DE60132571T2 - Für den menschlichen vanilloid-rezeptor vr3 kodierende dns - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gesundheitsschädliche chemische, thermische und mechanische Reize regen periphere Nervenendigungen von sensorischen Neuronen mit geringem Durchmesser (Nozizeptoren) in sensorischen Ganglien (zum Beispiel Dorsalwurzel, Ganglion Nodosum und Nervus Trigeminus) an und initiieren Signale, die als Schmerz wahrgenommen werden. Diese Neuronen sind für die Detektion von schädlichen oder potenziell schädlichen Reizen (Hitze) und Gewebeschäden (H+ (Acidose im lokalen Gewebe) und/oder Dehnung) wichtig, welche sich als Änderungen im extrazellulären Raum bei entzündlichen oder ischämischen Bedingungen ergeben (Wall und Melzack, 1994). Das Vanilloid-Capsaicin (8-Methyl-N-vanillyl-6-nonenamid), der scharfe Hauptbestandteil in "scharfen" Capsicum Pfeffern, ist ein sehr selektiver Aktivator der dünnen oder unmyelinierten nozizeptiven Afferenzen (Szolcsanyi, 1993; Szolcsanyi, 1996). Elektrophysiologische Studien haben gezeigt, dass Vanilloide kleine sensorische Neuronen durch die Aktivierung eines Plasmamembran- Kanals anregen, der nicht selektiv permeabel für Kationen ist (Bevan und Szolcsanyi, 1990; Oh et al., 1996; Wood et al., 1988). Das ultra potente tricyclische Diterpen Resiniferatoxin aus Euphorbia Pflanzen (RTX; (Szolcsanyi et al., 1991)) bindet mit einer nanomolaren Affinität an die Capsaicin-Bindungsstelle und hat eine örtlich sehr begrenzte Verteilung der Capsaicin-Rezeptoren auf somatischen und visceralen primären sensorischen Ratten Neuronen gezeigt (Szallasi, 1995).
  • Man glaubt, dass der Vanilloid-Rezeptor VR1 (Caterina et al., 1997) ein Wärme-sensorischer Rezeptor ist, dessen Reizschwelle in der Gegenwart von Protonen oder Capsaicin erniedrigt ist (Tominaga et al., 1998). Das Capsaicin und die Protonen interagieren mit spezifischen Membran-Erkennungsstellen (Vanilloid-Rezeptoren), die annähernd ausschließlich von primären sensorischen Neuronen exprimiert werden, die in der Nozizeption und neurogen Entzündung involviert sind (Bevan und Szolcsanyi, 1990). Der Vanilloid-("Capsaicin") Rezeptor VR1 wird durch Capsaicin und RTX aktiviert und die Aktivierung des VR1 wird durch die Antagonisten Capsazepine (CPZ; (Bevan et al., 1992)) und Rutheniumrot (RR; (Caterina et a)., 1997; Wood et al., 1988)) blockiert.
  • Hydropathieanalysen der Aminosäuresequenz des VR1 zeigten sechs mögliche die Membran durchspannende Regionen (S1–S6) und eine mutmaßliche Poren-Loch-Region zwischen S5 und S6. Eine große intrazelluläre Domäne enthält drei Ankyrin Wiederholungs-Domänen (Caterina et al., 1997). Dieser Kanal hat signifikante strukturelle Ähnlichkeiten mit der mutmaßlichen „Vorratsgesteuerten" TRP Calciumkanal Familie. VR1 ist ein Ligandengesteuerter nicht-selektiver Kationenkanal, der eine ausgeprägte Auswärtsgleichrichtung zeigt (Caterina et al., 1997). Von großer Bedeutung ist, dass der VR1 im hohen Maße für CR2+ permeabel ist, ein Ion, bekannt dafür, dass es sehr wichtig für die Regulation der Zellfunktion ist ((Blackstone und Sheng, 1999; Gupta und Pushkala, 1999: van Haasteren et al., 1999)).
  • Die Durchsuchung der genomischen Datenbanken hat das VRL-1 offenbart, eine Untereinheit, die strukturell dem VR1 entspricht. Ratten und humanes VRL-1 (entsprechend AF129113 und AF129112) sind zu ~49% identisch und zu 66% ähnlich dem Ratten-VR1 (AF029310)) (Caterina et al., 1999). Humanes VRL-Protein (AF103906), kloniert durch Wood und Kollegen (nicht publiziert), ist zu 99% identisch zum VRL-1 (AF129112). Vor kurzem ist eine Patentanmeldung von Partiseti und Renard veröffentlicht worden, die ein hVRCC (humaner Vanilloid-Rezeptor ähnlicher Kationenkanal (human vanilloid receptor like cation channel)) beschrieben hat, welcher dem AF129112 nahezu identisch ist (der einzige Unterschied ist die Deletion des Q418). Wir werden auf diese Sequenzen als VR2 Bezug nehmen. Im Großen und Ganzen ist die vorausgesagte Struktur für den VR1 und den VR2 charakteristisch für eine Familie von Innenkanälen, die über transiente Rezeptorpotenzial-(TRP (transient receptor potential)) Kanäle definiert wird, ursprünglich aus Drosophila melanogaster kloniert, ein Ca-durchlässiger Kanal, der eine Rolle bei der Phototransduktion spielt (Lu und Wong, 1987; Minke und Selinger, 1996). Dieser Rezeptor scheint auch in der Sinnesempfindung von Schmerz-erzeugender Hitze involviert zu sein (Caterina et al., 1999). Die Expression von VR2 in Oocyten und HEK-Zellen verleiht üblicherweise eine Sensitivität dieser Zellen für gesundheitsschädliche Temperaturen (> 53°C), welche nicht sensitiv für CPZ waren, aber annähernd komplett in 10 μM Rutheniumrot blockiert wurden. Die Aktivierung des VR2 induziert einen nicht-selektiven Kationen-Strom mit einer hohen Permeabilität für Ca2+. Interessanterweise nahm die Reizschwelle für die Hitzesensitivität mit einer wiederholten Applikation der gesundheitsschädlichen Stimuli ab, aber nicht die untere Reizschwelle für Temperaturen (Caterina et al., 1999).
  • Man vermutet von dem Ratten SIC (stretch-inhibitable channel; Dehnungs-hemmbarer Kanal; Genbank AB015231), kodiert durch 529 Aminosäuren, dass dieser einen Ionenkanal bildet, der durch Dehnung inhibiert wird (Suzuki et al., 1999). Die ersten 379 Aminosäuren sind homolog zum Ratten VR1. Dem SIC fehlt große N-terminale cytoplasmatische Domäne der VR-Familie, aber er enthält eine Sequenz, die homolog zum A Exon vor dem mutmaßlichen TM1 ist. Die letzten 163 Aminosäuren, beginnend in der Mitte der vermutlichen TM6 des Ratten SIC, sind der entsprechenden Aminosäuresequenz des humanen VR3 A+B- der vorliegenden Erfindung ähnlich.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt die Klonierung und Funktion eines neuen Mitglieds der Vanilloid-Rezeptor Familie, VR3. Dieses Gen scheint alternativ gespleißt zu werden, um mindestens drei Isoformen zu bilden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • DNA-Moleküle, welche drei Isoformen des humanen Vanilloid-Rezeptors 3 (hVR3) kodieren, sind kloniert und charakterisiert worden. Die biologischen und strukturellen Eigenschaften dieser Proteine wurden als Aminosäure- und Nukleotidsequenzen offengelegt. Das rekombinante Protein ist nützlich, um Modulatoren des Rezeptors VR3 zu identifizieren. Modulatoren, welche unter Verwendung des hierin offenbarten Assays identifiziert wurden, sind als therapeutische Mittel nützlich, welche Kandidaten für die Behandlung von entzündlichen Zuständen und für die Verwendung als schmerzlindernde Mittel für schwer zu bewältigende Schmerzen sind, die verbunden sind mit postherpetischer Neuralgie, diabetischer Neuropathie, Postmastektomieschmerz, komplexem regionalem Schmerzsyndrom, Arthritis (zum Beispiel Rheumatoider und Osteoarthritis), als auch Geschwüren, neurodegenerativen Erkrankungen, Asthma, chronischer Bronchitis, Reizdarmsyndrom und Psoriasis. Verwendungen umfassen die Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems, Erkrankungen des Verdauungstrakts, einer abnormen Proliferation und Krebs, besonders im Verdauungssystem, der Prostata und der weiblichen Gonaden, Geschwüren, Erkrankungen der Leber, Erkrankungen der Niere, Kontrolle der inneren Organe des Körpers, die durch Ganglien der Dorsalwurzel innerviert werden, oder um eine beliebige Störung zu diagnostizieren oder zu behandeln, die in Bezug zu einer abnormalen Expression dieser hVR3-Polypeptide, besteht, unter anderem. In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der Materialien, die durch die Erfindung bereitgestellt werden, und die Behandlung von Zuständen, die mit einer hVR3-Imbalance verbunden sind. Die rekombinanten DNA-Moleküle, und Teile davon, sind für die Isolierung von Homologen der DNA-Moleküle nützlich, für die Identifizierung und Isolierung genomischer Äquivalente der DNA-Moleküle und für die Identifizierung, Detektion und Isolierung mutanter Formen der DNA-Moleküle.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNG
  • 1 SEQ ID NR.: 5. Humane VR3A+B– Nukleotidsequenz der kodierenden Region (2616 bp).
  • 2 SEQ ID NR.: 6. Gezeigt ist die Nukleotidsequenz des humanen VR3A+B–, einschließlich der 337 bp 5' untranslatierten Region (UT) und 547 bp 3' UT (3500 bp).
  • 3 SEQ ID NR.: 7. Die kodierende Sequenz de humanen VR3A+B– (871 Aminosäuren).
  • 4 SEQ ID NR.: B. Die humane VR3A–B– Nukleotidsequenz der kodierenden Region (2436 bp).
  • 5 SEQ ID NR.: 9. Die kodierende Sequenz für des humanen VR3A–B– (811 Aminosäuren).
  • 6 SEQ ID NR.: 10. Die humane VR3A+B+ Nukleotidsequenz der kodierenden Region (2229 bp).
  • 7 SEQ ID NR.: 11. Gezeigt ist die Nukleotidsequenz des humanen VR3A+B+, einschließlich der 836 bp 5' UT und 994 bp 3' UT (4059 bp).
  • 8 SEQ ID NR.: 12. Die codierende Sequenz des humanen VR3A+B+ (742 Aminosäuren).
  • 9 Die funktionelle Expression der VR3-Isoformen in Xenopus Oocyten ist gezeigt: die Viabilität von Oocyten, welche in ND-96 mit 2 Ca2+ gehalten wurden, war 4–6 Tage nach der Injektion von 3.25 ng VR3 A+B– und VR3 A+B+ (5 ng) cRNA signifikant vermindert, aber nicht nach der Injektion von VR3 A–B– (1,5 ng) cRNA. Die Daten der VR3 A+B– und Wasser-injizierten Oocyten sind aus fünf unterschiedlichen Experimenten erhalten worden. Tote Oocyten sind visuell bestimmt worden. Die Daten sind unter Verwendung des Chi-Quadrat Testes analysiert worden.
  • 10 Funktionen in Oocyten: VR3-Isoformen werden durch Hitze aktiviert. A. Gezeigt ist die mittlere Spitzenstromstärke, welcher durch einen Hitzeanstieg von 25°C auf 46°C ausgelöst wurde und bei 46°C für mindestens 15 Sekunden aufrechterhalten wurde. Der Strom ist die Erhöhung über den anfänglichen Strom bei +80 mV. Spannungsanstiege sind von –120 bis +80 mV über 400 mSek alle zwei Sekunden angelegt worden. Den Oocyten sind jeweils 3.25, 1.5 und 5 ng VR3 A+B–, A–B– und A+B+ cRNA injiziert worden, und bis zu sechs Tage später erfasst worden. Die ausgefüllte Säule: Wasser-injizierte Kontrollen (n = 8); leere Säule: VR3 A+B– Isoform (n = 11); schraffierte Säule: VR3 A–B– Isoform (n = 8); getüpfelte Säule: VR3 A+B+ Isoform (n = 5). Alle Isoformen zeigen eine signifikante Erhöhung über die Wasser-Kontrollen (p = jeweils 0.001, 0.03 und 0.007; Student's t-Test). Die Hitze-induzierte Antwort ist ungefähr zweifach höher in der A+B– Isoform im Vergleich zu den anderen zwei Isoformen, aber die Unterschiede sind nicht signifikant (p = 0.051 und p = 0.16 für A+B– jeweils im Vergleich zu A–B– und A+B+). Die Daten sind aus zwei Sets von injizierten Oocyten erhalten worden. Die gezeigten Daten sind die Durchschnittswerte und die Standardabweichungen von den Durchschnittswerten. B. Die durch den Spannungsanstieg induzierten Ströme sind während der Anwendung erhöhter Hitze auf die Oocyten, die mit Wasser (oben), VR3 A+B– (zweite von oben), VR3 A–B– (dritte von oben) und VR3 A+B+ (unten) injiziert waren, aufgezeichnet worden. Die Oocyten sind konstant mit Ca2+ ND-96 perfusioniert worden und die Lösung ist durch ein Inline Heizgerät (TC-324B in Verbindung mit dem SH-27A Inline Heizgerät: Warner Instrument Corp.) erhitzt worden. Die Anstiegs-induzierten Stromstärken (in uA, wie auf der y-Achse angezeigt), die bei Temperaturen von 37°C bis 46°C erhalten wurden, sind gezeigt. Nur die Stromspuren bei den höheren Temperaturen sind mit der entsprechenden Temperatur markiert worden.
  • 11 Funktion in Oocyten: VR3 A+B– verleiht eine Sensitivität gegenüber 10 μM Rutheniumrot des durch die Perfusion aktivierten Strom (Iperfusion), der in VR1-exprimierenden Oocyten beobachtet wird, induziert durch Zellperfusion mit extrazellulären Salzlösungen. Die Aktivierung des Iperfusion durch eine erhöhte Perfusion ist durch Rutheniumrot nur in VR1-exprimierenden Oocyten blockiert worden, welchen VR3 A+B– cRNA injiziert worden ist, und nicht in Oocyten, die nur VR1 exprimieren. (a). Eine mit VR1 cRNA [4 ng] injizierte Oocyte, ist mit Spannungsanstiegen zwischen –120 und +80 mV über 400 mSek aus einem Haltepotenzial von –70 mV gefordert worden. Die Anstiegs-induzierten Stromstärken sind nach Beginn der Perfusion der Oocyte mit einer Rate von 10 ml/min erhöht worden. Eine Vorinkubation mit 10 μM Rutheniumrot für 0.5 Minuten blockierte den Strom. Der Block war teilweise reversibel (nicht gezeigt). (b). Eine Oocyte, welcher VR1 cRNA [4 ng] zusammen mit VR3 A+B– [1.3 ng] injiziert wurde, wurde mit Spannungsanstiegen zwischen –120 und +80 mV über 400 mSek aus einem Haltepotenzial von –70 mV gefordert. Die Anstiegs-induzierten Stromstärken sind nach dem Beginn der Perfusion der Oocyte bei einer Rate von 10 ml/min erhöht worden. Eine Vorinkubation mit 10 μM Rutheniumrot für 0.5 Minuten hatte nur einen geringen Effekt auf Iperfusion. Iperfusion hatte ähnliche Stärken in beiden Sets der Oocyten. Vrev für den RR-inhibierten Strom war ungefähr –13 mV (Pfeil).
  • 12 Funktion in Oocyten: VR3 A+B– zusammen mit VR1. Die Stärke und die Abfallkinetiken der Antwort auf 1 μM Capsaicin sind vermindert worden, wenn VR1 cRNA mit VR3 A+B– cRNA in gleichem Verhältniss [jede 2,9 ng] koexprimiert worden ist.
  • 13 Eine DNA-Array Verteilungsanalyse zeigt, dass hVR3 mRNAs in einer Vielfalt von Geweben exprimiert werden und es manche Überlappung der Expression mit VR1 auf Ebene des Gesamtgewebes gibt. Die in dem DNA-Array verwendete DNA-Sequenz ist nicht in A+B+-Isoformen vorhanden, einzig in A+B– und A–B–-Isoformen. Zu beachten ist, dass die cDNA-Spezies aus Hypophysen- und Prostatakeimdrüsen kloniert worden ist.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt drei Isoformen des humanen Vanilloid-Rezeptors, bezeichnet als VR3: VR3 A+B–, VR3 A–B– und VR 3A+B+. Die Nukleotidsequenzen der humanen VR3 Rezeptor cDNAs zeigten einen großen offenen Leserahmen von ungefähr 2616 (1), 2436 (4) und 2229 (6) Basenpaaren, die 871 (3), 811 (5) und 742 (8) Aminosäuren für entsprechend VR3 A+B–, A–B– und A+B+ codieren. Die cDNA für VR3 A+B– hat 5' und 3' untranslatierte Verlängerungen von ungefähr 337 und ungefähr 547 Nukleotiden, wie in 2 gezeigt ist, wobei die 5' UTR von 1–337 ist, die codierende Region von 338-2953 ist, und die 3' UTR von 2954–3500 ist. Die cDNA für VR3 A+B+ hat 5' und 3' untranslatierte Verlängerungen von ungefähr 836 und ungefähr 994 Nukleotiden, wie in 7 gezeigt ist, wobei die 5' UTR von 1–836 ist, die codierende Region ist von 837–3065 und die 3' UTR ist von 3066–4059. Das erste Methionin im Leserahmen ist als Anfangscodon für einen offenen Leserahmen bestimmt worden, der humane VR3-Rezeptorproteine mit einer geschätzten molekularen Masse (Mr) von ungefähr 98,242 Da, 91,294 Da und 83,310 Da für die entsprechenden Isoformen A+B–, A–B– und A+B+ voraussagt. Die A+B– Isoform codiert ein Protein mit 871 Aminosäuren. Die VR3 A–B– enthält eine Deletion von 60 Aminosäuten von Aminosäure 382 bis 441 der VR3 A+B–. Die VR3 A+B+ ist zu A+B– bis zu Aminosäure 736 identisch, nach welcher sechs abweichende Aminosäuren kommen, und ein Stoppcodon. Die VR3 A+B+ Isoform ist um 20 Aminosäuren nach der mutmaßlichen TM6 verlängert.
