RU2439080C2 - Биоанализ и пептиды, используемые в нем - Google Patents
Биоанализ и пептиды, используемые в нем Download PDFInfo
- Publication number
- RU2439080C2 RU2439080C2 RU2008130399/10A RU2008130399A RU2439080C2 RU 2439080 C2 RU2439080 C2 RU 2439080C2 RU 2008130399/10 A RU2008130399/10 A RU 2008130399/10A RU 2008130399 A RU2008130399 A RU 2008130399A RU 2439080 C2 RU2439080 C2 RU 2439080C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- peptide
- sequence
- sample
- methionine
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 90
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 27
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 title description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims abstract description 19
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 19
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 14
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 11
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 16
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 11
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims 2
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 claims 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 14
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 abstract description 13
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract description 5
- 101710088334 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85B Proteins 0.000 abstract description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 3
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 239000012112 Alexa Fluor 633 Substances 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000032376 Lung infection Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010069110 Mycobacterium tuberculosis antigen 85B Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- -1 peroxide hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1289—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/5695—Mycobacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
В изобретении представлены пептиды для детекции Mycobacterium tuberculosis, которые состоят менее чем из 18 аминокислот и способные связываться с антителом против пептида GRDIKVQFQSGGNNSPAV (все последовательности приведены в списке последовательностей). Один из пептидов содержит последовательность NSPAX, где Х представляет собой метионин, наиболее предпочтительные пептиды содержат последовательность NNSPAV или имеет вид SGGNNSPAX, где Х - метионин, лейцин, аланин или валин. Описана нуклеотидная последовательность, кодирующая пептиды по изобретению, а также антитело или его фрагмент, способное связываться с указанным пептидом. В изобретении раскрыты способы определения наличия M.tuberculosis, включающие проведение заместительного анализа ELISA образца с использованием пептида, обладающего способностью связываться с антителом против пептида GRDIKVQFQSGGNNSPAV или с использованием антитела. Использование изобретения позволит упростить проведение тестов по определению противотуберкулезных антител у населения благодаря искусственно модифицированным последовательностям пептида Т-клеточного эпитопа Ag85B M.tuberculosis. 6 н. и 21 з.п. ф-лы, 5 ил.
Description
2420-152611RU/071
БИОАНАЛИЗ И ПЕПТИДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В НЕМ
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к пептидам, используемым в анализе определения Mycobacterium tuberculosis, а также к самому анализу.
Уровень техники
Туберкулез представляет собой инфекцию, вызываемую бактерией Mycobacterium tuberculosis. Туберкулез представляет глобальную проблему во многих странах, особенно в развивающемся мире, и во многих развивающихся странах заболеваемость туберкулезом увеличивается. Несмотря на то, что туберкулез чаще представляет собой легочную инфекцию, он также может воздействовать на другие части тела, такие как лимфатические узлы, кожа и кости.
Диагностика туберкулеза, а также предоставляемое лечение, является основным средством против распространения заболевания. Диагноз может быть поставлен на основании сочетания клинических признаков, культурального исследования мокроты, рентгенограммы грудной клетки, гистологии ткани и жидкости бронхиального лаважа, и используя туберкулиновую кожную пробу (также известную как стандарт очищенного деривата белка или кожная проба PPD), такую как проба Манту и проба Гиффа. Пробы основаны на иммунной реакции на белок M.tuberculosis, показывающей наличие в крови пациента антител против M.tuberculosis.
Для проведения проб необходимо провести у пациента иммунологическую провокацию и затем оценить для определения результата теста. Эти этапы делают пробу трудоемкой для применения в скрининге населения.
В настоящем изобретении были сделаны попытки разрешить некоторые из этих проблем.
Сущность изобретения
В первом общем аспекте изобретение относится к пептиду, состоящему менее чем из 18 аминокислот, содержащему последовательность NSPAX, где Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17), аланин (SEQ ID NO: 15) или валин (SEQ ID NO: 10), где пептид способен связываться с антителом, направленным против пептида GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11). В наиболее предпочтительных вариантах осуществления пептид связывается с таким антителом.
