WO2016140063A1 - オキシトシンの高感度測定法 - Google Patents

オキシトシンの高感度測定法 Download PDF

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WO2016140063A1
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oxt
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oxytocin
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秀俊 荒川
博 大熊
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栄研化学株式会社
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    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors

Definitions

  • the present invention relates to a labeled oxytocin (hereinafter abbreviated as OXT) / vasopressin (hereinafter abbreviated as VP) family peptide; a method for detecting OXT / VP in a sample using the labeled peptide; It relates to the kit used. If the labeled OXT / VP family peptide of the present invention is used, it is possible to specifically measure the OXT / VP family peptide in the sample, and it is extremely effective in the field of diagnosis and clinical examination such as autism. .
  • OXT labeled oxytocin
  • VP vasopressin
  • OXT and VP are peptidic pituitary hormones.
  • OXT was identified as a uterine contractile activity factor and VP as a blood pressure increasing factor. Both consist of 9 amino acid residues. Its structure is very similar and evolutionarily well preserved, not only for vertebrates, but also for new mouth invertebrates (sea urchins and slugs) and old mouth animals (octopus and daphnia), similar to OXT / VP.
  • Peptide hormones are present.
  • OXT The primary structure of OXT is Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-CONH 2 (SEQ ID NO: 1) (the carbonyl group of the terminal Gly is amidated), Cyt 1 and Cyt 6 is bonded by an SS bond (disulfide bond) and has the following secondary structure.
  • SS bond disulfide bond
  • the primary structure of VP is Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-CONH 2 (SEQ ID NO: 2) (the carbonyl group at the terminal Gly is amidated), which is the same as OXT , Cyt 1 and Cyt 6 are linked by an SS bond (disulfide bond).
  • the S—S bond (disulfide bond) between Cyt 1 and Cyt 6 is conserved across species, and is also conserved in the above-mentioned new-mouth invertebrates and old-mouthed OX / VP-like peptide hormones.
  • OXT / VP family peptides have extremely important meanings in vivo, and have been suggested to be associated with various pathological conditions. VP functions to prevent diuresis in addition to the blood pressure increasing effect. OXT is mainly involved in smooth muscle contraction in peripheral tissues and causes uterine contraction during labor. In addition, the muscle fibers of the mammary glands are contracted to promote milk secretion. For this reason, it is used in various medical settings, including uterine contractors and labor promoters. It is secreted from neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN) and supraoptic nucleus (SON), and acts on various brain regions including the pituitary posterior lobe to regulate its function. OXT is secreted when good interpersonal relationships are built, reducing cravings, hunger, and fear.
  • PVN hypothalamic paraventricular nucleus
  • SON supraoptic nucleus
  • Oxytocin infusion reduces repetitive behaviors in adults with autistic and Asperger ’s disorders.
  • Angela Szeto Philip M.McCabe, Daniel A.Nation, Benjamin A.Tabak, Maria Psychosom Med., Vol.75, No.5, p393-400, Jun 2011
  • the present invention provides a labeled OXT / VP family peptide; a method for detecting an OXT / VP family peptide in a sample using the labeled peptide; a novel analog of an OXT / VP family peptide using the labeled peptide
  • the object is to provide a kit for use in searching for molecules (agonists and antagonists);
  • the configuration of the present invention is as follows [1] to [14].
  • Biotin is bound to the N-terminus of the modified peptide, the enzyme is bound to avidin or streptavidin, and the enzyme is bound to the modified peptide via a biotin- (strept) avidin bond.
  • the kit according to [10] wherein the anti-OXT antibody or anti-VP antibody is immobilized on a solid support.
  • an immunogen with a better immune response than before can be produced by applying the label of the present invention.
  • the OXT / VP family peptide in the sample can be detected with high sensitivity and specificity by the immunoassay using the label of the present invention.
  • the specimen sample to be collected include collected and isolated blood (whole blood), serum, plasma, saliva, urine, spinal fluid, culture supernatant, milk, and the like. The present invention is described in detail below.
  • Label means a label portion of a label according to the present invention, which may itself be a substance that fluoresces, emits light, or develops color, but reacts with a substrate to produce fluorescence, luminescence, or color. It may be an enzyme. Further, the “label” may be a molecule that can specifically bind to “a substance that emits fluorescence, luminescence, or color” or “an enzyme that reacts with a substrate to generate fluorescence, luminescence, or color”. For example, luciferase may be used as the “enzyme”. When the “enzyme” is firefly luciferase, the substrate may be firefly luciferin and the like.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the “substrate” may be o-phenylenediamine (coloring); tetramethylbenzidine (TMBZ) (coloring); luminol (chemiluminescence) and the like.
  • the “enzyme” alkaline phosphatase (ALP) may be used.
  • the “substrate” is p-nitrophenyl phosphate (color development) or AMPPD (registered trademark) (3- (2′-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3 ”-phosphoryloxy) phenyl-1, 2-dioxetane disodium salt) (chemiluminescence) can be selected.
  • the “enzyme that reacts with the substrate to produce fluorescence, luminescence, or color development” is an enzyme in which streptavidin is bound
  • the “label” may be biotin.
  • the “arbitrary amino acid” means alanine (Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys), glutamine, which are “ ⁇ -amino acids” that are constituent units of biological proteins.
  • (Gln) glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), proline (Pro), serine (Ser), threonine (Thr), tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr), or valine (Val).
  • Aliphatic amino acids include branched chain amino acids (valine; isoleucine; leucine); methionine; alanine; proline and glycine.
  • Aromatic amino acids include phenylalanine, tyrosine, tryptophan, and histidine.
  • Basic amino acids include lysine, arginine, histidine, tryptophan.