  • Die vorausgesagten humanen VR3-Rezeptorproteine sind mit Nukleotid- und Proteindatenbanken abgeglichen worden und werden der Vanilloid-Rezeptor Familie (VR1 und VR2) zugeordnet. Dort sind einige konservierte Motive, welche in dieser Familie von Rezeptoren gefunden werden, einschließlich eines großen mutmaßlichen N-terminalen hydrophilen Segments (ungefähr 467 Aminosäuren), drei mutmaßlichen Ankyrin Wiederholungs-Domänen in der N-terminalen Regionen, 6 vorausgesagte Transmembranregionen und eine Porenregion. VR3 A+B– ist 43% identisch zum humanen VR1, 39% identisch sowohl zum humanen VRL-1 (AF129112) als auch dem humanen VRL (AF103906). Somit ist der hierin beschriebene VR3-Rezeptor eindeutig ein neues Gen der Vanilloid-Rezeptor Familie.
  • Humane VR3 A+B– und VR3 A–B– Formen sind dem Ratten Dehnungs-inhibierbaren Kanal SIC [Genbank Akzession AB015231] von Aminosäure 694 bis zum Ende ähnlich. Von dem Ratten SIC, codiert von 529 Aminosäuren, wird geglaubt, dass er einen Innenkanal bildet, der durch Dehnung inhibiert wird. Ihm fehlt die große N-terminale cytoplasmatische Domäne der VR-Familie, aber enthält ein Sequenz-Homolog zu dem A Exon vor dem mutmaßlichen TM1.
  • Die vollständige genomische Sequenz der hierin beschriebenen VR3 codierenden Regionen scheint in einer 380512 Basenpaar Sequenzeingabe zur Genbank (Homo Sapiens Klon RPCI1-7G5 (AC007834) direkte Eingabe durch Worley, K. C.) vorzukommen. Dieser Genbankeintrag führt viele Fragmente einer DNA-Sequenz und eine vorgeschlagene zusammenhängende Sequenz auf, aber ihm fehlt jegliche Analyse der Nukleinsäuresequenz und versäumt die Eigenschaften der VR3 Nukleinsäuresequenzen zu charakterisieren, oder die Präsenz des VR3-Gens zu beschreiben.
  • Isolierung der humanen VR3-Rezeptor Nukleinsäure
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf für den humanen VR3-Rezeptor kodierende DNA, welche aus den humanen VR3-Rezeptor produzierenden Zellen isoliert worden ist. Humaner VR3-Rezeptor, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Protein, welches speziell als humaner Vanilloid-Rezeptor fungieren kann.
  • Die vollständige Aminosäuresequenz des humanen VR3-Rezeptors ist zuvor nicht bekannt gewesen, noch war die vollständige den humanen VR3-Rezeptor kodierende Nukleotidsequenz bekannt. Es wird prognostiziert, dass eine große Anzahl von Zellen und Zelltypen den beschriebenen humanen VR3-Rezeptor enthalten wird.
  • Andere Zellen und Zelllinien können auch für die Verwendung um humane VR3-Rezeptor-cDNA zu isolieren geeignet sein. Die Auswahl geeigneter Zellen kann durch eine Untersuchung auf humane VR3-Rezeptoraktivität in Zellextrakten oder Gesamtzell Assays, hierin beschrieben, erfolgen. Zellen, die humane VR3-Rezeptoraktivität in jeweils einem dieser Assays aufweisen, können für die Isolierung der humanen VR3-Rezeptor DNA oder RNA geeignet sein.
  • Irgendeine aus dem breiten Angebot von auf dem Fachgebiet bekannten Methoden kann verwendet werden, um molekular die humane VR3-Rezeptor DNA zu klonieren. Diese Methoden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die direkte funktionale Expression der humanen VR3-Rezeptor Gene in einem geeigneten Expressionsvektorsystem im Anschluss an die Erstellung einer den humanen VR3-Rezeptor enthaltenden cDNA-Bibliothek. Eine andere Methode ist, eine den humanen VR3-Rezeptor enthaltende cDNA-Bibliothek, die in einem Bakteriophagen oder einem Plasmidshuttle Vektor mit einer markierten Oligonukleotidprobe, gestaltet aus der Aminosäuresequenz von humanen VR3-Rezeptor Untereinheiten, erstellt wurde, zu untersuchen. Eine zusätzliche Methode besteht aus dem Screening einer den humanen VR3-Rezeptor enthaltende cDNA-Bibliothek, erstellt in einem Bakteriophagen oder einem Plasmidshuttle Vektor mit einer unvollständigen cDNA, die für das humane VR3-Rezeptorprotein kodiert. Diese unvollständige cDNA wird durch die spezifische PCR-Amplifikation des humanen VR3-Rezeptor DNA Fragments durch den Entwurf von degenerierten Oligonukleotid-Primern aus der Aminosäuresequenz des gereinigten humanen VR3-Rezeptorproteins erhalten.
  • Eine weitere Methode ist, RNA aus den humanen VR3-Rezeptorproduzierenden Zellen zu isolieren und die RNA in Protein mit Hilfe eines in vitro oder eines in vivo Translationssystems zu translatieren. Die Translation der RNA in ein Peptid in ein Protein wird die Herstellung von zumindest einem Teil des humanen VR3-Rezeptorproteins zur Folge haben, welches durch zum Beispiel die immunologische Reaktivität mit einem anti-humanen VR3-Rezeptor Antikörper oder durch die biologische Aktivität eines humanen VR3-Rezeptorproteins identifiziert werden kann. In diesem Verfahren können Pools der RNA, die aus den humanen VR3-Rezeptor produzierenden Zellen isoliert wurde, auf das Vorhandensein von RNA hin analysiert werden, die zumindest einen Teil des humanen VR3-Rezeptorproteins kodiert. Eine weitere Fraktionierung des RNA-Pools kann durchgeführt werden, um die humane VR3-Rezeptor RNA von nicht-humaner VR3-Rezeptor RNA zu reinigen. Die durch diese Methode hergestellten Peptide oder Proteine können analysiert werden, um Aminosäuresequenzen zu bestimmen, welche wiederum verwendet werden können, um Primer für die Herstellung von humaner VR3-Rezeptor cDNA bereitzustellen, oder die RNA, welche für die Translation verwendet wurde, kann analysiert werden, um den humanen VR3-Rezeptor kodierende Nukleotidsequenzen bereitzustellen und führt zu Proben für diese Herstellung von humaner VR3-Rezeptor cDNA. Diese Methode ist auf dem Fachgebiet bekannt und kann gefunden werden in, zum Beispiel, Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. in Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989.
  • Es ist für den Fachmann leicht ersichtlich, dass andere Arten von Bibliotheken, als auch Bibliotheken, die aus anderen Zellen oder Zellarten hergestellt wurden, für die Isolierung von den humanen VR3-Rezeptor codierender DNA nützlich sein können. Andere Arten von Bibliotheken umfassen, sind aber nicht limitiert auf diese, cDNA-Bibliotheken, erstellt aus anderen Zellen, aus Organismen, anderen als der humaner VR3-Rezeptor, und genomische DNA-Bibliotheken, die YAC (yeast artificial chromosome) und Cosmidbibliotheken umfassen.
  • Es ist für den Fachmann leicht ersichtlich, dass geeignete cDNA-Bibliotheken aus Zellen oder Zelllinien hergestellt werden können, welche humane VR3-Rezeptoraktivität haben. Die Auswahl von Zellen oder Zelllinien für die Verwendung zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek zur Isolierung von humaner VR3-Rezeptor-cDNA kann erfolgen, indem zuerst die Zell-assozierte humane VR3-Rezeptoraktivität unter Verwendung der Messung humaner VR3-Rezeptor assoziierter biologischen Aktivität oder eines Liganden-Bindungsassays gemessen wird.
  • Die Herstellung von cDNA-Bibliotheken kann anhand von Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt sind, durchgeführt werden. Gut bekannte Konstruktionstechniken zur Erstellung einer cDNA-Bibliothek können zum Beispiel gefunden werden in Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
  • Es ist ferner für den Fachmann leicht ersichtlich, dass die den humanen VR3-Rezeptor kodierende DNA auch aus einer geeigneten genomischen DNA-Bibliothek isoliert werden kann. Die Erstellung einer genomischen DNA-Bibliothek kann anhand von Standardtechniken, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, durchgeführt werden. Gut bekannte Konstruktionstechniken für die Erstellung einer genomischen DNA-Bibliothek können gefunden werden in Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook; J. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
  • Um das humane VR3-Rezeptor-Gen durch die obigen Methoden zu klonieren, kann die Aminosäuresequenz des humanen VR3-Rezeptors notwendig sein. Um das zu erreichen, kann das VR3-Rezeptorprotein gereinigt werden und eine Teil-Aminosäuresequenz durch automatische Sequenzierer bestimmt werden. Es ist nicht notwendig, die gesamte Aminosäuresequenz zu bestimmen, aber die lineare Sequenz von zwei Bereichen von 6 bis 8 Aminosäuren des Proteins wird für die Herstellung von Primern für die PCR-Amplifikation eines unvollständigen humanen VR3-Rezeptor DNA-Fragments bestimmt.
  • Sobald geeignete Aminosäuresequenzen identifiziert worden sind, werden die DNA-Sequenzen, die geeignet sind, diese zu kodieren, synthetisiert. Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon verwendet werden, um eine bestimmte Aminosäure zu kodieren, und daher kann die Aminosäuresequenz von jedem eines Sets von ähnlichen DNA Oligonukleotiden codiert werden. Nur ein Teil des Sets wird identisch mit der humanen VR3-Rezeptorsequenz sein, aber es wird in der Lage sein, mit der humanen VR3-Rezeptor-DNA sogar in Gegenwart von DNA-Oligonukleotiden mit Basenfehlpaarungen (Mismatches) zu hybridisieren. Die DNA-Oligonukleotide mit Basenfehlpaarungen können dennoch hinlänglich mit der humanen VR3-Rezeptor-DNA hybridisieren, um die Identifikation und Isolierung der den humanen VR3-Rezeptor kodierenden DNA zu ermöglichen. Die unter Verwendung dieser Methoden isolierte DNA kann verwendet werden, um DNA-Bibliotheken aus einer Vielzahl von Zellarten, aus Invertebraten und Vertebraten-Quellen, zu untersuchen und um homologe Gene zu isolieren.
  • Gereinigter, biologisch aktiver humaner VR3-Rezeptor kann einige unterschiedliche physikalische Formen haben. Humaner VR3-Rezeptor kann als ein vollständiges naszierendes oder als unverarbeitetes Polypeptid vorhanden sein, oder als teilweise verarbeitete Polypeptide oder Kombinationen von verarbeiteten Polypeptiden. Das vollständige naszierende humane VR3-Rezeptor-Polypeptid kann posttranslational durch spezifische proteolytische Spaltungsereignisse modifiziert werden, die in der Bildung von Fragmenten des vollständigen naszierenden Polypeptids resultieren. Ein Fragment, oder eine physikalische Assoziierung von Fragmenten kann die vollständige biologische Aktivität haben, die mit humanem VR3-Rezeptor verbunden ist, jedoch kann das Ausmaß der humanen VR3-Rezeptoraktivität zwischen den einzelnen humanen VR3-Rezeptorfragmenten und physikalisch assoziierten humanen VR3-Rezeptor-Polypeptidfragmenten variieren.
  • Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon verwendet werden, um eine bestimmte Aminosäure zu codieren, und daher kann die Aminosäuresequenz durch irgendeins von einem Set von ähnlichen DNA-Oligonukleotiden codiert werden. Nur ein Teil des Sets wird identisch mit der humanen VR3-Rezeptorsequenz sein, es wird aber auch selbst in der Gegenwart von DNA-Oligonukleotiden mit Basenfehlpaarungen (Mismatchen) unter geeigneten Bedingungen mit der humanen VR3-Rezeptor-DNA hybridisieren. Unter wechselnden Bedingungen können nach wie vor die DNA-Oligonukleotide mit Basenfehlpaarungen (mismatched) mit der humanen VR3-Rezeptor-DNA hybridisieren, um die Identifikation und Isolierung der den humanen VR3-Rezeptor codierenden DNA zu ermöglichen.
  • Es kann den humanen VR3-Rezeptor codierende DNA aus einem bestimmten Organismus verwendet werden, um Homologe des humanen VR3-Rezeptors aus anderen Organismen zu isolieren und zu reinigen. Um dieses zu bewerkstelligen, kann die erste humane VR3-Rezeptor-DNA unter geeigneten Bedingungen mit einer Probe gemischt werden, die DNA enthält, die Homologe des humanen VR3-Rezeptors codiert. Der hybridisierte DNA-Komplex kann isoliert werden und die DNA, welche die homologe DNA codiert, kann davon aufgereinigt werden.
  • Es ist bekannt, dass ein beträchtlicher Umfang an Redundanz in den verschiedenen Codons, die für die spezifischen Aminosäuren codieren, vorhanden ist. Daher bezieht sich diese Erfindung auch auf jene DNA-Sequenzen, die alternative Codons enthalten, die für die letztendliche Translation der identischen Aminosäuren codieren. Für die Zwecke dieser Beschreibung wird eine Sequenz, die eine oder mehrere ausgetauschte Codons hervorbringt, als degenerierte Variation definiert. Ferner sind innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung Mutationen, entweder in der DNA-Sequenz oder des translatierten Proteins, umfasst, die nicht wesentlich die endgültigen physikalischen Eigenschaften des exprimierten Proteins ändern. Zum Beispiel verursacht die Substitution von Valin für Leucin, von Arginin für Lysin, oder Asparagin für Glutamin keine Veränderung der Funktionalität des Polypeptids. Solche Substitutionen sind gut bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. Benjamin Cummings Pub. Co. by Watson et al.
  • Es ist bekannt, dass die für ein Peptid codierenden DNA-Sequenzen modifiziert werden können, so dass sie für ein Peptid codieren, dass Eigenschaften hat, die unterschiedlich zu jenen des natürlich vorkommenden Peptids sind. Methoden der Modifizierung von DNA-Sequenzen umfassen, sind aber nicht limitiert auf diese, eine zielgerichtete Mutagenese, chimäre Substitution und Genfusionen. Die zielgerichtete Mutagenese wird verwendet, um eine oder mehrere DNA-Reste auszutauschen, die in einer stillen Mutation, einer konservativen Mutation oder einer nicht-konservativen Mutation resultiert. Chimäre Gene werden durch Domänen-Tausch von ähnlichen oder unterschiedlichen Genen hergestellt, um ähnliche Domänen in dem humanen VR3-Rezeptorgen zu ersetzen. In ähnlicher Weise können Fusionsgene hergestellt werden, denen Domänen zu dem humanen VR3-Rezeptorgen hinzugefügt werden, wie zum Beispiel eine Affinitätsmarkierung, um die Identifikation und Isolierung der Gene zu erleichtern. Fusionsgene können hergestellt werden, um Regionen des humanen VR3-Rezeptorgens zu ersetzen, zum Beispiel um eine lösliche Version des Proteins durch die Entfernung einer transmembranen Domäne zu bilden oder um durch die Zufügung einer Markierungssequenz den normalen Transport des Proteins umzuleiten, oder um neue posttranslationale Modifikationssequenzen dem humanen VR3-Rezeptorgen hinzuzufügen. Beispiele von veränderten Eigenschaften umfassen, sind aber nicht limitiert auf Änderungen der Affinität eines Enzyms für ein Substrat oder eines Rezeptors für einen Liganden.
  • Wie hierin verwendet, ist ein "funktionales Derivat" eines humanen VR3-Rezeptors eine Verbindung, die eine biologische Aktivität (entweder funktional oder strukturell) besitzt, die im Wesentlichen ähnlich der biologischen Aktivität des humanen VR3-Rezeptors ist. Der Ausdruck "funktionelle Derivate" ist vorgesehen, "Fragmente", "Varianten", "degenerierte Varianten", "Analoge" und "Homologe" oder "chemische Derivate" des humanen VR3-Rezeptors zu umfassen. Der Ausdruck "Fragment" ist bestimmt für jede Polypeptid-Untermenge des humanen VR3-Rezeptors. Der Ausdruck "Variante" ist bestimmt für ein Molekül, das im Wesentlichen in Struktur und Funktion entweder zu dem gesamten humanen VR3-Rezeptormolekül oder zu einem Fragment davon ähnlich ist. Ein Molekül ist "im Wesentlichen ähnlich" zu einem humanen VR3-Rezeptor, wenn beide Moleküle im Wesentlichen ähnliche Strukturen haben oder wenn beide Moleküle eine ähnliche biologische Aktivität aufweisen. Deswegen werden, wenn die zwei Moleküle eine im Wesentlichen ähnliche Aktivität besitzen, diese als Varianten betrachtet, sogar wenn die Struktur von einem der Moleküle nicht in dem anderen gefunden werden kann oder sogar wenn die zwei Aminosäuresequenzen nicht identisch sind. Der Ausdruck "Analog" bezieht sich auf ein Molekül, das im Wesentlichen ähnlich in der Funktion entweder des gesamten humanen VR3-Rezeptormoleküls oder eines Fragments davon ist.