Практически такое антитело могло бы быть направлено против указанного пептида (SEQ ID NO: 11), дополненного дополнительной С-аминокислотой на С-терминальном конце, т.е. направленным против GRDIKVQFQSGGNNSPAVC.
Во втором аспекте таким образом пептид содержит до 6 дополнительных аминокислот на С и/или N-терминальном конце последовательности NSPAX.
Предпочтительно, следовательно, пептид по первому или второму аспекту содержит последовательность NSPAX, а более предпочтительно пептид содержит последовательность NNSPAV (SEQ ID NO: 14).
В дополнительном предпочтительном аспекте пептид содержит последовательность SGGNNSPAX (SEQ ID NO: 26), где Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17), аланин (SEQ ID NO: 15) или валин (SEQ ID NO: 10).
В любом аспекте изобретения предпочтительно, чтобы пептид отличался от GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11).
Также в любом аспекте изобретения предпочтительно, чтобы пептид состоял из последовательности SGGNNSPAX (SEQ ID NO: 26), где Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17), аланин (SEQ ID NO: 15) или валин (SEQ ID NO: 10).
Также в любом пептиде по изобретению предпочтительно, чтобы Х представлял собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17) или аланин (SEQ ID NO: 15). Особенно предпочтительны пептиды, в которых Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18) или аланин (SEQ ID NO: 15). Обнаружено, что именно такие замены обладают лучшей стабильностью Leu к нагреванию, что делает их подходящими для использования в странах с жарким климатом.
Наиболее предпочтительные пептиды по любому аспекту изобретения дополнительно содержат метку. Использование меченого пептида облегчает его использование в анализе определения Mycobacterium tuberculosis. К подходящим меткам относятся радиоактивные метки (например, путем введения радиоактивного изотопа или замены одного или нескольких атомов пептида их радиоактивным эквивалентом), что позволяет без труда определить наличие или концентрацию пептида или комплекса, содержащего пептид, например, с помощью сцинтилляционного счетчика или тому подобного. Также можно было использовать другие метки, такие как опосредованная ферментом хромогенная метка. Особенно предпочтительными метками являются флуоресцентные метки, включающие связывание пептида с флуоресцентным белком. Особенно подходящей, тем не менее, является флуоресцентная метка, такая как Alexa Fluor (например, Alexa Fluor 633).
Предпочтительно также, чтобы любой из вышеуказанных пептидов находился в выделенной форме, т.е., по существу, свободной от белков первичного источника (например, бактериальных, грибковых или белков млекопитающих).
Описанные выше пептиды применяют в анализах определения Mycobacterium tuberculosis.
Изобретение относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей любой из вышеуказанных пептидов. Такая последовательность применяется в биосинтезе пептидов по настоящему изобретению.
Изобретение относится к антителу, направленному против SEQ ID NO: 11. Антитела по изобретению могут быть поликлональными или моноклональными, или могут быть рекомбинантными антителами, такими как химерные антитела, в которых константные области легкой и тяжелой цепей мышей заменяют последовательностями человека, или CDR-привитые антитела, в которых присутствуют только комплементарные определяющие области, например, мышей. Антитела по изобретению также могут быть антителами человека, полученными, например, иммунизацией трансгенных животных, способных продуцировать антитела человека (смотри, например, заявку РСТ № WO 93/12227).
Также изобретение относится к заместительной ELISA (ферментный иммуносорбентный анализ) для определения наличия Mycobacterium tuberculosis, содержащий пептид по любому предшествующему пункту. Подходящий порядок выполнения такого анализа будет описан ниже. Предпочтительно чтобы такой заместительный анализ дополнительно включал антитело, направленное против SEQ ID NO: 11, или фрагмент такого антитела, имеющий сродство в отношении SEQ ID NO: 11.
Также изобретение относится к анализу ELISA для определения наличия Mycobacterium tuberculosis, содержащему антитело, направленное против SEQ ID NO: 11, или фрагмент такого антитела, имеющий сродство в отношении SEQ ID NO: 11.
Дополнительно изобретение относится к заместительному анализу для определения наличия Mycobacterium tuberculosis, содержащему пептид по изобретению, и пептид, соответствующий SEQ ID NO: 11.
