JP3259768B2

JP3259768B2 - 腎疾患の検査方法

Info

Publication number: JP3259768B2
Application number: JP33182898A
Authority: JP
Inventors: 昌也山之内; 章子本田; 裕美内田; 健菅谷; 健二郎木村
Original assignee: 田辺製薬株式会社
Priority date: 1997-11-26
Filing date: 1998-11-24
Publication date: 2002-02-25
Anticipated expiration: 2018-11-24
Also published as: JPH11242026A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、腎疾患の予後診断
等のための検査方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】慢性腎炎などの腎疾患は一般に複雑で多
様な病態を呈するが、早く適切な処置を行い、人工透析
が必要となる慢性腎不全への移行を回避するか、できる
だけ移行を遅らせることが重要な課題となる。腎疾患の
初期症状から慢性腎不全へと移行する場合、臨床的に
は、持続的高度蛋白尿や高血圧などが、組織学的には、
糸球体硬化と並んで最近では間質の線維化などが、予後
不良を規定する所見として重要であるといわれている。
しかしながら、腎疾患の予後を的確に診断するための決
定的な方法は未だ確立されていないのが現状であり、有
用な診断及び検査方法が望まれている。

【０００３】一方、脂肪酸結合蛋白質（ＦＡＢＰ：fatt
y acid binding protein）は、サイトゾルに存在して脂
肪酸と結合する能力を有する分子量約１５キロダルトン
前後の蛋白質群である。それらの生理機能については、
脂肪酸の細胞内転送や蓄積によって代謝酵素系の調節に
関与していると考えられているが詳細は不明である。Ｆ
ＡＢＰとしては、肝型（L−FABP）、腸型（I−FABP）、
心筋型（H−FABP）、脳型（B−FABP）、皮膚型（C−FAB
P/E−FABP）、脂肪細胞型（aP2）、末梢神経細胞型（ミ
エリンP2）等少なくとも７つの分子種が知られており、
その一次構造が決定されている。これらはいずれも脂肪
酸結合能を有し、一部に配列がよく保存された領域が認
められること等から共通の祖先遺伝子から進化したファ
ミリーであると考えられているが、全体としては互いに
異なる一次構造を有し、各々特異的な組識分布を示す。
ＦＡＢＰの命名は、初めにどの組織から見出されたかを
意味し、その組織にしか存在しないことを必ずしも意味
するものではない。

【０００４】ＦＡＢＰに着目した診断方法としては以下
のようなものが知られている。特開平４−３１７６２に
は、心筋梗塞の診断のために、ヒト心筋組織由来のＨ−
ＦＡＢＰの血清中や尿中レベルを、抗体を用いた免疫測
定法で定量することが記載されている。また、WO 93/08
276およびKandaらの報告（Gastroenterology 第110巻、
第339-343頁、1996年）には、小腸虚血時などに血清中
のＩ−ＦＡＢＰレベルが著しく高くなることからＩ−Ｆ
ＡＢＰが腸疾患の診断マーカーとして有用であることが
記載されている。しかし、これらは腎疾患とは関連しな
いし、虚血時の組織傷害に伴って漏出するＦＡＢＰを指
標として検出するものであって組織における発現に着目
したものではない。

【０００５】最近、山崎らは、大腸癌及びその転移巣に
おけるＬ−ＦＡＢＰの発現が癌の悪性度や予後と関連性
があり、Ｌ−ＦＡＢＰの発現量が高いほど予後良好であ
ることを報告している（第47回大腸癌研究会要旨集、第
42頁、1997年）。しかし、これは大腸癌という特異な組
織に関する知見である。

【０００６】さらに、雄性ラットの腎臓に存在する腎型
ＦＡＢＰはα_2U−グロブリンに由来することが知られて
いるが、特開平５−３３０２５には、化学物質の投与に
より雄性ラットに誘発されるα_2U−グロブリン腎症の診
断のために、尿中のα_2U−グロブリンの増加を測定する
ことが記載されている。しかし、これはα_2U−グロブリ
ンが著しく蓄積することが知られている特定の腎症モデ
ルのための方法にすぎない。

【０００７】このように、腎組織におけるＦＡＢＰと腎
疾患との関連及びこれに着目した診断や検査方法は知ら
れていなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、腎疾
患の診断のために有用な検査方法を提供することにあ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、腎組織に
由来する脂肪酸結合蛋白質に着目した研究の結果、腎組
織中における脂肪酸結合蛋白質の発現と腎疾患の予後と
の間に関連性があることを独自に見出し、本発明を完成
するに至った。

【００１０】すなわち、本発明は、ゲッ歯類以外の哺乳
動物から採取した被検試料中に存在する、腎臓組織由来
の脂肪酸結合蛋白質を検出することを特徴とする、腎疾
患の検査方法である。

【００１１】また、本発明は、ラット及びマウスから選
択されるゲッ歯類から採取した被検試料中の、α_2U−グ
ロブリン（Major Urinary Proteinとも称される）もし
くは腎臓組織由来の脂肪酸結合蛋白質を検出し、正常動
物から採取した被検試料と比較した場合の減少の度合い
を決定することからなる、α_2U−グロブリン腎症以外の
ゲッ歯類の腎疾患の検査方法である。

【００１２】また、これら検査方法に使用するための検
査用試薬又はキットである。

【００１３】本発明の検査方法が適用されるゲッ歯類以
外の哺乳動物としては、例えば、ヒトの他、ウサギ、サ
ル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等が
挙げられる。その中でも好ましくはヒト、ウサギ、ブタ
に適用され、とりわけ、ヒトに好適に適用される。

【００１４】腎臓組織中では少なくとも二種類の脂肪酸
結合蛋白質が発現しており、一つは肝臓型であり、もう
一つは心筋型であることが、ヒト腎臓について報告され
ている（Maatmanら、Biochemical Journal、第288巻、
第285-290頁、1992年）。また、これらのうち肝臓型は
近位尿細管に分布し、心筋型は主として遠位尿細管に分
布していることが知られている（Maatmanら、Biochemic
al Journal、第273巻、第759-766頁、1991年）。また、
発明者らは、後記実施例６で示した通り、ウサギ腎臓に
おいても、これら二種類の脂肪酸結合蛋白質が存在して
いることを見出している。

【００１５】上記のことから、ゲッ歯類以外の哺乳動物
において、腎臓組織由来の脂肪酸結合蛋白質（以下、Ｆ
ＡＢＰ）としては、肝臓型脂肪酸結合蛋白質（以下、Ｌ
−ＦＡＢＰ）及び心筋型脂肪酸結合蛋白質（以下、Ｈ−
ＦＡＢＰ）が挙げられる。