  • Others include ornithine.
  • Acidic amino acids include aspartic acid, glutamic acid, cysteine and tyrosine.
  • Highly hydrophilic amino acids include arginine, aspartic acid, glutamic acid, lysine and the like.
  • the “label” and the “amino acid” are bonded via the amino group of the “amino acid”.
  • a terminal amino (NH 2 ) group of an amino acid (RCH (NH 2 ) COOH) is more preferable.
  • the bond between “amino acid” and “OXT / VP family peptide” is linked by a normal peptide bond.
  • “Lys” and “OXT” are represented by SEQ ID NOs: 3 to 7
  • “Lys” and “VP” are represented by SEQ ID NOs: 8 to 12.
  • the labeled product according to the present invention can be produced not only by chemical synthesis but also when the “label” is an enzyme, a molecular biological technique (“enzyme”-“amino acid” n- “base sequence encoding“ OXT / VP family peptide ”) Is incorporated into a suitable expression vector and synthesized in a host).
  • Immunoassay means a biochemical test assay that uses the reaction between an antigen and an antibody to measure the level of a substance contained in a biological sample. Depending on the substance used for labeling, it is roughly classified into radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA), and fluorescent immunoassay (FIA).
  • RIA radioimmunoassay
  • EIA enzyme immunoassay
  • FIA fluorescent immunoassay
  • the EIA (Enzyme Immunoassay) method includes the following “ELISA method” and “Bioluminescent Immunoassay (BLEIA)”, and also includes a chemiluminescent enzyme immunoassay method (CLEIA).
  • BLEIA registered trademark
  • ELISA method Enzyme-Linked Immunosorbent-assay
  • An object is detected and measured by using color development based on an enzyme reaction as a signal.
  • the “competitive ELISA method” means an ELISA method that measures at what ratio “labeled antigen” and “antigen present in a sample” bind to an antibody under competitive conditions. Using the labeled product according to the present invention as “labeled antigen”, “OXT / VP in the specimen” is measured as “antigen present in the sample”.
  • the “bioluminescent enzyme immunoassay” is a bioluminescent enzyme immunoassay based on the firefly luciferin-luciferase reaction.
  • An antibody (or antigen) is immobilized on magnetic fine particles, and luciferase-labeled antigen (or antibody) is used for labeling.
  • the enzyme activity of the luciferase complex is detected by bioluminescence using luciferin, and the substance in the sample is measured or detected.
  • Solid support means an immobilized anti-OXT antibody or anti-VP antibody during immunoassay. Although not limited to this, it means glass, nylon membrane, semiconductor wafer, microbead, magnetic bead, magnetic fine particle, plastic plate and the like.
  • immobilization method a known technique may be used to directly immobilize an anti-OXT antibody or an anti-VP antibody on the surface of glass or the like physically or via a chemical bond, or via a bond such as biotin-avidin. Alternatively, it may be immobilized indirectly via a linker molecule.
  • the linker molecule may be a secondary antibody that recognizes and binds to an anti-OXT antibody or an anti-VP antibody.
  • the secondary antibody may be an anti-rabbit IgG goat antibody, and the anti-rabbit IgG goat antibody is magnetically coupled via a chemical bond between the NH 2 group of the antibody and the Tosyl group of the magnetic microparticle.
  • the anti-OXT rabbit antibody may be immobilized on the magnetic microparticles through binding to the microparticles and via the anti-rabbit IgG goat antibody.
  • Anti-OXT / VP family peptide antibody means an antibody that specifically binds to any of the members constituting the OXT / VP family peptide, and is an active fragment of an antibody (or fragment antibody: Fab, F (ab ′) 2 Etc.).
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • kits for immunoassay of an OXT / VP family peptide comprising: (1) a label according to the present invention; (2) a solid support; and (3) “ This can be done using a kit containing “anti-OXT / VP family peptide antibody”.
  • the solid support and the antibody solution are prepared separately, and the OXT / VP family peptide is prepared.
  • the antibody may be adsorbed on a solid support, or may be provided in a state where the antibody is adsorbed on the solid support in advance.
  • the kit of the present invention may contain a sample diluent as necessary.
  • a sample dilution solution for example, a buffer solution such as Tris can be used.
  • a chelating agent such as EDTA ⁇ 2Na and an inorganic salt such as sodium chloride may be added to the buffer solution.
  • concentration for preparation of a calibration curve was decided may be included.
  • OXT / VP family peptides can also be measured by a competitive ELISA method using the label of the present invention.
  • Specific examples are as follows. First, an anti-OXT antibody is adsorbed on a solid support, for example, a plate, reacted with a specimen (for example, OXT in serum), and / or simultaneously with a labeled label. Thereafter, the solid support is washed, and then the adsorbed label is detected using “label” as an index.
  • the label is labeled with biotin
  • OXT in the sample is detected and measured by reacting peroxidase or luciferase labeled with streptavidin, performing an enzyme reaction, and detecting color development or luminescence.
  • constituent reagents of known kits can be used. Such kits can be purchased from ENZO (Assay designs), abcam, Alpco, MyBioSource, Arbor Assays, and others.
  • OXT / VP family peptides can also be measured by a bioluminescent enzyme immunoassay (BLEIA method) using the label of the present invention.
  • BLEIA method bioluminescent enzyme immunoassay
  • Specific examples are as follows. First, an anti-OXT antibody is immobilized on magnetic fine particles, reacted with a specimen (for example, OXT in serum), and / or simultaneously with a labeled substance labeled. Thereafter, the magnetic fine particles are washed, and then the adsorbed label is detected using “label” as an index.