  • Rekombinante Expression des humanen VR3-Rezeptors
  • Die clonierte humane VR3-Rezeptor-DNA, die unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren erhalten wurde, kann rekombinant durch molekulare Klonierung in einen Expressionsvektor exprimiert werden, welcher einen geeigneten Promotor und andere Transkriptions-regulatorische Elemente enthält, und in eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle transferiert werden, um das rekombinante humane VR3- Rezeptorprotein herzustellen. Techniken für solche Manipulationen sind vollständig beschrieben in Maniatis, T. et al., supra und sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
  • Expressionsvektoren sind hierin als DNA-Sequenzen definiert, die für die Transkription von klonierten Kopien von Genen und der Translation ihrer mRNAs in einem geeigneten Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können verwendet werden, um eukaryotische Gene in einer Vielzahl von Wirtszellen, wie zum Beispiel Bakterien, einschließlich E. coli, Blau-Grünalgen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen, einschließlich Hefezellen, und tierischen Zellen zu exprimieren.
  • Spezifisch konstruierte Vektoren ermöglichen das hin und her bewegen (shuttling) von DNA zwischen Wirten, wie zum Beispiel Bakterien-Hefen oder Bakterien-tierischen Zellen oder Bakterien-Pilzzellen oder Bakterien-Invertebraten Zellen. Ein entsprechend konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: eine Origin of Replication für die autonome Replikation in Wirtszellen, auswählbare Marker, eine beschränkte Anzahl von geeigneten Restriktionsenzymstellen, die Möglichkeit für eine hohe Kopieanzahl und aktive Promotoren. Ein Promotor wird definiert als eine DNA-Sequenz, welche die RNA-Polymerase steuert, um an die DNA zu binden und die RNA-Synthese zu initiieren. Ein starker Promotor ist einer, der auslöst, dass die mRNAs in hoher Frequenz initiiert werden. Expressionsvektoren können umfassen, sind aber nicht limitiert auf diese, Klonierungsvektoren, modifzierte Klonierungsvektoren, speziell konstruierte Plasmide oder Viren.
  • Eine Vielzahl von Säugetierexpressionsvektoren kann verwendet werden, um den rekombinanten humanen VR3-Rezeptor in Säugetierzellen zu exprimieren. Kommerziell erhältliche Säugetierexpressionsvektoren, welche für die Expression von rekombinanten humanen VR3-Rezeptor geeignet sind, umfassen, sind aber nicht limitiert auf diese, pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (In Vitrogen), pMClneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1 (8-2) (ATCC37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) und IZD35 (ATCC 37565).
  • Eine Vielzahl von bakteriellen Expressionsvektoren kann verwendet werden, um den rekombinanten humanen VR3-Rezeptor in bakteriellen Zellen zu exprimieren. Kommerziell erhältliche bakterielle Expressionsvektoren, welche für die Expression von rekombinanten humanen VR3-Rezeptor geeignet sind, umfassen, sind aber nicht limitiert auf pET-Vektoren (Novagen) und pQE-Vektoren (Qiagen).
  • Eine Vielzahl von Pilzzellexpressionsvektoren kann verwendet werden,. um den rekombinanten VR3-Rezeptor in Pilzzellen, wie zum Beispiel Hefe, zu exprimieren. Kommerziell erhältliche Pilzzellexpressionsvektoren, welche für die Expression des rekombinanten humanen VR3-Rezeptors geeignet sind, umfassen, sind aber nicht limitiert auf, pYES2 (In Vitrogen) und Pichia Expressionsvektor (In Vitrogen). Eine Vielzahl von Insektenzellexpressionsvektoren können verwendet werden, um den rekombinanten humanen VR3-Rezeptor in Insektenzellen zu exprimieren. Kommerziell erhältliche Insektenzellexpressionsvektoren, welche für die rekombinante Expression des humanen VR3-Rezeptors geeignet sind, umfassen, sind aber nicht limitiert auf, pBlueBacII (In Vitrogen).
  • Die für den humanen VR3-Rezeptor codierende DNA kann in einem Expressionsvektor für die Expression in einer rekombinanten Wirtszelle kloniert werden. Rekombinante Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf Bakterien, wie zum Beispiel E. coli, Pilzzellen, wie zum Beispiel Hefe, Säugetierzellen, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf Zelllinien von humaner, Rinder-, Schweine-, Affen- oder Nagerherkunft, und Insektenzellen, einschließlich, aber nicht limitiert auf Drosophila und Zelllinien erhalten von der Seidenraupe. Von Säugetierarten erhaltene Zelllinien, welche geeignet sind und welche kommerziell erhältlich sind, umfassen, sind aber nicht limitiert auf CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), L-Zellen und HEK-293 (ATCC CRL1573).
  • Der Expressionsvektor kann in Wirtszellen mit Hilfe irgendeiner von Vielzahl von Techniken eingefügt werden, einschließlich, aber nicht limitiert auf Transformation, Transfektion, Protoplast Fusion, Lipofektin und Elektroporation. Die den Expressionsvektor enthaltenden Zellen werden klonal vermehrt und individuell analysiert, um zu bestimmen, ob sie das humane VR3-Rezeptorprotein herstellen. Die Identifikation der den humanen VR3-rezeptor exprimierenden Wirtszellklone kann durch verschiedene Mittel erfolgen, einschließlich, aber nicht limitiert auf, die immunologische Reaktivität mit anti-humanen VR3-Rezeptor Antikörpern und dem Vorhandensein von Wirtszell-assoziierter humaner VR3-Rezeptoraktivität.
  • Die Expression von humaner VR3-Rezeptor-DNA kann auch unter Verwendung von in vitro hergestellter synthetischer mRNA durchgeführt werden. Synthetische mRNA oder aus den humanen VR3-Rezeptor herstellenden Zellen isolierte mRNA kann effizient in verschiedenen zellfreien Systemen, einschließlich, aber nicht limitiert auf, Weizenkeimextrakte und Reticulozyten-Extrakten, translatiert werden, ebenso wie in auf Zellen basierenden Systemen, einschließlich, aber nicht limitiert auf, Mikroinjektion in Frosch Oocyten, effizient translatiert werden kann, wobei die Mikroinjektion in Frosch Oocyten im allgemeinen bevorzugt ist.
  • Um die humane VR3-Rezeptor-DNA-Sequenz(en) zu bestimmen, die optimale Level der humanen VR3-Rezeptoraktivität und/oder des humanen VR3-Rezeptorproteins ergeben, können einschließlich Folgende, aber nicht limitiert auf diese, humane VR3-Rezeptor-DNA-Moleküle konstruiert werden:
    Genname Start-Kodon End-Kodon Gesamte Basenpaare
    VR3A+B+ 837 3065 2229
    VR3A+B– 338 2953 2616
    VR3A-B– 1 2436 2436
  • (diese Anzahl entspricht dem ersten Nukleotid des ersten Methionin und dem letzten Nukleotid vor dem ersten Stopp-Codon) und verschiedene Konstrukte, die diese Teile der das humane VR3-Rezeptorprotein codierenden cDNA enthalten. Alle Konstrukte können konstruiert werden, um keinen, alle oder Teile der 5' oder der 3' nicht-translatierten Region der humanen VR3-Rezeptor cDNA zu enthalten. Die humane VR3-Rezeptoraktivität und die Level der Proteinexpression können im Anschluss an die Einfügung sowohl der Einzelnen als auch der Kombination dieser Konstrukte in geeignete Wirtszellen bestimmt werden. Im Anschluss an die Bestimmung der humanen VR3-Rezeptor-DNA-Kassette, welche die optimale Expression in den transienten Assays ergibt, wird dieses humane VR3-Rezeptor-DNA-Konstrukt in einer Art von Expressionsvektoren für die Expression in Wirtszellen transferiert, umfassend, aber nicht limitiert auf, Säugetierzellen, Baculovirus-infizierte Insektenzellen, E. coli und die Hefe S. cerevisiae.
  • Assaymethoden für den humanen VR3-Rezeptor
  • Wirtszell-Transfektanten und mikroinjizierte Oocyten können verwendet werden, um sowohl die Level der funktionalen humanen VR3-Rezeptoraktivität als auch die Level des gesamten humanen VR3-Rezeptorproteins durch die folgenden Methoden zu untersuchen. Im Falle von rekombinanten Wirtszellen involviert dies die Ko-Transfektion von einem oder möglicherweise zwei oder mehr Plasmiden, die die humane VR3-Rezeptor-DNA enthalten, die für eine oder mehrere Fragmente, Untereinheiten oder andere funktionelle Gene codiert. Im Falle von Oocyten involviert dies die Ko-Injektion von synthetischen RNAs für das humane VR3-Rezeptorprotein. Im Anschluss an eine geeignete Zeitdauer, um die Expression zu ermöglichen, wird das zelluläre Protein metabolisch mit zum Beispiel 35S-Methionin für 24 Stunden, markiert, nach welcher die Zelllysate und Zellkulturüberstände geerntet werden und einer Immunopräzipitation mit polyklonalen Antikörpern, die gegen das humane VR3-Rezeptorprotein gerichtet sind, unterworfen.
  • Die Level des humanen VR3-Rezeptorproteins in den Wirtszellen werden unter Verwendung von Immunoaffinitäts- und/oder Ligandenaffinitäts-Techniken quantifiziert. Humane VR3-rezeptorspezifische Affinitäts-Beads oder humane VR3-rezeptorspezifische Antikörper werden verwendet, um zum Beispiel 35S-Methionin markiertes oder unmarkiertes humanes VR3-Rezeptorprotein zu isolieren. Markiertes humanes VR3-Rezeptorprotein wird durch SDS-PAGE analysiert. Unmarkiertes humanes VR3-Rezeptorprotein wird durch Westernblotting, ELISA oder RIA Assays detektiert, die humane VR3-Rezeptor spezifische Antikörper verwenden.
  • Andere Verfahren zur Detektion von humaner VR3-Rezeptoraktivität umfassen die direkte Messung von humaner VR3-Rezeptoraktivität in ganzen Zellen, die mit humaner VR3-Rezeptor cDNA transfiziert sind, oder mit humaner VR3-Rezeptor mRNA injizierten Oocyten. Die humane VR3-Rezeptoraktivität wird durch spezifische Ligandenbindung oder durch biologische Eigenschaften der die humane VR3-Rezeptor DNA-exprimierenden Wirtszellen gemessen. Im Falle der den humanen VR3-Rezeptor exprimierenden rekombinanten Wirtszellen können die Patch-Voltage-Clamp-Techniken verwendet werden, um die Kanalaktivität zu messen und das humane VR3-Rezeptorprotein zu quantifizieren. Im Falle der Oocyten können sowohl die Patch-Clamp- als auch die Zwei-Elektroden-Voltage- Clamp-Techniken verwendet werden, um die Calciumkanalaktivität zu messen und das humane VR3-Rezeptorprotein zu quantifizieren.
  • Auf Zellen basierende Assays
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Ganz-Zell (whole cell) Methode zur Verfügung, um Verbindungen zu detektieren, die den humanen VR3-Rezeptor modulieren. Die Methode umfasst die Schritte: 1) Kontaktierung einer Verbindung und einer Zelle, die funktionalen humanen VR3-Rezeptor enthält, und 2) Messen einer Veränderung in der Zelle in Antwort auf die durch die Verbindung modifizierte humane VR3-Rezeptorfunktion.
  • Die Zeitdauer, die für den zellulären Kontakt mit der Verbindung notwendig ist, wird empirisch bestimmt, zum Beispiel durch das Verstreichen einer Zeitdauer mit einem bekannten VR3-Rezeptormodulator und das Messen zellulärer Änderungen als Funktion der Zeit.
  • Die Mittelwerte der Messungen der Verfahren der vorliegenden Erfindung können weiter bestimmt werden, indem eine Zelle, die einer Verbindung ausgesetzt worden ist, mit einer identischen Zelle, die nicht auf die gleiche Weise der Verbindung ausgesetzt worden ist, verglichen wird. Wahlweise können zwei Zellen, eine, die den funktionalen humanen VR3-Rezeptor enthält, und eine zweite Zelle, identisch mit der ersten, aber welcher der funktionale humane VR3-Rezeptor fehlt, mit der gleichen Verbindung kontaktiert werden und auf die Unterschiede zwischen den zwei Zellen hin verglichen werden. Diese Technik ist auch zur Bestimmung von Hintergrundsignalen in diesen Assays verwendbar. Der Fachmann wird verstehen, dass diese Kontrollmechanismen auch eine leichte Selektion zellulärer Veränderungen ermöglicht, die in Reaktion auf die Modulation des funktionalen humanen VR3-Rezeptors erfolgen.
  • Der Ausdruck "Zelle" bezieht sich auf zumindest eine Zelle, umfasst aber eine Vielzahl von Zellen, die für die Sensitivität der Detektionsmethoden geeignet sind. Die für die vorliegende Erfindung geeigneten Zellen können Bakterielle, Hefe oder Eukaryotisch sein.
  • Die Assaymethoden, um die Modulation des funktionalen humanen VR3-Rezeptors durch eine Verbindung zu bestimmen, können in herkömmlichen Laborausführungen erfolgen oder für einen Hochdurchsatz adaptiert werden. Der Begriff "Hochdurchsatz" bezieht sich auf ein Assaydesign, das eine leichte Analyse von vielen Proben gleichzeitig ermöglicht und eine Kapazität für eine Roboterbedienung aufweist. Ein weiteres erwünschtes Merkmal des Hochdurchsatz-Assays ist ein Assaydesign, das optimiert ist, um den Reagenzverbrauch zu reduzieren, oder die Anzahl an Manipulationen zu minimieren, um die erwünschte Analyse zu erzielen. Beispiele von Assay-Ausführungen umfassen, sind aber nicht limitiert auf, 96-Loch- oder 384-Loch-Platten, freischwebenden Tröpfchen und "lab an a chip"-Mikrokanalchips, die bei Experimente mit Hantierung von Flüssigkeiten verwendet werden. Es ist dem Fachmann gut bekannt, dass, indem die Miniaturisierung von Plastikformen und Mittel zur Handhabung von Flüssigkeiten weiter entwickelt wird, oder wenn verbesserte Assay-Mittel konstruiert werden, dass eine größere Anzahl von Proben unter Verwendung des Designs der vorliegenden Erfindung bestimmt werden kann.
  • Die für die Methoden der vorliegenden Erfindung geeigneten zellulären Änderungen umfassen die direkte Messung von Änderungen der Aktivität, Funktion oder Menge des humanen VR3-Rezeptors, oder das Messen von Downstream-Effekten der humanen VR3-Rezeptorfunktion, zum Beispiel durch Messung der Konzentrationen von Sekundärmessengern oder der Änderungen der Transkription oder der Änderungen der Proteinlevel von Genen, die transkriptionell durch den humanen VR3-Rezeptor beeinflusst werden, oder durch Messung phänotypischer Änderungen der Zelle. Bevorzugte Messmittel umfassen Änderungen der Quantität des humanen VR3-Rezeptorproteins, Änderungen der funktionalen Aktivität des humanen VR3-Rezeptors, Änderungen der Quantität der mRNA, Änderungen des intrazellulären Proteins, Änderungen der Zelloberflächenproteine oder des sezernenten Proteins, oder Änderungen der Ca2+, cAMP oder GTP Konzentration. Änderungen der Quantität oder der funktionalen Aktivität des humanen VR3-Rezeptors sind hierin beschrieben. Änderungen der Level an mRNA werden durch die reverse Transkription Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) oder durch die differentielle Genexpression detektiert. Die Immunoaffinität, Ligandenaffinität oder enzymatische Messung quantifiziert VR3 induzierte Änderungen der Level spezifischer Proteine in Wirtszellen. Wo das Protein ein Enzym ist, wird die Induktion des Proteins durch die Spaltung eines fluorogenen oder kolorimetrischen Substrats beobachtet.
  • Die für das Zelloberflächenprotein bevorzugten Detektionsmittel umfassen die Durchflusszytometrie oder das statistische Zell-Imaging. In beiden Techniken ist das Protein von Interesse an der Zelloberfläche lokalisiert, mit einer spezifischen fluoreszenten Probe markiert und wird mit Hilfe des Ausmaßes an zellulärer Fluoreszenz detektiert. In der Durchflusszytometrie werden die Zellen in einer Lösung analysiert, wobei in zellulären Imaging-Techniken ein Bereich von Zellen auf die relative Fluoreszenz hin verglichen wird.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zum Screenen nach Verbindungen, die die Expression von den humanen VR3-Rezeptor kodierender DNA oder RNA modulieren, als auch die Funktion des humanen VR3-Rezeptorproteins in vivo.
  • Verbindungen können modulieren durch Erhöhung oder Verminderung der Expression der den humanen VR3-Rezeptor kodierenden DNA oder RNA, oder der Funktion des humanen VR3-Rezeptorproteins. Verbindungen, die die Expression von den humanen VR3-Rezeptor kodierender DNA oder RNA oder die Funktion des humanen VR3-Rezeptorproteins modulieren, können durch eine Vielzahl von Assays detektiert werden. Der Assay kann schlicht ein "ja/nein"- Assay sein, um zu bestimmen, ob eine Änderung der Expression oder Funktion vorliegt. Der Assay kann quantitativ aufgebaut sein, indem die Expression oder Funktion einer Testprobe mit den Leveln der Expression oder Funktion in einer Standardprobe verglichen wird. Die in diesem Verfahren identifizierten Modulatoren sind als therapeutische Mittel nützlich, und humaner VR3-Rezeptor.
  • Reinigung des humanen VR3-Rezeptorproteins
  • Im Anschluss an die Expression des humanen VR3-Rezeptors in einer rekombinanten Wirtszelle kann das humane VR3-Rezeptorprotein wieder gewonnen werden, um gereinigten humanen VR3-Rezeptor bereitzustellen. Der rekombinante humane VR3-Rezeptor kann aus Zelllysaten und Extrakten, durch verschiedene Kombinationen von, oder einzelnen Applikationen von Salzfraktionierungen, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlusschromatographie, Hyroxylapatit Adsorptionschromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Lectinchromatographie und Antikörper/Liganden-Affinitätschromatographie aufgereinigt werden.
