KR20080000554A - 화학적으로 변형된 펩티드 유사체 - Google Patents

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KR20080000554A
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알더블유티에이치 아헨
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Abstract

본 발명은 IAPP 펩티드 유도체를 사용하여 당뇨병 및 알쯔하이머병을 치료하기 위한 개선된 수단 및 방법에 관련된다.
ＩＡＰＰ, ＩＡＰＰ 펩티드 유사체, 단백질 집합, 당뇨병, 알쯔하이머병.

Description

화학적으로 변형된 펩티드 유사체{CHEMICALLY MODIFIED PEPTIDE ANALOGS}
본 발명은 IAPP(islet amyloid polypeptide)의 펩티드 유사체, IAPP 또는 이의 집합체를 검출하는 방법, 단백질 집합 질환, 특히 당뇨병 및 알쯔하이머병의 예방 및 치료를 위한 약제학적 제제, 및 단백질 집합 질환, 특히 당뇨병 및 알쯔하이머병의 검출을 위한 진단용 조성물, 그리고 의학적 상태의 진단 및 치료 또는 기본적 연구를 위한 상기 펩티드 유사체의 용도에 관한 것이다.
당뇨병은 현재 만족스러운 치료 방법이 없는 의학적 상태이다. 일반적으로 타입 Ⅰ 및 타입 Ⅱ 당뇨병 간의 구별이 되어있다. 당뇨병 환자의 90 %는 타입 Ⅱ, 또는 연령-관련 당뇨병에 걸려있다. 현재 세계적으로 1억 5천만 이상의 타입 Ⅱ 당뇨병 환자가 있다. 당뇨병은 인슐린의 부족 또는 인슐린-의존성 생리적 과정의 기능부전에 의해 발병한다. 한편으로는 탄수화물 대사에서 인슐린의 중심 역할이 다른 분자에 의해 대체될 수 없고, 다른 한편으로는 인슐린 단독 투여가 타입 Ⅰ 당뇨병에서 질병의 병리 작용을 근절시킬 수 없거나, 타입 Ⅱ 당뇨병에서는 병 자체를 근절시킬 수 없기 때문에, 새로운 치료 시도가 필요하다. 이러한 시도는 인슐린의 분비, 흡수 및 생물학적 기능의 개발을 뒷받침하여야 하고, 또한 체중 증가 또는 저혈당과 같은 원치 않는 인슐린의 부작용으로부터의 보호를 제공하여야 한다. 이에 따라, 특히 인슐린과 함께 탄수화물 대사의 조절을 보조하는 새로운 분자가 생물의학 분야에서 매우 흥미를 끌고 있다.
이러한 새로운 분자의 하나가 아일렛 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP 또는 아밀린(amylin))이다. IAPP는 췌장의 β-세포에서 합성되고 인슐린 및 글루카곤과 함께 당 대사의 조절에 관여하는, 37 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드 호르몬이다. IAPP는 인슐린의 길항제(antagonist)이다. 소위 말하는 아밀로이드 플라크(plaques)는 타입 Ⅱ 당뇨병 환자의 95 % 이상의 췌장에서 발견된다. 아밀로이드 플라크는 폴리펩티드 IAPP의 불용성 집합체로 구성된 침전물이다. 알쯔하이머병, 파킨슨병, 프리온(prion)병, 또는 헌팅턴병에서와 유사하게, 당뇨병도 단백질 집합 질환으로 간주될 수도 있다(Ross 및 Poirier, Nature Medicine, July 2004, Vol. 10, Suppl., pages 10-17). IAPP의 생물활성은 cAMP-연결된 수용체를 통해 이의 가용성 모노머 형태에 의해 중개된다. 그러나, IAPP 아밀로이드 플라크, IAPP 분자의 가용성 올리고머, 및 멀티머형은 세포독성이다. IAPP 아밀로이드 형성에 의해 야기된 β-세포의 손상은 타입 Ⅱ 당뇨병 병인의 캐스케이드에 중요한 기여를 하는 것으로 추정된다. 따라서, IAPP 아밀로이드 형성 과정의 치료적으로 유효한 저해제의 개발이 생물의학 분야에서 매우 흥미를 끌고 있다. 또한, 인슐린 길항제로서, 그리고 인슐린의 분비 또는 투여와 관련된 식후 저혈당의 조절제로서의 그 생물학적 기능에 있어서, IAPP 분자 자체는 타입 Ⅰ(예를 들어 인슐린과 조합하여) 및 타입 Ⅱ 당뇨병의 치료에 잠재적 치료 용도를 가질 수 있는 중요한 폴리펩티드 호르몬이다. 그러나, IAPP의 의학적 용도는 그의 낮은 용해성 및 높은 집합 경향으로 인해 크게 제한된다.
가용성 IAPP 유사체 프람린타이드(pramlintide)가 알려져 있다. 프람린타이드(Symlin®)는 인간 IAPP 분자의 서열에서 25, 28 및 29 위치의 3 아미노산을 프롤린으로 치환하는 것에 의해 합성된다. 이들 프롤린 치환체는 래트 IAPP 서열에 존재하는데, 이는 집합 경향이 없다. 구조적으로, 프롤린-함유 서열의 감소된 집합 경향은 프롤린 라디칼이 β-폴드(β-fold) 구조일 수 없다는 사실에 의해 설명될 수 있다(프롤린은 β-폴드 "파괴" 라디칼이다). 사실, IAPP 유사체 프람린타이드는 집합에 대하여 매우 감소된 경향을 갖고, 따라서 인간 IAPP 보다 나은 용해도 프로파일을 갖는다. 아직 진행중인 임상 연구에서, 인슐린과 함께 이 유사체는 당뇨병의 치료 용도를 발견할 수 있음을 보여주었다. 그러나, pH 5 이상에서 프람린타이드의 집합에 대한 경향은 인슐린과 함께 제형화 및 투여되는 것을 방해한다. 따라서, 이 유사체는 피하주사에 의해 인슐린과 별도로 투여되는데, 이는 그 사용을 매우 어렵게 만든다(Nyholm B. et al., Expert Opinion, Investig . Drug (2001) 10(9) 1641-1652).
당뇨병의 조기 진단과 치료의 조기 개시에 의해, 이 질병의 진행을 크게 늦추고 이에 따라 긍정적인 영향을 주는 것이 가능하다. 그러나, 타입 Ⅱ 당뇨병에서 IAPP의 역할은 완전히 이해되지는 않고 있다. IAPP의 집합이 그 농도에 의존하기 때문에, 혈중 가용성 IAPP, 즉 가용성 IAPP 집합체의 농도와 질병의 발병 사이에는 명백히 관련이 있을 수 있다. 통상의 IAPP RIAs는 IAPP 항체에 의해 인식된 IAPP 분자를 측정하는 것만 가능하다. 그러나, 항원-항체 상호작용을 담당하는 단백질 영역(항원 영역)은 더 이상 단백질 결합에 의해 용이하게 인식될 수 없다. 따라서, IAPP 분자의 여러 가지 결합 형태를 특이적으로 인식할 수 있는 IAPP를 측정하는 화학적 실험실 방법을 개발하는 것이 중요하다. 이 목적을 위해, 구조-특이적 항체, 즉 모노머 또는 올리고머 IAPP 분자에 대하여 작용하도록 생산된 항체를 개발하는 것이 필요하게 된다. 통상의 IAPP 항체는 구조-특이적이 아니다.
이에 따라, 본 발명의 목적은 단백질 집합 질환, 특히 당뇨병 및/또는 알쯔하이머병의 예방, 치료 및 진단이 이에 의해 개선될 수 있는 시약 및 방법을 제공하는 것이다.
이 목적은 본 발명에 따라, 천연 IAPP 수용체에 결합할 수 있는 아일렛 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP)의 펩티드 유사체의 제조에 의해 달성되는데, 여기에서 a) 이 펩티드 유사체는 최대 38 아미노산, 바람직하게는 최대 37 아미노산을 포함하고, 이 중 37 아미노산은 본래의 서열에 천연 IAPP 아미노산 서열을 가지며, b) 이 펩티드 유사체는 본래의 서열에 천연 IAPP의 적어도 19 내지 37 아미노산을 포함하고, c) 이 펩티드 유사체의 적어도 하나의 아미드 결합은 N-메틸화되고, 그리고 임의로, d) 천연 IAPP의 아미노산 서열에서, 위치 1의 Lys(리신)은 Orn(오르니틴)으로 치환될 수 있고, 그리고/또는 위치 2 및 7의 Cys(시스테인)은 위치 2에서 Dap(2,3-디아미노프로피온산) 및 위치 7에서 Asp(아스파라긴산)으로, 또는 위치 2에서 Asp 및 위치 7에서 Dap로 치환될 수 있고, 그리고 e) 인간 IAPP의 야생형 아미노산 서열을 갖는 서열번호 1 내지 5의 N-메틸화된 펩티드 유사체가 추출된다. 본 발명의 목적은, 특히 천연 IAPP 수용체에 결합할 수 있는 진단용 또는 치료용 약제로서 아일렛 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP)의 펩티드 유사체의 제조에 의해 달성되는데, 여기에서 a) 이 펩티드 유사체는 최대 38 아미노산, 바람직하게는 최대 37 아미노산을 포함하고, 이 중 37 아미노산은 본래의 서열에 천연 IAPP의 아미노산 서열을 가지며, b) 이 펩티드 유사체는 본래의 서열에 천연 IAPP의 적어도 19 내지 37 아미노산을 포함하고, c) 이 펩티드 유사체의 적어도 하나의 아미드 결합은 N-메틸화되고, 그리고 임의로, d) 천연 IAPP의 아미노산 서열에서, 위치 1의 Lys(리신)은 Orn(오르니틴)으로 치환될 수 있고, 그리고/또는 위치 2 및 7의 Cys(시스테인)은 위치 2에서 Dap 및 위치 7에서 Asp으로, 또는 위치 2에서 Asp 및 위치 7에서 Dap로 치환될 수 있다.
본 발명에 따르면, 이들 펩티드 유사체, 즉 변형된 N-메틸화된 IAPP 유도체는 바람직하게는 분리된, 바람직하게는 부분적으로 또는 완전히 정제된 형태로 제조된다.