Разработка теста и описание предпочтительных вариантов осуществления
Тест основан на идентифицированном Т-клеточном эпитопе Ag85B M. tuberculosis [Mustafa, A.S. et al, "Identification and HL Restriction of Nuturally Derived Thl-Cell Epitopes from the Secreted 1-Cell Epitopes from the Secreted Mycobacterium tuberculosis Antigen 85B Recognised by Antigen-Specific Human CD4+ T-Cell Lines", Infection and Immunity, 68(7), 3933-3940, 2000], представленном 18-мерным пептидом р3 (аминокислоты с 19 по 36, обозначаемые Р779) с последовательностью GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11).
В одном из аспектов изобретение относится к обеспечению конкурентного заместительного ELISA (ферментный иммуносорбентный анализ) - эффективного лиганд-замещающего анализа. Антитела против M. tuberculosis, в частности, направленные к эпитопу Ag85B, связываются с тестируемой плашкой. Пептиды способны связываться с антителами, но связываются с антителами, предпочтительно меченными, например, флуоресцентным маркером, с более низким сродством по сравнению с антигеном M. tuberculosis. Если образцы, содержащие антигены M. tuberculosis (например, сам организм), приводят в контакт с комплексом антитело-пептид, то антигены замещают пептиды, что может быть определено по изменению флуоресценции. В другом аспекте изобретения подходящие синтетические пептиды получают, как описано ниже:
Для идентификации антигена-мишени с целью создания библиотеки аналогов были синтезированы 10 9-мерных перекрывающихся пептидов, картирующих 18-мерный р3 (т.е. 1-9аа, 2-10аа, 3-11аа и т.д. последовательности SEQ ID NO: 11).
Ниже представлены последовательности 10 9-мерных пептидов, используя стандартный 1 буквенный аминокислотный код:
SEQ ID NO: 1: GRDIKVQFQ (1-9аа), обозначаемая Р782-1
SEQ ID NO: 2: RDIKVQFQS (2-10aa), обозначаемая P782-2
SEQ ID NO: 3: DIKVQFQSG (3-11aa), обозначаемая P782-3
SEQ ID NO: 4: IKVQFQSGG (4-12aa), обозначаемая P782-4
SEQ ID NO: 5: KVQFQSGGN (5-13aa), обозначаемая P782-5
SEQ ID NO: 6: VQFQSGGNN (6-14aa), обозначаемая P782-6
SEQ ID NO: 7: QFQSGGNNS (7-15aa), обозначаемая P782-7
SEQ ID NO: 8: FQSGGNNSP (8-16aa), обозначаемая P782-8
SEQ ID NO: 9: QSGGNNSPA (9-17aa), обозначаемая P782-9
SEQ ID NO: 10: SGGNNSPAV (10-18aa), обозначаемая P782-10.
Эти пептиды наряду с 18-мерным р3 (SEQ ID NO: 11) были скринированы против антисыворотки (кролика) в отношении 18-мерного р3 (SEQ ID NO: 11). При скрининге использовали методику конкурентного ELISA (ферментный иммуносорбентный анализ), которую использовали для оценки относительного сродства связывания 9-мерных пептидов с 18-мерным пептидом.
Коротко, анализ включал связывание (покрытие) 18-мерного р3 (Р779, SEQ ID NO: 11) с планшетами для проведения ELISA, с последующей инкубацией с различными количествами конкурентного лиганда (9-меры, SEQ ID NO: 1-10) в присутствии антисыворотки (разведение 1:250). Уровень связывания антисыворотки с 18-мерным р3 (Р779, SEQ ID NO: 11) определяли обработкой антикроличьим антителом козы, конъюгированным с пероксидазой, с последующим добавлением хромогенного субстрата ABTS (2,2-азино-ди-[3-этилбензтиазолинсульфонат]) и перекиси водорода, где после появления зеленой окраски ее измеряли с помощью счетчика плашек как оптическую плотность (поглощения). Развитие окрашивания пропорционально уровню связывания исходной антисыворотки с плашкой.
