der humanen Histamin-H3-Rezeptor-Untereinheiten angelegt worden ist. Ein zusätzliches Verfahren besteht im Screenen einer humanen Histamin-H3-Rezeptor-enthaltenden cDNA-Bibliothek, die in einem Bakteriophagen- oder Plasmid-Shuttle-Vektor konstruiert ist, mit einer partiellen cDNA, die für das humane Histamin-H3-Rezeptor-Protein kodiert. Diese partielle cDNA wird durch die spezifische PCR-Amplifizierung von humanen Histamin-H3-Rezeptor-DNA-Fragmenten durch das Design von degenerierten Oligonukleotidprimern aus der Aminosäuresequenz des aufgereinigten humanen Histamin-H3-Rezeptor-Proteins erhalten.
Ein anderes Verfahren ist es, RNA aus humanen Histamin-H3-Rezeptor-erzeugenden Zellen zu isolieren und die RNA in Protein über ein in-vitro- oder ein in-vivo-Translationssystem zu translatieren. Die Translation der RNA in ein Peptid oder ein Protein wird zu der Produktion von wenigstens einem Teil des humanen Histamin-H3-Rezeptorproteins führen, das zum Beispiel mittels immunologischer Reaktivität mit einem anti-humanen Histamin-H3-Rezeptor-Antikörper oder anhand der biologischen Aktivität von humanem Histamin-H3-Rezeptor-Protein identifiziert werden kann. In diesem Verfahren können Pools von RNA, die aus humanen Histamin-H3-Rezeptor-produzierenden Zellen isoliert worden sind, auf die Anwesenheit einer RNA analysiert werden, die für wenigstens einen Teil des humanen Histamin-H3-Rezeptorproteins kodiert. Eine weitere Fraktionierung des RNA-Pools kann durchgeführt werden, um die humane Histamin-H3-Rezeptor-RNA aus nicht-humaner Histamin-H3-Rezeptor-RNA aufzureinigen. Das mit diesem Verfahren erzeugte Peptid oder Protein kann analysiert werden, um Aminosäuresequenzen bereitzustellen, die wiederum dazu verwendet werden, Primer zur Produktion von humaner Histamin-H3-Rezeptor-cDNA bereitzustellen, oder die RNA, die zur Translation verwendet wird, kann dahingehend analysiert werden, daß sie Nukleotidsequenzen bereitstellt, die für humanen Histamin-H3-Rezeptor kodieren, und Sonden für die Produktion von humaner Histamin-H3-Rezeptor-cDNA zu erzeugen. Dieses Verfahren ist auf dem Gebiet bekannt und kann zum Beispiel in Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989 gefunden werden.
Es ist Fachleuten offensichtlich, daß andere Bibliothektypen, ebenso wie Bibliotheken, die aus anderen Zellen oder Zelltypen konstruiert worden sind, zur Isolierung von humaner Histamin-H3-Rezeptor-kodierender DNA nützlich sein können. Andere Bibliothekstypen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, cDNA-Bibliotheken, die aus anderen Zellen, aus nicht-humanen Organismen stammen, und genomische DNA-Bibliotheken, die YAC (künstliches Hefechromosom) und Cosmid-Bibliotheken einschließen.
Es ist für Fachleute offensichtlich, daß geeignete cDNA-Bibliotheken aus Zellen oder Zellinien hergestellt werden können, die humane Histamin-H3-Rezeptoraktivität haben. Die Auswahl von Zellen oder Zellinien zur Verwendung beim Herstellen einer cDNA-Bibliothek zum Isolieren von humaner Histamin-H3-Rezeptor-cDNA kann durchgeführt werden, indem zuerst Zell-assoziierte humane Histamin-H3-Rezeptoraktivität unter Verwendung der Messung von humaner Histamin-H3-Rezeptor-assoziierter biologischer Aktivität oder eines ³H-Histamin-Ligandenbindungsassay oder ³H-N-Methylhistamin-Ligandenbindungsassay oder irgendeiner radioaktiven Ligandenbindung gemessen wird, die einen Liganden beinhaltet, der die Fähigkeit hat, an den humanen Histamin-H3-Rezeptor zu binden.
Die Herstellung von cDNA-Bibliotheken kann mit Standardtechniken durchgeführt werden, die auf dem Gebiet gut bekannt sind. Gut bekannte cDNA-Bibliotheken-Konstruktionstechniken können zum Beispiel in Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) gefunden werden.
Es ist ebenso für Fachleute offensichtlich, daß DNA, die für humanen Histamin-H3-Rezeptor kodiert, aus einer geeigneten genomischen DNA-Bibliothek isoliert werden kann. Die Konstruktion von genomischen DNA-Bibliotheken kann mittels Standardtechniken durchgeführt werden, die auf dem Gebiet gut bekannt sind. Gut bekannte genomische DNA-Bibliotheks-Konstruktionstechniken können gefunden werden in Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Um das humane Histamin-H3-Rezeptorgen mit den obigen Verfahren zu klonieren, kann die Aminosäuresequenz von humanem Histamin-H3-Rezeptor notwendig sein. Um dies zu erreichen, kann humanes Histamin-H3-Rezeptorprotein aufgereinigt werden und die partielle Aminosäuresequenz mittels automatisierten Sequenzierern bestimmt werden. Es ist nicht notwendig, die vollständige Aminosäuresequenz zu bestimmen, aber die lineare Sequenz von zwei Regionen von 6 bis 8 Aminosäuren aus dem Protein wird zur Herstellung von Primern für die PCR-Amplifizierung eines partiellen humanen Histamin-H3-Rezeptor-DNA-Fragments bestimmt.
Wenn geeignete Aminosäuresequenzen identifiziert worden sind, werden die DNA-Sequenzen synthetisiert, die zum Kodieren in der Lage sind. Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Kodon verwendet werden, um für eine bestimmte Aminosäure zu kodieren, und deshalb kann die Aminosäuresequenz durch ein Oligonukleotid aus einem Satz von ähnlichen DNA-Oligonukleotiden kodiert werden. Nur ein Mitglied des Satzes wird mit der humanen Histamin-H3-Rezeptor-Sequenz identisch sein, wird aber in der Lage sein, an humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA sogar in der Anwesenheit von DNA-Oligonukleotiden mit Fehlpaarungen zu hybridisieren. Die fehlgepaarten DNA-Oligonukleotide können immer noch in ausreichender Weise an die humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA hybridisieren, um eine Identifizierung und Isolierung von humaner Histamin-H3-Rezeptor-kodierender DNA zu ermöglichen. DNA, die mit diesen Verfahren isoliert worden ist, kann dazu verwendet werden, um DNA-Bibliotheken aus einer Vielzahl von Zelltypen, aus Invertebraten- und Vertebraten-Quellen zu screenen und homologe Gene zu isolieren.
Aufgereinigter biologisch aktiver humaner Histamin-H3-Rezeptor kann mehrere verschiedene physikalische Formen haben. Humaner Histamin-H3-Rezeptor kann als ein naszierendes oder nicht-prozessiertes Polypeptid voller Länge oder als partiell prozessierte Polypeptide oder Kombinationen von prozessierten Polypeptiden existieren. Das naszierende humane Histamin-H3-Rezeptor-Polypeptid voller Länge kann post-translational mittels spezifischer proteolytischer Spaltungsereignisse modifiziert werden, die zur Bildung von Fragmenten des naszierenden Vollängen-Polypeptids führen. Ein Fragment oder eine physische Assoziation von Fragmenten kann die volle biologische Aktivität haben, die mit humanem Histamin-H3- Rezeptor assoziiert ist, jedoch kann der Grad an humaner Histamin-H3-Rezeptoraktivität zwischen individuellen humanen Histamin-H3-Rezeptorfragmenten und physisch assoziierten humanen Histamin-H3-Rezeptor-Polypeptidfragmenten variieren.
Die klonierte humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA, die durch die hierin beschriebenen Verfahren erhalten wird, kann durch molekulares Klonieren in einen Expressionsvektor, der einen geeigneten Promoter und andere geeignete regulatorische Transkriptionselemente enthält, rekombinant exprimiert und in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen übertragen werden, um rekombinantes humanes Histamin-H3-Rezeptor-Protein zu erzeugen. Techniken für solche Manipulationen werden vollständig in Maniatis, T., et al., oben beschrieben, und sind auf dem Gebiet gut bekannt.
Expressionsvektoren werden hierin als DNA-Sequenzen definiert, die für die Transkription von klonierten Genkopien und die Translation ihrer mRNAs in einem geeigneten Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können verwendet werden, um eukaryotische Gene in einer Vielzahl von Wirten zu exprimieren, wie etwa Bakterien, einschließlich E. coli, Blaugrünalgen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen, einschließlich Hefezellen und tierischen Zellen.
Spezifisch konstruierte Vektoren ermöglichen die Übertragung von DNA zwischen Wirten, wie etwa Bakterien-Hefe oder Bakterien-tierische-Zellen oder Bakterien-Pilz-Zellen oder Bakterien-Invertebraten-Zellen. Ein geeignet konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Replikationsursprung für die autonome Replikation in Wirtszellen, auswählbare Marker, eine beschränkte Anzahl an nützlichen Restriktionsenzymstellen, ein Potential für eine hohe Kopienzahl und aktive Promoter. Ein Promoter wird als eine DNA-Sequenz definiert, die die RNA-Polymerase dahingehend steuert, daß sie an DNA bindet und die RNA-Synthese initiiert. Ein starker Promoter ist einer, der bewirkt, daß mRNAs mit hoher Frequenz initiiert werden. Expressionsvektoren können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, insbesondere konstruierte Plasmide oder Viren.
Eine Vielzahl von Säugetier-Expressionsvektoren können verwendet werden, um rekombinaten humanen Histamin-H3-Rezeptor in Säugetierzellen zu exprimieren. Kommerziell erhältliche Säugetier-Expressionsvektoren, die für die rekombinante humane Histamin-H3-Rezeptor- Expression geeignet sein können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (Invitrogen), pMCIneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene) pSG5 (Stratagene), pCIneo (Promega), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), und IZD35 (ATCC 37565).
Eine Vielzahl von bakteriellen Expressionsvektoren können verwendet werden, um rekombinanten humanen Histamin-H3-Rezeptor in Bakterienzellen zu exprimieren. Kommerziell erhältliche bakterielle Expressionsvektoren, die für die rekombinante humane Histamin-H3-Rezeptor-Expression geeignet sein können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf pET-Vektoren (Novagen) und pQE-Vektoren (Qiagen).