【００１６】これらのうち、Ｌ−ＦＡＢＰは近位尿細管
に分布しているが、発明者らの知見によれば、このＬ−
ＦＡＢＰの発現は、腎疾患の予後と密接に関連してお
り、その発現量が多いほど予後は良好であると判断され
る。

【００１７】一方、ラットの腎臓においても複数種のＦ
ＡＢＰが存在し、一つはＨ−ＦＡＢＰで遠位尿細管に分
布している。しかし、腎型ＦＡＢＰ（Ｋ−ＦＡＢＰ）と
称されるもう一つのＦＡＢＰは、雄性ラットに特異的な
尿中主要蛋白質として知られていたα_2U−グロブリンの
少なくともＮ末端側９アミノ酸残基が欠失したものであ
ることが明らかにされている（Kimuraら、FEBS Letter
s、第246巻、第101-104頁、1989年）。α_2U−グロブリ
ンは、肝臓で合成されて血中に放出された後、腎臓を経
由して尿中に排出されるが、興味深いことに、その一部
は腎臓の尿細管細胞内に再吸収され、細胞内でプロセッ
シングを受けて腎型ＦＡＢＰに変換されると考えられて
いる（Kimuraら、1989年）。発明者らは、雄性マウスに
おいても、Ｋ−ＦＡＢＰが近位尿細管に分布しているこ
とを見出している。この他、ラット腎臓には、ごく少量
Ｌ−ＦＡＢＰも存在することが知られているが、ヒトと
は異なって近位尿細管より遠位尿細管に多く分布してい
るとされている（Maatmanら、Biochemical Journal、第
288巻、第285-290頁、1992年）。

【００１８】上記のことから、ゲッ歯類（ラットおよび
マウス）の腎臓組織に由来するＦＡＢＰとしては、Ｈ−
ＦＡＢＰ、Ｌ−ＦＡＢＰ、及びＫ−ＦＡＢＰが挙げられ
る。これらのうちα_2U−グロブリンもしくはこれに由来
するＫ−ＦＡＢＰについて、発明者らは、その発現量が
腎疾患の予後と密接に関連していることを見出してお
り、発現量が多いほど予後は良好であると判断される。
従って、本発明の検査方法をゲッ歯類（ラット及びマウ
ス）に適用する場合には、α_2U−グロブリンもしくはＫ
−ＦＡＢＰを検出する方法を用いることができる。

【００１９】本発明に適用される被検試料としては、腎
組織のほか、尿、血液（血漿又は血清）、腎組織からの
抽出液等が挙げられる。これらのうち、特に腎組織、尿
が好適な被検試料である。腎組織としては、より具体的
には、腎生検等により採取された腎臓組織の切片等が挙
げられる。

【００２０】

【発明の実施の形態】被検試料中のＦＡＢＰ（もしくは
α_2U−グロブリン）の検出は、これと特異的に結合する
抗体を用いる免疫化学的方法により好適に実施できる。

【００２１】抗体は、免疫抗原として、例えば精製した
ＦＡＢＰ（もしくはα_2U−グロブリン）を用いて調製で
きる。

【００２２】ＦＡＢＰの各分子種については、すでにそ
の臓器分布、分子量、一次構造などが報告されている
（藤井ら、動脈硬化、第24巻、第353-361頁、1996年；
Veerkamp and Maatman、Prog.Lipid Res.、第34巻、第
17-52頁、1995年）。また、α_2U−グロブリンについて
も知られている（Drickamerら、J.Biol.Chem.、第256
巻、第3634-3636頁、1981年； UntermanらProc.Natl.A
cad.Sci.USA、第78巻、第3478-3482頁、1981年）。従っ
て精製は、これらの情報をもとに実施できる。

【００２３】ＦＡＢＰは、目的とする分子種のＦＡＢＰ
が分布していると考えられる臓器組織から精製できる。
例えば、Ｌ−ＦＡＢＰであれば、肝臓又は腎臓などか
ら、またＨ−ＦＡＢＰであれば、心臓又は腎臓などから
精製できる。ラット又はマウスのα_2U−グロブリンは、
肝臓、血液、尿から、またＫ−ＦＡＢＰは、腎臓から精
製できる。精製は、Kelvinらの文献（J.Biol.Chem.、第
263巻、第15762-15768頁、1988年）記載の方法などに準
じて実施できる。すなわち、摘出した臓器をホモジナイ
ズした後、超遠心して得られる細胞質画分を、ゲルろ過
および陰イオン交換クロマトグラフィーなどにより分画
し、分子量や脂肪酸結合活性を指標としてＦＡＢＰを含
有する画分を選択して精製する。さらに、SDS−ポリア
クリルアミド電気泳動を行い、精製を加えるか、または
単一バンドとなっていること確認することができる。精
製蛋白質について、アミノ酸組成やN末端側アミノ酸配
列を決定し、報告された組成や配列と比較することによ
り、目的とする分子種であることを確認できる。

【００２４】ＦＡＢＰ（もしくはα_2U−グロブリン）の
脂肪酸結合活性は、例えば、ＡＮＳ（1-anilinonaphtha
lene-8-sulfonic acid）（Polysciences 社製）等の蛍
光プローブを用いて容易に測定できる。これら蛍光プロ
ーブはＦＡＢＰの脂質結合部位など疎水性の高い領域と
結合することにより蛍光強度が上昇する。例えば、ＦＡ
ＢＰを含む溶液にＡＮＳを添加混合した後、蛍光強度
（励起波長372nm；蛍光波長480nm）を測定すればよい。
その他、ＲＩ標識した脂肪酸を用いることによってもＦ
ＡＢＰ（もしくはα_2U−グロブリン）の脂肪酸結合活性
を測定することができる（Kimuraら、FEBS Letters、第
246巻、第101-104頁、1989年)。

【００２５】また、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＨ−ＦＡＢＰに
ついては、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ラット間でホモ
ロジーが高く、アミノ酸レベルで９０％以上であること
が知られているので、ヒトのＬ−ＦＡＢＰと結合する抗
体を得るために、例えばマウスＬ−ＦＡＢＰを抗原とし
て用いることもできる。この場合、抗原の調製が容易で
あるという利点がある。

【００２６】抗原として用いるＦＡＢＰ（もしくはα_2U
−グロブリン）は、天然（例：肝臓、腎臓等の各組織）
由来のものでもよいが、遺伝子工学的手法によって製造
された組換え型蛋白質であってもよい。ＦＡＢＰのアミ
ノ酸配列や遺伝子配列は既に報告されている（Veerkamp
and Maatman、Prog.Lipid Res.、第34巻、第17-52頁、
1995年）ので、例えば、それらをもとにプライマーを設
計し、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法により
適当なｃＤＮＡライブラリ等からｃＤＮＡをクローニン
グし、これを用いて遺伝子組換え技術より、組換えＦＡ
ＢＰを調製することができる。