Для определения концентраций покрывающего пептида и конкурентных пептидов, использующихся для проведения экспериментов ELISA, осуществляли тест ELISA, содержащий конкуретный ELISA 9-мерного Р782-1 (GRDIKVQFQ) - SEQ ID NO: 1 - против 18-мерного Р779 (GRDIKVQFQSGGNNSPAV) - SEQ ID NO: 11 (Mustafa, A.S. et al, указано выше). Этот 9-мер выбирали так, чтобы он также перекрывался 18-мерным р2 (YLQVPSPSMGRDIKVQFQ) - SEQ ID NO: 12. На основании этих результатов авторы показали, что концентрации использованных пептидов подходили для проведения исследований с использованием ELISA. Плашки для проведения ELISA покрывали 2 мкМ раствором 18-мерного р3 (Р779) - SEQ ID NO: 11 и использовали 500 мкМ растворы конкурентных пептидов, которые затем подвергали четырехкратному серийному разведению. Результаты теста ELISA представлены на фиг.1.
Затем для определения относительного сродства связывания между десятью 9-мерами (с Р782-1 по Р782-10) - SEQ ID NO: с 1 по 10 - против 18-мерного р3 (Р779) - SEQ ID NO: 11 осуществляли картирование эпитопа посредством ELISA. Для получения количественной оценки относительного сродства связывания конкурирующих эпитопов важен выбранный диапазон концентрации пептида (линейная часть конкурентного графика). Результаты показали, что в этом диапазоне концентрации у 9-меров с Р782-1 по Р782-9 (т.е. SEQ ID NO: с 1 по 9) не наблюдалось связывания с антисывороткой в каком-либо значительном количестве; тем не менее, 9-мер Р782-10 (SGGNNSPAV) - SEQ ID NO: 10 - связывался с антисывороткой так же сильно, как и 18-мерный пептид р3 (SEQ ID NO: 11). Этот результат крайне важен и он привел авторов к мысли о возможной важности С-терминального остатка валина, поскольку у предшествующего 9-мера Р782-9 (QSGGNNSPA), SEQ ID NO: 9 не наблюдалось значительного связывания даже несмотря на то, что он перекрывает пептид Р782-10, SEQ ID NO: 10, 8 остатками. Результаты картирования этого эпитопа с помощью анализа ELISA представлены на фиг.2(а) и 2(b). Затем для проверки важности С-концевого региона эпитопа для связывания с антисывороткой наметили использовать анализ ELISA эпитопа-мишени. Были синтезированы два 6-мера, Р782-11 (GNNSPA) - SEQ ID NO: 13 - и P782-12 (NNSPAV) - SEQ ID NO: 14, которые являются усеченными формами соответствующих им 9-меров, и их подвергли конкурентному анализу ELISA в соответствии с вышеуказанным, и также повторно протестировали 9-мер Р782-10 (SEQ ID NO: 10), идентифицированный при картировании эпитопа посредством анализа ELISA как значимый эпитоп. Результаты ELISA эпитопа-мишени показаны на фиг.3. Данные ясно показывают воспроизводимые результаты и вновь указывают на то, что:
9-мер Р782-10 (SEQ ID NO: 10) связывается с антисывороткой так же прочно, как и р3 18-мерный пептид Р779 (SEQ ID NO: 11)
6-мерный Р782-11 (SEQ ID NO: 13) не связывается с антисывороткой и:
6-мерный Р782-12 (NNSPAV) (SEQ ID NO: 14) связывается с антисывороткой в 2 раза (1,99) слабее по сравнению либо с 9-мерным Р782-10 (SEQ ID NO: 10), либо с 18-мерным Р779 (SEQ ID NO: 11).
Этот результат указывает на важность С-концевого региона, который содержит остаток валина. На основании этого эксперимента было бы неразумно модифицировать N-концевой регион, чтобы вместо этого не нацеливать С-концевой остаток валина с целью создания некоторого различия сродства связывания. Поэтому авторы решили сосредоточить внимание на библиотеке, основанной на 9-мерном Р782-10 (SGGNNSPAV), SEQ ID NO: 10, и модифицировать С-концевой регион, и синтезировали пептиды с последовательностью SGGNNSPA-Х, где Х представляет собой вариабельную аминокислоту, включающую другие гидрофобные и имеющие заряд аминокислоты.