Eine Vielzahl von Pilzzell-Expressionsvektoren können verwendet werden, um rekombinanten humanen Histamin-H3-Rezeptor in Pilzzellen zu exprimieren, wie etwa Hefe. Kommerziell erhältliche Pilzzell-Expressionsvektoren, die für die rekombinante humane Histamin-H3-Rezeptor-Expression geeignet sein können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, pYES2 (Invitrogen) und Pichia-Expressionsvektor (Invitrogen).
Eine Vielzahl von Insektenzell-Expressionsvektoren können verwendet werden, um rekombinanten humanen Histamin-H3-Rezeptor in Insektenzellen zu exprimieren. Kommerziell erhältliche Insektenzell-Expressionsvektoren, die für die rekombinante Expression von humanem Histamin-H3-Rezeptor geeignet sein können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, pBlueBacII (Invitrogen).
DNA, die für humanen Histamin-H3-Rezeptor kodiert, kann in einen Expressionsvektor zur Expression in einer rekombinanten Wirtszelle kloniert werden. Rekombinante Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Bakterien, wie etwa E. coli, Pilzzellen, wie etwa Hefe, Säugetierzellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zellinien von humanem, bovinem, Schweine-, Affen- und Nagetier-Ursprung, und Insektenzellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Drosophila und aus Seidenraupen stammende Zellen. Zellinien, die aus Säugetierspezies stammen, die geeignet sein können und die kommerziell erhältlich sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), L-Zellen, und HEK-293 (ATCC CRL1573).
Der Expressionsvektor kann in Wirtszellen mit einer aus einer Vielzahl von Techniken eingeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Transformation, Transfektion, Protoplastenfusion, Lipofektion und Elektroporation. Die Expressionsvektor-enthaltenden Zellen werden klonal propagiert und individuell analysiert, um zu bestimmen, ob sie humanes Histamin-H3-Rezeptorprotein erzeugen. Die Identifizierung von humanen Histamin-H3-Rezeptor-exprimierenden Wirtszellklonen kann mit mehreren Mitteln durchgeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, immunologische Reaktivität mit anti-humanen Histamin-H3-Rezeptor-Antikörpern und die Anwesenheit von Wirtszell-assoziierter humaner Histamin-H3-Rezeptoraktivität.
Die Expression von humaner Histamin-H3-Rezeptor-DNA kann ebenfalls durchgeführt werden unter Verwendung von in-vitro-erzeugter synthetischer mRNA. Synthetische mRNA oder mRNA, die aus humanen Histamin-H3-Rezeptor-erzeugenden Zellen isoliert ist, kann in verschiedenen zellfreien Systemen effizient translatiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Weizenkeimextrakte und Retikulozyten-Extrakte, ebenso wie effizient in Zellbasierenden Systemen translatiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Mikroinjektion in Frosch-Oocyten, wobei Mikroinjektion in Frosch-Oocyten allgemein bevorzugt wird.
Um die humane(n) Histamin-H3-Rezeptor-DNA-Sequenz(en) zu bestimmen, die die optimalen Niveaus an humaner Histamin-H3-Rezeptoraktivität und/oder humanem Histamin-H3-Rezeptor-Protein ergibt, können humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA-Moleküle, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, die Folgenden, konstruiert werden: der offene Leserahmen voller Länge der humanen Histamin-H3-Rezeptor-cDNA, die für das 48656 kDa-Protein von näherungsweise Base 299 bis näherungsweise Base 1634 kodiert (diese Zahlen entsprechen dem ersten Nukleotid des ersten Methionins und dem letzten Nukleotid vor dem ersten Stop-Codon), und mehrere Konstrukte, die Teile der cDNA enthalten, die für humanes Histamin-H3-Rezeptor-Protein kodiert. Alle Konstrukte können dahingehend angelegt sein, daß sie nichts, alles oder Teile der 5'- oder der 3'-nicht-translatierten Region von humaner Histamin-H3-Rezeptor-cDNA enthalten. Humane Histamin-H3-Rezeptor-Aktivität und Proteinexpressionsniveaus können nach der Einführung dieser Konstrukte, sowohl einzeln als auch in Kombination, in geeignete Wirtszellen bestimmt werden. Nach Bestimmung der humanen Histamin-H3-Rezeptor-DNA-Kasette, die eine optimale Expression in transienten Assays ergibt, wird dieses humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA-Konstrukt in eine Vielzahl von Expressionsvektoren übertragen, zur Expression in Wirtszellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Säugetierzellen, Bakulovirus-infizierten Insektenzellen, E. coli und die Hefe S. cerevisiae.
Wirtszell-Transfektanten und mikroinjizierte Oocyten können verwendet werden, um sowohl die Niveaus an humaner Histamin-H3-Rezeptor-Aktivität als auch die Niveaus an humanem Histamin-H3-Rezeptor-Protein mit den folgenden Verfahren zu testen. Im Falle von rekombinanten Wirtszellen beinhaltet dies die Co-Transfektion von einem oder möglicherweise zwei oder mehreren Plasmiden, enthaltend die humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA, die für ein oder mehrere Fragmente oder Untereinheiten kodiert. Im Falle von Oocyten beinhaltet dies die Co-Injektion von RNAs, die für humanes Histamin-H3-Rezeptor-Protein kodieren. Nach einer geeigneten Zeitperiode für die Expression wird das zelluläre Protein metabolisch mit zum Beispiel ³⁵S-Methionin für 24 Stunden markiert, wonach Zell-Lysate und die Zellkultur-Überstände geerntet und einer Immunfällung mit polyklonalen Antikörpern unterzogen werden, die gegen das humane Histamin-H3-Rezeptor-Protein gerichtet sind.
Andere Verfahren zum Nachweis von humaner Histamin-H3-Rezeptor-Aktivität beinhalten die direkte Messung von humaner Histamin-H3-Rezeptor-Aktivität in ganzen Zellen, die mit humaner Histamin-H3-Rezeptor-cDNA oder Oocyten transfiziert worden sind, denen humane Histamin-H3-Rezeptor-mRNA injiziert worden ist. Humane Histamin-H3-Rezeptor-Aktivität wird mit spezifischer Ligandenbindung und biologischen Eigenschaften der Wirtszellen gemessen, die humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA exprimieren. Im Falle von rekombinanten Wirtszellen und Oocyten, die humanen Histamin-H3-Rezeptor exprimieren, sind cAMP-Quantifizierungs- und Rezeptorbindungstechniken geeignete Beispiele für Methoden, die verwendet werden können, um humane Histamin-H3-Rezeptor-Aktivität zu messen und humanes Histamin-H3-Rezeptorprotein zu quantifizieren.
Die Niveaus an humanem Histamin-H3-Rezeptor-Protein in Wirtszellen werden ebenfalls mittels Immunaffinitäts- und/oder Ligandenaffinitätstechniken quantifiziert. Zellen, die humanen Histamin-H3-Rezeptor exprimieren, können auf die Anzahl an exprimierten humanen Histamin-H3-Rezeptor-Molekülen getestet werden, indem man die Menge an radioaktivem Histamin oder Histamin-H3-Ligandenbindung an Zellmembranen mißt. Es werden humane Histamin-H3-Rezeptor-spezifische Affinitätskügelchen oder humane Histamin-H3-Rezeptor-spezifische Antikörper verwendet, um z.B. ³⁵S-Methionin-markiertes oder nicht-markiertes humanes Histamin-H3-Rezeptor-Protein zu isolieren. Markiertes humanes Histamin-H3-Rezeptor-Protein wird mittels SDS-PAGE analysiert. Nicht-markiertes humanes Histamin-H3-Rezeptor-Protein wird mittels Western-blotting, ELISA oder RIA-Assays nachgewiesen, die humane Histamin-H3-Rezeptor-spezifische Antikörper verwenden.
Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon verwendet werden, um für eine bestimmte Aminosäure zu kodieren, und deshalb kann die Aminosäuresequenz durch ein DNA-Oligonukleotid aus einem Satz von ähnlichen DNA-Oligonukleotiden kodiert werden. Nur ein Mitglied des Satzes wird mit der humanen Histamin-H3-Rezeptor-Sequenz identisch sein, wird aber in der Lage sein, an humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA sogar in der Anwesenheit von DNA-Oligonukleotiden mit Fehlpaarungen unter geeigneten Bedingungen zu hybridisieren. Unter anderen Bedingungen können die fehlgepaarten DNA-Oligonukleotide immer noch an die humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA hybridisieren, um eine Identifizierung und Isolierung von humaner Histamin-H3-Rezeptor-kodierender DNA zu ermöglichen.
DNA die für humanen Histamin-H3-Rezeptor aus einem bestimmten Organismus kodiert, kann verwendet werden, um Homologe von humanem Histamin-H3-Rezeptor aus anderen Organismen zu isolieren und aufzureinigen. Um dies zu erreichen, kann die erste humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA mit einer Probe unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen gemischt werden, die DNA enthält, die für Homologe von humanem Histamin-H3-Rezeptor kodiert. Der hybridisierte DNA-Komplex kann isoliert und die DNA, die für die homologe DNA kodiert, davon aufgereinigt werden.
Es ist bekannt, daß es eine beträchtliche Redundanz in den verschiedenen Codons gibt, die für spezifische Aminosäuren kodieren. Deshalb ist diese Erfindung auch auf diejenigen DNA-Sequenzen gerichtet, die alternative Codons enthalten, die für die schließliche Translation der identischen Aminosäure kodieren. Für die Zwecke dieser Beschreibung wird eine Sequenz, die ein oder mehrere ausgetauschte Codons trägt, als eine degenerierte Variation definiert.
Es ist bekannt, daß DNA-Sequenzen, die für ein Peptid kodieren, verändert werden können, um für ein Peptid mit Eigenschaften zu kodieren, die zu denjenigen des natürlich vorkom menden Peptids unterschiedlich sind. Verfahren zum Verändern der DNA-Sequenzen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf ortsgerichtete Mutagenese. Beispiele von veränderten Eigenschaften, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Veränderungen in der Affinität eines Enzyms für ein Substrat oder eines Rezeptors für einen Liganden.
