KR102431142B1 - L-fabp의 면역학적 측정 방법 및 해당 방법에 사용되는 측정 시약 - Google Patents

L-fabp의 면역학적 측정 방법 및 해당 방법에 사용되는 측정 시약 Download PDF

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Abstract

[과제] 기존의 체외 진단용 의약품과 동등 이상의 검출 감도를 가지며, 또한 양호한 상관성을 갖는, 항L-FABP 항체를 사용한 시료 중의 L-FABP의 면역학적 측정 방법을 제공하는 것.
[해결 수단] 시료 중의 L-FABP(간장형 지방산 결합 단백질)를 항L-FABP 항체에 의해 검출하는 방법이며, 항L-FABP 항체, 및 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 방법에 의해 상기 과제를 해결한다.

Description

L-FABP의 면역학적 측정 방법 및 해당 방법에 사용되는 측정 시약
본 발명은, 항L-FABP 항체를 사용한, L-FABP의 면역학적 측정 방법 및 해당 방법에 사용되는 측정 시약에 관한 것이다.
지방산 결합 단백질(FABP: fatty acid binding protein)은 사이토졸에 존재하고, 지방산과 결합하는 능력을 갖는 분자량 약 14킬로달톤의 단백질군으로, 간장형(L-FABP), 장형(I-FABP), 심근형(H-FABP), 뇌형(B-FABP), 피부형(C-FABP/E-FABP), 지방 세포형(aP2), 말초 신경 세포형(미엘린 P2) 등, 적어도 7개의 분자종이 알려져 있고, 이들은 공통의 선조 유전자로부터 진화된 패밀리인 것으로 생각되고 있다. 각 형태의 FABP는 특이적인 조직 분포를 나타내는 한편, 그 명칭은, 최초에 발견된 조직을 의미하고 있으며, 그 조직에밖에 존재하지 않음을 반드시 의미하지는 않는다. 예를 들어, 인간의 신장 조직 중에서는, 간장형(L-FABP)과 심근형(H-FABP)의 적어도 2종류의 FABP가 발현되고 있으며, 이들 중 L-FABP는 근위요세관에 분포하고, H-FABP는 주로 원위요세관에 분포하고 있다(Maatman 등, Biochemical Journal, 제288권, 제285-290페이지, 1992년; Maatman 등, Biochemical Journal, 제273권, 제759-766페이지, 1991년).
특허문헌 1에는, 신장 조직 중에 있어서의 L-FABP의 발현과 신장 질환의 예후의 관련성에 착안하여, 피검 시료 중에 존재하는, 신장 조직 유래의 지방산 결합 단백질을 검출하는 것을 특징으로 하는, 신장 질환의 검사 방법이 개시되어 있다. 보다 구체적으로는, 항 마우스 L-FABP 폴리클로날 항체를 사용하고, 신장 질환 환자에게서 채취한 오줌을 샘플로 하여, 오줌 중에 누출되어 있는 L-FABP량을 샌드위치 ELISA에 의해 측정한 예가 기재되어 있다. 그러나, 상세한 측정 조건(시료의 처리나 항원 항체 반응의 조건)이나 검출 감도, 측정값 등에 대해서는 기재되어 있지 않다.
또한, 특허문헌 2에서는, 채취한 오줌을 헤민(클로로[3,7,12,17-테트라메틸-8,13-디비닐포르피린-2,18-디프로파노에이토(2-)]철(III), 클로로(포르피리나토)철(III) 착체라고도 불림) 등의 산화 환원 시약으로 처리함으로써, 오줌 중 L-FABP의 면역 반응성이 증강되는 것, 그리고 그 증강 정도(유도 배율)가 클수록, 패혈증 또는 다장기부전 환자의 예후가 불량하다는 지견에 기초하여, 산화 환원 시약에 의한 처리 전후의 오줌에 포함되는 L-FABP를 특이적 항체를 사용한 ELISA로 검출하여, 검출값을 처리 전후에 비교하는 패혈증 또는 다장기부전의 예후 진단 방법이 개시되어 있다.
또한, 특허문헌 3에는, 오줌 시료에 변성제로서, 환원제(글루타티온, 시스테인, 페니실라민 등), 카오트로픽 시약(요소, 구아니딘 등) 및 계면 활성제(n-도데실벤젠술폰산나트륨 등)를 포함하는 화합물의 1종 또는 2종을 첨가하고, 오줌 시료를 이들 화합물을 사용하여 전처리함으로써 면역 측정의 감도, 즉 측정 대상물인 오줌 중의 단백질의 측정 감도를 향상시키는 방법이 개시되어 있으며, 오줌 중의 단백질의 일례로서, L-FABP가 예시되어 있다. 그러나, 오줌 중의 단백질의 측정 방법의 구체적인 예로서는, 메갈린을 변성제 처리하고, 상이한 2개의 에피토프를 인식하는 항인간 메갈린 LBD1 모노클로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA로 검출한 것이 기재되어 있을 뿐이며, L-FABP의 검출에 관한 구체적인 기재는 없다.
한편, 특허문헌 4에는, 피검 시료 중에 존재하는 신장 조직 유래의 L-FABP를, 양자점에 의해 표지된 프로브를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는, 신부전의 검사 방법 및 그의 검사 키트가 개시되어 있다. 당해 문헌에 구체적인 예로서 기재되어 있는 것은, 양자점에 의해 표지된 프로브를 사용한 면역 크로마토그래피이며, 희석 등의 조작을 하지 않은 오줌 시료를 적하하여 면역 크로마토그래피 전개하고, L-FABP와 양자점 표지 모노클로날 항체와의 복합체의 포착량을, 여기광(파장: 350nm)을 조사했을 때의 적색 형광에 의해 육안으로 관찰하고 있다.
일본 특허 공개 평11-242026호 공보 일본 특허 공개 제2011-22000호 공보 일본 특허 공개 제2014-85208호 공보 국제 공개 WO2009/081680호 팸플릿
본 발명자들은, 보다 신속하며 간편한 L-FABP의 측정 방법을 개발하기 위해, 라텍스 면역 비탁법(이하, LTIA라 하는 경우가 있음)에 의한 L-FABP의 검출을 시도하였다. 그리고, 제1 시약으로서 완충액, 제2 시약으로서 항L-FABP 항체 고정화 라텍스 입자를 포함하는 완충액을 포함하는 일반적인 구성의 LTIA용 시약에 의해, L-FABP를 측정한바, 원하는 감도가 얻어지지 않고, 또한 오줌 중의 L-FABP의 측정에 있어서, ELISA에 의한 체외 진단용 의약품(레나프로(등록 상표) L-FABP 테스트 TMB(시믹 홀딩스사제))과의 상관성에 대해서도 원하는 성적을 얻을 수 없었다.
본 발명의 과제는, 기존의 체외 진단용 의약품과 동등 이상의 검출 감도를 가지며, 또한 양호한 상관성을 갖는, 항L-FABP 항체를 사용한 시료 중의 L-FABP의 면역학적 측정 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 과제는, 항L-FABP 항체를 사용한 시료 중의 L-FABP의 면역학적 측정 방법에 사용하는 시약, 키트를 제공하는 것이다.
[1]
시료 중의 L-FABP(간장형 지방산 결합 단백질)를 항L-FABP 항체에 의해 검출하는 방법이며, 항L-FABP 항체, 및 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 방법.
[2]
분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물이, 하기 식(1)로 표시되는 화합물 또는 그의 염 또는 에스테르, 및 하기 식(2)로 표시되는 화합물 또는 그의 염으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [1]에 기재된 방법.
식(1)
Figure 112017091521842-pct00001
[식(1) 중, R1은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기이며, R2 내지 R6은 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기, 수산기, 카르복시기, 아미노기 또는 -SR7(R7은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R7이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)을 나타냄]의 화합물 또는 그의 염 또는 에스테르.
식(2)
Figure 112017091521842-pct00002
[상기 식(2) 중, R11 내지 R14는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기, 아미노기, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 또는 -SR16(R16은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R16이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)이고, 여기서, R11과 R12의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되고, R13과 R14의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되며,
R15는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기이며,
X11은, 질소 원자 또는 황 원자이며,
X12 및 X13은 각각 독립적으로, 탄소 원자 또는 질소 원자이며,
l1, l2, m1, m2 및 n은 각각 독립적으로, 0 또는 1이며,
X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 각각 독립적으로, 단결합 또는 이중 결합이며, 여기서,
상기 l1, l2, m1, m2 및 n의 값 그리고 X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선의 결합은, X11 내지 X13의 원자가에 따라서 적절히 정해지는 값 및 결합을 나타냄]의 화합물 또는 그의 염.
[3]
식(2)로 표시되는 화합물 또는 그의 염이, 이하의 화합물 또는 그의 염으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [2]에 기재된 방법.
식(2)
Figure 112017091521842-pct00003
[식(2) 중, R11 내지 R14는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기, 아미노기, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 또는 -SR16(R16은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R16이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)이고, 여기서, R11과 R12의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되고, R13과 R14의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되며,
R15는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기를 나타냄]에 있어서,
X11 내지 X13, l1+l2, m1+m2, n(l1, l2, m1, m2 및 n은 각각 독립적으로, 0 또는 1을 나타냄) 및 이중 파선의 조합은,
(a) X11은 황 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 2, m1+m2는 2, n은 0이며, X11과 X13 사이 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 단결합이거나,