【００２７】また、抗原として、ＦＡＢＰの断片、また
はその部分配列を有する合成ペプチド等を、必要に応じ
てキャリア高分子物質（牛血清アルブミン、ヘモシアニ
ン等）と結合させて用いることもできる。

【００２８】ＦＡＢＰもしくはα_2U−グロブリンと特異
的に結合する抗体は、抗血清、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体等いずれであってもよい。

【００２９】抗体は、高い特異性を有するものが好まし
く、例えば、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体であれば、Ｈ−ＦＡＢ
Ｐとは実質的に交差反応しないことが望ましい。より特
異性の高い抗体を取得するためには、より高度に精製さ
れ純度の高い抗原を用いることが望ましい。

【００３０】抗体の調製に際しては、温血動物に、前記
のごとく調製した精製抗原（例えば精製ＦＡＢＰ等）を
接種して免疫する。免疫する温血動物としては、哺乳動
物（ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモット、ウ
マ、ブタなど）、鳥類（ニワトリ、アヒル、ガチョウな
ど）が挙げられる。ウサギの場合、例えば、抗原100μg
〜１mg程度を約1mlの生理食塩水及びフロイントの完全
アジュバント中に乳化したものを、背部又は後肢掌皮下
に接種し、２回目以降はアジュバントをフロイントの不
完全アジュバントにかえて、これを２〜４週間おきに３
〜８回接種して免疫し、最終接種の約７〜12日後に使用
する。マウスの場合、１回あたり10〜30μg／匹の抗原
を、通常、皮下、腹腔内、静脈内に、約２週間隔で３〜
８回接種して免疫し、最終接種の約２〜４日後に使用す
る。

【００３１】ポリクローナル抗体は、前記のように免疫
した動物から採血し、血清（抗血清）を分取して、得ら
れた抗血清からＩｇ画分を回収して調製できる。例え
ば、抗血清からProtein Gカラムを用いるアフィニティ
ークロマトグラフィーなどによりＩｇＧ画分を回収して
ポリクローナルＩｇＧを得ることができる。

【００３２】モノクローナル抗体は、免疫動物から採取
した抗体産生細胞を、不死化細胞と融合させて得られる
ハイブリドーマにより産生される。モノクローナル抗体
のための免疫動物としてはマウス及びラットが好適に用
いられる。ハイブリドーマの作製は、ケーラーおよびミ
ルシュタインの方法（Kohler & Milstein、Nature、第2
56巻、第495〜897頁、1975年）に準じて以下のように実
施できる。前記のように免疫した動物から抗体産生細胞
（例えば脾細胞又はリンパ節細胞など）を採取し、これ
を適当な不死化細胞と細胞融合させる。不死化細胞とし
ては、例えば骨髄腫細胞の細胞株（NSI-Ag4/1、Sp2/O-A
gl4など）が好適に用いられる。骨髄腫細胞は、それ自
身が抗体又は免疫グロブリンのＨ鎖又はＬ鎖を産生しな
い非分泌型であることが好ましい。また、未融合の骨髄
腫細胞と融合したハイブリドーマとを選択培地中で選別
し得るような選択マーカーを有していることが好まし
い。例えば選択マーカーとして、８−アザグアニン耐性
（ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランス
フェラーゼ欠損）、チミジンキナーゼ欠損等を有する細
胞株がよく使用される。

【００３３】細胞融合は、ポリエチレングリコールなど
適当な融合促進剤を添加して行う。細胞融合は、不死化
細胞当たり約１０の抗体産生細胞の比率で行うことが好
ましく、またおよそ抗体産生細胞１０⁶個／mlの細胞密
度で好適に実施できる。

【００３４】融合処理した細胞を、適当に希釈した後、
選択培地中で１〜２週間培養する。例えば、８−アザグ
アニンに耐性の骨髄腫細胞を用いる場合、ＨＡＴ（ヒポ
キサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地中で培養
すると、未融合骨髄腫細胞は死滅し、また未融合の抗体
産生細胞も分裂サイクルが限られているため死滅する
が、融合細胞だけは選択培地中で分裂を続け生存でき
る。

【００３５】選択培地中での培養後、その上清について
例えばエンザイムイムノアッセイを行って目的とする抗
体の有無を検出し、限界希釈法によってクローニングす
ることにより、目的抗原を認識するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを選択できる。選択に際して
は、抗体価、抗体のクラス、サブクラス、抗原との親和
性、特異性、エピトープなど好適な性質を有するハイブ
リドーマ（モノクローナル抗体）を選択できる。モノク
ローナル抗体のクラスとしては一般にＩｇＧが好まし
い。

【００３６】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
は、例えば免疫に使用した動物の腹腔内に移植し、一定
期間後腹水を採取し、それから目的のモノクローナル抗
体を単離することができる。あるいは、ハイブリドーマ
を適当な動物細胞培養用の培地中で培養し、その培養液
からモノクローナル抗体を単離することもできる。ま
た、一旦目的のハイブリドーマを得たら、これからモノ
クローナル抗体をコードする遺伝子を取得し、通常の遺
伝子組換え技術により適当な宿主中で目的のモノクロー
ナル抗体を発現させ産生させることができる。

【００３７】抗体の分離・精製は、例えば、硫酸アンモ
ニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等
を必要に応じて組合せた通常の精製法に従って行うこと
ができる。

【００３８】上記のようにして得られた抗体を用いて、
免疫化学的方法により、被検試料中のＦＡＢＰ（もしく
はα_2U−グロブリン）（抗原）を検出できる。

【００３９】被検試料が組織切片の場合、抗原（ＦＡＢ
Ｐもしくはα_2U−グロブリン）の検出は、公知の免疫組
織染色法により実施できる。例えば、採取した腎組織か
ら、パラフィン包埋切片を作製した後、脱パラフィン
し、固定した後、一次抗体と反応させる。これを洗浄
後、ペルオキシダーゼなどの酵素で標識した二次抗体と
反応させた後、発色基質などを加えて反応させた後洗浄
する。或いはビオチン標識した二次抗体を用い、二次反
応後ビオチン標識した酵素をストレプトアビジンととも
に加え、発色基質などを加えて反応させてもよい。