  • firefly luciferase bound to (strept) avidin is bound to the label labeled with biotin to detect bioluminescence generated by the substrate containing firefly luciferin / ATP / Mg ions, etc. By doing so, OXT in the specimen is detected and measured.
  • the labeling body of the present invention can be applied to make an immunogen for antibody production. It is possible to produce an immunogen with a better immune response than before by combining OXT or VP with a carrier protein such as bovine serum albumin or mussel hemocyanin instead of the enzyme. If antibodies are produced by immunizing animals using this immunogen, polyclonal antibodies against OXT and VP can be obtained from serum. In addition, a hybridoma producing a monoclonal antibody can be obtained by immunizing a mouse or rat and fusing antibody-producing cells.
  • the hybridoma can be obtained by the following method.
  • the immunogen is mixed together using already known ones such as Freund's complete, incomplete adjuvant, aluminum hydroxide adjuvant, pertussis adjuvant, etc., and an adjuvant solution for immunization is prepared and divided into several times for mice, rats, etc. Animals are immunized by intraperitoneal subcutaneous or tail vein administration every 1-3 weeks.
  • the amount of antigen is between 1 ⁇ g and 100 mg, but generally about 50 ⁇ g is preferable.
  • the number of immunizations is generally 2-7, but various methods are known.
  • antibody-producing cells derived from the spleen and the like are fused with cells having proliferation ability in a test tube such as bone marrow tumor cells (myeloma cells).
  • Antibody-producing cells can be obtained from mice, nude mice, spleens of rats and the like.
  • fusion can be carried out by using polyethylene glycol (PEG) according to the conventional method of Kohler and Milstein (Nature. 256, 495.1975) which is already known per se. Fusion can also be achieved by Sendai virus or electrofusion.
  • the method for selecting a hybridoma that produces an antibody that recognizes the OXT / VP family peptide that is an immunogen from the fused cells can be performed as follows. That is, hybridomas are selected from colonies produced by cells surviving in the HAT medium and HT medium from the fused cells by the limiting dilution method. When an antibody against OXT / VP family peptide is contained in a colony culture supernatant made of a fused cell spread in a 96-well microtiter plate, the OXT / VP or the label of the present invention is placed on the plate.
  • a monoclonal antibody-producing clone against an OXT / VP family peptide can be selected by an ELISA method in which the supernatant is placed on an assay plate immobilized on, and a secondary labeled antibody such as an anti-mouse immunoglobulin-HRP labeled antibody is reacted after the reaction.
  • a secondary labeled antibody such as an anti-mouse immunoglobulin-HRP labeled antibody is reacted after the reaction.
  • enzymes such as alkaline phosphatase, fluorescent substances, radioactive substances and the like can be used as the labeling substance for the labeled antibody.
  • an OXT / VP family peptide-specific antibody can be screened by simultaneously performing ELISA using an assay plate to which only BSA as a blocking agent is bound. In other words, clones that are positive in the OXT / VP family peptide plate and negative in BSA ELISA can be selected.
  • Example 1 Measurement of OXT by BLEIA method (1) 1 ⁇ 10 ⁇ 9 M Streptavidin (Roche) and 1 ⁇ 10 ⁇ 10 M Biotinyl-luciferase (Kikkoman Biochemifa) are mixed at a ratio of 1: 1 and allowed to react at room temperature for 30 minutes. , Streptavidin-Biotinyl-luciferase complex is prepared (100 mmol / L phosphate buffer (PB), 1 mmol / L EDTA ⁇ 2Na, 2 mmol / L 2-Mercaptoethanol, 0.1% BSA, pH 7.4).
  • PB phosphate buffer
  • mmol / L EDTA 1 mmol / L EDTA ⁇ 2Na
  • 2 mmol / L 2-Mercaptoethanol 0.1% BSA, pH 7.4
  • Oxtocin acetate salt hydrate (SIGMA) was added to 20 ⁇ L of the 2nd antibody-immobilized magnetic particles prepared in (1) above using Assay buffer (100 mmol / L phosphate buffer (PB), 2 mmol / L EDTA ⁇ 2Na, 0.2 100 ⁇ L (1-100,000 pg / ml (0.1-10,000 pg / assay)) diluted with% BSA, 0.05% NaN 3 , pH 7.4) and anti-Oxytocin Rabbit IgG antibody (Affinity Purify) Biological laboratory commissioned production) 50 ⁇ L (1: 1000-1: 3000 dilution)) is added and allowed to react overnight at 4 ° C.
  • Assay buffer 100 mmol / L phosphate buffer (PB), 2 mmol / L EDTA ⁇ 2Na, 0.2 100 ⁇ L (1-100,000 pg / ml (0.1-10,000 pg / assay)) diluted with% BSA,
  • a calibration curve of OXT was prepared using Biotin-OXT (Lys0) and Biotin- (Lys) 5 -OXT (Lys5) by bioluminescence enzyme immunoassay (FIG. 2).
  • IC 50 values calculated from the calibration curve were 5,490 pg / ml (Lys0) and 1,000 pg / ml (Lys5).
  • Lys5 decreasing the amount of antibody used increased the detection sensitivity and decreased the IC 50 value (800 pg / ml).
  • the labeled body and the immunoassay method of the present invention make it possible to specifically and precisely measure the target substance to be measured.