따라서, 상기 펩티드 유사체는 절대적으로 필수적인 특징 a), b) 및 c)를 특징으로 하고, 그리고 임의로 특징 d)를 포함할 수 있는데; 즉 본 발명의 이러한 임의의 태양에서, 펩티드 유사체는 천연 인간 IAPP 서열에서 1 위치에 포함되는 리신이 아미노산 오르니틴으로 치환되고, 그리고/또는 천연, 특히 인간 IAPP의 2 및 7 위치에서 두 개의 시스테인이 위치 2에서 Dap(2,3-디아미노프로피온산) 및 위치 7에서 Asp로, 또는 위치 2에서 Asp 및 위치 7에서 Dap로 치환되는 사실에 의해, 천연 IAPP, 특히 인간 IAPP 서열로부터 벗어나는 아미노산 서열을 특징으로 한다. 특징 d)에 따라, 즉 천연 IAPP 서열, 특히 인간 IAPP 서열로부터의 일탈로 제공되는 본 발명에 따른 펩티드 유사체는, 위치 1에 오르니틴을 (리신 대신에) 포함하고, 그리고/또는 위치 2에 Asp 또는 Dap를 포함하고 위치 7에 Dap 또는 Asp를 (각각의 경우 시스테인 대신) 포함하여, 본 발명에 따른 펩티드 유사체의 유도체로서 이하에 언급된다.
위치 2 및 7에 Cys를 포함하는 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 바람직하게는 산화되어, 즉 Cys 2와 Cys 7의 티올 라디칼 사이에 디설파이드 다리가 닫혀있다.
마찬가지로, 위치 2 및 7에 Dap 및 Asp, 또는 Asp 및 Dap을 포함하는 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 바람직하게는 연결되어, 즉 Asp와 Dap의 측쇄가 락탐 다리를 통해 서로 공유결합된다.
바람직한 하나의 태양에서, C-말단은 본 발명의 모든 펩티드 유사체에서 아미드로서 존재한다.
본 발명과 관련하여, 용어 "천연 IAPP(natural IAPP)"는 야생형 IAPP 아미노산 서열, 즉 관련된 유기체, 즉 바람직하게는 인간에서 생체내 천연적으로 존재하는 아미노산 서열을 갖는 IAPP를 의미하는 것으로 이해된다. 여러 가지 천연 IAPP 서열, 특히 인간의 것이 Kapurniotu(Biopolymers (Peptide Science) 60 (2001) 438-459)에 개시되어있다. 본 교시로부터 서열번호 18은 인간에서 야생형 IAPP 서열을 나타낸다. 이에 따라, 본 발명의 범위 내에서, 아미노산 또는 아미드 결합의 위치 데이터는 달리 언급되지 않는 한, 항상 Kapurniotu(상기)의 도표 1 또는 서열번호 18에 예시된 천연 인간 IAPP의 아미노산 서열을 의미한다. 마찬가지로, 용어 "천연 IAPP 수용체(natural IAPP receptor)"는 자연에 존재하는 야생형 IAPP 수용체, 특히 인간 야생형 수용체를 의미하는 것으로 이해된다.
하나의 태양에서 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 천연 인간 IAPP와 완전히 동일한 일차 구조를 갖고, 다른 태양에서 펩티드 유사체는 특히 인간 IAPP와 본질적으로 동일한 일차 구조를 갖지만, 본 발명에 따라 어떤 아미드 결합에 선택적으로 삽입된 N-메틸 그룹 때문에 IAPP와 다른 구조를 갖고, 따라서 천연 인간 IAPP와 비교하여 변형된 생물학적, 특히 생화학적 및 생물물리학적 특성을 갖는다. 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 특히 이들이 천연 IAPP, 특히 천연 인간 IAPP와 상호작용할 수 있고, 아밀로이드 피브릴에서 이의 집합, 후속되는 아밀로이드 플라크 형성 및 관련된 독성을 감소 또는 저해할 수 있다는 사실을 특징으로 한다. 동시에, 상기 펩티드 유사체는 천연, 즉 야생형 수용체, 즉 바람직하게는 인간 IAPP 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 유리한 특성을 갖는다. 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 피브릴 형성 능력이 없거나 매우 감소되어 있다. 약 7의 생리적 pH에서 이들은 피브릴 형성에 대해 특히 매우 감소된 경향을 보여주고, 따라서, 천연 IAPP 또는 프람린타이드와 달리, 특히 유리한 방식으로 인슐린과 함께 제형화되고 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드 유사체는, 특히 약 7 내지 7.4의 생리적 pH에서 IAPP 보다 적어도 100 배 더 가용성으로, 상기와 같이 인슐린과 함께 이들이 제형화되는 것이 허용된다. IAPP와 비교하여 이들의 높은 가용성으로 인해, 이들의 생물학적 활성은 용액(1 ㎎/mL)으로 저장 중에 감소되지 않는 반면, IAPP의 경우 감소된다. 또한, IAPP-함유 용액의 첨가제로서, 이들은 IAPP를 가용성으로, 따라서 생물학적으로 활성인 형태로 유지하는 데 도움을 줄 수 있다. IAPP와 비교하여, 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 프로테아제에 의한 분해에 대하여 보다 안정하여, 본 발명의 펩티드 유사체는 정제형으로 투여하는 것이 허용될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 β-아밀로이드 펩티드와 상호작용하여, 알쯔하이머병의 진행에 중요한 역할을 한다. 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 특히 β-아밀로이드 펩티드의 세포독성을 감소시키고, 이에 따라 알쯔하이머병의 진단, 치료 및 예방에 적합하다.
본 발명에 따른 펩티드 유사체는 특히 단백질 집합 질환, 특히 당뇨병, 특히 바람직하게는 타입 Ⅰ 당뇨병 및/또는 타입 Ⅱ 당뇨병(diabetes mellitus)의 예방, 치료 및 진단에 적합하다. 하나의 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 임의로 인슐린 및/또는 IAPP 및/또는 프람린타이드와 함께 당뇨병, 특히 타입 Ⅰ 및/또는 타입 Ⅱ 당뇨병의 예방 및 치료를 위해 사용된다. 더욱이, 본 발명에 따라 제조된 구조-안정화된 펩티드 유사체는, 예를 들어 체액 중 IAPP의 ELISA/RIA-베이스의 검출을 위한 구조-특이적 항체를 제조 및 사용하기 위해 항원으로서, 예를 들어 정해진 크기의 IAPP 모노머 또는 IAPP 올리고머와 조합하거나 단독으로 사용되며, 따라서 개선된 진단 및 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 펩티드 유사체는, 예를 들어 스핀 라벨 또는 형광(fluorescence) 또는 냉광(luminescence) 표지, 특히 N-말단-표지된, 특히 바람직하게는 N-말단 비오틴화된 형태, 또는 N-말단 형광-표지된 형태로, 또는 다른 형광 표지와 함께 제공되는 표지와 함께, 예를 들어 ELISA, RIA 등에 사용될 수 있다.
하나의 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 펩티드 유사체가 천연 IAPP, 특히 천연 인간 IAPP의 완전한 1 내지 37 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기 언급된 이의 유도체의 1 내지 37 아미노산을 포함하거나, 또는 이들 37 아미노산을 단독으로 포함, 즉 동일하게 구성되는 것을 본 발명은 제공한다. 하나의 특히 바람직한 태양에서, 본 발명은 천연, 특히 인간 IAPP의 37 아미노산, 또는 천연 인간 IAPP의 서열로 구성되는 상기 언급된 유도체의 아미노산을 포함하는 상기 언급된 펩티드 유사체를 제공하며, 이 펩티드 유사체에서 아미노산의 α-아미노 그룹의 적어도 하나의 아미드 결합은 N-메틸화된다.
하나의 특히 바람직한 태양에서, 본 발명은 천연, 특히 인간의 IAPP의 완전한 아미노산 서열, 즉 완전한 길이의 1 내지 37 아미노산을 포함하거나, 상기 언급된 이의 유도체의 아미노산 서열을 갖거나 이들로 구성되는, 본 발명에 따른 IAPP의 펩티드 유사체가 천연 IAPP 수용체의 수용체 효능제로서 작용한다는 교시를 제공한다. 이 태양에서, 펩티드 유사체는 IAPP 수용체를 활성화시킨다. 이러한 교시에 따르면, 본 발명에 따른 이들 펩티드 유사체는 당 대사 및 천연 IAPP 분자의 다른 생물학적 활성을 조절하는 데 특히 적합하다. 동시에, 이들 펩티드 유사체는 아밀로이드 피브릴 및/또는 아밀로이드 플라크의 형성에 대한 저해제로서, 즉 불용성 세포-손상 IAPP 집합체의 형성에 대한 저해제로서 작용하고, 따라서 이에 의해 야기되는 세포독성을 동시에 감소 또는 저해시킨다.
하나의 다른 바람직한 태양에서, 야생형 서열과 비교하여 본 발명에 따른 펩티드 유사체는, 특히 그의 N-말단에서 단축되고 천연 IAPP의 적어도 19 내지 37 아미노산, 바람직하게는 8 내지 37 아미노산, 또는 상기 언급된 이의 유도체의 아미노산을 포함하거나, 이들 아미노산만으로 본래의 서열에서 구성된다. 또한, 이 태양에서, 단축된 펩티드 유도체는 천연, 특히 인간 야생형 IAPP의 적어도 19 내지 37, 바람직하게는 8 내지 37 아미노산을, 그리고 최대 2 내지 37 아미노산을 포함하거나, 상기 언급된 이의 유도체의 아미노산을 포함하거나 이들로 구성되고, 펩티드 유사체의 적어도 하나의 아미드 결합이 N-메틸화된다.
본 발명은 또한 천연, 특히 인간 IAPP의 완전한 아미노산 서열을 갖지 않거나, 상기 언급된 유도체, 즉 위치 2 내지 37로부터 위치 19 내지 37까지의 아미노산을 포함하거나 이들로 구성되는 펩티드 유사체의 완전한 아미노산 서열 또는 상기 언급된 이의 유도체의 아미노산 서열을 갖지 않는 본 발명에 따른 단축된 펩티드 유사체가 마찬가지로 야생형 천연 IAPP 수용체에 결합하지만, 이 위치에서 수용체 길항제로 작용하고 따라서 당 대사의 조절제로서 기능하는 데 적합하다는 교시를 제공한다. 이 태양에서, 펩티드 유사체는 IAPP 수용체를 저해한다. 이들 특히 바람직한 펩티드 유사체는 아밀로이드 피브릴 및/또는 아밀로이드 플라크의 형성에 대한 저해제로서 동시에 작용하고, 따라서 관련된 세포독성을 감소 또는 저해시킨다.
따라서, 본 발명은 또한 태양, 즉 예를 들어 천연, 특히 인간 IAPP의 7 내지 37, 6 내지 37, 5 내지 37, 4 내지 37, 3 내지 37, 및 2 내지 37 아미노산, 또는 상기 언급된 이의 유도체의 아미노산을 포함하거나, 이들만으로 구성된 야생형 IAPP의 펩티드 유사체인 태양을 포함하는데, 여기에서 이들 태양 각각은 펩티드 유사체의 적어도 하나의 아미드 결합이 N-메틸화된다.
