CN108445222A

CN108445222A - 一种定量检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒及制备方法

Info

Publication number: CN108445222A
Application number: CN201810102449.7A
Authority: CN
Inventors: 陈志强; 胡国富; 朱炎
Original assignee: Zhejiang Ai Ming Bio Technology Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Ai Ming Bio Technology Co Ltd
Priority date: 2018-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2018-08-24

Abstract

本发明提供了一种定量检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，其特征在于，包括：心型脂肪酸结合蛋白校准品、偶联有抗生物素抗体的磁微粒、吖啶类衍生物标记的心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体、生物素标记心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体、化学发光底物和质控品。同时，试剂盒的制备方法包括：以心型脂肪酸结合蛋白纯品原料配制校准品；制备吖啶类衍生物标记的抗体；制备生物素化抗体；以抗生物素抗体偶联磁微粒；分装上述校准品、标记物混合液和化学发光底物；组装为成品。本发明的试剂盒灵敏度高，特异性好，定量检测结果准确度高，使用成本低，更易推广应用。

Description

一种定量检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种定量检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒及制备方法。

背景技术

心型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)是心脏中富含的一种新型小胞质蛋白，它具有高度心脏特异性 (也就是主要在心脏组织中表达)。心肌缺血性损伤出现后，h-FABP 可以早在胸痛发作后 1 至 3 小时在血液中被发现，6 至 8 小时达到峰值而且血浆水平在 24 至30 小时内恢复正常。心脏脂肪酸结合胞质蛋白由 132 个氨基酸组成，分子量为 15 kDa。h-FABP 基因位于染色体 I 上。它是心脏最丰富的蛋白质之一。h-FABP 结合两个脂肪酸分子并参与脂肪酰基辅酶 A 的运输，活跃于氧化过程，从而在线粒体中产生能量。

心型脂肪酸结合蛋白检测在心血管疾病的诊断应用主要表现在三个方面：一是h-FABP 与急性心肌梗死。由于 h-FABP 可以早在胸痛发作后 1 至 3 小时在血液中被发现，故 h-FABP 能够提供最强的诊断能力，尤其是在急性缺血事件的前 6 小时内，有助于快速危险分层和更早预测患者预后。二是 h-FABP 和手术后急性心肌损伤。h-FABP 用于早期检测心肌损伤还被延伸到心脏手术。在心脏手术中松开主动脉钳夹后 h-FABP 血清浓度比 CK-MB 和 TnT 更早达到最高水平。h-FABP 释放量反映心肌损伤的程度。三是 h-FABP与急性冠脉综合征(ACS)。h-FABP在ACS发病早期可迅速释放到血液中，对于ACS 的诊断具有时间优势，同时对心肌损伤具备高特异性、高灵敏度、高符合率的特点。

现有技术检测方法主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金免疫层析法（GICA）、胶乳免疫比浊法(PETIA)。近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。但现有技术中对心型脂肪酸结合蛋白的检测方法一般都有各自的不足：酶联免疫法检测 h-FABP：酶联免疫检测操作过程复杂，不能一蹴而就；敞开式加样有潜在污染风险；酶联检测板难以克服的边缘受热不均导致的干扰效应；，固-液反应试验时间长，不适合急诊的快速检测。胶乳免疫比浊法检测 h-FABP：抗体因素：抗原或抗体量过剩时易出现可溶性复合物，造成测定误差；检测结果受血脂影响，尤其是低稀释度时，脂蛋白的小颗粒可形成浊度，使得测定值假性升高；无论是透射比浊还是散射比浊，入射光波长均影响浊度测定的灵敏度，血清成分存在能吸收部分入射光的风险，透射比浊法误测为被检测物假性升高，散射比浊法误测为被检测物假性降低；血清内源性光散射会对免疫浊度检测造成干扰，血清中的乳糜颗粒（CM）、极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）等都会产生内源性杂散光，血清蛋白的荧光对浊度测定也会产生干扰。现有技术在心型脂肪酸结合蛋白免疫分析产品的应用定量检测的技术存在灵敏度低，特异性差的缺点限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。

发明内容

本发明提供一种定量检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒及制备方法，克服现有技术的灵敏度低，特异性差的缺点。