(b) X11은 황 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 1, m1+m2는 1, n은 0이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 단결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합이거나,
(c) X11은 질소 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 2, m1+m2는 2, n은 1이며, X11과 X13 사이 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 단결합이거나,
(d) X11은 질소 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 1, m1+m2는 1, n은 1이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 단결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합이거나,
(e) X11 및 X12는 질소 원자, X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 1, m1+m2는 1, n은 0이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 단결합이거나, 또는
(f) X11 및 X12 및 X13은 질소 원자이며, l1+l2는 0, m1+m2는 0, n은 1이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 단결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합인, 화합물 또는 그의 염.
[4]
항L-FABP 항체, 및 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정이, 상기 화합물과 L-FABP의 존재가 의심되는 시료를 접촉시키는 공정 후, 항L-FABP 항체와 접촉시키는 공정의 순서로 행해지는, [1]에 기재된 방법.
[5]
항L-FABP 항체, 및 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정에 있어서의, 상기 화합물의 농도가 300mol/L 내지 500mmol/L인, [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[6]
항L-FABP 항체가 불용성 담체에 고정화되어 있는, [1] 내지 [5] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[7]
불용성 담체가, 라텍스 입자, 금속 콜로이드 입자, 다공성 멤브레인, 또는 합성 고분자 화합물을 포함하는 면역 플레이트인, [6]에 기재된 방법.
[8]
입자 면역 응집 측정법을 이용하는, [7]에 기재된 방법.
[9]
측방 유동식(lateral-flow type) 또는 관통식(flow-through type)의 면역 크로마토그래피를 이용하는, [7]에 기재된 방법.
[10]
항L-FABP 항체가, 서로 인식 부위가 다른 2종 이상의 모노클로날 항체인, [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[11]
서로 인식 부위가 다른 2종 이상의 모노클로날 항체가, 라텍스 입자에 각각 고정화되어 있으며, 라텍스 면역 비탁법에 의해 L-FABP를 검출하는, [10]에 기재된 방법.
[12]
서로 인식 부위가 다른 2종 이상의 모노클로날 항체의, 한쪽의 모노클로날 항체는 표지 물질로 표지되어 있고, 다른 쪽의 모노클로날 항체는 고상에 고정화되어 있으며, 면역 크로마토그래피, ELISA 또는 화학 발광 검출법에 의해 L-FABP를 검출하는, [10]에 기재된 방법.
[13]
시료가 오줌, 전혈, 혈청 또는 혈장인, [1] 내지 [12] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[14]
시료 중의 L-FABP를, 항L-FABP 항체에 의해 검출하기 위한 시약이며, 항L-FABP 항체, 및 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을 포함하는 상기 시약.
[15]
시료 중의 L-FABP를 항L-FABP 항체에 의해 검출하기 위한 전처리 방법이며, 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 전처리 방법.
[16]
시료 중의 L-FABP를, 항L-FABP 항체에 의해 검출하기 위한 전처리 시약이며, 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을 포함하는 상기 전처리 시약.
[17]
시료 중의 L-FABP(간장형 지방산 결합 단백질)을 항L-FABP 항체에 의해 검출하는 방법에 있어서의, 측정 감도를 향상시키는 방법이며, 항L-FABP 항체, 및 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 방법.
[18]
분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물이, 하기 식(1)로 표시되는 화합물 또는 그의 염 또는 에스테르, 하기 식(2)로 표시되는 화합물 또는 그의 염으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [17]에 기재된 방법.
식(1)
Figure 112017091521842-pct00004
[식(1) 중, R1은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기이며, R2 내지 R6은 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기, 수산기, 카르복시기, 아미노기 또는 -SR7(R7은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R7이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)를 나타냄]의 화합물 또는 그의 염 또는 에스테르.
식(2)
Figure 112017091521842-pct00005
[상기 식(2) 중, R11 내지 R14는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기, 아미노기, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 또는 -SR16(R16은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R16이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)이고, 여기서, R11과 R12의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되고, R13과 R14의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되며,
R15는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기이며,
X11은, 질소 원자 또는 황 원자이며,
X12 및 X13은 각각 독립적으로, 탄소 원자 또는 질소 원자이며,
l1, l2, m1, m2 및 n은 각각 독립적으로, 0 또는 1이며,
X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 각각 독립적으로, 단결합 또는 이중 결합이며, 여기서,
상기 l1, l2, m1, m2 및 n의 값 그리고 X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선의 결합은, X11 내지 X13의 원자가에 따라서 적절히 정해지는 값 및 결합을 나타냄]의 화합물 또는 그의 염.
[19]
식(2)로 표시되는 화합물 또는 그의 염이, 이하의 화합물 또는 그의 염으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, [18]에 기재된 방법.
식(2)
Figure 112017091521842-pct00006
[식(2) 중, R11 내지 R14는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기, 아미노기, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 또는 -SR16(R16은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R16이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)이고, 여기서, R11과 R12의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되고, R13과 R14의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되며, R15는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기를 나타냄]에 있어서,
X11 내지 X13, l1+l2, m1+m2, n(l1, l2, m1, m2 및 n은 각각 독립적으로, 0 또는 1을 나타냄) 및 이중 파선의 조합은,
(a) X11은 황 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 2, m1+m2는 2, n은 0이며, X11과 X13 사이 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 단결합이거나,
(b) X11은 황 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 1, m1+m2는 1, n은 0이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 단결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합이거나,
(c) X11은 질소 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 2, m1+m2는 2, n은 1이며, X11과 X13 사이 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 단결합이거나,
(d) X11은 질소 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 1, m1+m2는 1, n은 1이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 단결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합이거나,
(e) X11 및 X12는 질소 원자, X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 1, m1+m2는 1, n은 0이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 단결합이거나, 또는
(f) X11 및 X12 및 X13은 질소 원자이며, l1+l2는 0, m1+m2는 0, n은 1이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 단결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합인, 화합물 또는 그의 염.
[20]
