CN104977404A - 抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂，包括试剂R1和试剂R2，其中试剂R2包括胶乳微粒，试剂R1的PH值为5.5-6.0。本发明抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂组成简单，且具有良好的通用性，针对胶乳增强免疫比浊试剂，可以比较有效地消除大多数类风湿因子的干扰，提高检测结果的特异性和准确性。

Description

抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂
技术领域
本发明涉及一种免疫检测试剂，特别是一种抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂。
0.01-0.2％(W/V)指每100ml溶剂中添加0.01-0.2g溶质，本文中类似之处意见同此之处。
背景技术
胶乳增强免疫比浊法是在免疫比浊法基础上发展的一种测定人体液特种标志蛋白含量的检测方法。其基本原理是：将待测物质相对应的具有高特异性、高亲和力抗体包被至纳米胶乳微球上，当此微球与含有待测样本混合时，在合适的反应条件下，抗体与样本中抗原特异结合，形成抗原-抗体-胶乳微粒复合物，在短时间内迅速聚集在一起，改变反应液的散光或透光性能，并且在一定范围内，反应液吸光度值变化与待测样本中的抗原含量成正比关系，利用标准品绘制标准曲线，便可根据样本吸光度值变化测定待测物含量。由于抗体特异性识别抗原，所以该方法具有很好的检测特异性；纳米胶乳微球的引入使反应液浊度变化更为显著，从而提高试验的灵敏度，能测定体液中微量蛋白含量；同时胶乳增强免疫比浊法能利用普通生化分析仪进行检测，操作简单，容易实现自动化，不易受人为操作和外界因素干扰，检测稳定性和重复性好，可快速、准确获得检测结果，对疾病早期诊断和治疗具有重要临床意义。
胶乳增强免疫比浊法常规检测的一个限制是易于受到由可能存在于测试样品中的嗜异性抗体引起的干扰，尤其是类风湿因子引起的干扰。类风湿因子(rheumatoid factor，RF)是抗人IgG分子Fc片段上抗原决定族的特异性抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。在商业免疫类检测试剂中所采用的抗体大多是动物来源的IgG类抗体，Fc段与人IgG的Fc段具有较高的同源性，能被RF识别并结合，所以在待测物质为阴性、RF阳性的检测样本中，免疫检测试剂有可能被RF捕获产生信号，从而导致假阳性结果。
免疫检测试剂研制中，减少类风湿因子或异嗜性干扰的方法通常有：(1)从样品中去除干扰性的免疫球蛋白或使其失活。比如使用IgG固相吸附剂吸附样本中的类风湿因子，或使用含有2-巯基乙醇的稀释液稀释样本，以降解IgM型类风湿因子，但这会使检测操作复杂化，并且有可能在去除干扰蛋白的同时也减少了待测物质的含量或活性。(2)使用减少干扰的封闭剂，大多为IgG，市场上有许多商品化的封闭剂。但由于类风湿因子或异嗜性抗体的多样化，以及各种产品所使用的抗体不同，目前尚未有一种产品可以有效消除所有干扰，通常需要使用不同产品进行组合、筛选，不但增加工作量、挺高试剂成本，另一方面由于使用多种不明成分的封闭剂，也不可控制地引入新的干扰检测结果的因素。(3)修饰测定抗体以使其更不易与类风湿因子反应。目前最常使用的一种方法是将检测IgG抗体酶切去除Fc片段，用F(ab’)2替代完整的IgG，既保留其识别结合抗体的活性，又消除Fc的干扰，减少试剂的非特异性反应。但在IgG的酶切、纯化制备工艺中会损失一部分抗体且对抗体活性也有一定程度影响，提高试剂成本，更重要的是试剂制备过程进一步复杂，对控制试剂批间差设置了不可逾越的障碍，从而限制了此类试剂在临床上的推广。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开的抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂，试剂组成简单，且具有良好的通用性，针对胶乳增强免疫比浊试剂具有较为广泛的通用性，可以比较有效地消除大多数类风湿因子的干扰，提高检测结果的特异性和准确性。
本发明公开的抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂，包括试剂R1和试剂R2，其中试剂R2包括抗体致敏的胶乳微粒，试剂R1的PH值为5.5-6.0。优选为试剂R1的PH值为5.5-5.7。
本发明公开的抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂的一种改进，试剂R1还包括0.01-0.2％(W/V)的蛋白变性剂。优选为试剂R1还包括0.01-0.1％(W/V)的蛋白变性剂。
本发明公开的抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂的一种改进，蛋白变性剂为十二烷基硫酸钠、尿素、盐酸胍中的任一。
本发明方案中控制PH和加入蛋白变性剂是基于：类风湿因子或异嗜性抗体多为多重特异性抗体，相较于一般抗体与抗原的专一地特异性结合反应，其对不同物种的检测试剂抗体结合能力相对较弱，利用这种亲和力上的差异，适当降低检测反应pH值或加入适量的蛋白变性剂均可以解离蛋白间的相互作用，能在不影响检测抗体与待测抗原特异反应的前提下，减弱类风湿因子对检测抗体的非特异结合反应，从而有效消除类风湿因子对检测结果的干扰。
因此，本发明方案提出一种简单且通用的胶乳增强免疫比浊检测试剂的配置，从多个角度入手可以有效地消除大多数类风湿因子的干扰，提高检测结果的特异性和准确性，试剂组成简单，具有较高的灵敏度，针对大多数胶乳增强免疫比浊试剂具有较为广泛的通用性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明方案广泛通用地适用于多种胶乳增加免疫比浊试剂，包括而不限于采用胶乳增强免疫比浊法的铁蛋白检测试剂、胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂、胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂、降钙素原检测试剂、D二聚体检测试剂、肌钙蛋白I检测试剂等，以下实施例仅列举本发明方案对铁蛋白检测试剂、胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂、降钙素原检测试剂三种检测试剂的应用以说明本发明方案的优越性，但是这三种举例并非用于限制本发明方案的保护范围，需要表明的是本方案对包括铁蛋白检测试剂、胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂、降钙素原检测试剂在内绝大多数胶乳增加免疫比浊试剂均具有良好的通用性。