  • Der rekombinate humane VR3-Rezeptor kann von anderen zellulären Proteinen unter Verwendung einer Immunoaffnitätssäule, die mit monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern, die für den vollständigen naszierenden humanen VR3-Rezeptor, Polypeptidfragmenten des humanen VR3-Rezeptors oder humanen VR3-Rezeptoruntereinheiten spezifisch sind, hergestellt ist. Das Affinitätsharz wird dann mit einem geeigneten Puffer, zum Beispiel phosphatgepufferter Saline (pH 7,3), äquilibriert und die Zellkulturüberstände oder Zellextrakte, welche den humanen VR3-Rezeptor oder die humanen VR3-Rezeptoruntereinheiten enthalten, werden langsam über die Säule gegossen. Die Säule wird dann mit dem Puffer gewaschen, bis die optische Dichte (A280) bis auf ein Hintergrundsignal abfällt, dann wird das Protein durch Änderungen der Pufferbedingung eluiert, wie zum Beispiel durch Erniedrigung des pHs unter Verwendung eines Puffers, wie zum Beispiel 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6). Das gereinigte humane VR3-Rezeptorprotein wird dann gegen einen geeigneten Puffer, wie zum Beispiel phosphatgepufferte Saline, dialysiert.
  • Herstellung und Verwendung von Antikörpern, die an den humanen VR3-Rezeptor binden
  • Für den humanen VR3-Rezeptor monospezifische Antikörper werden aus Säugetierantiseren aufgereinigt, die mit dem humanen VR3-Rezeptor reaktive Antikörper enthalten, oder werden als mit dem humanen VR3-Rezeptor reaktive monoclonale Antikörper unter Verwendung der Technik, die ursprünglich von Kohler und Milstein, Nature 256: 495–497 (1975) beschrieben wurde, hergestellt. Immunologische Techniken sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und zum Beispiel beschrieben in Antibodies: A laboratory manual, veröffentlicht durch die Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ISBN 0879693142. Monospezifische Antikörper, wie hierin verwendet, sind definiert als einzelne Antikörperarten oder viele Antikörperarten mit homogener Bindungscharakteristiken für den VR3-Rezeptor. Eine homogene Bindung, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit der Antikörperspezies, an ein spezifisches Antigen oder Epitop zu binden, wie zum Beispiel jene, die mit dem humanen VR3-Rezeptor, wie oben beschrieben, verbunden sind. Für den humanen VR3-Rezeptor spezifische Antikörper werden durch die Immunisierung von Tieren, wie zum Beispiel Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Ziegen, Pferde und ähnlichen, gewonnen, wobei Kaninchen bevorzugt werden, mit einer entsprechenden Konzentration des humanen VR3-Rezeptors, entweder mit oder ohne einem Immunadjuvans.
  • Prä-Immunserum wird vor der ersten Immunisierung gesammelt. Jedes Tier erhält zwischen ungefähr 0,001 mg und ungefähr 100 mg des humanen VR3-Rezeptors, verbunden mit einem akzeptablen Immunadjuvans. Solche verträglichen Adjuvantien umfassen, sind aber nicht limitiert auf diese, komplettes Freund-Adjuvans, inkomplettes Freund-Adjuvans, Alaun-Präzipitate, Wasser-in-Öl-Emulsionen, die Cornybacterium parvum und tRNA enthalten. Die Erstimmunisierung besteht bevorzugt aus dem humanen VR3-Rezeptor in komplettem Freundschem Adjuvans an mehreren Stellen, entweder subkutan (SC), intraperitoneal (IP), oder beidem. Jedem Tier wird in regelmäßigen Intervallen Blut abgenommen, bevorzugt wöchentlich, um den Antikörper-Titer zu bestimmen. Die Tiere können oder können nicht Boosterinjektionen im Anschluss an die Erstimmunisierung erhalten. Den Tieren, die eine Boosterinjektion erhalten, wird im Allgemeinen eine gleiche Menge an Antigen in inkompletten Freundschen Adjuvans auf die gleiche Art und Weise verabreicht. Boosterinjektionen werden in einem Dreiwochenintervall gegeben, bis maximale Titer erreicht werden. Nach sieben Tagen nach jeder Boosterimmunisierung, oder ungefähr wöchentlich nach einer einfachen Immunisierung, werden die Tiere ausgeblutet, das Serum gesammelt und Aliquots werden bei ungefähr –20°C gelagert.
  • Mit dem humanen VR3-Rezeptor reaktive monoclonale Antikörper (mAb) werden durch die Immunisierung von durch Inzucht erzeugten Mäusen, bevorzugt Balb/c, mit dem humanen VR3-Rezeptor hergestellt. Die Mäuse werden auf dem IP- oder SC-Wege mit ungefähr 0,001 mg bis ungefähr 1,0 mg immunisiert, bevorzugt ungefähr 0,1 mg, des humanen VR3-Rezeptors in ungefähr 0,1 ml Puffer oder Saline, enthalten in einer gleichen Menge an verträglichem Adjuvans, wie oben diskutiert. Freundsches Adjuvans wird bevorzugt, wobei das komplette Freundsche Adjuvans für die Erstimmunisierung verwendet wird und das inkomplette Freundsche Adjuvans danach verwendet wird. Die Mäuse erhalten eine Erstimmunisierung am Tag 0 und werden für 2 bis ungefähr 30 Wochen geschont. Immunisierten Mäusen werden eine oder mehrere Boosterimmunisierungen mit ungefähr 0,001 bis ungefähr 1,0 mg des humanen VR3-Rezeptors in einer Pufferlösung, wie zum Beispiel phosphatgepufferter Saline, auf dem Wege der intravenösen Route (IV) gegeben. Lymphozyten aus Antikörper-positiven Mäusen, bevorzugt Milzlymphozyten, werden durch die Entfernung der Milz aus immunisierten Mäusen unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Standardverfahren erhalten. Hybridomazellen werden hergestellt, indem die Milzlymphozyten mit einem geeigneten Fusionspartner, bevorzugt Myelomazellen, unter Bedingungen gemischt werden, die die Bildung von stabilen Hybridoma ermöglichen.
  • Fusionsparter können umfassen, sind aber nicht limitiert auf: Maus Myelomas P3/NS1/Ag 4– 1; MPC-11; S-194 und Sp2/0, wobei Sp2/0 im Allgemeinen bevorzugt wird. Die Antikörper herstellenden Zellen und die Myelomzellen werden in Polyethylenglycol, ungefähr 1000 mol. wt., bei Konzentrationen von ungefähr 30% bis ungefähr 50%, fusioniert. Fusionierte Hybridomazellen werden durch Wachstum in Hypoxanthin-, Thymidin- und Aminopterinergänztem Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren selektiert. Die Überstandsflüssigkeiten werden von den wachstumspositiven Löchern ungeführ an den Tagen 14, 18 und 21 gesammelt und werden dann auf die Antikörperherstellung unter Verwendung eines Immunoassays hin untersucht, wie zum Beispiel eines Festphasenimmunoradioassay (SPIRA = solid Phase immunoradioassay), unter Verwendung des humanen VR3-Rezeptors als Antigen. Die Kulturflüssigkeiten werden auch in dem Ouchterlony Präzipitationsassay getestet, um Isotypen der mAb zu bestimmen. Hybridomazellen aus Antikörper positiven Löchern werden unter Verwendung einer Technik kloniert, wie zum Beispiel die Weichagartechnik von PacPherson, Soft Agar Techniques, in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse und Paterson, Eds., Academic Press, 1973, oder durch die Technik der limitierten Verdünnung.
  • Monoklonale Antikörper werden in vivo durch Injektion von mit Pristan vorbereiteten Balb/c-Mäusen hergestellt, ungeführ 0,5 ml pro Maus, mit ungefähr 1 × 106 bis ungefähr 6 × 106 Hybridomazellen, wenigstens ca. 4 Tage nach der Vorbereitung (priming). Aszites-Flüssigkeit wird ca. 8 bis 12 Tage nach dem Zelltransfer gesammelt, und die monoklonalen Antikörper werden unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Techniken aufgereinigt.
  • Die in vitro Herstellung eines anti-humanen VR3-Rezeptor monoklonalen Antikörpers wird durchgeführt, indem die Hybridoma in auf dem Fachgebiet gut bekannten Kulturmedien wachsen. Eine hohe Dichte der in vitro Zellkultur kann betrieben werden, um große Mengen der anti-humanen VR3-Rezeptor monoklonalen Antikörper herzustellen, unter Verwendung von Hohlfaserkulturtechniken, Airliftreaktoren, Rollerflaschen oder Spinnerflask-Kulturtechniken, auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die mAb werden unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Techniken aufgereinigt.
  • Die Antikörper-Titer des Aszites oder die Hybridoma-Kulturflüssigkeiten werden unter Verwendung von verschiedenen serologischen oder immunologischen Assays bestimmt, welche umfassen, aber nicht limitiert sind auf, Präzipitation, passive Agglutination, enzyme linked immunosorbent antibody (ELISA)-Techniken und Radioimmunoassaytechniken (RIA). Ähnliche Assays werden verwendet, um das Vorhandensein des humanen VR3-Rezeptors in Körperflüssigkeiten oder Gewebe und Zellextrakten zu detektieren.
  • Es ist für den Fachmann leicht ersichtlich, dass die oben beschriebenen Verfahren für die Herstellung von monospezifischen Antikörpern verwendet werden können, um Antikörper herzustellen, die für humane VR3-Rezeptorpolypeptidfragmente, oder das vollständige naszierende humane VR3-Rezeptorpolypeptid oder für die einzelnen humanen VR3-Rezeptoruntereinheiten spezifisch sind. Im Speziellen ist es für jene auf dem Fachgebiet leicht ersichtlich, dass monospezifische Antikörper erzeugt werden können, welche für nur eine humane VR3-Rezeptoruntereinheit oder für das vollständig funktionale humane VR3-Rezeptorprotein spezifisch sind. Es ist auch für jene auf dem Fachgebiet ersichtlich, dass monospezifische Antikörper erzeugt werden können, die die normale Funktion des humanen VR3-Rezeptorproteins inhibieren.
  • Humane VR3-Rezeptorantikörperaffinitätssäulen werden hergestellt, indem die Antikörper auf eine Gelsäule so aufgetragen werden, so dass die Antikörper kovalente Bindungen mit der Gelkügelchensäule bilden. Bevorzugte kovalente Bindungen werden durch Amine, Aldehyde oder Sulfhydrylreste gebildet, die auf dem Antikörper enthalten sind. Verfahren, um Aldehyde oder freie Sulfhydrylgruppen auf den Antikörpern zu erzeugen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt: Amingruppen sind reaktiv mit, zum Beispiel, N-Hydroxysuccinimidestern.
  • Kit-Zusammenstellungen, welche humane VR3-Rezeptor spezifische Reagenzien umfassen
  • Kits, die die humane VR3-Rezeptor DNA oder RNA, Antikörper gegen den humanen VR3-Rezeptor oder das humane VR3-Rezeptorprotein umfassen, können hergestellt werden. Solche Kits werden verwendet, um DNA zu detektieren, die mit der humanen VR3-Rezeptor DNA hybridisiert, oder um das Vorhandensein von humanem VR3-Rezeptorprotein oder Peptidfragmenten in einer Probe zu detektieren. Solch eine Charakterisierung ist für eine Vielzahl von Zwecken nützlich, einschließlich, aber nicht limitiert auf, forensische Analysen, diagnostische Anwendungen und epidemiologischen Studien.
  • Diese Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von humanen VR3-Polynukleotiden für die Verwendung als diagnostische Reagenzien. Die Detektion einer mutierten Form des humanen VR3-Gens, die mit einer Dysfunktion verbunden ist, stellt ein diagnostisches Hilfsmittel bereit, das zu einer Diagnose einer Erkrankung oder der Empfänglichkeit für eine Erkrankung, welche sich aus einer Unterexpression oder einer Überexpression des humanen VR3 ergibt, beitragen kann oder eine Diagnose definieren kann. Individuen, die Mutationen in dem humanen VR3-Gen tragen, können auf DNA-Ebene durch eine Vielzahl auf dem Fachgebiet gut bekannten und hierin beschriebenen Techniken aufgespürt werden.
  • Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, das rekombinante Protein und Antikörper können verwendet werden, um die Mengen der humanen VR3-Rezeptor DNA, der humanen VR3-Rezeptor RNA oder des humanen VR3-Rezeptorproteins zu messen. Die rekombinanten Proteine, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle und Antikörper eignen sich für die Formulierung von Kits, die für die Detektion und die Typisierung des humanen VR3-Rezeptors eignen. Solch ein Kit würde einen aufgeteilten Träger umfassen, der geeignet ist, in zumindest einen Container in strengem Gewahrsam zu halten. Der Träger würde weiterhin Reagenzien umfassen, wie zum Beispiel rekombinantes humanes VR3-Rezeptorprotein oder anti-humane VR3-Rezeptor Antikörper, die für die Detektion von humanem VR3-Rezeptor geeignet sind. Der Träger kann auch ein Mittel für die Detektion umfassen, wie zum Beispiel markierte Antigene oder Enzymsubstrate oder ähnliches.
  • Gentherapie
  • Nukleotidsequenzen, die zu den humanen VR3-Rezeptor kodierenden DNA-Sequenzen komplementär sind, können für die Antisense Therapie synthetisiert werden. Diese antisense-Moleküle können DNA, stabile Derivate der DNA wie zum Beispiel Phosphorothioat oder Methylphosphonat, RNA, stabile Derivate der RNA wie zum Beispiel 2-O-AlkylRNA, oder andere humane VR3-Rezeptor antisense-Oligonukleotidmimetika sein. Die humanen VR3-Rezeptor antisense-Moleküle können in die Zellen durch Mikroinjektion, Liposomeneinkapselung oder durch Expression von Vektoren, die die antisense-Sequenz beinhalten, eingeführt werden. Eine humane VR3-Rezeptor Antisense Therapie kann besonders für die Behandlung von Erkrankungen nützlich sein, wo es von Vorteil ist, die humane VR3-Rezeptoraktivität zu verringern.
  • Eine humane VR3-Rezeptor Gentherapie kann verwendet werden, um den humanen VR3-Rezeptor in die Zellen eines Zielorganismus einzubringen. Das humane VR3-Rezeptorgen kann in virale Vektoren ligiert werden, die den Transfer der humanen VR3-Rezeptor-DNA durch Infektion der Empfängerzellen vermitteln. Geeignete virale Vektoren umfassen Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren, Herpesviren, Vacciniaviren, Polioviren und Ähnliche. Wahlweise kann die humane VR3-Rezeptor DNA für die Gentherapie in Zellen durch nicht-virale Techniken transferiert werden, einschließlich Rezeptor-mediierter gezielt ausgerichteter DNA-Transfer unter Verwendung von Liganden-DNA-Konjugate oder Adenovirus-Ligand-DNA-Konjugate, Lipofectin-Membranfusion oder direkte Mikroinjektion. Diese Verfahren und die Varianten davon sind für die ex vivo als auch die in vivo humane VR3-Rezeptor Gentherapie geeignet. Die humane VR3-Rezeptor Gentherapie kann besonders nützlich zur Behandlung von Erkrankungen sein, wo es von Vorteil ist, die humane VR3-Rezeptoraktivität zu erhöhen. Protokolle für die molekularen Methoden der Gentherapie, die für die Verwendung mit dem humanen VR3-Rezeptorgen geeignet sind, werden beschrieben in Gene Therapy Protocols, herausgegeben von Paul D. Robbins, Human press, Totawa NJ, 1996.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Pharmazeutisch verwendbare Zusammensetzungen, die die humane VR3-Rezeptor DNA, die humane VR3-Rezeptor RNA, oder humanes VR3-Rezeptorprotein, oder Modulatoren der humanen VR3-Rezeptoraktivität umfassen, können entsprechend den bekannten Methoden formuliert werden, wie zum Beispiel durch den Zusatz von pharmazeutisch verträglichen Trägern. Beispiele von solchen Trägern und Verfahren der Formulierungen können gefunden werden in Remington's Pharmaceutical Sciences. Um eine pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung zu schaffen, die für eine effektive Verabreichung geeignet ist, werden solche Zusammensetzungen eine effektive Menge des Proteins, der DNA, der RNA oder der Modulatoren enthalten.
  • Erfindungsgemäße therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen werden einem Individuum in Mengen verabreicht, die ausreichend sind, um Erkrankungen zu behandeln oder zu diagnostizieren, in welchen die Modulation der humanen VR3-Rezeptor-bezogenen Aktivität angezeigt ist. Die effektive Menge kann gemäß einer Vielzahl von Faktoren variieren, wie zum Beispiel der individuelle Zustand, Gewicht, Geschlecht und Alter. Andere Faktoren umfassen die Art der Verabreichung. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum auf einer Vielzahl von Wegen zur Verfügung gestellt werden, wie zum Beispiel subkutan, topisch, oral und intramuskulär.
  • Der Begriff "chemisches Derivat" beschreibt ein Molekül, das zusätzliche chemische Reste enthält, die normalerweise nicht Teil des Grundmoleküls sind. Solche Reste können die Löslichkeit, die Halbwertszeit, die Absorption, etc. des Grundmoleküls verbessern. Wahlweise können die Reste unerwünschte Nebeneffekte des Grundmoleküls vermindern oder die Toxizität des Grundmoleküls erniedrigen. Beispiele solcher Reste werden in einer Vielzahl von Texten beschrieben, wie zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Sciences.
  • Die gemäß der hierin offenbarten Verfahren identifizierten Verbindungen können alleine in entsprechenden Dosierungen verwendet werden, die durch Routineuntersuchungen definiert werden, um eine optimale Inhibition des humanen VR3-Rezeptors oder seiner Aktivität zu erhalten, während jegliche mögliche Toxizität minimiert wird. Darüber hinaus kann die Ko-Administration oder die sequentielle Verabreichung von anderen Mitteln wünschenswert sein.