【００４０】また、被検試料が、尿、血液（血漿又は血
清）、腎組織からの抽出液などの場合、検出・定量は、
公知のラジオイムノアッセイ（RIA）、エンザイムイム
ノアッセイ（EIA）、ケミルミネッセントイムノアッセ
イ、フルオロイムノアッセイ等の方法を採用して実施で
きる。より具体的には、例えば、抗体と標識抗原を用い
る競合法、抗原に対する認識部位が異なる二種類のモノ
クローナル抗体又はポリクローナル抗体（もしくはモノ
クローナル抗体とポリクローナル抗体）を組合せて用い
るサンドイッチEIA法等が挙げられる。これらアッセイ
法においては、必要に応じて、抗原又は抗体を適当な担
体（ゲル粒子、セルロース粒子、ポリアクリルアミドゲ
ル、物理的吸着剤（ガラス、スチレン系樹脂）など）上
に保持する。例えば抗原又は抗体をポリスチレン製のプ
レートやビーズ等の固相に吸着させて用いる固相法がよ
く採用される。また、検出のためには、例えばウエスタ
ンブロッティング法を採用することもできる。

【００４１】上記のような免疫化学的方法において、抗
体や抗原は必要に応じて標識したものが使用される。こ
のような標識としては、放射性同位元素（¹²⁴Ｉ、
¹⁴Ｃ、³Ｈ）の他、酵素（ぺルオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ等）、発光物質（アクリジニウムエステ
ル、イソルミノール、ルシフェリン等）、蛍光物質（フ
ルオレッセインイソチオシアネート等）等が挙げられ
る。このほか、ビオチン標識とストレプトアビジンを組
合せて用いる方法も採用できる。

【００４２】上記のような免疫化学的方法のほか、被検
試料中のＦＡＢＰ（もしくはα_2U−グロブリン）を検出
するためのより簡便法として、例えば、前記のようにＡ
ＮＳ（1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid）等の蛍
光プローブを用い、脂肪酸結合活性を指標として検出す
ることも可能である。ただし、ＡＮＳは生体試料中に非
常に多量に存在するアルブミンと強く結合するため、被
検試料によっては前処理によりアルブミンを除去した後
で用いる必要がある。

【００４３】本発明の検査方法のための検査用試薬とし
ては、例えば、抗ＦＡＢＰ抗体（ＦＡＢＰと特異的に結
合する抗体）及びその標識物などが挙げられる。抗ＦＡ
ＢＰ抗体としては、抗Ｌ−ＦＡＢＰ抗体、抗Ｈ−ＦＡＢ
Ｐ抗体、抗Ｋ−ＦＡＢＰ抗体が挙げられ、とりわけ抗Ｌ
−ＦＡＢＰ抗体が好適である。抗体の標識物としては、
ペルオキシダーゼ等の酵素が結合された抗体（酵素標識
抗体）、ビオチン化された抗体（ビオチン標識抗体）な
どが挙げられる。

【００４４】検査用キットとしては、例えば、ビーズや
プレート（96穴マイクロプレート等）等の担体上に抗Ｆ
ＡＢＰ抗体を、吸着／結合させたものが挙げられる。ま
た、キットには、その他ＥＩＡ等に必要となる試薬（酵
素標識した二次抗体や発色基質など）が組合されて、含
まれていてもよい。

【００４５】本検査方法の結果の解析方法については以
下の通りである。

【００４６】ヒトなどゲッシ類以外の場合、腎組織の試
料中におけるＬ−ＦＡＢＰの発現が正常腎と比較して低
ければ、その度合いに応じて、予後不良であるリスクが
高いと判断できる。また、Ｌ−ＦＡＢＰは近位尿細管に
局在しているので、特に近位尿細管における発現に着目
することが望ましいと考えられる。

【００４７】一方、尿中、血液中のＦＡＢＰの検査結果
を解析する場合、腎疾患に起因する腎組織傷害に伴って
尿中に腎組織由来の蛋白質が漏出するため、これを考慮
する必要がある。すなわち、腎組織傷害とパラレルな関
係にあると考えられる適当な対照マーカーを設定し、尿
中の対照マーカーの量に対するＬ−ＦＡＢＰ量の比（Ｌ
−ＦＡＢＰの相対量）を指標とすることができる。Ｌ−
ＦＡＢＰの相対量が、例えば予後良好であった症例と比
較して低ければ、その度合いに応じて、予後不良である
リスクが高いと判断できる。

【００４８】ラットやマウスの場合は、腎組織における
Ｋ−ＦＡＢＰの発現が正常腎と比較して低ければ、その
度合いに応じて、予後不良であるリスクが高いと判断で
きる。Ｋ−ＦＡＢＰもまた、ヒトにおけるＬ−ＦＡＢＰ
と同様、近位尿細管に局在しているので、特に近位尿細
管における発現に着目することが望ましいと考えられ
る。また、雄では、尿中のα_2U−グロブリンの量が、正
常固体の尿と比較して低ければ、その度合いに応じて、
予後不良であるリスクが高いと判断できる。

【００４９】本発明の検査方法を実施する際には、被検
試料における検査結果を、対照試料における検出結果と
比較することにより、より正確に腎疾患の予後等の診断
を行うことができる。対照試料としては、正常な腎臓組
織を有する動物から採取した試料、例えば正常な腎組
織、尿などが挙げられる。

【００５０】あるいはまた、同じ腎疾患であっても他の
症状又は経過を示す症例、同じ症状であってもステージ
の異なる症例などを対照としてとり、これらから採取し
た試料を対照試料として、被検試料における検査結果と
比較することができる。

【００５１】また、同じ症例であっても試料採取の時期
の異なる被検試料における検査結果を比較して、経時的
変化を調べて今後の経過を予測したり、薬物等の治療効
果を調べることもできる。

【００５２】

【実施例】実施例１ヒト腎組織のＦＡＢＰと結合する
抗体の調製（Ｉ）（抗マウスＦＡＢＰ抗体の調製）（１）抗マウスＬ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体ヒトの近位尿細管に存在するＦＡＢＰは、主として肝臓
型ＦＡＢＰ（Ｌ−ＦＡＢＰ）であることが知られてい
る。ヒトとマウスのＬ−ＦＡＢＰではホモロジーが高い
ので、ヒト腎組織中のＬ−ＦＡＢＰと結合する抗体とし
て、抗マウスＬ−ＦＡＢＰ抗体を用いることができる。