Wie hierin verwendet, ist ein „funktionelles Derivat" von humanem Histamin-H3-Rezeptor eine Verbindung, die eine biologische Aktivität besitzt (entweder funktionell oder strukturell), die im wesentlichen der biologischen Aktivität von humanem Histamin-H3-Rezeptor ähnlich ist. Der Begriff „funktionelle Derivate" soll die „Fragmente", „Varianten", „degenerierte Varianten", „Analoge" und „Homologe" oder „chemische Derivate" von humanem Histamin-H3-Rezeptor einschließen. Der Begriff „Fragment" soll sich auf jegliche Polypeptid-Teilmenge von humanem Histamin-H3-Rezeptor beziehen. Der Begriff „Variante" soll sich auf ein Molekül beziehen, das in seiner Struktur und Funktion im wesentlichen mit dem gesamten humanem Histamin-H3-Rezeptor-Molekül oder mit einem Fragment davon ähnlich ist. Ein Molekül ist „im wesentlichen ähnlich" mit humanem Histamin-H3-Rezeptor, wenn beide Moleküle im wesentlichen ähnliche Strukturen haben, oder wenn beide Moleküle ähnliche biologische Aktivität haben. Deshalb werden zwei Moleküle, wenn sie im wesentlichen ähnliche Aktivität haben, als Varianten angesehen, sogar wenn die Struktur von einem der Moleküle nicht in dem anderen gefunden wird, oder sogar wenn die beiden Aminosäuresequenzen nicht identisch sind. Der Begriff „Analog" bezieht sich auf ein Molekül, das im wesentlichen in seiner Funktion mit entweder dem gesamten humanen Histamin-H3-Rezeptor-Molekül oder einem Fragment davon im wesentlichen ähnlich ist.
Monospezifische Antikörper auf humanem Histamin-H3-Rezeptor werden aus Säugetier-Antiseren aufgereinigt, die Antikörper enthalten, die gegen humanen Histamin-H3-Rezeptor reaktiv sind, oder werden als monoklonale Antikörper aufgereinigt, die mit humanem Histamin-H3-Rezeptor reaktiv sind, unter Verwendung der Technik von Kohler und Milstein, Nature 256: 495–497 (1975). Ein monospezifischer Antikörper, wie hierin verwendet, wird als eine einzelne Antikörper-Spezies oder als eine multiple Antikörper-Spezies mit homogenen Bindungseigenschaften für humanen Histamin-H3-Rezeptor definiert. Eine homogene Bindung, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit der Antikörper-Spezies, an ein spezifisches Antigen oder Epitop zu binden, wie etwa diejenigen, die mit dem humanen Histamin-H3-Rezeptor assoziiert sind, wie oben beschrieben. Humane Histamin-H3-Rezeptor-spezifische Antikörper werden durch Immunisieren von Tieren, wie etwa Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Ziegen, Pferden und ähnliches, mit einer geeigneten Konzentration an humanem Histamin-H3-Rezeptor entweder mit oder ohne ein Immun-Adjuvans, gezogen, wobei Kaninchen bevorzugt sind.
Präimmun-Serum wird vor der ersten Immunisierung gesammelt. Jedes Tier enthält zwischen ungefähr 0,1 mg und ungefähr 1000 mg humanen Histamin-H3-Rezeptor, der mit einem akzeptablen Immun-Adjuvans assoziiert ist. Solche akzeptable Adjuvantien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Freundsches vollständiges Adjuvans, Freundsches unvollständiges Adjuvans, Aluminium-Niederschlag („alum-precipitate"), Wasser-in-Öl-Emulsion enthaltend Corynebacterium parvum und tRNA. Die anfängliche Immunisierung besteht aus humanem Histamin-H3-Rezeptor in bevorzugt Freundschem vollständigem Adjuvans an mehreren Stellen entweder subkutan (SC), intraperitoneal (IP) oder beidem. Jedes Tier wird in regelmäßigen Intervallen bluten gelassen, bevorzugt wöchentlich, um den Antikörpertiter zu bestimmen. Die Tiere können Booster-Injektionen nach der anfänglichen Immunisierung erhalten oder auch nicht. Diejenigen Tiere, die Booster-Injektion erhalten, erhalten üblicherweise eine gleiche Menge an Freundschem unvollständigem Adjuvans auf dieselbe Verabreichungsroute. Booster-Injektionen werden in ungefähr in dreiwöchigen Intervallen verabreicht, bis maximale Titer erhalten werden. Nach ungefähr 7 Tagen nach jeder Booster-Immunisierung oder ungefähr wöchentlich einer einzelnen Immunisierung werden die Mäuse bluten gelassen, das Serum wird gesammelt, und die Aliquots werden bis –20°C gelagert.
Monoklonale Antikörper (mAb), die mit humanem Histamin-H3-Rezeptor reaktiv sind, werden durch Immunisieren von Inzuchtmäusen, bevorzugt Balb/c, mit humanem Histamin-H3-Rezeptor und beliebigen Fragmenten davon hergestellt. Die Mäuse werden über die IP- oder SC-Verabreichungsroute mit ungefähr 0,1 mg bis ungefähr 10 mg, bevorzugt 1 mg, an humanem Histamin-H3-Rezeptor in ungefähr 0,5 ml Puffer oder Salzlösung, eingeschlossen, in einem gleichen Volumen an akzeptablen Adjuvans, wie oben diskutiert, immunisiert. Freundsches vollständiges Adjuvans wird bevorzugt. Die Mäuse erhalten eine anfängliche Immunisierung am Tag 0 und werden für ungefähr 3 bis ungefähr 30 Wochen ruhen gelassen. Den immunisierten Mäusen werden ein oder mehrere Booster-Immunisierungen von ungefähr 0,1 bis ungefähr 10 mg an humanem Histamin-H3-Rezeptor in einer Pufferlösung gegeben, wie etwa Phosphat-gepufferte Salzlösung über die intravenöse (IV) Verabreichungsroute. Lymphocyten von Antikörper-positiven Mäusen, bevorzugt Milz-Lymphocyten, werden erhalten durch Entnahme der Milze aus immunisierten Mäusen mittels Standardprozeduren, die auf dem Gebiet bekannt sind. Hybridomzellen werden durch Mischen der Milz-Lymphozyten mit einem geeigneten Fusionspartner erzeugt, bevorzugt Myelom-Zellen, unter Bedingungen, die die Bildung von stabilen Hybridomen ermöglichen werden. Fusionspartner können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf: Maus-Myelome P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 und Sp 2/0, wobei Sp 2/0 im allgemeinen bevorzugt wird. Die Antikörper-produzierenden Zellen und Myelom-Zellen werden in Polyethylen-Glycol fusioniert, ungefähr 1000 Mol. Gew., bei Konzentrationen von ungefähr 30% bis ungefähr 50%. Fusionierte Hybridomzellen werden durch Wachstum in Hypoxanthin-, Thymidin-, und Aminopterin-supplementiertem Dulbecco's Modifiziertem Eagles-Medium (DMEM) mit Prozeduren, die auf dem Gebiet bekannt sind, ausgewählt. Überstands-Flüssigkeiten werden aus Wachstums-positiven Näpfen ungefähr an den Tagen 14, 18 und 21 gesammelt und werden auf Antikörper-Produktion mit einem Immunassay gescreent, wie etwa Festphasen-Immunradioassay (SPIRA) unter Verwendung von humanem Histamin-H3-Rezeptor als dem Antigen. Die Kulturflüssigkeiten werden ebenfalls in dem Ouchterlony-Fällungsassay getestet, um den Isotyp der mAb zu bestimmen. Hybridomzellen aus Antikörper-positiven Näpfen werden durch eine Technik kloniert, wie etwa die Weich-Agar-Technik von MacPherson, Soft Agar Techniques, in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson, Eds., Academic Press, 1973.
Monoklonale Antikörper werden in vivo durch Injektion von erstmalig behandelten („pristane primed") Balb/c-Mäusen, näherungsweise 0,5 ml pro Maus, mit ungefähr 2 × 10⁶ bis ungefähr 6 × 10⁶ Hybridomzellen ungefähr 4 Tage nach der ersten Behandlung („after priming") erzeugt. Ascites-Flüssigkeit wird nährungsweise ungefähr 8–12 Tage nach der Zellübertragung gesammelt, und die monoklonalen Antikörper werden mit auf dem Gebiet bekannten Techniken aufgereinigt.
Eine in -vitro-Produktion von anti-humanem Histamin-H3-Rezeptor-mAb wird durchgeführt durch Wachsenlassen des Hybridoms in DMEM, enthaltend ungefähr 2% fetalem Kälberserum, um ausreichende Mengen des spezifischen mAb zu erhalten. Die mAb werden mit auf dem Gebiet bekannten Techniken aufgereinigt.
Antikörpertiter der Ascites- oder Hybridom-Kulturflüssigkeiten werden durch verschiedene serologische oder immunologische Assays bestimmt, die einschließen, aber nicht beschränkt sind auf Fällung, passive Agglutination, Enzym-verknüpfte immunsorbierende Antikörper (ELISA)-Technik und Radioimmun-Assay (RIA)-Techniken. Ähnliche Techniken werden verwendet, um die Anwesenheit von humanem Histamin-H3-Rezeptor in Körperflüssigkeiten oder Gewebe- und Zellextrakten nachzuweisen.
Es ist Fachleuten in leichter Weise offensichtlich, daß die oben beschriebenen Verfahren zum Herstellen von monospezifischen Antikörpern verwendet werden können, um Antikörper zu produzieren, die für humane Histamin-H3-Rezeptor-Polypeptidfragmente oder naszierendes humanes Histamin-H3-Rezeptor-Polypeptid voller Länge oder die einzelnen humanen Histamin-H3-Rezeptor-Untereinheiten zu erzeugen. Insbesondere ist es Fachleuten in leichter Weise offensichtlich, daß monospezifische Antikörper erzeugt werden können, die für nur eine humane Histamin-H3-Rezeptor-Untereinheit oder den vollständigen funktionellen Histamin-H3-Rezeptor spezifisch sind.
DNA-Klone, die als pH3R bezeichnet werden, werden identifiziert, die für Proteine kodieren, die bei Expression in einem rekombinanten Wirt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Säugetierzellen oder Insektenzellen oder Bakterien, einen humanen Histamin-H3-Rezeptor bilden, der gegenüber Histamin oder anderen Histamin-H3-Liganden empfindlich ist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Histamin oder R-alpha-Methylhistamin. Die Expression von humaner Histamin-H3-Rezeptor-DNA führt zur Expression der Eigenschaften, die bei humanem Histamin-H3-Rezeptor beobachtet werden. Diese schließen ein: direkte Aktivierung mit Histamin oder R-alpha-Methylhistamin oder einem anderen Histamin-H3-Liganden, der Fachleuten bekannt ist.
