CN102199197B

CN102199197B - 一种具有自组装钾通道功能的多肽及其应用

Info

Publication number: CN102199197B
Application number: CN 201110091437
Authority: CN
Inventors: 沈兵; 杜鹃; 范礼斌; 柯道平; 朱金行
Original assignee: Anhui Medical University
Current assignee: Anhui Medical University
Priority date: 2011-04-13
Filing date: 2011-04-13
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2031-04-13
Also published as: CN102199197A

Abstract

本发明提供一种具有自组装钾通道功能的多肽。该多肽的多肽片段、类似物、衍生物、变体的氨基酸主序列具有与该多肽氨基酸主序列≥70%的相同性，≥90%的相似性；多肽、核苷酸、多肽片段、多肽类似物、多肽衍生物和多肽变体用于制备具有治疗钾通道功能障碍/缺失引起的疾病、高血压药物的应用，也可用于制备具有改变脂质体、细胞膜电位的研究领域工具药的应用。是一种治疗钾通道功能障碍/缺失性疾病和改变细胞膜电位的新方法。

Description

一种具有自组装钾通道功能的多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物工程药物开发领域，具体涉及一种具有自组装钾通道功能的多肽及其应用。

背景技术

生命活动过程中，由于自身代谢和应对各种生理刺激，细胞内离子浓度经常发生变化，而调节细胞内离子浓度的主要途径是细胞膜上的离子通道。离子通道在许多生理反应中具有重要作用，例如：神经系统的电信号产生和传递、肌肉收缩、腺体分泌、细胞质酸碱度调节、心血管系统功能、免疫反应等等。离子通道一般是由几个相同或不同的亚基组成的膜蛋白，每个亚基又含有几个疏水跨膜段，不同亚基的跨膜段围绕形成离子通道孔区，孔的中央有一个离子选择性滤器，决定了该离子通道主要通透何种离子。细胞膜内外亲水区段有一些配体结合位点，可以调节离子通道的活性。天然离子通道有两个重要的特性：离子选择性和门控机制。离子选择性是指一种离子通道只对一种或几种离子选择性透过其孔区，门控是指离子通道开放和关闭机制。离子通道根据其通透离子的种类分为阳离子通道和阴离子通道，其中阳离子通道又根据其通透离子的不同分为钾通道、钠通道、钙通道和非选择性阳离子通道等种类。各种组织的细胞膜上离子通道功能出现障碍和/或蛋白表达异常都会导致疾病，目前已确定许多重要的疾病是由于离子通道功能异常所致，严重威胁人类的健康，所以发展和发现新型调节和/或代替离子通道功能的药物越来越重要。

在所有离子通道中，钾通道是细胞表达最丰富的一种，而且具有重要的生理功能。钾通道参与维持细胞膜电位、心肌细胞动作电位复极化、平滑肌细胞舒张、神经递质释放、免疫反应和胰岛素分泌。因此钾通道功能出现障碍和/或蛋白表达异常会导致许多种疾病。例如Anderson – Tawil综合症、糖尿病、癫痫、共济失调、勃起障碍、长QT综合症和周期性麻痹等疾病。所以，钾通道一直以来是药物筛选和开发领域的重要靶点。目前已有多种调节钾通道的药物用于临床治疗疾病。例如：治疗心脏病的烟酰胺和抗心绞痛的尼可地尔等。因而，开发调节钾通道的药物具有重要的临床价值。

合成离子通道研究已有20多年的历史，合成的离子通道可以模仿天然离子通道的某些功能，通过对合成离子通道的研究也可以了解天然离子通道的某些特征和性质。所以，设计和合成新型的合成离子通道可以发现新的具有治疗离子通道疾病的药物候选化合物。通过合成的离子通道可以调节某种离子在细胞内的浓度，补偿由于天然离子通道功能障碍、缺失和/或蛋白表达异常所导致的疾病。现阶段临床上治疗钾通道障碍相关疾病的方法主要是一些使用钾通道开放剂，促进有功能的钾通道开放增强，未见有使用合成钾通道补偿、代替或增强钾通道功能的治疗药物。目前国际上许多合成的离子通道对离子的选择性不高，限制了其在临床治疗中的潜在应用价值，而国内尚未见相关发明专利发布。