항L-FABP 항체, 및 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정이, 상기 화합물과 L-FABP의 존재가 의심되는 시료를 접촉시키는 공정 후, 항L-FABP 항체와 접촉시키는 공정의 순서로 행해지는, [17]에 기재된 방법.
[21]
항L-FABP 항체, 및 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정에 있어서의, 상기 화합물의 농도가 300mmol/L 내지 500mmol/L인, [17] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[22]
항L-FABP 항체가 불용성 담체에 고정화되어 있는, [17] 내지 [21] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[23]
불용성 담체가, 라텍스 입자, 금속 콜로이드 입자, 다공성 멤브레인, 또는 합성 고분자 화합물을 포함하는 면역 플레이트인, [22]에 기재된 방법.
[24]
입자 면역 응집 측정법을 이용하는, [23]에 기재된 방법.
[25]
측방 유동식 또는 관통식의 면역 크로마토그래피를 이용하는, [23]에 기재된 방법.
[26]
항L-FABP 항체가, 서로 인식 부위가 다른 2종 이상의 모노클로날 항체인, [17] 내지 [25] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[27]
서로 인식 부위가 다른 2종 이상의 모노클로날 항체가, 라텍스 입자에 각각 고정화되어 있으며, 라텍스 면역 비탁법에 의해 L-FABP를 검출하는, [26]에 기재된 방법.
[28]
서로 인식 부위가 다른 2종 이상의 모노클로날 항체의, 한쪽의 모노클로날 항체는 표지 물질로 표지되어 있고, 다른 쪽의 모노클로날 항체는 고상에 고정화되어 있으며, 면역 크로마토그래피, ELISA 또는 화학 발광 검출법에 의해 L-FABP를 검출하는, [26]에 기재된 방법.
[29]
시료가 오줌, 전혈, 혈청 또는 혈장인, [17] 내지 [28] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[30]
시료 중의 L-FABP를, 항L-FABP 항체에 의해 검출하기 위한 시약에 있어서의, 측정 감도를 향상시키기 위한 시약이며, 항L-FABP 항체, 및 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을 포함하는 상기 시약.
[31]
시료 중의 L-FABP를 항L-FABP 항체에 의해 검출하기 위한 방법에 있어서의, 측정 감도를 향상시키기 위한 전처리 방법이며, 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 전처리 방법.
[32]
시료 중의 L-FABP를, 항L-FABP 항체에 의해 검출하기 위한 시약에 있어서의, 측정 감도를 향상시키기 위한 전처리 시약이며, 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을 포함하는 상기 전처리 시약.
본 발명에 따르면, 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을 시료 중의 L-FABP와 접촉시킴으로써, 시료 중의 L-FABP를 신속, 간편하게 면역학적 측정 방법으로 검출하는 것을 가능하게 한다.
도 1은, LTIA에 있어서의, 식(1)의 화합물(벤즈아미딘염산염) 및 기준 방법의 전처리액 성분의 효과를 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
(시료)
본 발명에 사용되는 시료로서는, 오줌, 혈액(전혈, 혈장 또는 혈청), 신장 조직, 신장 조직으로부터의 추출액 등을 들 수 있다. 이들 중, 특히 오줌이 적합한 시료이다. L-FABP의 존재가 의심되는 시료라면, 정상인 유래의 시료, 환자 유래의 시료, 병에 걸린 걸로 의심되는 사람 유래의 시료 등, 어느 시료도 사용할 수 있다.
(항L-FABP 항체)
본 발명에 사용되는 항L-FABP 항체는, 장기, 세포, 체액 등으로부터 정제한 천연의 L-FABP를 면역원(항원)으로 하여 제조할 수 있다. L-FABP는, 주로 간장 또는 신장에 분포하고 있으므로, 그들 장기 등으로부터 정제, 단리할 수 있다. 또한, L-FABP는, 인간, 마우스, 돼지, 소, 래트 사이에서 호몰로지가 높고, 아미노산 레벨로 90％ 이상의 호몰로지가 있는 것으로 알려져 있으므로, 인간의 L-FABP와 결합하는 항체를 얻기 위해서, 예를 들어 마우스 L-FABP를 항원으로서 사용할 수도 있다.
천연 L-FABP의 정제는, Kelvin 등의 문헌(J. Biol. Chem., 제263권, 제15762-15768페이지, 1988년)에 기재된 방법 등에 준하여 실시할 수 있다. 즉, 적출한 장기를 균질화한 후, 초원심하여 얻어지는 세포질 획분을, 겔 여과 및 음이온 교환 크로마토그래피 등에 의해 분획하고, 분자량이나 지방산 결합 활성을 지표로 하여 L-FABP를 함유하는 획분을 선택하여 단리, 정제한다. 상기 선택된 획분을 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 걸어, 정제 단백질이 단일 밴드로 되어 있음을 확인하고, 필요하다면 추가로 정제를 행한다. 정제 단백질에 대해서, 아미노산 조성이나 N 말단측 아미노산 서열을 결정하고, 보고된 조성이나 배열과 비교함으로써, 목적으로 하는 분자종임을 확인할 수 있다.
항원으로서 사용되는 L-FABP는, 유전자 공학적 방법에 의해 제조된 재조합 단백질이어도 된다. L-FABP의 아미노산 서열이나 유전자 서열은 이미 보고되어 있기 때문에(Veerkamp and Maatman, Prog. Lipid Res., 제34권, 제17-52페이지, 1995년), 예를 들어 그것들을 바탕으로 프라이머를 설계하고, PCR(polymerase chain reaction)법에 의해 적당한 cDNA 라이브러리 등으로부터 cDNA를 클로닝할 수 있다. 이것을 사용하여 유전자 재조합을 행함으로써, 재조합 L-FABP를 제조할 수 있다. 또한, 항원으로서, L-FABP의 단편, 또는 그의 부분 서열을 갖는 합성 펩티드 등을, 필요에 따라 캐리어 고분자 물질(BSA, 헤모시아닌 등)과 결합시켜 사용할 수도 있다.
L-FABP와 특이적으로 결합하는 항체는, 항혈청, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 등 중 어느 것이어도 된다.
항체는, 높은 특이성을 갖는 것이 바람직하고, 예를 들어 항L-FABP 항체라면, H-FABP와는 실질적으로 교차 반응하지 않는 것이 바람직하다. 보다 특이성이 높은 항체를 취득하기 위해서는, 보다 고도로 정제되어 순도가 높은 항원을 사용하는 것이 바람직하다. 항체의 제조 시에는, 인간 이외의 온혈 동물에, 상기와 같이 제조한 정제 항원을 접종하여 면역시킨다. 면역시키는 인간 이외의 온혈 동물로서는, 포유 동물(토끼, 양, 래트, 마우스, 모르모트, 말, 돼지 등), 조류(닭, 집오리, 거위 등)를 들 수 있다. 토끼의 경우, 예를 들어 항원 100μg 내지 1mg 정도를 약 1mL의 생리 식염수 및 프로인트의 완전 아쥬반트 중에 유화시킨 것을, 배면부 또는 뒷다리 발바닥 피하에 접종하고, 2회째 이후는 아쥬반트를 프로인트의 불완전 아쥬반트로 바꾸어, 이것을 2 내지 4주일 간격으로 3 내지 8회 접종하여 면역시키고, 최종 접종의 약 7 내지 12일 후에 생산된 항체를 사용한다. 마우스의 경우, 1회당 10 내지 30μg/마리의 항원을, 통상, 피하, 복강 내, 정맥 내에, 약 2주 간격으로 3 내지 8회 접종하여 면역시키고, 최종 접종의 약 2 내지 4일 후에 생산된 항체를 사용한다.
폴리클로날 항체는, 상기와 같이 면역시킨 동물로부터 채혈하여, 혈청(항혈청)을 분취하고, 얻어진 항혈청으로부터 Ig 획분을 회수하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 항혈청으로부터 Protein G 칼럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피 등에 의해 IgG 획분을 회수하여 폴리클로날 IgG를 얻을 수 있다.
모노클로날 항체는, 면역 동물로부터 채취된 항체 생산 세포를, 불사화 세포와 융합시켜 얻어지는 하이브리도마에 의해 생산된다. 모노클로날 항체를 위한 면역 동물로서는 마우스 및 래트가 적합하게 사용된다. 하이브리도마의 제작은, 쾰러 및 밀슈타인의 방법(Kohler & Milstein, Nature, 제256권, 제495 내지 897페이지, 1975년)에 준하여 이하와 같이 실시할 수 있다. 상기와 같이 면역시킨 동물로부터 항체 생산 세포(예를 들어 비장세포 또는 림프절 세포 등)를 채취하고, 이것을 적당한 불사화 세포와 세포 융합시킨다. 불사화 세포로서는, 예를 들어 골수종 세포의 세포주(NSI-Ag4/1, Sp2/O-Agl4 등)가 적합하게 사용된다. 골수종 세포는, 그 자체가 항체 또는 면역 글로불린의 H쇄 또는 L쇄를 생산하지 않는 비분비형인 것이 바람직하다. 또한, 미융합 골수종 세포와 융합한 하이브리도마를 선택 배지 중에서 선별할 수 있는 선택 마커를 갖고 있는 것이 바람직하다. 예를 들어 선택 마커로서, 8-아자구아닌 내성(히포크산틴-구아닌-포스포리보실 트랜스퍼라아제 결손), 티미딘 키나아제 결손 등을 갖는 세포주가 자주 사용된다. 세포 융합은, 폴리에틸렌글리콜 등, 적당한 융합 촉진제를 첨가하여 행한다. 세포 융합은, 불사화 세포당 약 10의 항체 생산 세포가 되는 비율로 행하는 것이 바람직하고, 또한 대략 항체 생산 세포 106개/mL의 세포 밀도에서 적합하게 실시할 수 있다.
융합 처리된 세포를, 적당히 희석한 후, 선택 배지 중에서 1 내지 2주일 배양한다. 예를 들어, 8-아자구아닌에 내성인 골수종 세포를 사용하는 경우, HAT(히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 배지 중에서 배양하면, 미융합 골수종 세포는 사멸하고, 또한 미융합 항체 생산 세포도 분열 사이클이 한정되어 있기 때문에 사멸하지만, 융합 세포만은 선택 배지 중에서 분열을 계속하여 생존할 수 있다. 선택 배지 중에서의 배양 후, 그 상청에 대하여 예를 들어 항원을 고상에 고정화한 ELISA 등을 행하여 목적으로 하는 항체의 유무를 검출하고, 한계 희석법에 의해 클로닝함으로써, 목적 항원을 인식하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택할 수 있다. 항체값, 항체의 클래스, 서브클래스, 항원과의 친화성, 특이성, 에피토프 등, 원하는 성질을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택한다. 모노클로날 항체의 클래스로서는 일반적으로 IgG가 바람직하다.
모노클로날 항체 생산 하이브리도마를, 면역에 사용된 동물과 동종인 동물의 복강 내에 이식하고, 일정 기간 경과 후, 당해 동물로부터 복수를 채취하여, 목적으로 하는 모노클로날 항체를 단리할 수 있다. 또는, 하이브리도마를 적당한 동물 세포 배양용 배지 중에서 배양하고, 그 배양액으로부터 모노클로날 항체를 단리할 수도 있다. 또한, 일단 목적으로 하는 하이브리도마를 얻으면, 해당 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 취득하고, 통상의 유전자 재조합 기술에 의해 적당한 숙주(예를 들어 누에 등)에 있어서 목적으로 하는 모노클로날 항체를 발현시켜 생산시킬 수 있다. 항체의 분리·정제는, 예를 들어 황산암모늄 침전, 겔 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등을 필요에 따라 조합한 통상의 정제법에 따라서 행할 수 있다.