一方面，本发明提供了一种定量检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，本发明的试剂盒包括：

1）心型脂肪酸结合蛋白校准品；

2）偶联有抗生物素抗体的磁微粒；

3）吖啶类衍生物标记的心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体

4）生物素标记心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体；

5）化学发光底物；

6）质控品。

所述抗生物素抗体是一种高亲和力羊单克隆抗体（SMAs），羊单克隆抗体的高亲和力抗体具有优于常规啮齿动物单克隆抗体，其中靶标存在于低浓度，或其中目标是一个半抗原或小分子的优点。使用高亲和力的形状记忆合金还赋予提高检测的灵敏度和精确度。

另一方面，本发明提供了一种定量检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒的制备方法，该方法包括：

1)以心型脂肪酸结合蛋白纯品原料配制校准品；

2)制备吖啶类衍生物标记的抗体；

3）制备生物素化抗体；

4)以抗生物素抗体偶联磁微粒；

5)分装上述校准品、标记物混合液和化学发光底物；

6)组装为成品。

在上述根据本发明的试剂盒及其制备方法中，所述载体可以为固相载体、磁性微粒、微孔板、塑料管或塑料珠；

在其中一个实施例中，所述载体优选为磁性微粒：由于其表面积大及结合蛋白能力强，所述磁微粒为粒径2.5～3μm，所述活性基团为氨基或羧基，所述磁微粒的使用浓度为10mg/mL。

所述吖啶类衍生物标记物可以为吖啶酯，吖啶酮类化合物，吖啶磺酰胺类化合物或吖啶基氨基乙酸；

在其中一个实施例中，标记物还可以为磺酸丙基吖啶酸-NHS酯。

所述生物素-抗生物素抗体系统可使用异硫氰酸荧光素（FITC）-FITC抗体系统或生物素-链酶亲和素替换，生物素化抗体使用FITC标记抗体替换，抗生物素抗体包被抗体使用FITC抗体包被或偶联磁性微粒、链酶亲和素偶联磁性微粒。

所述化学发光底物为由H₂O₂和HNO₃组成；所述化学发光底物B由聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和NaOH。

在根据本发明的方法中，其中所述步骤2）中的制备吖啶类衍生物标记的抗体可以包括以下过程：

1）称取H-FABP单抗适量，使用0.05mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液（CB）调正至1mg/mL；

2）吖啶类衍生物与抗体按照1:15摩尔计算，溶于二甲基甲酰胺（DMF），将两者混合，室温继续反应30分钟；

3）反应液移至透析袋(截留分子量8000～12000)，使用0.01M pH 7.2的PBS透析24小时;

4）加入等体积甘油和体积比0.1%的生物防腐剂ProClin 300(PC-300)。

在根据本发明的方法中，其中所述步骤3）中的制备生物素化抗体可以包括以下过程：

1）加入15倍（摩尔比）已活化的长链磺化生物素（Sulfo‐NHS‐LC‐Biotin），2～8℃ 反应2小时，再转入室温继续反应30分钟;

2）取适量Anti‐H-FABP单抗，0.01M pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）透析纯化；

3）加入15倍（摩尔比）已活化的长链磺化生物素Sulfo‐NHS‐LC‐Biotin ，2～8℃ 反应2小时，再转入室温继续反应30分钟；

4）再反应液移至透析袋(截留分子量8000～12000)，使用0.01M pH 7.2的PBS透析24小时；

5）加入等体积甘油和体积比0.1％ PC-300。

在根据本发明的方法中，其中所述步骤4）中的以抗生物素抗体磁微粒可以包括以下过程：

1) 取100mL 0.05mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入 10 mg 磁性微粒和0.5 mg抗生物素抗体;

2) 加入10mg/mL 碳二亚盐酸盐溶液4μL ，反应2小时，在磁场作用下移去上清液;

3) 加入0.01M pH 7.2的PBS 10 mL，混匀，移去上清液;

4) 使用0.01M pH 7.2的PBS 重复洗涤3次，稀释至0.75mg/mL。

在本发明的其中一个实施例中，H-FABP不同配对的生物素化单克隆抗体和标记单克隆抗体要求这些H-FABP单克隆抗体，纯度不低于90％；

其中，生物素化抗体浓度为 0.18μg/ mL，低或高于于此浓度，会使H-FABP定量检测的灵敏度偏低；

在本发明的过程中，发明人发现，H-FABP定量检测使用的双抗体夹心一步法的反应模式和反应条件最终也会影响试剂盒。

本发明“H-FABP免疫分析定量测定试剂盒”可以准确地定量检测出病人H-FABP的含量，可以H-FABP含量，监测心肌缺血性损伤，H-FABP测定可用于心肌损伤得早期发现。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。根据本发明的试剂盒，吖啶脂标记的H-FABP单抗与生物素化H-FABP单抗和被测样品的H-FABP抗原形成双抗体夹心的结构，因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。