【００５３】そこで、抗マウスＬ−ＦＡＢＰポリクロー
ナル抗体を調製した。抗原とするマウスＬ−ＦＡＢＰ
は、Takahashiらの文献（Eur.J.Biochem.、第136巻、第
589-601頁、1983年）記載の方法に準じて以下のように
調製した。すなわち、脱血死させたマウスから摘出した
肝臓に４倍量の30mM Tris-HCl 緩衝液（pH8）を加え、
ポリトロン型ホモジナイザーで処理した。これを遠心分
離（8000rpm、15分）し、上清をさらに超遠心（100,000
ｘｇ、９０分）して、細胞質画分を得た。これをゲルろ
過カラム（Sephacryl S-100HR、ファルマシア社製）を
用いて分画し、ＡＮＳ（1-anilinonaphthalene-8-sulfo
nic acid）（Polysciences社製）との結合活性を指標と
して、脂肪酸結合活性を示す画分を回収した。得られ
た分子量10〜20 キロダルトンの画分を、10mM Tris-Hcl
緩衝液（pH8.5）で透析した後、陰イオン交換カラム（H
iTrap Q、ファルマシア社製）を用いて500mM NaClまで
の直線的濃度勾配で溶出し、ＡＮＳ結合活性を示す画分
を回収した。さらに再度前記と同様にしてゲルろ過カラ
ム（Sephacryl S-100HR、ファルマシア社製）を用いて
分画して、得られた各画分についてSDS−ポリアクリル
アミド電気泳動を行い、約１４キロダルトンの単一のバ
ンドが認められた画分を回収して、精製マウスＬ−ＦＡ
ＢＰを得た。

【００５４】前記で得られた精製マウスＬ−ＦＡＢＰを
抗原として用い、以下のようにしてウサギを免疫し、抗
マウスＬ−ＦＡＢＰ抗体を得た。すなわち、精製マウス
Ｌ−ＦＡＢＰ（200μｇ／430μｌ）にフロイント完全ア
ジュバンド（470μｌ）を加えてエマルジョンを調製
し、これをウサギの背部皮下５カ所及び大腿部４カ所に
100μｌずつ注射した。４週間後にアジュバンドをフロ
イント不完全アジュバンドに変えて同量の追加免疫を行
い、以後２週間後に100μｇ、さらにその２週間後に50
μｇと合計４回免疫を行った。最終免疫の１週間後に心
臓採血にて血液を採取し、血清を分離して抗血清を得
た。得られた抗血清から、HiTrap proteinGカラム（フ
ァルマシア社製）を用いてＩｇＧ画分を精製し、抗マウ
スＬ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体（ＩｇＧ）を得た。
得られた抗マウスＬ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体を用
いてウエスタンブロッティングを行った結果、この抗マ
ウスＬ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体は、後記実施例２
と同様にして調製した組換えヒトＬ−ＦＡＢＰと結合す
ることが確認できた。また、この抗マウスＬ−ＦＡＢＰ
ポリクローナル抗体は、精製マウスＨ−ＦＡＢＰと交差
反応しなかった。

【００５５】（２）抗マウスＨ−ＦＡＢＰポリクローナ
ル抗体ヒトの遠位尿細管では、心臓型ＦＡＢＰ（Ｈ−ＦＡＢ
Ｐ）が存在していることが知られている。Ｈ−ＦＡＢＰ
もまたヒトとマウスとの間のホモロジーが高いので、ヒ
ト腎組織中のＨ−ＦＡＢＰと結合する抗体として、抗マ
ウスＨ−ＦＡＢＰ抗体を用いることとし、前項（１）記
載の方法に準じて、マウス心臓からＨ−ＦＡＢＰを精製
し、抗マウスＨ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体（Ｉｇ
Ｇ）を取得した。

【００５６】得られた抗マウスＨ−ＦＡＢＰポリクロー
ナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結
果、この抗マウスＨ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体は、
マウスＨ−ＦＡＢＰとは結合したが、精製マウスＬ−Ｆ
ＡＢＰ及び組換えヒトＬ−ＦＡＢＰとは交差反応しなか
った。

【００５７】実施例２ヒト腎組織のＦＡＢＰと結合す
る抗体の調製（ＩＩ）（抗ヒトＬ−ＦＡＢＰ抗体の調製）（１）組換えヒトＬ−ＦＡＢＰの精製ヒトＬ−ＦＡＢＰのｃＤＮＡを、ヒト肝臓由来のcDNAラ
イブラリー（クロンテック社製、Cat#HL1115b LOT#562
1）からＰＣＲ（polymerase chain reaction）法によっ
て取得した。プライマーはＤＮＡ合成機で合成した２３
〜２７マーのオリゴヌクレオチドを用いた。プライマー
の塩基配列は、Loweらの文献（J.Biol.Chem.、第260
巻、第3413-3417頁、1985年）及び遺伝子データベース
（Genbankの登録番号M10617）に記載されたヒトＬ−Ｆ
ＡＢＰの遺伝子配列を元にし、プライマーの末端には発
現ベクターに挿入するための制限酵素認識部位を付加さ
れるように設計した。得られたＤＮＡ断片（約420塩基
対）は、開始コドンの前にBamHI認識部位、終止コドン
の後にBamHI認識部位を有しており、目的とする完全長
のヒトＬ−ＦＡＢＰをコードしていた。

【００５８】前記で得られたヒトＬ−ＦＡＢＰをコード
するＤＮＡ断片を制限酵素BamHIで消化し、融合蛋白質
発現用ベクタープラスミドｐＭＡＬ−ｃＲＩ（New Engl
andBiolabs社製）のBamHI切断部位に挿入して、組換え
ヒトＬ−ＦＡＢＰ融合蛋白質発現のためのプラスミドｐ
ＭＡＬ／Ｌ−ＦＡＢＰを得た。ｐＭＡＬ／Ｌ−ＦＡＢＰ
は、ベクターに由来するＭＢＰ（maltose binding prot
ein）のコーディング配列とジャンクション配列に続い
て、ヒトＬ−ＦＡＢＰｃＤＮＡが正方向に挿入されてお
り、ＭＢＰ、ジャンクション配列及びヒトＬ−ＦＡＢＰ
からなる融合蛋白質をコードしている。

【００５９】このプラスミドｐＭＡＬ／Ｌ−ＦＡＢＰを
市販の形質転換用宿主大腸菌ＪＭ１０９株（Yanisch-Pe
rron.C.ら、Gene、第33巻、第103-119頁、1985年）（東
洋紡績（株）社製）に導入し、アンピシリン耐性となっ
た形質転換株を、IPTG（isopropyl-β-D-thiogalalctos
ide）を途中添加したＬＢ培地中にて培養した。