发明内容

本发明主要是针对目前生物工程药物开发领域缺乏合成离子通道药物，采用天然氨基酸序列开发合成离子通道药物，提供了一种具有在细胞膜上自组装成钾离子通道的多肽及其应用。

本发明由24个氨基酸组成的多肽，分子量为：2762.36。主要序列来自于天然离子通道蛋白瞬时受体电位通道家族TRPV4的第四个跨膜段。

本发明的一种具有自组装钾通道功能的多肽，组成氨基酸序列<1>和编码多肽的核苷酸序列<2>如下：

<1>亮氨酸-酪氨酸-亮氨酸-丙氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-缬氨酸-亮氨酸-甘氨酸-色氨酸-甲硫氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-亮氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸-精氨酸-甘氨酸-亮氨酸，（所述多肽的氨基酸序列为：Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-Asn-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu）；

<2>CTG TAC CTG GCT GTG ATG GTC TTT GCC CTG GTC CTG GGC TGG ATG AAT GCG CTG TAC TTC ACG CGC GGG TTG。

本发明的自组装钾通道的多肽片段，其氨基酸主序列具有与该多肽氨基酸主序列≥70%的相同性，≥90%的相似性，片段为把所述的24个氨基酸的序列从任意位置截取成3个或3个以上氨基酸组成的与所述多肽具有同样生物活性的多肽。

本发明的自组装钾通道的多肽类似物具有与所述多肽相同的生物活性，所述类似物是指在用所述多肽和另一种化合物融合或者用所述多肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。

本发明的自组装钾通道的多肽衍生物，其氨基酸序列具有与该多肽氨基酸主序列≥70%的相同性，≥90%的相似性，该衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后与所述多肽具有同样生物活性的多肽。

本发明的自组装钾通道的多肽变体，其氨基酸序列具有与该多肽氨基酸主序列≥70%的相同性，≥90%的相似性，该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸。

所述多肽具有在脂质双层膜和细胞膜上自组装成选择性通透钾离子的钾通道；在细胞膜上，其通透钾离子可以显著引起细胞膜电位超极化。

本发明多肽、核苷酸、多肽片段、多肽类似物、多肽衍生物和多肽变体用于制备具有治疗钾通道功能障碍/缺失引起的疾病、高血压药物的应用，也可用于制备具有改变脂质体、细胞膜电位的研究领域工具药的应用。

本发明的多肽来自于运用生物信息学的方法把国际蛋白质数据库的蛋白进行序列比对，筛选出来的一种新型的具有活性功能的生物活性肽，本发明有益技术效果体现在以下方面：(1)本发明多肽的分子量小，可容易透过组织屏障；(2)可通过固相合成技术大量制备，而且纯度高，成本低；(3)本发明多肽代表了一种新的治疗离子通道疾病的新方式；(4)本发明多肽主要序列来自于天然物质，是对自然生物资源的充分利用。

附图说明

图1：100 nM 本发明多肽在内外对称200 mM KCl的人工合成的脂质体上形成的单通道电流（分别在80，100和120 mV电压下记录），C：关闭（Close）; O：开放（Open）。

图2：100 nM 本发明多肽在内外对称200 mM NMDG-Cl的人工合成的脂质体上无单通道电流（分别在80，100和120 mV电压下记录），C：关闭（Close）; O：开放（Open）。

图3：本发明多肽可以使脂质体通透K⁺。5 uM 本发明多肽显著性的增强脂质体内K⁺特异性荧光指示剂PBFI荧光强度；而本发明多肽溶剂对照DMSO只是轻微增强荧光背景强度（脂质体内含100 mM NMDG-Cl和400 uM PBFI，脂质体外是100 mM KCl，其中NMDG⁺是一个大的有机阳离子，不能通过离子通道孔，K⁺和PBFI结合后荧光强度增加）。

图4：本发明多肽可以使脂质体通透K⁺并升高脂质体细胞膜电位；而本发明多肽溶剂对照DMSO只是轻微增强荧光背景强度（脂质体内含100 mM KCl，外液是100 mM NaCl和60 nM safranin O，safranin O是膜电位感受荧光染料，信号升高说明膜电位超极化）。

图5：本发明多肽浓度依赖地降低60 mM KCl引起的原代平滑肌细胞膜去极化（细胞膜电位用膜电位敏感性荧光指示剂DiBAC4(3) 检测，DiBAC4(3)荧光信号升高代表去极化，降低代表复极化或超极化）。

图6：100 nM 本发明多肽降低了60 mM KCl引起的原代平滑肌细胞内钙浓度升高（细胞内钙用钙荧光指示剂：Fluo-4检测，其可以测定细胞内钙浓度的变化率）。