본 발명에 사용되는 항L-FABP 항체는, 공지된 항체여도 되고, 이후 개발되는 항체여도 된다. 특별히 한정되지 않지만, 시판되고 있는 항L-FABP 항체인, Santa Cruz Biotechnology사의 C-4(카탈로그 No. sc-374537), F-9(카탈로그 No. sc-271591), R&D systems사의 328607(카탈로그 No. MAB2964), Hycult biotech사의 L2B10(카탈로그 No. HA2049-IA), Lifespan Biosciences사의 2G4(카탈로그 No. LS-B3001) 등이 이용 가능하다. 이들 항체는, 인간 유래 L-FABP 단백질의 내부 영역이나 N 말단 영역 등의 폴리펩티드와 결합하지만, 본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을 사용하면, 항체가 L-FABP 분자의 내부 영역과 결합하는 경우에도, 보다 고감도, 보다 특이적으로 L-FABP를 검출하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서의 「항체」에는, 완전한 면역 글로불린 분자뿐만 아니라, Fab, Fab'2, CDR, 인간화 항체, 다기능 항체, 단쇄 항체(ScFv) 등, 본 기술 분야에 있어서 공지된 항원 결합능을 갖는 항체 단편 또는 항체 유도체가 포함된다.
(검출)
본 발명의 항L-FABP 항체를 사용한 L-FABP를 검출하는 방법은, 면역학적 측정법이다. 보다 구체적으로는, 라텍스 면역 비탁법(LTIA) 등의 입자 면역 응집 측정법, ELISA, 화학 발광 검출법, 면역 크로마토그래피(측방 유동식, 관통식)를 들 수 있지만, 이들 예에 한정되지 않는다. 그 중에서도, B/F 분리를 위한 공정을 포함하지 않는 면역학적 측정법(균질 면역 측정법)이 보다 바람직하다.
또한, 본 명세서에 있어서 측정 방법으로서 LTIA를 기술하는 경우, 그 검출 방법은, 투과광(흡광도)의 변화 측정, 산란광의 변화 측정, 입자 직경의 변화 측정 등, 공지된 검출 방법 중 어느 것을 사용해도 지장이 없는 것으로서 기술하고 있다.
또한, 본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물과 접촉시킨 시료를 사용하여, 항L-FABP 항체를 사용한 면역학적 측정을 행하는 한, 면역 조직 염색법, 전기 영동법(웨스턴 블롯 등), 도트·블로팅법 등에 있어서도 본 발명이 적용 가능한 것은, 당업자에게는 용이하게 이해될 수 있다.
또한, 「검출」 또는 「측정」이라는 용어는, L-FABP의 존재의 증명 및/또는 정량 등을 포함하여 가장 광의로 해석될 필요가 있고, 한정적으로 해석되어서는 안 된다.
(불용성 담체)
본 발명에서 사용되는 불용성 담체로서는, 폴리스티렌 수지 등의 고분자 기재, 유리 등의 무기 기재, 셀룰로오스나 아가로오스 등의 다당류 기재 등을 포함하는 불용성 담체를 사용할 수 있고, 그의 형상은 특별히 한정되지 않으며, 비즈 또는 입자 형상(예를 들어, 라텍스 입자, 금속 콜로이드 입자), 판 또는 시트 형상(예를 들어, 다공성 멤브레인, 면역 플레이트), 통 형상(예를 들어, 시험관) 등, 채용하는 측정법에 따른 임의의 형상을 선택할 수 있다.
입자의 예로서는, 입자 면역 응집 측정법에서 일반적으로 사용되는 폴리스티렌을 주성분으로 하는 라텍스 입자 이외에도, 스티렌-부타디엔 공중합체, (메트)아크릴산에스테르류 중합체 등을 기재로 하는 입자를 들 수 있다. 또한, 금속 콜로이드, 젤라틴, 리포솜, 마이크로 캡슐, 실리카, 알루미나, 카본 블랙, 금속 화합물, 금속, 세라믹스 또는 자성체 등의 재질로 이루어지는 입자를 사용할 수도 있다. 본 발명에서 사용되는 담체 입자는 동일 종류의 재질, 또는 2종류 이상의 재질을 사용할 수 있다.
담체 입자의 입자 직경으로서는, 0.15 내지 0.45㎛ 정도가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.2 내지 0.4㎛이다. 또한, 평균 입자 직경이 다른 2종류 이상의 담체 입자를 조합하여 사용할 수도 있다.
다공성 멤브레인으로서는, 공지된 것을 사용할 수 있고, 또한 임의 재질의 것을 사용할 수 있다. 다공성 멤브레인의 재질로서는, 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 나일론류, 유리, 셀룰로오스나 셀룰로오스 유도체 등의 다당류 또는 세라믹스 등을 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다. 구체적으로는, 밀리포어사, 도요 로시사, 와트만사 등으로부터 판매되고 있는 유리 섬유 여과지나 셀룰로오스 여과지 등이 있다.
플레이트(면역 플레이트)로서는, 공지된 것을 사용할 수 있고, 또한 임의 재질의 것을 사용할 수 있다. 플레이트의 재질로서는, 예를 들어 염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리올레핀 엘라스토머 등의 합성 고분자 화합물 이외에, 유리 등도 이용할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
(불용성 담체에 대한 항체의 고정화)
항L-FABP 항체를 불용성 담체 상에 고정화하는 방법으로서는 특별히 제한은 없고, 공지된 방법을 사용할 수 있다.
항L-FABP 항체를 입자 상에 고정화하는 경우, 예를 들어 입자와 항체를 혼합함으로써 일어나는 물리적인 흡착을 사용하는 물리 흡착법, 카르보디이미드 등의 커플링제에 의해, 입자 표면의 카르복시기나 아미노기와 항체 분자를 화학적으로 결합시키는 화학 결합법이 사용된다. 또한, 항체 분자는 스페이서 분자를 통해 입자에 고정화시켜도 된다. 또, 알부민 등의 다른 단백질에 화학 결합법을 사용하여 항체를 결합시킨 후에, 그 단백질을 입자에 물리적 또는 화학적으로 고정화해도 된다.
또한, 항L-FABP 항체를 다공성 멤브레인 상에 고정화하는 경우, 예를 들어 항체를 포함하는 용액을 일정량, 라인 형상, 점 또는, + 등의 특정 심벌 형상으로, 다공성 멤브레인에 도포함으로써 고정화할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「불용성 담체」를 「고상」, 항원이나 항체를 불용성 담체에 물리적 또는 화학적으로 담지시키는 것 또는 담지시킨 상태를 「고정」, 「고정화」, 「고상화」, 「감작」, 「흡착」이라고 표현하는 경우가 있다.
(표지 항체)
항체를 표지하기 위한 표지 물질로서는, 예를 들어 효소, 형광 물질, 화학 발광 물질, 비오틴, 아비딘, 방사성 동위체, 금 콜로이드 입자, 또는 착색 라텍스 입자 등을 들 수 있다. 또한 표지 물질과 항체의 결합 방법으로서는, 당업자에게 이용 가능한 글루타르알데히드법, 말레이미드법, 피리딜디술피드법 또는 과요오드산법 등의 방법을 사용할 수 있다. 표지 물질, 결합 방법 모두, 상기에 한정되지 않고 공지된 방법을 사용할 수 있다.
표지의 검출은, 예를 들어 퍼옥시다아제나 알칼리 포스파타아제 등의 효소를 표지 물질로서 사용하는 경우에는, 그 효소의 특이적 기질(효소가 서양 고추냉이 퍼옥시다아제인 경우에는, 예를 들어 1,2-페닐렌디아민 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, 알칼리 포스파타아제인 경우에는, p-니트로페닐포스페이트 등)을 사용하여 효소 활성을 측정할 수 있고, 비오틴을 표지 물질로서 사용하는 경우에는 적어도 비오틴 이외의 표지 물질로 표지된 아비딘을 반응시키는 것이 일반적이다.
(분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물)
본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물은, 식(1) 및 식(2)로 표시되는 화합물이다(본 명세서에 있어서, 「식(1)의 화합물」, 「식(2)의 화합물」이라 하는 경우가 있음).
식(1)의 화합물은,
Figure 112017091521842-pct00007
[식(1) 중, R1은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기이며, R2 내지 R6은 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기, 수산기, 카르복시기, 아미노기 또는 -SR7(R7은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R7이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)을 나타냄]의 화합물 또는 그의 염 또는 에스테르이다.
식(2)의 화합물은,
Figure 112017091521842-pct00008
[식(2) 중, R11 내지 R14는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기, 아미노기, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 또는 -SR16(R16은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R16이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)이고, 여기서, R11과 R12의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되고, R13과 R14의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되며, R15는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기이며,
X11은, 질소 원자 또는 황 원자이며,
X12 및 X13은 각각 독립적으로, 탄소 원자 또는 질소 원자이며,
l1, l2, m1, m2 및 n은 각각 독립적으로, 0 또는 1이며,
X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 각각 독립적으로, 단결합 또는 이중 결합이며, 여기서,
상기 l1, l2, m1, m2 및 n의 값 그리고 X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선의 결합은, X11 내지 X13의 원자가에 따라서 적절히 정해지는 값 및 결합을 나타냄]의 화합물 또는 그의 염이다.
또한 식(2)의 화합물은,
Figure 112017091521842-pct00009
[식(2) 중, R11 내지 R14는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기, 아미노기, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 또는 -SR16(R16은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R16이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)이고, 여기서, R11과 R12의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되고, R13과 R14의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되며, R15는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기를 나타냄]에 있어서,