하나의 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 1, 2, 3 또는 4 개의 N-메틸화된 아미드 결합을 갖는데, 즉 펩티드 아미노산의 α-아미노 그룹의 수소 원자가 메틸 그룹으로 치환된다. 본 발명의 하나의 바람직한 태양에서, 위치 22 및/또는 23 및/또는 24 및/또는 25 및/또는 26 및/또는 27 및/또는 28 및/또는 29와 관련된 본 발명에 따른 펩티드 유사체의 아미드 결합은 N-메틸화된다. 하나의 특히 바람직한 태양에서, N-메틸화된 아미드 결합은 연속되는 4 내지 8 아미노산을 포함하는 펩티드 유사체 영역의 아미노산 서열에 위치한다. 더욱 바람직한 태양에서, N-메틸 그룹은 펩티드 유사체의 두 번째 아미드 결합마다, 특히 상기 언급된 아미노산 위치에, 4 내지 8 아미노산을 포함하는 펩티드 유사체의 영역에 존재할 수 있다.
특히 바람직한 태양에서, 본 발명은 인간 야생형 IAPP의 천연 아미노산 서열을 갖고 동시에 서열번호 1 내지 5에 따른 N-메틸화를 갖는 펩티드 유사체를 제외하고, 서열번호 1 내지 17을 포함하는 그룹으로부터 선택된 펩티드 유사체와 관련된다. 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 17을 포함하는 그룹으로부터 선택된 치료 또는 진단 목적을 위한 펩티드 유사체와 관련된다. 본 발명에 따른 펩티드 유사체, 특히 서열번호 1 내지 17을 위해, 본 발명은 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에서, 그리고 인간 또는 동물 신체에 대한 진단 방법에서 첫 번째 용도를 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 언급된 본 발명의 펩티드 유사체, 특히 서열번호 1 내지 17을 포함하는 그룹으로부터 선택된 펩티드 유사체를 포함하는 약제학적 및 진단용 약제와 관련된다.
하나의 특히 바람직한 태양에서, 본 발명은 인간 야생형 IAPP 또는 이의 유도체의 1 내지 37 아미노산을 포함하는 본 발명에 따른 펩티드 유사체의 그룹으로부터 선택된 펩티드 유사체와 관련되는데, 이들은 위치 (24 및 26), (25 및 27), (23 및 25), (26 및 27), (25 및 26 및 27), (24 및 25), (25 및 26), (22 및 24), (23 및 24), (24 및 26), (23), (24), (25), (26), (27), (28 및 29), (25 및 28 및 29)에서 아미노산의 α-아미노 그룹의 아미드 결합을 포함한다. 이들 펩티드 유사체는 또한, 이들이 인간 야생형 IAPP의 아미노산 서열을 갖는다면, 이하 상기 언급된 서열에서 IAPP-GI, IAPP-AL, IAPP-FA, IAPID-IL, IAPP-AIL, IAPP-GA, IAPP-AI, IAPP-NG, IAPP-FG, IAPP-GAIL, IAPP-F, IAPP-G, IAPP-A, IAPP-I, IAPP-L, IAPP-SS, 및 IAPP-ASS로서 언급된다.
물론, 본 발명은 또한, 특히 약제학적 또는 진단용 약제를 생산하기 위한, 그리고 연구 및 시험 목적을 위한, 상기 언급된 야생형 IAPP의 펩티드 유사체 또는 그 유도체와, 천연의 변형되지 않은 IAPP 및/또는 β-아밀로이드 펩티드, 또는 IAPP나 β-아밀로이드 펩티드(A-β)의 다른 알려진 펩티드 유사체, 또는 IAPP나 A-β의 다른 유도체와의 1:1 혼합물과 같은 혼합물과도 관련된다.
하나의 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명은 가용성이고, 특히 천연 IAPP, 특히 인간 천연 IAPP 보다, 특히 물 또는 생리식염수에서, 바람직하게는 약 7.0 내지 8.0의 생리적 pH, 바람직하게는 pH=7.4에서 적어도 100 배 더 가용성인 본 발명에 따른 펩티드 유사체와 관련된다.
하나의 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 펩티드 유사체는, 바람직하게는 하기 표지가 아미노산일 수 있는 스페이서에 의해 펩티드 유사체에 결합되는 방식으로, 특히 그 N-말단 α-아미노 그룹에서, 특히 아세틸 그룹, 방사성 표지, 효소 표지, 형광 표지, 냉광 표지, 또는 스핀 라벨로 표지된다.
하나의 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 아실 그룹, 기능화된 아실 그룹, 방향족 그룹, 아미노산, 글리콜 그룹, 및 리피드 그룹을 포함하는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 기능성 그룹으로 기능화된다.
하나의 바람직한 태양에서, 기능성 그룹 자체가 아미노산 그룹이 아니라면, 기능성 그룹은 스페이서, 예를 들어 아미노산에 의해 펩티드 유사체와 결합된다.
하나의 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 기질, 예를 들어 매트릭스 상에서, 또는 웰, 마이크로타이터 플레이트, 멤브레인 등의 표면에서 부동화된다(immobilized).
본 발명에 따른 펩티드 유사체는 통상 화학적으로 합성 및/또는 변형될 수 있다.
본 발명은 또한 a) IAPP 또는 b) 펩티드 유사체/IAPP 복합체에 대하여 특이적으로 유도되거나, c) 본 발명의 펩티드 유사체에 대하여 특이적으로 유도된 항체를 생산하는 방법과도 관련되며, 여기에서 적어도 하나의 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 항원 형태로, 임의로 모노머 IAPP 또는 이의 올리고머와 함께, 항체를 형성할 수 있는 시스템과 접촉하도록, 예를 들어 동물 유기체로 주입되고, 형성된 항체가 회수된다. 물론, 본 발명은 또한 IAPP 또는 IAPP/펩티드 유사체 복합체에 대하여 특이적으로 유도되거나, 본 발명의 펩티드 유사체에 대하여 특이적으로 유도된 항체를 생산하는 방법과도 관련되며, 여기에서 항체는 폴리클로날 항체 뿐 아니라 모노클로날 항체도 될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 언급된 방법에 따라 생산될 수 있는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이의 단편과도 관련되며, 여기에서 항체 또는 이의 단편은 본 발명의 펩티드 유사체에 대하여 특이적으로 유도되거나 IAPP 또는 펩티드 유사체/IAPP 복합체에 대하여 특이적으로 유도되어, 즉 이를 특이적으로 인식하고 이에 결합할 수 있다. 항체는 통상의 방법으로 변형, 예를 들어 표지될 수 있다. 이들은 또한 부동화된 형태로, 기질 또는 펠렛에 고정되어 존재할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리클로날 또는 모노클로날 항체는, 예를 들어 본 발명에 따른 펩티드 유사체로 치료받는 환자에서 질병의 진행을 분석하기 위해, 또는 예를 들어 치료에 유효한 추가의 펩티드를 분리 및 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이들의 면역원으로서의 용도와 관련하여, 본 발명에 따른 펩티드는, 천연적으로 존재하는 매우 용해성이 낮은 펩티드에 비하여 크게 개선된 이들의 취급 용이성으로 인해, 진단용 및 치료용 목적의 항체 생산에 특히 유리하다는 것이 입증되었다. 하나의 태양에서, 이렇게 생산된 항체는 본 발명에 따른 펩티드를 특이적으로 인식할 수 있고, 다른 태양에서는 또한 천연적으로 존재하는 야생형 IAPP를 임의로 집합된 형태에서 인식할 수 있어, 본 발명에 따른 항체는 예를 들어 알쯔하이머병 또는 당뇨병의 진단에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 인간 또는 동물 유기체를 면역시키는 방법과도 관련되는데, 여기에서 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 인간 또는 동물 유기체에 투여되어 IAPP 또는 그 유도체에 대하여 면역화가 달성된다.
따라서 본 발명은 본 발명의 펩티드 유사체에 대하여 특이적으로 유도된 항체를 생산하는 방법과 관련되며, 여기에서 적어도 하나의 본 발명의 펩티드 유사체는 항원의 형태로 항체를 형성할 수 있는 시스템과 접촉하게 되고 형성된 항체가 회수된다. 본 발명은 또한 본 발명의 펩티드 유사체 및 IAPP에 대하여 특이적으로 유도된 항체를 생산하는 방법과 관련되며, 여기에서 적어도 하나의 본 발명의 펩티드 유사체는 항체를 형성할 수 있는 시스템과 접촉하게 되고 형성된 항체가 회수된다. 본 발명은 또한 펩티드 유사체와 IAPP의 혼합물에 대하여 특이적으로 유도된 항체를 생산하는 방법과 관련되며, 여기에서 항원 형태인 본 발명의 펩티드 유사체와 모노머 IAPP의 혼합물은, IAPP는 임의로 올리고머의 형태로 이용 가능하기도 한데, 항체를 형성할 수 있는 시스템과 접촉하게 되고 형성된 항체가 회수된다. 본 발명은 또한 펩티드 유사체와 β-아밀로이드 펩티드의 혼합물에 대하여 특이적으로 유도된 항체를 생산하는 방법과 관련되며, 여기에서 항원 형태인 적어도 하나의 본 발명의 펩티드 유사체와 모노머 또는 올리고머 β-아밀로이드 펩티드의 혼합물은 항체를 형성할 수 있는 시스템과 접촉하게 되고 형성된 항체가 회수된다.
본 발명은 또한 상기 방법의 사용에 의해 생산된 특이적 항체 또는 이의 특이적 단편과 관련되며, 이들은 특히 질환, 특히 단백질 집합 질환, 특히 당뇨병 및/또는 알쯔하이머병의 진단, 예방 또는 치료를 위해, 이의 항원을 인식하고 이에 결합한다. 따라서 본 발명은 또한, 특히 당뇨병 및/또는 알쯔하이머병의 진단, 예방 또는 치료를 위한 진단용 또는 약제학적 시약을 생산하기 위한 상기 언급된 항체 또는 이의 특이적 단편의 용도와 관련된다.
하나의 더욱 바람직한 태양에서, 이미 기술한 바와 같이 본 발명은 활성성분으로서 적어도 하나의 펩티드 유사체 및/또는 본 발명의 항체를, 바람직하게는 예방 또는 치료에 유효한 양으로, 바람직하게는 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약제학적 제제와 관련된다.
특히 바람직한 태양에서, 본 약제학적 제제는 임의로, 필요에 따라, 분리제, 활탁제, 용매, 분산제, 코팅제, 항균제 또는 항진균제, 보존제, 착색제, 유화제, 향미제, 또는 다른 통상의 제형 보조제도 포함한다. 추가 성분은, 예를 들어 표적 유기체에, 예를 들어 뇌-혈관 관문을 통해 전달하기 위해 사용되는 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다.
