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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Gesundheitsschädliche chemische,
thermische und mechanische Reize regen periphere Nervenendigungen
von sensorischen Neuronen mit geringem Durchmesser (Nozizeptoren)
in sensorischen Ganglien (zum Beispiel Dorsalwurzel, Ganglion Nodosum
und Nervus Trigeminus) an und initiieren Signale, die als Schmerz
wahrgenommen werden. Diese Neuronen sind für die Detektion von schädlichen
oder potenziell schädlichen
Reizen (Hitze) und Gewebeschäden
(H+ (Acidose im lokalen Gewebe) und/oder
Dehnung) wichtig, welche sich als Änderungen im extrazellulären Raum
bei entzündlichen
oder ischämischen
Bedingungen ergeben (Wall und Melzack, 1994). Das Vanilloid-Capsaicin
(8-Methyl-N-vanillyl-6-nonenamid),
der scharfe Hauptbestandteil in "scharfen" Capsicum Pfeffern,
ist ein sehr selektiver Aktivator der dünnen oder unmyelinierten nozizeptiven
Afferenzen (Szolcsanyi, 1993; Szolcsanyi, 1996). Elektrophysiologische
Studien haben gezeigt, dass Vanilloide kleine sensorische Neuronen
durch die Aktivierung eines Plasmamembran- Kanals anregen, der nicht
selektiv permeabel für
Kationen ist (Bevan und Szolcsanyi, 1990; Oh et al., 1996; Wood
et al., 1988). Das ultra potente tricyclische Diterpen Resiniferatoxin
aus Euphorbia Pflanzen (RTX; (Szolcsanyi et al., 1991)) bindet mit
einer nanomolaren Affinität
an die Capsaicin-Bindungsstelle und hat eine örtlich sehr begrenzte Verteilung
der Capsaicin-Rezeptoren
auf somatischen und visceralen primären sensorischen Ratten Neuronen
gezeigt (Szallasi, 1995).
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Man
glaubt, dass der Vanilloid-Rezeptor VR1 (Caterina et al., 1997)
ein Wärme-sensorischer
Rezeptor ist, dessen Reizschwelle in der Gegenwart von Protonen
oder Capsaicin erniedrigt ist (Tominaga et al., 1998). Das Capsaicin
und die Protonen interagieren mit spezifischen Membran-Erkennungsstellen
(Vanilloid-Rezeptoren), die annähernd
ausschließlich
von primären
sensorischen Neuronen exprimiert werden, die in der Nozizeption
und neurogen Entzündung
involviert sind (Bevan und Szolcsanyi, 1990). Der Vanilloid-("Capsaicin") Rezeptor VR1 wird
durch Capsaicin und RTX aktiviert und die Aktivierung des VR1 wird
durch die Antagonisten Capsazepine (CPZ; (Bevan et al., 1992)) und
Rutheniumrot (RR; (Caterina et a)., 1997; Wood et al., 1988)) blockiert.
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Hydropathieanalysen
der Aminosäuresequenz
des VR1 zeigten sechs mögliche
die Membran durchspannende Regionen (S1–S6) und eine mutmaßliche Poren-Loch-Region
zwischen S5 und S6. Eine große
intrazelluläre
Domäne
enthält
drei Ankyrin Wiederholungs-Domänen
(Caterina et al., 1997). Dieser Kanal hat signifikante strukturelle Ähnlichkeiten
mit der mutmaßlichen „Vorratsgesteuerten" TRP Calciumkanal
Familie. VR1 ist ein Ligandengesteuerter nicht-selektiver Kationenkanal,
der eine ausgeprägte
Auswärtsgleichrichtung zeigt
(Caterina et al., 1997). Von großer Bedeutung ist, dass der
VR1 im hohen Maße
für CR2+
permeabel ist, ein Ion, bekannt dafür, dass es sehr wichtig für die Regulation
der Zellfunktion ist ((Blackstone und Sheng, 1999; Gupta und Pushkala,
1999: van Haasteren et al., 1999)).
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Die
Durchsuchung der genomischen Datenbanken hat das VRL-1 offenbart,
eine Untereinheit, die strukturell dem VR1 entspricht. Ratten und
humanes VRL-1 (entsprechend AF129113 und AF129112) sind zu ~49%
identisch und zu 66% ähnlich
dem Ratten-VR1 (AF029310)) (Caterina et al., 1999). Humanes VRL-Protein
(AF103906), kloniert durch Wood und Kollegen (nicht publiziert),
ist zu 99% identisch zum VRL-1 (AF129112). Vor kurzem ist eine Patentanmeldung
von Partiseti und Renard veröffentlicht
worden, die ein hVRCC (humaner Vanilloid-Rezeptor ähnlicher
Kationenkanal (human vanilloid receptor like cation channel)) beschrieben
hat, welcher dem AF129112 nahezu identisch ist (der einzige Unterschied
ist die Deletion des Q418). Wir werden auf diese Sequenzen als VR2
Bezug nehmen. Im Großen
und Ganzen ist die vorausgesagte Struktur für den VR1 und den VR2 charakteristisch
für eine
Familie von Innenkanälen,
die über
transiente Rezeptorpotenzial-(TRP
(transient receptor potential)) Kanäle definiert wird, ursprünglich aus
Drosophila melanogaster kloniert, ein Ca-durchlässiger Kanal, der eine Rolle
bei der Phototransduktion spielt (Lu und Wong, 1987; Minke und Selinger,
1996). Dieser Rezeptor scheint auch in der Sinnesempfindung von
Schmerz-erzeugender Hitze involviert zu sein (Caterina et al., 1999).
Die Expression von VR2 in Oocyten und HEK-Zellen verleiht üblicherweise
eine Sensitivität
dieser Zellen für
gesundheitsschädliche
Temperaturen (> 53°C), welche nicht
sensitiv für
CPZ waren, aber annähernd
komplett in 10 μM
Rutheniumrot blockiert wurden. Die Aktivierung des VR2 induziert
einen nicht-selektiven Kationen-Strom mit einer hohen Permeabilität für Ca2+.
Interessanterweise nahm die Reizschwelle für die Hitzesensitivität mit einer
wiederholten Applikation der gesundheitsschädlichen Stimuli ab, aber nicht
die untere Reizschwelle für
Temperaturen (Caterina et al., 1999).
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Man
vermutet von dem Ratten SIC (stretch-inhibitable channel; Dehnungs-hemmbarer
Kanal; Genbank AB015231), kodiert durch 529 Aminosäuren, dass
dieser einen Ionenkanal bildet, der durch Dehnung inhibiert wird
(Suzuki et al., 1999). Die ersten 379 Aminosäuren sind homolog zum Ratten
VR1. Dem SIC fehlt große
N-terminale cytoplasmatische Domäne
der VR-Familie, aber er enthält
eine Sequenz, die homolog zum A Exon vor dem mutmaßlichen
TM1 ist. Die letzten 163 Aminosäuren,
beginnend in der Mitte der vermutlichen TM6 des Ratten SIC, sind
der entsprechenden Aminosäuresequenz
des humanen VR3 A+B- der vorliegenden Erfindung ähnlich.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt die Klonierung und Funktion eines
neuen Mitglieds der Vanilloid-Rezeptor Familie, VR3. Dieses Gen
scheint alternativ gespleißt
zu werden, um mindestens drei Isoformen zu bilden.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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DNA-Moleküle, welche
drei Isoformen des humanen Vanilloid-Rezeptors 3 (hVR3) kodieren,
sind kloniert und charakterisiert worden. Die biologischen und strukturellen
Eigenschaften dieser Proteine wurden als Aminosäure- und Nukleotidsequenzen
offengelegt. Das rekombinante Protein ist nützlich, um Modulatoren des Rezeptors
VR3 zu identifizieren. Modulatoren, welche unter Verwendung des
hierin offenbarten Assays identifiziert wurden, sind als therapeutische
Mittel nützlich,
welche Kandidaten für
die Behandlung von entzündlichen
Zuständen
und für
die Verwendung als schmerzlindernde Mittel für schwer zu bewältigende
Schmerzen sind, die verbunden sind mit postherpetischer Neuralgie,
diabetischer Neuropathie, Postmastektomieschmerz, komplexem regionalem
Schmerzsyndrom, Arthritis (zum Beispiel Rheumatoider und Osteoarthritis),
als auch Geschwüren,
neurodegenerativen Erkrankungen, Asthma, chronischer Bronchitis,
Reizdarmsyndrom und Psoriasis. Verwendungen umfassen die Behandlung
von Erkrankungen des zentralen Nervensystems, Erkrankungen des Verdauungstrakts,
einer abnormen Proliferation und Krebs, besonders im Verdauungssystem,
der Prostata und der weiblichen Gonaden, Geschwüren, Erkrankungen der Leber,
Erkrankungen der Niere, Kontrolle der inneren Organe des Körpers, die
durch Ganglien der Dorsalwurzel innerviert werden, oder um eine beliebige
Störung
zu diagnostizieren oder zu behandeln, die in Bezug zu einer abnormalen
Expression dieser hVR3-Polypeptide, besteht, unter anderem. In einem
weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zur Identifizierung
von Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der Materialien,
die durch die Erfindung bereitgestellt werden, und die Behandlung
von Zuständen,
die mit einer hVR3-Imbalance verbunden sind. Die rekombinanten DNA-Moleküle, und
Teile davon, sind für
die Isolierung von Homologen der DNA-Moleküle nützlich, für die Identifizierung und Isolierung
genomischer Äquivalente
der DNA-Moleküle
und für
die Identifizierung, Detektion und Isolierung mutanter Formen der
DNA-Moleküle.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNG
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1 SEQ
ID NR.: 5. Humane VR3A+B– Nukleotidsequenz
der kodierenden Region (2616 bp).
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2 SEQ
ID NR.: 6. Gezeigt ist die Nukleotidsequenz des humanen VR3A+B–, einschließlich der 337
bp 5' untranslatierten
Region (UT) und 547 bp 3' UT
(3500 bp).
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3 SEQ
ID NR.: 7. Die kodierende Sequenz de humanen VR3A+B– (871 Aminosäuren).
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4 SEQ
ID NR.: B. Die humane VR3A–B– Nukleotidsequenz
der kodierenden Region (2436 bp).
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5 SEQ
ID NR.: 9. Die kodierende Sequenz für des humanen VR3A–B– (811 Aminosäuren).
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6 SEQ
ID NR.: 10. Die humane VR3A+B+ Nukleotidsequenz der kodierenden
Region (2229 bp).
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7 SEQ
ID NR.: 11. Gezeigt ist die Nukleotidsequenz des humanen VR3A+B+,
einschließlich
der 836 bp 5' UT
und 994 bp 3' UT
(4059 bp).
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8 SEQ
ID NR.: 12. Die codierende Sequenz des humanen VR3A+B+ (742 Aminosäuren).
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9 Die
funktionelle Expression der VR3-Isoformen in Xenopus Oocyten ist
gezeigt: die Viabilität von
Oocyten, welche in ND-96 mit 2 Ca2+ gehalten
wurden, war 4–6
Tage nach der Injektion von 3.25 ng VR3 A+B– und VR3 A+B+ (5 ng) cRNA
signifikant vermindert, aber nicht nach der Injektion von VR3 A–B– (1,5 ng) cRNA.
Die Daten der VR3 A+B– und
Wasser-injizierten Oocyten sind aus fünf unterschiedlichen Experimenten erhalten
worden. Tote Oocyten sind visuell bestimmt worden. Die Daten sind
unter Verwendung des Chi-Quadrat Testes analysiert worden.
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10 Funktionen in Oocyten: VR3-Isoformen werden
durch Hitze aktiviert. A. Gezeigt ist die mittlere Spitzenstromstärke, welcher
durch einen Hitzeanstieg von 25°C
auf 46°C
ausgelöst
wurde und bei 46°C
für mindestens
15 Sekunden aufrechterhalten wurde. Der Strom ist die Erhöhung über den
anfänglichen
Strom bei +80 mV. Spannungsanstiege sind von –120 bis +80 mV über 400
mSek alle zwei Sekunden angelegt worden. Den Oocyten sind jeweils
3.25, 1.5 und 5 ng VR3 A+B–,
A–B– und A+B+
cRNA injiziert worden, und bis zu sechs Tage später erfasst worden. Die ausgefüllte Säule: Wasser-injizierte
Kontrollen (n = 8); leere Säule: VR3
A+B– Isoform
(n = 11); schraffierte Säule:
VR3 A–B– Isoform
(n = 8); getüpfelte
Säule:
VR3 A+B+ Isoform (n = 5). Alle Isoformen zeigen eine signifikante
Erhöhung über die
Wasser-Kontrollen (p = jeweils 0.001, 0.03 und 0.007; Student's t-Test). Die Hitze-induzierte
Antwort ist ungefähr
zweifach höher
in der A+B– Isoform
im Vergleich zu den anderen zwei Isoformen, aber die Unterschiede
sind nicht signifikant (p = 0.051 und p = 0.16 für A+B– jeweils im Vergleich zu A–B– und A+B+).
Die Daten sind aus zwei Sets von injizierten Oocyten erhalten worden.
Die gezeigten Daten sind die Durchschnittswerte und die Standardabweichungen
von den Durchschnittswerten. B. Die durch den Spannungsanstieg induzierten
Ströme
sind während
der Anwendung erhöhter
Hitze auf die Oocyten, die mit Wasser (oben), VR3 A+B– (zweite
von oben), VR3 A–B– (dritte
von oben) und VR3 A+B+ (unten) injiziert waren, aufgezeichnet worden.
Die Oocyten sind konstant mit Ca2+ ND-96 perfusioniert worden und
die Lösung
ist durch ein Inline Heizgerät
(TC-324B in Verbindung
mit dem SH-27A Inline Heizgerät:
Warner Instrument Corp.) erhitzt worden. Die Anstiegs-induzierten
Stromstärken
(in uA, wie auf der y-Achse angezeigt), die bei Temperaturen von
37°C bis
46°C erhalten
wurden, sind gezeigt. Nur die Stromspuren bei den höheren Temperaturen
sind mit der entsprechenden Temperatur markiert worden.
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11 Funktion in Oocyten: VR3 A+B– verleiht
eine Sensitivität
gegenüber
10 μM Rutheniumrot
des durch die Perfusion aktivierten Strom (Iperfusion),
der in VR1-exprimierenden
Oocyten beobachtet wird, induziert durch Zellperfusion mit extrazellulären Salzlösungen.
Die Aktivierung des Iperfusion durch eine
erhöhte
Perfusion ist durch Rutheniumrot nur in VR1-exprimierenden Oocyten
blockiert worden, welchen VR3 A+B– cRNA injiziert worden ist,
und nicht in Oocyten, die nur VR1 exprimieren. (a). Eine mit VR1
cRNA [4 ng] injizierte Oocyte, ist mit Spannungsanstiegen zwischen –120 und
+80 mV über
400 mSek aus einem Haltepotenzial von –70 mV gefordert worden. Die
Anstiegs-induzierten Stromstärken
sind nach Beginn der Perfusion der Oocyte mit einer Rate von 10
ml/min erhöht
worden. Eine Vorinkubation mit 10 μM Rutheniumrot für 0.5 Minuten
blockierte den Strom. Der Block war teilweise reversibel (nicht
gezeigt). (b). Eine Oocyte, welcher VR1 cRNA [4 ng] zusammen mit
VR3 A+B– [1.3
ng] injiziert wurde, wurde mit Spannungsanstiegen zwischen –120 und
+80 mV über 400
mSek aus einem Haltepotenzial von –70 mV gefordert. Die Anstiegs-induzierten
Stromstärken
sind nach dem Beginn der Perfusion der Oocyte bei einer Rate von
10 ml/min erhöht
worden. Eine Vorinkubation mit 10 μM Rutheniumrot für 0.5 Minuten
hatte nur einen geringen Effekt auf Iperfusion.
Iperfusion hatte ähnliche Stärken in beiden Sets der Oocyten.
Vrev für
den RR-inhibierten Strom war ungefähr –13 mV (Pfeil).
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12 Funktion in Oocyten: VR3 A+B– zusammen
mit VR1. Die Stärke
und die Abfallkinetiken der Antwort auf 1 μM Capsaicin sind vermindert
worden, wenn VR1 cRNA mit VR3 A+B– cRNA in gleichem Verhältniss [jede
2,9 ng] koexprimiert worden ist.
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13 Eine DNA-Array Verteilungsanalyse zeigt, dass
hVR3 mRNAs in einer Vielfalt von Geweben exprimiert werden und es
manche Überlappung
der Expression mit VR1 auf Ebene des Gesamtgewebes gibt. Die in
dem DNA-Array verwendete DNA-Sequenz ist nicht in A+B+-Isoformen
vorhanden, einzig in A+B– und A–B–-Isoformen. Zu beachten
ist, dass die cDNA-Spezies aus Hypophysen- und Prostatakeimdrüsen kloniert worden
ist.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt drei Isoformen des humanen Vanilloid-Rezeptors,
bezeichnet als VR3: VR3 A+B–,
VR3 A–B– und VR
3A+B+. Die Nukleotidsequenzen der humanen VR3 Rezeptor cDNAs zeigten
einen großen
offenen Leserahmen von ungefähr
2616 (1), 2436 (4) und 2229
(6) Basenpaaren, die 871 (3), 811
(5) und 742 (8) Aminosäuren für entsprechend
VR3 A+B–,
A–B– und A+B+ codieren.
Die cDNA für
VR3 A+B– hat
5' und 3' untranslatierte
Verlängerungen
von ungefähr
337 und ungefähr 547
Nukleotiden, wie in 2 gezeigt ist, wobei die 5' UTR von 1–337 ist,
die codierende Region von 338-2953 ist, und die 3' UTR von 2954–3500 ist.
Die cDNA für
VR3 A+B+ hat 5' und
3' untranslatierte
Verlängerungen von
ungefähr
836 und ungefähr
994 Nukleotiden, wie in 7 gezeigt ist, wobei die 5' UTR von 1–836 ist,
die codierende Region ist von 837–3065 und die 3' UTR ist von 3066–4059. Das
erste Methionin im Leserahmen ist als Anfangscodon für einen
offenen Leserahmen bestimmt worden, der humane VR3-Rezeptorproteine
mit einer geschätzten
molekularen Masse (Mr) von ungefähr 98,242
Da, 91,294 Da und 83,310 Da für
die entsprechenden Isoformen A+B–, A–B– und A+B+ voraussagt. Die
A+B– Isoform
codiert ein Protein mit 871 Aminosäuren. Die VR3 A–B– enthält eine
Deletion von 60 Aminosäuten
von Aminosäure
382 bis 441 der VR3 A+B–. Die
VR3 A+B+ ist zu A+B– bis
zu Aminosäure
736 identisch, nach welcher sechs abweichende Aminosäuren kommen,
und ein Stoppcodon. Die VR3 A+B+ Isoform ist um 20 Aminosäuren nach
der mutmaßlichen
TM6 verlängert.