Histamin ist ein biogener Amin-Transmitter, der zu einem gewissen Ausmaß in nahezu allen physiologischen und pathophysiologischen Situationen wirkt. Histamin wirkt als ein Neurotransmitter und Neuromodulator im zentralen Nervensystem, vermittelt entzündliche und allergische Antworten, reguliert Atemwegsfunktion, kontrolliert Säuresekretion im Magen, reguliert kardiovaskuläre Funktion ebenso wie arterielle und venöse Antworten und ist ohne Zweifel an weiteren, noch zu bestimmenden Prozessen beteiligt. Die Histamin-Rezeptoren, die diese Effekte vermitteln, sind nicht vollständig charakterisiert. Ein Weg, um zu verstehen, welche Histamin-Rezeptoren an diesen Prozessen beteiligt sind, ist es, chemische Modulatoren (Agonisten, Antagonisten) der Rezeptoren als Forschungswerkzeuge und therapeutische Größen zu entwickeln. Rekombinante Wirtszellen, die den humanen Histamin-H3-Rezeptor exprimieren, können verwendet werden, um Materialien für ein Screening-Verfahren zum Identifizieren solcher Agonisten und Antagonisten bereitzustellen. Als solches lehrt diese Er findung des humanen Histamin-H3-Rezeptor direkt einen Weg, um neue Agonisten und Antagonisten zu identifizieren, die sich als Forschungswerkzeuge nützlich herausstellen können, oder die als Therapeutika verwendet werden können, um Krankheiten zu behandeln, die direkt oder indirekt Histamin-Rezeptoren beteiligen.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf Verfahren zum Screenen auf Verbindungen gerichtet, die die Funktion des humanen Histamin-H3-Rezeptor-Proteins in vivo modulieren. Verbindungen, die diese Aktivitäten modulieren, können DNA, RNA, Peptide, Proteine oder organische, nicht-Protein-Moleküle sein. Die Verbindungen können eine modulierende Funktion ausüben, indem sie die Funktion des humanen Histamin-H3-Rezeptor-Proteins verstärken oder abschwächen. Verbindungen, die die Funktion des humanen Histamin-H3-Rezeptor-Proteins modulieren, können mit einer Vielzahl von Assays nachgewiesen werden. Der Assay kann ein einfacher „ja/nein"-Assay sein, um zu bestimmen, um zu bestimmen, ob es eine Veränderung in der Expression oder Funktion gibt. Der Assay kann quantitativ gemacht werden, indem man die Funktion einer Testprobe mit der Funktion in einer Standardprobe vergleicht. Modulatoren, die in diesem Prozeß identifiziert werden, sind als therapeutische Mittel, Forschungswerkzeuge und diagnostische Mittel nützlich.
Kits, die humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA oder -RNA, Antikörper auf humanen Histamin-H3-Rezeptor oder humanes Histamin-H3-Rezeptor-Protein enthalten, können hergestellt werden. Solche Kits werden dazu verwendet, um DNA nachzuweisen, die an humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA hybridisiert, oder um die Anwesenheit von humanem Histamin-H3-Rezeptor-Protein oder Peptid-Fragmenten in einer Probe nachzuweisen. Eine solche Charakterisierung ist für eine Vielzahl von Zwecken nützlich, einschließlich, aber nicht beschränkt auf forensische Analysen, diagnostische Anwendungen und epidemiologische Studien.
Die DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, rekombinantes Protein und Antikörper der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Niveaus von humaner Histamin-H3-Rezeptor-DNA, humaner Histamin-H3-Rezeptor-RNA oder humanem Histamin-H3-Rezeptor-Protein zu screenen und zu messen. Die rekombinanten Proteine, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle und Antikörper bieten sich für die Formulierung von Kits an, die zum Nachweis und Typisieren von humanem Histamin-H3-Rezeptor geeignet sind. Ein solches Kit würde einen in Abteile unterteilten Träger umfassen, der geeignet ist, in enger Umgrenzung wenigstens einen Behälter zu umfassen. Der Träger würde weiterhin Reagenzien umfassen, wie etwa rekombi nantes Histamin-H3-Rezeptor-Protein oder anti-humane Histamin-H3-Rezeptor-Antikörper, die zum Nachweis von humanem Histamin-H3-Rezeptor geeignet sind. Der Träger kann ebenfalls ein Mittel zum Nachweis enthalten, wie etwa markiertes Antigen oder Enzymsubstrate oder ähnliches.
Nukleotidsequenzen, die zu der humanen Histamin-H3-Rezeptor-kodierenden DNA-Sequenz komplementär sind, können für eine Antisense-Therapie synthetisiert werden. Diese Antisense-Moleküle können DNA, stabile Derivate von DNA, wie etwa Phosphorothioate oder Methylphosphonate, RNA, stabile Derivate von RNA, wie etwa 2'-O-alkylRNA, oder andere humane Histamin-H3-Rezeptor-Antisense-Oligonukleotid-Mimetika sein. Humane Histamin-H3-Rezeptor-Antisense-Moleküle können in die Zellen mittels Mikroinjektion, Liposomen-Verkapselung oder mittels Expression aus Vektoren eingeführt werden, die die Antisense-Sequenz beinhalten. Eine humane Histamin-H3-Rezeptor-Antisense-Therapie kann besonders für die Behandlung von Krankheiten nützlich sein, bei denen es von Vorteil ist, die humane Histamin-H3-Rezeptor-Aktivität zu verringern.
Eine humane Histamin-H3-Rezeptor-Gentherapie kann verwendet werden, um humanen Histamin-H3-Rezeptor in Zellen von Zielorganismen einzuführen. Das humane Histamin-H3-Rezeptor-Gen kann in virale Vektoren ligiert werden, die die Übertragung von humaner Histamin-H3-Rezeptor-DNA mittels Infektion von Empfänger-Wirtszellen vermitteln. Geeignete virale Vektoren schließen Retrovirus, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpes-Virus, Vaccinia-Virus, Polio-Virus und ähnliches ein. Alternativ kann humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA in Zellen zur Gentherapie mittels nicht-viraler Techniken übertragen werden, einschließlich Rezeptor-vermittelter, gezielter DNA-Übertragung unter Verwendung von Ligand-DNA-Konjugaten, oder Adenovirus-Ligand-DNA-Konjugaten, Lipofektion-Membran-Fusion oder direkte Mikroinjektion. Diese Prozeduren und Variationen davon sind für eine ex-vivo- ebenso wie in-vivo-humane Histamin-H3-Rezeptor-Gentherapie geeignet. Humane Histamin-H3-Rezeptor-Gentherapie kann besonders zur Behandlung von Krankheiten nützlich sein, bei denen es vorteilhaft ist, die humane Histamin-H3-Rezeptor-Aktivität zu erhöhen.
Pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen, umfassend humane Histamin-H3-Rezeptor-DNA, humane Histamin-H3-Rezeptor-RNA oder humanes Histamin-H3-Rezeptor-Protein oder Modulatoren von humaner Histamin-H3-Rezeptor-Aktivität können gemäß bekannter Verfahren formuliert werden, wie etwa durch Beimischung eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers. Beispiel für solche Träger und Verfahren zur Formulierung können in Remington's Pharmaceutical Sciences gefunden werden. Um eine pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung, die zur effektiven Verabreichung geeignet ist, zu bilden, werden derlei Zusammensetzungen eine wirksame Menge des Proteins, DNA, RNA oder Modulator enthalten.
Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen der Erfindung werden an ein Individuum in Mengen verabreicht, die ausreichen, um Störungen zu behandeln oder zu diagnostizieren, bei denen eine Modulation von humaner Histamin-H3-Rezeptor-verwandter Aktivität angezeigt ist. Die effektive Menge kann gemäß einer Vielzahl von Faktoren variieren, wie etwa dem Zustand, dem Gewicht, dem Geschlecht und Alter des Individuums. Andere Faktoren schließen den Verabreichungsmodus ein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum über eine Vielzahl von Routen verabreicht werden, wie etwa subkutan, topisch, oral und intramuskulär.
Der Begriff „chemisches Derivat", beschreibt ein Molekül, das zusätzliche chemische Gruppen enthält, die normalerweise nicht Teil des Grundmoleküls sind. Solche Gruppen können die Löslichkeit, die Halbwertszeit, die Absorption etc. des Grundmoleküls verbessern. Alternativ können die Gruppen unerwünschte Nebenwirkungen des Grundmoleküls abschwächen oder die Toxizität des Grundmoleküls verringern. Beispiele für solche Gruppen werden in einer Vielzahl von Texten beschrieben, wie etwa Remington's Pharmaceutical Sciences.
Verbindungen, die gemäß den hierin offenbarten Verfahren identifiziert worden sind, können alleine in geeigneten Dosierungen verwendet werden, die mittels Routinetests definiert worden sind, um eine optimale Inhibition des humanen Histamin-H3-Rezeptors oder seiner Aktivität zu erhalten, unter gleichzeitiger Minimierung jeglicher potentieller Toxizität. Zusätzlich kann die Co-Verabreichung oder sequenzielle Verabreichung von anderen Mitteln wünschenswert sein.
Die vorliegende Erfindung hat auch die Aufgabe der Bereitstellung von geeigneten topischen, oralen, systemischen und parenteralen pharmazeutischen Formulierungen zur Verwendung bei den neuen Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung. Die Zusammensetzungen, die gemäß dieser Erfindung identifizierte Verbindungen oder Modulatoren als aktiven Inhaltsstoff zur Verwendung bei der Modulation von humanen Histamin-H3-Rezeptor-Rezeptoren enthalten, können in einer großen Vielzahl von therapeutischen Dosierungsformen in her kömmlichen Trägern zur Verabreichung verabreicht werden. Zum Beispiel können die Verbindungen oder Modulatoren in solchen oralen Dosierungsformen verabreicht werden, wie etwa Tabletten, Kapseln (jeweils einschließlich Formulierungen mit zeitlich abgestimmter Freisetzung und verzögerter Freisetzung), Pillen, Pulver, Granula, Elixiere, Tinkturen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Emulsionen oder mittels Injektion. Ähnlich können sie auch in intravenöser (sowohl Bolus als auch Fusion), intraperitonealer, subkutaner, topischer mit oder ohne Einschluß, oder in intramuskulärer Form verabreicht werden, von denen alle jeweils Formen verwenden, die Fachleuten auf dem pharmazeutischen Gebiet gut bekannt sind. Ein wirksame, aber nicht-toxische Menge der erwünschten Verbindung kann als ein humanes Histamin-H3-Rezeptor-modulierendes Mittel verwendet werden.
Die tägliche Dosierung der Produkte kann über einen großen Bereich von 0,01 bis 1000 mg pro Patient pro Tag variiert werden. Für die orale Verabreichung werden die Zusammensetzungen bevorzugt in der Form von bewerteten oder nicht-bewerteten Tabletten bereit gestellt, enthaltend 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0 und 50,0 mg des aktiven Inhaltsstoffs zur symptomatischen Einstellung der Dosierung an den zu behandelnden Patienten. Ein wirksame Menge der Arznei wird normalerweise mit einem Dosierungsniveau von ungefähr 0,0001 mg/kg bis ungefähr 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht. Der Bereich ist genauer von ungefähr 0,001 mg/kg bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die Dosierungen der humanen Histamin-H3-Rezeptor-Rezeptormodulatoren werden eingestellt, wenn sie kombiniert werden, um die erwünschten Effekte zu erzielen. Andererseits können die Dosierungen dieser verschiedenen Mittel unabhängig optimiert und kombiniert werden, um ein synergistisches Ergebnis zu erzielen, bei dem die Pathologie stärker verringert ist, als sie sein würde, wenn jedes der Mittel alleine verwendet würde.