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Abstract

【課題】新規の標識されたオキシトシン(Oxytocin)／バソプレシン(Vasopressin)ファミリーペプチド及びその標識されたペプチドを用いた免疫測定方法を提供することを目的とする。 【解決手段】本発明は、標識されたオキシトシン／バソプレシンファミリーペプチド；該標識ペプチドを用いた試料内オキシトシン／バソプレシンファミリーペプチドを検出する方法；並びにこれらに用いるキットに関する。　本発明の標識されたオキシトシン／バソプレシンファミリーペプチドを用いれば、試料内オキシトシン／バソプレシンファミリーペプチドを特異的に測定することが可能であり、自閉症などの診断や臨床検査の分野において極めて有効である。

Description

オキシトシンの高感度測定法
　本発明は、標識されたオキシトシン（Oxytocin：以下、ＯＸＴと略）/バソプレシン（Vasopressin：以下、ＶＰと略）ファミリーペプチド；該標識ペプチドを用いた試料内ＯＸＴ/ＶＰを検出する方法；並びにこれらに用いるキットに関する。
　本発明の標識されたＯＸＴ/ＶＰファミリーペプチドを用いれば、試料内ＯＸＴ/ＶＰファミリーペプチドを特異的に測定することが可能であり、自閉症などの診断や臨床検査の分野において極めて有効である。
　ＯＸＴとＶＰはペプチド性の下垂体後葉ホルモンである。ＯＸＴは子宮収縮活性因子として、ＶＰは血圧上昇因子として同定された。
　共に９アミノ酸残基よりなる。その構造は極めて似ており、進化的にも極めてよく保存され、脊椎動物だけでなく、新口無脊椎動物（ウニやナメクジウオ）や旧口動物（タコやミジンコ）にも、ＯＸＴ／ＶＰ類似のペプチドホルモンが存在する。
ＯＸＴの一次構造はCys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-CONH2（配列番号：１）であり（末端Glyのカルボニル基はアミド化している）、Cyt1とCyt６がＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合）により結合し、以下の２次構造を有している。かかる構造はホルモンとして機能する上で必須である (非特許文献１及び２)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　一方、ＶＰの一次構造はCys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-CONH2（配列番号：２）であり（末端Glyのカルボニル基はアミド化している）、ＯＸＴ同様、Cyt1とCyt６がＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合）により結合している。このCyt1とCyt６とのＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合）は種を超えて保存され、上記新口無脊椎動物や旧口動物のＯＸＴ／ＶＰ類似のペプチドホルモンにも保存されている。
　ＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチドは生体内で極めて重要な意味を持ち、とりわけ様々な病態との関連性が示唆されている。
　ＶＰは、血圧上昇作用以外に利尿を妨げる働きをする。
　ＯＸＴは、末梢組織では主に平滑筋の収縮に関与し、分娩時に子宮収縮させる。また乳腺の筋線維を収縮させて乳汁分泌を促すなどの働きを持つ。このため臨床では子宮収縮薬や陣痛促進剤をはじめとして、さまざまな医学的場面で使用されている。また、視床下部の室傍核 (PVN) や視索上核 (SON) にあるニューロンから分泌され、下垂体後葉をはじめ様々な脳の部位に作用し機能を調節している。ＯＸＴは良好な対人関係が築かれているときに分泌され、闘争欲や遁走欲、恐怖心を減少させる。
　さらに最近、自閉症スペクトラム (Autistic spectrum disorder : ASD) とＯＸＴとの関連性を示唆する報告がなされ(特許文献１及び非特許文献３～６)、今まで以上に高感度の定量アッセイ系の開発が必要となっている。検出方法としてはその簡便さから、競合イムノアッセイ法（competitive immunoassay method）がよく用いられているものの、放射性同位体元素を用いたＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）以外において、その分子量の小ささ及びその２次構造の安定性を考慮し、非特異的な標識方法で標識された標識体を用いることが多かった（特許文献２及び非特許文献７）。
特許第4905901号公報 特開昭59-211861号公報
臨床検査47巻8号p861-870 Conformation of oxytocin studied by laser raman spectroscopy. Anthony T.Tu, Jon B.Bjamason & Victor J.Hruby, Biochim Biophys Acta Vol.533, No.2, p530-533 1978 Oxytocin increases trust in humans.Michael Kosfeld, Markus Heinrichs, Paul J.Zak, Urs Fischbacher & Ernst Fehr, Nature 435,673-676, 2 June 2005 Neuropsychopharmacology 2003.1.28 Plasma oxytocin levels in autistic children.Charlotte Modahl, Lee Anne Green, Deborah Fein, Mariana Morris, Lynn Waterhouse, Carl Feinstein & Harriet Levin, Biol Psychiatry, Vol.43, No.4, p270-277, 15 Feb 1998 Oxytocin infusion reduces repetitive behaviors in adults with autistic and Asperger’s disorders. Eric Hollander, Sherie Novotny, Margaret Hanratty, Rona Yaffe, Concetta M DeCaria, Bonnie R Aronowitz & Serge Mosovich, Neuropsychopharmacology, 28,p193-198, 2003 Evaluation of enzyme immunoassay and radioimmunoassay methods for the measurement of plasma oxytocin. Angela Szeto, Philip M.McCabe, Daniel A.Nation, Benjamin A.Tabak, Maria A.Rossetti, Michael E.McCullough, Neil Schneiderman & Armando J.Mendez, Psychosom Med.,Vol.75,No.5,p393-400,Jun 2011