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Die
vorausgesagten humanen VR3-Rezeptorproteine sind mit Nukleotid-
und Proteindatenbanken abgeglichen worden und werden der Vanilloid-Rezeptor
Familie (VR1 und VR2) zugeordnet. Dort sind einige konservierte
Motive, welche in dieser Familie von Rezeptoren gefunden werden,
einschließlich
eines großen
mutmaßlichen
N-terminalen hydrophilen Segments (ungefähr 467 Aminosäuren), drei
mutmaßlichen
Ankyrin Wiederholungs-Domänen
in der N-terminalen Regionen, 6 vorausgesagte Transmembranregionen
und eine Porenregion. VR3 A+B– ist
43% identisch zum humanen VR1, 39% identisch sowohl zum humanen
VRL-1 (AF129112) als auch dem humanen VRL (AF103906). Somit ist
der hierin beschriebene VR3-Rezeptor eindeutig ein neues Gen der
Vanilloid-Rezeptor Familie.
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Humane
VR3 A+B– und
VR3 A–B– Formen
sind dem Ratten Dehnungs-inhibierbaren Kanal SIC [Genbank Akzession
AB015231] von Aminosäure
694 bis zum Ende ähnlich.
Von dem Ratten SIC, codiert von 529 Aminosäuren, wird geglaubt, dass er
einen Innenkanal bildet, der durch Dehnung inhibiert wird. Ihm fehlt
die große
N-terminale cytoplasmatische Domäne
der VR-Familie, aber enthält
ein Sequenz-Homolog zu dem A Exon vor dem mutmaßlichen TM1.
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Die
vollständige
genomische Sequenz der hierin beschriebenen VR3 codierenden Regionen
scheint in einer 380512 Basenpaar Sequenzeingabe zur Genbank (Homo
Sapiens Klon RPCI1-7G5 (AC007834) direkte Eingabe durch Worley,
K. C.) vorzukommen. Dieser Genbankeintrag führt viele Fragmente einer DNA-Sequenz
und eine vorgeschlagene zusammenhängende Sequenz auf, aber ihm
fehlt jegliche Analyse der Nukleinsäuresequenz und versäumt die
Eigenschaften der VR3 Nukleinsäuresequenzen
zu charakterisieren, oder die Präsenz
des VR3-Gens zu beschreiben.
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Isolierung der humanen VR3-Rezeptor Nukleinsäure
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf für den humanen VR3-Rezeptor
kodierende DNA, welche aus den humanen VR3-Rezeptor produzierenden
Zellen isoliert worden ist. Humaner VR3-Rezeptor, wie hierin verwendet,
bezieht sich auf ein Protein, welches speziell als humaner Vanilloid-Rezeptor
fungieren kann.
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Die
vollständige
Aminosäuresequenz
des humanen VR3-Rezeptors ist zuvor nicht bekannt gewesen, noch
war die vollständige
den humanen VR3-Rezeptor kodierende Nukleotidsequenz bekannt. Es
wird prognostiziert, dass eine große Anzahl von Zellen und Zelltypen
den beschriebenen humanen VR3-Rezeptor enthalten wird.
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Andere
Zellen und Zelllinien können
auch für
die Verwendung um humane VR3-Rezeptor-cDNA zu isolieren geeignet sein. Die
Auswahl geeigneter Zellen kann durch eine Untersuchung auf humane
VR3-Rezeptoraktivität
in Zellextrakten oder Gesamtzell Assays, hierin beschrieben, erfolgen.
Zellen, die humane VR3-Rezeptoraktivität in jeweils einem dieser Assays
aufweisen, können
für die
Isolierung der humanen VR3-Rezeptor DNA oder RNA geeignet sein.
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Irgendeine
aus dem breiten Angebot von auf dem Fachgebiet bekannten Methoden
kann verwendet werden, um molekular die humane VR3-Rezeptor DNA
zu klonieren. Diese Methoden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf,
die direkte funktionale Expression der humanen VR3-Rezeptor Gene
in einem geeigneten Expressionsvektorsystem im Anschluss an die
Erstellung einer den humanen VR3-Rezeptor enthaltenden cDNA-Bibliothek.
Eine andere Methode ist, eine den humanen VR3-Rezeptor enthaltende
cDNA-Bibliothek, die in einem Bakteriophagen oder einem Plasmidshuttle
Vektor mit einer markierten Oligonukleotidprobe, gestaltet aus der
Aminosäuresequenz
von humanen VR3-Rezeptor Untereinheiten, erstellt wurde, zu untersuchen.
Eine zusätzliche
Methode besteht aus dem Screening einer den humanen VR3-Rezeptor
enthaltende cDNA-Bibliothek, erstellt in einem Bakteriophagen oder
einem Plasmidshuttle Vektor mit einer unvollständigen cDNA, die für das humane
VR3-Rezeptorprotein
kodiert. Diese unvollständige
cDNA wird durch die spezifische PCR-Amplifikation des humanen VR3-Rezeptor
DNA Fragments durch den Entwurf von degenerierten Oligonukleotid-Primern
aus der Aminosäuresequenz
des gereinigten humanen VR3-Rezeptorproteins erhalten.
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Eine
weitere Methode ist, RNA aus den humanen VR3-Rezeptorproduzierenden
Zellen zu isolieren und die RNA in Protein mit Hilfe eines in vitro
oder eines in vivo Translationssystems zu translatieren. Die Translation
der RNA in ein Peptid in ein Protein wird die Herstellung von zumindest
einem Teil des humanen VR3-Rezeptorproteins zur Folge haben, welches
durch zum Beispiel die immunologische Reaktivität mit einem anti-humanen VR3-Rezeptor Antikörper oder
durch die biologische Aktivität
eines humanen VR3-Rezeptorproteins
identifiziert werden kann. In diesem Verfahren können Pools der RNA, die aus
den humanen VR3-Rezeptor produzierenden Zellen isoliert wurde, auf
das Vorhandensein von RNA hin analysiert werden, die zumindest einen
Teil des humanen VR3-Rezeptorproteins
kodiert. Eine weitere Fraktionierung des RNA-Pools kann durchgeführt werden,
um die humane VR3-Rezeptor RNA von nicht-humaner VR3-Rezeptor RNA
zu reinigen. Die durch diese Methode hergestellten Peptide oder
Proteine können
analysiert werden, um Aminosäuresequenzen
zu bestimmen, welche wiederum verwendet werden können, um Primer für die Herstellung
von humaner VR3-Rezeptor cDNA bereitzustellen, oder die RNA, welche
für die
Translation verwendet wurde, kann analysiert werden, um den humanen
VR3-Rezeptor kodierende Nukleotidsequenzen bereitzustellen und führt zu Proben
für diese
Herstellung von humaner VR3-Rezeptor cDNA. Diese Methode ist auf
dem Fachgebiet bekannt und kann gefunden werden in, zum Beispiel,
Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. in Molecular Cloning;
A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989.
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Es
ist für
den Fachmann leicht ersichtlich, dass andere Arten von Bibliotheken,
als auch Bibliotheken, die aus anderen Zellen oder Zellarten hergestellt
wurden, für
die Isolierung von den humanen VR3-Rezeptor codierender DNA nützlich sein
können.
Andere Arten von Bibliotheken umfassen, sind aber nicht limitiert
auf diese, cDNA-Bibliotheken, erstellt aus anderen Zellen, aus Organismen,
anderen als der humaner VR3-Rezeptor, und genomische DNA-Bibliotheken,
die YAC (yeast artificial chromosome) und Cosmidbibliotheken umfassen.
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Es
ist für
den Fachmann leicht ersichtlich, dass geeignete cDNA-Bibliotheken
aus Zellen oder Zelllinien hergestellt werden können, welche humane VR3-Rezeptoraktivität haben.
Die Auswahl von Zellen oder Zelllinien für die Verwendung zur Herstellung
einer cDNA-Bibliothek
zur Isolierung von humaner VR3-Rezeptor-cDNA kann erfolgen, indem
zuerst die Zell-assozierte humane VR3-Rezeptoraktivität unter
Verwendung der Messung humaner VR3-Rezeptor assoziierter biologischen
Aktivität
oder eines Liganden-Bindungsassays gemessen wird.
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Die
Herstellung von cDNA-Bibliotheken kann anhand von Standardtechniken,
die auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt sind, durchgeführt werden.
Gut bekannte Konstruktionstechniken zur Erstellung einer cDNA-Bibliothek
können
zum Beispiel gefunden werden in Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook,
J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
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Es
ist ferner für
den Fachmann leicht ersichtlich, dass die den humanen VR3-Rezeptor
kodierende DNA auch aus einer geeigneten genomischen DNA-Bibliothek
isoliert werden kann. Die Erstellung einer genomischen DNA-Bibliothek
kann anhand von Standardtechniken, die auf dem Gebiet gut bekannt
sind, durchgeführt
werden. Gut bekannte Konstruktionstechniken für die Erstellung einer genomischen
DNA-Bibliothek können
gefunden werden in Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook; J. in
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
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Um
das humane VR3-Rezeptor-Gen durch die obigen Methoden zu klonieren,
kann die Aminosäuresequenz
des humanen VR3-Rezeptors notwendig sein. Um das zu erreichen, kann
das VR3-Rezeptorprotein gereinigt werden und eine Teil-Aminosäuresequenz
durch automatische Sequenzierer bestimmt werden. Es ist nicht notwendig,
die gesamte Aminosäuresequenz
zu bestimmen, aber die lineare Sequenz von zwei Bereichen von 6
bis 8 Aminosäuren
des Proteins wird für
die Herstellung von Primern für
die PCR-Amplifikation eines unvollständigen humanen VR3-Rezeptor
DNA-Fragments bestimmt.
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Sobald
geeignete Aminosäuresequenzen
identifiziert worden sind, werden die DNA-Sequenzen, die geeignet sind, diese
zu kodieren, synthetisiert. Da der genetische Code degeneriert ist,
kann mehr als ein Codon verwendet werden, um eine bestimmte Aminosäure zu kodieren,
und daher kann die Aminosäuresequenz von
jedem eines Sets von ähnlichen
DNA Oligonukleotiden codiert werden. Nur ein Teil des Sets wird
identisch mit der humanen VR3-Rezeptorsequenz sein, aber es wird
in der Lage sein, mit der humanen VR3-Rezeptor-DNA sogar in Gegenwart von DNA-Oligonukleotiden
mit Basenfehlpaarungen (Mismatches) zu hybridisieren. Die DNA-Oligonukleotide
mit Basenfehlpaarungen können
dennoch hinlänglich
mit der humanen VR3-Rezeptor-DNA hybridisieren, um die Identifikation
und Isolierung der den humanen VR3-Rezeptor kodierenden DNA zu ermöglichen.
Die unter Verwendung dieser Methoden isolierte DNA kann verwendet
werden, um DNA-Bibliotheken aus einer Vielzahl von Zellarten, aus
Invertebraten und Vertebraten-Quellen, zu untersuchen und um homologe
Gene zu isolieren.
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Gereinigter,
biologisch aktiver humaner VR3-Rezeptor kann einige unterschiedliche
physikalische Formen haben. Humaner VR3-Rezeptor kann als ein vollständiges naszierendes
oder als unverarbeitetes Polypeptid vorhanden sein, oder als teilweise
verarbeitete Polypeptide oder Kombinationen von verarbeiteten Polypeptiden.
Das vollständige
naszierende humane VR3-Rezeptor-Polypeptid kann posttranslational
durch spezifische proteolytische Spaltungsereignisse modifiziert
werden, die in der Bildung von Fragmenten des vollständigen naszierenden
Polypeptids resultieren. Ein Fragment, oder eine physikalische Assoziierung
von Fragmenten kann die vollständige
biologische Aktivität
haben, die mit humanem VR3-Rezeptor verbunden ist, jedoch kann das
Ausmaß der
humanen VR3-Rezeptoraktivität zwischen
den einzelnen humanen VR3-Rezeptorfragmenten und physikalisch assoziierten
humanen VR3-Rezeptor-Polypeptidfragmenten variieren.
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Da
der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon verwendet
werden, um eine bestimmte Aminosäure
zu codieren, und daher kann die Aminosäuresequenz durch irgendeins
von einem Set von ähnlichen
DNA-Oligonukleotiden codiert werden. Nur ein Teil des Sets wird
identisch mit der humanen VR3-Rezeptorsequenz sein, es wird aber
auch selbst in der Gegenwart von DNA-Oligonukleotiden mit Basenfehlpaarungen
(Mismatchen) unter geeigneten Bedingungen mit der humanen VR3-Rezeptor-DNA
hybridisieren. Unter wechselnden Bedingungen können nach wie vor die DNA-Oligonukleotide
mit Basenfehlpaarungen (mismatched) mit der humanen VR3-Rezeptor-DNA
hybridisieren, um die Identifikation und Isolierung der den humanen
VR3-Rezeptor codierenden DNA zu ermöglichen.
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Es
kann den humanen VR3-Rezeptor codierende DNA aus einem bestimmten
Organismus verwendet werden, um Homologe des humanen VR3-Rezeptors
aus anderen Organismen zu isolieren und zu reinigen. Um dieses zu
bewerkstelligen, kann die erste humane VR3-Rezeptor-DNA unter geeigneten Bedingungen
mit einer Probe gemischt werden, die DNA enthält, die Homologe des humanen
VR3-Rezeptors codiert. Der hybridisierte DNA-Komplex kann isoliert
werden und die DNA, welche die homologe DNA codiert, kann davon
aufgereinigt werden.
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Es
ist bekannt, dass ein beträchtlicher
Umfang an Redundanz in den verschiedenen Codons, die für die spezifischen
Aminosäuren
codieren, vorhanden ist. Daher bezieht sich diese Erfindung auch
auf jene DNA-Sequenzen, die alternative Codons enthalten, die für die letztendliche
Translation der identischen Aminosäuren codieren. Für die Zwecke
dieser Beschreibung wird eine Sequenz, die eine oder mehrere ausgetauschte
Codons hervorbringt, als degenerierte Variation definiert. Ferner
sind innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung Mutationen, entweder
in der DNA-Sequenz oder des translatierten Proteins, umfasst, die nicht
wesentlich die endgültigen
physikalischen Eigenschaften des exprimierten Proteins ändern. Zum
Beispiel verursacht die Substitution von Valin für Leucin, von Arginin für Lysin,
oder Asparagin für
Glutamin keine Veränderung
der Funktionalität
des Polypeptids. Solche Substitutionen sind gut bekannt und sind
zum Beispiel beschrieben in Molecular Biology of the Gene, 4th Ed.
Benjamin Cummings Pub. Co. by Watson et al.
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Es
ist bekannt, dass die für
ein Peptid codierenden DNA-Sequenzen modifiziert werden können, so dass
sie für
ein Peptid codieren, dass Eigenschaften hat, die unterschiedlich
zu jenen des natürlich
vorkommenden Peptids sind. Methoden der Modifizierung von DNA-Sequenzen umfassen,
sind aber nicht limitiert auf diese, eine zielgerichtete Mutagenese,
chimäre
Substitution und Genfusionen. Die zielgerichtete Mutagenese wird
verwendet, um eine oder mehrere DNA-Reste auszutauschen, die in
einer stillen Mutation, einer konservativen Mutation oder einer
nicht-konservativen Mutation resultiert. Chimäre Gene werden durch Domänen-Tausch
von ähnlichen
oder unterschiedlichen Genen hergestellt, um ähnliche Domänen in dem humanen VR3-Rezeptorgen
zu ersetzen. In ähnlicher
Weise können
Fusionsgene hergestellt werden, denen Domänen zu dem humanen VR3-Rezeptorgen hinzugefügt werden,
wie zum Beispiel eine Affinitätsmarkierung,
um die Identifikation und Isolierung der Gene zu erleichtern. Fusionsgene
können
hergestellt werden, um Regionen des humanen VR3-Rezeptorgens zu
ersetzen, zum Beispiel um eine lösliche
Version des Proteins durch die Entfernung einer transmembranen Domäne zu bilden
oder um durch die Zufügung
einer Markierungssequenz den normalen Transport des Proteins umzuleiten,
oder um neue posttranslationale Modifikationssequenzen dem humanen
VR3-Rezeptorgen hinzuzufügen.
Beispiele von veränderten
Eigenschaften umfassen, sind aber nicht limitiert auf Änderungen
der Affinität
eines Enzyms für
ein Substrat oder eines Rezeptors für einen Liganden.
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Wie
hierin verwendet, ist ein "funktionales
Derivat" eines humanen
VR3-Rezeptors eine Verbindung, die eine biologische Aktivität (entweder
funktional oder strukturell) besitzt, die im Wesentlichen ähnlich der
biologischen Aktivität
des humanen VR3-Rezeptors ist. Der Ausdruck "funktionelle Derivate" ist vorgesehen, "Fragmente", "Varianten", "degenerierte Varianten", "Analoge" und "Homologe" oder "chemische Derivate" des humanen VR3-Rezeptors zu umfassen.
Der Ausdruck "Fragment" ist bestimmt für jede Polypeptid-Untermenge des humanen
VR3-Rezeptors. Der Ausdruck "Variante" ist bestimmt für ein Molekül, das im
Wesentlichen in Struktur und Funktion entweder zu dem gesamten humanen
VR3-Rezeptormolekül
oder zu einem Fragment davon ähnlich
ist. Ein Molekül
ist "im Wesentlichen ähnlich" zu einem humanen
VR3-Rezeptor, wenn beide Moleküle
im Wesentlichen ähnliche
Strukturen haben oder wenn beide Moleküle eine ähnliche biologische Aktivität aufweisen.
Deswegen werden, wenn die zwei Moleküle eine im Wesentlichen ähnliche
Aktivität
besitzen, diese als Varianten betrachtet, sogar wenn die Struktur
von einem der Moleküle
nicht in dem anderen gefunden werden kann oder sogar wenn die zwei
Aminosäuresequenzen
nicht identisch sind. Der Ausdruck "Analog" bezieht sich auf ein Molekül, das im
Wesentlichen ähnlich
in der Funktion entweder des gesamten humanen VR3-Rezeptormoleküls oder
eines Fragments davon ist.
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Rekombinante Expression des humanen VR3-Rezeptors
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Die
clonierte humane VR3-Rezeptor-DNA, die unter Verwendung der hierin
beschriebenen Verfahren erhalten wurde, kann rekombinant durch molekulare
Klonierung in einen Expressionsvektor exprimiert werden, welcher
einen geeigneten Promotor und andere Transkriptions-regulatorische
Elemente enthält,
und in eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle transferiert
werden, um das rekombinante humane VR3- Rezeptorprotein herzustellen. Techniken
für solche
Manipulationen sind vollständig
beschrieben in Maniatis, T. et al., supra und sind auf dem Fachgebiet
gut bekannt.