Vorteilhafterweise können die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung in einer einzelnen täglichen Dosis verabreicht werden, oder die gesamte tägliche Dosierung kann in aufgeteilten Dosen von 2-, 3-, oder 4-mal täglich verabreicht werden. Darüber hinaus können Verbindungen oder Modulatoren für die vorliegende Erfindung in intranasaler Form mittels topischer Verwendung von geeigneten intranasalen Trägern oder über transdermale Routen unter Verwendung derjenigen Formen von transdermalen Hautpflastern verabreicht werden, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind. Um in der Form eines transdermalen Abgabesystems verabreicht zu werden, wird die Dosierungsverabreichung natürlich eher kontinuierlich als unterbrochen während des Dosierungsschema sein.
Für eine Kombinationsbehandlung mit mehr als einem aktiven Mittel, bei dem die aktiven Mittel in separaten Dosierungsformulierungen sind, können die aktiven Mittel zusammen verabreicht werden, oder sie können in getrennt verschobenen Zeiten verabreicht werden.
Das Dosierungsschema, das die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung verwendet, wird in Übereinstimmung mit einer Vielzahl von Faktoren ausgewählt, einschließlich Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischem Zustand des Patienten, des Ausmaßes des zu behandelnden Zustands, der Verabreichungsroute, der Nieren- und Leber-Funktion des Patienten und der jeweiligen Verbindung, die verwendet wird. Ein behandelnder Arzt oder Tierarzt mit normalen Fähigkeiten kann in leichter Weise die wirksame Menge der Arznei bestimmen und verschreiben, die erforderlich ist, um das Fortschreiten des Zustandes zu verhindern, dagegen vorzugehen oder anzuhalten. Optimale Präzision beim Erzielen von Konzentrationen der Arznei innerhalb des Bereichs, der eine Wirksamkeit ohne Toxizität ergibt, erfordert ein Schema, basierend auf den Kinetiken der Verfügbarkeit der Arznei an Zielstellen. Dies beinhaltet eine Berücksichtigung der Verteilung, des Gleichgewichts und der Eliminierung einer Arznei.
Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung können die hierin im einzelnen beschriebenen Verbindungen oder Modulatoren den aktiven Inhaltsstoff bilden und werden typischerweise in Beimischung mit geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Bindemitteln oder Trägern verabreicht werden (kollektiv hierin als „Träger"-Materialien bezeichnet), die in geeigneter Weise im Hinblick auf die beabsichtigte Verabreichungsform ausgewählt sind, d.h. orale Tabletten, Kapseln, Elixiere, Sirups und ähnliches, und die mit herkömmlicher pharmazeutischer Praxis übereinstimmen.
Zum Beispiel kann zur oralen Verabreichung in der Form einer Tablette oder Kapsel der aktive Arzneibestandteil mit einem oralen, nicht-toxischen pharmazeutisch akzeptablen inerten Träger, wie etwa Ethanol, Glycerol, Wasser und ähnlichem kombiniert werden. Darüber hinaus können, sofern erwünscht oder notwendig, geeignete Bindemittel, Schmiermittel, Zersetzungsmittel und Farbstoffe ebenfalls in die Mischung eingebaut werden. Geeignete Bindemittel schließen ohne Beschränkung Stärke, Gelatine, natürliche Zucker, wie etwa Glukose oder beta-Laktose, Mais-Süßmittel, natürliche und synthetischen Gummis wie etwa Akaziengummi, Tragant oder Natriumalginat, Carboxymethylzellulose, Polyethylenglykol, Wachse und ähnliches ein. Schmiermittel, die in diesen Dosierungsformen verwendet werden, schließen ohne Beschränkung Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid und ähnliches ein. Zersetzungsmittel schließen ohne Beschränkung Stärke, Methylzellulose, Agar, Bentonit, Xanthangummi und ähnliches ein.
Für flüssige Formen kann der aktive Arzneibestandteil in mit geeignetem Geschmackmittel versehenen Suspendier- oder Dispersionsmittel kombiniert werden, wie etwa die synthetischen und natürlichen Gummis, zum Beispiel Tragant, Akaziengummi, Methylzellulose und ähnliches. Andere Zersetzungsmittel, die verwendet werden können, schließen Glyzerin und ähnliches ein. Für die parenterale Verabreichung werden sterile Suspensionen und Lösungen erwünscht. Isotonische Zubereitungen, die im Allgemeinen geeignete Konservierungsmittel enthalten, werden verwendet, wenn eine intravenöse Verabreichung erwünscht ist.
Topische Zubereitungen, die den aktiven Arzneibestandteil enthalten, können mit einer Vielzahl von Trägermaterialien gemischt werden, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, wie etwa z.B. Alkohole, Aloe Vera-Gel, Allantoin, Glyzerin, Vitamin-A- und -E-Öle, Mineralöl, PPG2-Myristyl-Propionat und ähnliches, um z.B. alkoholische Lösungen, topische Reinigungsmittel, Reinigungscremes, Hautgele, Hautlotionen und Shampoos in Creme- oder Gelformulierungen zu bilden.
Die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in der Form von Liposomenabgabesystemen verabreicht werden, wie etwa kleine unilamellare Vesikel, große unilamellare Vesikel und multilamellare Vesikel. Liposomen können aus einer Vielzahl von Phospholipiden gebildet werden, wie etwa Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholinen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls durch die Verwendung von monoklonalen Antikörpern als individuellen Trägern verabreicht werden, an die die Verbindungsmoleküle gekoppelt sind. Die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung können ebenfalls mit löslichen Polymeren als zielgerichtet einsetzbaren Arzneiträgern gekoppelt werden. Solche Polymere können Polyvinylpyrrolidon, Pyran-Copolymer, Polyhydroxypropylmethacryl-Amidphenol, Polyhydroxy-Ethylaspartamidphenol oder Polyethyl-Enoxidpolylysin substituiert mit Palmitoyl-Resten, einschließen. Darüber hinaus können die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung an eine Klasse von bio abbaubaren Polymeren gekoppelt werden, die bei dem Erzielen einer kontrollierten Freisetzung einer Arznei nützlich sind, zum Beispiel Polymilchsäure, Polyepsilon-Caprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanyoacrylate und quervernetzte oder amphipathische Blockcopolymere von Hydrogelen.
Für die orale Verabreichung können die Verbindungen oder Modulatoren in Kapsel-, Tabletten- oder Bolus-Form verabreicht werden, oder sie können alternativ in Tiernahrung gemischt werden. Die Kapseln, Tabletten und Boli umfassen den aktiven Inhaltsstoff in Kombination mit einem geeigneten Träger, wie etwa Stärke, Talkum, Magnesiumstearat oder Dicalciumphosphat. Diese Einheitsdosierungsformen werden hergestellt durch intensives Mischen des aktiven Inhaltstoffes mit geeigneten feinpulvrigen inerten Inhaltsstoffen, einschließlich Verdünnungsmitteln, Füllstoffen, Zersetzungsmitteln und/oder Bindern, so daß eine uniforme Mischung erhalten wird. Ein inerter Inhaltsstoff ist einer, der mit den Verbindungen oder Modulatoren nicht reagieren wird und der nicht-toxisch für das zu behandelnde Tier ist. Geeignete inerte Inhaltsstoffe schließen Stärke, Laktose, Talkum, Magnesiumstearat, pflanzliche Gummis und Öle und ähnliches ein. Diese Formulierungen können eine in starkem Maße variable Menge der aktiven und inaktiven Inhaltsstoffe enthalten, abhängig von zahlreichen Faktoren, wie etwa der Größe und des Typs der zu behandelnden Tierspezies und des Typs und des Ausmaßes der Infektion. Der aktive Inhaltsstoff kann ebenfalls ein Zusatz zu der Nahrung verabreicht werden, indem die Verbindung mit der Nahrung gemischt wird oder indem die Verbindung auf die Oberfläche der Nahrung aufgetragen wird. Alternativ kann der aktive Inhaltsstoff mit einem inerten Träger gemischt werden, und die resultierende Zusammensetzung kann dann entweder mit der Nahrung gemischt oder direkt an das Tier gegeben werden. Geeignete inerte Träger schließen Maismehl, Zitrusmehl, Fermentationsrückstände, Sojagries, getrocknete Körner und ähnliches ein. Die aktiven Inhaltsstoffe werden intensiv mit diesen inerten Trägern durch Zermahlen, Rühren, Mahlen oder Taumeln gemischt, so daß die endgültige Zusammensetzung 0,001 bis 5 Gew.-% des aktiven Inhaltsstoffs enthält.
Die Verbindungen oder Modulatoren können alternativ parenteral mittels Injektion einer Formulierung verabreicht werden, die aus dem aktiven Inhaltsstoff, aufgelöst in einem inerten flüssigen Träger, besteht. Die Injektion kann entweder intramuskulär, intraruminal, intratracheal oder subkutan sein. Die injizierbare Formulierung besteht aus dem aktiven Inhaltsstoff, der mit einem geeigneten inerten flüssigen Träger gemischt ist. Akzeptable flüssige Träger schließen die pflanzlichen Öle, wie etwa Erdnußöl, Baumwollsamenöl, Sesamöl und ähnli ches ein, ebenso wie organische Lösungsmittel, wie etwa Solketal, Glyzerolformal und ähnliches. Als eine Alternative können auch wäßrige parenterale Formulierungen verwendet werden. Die pflanzlichen Öle sind die bevorzugte flüssigen Träger. Die Formulierungen werden durch Auflösen oder Suspendieren des aktiven Inhaltsstoffs in dem flüssigen Träger hergestellt, so daß die endgültige Formulierung von 0,005 bis 10 Gew.-% des aktiven Inhaltsstoffs enthält.
Die topische Anwendung der Verbindungen oder Modulatoren ist durch die Verwendung einer flüssigen Arznei oder eines Shampoos möglich, das die vorliegenden Verbindungen oder Modulatoren als eine wäßrige Lösung oder Suspension enthält. Diese Formulierungen enthalten im allgemeinen ein Suspendiermittel, wie etwa Bentonit, und werden normalerweise auch ein Antischaummittel enthalten. Formulierungen, die von 0,005 bis 10 Gew.-% des aktiven Inhaltsstoffs enthalten, sind akzeptabel. Bevorzugte Formulierungen sind diejenigen, die von 0,01 bis 5 Gew.-% der vorliegenden Verbindungen oder Modulatoren enthalten.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.