더욱 바람직한 태양에서, 약제학적 제제는 저장(depot) 약제, 즉 활성 성분, 즉 존재하는 펩티드 유사체의 느린 방출을 허용하고, 예를 들어 서방성 매트릭스를 포함하거나, 약제학적 제제가 환자의 신체에서 느리게 용출되는 드라제 커버링에 감싸인 형태로 제공된다.
특히 바람직한 태양에서, 상기 형태의 약제학적 제제는 조합 약제의 형태로 제공되어, 즉 동일 제형 또는 동일 약제 팩 내에 인슐린 및/또는 IAPP 및/또는 프람린타이드도 포함한다. 따라서 본 발명은 a) 적어도 하나의 상기 펩티드 유사체 및/또는 이에 대한 항체를 포함하는 약제학적 제형 및 b) 인슐린 및/또는 IAPP 및/또는 프람린타이드를 포함하는 의료용 키트와 관련되며, 이들 각각은 임의로 약제학적으로 허용되는 담체 및 다른 제형 보조제와 함께 제공되고, 여기에서 펩티드 유사체 및 인슐린 및/또는 프람린타이드 및/또는 IAPP는 활성성분으로서 예방 또는 치료에 유효한 양으로 존재한다.
하나의 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명은 약제학적 제제가 정제 형태로, 에어졸로서, 또는 용액으로서, 특히 주사 용액으로 제공되는 것을 제공한다.
하나의 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명은 단백질 집합 질환, 특히 당뇨병, 바람직하게는 타입 Ⅰ 당뇨병 또는 타입 Ⅱ 당뇨병의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 제제를 생산하기 위한, 본 발명에 따른 펩티드 유사체 또는 상기 언급된 항체의 용도와 관련된다.
본 발명은 또한, 인슐린 및/또는 IAPP 및/또는 프람린타이드와 함께, 당뇨병, 예를 들어 타입 Ⅰ 또는 타입 Ⅱ 당뇨병의 예방 또는 치료를 위한 활성물질로서 펩티드 유사체 및/또는 인슐린 및/또는 IAPP 및/또는 프람린타이드의 두 분리된 제형을 사용하여, 동시 또는 시간차-방출 투여를 위한 조합 약제 키트, 예를 들어 공동 제형 또는 약제 키트를 생산하기 위한 본 발명에 따른 펩티드 유사체 또는 상기 언급된 항체의 용도와 관련된다.
하나의 특히 바람직한 태양에서 본 발명은, 임의로 인슐린 및/또는 IAPP 및/또는 프람린타이드와 함께, 당뇨병, 예를 들어 타입 Ⅰ 또는 타입 Ⅱ 당뇨병의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 제제를 생산하기 위한 본 발명에 따른 펩티드 유사체의 용도와 관련되며, 여기에서 본 발명에 따른 펩티드 유사체, 특히 천연 IAPP의 1 내지 37 아미노산 또는 이의 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 유사체는 당뇨병의 IAPP 수용체-제어된 치료에 대한 수용체 효능제로서, 특히 천연 IAPP 수용체의 활성화를 위해 사용된다. 따라서 본 발명에 따른 용도는 그 범위 내에서 상기 타입의 펩티드 유사체가 생체내에서 천연 IAPP에 결합하고 이를 활성화시켜, 당 대사 조절이 허용되는 것을 제공한다.
하나의 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 용도는, 임의로 인슐린 및/또는 IAPP 및/또는 프람린타이드와 함께, 약제학적 제제를 생산하기 위한 본 발명의 펩티드 유사체, 특히 단축된, 특히 N-말단 단축된 펩티드 유사체, 바람직하게는 천연 인간 IAPP의 적어도 8 내지 37 또는 적어도 19 내지 37 및 최대 2 내지 37 아미노산을 포함하거나 상기 언급된 이의 유도체인 펩티드 유사체가 당뇨병의 치료를 위해 제공되며, 여기에서 펩티드 유사체는 당뇨병의 IAPP 수용체-제어된 치료를 위한 수용체 길항제로서 사용되어, 즉 생체내에서 천연 IAPP 수용체에 결합하여 이를 저해함으로써, 당 대사 및 IAPP의 다른 생리적 기능이 조절되도록 허용한다.
하나의 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 모든 펩티드 유사체 또는 이에 대한 항체는 IAPP 집합의 저해제, 특히 IAPP 아밀로이드 플라크 형성의 저해제로서 사용된다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드 유사체 또는 이에 대한 항체가 IAPP의 세포독성을 감소 또는 저해시키기 위해, 특히 적절한 약제학적 제제를 생산하기 위해 사용되는 것을 제공한다. 하나의 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명의 펩티드 유사체 또는 본 발명의 항체는 동시에, 수용체 효능제이거나 수용체 길항제로서, a) IAPP 집합, 즉 아밀로이드 플라크의 형성을 감소 또는 저해시키고, b) 당 대사를 조절하기 위한 약제학적 제제를 생산하기 위해 사용된다.
하나의 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 펩티드 유사체 또는 본 발명에 따른 항체는 약제학적 제제를 생산하기 위해 사용되며, 여기에서 펩티드 유사체 또는 항체는 동시에, 수용체 효능제이거나 수용체 길항제로서, a) IAPP의 세포독성 또는 이의 집합을 감소 또는 저해시키고, b) 당 대사를 조절하기 위해 사용된다.
하나의 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명은 알쯔하이머병 또는 파킨슨병, 헌팅턴병 또는 프라이온병과 같은 다른 단백질 집합 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 제제를 생산하기 위해 사용되는 상기 타입의 펩티드 유사체 및/또는 이에 대한 항체와 관련되고, 이들 펩티드 유사체 및/또는 항체는 치료 또는 예방에 유효한 양으로 사용되고, 특히 펩티드 유사체 또는 이에 대한 항체는 β-아밀로이드 펩티드의 아밀로이드 플라크 형성 또는 집합체 형성을 감소 또는 저해하거나, 이의 세포독성을 감소 또는 저해한다.
다른 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명은 a) 알쯔하이머병 또는 프라이온병, 파킨슨병, 또는 헌팅턴병과 같은 다른 단백질 집합 질환, 그리고 b) 당뇨병, 특히 타입 Ⅰ 당뇨병 또는 타입 Ⅱ 당뇨병의 동시 예방 및 치료를 위한 약제학적 제제를 생산하기 위한, 상기 타입의 펩티드 유사체 또는 이에 대한 항체와 관련된다.
하나의 더욱 바람직한 태양에서, 알쯔하이머병 또는 파킨슨병, 프라이온병, 또는 헌팅턴병과 같은 다른 단백질 집합 질환의 예방 및 치료, 특히 a) 알쯔하이머병 또는 프라이온병, 파킨슨병, 또는 헌팅턴병과 같은 다른 단백질 집합 질환, 그리고 b) 당뇨병의 동시 예방 및 치료를 위한 약제학적 제제는 인슐린, 프람린타이드, 또는 IAPP와 함께 조합 약제로서 제공된다.
본 발명의 더욱 바람직한 태양은 알쯔하이머병 또는 프라이온병, 파킨슨병, 및/또는 헌팅턴병과 같은 다른 단백질 집합 질환의 진단을 위한 진단용 시약을 생산하기 위한 본 발명의 펩티드 유사체 또는 항체와 관련된다.
본 발명의 더욱 바람직한 태양은 단백질 집합 질환, 특히 당뇨병의 진단을 위한 진단용 시약을 생산하기 위한 본 발명의 펩티드 유사체 또는 본 발명의 항체와 관련된다.
본 발명은 또한 연구 목적을 위한 펩티드 유사체의 용도와 관련된다.
하나의 바람직한 태양에서, 본 발명은 진단용, 치료용 및 연구 목적을 위한 항체, 특히 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 생산을 위한, 보다 용이하게 처리할 수 있는 면역원으로서의 본 발명의 펩티드 유사체와 관련된다.
하나의 다른 태양에서, 본 발명은 IAPP 또는 이의 집합체의 정성적 및/또는 정량적 검출을 위한 방법과 관련되며, 여기에서 검출 표지와 함께 제공되는 본 발명의 펩티드 유사체, 또는 검출 표지와 함께 제공되는 본 발명의 항체는 프로브의 형태로, 생체내, 즉 인간 또는 동물 유기체에서, 또는 검사받는 샘플과 함께 생체외에서 접촉하고, 존재할 수 있는 펩티드 유사체 또는 IAPP에 대한 항체 또는 올리고머 또는 이의 집합체의 결합이 검출된다.
여러 가지 아밀로이드 형성 폴리펩티드, 즉 β-아밀로이드 펩티드, 프라이온 단백질, 폴리글루타민(헌팅턴병), α-시뉴클레인(파킨슨병) 등과 같은 단백질로 구성된 가용성 올리고머는 유사한 공간 구조를 갖는다는 증거가 있다(Kayed et al., Science (2003), 300, 486-489). Kayed 등(loc. cit)은 최근에 β-아밀로이드 펩티드(알쯔하이머병)의 가용성 올리고머 구조의 모델에 대하여 작용하도록 생산된 항체가 IAPP, α-시뉴클레인 및 프라이온 단백질 단편과 같은 여러 가지 다른 단백질로부터의 가용성 독성 올리고머를 인식하고 이들의 세포독성을 생체외에서 중화시킬 수 있음을 보여주었다. 따라서, 본 발명에 따른 유사체 또는 이에 대한 항체는 집합을 변경하거나 β-아밀로이드 펩티드, 프라이온 단백질, 폴리글루타민, 또는 α-시뉴클레인과 같은 다른 아밀로이드 형성 폴리펩티드를 검출하기 위한 여러 가지 방법에도 적합하다.
본 발명은 또한 집합의 추적 및 변경, 특히 아밀로이드 형성 펩티드, 올리고머, 또는 이의 집합체, 특히 IAPP 단백질, IAPP 올리고머, 또는 IAPP 집합체의 정성적 또는 정량적 검출, 또는 IAPP 폴리펩티드, 올리고머, 또는 이의 집합체의 세포독성을 저해하기 위한 방법과도 관련되는데, 여기에서 본 발명에 따른 펩티드 유사체 또는 이에 대한 항체는 생체내 또는 생체외에서 아밀로이드 형성 펩티드, 올리고머, 또는 이의 집합체와 접촉하게 되어 아밀로이드 형성 펩티드, 올리고머 또는 이의 집합체의 집합 양상이 변경되고, 특히 집합이 감소 또는 저해되고, 그리고/또는 이에 의해 추적(진단)될 수 있다.