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Expressionsvektoren
sind hierin als DNA-Sequenzen definiert, die für die Transkription von klonierten Kopien
von Genen und der Translation ihrer mRNAs in einem geeigneten Wirt
erforderlich sind. Solche Vektoren können verwendet werden, um eukaryotische
Gene in einer Vielzahl von Wirtszellen, wie zum Beispiel Bakterien,
einschließlich
E. coli, Blau-Grünalgen,
Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen, einschließlich Hefezellen,
und tierischen Zellen zu exprimieren.
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Spezifisch
konstruierte Vektoren ermöglichen
das hin und her bewegen (shuttling) von DNA zwischen Wirten, wie
zum Beispiel Bakterien-Hefen oder Bakterien-tierischen Zellen oder
Bakterien-Pilzzellen oder Bakterien-Invertebraten Zellen. Ein entsprechend
konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: eine Origin of Replication
für die
autonome Replikation in Wirtszellen, auswählbare Marker, eine beschränkte Anzahl
von geeigneten Restriktionsenzymstellen, die Möglichkeit für eine hohe Kopieanzahl und
aktive Promotoren. Ein Promotor wird definiert als eine DNA-Sequenz,
welche die RNA-Polymerase steuert, um an die DNA zu binden und die
RNA-Synthese zu initiieren. Ein starker Promotor ist einer, der
auslöst,
dass die mRNAs in hoher Frequenz initiiert werden. Expressionsvektoren
können
umfassen, sind aber nicht limitiert auf diese, Klonierungsvektoren,
modifzierte Klonierungsvektoren, speziell konstruierte Plasmide
oder Viren.
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Eine
Vielzahl von Säugetierexpressionsvektoren
kann verwendet werden, um den rekombinanten humanen VR3-Rezeptor
in Säugetierzellen
zu exprimieren. Kommerziell erhältliche
Säugetierexpressionsvektoren,
welche für
die Expression von rekombinanten humanen VR3-Rezeptor geeignet sind,
umfassen, sind aber nicht limitiert auf diese, pMAMneo (Clontech),
pcDNA3 (In Vitrogen), pMClneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5
(Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1 (8-2) (ATCC37110),
pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC
37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC
37146), pUCTag (ATCC 37460) und IZD35 (ATCC 37565).
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Eine
Vielzahl von bakteriellen Expressionsvektoren kann verwendet werden,
um den rekombinanten humanen VR3-Rezeptor in bakteriellen Zellen
zu exprimieren. Kommerziell erhältliche
bakterielle Expressionsvektoren, welche für die Expression von rekombinanten humanen
VR3-Rezeptor geeignet sind, umfassen, sind aber nicht limitiert
auf pET-Vektoren (Novagen) und pQE-Vektoren (Qiagen).
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Eine
Vielzahl von Pilzzellexpressionsvektoren kann verwendet werden,.
um den rekombinanten VR3-Rezeptor in Pilzzellen, wie zum Beispiel
Hefe, zu exprimieren. Kommerziell erhältliche Pilzzellexpressionsvektoren,
welche für
die Expression des rekombinanten humanen VR3-Rezeptors geeignet
sind, umfassen, sind aber nicht limitiert auf, pYES2 (In Vitrogen)
und Pichia Expressionsvektor (In Vitrogen). Eine Vielzahl von Insektenzellexpressionsvektoren
können
verwendet werden, um den rekombinanten humanen VR3-Rezeptor in Insektenzellen
zu exprimieren. Kommerziell erhältliche
Insektenzellexpressionsvektoren, welche für die rekombinante Expression
des humanen VR3-Rezeptors
geeignet sind, umfassen, sind aber nicht limitiert auf, pBlueBacII
(In Vitrogen).
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Die
für den
humanen VR3-Rezeptor codierende DNA kann in einem Expressionsvektor
für die
Expression in einer rekombinanten Wirtszelle kloniert werden. Rekombinante
Wirtszellen können
prokaryotisch oder eukaryotisch sein, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf
Bakterien, wie zum Beispiel E. coli, Pilzzellen, wie zum Beispiel
Hefe, Säugetierzellen,
einschließlich,
aber nicht eingeschränkt
auf Zelllinien von humaner, Rinder-, Schweine-, Affen- oder Nagerherkunft,
und Insektenzellen, einschließlich,
aber nicht limitiert auf Drosophila und Zelllinien erhalten von
der Seidenraupe. Von Säugetierarten
erhaltene Zelllinien, welche geeignet sind und welche kommerziell
erhältlich
sind, umfassen, sind aber nicht limitiert auf CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1
(ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3
(ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I
(ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), L-Zellen
und HEK-293 (ATCC CRL1573).
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Der
Expressionsvektor kann in Wirtszellen mit Hilfe irgendeiner von
Vielzahl von Techniken eingefügt werden,
einschließlich,
aber nicht limitiert auf Transformation, Transfektion, Protoplast
Fusion, Lipofektin und Elektroporation. Die den Expressionsvektor
enthaltenden Zellen werden klonal vermehrt und individuell analysiert,
um zu bestimmen, ob sie das humane VR3-Rezeptorprotein herstellen.
Die Identifikation der den humanen VR3-rezeptor exprimierenden Wirtszellklone
kann durch verschiedene Mittel erfolgen, einschließlich, aber nicht
limitiert auf, die immunologische Reaktivität mit anti-humanen VR3-Rezeptor Antikörpern und
dem Vorhandensein von Wirtszell-assoziierter humaner VR3-Rezeptoraktivität.
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Die
Expression von humaner VR3-Rezeptor-DNA kann auch unter Verwendung
von in vitro hergestellter synthetischer mRNA durchgeführt werden.
Synthetische mRNA oder aus den humanen VR3-Rezeptor herstellenden
Zellen isolierte mRNA kann effizient in verschiedenen zellfreien
Systemen, einschließlich,
aber nicht limitiert auf, Weizenkeimextrakte und Reticulozyten-Extrakten,
translatiert werden, ebenso wie in auf Zellen basierenden Systemen,
einschließlich,
aber nicht limitiert auf, Mikroinjektion in Frosch Oocyten, effizient
translatiert werden kann, wobei die Mikroinjektion in Frosch Oocyten
im allgemeinen bevorzugt ist.
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Um
die humane VR3-Rezeptor-DNA-Sequenz(en) zu bestimmen, die optimale
Level der humanen VR3-Rezeptoraktivität und/oder des humanen VR3-Rezeptorproteins
ergeben, können
einschließlich
Folgende, aber nicht limitiert auf diese, humane VR3-Rezeptor-DNA-Moleküle konstruiert
werden:
Genname | Start-Kodon | End-Kodon | Gesamte
Basenpaare |
VR3A+B+ | 837 | 3065 | 2229 |
VR3A+B– | 338 | 2953 | 2616 |
VR3A-B– | 1 | 2436 | 2436 |
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(diese
Anzahl entspricht dem ersten Nukleotid des ersten Methionin und
dem letzten Nukleotid vor dem ersten Stopp-Codon) und verschiedene
Konstrukte, die diese Teile der das humane VR3-Rezeptorprotein codierenden
cDNA enthalten. Alle Konstrukte können konstruiert werden, um
keinen, alle oder Teile der 5' oder der
3' nicht-translatierten
Region der humanen VR3-Rezeptor cDNA zu enthalten. Die humane VR3-Rezeptoraktivität und die
Level der Proteinexpression können
im Anschluss an die Einfügung
sowohl der Einzelnen als auch der Kombination dieser Konstrukte
in geeignete Wirtszellen bestimmt werden. Im Anschluss an die Bestimmung
der humanen VR3-Rezeptor-DNA-Kassette, welche die optimale Expression
in den transienten Assays ergibt, wird dieses humane VR3-Rezeptor-DNA-Konstrukt in
einer Art von Expressionsvektoren für die Expression in Wirtszellen
transferiert, umfassend, aber nicht limitiert auf, Säugetierzellen,
Baculovirus-infizierte Insektenzellen, E. coli und die Hefe S. cerevisiae.
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Assaymethoden für den humanen VR3-Rezeptor
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Wirtszell-Transfektanten
und mikroinjizierte Oocyten können
verwendet werden, um sowohl die Level der funktionalen humanen VR3-Rezeptoraktivität als auch
die Level des gesamten humanen VR3-Rezeptorproteins durch die folgenden
Methoden zu untersuchen. Im Falle von rekombinanten Wirtszellen
involviert dies die Ko-Transfektion von einem oder möglicherweise
zwei oder mehr Plasmiden, die die humane VR3-Rezeptor-DNA enthalten,
die für
eine oder mehrere Fragmente, Untereinheiten oder andere funktionelle
Gene codiert. Im Falle von Oocyten involviert dies die Ko-Injektion
von synthetischen RNAs für
das humane VR3-Rezeptorprotein. Im Anschluss an eine geeignete Zeitdauer,
um die Expression zu ermöglichen,
wird das zelluläre Protein
metabolisch mit zum Beispiel 35S-Methionin
für 24
Stunden, markiert, nach welcher die Zelllysate und Zellkulturüberstände geerntet
werden und einer Immunopräzipitation
mit polyklonalen Antikörpern,
die gegen das humane VR3-Rezeptorprotein
gerichtet sind, unterworfen.
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Die
Level des humanen VR3-Rezeptorproteins in den Wirtszellen werden
unter Verwendung von Immunoaffinitäts- und/oder Ligandenaffinitäts-Techniken
quantifiziert. Humane VR3-rezeptorspezifische
Affinitäts-Beads
oder humane VR3-rezeptorspezifische Antikörper werden verwendet, um zum
Beispiel 35S-Methionin markiertes oder unmarkiertes
humanes VR3-Rezeptorprotein zu isolieren. Markiertes humanes VR3-Rezeptorprotein
wird durch SDS-PAGE analysiert. Unmarkiertes humanes VR3-Rezeptorprotein
wird durch Westernblotting, ELISA oder RIA Assays detektiert, die
humane VR3-Rezeptor spezifische Antikörper verwenden.
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Andere
Verfahren zur Detektion von humaner VR3-Rezeptoraktivität umfassen
die direkte Messung von humaner VR3-Rezeptoraktivität in ganzen
Zellen, die mit humaner VR3-Rezeptor
cDNA transfiziert sind, oder mit humaner VR3-Rezeptor mRNA injizierten
Oocyten. Die humane VR3-Rezeptoraktivität wird durch spezifische Ligandenbindung
oder durch biologische Eigenschaften der die humane VR3-Rezeptor
DNA-exprimierenden Wirtszellen gemessen. Im Falle der den humanen
VR3-Rezeptor exprimierenden rekombinanten Wirtszellen können die
Patch-Voltage-Clamp-Techniken verwendet werden, um die Kanalaktivität zu messen und
das humane VR3-Rezeptorprotein zu quantifizieren. Im Falle der Oocyten
können
sowohl die Patch-Clamp- als auch die Zwei-Elektroden-Voltage- Clamp-Techniken verwendet
werden, um die Calciumkanalaktivität zu messen und das humane
VR3-Rezeptorprotein zu quantifizieren.
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Auf Zellen basierende Assays
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Ganz-Zell (whole cell) Methode
zur Verfügung,
um Verbindungen zu detektieren, die den humanen VR3-Rezeptor modulieren.
Die Methode umfasst die Schritte: 1) Kontaktierung einer Verbindung
und einer Zelle, die funktionalen humanen VR3-Rezeptor enthält, und
2) Messen einer Veränderung
in der Zelle in Antwort auf die durch die Verbindung modifizierte
humane VR3-Rezeptorfunktion.
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Die
Zeitdauer, die für
den zellulären
Kontakt mit der Verbindung notwendig ist, wird empirisch bestimmt,
zum Beispiel durch das Verstreichen einer Zeitdauer mit einem bekannten
VR3-Rezeptormodulator und das Messen zellulärer Änderungen als Funktion der
Zeit.
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Die
Mittelwerte der Messungen der Verfahren der vorliegenden Erfindung
können
weiter bestimmt werden, indem eine Zelle, die einer Verbindung ausgesetzt
worden ist, mit einer identischen Zelle, die nicht auf die gleiche
Weise der Verbindung ausgesetzt worden ist, verglichen wird. Wahlweise
können
zwei Zellen, eine, die den funktionalen humanen VR3-Rezeptor enthält, und
eine zweite Zelle, identisch mit der ersten, aber welcher der funktionale
humane VR3-Rezeptor fehlt, mit der gleichen Verbindung kontaktiert
werden und auf die Unterschiede zwischen den zwei Zellen hin verglichen
werden. Diese Technik ist auch zur Bestimmung von Hintergrundsignalen
in diesen Assays verwendbar. Der Fachmann wird verstehen, dass diese
Kontrollmechanismen auch eine leichte Selektion zellulärer Veränderungen
ermöglicht,
die in Reaktion auf die Modulation des funktionalen humanen VR3-Rezeptors
erfolgen.
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Der
Ausdruck "Zelle" bezieht sich auf
zumindest eine Zelle, umfasst aber eine Vielzahl von Zellen, die für die Sensitivität der Detektionsmethoden
geeignet sind. Die für
die vorliegende Erfindung geeigneten Zellen können Bakterielle, Hefe oder
Eukaryotisch sein.
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Die
Assaymethoden, um die Modulation des funktionalen humanen VR3-Rezeptors
durch eine Verbindung zu bestimmen, können in herkömmlichen
Laborausführungen
erfolgen oder für
einen Hochdurchsatz adaptiert werden. Der Begriff "Hochdurchsatz" bezieht sich auf
ein Assaydesign, das eine leichte Analyse von vielen Proben gleichzeitig
ermöglicht
und eine Kapazität
für eine
Roboterbedienung aufweist. Ein weiteres erwünschtes Merkmal des Hochdurchsatz-Assays
ist ein Assaydesign, das optimiert ist, um den Reagenzverbrauch
zu reduzieren, oder die Anzahl an Manipulationen zu minimieren,
um die erwünschte
Analyse zu erzielen. Beispiele von Assay-Ausführungen umfassen, sind aber
nicht limitiert auf, 96-Loch- oder
384-Loch-Platten, freischwebenden Tröpfchen und "lab an a chip"-Mikrokanalchips, die bei Experimente
mit Hantierung von Flüssigkeiten
verwendet werden. Es ist dem Fachmann gut bekannt, dass, indem die
Miniaturisierung von Plastikformen und Mittel zur Handhabung von
Flüssigkeiten
weiter entwickelt wird, oder wenn verbesserte Assay-Mittel konstruiert
werden, dass eine größere Anzahl
von Proben unter Verwendung des Designs der vorliegenden Erfindung
bestimmt werden kann.
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Die
für die
Methoden der vorliegenden Erfindung geeigneten zellulären Änderungen
umfassen die direkte Messung von Änderungen der Aktivität, Funktion
oder Menge des humanen VR3-Rezeptors, oder das Messen von Downstream-Effekten
der humanen VR3-Rezeptorfunktion,
zum Beispiel durch Messung der Konzentrationen von Sekundärmessengern
oder der Änderungen
der Transkription oder der Änderungen
der Proteinlevel von Genen, die transkriptionell durch den humanen
VR3-Rezeptor beeinflusst werden, oder durch Messung phänotypischer Änderungen
der Zelle. Bevorzugte Messmittel umfassen Änderungen der Quantität des humanen
VR3-Rezeptorproteins, Änderungen
der funktionalen Aktivität
des humanen VR3-Rezeptors, Änderungen
der Quantität
der mRNA, Änderungen
des intrazellulären
Proteins, Änderungen
der Zelloberflächenproteine
oder des sezernenten Proteins, oder Änderungen der Ca2+, cAMP oder
GTP Konzentration. Änderungen
der Quantität
oder der funktionalen Aktivität
des humanen VR3-Rezeptors sind hierin beschrieben. Änderungen
der Level an mRNA werden durch die reverse Transkription Polymerasekettenreaktion
(RT-PCR) oder durch die differentielle Genexpression detektiert.
Die Immunoaffinität,
Ligandenaffinität
oder enzymatische Messung quantifiziert VR3 induzierte Änderungen
der Level spezifischer Proteine in Wirtszellen. Wo das Protein ein
Enzym ist, wird die Induktion des Proteins durch die Spaltung eines
fluorogenen oder kolorimetrischen Substrats beobachtet.
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Die
für das
Zelloberflächenprotein
bevorzugten Detektionsmittel umfassen die Durchflusszytometrie oder
das statistische Zell-Imaging. In beiden Techniken ist das Protein
von Interesse an der Zelloberfläche
lokalisiert, mit einer spezifischen fluoreszenten Probe markiert
und wird mit Hilfe des Ausmaßes
an zellulärer Fluoreszenz
detektiert. In der Durchflusszytometrie werden die Zellen in einer
Lösung
analysiert, wobei in zellulären
Imaging-Techniken ein Bereich von Zellen auf die relative Fluoreszenz
hin verglichen wird.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zum Screenen
nach Verbindungen, die die Expression von den humanen VR3-Rezeptor
kodierender DNA oder RNA modulieren, als auch die Funktion des humanen
VR3-Rezeptorproteins in vivo.
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Verbindungen
können
modulieren durch Erhöhung
oder Verminderung der Expression der den humanen VR3-Rezeptor kodierenden
DNA oder RNA, oder der Funktion des humanen VR3-Rezeptorproteins.
Verbindungen, die die Expression von den humanen VR3-Rezeptor kodierender
DNA oder RNA oder die Funktion des humanen VR3-Rezeptorproteins
modulieren, können
durch eine Vielzahl von Assays detektiert werden. Der Assay kann
schlicht ein "ja/nein"- Assay sein, um
zu bestimmen, ob eine Änderung
der Expression oder Funktion vorliegt. Der Assay kann quantitativ
aufgebaut sein, indem die Expression oder Funktion einer Testprobe
mit den Leveln der Expression oder Funktion in einer Standardprobe
verglichen wird. Die in diesem Verfahren identifizierten Modulatoren
sind als therapeutische Mittel nützlich,
und humaner VR3-Rezeptor.
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Reinigung des humanen VR3-Rezeptorproteins
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Im
Anschluss an die Expression des humanen VR3-Rezeptors in einer rekombinanten
Wirtszelle kann das humane VR3-Rezeptorprotein wieder gewonnen werden,
um gereinigten humanen VR3-Rezeptor bereitzustellen. Der rekombinante
humane VR3-Rezeptor kann aus Zelllysaten und Extrakten, durch verschiedene Kombinationen
von, oder einzelnen Applikationen von Salzfraktionierungen, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlusschromatographie,
Hyroxylapatit Adsorptionschromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie,
Lectinchromatographie und Antikörper/Liganden-Affinitätschromatographie
aufgereinigt werden.