BEISPIEL 1
Klonierung von humaner Histamin-H3-Rezeptor-DNA (pH3R)
cDNA-Synthese:
Erststrang-Synthese:
Näherungsweise 5 μg humane Thalamus-mRNA (Clonetech) wurde verwendet, um cDNA zu synthetisieren, unter Verwendung des cDNA-Synthesekit (Life Technologies). 2 μl des NotI-Primer-Adapter wurde zu 5 μl mRNA zugegeben, und die Mischung wurde auf 70°C für 10 Minuten erhitzt und auf Eis gebracht. Die folgenden Reagenzien wurden auf Eis zugegeben: 4 μl eines 5×-Erststrangpuffers (250 mM TRIS-HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂), 2 μl 0,1 M DTT, 10 mM dNTP (Nukleotidtriphosphate)-Mischung und 1 μl DEPC-behandeltem Wasser. Die Reaktion wurde bei 42°C für 5 Minuten inkubiert. Schließlich wurden 5 μl Superscript-RT II zugegeben und bei 42°C für 2 weitere Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde auf Eis beendet.
Zweitstrangsynthese:
Das Erststrangprodukt wurde auf 93 μl mit Wasser eingestellt, und die folgenden Reagenzien wurden auf Eis zugegeben: 30 μl 5× Zweitstrang-Puffer (100 mM TRIS-HCl (pH 6,9), 450 mM KCl, 23 mM MgCl₂, 0,75 mM β-NAD+, 50 mM (NH₄)₂SO₄), 3 μl 10 mM dNTP (Nukleotidtriphosphate), 1 μl E. coli DNA-Ligase (10 Einheiten) 1 μl RNase H (2 Einheiten), 4 μl DNA pol I (10 Einheiten). Die Reaktion wurde bei 16°C für 2 Stunden inkubiert. Die DNA aus der Zweitstrangsynthese wurde mit T4-DNA-Polymerase behandelt und auf 16°C gebracht, um die DNA-Enden stumpf zu machen. Die doppelsträngige cDNA wurde mit 150 μl einer Mischung von Phenol und Chloroform extrahiert (1:1, vol.: vol.) und mit 0,5 Volumina 7,5 M NH₄OAc und 2 Volumina absolutem Ethanol ausgefällt. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und auf 37°C runtergetrocknet, um den Ethanolrückstand zu entfernen. Das doppelsträngige DNA-Pellet wurde in 25 μl Wasser resuspendiert, und die folgenden Reagenzien wurden zugegeben: 10 μl 5× T4-DNA-Ligasepuffer, 10 μl SalI-Adapter und 5 μl T4-DNA-Ligase. Die Inhaltsstoffe wurden sanft gemischt und über Nacht bei 16°C ligiert. Die Ligationsmischung wurde mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol extrahiert, vollständig mit einem Vortex verwirbelt und bei Zimmertemperatur für 5 Minuten bei 14000 × g zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Die wäßrige Phase wurde in ein neues Röhrchen übertragen, und das Volumen auf 100 ml Wasser eingestellt. Die aufgereinigte DNA wurde hinsichtlich ihrer Größe auf einer Chromaspin-1000-Säule (Clontech) ausgewählt, um die kleineren cDNA-Moleküle zu eliminieren. Die doppelsträngige DNA wurde mit NotI-Restriktionsenzym für 3–4 Stunden bei 37°C verdaut. Der Restriktionsverdau wurde auf einem 0,8% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt elektrophoresiert. Die cDNA im Bereich von 1–5 kb wurde ausgeschnitten und unter Verwendung von Gelzyme (Invitrogen) aufgereinigt. Das Produkt wurde mit Phenol:Chloroform extrahiert und mit NH₄OAc und absolutem Ethanol ausgefällt. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in 10 ml Wasser resuspendiert.
Ligation von cDNA an den Vektor:
Die cDNA wurde in 5 Röhrchen (jeweils 2 μl) aufgeteilt, und die Ligationsreaktionen wurden durch Zugabe von 4,5 μl, 2 μl 5× Ligationspuffer, 1 μl p-Sport-Vektor-DNA (geschnitten mit Sal-I/NotI und Phosphatase behandelt) und von 0,5 μl T4-DNA-Ligase angesetzt. Die Ligation wurde bei 40°C über Nacht inkubiert.
Einführung von ligierter cDNA in E. coli mittels Elektroporation:
Das Ligationsreaktionsvolumen wurde auf ein Gesamtvolumen von 20 μl mit Wasser eingestellt. 5 μl Hefe-tRNA, 12,5 ml 7,5 NH₄OAc und 70 ml absoluter Ethanol (–20°C) wurden zugegeben. Die Mischung wurde vollständig mit einem Vortex verwirbelt und sofort bei Zimmertemperatur für 20 Minuten bei 14000 × g zentrifugiert. Die Pellets wurden in 70% Ethanol gewaschen, und jedes Pellet wurde in 5 ml Wasser resuspendiert. Alle 5 Ligationen (25 ml) wurden vereinigt und 100 μl DH10B elektrokompetente Zellen (Life Technologies) wurden mit 1 ml DNA (insgesamt 20 Elektroporationen) elektroporiert, dann auf Ampicillinplatten ausplattiert, um die Anzahl an rekombinanten (cfu) pro μl zu bestimmen. Die gesamte Bibliothek wurde in 2 Liter Super Broth ausgesät, und Maxipreparationen wurden unter Verwendung des Promega Maxi Prep-Kit gemacht und auf Cäsiumchloridgradienten aufgereinigt.
Screening der Bibliothek:
1 μl Aliquots der Bibliothek, die oben konstruiert worden war, wurden in Elektromax DH10B-Zellen (Life Technologies) elektroporiert. Das Volumen wurde auf 1 ml mit SOC-Medium eingestellt und für 1 Stunde bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Bibliothek wurde dann auf 50 150 cm² Platten ausplattiert, enthaltend LB, auf eine Dichte von 5000 Kolonien pro Platte. Diese wurden über Nacht bei 37° wachsen gelassen.
Eine Histamin-H3-Rezeptor-Sonde wurde mittels Polymerasekettenreaktion unter Verwendung des folgenden Primerpaars erzeugt. 5'-Oligo: 5'ACTGGTACGAAACCTCCTTCTGGCTC 3' [SEQ. ID. NO.: 2] und 3'-Oligo: 5' CACCCAGCCTCCAGTCCAGCCAGTGAG 3' [SEQ. ID. NO.: 1]. Die endgültige Sondensequenz wird in 6 gezeigt. Die Amplifikation wurde mit 35 Zyklen durchgeführt mit einer 50–60°C-Annealing-Temperatur und humaner Thalamus-cDNA als Matrize. Das PCR-Fragment, das erzeugt wurde (400–500 bp), wurde 32P-markiert unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase-I und eines Oligo-Markierungskit (Pharmacia). Das Fragment wurde dann durch eine Passage durch eine S-200-Säule (Pharmacia) gereinigt.
Die Bibliothekskolonien werden auf Nitrozellulosefilter gebracht und mittels UV-Bestrahlung quervernetzt (Stratagene). Die Filter wurden dreimal in Puffer (50 mM TRIS, 1 M NaCl, 2 mM EDTA, 1% SDS) bei 42°C gewaschen. Die Filter wurden dann in 1:1 Southern Prehyb-Formamid mit Lachs-Spermien-DNA (50 mg, gekocht) für 6 Stunden bei 42°C prähybridisiert. Die Filter wurden dann mit der Sonde (1 × 10⁶ Zählungen/ml) über Nacht hybridisiert. Die Filter wurden dann einmal mit 2 × SSC/0,2% SDS bei Zimmertemperatur für 15 Minuten, zweimal mit 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 45°C für 30 Minuten jeweils gewaschen. Die Filter wurden dann in Plastikfolien gewickelt und einem Film (Kodak) über Nacht bei –80°C ausgesetzt.
Positive Klone wurden identifiziert. Die resultierenden Positiven wurden von der ursprünglichen Platte vereinigt, in LB für 45 Minuten bei 37°C inkubiert und über Nacht erneut ausplat tiert. Die Filteraufnahme/Hybridisierung/Wasch/Kolonienauswahl-Prozedur wurde wiederholt, bis ein einzelner Klon oder Klone isoliert wurden, die eine individuelle cDNA darstellten.
Aus dem Screen auf humanen Histamin-H3-Rezeptor wurden alle cDNA-Klone isoliert und sequenziert. Ein Klon, pH3R, enthielt ein 2699 bp-Insert (1). Diese Sequenz hatte einen sichtbaren offenen Leserahmen von Nukleotid 299 bis 1335 (2). Dieser offene Leserahmen kodierte für ein Protein von 445 Aminosäuren (3).
BEISPIEL 4
Klonierung von humaner Histamin-H3-Rezeptor-cDNA in einen Säugetierexpressionsvektor
Die humanen Histamin-H3-Rezeptor-cDNAs (kollektiv hierin als pH3R bezeichnet) wurden in den Säugetier-Expressionsvektor pCIneo kloniert. Der humane Histamin-H3-Rezeptor-cDNA-Klon wurde aus der humanen Thalamus-cDNA-Bibliothek isoliert. Die Vollängen-cDNA wurde verwendet als Matrize für PCR unter Verwendung von spezifischen Primern mit EcoRI (5'AAC GTT GAA TTC GCC ACC ATG GAG CGC GCG CCG CCC GAC GGG CCG CTG AAC3') [SEQ. ID. NO.: 3] und Not1 (5'AAC GTT GCG GCC GCA GGC TCT GGT GGG CCA CTC ACT TCC AG3') [SEQ. ID. NO.: 4]-Stellen zur Klonierung. Das PCR-Produkt wurde auf einer Säule aufgereinigt (Wizard PCR DNA Aufreinigungskit von Promega) und mit Not 1 und EcoR1 (NEB) verdaut, um cohäsive Enden zu erzeugen. Das Produkt wurde mittels Agarose-Gel-Elektrophorese mit niedrigem Schmelzpunkt aufgereinigt. Der pCIneo-Vektor wurde mit EcoR1 und Not1-Enzymen verdaut und anschließend auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt aufgereinigt. Der lineare Vektor wurde verwendet, um die humanen Histamin-H3-Rezeptor-cDNA-Inserts zu ligieren. Die Rekombinanten wurden isoliert, als humaner Histamin-H3-Rezeptor bezeichnet und dazu verwendet, um Säugetierzellen (L-Zellen) mittels CaPO₄-DNA-Fällung zu transfizieren. Stabile Zellklone wurden durch Wachstum in der Anwesenheit von G418 ausgewählt. Einzelne G418-resistente Klone wurden isoliert, und es wurde gezeigt, daß sie das intakte humane Histamin-H3-Rezeptor-Gen enthalten. Klone, die die humanen Histamin-H3-Rezeptor-cDNAs enthalten, wurden auf pH3R-Expression analysiert, indem die Inhibition der Adenylat-Cyclase in Antwort auf Histamin (5) gemäß dem Verfahren von (König, Mahan et al. 1991) gemessen wurde, oder indem direkt cAMP-Akkumulation mittels Radioimmunassay unter Verwendung von Flashplates (NEN) gemessen wurde. Die Expression wurde auch unter Verwendung von [³H]- N-alpha-Methylhistamin-Bindungsassay analysiert (Clark, Korte et al. 1992). Rekombinante Plasmide, enthaltend humane Histamin-H3-Rezeptor-kodierende DNA, wurden verwendet, um Säugetier-COS- oder CHO-Zellen oder HEK293- oder L-Zellen zu transformieren.