X11 내지 X13, l1+l2, m1+m2, n(l1, l2, m1, m2 및 n은 각각 독립적으로, 0 또는 1을 나타냄) 및 이중 파선의 조합은,
(a) X11은 황 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 2, m1+m2는 2, n은 0이며, X11과 X13 사이 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 단결합이거나,
(b) X11은 황 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 1, m1+m2는 1, n은 0이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 단결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합이거나,
(c) X11은 질소 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 2, m1+m2는 2, n은 1이며, X11과 X13 사이 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 단결합이거나,
(d) X11은 질소 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 1, m1+m2는 1, n은 1이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 단결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합이거나,
(e) X11 및 X12는 질소 원자, X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 1, m1+m2는 1, n은 0이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 단결합이거나, 또는
(f) X11 및 X12 및 X13은 질소 원자이며, l1+l2는 0, m1+m2는 0, n은 1이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 단결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합인, 화합물 또는 그의 염이다.
식(1)로 표시되는 화합물의 예로서는, 벤즈아미딘 유도체를 들 수 있고, 또한 식(2)로 표시되는 화합물의 예로서는, 아미노티아졸 유도체, 아미노트리아졸 유도체, 아미노테트라졸 유도체, 아미노이미다졸 유도체를 들 수 있다. 각 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물의 염으로서는, 염산염, 황산염, 질산염, 브롬화수소염, 불화수소산염, 붕불화수소산염, 옥살산염, 락트산염, 아디프산염, 타르타르산염, 요오드화수소산염, 톨루엔술폰산염, 말론산염, 중탄산염 등 특별히 제한은 없고, 본 발명의 효과 이외에도 시약으로서의 취급 용이성이나 입수 용이성 등을 감안하여 적절히 선택할 수 있다.
더욱 상세한 식(1)의 화합물로서는, 벤즈아미딘염산염(CAS 번호: 1670-14-0), 벤즈아미딘염산염 수화물(CAS 번호: 206752-36-5), 4-플루오로벤즈아미도옥심(CAS 번호: 69113-32-2), 4-클로로벤즈아미딘염산염(CAS 번호: 14401-51-5)을 들 수 있다. 더욱 상세한 식(2)의 화합물로서는, 아미노티아졸린(CAS 번호: 1779-81-3), 2-아미노-2-티아졸린염산염(CAS 번호: 3882-98-2), 슈도티오히단토인(CAS 번호: 556-90-1), 2-아미노-5-브로모티아졸브롬화수소산염(CAS 번호: 61296-22-8), 2-아미노-4,5-디메틸티아졸1브롬화수소산염(CAS 번호: 7170-76-5), 2,4-디아미노-5-페닐티아졸브롬화수소산염(CAS 번호: 6020-54-8), 크레아티닌(CAS 번호: 60-27-5)을 들 수 있다. 이들 중에서도, 벤즈아미딘염산염, 2-아미노-2-티아졸린염산염, 크레아티닌이 특히 바람직하다. 또한, 이들 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물은, 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물의 첨가 농도의 바람직한 범위로서는, 50mmol/L 내지 1000mmol/L, 50mmol/L 내지 500mmol/L, 50mmol/L 내지 600mmol/L, 100mmol/L 내지 900mmol/L, 200mmol/L 내지 800mmol/L, 300mmol/L 내지 600mmol/L, 300mmol/L 내지 550mmol/L, 300mmol/L 내지 500mmol/L, 350mmol/L 내지 450mmol/L을 들 수 있고, 바람직하게는 50mmol/L 내지 500mmol/L, 보다 바람직하게는 300mmol/L 내지 500mmol/L이다. 사용되는 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물마다의 최적 농도는, 본 명세서의 기재에 따라서 실험적으로 구할 수 있다.
(본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을 시료 중의 L-FABP와 접촉시키는 방법, 및 항L-FABP 항체와 시료 중의 L-FABP를 접촉시키는 방법)
본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, 시료 중의 L-FABP와 접촉시키는 방법으로서는, 예를 들어 본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을 함유하는 액상 시약과 시료를 혼합하는 방법을 들 수 있다. 또한, 다른 방법으로서는, 본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을 침윤시킨 다공성 멤브레인 등의 불용성 담체에, 시료를 공급함으로써 접촉시키는 방법을 들 수 있다.
또한 시료 중의 L-FABP는, 본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물과 접촉시킨 후, 또는 접촉과 동시에, 불용성 담체에 고정화된 항L-FABP 항체와 공지된 적절한 방법에 의해 접촉시킨다.
또한, 본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을 시료와 접촉시키는 방법으로서는, 시료의 희석액, 시료의 추출액, 또는 시료의 보존액, 전개액 등으로서 접촉시키는 방법도 포함된다. 또, 채뇨, 채혈 등 시료의 수집 시에, 채뇨컵, 채혈관 등의 시료 수집 용기 내에서, 필요에 따라 효소 활성 저해제나 항응고제 등과 함께 시료와 접촉시키는 방법도 포함된다.
(측정 키트)
본 발명에 의해 제공되는, 본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물 이외의, 측정 키트의 구성물은, L-FABP를 면역학적으로 측정할 수 있는 것을 한도로 하고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 이하, 샌드위치 ELISA, 면역 크로마토그래피 및 LTIA를 예로 들어 각각을 설명한다.
<샌드위치 ELISA>
샌드위치 ELISA의 경우, 측정용 키트는 적어도, (a) 본 발명의 항L-FABP 항체를 고정화한 불용성 담체 및 (b) 표지 물질로 표지되며, L-FABP와 반응하는 성질을 갖는 항체를 포함한다. 이 경우, 불용성 담체는 플레이트(면역 플레이트)가 바람직하고, 표지 물질은 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
불용성 담체에 고정화된 항체는, 시료 중의 L-FABP를 포착하여, 불용성 담체 상에서 복합체를 형성한다. 표지 물질로 표지된 항체는, 상기 포착된 L-FABP에 결합하여 전술한 복합체와 샌드위치를 형성한다. 표지 물질에 따른 방법에 의해 표지 물질의 양을 측정함으로써, 시료 중의 L-FABP를 측정할 수 있다. 항체의 불용성 담체에 대한 고정화 방법, 항체와 표지 물질의 결합 방법 등, 구체적인 방법은, 당업자에게 주지된 방법을 특별히 제한없이 사용할 수 있다. 이 구성의 경우, 균질 측정 방법, 불균질 측정 방법 중 어느 것도 구성하는 것이 가능하지만, 균질 측정 방법이 보다 적합하다.
본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물은, 예를 들어 시료 희석액이나 항원 항체 반응을 행하는 용액에 첨가함으로써, 시료 중의 L-FABP와 접촉시킬 수 있다.
<면역 크로마토그래피>
일반적인 면역 크로마토그래피에서는, 다공성 멤브레인 등의 시트 형상 불용성 담체 상에, 시료를 포함하는 용액의 전개 방향으로 순서대로 「1. 시료 공급 부위」, 「2. 표지 항체를 유지하는 부위(표지 항체 유지 부위)」, 「3. 표지 항체와 L-FABP 항체에 의해 형성된 복합체를 포착하기 위한 항체를 고정화하는 부위(포착 항체 부위)」를 구비한 시험편이 사용되고, 시료 용액이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동하도록 구성되어 있다. 면역 크로마토그래피에서는, 측정용 키트는, 상기와 같은 시험편을 적어도 포함한다.
구체적으로는, L-FABP를 포함하는 시료를 시료 공급 부위에 소정량 첨가하면, 시료는 모세관 현상에 의해 표지 유지 부위에 침입하고, L-FABP와 표지 항체가 결합하여 복합체를 형성한다. 해당 복합체는, 멤브레인을 전개하여, 포착 항체 부위에 침입하면, 멤브레인에 고정화된 항체(포착 항체)에 포착되어, 포착 항체-L-FABP-표지 항체의 3원 복합체가 형성된다. 그리고 표지를 임의의 방법(예를 들어, 금 콜로이드 입자 등의 가시화 가능한 표지인 경우에는 그의 응집상, 효소인 경우에는, 기질을 첨가하는 것에 의한 발색 반응)으로 검출함으로써, L-FABP의 존재를 검출할 수 있다.
본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물은, 예를 들어 시료 희석액 등에 첨가해두거나, 시료 공급 부위나 표지 유지 부위에 함유시켜두거나 함으로써, 시료 중의 L-FABP와 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 특허문헌 4에 기재된 면역 크로마토그래피는, 본 발명을 채용하는 것이 가능한 방법이다.
<라텍스 면역 응집 측정법>
라텍스 면역 응집 측정법에서는, 측정용 키트는 적어도 항체가 고정화된 라텍스 입자를 포함한다. 라텍스 면역 응집 측정법에 사용되는 항체로서는, 「항원에 대한 인식 부위가 다른 2종류의 모노클로날 항체」, 「폴리클로날 항체」, 또는 「모노클로날 항체와 폴리클로날 항체」의 어느 조합도 사용할 수 있다. 이 경우, 라텍스 입자는, 항체를 고정화하는 불용성 담체임과 동시에, 표지 물질이다.