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Der
rekombinate humane VR3-Rezeptor kann von anderen zellulären Proteinen
unter Verwendung einer Immunoaffnitätssäule, die mit monoclonalen oder
polyclonalen Antikörpern,
die für
den vollständigen
naszierenden humanen VR3-Rezeptor, Polypeptidfragmenten des humanen
VR3-Rezeptors oder humanen VR3-Rezeptoruntereinheiten
spezifisch sind, hergestellt ist. Das Affinitätsharz wird dann mit einem
geeigneten Puffer, zum Beispiel phosphatgepufferter Saline (pH 7,3), äquilibriert
und die Zellkulturüberstände oder
Zellextrakte, welche den humanen VR3-Rezeptor oder die humanen VR3-Rezeptoruntereinheiten
enthalten, werden langsam über
die Säule
gegossen. Die Säule
wird dann mit dem Puffer gewaschen, bis die optische Dichte (A280) bis auf ein Hintergrundsignal abfällt, dann
wird das Protein durch Änderungen
der Pufferbedingung eluiert, wie zum Beispiel durch Erniedrigung
des pHs unter Verwendung eines Puffers, wie zum Beispiel 0,23 M Glycin-HCl
(pH 2,6). Das gereinigte humane VR3-Rezeptorprotein wird dann gegen
einen geeigneten Puffer, wie zum Beispiel phosphatgepufferte Saline,
dialysiert.
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Herstellung und Verwendung von Antikörpern, die
an den humanen VR3-Rezeptor binden
-
Für den humanen
VR3-Rezeptor monospezifische Antikörper werden aus Säugetierantiseren
aufgereinigt, die mit dem humanen VR3-Rezeptor reaktive Antikörper enthalten,
oder werden als mit dem humanen VR3-Rezeptor reaktive monoclonale
Antikörper
unter Verwendung der Technik, die ursprünglich von Kohler und Milstein,
Nature 256: 495–497
(1975) beschrieben wurde, hergestellt. Immunologische Techniken
sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und zum Beispiel beschrieben
in Antibodies: A laboratory manual, veröffentlicht durch die Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ISBN 0879693142.
Monospezifische Antikörper,
wie hierin verwendet, sind definiert als einzelne Antikörperarten
oder viele Antikörperarten
mit homogener Bindungscharakteristiken für den VR3-Rezeptor. Eine homogene
Bindung, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit
der Antikörperspezies,
an ein spezifisches Antigen oder Epitop zu binden, wie zum Beispiel
jene, die mit dem humanen VR3-Rezeptor, wie oben beschrieben, verbunden
sind. Für
den humanen VR3-Rezeptor spezifische Antikörper werden durch die Immunisierung
von Tieren, wie zum Beispiel Mäusen, Ratten,
Meerschweinchen, Kaninchen, Ziegen, Pferde und ähnlichen, gewonnen, wobei Kaninchen
bevorzugt werden, mit einer entsprechenden Konzentration des humanen
VR3-Rezeptors, entweder mit oder ohne einem Immunadjuvans.
-
Prä-Immunserum
wird vor der ersten Immunisierung gesammelt. Jedes Tier erhält zwischen
ungefähr 0,001
mg und ungefähr
100 mg des humanen VR3-Rezeptors, verbunden mit einem akzeptablen
Immunadjuvans. Solche verträglichen
Adjuvantien umfassen, sind aber nicht limitiert auf diese, komplettes
Freund-Adjuvans, inkomplettes Freund-Adjuvans, Alaun-Präzipitate,
Wasser-in-Öl-Emulsionen,
die Cornybacterium parvum und tRNA enthalten. Die Erstimmunisierung
besteht bevorzugt aus dem humanen VR3-Rezeptor in komplettem Freundschem
Adjuvans an mehreren Stellen, entweder subkutan (SC), intraperitoneal
(IP), oder beidem. Jedem Tier wird in regelmäßigen Intervallen Blut abgenommen,
bevorzugt wöchentlich,
um den Antikörper-Titer
zu bestimmen. Die Tiere können
oder können
nicht Boosterinjektionen im Anschluss an die Erstimmunisierung erhalten.
Den Tieren, die eine Boosterinjektion erhalten, wird im Allgemeinen
eine gleiche Menge an Antigen in inkompletten Freundschen Adjuvans
auf die gleiche Art und Weise verabreicht. Boosterinjektionen werden
in einem Dreiwochenintervall gegeben, bis maximale Titer erreicht
werden. Nach sieben Tagen nach jeder Boosterimmunisierung, oder
ungefähr
wöchentlich
nach einer einfachen Immunisierung, werden die Tiere ausgeblutet,
das Serum gesammelt und Aliquots werden bei ungefähr –20°C gelagert.
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Mit
dem humanen VR3-Rezeptor reaktive monoclonale Antikörper (mAb)
werden durch die Immunisierung von durch Inzucht erzeugten Mäusen, bevorzugt
Balb/c, mit dem humanen VR3-Rezeptor hergestellt. Die Mäuse werden
auf dem IP- oder SC-Wege mit ungefähr 0,001 mg bis ungefähr 1,0 mg
immunisiert, bevorzugt ungefähr
0,1 mg, des humanen VR3-Rezeptors
in ungefähr
0,1 ml Puffer oder Saline, enthalten in einer gleichen Menge an
verträglichem
Adjuvans, wie oben diskutiert. Freundsches Adjuvans wird bevorzugt,
wobei das komplette Freundsche Adjuvans für die Erstimmunisierung verwendet
wird und das inkomplette Freundsche Adjuvans danach verwendet wird.
Die Mäuse
erhalten eine Erstimmunisierung am Tag 0 und werden für 2 bis
ungefähr
30 Wochen geschont. Immunisierten Mäusen werden eine oder mehrere
Boosterimmunisierungen mit ungefähr
0,001 bis ungefähr
1,0 mg des humanen VR3-Rezeptors in einer Pufferlösung, wie
zum Beispiel phosphatgepufferter Saline, auf dem Wege der intravenösen Route
(IV) gegeben. Lymphozyten aus Antikörper-positiven Mäusen, bevorzugt
Milzlymphozyten, werden durch die Entfernung der Milz aus immunisierten
Mäusen
unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Standardverfahren
erhalten. Hybridomazellen werden hergestellt, indem die Milzlymphozyten
mit einem geeigneten Fusionspartner, bevorzugt Myelomazellen, unter
Bedingungen gemischt werden, die die Bildung von stabilen Hybridoma
ermöglichen.
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Fusionsparter
können
umfassen, sind aber nicht limitiert auf: Maus Myelomas P3/NS1/Ag
4– 1; MPC-11;
S-194 und Sp2/0, wobei Sp2/0 im Allgemeinen bevorzugt wird. Die
Antikörper
herstellenden Zellen und die Myelomzellen werden in Polyethylenglycol,
ungefähr
1000 mol. wt., bei Konzentrationen von ungefähr 30% bis ungefähr 50%,
fusioniert. Fusionierte Hybridomazellen werden durch Wachstum in
Hypoxanthin-, Thymidin- und Aminopterinergänztem Dulbecco's Modified Eagles
Medium (DMEM) unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten
Verfahren selektiert. Die Überstandsflüssigkeiten
werden von den wachstumspositiven Löchern ungeführ an den Tagen 14, 18 und
21 gesammelt und werden dann auf die Antikörperherstellung unter Verwendung
eines Immunoassays hin untersucht, wie zum Beispiel eines Festphasenimmunoradioassay
(SPIRA = solid Phase immunoradioassay), unter Verwendung des humanen
VR3-Rezeptors als Antigen. Die Kulturflüssigkeiten werden auch in dem
Ouchterlony Präzipitationsassay
getestet, um Isotypen der mAb zu bestimmen. Hybridomazellen aus
Antikörper
positiven Löchern
werden unter Verwendung einer Technik kloniert, wie zum Beispiel
die Weichagartechnik von PacPherson, Soft Agar Techniques, in Tissue
Culture Methods and Applications, Kruse und Paterson, Eds., Academic
Press, 1973, oder durch die Technik der limitierten Verdünnung.
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Monoklonale
Antikörper
werden in vivo durch Injektion von mit Pristan vorbereiteten Balb/c-Mäusen hergestellt, ungeführ 0,5 ml
pro Maus, mit ungefähr
1 × 106 bis ungefähr 6 × 106 Hybridomazellen,
wenigstens ca. 4 Tage nach der Vorbereitung (priming). Aszites-Flüssigkeit
wird ca. 8 bis 12 Tage nach dem Zelltransfer gesammelt, und die
monoklonalen Antikörper
werden unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Techniken
aufgereinigt.
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Die
in vitro Herstellung eines anti-humanen VR3-Rezeptor monoklonalen
Antikörpers
wird durchgeführt,
indem die Hybridoma in auf dem Fachgebiet gut bekannten Kulturmedien
wachsen. Eine hohe Dichte der in vitro Zellkultur kann betrieben
werden, um große
Mengen der anti-humanen VR3-Rezeptor monoklonalen Antikörper herzustellen,
unter Verwendung von Hohlfaserkulturtechniken, Airliftreaktoren,
Rollerflaschen oder Spinnerflask-Kulturtechniken,
auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die mAb werden unter Verwendung
von auf dem Fachgebiet bekannten Techniken aufgereinigt.
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Die
Antikörper-Titer
des Aszites oder die Hybridoma-Kulturflüssigkeiten werden unter Verwendung von
verschiedenen serologischen oder immunologischen Assays bestimmt,
welche umfassen, aber nicht limitiert sind auf, Präzipitation,
passive Agglutination, enzyme linked immunosorbent antibody (ELISA)-Techniken und
Radioimmunoassaytechniken (RIA). Ähnliche Assays werden verwendet,
um das Vorhandensein des humanen VR3-Rezeptors in Körperflüssigkeiten oder Gewebe und
Zellextrakten zu detektieren.
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Es
ist für
den Fachmann leicht ersichtlich, dass die oben beschriebenen Verfahren
für die
Herstellung von monospezifischen Antikörpern verwendet werden können, um
Antikörper
herzustellen, die für
humane VR3-Rezeptorpolypeptidfragmente, oder das vollständige naszierende
humane VR3-Rezeptorpolypeptid oder für die einzelnen humanen VR3-Rezeptoruntereinheiten
spezifisch sind. Im Speziellen ist es für jene auf dem Fachgebiet leicht
ersichtlich, dass monospezifische Antikörper erzeugt werden können, welche
für nur
eine humane VR3-Rezeptoruntereinheit oder für das vollständig funktionale
humane VR3-Rezeptorprotein
spezifisch sind. Es ist auch für
jene auf dem Fachgebiet ersichtlich, dass monospezifische Antikörper erzeugt
werden können,
die die normale Funktion des humanen VR3-Rezeptorproteins inhibieren.
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Humane
VR3-Rezeptorantikörperaffinitätssäulen werden
hergestellt, indem die Antikörper
auf eine Gelsäule
so aufgetragen werden, so dass die Antikörper kovalente Bindungen mit
der Gelkügelchensäule bilden.
Bevorzugte kovalente Bindungen werden durch Amine, Aldehyde oder
Sulfhydrylreste gebildet, die auf dem Antikörper enthalten sind. Verfahren,
um Aldehyde oder freie Sulfhydrylgruppen auf den Antikörpern zu erzeugen,
sind auf dem Fachgebiet gut bekannt: Amingruppen sind reaktiv mit,
zum Beispiel, N-Hydroxysuccinimidestern.
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Kit-Zusammenstellungen, welche humane
VR3-Rezeptor spezifische Reagenzien umfassen
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Kits,
die die humane VR3-Rezeptor DNA oder RNA, Antikörper gegen den humanen VR3-Rezeptor oder das
humane VR3-Rezeptorprotein umfassen, können hergestellt werden. Solche
Kits werden verwendet, um DNA zu detektieren, die mit der humanen
VR3-Rezeptor DNA hybridisiert, oder um das Vorhandensein von humanem
VR3-Rezeptorprotein oder Peptidfragmenten in einer Probe zu detektieren.
Solch eine Charakterisierung ist für eine Vielzahl von Zwecken
nützlich,
einschließlich,
aber nicht limitiert auf, forensische Analysen, diagnostische Anwendungen
und epidemiologischen Studien.
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Diese
Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von humanen VR3-Polynukleotiden
für die
Verwendung als diagnostische Reagenzien. Die Detektion einer mutierten
Form des humanen VR3-Gens, die mit einer Dysfunktion verbunden ist,
stellt ein diagnostisches Hilfsmittel bereit, das zu einer Diagnose
einer Erkrankung oder der Empfänglichkeit
für eine
Erkrankung, welche sich aus einer Unterexpression oder einer Überexpression
des humanen VR3 ergibt, beitragen kann oder eine Diagnose definieren
kann. Individuen, die Mutationen in dem humanen VR3-Gen tragen,
können
auf DNA-Ebene durch eine Vielzahl auf dem Fachgebiet gut bekannten
und hierin beschriebenen Techniken aufgespürt werden.
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Die
erfindungsgemäßen DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, das
rekombinante Protein und Antikörper können verwendet
werden, um die Mengen der humanen VR3-Rezeptor DNA, der humanen
VR3-Rezeptor RNA oder des humanen VR3-Rezeptorproteins zu messen.
Die rekombinanten Proteine, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle und Antikörper eignen
sich für
die Formulierung von Kits, die für
die Detektion und die Typisierung des humanen VR3-Rezeptors eignen.
Solch ein Kit würde
einen aufgeteilten Träger
umfassen, der geeignet ist, in zumindest einen Container in strengem
Gewahrsam zu halten. Der Träger
würde weiterhin
Reagenzien umfassen, wie zum Beispiel rekombinantes humanes VR3-Rezeptorprotein
oder anti-humane VR3-Rezeptor Antikörper, die für die Detektion von humanem
VR3-Rezeptor geeignet sind. Der Träger kann auch ein Mittel für die Detektion
umfassen, wie zum Beispiel markierte Antigene oder Enzymsubstrate
oder ähnliches.
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Gentherapie
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Nukleotidsequenzen,
die zu den humanen VR3-Rezeptor kodierenden DNA-Sequenzen komplementär sind,
können
für die
Antisense Therapie synthetisiert werden. Diese antisense-Moleküle können DNA,
stabile Derivate der DNA wie zum Beispiel Phosphorothioat oder Methylphosphonat,
RNA, stabile Derivate der RNA wie zum Beispiel 2-O-AlkylRNA, oder
andere humane VR3-Rezeptor antisense-Oligonukleotidmimetika sein.
Die humanen VR3-Rezeptor
antisense-Moleküle
können
in die Zellen durch Mikroinjektion, Liposomeneinkapselung oder durch
Expression von Vektoren, die die antisense-Sequenz beinhalten, eingeführt werden. Eine
humane VR3-Rezeptor Antisense Therapie kann besonders für die Behandlung
von Erkrankungen nützlich
sein, wo es von Vorteil ist, die humane VR3-Rezeptoraktivität zu verringern.
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Eine
humane VR3-Rezeptor Gentherapie kann verwendet werden, um den humanen
VR3-Rezeptor in
die Zellen eines Zielorganismus einzubringen. Das humane VR3-Rezeptorgen
kann in virale Vektoren ligiert werden, die den Transfer der humanen
VR3-Rezeptor-DNA durch Infektion der Empfängerzellen vermitteln. Geeignete
virale Vektoren umfassen Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierte
Viren, Herpesviren, Vacciniaviren, Polioviren und Ähnliche.
Wahlweise kann die humane VR3-Rezeptor DNA für die Gentherapie in Zellen durch
nicht-virale Techniken transferiert werden, einschließlich Rezeptor-mediierter
gezielt ausgerichteter DNA-Transfer unter Verwendung von Liganden-DNA-Konjugate
oder Adenovirus-Ligand-DNA-Konjugate, Lipofectin-Membranfusion oder
direkte Mikroinjektion. Diese Verfahren und die Varianten davon
sind für
die ex vivo als auch die in vivo humane VR3-Rezeptor Gentherapie
geeignet. Die humane VR3-Rezeptor Gentherapie kann besonders nützlich zur
Behandlung von Erkrankungen sein, wo es von Vorteil ist, die humane VR3-Rezeptoraktivität zu erhöhen. Protokolle
für die
molekularen Methoden der Gentherapie, die für die Verwendung mit dem humanen
VR3-Rezeptorgen geeignet sind, werden beschrieben in Gene Therapy
Protocols, herausgegeben von Paul D. Robbins, Human press, Totawa
NJ, 1996.
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Pharmazeutische Zusammensetzungen
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Pharmazeutisch
verwendbare Zusammensetzungen, die die humane VR3-Rezeptor DNA,
die humane VR3-Rezeptor RNA, oder humanes VR3-Rezeptorprotein, oder
Modulatoren der humanen VR3-Rezeptoraktivität umfassen, können entsprechend
den bekannten Methoden formuliert werden, wie zum Beispiel durch den
Zusatz von pharmazeutisch verträglichen
Trägern.
Beispiele von solchen Trägern
und Verfahren der Formulierungen können gefunden werden in Remington's Pharmaceutical
Sciences. Um eine pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung zu schaffen,
die für
eine effektive Verabreichung geeignet ist, werden solche Zusammensetzungen
eine effektive Menge des Proteins, der DNA, der RNA oder der Modulatoren
enthalten.
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Erfindungsgemäße therapeutische
oder diagnostische Zusammensetzungen werden einem Individuum in
Mengen verabreicht, die ausreichend sind, um Erkrankungen zu behandeln
oder zu diagnostizieren, in welchen die Modulation der humanen VR3-Rezeptor-bezogenen
Aktivität
angezeigt ist. Die effektive Menge kann gemäß einer Vielzahl von Faktoren
variieren, wie zum Beispiel der individuelle Zustand, Gewicht, Geschlecht
und Alter. Andere Faktoren umfassen die Art der Verabreichung. Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum auf einer
Vielzahl von Wegen zur Verfügung
gestellt werden, wie zum Beispiel subkutan, topisch, oral und intramuskulär.
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Der
Begriff "chemisches
Derivat" beschreibt
ein Molekül,
das zusätzliche
chemische Reste enthält,
die normalerweise nicht Teil des Grundmoleküls sind. Solche Reste können die
Löslichkeit,
die Halbwertszeit, die Absorption, etc. des Grundmoleküls verbessern.
Wahlweise können
die Reste unerwünschte
Nebeneffekte des Grundmoleküls
vermindern oder die Toxizität
des Grundmoleküls
erniedrigen. Beispiele solcher Reste werden in einer Vielzahl von
Texten beschrieben, wie zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Sciences.