Для создания библиотеки ELISA авторы синтезировали следующие пептиды:
SEQ ID NO 15: SGGNNSPAA, обозначаемая P783-1
SEQ ID NO 16: SGGNNSPAF, обозначаемая P783-2
SEQ ID NO 17: SGGNNSPAL, обозначаемая P783-3
SEQ ID NO 18: SGGNNSPAM, обозначаемая P783-4
SEQ ID NO 19: SGGNNSPAY, обозначаемая P783-5
SEQ ID NO 20: SGGNNSPAG, обозначаемая P783-6
SEQ ID NO 21: SGGNNSPAS, обозначаемая P783-7
SEQ ID NO 22: SGGNNSPAP, обозначаемая P783-8
SEQ ID NO 23: SGGNNSPAN, обозначаемая P783-9
SEQ ID NO 24: SGGNNSPAE, обозначаемая P783-10
SEQ ID NO 25: SGGNNSPAR, обозначаемая P783-11.
Авторы ограничились концентрациями конкурентных пептидов, использованными в предыдущих экспериментах, поскольку было бы невозможно оценить относительное сродство связывания конкурентных пептидов в рамках одного исследования. Результаты конкурентного анализа ELISA библиотеки (графически представлены на фиг.4) показывают диапазон сродства связывания относительно 9-мерного Р782-10 (SGGNNSPAV), SEQ ID NO: 10. Особенно важными эпитопами являются варианты с аланином, лейцином и метионином (SEQ ID NO: 15, 17 и 18) особенно при концентрациях эпитопов 125 мкМ и 31,3 мкМ. Наиболее предпочтительными из этих вариантов являются варианты с аланином и метионином, поскольку они обладают повышенной устойчивостью к нагреванию, что делает их особенно эффективными для использования в странах с жарким климатом.
Анализ ELISA
Подходящий способ осуществления анализа ELISA по настоящему изобретению выглядит следующим образом.
Для определения наличия или отсутствия Mycobacterium tuberculosis образец пациента приводят в контакт с антителом, направленным против SEQ ID NO: 11; определяют наличие или отсутствие комплекса, сформированного между пептидом в образце и указанным антителом; определяют количество комплекса, образованного в указанном образце по сравнению с контролем, принимаемым за значение нормы, где увеличение количества комплекса в образце по сравнению с контролем указывает на наличие Mycobacterium tuberculosis. Основные способы осуществления анализов ELISA известны специалисту в данной области. Образцы пациентов могут быть получены в виде жидкостей, таких как кровь, слюна, сперма и молоко, или образцов ткани, таких как материал биопсии, подходящим образом полученный, например, путем гомогенизации. Тем не менее, предпочтительными являются образцы, полученные из дыхательных путей. Особенно предпочтительна мокрота или жидкости, полученные бронхиальным или легочным лаважем. Наиболее предпочтительными, тем не менее, являются образцы, полученные индуцированием кашлевого рефлекса у пациента путем распыления аэрозоля и сбора полученного материала из дыхательных путей пациента; эти образцы содержат материал, происходящий из трахеи.
Заместительный анализ ELISA
Подходящий способ осуществления заместительного анализа ELISA по настоящему изобретению выглядит следующим образом.
Для определения наличия или отсутствия Mycobacterium tuberculosis получают композицию, содержащую пептид, как описано в настоящем документе и определено в формуле изобретения, и образец пациента. Композицию приводят в контакт с антителом, направленным против SEQ ID NO: 11; определяют наличие или отсутствие комплекса, образованного между указанным пептидом и указанным антителом; и количество комплекса, образованного в указанном образце, сравнивают с контролем, принимаемым за значение нормы, где снижение количества комплекса в образце по сравнению с контролем указывает на наличие Mycobacterium tuberculosis.