본 발명은 또한 집합의 추적 및 변경, 특히 아밀로이드 형성 펩티드, 올리고머, 또는 이의 집합체, 특히 β-아밀로이드 펩티드, 프라이온 단백질, α-시뉴클레인, 폴리글루타민, 이의 올리고머 또는 이의 집합체의 정성적 또는 정량적 검출, 또는 β-아밀로이드 펩티드, 프라이온 단백질, α-시뉴클레인, 또는 폴리글루타민, 또는 이의 올리고머 또는 집합체의 세포독성을 저해하기 위한 방법과도 관련되는데, 여기에서 본 발명에 따른 펩티드 유사체 또는 이에 대한 항체는 생체내 또는 생체외에서 아밀로이드 형성 펩티드, 올리고머, 또는 이의 집합체와 접촉하게 되고 아밀로이드 형성 펩티드, 올리고머 또는 이의 집합체의 집합 양상이 변경되고, 특히 집합이 감소 또는 저해되고, 그리고/또는 이에 의해 추적(진단)될 수 있다.
하나의 더욱 바람직한 태양에서, 본 발명은 IAPP, 폴리글루타민, α-시뉴클레인, 프라이온 단백질, 또는 β-아밀로이드 펩티드의 액체 중에서의 집합체 형성을 변경, 특히 방지하기 위한 방법과 관련되는데, 여기에서 본 발명의 펩티드 유사체는 액체와 접촉 및 배양되고, IAPP, 프라이온 단백질, α-시뉴클레인, 폴리글루타민, 또는 β-아밀로이드 펩티드의 집합 양상이 변경된다.
본 발명의 다른 태양은 종속항으로부터 비롯된다.
서열 프로토콜:
서열번호는 다음을 나타낸다:
서열번호 1 내지 17은 본 발명 펩티드 유사체의 바람직한 태양을 나타낸다. 각 서열번호는 동일한 N-메틸화 패턴에서 일차 구조가 다른 복수의 다양한 본 발명의 펩티드 유사체를 나타낸다. 따라서 각각의 서열번호는 특이적 N-메틸화 패턴을 나타내는데, 이는 다양한 일차 구조, 즉 다양한 아미노산 서열, 예를 들어 인간 IAPP 또는 상기 정의된 이의 유도체, 즉 위치 1의 리신 및/또는 위치 2 및 7의 두 시스테인 라디칼이 위치 1에서 (리신의 치환물로서) 오르니틴으로 치환되고, 그리고/또는 아스파라긴산 및 Dap가 (두 시스테인 라디칼의 치환물로서) 사용되는 유도체의 천연 야생형 아미노산 서열에서 존재할 수 있다. 따라서, 각각의 서열번호는 특이적 N-메틸화 패턴을 갖는 천연 인간 야생형 IAPP의 일차 구조를 나타내고, 또한 동일한 N-메틸화 패턴을 갖는 상기 언급된 유도체를 나타내기도 한다. 위치 2 및 7에 Cys를 포함하는 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 바람직하게는 산화되어; 즉, Cys 2 및 7의 티올 라디칼 사이의 디설파이드 다리가 닫혀있다.
마찬가지로, 위치 2 및 7에 Dap 및 Asp, 또는 Asp 및 Dap를 포함하는 본 발명에 따른 펩티드 유사체는 바람직하게는 연결되어; 즉 Asp와 Dap의 측쇄가 락탐 다리를 통해 서로 공유결합되어있다. 본 발명의 하나의 바람직한 태양에서, C-말단은 본 발명의 모든 펩티드 유사체에서 아미드로서 존재한다.
[서열목록 자유텍스트]
서열번호 1에서 위치 24의 Gly 및 위치 26의 Ile는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 2에서 위치 25의 Ala 및 위치 27의 Leu는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 3에서 위치 23의 Phe 및 위치 25의 Ala는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 4에서 위치 26의 Ile 및 위치 27의 Leu는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 5에서 위치 25의 Ala 및 위치 26의 Ile는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 6에서 위치 24의 Gly 및 위치 25의 Ala는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 7에서 위치 25의 Ala 및 위치 26의 Ile는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 8에서 위치 22의 Asn 및 위치 24의 Gly는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 9에서 위치 23의 Phe 및 위치 24의 Gly는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 10에서 위치 24의 Gly, 위치 25의 Ala, 위치 26의 Ile 및 위치 27의 Leu는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 11에서 위치 23의 Phe는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 12에서 위치 24의 Gly는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 13에서 위치 25의 Ala는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 14에서 위치 26의 Ile는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 15에서 위치 27의 Leu는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 16에서 위치 28의 Ser 및 위치 29의 Ser는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
서열번호 17에서 위치 25의 Ala, 위치 28의 Ser 및 위치 29의 Ser는 N-메틸화되고; 위치 1은 리신 또는 오르니틴이고, 위치 2 및 7은 (Cys 및 Cys) 또는 (Asp 및 Dap) 또는 (Dap 및 Asp)이다.
다음 실시예에서 사용되는 바람직한 펩티드 유사체의 약자와 서열번호의 조합은 실시예 8에 제공된다.
서열번호 18은 천연 인간 IAPP의 아미노산 서열을 나타낸다.
본 발명은 다음 실시예 및 첨부 도면을 참고하여 더욱 상세하게 설명된다.
도 1은 IAPP(10 및 100 μM에서) 및 IAPP-GI, IAPP-AL, IAPP-FA, 그리고 IAPP-IL 유사체의 침전 분석의 흡광도를 보여준다. 570 ㎚에서의 흡광도는 단백질의 양에 대응한다(펠렛 또는 상등액에서).
도 2는 피브릴 형성 시험의 결과를 보여준다: 62.5 μM IAPP 대 62.5 μM IAPP-GI, IAPP-AL, 및 IAPP-IL의 피브릴 형성 잠재력(potential)은 ThT 결합 분석을 사용하여 정량하였다.
도 3은 IAPP 및 IAPP-GI, IAPP-AL, 그리고 IAPP-FA 유사체의 아밀로이드 형성 잠재력(potential)의 전자 현미경(EM) 시험의 결과를 보여준다. 펩티드의 배양(5 μM, 20 시간)은 EM-베이스의 집합 시험에 의해 검사하였다. 다음 배양 등분은 좌측으로부터 우측으로 다음과 같다: IAPP 단독, IAPP-GI, IAPP-FA, 및 IAPP-AL (막대: 100 ㎚).
도 4는 IAPP와 비교한 IAPP-GI, IAPP-AL, 및 IAPP-FA 유사체의 잠재적(potential) 세포독성 효과를 결정하기 위한 MTT 환원 분석의 결과를 보여준다.
도 5는 피브릴 결합 시험의 결과를 보여준다: IAPP(6.25 μM)의 피브릴 형성 잠재력(potential)에 대한 IAPP-GI, IAPP-AL, 및 IAPP-FA(1:1 혼합물)의 효과는 ThT 결합 분석에 의해 정량하였다.
도 6은 집합 시험의 결과를 보여준다: IAPP(5 μM)의 피브릴 형성 잠재력(potential)에 대한 IAPP-GI, IAPP-AL, 및 IAPP-FA(1:1 혼합물)의 효과는 EM-베이스의 집합 분석에 의해 검사하였다. 다음 배양 등분은 좌측으로부터 우측으로 다음과 같다: IAPP 단독, IAPP-GI와 혼합된 IAPP, IAPP-FA와 혼합된 IAPP, 및 IAPP-AL과 혼합된 IAPP.
도 7a는 IAPP(RIN5fm 세포주)의 췌장 세포독성에 대한 IAPP-GI, IAPP-AL, 및 IAPP-FA 유사체의 효과를 측정하기 위한 MTT 환원 분석의 결과를 보여준다.
도 7b는 RIN5fm 세포 단독에 대한, 그리고 IAPP-GI(1:1) 존재 중에 IAPP-유도된 세포사멸의 측정을 보여준다. IAPP-GI 단독의 경우도 동일한 조건 하에서 시험하였고, 어떠한 세포독성도 발견되지 않았다. 적어도 두 개의 독립된 분석으로부터의 대응하는 평균값(±SEM)을 보여준다.
도 8a는 MCF-7 세포에 대한 IAPP 및 IAPP-GI, IAPP-AL, 그리고 IAPP-FA 유사체를 사용한 (인간) IAPP 수용체 결합 분석의 결과를 보여준다. 방사성리간드 [125I]-rIAPP의 특이적 결합은 리간드 농도에 대하여 플롯팅하였다.
도 8b는 MCF-7 세포에 대한 IAPP 및 IAPP-GI, IAPP-AL, 그리고 IAPP-FA 유사체를 사용한 수용체 활성화 분석의 결과를 보여준다. 아데닐레이트 사이클라제 활성화(최대 %)는 cAMP Biotrak ELISA(Amersham)를 사용하여 cAMP를 정량하여 측정하였다. 최대 AC 활성화는 1 μM IAPP에 의해 달성된 AC 활성화인 것으로 추정되었다.
도 9는 ELISA의 결과를 보여준다: 250-μM IAPP 용액(10 mM 인산나트륨, pH 7.4 중)에서 실온(RT) 하에 4 일 동안 보존된 MCF-7 세포에 대한 수용체 활성화 잠재력(potential)의 시간 의존성을 IAPP-GI 및 IAPP-AL 유사체 및 IAPP와 유사체의 혼합물에 대한 값과 비교하였다. 아데닐레이트 사이클라제 활성화(최대 %)는 cAMP Biotrak ELISA(Amersham)를 사용하여 cAMP를 정량하여 측정하였다. 최대 AC 활성화는 1 μM IAPP에 의해 달성된 AC 활성화인 것으로 추정되었다.
도 10은 A-β(PC-12 세포주)의 세포독성에 대한 IAPP-GI 유사체의 효과를 측정하기 위한 MTT 환원 시험의 결과를 보여준다. 결과는 하나의 대표 분석(3회 측정)으로부터의 평균값(±SEM)이다.