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Die
gemäß der hierin
offenbarten Verfahren identifizierten Verbindungen können alleine
in entsprechenden Dosierungen verwendet werden, die durch Routineuntersuchungen
definiert werden, um eine optimale Inhibition des humanen VR3-Rezeptors
oder seiner Aktivität
zu erhalten, während
jegliche mögliche
Toxizität
minimiert wird. Darüber
hinaus kann die Ko-Administration
oder die sequentielle Verabreichung von anderen Mitteln wünschenswert
sein.
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Die
vorliegende Erfindung hat auch das Ziel, geeignete topische, orale,
systemische oder parenterale pharmazeutische Formulierungen für die Verwendung
in den neuen erfindungsgemäßen Methoden
zur Behandlung bereitzustellen. Die Zusammensetzungen, die gemäß dieser
Erfindung identifizierte Verbindungen oder Modulatoren als aktive
Bestandteile für
die Verwendung in der Modulation des humanen VR3-Rezeptors umfassen,
können
in einer Vielzahl von therapeutischen Dosierungsformen in für die Verabreichung
herkömmlichen
Vehikeln verabreicht werden. Zum Beispiel können die Verbindungen oder
Modulatoren in solchen oralen Dosierungsformen verabreicht werden,
wie Tabletten, Kapseln (jede umfassend Formulierungen zur Freisetzung
mit Zeitverzögerung
und konstanter Geschwindigkeit), Pillen, Puder, Granulate, Elixiere,
Tinkturen, Lösungen,
Suspensionen, Sirups und Emulsionen, oder durch Injektion. Ebenso
können
sie auch intravenös (sowohl
als Bolus als auch als Infusion), intraperitoneal, subkutan, topisch
mit oder ohne Okklusion, oder intramuskulär verabreicht werden, alle
verwendeten Formen sind dem Fachmann auf dem pharmazeutischen Fachgebiet
gut bekannt. Eine effektive, aber nicht toxische Menge der gewünschten
Verbindung kann zum Einsatz als ein humanes VR3-Rezeptor modulierendes
Mittel zum Einsatz kommen.
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Die
tägliche
Dosierung der Produkte kann über
einen breiten Bereich von 0.01 bis 1.000 mg pro Patient, pro Tag,
variiert werden. Für
die orale Verabreichung werden die Zusammensetzungen bevorzugt in
der Form von angeritzten oder unangeritzten Tabletten zur Verfügung gestellt,
die 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0 und 50.0
mg des aktiven Bestandsteils für
die symptompatische Einstellung der Dosierung auf den zu behandelnden
Patienten enthalten. Eine effektive Menge der Arznei wird gewöhnlich in
einer Dosierungsmenge von ungefähr
0,0001 mg/kg bis ungefähr
100 mg/kg pro Körpergewicht
pro Tag bereitgestellt. Der Bereich ist noch bevorzugter von ungefähr 0,001
mg/kg bis 10 mg/kg Körpergewicht
pro Tag. Die Dosierungen der humanen VR3-Rezeptor Modulatoren werden
angepasst, wenn sie kombiniert werden, um gewünschte Effekte zu erzielen.
Demgegenüber
können
die Dosierungen dieser unterschiedlichen Mittel unabhängig optimiert
und kombiniert werden, um ein synergistisches Ergebnis zu erzielen,
wobei die Pathologie stärker
herab gesetzt ist, als sie sein würde, wenn eins von den beiden
Mittel alleine verwendet werden würde.
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Vorteilhafterweise
können
die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung in
einer einzigen täglichen
Dosis verabreicht werden, oder die Gesamt-Tagesdosis kann in aufgeteilten
Dosierungen zwei-, drei- oder viermal täglich verabreicht werden. Weiterhin
können
die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung in
intranasaler Form, mit Hilfe der topischen Verwendung von geeigneten
intranasalen Vehikeln, oder via transdermaler Wegen unter Verwendung
von jenen Formen von transdermalen Hautpflastern verabreicht werden,
die jenen auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Um in der Form eines
transdermalen Zuführungssystems
verabreicht zu werden, wird die Verabreichung der Dosierung sicherlich
eher kontinuierlich als unterbrochen während der gesamten Dosierungsregimen
sein.
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Für die Kombinationsbehandlung
mit mehr als einem aktiven Mittel, wobei die aktiven Mittel in separaten
Dosierungsformulierungen sind, können
die aktiven Mittel gleichzeitig verabreicht werden, oder sie können jedes
für sich
zu versetzten Zeitpunkten verabreicht werden.
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Das
Dosierungsregimen, das die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden
Erfindung verwendet, wird in Übereinstimmung
mit einer Vielzahl von Faktoren ausgewählt, einschließlich der
Art, der Spezies, des Alters, des Gewichtes, des Geschlechts und
des medizinischen Zustands des Patienten; der Ernsthaftigkeit des
zu behandelnden Zustandes; der Route der Verabreichung; der renalen
und hepatischen Funktion des Patienten; und der bestimmten, dafür verwendeten
Verbindung. Ein durchschnittlicher Mediziner oder Veterinär kann leicht
die effektive Menge der Arznei bestimmen und verordnen, die erforderlich
ist, um dem Voranschreiten des Zustandes vorzubeugen, dem entgegenzuwirken
oder aufzuhalten. Die optimale Präzision bei dem Erlangen der
Konzentrationen der Arznei innerhalb des Bereiches, der eine Wirksamkeit
ohne Toxizität erzielt,
erfordert ein Regimen basierend auf den Kinetiken der Arzneimittelverfügbarkeit
an den Zielstellen. Dieses umfasst Überlegungen bezüglich der
Verteilung, des Gleichgewichts und der Eliminierung der Arznei.
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In
den Methoden der Erfindung können
die hierin im Detail beschriebenen Verbindungen oder Modulatoren
die aktiven Bestandteile bilden und werden üblicherweise als Gemisch mit
geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln,
Arzneistoffträger
oder Träger
(hierin gemeinsam als "Träger"-Materialien bezeichnet),
die entsprechend hinsichtlich der beabsichtigten Form der Verabreichung
ausgewählt
wurden, verabreicht, das heißt
orale Tabletten, Kapseln, Elixiere, Sirups und ähnliches und in Übereinstimmung
mit herkömmlichen
pharmazeutischen Praktiken.
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Zum
Beispiel kann für
die orale Verabreichung in Form einer Tablette oder Kapsel die aktive
Arzneikomponente mit einem oralen, nicht-toxischen, pharmazeutisch
verträglichen,
inerten Träger
kombiniert werden, wie zum Beispiel Ethanol, Glycerol, Wasser und ähnliches.
Darüber
hinaus können,
wenn es erwünscht oder
erforderlich ist, geeignete Bindemittel, Gleitmittel, disintegrierende
Mittel und einfärbende
Mittel in dem Gemisch aufgenommen werden. Geeignete Bindemittel
umfassen, ohne Einschränkung,
Stärke,
Gelatine, natürliche
Zucker, wie zum Beispiel Glukose oder beta-Laktose, Getreidesüßstoffe,
natürliche
und synthetische Gummi, wie zum Beispiel Akazie, Traganthgummi oder
Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Polyethylenglycol, Wachse
und ähnliches.
In diesen Dosierungsformen verwendete Gleitmittel umfassen, ohne
Einschränkung,
Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat,
Natriumacetat, Natriumchlorid und ähnliches. Disintegratoren umfassen,
ohne Einschränkung,
Stärke,
Methylcellulose, Agar, Bentonit, Xanthan und ähnliches.
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Für flüssige Formen
kann die aktive Arzneimittelkomponente mit geeigneten aromatisierten
Füllmitteln oder
Dispergiermitteln kombiniert werden, wie zum Beispiel synthetische
und natürliche
Gummi, wie zum Beispiel Traganth, Akazie, Methylcellulose und ähnliches.
Andere Dispergiermittel, die verwendet werden können, umfassen Glycerin und ähnliches.
Für die
parenterale Verabreichung sind sterile Suspensionen und Lösungen wünschenswert.
Isotonische Herstellungen, welche üblicherweise geeignete Konservierungsmittel
enthalten, werden verwendet, wenn die intravenöse Verabreichung erwünscht ist.
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Die
topischen Präparate,
die den aktiven Arzneimittelbestandteil enthalten, können mit
einer Vielzahl von auf dem Fachgebiet gut bekannten Trägermaterialien
zusammen gemischt werden, wie zum Beispiel beispielsweise Alkohole,
Aloe Vera Gel, Allantoin, Glycerin, Vitamin A- und E-Öle, Mineralöl, PPG2-Myristylpropionat
und ähnliches,
um zum Beispiel alkoholische Lösungen,
topische Reinigungsmittel, Reinigungscremes, Hautgele, Hautlotionen
und Shampoos in Creme- oder Gelformulierungen zu bilden.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
oder Modulatoren können
auch in Form von Liposomen-Zuführungssystemen
verabreicht werden, wie zum Beispiel kleine unilamellare Vesikel,
große
unilamellare Vesikel und multilamellare Vesikel. Liposomen können aus
einer Vielzahl von Phospholipiden gebildet werden, wie zum Beispiel
Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholin.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
auch verabreicht werden, indem monoklonale Antikörper als individuelle Träger, an
welche die Verbindungsmoleküle
gekoppelt sind, verwendet werden. Die Verbindungen oder Modulatoren
der vorliegenden Erfindung können
auch mit löslichen
Polymeren als markierbare Arzneimittelträger gekoppelt sein. Solche
Polymere können
Polyvinyl-Pyrrolidon, Pyrancopolymer, Polyhydroxypropylmethacryl-Amidephenol, Polyhydroxy-Ethylaspartamidphenol,
oder Polyethyl-Eneoxidpolylysin, substituiert mit Palmitoylresten,
umfassen. Darüber
hinaus können
die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung an
eine Klasse von bioabbaubaren Polymeren gekoppelt sein, die zur
Erreichung einer kontrollierten Freisetzung des Arzneimittels nützlich sind,
zum Beispiel Poly-Milchsäuren,
Polyepsilon-Caprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetal,
Polydihydro-Pyran, Polycyanoacrylat and quervernetzte oder amphipatische
Blockcopolymere von Hydrogelen.
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Für die orale
Verabreichung können
die Verbindungen oder Modulatoren in Kapseln, Tabletten oder in Pillenform
verabreicht werden, oder wahlweise können sie in Tierfutter gemischt
werden. Die Kapseln, Tabletten und Pillen beinhalten den aktiven
Bestandteil in Kombination mit einem geeigneten Trägervehikel,
wie zum Beispiel Stärke,
Talk, Magnesiumstearat oder di-Calciumphosphat. Diese Einheits-Dosierungsformen
(unit dosage forms) werden hergestellt, indem der aktive Bestandteil
mit geeigneten fein gepuderten inerten Bestandteilen, umfassend
Verdünnungsmittel,
Füller,
disintegrierende Mittel und/oder Bindemittel, gut gemischt wird, so
dass ein gleichmäßiges Gemisch
erhalten wird. Ein inerter Bestandteil ist einer, der nicht mit
den Verbindungen oder Modulatoren reagiert und welcher nicht toxisch
ist für
das zu behandelnde Lebewesen. Geeignete inerte Bestandteile umfassen
Stärke,
Lactose, Talk, Magnesiumstearat, Pflanzengummi und Öle und ähnliches.
Diese Formulierungen können
weit voneinander abweichende Mengen der aktiven und inaktiven Bestandteile
enthalten, in Abhängigkeit
von zahlreichen Faktoren, wie zum Beispiel der Größe und der
Art der zu behandelnden Lebewesen-Spezies und der Art und der Ernsthaftigkeit
der Infektion. Der aktive Bestandteil kann auch als Zusatz zum Futter
verabreicht werden, indem die Verbindung mit dem Futter einfach
gemischt wird oder indem die Verbindung auf die Oberfläche des
Futters aufgetragen wird. Wahlweise kann der aktive Bestandteil
mit einem inerten Träger
gemischt werden und die resultierende Zusammensetzung kann dann entweder
mit dem Futter gemischt werden oder direkt dem Lebewesen gefüttert werden.
Geeignete inerte Träger
umfassen Getreidemehl, Zitrusmehl, Fermentationsreste, Soja-Körner, getrocknete
Körner
und ähnliches. Die
aktiven Bestandteile werden mit diesen inerten Trägern durch
Vermahlen, Rühren,
Zerkleinern oder Durcheinanderbringen gut gemischt, so dass die
endgültige
Zusammensetzung von 0,001 bis 5 Massenanteile in Prozent des aktiven
Bestandteils enthält.
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Die
Verbindungen oder Modulatoren können
wahlweise parenteral via Injektion einer Formulierung verabreicht
werden, die aus dem aktiven Bestandteil gelöst in einem inerten liquiden
Träger
besteht. Die Injektion kann entweder intramuskulär, intraruminal, intratracheal
oder subkutan erfolgen. Die injizierbaren Formulierungen bestehen
aus dem aktiven Bestandteil, gemischt mit einem geeigneten inerten
liquiden Träger.
Verträgliche
liquide Träger
umfassen vegetarische Öle,
wie zum Beispiel Erdnussöl,
Baumwollsamenöl,
Sesamöl und ähnliches,
als auch organische Lösungsmittel,
wie zum Beispiel Solketal, der Form halber Glycerol und ähnliches.
Als Alternative können
auch wässrige
parenterale Formulierungen verwendet werden. Die pflanzlichen Öle sind
die bevorzugten liquiden Träger.
Die Formulierungen werden hergestellt, indem der aktive Bestandteil
in dem liquiden Träger
gelöst
oder suspendiert wird, so dass die endgültige Formulierung von 0,005 bis
10 Massenanteile in Prozent des aktiven Bestandteils enthält.
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Eine
topische Anwendung der Verbindungen und Modulatoren ist möglich durch
die Verwendung einer flüssigen
Dusche (liquid drenche) oder eines Shampoos, welche die vorliegenden
Verbindungen oder Modulatoren als eine wässrige Lösung oder Suspension enthalten.
Diese Formulierungen enthalten im Allgemeinen ein Stellmittel, wie
zum Beispiel Bentonit und umfassen üblicherweise ein Anti-Schäummittel.
Formulierungen, die von 0,005 bis 10 Massenanteil in Prozent des
aktiven Bestandteils umfassen, sind verträglich. Bevorzugte Formulierungen
sind jene, die von 0,01 bis 5 Massenanteile in Prozent der vorliegenden
Verbindungen oder Modulatoren umfassen.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung,
jedoch ohne darauf einschränkend
zu wirken.
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BEISPIEL 1 Bildung von humanen cDNA-Bibliotheken
aus Prostata und Hypophyse cDNA-Synthese:
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Synthese
des ersten Stranges: Ungefähr
5 μg humaner
mRNA aus Prostata oder Hypophyse (Clontech) sind verwendet worden,
um cDNA unter Verwendung des cDNA-Synthesekits (Life Technologies)
zu synthetisieren. Zwei Mikroliter der Not1-Primeradapter sind den
5 μl mRNA
hinzugefügt
worden und das Gemisch ist auf 70°C
für 10
Minuten erhitzt worden und auf Eis platziert worden. Die folgenden
Reagenzien sind auf dem Eis hinzugemischt worden: 4 μl des 5 × First
Strand Buffer (250 mM TRIS-HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2), 2 μl
0,1 M DTT, 10 mM dNTP (Nucleotidetriphosphat)-Gemisch und 1 μl von DEPCbehandeltem Wasser.
Diese Reaktion ist für
5 Minuten bei 42°C
inkubiert worden. Zum Schluss sind 5 μl der Superscript RT II hinzugefügt worden
und für
weitere 2 Stunden bei 42°C
inkubiert worden. Die Reaktion ist auf Eis beendet worden.
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Synthese
des zweiten Stranges: Das Erststrangprodukt ist mit Wasser auf 93 μl abgeglichen
worden und die folgenden Reagenzien sind auf Eis hinzugefügt worden:
30 μl des
5 × 2nd
Strand Puffers (100 mM TRIS-HCl (pH 6,9), 450 mM KCl, 23 mM MgCl2, 0,75 mM β-NAD+, 50 mM (NH4)2SO4), 3 μl 10 mM dNTP
(Nucleotidetriphosphat), 1 μl
E. coli DNA-Ligase
(10 units) 1 μl
RNase H (2 units), 4 μl
DNA pol I (10 units). Die Reaktion ist für 2 Stunden bei 16°C inkubiert
worden. Die DNA aus der Zweitstrangsynthese ist mit T4 DNA- Polymerase behandelt
worden und bei 16°C
platziert worden, um die DNA-Enden stumpf zu machen. Die Doppelstrang-cDNA
ist mit 150 μl
eines Gemisches aus Phenol und Chloroform (1:1, v:v) extrahiert
worden und mit 0,5 Volumen einer 7,5 M NH40Ac und 2 Volumen absolutem
Ethanol präzipitiert
worden. Das Pellet ist mit 70% Ethanol gewaschen worden und bei
37°C getrocknet
worden, um das restliche Ethanol zu entfernen. Das Doppelstrang-DNA-Pellet ist in
25 μl Wasser
resuspendiert worden und die folgenden Reagenzien sind hinzugefügt worden:
10 μl eines
5 × T4
DNA-Ligasepuffers, 10 μl
Sal1-Adapters und 5 μl
einer T4 DNA-Ligase. Die Bestandteile sind behutsam gemischt worden
und über
Nacht bei 16°C
ligiert worden. Das Ligationsgemisch ist mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol
extrahiert worden, gründlich
gevortext worden und bei Raumtemperatur für 5 Minuten bei 14.000 g zentrifugiert
worden, um die Phasen zu trennen. Die wässrige Phase ist in ein neues
Tube transferiert worden und das Volumen wurde mit Wasser auf 100
ml angepasst. Die aufgereinigte DNA ist auf einer Chromaspin 1000
Säule (Clontech)
Größen-selektiert
worden, um die kleineren cDNA-Moleküle zu entfernen. Die Doppelstrang-DNA
ist mit Not1-Restriktionsenzym für
3–4 Stunden
bei 37°C
verdaut worden. Das Restriktionsverdau ist auf einem 0,8%-igen low
melting Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen worden. Die
cDNA in einem Bereich von 1–5
kb ist ausgeschnitten worden und unter Verwendung von Gelzyme (In
Vitrogen) gereinigt worden. Das Produkt ist mit Phenol:Chloroform
extrahiert worden und mit NH4OAc und absolutem
Ethanol präzipitiert
worden. Das Pellet ist mit 70%-igem
Ethanol gewaschen worden und in 10 ml Wasser resuspendiert worden.
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Ligation
der cDNA in den Vektor: Die cDNA ist in 5 Tubes (2 μl in jedes)
aufgeteilt worden und die Ligationsreaktionen sind durch Zugabe
von 4,5 μl
Wasser, 2 μl
eines 5 × Ligationspuffers,
1 μl einer
p-Sport Vektor-DNA (geschnitten mit Sal-1/Not1 und Phosphatase behandelt)
und 0,5 μl
einer T4 DNA-Ligase hergestellt worden. Die Ligation ist über Nacht
bei 40°C
inkubiert worden.