  • Die vorliegende Erfindung hat auch das Ziel, geeignete topische, orale, systemische oder parenterale pharmazeutische Formulierungen für die Verwendung in den neuen erfindungsgemäßen Methoden zur Behandlung bereitzustellen. Die Zusammensetzungen, die gemäß dieser Erfindung identifizierte Verbindungen oder Modulatoren als aktive Bestandteile für die Verwendung in der Modulation des humanen VR3-Rezeptors umfassen, können in einer Vielzahl von therapeutischen Dosierungsformen in für die Verabreichung herkömmlichen Vehikeln verabreicht werden. Zum Beispiel können die Verbindungen oder Modulatoren in solchen oralen Dosierungsformen verabreicht werden, wie Tabletten, Kapseln (jede umfassend Formulierungen zur Freisetzung mit Zeitverzögerung und konstanter Geschwindigkeit), Pillen, Puder, Granulate, Elixiere, Tinkturen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Emulsionen, oder durch Injektion. Ebenso können sie auch intravenös (sowohl als Bolus als auch als Infusion), intraperitoneal, subkutan, topisch mit oder ohne Okklusion, oder intramuskulär verabreicht werden, alle verwendeten Formen sind dem Fachmann auf dem pharmazeutischen Fachgebiet gut bekannt. Eine effektive, aber nicht toxische Menge der gewünschten Verbindung kann zum Einsatz als ein humanes VR3-Rezeptor modulierendes Mittel zum Einsatz kommen.
  • Die tägliche Dosierung der Produkte kann über einen breiten Bereich von 0.01 bis 1.000 mg pro Patient, pro Tag, variiert werden. Für die orale Verabreichung werden die Zusammensetzungen bevorzugt in der Form von angeritzten oder unangeritzten Tabletten zur Verfügung gestellt, die 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0 und 50.0 mg des aktiven Bestandsteils für die symptompatische Einstellung der Dosierung auf den zu behandelnden Patienten enthalten. Eine effektive Menge der Arznei wird gewöhnlich in einer Dosierungsmenge von ungefähr 0,0001 mg/kg bis ungefähr 100 mg/kg pro Körpergewicht pro Tag bereitgestellt. Der Bereich ist noch bevorzugter von ungefähr 0,001 mg/kg bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die Dosierungen der humanen VR3-Rezeptor Modulatoren werden angepasst, wenn sie kombiniert werden, um gewünschte Effekte zu erzielen. Demgegenüber können die Dosierungen dieser unterschiedlichen Mittel unabhängig optimiert und kombiniert werden, um ein synergistisches Ergebnis zu erzielen, wobei die Pathologie stärker herab gesetzt ist, als sie sein würde, wenn eins von den beiden Mittel alleine verwendet werden würde.
  • Vorteilhafterweise können die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung in einer einzigen täglichen Dosis verabreicht werden, oder die Gesamt-Tagesdosis kann in aufgeteilten Dosierungen zwei-, drei- oder viermal täglich verabreicht werden. Weiterhin können die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung in intranasaler Form, mit Hilfe der topischen Verwendung von geeigneten intranasalen Vehikeln, oder via transdermaler Wegen unter Verwendung von jenen Formen von transdermalen Hautpflastern verabreicht werden, die jenen auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Um in der Form eines transdermalen Zuführungssystems verabreicht zu werden, wird die Verabreichung der Dosierung sicherlich eher kontinuierlich als unterbrochen während der gesamten Dosierungsregimen sein.
  • Für die Kombinationsbehandlung mit mehr als einem aktiven Mittel, wobei die aktiven Mittel in separaten Dosierungsformulierungen sind, können die aktiven Mittel gleichzeitig verabreicht werden, oder sie können jedes für sich zu versetzten Zeitpunkten verabreicht werden.
  • Das Dosierungsregimen, das die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung verwendet, wird in Übereinstimmung mit einer Vielzahl von Faktoren ausgewählt, einschließlich der Art, der Spezies, des Alters, des Gewichtes, des Geschlechts und des medizinischen Zustands des Patienten; der Ernsthaftigkeit des zu behandelnden Zustandes; der Route der Verabreichung; der renalen und hepatischen Funktion des Patienten; und der bestimmten, dafür verwendeten Verbindung. Ein durchschnittlicher Mediziner oder Veterinär kann leicht die effektive Menge der Arznei bestimmen und verordnen, die erforderlich ist, um dem Voranschreiten des Zustandes vorzubeugen, dem entgegenzuwirken oder aufzuhalten. Die optimale Präzision bei dem Erlangen der Konzentrationen der Arznei innerhalb des Bereiches, der eine Wirksamkeit ohne Toxizität erzielt, erfordert ein Regimen basierend auf den Kinetiken der Arzneimittelverfügbarkeit an den Zielstellen. Dieses umfasst Überlegungen bezüglich der Verteilung, des Gleichgewichts und der Eliminierung der Arznei.
  • In den Methoden der Erfindung können die hierin im Detail beschriebenen Verbindungen oder Modulatoren die aktiven Bestandteile bilden und werden üblicherweise als Gemisch mit geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Arzneistoffträger oder Träger (hierin gemeinsam als "Träger"-Materialien bezeichnet), die entsprechend hinsichtlich der beabsichtigten Form der Verabreichung ausgewählt wurden, verabreicht, das heißt orale Tabletten, Kapseln, Elixiere, Sirups und ähnliches und in Übereinstimmung mit herkömmlichen pharmazeutischen Praktiken.
  • Zum Beispiel kann für die orale Verabreichung in Form einer Tablette oder Kapsel die aktive Arzneikomponente mit einem oralen, nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen, inerten Träger kombiniert werden, wie zum Beispiel Ethanol, Glycerol, Wasser und ähnliches. Darüber hinaus können, wenn es erwünscht oder erforderlich ist, geeignete Bindemittel, Gleitmittel, disintegrierende Mittel und einfärbende Mittel in dem Gemisch aufgenommen werden. Geeignete Bindemittel umfassen, ohne Einschränkung, Stärke, Gelatine, natürliche Zucker, wie zum Beispiel Glukose oder beta-Laktose, Getreidesüßstoffe, natürliche und synthetische Gummi, wie zum Beispiel Akazie, Traganthgummi oder Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Polyethylenglycol, Wachse und ähnliches. In diesen Dosierungsformen verwendete Gleitmittel umfassen, ohne Einschränkung, Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid und ähnliches. Disintegratoren umfassen, ohne Einschränkung, Stärke, Methylcellulose, Agar, Bentonit, Xanthan und ähnliches.
  • Für flüssige Formen kann die aktive Arzneimittelkomponente mit geeigneten aromatisierten Füllmitteln oder Dispergiermitteln kombiniert werden, wie zum Beispiel synthetische und natürliche Gummi, wie zum Beispiel Traganth, Akazie, Methylcellulose und ähnliches. Andere Dispergiermittel, die verwendet werden können, umfassen Glycerin und ähnliches. Für die parenterale Verabreichung sind sterile Suspensionen und Lösungen wünschenswert. Isotonische Herstellungen, welche üblicherweise geeignete Konservierungsmittel enthalten, werden verwendet, wenn die intravenöse Verabreichung erwünscht ist.
  • Die topischen Präparate, die den aktiven Arzneimittelbestandteil enthalten, können mit einer Vielzahl von auf dem Fachgebiet gut bekannten Trägermaterialien zusammen gemischt werden, wie zum Beispiel beispielsweise Alkohole, Aloe Vera Gel, Allantoin, Glycerin, Vitamin A- und E-Öle, Mineralöl, PPG2-Myristylpropionat und ähnliches, um zum Beispiel alkoholische Lösungen, topische Reinigungsmittel, Reinigungscremes, Hautgele, Hautlotionen und Shampoos in Creme- oder Gelformulierungen zu bilden.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen oder Modulatoren können auch in Form von Liposomen-Zuführungssystemen verabreicht werden, wie zum Beispiel kleine unilamellare Vesikel, große unilamellare Vesikel und multilamellare Vesikel. Liposomen können aus einer Vielzahl von Phospholipiden gebildet werden, wie zum Beispiel Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholin.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch verabreicht werden, indem monoklonale Antikörper als individuelle Träger, an welche die Verbindungsmoleküle gekoppelt sind, verwendet werden. Die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung können auch mit löslichen Polymeren als markierbare Arzneimittelträger gekoppelt sein. Solche Polymere können Polyvinyl-Pyrrolidon, Pyrancopolymer, Polyhydroxypropylmethacryl-Amidephenol, Polyhydroxy-Ethylaspartamidphenol, oder Polyethyl-Eneoxidpolylysin, substituiert mit Palmitoylresten, umfassen. Darüber hinaus können die Verbindungen oder Modulatoren der vorliegenden Erfindung an eine Klasse von bioabbaubaren Polymeren gekoppelt sein, die zur Erreichung einer kontrollierten Freisetzung des Arzneimittels nützlich sind, zum Beispiel Poly-Milchsäuren, Polyepsilon-Caprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetal, Polydihydro-Pyran, Polycyanoacrylat and quervernetzte oder amphipatische Blockcopolymere von Hydrogelen.
  • Für die orale Verabreichung können die Verbindungen oder Modulatoren in Kapseln, Tabletten oder in Pillenform verabreicht werden, oder wahlweise können sie in Tierfutter gemischt werden. Die Kapseln, Tabletten und Pillen beinhalten den aktiven Bestandteil in Kombination mit einem geeigneten Trägervehikel, wie zum Beispiel Stärke, Talk, Magnesiumstearat oder di-Calciumphosphat. Diese Einheits-Dosierungsformen (unit dosage forms) werden hergestellt, indem der aktive Bestandteil mit geeigneten fein gepuderten inerten Bestandteilen, umfassend Verdünnungsmittel, Füller, disintegrierende Mittel und/oder Bindemittel, gut gemischt wird, so dass ein gleichmäßiges Gemisch erhalten wird. Ein inerter Bestandteil ist einer, der nicht mit den Verbindungen oder Modulatoren reagiert und welcher nicht toxisch ist für das zu behandelnde Lebewesen. Geeignete inerte Bestandteile umfassen Stärke, Lactose, Talk, Magnesiumstearat, Pflanzengummi und Öle und ähnliches. Diese Formulierungen können weit voneinander abweichende Mengen der aktiven und inaktiven Bestandteile enthalten, in Abhängigkeit von zahlreichen Faktoren, wie zum Beispiel der Größe und der Art der zu behandelnden Lebewesen-Spezies und der Art und der Ernsthaftigkeit der Infektion. Der aktive Bestandteil kann auch als Zusatz zum Futter verabreicht werden, indem die Verbindung mit dem Futter einfach gemischt wird oder indem die Verbindung auf die Oberfläche des Futters aufgetragen wird. Wahlweise kann der aktive Bestandteil mit einem inerten Träger gemischt werden und die resultierende Zusammensetzung kann dann entweder mit dem Futter gemischt werden oder direkt dem Lebewesen gefüttert werden. Geeignete inerte Träger umfassen Getreidemehl, Zitrusmehl, Fermentationsreste, Soja-Körner, getrocknete Körner und ähnliches. Die aktiven Bestandteile werden mit diesen inerten Trägern durch Vermahlen, Rühren, Zerkleinern oder Durcheinanderbringen gut gemischt, so dass die endgültige Zusammensetzung von 0,001 bis 5 Massenanteile in Prozent des aktiven Bestandteils enthält.
  • Die Verbindungen oder Modulatoren können wahlweise parenteral via Injektion einer Formulierung verabreicht werden, die aus dem aktiven Bestandteil gelöst in einem inerten liquiden Träger besteht. Die Injektion kann entweder intramuskulär, intraruminal, intratracheal oder subkutan erfolgen. Die injizierbaren Formulierungen bestehen aus dem aktiven Bestandteil, gemischt mit einem geeigneten inerten liquiden Träger. Verträgliche liquide Träger umfassen vegetarische Öle, wie zum Beispiel Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Sesamöl und ähnliches, als auch organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel Solketal, der Form halber Glycerol und ähnliches. Als Alternative können auch wässrige parenterale Formulierungen verwendet werden. Die pflanzlichen Öle sind die bevorzugten liquiden Träger. Die Formulierungen werden hergestellt, indem der aktive Bestandteil in dem liquiden Träger gelöst oder suspendiert wird, so dass die endgültige Formulierung von 0,005 bis 10 Massenanteile in Prozent des aktiven Bestandteils enthält.
  • Eine topische Anwendung der Verbindungen und Modulatoren ist möglich durch die Verwendung einer flüssigen Dusche (liquid drenche) oder eines Shampoos, welche die vorliegenden Verbindungen oder Modulatoren als eine wässrige Lösung oder Suspension enthalten. Diese Formulierungen enthalten im Allgemeinen ein Stellmittel, wie zum Beispiel Bentonit und umfassen üblicherweise ein Anti-Schäummittel. Formulierungen, die von 0,005 bis 10 Massenanteil in Prozent des aktiven Bestandteils umfassen, sind verträglich. Bevorzugte Formulierungen sind jene, die von 0,01 bis 5 Massenanteile in Prozent der vorliegenden Verbindungen oder Modulatoren umfassen.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, jedoch ohne darauf einschränkend zu wirken.
  • BEISPIEL 1 Bildung von humanen cDNA-Bibliotheken aus Prostata und Hypophyse cDNA-Synthese:
  • Synthese des ersten Stranges: Ungefähr 5 μg humaner mRNA aus Prostata oder Hypophyse (Clontech) sind verwendet worden, um cDNA unter Verwendung des cDNA-Synthesekits (Life Technologies) zu synthetisieren. Zwei Mikroliter der Not1-Primeradapter sind den 5 μl mRNA hinzugefügt worden und das Gemisch ist auf 70°C für 10 Minuten erhitzt worden und auf Eis platziert worden. Die folgenden Reagenzien sind auf dem Eis hinzugemischt worden: 4 μl des 5 × First Strand Buffer (250 mM TRIS-HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2), 2 μl 0,1 M DTT, 10 mM dNTP (Nucleotidetriphosphat)-Gemisch und 1 μl von DEPCbehandeltem Wasser. Diese Reaktion ist für 5 Minuten bei 42°C inkubiert worden. Zum Schluss sind 5 μl der Superscript RT II hinzugefügt worden und für weitere 2 Stunden bei 42°C inkubiert worden. Die Reaktion ist auf Eis beendet worden.
  • Synthese des zweiten Stranges: Das Erststrangprodukt ist mit Wasser auf 93 μl abgeglichen worden und die folgenden Reagenzien sind auf Eis hinzugefügt worden: 30 μl des 5 × 2nd Strand Puffers (100 mM TRIS-HCl (pH 6,9), 450 mM KCl, 23 mM MgCl2, 0,75 mM β-NAD+, 50 mM (NH4)2SO4), 3 μl 10 mM dNTP (Nucleotidetriphosphat), 1 μl E. coli DNA-Ligase (10 units) 1 μl RNase H (2 units), 4 μl DNA pol I (10 units). Die Reaktion ist für 2 Stunden bei 16°C inkubiert worden. Die DNA aus der Zweitstrangsynthese ist mit T4 DNA- Polymerase behandelt worden und bei 16°C platziert worden, um die DNA-Enden stumpf zu machen. Die Doppelstrang-cDNA ist mit 150 μl eines Gemisches aus Phenol und Chloroform (1:1, v:v) extrahiert worden und mit 0,5 Volumen einer 7,5 M NH40Ac und 2 Volumen absolutem Ethanol präzipitiert worden. Das Pellet ist mit 70% Ethanol gewaschen worden und bei 37°C getrocknet worden, um das restliche Ethanol zu entfernen. Das Doppelstrang-DNA-Pellet ist in 25 μl Wasser resuspendiert worden und die folgenden Reagenzien sind hinzugefügt worden: 10 μl eines 5 × T4 DNA-Ligasepuffers, 10 μl Sal1-Adapters und 5 μl einer T4 DNA-Ligase. Die Bestandteile sind behutsam gemischt worden und über Nacht bei 16°C ligiert worden. Das Ligationsgemisch ist mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol extrahiert worden, gründlich gevortext worden und bei Raumtemperatur für 5 Minuten bei 14.000 g zentrifugiert worden, um die Phasen zu trennen. Die wässrige Phase ist in ein neues Tube transferiert worden und das Volumen wurde mit Wasser auf 100 ml angepasst. Die aufgereinigte DNA ist auf einer Chromaspin 1000 Säule (Clontech) Größen-selektiert worden, um die kleineren cDNA-Moleküle zu entfernen. Die Doppelstrang-DNA ist mit Not1-Restriktionsenzym für 3–4 Stunden bei 37°C verdaut worden. Das Restriktionsverdau ist auf einem 0,8%-igen low melting Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen worden. Die cDNA in einem Bereich von 1–5 kb ist ausgeschnitten worden und unter Verwendung von Gelzyme (In Vitrogen) gereinigt worden. Das Produkt ist mit Phenol:Chloroform extrahiert worden und mit NH4OAc und absolutem Ethanol präzipitiert worden. Das Pellet ist mit 70%-igem Ethanol gewaschen worden und in 10 ml Wasser resuspendiert worden.
  • Ligation der cDNA in den Vektor: Die cDNA ist in 5 Tubes (2 μl in jedes) aufgeteilt worden und die Ligationsreaktionen sind durch Zugabe von 4,5 μl Wasser, 2 μl eines 5 × Ligationspuffers, 1 μl einer p-Sport Vektor-DNA (geschnitten mit Sal-1/Not1 und Phosphatase behandelt) und 0,5 μl einer T4 DNA-Ligase hergestellt worden. Die Ligation ist über Nacht bei 40°C inkubiert worden.