Специалистам в данной области известны основные способы осуществления заместительных анализов ELISA. Кроме того, образцы пациентов могут быть получены в виде жидкостей организма, таких как кровь, слюна, сперма и молоко, или образцы ткани, такие как биопсийный материал, полученный подходящим образом, например путем гомогенизации. Тем не менее, предпочитаются образцы, получаемые из дыхательных путей. Особенно предпочтительна мокрота или жидкости, полученные бронхиальным или легочным лаважем. Наиболее предпочтительными, тем не менее, являются образцы, полученные индуцированием кашлевого рефлекса у пациента путем распыления аэрозоля и сбора полученного материала из дыхательных путей пациента; эти образцы содержат материал, происходящий из трахеи.
Claims (27)
1. Пептид для детекции Mycobacterium tuberculosis, состоящий менее чем из 18 аминокислот, содержащий последовательность NSPAX, где Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18), где пептид обладает способностью связываться с антителом против пептида GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11).
2. Пептид по п.1, где пептид содержит до 6 дополнительных аминокислот на С- и/или N-конце последовательности NSPAX.
3. Пептид для детекции Mycobacterium tuberculosis, состоящий менее чем из 18 аминокислот, содержащий последовательность NNSPAX, где Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17) или аланин (SEQ ID NO: 15), где пептид обладает способностью связываться с антителом против пептида GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11).
4. Пептид по п.3, где пептид содержит последовательность SGGNNSPAX (SEQ ID NO: 26).
5. Пептид по п.4, где пептид состоит из последовательности SGGNNSPAX (SEQ ID NO: 26), где X представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17), аланин (SEQ ID NO: 15) или валин (SEQ ID NO: 10).
6. Пептид по п.5, где Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17) или аланин (SEQ ID NO: 15).
7. Пептид по любому из пп.3-6, где Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18) или аланин (SEQ ID NO: 15).
8. Пептид по любому из пп.1-6, дополнительно содержащий метку.
9. Нуклеотидная последовательность, кодирующая пептид по любому из пп.1-8.
10. Антитело против пептида с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 11, или его фрагмент, имеющий сродство связывания в отношении SEQ ID NO: 11, используемое для детекции Mycobacterium tuberculosis.
11. Способ определения наличия Mycobacterium tuberculosis в образце, где указанный способ включает проведение заместительного анализа ELISA указанного образца, где процедура указанного анализа включает использование пептида, состоящего менее чем из 18 аминокислот, содержащего последовательность NSPAX, где Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17), аланин (SEQ ID NO: 15) или валин (SEQ ID NO: 10), где пептид обладает способностью связываться с антителом против пептида GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11).
12. Способ по п.11, где пептид содержит до 6 дополнительных аминокислот на С- и/или N-конце последовательности NSPAX.
13. Способ по п.11 или 12, где пептид содержит последовательность NNSPAX.
14. Способ по п.13, где пептид содержит последовательность NNSPAV (SEQ ID NO: 14).
15. Способ по п.11 или 12, где пептид содержит последовательность SGGNNSPAX (SEQ ID NO: 26), где Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17), аланин (SEQ ID NO: 15) или валин (SEQ ID NO: 10).
16. Способ по п.11 или 12, где пептид не является GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11).
17. Способ по п.11, где пептид состоит из последовательности SGGNNSPAX (SEQ ID NO: 26), где X представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17), аланин (SEQ ID NO: 15) или валин (SEQ ID NO: 10).
18. Способ по любому из пп.11, 12 или 17, где Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18), лейцин (SEQ ID NO: 17) или аланин (SEQ ID NO: 15).
19. Способ по п.18, где Х представляет собой метионин (SEQ ID NO: 18) или аланин (SEQ ID NO: 15).
20. Способ по п.11 или 12, где указанный способ дополнительно включает использование антитела по п.10.
21. Способ по п.11 или 12, где указанный способ дополнительно включает использование пептида GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11).
22. Способ по п.11 или 12, включающий следующие стадии:
(i) получение композиции, содержащей указанный пептид и образец пациента;
(ii) приведение в контакт указанной композиции с антителом против GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11);
(iii) определение наличия или отсутствия комплекса, образованного между указанным пептидом и указанным антителом; и
(iv) сравнение количества комплекса, образованного в указанном образце, с нормальным контролем, где увеличение количества комплекса в образце по сравнению с контролем указывает на наличие Mycobacterium tuberculosis.