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Einbringen der ligierten cDNA in E. coli
durch Elektroporation:
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Das
Volumen der Ligationsreaktion ist auf ein Gesamtvolumen von 20 μl mit Wasser
eingestellt worden. 5 ml einer Hefe-tRNA, 12,5 ml einer 7,5 M NH4OAc und 70 ml von absolutem Ethanol (–20°C) sind hinzugefügt worden.
Das Gemisch ist sorgfältig
gevortext worden und umgehend bei Raumtemperatur für 20 Minuten
bei 14000 x g zentrifugiert worden. Die Pellets sind in 70%-igem
Ethanol gewaschen worden und jedes Pellet ist in 5 ml Wasser resuspendiert
worden. Alle fünf
Ligierungen (25 ml) sind gepoolt worden und 100 μl von DH10B elektrokompetenten
Zellen (Life Technologies) sind mit 1 ml der DNA elektroporiert
worden (Gesamtzahl von 20 Elektroporationen), dann auf Ampicillinplatten
ausplattiert worden, um die Anzahl von Rekombinanten (cfu) pro Mikroliter
zu bestimmen. Die gesamte Bibliothek ist in 2 Litern Super Broth
gesät worden und
Maxi Preps sind unter Verwendung des Promega Maxi Prep Kits hergestellt
worden und auf Cäsiumchloridgradienten
gereinigt worden.
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BEISPIEL 2: Bibliothekenscreening/Bildung
von humanem VR3 A+B+
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Untersuchung der Bibliothek aus der humanen
Hypophyse:
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Ein-μl Aliquots
der Bibliothek aus der humanen Hypophyse sind in Electromax DH10B-Zellen (Life Technologies)
elektroporiert worden. Das Volumen ist auf 1 ml mit SOC-Medium abgeglichen
worden und für 45
Minuten bei 37°C
unter Schütteln
inkubiert worden. Die Bibliothek ist dann auf 150 cm2-Platten,
die LB enthalten, in einer Dichte von 20000 Kolonien pro Platte
ausplattiert worden. Diese Kulturen sind über Nacht bei 37°C gezogen
worden.
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Eine
humane VR3-Rezeptorprobe ist durch eine Polymerasekettenreaktion
unter Verwendung der folgenden Primerpaare generiert worden:
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Die
Probe ist unter Verwendung einer PCR, die unter normalen PCR-Bedingungen
erfolgte, die 5'-
und 3'-Probenoligos
(jedes 100 ng) und 10 ng der diluierten Miniprep-DNA verwendete,
erzeugt worden. Das resultierende 493 bp Fragment wurde auf einem
1%-igen Agarosegel laufen gelassen und unter Verwendung eines QUIAquick-Gelextraktionskits
(Quiagen) gereinigt. Ungefähr
100 ng der aufgereinigten Probe ist mit alpha 32P unter Verwendung
des Oligolabeling-Kits von Pharmacia markiert worden und die markierte
DNA ist mit einer S-200 Säule
(Pharmacia) aufgereinigt worden.
-
Die
Bibliothekskolonien sind auf Protran Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schuel) abgehoben
worden und die DNA ist in 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH denaturiert worden.
Die Filterscheiben sind mit 1,5 M NaCl, 1,0 M Tris-HCl, pH 7,5 neutralisiert
worden und dann auf der Membran unter Verwendung eines UV-Stratalinkers (Stratagene)
UV quervernetzt worden. Die Filter sind dann einige Male mit einer
Waschlösung
(1 M Tris-HCl, pH 8,0; 5 M NaCl; 0,5 M EDTA; 20% SDS) bei 42°C gewaschen
worden. Dann sind die Scheiben in einem 1 × Southern Prä-Hybridisierungspuffer
(5'-3' Inc), welcher 50%
Formamid und 100 μg/ml
gescherter Lachssperma-DNA (5'-3' Inc) enthält, für 6 Stunden
bei 42°C
inkubiert worden. Zum Schluss ist die Hybridisierung über Nacht
bei 42°C
in einem 1 × Hybridisierungspuffer
(5'-3'), welcher 50% Formamid,
100 ng der gescherten Lachssperma-DNA enthält, in Gegenwart von markierter
Probe (5×105 bis 1×106 cmp/ml des Hybridisierungspuffers) durchgeführt worden.
-
Die
Scheiben sind dann zweimal in 2 × SSC, 0,2% SDS bei Raumtemperatur
(jede 20 Minuten) gewaschen worden und einmal in 0,2 × SSC, 0,1%
SDS bei 50°C
für 30
Minuten. Die Membranen sind dann auf Filterpapier platziert worden,
in Plastiktüten
eingewickelt worden und einem Film bei –20°C über Nacht ausgesetzt worden.
-
Die
positiven Klone sind identifiziert worden und gesammelt worden,
indem die Kolonien aus der Originalplatte ausgekernt wurden. Die
Kolonien sind in LB für
1 Stunde bei 37°C
inkubiert worden. Verdünnungen der
Kulturen sind auf LB Agarplatten ausplattiert worden und das Abheben
auf den Filter, die Hybridisierung, das Waschen, die Prozedur des
Kolonien Pickens ist wiederholt worden. Einzelne Klone aus dem zweiten Suchtest
sind gepickt worden und mit SalI/NotI verdaut worden, um die Größe der Inserts
zu bestimmen und die Inserts sind sequenziert worden.
-
Der
vollständige
Klon ist mit Hilfe der PCR mit Pfu-Polymerase unter Verwendung von
10 ng des sequenzierten Bibliotheksklon als Template und vollständigen Oligos
mit KpnI (FL 5' Oligo
SEQ, ID. NO. 3) und NotI (FL 3' Oligo
SEQ.ID.NO.4) Stellen erzeugt worden.
-
-
Das
PCR-Produkt ist mit KpnI und NotI Enzymen verdaut worden und in
einen pSP64T.GC Expressionsvektor kloniert worden. Präparationen
der DNA sind in großem
Umfang unter Verwendung eines MEGA-Prep-Kit (Quiagen) gemacht worden.
-
BEISPIEL 3:: Bibliothekenscreening/Bildung
von humanem VR3 A+B– und
humanem VR3 A–B–
-
Untersuchung der Bibliothek aus der humanen
Prostata:
-
Ein-Mikroliter
Aliquots der Bibliothek aus der humanen Prostata sind in Electromax
DH10B-Zellen (Life Technologies)
elektroporiert worden. Das Volumen ist auf 1 ml mit SOC-Medium angeglichen
worden und es ist für
45 Minuten bei 37°C
unter Schütteln
inkubiert worden. Die Bibliothek ist dann auf 150 cm2-Platten,
die LB enthalten, in einer Dichte von 20000 Kolonien pro Platte
ausplattiert worden. Diese Kulturen sind über Nach bei 37°C gezogen
worden.
-
Eine
Probe des humanen VR3-Rezeptors ist durch die Polymerasekettenreaktion
unter Verwendung der folgenden Primerpaare generiert worden:
-
Die
Probe ist durch eine PCR, die unter Verwendung normaler PCR-Bedingungen
erfolgte, die 5'-
und 3'-Probenoligos
(jedes 100 ng) und 10 ng der diluierten Miniprep-DNA verwendete,
erzeugt worden. Das resultierende 387 bp Fragment wurde auf einem
1%-igen Agarosegel laufen gelassen und unter Verwendung eines QUIAquick-Gelextraktionskit
(Quiagen) aufgereinigt. Ungefähr
100 ng der gereinigten Probe ist mit alpha 32P unter Verwendung
des Oligolabeling-Kits von Pharmacia markiert worden und die markierte
DNA ist dann auf S-200-Säulen
(Pharmacia) aufgereinigt worden.
-
Die
Bibliothekskolonien sind auf Protran Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schuel) abgehoben
worden und die DNA ist mit 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH denaturiert worden.
Die Filterscheiben sind dann mit 1,5 M NaCl, 1,0 M Tris-HCl, pH
7,5 neutralisiert worden und dann auf der Membran unter Verwendung
eines UV-Stratalinkers (Stratagene) durch UV quervernetzt worden.
Die Filter sind dann einige Male mit einer Waschlösung (1
M Tris-HCl, pH 8,0; 5 M NaCl; 0,5 M EDTA; 20% SDS) bei 42°C gewaschen
worden. Dann sind die Scheiben in einem 1 × Southern Prä-Hybridisierungspuffer
(5'-3' Inc), der 50% Formamid
und 100 μg/ml
gescherter Lachssperma-DNA (5'-3' Inc) enthält, für 6 Stunden
bei 42°C
inkubiert worden. Zum Schluss ist die Hybridisierung über Nacht
bei 42°C
in einem 1 × Hybridisierungspuffer
(5'-3'), der 50% Formamid,
100 ng gescherter Lachssperma-DNA enthält, in Gegenwart der markierten
Proben (5 × 105 bis 1 × 106 cmp/ml des Hybridisierungspuffers), durchgeführt worden.
-
Die
Scheiben sind dann zweimal mit 2 × SSC, 0,2% SDS bei Raumtempratur
(je 20 Minuten) gewaschen worden und einmal in 0,2 × SSC, 0,1%
SDS bei 50°C
für 30
Minuten. Die Membranen sind dann auf Filterpapier gelegt worden,
in Plastiktüten
eingewickelt worden und einem Film bei –20°C über Nacht ausgesetzt worden.
-
Die
positiven Klone sind identifiziert und gesammelt worden, indem die
Kolonien aus der Originalplatte ausgekernt wurden. Die Kolonien
sind in LB für
1 Stunde bei 37°C
inkubiert worden. Verdünnungen
der Kulturen sind auf LB Agarplatten ausplattiert worden und das
Abheben auf den Filter, die Hybridisierung, das Waschen, die Prozedur
des Kolonien Pickens ist wiederholt worden. Einzelne Klone aus dem
zweiten Suchtest sind gepickt worden und mit EcoRI/NotI verdaut
worden, um die Größe der Inserts
zu bestimmen und die Inserts sind sequenziert worden.
-
Der
vollständige
Klon ist mit Hilfe der PCR mit Pfu-Polymerase unter Verwendung von
10 ng des sequenzierten Bibliotheksklon als Template und vollständigen Oligos
mit NotI (FL 5' Oligo
SEQ, ID. NO.: 15) und XbaI (FL 3' Oligo
SEQ.ID.NO.: 16) Stellen erzeugt worden.
-
-
Das
PCR-Produkt ist mit NotI und XbaI Enzymen verdaut worden und in
einen pGem HE Expressionsvektor kloniert worden. Präparationen
der DNA sind in großem
Umfang unter Verwendung eines MEGA-Prep-Kit (Quiagen) gemacht worden.
-
BEISPIEL 4: Klonierung der humanen VR3-Rezeptor
cDNA in einem S äugetierexpressionsvektor
-
Die
humanen VR3-Rezeptor cDNAs (gemeinsam bezeichnet als hVR3) sind
in den Säugetierexpressionsvektor
pcDNA3.1/Zeo(+) kloniert worden. Das klonierte PCR-Produkt ist auf
einer Säule
(Wizard PCR DNA purification kit von Promega) aufgereinigt worden
und mit NotI und EcoRI (NEB) verdaut worden, um kohäsive Enden
zu bilden. Das Produkt ist durch eine Elektrophorese auf einem Agarosegel
mit geringem Schmelzpunkt aufgereinigt worden. Der pcDNA3.1/Zeo(+)-Vektor
ist mit NotI und XbaI (außer
für hVR3
A+B+, welcher in BamHI/NotI Stellen kloniert worden ist) Enzymen
verdaut worden und anschließend
auf einem Low Melting Point Agarose-Gel aufgereinigt worden. Der
lineare Vektor ist verwendet worden, um an die humanen VR3-cDNA-Inserts
ligiert zu werden. Die Rekombinanten sind isoliert worden, als humane
VR3-Rezeptor bezeichnet worden und verwendet worden, um Säugetierzellen
zu transfizieren (HEK293, COS-7 oder CHO-K1 Zellen) unter Verwendung
des Effectene non-liposomal lipid based transfection kit (Quiagen).
Stabile Zellklone sind durch das Wachstum in Gegenwart von Zeocin
selektiert worden. Einzelne Zeocin-resistente Klone sind isoliert
worden und es ist gezeigt worden, dass sie das intakte humane VR3-Rezeptorgen
umfassen. Klone, die die humaner VR3-Rezeptor cDNAs umfassen, sind
auf die hVR3-Proteinexpression hin analysiert worden. Rekombinante
Plasmide, welche die humane VR3-codierende DNA enthalten, sind verwendet
worden, um Säugetier-COS
oder CHO-Zellen oder HEK293 Zellen zu transformieren.
-
Die
den humanen VR3-Rezeptor exprimierenden Zellen, stabil oder transient,
sind verwendet worden, um auf die Expression des humanen VR3-Rezeptors
und die 3H-RTX-Bindungsaktivität hin zu testen. Diese Zellen
sind verwendet worden, um andere Verbindungen zu identifizieren
auf ihre Fähigkeit
hin und zu untersuchen, den humanen VR3-Rezeptor zu modulieren, zu inhibieren
oder zu aktivieren und die radioaktive 3H-RTX-Bindung zu kompetitieren.
-
Kassetten,
die die humane VR3-Rezeptor DNA in positiver Orientierung mit Hinblick
auf den Promotor enthalten, werden in geeignete Restriktionsstellen
3' vom Promotor
ligiert und durch Restriktionsstellen-Mapping und/oder Sequenzierung
identifiziert. Diese cDNA-Expressionsvektoren
sind in Fibroblasten Wirtszellen, zum Beispiel COS-7 (ATCC# CRL1651)
und CV-1 tat [Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987)], 293.
L (ATCC# CRL6362)] unter Verwendung von Standardmethoden, einschließlich, aber
nicht limitiert auf, Elektroporation oder chemische Verfahren (kationische
Liposomen, DEAE-Dextran, Calciumphosphat), eingefügt worden.
Transfizierte Zellen und Zellkulturüberstände werden geerntet und auf
die Expression des humanen VR3-Rezeptors hin analysiert, wie hierin
beschrieben.
-
Alle
Vektoren, die für
die transiente Säugetier-Expression
verwendet werden, können
verwendet werden, um stabile Zelllinien, die den humanen VR3-Rezeptor
exprimieren, zu etablieren. Es wird von den nicht-veränderten
humanen VR3-Rezeptor DNA-Konstrukten, die in Expressionsvektoren
kloniert sind, erwartet, dass sie die Wirtszellen dahingehend programmieren,
humanes VR3-Rezeptorprotein zu machen. Die Transfektions-Wirtszellen
umfassen, sind aber nicht limitiert auf, CV-1-P [Sackevitz et al.,
Science 238: 1575 (1987)] tk-L [Wigler, et al., Cell 11: 223 (1977)],
NS/O und dHFr-CHO [Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601, (1982)].
-
Die
Ko-Transfektion eines Vektors, der die humane VR3-Rezeptor-DNA umfasst,
mit einem Plasmid zur Arzneimittel-Selektion, umfassend, aber nicht
einschränkend,
G418, Aminoglycosid Phosphotransferase; Hygromycin, Hygromycin-B
Phospholtransferase; APRT, Xanthin-Guanin Phosphoribosyl-Transferase,
ermöglicht
die Selektion von stabil transfizierten Klonen. Die Mengen des humanen
VR3-Rezeptors werden durch die hierin beschriebenen Assays quantifiziert.
-
Humane
VR3-Rezeptor cDNA-Konstrukte werden auch in Vektoren ligiert, die
amplifizierbare Arzneimittelresistenzmarker für die Herstellung von Säugetierzellklonen
enthalten, die die höchstmöglichen
Mengen an humanen VR3-Rezeptor synthetisieren. Im Anschluss an die
Einfügung
dieser Konstrukte in Zellen werden die das Plasmid enthaltenden
Klone mit geeigneten Mittel selektiert und die Isolierung eines überexprimierenden
Klons mit einer hohen Kopieanzahl an Plasmiden erfolgt über die
Selektion einer zunehmenden Dosis des Mittels.
-
Die
Expression des rekombinanten humanen VR3-Rezeptors wird durch die
Transfektion der vollständigen
humanen VR3-Rezeptor cDNA in eine Säugetierwirtszelle erreicht.
-
BEISPIEL 5 – Charakterisierung des durch
pVR3R kodierten funktionalen Proteins in Xenopus-Oocyten
-
Xenopus
laevis Oocyten sind hergestellt worden und unter Verwendung von
zuvor beschriebenen und auf dem Fachgebiet bekannten Standardmethoden
(Fraser et al., 1993) injiziert worden. Die Ovarianlappen sind aus
den erwachsenen weiblichen Xenopus laevis (Nasco, Fort Atkinson,
WI) herausgearbeitet worden, einige Male mit dem Namen nach calciumfreier
Saline gespült
worden, umfassend: 82,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5
mM HEPES, mit NaOH (OR-2) auf pH 7,0 eingestellt und vorsichtig
OR-2 enthaltender 0,2% Collagenase Typ 1 (ICN Biomedicals, Aurora,
Ohio) für
2 bis 5 Stunden vorsichtig geschüttelt
worden. Wenn ungefähr
50% der follikulären
Schichten entfernt worden sind, sind Phase V und VI Oocyten selektiert worden
und mit Medium gespült
worden, das zusammengesetzt ist aus 75% OR-2 und 25% ND-96. Das
ND-96 enthält:
100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MagCl2, 1,8
mM CaCl2, 5 mM HEPES, 2,5 mM Na-Pyruvat,
Gentamicin (50 μg/ml),
mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt. Das extrazelluläre Ca+2 ist
allmählich
erhöht
worden und
1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES,
2,5 mM Na-Pyruvat, Gentamicin (50 μg/ml), mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt. Das
extrazelluläre
Ca+2 ist allmählich erhöht worden und die Zellen sind
für 2 – 24 Stunden
vor der Injektion in ND-96 gehalten worden. Für die in vitro Transkription
ist pGEM HE (Liman et al., 1992), welcher humanes VR3 enthält, mit
NheI linearitsiert worden und mit T7 RNA-Polymerase (Promega) in
der Gegenwart des Cap-Analogs m7G(5')ppp(5')G transkribiert worden. Die synthetisierte
cRNA ist mit Ammoniumacetat und Isopropanol präzipitiert worden und in 50 μl Nuklease-freiem
Wasser resuspendiert worden. Die cRNA ist unter Verwendung eines
Formaldehydgels (1% Agarose, 1 × MOPS,
3% Formaldehyd) in Abhängigkeit
eines 1,2 und 5 μl RNA-Marker
(Gibco BRL, 0,24 bis 9,5 Kb) quantifiziert worden.