  • Einbringen der ligierten cDNA in E. coli durch Elektroporation:
  • Das Volumen der Ligationsreaktion ist auf ein Gesamtvolumen von 20 μl mit Wasser eingestellt worden. 5 ml einer Hefe-tRNA, 12,5 ml einer 7,5 M NH4OAc und 70 ml von absolutem Ethanol (–20°C) sind hinzugefügt worden. Das Gemisch ist sorgfältig gevortext worden und umgehend bei Raumtemperatur für 20 Minuten bei 14000 x g zentrifugiert worden. Die Pellets sind in 70%-igem Ethanol gewaschen worden und jedes Pellet ist in 5 ml Wasser resuspendiert worden. Alle fünf Ligierungen (25 ml) sind gepoolt worden und 100 μl von DH10B elektrokompetenten Zellen (Life Technologies) sind mit 1 ml der DNA elektroporiert worden (Gesamtzahl von 20 Elektroporationen), dann auf Ampicillinplatten ausplattiert worden, um die Anzahl von Rekombinanten (cfu) pro Mikroliter zu bestimmen. Die gesamte Bibliothek ist in 2 Litern Super Broth gesät worden und Maxi Preps sind unter Verwendung des Promega Maxi Prep Kits hergestellt worden und auf Cäsiumchloridgradienten gereinigt worden.
  • BEISPIEL 2: Bibliothekenscreening/Bildung von humanem VR3 A+B+
  • Untersuchung der Bibliothek aus der humanen Hypophyse:
  • Ein-μl Aliquots der Bibliothek aus der humanen Hypophyse sind in Electromax DH10B-Zellen (Life Technologies) elektroporiert worden. Das Volumen ist auf 1 ml mit SOC-Medium abgeglichen worden und für 45 Minuten bei 37°C unter Schütteln inkubiert worden. Die Bibliothek ist dann auf 150 cm2-Platten, die LB enthalten, in einer Dichte von 20000 Kolonien pro Platte ausplattiert worden. Diese Kulturen sind über Nacht bei 37°C gezogen worden.
  • Eine humane VR3-Rezeptorprobe ist durch eine Polymerasekettenreaktion unter Verwendung der folgenden Primerpaare generiert worden:
    Figure 00340001
  • Die Probe ist unter Verwendung einer PCR, die unter normalen PCR-Bedingungen erfolgte, die 5'- und 3'-Probenoligos (jedes 100 ng) und 10 ng der diluierten Miniprep-DNA verwendete, erzeugt worden. Das resultierende 493 bp Fragment wurde auf einem 1%-igen Agarosegel laufen gelassen und unter Verwendung eines QUIAquick-Gelextraktionskits (Quiagen) gereinigt. Ungefähr 100 ng der aufgereinigten Probe ist mit alpha 32P unter Verwendung des Oligolabeling-Kits von Pharmacia markiert worden und die markierte DNA ist mit einer S-200 Säule (Pharmacia) aufgereinigt worden.
  • Die Bibliothekskolonien sind auf Protran Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schuel) abgehoben worden und die DNA ist in 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH denaturiert worden. Die Filterscheiben sind mit 1,5 M NaCl, 1,0 M Tris-HCl, pH 7,5 neutralisiert worden und dann auf der Membran unter Verwendung eines UV-Stratalinkers (Stratagene) UV quervernetzt worden. Die Filter sind dann einige Male mit einer Waschlösung (1 M Tris-HCl, pH 8,0; 5 M NaCl; 0,5 M EDTA; 20% SDS) bei 42°C gewaschen worden. Dann sind die Scheiben in einem 1 × Southern Prä-Hybridisierungspuffer (5'-3' Inc), welcher 50% Formamid und 100 μg/ml gescherter Lachssperma-DNA (5'-3' Inc) enthält, für 6 Stunden bei 42°C inkubiert worden. Zum Schluss ist die Hybridisierung über Nacht bei 42°C in einem 1 × Hybridisierungspuffer (5'-3'), welcher 50% Formamid, 100 ng der gescherten Lachssperma-DNA enthält, in Gegenwart von markierter Probe (5×105 bis 1×106 cmp/ml des Hybridisierungspuffers) durchgeführt worden.
  • Die Scheiben sind dann zweimal in 2 × SSC, 0,2% SDS bei Raumtemperatur (jede 20 Minuten) gewaschen worden und einmal in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C für 30 Minuten. Die Membranen sind dann auf Filterpapier platziert worden, in Plastiktüten eingewickelt worden und einem Film bei –20°C über Nacht ausgesetzt worden.
  • Die positiven Klone sind identifiziert worden und gesammelt worden, indem die Kolonien aus der Originalplatte ausgekernt wurden. Die Kolonien sind in LB für 1 Stunde bei 37°C inkubiert worden. Verdünnungen der Kulturen sind auf LB Agarplatten ausplattiert worden und das Abheben auf den Filter, die Hybridisierung, das Waschen, die Prozedur des Kolonien Pickens ist wiederholt worden. Einzelne Klone aus dem zweiten Suchtest sind gepickt worden und mit SalI/NotI verdaut worden, um die Größe der Inserts zu bestimmen und die Inserts sind sequenziert worden.
  • Der vollständige Klon ist mit Hilfe der PCR mit Pfu-Polymerase unter Verwendung von 10 ng des sequenzierten Bibliotheksklon als Template und vollständigen Oligos mit KpnI (FL 5' Oligo SEQ, ID. NO. 3) und NotI (FL 3' Oligo SEQ.ID.NO.4) Stellen erzeugt worden.
  • Figure 00350001
  • Das PCR-Produkt ist mit KpnI und NotI Enzymen verdaut worden und in einen pSP64T.GC Expressionsvektor kloniert worden. Präparationen der DNA sind in großem Umfang unter Verwendung eines MEGA-Prep-Kit (Quiagen) gemacht worden.
  • BEISPIEL 3:: Bibliothekenscreening/Bildung von humanem VR3 A+B– und humanem VR3 A–B–
  • Untersuchung der Bibliothek aus der humanen Prostata:
  • Ein-Mikroliter Aliquots der Bibliothek aus der humanen Prostata sind in Electromax DH10B-Zellen (Life Technologies) elektroporiert worden. Das Volumen ist auf 1 ml mit SOC-Medium angeglichen worden und es ist für 45 Minuten bei 37°C unter Schütteln inkubiert worden. Die Bibliothek ist dann auf 150 cm2-Platten, die LB enthalten, in einer Dichte von 20000 Kolonien pro Platte ausplattiert worden. Diese Kulturen sind über Nach bei 37°C gezogen worden.
  • Eine Probe des humanen VR3-Rezeptors ist durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung der folgenden Primerpaare generiert worden:
    Figure 00360001
  • Die Probe ist durch eine PCR, die unter Verwendung normaler PCR-Bedingungen erfolgte, die 5'- und 3'-Probenoligos (jedes 100 ng) und 10 ng der diluierten Miniprep-DNA verwendete, erzeugt worden. Das resultierende 387 bp Fragment wurde auf einem 1%-igen Agarosegel laufen gelassen und unter Verwendung eines QUIAquick-Gelextraktionskit (Quiagen) aufgereinigt. Ungefähr 100 ng der gereinigten Probe ist mit alpha 32P unter Verwendung des Oligolabeling-Kits von Pharmacia markiert worden und die markierte DNA ist dann auf S-200-Säulen (Pharmacia) aufgereinigt worden.
  • Die Bibliothekskolonien sind auf Protran Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schuel) abgehoben worden und die DNA ist mit 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH denaturiert worden. Die Filterscheiben sind dann mit 1,5 M NaCl, 1,0 M Tris-HCl, pH 7,5 neutralisiert worden und dann auf der Membran unter Verwendung eines UV-Stratalinkers (Stratagene) durch UV quervernetzt worden. Die Filter sind dann einige Male mit einer Waschlösung (1 M Tris-HCl, pH 8,0; 5 M NaCl; 0,5 M EDTA; 20% SDS) bei 42°C gewaschen worden. Dann sind die Scheiben in einem 1 × Southern Prä-Hybridisierungspuffer (5'-3' Inc), der 50% Formamid und 100 μg/ml gescherter Lachssperma-DNA (5'-3' Inc) enthält, für 6 Stunden bei 42°C inkubiert worden. Zum Schluss ist die Hybridisierung über Nacht bei 42°C in einem 1 × Hybridisierungspuffer (5'-3'), der 50% Formamid, 100 ng gescherter Lachssperma-DNA enthält, in Gegenwart der markierten Proben (5 × 105 bis 1 × 106 cmp/ml des Hybridisierungspuffers), durchgeführt worden.
  • Die Scheiben sind dann zweimal mit 2 × SSC, 0,2% SDS bei Raumtempratur (je 20 Minuten) gewaschen worden und einmal in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C für 30 Minuten. Die Membranen sind dann auf Filterpapier gelegt worden, in Plastiktüten eingewickelt worden und einem Film bei –20°C über Nacht ausgesetzt worden.
  • Die positiven Klone sind identifiziert und gesammelt worden, indem die Kolonien aus der Originalplatte ausgekernt wurden. Die Kolonien sind in LB für 1 Stunde bei 37°C inkubiert worden. Verdünnungen der Kulturen sind auf LB Agarplatten ausplattiert worden und das Abheben auf den Filter, die Hybridisierung, das Waschen, die Prozedur des Kolonien Pickens ist wiederholt worden. Einzelne Klone aus dem zweiten Suchtest sind gepickt worden und mit EcoRI/NotI verdaut worden, um die Größe der Inserts zu bestimmen und die Inserts sind sequenziert worden.
  • Der vollständige Klon ist mit Hilfe der PCR mit Pfu-Polymerase unter Verwendung von 10 ng des sequenzierten Bibliotheksklon als Template und vollständigen Oligos mit NotI (FL 5' Oligo SEQ, ID. NO.: 15) und XbaI (FL 3' Oligo SEQ.ID.NO.: 16) Stellen erzeugt worden.
  • Figure 00370001
  • Das PCR-Produkt ist mit NotI und XbaI Enzymen verdaut worden und in einen pGem HE Expressionsvektor kloniert worden. Präparationen der DNA sind in großem Umfang unter Verwendung eines MEGA-Prep-Kit (Quiagen) gemacht worden.
  • BEISPIEL 4: Klonierung der humanen VR3-Rezeptor cDNA in einem S äugetierexpressionsvektor
  • Die humanen VR3-Rezeptor cDNAs (gemeinsam bezeichnet als hVR3) sind in den Säugetierexpressionsvektor pcDNA3.1/Zeo(+) kloniert worden. Das klonierte PCR-Produkt ist auf einer Säule (Wizard PCR DNA purification kit von Promega) aufgereinigt worden und mit NotI und EcoRI (NEB) verdaut worden, um kohäsive Enden zu bilden. Das Produkt ist durch eine Elektrophorese auf einem Agarosegel mit geringem Schmelzpunkt aufgereinigt worden. Der pcDNA3.1/Zeo(+)-Vektor ist mit NotI und XbaI (außer für hVR3 A+B+, welcher in BamHI/NotI Stellen kloniert worden ist) Enzymen verdaut worden und anschließend auf einem Low Melting Point Agarose-Gel aufgereinigt worden. Der lineare Vektor ist verwendet worden, um an die humanen VR3-cDNA-Inserts ligiert zu werden. Die Rekombinanten sind isoliert worden, als humane VR3-Rezeptor bezeichnet worden und verwendet worden, um Säugetierzellen zu transfizieren (HEK293, COS-7 oder CHO-K1 Zellen) unter Verwendung des Effectene non-liposomal lipid based transfection kit (Quiagen). Stabile Zellklone sind durch das Wachstum in Gegenwart von Zeocin selektiert worden. Einzelne Zeocin-resistente Klone sind isoliert worden und es ist gezeigt worden, dass sie das intakte humane VR3-Rezeptorgen umfassen. Klone, die die humaner VR3-Rezeptor cDNAs umfassen, sind auf die hVR3-Proteinexpression hin analysiert worden. Rekombinante Plasmide, welche die humane VR3-codierende DNA enthalten, sind verwendet worden, um Säugetier-COS oder CHO-Zellen oder HEK293 Zellen zu transformieren.
  • Die den humanen VR3-Rezeptor exprimierenden Zellen, stabil oder transient, sind verwendet worden, um auf die Expression des humanen VR3-Rezeptors und die 3H-RTX-Bindungsaktivität hin zu testen. Diese Zellen sind verwendet worden, um andere Verbindungen zu identifizieren auf ihre Fähigkeit hin und zu untersuchen, den humanen VR3-Rezeptor zu modulieren, zu inhibieren oder zu aktivieren und die radioaktive 3H-RTX-Bindung zu kompetitieren.
  • Kassetten, die die humane VR3-Rezeptor DNA in positiver Orientierung mit Hinblick auf den Promotor enthalten, werden in geeignete Restriktionsstellen 3' vom Promotor ligiert und durch Restriktionsstellen-Mapping und/oder Sequenzierung identifiziert. Diese cDNA-Expressionsvektoren sind in Fibroblasten Wirtszellen, zum Beispiel COS-7 (ATCC# CRL1651) und CV-1 tat [Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987)], 293. L (ATCC# CRL6362)] unter Verwendung von Standardmethoden, einschließlich, aber nicht limitiert auf, Elektroporation oder chemische Verfahren (kationische Liposomen, DEAE-Dextran, Calciumphosphat), eingefügt worden. Transfizierte Zellen und Zellkulturüberstände werden geerntet und auf die Expression des humanen VR3-Rezeptors hin analysiert, wie hierin beschrieben.
  • Alle Vektoren, die für die transiente Säugetier-Expression verwendet werden, können verwendet werden, um stabile Zelllinien, die den humanen VR3-Rezeptor exprimieren, zu etablieren. Es wird von den nicht-veränderten humanen VR3-Rezeptor DNA-Konstrukten, die in Expressionsvektoren kloniert sind, erwartet, dass sie die Wirtszellen dahingehend programmieren, humanes VR3-Rezeptorprotein zu machen. Die Transfektions-Wirtszellen umfassen, sind aber nicht limitiert auf, CV-1-P [Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987)] tk-L [Wigler, et al., Cell 11: 223 (1977)], NS/O und dHFr-CHO [Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601, (1982)].
  • Die Ko-Transfektion eines Vektors, der die humane VR3-Rezeptor-DNA umfasst, mit einem Plasmid zur Arzneimittel-Selektion, umfassend, aber nicht einschränkend, G418, Aminoglycosid Phosphotransferase; Hygromycin, Hygromycin-B Phospholtransferase; APRT, Xanthin-Guanin Phosphoribosyl-Transferase, ermöglicht die Selektion von stabil transfizierten Klonen. Die Mengen des humanen VR3-Rezeptors werden durch die hierin beschriebenen Assays quantifiziert.
  • Humane VR3-Rezeptor cDNA-Konstrukte werden auch in Vektoren ligiert, die amplifizierbare Arzneimittelresistenzmarker für die Herstellung von Säugetierzellklonen enthalten, die die höchstmöglichen Mengen an humanen VR3-Rezeptor synthetisieren. Im Anschluss an die Einfügung dieser Konstrukte in Zellen werden die das Plasmid enthaltenden Klone mit geeigneten Mittel selektiert und die Isolierung eines überexprimierenden Klons mit einer hohen Kopieanzahl an Plasmiden erfolgt über die Selektion einer zunehmenden Dosis des Mittels.
  • Die Expression des rekombinanten humanen VR3-Rezeptors wird durch die Transfektion der vollständigen humanen VR3-Rezeptor cDNA in eine Säugetierwirtszelle erreicht.
  • BEISPIEL 5 – Charakterisierung des durch pVR3R kodierten funktionalen Proteins in Xenopus-Oocyten
  • Xenopus laevis Oocyten sind hergestellt worden und unter Verwendung von zuvor beschriebenen und auf dem Fachgebiet bekannten Standardmethoden (Fraser et al., 1993) injiziert worden. Die Ovarianlappen sind aus den erwachsenen weiblichen Xenopus laevis (Nasco, Fort Atkinson, WI) herausgearbeitet worden, einige Male mit dem Namen nach calciumfreier Saline gespült worden, umfassend: 82,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, mit NaOH (OR-2) auf pH 7,0 eingestellt und vorsichtig OR-2 enthaltender 0,2% Collagenase Typ 1 (ICN Biomedicals, Aurora, Ohio) für 2 bis 5 Stunden vorsichtig geschüttelt worden. Wenn ungefähr 50% der follikulären Schichten entfernt worden sind, sind Phase V und VI Oocyten selektiert worden und mit Medium gespült worden, das zusammengesetzt ist aus 75% OR-2 und 25% ND-96. Das ND-96 enthält: 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MagCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 2,5 mM Na-Pyruvat, Gentamicin (50 μg/ml), mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt. Das extrazelluläre Ca+2 ist allmählich erhöht worden und
    1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 2,5 mM Na-Pyruvat, Gentamicin (50 μg/ml), mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt. Das extrazelluläre Ca+2 ist allmählich erhöht worden und die Zellen sind für 2 – 24 Stunden vor der Injektion in ND-96 gehalten worden. Für die in vitro Transkription ist pGEM HE (Liman et al., 1992), welcher humanes VR3 enthält, mit NheI linearitsiert worden und mit T7 RNA-Polymerase (Promega) in der Gegenwart des Cap-Analogs m7G(5')ppp(5')G transkribiert worden. Die synthetisierte cRNA ist mit Ammoniumacetat und Isopropanol präzipitiert worden und in 50 μl Nuklease-freiem Wasser resuspendiert worden. Die cRNA ist unter Verwendung eines Formaldehydgels (1% Agarose, 1 × MOPS, 3% Formaldehyd) in Abhängigkeit eines 1,2 und 5 μl RNA-Marker (Gibco BRL, 0,24 bis 9,5 Kb) quantifiziert worden.