　かかる問題に鑑み、本発明は、標識されたＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチド；該標識ペプチドを用いた試料内ＯＸＴ/ＶＰファミリーペプチドを検出する方法；該標識ペプチドを用いたＯＸＴ/ＶＰファミリーペプチドの新規アナログ分子（アゴニスト・アンタゴニスト）探索；並びにこれらに用いるキットを提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため、本願発明者らは、試行錯誤の末、あえてＯＸＴ／ＶＰの１次構造だけでなく、その高次構造を壊す可能性を度外視し、ＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチドのＮ端のCysのさらに５‘端にアミノ酸であるLysをリンカーとして結合させた。その結果、驚くべきことに、そのLysの先に標識を結合させても、上記［化１］で示される天然の高次構造（Ｓ－Ｓ結合を含む）を維持でき、かつその標識体を競合イムノアッセイ法（competitive immunoassay method）に用いた場合、極めて検出感度の高い測定系となることを新たに発見し、本願発明を完成するにいたりました。
　即ち、本発明の構成は以下の［１］から［１４］の通りである。
［１］　（Ｘａａ）n－（配列番号１又は２）
で表されるＯＸＴ又はＶＰのＮ末端にアミノ酸残基が結合した修飾ペプチドのＮ末端に標識が結合した標識体
［ここで、Ｘａａは任意のアミノ酸を示し、ｎは１，２，３，４又は５の整数を表し、修飾ペプチドのＣ末端はアミド化されている］。
［２］　ＸａａがＬｙｓであることを特徴とする［１］に記載の標識体。
［３］　修飾ペプチドが配列番号３、４、５，６、７、８、９、１０、１１又は１２で表される［１］又は［２］に記載の標識体。
［４］　標識がビオチンである［１］から［３］のいずれかに記載の標識体。
［５］　標識が酵素である［１］から［３］のいずれかに記載の標識体。
［６］　前記修飾ペプチドのＮ末端にビオチンが結合しており、前記酵素がアビジン又はストレプトアビジンと結合しており、ビオチン－（ストレプト）アビジン結合を介して、酵素が修飾ペプチドに結合している、［５］に記載の標識体。
［７］　前記酵素が、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、イクオリン、またはルシフェラーゼである［５］又は［６］のいずれかに記載の標識体。
［８］　［１］から［７］のいずれかに記載の標識体を用いて、免疫測定法により検体中のＯＸＴまたはＶＰを検出する方法。
［９］　［８］に記載の検出方法に用いるためのキットであって、［１］から［７］のいずれかに記載の標識体を構成成分として含む検体中のＯＸＴまたはＶＰの測定キット。
［１０］　［８］に記載の検出方法に用いるためのキットであって、
　　（１）［１］から［７］のいずれかに記載の標識体；
　　（２）抗ＯＸＴ抗体、または抗ＶＰ抗体
を構成成分として含むキット。
［１１］　抗ＯＸＴ抗体、または抗ＶＰ抗体が固相支持体に固相化されている、［１０］に記載のキット。
［１２］免疫測定法が競合ＥＬＩＳＡ法である、［８］に記載の方法；
［１３］免疫測定法が生物発光酵素免疫測定法である、［８］に記載の方法。
［１４］［１２］に記載の検出方法に用いるためのキットであって、
　　（１）［１］から［７］のいずれかに記載の標識体；
　　（２）固相支持体；および
　　（３）抗ＯＸＴ/抗ＶＰ抗体を構成成分として含むキット；
［１５］［１３］に記載の検出方法に用いるためのキットであって、
　　（１）［４］に記載の標識体；
　　（２）ストレプトアビジンに結合したルシフェラーゼ；
　　（３）ルシフェリン；
　　（４）ＡＴＰ；及び
　　（５）Ｍｇ塩；
を構成成分として含むキット。
　本発明によって、生体試料中のＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチドを効率よく検出定量することが可能であり、様々な疾患の診断の一助とすることが出来る。
　また別態様として、本発明の標識体を応用して従来よりも免疫応答が良好な免疫原を作製することができる。
Biotin-OXT と Biotin-Lys(n)-OXT conjugateの比較B0値 Biotin-OXT と Biotin-Lys(5)-OXT conjugateの比較検量線（ＥＬＩＳＡ法とＢＬＥＩＡ法）
　本発明の標識体を用いた免疫測定法によって検体中のＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチドを高感度で且つ特異的に検出することができる。対象となる検体試料としては、採取、単離された血液（全血）、血清、血漿、唾液、尿、髄液、培養上清、ミルク等が挙げられる。
　以下に本発明について詳細に説明する。
　「標識」とは、本願発明に係る標識体の標識部分を意味し、それ自体が蛍光、発光、あるいは発色する物質であってもよいが、基質と反応して蛍光、発光、あるいは発色を生じる酵素であってもよい。
　さらに、「標識」は、「蛍光、発光、あるいは発色する物質」又は「基質と反応して蛍光、発光、あるいは発色を生じる酵素」と特異的に結合できる分子であってもよい。
　たとえば該「酵素」としては、ルシフェラーゼを用いてよい。「酵素」がホタルルシフェラーゼの場合、基質はホタル・ルシフェリンなどであってよい。「酵素」はウミホタルルシフェラーゼ（基質（Luciferin）＝イミダゾピラジノン誘導体）、夜光虫ルシフェラーゼ（基質＝夜光虫Luciferin）、オワンクラゲイクオリン（基質＝セレンテラジン）、ウミシイタケルシフェラーゼ（基質＝セレンテラジン）、バクテリアルシフェラーゼ（基質＝フラビンモノヌクレオチド）などであってもよい。
　該「酵素」としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を用いてよい。この場合「基質」は、o-フェニレンジアミン（発色）；テトラメチルベンチジン（TMBZ）（発色）；ルミノール（化学発光）などであってよい。
　該「酵素」としては、アルカリホスファターゼ（ALP）を用いてもよい。この場合、その「基質」は、p-ニトロフェニルホスファート(発色)やＡＭＰＰＤ（登録商標）（3-(2'-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3"-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane disodium salt）(化学発光)などが選択できる。
　「基質と反応して蛍光、発光、あるいは発色を生じる酵素」がストレプトアビジンと結合した酵素の場合、「標識」はビオチンであってもよい。