-
Den
Oocyten ist 50 nl der humanen VR3-Rezeptor RNA (0,3 bis 5 ng) mit
oder ohne Ko-Injektion
des VR1 (2–3
ng) injiziert worden. Kontroll-Oocyten ist 50 nl Wasser injiziert
worden. Die Oocyten sind für
1 bis 13 Tage vor der Analyse auf die Expression des humanen VR3
hin in ND-96 inkubiert worden. Die Inkubationen und der Collagenase
Verdau ist bei Raumtemperatur durchgeführt worden. Die injizierten
Oocyten sind in 48 Loch Zellkulturclustern (Costar; Cambridge, MA)
bei 18°C
gehalten worden. Die Gesamtzell Agonisten-induzierten Ströme (whole
cell agonist-induced currents) sind 1 – 14 Tage nach der Injektion
mit einem herkömmlichen
Zwei-Elektroden Voltage Clamp (GeneClamp 500, Axon Instruments,
Foster City, CA) unter Verwendung von zuvor beschriebenen und auf
dem Fachgebiet bekannten Methoden (Dascal, 1987) gemessen worden.
Die Mikroelektroden sind mit 3 M KCl gefüllt worden, welche eine Resistenz
von 1 und 2 MΩ haben.
Die Zellen sind kontinuierlich mit ND96 bei ~10 ml/Minute, wenn
nicht anders angezeigt, bei Raumtemperatur durchgespült worden.
Die Membran-Spannung ist bei –70
mV gehalten worden, wenn nicht anders angezeigt.
-
Die
Oocyten sind mit einer Vielzahl von Liganden, geringem pH und Depolarisierungs-
als auch Hyperpolarisierungs-Spannungsschritten konfrontiert worden,
aber es waren keine detektierbaren Unterschiede in der Membran-Konduktanz
zwischen humanen VR3-exprimierenden
Oocyten und Kontrolloocyen [siehe Tabelle 1]. Jedoch zeigten die
mit dem humanen VR3 injizierten Oocyten Eigenschaften, die unterschiedlich
von denen der Kontrollen in vier Aspekten war. Erstens, die Injektion
der VR3 A+B– cRNA
verursachte den Tod der Oocyten. Die Viabilität der Oocyten, denen das A-Insert
enthaltenden VR3-Isoformen
injiziert worden ist, war signifikant reduziert im Vergleich zu
den Schwesterkontrollen 3 bis 4 Tage nach der Injektion (
9).
Zweitens, alle drei Isoformen des VR3 erhöhten die Hitze-induzierte Antwort
(
10). Drittens, die A+B– Ko-Injektion mit dem humanen
VR1 produzierte einen Rhuteniumrot sensitiven Perfusions-induzierten
Strom (I
perfusion) (
11). Viertens,
die Ko-Injektion von humaner VR3 A+B– cRNA mit humaner VR1 cRNA
veränderte
die Empfindlichkeit der Oocyten auf 1 μM Capsaicin, einem Agonisten
des VR1-Rezeptors (
12). TABELLE 1
Stimulus | VR3
A+B– (3,25–4 ng pro
Oocyte injiziert, wenn nicht anders angegeben) | VR3
A–B– (1,5 ng
pro Oocyte injiziert) | VR3
A+B+ (5 ng pro Oocyte injiziert) |
Capsaicin
(1 μM) | NE:
n = 3 (n = 3 0,4 ng) | NE:
n = 3 | NE:
n = 3 |
Eugenol
(10 μM) | NE:
n = 3 (n = 3 0,4 ng) | NE:
n = 3 | NE:
n = 3 |
Olvanil
(10 μM) | NE:
n = 3 (n = 1 0,4 ng) | NE:
n = 3 | NE:
n = 3 |
Resiniferatoxin
(1 μM) | NE:
n = 3 (n = 1 0,4 ng) | NE:
n = 3 | NE:
n = 3 |
Piperin
(10 μM) | NE:
n = 3 (n = 1 0,4 ng) | NE:
n = 3 | NE:
n = 3 |
Gingerol
(10 μM) | NE:
n = 3 (n = 1 0,4 ng) | NE:
n = 3 | NE:
n = 3 |
Guiaicol
(10 μM) | NE:
n = 3 (n = 1 0,4 ng) | NE:
n = 3 | NE:
n = 3 |
β-Phenylethylamin
(100 μM) | NE:
n = 2 | NT | NT |
γ-Hydroxybutyrat
(100 μM) | NE:
n = 2 | NT | NT |
Anandamid
(1,15 μM; RBI) | NE:
n = 3 (0,4 ng injiziert) | NE:
n = 1 | NT |
Arachodonsäure (10 μM) | NT | NE:
n = 3 | NT |
pH
4,5 bis 5,5 | NE:
n = 2 (4 ng cRNA): n = 1 (0,4 ng cRNA) | NE:
n = 1 | NE:
n = 1 |
Depolarisierung | Kein
Unterschied zur Kontrolle (n = 4) | Kein
Unterschied zur Kontrolle (n = 6) | Kein
Unterschied zur Kontrolle (n = 3) |
Hyperpolarisierung | Kein
Unterschied zur Kontrolle (n = 4) | Kein
Unterschied zur Kontrolle (n = 6) | Kein
Unterschied zur Kontrolle (n = 3) |
NE:
Keine Wirkung
NT: Nicht getestet | | | |
-
Viabilität.
-
Die
funktionale Expression der humanen VR3-Isoformen in Xenopus Oocyten
ist gezeigt: Die Viabilität von
Oocyten, gehalten in 2 Ca2+ enthaltendem
ND-96, war 4 bis 6 Tage nach der Injektion mit VR3 A+B– (3,25 ng)
und VR3 A+B+ ( 5 ng), aber nicht VR3 A–B– (1,5 ng) cRNA signifikant
vermindert. Die Daten für
VR3 A+B– und
Wasser-injizierten Kontroll-Oocyten
waren in fünf
separaten Experimenten ähnlich
und wurden kombiniert. Die toten Oocyten sind visuell unter Verwendung
eines Bauch and Lomb Stereo-Mikroskop bestimmt worden. Die Daten
sind unter Verwendung des Chi-Quadrattestes analysiert worden. Die
VR3 A+B– injizierten
Oocyten waren die am wenigsten lebensfähigen. Ungefähr nur 9%
der Oocyten überlebten
bis 4 bis 6 Tage nach der Injektion. Ungefähr 33% der Oocyten, denen humanes
VR3 A+B+ injiziert worden war, überlebten
4 bis 6 Tage nach der Injektion. Ungefähr 67% der Wasser-injizierten
Schwester-Kontroll-Oocyten überlebten
die gleiche Zeitperiode unter den im Wesentlichen identischen Bedingungen.
Die VR3 A–B– injizierten
Oocyten zeigten eine ähnliche
Lebensfähigkeit
wie die Wasser-injizierten Kontrollen. Ähnliche Daten sind aus zwei
separaten Chargen von cRNA erhalten worden.
-
Hitzeempfindlichkeit.
-
Gezeigt
ist die funktionale Expression der humanen VR3-Isoformen in Xenopus
Oocyten: Aktivierung durch Hitze. (a). Gezeigt ist der durchschnittliche
Höchststrom,
der von einem Hitzeanstieg von 25°C
bis 46°C ausgelöst wurde
und bei 46°C
für mindestens
15 Sekunden aufrechterhalten wurde. Spannungsanstiege von –120 bis
+80 mV über
400 mSek. sind bei einer Abtastfrequenz von 2 Sek. angelegt worden.
Der gezeigte Strom war die Erhöhung
des Stroms über
und oberhalb des anfänglichen
Stromes, ausgelöst
bei +80 mV (der ganz rechte Punkt auf der in (b) gezeigten Stromspannungskurve).
Den Oocyten ist jeweils 3,25, 1,5 und 5 ng VR3 A+B–, A–B– und A+B+
cRNA injiziert worden und 6 Tage später erfasst worden. Ausgefüllter Balken:
Wasser-injizierte Kontrollen (n = 8); leerer Balken. VR3 A+B– Isoform
(n = 11); schraffierter Balken: VR3 A–B– Isoform (n = 8); gepunkteter
Balken: VR3 A+B+ Isoform (n = 5). Alle Isoformen zeigten eine signifikante
Erhöhung über die
Wasser-Kontrolle (p = jeweils 0,001, 0,03 und 0,007). Die Hitze-induzierte
Antwort war ungefähr
zweifach höher
in der A+B– Isoform
im Vergleich zu den anderen zwei Isoformen, aber die Unterschiede
waren nicht signifikant (p = jeweils 0,051 und p = 0,16 für A+B– im Vergleich
zu A–B– und A+B+).
Die Daten sind aus zwei Sets von injizierten Oocyten erhalten worden.
Die gezeigten Daten sind der Mittelwert und die Standardabweichung
des Mittelwertes (b). Die durch Spannungsanstiege induzierten Ströme sind
während
der Anbringung der zunehmenden Hitze auf die mit Wasser injizierten
Oocyten aufgezeichnet worden (oben), VR3 A+B– (zweite von oben), VR3 A–B– (drittes
von oben) und VR3 A+B+ (unten). Die Oocyten sind konstant mit Ca2+ ND-96
gespült
worden und die Lösung
ist durch einen inline heater (TC-324B in Verbindung mit dem SH-27A inline
heater; Warner Instrument Corp.) erhitzt worden. Die Anstiegs-induzierten
Ströme
(in microAmpere, wie auf der y-Achse angezeigt) erhalten bei Temperaturen
von 37°C
bis 46°C,
sind gezeigt; nur die Stromspuren bei den höheren Temperaturen sind mit
der entsprechenden Temperatur gekennzeichnet worden.
-
Perfusions-induzierte Ströme (Iperfusion: 11).
-
Der
Beginn der Badperfusion löste
eine Erhöhung
der Membran-Konduktanz in den Oocyten aus, denen RNA injiziert worden
waren, die von dem klonierten humanen VR1 transkribiert worden war
mit und ohne RNA transkribiert von der VR3 A+B– Rezeptor cDNA, wie in 11 gezeigt. Eine mit VR1 cRNA (a) injizierte Oocyte
ist einen Spannungsanstieg zwischen –120 und +80 mV über 400
mSek. unterworfen worden. Die spannungsinduzierten Ströme sind
nach dem Beginn der Perfusion der Oocyten mit einer Rate von 10
ml/Min. erhöht
worden. Kontroll-Anstiegsinduzierte Ströme von Oocyten in unbewegter
extrazellulärer
Saline (C) sind vor dem Beginn der Badperfusion von Ca2+ ND-96 aufgezeichnet
worden. Während
der Perfusion waren die Anstiegs-induzierten Ströme erhöht, was auf eine Erhöhung des
elektrischen Leitwerts hinweist (P). Die anschließende Perfusion
mit 10 μM
Rhuteniumrot (RR) blockierte den Perfusions-induzierten Strom (P)
in den VR1 exprimierenden Oocyten nicht. Somit war der in den lediglich
VR1 exprimierenden Oocyten beobachtete Perfusionsinduzierte Strom
unempfindlich gegenüber
10 μM Rhuteniumrot
(A, "RR"). Jedoch war der
Perfusions-induzierte Strom, der in VR3 A+B– und VR1 exprimierenden Oocyten
ausgelöst
wurde, drastisch durch 10 μM
Rutheniumrot (B, "RR") inhibiert. Dieser
Unterschied ist in 6 Oocyten beobachtet worden. Diese Blockierung
war teilweise reversibel (nicht gezeigt). (b) Eine zusammen mit
VR3 A+B– VR1
cRNA injizierte Oocyte ist einem Spannungsanstieg zwischen –120 und
+80 mV über
400 mSek. unterworfen worden. Die Anstiegs-induzierten Ströme sind
nach dem Beginn der Perfusion der Oocyten mit einer Rate von 10
ml/Min. erhöht
worden. Die Perfusions-aktivierten Ströme hatten ähnliche Größen in beiden Sets von Oocyten.
Vrev für
RR-inhibierten Strom war ungefähr –13 mV (Pfeil).
Die durch beide Agonisten induzierten Ströme wurden stark nach außen gleichgerichtet,
wie zuvor für
den Ratten-VR1 (Caterina et al., 1997) berichtet wurde.
-
Capsain-induzierte Ströme in den humanen VR1 exprimierenden
Oocyten in Gegenwart oder Abwesenheit von humanem VR3 A+B– (12).
-
Die
durch 1 μM
Capsaicin (12) ausgelösten Ströme sind bei einer elektrischen
Haltespannung von +50 mV gemessen worden, da die Antworten bei dieser
elektrischen Spannung aufgrund der profunden Auswärtsgleichrichtung
der Capsaicin-induzierten Ströme
(Caterina et al., 1997) am größten waren.
Gezeigt sind drei Beispiele von mit VR1 und Wasser-(eine Kontrolle
für die
VR3-Injektion) injizierten Oocyten (a) und mit VR1 cRNA und VR3
A+B– cRNA
injizierten Oocyten (b). Das Capsaicin ist im Bad während der
durch die ausgefüllten
horizontalen Balken angezeigten Zeit hinzugefügt worden. Die Höhe der ersten
Antwort auf 1 μM Capsaicin
ist vermindert worden, wenn die VR1 cRNA mit VR3 A+B– cRNA in
gleichen Teilen (2,9 ng jedes) ko-exprimiert worden war. Der bemerkenswerteste
Unterschied war die Höhe
und die Abklingrate der zweiten Antwort, der zweite kleine Hügel ist üblicherweise
zu Beginn des Auswaschens des Capsaicins erhalten worden.
-
BEISPIEL 6 Charakterisierung des humanen
VR3 in Säugetierzelllinien
-
Humane
HEK293, CHO-K1 und COS-7 Zellen sind mit den humanen VR3-Isoformen
pVR3A+B–R, pVR3A–B–R oder
pVR3A+B+R transfiziert worden. Transiente Transfektionen von 1 μg pVR3R pro
106 Zellen pro 100 mm-Platte sind unter
Verwendung des Effectene Transfektions-Kit (Quiagen; 301425) durchgeführt worden.
Drei Tage nach der Transfektion sind die Zellen auf eine 96-Lochplatte
(Biocoat, poly-D-Lysine beschichtet black/clear Platte; Becton Dickinson
Part # 354640) ausplattiert worden. Nach einem Tag sind die Löcher mit
F-12/DMEM gespült worden,
dann in Fluo-4 (2 μM)
mit Pluronic F-127 (20%, 40 μl
sind in 20 ml Gesamtvolumen verwendet worden) für 1 Stunde bei Raumtemperatur
inkubiert worden. Die Platten sind unter Verwendung des FLIPR (Molecular
Devices, FL-101) untersucht worden. Die Zellen sind Lösungen mit
unterschiedlicher Osmolarität
(40 μl sind
80 μl bei
einer Geschwindigkeit von 50 μl/Sek.
hinzugefügt
worden) unterworfen worden. Einige Löcher sind energisch gemischt
worden, um eine erhöhte
Perfusion der Zellen mit der extrazellularen Lösung zu simulieren. Transfektanten
mit dem Vektor alleine sind als Kontrollen verwendet worden.
-
Nach
drei Tagen sind die Zellen in der Gegenwart von Neomycin (200 μg/ml) selektiert
worden und sind über
drei 1:10 Verdünnungspassagen
für ungefähr 2 Wochen
gezogen worden. Einzelne Kolonien sind gepickt worden und in 6-Lochplatten
gezogen worden. Die Zellen sind dann in 96-Lochplatten (Bicoat,
poly-D-Lysine coated black/clear plate; Becton Dickinson Part #
354640) ausplattiert worden und drei Tage bis zur Konfluenz gezogen
worden. Die Löcher
sind mit F12/DMEM gespült
worden, dann in Fluo-4 (2 μM)
mit Pluronicsäure
(20%, 40 μl
sind in 20 ml Gesamtvolumen verwendet worden) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert
worden. Die Platten sind dann unter Verwendung des FLIPR (Molecular
Devices, FL-101) untersucht worden. Die Zellen sind mit Agonisten
(bei einer dreifachen Konzentration in 40 μl je 80 μl bei einer Geschwindigkeit
von 50 μl
pro Sekunde hinzugefügt)
behandelt worden.
-
Die
Whole-Cell Patch-Clamp-Technik (Hamill et al., 1981) ist verwendet
worden, um Liganden-induzierte Ströme aus den den humanen VR3-Rezeptor
stabil exprimierenden HEK293-Zellen, die zwei Tage auf 12 mm Deckgläsern gehalten
worden sind, aufzuzeichnen. Die Zellen sind unter Verwendung einer
Nikon Diaphot 300 mit DIC Nomarski Optics visualisiert worden. Die
Zellen sind kontinuierlich in einer physiologischen Salzlösung (–0,5 ml/Min.)
perfusioniert worden, wenn es nicht anders angezeigt wurde. Die
physiologische Standardsaline ("Tyrodes") enthält: 130
mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2 und 10 mM hemi-Na-HEPES (pH 7,3, 295–300 mOsm,
gemessen unter Verwendung einer Wescor 5500 vapor-Pressure (Wescor.
Inc., Logan, UT). Die aufnehmenden Elektroden sind aus Borosilikat
Kapillarröhren
hergestellt worden (R6; Garner Glass, Claremont, CA), die Spitzen
sind mit Dentalperipheriewachs beschichtet (Miles Laboratories,
South Bend, IN) und haben eine Resistenz von 1 bis 2 MΩ, wenn sie
eine intrazelluläre
Saline enthalten: 100 mM K-Gluconat, 25 mM KCl, 0,483 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 10
mM hemi-Na-HEPES und 1 mM K4-BAPTA (100
nM freies Ca2 +);
pH 7,4, mit hinzugefügter
Dextrose, um 290 mOsm zu erhalten). Die Liquid Junction Potentiale
sind –18
mV unter Verwendung von Standardpipetten und Badlösungen,
wie sowohl empirisch als auch unter Verwendung eines Computerprogramms
JPCalc ((Barry, 1994)) bestimmt wurde. Alle gezeigten elektrischen
Spannungen sind in Bezug auf die Liquid Junction Potentiale nachgebessert
worden. Die Ströme
und die elektrischen Spannungs-Signale sind bei 2 kHz mit einem
Axopatch 1D Patchclamp amplifier (Axon Instruments, Foster City,
CA) detektiert und gefiltert worden, digital mit einer DigiData
1200B Laborstory Interface (Axon Instruments) und PC-kompatible Computersysteme
aufgezeichnet worden und auf magnetischen Disks für die Offline-Analyse
gespeichert worden. Die Daten-Akquisition und Analysen sind mit der
PClamp-Software durchgeführt
worden. Kleine Änderungen
in dem Haltestrom sind bei 2 kHz detektiert und gefiltert worden
und mit einer LPF202A DC Amplifier (Warner, Hamden, CT) detektiert
und einem VR10B Digital Data Recorder (Instrutech, Great Neck, NY)
auf einem Videoband aufgezeichnet worden. Das Signal ist später bei
10 Hz unter Verwendung der Axotape Software analysiert worden.
-
Die
Gesamtmembrankapazität
(Cm) wird bestimmt als die Differenz zwischen
dem Maximalstrom nach einem 30 mV hyperpolarisierenden Spannungsanstieg
von –68
mV, erzeugt bei einer Rate von 10 mV/ms und einem Steady State Strom
bei einem endgültigen
Potential (–98
mV) (Dubin et al. 1999).