图7：本发明多肽浓度依赖地降低10 uM苯肾上腺素引起的血管收缩。

具体实施方式

本发明多肽的制备方法采用化学合成的方法，即本领域熟知的已经非常成熟的固相肽合成方法，其氨基保护策略主要有9-芴甲氧羰基（Fmoc）法和叔丁氧羰基（Boc）法两种，目前国内外主要采用Fmoc固相合成法。固相合成法可用市售保护氨基酸为原料，快速高效获得较大量样品。在9-芴甲氧羰基（Fmoc）合成系统中，优选王（Wang）树脂，加入15ml/g的二甲基甲酰胺（DMF）30分钟，再加入总量为20%的六氢吡啶室温处理20分钟，以脱去Fmoc保护基团，然后再加入过量相应的保护氨基酸和活化剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU），反应30分钟缩合，按照给定的氨基酸序列：（Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-Asn-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu）由C端逐个向N端延伸，以此类推，直到缩合到最后一个亮氨酸，合成完成后，用含4%对甲基苯酚的三氟乙酸（TFA）将多肽从树脂上切割下来并除去保护基，采用过滤去除树脂后乙醚沉淀分离得到粗品多肽；

合成后的粗品多肽采用反相高压液相（HPLC）层析：含1‰三氟乙酸的超纯水充分平衡C18反相柱（长300 mm，直径5 mm），用含1‰三氟乙酸的乙晴缓冲液梯度洗脱上述洗脱液，收集活性峰，得到高纯度（＞95 %）的肽冻干粉，-20°C储存。

核苷酸采用人工合成方法制备；编码多肽的核苷酸包含下组中的一种：

（a）编码具有所述氨基酸序列的多肽或其片段、类似物、衍生物或其变体的核苷酸；

（b）与（a）所述核苷酸互补的核苷酸；

（c）与（a）或（b）中所述核苷酸有≥75%相同性的核苷酸；

该核苷酸基本有编码具有<1>氨基酸序列多肽的核苷酸组成，本发明的核苷酸序列包括<2>中的核苷酸序列，其形式为DNA形式，包括cNDA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的也可以是双链的。编码多肽的编码区序列可以和<2>中的核苷酸相同，也可以不同，称为变异体，其中变异体是指具有编码<1>中的氨基酸序列的编码，但可以和<2>中的核苷酸不同。变异体可以是一个或几个核苷酸取代、插入、缺失的核苷酸序列，但不会改变编码<1>中氨基酸序列的多肽的活性功能。

该多肽或核苷酸的“变体”是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列。改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入、添加或替换，变体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，也可以有“非保守性”改变，其中替换的氨基酸不具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质。“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或几个氨基酸或核苷酸缺失；“插入”是指在氨基酸序列或核苷酸序列的中间任意位置插入一个或几个氨基酸；“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列的N端或C端添加一个或几个氨基酸；“替换”是指用不同的氨基酸或核苷酸替换一个或几个氨基酸或核苷酸。

该多肽、核苷酸、多肽片段、多肽类似物、多肽衍生物和多肽变体用于制备具有治疗包括但不限于下述疾病的药物的用途：

1. Anderson–Tawil综合症、糖尿病、癫痫、共济失调、勃起障碍、长QT综合症和周期性麻痹等疾病。

2. 高血压疾病：原发性高血压和继发性高血压。

下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步说明。这些实施举例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列所有列举实施例所涉及的合成多肽具有本发明涉及的药物功能而不限于所列举功能。

实施例 1 ：

一种具有自组装钾通道功能的多肽是一个含有24个氨基酸的多肽：所述多肽全序列一级结构为：亮氨酸-酪氨酸-亮氨酸-丙氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-缬氨酸-亮氨酸-甘氨酸-色氨酸-甲硫氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-亮氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸-精氨酸-甘氨酸-亮氨酸（所述多肽的氨基酸序列为：Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-Asn-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu）。

本发明多肽（ Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-Asn-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu ）的固相合成

采用市售的Quartet多肽合成仪（PTI公司）合成序列为LYLAVMVFALVLGWMNALYFTRGL的本发明多肽，具体步骤如下：

1、根据软件测算加入适量的相应保护氨基酸溶液、缩合试剂、切割试剂

2、在反应器中加入Wang树脂：Fmoc-Leu-Wang-Resin 100 umol;