【００６０】得られた菌体を超音波破砕し、菌体抽出液
を5mM Tris-HCl pH8.5で透析した。これを陰イオン交換
カラム（RESOURCE Q 6ml、ファルマシア社製）を用い
て、300mM NaClまでの直線的濃度勾配で溶出して分画
し、ＡＮＳ結合活性を示す画分を回収した。これをセン
トリプレップ（アミコン社製）で限外ろ過して濃縮した
後、ゲルろ過カラム（Superdex75pg、ファルマシア社
製）を用いて分画し、ＡＮＳ結合活性を示す画分を、ヒ
トＬ−ＦＡＢＰ融合蛋白質として回収した。このヒトＬ
−ＦＡＢＰ融合蛋白質に、Factor Xa（New England Bio
labs社製）を重量比で１／１００量加え、室温で一晩反
応させて、酵素的に限定分解した。酵素処理後の反応液
を再度ゲルろ過で分離し、ＡＮＳ結合活性を示す約14キ
ロダルトンの画分を、組換えヒトＬ−ＦＡＢＰとして回
収した。得られた精製蛋白質をSDS−ポリアクリルアミ
ド電気泳動に供し、シルバー染色したところ、単一バン
ドとなっていた。

【００６１】かくして得られた精製組換えヒトＬ−ＦＡ
ＢＰについて、アミノ酸シークエンサーでアミノ酸配列
を調べた。その結果、そのＮ末端アミノ酸配列には、ベ
クターのジャンクション配列に由来する６アミノ酸残基
（Ile Ser Glu Phe Gly Ser）の配列に続いて、既報の
ヒトＬ−ＦＡＢＰのＮ末端領域と一致する１４アミノ酸
残基の配列が存在することが確認できた。

【００６２】（２）抗ヒトＬ−ＦＡＢＰポリクローナル
抗体の調製前項（１）で得られた精製組換えヒトＬ−ＦＡＢＰを抗
原として用い、前記実施例１の（１）項記載の方法と同
様にしてウサギを免疫し、抗ヒトＬ−ＦＡＢＰ抗血清か
ら抗ヒトＬ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体（ＩｇＧ）を
得る。

【００６３】実施例３ヒト腎組織（正常腎組織）にお
けるＦＡＢＰの局在正常なヒト腎臓組織について、ＦＡＢＰの免疫組織染色
を行った。ヒト腎臓組織は、腎癌患者から摘出された腎
臓の中の正常な組織部位を用いた。Ｌ−ＦＡＢＰの染色
のための一次抗体としては、前記実施例１の（１）と同
様にして調製した抗マウスＬ−ＦＡＢＰポリクローナル
抗体（ＩｇＧ）を用い、Ｈ−ＦＡＢＰの染色のための一
次抗体としては、前記実施例１の（２）と同様にして調
製した抗マウスＨ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体（Ｉｇ
Ｇ）を用いた。免疫染色は、ベクタステインABC キット
（ベクターラボラトリー社製）を用いて行い、二次抗体
はビオチン標識抗ウサギＩｇＧを用い、酵素はビオチン
標識ワサビペルオキシダーゼを、発色基質はＤＡＢ
（３，３’−ジアミノベンシジン四塩酸塩）を各々用
いた。

【００６４】その結果、図１に示したように、抗Ｌ−Ｆ
ＡＢＰ抗体を用いた場合、近位尿細管が染色された。一
方、抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体を用いた場合、主に遠位尿細管
が染色され、近位尿細管においても弱い染色が認められ
た。糸球体はいずれの抗体を用いても染色されなかっ
た。

【００６５】これらのことから、正常腎組織において、
Ｌ−ＦＡＢＰは近位尿細管に存在し、Ｈ−ＦＡＢＰは主
として遠位尿細管に存在することが確認できた。

【００６６】実施例４腎疾患患者の腎組織におけるＦ
ＡＢＰの検出ＩｇＡ腎症と診断され、ステロイド治療に対し抵抗性を
示した２名の患者（患者１及び患者２）から腎生検によ
り採取された腎組織サンプルについて、Ｌ−ＦＡＢＰの
免疫組織染色を行った。患者１は予後不良であり、腎生
検から５年後に腎不全に陥り人工透析が必要となった症
例である。一方、患者２は予後良好であり、腎生検後寛
解した症例である。

【００６７】免疫組織染色は、前記実施例３と同様にし
て、一次抗体として抗マウスＬ−ＦＡＢＰポリクローナ
ル抗体（ＩｇＧ）を用いて行った。その結果、図２に示
したように、患者２の腎組織では近位尿細管が全体的に
染色されており、Ｌ−ＦＡＢＰの発現が明確に認められ
た。これに対し、患者１の腎組織では染色性が顕著に落
ちており、Ｌ−ＦＡＢＰの発現がほとんど認められなか
った。

【００６８】これらの結果から、腎組織におけるＬ−Ｆ
ＡＢＰの発現量と腎疾患の予後の良好性とは相関関係が
あり、腎組織中のＬ−ＦＡＢＰを検出することにより、
腎疾患の予後不良のリスクを診断することが可能である
ことがわかる。

【００６９】実施例５腎疾患患者の尿中のＦＡＢＰの
検出腎疾患患者（３４例）から採取した尿サンプルについ
て、尿中に漏出しているＬ−ＦＡＢＰ量をサンドイッチ
ＥＬＩＳＡ法により以下のように測定した。すなわち、
予め抗マウスＬ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体（Ｉｇ
Ｇ）をプレートに固相化し、尿サンプルを加え、一定時
間静置後洗浄した。これに、ビオチンで標識した抗マウ
スＬ−ＦＡＢＰポリクローナル抗体（ＩｇＧ）を加え、
洗浄後、市販のアビジン−ビオチン検出キット（フナコ
シ社製、 ABC-PO kit ）を用いて検出を行い吸光度を測
定した。

【００７０】また、同尿サンプルについて、漏出ＮＡＧ
（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ）の量も
測定した。ＮＡＧは腎組織細胞中に存在するマーカー酵
素であり、尿中に漏出したＮＡＧ量は一般的に腎組織の
傷害の指標とされている。尿中のＮＡＧ量は、文献（日
本臨床、第43巻、秋季臨時増刊号、第234-236頁、1985
年）記載の方法に準じて測定した。

【００７１】各サンプルの測定結果について解析するた
め、縦横各座標軸に各々Ｌ−ＦＡＢＰ量及びＮＡＧ量を
とってグラフにプロットした。その結果、一般的な症例
では、漏出ＮＡＧ量と漏出Ｌ−ＦＡＢＰ量の値には正の
相関が見られた。しかし、いくつかの症例（典型例約５
例）を含むグループでは、漏出ＮＡＧ量が高い（すなわ
ち組織傷害は大きい）のにもかかわらず、漏出Ｌ−ＦＡ
ＢＰ量は低値を示していた。このグループでは、腎組織
中におけるＬ−ＦＡＢＰの発現量が低いと考えられ、従
ってこのグループは予後不良のリスクの高いグループで
あることが考えられる。