실시예 1
본 발명에 따른 펩티드 유사체의 용해도 특성의 평가, 및 IAPP와의 비교
본 발명에 따른 펩티드 유사체의 천연 IAPP와 비교한 용해도 특성을 침전 시험, 전자현미경 분석, 및 티오플라빈-T 결합 시험을 사용하여 조사하였다.
a) 침전 시험은 IAPP와 비교한 유사체의 용해도를 조사하기 위해 사용되었다. 침전되거나 용해된 펩티드의 양은 시간의 함수로 측정되었다. 하나의 통상적인 실험에서, 먼저 10 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.4 중 주어진 농도(1, 10, 또는 100 μM)의 펩티드 용액을 제조하였다. 이 용액의 등분을 특정 시간 원심분리하고(20200 g, 20 분), 펠렛 중에 침전된 단백질과 상등액을 비신코닉산(BCA; bicinchonic acid) 단백질 측정 분석을 사용하여 정량하였다. 도 1은 이 시험으로 부터 몇 가지 결과를 보여준다. 10 μM 농도에서 IAPP의 집합은 용액의 제조 직후 시작외었다. 20 시간 후 IAPP는 완전히 침전되었다; 반면, N-메틸화된 IAPP-AL, IAPP-GI, 및 IAPP-FA 유사체는, 100 μM의 농도에서도 14일이 지나도 용해상태를 유지하였다. IAPP는 후술한 조건(100 μM) 하에서는 단 2 시간 후에 완전히 침전되었다.
b) 여러 단백질 종으로부터의 아밀로이드 피브릴은 ThT 염료에 결합하고 단백질의 최대 형광 방출에서 증가를 야기한다. 따라서, ThT 결합은 아밀로이드 피브릴을 정량하기 위하여 널리 사용되는 특이적 시험이다. 이 시험은 IAPP와 비교한 유사체의 아밀로이드 형성 잠재력(potential)을 측정하기 위해 사용되었다. 이 시험을 위해, 유사체와 IAPP를 62.5 μM의 농도로 배양하였다(2% HFIP, 10 mM 트리스, pH 7.4). 이들 배양액으로부터 40-mL 등분을 5 μM ThT 용액(0.1 M 글리신-NaOH 완충액, pH 8.5 중) 160 mL와 결합시키고, 혼합하여, 450 ㎚에서 여기 후 용액으로부터의 방출을 485 ㎚에서 측정하였다.
IAPP는 625 nM 농도에서 피브릴을 형성하는 것으로 나타났다. 반면, 유사체들은 62.5 μM의 농도에서도 피브릴을 형성하지 않았다(도 2).
c) EM 분석을 위해, IAPP 대 유사체의 5-μM 용액(1% HFIP를 함유하는 10 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.4 중)을 실온에서 약 20 시간 동안 배양하였다. 다음에 용액 10 μL를 EM 플레이트에 적용하고, Kayed, J. Mol . Biol . (1999) 287, 781-796에 기재된 바와 같이 1% 우라닐아세테이트로 염색한 후, EM에 의해 피브릴의 존재를 분석하였다. 주로 IAPP 아밀로이드 피브릴로 구성된 IAPP 용액과는 대조적으 로, IAPP 유사체의 용액은 피브릴을 함유하지 않는 것으로 나타났다(도 3).
ThT 결합 분석 및 침전 분석 결과와 함께, 이들 데이터는 유사체가 아밀로이드를 형성하지 않고, IAPP 보다 적어도 100 배 더 가용성임을 보여준다.
실시예 2
IAPP와 비교한 유사체의 세포독성 조사
IAPP 아밀로이드 집합체는 췌장 β-세포 및 많은 다른 세포에 대하여 세포독성이다. IAPP 및 다른 아밀로이드 폴리펩티드의 세포독성 작용은 이들의 아밀로이드에 대한 집합과 관련되는 것으로 추정된다. 유사체들은 아밀로이드를 형성하지 않기 때문에, 이들은 세포독성이 아닐 것이다. 이 가설을 시험하기 위해, 원래의 산화환원 전위를 갖는 건강한 세포에 의한 염료 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT)의 환원에 기초한 MTT 세포독성 시험이 사용되었다(Shearman et al., J. Neurochem . (1995) 65, 218-227; Shearman et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA (1994) 91, 1470-74). 후자는 세포 생존 또는 손상의 조기 지시약이다. IAPP를 포함하는 아밀로이드 집합체의 세포독성 작용은 이 시험에 의해 정량화될 수 있는 것으로 나타났다. IAPP 및 유사체의 세포 독성은 Kapurniotu et al., J. Mol . Biol . (2002) 315, 339-350에 기재된 바와 같이 RIN5fm 췌장 세포주를 사용하여 조사되었다(도 4). 하나의 통상적인 MTT 시험에서, 배양을 위해 펩티드(1% HFIP를 포함하거나 포함하지 않는 10 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.4 중 5 μM)를 제조하고 실온에서 20 시간 후 세포(세포 농도 5×105 세포/mL에서 20 시간 전에 접종된))에 적용하였다. 세포와 함께 약 20 시간 배양 후, MTT를 여기에 첨가하고 2 시간 동안 작용 후에 세포의 MTT 환원 전위를 스펙트로포토미터로 측정하였다. 결과는 대조군 세포에 의한 MTT의 환원 백분율에 대응하는 세포생존 %로 보고되고(MTT의 100% 환원은 100% 생존에 대응한다), 이는 적어도 두 개의 독립 시험으로부터 평균값(±SEM)에 대응한다.
도 4에서 보듯이, IAPP와 대조적으로, IAPP-AL, IAPP-GI, 및 IAPP-FA 유사체는 세포독성을 보이지 않았다.
실시예 3
IAPP의 아밀로이드 형성 잠재력의 저해제 또는 조절제로서의 유사체의 작용
IAPP의 아밀로이드 형성 잠재력에 대한 유사체의 작용을 전자현미경(EM) 및 ThT 결합 시험에 의해 조사하였다.
하나의 통상적인 ThT 결합 시험 분석에서, 분석용 완충액(10 mM 트리스, pH 7.4 및 2% HFIP) 중 6.25 μM IAPP를 단독으로 또는 유사체의 하나와 1:1 혼합물로 함유하는 배양액을 제조하였다. 이 용액의 등분을 위에 기재된 바와 같이 특정 배수로 ThT와 결합시키고 이들의 형광 방출을 조사하였다. 도 5에서 보듯이, 유사체는 IAPP의 아밀로이드 형성 잠재력에 대한 강한 저해 작용을 갖는다.
EM에 의해 추적된 하나의 통상적인 집합 시험에서, IAPP(5 μM)를 단독으로 또는 1:1 비율로 유사체 중 하나의 존재 중에(1% HFIP를 포함하는 10 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.4 중) 배양하였다. 20 시간 후, 용액 10 μL를 EM 플레이트에 적용하고, Kayed, J. Mol . Biol . (1999) 287, 781-796에 기재된 바와 같이 1% 우라닐 아세테이트로 염색한 후, EM에 의해 피브릴의 존재를 분석하였다. 주로 IAPP 아밀로이드 피브릴로 구성된 IAPP 용액과는 대조적으로, IAPP 유사체 혼합물에서는 피브릴 형성이 완전히 억제되었다(도 6).
실시예 4
IAPP 세포독성의 저해제로서 유사체의 작용
IAPP 아밀로이드 집합체의 β-세포 독성에 대한 IAPP-GI, IAPP-AL, 및 IAPP-FA 유사체의 작용을 두 가지 다른 시험을 사용하여 조사하였다. 첫 번째로 MTT 세포 생존 시험을 사용하였다(상기 참조). 이 시험에서는 IAPP/펩티드 유사체 혼합 비율 1:1에서 모든 유사체가 IAPP의 세포 독성을 유의적으로 저해하는 것을 보여주었다(도 7a). 이는 IAPP-GI가 IAPP 세포독성의 가장 강력한 저해제임을 보여준다.
두 번째 시험에서, IAPP 아밀로이드에 의해 야기된 세포사멸성(apoptotic) β-세포 사멸에 대한 IAPP-GI의 작용을 조사하였다(IAPP-중개의 세포 사멸은 세포사멸(apoptosis)에 의해 우선적으로 야기되는 것으로 알려져 있다). 이 목적으로, IAPP 단독 또는 IAPP-GI의 존재 중의(1:1)(10 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.4 중 5 μM) IAPP 용액을 제조하고, 최종 농도 500 nM로 도말된 세포와 20 시간 동안 배양하였다. 다음에 시판되는 세포사멸(apoptosis) ELISA(Roche의 세포 사멸 검출 키트)를 사용하여 세포사멸을 정량하였다. 세포사멸성 세포 사멸의 조기 및 특이적 지시약인 세포졸 뉴클레오좀을 이 ELISA 분석을 사용하여 정량하였다. 이 시험은 또한 IAPP-GI는 IAPP-유도된 세포사멸성 세포 사멸로부터 췌장 β-세포를 보호할 수 있음을 보여주었다(도 7b).
실시예 5
IAPP 수용체 효능제로서의 유사체의 작용
(인간) IAPP 수용체 효능제로서의 유사체의 작용을 시험하기 위해, 먼저 이 수용체를 발현하는 세포에 대한 이들의 수용체 결합 친화성을 시험하였다. 이러한 세포의 한 예는 MCF-7 세포주(Zimmermann, et al., J. Endocrinology (1997), 155, 423-31)로, 인간 흉부암세포로부터 유래된다. 특이적 IAPP 수용체가 MCF-7 세포주에서 발현되고, 이러한 이유로 이 세포주는 IAPP 효능제/길항제를 시험하기 위해 널리 사용된다.
수용체 결합 시험은 Zimmermann, et al., J. Endocrinology (1997), 155, 423-31에 기술된 것과 유사한 방식으로 실시되었다. IAPP 또는 IAPP-GI, IAPP-AL, 또는 IAPP-FA 펩티드 유사체의 존재 중에서, 현재까지 알려진 가장 강력한 수용체 리간드인 125I로 표지된 래트 IAPP (rIAPP) 서열의 결합을 정량적으로 측정하였다. 다양한 최종 농도에서 대응하는 펩티드와 방사성 표지된 rIAPP 리간드(∼80 pM)의 혼합물(도 8a)을 MCF-7 세포와 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 다음에 세포를 시험 완충액(시험 완충액은 0.1% BSA를 함유하는 F12 영양 혼합물(HAM)과 Dulbeccos MOD Eagle의 1:1 혼합물로 구성됨)으로 세척하고, 먼저 NaOH(0.5 M)와, 다음에 신틸레이션 액과 결합시키고, 신틸레이션 카운터를 사용하여 멤브레인-결합 방사능을 측정하였다. 도 8a에 나타낸 바와 같이, 여기에서 시험된 세 유사체 모두 IAPP 수용체와 결합할 수 있었다. IAPP-AL은 가장 높은 수용체 친화성을 갖는 효능 제로 나타난 반면, IAPP-GI는 가장 약하였다(도 8a).
유사체의 효능제 잠재력을 시험하기 위해, 다음에 이들의 아데닐레이트 사이클라제 활성화 전위(AC 활성화)를 시험하였다. IAPP의 수용체-중개된 생물학적 작용 몇 가지는 아데닐레이트 사이클라제 활성에 의해 부여되는 것으로 나타났다. AC 활성화는 cAMP Biotrak ELISA(Amersham)을 사용하여, 여러 농도의 IAPP 또는 유사체로 세포를 처리(15 분, 37 ℃)한 후 생산된 cAMP를 정량하는 것에 의해 측정하였다. 이 시험은 Zimmermann, et al., J. Endocrinology (1997)(loc. cit.)에 기술된 것과 유사한 방식으로 시행되었다. 도 8b에서 보듯이, 시험된 모든 유사체(IAPP-GI, IAPP-AL, IAPP-FA)는 완전한 IAPP 효능제였다. IAPP-AL은 가장 강력한 효능제로 나타났고, IAPP 보다 양호한 AC 활성화 리간드이다. IAPP-FA는 IAPP와 동일한 AC 활성화 전위를 갖고, IAPP-GI는 IAPP 보다 약한 효능제이다.