进一步地，本发明中对抗体及生物素-生物素抗体系统进行了筛选及优化，其结果将影响包括标记抗体与生物素化抗体的活性、载体的吸附性能和变异大小等；最终影响试剂盒的灵敏度和特异性。

更进一步地，本发明对试剂盒的缓冲液系统进行了优化，缓冲液将影响定量检测的准确性，降低非特异结合、降低免疫反应信噪干扰，提高试剂的分析灵敏度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是试剂盒校准曲线图，以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，采用双对数进行曲线拟合，其中线性方程为y=0.9648x+3.7282，r= 0.9998；

图2为试剂盒制备方法的流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 H-FABP吖啶脂标记单抗的制备

1)称取H-FABP单抗适量，使用0.05mol/L pH 9.5 CB 调正至1mg/mL；

2)吖啶脂与抗体按照1:15摩尔计算，溶于DMF，将两者混合，室温继续反应30分钟；

3)反应液移至透析袋(截留分子量8000～12000)，使用0.01M pH 7.2的PBS透析24小时;

4)加入等体积甘油和体积比0.1％的PC-300。

实施例2 制备本发明的H-FABP定量测定试剂盒

一、吖啶脂抗体制备

1. 吖啶脂标记单抗稀释液Buffer A :

Buffer A ： 0.01-0.1M PBS pH 7.2，0.1%-1%BSA，0.2% PC-300

2. 吖啶脂标记单抗浓度选定：

吖啶脂标记单抗的工作浓度大于0.41μg/ mL 。

二、H-FABP校准品的制备

用0.01M PBS pH 7.2，0.5%牛血清白蛋白（BSA）稀释液稀释H-FABP抗原，配制标准品浓度为1、5、25、100、500ng/mL 五种浓度的校准品。

三、吖啶脂标记的抗体制备：

1）称取H-FABP单抗适量，使用0.05mol/L pH 9.5 CB 调正至1mg/mL；

2) 吖啶脂与抗体按照1:15摩尔计算，溶于DMF，将两者混合，室温继续反应30分钟 ;

3) 反应液移至透析袋(截留分子量8000～12000)，使用0.01M pH 7.2的PBS透析24小时;

4) 加入等体积甘油和体积比0.1％ PC-300。

所述吖啶酯标记物可以为吖啶酮类化合物，吖啶磺酰胺类化合物或吖啶基氨基乙酸。

四、生物素化抗体制备：

1）称取Anti‐H-FABP单抗适量，0.01M pH 7.2的PBS 缓冲液透析纯化；

2）加入15倍（摩尔比）已活化的长链磺化生物素Sulfo‐NHS‐LC‐Biotin ，2～8℃ 反应2h后再转入室温继续反应30min ；

3）反应液移至透析袋(截留分子量8000～12000)，使用0.01M pH 7.2的PBS透析24小时；

4）加入等体积甘油和0.1％ PC-300。

五、抗生物素抗体偶联磁微粒：

1）100mL 0.05mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入 10 mg 磁性微粒和0.5mg抗生物素抗体；

2）然后加入10mg/mL 碳二亚盐酸盐溶液4μL ，反应2小时，在磁场作用下移去上清液；

3）加入0.01M pH 7.2的PBS 10 mL，混匀，移去上清液；

4）使用0.01M pH 7.2的PBS 重复洗涤3次，稀释至0.75mg/mL。

六、质控品制备：

用0.01M PBS pH 7.2，50% 小牛血清作为校准品稀释液稀释H-FABP抗原，配制标准品浓度为4、150ng/mL 2种浓度的质控品。

七、化学发光底物液制备：

化学发光液A:

由H₂O₂ 和HNO₃组成，H₂O₂质量分数1.6%，HNO₃ 浓度为0.1 mol/L 用棕瓶分装室温保存。

化学发光液B:

由Triton X-100 和NaOH 组成，Triton X-100 浓度为0.1 mol/L ，NaOH浓度为0.36mol/L用棕瓶分装室温保存。

八、清洗液：

0.02M pH 7.2的Tris-HCl 溶液；

Tween -20 质量分数0.05%；

NaCl 浓度为0.15 mol/L。

九、成品组成。

实施例3 缓冲液Buffer

缓冲液作为本发明的重要组成，其是稀释生物素化抗体、吖啶类衍生物标记的抗体、偶联有抗生物素抗体的磁微粒的缓冲液，使用BSA、海藻糖与酪蛋白的组合配方，改善磁微粒非特异性物理吸附免疫球蛋白的情况，加入羊免疫球蛋白G（羊IgG）、鼠IgG，进一步降低特异结合，减少HAMA效应，提高试剂的分析灵敏度。

Buffer A：0.01-0.1M PBS pH 7.2，质量比0.1%-1%BSA，体积比0.2% PC-300；

Buffer B：用0.01-0.1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（ HEPES），150mM NaCl，质量比0.1%-1%BSA，质量比0.1%-5% 海藻糖，质量比0.5%-1% 酪蛋白钠盐，兔IgG 5mg/mL，羊IgG 3mg/mL，鼠IgG 1 mg/mL ，体积比0.2% PC-300，pH 7.2。

在其中一个实施例中，海藻糖还可以为蔗糖或者果糖。可使用鼠IgG，最好使用鼠IgG₃。

分析灵敏度=2* (0值 RLU SD)* 5/(校准品RLU mean - 0值 RLU mean)

使用Buffer B 作为AE-H-FABP、M 试剂的稀释液，其分析灵敏度由Buffer A的0.074μg/mL降至0.0202μg/mL，Buffer B 缓冲液起到降低非特异结合、降低免疫反应信噪干扰，提高试剂的分析灵敏度。

比值=（37℃信号均值-4℃信号均值）/ 4℃信号均值

使用Buffer A、 Buffer B 缓冲液分别稀释吖啶酯‐H-FABP抗体结合物（AE- H-FABP）、磁微粒‐抗生物素(M)试剂试剂。分别放置 4℃、37℃各9天。两种贮存条件下，Buffer A 缓冲液稀稀释的试剂放置37℃条件下其信号值(RLU)与4℃相比显著下降，Buffer A 缓冲液不能有效保护抗体的免疫活性。Buffer B 缓冲液稀释AE-H-FABP、M 试剂放置37℃条件下与放置4℃相比其RLU值降低在10%以内，试剂的免疫活性无明显下降，其稳定性符合定量检测的要求。

实施例3 H-FABP原料的筛选

H-FABP抗体原料的筛选，对H-FABP定量检测的灵敏度有较大影响；

本发明中，发明人对多种H-FABP单克隆抗体进行筛选，抗体的选择，将直接影响本发明试剂盒的灵敏度和准确性。

选用选择4 株商业化H-FABP单克隆抗体，4 种单克隆抗体编号记H-FABP 1-4#（1-4#为1-4号编号），分别进行标记吖啶脂和生物素化。

结果统计：

使用吖啶脂标记心型脂肪酸结合蛋白3#单抗与生物素化H-FABP2#配对效果最佳，本发明的试剂盒的线性范围最高至500 ng/mL，选定的抗体配对在HOOK实验中，样本浓度1000ng/mL RLU值仍大于样本浓度500 ng/mL RLU值，心型脂肪酸结合蛋白的临床阈值小于5ng/mL，本发明的HOOK效应不低于1000 ng/mL，远高于临床阈值。

实施例5 本发明的试剂盒的方法学鉴定

按照该产品的技术标准要求对实施例2中制备的试剂盒进行检定，

（1）试剂盒灵敏度实验

以S0校准品进行20孔重复测定，其平均值加上两倍标准差带入曲线方程所得的浓度值为试剂盒的灵敏度，其灵敏度为0.0202ng/mL。

（2）试剂盒特异性实验

与其类似物作交叉反应实验，交叉反应率<0.01%。

（3）试剂盒精密性实验

批内变异

取4、150ng/mL两水平质控品分别进行10孔平行实验，计算测定值的平均值（）和标准差（s）。按公式CV＝s/×100％计算变异系数，批内变异系数CV分别为5.49%、4.02%。

批间变异

选择5份不同浓度的血清样品对每份血清进行3次重复测定，计算其批间变异系数（CV％），批间变异CV小于5%。

（4）试剂盒准确性实验

将高浓度的校准品原料，用正常人血清稀释成四个不同浓度值，每个浓度做5孔平行实验，分别计算回收率在91-108%范围内。

（5）试剂盒稳定性实验

试剂盒保存温度为2-80⁰C，经过15个月的测定试剂盒的各项指标均满足要求，

考虑到运输和使用过程中对试剂盒的影响，我们进行37⁰C ，7天的加速实验，实验结果表明试剂盒的各项指标完全符合要求。

说明“心型脂肪酸结合蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒”的灵敏度、特异性、精密性、准确性和稳定性是完全合格的。