　「任意のアミノ酸」とは、生体のタンパク質の構成ユニットとなる「α-アミノ酸」であるアラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、又はバリン（Ｖａｌ）を含む。
　脂肪族アミノ酸には、分枝鎖アミノ酸 (バリン；イソロイシン；ロイシン)；メチオニン；アラニン；プロリン及びグリシンが含まれる。
　芳香族アミノ酸にはフェニルアラニン 、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンが含まれる。
　塩基性アミノ酸にはリジン，アルギニン，ヒスチジン，トリプトファンが含まれる。その他では，オルニチンなどもこれにあたる。
　酸性アミノ酸にはアスパラギン酸、グルタミン酸、システイン 、チロシンが含まれる。
　親水性の高いアミノ酸には、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンなどが含まれる。
「標識」と「アミノ酸」は「アミノ酸」のアミノ基を介して結合している。より好ましくはアミノ酸（RCH(NH2)COOH）の末端アミノ（ＮＨ２）基である。「アミノ酸」と「ＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチド」の結合は通常のペプチド結合で結合されている。たとえば、「Ｌｙｓ」と「ＯＸＴ」であれば、配列番号３～７で表され、「Ｌｙｓ」と「ＶＰ」であれば、配列番号８～１２で表される。
　本発明に係る標識体は化学合成で作製できるだけでなく、「標識」が酵素の場合、分子生物学的手法（「酵素」－「アミノ酸」ｎ－「ＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチド」をコードする塩基配列を適当な発現ベクターに組み込み、宿主の中で合成させる態様を含む）で合成されてもよい。
　「免疫測定法」とは抗原と抗体の反応を利用して、生物学的試料の中に含まれる物質のレベルを測定する生化学的試験測定法を意味する。標識に用いる物質によって、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）に大別される。ＥＩＡ（Enzyme Immunoassay）法には以下の「ＥＬＩＳＡ法」や「生物発光酵素免疫測定法（Bioluminescent Enzyme Immunoassay：ＢＬＥＩＡ）」が含まれ、さらに化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）も含まれる。なお、ＢＬＥＩＡ（登録商標）は栄研化学株式会社の登録商標である。
　「ＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked Immunosorbent-assay）」は、試料中に含まれる物質の濃度を酵素反応を用いて検出定量する方法を指す。酵素反応に基づく発色をシグナルに用いることで対象を検出測定する。
　「競合ＥＬＩＳＡ法」とは「標識した抗原」と「試料中の存在する抗原」が、競合条件下でどの割合で抗体に結合するかを測定するＥＬＩＳＡ法を意味する。本発明に係る標識体を「標識した抗原」として用いて、「検体中のＯＸＴ／ＶＰ」を「試料中の存在する抗原」として測定する。
「生物発光酵素免疫測定法」とは、ホタルのルシフェリン・ルシフェラーゼ反応に基づく生物発光酵素免疫測定法である。磁性微粒子に抗体（または抗原）を固定化し、標識にルシフェラーゼ標識抗原（または抗体）を用いる。ルシフェラーゼ複合体の酵素活性をルシフェリンを用いた生物発光で検出し、検体中の物質を測定あるいは検出する方法である。
「固相支持体」とは免疫測定中、抗ＯＸＴ抗体や抗ＶＰ抗体を固定（immobilized）させるものを意味する。これに限定されないが、ガラス、ナイロンメンブレン、半導体ウェハー、マイクロビーズ、磁気ビーズ、磁性微粒子、プラスチックプレートなどを意味する。固定の方法は公知の技術を用いて、直接抗ＯＸＴ抗体や抗ＶＰ抗体をガラス等の表面に物理的に又は化学結合を介して固定してもよいし、ビオチン－アビジンなどの結合を介して、あるいはリンカー分子を介して間接的に固定させてもよい。リンカー分子としては抗ＯＸＴ抗体や抗ＶＰ抗体を認識結合する２次抗体であってもよい。
　具体的には抗ＯＸＴウサギ抗体の場合、２次抗体は抗ウサギＩｇＧヤギ抗体であってよく、抗ウサギＩｇＧヤギ抗体は抗体のNH2基と磁性微粒子のTosyl基の化学結合を介して、磁性微粒子に結合し、その抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を介して、抗ＯＸＴウサギ抗体は磁性微粒子に固定されていてよい。
　「抗ＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチド抗体」とはＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチドを構成するメンバーのいずれかと特異的に結合する抗体を意味し、抗体の活性断片（あるいは断片抗体：Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２など）でもよい。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体であってもよい。
　本発明の測定方法を実施するときは、ＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチドを免疫測定するためのキットであって、（１）本発明に係る標識体；（２）固相支持体；および（３）「抗ＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチド抗体」を含むキットを用いて行える。
　このキットにおいては、（２）固相支持体；および（３）「抗ＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチド抗体」に関しては、固相支持体と抗体溶液とを別々に作製しておき、ＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチドを測定する際、抗体を固相支持体に吸着させてもよく、あらかじめ、抗体を固相支持体に吸着させた状態で提供してもよい。
　本発明のキットには、必要に応じ、検体希釈液を加えて含むこともできる。検体希釈液としては、例えば、トリス等の緩衝液を使用できる。その緩衝液には、必要に応じて、EDTA・2Na等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。
　また、検量線作成のための濃度の決められたＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチドを含んでいてもよい。