(i) получение композиции, содержащей указанный пептид и образец пациента;
(ii) приведение в контакт указанной композиции с антителом против GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11);
(iii) определение наличия или отсутствия комплекса, образованного между указанным пептидом и указанным антителом; и
(iv) сравнение количества комплекса, образованного в указанном образце, с нормальным контролем, где увеличение количества комплекса в образце по сравнению с контролем указывает на наличие Mycobacterium tuberculosis.
23. Способ по п.22, где образец пациента содержит образец трахеи.
24. Способ определения наличия Mycobacterium tuberculosis в образце, где указанный способ включает проведение заместительного анализа ELISA указанного образца и где процедура указанного анализа включает использование антитела по п.10.
25. Способ по п.24, включающий стадии:
(i) приведение в контакт образца пациента с антителом против GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11);
(ii) определение наличия или отсутствия комплекса, образованного между указанным пептидом и указанным антителом; и
(iii) сравнение количества комплекса, образованного в указанном образце, с нормальным контролем, где повышение количества комплекса в образце по сравнению с контролем указывает на наличие Mycobacterium tuberculosis.
(i) приведение в контакт образца пациента с антителом против GRDIKVQFQSGGNNSPAV (SEQ ID NO: 11);
(ii) определение наличия или отсутствия комплекса, образованного между указанным пептидом и указанным антителом; и
(iii) сравнение количества комплекса, образованного в указанном образце, с нормальным контролем, где повышение количества комплекса в образце по сравнению с контролем указывает на наличие Mycobacterium tuberculosis.
26. Способ по п.25, где образец пациента содержит образец, полученный из легких.
27. Способ по п.25 или 26, где антитело мечено ферментом.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0526273.8 | 2005-12-23 | ||
| GB0526273A GB2433740A (en) | 2005-12-23 | 2005-12-23 | Detection of tuberculosis infection |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008130399A RU2008130399A (ru) | 2010-01-27 |
| RU2439080C2 true RU2439080C2 (ru) | 2012-01-10 |
Family
ID=35841094
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008130399/10A RU2439080C2 (ru) | 2005-12-23 | 2006-12-22 | Биоанализ и пептиды, используемые в нем |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8372412B2 (ru) |
| EP (1) | EP1963858B1 (ru) |
| JP (1) | JP2009520798A (ru) |
| AU (1) | AU2006327953B2 (ru) |
| CA (1) | CA2634638C (ru) |
| GB (1) | GB2433740A (ru) |
| RU (1) | RU2439080C2 (ru) |
| WO (1) | WO2007072063A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA200805343B (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106248934B (zh) * | 2016-08-25 | 2018-04-06 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c及其T细胞表位肽的应用 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0746609A4 (en) | 1991-12-17 | 1997-12-17 | Genpharm Int | NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES |
| US6033904A (en) * | 1992-01-13 | 2000-03-07 | Syntro Corporation | Recombinant swinepox virus |
| US6599510B1 (en) * | 1993-11-23 | 2003-07-29 | The Regents Of The University Of California | Abundant extracellular products and methods for their production and use |
| US6818223B2 (en) * | 1993-11-23 | 2004-11-16 | The Regents Of The University Of California | Abundant extracellular products and methods for their production and use |
| NZ309945A (en) * | 1995-05-23 | 2001-04-27 | Univ California | Abundant extracellular products and their use as vaccines |