따라서, AC 활성화 시험의 결과는 수용체 결합 시험의 결과와 일치한다.
실시예 6
용액(pH 7.4에서 1 ㎎/mL 농도)에서의 안정성 및 그 생리활성(호르몬 활성)의 보존의 IAPP와의 비교; 치료에 있어서 IAPP 대체제로서의 사용 가능성
당뇨병 및/또는 다른 질병의 치료에서, IAPP 또는 프람린타이드 대체제로서 유사체의 적용 가능성을 위해, 용이하게 집합하는 IAPP와 비교하여 유사체 용액의 안정성 및 이들의 호르몬 활성을 조사하였다. 하나의 통상적인 분석에서, 10 μM 인산나트륨, pH 7.4 중 (250 μM 또는 1 ㎎/mL) IAPP, IAPP-AL, IAPP-GI, 또는 IAPP와 유사체의 1:1 혼합물의 수용액을 실온에서 사용하여 4 일 동안 배양하였다. 이들 용액의 AC 활성화 전위를 여러 시간, 예를 들어 시간 0, 48 시간, 및 96 시간에서 상기 기술된 AC 활성화 분석에 의해 측정하였다(세포 중에서 최종 농도는 1 μM로 최대 활성화에 대응)(도 9).
이들 실험은 상기 조건 하에서 저장시, IAPP는 원래의 호르몬 활성의 반 이상을 (아마도 집합 때문에) 소실할 수 있다는 것을 보여준다. 대조적으로, 유사체 및 IAPP/유사체 혼합물(1:1)의 호르몬 활성은 완전히 유지되었다. 선택된 농도인 1 ㎎/mL는, 임상 연구에서 당뇨병의 치료에 사용되는 Amylin Pharmaceuticals의 Symlin(프람린타이드 아세테이트) 제형의 농도에 대응한다.
실시예 7
알쯔하이머 펩티드인 β-아밀로이드 펩티드(A-β)의 세포독성에 대한 유사체의 저해 작용: 알쯔하이머병(AD)의 치료를 위한 사용 가능성
A-β의 세포독성에 대한 IAPP-GI(1:1 혼합물)의 작용을 MTT 시험을 사용하여 조사하였다. 이 목적을 위해, A-β(100 μM)를 단독 또는 IAPP-GI와 함께 실온에서 4 일 동안 150 mM NaCl 및 2.2% HFIP를 포함하는 10 mM 트리스 완충액, pH 7.4 중에서 배양하였다. 희석 후, 용액을 PC-12 및 HTB-14 세포와 결합시켰다. 양 세포주는 잠재적 A-β 세포독성 저해제의 저해 작용을 조사하기 위해 종종 사용된다. 양 세포주에서, IAPP-GI는 실제로 A-β 펩티드의 세포독성을 크게 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다(도 10). A-β와 IAPP-GI의 상호작용은 다른 결합 시험에 의해 입증되었다. 따라서, IAPP-GI 및 다른 N-메틸화된 IAPP 유사체는 알쯔하이머병(AD)의 치료에 특히 적합하다.
실시예 8
본 발명의 펩티드 유사체
Figure 112007036248554-PCT00001
Fmoc/tBu 방법을 사용하여 RINK 아미드-MBHA 수지 상에서 통상적인 고체-상 펩티드 합성 방법에 따라, 본 발명에 따른 펩티드 유사체를 간단한 화학 합성에 의해 고순도 및 양호한 수율로 제조하였다(Kazantzis et al., Eur . J. Biochem . (2002) 269, 780-791). 하나의 통상적인 합성에서, Na-Fmoc-보호된 아미노산(측쇄 보호)는 다음과 같다: Lys(Boc), Cys(Tet), Arg(Pmc), Asn(Tet), His(Tet), Ser(tBu), Tyr(tBu), Thr(tBu)). N-메틸화된 Fmoc 아미노산도 이 형태로 사용되었다(예를 들어, Fmoc-(N-Me) Ile; Fmoc-(N-Me) Gly, 등). Fmoc 아미노산(AA)의 연결은 DMF 및/또는 NMP 중 TBTU 및 DIEA(C-말단 AA의 몰량에 대하여 4x 몰 과량의 AA, 4x 과량의 TBTU; 6x 과량의 DIEA)를 사용하여 실시하였다. N-메틸화된 AA의 연결 또는 N-메틸화된 AA로의 연결을 위해, 매우 과량, 2 배 내지 x배 연결 수, 용매 혼합물, 및 더 긴 연결 배수가 사용되었다. Fmoc 그룹의 절단은 DMF 중 25% 피페리딘을 사용하여 실시하였다. 수지로부터 펩티드의 절단은 TFA/물/티오아니솔/에탄디티올/페놀(83:4.5:4.5:2:6(v/v/v/v/w))의 혼합물을 사용하여 실시되었다(Kazantzis et al., Eur . J. Biochem . (2002) 269, 780-791). 수지를 여과에 의해 펩티드 용액으로부터 제거하고, 용매의 증발, 10% HAc 중에 용해, 에테르로 추출, 그리고 수성 상의 동결건조 후 조 생성물이 환원된 형태로 얻어졌다. Cys2/Cys7 디설파이드 연결의 폐쇄는 3 M GdnHCl을 포함하는 0.1 M NH4HCO3 용액(1 ㎎/mL 펩티드 농도) 중에서 실시되었으며 2-4 시간을 요하였다. 산화 후, 조 생성물을 ACN-함유 구배를 사용하여 C18 컬럼 상에서 역상 크로마토그라피에 의해 다시 초고순도 정제하였다(Kazantzis et al., loc. cit.).
본 발명은 IAPP 펩티드 유도체를 사용하여 당뇨병 및 알쯔하이머병을 치료하기 위한 개선된 수단 및 방법을 제공한다.
<110> RWTH AACHEN FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT ZUR FORDERUNG DER ANGEWANDTEN FORSCHUNG E.V. <120> CHEMICALLY MODIFIED PEPTIDE ANALOGS <130> PI071423/PCT/EP <150> 10 2004 051 014.8 <151> 2004-10-20 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (24)..(26) <223> The amide bonds of Gly at position 24 and of Ile at position 26 are N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 1 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (25)..(27) <223> The amide bonds of Ala at position 25 and of Leu at position 27 are N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 2 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (23)..(25) <223> The amide bonds of Phe at position 23 and of Ala at position 25 are N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 3 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 4 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (26)..(27) <223> The amide bonds of Ile at position 26 and of Leu at position 27 are N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 4 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 5 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (25)..(27) <223> The amide bonds of Ala at position 25, of Ile at position 26, and of Leu at position 27 are N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 5 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 6 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (24)..(25) <223> The amide bonds of Gly at position 24 and of Ala at position 25 are N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 6 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 7 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (25)..(26) <223> The amide bonds of Ala at position 25 and of Ile at position 26 are N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 7 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 8 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (22)..(24) <223> The amide bonds of Asn at position 22 and of Gly at position 24 are N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 8 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 9 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (23)..(24) <223> The amide bonds of Phe at position 23 and of Gly at position 24 are N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 9 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 10 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (24)..(27) <223> The amide bonds of Gly at position 24, of Ala at position 25, of Ile at position 26, and of Leu at position 27 are N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 10 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 11 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (23) <223> The amide bond of Phe at position 23 is N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 11 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 12 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (24) <223> The amide bond of Gly at position 24 is N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 12 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 13 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (25) <223> The amide bond of Ala at position 25 is N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 13 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 14 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (26) <223> The amide bond of Ile at position 26 is N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 14 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 15 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (27) <223> The amide bond of Leu at position 27 is N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 15 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 16 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (28)..(29) <223> The amide bonds of Ser at position 28 and of Ser at position 29 are N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 16 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 17 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (25)..(29) <223> The amide bonds of Ala at position 25, of Ser at position 28, and of Ser at position 29 are N-methylated. <220> <221> SITE <222> (1) <223> Position 1 is lysine or ornithine. <220> <221> SITE <222> (2)..(7) <223> Positions 2 and 7 are (Cys and Cys) or (Asp and Dap) or (Dap and Asp). <400> 17 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 18 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35

Claims (43)

  1. 천연 IAPP 수용체에 결합할 수 있는 아일렛 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP)의 펩티드 유사체에 있어서, a) 펩티드 유사체는 최대 38 아미노산을 함유하고, 이중 37 아미노산은 본래의 서열에 천연 IAPP의 아미노산 서열을 가지며, b) 펩티드 유사체는 본래의 서열에 천연 IAPP의 적어도 19 내지 37 아미노산을 포함하고, c) 펩티드 유사체의 적어도 하나의 아미드 결합은 N-메틸화되고, 그리고 임의로, d) 천연 IAPP의 아미노산 서열에서, 위치 1의 Lys(리신)은 Orn(오르니틴)으로 치환될 수 있고, 그리고/또는 위치 2 및 7의 Cys(시스테인)은 위치 2에서 Dap(디아미노프로피온산) 및 위치 7에서 Asp(아스파라긴산)으로, 또는 위치 2에서 Asp 및 위치 7에서 Dap로 치환될 수 있고, 그리고 e) 천연 인간 IAPP의 아미노산 서열을 갖는 서열번호 1 내지 5의 펩티드 유사체가 추출된 것을 특징으로 하는 IAPP의 펩티드 유사체.
  2. 천연 IAPP 수용체에 결합할 수 있는 진단용 또는 치료용 약제로서 아일렛 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP)의 펩티드 유사체에 있어서, a) 펩티드 유사체는 최대 38 아미노산을 함유하고, 이중 37 아미노산은 본래의 서열에 천연 IAPP의 아미노산 서열을 가지며, b) 펩티드 유사체는 본래의 서열에 천연 IAPP의 적어도 19 내지 37 아미노산을 포함하고, c) 펩티드 유사체의 적어도 하나의 아미드 결합은 N-메틸화되고, 그리고 임의로, d) 천연 IAPP의 아미노산 서열에서, 위치 1의 Lys(리신)은 Orn(오르니틴)으로 치환될 수 있고, 그리고/또는 위치 2 및 7의 Cys(시스테인)은 위치 2에서 Dap(디아미노프로피온산) 및 위치 7에서 Asp(아스파라긴산)으로, 또는 위치 2에서 Asp 및 위치 7에서 Dap로 치환될 수 있는 것을 특징으로 하는 IAPP의 펩티드 유사체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 펩티드 유사체는 천연 IAPP의 완전한 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드 유사체.