3、在搜集切割液的管道上放入15 ml的离心管；

4、设定相关参数并开机按照程序合成；

5、最后将切割液用乙醚沉淀，离心，干燥，过反向HPLC纯化。

制得11 mg本发明多肽，为白色粉末，纯度＞95%，20 ℃保存留用。

实施例 2

本发明多肽（ Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-Asn-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu ）在脂质双层膜上形成 K⁺ 离子单通道电流

1. 材料和方法

1.1 材料：KCl、NMDG-Cl够自Sigma公司，POPC磷脂、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）购自Avanti公司（Avanti Polar Lipids，美国），倒置显微镜（IX70，Olympus，日本），微电极拉制仪（P-97，美国Sutter 公司），三维微电极操纵器（MP-285， Sutter，美国），膜片钳放大器（EPC-9，HEKA，德国），PULSE+PULSEFIT记录和分析软件（HEKA，德国）。

1.2 脂质双层的合成：称取80 mg POPC和20 mg磷脂酰丝氨酸溶于2 ml双蒸水，在氮气下，用涡旋混合器混悬20分钟，然后用超声波乳化10分钟，将该脂质悬液在高速离心机下160000 g离心1小时，弃去上清并用200 ul 10 mM的MOPS缓冲液（含有5 % 乙二醇，pH 7.2）悬浮沉淀，然后用加样枪将该脂质混悬液以15 ul/滴分别滴在盖玻片上，置于干燥器中4 ℃干燥6小时。使用时，将相应的细胞内液加在干燥后的脂质膜上，4 ℃保持湿润10小时以上，即可用于膜片钳离子通道电流记录。

1.3 膜片钳单通道记录：将脂质体放在3.5 mm的培养皿上静止15分钟，然后加入细胞外液。电极内灌以电极液，置于推进器上，电极尖端浸入浴液前，电极内给予弱正压（1-2 cm水柱）以保持尖端通畅、干净，同时由刺激器经膜片钳放大器向微电极尖端发放一电压为l mV、波宽为20 mS的方波脉冲信号,用于检查电极尖端阻抗及观察封接形成过程。

记录用玻璃微电极的制作，是用硬质厚壁玻璃毛坯在水平微电极拉制仪上分四步拉制而成，电极尖端直径约为l um,内灌电极液后,电阻为6-10 M。内插泛极化氯化银。

通过倒置显微镜监视和三维微电极操纵器驱动微电极接近细胞。当微电极尖端刚刚碰到细胞时，稍加10-20 cm 水柱的负压，高阻封接即刻形成。实验中仅选用封接电阻大于5 G的细胞。当高阻封接形成后，即可通过改变电极内电位而控制电极下的一小片细胞膜的跨膜电位，以观察此小片膜上的离子通道电流随电压改变的变化，此为细胞贴附式膜片。实验均在室温下进行（20-22℃）

实验中采用细胞贴附式记录方式及用药前后自身对照的设计方法，观察并记录加入本发明多肽前后特征性离子通道单通道电流。

单通道电流采用PULSE+PULSEFIT软件进行采样、贮存，实验中单通道电流信号经膜片钳放大器及A/D、D/A转换器，输入计算机；采用低通滤波，频率为3 KHz。

2. 结果

当脂质体内外液是对称的200 mM的KCl，并有100 nM的本发明多肽加入到外液中时，可分别在80、100、120 mV记录到典型的单通道电流（图1），而且随着电压的增大本发明多肽形成的通道开放越强（图1）；而当K⁺用大的有机阳离子NMDG⁺代替后，即脂质体内外是200 mM NMDG-Cl，100 nM 本发明多肽加入到外液中时，在80、100、120 mV记录不到单通道电流（图2）。

实施例 3

本发明多肽（ Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-Asn-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu ）在脂质体膜上介导 K⁺ 的通透并能改变膜电位

1. 材料和方法

1.1 材料：POPC磷脂、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）购自Avanti公司（Avanti Polar Lipids，美国），K⁺离子敏感的荧光指示剂PBFI购自Invitrogen公司（美国），膜电位荧光指示剂safranin O购自Sigma公司（美国）。