이들 측정용 시약에 사용되는 라텍스 입자는, 감도 향상 등의 원하는 성능을 얻기 위해서, 입자 직경이나 재질을 적절히 선택할 수 있다. 라텍스 입자로서는, 항체의 담지에 적합한 것이면 된다. 예를 들어, 폴리스티렌, 스티렌-술폰산(염) 공중합체, 스티렌-메타크릴산 공중합체, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌 공중합체, 염화비닐-아크릴산에스테르 공중합체, 아세트산비닐-아크릴산에스테르 공중합체 등을 기재로 하는 입자를 들 수 있다. 라텍스 입자의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 그 평균 입자 직경은, 라텍스 입자 표면의 항체와 L-FABP의 응집 반응의 결과로 발생하는 응집체가, 육안 또는 광학적으로 검출되기에 충분한 크기를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 금속 콜로이드, 젤라틴, 리포솜, 마이크로캡슐, 실리카, 알루미나, 카본 블랙, 금속 화합물, 금속, 세라믹스 또는 자성체 등의 재질로 이루어지는 입자를 라텍스 입자 대신에 사용할 수도 있다.
임상 검사에서 사용되는 일반적인 LTIA용 측정 키트는, 통상, 제1 시약, 제2 시약의 형태로 제공된다. 상기 항체를 고정화한 라텍스 입자는, 제1 시약 또는 제2 시약에 함유시킬 수 있다. 일반적으로는 항체를 고정화한 라텍스 입자를 제2 시약에 함유시키는 것이 적합하지만, 제1 시약에 함유시키거나, 제1 시약, 제2 시약의 양쪽에 함유시키는 것도 가능하다.
본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물은, 제1 시약에 포함되어 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을 포함하는 제1 시약과 시료를 혼합함으로써, 시료 중의 L-FABP와 본 발명의 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물이 접촉된다.
본 발명의 키트는, 각각 상기 이외에도, 적절히 완충 성분(완충액)을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 완충액으로서는, 일반적으로 사용되는 것이면 되고, 예를 들어 트리스염산, 붕산, 인산, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 프탈산, 글루타르산, 말레산, 글리신 및 그들의 염 등이나, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES 등의 굿(Good) 완충액 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는, 측정 감도 향상이나 비특이적 반응 억제의 목적으로, 필요에 따라 당류나 단백질 등을 포함한다. 예를 들어, 항원 항체 반응을 촉진시키는 성분(폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 인지질 중합체 등의 고분자 화합물 등), 단백질이나 펩티드(알부민, 카제인 등), 아미노산, 당류(자당, 시클로덱스트린 등), 방부제(아지드화나트륨, ProClin300 등)를 들 수 있다.
또한, 시료 측정에 있어서의 표준 물질(L-FABP 표준 물질)로서, 간장, 신장 등의 각 조직 유래의 천연 L-FABP를 사용할 수 있지만, 유전자 공학적 방법에 의해 제조된 재조합 단백질이어도 된다. L-FABP의 아미노산 서열이나 유전자 서열은 이미 보고되어 있기 때문에(Veerkamp and Maatman, Prog. Lipid Res., 제34권, 제17-52페이지, 1995년), 예를 들어 그들을 바탕으로 프라이머를 설계하고, PCR(polymerase chainreaction)법에 의해 적당한 cDNA 라이브러리 등으로부터 cDNA를 클로닝할 수 있다. 이것을 사용하여 유전자 재조합 기술로부터, 재조합 L-FABP를 제조할 수 있다. 표준 물질로서, 구조가 안정된 재조합 단백질을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
실시예
이하에 본 발명의 실시예를 나타내어, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은, 이들에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 일탈하지 않는 범위 내에서 다양한 응용이 가능하다.
실시예 1 내지 4에 대해서는, 이하의 재료를 사용하여, 이하의 조건에서 측정을 행하였다.
(항L-FABP 항체 고정화 라텍스 입자 현탁액)
(1) Clone L 항체 고정화 라텍스 입자 현탁액의 제조
항L-FABP 항체 Clone L(시믹 홀딩스사제)을 0.36mg/mL 포함하는 20mmol/L Tris 완충액(pH 8.5) 13mL에, 평균 입경 0.27㎛의 1％ 라텍스 입자(세키스이가가쿠 고교사제) 현탁액 13mL를 첨가하여, 4℃에서 2시간 교반하였다. 이것에, 0.5％ BSA를 포함하는 20mmol/L Tris 완충액(pH 8.5) 13mL를 첨가하여, 4℃에서 1시간 교반하였다. 그 후, 5mmol/L MOPS 완충액(pH 7.0)에 투석하여, Clone L 항체 고정화 라텍스 입자 현탁액을 얻었다.
(2) Clone 2 항체 고정화 라텍스 입자 현탁액의 제조
항L-FABP 항체 Clone 2(시믹 홀딩스사제)를 0.54mg/mL 포함하는 20mmol/L 글리신 완충액(pH 9.5) 8mL에, 평균 입경 0.25㎛의 1％ 라텍스 입자(세키스이가가쿠 고교사제) 현탁액 8mL를 첨가하여, 4℃에서 2시간 교반하였다. 이것에, 0.5％ BSA를 포함하는 20mmol/L 글리신 완충액(pH 9.5) 8mL를 첨가하여, 4℃에서 1시간 교반하였다. 그 후, 5mmol/L MOPS 완충액(pH 7.0)에 투석하여 Clone 2 항체 고정화 라텍스 입자 현탁액을 얻었다.
(L-FABP 표준 물질)
L-FABP 표준 물질은, 특허문헌 1의 기재에 따라, 유전자 재조합에 의해 얻었다.
(L-FABP 기준 측정 방법: 기준 방법)
ELISA에 의한 체외 진단용 의약품(레나프로(등록 상표) L-FABP 테스트 TMB)을 기준 방법으로 하였다.
(대조 제1 시약: 표준 물질 희석액을 겸함)
100mmol/L 인산 완충액(pH 7.0)
300mmol/L NaCl
0.2％ BSA
0.4％ Lipidure-BL103
(제2 시약)
5mmol/L MOPS 완충액(pH 7.0)
2.5Abs/mL Clone L 항체 고정화 라텍스 입자 현탁액(주)
2.5Abs/mL Clone 2 항체 고정화 라텍스 입자 현탁액(주)
(주) Abs는 280nm에 있어서의 흡광도를 나타낸다.
(표준액)
L-FABP 표준 물질을, 표준 물질 희석액을 사용하여 원하는 농도로 조정하고, 표준액으로 하였다.
(동결 융해 오줌)
채취 후, -30℃에서 동결 보존되어 있던 부분 오줌을, 한번만 융해시켜 측정에 사용하였다.
(건강 혈청)
체 내에서의 L-FABP의 변동을, 염려되는 기존 병력이 없고, 실제로 오줌 중 L-FABP 농도가 기준 범위 내인 지원자 50명으로부터 채혈하여 얻은 혈청을 풀(pool)하여 건강 혈청으로 하였다. 당해 건강 혈청은, 채혈 및 풀 당일에 사용하였다. 참고로 기준 방법을 사용하여 측정한 건강 혈청 중 L-FABP의 농도는 3ng/mL 미만이었다.
(LTIA의 측정 조건)
(1) 분석 장치: 히타치 7170형 자동 분석 장치(히타치 하이테크놀러지즈사제)
(2) 시료량 및 시약량: 시료 3μL, 제1 시약 150μL, 제2 시약 50μL
(3) 반응 시간(반응 온도): 제1 시약 5분(37℃), 제2 시약 5분(37℃)
(4) 측광 포인트 및 측광 대상: 제2 시약 첨가 직후와 첨가 5분 후 사이의 흡광도 변화량
[실시예 1] 기준 방법의 전처리액과, 본 발명의 화합물의 LTIA에 미치는 효과의 확인
종래 기술에 의한 LTIA(대조예 A), 기준 방법의 전처리액을 사용한 LTIA(비교예 1) 및 식(1)의 화합물(벤즈아미딘염산염)을 사용한 LTIA(실시예 1)를 비교하였다.
1. 조작
(1) 실시예 1
표준액을 시료로 하고, 500mmol/L 식(1)의 화합물(벤즈아미딘염산염)을 함유하는 대조 제1 시약 및 제2 시약을 사용하여 시료 중의 L-FABP의 측정을 행하였다.
(2) 대조예 A
표준액을 시료로 하고, 대조 제1 시약 및 제2 시약을 사용하여 시료 중의 L-FABP의 측정을 행하였다.
(3) 비교예 1
기준 방법의 전처리액과 2배 농후 표준 물질 희석액을, 1 용량 대 1 용량의 비율로 혼합하여 얻은 용액을 사용하고, 표준 물질을 원하는 농도로 희석 조정하여, 비교예 1용 시료로 하였다. 비교예 1용 시료를 시료로 하고, 대조 제1 시약 및 제2 시약을 사용하여 시료 중의 L-FABP의 측정을 행하였다.
2. 결과
실시예 1, 대조예 A 및 비교예 1, 각각의 시험에 있어서 측정된 각 시료의 흡광도로부터, 각 시험에 있어서 측정된 L-FABP 0ng/mL 시료의 흡광도(블랭크 흡광도)를 차감하여 순 흡광도를 산출하였다. L-FABP 농도를 x축, 순 흡광도를 y축으로 하는 검량선을 도 1에 도시하였다.
기준 방법의 전처리액 성분을 함유하는 비교예 1용 시료를 측정한 경우(-■-), 어느 L-FABP 농도에 있어서도, 대조예 A(-◆-)의 순 흡광도를 하회했을 뿐만 아니라, L-FABP 농도 의존적인 흡광도 증가가 전혀 관찰되지 않았다. 이로부터, 기준 방법의 전처리액 중의 성분에 의한 LTIA에 대한 측정 방해 효과가 확인되었다. 기준 방법의 첨부 문서에는, 전처리액에 계면 활성제를 함유하는 것이 기재되어 있으며, 당해 계면 활성제가 LTIA에 대한 측정 방해에 관여하고 있을 가능성이 생각되었다.
한편, 식(1)의 화합물(벤즈아미딘염산염)을 함유하는 대조 제1 시약을 사용한 실시예 1의 조건에서 측정한 경우(-△-), 어느 L-FABP 농도에 있어서도, 대조예 A(-◆-)의 순 흡광도를 상회하며, 또한 농도 의존적인 순 흡광도의 증가가 관찰되었다. 이로부터, 식(1)의 화합물(벤즈아미딘염산염)의 LTIA에 있어서의 증감 효과가 확인되었다.
[실시예 2] 동결 융해 오줌을 측정한 경우의 본 발명 화합물의 LTIA에 미치는 효과의 확인
식(1)의 화합물(벤즈아미딘염산염) 및 식(2)의 화합물(2-아미노-2-티아졸린염산염)과 공통인 부분 구조(NH2-C=N-)를 갖지만 환상 구조를 갖지 않은 화합물을 참고예의 화합물로서 사용하여, LTIA에 미치는 효과를 확인하였다.
1. 조작
(1) 실시예 2a, 실시예 2b
동결 융해 오줌 21예(L-FABP 농도: 6ng/mL 내지 365ng/mL)를 시료로 하고, 500mmol/L 벤즈아미딘염산염을 함유하는 대조 제1 시약(실시예 2a) 또는 500mmol/L 2-아미노-2-티아졸린염산염을 함유하는 대조 제1 시약(실시예 2b), 및 제2 시약을 사용하여 시료 중의 L-FABP의 측정을 행하였다.
(2) 대조예 B
상기 동결 융해 오줌을 시료로 하고, 대조 제1 시약 및 제2 시약을 사용하여 시료 중의 L-FABP의 측정을 행하였다.
(3) 참고예 2a
상기 동결 융해 오줌을 시료로 하고, 500mmol/L 구아니딘염산염을 함유하는 대조 제1 시약 및 제2 시약을 사용하여 시료 중의 L-FABP의 측정을 행하였다.
(4) 참고예 2b
상기 동결 융해 오줌을 시료로 하고, 500mmol/L 구아니딘술팜산염을 함유하는 대조 제1 시약 및 제2 시약을 사용하여 시료 중의 L-FABP의 측정을 행하였다.
(5) 참고예 2c
상기 동결 융해 오줌을 시료로 하고, 500mmol/L 아미노구아니딘염산염을 함유하는 대조 제1 시약 및 제2 시약을 사용하여 시료 중의 L-FABP의 측정을 행하였다.
2. 결과