  4. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 펩티드 유사체는 천연 IAPP의 8 내지 37 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드 유사체.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 펩티드 유사체는 천연 수용체의 효능제로서 작용하는 것을 특징으로 하는 펩티드 유사체.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 펩티드 유사체는 천연 수용체의 길항제로서 작용하는 것을 특징으로 하는 펩티드 유사체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항의 어느 한 항에 있어서, IAPP의 1, 2, 3, 또는 4 아미드 결합이 N-메틸화된 것을 특징으로 하는 펩티드 유사체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항의 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 아미드 결합이 위치 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29의 아미노산에서 α-아미노 그룹의 아미드 결합을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드 유사체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항의 어느 한 항에 있어서, 펩티드 유사체는 서열번호 1 내지 17을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드 유사체.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항의 어느 한 항에 있어서, 펩티드 유사체는 가용성인 것을 특징으로 하는 펩티드 유사체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항의 어느 한 항에 있어서, 펩티드 유사체는, 특히 그의 N-말단 α-아미노 그룹에서, 특히 아세틸 그룹, 방사성 표지, 효소 표지, 형광 표지, 냉광 표지, 또는 스핀 표지로 표지되는 것을 특징으로 하는 펩티드 유사체.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항의 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 아실 그룹, 기능화된 아실 그룹, 방향족 그룹, 아미노산, 글리콜 그룹, 및 리피드 그룹을 포함하는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 기능성 그룹으로 유도되는 것을 특징으로 하는 펩티드 유사체.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 표지 및/또는 기능성 그룹은 스페이서, 특히 아미노산에 의해 결합된 것을 특징으로 하는 펩티드 유사체.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드 유사체는 기질 상에 부동화된(immobilized) 것을 특징으로 하는 펩티드 유사체.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항의 어느 한 항에 있어서, IAPP는 인간인 것을 특징으로 하는 펩티드 유사체.
  16. IAPP에 대하여 특이적으로, 또는 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체에 대하여 특이적으로 유도된 항체의 생산 방법에 있어서, 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 펩티드 유사체가 항원 형태로, 임의로 모노머 IAPP 또는 이의 올리고머와 함께, 항체를 형성할 수 있는 시스템과 접촉하고, 형성된 항체가 회수되는 방법.
  17. IAPP 또는 β-아밀로이드 펩티드와 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체의 혼합물에 대하여 특이적으로 유도된 항체의 생산 방법에 있어서, IAPP 또는 β-아밀로이드 펩티드 또는 이의 올리고머와, 각 경우 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체의 혼합물이 항원 형태로 항체를 형성할 수 있는 시스템과 접촉하고, 형성된 항체가 회수되는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체와 IAPP의 혼합물 에 대하여 특이적으로 유도되거나, 또는 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체와 β-아밀로이드 펩티드의 혼합물에 대하여 특이적으로 유도되고, 이에 특이적으로 결합하는, 제 17 항의 방법에 의해 생산될 수 있는 항체.
  19. 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체에 대하여 특이적으로 유도되거나, 또는 IAPP 또는 IAPP/펩티드 유사체 복합체에 대하여 특이적으로 유도되고, 이에 특이적으로 결합하는, 제 16 항의 방법에 의해 생산될 수 있는 항체.
  20. 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 펩티드 유사체 및/또는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 항체를 포함하는 약제학적 제제.
  21. 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 펩티드 유사체 및/또는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 항체, 및 인슐린 및/또는 IAPP 및/또는 프람린타이드를 포함하는 조합 약제.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.
  23. 제 20 항 내지 제 22 항의 어느 한 항에 있어서, 약제가 저장(depot) 약제로 제공되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.
  24. 제 20 항 내지 제 23 항의 어느 한 항에 있어서, 약제가 정제 형태로, 또는 에어졸이나 용액으로서 제공되는 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.
  25. 단백질 집합 질환, 특히 당뇨병의 예방 또는 치료용 약제학적 제제의 생산을 위한, 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체, 또는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 항체의 용도.
  26. 인슐린 및/또는 IAPP 및/또는 프람린타이드와 함께, 당뇨병의 예방 또는 치료용 조합 약제의 생산을 위한, 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체, 또는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 항체의 용도.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 펩티드 유사체는 IAPP 수용체-제어된 당뇨병의 치료를 위한 수용체 길항제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  28. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 펩티드 유사체는 IAPP 수용체-제어된 당뇨병의 치료를 위한 수용체 효능제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  29. 제 25 항 내지 제 28 항의 어느 한 항에 있어서, 펩티드 유사체는 IAPP 집합 및 IAPP 플라크 형성의 저해제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  30. 동시에 a) IAPP 집합 또는 IAPP로부터 아밀로이드 플라크의 형성의 감소 또는 저해, 및 b) 당 대사의 조절을 위한 약제학적 제제의 생산을 위한, 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체, 또는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 항체의 용도.
  31. 동시에 a) IAPP 또는 이의 집합체의 세포독성의 감소 또는 저해, 및 b) 당 대사의 조절을 위한 약제학적 제제의 생산을 위한, 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체, 또는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 항체의 용도.
  32. β-아밀로이드 펩티드 집합 또는 β-아밀로이드 펩티드로부터 아밀로이드 플라크의 형성을 감소 또는 저해하기 위한 약제학적 제제의 생산을 위한, 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체, 또는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 항체의 용도.
  33. β-아밀로이드 펩티드 또는 이의 집합체의 세포독성을 감소 또는 저해하기 위한 약제학적 제제의 생산을 위한, 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체, 또는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 항체의 용도.
  34. 알쯔하이머병 또는 다른 단백질 집합 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 제제의 생산을 위한, 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체, 또는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 항체의 용도.
  35. a) 알쯔하이머병 또는 다른 단백질 집합 질환 및 b) 당뇨병의 동시 예방 및 치료를 위한 약제학적 제제의 생산을 위한, 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체, 또는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 항체의 용도.
  36. 제 25 항 내지 제 35 항의 어느 한 항에 있어서, 약제학적 제제가 인슐린 및/또는 프람린타이드 및/또는 IAPP의 조합 약제의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 용도.
  37. 알쯔하이머병 또는 다른 단백질 집합 질환의 진단을 위한 진단용 약제의 생산을 위한, 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체, 또는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 항체의 용도.
  38. 단백질 집합 질환, 특히 당뇨병의 진단을 위한 진단용 약제의 생산을 위한, 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체, 또는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 항체의 용도.
  39. 진단용, 치료용, 및 연구용 목적으로 항체를 생산하기 위한, 보다 용이하게 관리 가능한 면역원으로서의 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체의 용도.
  40. IAPP, β-아밀로이드 펩티드, 프라이온 단백질, α-시뉴클레인 또는 폴리글루타민, 또는 이의 집합체의 정성적 및/또는 정량적 검출 방법에 있어서, 검출 표지와 함께 제공되는 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체, 또는 검출 표지와 함께 제공되는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 항체가, 프로브의 형태로, 검사되는 샘플과 접촉하고, 존재할 수 있는 펩티드 유사체 또는 IAPP, β-아밀로이드 펩티드, 프라이온 단백질, α-시뉴클레인 또는 폴리글루타민, 또는 이의 집합체에 대한 항체의 결합이 검출되는 방법.
  41. 액체 중에 포함된 IAPP, β-아밀로이드 펩티드, 프라이온 단백질, α-시뉴클레인 또는 폴리글루타민의 집합체 형성을 변형, 특히 방지하는 방법에 있어서, 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체가 액체와 접촉하고 배양되고, 집합 형성이 변형되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체 또는 제 18 항 또는 제 19 항에 따른 항체의 연구 목적을 위한 용도.
  43. 제 1 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 따른 펩티드 유사체와 IAPP 및/또는 β-아밀로이드 펩티드 및/또는 프람린타이드의 혼합물.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9814761B2 (en) 2012-04-03 2017-11-14 Trustees Of Boston University Compositions, methods and assays comprising amylin or amlyin analogs for abeta-peptide mediated disorders
AR097701A1 (es) * 2013-09-19 2016-04-13 Zealand Pharma As Análogos de amilina
AU2015228818B2 (en) * 2014-03-12 2021-02-11 Neurimmune Holding Ag Novel compounds capable of antagonizing islet amyloid polypeptide (IAPP) induced beta-cell damage and impaired glucose tolerance
CA2947587C (en) * 2014-05-02 2022-10-18 The Research Foundation For The State University Of New York Islet amyloid polypeptides with improved solubility
WO2016140063A1 (ja) * 2015-03-04 2016-09-09 栄研化学株式会社 オキシトシンの高感度測定法
BR112017019378A2 (pt) 2015-03-18 2019-02-19 Zealand Pharma A/S análogos de amilina
US10071140B2 (en) 2016-09-09 2018-09-11 Zealand Pharma A/S Amylin analogues
WO2018144671A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 The Research Foundation For The State University Of New York Mutant islet amyloid polypeptides with improved solubility and methods for using the same
CA3073060A1 (en) * 2017-08-18 2019-02-21 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Srcp1-based therapy for diseases associated with protein aggregation
WO2023232781A1 (en) 2022-05-30 2023-12-07 Zealand Pharma A/S Liquid formulations of amylin analogues
WO2024061919A1 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Zealand Pharma A/S Combination therapy

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE454299B (sv) * 1986-10-08 1988-04-18 Westermark P Sats innehallande polypeptid som finns i pankreasoamyloid och/eller antikroppar riktade mot polypeptiden
US5280014A (en) * 1988-01-11 1994-01-18 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of obesity and essential hypertension and related disorders
US5264372A (en) * 1991-03-15 1993-11-23 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Receptor-based screening methods for amylin agonists and antagonists
HU222249B1 (hu) * 1991-03-08 2003-05-28 Amylin Pharmaceuticals Inc. Eljárás amilin agonista peptidszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
US5580953A (en) * 1991-08-14 1996-12-03 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Amylin antagonist peptides and uses therefor
US5625032A (en) * 1993-07-21 1997-04-29 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Selective amylin antagonist peptides and uses therefor
US6034211A (en) * 1996-06-03 2000-03-07 Kelly; Jeffery W. β-sheet nucleating peptidomimetics
DE19725619A1 (de) * 1997-06-17 1998-12-24 Fraunhofer Ges Forschung Peptide als Agonisten und/oder Inhibitoren der Amyloidbildung und Zytotoxizität sowie der Verwendung bei Alzheimer'schen Krankheit, beim Typ II Diabetes mellitus und bei spongiformen Encephalopathien
EP1325028A2 (en) * 2000-09-19 2003-07-09 University Of Toronto New inhibitors of iapp fibril formation and uses thereof

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