1.2 脂质双层的合成：称取80 mg POPC和20 mg磷脂酰丝氨酸溶于氯仿和甲醇1:1的混合液中，置于旋转蒸发仪上蒸干并得到一层脂质膜，然后用真空泵继续干燥3小时，将1.3 ml细胞内液（K⁺浓度测定：400 uM PBFI, 10 mM HEPES, 100 mM NMDG-Cl，pH 7.0；膜电位测定：100 mM KCl，10 mM HEPES, pH 7.0）加入脂质膜中室温重新水化2小时，在水化过程中将该脂质悬液用液氮和室温的水反复冻融5个循环，然后将该脂质悬液吸入制造脂质体的1毫升玻璃注射器中，用力推注射器，使脂质悬液通过100 nm孔径的滤膜，反复5次后，就可以得到直径约100 nm均匀的脂质体，将该脂质体置于4 ℃保存留用。

1.3 K⁺敏感的荧光信号记录：将100 ul包被有K⁺荧光指示剂PBFI和NMDG-Cl的脂质体悬液加入1.9 ul含有（10 mM HEPES, 100 mM KCl，pH 7.0）的浴槽中，置于荧光显微镜上，给予350 nm激发光，并在508 nm处实时记录发射光。

1.4 膜电位记录：将100 ul包被有100 mM KCl的脂质体悬液加入1.9 ml含有（100 mM NaCl，10 mM HEPES, pH 7.0）的浴槽中，并加入60 nM的safranin O置于荧光显微镜上，给予520 nm激发光，并在580 nm处实时记录发射光。

2. 结果

2.1本发明多肽在脂质体膜上介导K⁺的通透

如图3所示，当脂质体内液是100 mM NMDG-Cl并含有400 uM PBFI，而脂质体外是100 mM KCl，在外液中加入5 uM本发明多肽时，脂质体的PBFI荧光强度迅速升高，因为PBFI和K⁺结合后，荧光强度会升高，所以这个脂质体内荧光强度的升高说明脂质体外有K⁺通过本发明多肽形成的通道流进脂质体内；因为本发明多肽的溶剂是DMSO，所以采用DMSO作对照，DMSO加入脂质体外液后只稍微提高基线水平（图3）。

2.2本发明多肽能改变脂质体膜电位

脂质体内充满100 mM KCl，外液是100 mM NaCl和60 nM safranin O（膜电位荧光指示剂），当在外液加入5 uM本发明多肽时，safranin O的荧光强度立即升高（图4），safranin O荧光强度升高代表脂质体膜电位超极化，说明有K⁺从脂质体内流到外面，使脂质体内电位降低而出现超极化；而在DMSO对照组，DMSO没有显著升高脂质体膜电位（图4）。在实验最后，加入10 mM melittin破坏脂质体膜，荧光强度立即降低，说明荧光强度的升高是由于脂质体膜电位超极化引起，而不是由于本发明多肽对荧光指示剂的直接影响造成。

实施例 4

本发明多肽（ Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-Asn-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu ）引起血管平滑肌细胞膜超极化并降低高钾引起的内钙升高

1. 材料和方法

1.1 实验动物和材料：健康雄性SD大鼠（5-6周龄，体重约150 g）由安徽医科大学实验动物中心提供；DMEM平滑肌细胞培养基、胰酶、胎牛血清、钙荧光指示剂Fluo-4、细胞膜电位荧光指示剂DiBAC4(3)购自Invitrogen公司（美国）。钙成像荧光记录系统（TILL公司，德国）。

1.2 血管平滑肌细原代培养

平滑肌组织块的获得：将大鼠脱颈椎后，迅速开胸取出胸主动脉，常温下，在通有95 ％O₂ ＋ 5 ％CO₂混合气的KH液（118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.5 mM CaCl₂, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgSO₄·7H₂O, 25.2 mM NaHCO₃, and 11.1 mM glucose）平皿中，仔细分离血管周围的脂肪和结缔组织，然后纵向剖开动脉，用棉签轻刮去血管内膜，再剥去外膜，将仅剩的平滑肌层斜行剪成1×5 mm的条块，将平滑肌组织块贴在培养皿底部并放在细胞培养箱中约20分钟后，缓慢从培养皿壁加入培养基，然后放入培养箱中培养7天左右可见大量平滑肌细胞爬出，每3天换一次新鲜的培养基。

1.3 血管平滑肌细膜电位和细胞内钙测定

用胰酶将培养的雄主动脉血管平滑肌细胞消化下来后，种在18 mm直径的圆形盖玻片上，放在12孔培养板中培养3天，将种有细胞的盖玻片放入浴槽中，加入生理缓冲液（140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM glucose, 5 mM Hepes, pH 7.4），并加入0.1微摩尔/升的DiBAC4(3)（细胞膜电位记录）或10 uM的Fluo-4（细胞内钙测定）置于37 ℃培养箱中孵育30分钟，然后用生理缓冲液冲洗2次后，再加入新鲜的生理缓冲液用于实验。