-
Sichtbare
Umkehrpotentiale (Vrev) der Liganden-induzierten
Konduktanz-Änderungen
sind unter Verwendung eines Spannungsanstiegs-Protokolls bestimmt
worden (Dubin et al., 1999). Die Spannungsanstiege sind jede Sekunde
angelegt worden und die resultierenden Gesamt-Zell Anstiegs-induzierten Ströme (whole cell
ramp-induced current) sind aufgezeichnet worden. Üblicherweise
erfolgte der Spannungsanstieg von negativen zu positiven zu negativen
Werten. Der Strom erforderte, dass die Zellen bei –68 mV geklemmt
wurden und kontinuierlich beobachtet wurde. Die Liganden-induzierten
Leitwerte sind aus Whole-Cell Strömen bestimmt worden, die durch
ein Spannungsanstiegs-Protokoll in Gegenwart oder Abwesenheit der
Liganden ausgelöst
wurden. Die Spannungsanstiegs-induzierten Ströme, die vor (Kontrolle) und
in Gegenwart der Liganden gemessen worden sind, sind verglichen
worden, um den Effekt der Liganden auf den Kanal zu zeigen, um den Kanalstromoutput
zu modulieren. Die elektrische Spannung, bei welcher kein Netto
Liganden-induzierter Strom vorliegt, ist bestimmt worden (Vrev).
-
BEISPIEL 7 – Primäre Struktur des humanen VR3-Rezeptorproteins
-
Die
vorliegende Erfindung beschreibt drei Isoformen des hVR3: A+B–, A–B– und A+B+.
Die Nukleotidsequenzen der humanen VR3-Rezeptor cDNAs zeigten einzelne
große
offene Leserahmen von ungefähr 2616,
2436 und 2229 Basenpaaren, die entsprechend 871, 811 und 742 Aminosäuren des
humanen VR3 A+B–,
A–B– und A+B+
kodieren. Die cDNA für
VR3 A+B– hat
5' und 3' untranslatierte
Verlängerungen
von ungefähr
337 und ungefähr
547 Nukleotiden. Die cDNA für
VR3 A+B+ hat 5' und
3' untranslatierte
Verlängerungen
von ungefähr
836 und ungefähr
994 Nukleotiden. Das erste in-frame Methionin ist als Anfangscodon
für einen
offenen Leserahmen bestimmt worden, der humane VR3-Rezeptorproteine
mit einer geschätzten
Molekularmasse (Mr) von ungefähr jeweils
98,242 Da, 91,294 Da und 83,310 Da für die Isoformen A+B–, A–B– und A+B+
voraussagt. Die A+B– Isoform
kodiert am Protein mit 871 Aminosäuren. Der VR3 A–B– enthält eine
Deletion von 60 Aminosäuren
von der Aminosäure
382 bis 441 des VR3 A+B–.
Der VR3 A+B+ ist identisch zum A+B–, bis zur Aminosäure 736,
nach welcher sechs divergente Aminosäuren und ein Stoppcodon folgen.
Die VR3 A+B+ Isoform ist um 20 Aminosäuren nach der vermeintlichen
TM6 erweitert.
-
Die
vorausgesagten humanen VR3-Rezeptorproteine sind mit Nukleotid-
und Protein-Datenbanken abgeglichen
worden und es ist gefunden worden, dass sie zu der Vanilloid-Rezeptorfamilie (VR1
und VR2) in Beziehung stehen. In dieser Familie von Rezeptoren werden
einige konservierte Motive gefunden, einschließlich eines großen putativen
N-terminalen hydrophilen
Segments (ungefähr
467 Aminosäuren),
drei putativen Ankyrin-Repeat-Domänen in der
N-Terminusregion, sechs vorausgesagte Transmembranregionen und einer Kernregion.
Der VR3 A+B– ist
43% identisch zum humanen VR1, 39% identisch zu sowohl dem humanen VRL-1
(AF129112) und dem humanen VRL (AF103906). Somit ist der hierin
beschriebene VR3-Rezeptor klar ein neues Gen der Vanilloid-Rezeptorfamilie.
-
Die
VR3 A+B– und
VR3 A–B– Formen
sind dem Dehnungs-inhibierbaren Ratten Kanal SIC [Genbankakzession
Nr. AB015230] von der Aminosäure
694 bis zum Ende sehr ähnlich.
Es wurde davon ausgegangen, dass SIC, kodiert durch 529 Aminosäuren, einen
durch Dehnung inhibierbaren Innenkanal bildet. Ihm fehlt die große N-terminale
cytoplasmatische Domäne
der VR-Familie, aber er enthält
Sequenzhomologe zu dem A Exon vor der mutmaßlichen TM1.
-
Die
hierin beschriebene vollständige
genomische Sequenz der VR3-kodierenden Regionen kann auch in einer
380512 Basenpaar Sequenzeingabe bei der Genbank gefunden werden
(Homo Sapiens Klon RPCI1-7G5 (AC007834), direkte Eingabe durch Worley,
K. C.). Dieser Genbankeintrag listet viele Fragmente einer DNA-Sequenz
und eine vorgeschlagene kontinuierliche Sequenz auf, aber ihm fehlt
jegliche Analyse der Nukleinsäuresequenz
und ihm fehlt eine Charakterisierung der Eigenschaften der VR3-Nukleinsäuresequenzen
noch beschreibt er das Vorhandensein des VR3-Gens.
- 1 Ein Vergleich der erfindungsgemäßen Sequenzen und der genomischen
Sequenz zeigt, dass das VR3-Gen aus mindestens 15 Exons zusammengesetzt
ist. "A" ist ein 60 Aminosäuren Insert
in der mutmaßlichen
N-terminalen cytoplasmatischen Domäne, die in den cDNAs gefunden
wurde, die aus den cDNA-Bibliotheken sowohl aus der Hypophyse als
auch der Prostata erhalten wurden. Es gibt Intron/Exon Rand-Sequenzen an den
A- und B-Inserts.
-
Die
A+B– und
A+B+ Isoformen enthalten eine Domäne in der N-terminalen putativen
cytoplasmatischen Region mit Homologie zu den Konsensussequenzen
von Ankyrin Repeat-Domänen. Somit
scheinen die VR3 A+ Isoformen eine ähnliche Architektur zu haben,
wie für
den VR1 vorausgesagt wird. Die erste Domäne war signifikant ähnlich der
Konsensussequenz (E = 2,6 e-5). Die nächsten zwei Domänen waren
für sich
genommen nicht signifikant (e = 37 und E = 2,7), jedoch als Ganzes
genommen enthält
diese Region vermutlich drei Ankyrin- Bindungsdomänen. Der A– Isoform fehlen 20 Aminosäuren der
putativen dritten Ankyrin-Wiederholungs-Domäne und die
nebeneinander gestellten Sequenzen sind nicht übereinstimmend mit Ankyrin
Repeat Domainen.
-
Die
VR3 A+B– Isoform
hat zwei möglichte
Myristoylierungsstellen: [GPGGE] N-Terminal und zwischen der TM4
und TM5. Putative Phosphorylierungsstellen umfassen: sieben mögliche PKC-Phosphorylierungsstellen:
T112, S134, T175, T190, T380, S403, S688 [jedoch ist das S688 in
einer putativen extrazellulären
Region]: eine mögliche
PKA- und PKG-Phoysphorylierungsstelle:
T181; 12 potentielle Caseinkinase II Phosphorylierungsstellen: T89,
S162, T181, T395, S416, S422, S432, T426, S432, S441, T740, S836;
drei potentielle Brustdrüsen
Caseinkinase Phosphorylierungsstellen (S × E): S4, S726, S758; eine
potentielle Tyrosinkinase Phosphorylierungsstelle: Y411 [vorhanden
in dem "A"-Insert]; und eine
potentielle N-verknüpfte
Glycosylierungsstelle: N651, [N201, N207 sind in der putativen intrazellulären N-terminalen
Domäne
und werden recht unwahrscheinlich glycosyliert]. Es gibt keine putativen
CaM-Bindungsdomänen
in einer in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Isoform.
-
In
der A– Isoform,
welcher das "A"-Insert fehlt, fehlen
2 PKC-Phosphorylierungsstellen, 6 Caseinkinase-II-Phosporylierungsstellen
und die einzige putative Tyrosinkinase Phosphorylierungsstelle.
-
Die
A+B+ Isoform kodiert ein putatives Protein, dem zwei Caseinkinase-II-Phosphorylierungsstellen
in der C-terminalen putativen intrazellulären Region fehlen.
-
BEISPIEL 8 – Expression des humanen VR3
in Geweben
-
Expression
unter Verwendung eines DNA-Arrays (Luo et al., 1999). Eine DNA-Array
Verteilungsanalyse zeigt, dass humane VR3 mRNAs in einer Vielfalt
von Geweben exprimiert worden sind und dass es einige Überlappungen
der Expression mit VR1 auf Gesamtgewebeebene gibt [
13]. Die cRNA aus der Gewebe-Art, die in der linken
Säule angezeigt
ist, enthält
Sequenzen, die humanes VR3 (mittlere Säule) kodieren. Die Expression
des humanen VR1 ist in der rechten Säule gezeigt und die meisten
Fälle überlappte
sie mit der VR3-Expression. Bemerkung: NS war eine nicht-signifikante
Expression des humanen VR1. Die Sequenz der humanen VR3 DNA, die
auf den DNA-Arrays immobilisiert war, (SEQ.ID.NO.:17)
-
Diese
DNA-Sequenz ist in A+B+ nicht vorhanden, sondern nur in den A+B– und A–B– Isoformen.
Es ist zu beachten, dass die cDNA-Spezies aus der Prostatadrüse kloniert
worden ist (*; 13).
-
Die
Northern-Blot-Analyse zeigte eine Expression des VR3 im gesamten
Gehirn, der Plazenta, der Lunge, den Nieren, des Pankreas und der
Prostata.
-
BEISPIEL 9 – Klonierung der humanen VR3-Rezeptor-cDNA
in E. coli Expressionsvektoren
-
Der
rekombinante humane VR3-Rezeptor ist in E. coli im Anschluss an
den Transfer der humanen VR3-Rezeptor Expressionskassette in E.
coli-Expressionsvektoren, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf,
der pET-Serie (Novagen), hergestellt worden. Der pET-Vektor bringt
die Expression des humanen VR3-Rezeptors unter Kontrolle des stark
regulierten Bakteriophagen T7 Promotors. Im Anschluss an den Transfer
dieses Konstruktes in den E. coli Wirt, der eine chromosomale Kopie
des T7 RNA Polymerasegens umfasst, welches durch den induzierbaren
lac-Promotor getrieben wird, wird die Expression des humanen VR3-Rezeptors induziert,
wenn ein geeignetes lac-Substrat (IPTG) der Kultur hinzugefügt wird.
Die Mengen des exprimierten humanen VR3-Rezeptors werden durch die
hierin beschriebenen Assays bestimmt.
-
Die
cDNA, welche den gesamten offenen Leserahmen für den humanen VR3-Rezeptor
kodiert, wird in die NdeI-Stelle des pET [16]11a eingesetzt. Konstrukte
in der positiven Orientierung werden durch Sequenzanalysen analysiert
und verwendet, um den Expressions-Wirtstrang BL21 zu transformieren. Die
Transformanten werden dann verwendet, um Kulturen für die Herstellung
des humanen VR3-Rezeptorproteins zu beimpfen. Die Kulturen können in
M9- oder ZB-Medien wachsen, dessen Formulierungen jenen auf dem
Fachgebiet bekannt sind. Nach dem Wachstum bis zu einer OD600= 1,5 wird die Expression des humanen
VR3-Rezeptors mit 1 mM IPTG für
3 Stunden bei 37°C
induziert.
-
BEISPIEL 10 – Klonierung der humanen VR3-Rezeptor
cDNA in einen Baculovirus Expressionsvektor für die Expression in Insektenzellen
-
Baculovirus
Vektoren, welche aus dem Genom des AcNPV-Virus erhalten werden,
sind so gestaltet, dass sie die Expression von cDNA in der Sf9-Linie
von Insektenzellen (ATCC CRL# 1711) in hohen Mengen ermöglichen.
Rekombinante Baculoviren, welche die humane VR3-Rezeptor cDNA exprimieren,
werden durch die folgenden Standardmethoden hergestellt (In Vitrogen
Maxbac Manual): die humanen VR3-Rezeptor cDNA-Konstrukte werden
in das Polyhedringen in einer Vielzahl von Baculovirus Transfervektoren
ligiert, einschließlich
des pAC360 und des BlueBac-Vektors (In Vitrogen). Rekombinante Baculoviren
werden durch die homologe Rekombination im Anschluss an die Ko-Transfektion
des Baculovirus Transfervektors und des linearisierten AcNPV genomische
DNA [Kitts, P.A., Nuc. Acid. Res. 18: 5667 (1990)] in Sf9-Zellen
erzeugt. Rekombinante pAC360 Viren werden durch die Abwesenheit
von Inklusionskörpern
in infizierten Zellen identifiziert und rekombinante pBlueBac Viren
werden auf der Basis der β-Galactosidase
Expression identifiziert (Summers, M.D. und Smith, G.E., Texas Agriculture
Exp. Station Bulletin Nr. 1555). Im Anschluss an die Plaquereinigung
wird die humane VR3-Rezeptorexpression durch die hierin beschriebenen
Assays gemessen.
-
Die
cDNA, welche den gesamten offenen Leserahmen für den humanen VR3-Rezeptor
kodiert, wird in die BamHI-Stelle des pBlueBacII insertiert. Konstrukte
in einer positiven Orientierung werden durch Sequenzanalyse identifiziert
und verwendet, um Sf9-Zellen in Gegenwart der linearen AcNPV-Wildtyp-DNA
zu transfizieren.
-
Echter
aktiver humaner VR3-Rezeptor wurde im Cytoplasma der infizierten
Zellen gefunden. Der aktive humane VR3-Rezeptor wird aus den infizierten
Zellen durch hypotone oder Detergentien-Lyse extrahiert.
-
BEISPIEL 11 – Klonierung der humanen VR3-Rezeptor
cDNA in einem Hefe-Expressionsvektor
-
Der
rekombinante humane VR3-Rezeptor wird in der Hefe S. cerevisiae
im Anschluss an die Insertion des optimalen humanen VR3-Rezeptor
cDNA Cistrons in Expressionsvektoren hergestellt, die so gestaltet sind,
dass sie die intrazelluläre
oder extrazelluläre
Expression des heterologen Proteins regeln. Im Fall der intrazellulären Expression
werden Vektoren, wie zum Beispiel EmBLyex4 oder ähnliche an das humane VR3-Rezeptor
Cistron ligiert [Rinas. U. et al., Biotechnology 8: 543–545 (1990);
Hornwitz B. et al., J. Biol. Chem. 265: 4189–4192 (1989)]. Für die extrazelluläre Expression
wird das humane VR3-Rezeptor Cistron in Hefe-Expressionsvektoren ligiert, die ein
Sekretionssignal (ein Hefe- oder Säugetierpeptid) an den NH2-Terminus des humanen VR3-Rezeptorproteins
fusionieren [Jacobson, M. A., Gene 85: 511–516 (1989); Riett L. und Bellon
N. Biochem. 28: 2941–2949
(1989)].
-
Diese
Vektoren umfassen, sind aber nicht limitiert auf pAVE1>6, welche das humane
Serum-Albumin-Signal
an die exprimierte cDNA fusionieren [Steep O. Biotechnology 8: 42–46 (1990)]
und der Vektor pL8PL, welcher das humane Lysozym-Signal an die exprimierte
cDNA fusioniert [Yamamoto. Y., Biochem. 28: 2728–2732]. Darüber hinaus wird der humane
VR3-Rezeptor in Hefe als ein Fusionsprotein exprimiert, welches
an Ubiquitin unter Verwendung des Vektors pVEP konjugiert ist [Ecker,
D. J., J. Biol. Chem. 264: 7715–7719
(1989), Sabin, E. A., Biotechnology 7: 705–709 (1989). McDonell D. P.,
Mol. Cell Biol. 9: 5517–5523 (1989)].
Die Mengen des exprimierten humanen VR3-Rezeptors werden durch die
hierin beschriebenen Assays bestimmt.
-
BEISPIEL 12 – Reinigung des rekombinanten
humanen VR3-Rezeptors
-
Rekombinant
hergestellter humaner VR3-Rezeptor kann durch eine Antikörper-Affinitätschromatographie
gereinigt werden.
-
Humane
VR3-Rezeptor Antikörper-Affinitätssäulen werden
gemacht, indem anti-humane VR3-Rezeptor Antikörper dem Affigel-10 (Bio-Rad)
hinzugefügt
werden, eine Gelauflage, die mit N-Hydroxysuccinimidestern voraktiviert
ist, so dass die Antikörper
kovalente Bindungen mit der Agarose-Gelkügelchen-Auflage bilden können. Die
Antikörper
werden dann an das Gel via Amidbindungen mit dem Spacerarm gekoppelt.
Die verbleibenden aktivierten Ester werden dann mit 1M Ethanolamin
HCl (pH 8) gequenscht. Die Säule
wird mit Wasser gewaschen, gefolgt durch 0,23 M Glycin HCl (pH 2,6),
um jeglichen nicht-konjugierten
Antikörper
oder irrelevantes Protein zu entfernen. Die Säule wird dann mit phosphatgepufferter
Saline (pH 7,3) zusammen mit geeigneten die Membran lösenden Mitteln,
wie zum Beispiel Detergentien equilibriert, und der Zellkulturüberstand
oder Zellextrakt, welcher gelösten
VR3-Rezeptor enthält,
wird langsam über
die Säule
gegeben. Die Säule
wird dann mit phosphatgepufferter Saline, zusammen mit Detergentien,
gewaschen bis die optische Dichte (A280) bis auf Hintergrundsignale
abnimmt, dann wird das Protein mit 0,2 M Glycine-HCl (pH 2,6) zusammen
mit Detergentien eluiert. Das aufgereinigte humane VR3-Rezeptorprotein
wird dann gegen phosphatgepufferte Saline dialysiert.
-
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