  • Den Oocyten ist 50 nl der humanen VR3-Rezeptor RNA (0,3 bis 5 ng) mit oder ohne Ko-Injektion des VR1 (2–3 ng) injiziert worden. Kontroll-Oocyten ist 50 nl Wasser injiziert worden. Die Oocyten sind für 1 bis 13 Tage vor der Analyse auf die Expression des humanen VR3 hin in ND-96 inkubiert worden. Die Inkubationen und der Collagenase Verdau ist bei Raumtemperatur durchgeführt worden. Die injizierten Oocyten sind in 48 Loch Zellkulturclustern (Costar; Cambridge, MA) bei 18°C gehalten worden. Die Gesamtzell Agonisten-induzierten Ströme (whole cell agonist-induced currents) sind 1 – 14 Tage nach der Injektion mit einem herkömmlichen Zwei-Elektroden Voltage Clamp (GeneClamp 500, Axon Instruments, Foster City, CA) unter Verwendung von zuvor beschriebenen und auf dem Fachgebiet bekannten Methoden (Dascal, 1987) gemessen worden. Die Mikroelektroden sind mit 3 M KCl gefüllt worden, welche eine Resistenz von 1 und 2 MΩ haben. Die Zellen sind kontinuierlich mit ND96 bei ~10 ml/Minute, wenn nicht anders angezeigt, bei Raumtemperatur durchgespült worden. Die Membran-Spannung ist bei –70 mV gehalten worden, wenn nicht anders angezeigt.
  • Die Oocyten sind mit einer Vielzahl von Liganden, geringem pH und Depolarisierungs- als auch Hyperpolarisierungs-Spannungsschritten konfrontiert worden, aber es waren keine detektierbaren Unterschiede in der Membran-Konduktanz zwischen humanen VR3-exprimierenden Oocyten und Kontrolloocyen [siehe Tabelle 1]. Jedoch zeigten die mit dem humanen VR3 injizierten Oocyten Eigenschaften, die unterschiedlich von denen der Kontrollen in vier Aspekten war. Erstens, die Injektion der VR3 A+B– cRNA verursachte den Tod der Oocyten. Die Viabilität der Oocyten, denen das A-Insert enthaltenden VR3-Isoformen injiziert worden ist, war signifikant reduziert im Vergleich zu den Schwesterkontrollen 3 bis 4 Tage nach der Injektion (9). Zweitens, alle drei Isoformen des VR3 erhöhten die Hitze-induzierte Antwort (10). Drittens, die A+B– Ko-Injektion mit dem humanen VR1 produzierte einen Rhuteniumrot sensitiven Perfusions-induzierten Strom (Iperfusion) (11). Viertens, die Ko-Injektion von humaner VR3 A+B– cRNA mit humaner VR1 cRNA veränderte die Empfindlichkeit der Oocyten auf 1 μM Capsaicin, einem Agonisten des VR1-Rezeptors (12). TABELLE 1
    Stimulus VR3 A+B– (3,25–4 ng pro Oocyte injiziert, wenn nicht anders angegeben) VR3 A–B– (1,5 ng pro Oocyte injiziert) VR3 A+B+ (5 ng pro Oocyte injiziert)
    Capsaicin (1 μM) NE: n = 3 (n = 3 0,4 ng) NE: n = 3 NE: n = 3
    Eugenol (10 μM) NE: n = 3 (n = 3 0,4 ng) NE: n = 3 NE: n = 3
    Olvanil (10 μM) NE: n = 3 (n = 1 0,4 ng) NE: n = 3 NE: n = 3
    Resiniferatoxin (1 μM) NE: n = 3 (n = 1 0,4 ng) NE: n = 3 NE: n = 3
    Piperin (10 μM) NE: n = 3 (n = 1 0,4 ng) NE: n = 3 NE: n = 3
    Gingerol (10 μM) NE: n = 3 (n = 1 0,4 ng) NE: n = 3 NE: n = 3
    Guiaicol (10 μM) NE: n = 3 (n = 1 0,4 ng) NE: n = 3 NE: n = 3
    β-Phenylethylamin (100 μM) NE: n = 2 NT NT
    γ-Hydroxybutyrat (100 μM) NE: n = 2 NT NT
    Anandamid (1,15 μM; RBI) NE: n = 3 (0,4 ng injiziert) NE: n = 1 NT
    Arachodonsäure (10 μM) NT NE: n = 3 NT
    pH 4,5 bis 5,5 NE: n = 2 (4 ng cRNA): n = 1 (0,4 ng cRNA) NE: n = 1 NE: n = 1
    Depolarisierung Kein Unterschied zur Kontrolle (n = 4) Kein Unterschied zur Kontrolle (n = 6) Kein Unterschied zur Kontrolle (n = 3)
    Hyperpolarisierung Kein Unterschied zur Kontrolle (n = 4) Kein Unterschied zur Kontrolle (n = 6) Kein Unterschied zur Kontrolle (n = 3)
    NE: Keine Wirkung NT: Nicht getestet
  • Viabilität.
  • Die funktionale Expression der humanen VR3-Isoformen in Xenopus Oocyten ist gezeigt: Die Viabilität von Oocyten, gehalten in 2 Ca2+ enthaltendem ND-96, war 4 bis 6 Tage nach der Injektion mit VR3 A+B– (3,25 ng) und VR3 A+B+ ( 5 ng), aber nicht VR3 A–B– (1,5 ng) cRNA signifikant vermindert. Die Daten für VR3 A+B– und Wasser-injizierten Kontroll-Oocyten waren in fünf separaten Experimenten ähnlich und wurden kombiniert. Die toten Oocyten sind visuell unter Verwendung eines Bauch and Lomb Stereo-Mikroskop bestimmt worden. Die Daten sind unter Verwendung des Chi-Quadrattestes analysiert worden. Die VR3 A+B– injizierten Oocyten waren die am wenigsten lebensfähigen. Ungefähr nur 9% der Oocyten überlebten bis 4 bis 6 Tage nach der Injektion. Ungefähr 33% der Oocyten, denen humanes VR3 A+B+ injiziert worden war, überlebten 4 bis 6 Tage nach der Injektion. Ungefähr 67% der Wasser-injizierten Schwester-Kontroll-Oocyten überlebten die gleiche Zeitperiode unter den im Wesentlichen identischen Bedingungen. Die VR3 A–B– injizierten Oocyten zeigten eine ähnliche Lebensfähigkeit wie die Wasser-injizierten Kontrollen. Ähnliche Daten sind aus zwei separaten Chargen von cRNA erhalten worden.
  • Hitzeempfindlichkeit.
  • Gezeigt ist die funktionale Expression der humanen VR3-Isoformen in Xenopus Oocyten: Aktivierung durch Hitze. (a). Gezeigt ist der durchschnittliche Höchststrom, der von einem Hitzeanstieg von 25°C bis 46°C ausgelöst wurde und bei 46°C für mindestens 15 Sekunden aufrechterhalten wurde. Spannungsanstiege von –120 bis +80 mV über 400 mSek. sind bei einer Abtastfrequenz von 2 Sek. angelegt worden. Der gezeigte Strom war die Erhöhung des Stroms über und oberhalb des anfänglichen Stromes, ausgelöst bei +80 mV (der ganz rechte Punkt auf der in (b) gezeigten Stromspannungskurve). Den Oocyten ist jeweils 3,25, 1,5 und 5 ng VR3 A+B–, A–B– und A+B+ cRNA injiziert worden und 6 Tage später erfasst worden. Ausgefüllter Balken: Wasser-injizierte Kontrollen (n = 8); leerer Balken. VR3 A+B– Isoform (n = 11); schraffierter Balken: VR3 A–B– Isoform (n = 8); gepunkteter Balken: VR3 A+B+ Isoform (n = 5). Alle Isoformen zeigten eine signifikante Erhöhung über die Wasser-Kontrolle (p = jeweils 0,001, 0,03 und 0,007). Die Hitze-induzierte Antwort war ungefähr zweifach höher in der A+B– Isoform im Vergleich zu den anderen zwei Isoformen, aber die Unterschiede waren nicht signifikant (p = jeweils 0,051 und p = 0,16 für A+B– im Vergleich zu A–B– und A+B+). Die Daten sind aus zwei Sets von injizierten Oocyten erhalten worden. Die gezeigten Daten sind der Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwertes (b). Die durch Spannungsanstiege induzierten Ströme sind während der Anbringung der zunehmenden Hitze auf die mit Wasser injizierten Oocyten aufgezeichnet worden (oben), VR3 A+B– (zweite von oben), VR3 A–B– (drittes von oben) und VR3 A+B+ (unten). Die Oocyten sind konstant mit Ca2+ ND-96 gespült worden und die Lösung ist durch einen inline heater (TC-324B in Verbindung mit dem SH-27A inline heater; Warner Instrument Corp.) erhitzt worden. Die Anstiegs-induzierten Ströme (in microAmpere, wie auf der y-Achse angezeigt) erhalten bei Temperaturen von 37°C bis 46°C, sind gezeigt; nur die Stromspuren bei den höheren Temperaturen sind mit der entsprechenden Temperatur gekennzeichnet worden.
  • Perfusions-induzierte Ströme (Iperfusion: 11).
  • Der Beginn der Badperfusion löste eine Erhöhung der Membran-Konduktanz in den Oocyten aus, denen RNA injiziert worden waren, die von dem klonierten humanen VR1 transkribiert worden war mit und ohne RNA transkribiert von der VR3 A+B– Rezeptor cDNA, wie in 11 gezeigt. Eine mit VR1 cRNA (a) injizierte Oocyte ist einen Spannungsanstieg zwischen –120 und +80 mV über 400 mSek. unterworfen worden. Die spannungsinduzierten Ströme sind nach dem Beginn der Perfusion der Oocyten mit einer Rate von 10 ml/Min. erhöht worden. Kontroll-Anstiegsinduzierte Ströme von Oocyten in unbewegter extrazellulärer Saline (C) sind vor dem Beginn der Badperfusion von Ca2+ ND-96 aufgezeichnet worden. Während der Perfusion waren die Anstiegs-induzierten Ströme erhöht, was auf eine Erhöhung des elektrischen Leitwerts hinweist (P). Die anschließende Perfusion mit 10 μM Rhuteniumrot (RR) blockierte den Perfusions-induzierten Strom (P) in den VR1 exprimierenden Oocyten nicht. Somit war der in den lediglich VR1 exprimierenden Oocyten beobachtete Perfusionsinduzierte Strom unempfindlich gegenüber 10 μM Rhuteniumrot (A, "RR"). Jedoch war der Perfusions-induzierte Strom, der in VR3 A+B– und VR1 exprimierenden Oocyten ausgelöst wurde, drastisch durch 10 μM Rutheniumrot (B, "RR") inhibiert. Dieser Unterschied ist in 6 Oocyten beobachtet worden. Diese Blockierung war teilweise reversibel (nicht gezeigt). (b) Eine zusammen mit VR3 A+B– VR1 cRNA injizierte Oocyte ist einem Spannungsanstieg zwischen –120 und +80 mV über 400 mSek. unterworfen worden. Die Anstiegs-induzierten Ströme sind nach dem Beginn der Perfusion der Oocyten mit einer Rate von 10 ml/Min. erhöht worden. Die Perfusions-aktivierten Ströme hatten ähnliche Größen in beiden Sets von Oocyten. Vrev für RR-inhibierten Strom war ungefähr –13 mV (Pfeil). Die durch beide Agonisten induzierten Ströme wurden stark nach außen gleichgerichtet, wie zuvor für den Ratten-VR1 (Caterina et al., 1997) berichtet wurde.
  • Capsain-induzierte Ströme in den humanen VR1 exprimierenden Oocyten in Gegenwart oder Abwesenheit von humanem VR3 A+B– (12).
  • Die durch 1 μM Capsaicin (12) ausgelösten Ströme sind bei einer elektrischen Haltespannung von +50 mV gemessen worden, da die Antworten bei dieser elektrischen Spannung aufgrund der profunden Auswärtsgleichrichtung der Capsaicin-induzierten Ströme (Caterina et al., 1997) am größten waren. Gezeigt sind drei Beispiele von mit VR1 und Wasser-(eine Kontrolle für die VR3-Injektion) injizierten Oocyten (a) und mit VR1 cRNA und VR3 A+B– cRNA injizierten Oocyten (b). Das Capsaicin ist im Bad während der durch die ausgefüllten horizontalen Balken angezeigten Zeit hinzugefügt worden. Die Höhe der ersten Antwort auf 1 μM Capsaicin ist vermindert worden, wenn die VR1 cRNA mit VR3 A+B– cRNA in gleichen Teilen (2,9 ng jedes) ko-exprimiert worden war. Der bemerkenswerteste Unterschied war die Höhe und die Abklingrate der zweiten Antwort, der zweite kleine Hügel ist üblicherweise zu Beginn des Auswaschens des Capsaicins erhalten worden.
  • BEISPIEL 6 Charakterisierung des humanen VR3 in Säugetierzelllinien
  • Humane HEK293, CHO-K1 und COS-7 Zellen sind mit den humanen VR3-Isoformen pVR3A+B–R, pVR3A–B–R oder pVR3A+B+R transfiziert worden. Transiente Transfektionen von 1 μg pVR3R pro 106 Zellen pro 100 mm-Platte sind unter Verwendung des Effectene Transfektions-Kit (Quiagen; 301425) durchgeführt worden. Drei Tage nach der Transfektion sind die Zellen auf eine 96-Lochplatte (Biocoat, poly-D-Lysine beschichtet black/clear Platte; Becton Dickinson Part # 354640) ausplattiert worden. Nach einem Tag sind die Löcher mit F-12/DMEM gespült worden, dann in Fluo-4 (2 μM) mit Pluronic F-127 (20%, 40 μl sind in 20 ml Gesamtvolumen verwendet worden) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert worden. Die Platten sind unter Verwendung des FLIPR (Molecular Devices, FL-101) untersucht worden. Die Zellen sind Lösungen mit unterschiedlicher Osmolarität (40 μl sind 80 μl bei einer Geschwindigkeit von 50 μl/Sek. hinzugefügt worden) unterworfen worden. Einige Löcher sind energisch gemischt worden, um eine erhöhte Perfusion der Zellen mit der extrazellularen Lösung zu simulieren. Transfektanten mit dem Vektor alleine sind als Kontrollen verwendet worden.
  • Nach drei Tagen sind die Zellen in der Gegenwart von Neomycin (200 μg/ml) selektiert worden und sind über drei 1:10 Verdünnungspassagen für ungefähr 2 Wochen gezogen worden. Einzelne Kolonien sind gepickt worden und in 6-Lochplatten gezogen worden. Die Zellen sind dann in 96-Lochplatten (Bicoat, poly-D-Lysine coated black/clear plate; Becton Dickinson Part # 354640) ausplattiert worden und drei Tage bis zur Konfluenz gezogen worden. Die Löcher sind mit F12/DMEM gespült worden, dann in Fluo-4 (2 μM) mit Pluronicsäure (20%, 40 μl sind in 20 ml Gesamtvolumen verwendet worden) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert worden. Die Platten sind dann unter Verwendung des FLIPR (Molecular Devices, FL-101) untersucht worden. Die Zellen sind mit Agonisten (bei einer dreifachen Konzentration in 40 μl je 80 μl bei einer Geschwindigkeit von 50 μl pro Sekunde hinzugefügt) behandelt worden.
  • Die Whole-Cell Patch-Clamp-Technik (Hamill et al., 1981) ist verwendet worden, um Liganden-induzierte Ströme aus den den humanen VR3-Rezeptor stabil exprimierenden HEK293-Zellen, die zwei Tage auf 12 mm Deckgläsern gehalten worden sind, aufzuzeichnen. Die Zellen sind unter Verwendung einer Nikon Diaphot 300 mit DIC Nomarski Optics visualisiert worden. Die Zellen sind kontinuierlich in einer physiologischen Salzlösung (–0,5 ml/Min.) perfusioniert worden, wenn es nicht anders angezeigt wurde. Die physiologische Standardsaline ("Tyrodes") enthält: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2 und 10 mM hemi-Na-HEPES (pH 7,3, 295–300 mOsm, gemessen unter Verwendung einer Wescor 5500 vapor-Pressure (Wescor. Inc., Logan, UT). Die aufnehmenden Elektroden sind aus Borosilikat Kapillarröhren hergestellt worden (R6; Garner Glass, Claremont, CA), die Spitzen sind mit Dentalperipheriewachs beschichtet (Miles Laboratories, South Bend, IN) und haben eine Resistenz von 1 bis 2 MΩ, wenn sie eine intrazelluläre Saline enthalten: 100 mM K-Gluconat, 25 mM KCl, 0,483 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 10 mM hemi-Na-HEPES und 1 mM K4-BAPTA (100 nM freies Ca2 +); pH 7,4, mit hinzugefügter Dextrose, um 290 mOsm zu erhalten). Die Liquid Junction Potentiale sind –18 mV unter Verwendung von Standardpipetten und Badlösungen, wie sowohl empirisch als auch unter Verwendung eines Computerprogramms JPCalc ((Barry, 1994)) bestimmt wurde. Alle gezeigten elektrischen Spannungen sind in Bezug auf die Liquid Junction Potentiale nachgebessert worden. Die Ströme und die elektrischen Spannungs-Signale sind bei 2 kHz mit einem Axopatch 1D Patchclamp amplifier (Axon Instruments, Foster City, CA) detektiert und gefiltert worden, digital mit einer DigiData 1200B Laborstory Interface (Axon Instruments) und PC-kompatible Computersysteme aufgezeichnet worden und auf magnetischen Disks für die Offline-Analyse gespeichert worden. Die Daten-Akquisition und Analysen sind mit der PClamp-Software durchgeführt worden. Kleine Änderungen in dem Haltestrom sind bei 2 kHz detektiert und gefiltert worden und mit einer LPF202A DC Amplifier (Warner, Hamden, CT) detektiert und einem VR10B Digital Data Recorder (Instrutech, Great Neck, NY) auf einem Videoband aufgezeichnet worden. Das Signal ist später bei 10 Hz unter Verwendung der Axotape Software analysiert worden.
  • Die Gesamtmembrankapazität (Cm) wird bestimmt als die Differenz zwischen dem Maximalstrom nach einem 30 mV hyperpolarisierenden Spannungsanstieg von –68 mV, erzeugt bei einer Rate von 10 mV/ms und einem Steady State Strom bei einem endgültigen Potential (–98 mV) (Dubin et al. 1999).