本发明“心型脂肪酸结合蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒”可以准确地定量检测出病人H-FABP的含量，可以根据H-FABP含量，对心血管疾病的病情进行监测、疗效评价和预后的判断有重要意义。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。根据本发明的试剂盒，吖啶脂标记的H-FABP单抗与载体上包被的H-FABP单抗和被测样品的H-FABP抗原形成双抗体夹心的结构，因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。

进一步地，本发明中对抗体及生物素-生物素抗体系统进行了筛选及优化，其结果将影响包括标记抗体与包被抗体的活性、载体的吸附性能和变异大小等；最终影响试剂盒的灵敏度和特异性。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种定量检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒，其特征在于，包括：心型脂肪酸结合蛋白校准品、偶联有抗生物素抗体的磁微粒、吖啶类衍生物标记的心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体、生物素标记心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体、化学发光底物和质控品。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述磁性微粒粒径2.5～3μm，所述磁微粒的活性基团为氨基或羧基，所述磁微粒的使用浓度为10mg/mL。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述吖啶类衍生物标记物为吖啶酯、吖啶酮类化合物、吖啶磺酰胺类化合物、吖啶基氨基乙酸或磺酸丙基吖啶酸-NHS酯。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液，用于稀释生物素化抗体、吖啶类衍生物标记的抗体、偶联有抗生物素抗体的磁微粒，所述缓冲液包括：0.01-0.1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸， 150mM NaCl，质量比0.1%-1%的牛血清白蛋白，质量比0.1%-5% 海藻糖，质量比0.5%-1% 酪蛋白钠盐，兔免疫球蛋白G 5mg/mL，羊免疫球蛋白G3mg/mL，鼠免疫球蛋白G 1 mg/mL ，体积比0.2%的生物防腐剂ProClin 300；所述缓冲液的pH值为7.2。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述鼠免疫球蛋白G为鼠免疫球蛋白G₃。

6.一种定量检测心型脂肪酸结合蛋白的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：

（1）以心型脂肪酸结合蛋白纯品原料配制校准品；

（2）制备吖啶类衍生物标记的抗体；

（3）制备生物素化抗体；

（4）以抗生物素抗体偶联磁微粒；

（5）分装上述校准品、标记物混合液和化学发光底物；

（6）组装为成品。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述以抗生物素抗体偶联磁微粒，包括：

（1）取100mL 0.05mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入 10 mg 磁性微粒和0.5 mg抗生物素抗体;

（2）加入10mg/mL 碳二亚盐酸盐溶液4μL ，反应2小时，在磁场作用下移去上清液;

（3）加入0.01M pH 7.2的磷酸盐缓冲液 10 mL，混匀，移去上清液;

（4）使用0.01M pH 7.2的磷酸盐缓冲液重复洗涤3次，稀释至0.75mg/mL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述制备吖啶类衍生物标记的抗体包括：

（1）称取心型脂肪酸结合蛋白单抗适量，使用0.05mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液调正至1mg/mL；

（2）吖啶类衍生物与抗体按照1:15摩尔计算，溶于二甲基甲酰胺，将两者混合，室温继续反应30分钟；

（3）反应液移至截留分子量8000～12000的透析袋，使用0.01M pH 7.2的磷酸盐缓冲液透析24小时;

（4）加入等体积甘油和体积比0.1%的生物防腐剂ProClin 300；

所述制备生物素化抗体包括：

（1）加入摩尔比15倍已活化的长链磺化生物素，2～8℃ 反应2小时，再转入室温继续反应30分钟;

（2）取适量抗-心型脂肪酸结合蛋白单抗，0.01M pH 7.2的磷酸盐缓冲液透析纯化；

（3）加入摩尔比15倍已活化的长链磺化生物素，2～8℃ 反应2小时，再转入室温继续反应30分钟；

（4）反应液移至截留分子量8000～12000的透析袋，使用0.01M pH 7.2的磷酸盐缓冲液透析24小时；

（5）加入等体积甘油和体积比0.1%的生物防腐剂ProClin 300。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于生物素化抗体浓度为0.18μg/ mL。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于吖啶脂标记单抗的工作浓度大于0.41μg/mL。