将浴槽置于显微镜平台上，调好焦距，选好视野，用488 nm的激发光激发Fluo-4钙荧光指示剂，并实时记录516 nm发射光；用535 nm激发光激发DiBAC4(3)细胞膜电位荧光指示剂，并实时记录580 nm发射光。

2. 结果

2.1 本发明多肽引起血管平滑肌细胞膜超极化

原代培养的血管平滑肌细胞膜电位用DiBAC4(3)膜电位敏感的荧光指示剂测定。在细胞用含有100 nM DiBAC4(3)的生理缓冲液孵育20分钟后，当细胞外液换成含有DiBAC4(3)的60 mM KCl的缓冲液后，细胞膜电位迅速去极化（图5），待膜电位趋于稳定后，依次累积加入0.1 uM、1 uM 本发明多肽，细胞膜电位慢慢复极化（图5），说明本发明多肽形成的通道增加了平滑肌细胞膜对K⁺的通透性，使更多的K⁺从细胞内流出，从而使细胞膜电位复极化。

2.2 本发明多肽降低血管平滑肌细胞高钾引起的内钙升高

原代培养的血管平滑肌细胞内钙离子用Fluo-4钙离子荧光指示剂标记。细胞用含有10 uM Fluo-4的生理缓冲液孵育30分钟后，当细胞外液换成60 mM KCl的缓冲液，细胞膜电位迅速去极化，从而使细胞膜上电压依赖钙通道开放，细胞内钙浓度升高（图6），待细胞内钙浓度稳定后，加入100 nM的本发明多肽，平滑肌细胞内钙离子浓度迅速降低（图6）。

实施例 5

本发明多肽（ Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-Asn-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu ）降低激动剂引起的血管收缩

1. 材料和方法

1.1 实验动物和材料：健康雄性C57小鼠（5-6周龄，体重约20 g）由安徽医科大学实验动物中心提供；张力换能器（JH-2，量程为0-10 g，北京航天医学工程研究所，中国）；生物机能信号采集系统（Biolap 420S，成都泰盟公司，中国）；苯肾上腺素（phenylephrine, PE）购自上海禾丰制药有限公司；乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）购自上海试剂三厂。

1.2 胸主动脉环的制备：将小鼠脱颈椎后，迅速开胸取出胸主动脉，常温下，在通有95 ％O₂ ＋ 5 ％CO₂混合气的KH液平皿中，仔细分离血管周围的脂肪和结缔组织并将其剪成（2-3）mm的动脉环。

1.3 实验步骤：将水平恒温浴槽内充盈KH液并持续通有95 ％O₂ ＋ 5 ％CO₂混合气以保持pH在7.4，同时通过恒温器将浴槽温度控制在37 ℃。把动脉环的一边穿在水平恒温浴槽上的可微调距离的细钢丝上，另一边穿在张力换能器的细钢丝上，张力换能器接在Biolap 420S生物机能信号采集系统上并用计算机监视和记录张力信号，通过浴槽上可调的细钢丝施加500-550 mg的前负荷平衡1 h，期间每15分钟换一次KH液。然后用60 mM KCl 预激1次，10分钟后用KH液反复3次洗去60 mM KCl，重新平衡30分钟，再用60 mM KCl 收缩血管并记录其最大张力。然后同样方法用10 uM PE预激并用10 uM ACh舒张1次，再用60 mM KCl 收缩血管达平台后，累积浓度加入本发明多肽（1, 3, 10, 30 uM），分别记录其值。

2. 结果

小鼠胸主动脉用受体激动剂苯肾上腺素（10 uM）收缩后，依次累积浓度（1, 3, 10, 30 uM）加入本发明多肽，血管出现浓度依赖性舒张（图7）。

Claims

1.一种具有自组装钾通道功能的多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为：Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-Asn-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu。

2.一种编码根据权利要求1所述具有自组装钾通道功能的多肽的核苷酸。

3.如权利要求1所述的具有自组装钾通道功能的多肽在制备具有治疗钾通道功能障碍/缺失引起的血管收缩增强药物中的应用。

4.如权利要求2所述的具有自组装钾通道功能的多肽的核苷酸在制备具有治疗钾通道功能障碍/缺失引起的血管收缩增强药物中的应用。