Zellen, die den humanen Histamin-H3-Rezeptor exprimieren, stabil oder transient, werden verwendet, um auf Expression von humanem Histamin-H3-Rezeptor und auf [³H]-N-Alpha-Methylhistamin-Bindungsaktivität zu testen. Diese Zellen werden verwendet, um andere Verbindungen auf ihre Fähigkeit zu identifizieren und zu untersuchen, den humanen Histamin-H3-Rezeptor zu modulieren, inhibieren oder aktivieren und um radioaktive Histaminbindung in Wettbewerb zu treten.
Kassetten, die die humane Histamin-H3-Rezeptor-cDNA in der positiven Orientierung im Hinblick auf den Promoter enthalten, werden in geeignete Restriktionsstellen 3' vom Promoter ligiert und mittels Restriktionsstellenkartierung und/oder Sequenzierung identifiziert. Diese cDNA-Expressionsvektoren werden in fibroblastische Wirtszellen eingeführt, z.B. COS-7 (ATCC# CRL1651), und CV-1 tat [Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987)], 293, L (ATCC# CRL6362)] mittels Standardverfahren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Elektroporation oder chemische Prozeduren (kationische Liposomen, DEAE-Dextran, Calciumphosphat). Transfizierte Zellen und Zellkultur-Überstände werden geerntet und auf humane Histamin-H3-Rezeptor-Expression analysiert, wie hierin beschrieben.
Alle Vektoren, die für eine vorübergehenden Säugetierexpression verwendet werden, können verwendet werden, um stabile Zellinien zu etablieren, die humanen Histamin-H3-Rezeptor exprimieren. Es wird erwartet, daß nicht veränderte humane Histamin-H3-Rezeptor-cDNA-Konstrukte, die in Expressionsvektoren kloniert worden sind, die Wirtszellen dahingehend programmieren, daß sie humanes Histamin-H3-Rezeptor-Protein machen. Die Transfektions-Wirtszellen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf CV-1-P [Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987)], tk-L [Wilger, et al. Cell 11: 223 (1977)], NS/0, und dHFr- CHO [Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601, (1982)].
Eine Co-Transfektion eines beliebigen Vektors, enthaltend humane Histamin-H3-Rezeptor-cDNA, mit einem Arzneiselektionsplasmid, einschließlich, aber nicht beschränkt auf G418, Aminoglycosid-Phosphotransferase; Hygromycin, Hygromycin-B-Phosphotransferase; APRT, Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase, wird die Selektion von stabil trans fizierten Klonen ermöglichen. Die Niveaus des humanen Histamin-H3-Rezeptors werden mit den hierin beschriebenen Assays quantifiziert.
Humane Histamin-H3-Rezeptor-cDNA-Konstrukte werden auch in Vektoren ligiert, die amplifizierbare Arzneiresistenz-Marker enthalten, zur Herstellung von Säugetierzellklonen, die die höchstmöglichen Niveaus an humanem Histamin-H3-Rezeptor synthetisieren. Nach der Einführung dieser Konstrukte in Zellen werden Klone, die das Plasmid enthalten, mit dem geeigneten Mittel ausgewählt, und eine Isolierung eines überexprimierenden Klons mit einer hohen Kopienzahl Plasmide, wird durch Selektion in wachsenden Dosierungen des Mittels erzielt.
Die Expression von rekombinantem humanem Histamin-H3-Rezeptor wird durch Transfektion von humaner Histamin-H3-Rezeptor-cDNA voller Länge in eine Säugetierwirtszelle erreicht.
Charakterisierung von humanem Histamin-H3-Rezeptor
Maus-L-Zellen wurden mit pH3R transfiziert und in der Anwesenheit von Neomycin für 10 Tage ausgewählt. Einzelne Kolonien wurden aufgenommen und in 6-Napf-Schalen wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann auf 96-Napf-Platten ausplattiert und bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen wurden für 20 Minuten mit Isobutylmethylxanthin (1 mM) inkubiert. Die Zellen wurden dann mit Histamin (100 nM–100 μM) für 5 Minuten stimuliert. Die Zellen wurden dann mit Forskolin (3 μM) stimuliert und bei 37°C für 20 Minuten inkubieren gelassen. Die Zellen wurden dann mit 0,1 N Salzsäure behandelt. Die Zellen wurden dann eingefroren und aufgetaut. Aliquots des Überstands wurden dann auf ihren zyklischen AMP-Gehalt unter Verwendung eines Standard-cAMP-Radioimmunassay-Kit (Flashplate, NEN) analysiert. Die Forskolin-Behandlung hebt die intrazelluläre Konzentration von cAMP. Jegliche Zellen, die auf Histamin durch Senkung des cAMP-Gehalts in Antwort auf Forskolin antworteten, wurden als einen aktiven funktionellen humanen Histamin-H3-Rezeptor exprimierend angesehen. Es wurde gezeigt, daß der aus dem hierin beschriebenen Histamin-H3-Rezeptor-kodierenden DNA-Molekül exprimierte rekombinante humane Histamin-H3-Rezeptor spezifisch durch einen Histamin-H3-Rezeptor-Agonisten aktiviert wurde, und es wurde ebenso gezeigt, daß er durch einen Histamin-H3-Rezeptor-Antagonisten inhibiert wurde.
BEISPIEL 5
Bindungsassay auf rekombinanten humanen Histamin-H3-Rezeptor
L-Zellen, die Forskolin-stimulierte cAMP-Akkumulation, wie oben beschrieben, inhibierten, wurden in 150 cm² Gewebekultur-Schalen wachsen gelassen. Die Zellen wurden mit Salzlösung gewaschen, mit einem Zellkratzer zusammengekratzt und mittels Zentrifugation (1000 rpm, 5 min) eingesammelt. L-Zellen, die humanen Histamin-H3-Rezeptor exprimierten, gingen eine Bindung mit ³H-N-Alpha-Methylhistamin mit hoher Affinität ein (7). Zellmembranen wurden mittels Homogenisierung des Zellpellets in 20 mM TRIS-HCl mit einem Polytron-Gewebe-Homogenisator für 10 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit hergestellt. Das Homogenat wurde bei 1000 rpm für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dann gesammelt und bei 20.000 × g für 25 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das endgültige Pellet wird in 50 mM TRIS-HCl resuspendiert. Die Zellmembranen wurden mit ³H-N-Alpha-Methylhistamin (0,01 nM–25 nM) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von überschüssigem Histamin (10.000 nM) inkubiert. Die Inkubation wurde bei Zimmertemperatur für 45 Minuten durchgeführt. Die Membranen wurden durch rasche Filtration über Whatman GF/C-Filter geerntet und viermal mit eiskaltem 50 mM TRIS HCl gewaschen. Die Filter wurden dann getrocknet, mit Scintillans gemischt und auf Radioaktivität in einen Zählapparat gebracht. L-Zellen, die humanen Histamin-H3-Rezeptor exprimierten, wurden verwendet, um die Bindungsaffinität von anderen Verbindungen und ihre Fähigkeit zum Verdrängen von ³H-Ligandenbindung zu messen, indem die oben beschriebene Reaktion in der Anwesenheit verschiedener Konzentrationen an Inhibitor oder zu testender Verbindung inkubiert wurde.
BEISPIEL 6
Primärstruktur des Histamin-H3-Rezeptor-Protein
Die Nukleotidsequenzen des pH3R-Rezeptor zeigten einen einzelnen offenen Leserahmen von ungefähr 1335 Basenpaaren. Die cDNAs haben 5' und 3'-nichttranslatierte Verlängerungen von ungefähr 298 und ungefähr 1066 Nukleotiden für pH3R. Das erste Methionin im Leserahmen wurde als das Initiationscodon für einen offenen Leserahmen bezeichnet, der ein humanes Histamin-H3-Rezeptor-Protein mit einer geschätzten Molekularen Masse (M_r) von ungefähr 48.656 vorhersagt.
Das vorhergesagte humane Histamin-H3-Rezeptor-Protein wurde mit Nukleotid- und Protein-Datenbanken ausgerichtet, und es wurde gefunden, daß es mit dem humanen Histamin-H1- und dem humanem Histamin-H2-Rezeptor verwandt ist. Näherungsweise 25% der Aminosäuren im humanen Histamin-H3-Rezeptor waren stark konserviert und zeigten wenigstens 25% Aminosäureidentität innerhalb des Histamin-H2-Rezeptors, 28% mit dem Histamin-H1-Rezeptor und näherungsweise 25% mit der Familie der biogenen Amin-G-Proteingekoppelten Rezeptoren. Die in dieser Rezeptoren-Familie gefundenen konservierten Motive, wie etwa sieben konservierte hydrophobe Domänen, wurden auch in der humanen Histamin-H3-Rezeptor-Sequenz gefunden. Das humane Histamin-H3-Rezeptor-Protein enthielt den konservierten Asparaginsäurerest, der in der dritten Transmembran-Domäne aller biogenen Amin-Rezeptoren gefunden wird. Das humane Histamin-H3-Rezeptor-Protein enthielt den konservierten Asparaginrest, der in der ersten Transmembran-Domäne aller biogenen Amin-Rezeptoren gefunden wird. Das humane Histamin-H3-Rezeptor-Protein enthielt den konservierten Argininrest, der in der dritten Transmembran-Domäne aller biogenen Amin-Rezeptoren gefunden wird. Das humane Histamin-H3-Rezeptor-Protein enthielt den konservierten Tryptophan-Rest, der in der vierten Transmembran-Domäne aller biogenen Amin-Rezeptoren gefunden wird. Das humane Histamin-H3-Rezeptor-Protein enthielt den konservierten Phenylalanin-Rest, der in der fünften Transmembran-Domäne aller biogenen Amin-Rezeptoren gefunden wird. Das humane Histamin-H3-Rezeptor-Protein enthielt den konservierten Prolin-Rest, der in der sechsten Transmembran-Domäne aller biogenen Amin-Rezeptoren gefunden wird. Das humane Histamin-H3-Rezeptor-Protein enthielt den konservierten Tyrosin-Rest, der in der siebten Transmembran-Domäne aller biogenen Amin-Rezeptoren gefunden wird.