【００７２】実施例６ウサギ腎組織由来のＦＡＢＰの
精製ウサギを脱血死させた後摘出した腎臓から、前記実施例
１の（１）項記載の方法に準じてＦＡＢＰを精製し
た。すなわち、腎臓をホモジナイズした後、遠心分離及
び超遠心により得られた細胞質分画について、ゲル濾過
カラム（Superdex75pg、ファルマシア社製）を用いて分
画し、ＡＮＳ結合活性を指標として分子量10〜20キロダ
ルトンのフラクションを回収した。これを30mM Tris-HC
l（pH 7.5）で透析した後、陰イオン交換カラム（RESOU
RCE Q、ファルマシア社製）を用いて300mM NaClまでの
直線的濃度勾配で溶出し、ＡＮＳ結合活性を示す画分を
ＦＡＢＰとして回収した。NaCl濃度0mMおよび60mMにＡ
ＮＳ結合活性を示すピークが見られた。

【００７３】前記実施例１で得られた抗マウスＬ−ＦＡ
ＢＰ抗体ならびに抗マウスＨ−ＦＡＢＰ抗体を用いて、
ウエスタンブロッティングを行った。その結果、NaCl濃
度0mMのピークに含まれる蛋白質は、抗マウスＬ−ＦＡ
ＢＰ抗体と交差反応し、ウサギＬ−ＦＡＢＰであると考
えられた。また、NaCl濃度60mMのピークに含まれる蛋白
質は抗マウスＨ−ＦＡＢＰ抗体と交差反応し、ウサギＨ
−ＦＡＢＰであると考えられた。また、これらのことか
ら、ウサギ腎臓組織には、ヒト腎臓組織と同様に、Ｌ−
ＦＡＢＰとＨ−ＦＡＢＰの少なくとも二種類のＦＡＢＰ
が存在することがわかった。

【００７４】実施例７腎炎モデルマウスにおける解析（１）腎炎モデルマウスの作製加速型抗ＧＢＭ腎炎モデルマウスの作製を、Nagaiらの
文献（Jpn.J.Pharmacol.、第32巻、第1117-1124頁、198
2年）記載の方法に準じ、以下のようにして行った。マ
ウスの糸球体基底膜（ＧＢＭ：glomular basal membran
e）を抗原としてウサギを免疫し、抗血清（ＮＴＳ：nep
hrotoxic serum）を調製した。得られたＮＴＳを、マウ
スに投与し、抗ＧＢＭ腎炎モデルマウスを作製した。Ｇ
ＢＭの調製は、Nagaiらの文献（Jpn.J.Pharmacol.、第3
2巻、第1117-1124頁、1982年）記載の方法に準じて行っ
た。

【００７５】（２）腎炎モデルマウスの尿中蛋白質の解
析上記（１）項にて作製した加速型抗ＧＢＭ腎炎モデルマ
ウス及び正常マウスの尿について、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行いシルバー染色して、尿中蛋
白質を比較した。その結果は図３に示す通りであり、腎
炎モデルマウスでは、ＮＴＳ投与後７日目で既に、分子
量６７キロダルトン付近のメインバンド（アルブミンと
考えられる）を含む多数の濃い蛋白質バンドが見られ、
いわゆる高度蛋白尿の症状が認められた。また、正常マ
ウスにおいては、約１７キロダルトンの明瞭なバンドが
見られたのに対して、腎炎モデルマウスでは、これが著
名に減少しているのが観察された。

【００７６】尿中蛋白質のほとんどは、血清中の蛋白質
が糸球体基底膜のバリアーを越えて漏出してきたもので
ある。しかし、この蛋白質のように、高度蛋白質尿の状
態で逆に正常状態での尿中存在量より存在量が減少する
ということは、この蛋白質が、単なる漏出蛋白ではな
く、腎機能異常との関係において何か特別な役割を担っ
ていると考えられる。

【００７７】次に、以下のようにして、この約１７キロ
ダルトンの蛋白質を精製した。すなわち、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行いクマシーブリリアン
トブルーで染色したゲルから、約１７キロダルトンのバ
ンドを切り出し、そのゲル片を透析膜に入れた。水平型
電気泳動装置を用いて、染色されたバンドがゲルから完
全に抜けるまで泳動し、溶出液を回収し、限外濾過にて
濃縮した。

【００７８】得られた精製蛋白質について、アミノ酸シ
ークエンサーを用いて、Ｎ末端側アミノ酸配列の決定を
行った。決定した１５残基の配列をもとに、既知蛋白質
のアミノ酸配列とのホモロジー検索を行ったところ、こ
の蛋白質はα_2U−グロブリン（Major Urinary Protein
とも称される）（データベース名：SWISS-PROT、登録番
号：P02762）と相同であった。

【００７９】α_2U−グロブリンは、雄性ラット、マウス
に特異的な主要尿中蛋白質として知られている。α_2U−
グロブリンは、肝臓で合成されて血中に放出された後、
腎臓を経由して尿中に排出されるが、その際一部が腎臓
の尿細管細胞内に再吸収され、細胞内でプロセッシング
を受けて腎型ＦＡＢＰ（Ｋ−ＦＡＢＰ）に変換されると
考えられている。

【００８０】（３）腎炎モデルマウスの腎組織における
ＦＡＢＰ（Ｋ−ＦＡＢＰ）の検出加速型抗ＧＢＭ腎炎モデルマウスについて、腎組織での
Ｋ−ＦＡＢＰの増減と腎組織傷害との関係を、免疫組織
染色を用いて解析した。

【００８１】ラットにおいて、α_2U−グロブリン（180
アミノ酸残基、約20キロダルトン）の少なくともＮ末端
側９アミノ酸残基が欠失してＫ−ＦＡＢＰ（約15キロダ
ルトン）となることが知られている。

【００８２】そこで、Ｋ−ＦＡＢＰの免疫染色に用いる
抗体としては、市販のヤギ抗マウスα_2U−グロブリン抗
血清（ノルディック社製、Anti Major Urinary Protein
Ab）を用いた。