  • Sichtbare Umkehrpotentiale (Vrev) der Liganden-induzierten Konduktanz-Änderungen sind unter Verwendung eines Spannungsanstiegs-Protokolls bestimmt worden (Dubin et al., 1999). Die Spannungsanstiege sind jede Sekunde angelegt worden und die resultierenden Gesamt-Zell Anstiegs-induzierten Ströme (whole cell ramp-induced current) sind aufgezeichnet worden. Üblicherweise erfolgte der Spannungsanstieg von negativen zu positiven zu negativen Werten. Der Strom erforderte, dass die Zellen bei –68 mV geklemmt wurden und kontinuierlich beobachtet wurde. Die Liganden-induzierten Leitwerte sind aus Whole-Cell Strömen bestimmt worden, die durch ein Spannungsanstiegs-Protokoll in Gegenwart oder Abwesenheit der Liganden ausgelöst wurden. Die Spannungsanstiegs-induzierten Ströme, die vor (Kontrolle) und in Gegenwart der Liganden gemessen worden sind, sind verglichen worden, um den Effekt der Liganden auf den Kanal zu zeigen, um den Kanalstromoutput zu modulieren. Die elektrische Spannung, bei welcher kein Netto Liganden-induzierter Strom vorliegt, ist bestimmt worden (Vrev).
  • BEISPIEL 7 – Primäre Struktur des humanen VR3-Rezeptorproteins
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt drei Isoformen des hVR3: A+B–, A–B– und A+B+. Die Nukleotidsequenzen der humanen VR3-Rezeptor cDNAs zeigten einzelne große offene Leserahmen von ungefähr 2616, 2436 und 2229 Basenpaaren, die entsprechend 871, 811 und 742 Aminosäuren des humanen VR3 A+B–, A–B– und A+B+ kodieren. Die cDNA für VR3 A+B– hat 5' und 3' untranslatierte Verlängerungen von ungefähr 337 und ungefähr 547 Nukleotiden. Die cDNA für VR3 A+B+ hat 5' und 3' untranslatierte Verlängerungen von ungefähr 836 und ungefähr 994 Nukleotiden. Das erste in-frame Methionin ist als Anfangscodon für einen offenen Leserahmen bestimmt worden, der humane VR3-Rezeptorproteine mit einer geschätzten Molekularmasse (Mr) von ungefähr jeweils 98,242 Da, 91,294 Da und 83,310 Da für die Isoformen A+B–, A–B– und A+B+ voraussagt. Die A+B– Isoform kodiert am Protein mit 871 Aminosäuren. Der VR3 A–B– enthält eine Deletion von 60 Aminosäuren von der Aminosäure 382 bis 441 des VR3 A+B–. Der VR3 A+B+ ist identisch zum A+B–, bis zur Aminosäure 736, nach welcher sechs divergente Aminosäuren und ein Stoppcodon folgen. Die VR3 A+B+ Isoform ist um 20 Aminosäuren nach der vermeintlichen TM6 erweitert.
  • Die vorausgesagten humanen VR3-Rezeptorproteine sind mit Nukleotid- und Protein-Datenbanken abgeglichen worden und es ist gefunden worden, dass sie zu der Vanilloid-Rezeptorfamilie (VR1 und VR2) in Beziehung stehen. In dieser Familie von Rezeptoren werden einige konservierte Motive gefunden, einschließlich eines großen putativen N-terminalen hydrophilen Segments (ungefähr 467 Aminosäuren), drei putativen Ankyrin-Repeat-Domänen in der N-Terminusregion, sechs vorausgesagte Transmembranregionen und einer Kernregion. Der VR3 A+B– ist 43% identisch zum humanen VR1, 39% identisch zu sowohl dem humanen VRL-1 (AF129112) und dem humanen VRL (AF103906). Somit ist der hierin beschriebene VR3-Rezeptor klar ein neues Gen der Vanilloid-Rezeptorfamilie.
  • Die VR3 A+B– und VR3 A–B– Formen sind dem Dehnungs-inhibierbaren Ratten Kanal SIC [Genbankakzession Nr. AB015230] von der Aminosäure 694 bis zum Ende sehr ähnlich. Es wurde davon ausgegangen, dass SIC, kodiert durch 529 Aminosäuren, einen durch Dehnung inhibierbaren Innenkanal bildet. Ihm fehlt die große N-terminale cytoplasmatische Domäne der VR-Familie, aber er enthält Sequenzhomologe zu dem A Exon vor der mutmaßlichen TM1.
  • Die hierin beschriebene vollständige genomische Sequenz der VR3-kodierenden Regionen kann auch in einer 380512 Basenpaar Sequenzeingabe bei der Genbank gefunden werden (Homo Sapiens Klon RPCI1-7G5 (AC007834), direkte Eingabe durch Worley, K. C.). Dieser Genbankeintrag listet viele Fragmente einer DNA-Sequenz und eine vorgeschlagene kontinuierliche Sequenz auf, aber ihm fehlt jegliche Analyse der Nukleinsäuresequenz und ihm fehlt eine Charakterisierung der Eigenschaften der VR3-Nukleinsäuresequenzen noch beschreibt er das Vorhandensein des VR3-Gens.
    • 1 Ein Vergleich der erfindungsgemäßen Sequenzen und der genomischen Sequenz zeigt, dass das VR3-Gen aus mindestens 15 Exons zusammengesetzt ist. "A" ist ein 60 Aminosäuren Insert in der mutmaßlichen N-terminalen cytoplasmatischen Domäne, die in den cDNAs gefunden wurde, die aus den cDNA-Bibliotheken sowohl aus der Hypophyse als auch der Prostata erhalten wurden. Es gibt Intron/Exon Rand-Sequenzen an den A- und B-Inserts.
  • Die A+B– und A+B+ Isoformen enthalten eine Domäne in der N-terminalen putativen cytoplasmatischen Region mit Homologie zu den Konsensussequenzen von Ankyrin Repeat-Domänen. Somit scheinen die VR3 A+ Isoformen eine ähnliche Architektur zu haben, wie für den VR1 vorausgesagt wird. Die erste Domäne war signifikant ähnlich der Konsensussequenz (E = 2,6 e-5). Die nächsten zwei Domänen waren für sich genommen nicht signifikant (e = 37 und E = 2,7), jedoch als Ganzes genommen enthält diese Region vermutlich drei Ankyrin- Bindungsdomänen. Der A– Isoform fehlen 20 Aminosäuren der putativen dritten Ankyrin-Wiederholungs-Domäne und die nebeneinander gestellten Sequenzen sind nicht übereinstimmend mit Ankyrin Repeat Domainen.
  • Die VR3 A+B– Isoform hat zwei möglichte Myristoylierungsstellen: [GPGGE] N-Terminal und zwischen der TM4 und TM5. Putative Phosphorylierungsstellen umfassen: sieben mögliche PKC-Phosphorylierungsstellen: T112, S134, T175, T190, T380, S403, S688 [jedoch ist das S688 in einer putativen extrazellulären Region]: eine mögliche PKA- und PKG-Phoysphorylierungsstelle: T181; 12 potentielle Caseinkinase II Phosphorylierungsstellen: T89, S162, T181, T395, S416, S422, S432, T426, S432, S441, T740, S836; drei potentielle Brustdrüsen Caseinkinase Phosphorylierungsstellen (S × E): S4, S726, S758; eine potentielle Tyrosinkinase Phosphorylierungsstelle: Y411 [vorhanden in dem "A"-Insert]; und eine potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstelle: N651, [N201, N207 sind in der putativen intrazellulären N-terminalen Domäne und werden recht unwahrscheinlich glycosyliert]. Es gibt keine putativen CaM-Bindungsdomänen in einer in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Isoform.
  • In der A– Isoform, welcher das "A"-Insert fehlt, fehlen 2 PKC-Phosphorylierungsstellen, 6 Caseinkinase-II-Phosporylierungsstellen und die einzige putative Tyrosinkinase Phosphorylierungsstelle.
  • Die A+B+ Isoform kodiert ein putatives Protein, dem zwei Caseinkinase-II-Phosphorylierungsstellen in der C-terminalen putativen intrazellulären Region fehlen.
  • BEISPIEL 8 – Expression des humanen VR3 in Geweben
  • Expression unter Verwendung eines DNA-Arrays (Luo et al., 1999). Eine DNA-Array Verteilungsanalyse zeigt, dass humane VR3 mRNAs in einer Vielfalt von Geweben exprimiert worden sind und dass es einige Überlappungen der Expression mit VR1 auf Gesamtgewebeebene gibt [13]. Die cRNA aus der Gewebe-Art, die in der linken Säule angezeigt ist, enthält Sequenzen, die humanes VR3 (mittlere Säule) kodieren. Die Expression des humanen VR1 ist in der rechten Säule gezeigt und die meisten Fälle überlappte sie mit der VR3-Expression. Bemerkung: NS war eine nicht-signifikante Expression des humanen VR1. Die Sequenz der humanen VR3 DNA, die auf den DNA-Arrays immobilisiert war, (SEQ.ID.NO.:17)
    Figure 00500001
  • Diese DNA-Sequenz ist in A+B+ nicht vorhanden, sondern nur in den A+B– und A–B– Isoformen. Es ist zu beachten, dass die cDNA-Spezies aus der Prostatadrüse kloniert worden ist (*; 13).
  • Die Northern-Blot-Analyse zeigte eine Expression des VR3 im gesamten Gehirn, der Plazenta, der Lunge, den Nieren, des Pankreas und der Prostata.
  • BEISPIEL 9 – Klonierung der humanen VR3-Rezeptor-cDNA in E. coli Expressionsvektoren
  • Der rekombinante humane VR3-Rezeptor ist in E. coli im Anschluss an den Transfer der humanen VR3-Rezeptor Expressionskassette in E. coli-Expressionsvektoren, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, der pET-Serie (Novagen), hergestellt worden. Der pET-Vektor bringt die Expression des humanen VR3-Rezeptors unter Kontrolle des stark regulierten Bakteriophagen T7 Promotors. Im Anschluss an den Transfer dieses Konstruktes in den E. coli Wirt, der eine chromosomale Kopie des T7 RNA Polymerasegens umfasst, welches durch den induzierbaren lac-Promotor getrieben wird, wird die Expression des humanen VR3-Rezeptors induziert, wenn ein geeignetes lac-Substrat (IPTG) der Kultur hinzugefügt wird. Die Mengen des exprimierten humanen VR3-Rezeptors werden durch die hierin beschriebenen Assays bestimmt.
  • Die cDNA, welche den gesamten offenen Leserahmen für den humanen VR3-Rezeptor kodiert, wird in die NdeI-Stelle des pET [16]11a eingesetzt. Konstrukte in der positiven Orientierung werden durch Sequenzanalysen analysiert und verwendet, um den Expressions-Wirtstrang BL21 zu transformieren. Die Transformanten werden dann verwendet, um Kulturen für die Herstellung des humanen VR3-Rezeptorproteins zu beimpfen. Die Kulturen können in M9- oder ZB-Medien wachsen, dessen Formulierungen jenen auf dem Fachgebiet bekannt sind. Nach dem Wachstum bis zu einer OD600= 1,5 wird die Expression des humanen VR3-Rezeptors mit 1 mM IPTG für 3 Stunden bei 37°C induziert.
  • BEISPIEL 10 – Klonierung der humanen VR3-Rezeptor cDNA in einen Baculovirus Expressionsvektor für die Expression in Insektenzellen
  • Baculovirus Vektoren, welche aus dem Genom des AcNPV-Virus erhalten werden, sind so gestaltet, dass sie die Expression von cDNA in der Sf9-Linie von Insektenzellen (ATCC CRL# 1711) in hohen Mengen ermöglichen. Rekombinante Baculoviren, welche die humane VR3-Rezeptor cDNA exprimieren, werden durch die folgenden Standardmethoden hergestellt (In Vitrogen Maxbac Manual): die humanen VR3-Rezeptor cDNA-Konstrukte werden in das Polyhedringen in einer Vielzahl von Baculovirus Transfervektoren ligiert, einschließlich des pAC360 und des BlueBac-Vektors (In Vitrogen). Rekombinante Baculoviren werden durch die homologe Rekombination im Anschluss an die Ko-Transfektion des Baculovirus Transfervektors und des linearisierten AcNPV genomische DNA [Kitts, P.A., Nuc. Acid. Res. 18: 5667 (1990)] in Sf9-Zellen erzeugt. Rekombinante pAC360 Viren werden durch die Abwesenheit von Inklusionskörpern in infizierten Zellen identifiziert und rekombinante pBlueBac Viren werden auf der Basis der β-Galactosidase Expression identifiziert (Summers, M.D. und Smith, G.E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin Nr. 1555). Im Anschluss an die Plaquereinigung wird die humane VR3-Rezeptorexpression durch die hierin beschriebenen Assays gemessen.
  • Die cDNA, welche den gesamten offenen Leserahmen für den humanen VR3-Rezeptor kodiert, wird in die BamHI-Stelle des pBlueBacII insertiert. Konstrukte in einer positiven Orientierung werden durch Sequenzanalyse identifiziert und verwendet, um Sf9-Zellen in Gegenwart der linearen AcNPV-Wildtyp-DNA zu transfizieren.
  • Echter aktiver humaner VR3-Rezeptor wurde im Cytoplasma der infizierten Zellen gefunden. Der aktive humane VR3-Rezeptor wird aus den infizierten Zellen durch hypotone oder Detergentien-Lyse extrahiert.
  • BEISPIEL 11 – Klonierung der humanen VR3-Rezeptor cDNA in einem Hefe-Expressionsvektor
  • Der rekombinante humane VR3-Rezeptor wird in der Hefe S. cerevisiae im Anschluss an die Insertion des optimalen humanen VR3-Rezeptor cDNA Cistrons in Expressionsvektoren hergestellt, die so gestaltet sind, dass sie die intrazelluläre oder extrazelluläre Expression des heterologen Proteins regeln. Im Fall der intrazellulären Expression werden Vektoren, wie zum Beispiel EmBLyex4 oder ähnliche an das humane VR3-Rezeptor Cistron ligiert [Rinas. U. et al., Biotechnology 8: 543–545 (1990); Hornwitz B. et al., J. Biol. Chem. 265: 4189–4192 (1989)]. Für die extrazelluläre Expression wird das humane VR3-Rezeptor Cistron in Hefe-Expressionsvektoren ligiert, die ein Sekretionssignal (ein Hefe- oder Säugetierpeptid) an den NH2-Terminus des humanen VR3-Rezeptorproteins fusionieren [Jacobson, M. A., Gene 85: 511–516 (1989); Riett L. und Bellon N. Biochem. 28: 2941–2949 (1989)].
  • Diese Vektoren umfassen, sind aber nicht limitiert auf pAVE1>6, welche das humane Serum-Albumin-Signal an die exprimierte cDNA fusionieren [Steep O. Biotechnology 8: 42–46 (1990)] und der Vektor pL8PL, welcher das humane Lysozym-Signal an die exprimierte cDNA fusioniert [Yamamoto. Y., Biochem. 28: 2728–2732]. Darüber hinaus wird der humane VR3-Rezeptor in Hefe als ein Fusionsprotein exprimiert, welches an Ubiquitin unter Verwendung des Vektors pVEP konjugiert ist [Ecker, D. J., J. Biol. Chem. 264: 7715–7719 (1989), Sabin, E. A., Biotechnology 7: 705–709 (1989). McDonell D. P., Mol. Cell Biol. 9: 5517–5523 (1989)]. Die Mengen des exprimierten humanen VR3-Rezeptors werden durch die hierin beschriebenen Assays bestimmt.
  • BEISPIEL 12 – Reinigung des rekombinanten humanen VR3-Rezeptors
  • Rekombinant hergestellter humaner VR3-Rezeptor kann durch eine Antikörper-Affinitätschromatographie gereinigt werden.
  • Humane VR3-Rezeptor Antikörper-Affinitätssäulen werden gemacht, indem anti-humane VR3-Rezeptor Antikörper dem Affigel-10 (Bio-Rad) hinzugefügt werden, eine Gelauflage, die mit N-Hydroxysuccinimidestern voraktiviert ist, so dass die Antikörper kovalente Bindungen mit der Agarose-Gelkügelchen-Auflage bilden können. Die Antikörper werden dann an das Gel via Amidbindungen mit dem Spacerarm gekoppelt. Die verbleibenden aktivierten Ester werden dann mit 1M Ethanolamin HCl (pH 8) gequenscht. Die Säule wird mit Wasser gewaschen, gefolgt durch 0,23 M Glycin HCl (pH 2,6), um jeglichen nicht-konjugierten Antikörper oder irrelevantes Protein zu entfernen. Die Säule wird dann mit phosphatgepufferter Saline (pH 7,3) zusammen mit geeigneten die Membran lösenden Mitteln, wie zum Beispiel Detergentien equilibriert, und der Zellkulturüberstand oder Zellextrakt, welcher gelösten VR3-Rezeptor enthält, wird langsam über die Säule gegeben. Die Säule wird dann mit phosphatgepufferter Saline, zusammen mit Detergentien, gewaschen bis die optische Dichte (A280) bis auf Hintergrundsignale abnimmt, dann wird das Protein mit 0,2 M Glycine-HCl (pH 2,6) zusammen mit Detergentien eluiert. Das aufgereinigte humane VR3-Rezeptorprotein wird dann gegen phosphatgepufferte Saline dialysiert.
  • Referenzen
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  • SEQUENZPROTOKOLL (WIE URSPRÜNGLICH EINGEREICHT)
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    SEQUENZPROTOKOLL VOM 27.04.2004
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    Figure 00920001

Claims (3)

  1. Isoliertes Protein umfassend die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO. 7 oder 9 dargestellt ist.
  2. Isoliertes Protein wie in Anspruch 1 definiert, wobei das Protein aus der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO. 7 dargestellt ist, besteht.
  3. Isoliertes Protein wie in Anspruch 1 definiert, wobei das Protein aus der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO. 9 dargestellt ist, besteht.
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