실시예 2a, 2b, 대조예 B, 참고예 2a 내지 2c, 각각의 시험에 있어서 측정된 각 시료의 순 흡광도를, 표준액을 시료로 하여 작성한 검량선을 사용하여 L-FABP 농도로 환산하였다. 기준 방법을 사용하여 구한 각 시료의 L-FABP 농도(기준 측정값)를 x축, 각각의 시험으로부터 구해진 L-FABP 농도(시험 측정값)를 y축으로 하여, 기준 측정값에 대한 각 시험 측정값의 상관 관계를 최소 제곱법에 의해 검토하여, 표 1에 나타냈다.
Figure 112017091521842-pct00010
대조예 B에 있어서의 측정값과 기준 측정값의 R2는 0.458로 낮고, 대조예 B의 조건이 임상 검사의 검체로서 사용되는 오줌을 시료로 하는 측정에는 적용할 수 없음이 확인되었다. 한편, 실시예 2a, 실시예 2b에 있어서의 측정값과 기준 측정값의 상관 관계는, 모두 양호하였다. 이로부터, 식(1)의 화합물 및 식(2)의 화합물은, 기준 측정값과의 상관 관계를 손상시키지 않고, 증감 효과를 발휘할 수 있으며, 또한 오줌 중의 L-FABP와 표준 물질의 면역 반응성을 동질로 할 수 있음이 확인되었다.
또한, 참고예 2a 내지 2c에 있어서의 측정값과 기준 측정값의 상관 관계는, 대조예 B를 상회하기는 했지만 실시예 2a, 실시예 2b를 하회하였다. 이로부터, 식(1)의 화합물 및 식(2)의 화합물의 효과는, 참고예의 화합물과 공통인 부분 구조(NH2-C=N-)에 더하여, 식(1) 및 식(2)의 화합물이 갖는 환상 구조가 관여하고 있을 가능성이 시사되었다.
[실시예 3] LTIA에 있어서의 본 발명의 화합물의 적합한 농도의 확인 1
식(1)의 화합물(벤즈아미딘염산염: BA)의 적합한 농도를 검토하였다.
1. 조작
(1) 실시예 3
동결 융해 오줌 12예(L-FABP 농도: 6ng/mL 내지 130ng/mL)를 시료로 하고, 표 2 기재된 농도로 식(1)의 화합물(벤즈아미딘염산염: BAH)을 함유하는 대조 제1 시약 및 제2 시약을 사용하여 시료 중의 L-FABP의 측정을 행하였다.
2. 결과
실시예 3에 있어서 측정된 각 시료의 순 흡광도를, 표준액을 시료로 하여 작성한 검량선을 사용하여 L-FABP 농도로 환산하였다. 기준 방법을 사용하여 구한 각 시료의 L-FABP 농도(기준 측정값)를 x축, 각각의 시험으로부터 구해진 L-FABP 농도(시험 측정값)를 y축으로 하여, 기준 측정값에 대한 각 시험 측정값의 상관 관계를 최소 제곱법에 의해 검토하고, 표 2에 나타냈다.
Figure 112017091521842-pct00011
식(1)의 화합물을 사용한 경우, 어느 농도에서도 양호한 상관성이 확인되었다. 또한 회귀식의 변동으로부터, 식(1)의 화합물의 사용 농도를 컨트롤함으로써 상관성을 유지한 채, 감도를 조정할 수 있다고 생각된다.
[실시예 4] 혈청에 있어서의 L-FABP의 첨가 회수 시험
1. 조작
첨가 L-FABP 농도가 표 3에 나타내는 농도가 되도록, 2배 농후 표준 물질 희석액과 건강 혈청을 사용하여 L-FABP 표준 물질을 희석하여, 첨가 회수 시험 시료를 제조하였다. 또한, 상기 시료 중의 건강 혈청의 최종 농도는 당초 농도의 1/2이다.
500mmol/L 벤즈아미딘염산염을 함유하는 대조 제1 시약, 제2 시약을 사용하여, 상기 시료의 L-FABP의 측정을 행하였다. 얻어진 측정값으로부터 회수율을 구하였다.
2. 결과
각 L-FABP 농도에 있어서의 회수율을 표 3에 나타냈다.
Figure 112017091521842-pct00012
시험한 첨가 L-FABP의 농도 범위에 있어서, 양호한 회수율이 얻어졌다. 본 발명의 방법은, 시료가 오줌인 것에 한정되지 않고, 혈청을 시료로 한 경우에 있어서도, 원하는 효과를 얻을 수 있음을 확인하였다. 오줌과 비교하여 공존하는 단백이 다종, 다량인 혈청에 있어서도 오줌을 시료로 한 경우와 동일한 효과가 얻어진 것으로부터, 본 발명의 화합물의 효과는 공존 단백에 대한 작용에 비해 L-FABP에 대하여 선택적이라고 생각된다.
실시예 5 및 6에 대해서는, 이하의 재료를 사용하여, 이하의 조건에서 측정을 행하였다.
(항L-FABP 항체 고정화 라텍스 입자 현탁액)
(1) Clone L 항체 고정화 라텍스 입자 현탁액의 제조
항L-FABP 항체 Clone L(시믹 홀딩스사제)을 0.36mg/mL 포함하는 20mmol/L Tris 완충액(pH 8.5) 13mL에, 평균 입경 0.27㎛의 1％ 라텍스 입자(세키스이가가쿠 고교사제) 현탁액 13mL를 첨가하여, 4℃에서 2시간 교반하였다. 이것에, 0.5％ BSA를 포함하는 20mmol/L Tris 완충액(pH 8.5) 13mL를 첨가하여, 4℃에서 1시간 교반하였다. 그 후, 5mmol/L MOPS 완충액(pH 7.0)으로 투석하여, Clone L 항체 고정화 라텍스 입자 현탁액을 얻었다.
(2) Clone 1 항체 고정화 라텍스 입자 현탁액의 제조
항L-FABP 항체 Clone 1(시믹 홀딩스사제)을 0.54mg/mL 포함하는 5mmol/L 트리스 완충액(pH 7.5) 8mL에, 평균 입경 0.25㎛의 1％ 라텍스 입자(세키스이가가쿠 고교사제) 현탁액 8mL를 첨가하여, 4℃에서 2시간 교반하였다. 이것에, 0.5％ BSA를 포함하는 5mmol/L 트리스 완충액(pH 7.5) 8mL를 첨가하여, 4℃에서 1시간 교반하였다. 그 후, 5mmol/L MOPS 완충액(pH 7.0)으로 투석하여 Clone 1 항체 고정화 라텍스 입자 현탁액을 얻었다.
(L-FABP 표준 물질)
L-FABP 표준 물질은, 특허문헌 1의 기재에 따라, 유전자 재조합에 의해 얻었다.
(L-FABP 기준 측정 방법: 기준 방법)
ELISA에 의한 체외 진단용 의약품(레나프로(등록 상표) L-FABP 테스트 TMB)을 기준 방법으로 하였다.
(대조 제1 시약)
300mmol/L KCl
0.2％ BPF(도요보사제, 카탈로그 번호 BPF-301)
0.32 내지 0.68％ Lipidure-BL403SE
(제2 시약)
5mmol/L MOPS 완충액(pH 7.0)
3.75Abs/mL Clone L 항체 고정화 라텍스 입자 현탁액(주)
1.25Abs/mL Clone 1 항체 고정화 라텍스 입자 현탁액(주)
(주) Abs는 280nm에 있어서의 흡광도를 나타낸다.
(표준 물질 희석액)
인산 완충액(pH 7.0)
0.1％ BPF(도요보사제, 카탈로그 번호 BPF-301)
(표준액)
L-FABP 표준 물질을, 표준 물질 희석액을 사용하여 원하는 농도로 조정하여, 표준액으로 하였다.
(동결 융해 오줌)
채취 후, -30℃에서 동결 보존되어 있던 부분 오줌을, 한번만 융해시켜 측정에 사용하였다.
(LTIA의 측정 조건)
(1) 분석 장치: 히타치 7170형 자동 분석 장치(히타치 하이테크놀러지즈사제)
(2) 시료량 및 시약량: 시료 3μL, 제1 시약 150μL, 제2 시약 50μL
(3) 반응 시간(반응 온도): 제1 시약 5분(37℃), 제2 시약 5분(37℃)
(4) 측광 포인트 및 측광 대상: 제2 시약 첨가 직후와 첨가 5분 후 사이의 흡광도 변화량
(5) 측정 파장 570nm/800nm
[실시예 5] LTIA에 있어서의 본 발명의 화합물의 적합한 농도의 확인 2
식(1)의 화합물(벤즈아미딘염산염) 및 식(2)의 화합물(2-아미노-2-티아졸린염산염 및 크레아티닌)을 사용하여, LTIA에 미치는 효과를 확인하였다.
1. 조작
(1) 실시예 5a, 5b, 5c
동결 융해 오줌 34예(L-FABP 농도: 0.6ng/mL 내지 123.0ng/mL)를 시료로 하여, 표 4에 기재된 농도의 벤즈아미딘염산염(구조식: 표 5 중의 5a, 실시예 5a), 2-아미노-2-티아졸린염산염(구조식: 표 5 중의 5b, 실시예 5b) 또는 크레아티닌(구조식: 표 5 중의 5c, 실시예 5c)을 함유하는 대조 제1 시약 및 제2 시약을 사용하여 시료 중의 L-FABP의 측정을 행하였다.
2. 결과
실시예 5a, 5b, 5c 각각의 시험에 있어서 측정된 각 시료의 순 흡광도를, 표준액을 시료로 하여 작성한 검량선을 사용하여 L-FABP 농도로 환산하였다. 기준 방법을 사용하여 구한 각 시료의 L-FABP 농도(기준 측정값)를 x축, 각각의 시험으로부터 구해진 L-FABP 농도(시험 측정값)를 y축으로 하여, 기준 측정값에 대한 각 시험 측정값의 상관 관계를 최소 제곱법에 의해 검토하고, 표 4에 나타냈다.
Figure 112017091521842-pct00013
Figure 112017091521842-pct00014
실시예 5a, 5b, 5c에 있어서의 측정값과 기준 측정값의 상관 관계는, 어느 농도에 있어서도 양호하였다. 또한, 오줌 중의 L-FABP와 표준 물질의 면역 반응성을 동질로 할 수 있음이 확인되었다.
[실시예 6] 시료 보존 조건에 대한 본 발명의 화합물의 효과의 확인
기준 방법인 레나프로(등록 상표) L-FABP 테스트 TMB의 첨부 문서에는, 시료인 오줌을 채취 후, 시료를 보존하는 경우에는, 냉장 또는 동결(-20 내지 -80℃)로 하는 취지가 기재되어 있다.
임상 시에는, 시료를 채취 후, 즉시 측정할 수 없는 경우가 있다. 적절하지 않은 시료의 보존은, 예기치 않은 측정값의 변동을 초래하는 경우가 있다. 본 발명의 시약을 사용하여, 실온에서 24시간 보존된 시료(오줌)의 측정을 행하였다.
1. 조작
(1) 실시예 6, 비교예 2
동결 융해 오줌 23예(L-FABP 농도: 0.3ng/mL 내지 111.9ng/mL)를 시료로 하여, 표 6에 기재된 농도의 식(1)의 화합물(벤즈아미딘염산염: BAH)을 함유하는 대조 제1 시약(실시예 6, 비교예 2), 및 제2 시약을 사용하여 시료 중의 L-FABP의 측정을 행하였다. 참고예로서 기준 방법의 첨부 문서에 기재된 조건(냉장 보존 24시간)에서 보존한 시료에 대해서도 동일한 시약을 사용하여 L-FABP의 측정을 행하였다.
2, 결과
실시예 6, 비교예 2, 참고예 각각의 시험에 있어서 측정된 각 시료의 순 흡광도를, 표준액을 시료로 하여 작성한 검량선을 사용하여 L-FABP 농도로 환산하였다. 보존 0시간의 시료를 사용하여 구한 각 시료의 L-FABP 농도(0시간 측정값)를 x축, 각각의 시험으로부터 구해진 L-FABP 농도(시험 측정값)를 y축으로 하여, 0시간 측정값에 대한 각 시험 측정값의 상관 관계를 최소 제곱법에 의해 검토하고, 표 6에 나타냈다.
Figure 112017091521842-pct00015
실온에서 24시간 보존한 시료에 대해서, 벤즈아미딘염산염 250mmol/L를 첨가한 시약으로 측정한 경우, 보존 0시간과의 상관은 양호하지만, 회귀식의 기울기가 커지게 되었다. 이것은, 실온에서 24시간 보존한 시료의 측정값이 보존 0시간의 측정값보다도 높아져 있음을 나타낸다. 한편, 벤즈아미딘염산염 500mmol/L를 첨가한 시약으로 측정한 경우, 보존 0시간과의 상관은 양호하며, 회귀식의 기울기의 변동은 15％ 이내였다. 기준 방법의 첨부 문서에 기재되지 않은 조건인 실온 24시간 동안 보존한 시료라도, 본 발명의 시약을 사용함으로써, 신선한 시료나 보존 상태가 좋은 시료와 동일하게 시료 중의 L-FABP를 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 시료의 보존액으로서 사용하는 것이 가능함도 나타났다.
본 발명에 따르면, 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을 시료 중의 L-FABP와 접촉시킴으로써, 시료 중의 L-FABP를 신속, 간편하게 면역학적 측정 방법으로 검출하는 것을 가능하게 한다.