| US6245331B1 (en) * | 1997-01-02 | 2001-06-12 | New York Univ. Medical Center | Early detection of mycobacterial disease |
| AU5294000A (en) * | 1999-05-28 | 2000-12-18 | Promega Corporation | Antibodies specific for mycobacterial polypeptides and uses thereof |
| AU2002353934A1 (en) * | 2001-10-31 | 2003-05-12 | Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. | Biomarkers of liver function |
| CU23225A1 (es) * | 2001-12-20 | 2007-08-30 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | PéPTIDOS PARA EL TRATAMIENTO DEL CáNCER ASOCIADO AL VIRUS PAPILOMA HUMANO (VPH) Y DE OTROS TUMORES EPITELIALES |
| WO2004108948A2 (en) | 2003-06-04 | 2004-12-16 | President And Fellows Of Harvard College | Systems, methods and kits for characterizing phosphoproteomes |
| US20060002941A1 (en) * | 2004-01-23 | 2006-01-05 | Vievax Corp. | Compositions comprising immune response altering agents and methods of use |
-
2005
- 2005-12-23 GB GB0526273A patent/GB2433740A/en not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-12-22 WO PCT/GB2006/004931 patent/WO2007072063A2/en active Application Filing
- 2006-12-22 EP EP06831482.2A patent/EP1963858B1/en active Active
- 2006-12-22 US US12/158,781 patent/US8372412B2/en active Active
- 2006-12-22 JP JP2008546638A patent/JP2009520798A/ja active Pending
- 2006-12-22 ZA ZA200805343A patent/ZA200805343B/xx unknown
- 2006-12-22 AU AU2006327953A patent/AU2006327953B2/en not_active Ceased
- 2006-12-22 RU RU2008130399/10A patent/RU2439080C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-12-22 CA CA2634638A patent/CA2634638C/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2007072063A3 (en) | 2008-01-24 |
| JP2009520798A (ja) | 2009-05-28 |
| GB2433740A (en) | 2007-07-04 |
| ZA200805343B (en) | 2009-11-25 |
| AU2006327953B2 (en) | 2013-05-09 |
| AU2006327953A1 (en) | 2007-06-28 |
| EP1963858A2 (en) | 2008-09-03 |
| WO2007072063A2 (en) | 2007-06-28 |
| GB0526273D0 (en) | 2006-02-01 |
| CA2634638A1 (en) | 2007-06-28 |
| RU2008130399A (ru) | 2010-01-27 |
| US20120115168A1 (en) | 2012-05-10 |
| US8372412B2 (en) | 2013-02-12 |
| EP1963858B1 (en) | 2016-09-28 |
| CA2634638C (en) | 2016-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7022969B2 (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を診断するための方法および試薬 | |
| JP6580102B2 (ja) | 腎疾患のためのマーカー | |
| JPWO2008120684A1 (ja) | 急性中枢神経障害の予後判定方法 | |
| CN104470942B (zh) | 生物标志物 | |
| JP5090332B2 (ja) | 炎症及び感染症のためのバイオマーカーとしての短鎖ｓｒｌアルコールデヒドロゲナーゼ（ｄｈｒｓ４）の測定 | |
| EP1543331B1 (en) | Method of diagnosing alzheimer's disease | |
| US20150253324A1 (en) | Point of care assays to detect the status of tuberculosis infection | |
| CN113287013A (zh) | 溃疡性大肠炎以及原发性硬化性胆管炎的检查方法 | |
| JP3259768B2 (ja) | 腎疾患の検査方法 | |
| JP2009156615A (ja) | Ｐａｄ４及び抗ｐａｄ４抗体の測定方法並びに関節リウマチの検出方法 | |
| US7094551B2 (en) | Immunoassays, assay methods, antibodies and method of creating antibodies for detecting FGF-23 | |
| JP2000515854A (ja) | 脳タンパク質ｓ―１００の存在の測定方法 | |
| RU2439080C2 (ru) | Биоанализ и пептиды, используемые в нем | |
| CN111656196A (zh) | 肾癌的检测方法和检查试剂 | |
| KR101893244B1 (ko) | 당뇨병에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도 | |
| CN113817025B (zh) | Sle抗原表位多肽在鉴别sle和其他自身免疫疾病中的作用 | |
| US9915662B2 (en) | Protein microarray for characterizing the specificity of the monoclonal immunoglobulins of MGUS or myeloma patients | |
| CN113831401B (zh) | 一种sle抗原表位多肽及其在sle诊断中的作用 | |
| AU2015230872B2 (en) | Markers for renal disease | |
| TW202311744A (zh) | SARS-CoV-2之免疫測定方法及免疫測定套組 | |
| CN115197294A (zh) | 多肽、多肽组合物、试剂盒及相关应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181223 |