BEISPIEL 7
Klonierung der humanen Histamin-H3-Rezeptor-cDNA in E. coli Expressionsvektoren
Rekombinanter humaner Histamin-H3-Rezeptor wird in E. coli nach der Übertragung der humanen Histamin-H3-Rezeptor-Expressionskassette in E. coli-Expressionsvektoren erzeugt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die pET-Reihe (Novagen). Die pET-Vektoren setzen die humane Histamin-H3-Rezeptor-Expression unter Kontrolle des stark regulierten Bakteri ophagen T7-Promoter. Nach einem Übertrag dieses Konstruktes in einen E. coli-Wirt, der eine chromosomale Kopie des T7-RNA-Polymerase-Gens enthält, angetrieben durch den induzierbaren Lac-Promoter, wird die Expression von humanem Histamin-H3-Rezeptor induziert, wenn ein geeignetes Lac-Substrat (IPTG) zu der Kultur zugegeben wird. Die Niveaus an exprimiertem humanem Histamin-H3-Rezeptor werden durch die hierin beschriebenen Assays bestimmt.
Die cDNA, die für den gesamten offenen Leserahmen für humanen Histamin-H3-Rezeptor kodiert, wird in die NdeI-Stelle von pET [16] 11a eingeführt. Konstrukte in der positiven Orientierung werden mittels Sequenz-Analyse identifiziert und dazu verwendet, um die Expression des Wirtsstammes BL21 zu transformieren. Die Transformanten werden dann verwendet, um Kulturen zur Herstellung von humanem Histamin-H3-Rezeptor-Protein zu beimpfen. Kulturen können in M9- oder ZB-Medium wachsen gelassen werden, deren Formulierung Fachleuten bekannt ist. Nach Wachstum auf eine OD₆₀₀ = 1,5, wird die Expression von humanem Histamin-H3-Rezeptor mit 1 mM IPTG für 3 Stunden bei 37°C induziert.
BEISPIEL 8
Klonierung von humaner Histamin-H3-Rezeptor-cDNA in einen Baculovirus-Expressionsvektor zur Expression in Insektenzellen
Baculovirusvektoren, die aus dem Genom des AcNPV-Virus stammen, werden so angelegt, daß sie eine Expression auf hohem Niveau von cDNA in der Sf9-Insektenzellinie (ATCC CRL# 1711) liefern. Rekombinante Baculoviren, die humane Histamin-H3-Rezeptor-cDNA exprimieren, werden mittels der folgenden Standardverfahren erzeugt (In Vitrogen Maxbac-Handbuch): Die humanen Histamin-H3-Rezeptor-cDNA-Konstrukte werden in das Polyhedrin-Gen in einer Vielzahl von Baculovirustransfervektoren ligiert, einschließlich des pAC360 – und des BlueBac-Vektors (InVitrogen). Rekombinante Baculoviren werden durch homologe Rekombination nach Cotransfektion des Baculovirustransfervektors und linearisierter AcNPV-genomischer DNA in SF9-Zellen erzeugt [Kitts, P.A., Nuc. Acid. Res. 18: 5667 (1990)]. Rekombinante pAC360-Viren werden anhand der Abwesenheit von inclusion-bodies in infizierten Zellen identifiziert, und rekombinante pBlueBac-Viren werden auf Grundlage von β-Galactosidase-Expression identifiziert (Sommers, M. D. and Smith, G. E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin No. 1555). Nach einer Plaque-Aufreinigung wird die humane Histamin-H3-Rezeptorexpression mit den hierin beschriebenen Assays gemessen.
Die cDNA, die für den gesamten offenen Leserahmen für humanen Histamin-H3-Rezeptor kodiert, wird in die BamHI-Stelle von pBlueBacII eingeführt. Konstrukte in der positiven Orientierung werden mittels Sequenzanalyse identifiziert und dazu verwendet, um Sf9-Zellen in der Anwesenheit von linearer AcNPV-Mild-Typ-DNA zu transfizieren.
Authentischer, aktiver humaner Histamin-H3-Rezeptor wird im Cytoplasma von infizierten Zellen gefunden. Aktiver humaner Histamin-H3-Rezeptor wird aus infizierten Zellen mittels hypotoner oder Detergens-Lyse extrahiert.
BEISPIEL 9
Klonierung von humaner Histamin-H3-Rezeptor-cDNA in einen Hefeexpressionsvektor
Rekombinanter humaner Histamin-H3-Rezeptor wird in der Hefe S. cerevisiae nach der Einführung des optimalen humanen Histamin-H3-Rezeptor-cDNA-Cistrons in Expressionsvektoren erzeugt, die darauf angelegt sind, die intrazelluläre oder extrazelluläre Expression von heterologen Proteinen zu steuern. Im Falle von intrazellulärer Expression werden Vektoren, wie etwa EmBLyex4 oder ähnliches an das humane Histamin-H3-Rezeptor-Cistron ligiert [Rinas, U. et al., Biotechnology 8: 543–545 (1990); Horowitz B. et al., J. Biol. Chem. 465: 4189–4192 (1989)]. Für die extrazelluläre Expression wird das humane Histamin-H3-Rezeptor-Cistron in Hefeexpressionsvektoren ligiert, die ein Sekretionssignal (ein Hefe- oder Säugetierpeptid) an den NH₂-Terminus des humanen Histamin-H3-Rezeptorproteins fusionieren [Jacobson, M. A., Gene 85: 511–516 (1989); Riett L. und Bellon N. Biochem. 28: 2941–2949 (1989)].
Diese Vektoren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf pAVEl>6, der das humane Serum-Albumin-Signal an die exprimierte cDNA fusioniert [Steep O. Biotechnology 8: 42–46 (1990)], und den Vektor pL8PL, der das humane Lysozym-Signal an die exprimierte cDNA fusioniert [Yamamoto, Y., Biochem. 28: 2728–2732]. Zusätzlich wird humaner Histamin-H3-Rezeptor in Hefe als ein Fusionsprotein exprimiert, das mit Ubiquitin konjugiert ist, unter Verwendung des Vektors pVEP [Ecker, D. J., J. Biol. Chem. 264: 7715–7719 (1989), Sabin, E. A., Biotechnology 7: 705–709 (1989), McDonnell D. P., Mol. Cell Biol. 9: 5517–5523 (1989)]. Die Niveaus an exprimiertem Humanhistamin-H3-Rezeptor werden durch die hierin beschriebenen Assays bestimmt.
LITERATURANGABEN:

Arrang, J. M., M. Garbarg, et al. (1983). "Autoinhibition of brain histamine release mediated by a novel class (H3) of histamine receptor." Nature (London) 302 (5911): 832–7.
Clark, M. A., A. Korte, et al. (1993). "Guanine nucleotides and pertussis toxin reduce the affinity of histamine H3 receptors on AtT-20 cells." Agents Actions 40 (3–4): 129–34.
Clark, M. A., A. Korte, et al. (1992). "High affinity histamine H3 receptors regulate ACTH release by AtT-20 cells." Eur. J. Pharmacol. 20 (1): 31–5.
Gantz, I., M. Schaffer, et al. (1991). "Molecular cloning of a gene encoding the histamine H2 receptor." Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (2): 429–33.
Hill, S. J., C. R. Ganellin, et al. (1997). "International Union of Pharmacology. XIII. Classification of histamine receptors." Pharmacol. Rev. 49 (3): 253–278.
Konig, M., L. C. Mahan, et al. (1991). "Method for identifying ligands that bind to cloned Gs- or Gi-coupled receptors." Mol. Cell. Neurosci. 2 (4): 331–7.
Pollard, H., J. Moreau, et al. (1993). "A detailed autoradiographic mapping of histamine H3 receptors in rat brain areas." Neuroscience (Oxford) 52 (1): 169–89.
Yamashita, M., H. Fukui, et al. (1991). "Expression cloning of a cDNA encoding the bovine histamine H1 receptor." Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (24): 11515–19.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes und aufgereinigtes DNA-Molekül, das für humanes Histamin-H3-Rezeptorprotein kodiert, wobei das isolierte und aufgereinigte DNA-Molekül die in 1 oder 2 gezeigte Nukleotidsequenz hat.
Expressionsvektor zur Expression von humanem Histamin-H3-Rezeptorprotein in einem rekombinanten Wirt, wobei der Vektor ein rekombinantes Gen enthält, das für humanes H3-Rezeptorprotein kodiert, wobei das Gen die in 1 oder 2 gezeigte Nukleotidsequenz hat.
Rekombinante Wirtszelle, enthaltend ein rekombinant kloniertes Gen, das für humanes Histamin-H3-Rezeptorprotein kodiert, wobei das Gen die in 1 oder 2 gezeigte Nukleotidsequenz hat.
Isoliertes und aufgereinigtes Protein, das aus einem rekombinanten DNA-Molekül exprimiert worden ist, welches für einen humanen Histamin-H3-Rezeptor kodiert, wobei das Protein die in 3 dargestellte Aminosäuresequenz hat.
Verfahren zur Expression von humanem Histamin-H3-Rezeptorprotein, wobei das Protein als ein humaner Histamin-H3-Rezeptor in einer rekombinanten Wirtszelle fungiert, umfassend: (a) Übertragen des Expressionsvektors von Anspruch 3 oder Anspruch 4 in geeignete Wirtszellen; und (b) Kultivieren der Wirtszellen aus Schritt (a) unter Bedingungen, die die Expression des humanen Histamin-H3-Rezeptorproteins von dem Expressionsvektor ermöglichen.
In-vitro-Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die humane Histamin-H3-Rezeptorproteinaktivität modulieren, umfassend: (a) Kombinieren eines Modulators von humaner Histamin-H3-Rezeptorproteinaktivität mit einem rekombinanten humanen Histamin-H3-Rezeptorprotein, das die in 3 dargestellte Aminosäuresequenz hat; (b) Messen eines Effekts des Modulators auf das Protein.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Effekt des Modulators auf das Protein die Modulation der Bindung von Histamin-H3-Liganden oder die Modulation der Bildung eines intrazellulären Second Messenger ist, die durch Histamin-H3-Rezeptoren vermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der intrazelluläre Second Messenger cAMP oder Calcium oder ein Reportergenprodukt ist.