Claims (17)

  1. 입자 응집 측정법을 이용하여 시료 중의 L-FABP(간장형 지방산 결합 단백질)를 항L-FABP 항체에 의해 검출하는 방법이며, 항L-FABP 항체, 및 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 방법:
    여기서, 항L-FABP 항체, 및 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정은,
    상기 화합물과 L-FABP의 존재가 의심되는 시료를 접촉시키는 공정 후, 항L-FABP 항체와 접촉시키는 공정의 순서로 행해지고,
    분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물은, 하기 식(1)로 표시되는 화합물 또는 그의 염 또는 에스테르, 및 하기 식(2)로 표시되는 화합물 또는 그의 염으로부터 선택된다.
    식(1)
    Figure 112022020771296-pct00016

    [식(1) 중, R1은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기이며, R2 내지 R6은 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기, 수산기, 카르복시기, 아미노기 또는 -SR7(R7은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R7이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)을 나타냄]
    식(2)
    Figure 112022020771296-pct00017

    [식(2) 중, R11 내지 R14는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기, 아미노기, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 또는 -SR16(R16은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R16이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)이고, 여기서, R11과 R12의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되고, R13과 R14의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되며, R15는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기이며,
    X11은, 질소 원자 또는 황 원자이며,
    X12 및 X13은 각각 독립적으로, 탄소 원자 또는 질소 원자이며,
    l1, l2, m1, m2 및 n은 각각 독립적으로, 0 또는 1이며,
    X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 각각 독립적으로, 단결합 또는 이중 결합이며, 여기서,
    상기 l1, l2, m1, m2 및 n의 값 그리고 X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선의 결합은, X11 내지 X13의 원자가에 따라서 적절히 정해지는 값 및 결합을 나타냄]
  2. 제1항에 있어서, 식(2)로 표시되는 화합물 또는 그의 염이, 이하의 화합물 또는 그의 염으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 방법.
    식(2)
    Figure 112022020771296-pct00018

    [식(2) 중, R11 내지 R14는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기, 아미노기, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 또는 -SR16(R16은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R16이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)이고, 여기서, R11과 R12의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되고, R13과 R14의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되며,
    R15는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기를 나타냄]에 있어서,
    X11 내지 X13, l1+l2, m1+m2, n(l1, l2, m1, m2 및 n은 각각 독립적으로, 0 또는 1을 나타냄) 및 이중 파선의 조합은,
    (a) X11은 황 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 2, m1+m2는 2, n은 0이며, X11과 X13 사이 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 단결합이거나,
    (b) X11은 황 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 1, m1+m2는 1, n은 0이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 단결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합이거나,
    (c) X11은 질소 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 2, m1+m2는 2, n은 1이며, X11과 X13 사이 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 단결합이거나,
    (d) X11은 질소 원자, X12 및 X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 1, m1+m2는 1, n은 1이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 단결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합이거나,
    (e) X11 및 X12는 질소 원자, X13은 탄소 원자이며, l1+l2는 1, m1+m2는 1, n은 0이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 단결합이거나, 또는
    (f) X11 및 X12 및 X13은 질소 원자이며, l1+l2는 0, m1+m2는 0, n은 1이며, X11과 X13 사이의 이중 파선은 단결합, X12와 X13 사이의 이중 파선은 이중 결합임]
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항L-FABP 항체, 및 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정에 있어서의, 상기 화합물의 농도가 300mmol/L 내지 500mmol/L인, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항L-FABP 항체가 불용성 담체에 고정화되어 있는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 불용성 담체가, 라텍스 입자 또는 금속 콜로이드 입자인, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항L-FABP 항체가, 서로 인식 부위가 다른 2종 이상의 모노클로날 항체인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 서로 인식 부위가 다른 2종 이상의 모노클로날 항체가, 라텍스 입자에 각각 고정화되어 있으며, 라텍스 면역 비탁법에 의해 L-FABP를 검출하는, 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시료가 오줌, 전혈, 혈청 또는 혈장인, 방법.
  9. 입자 응집 측정법을 이용하여, 시료 중의 L-FABP를, 항L-FABP 항체에 의해 검출하기 위한 키트:
    여기서, 상기 키트는 제1 시약 및 제2 시약을 포함하고,
    제1 시약은 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을 포함하며,
    제2 시약은 항L-FABP 항체를 고정화한 불용성 담체 입자를 포함하고,
    분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물은, 하기 식(1)로 표시되는 화합물 또는 그의 염 또는 에스테르, 및 하기 식(2)로 표시되는 화합물 또는 그의 염으로부터 선택된다.
    식(1)
    Figure 112022020771296-pct00020

    [식(1) 중, R1은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기이며, R2 내지 R6은 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기, 수산기, 카르복시기, 아미노기 또는 -SR7(R7은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R7이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)을 나타냄]
    식(2)
    Figure 112022020771296-pct00021

    [식(2) 중, R11 내지 R14는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기, 아미노기, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 또는 -SR16(R16은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R16이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)이고, 여기서, R11과 R12의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되고, R13과 R14의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되며, R15는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기이며,
    X11은, 질소 원자 또는 황 원자이며,
    X12 및 X13은 각각 독립적으로, 탄소 원자 또는 질소 원자이며,
    l1, l2, m1, m2 및 n은 각각 독립적으로, 0 또는 1이며,
    X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 각각 독립적으로, 단결합 또는 이중 결합이며, 여기서,
    상기 l1, l2, m1, m2 및 n의 값 그리고 X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선의 결합은, X11 내지 X13의 원자가에 따라서 적절히 정해지는 값 및 결합을 나타냄]
  10. 시료 중의 L-FABP를 항L-FABP 항체에 의해 검출하기 위한 전처리 방법이며, 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 전처리 방법: 여기서,
    분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물은, 하기 식(1)로 표시되는 화합물 또는 그의 염 또는 에스테르, 및 하기 식(2)로 표시되는 화합물 또는 그의 염으로부터 선택된다.
    식(1)
    Figure 112022020771296-pct00022

    [식(1) 중, R1은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기이며, R2 내지 R6은 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기, 수산기, 카르복시기, 아미노기 또는 -SR7(R7은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R7이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)을 나타냄]
    식(2)
    Figure 112022020771296-pct00023

    [식(2) 중, R11 내지 R14는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기, 아미노기, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 또는 -SR16(R16은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R16이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)이고, 여기서, R11과 R12의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되고, R13과 R14의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되며, R15는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기이며,
    X11은, 질소 원자 또는 황 원자이며,
    X12 및 X13은 각각 독립적으로, 탄소 원자 또는 질소 원자이며,
    l1, l2, m1, m2 및 n은 각각 독립적으로, 0 또는 1이며,
    X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 각각 독립적으로, 단결합 또는 이중 결합이며, 여기서,
    상기 l1, l2, m1, m2 및 n의 값 그리고 X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선의 결합은, X11 내지 X13의 원자가에 따라서 적절히 정해지는 값 및 결합을 나타냄]
  11. 시료 중의 L-FABP를, 항L-FABP 항체에 의해 검출하기 위한 전처리 시약이며, 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을 포함하는 상기 전처리 시약: 여기서,
    분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물은, 하기 식(1)로 표시되는 화합물 또는 그의 염 또는 에스테르, 및 하기 식(2)로 표시되는 화합물 또는 그의 염으로부터 선택된다.
    식(1)
    Figure 112022020771296-pct00024

    [식(1) 중, R1은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기이며, R2 내지 R6은 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기, 수산기, 카르복시기, 아미노기 또는 -SR7(R7은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R7이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)을 나타냄]
    식(2)
    Figure 112022020771296-pct00025

    [식(2) 중, R11 내지 R14는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기, 아미노기, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 또는 -SR16(R16은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R16이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)이고, 여기서, R11과 R12의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되고, R13과 R14의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되며, R15는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기이며,
    X11은, 질소 원자 또는 황 원자이며,
    X12 및 X13은 각각 독립적으로, 탄소 원자 또는 질소 원자이며,
    l1, l2, m1, m2 및 n은 각각 독립적으로, 0 또는 1이며,
    X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 각각 독립적으로, 단결합 또는 이중 결합이며, 여기서,
    상기 l1, l2, m1, m2 및 n의 값 그리고 X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선의 결합은, X11 내지 X13의 원자가에 따라서 적절히 정해지는 값 및 결합을 나타냄]
  12. 입자 응집 측정법을 이용하여 시료 중의 L-FABP를 항L-FABP 항체에 의해 검출하는 방법에 있어서의, 측정 감도를 향상시키는 방법이며, 항L-FABP 항체, 및 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정을 포함하는 상기 방법:
    여기서, 항L-FABP 항체, 및 분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물을, L-FABP의 존재가 의심되는 시료와 접촉시키는 공정은,
    상기 화합물과 L-FABP의 존재가 의심되는 시료를 접촉시키는 공정 후, 항L-FABP 항체와 접촉시키는 공정의 순서로 행해지고,
    분자 내에 NH2-C=N-의 부분 구조와 환상 구조를 갖는 화합물은, 하기 식(1)로 표시되는 화합물 또는 그의 염 또는 에스테르, 및 하기 식(2)로 표시되는 화합물 또는 그의 염으로부터 선택된다.
    식(1)
    Figure 112022020771296-pct00026

    [식(1) 중, R1은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기이며, R2 내지 R6은 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기, 수산기, 카르복시기, 아미노기 또는 -SR7(R7은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R7이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)을 나타냄]
    식(2)
    Figure 112022020771296-pct00027

    [식(2) 중, R11 내지 R14는 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기, 아미노기, 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 또는 -SR16(R16은, 수소 원자, 수산기 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수 1, 2 또는 3의 알킬기를 나타낸다. R16이 복수 존재할 때는, 각각 동일한 기여도 상이한 기여도 됨)이고, 여기서, R11과 R12의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되고, R13과 R14의 양방이 존재하는 경우에는 각각 하나로 되어 카르보닐기를 형성하고 있어도 되며, R15는, 수소 원자, 할로겐 원자 또는 분지되어 있어도 되는 탄소수가 1, 2 또는 3인 알킬기이며,
    X11은, 질소 원자 또는 황 원자이며,
    X12 및 X13은 각각 독립적으로, 탄소 원자 또는 질소 원자이며,
    l1, l2, m1, m2 및 n은 각각 독립적으로, 0 또는 1이며,
    X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선은 각각 독립적으로, 단결합 또는 이중 결합이며, 여기서,
    상기 l1, l2, m1, m2 및 n의 값 그리고 X11과 X13 사이의 이중 파선 및 X12와 X13 사이의 이중 파선의 결합은, X11 내지 X13의 원자가에 따라서 적절히 정해지는 값 및 결합을 나타냄]
  13. 삭제
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