　本発明においては、本発明の標識体を用いた競合ＥＬＩＳＡ法により、ＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチドを測定することもできる。
　具体例は以下の通りである。まず抗ＯＸＴ抗体を固相支持体、例えば、プレートに吸着させ、検体（例えば、血清中のＯＸＴ）と反応させ、次いで／あるいは同時に標識された標識体を反応させる。その後、固相支持体を洗浄し、次いで、吸着した標識体を「標識」を指標に検出する。標識体がビオチンで標識されている場合には、ストレプトアビジンで標識されたペルオキシダーゼやルシフェラーゼを反応させ、酵素反応を行い、発色や発光を検出することにより、検体内のＯＸＴを検出測定する。
　この場合、本発明に係るキット以外にも、公知のキットの構成試薬を流用することも出来る。このようなキットとして、ENZO(Assay designs)社、abcam社、Alpco社、MyBioSource社、Arbor Assays社などから購入できる。
　本発明においては、本発明の標識体を用いた生物発光酵素免疫測定法（ＢＬＥＩＡ法）により、ＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチドを測定することもできる。
　具体例は以下の通りである。まず抗ＯＸＴ抗体を磁性微粒子に固定し、検体（例えば、血清中のＯＸＴ）と反応させ、次いで／あるいは同時に標識された標識体を反応させる。その後、磁性微粒子を洗浄し、次いで、吸着した標識体を「標識」を指標に検出する。標識体がビオチンで標識されている場合、（ストレプト）アビジンに結合したホタルルシフェラーゼをビオチンで標識された標識体と結合させ、ホタルのルシフェリン/ATP/Mgイオンなどを含む基質により生じる生物発光を検出することにより、検体中のＯＸＴを検出測定する。
　本発明の標識体を応用して、抗体作製用の免疫原とすることもできる。酵素の代わりに牛血清アルブミンやスカシ貝ヘモシアニン等のキャリヤ蛋白質とＯＸＴやＶＰを結合させて、従来よりも免疫応答が良好な免疫原を作製することが可能である。この免疫原を用いて動物を免疫して抗体を産生すれば、血清からＯＸＴやＶＰに対するポリクローナル抗体を得ることができる。また、マウスやラット等を免疫し、抗体産生細胞を細胞融合させることにより、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
　上記ハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。免疫原を、フロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等の既に公知のものを用いて共に混和し、免疫用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に1～3週間おきに腹腔内皮下、または尾静脈投与することによって免疫する。抗原量は1μg～100mgの間とされているが、一般的には50μg程度が好ましい。免疫回数は2～7回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖能力を有する細胞とを融合する。抗体産生細胞はマウス、ヌードマウス、ラットなどの脾臓等より得ることができる。
　上記融合法としては、既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法（Nature.256,495.1975）によってポリエチレングリコール（PEG）を用いることで融合できる。センダイウイルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。
　上記融合した細胞から免疫原であるＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチドを認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、上記融合した細胞から限界希釈法によってHAT培地およびHT培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択する。96穴マイクロタイタープレートなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチドに対する抗体が含まれている場合には、ＯＸＴ／ＶＰあるいは、本発明の標識体をプレート上に固定化したアッセイプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウスイムノグロブリン-HRP標識抗体等の2次標識抗体を反応させるELISA法により、ＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチドに対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質にはHRPの他、アルカリホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。またコントロールとしてブロッキング剤であるBSAのみを結合したアッセイプレートによるELISAを同時に行うことでＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチド特異的抗体のスクリーニングができる。つまりＯＸＴ／ＶＰファミリーペプチドプレートで陽性であり、BSAによるELISAで陰性のクローンを選択できる。
　以下の実施例、比較例及び参考例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞　ＢＬＥＩＡ法によるＯＸＴの測定
（１）1x10-9M Streptavidin（Ｒｏｃｈｅ）と1x10-10M Biotinyl-luciferase (キッコーマンバイオケミファ)を１：１で混合し、室温で３０分反応させて、Streptavidin-Biotinyl-luciferase complexを作製する（100mmol/L リン酸buffer（PB）, 1mmol/L EDTA・2Na, 2mmol/L 2-Mercaptoethanol, 0.1%BSA, pH7.4）。
　DynaBeadsM280T（磁性微粒子）（ライフテクノロジー社）に抗ウサギＩｇＧヤギ精製抗体(EIKEN)を結合させ（１％濃度）を希釈して0.15%Beads(50mMPB, 0.05%BSA, 0.09%NaN3)の2nd antibody-immobilized magnetic particlesを作製する。
（２）上記（１）で調製した2nd antibody-immobilized magnetic particles　20μLにOXT（Oxytocin acetate salt hydrate) (SIGMA)をAssay buffer（100mmol/Lリン酸buffer（PB）, 2mmol/L EDTA・2Na, 0.2%BSA, 0.05%NaN3, pH7.4）で希釈したものを100μL（1～100,000pg/ml（0.1～10,000pg/assay））と抗-Oxytocin Rabbit IgG抗体(Affinity Purify) （（株）免疫生物研究所委託作製）50μL（1:1000～1:3000希釈））を加え、４℃で一晩反応させる。