【００８３】腎組織におけるＫ−ＦＡＢＰの免疫組織染
色は、ベクタステインABC キット（ベクターラボラトリ
ー社製）を用い、以下のように行った。すなわち、マウ
ス腎臓から厚さ３μｍの腎臓パラフィン切片を調製した
後、脱パラフィン操作を行った。これを、０．０５％Tw
een２０を含む生理的リン酸緩衝液（pH7.4）（以下、Ｐ
ＢＳＴ）にて軽く洗浄した後、0.5% 過酸化水素を含む
メタノール中にて３０分間固定し、ＰＢＳＴで軽く洗浄
した後、マーキングを行った。これをＰＢＳＴで洗浄
（５分ｘ２回）した後、正常ヤギ血清を含むＰＢＳ中６
０分間ブロッキングを行い、さらに、一次抗体として抗
マウスα_2U−グロブリン抗血清を含むＰＢＳ中にて一夜
反応させた。これをＰＢＳＴで洗浄（５分ｘ３回、以下
同様）した後、二次抗体としてビオチン標識した抗ウ
サギIgG抗体（ベクターラボラトリー社製）を含むＰＢ
Ｓ中にて４５分間反応させた。これをＰＢＳＴで洗浄し
た後、ストレプトアビジンとビオチン標識ペルオキシダ
ーゼを含む溶液（ベクターラボラトリー社製）中４５分
間反応させ、再度ＰＢＳＴで洗浄した後、発色基質ＤＡ
ＢとＨ₂Ｏ₂を含むＰＢＳＴ中で発色させた。これを適
宜、検鏡し、蒸留水による水洗にて反応を停止した。

【００８４】前記のようにして免疫染色した組織切片を
さらに、ヘマトキシリン染色して、核を染色した。蒸留
水で洗浄後、常法により脱水、透徹および封入を行っ
た。

【００８５】膠原線維を染色するアザン染色は、前記と
同様にして調製したマウス腎臓パラフィン切片につい
て、Ishikawaらの文献（Medical Technology、第19巻、
第176-177頁、1991年）記載の方法に準じ、以下のよう
にして行った。すなわち、パラフィン切片の脱パラフィ
ン操作を行った後、10%重クロム酸カリウム／10%トリク
ロル酢酸等量混合液中にて、２０分間媒染し蒸留水水
洗（５分間）した後、０．８％オレンジＧ水溶液中１０
分間浸漬した。蒸留水水洗（約１０秒間、以下同様）の
後、アゾカルミンＧ液中６０分間浸漬し、蒸留水水洗の
後、アニリン・アルコール中で３秒間浸漬して分別し
た。蒸留水水洗した後、酢酸アルコール中で１分間処理
し、蒸留水水洗した後、さらに２．５％リンタングステ
ン酸溶液中２０分間処理した。これを蒸留水水洗した
後、アニリン青／オレンジＧ混合液中で２０〜６０分
間、鏡検しながら染色した。染色後水洗し、脱水、透徹
および封入を行った。

【００８６】前項（１）及び（２）と同様にして作製
し、尿中蛋白質を解析した加速型抗ＧＢＭ腎炎モデルマ
ウス及び正常マウスの腎臓組織切片について、Ｋ−ＦＡ
ＢＰの免疫染色を行った。その結果、図４に示した通
り、正常マウスの腎組織の近位尿細管において、抗α_2U
−グロブリン抗体によって認識される蛋白質の存在が明
確に認められ、これはα_2U−グロブリンから生成された
Ｋ−ＦＡＢＰであると考えられた。一方、尿中でα_2U−
グロブリンが減少しているＮＴＳ投与後４２日目のマウ
スでは、この腎組織近位尿細管のＫ−ＦＡＢＰも正常マ
ウスと比べて顕著に減少していた。

【００８７】また、間質線維化の進行度をみるために同
様の腎組織切片についてアザン染色を行ったところ、近
位尿細管のＫ−ＦＡＢＰ減少が確認されたＮＴＳ投与後
４２日目のマウスでは、線維化部位はわずかに見られる
だけであったが、８４日目では線維化部位が著明に増大
していた。

【００８８】これらの結果から、尿中α_2U−グロブリン
の減少、及び腎組織中のＫ−ＦＡＢＰの減少は、間質線
維化に先行して起こり、腎障害の予後を予知するための
指標となることがわかった。

【００８９】また、尿中でα_2U−グロブリンが減少して
いる腎炎マウスでＫ−ＦＡＢＰも減少していたことか
ら、尿中のα_2U−グロブリンの減少は、近位尿細管での
再吸収の亢進によるものではなく、肝臓でのα_2U−グロ
ブリン産生が抑制されているのではないかと考えられ
た。

【００９０】

【発明の効果】本発明の方法によれば、従来困難であっ
た腎疾患の予後等の診断のために、非常に有用な情報と
なる検査結果を得ることができる。従って本発明の方法
によって得られる検査結果をもとに、予後に関するリス
クに応じた適切な治療方法を選択することも可能とな
る。また、本発明の方法は、腎組織サンプルの他、尿サ
ンプルにも適用することが可能なので、簡便で効率よく
検査を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】正常ヒト腎組織におけるＦＡＢＰの免疫染色
結果を示した組織切片の写真。

【図２】ＩｇＡ腎症患者の腎組織におけるＬ−ＦＡＢ
Ｐの免疫染色結果を示した組織切片の写真。

【図３】正常及び腎炎マウスにおける尿中蛋白質の解
析結果を示したＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の
写真。

【図４】正常及び腎炎マウスの腎組織におけるＫ−Ｆ
ＡＢＰの免疫染色結果を示した組織切片の写真。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者菅谷健兵庫県伊丹市北本町１丁目110−１−３ −601 (72)発明者木村健二郎東京都練馬区谷原５−15−４ (56)参考文献特開平２−275359（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/50 G01N 33/53 G01N 33/68

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトから採取した被検試料中に存在する
肝型脂肪酸結合蛋白質を検出することを特徴とする、腎
疾患の検査方法。
【請求項２】肝型脂肪酸結合蛋白質が、腎臓の近位細
尿管の組織に由来する肝型脂肪酸結合蛋白質である請求
項１記載の検査方法。
【請求項３】被検試料が、腎組織又は尿である請求項
１記載の検査方法。
【請求項４】正常な腎臓組織を有するヒトから採取し
た対照試料における検出結果と被検試料における検出結
果とを比較する工程を含む請求項１記載の検査方法。
【請求項５】肝型脂肪酸結合蛋白質の検出を肝型脂肪
酸結合蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて行う請求
項１記載の検査方法。
【請求項６】肝型脂肪酸結合蛋白質に特異的に結合す
る抗体が、心筋型脂肪酸結合蛋白質と実質的に交差反応
しないものである請求項５記載の検査方法。
【請求項７】請求項１〜６記載の検査方法に使用する
ための検査用試薬又はキット。
【請求項８】肝型脂肪酸結合蛋白質に特異的に結合す
る抗体を含有してなる請求項７記載の検査用試薬又はキ
ット。