（３）Biotin-(Lys(n))-OXT 標識体（n=0,1,2,3,4,5,6）(（株）免疫生物研究所による委託合成品（20ng/ml）を50,000倍希釈)を50μl加え、４℃で一時間反応させる。
（４）Washing Buffer（100mmol/L PB, 0.15mol/L NaCl, 0.05%Tween20（登録商標）, pH7.4）1000μLで３回洗浄する（磁性粒子洗浄分離機（MW-50）：柴崎製作所（株））。
（５）上記（１）で調製したStreptavidin-Biotinyl-luciferase complexを200μL加えて、室温で３０分反応させる。
（６）Washing Buffer（100mmol/L PB, 0.15mol/L NaCl, 0.05%Tween20（登録商標）, pH7.4）1000μLで３回洗浄する（磁性粒子洗浄分離機（MW-50）：柴崎製作所（株））。
（７）Suspension buffer（50mmol/L Tris-HCl, pH8.5）100μLとBL substrate solution （Luciferase substrate powder (EIKEN)1瓶をH2O 24mlにて溶解したもの）100μLを加え、発光測定器（SHE：柴崎製作所（株））で発光を検出する（５秒）。
　生物発光酵素免疫測定法による「Ｌｙｓ」の長さの数の影響を調べた（図１）。その結果、Biotin-Lys(n) -OXT 標識体（Ｌｙｓ０（ｎ＝０）、Ｌｙｓ１（ｎ＝１）、Ｌｙｓ２（ｎ＝２）、Ｌｙｓ３（ｎ＝３）、Ｌｙｓ４（ｎ＝４）、Ｌｙｓ５（ｎ＝５））を用いた場合、Ｌｙｓの数が多いほど、検出のＢ０値（発光強度）が大きくなることがわかった。一方、さらにＬｙｓの長さを長くすると（検出のＢ０値（発光強度）は小さくなってしまった（Ｌｙｓ６（ｎ＝６））。
　生物発光酵素免疫測定法によるＢｉｏｔｉｎ－ＯＸＴ（Ｌｙｓ０）とＢｉｏｔｉｎ－（Ｌｙｓ）５－ＯＸＴ（Ｌｙｓ５）を用いた場合のＯＸＴの検量線を作成した（図２）。検量線よりＩＣ５０を算出した所、5,490pg/ml（Lys0）と1,000pg/ml（Lys5）であった。Ｌｙｓ５を用いた場合、用いる抗体の量を減らすと、検出感度があがり、ＩＣ５０の値は小さくなった（800pg/ml）。
＜実施例２＞　ＥＬＩＳＡ法によるＯＸＴの測定
（１）2nd antibody-immobilized plate（抗ウサギIgG（H+L）ヤギ血清（（株）シバヤギ）をコ－ティングしたプレート）にOXT（Oxytocin acetate salt hydrate）（SIGMA）をAssay buffer（10mmol/L リン酸buffer（PB）, 0.15M NaCl, 0.1%BSA, pH7.4）で希釈したものを100μL（1～100,000pg/mL（0.1～10,000pg/assay））と抗-Oxytocin Rabbit IgG抗体(Affinity Purify) （（株）免疫生物研究所委託作製）50μL（1:1000～1:3000希釈））を加え、４℃で一晩反応させる。
（２）Biotin-(Lys(n))-OXT 標識体（n=0,1,2,3,4,5,6：（株）免疫生物研究所による委託合成品（20ng/ml）を50,000倍希釈）を50μL加え、４℃で一時間反応させる。
（３）Streptavidin-HRP（Thermo）(500ng/ml) 200μLを加え、室温で１時間反応させる。
（４）Washing Buffer（10mmol/L PB, 0.15mol/L NaCl, 0.1%Tween20（登録商標）, pH7.4）３５０μLで３回洗浄する。
（５）OPD （o-フェニレンジアミン二塩酸塩）溶液（542μg/mL；50mmol/L citrate buffer, 0.015%H2O2, pH5.5）を加え、室温で一時間反応後、停止溶液（2M Sulfuric acid）を50μL添加後、吸光光度計（WALLAC ARVO SXd 1420 MULTILAVEL COUNTER（PerkinElmer））で（492nm）で発色を検出した。
　ＥＬＩＳＡ法による「Ｌｙｓ」の数の影響を調べた(図２)。生物発光酵素免疫測定法と同様に検量線を作成し、そのＩＣ５０を算出した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　その結果、生物発光酵素免疫測定法の結果と同様にＬｙｓ５を上限としてＬｙｓの数が多いほど検出感度が上がることがわかった。
　以上に詳細に説明した通り、本発明の標識体及び免疫測定法では、測定対象目的物質を特異的に精密測定することを可能にする。

Claims (11)

  1. 　（Ｘａａ）ｎ－（配列番号１又は２）
    で表されるオキシトシン又はバソプレシンのＮ末端にアミノ酸残基が結合した修飾ペプチドのＮ末端に標識が結合した標識体
    ［ここで、Ｘａａは任意のアミノ酸を示し、ｎは１，２，３，４又は５の整数を表し、修飾ペプチドのＣ末端はアミド化されている］。
  2. 　ＸａａがＬｙｓであることを特徴とする請求項１に記載の標識体。
  3. 　修飾ペプチドが配列番号３、４、５，６、７、８、９、１０、１１又は１２で表される請求項１又は２に記載の標識体。
  4. 　標識がビオチンである請求項１から３のいずれかに記載の標識体。
  5. 　標識が酵素である請求項１から３のいずれかに記載の標識体。
  6. 　前記修飾ペプチドのＮ末端にビオチンが結合しており、前記酵素がアビジン又はストレプトアビジンと結合しており、ビオチン－（ストレプト）アビジン結合を介して、酵素が修飾ペプチドに結合している、請求項５に記載の標識体。
  7. 　前記酵素が、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、イクオリン、またはルシフェラーゼである請求項５又は６のいずれかに記載の標識体。
  8. 　請求項１から７のいずれかに記載の標識体を用いて、免疫測定法により検体中のオキシトシンまたはバソプレシンを検出する方法。
  9. 　請求項８に記載の検出方法に用いるためのキットであって、請求項１から７のいずれかに記載の標識体を構成成分として含む検体中のオキシトシンまたはバソプレシンの測定キット。
  10. 　請求項８に記載の検出方法に用いるためのキットであって、
    　　（１）請求項１から７のいずれかに記載の標識体；
    　　（２）抗オキシトシン抗体、または抗バソプレシン抗体
    を構成成分として含むキット；
  11. 　抗オキシトシン抗体、または抗バソプレシン抗体が固相支持体に固相化されている、請求項１０に記載のキット。
     
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