实施例一针对铁蛋白检测试剂(胶乳增强免疫比浊法)
铁蛋白检测试剂R2(pH7.4)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、5％海藻糖、0.1％铁蛋白多克隆抗体致敏的纳米胶乳微粒。
不同类风湿因子含量的铁蛋白样本制备：
在含有300μg/L铁蛋白纯品的样品中分别加入0、20、100、400IU/mL的类风湿因子，类风湿因子有两种来源，购自两个不同厂家(RF-Ⅰ、RF-Ⅱ)。
(1)不同pH值铁蛋白检测试剂R1的比较
铁蛋白检测试剂R1-A(pH7.4)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、1％PEG6000。
铁蛋白检测试剂R1-B(pH6.0)：100mM MES缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、1％PEG6000。
铁蛋白检测试剂R1-C(pH5.8)：100mM MES缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、1％PEG6000。
铁蛋白检测试剂R1-D(pH5.7)：100mM MES缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、1％PEG6000。
铁蛋白检测试剂R1-E(pH5.5)：100mM MES缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、1％PEG6000。
以上配制的五种铁蛋白检测试剂R1(R1-A、R1-B、R1-C、R1-D、R1-E，各试剂的PH不同)与同一试剂R2配套使用，对待测样本铁蛋白含量进行检测。结果如表11所示，低值RF(20IU/mL)对铁蛋白检测试剂基本没有干扰，两种高值RF都会对检测结果造成干扰，尤其是当试剂R1pH值在7.4时，检测结果受高值RF干扰较大，随R1pH值降低，RF干扰逐渐降低，当R1pH值为5.5时，铁蛋白含量检测结果基本不受添加的类风湿因子影响，与靶值一致。说明在一定范围内降低R1pH值能有效消除类风湿因子对检测结果的干扰，同时不会影响对目的铁蛋白的检出含量。
表11铁蛋白检测试剂R1不同pH对类风湿因子干扰的抑制比较
同时，将上述五套配制试剂与进口试剂对10份RF阳性血清标本进行铁蛋白含量检测，并用类风湿因子检测试剂检测样本中RF含量，进一步确认低pH值试剂R1能有效抑制血清中RF对铁蛋白含量检测的干扰，准确检测血清的铁蛋白含量。
表12铁蛋白检测试剂R1不同pH对RF阳性血清铁蛋白含量检测的比较
(2)蛋白变性剂对铁蛋白检测试剂受RF干扰的抑制作用的比较
铁蛋白检测试剂R1-A(pH7.4)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、1％PEG6000。
铁蛋白检测试剂R1-B(pH7.4)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、1％PEG6000、0.01％尿素。
铁蛋白检测试剂R1-C(pH7.4)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、1％PEG6000、0.05％尿素。
铁蛋白检测试剂R1-D(pH7.4)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、1％PEG6000、0.1％尿素。
铁蛋白检测试剂R1-E(pH7.4)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、1％PEG6000、0.2％尿素。
以上配制的五种铁蛋白检测试剂R1(R1-A、R1-B、R1-C、R1-D、R1-E，各试剂的蛋白变性剂用量不同)与同一试剂R2配套使用，对待测样本铁蛋白含量进行检测。结果如表13所示，通过在铁蛋白检测试剂R1中加入少量蛋白变性剂尿素，能部分抑制高值RF对检测试剂的干扰作用。
表13铁蛋白检测试剂R1中不同含量尿素对类风湿因子干扰的抑制作用
以上蛋白变性剂对铁蛋白检测试剂受RF干扰的抑制作用实施方案中，蛋白变性剂还可以用十二烷基硫酸钠或盐酸胍进行同等替换而不超出本发明要求的保护范围。蛋白变性剂在R1中的用量还可以为0.03％、0.05％、0.07％、0.08％、0.12％、0.15％、0.19％、0.2％以及0.01-0.2％范围内的其它任意值进行同等替换而不超出本发明要求的保护范围。
实施例二对胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂(胶乳增强免疫比浊法)
胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R2(pH7.5)：20mM Tris缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、5％海藻糖、0.15％胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体致敏的纳米胶乳微粒。
不同类风湿因子含量的胃蛋白酶原Ⅰ样本制备：
在含有100μg/L胃蛋白酶原Ⅰ纯品的样品中加入0、20、100、400IU/mL的类风湿因子，类风湿因子有两种来源，购自两个不同厂家(RF-Ⅰ、RF-Ⅱ)。
(1)不同pH值胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1的比较
胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1-A(pH7.4)：100mM MES缓冲液、300mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、0.5％PEG6000。
胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1-B(pH6.0)：100mM MES缓冲液、300mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、0.5％PEG6000。
胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1-C(pH5.8)：100mM MES缓冲液、300mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、0.5％PEG6000。
胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1-D(pH5.7)：100mM MES缓冲液、300mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、0.5％PEG6000。
胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1-E(pH5.5)：100mM MES缓冲液、300mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、0.5％PEG6000。
以上配制的五种胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1(R1-A、R1-B、R1-C、R1-D、R1-E，各试剂的PH不同)与同一试剂R2配套使用，对待测样本胃蛋白酶原Ⅰ含量进行检测。结果如表21所示，低值RF(20IU/mL)对胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂基本没有干扰，两种高值RF都会对检测结果造成干扰，尤其是当试剂R1pH值在7.4时，检测结果受高值RF干扰较大，随R1pH值降低，RF干扰逐渐降低，但pH值从6.0到5.5变化，对RF的抑制效果变化不大，不能完全消除高值RF的干扰。
表21胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1不同pH对类风湿因子干扰的抑制比较
(2)蛋白变性剂对胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂受RF干扰的抑制作用的比较
胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1-A(pH6.0)：100mM MES缓冲液、300mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、0.5％PEG6000。
胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1-B(pH6.0)：100mM MES缓冲液、300mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、0.5％PEG6000、0.01％SDS(十二烷基硫酸钠)。
胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1-C(pH6.0)：100mM MES缓冲液、300mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、0.5％PEG6000、0.05％SDS。
胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1-D(pH6.0)：100mM MES缓冲液、300mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、0.5％PEG6000、0.1％SDS。
胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1-E(pH6.0)：100mM MES缓冲液、300mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、0.5％PEG6000、0.2％SDS。
以上配制的五种胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1(R1-A、R1-B、R1-C、R1-D、R1-E，各试剂的蛋白变性剂用量不同)与同一试剂R2配套使用，对待测样本胃蛋白酶原Ⅰ含量进行检测。结果如表22所示，两种RF产生的干扰效果不同，当R1pH值为6.0，样本中RF-Ⅰ值高达100IU/mL时，胃蛋白酶原Ⅰ的检测基本不受影响，而RF-Ⅱ对胃蛋白酶原Ⅰ的检测干扰较明显。通过在胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1中加入适量蛋白变性剂SDS，能有效抑制并消除RF的干扰，同时不会影响对目的胃蛋白酶原Ⅰ的检出含量。
表22胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂R1中不同含量SDS对类风湿因子干扰的抑制作用
同时，将上述五套配制试剂与进口试剂对20份血清标本进行胃蛋白酶原Ⅰ含量的检测，并用类风湿因子检测试剂检测样本中RF含量，进一步确认SDS对血清中RF干扰的抑制作用，并且适量SDS对胃蛋白酶原Ⅰ含量的检测没有影响。试剂配方经过优化后，对血清胃蛋白酶原Ⅰ含量的检测结果与进口对照试剂基本一致(表23)。
表23SDS有效抑制RF对胃蛋白酶原Ⅰ的干扰
以上蛋白变性剂对胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂受RF干扰的抑制作用实施方案中，蛋白变性剂还可以用尿素或盐酸胍进行同等替换而不超出本发明要求的保护范围。蛋白变性剂在R1中的用量还可以为0.03％、0.07％、0.08％、0.12％、0.15％、0.19％、0.2％以及0.01-0.2％范围内的其它任意值进行同等替换而不超出本发明要求的保护范围。
实施例三针对降钙素原检测试剂(胶乳增强免疫比浊法)
降钙素原检测试剂R2(pH7.5)：20mM Tris缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、5％海藻糖、0.1％降钙素原多克隆抗体致敏的纳米胶乳微粒。
不同类风湿因子含量的降钙素原样本制备：
在含有0.5ng/mL降钙素原纯品的样品中加入0、20、100、400IU/mL的类风湿因子，类风湿因子有两种来源，购自两个不同厂家(RF-Ⅰ、RF-Ⅱ)。
(1)不同pH值降钙素原检测试剂R1的比较
降钙素原检测试剂R1-A(pH7.4)：10mM PB缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、2％PEG6000。
降钙素原检测试剂R1-B(pH6.0)：100mM MES缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、2％PEG6000。
降钙素原检测试剂R1-C(pH5.8)：100mM MES缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、2％PEG6000。
降钙素原检测试剂R1-D(pH5.7)：100mM MES缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、2％PEG6000。
降钙素原检测试剂R1-E(pH5.5)：100mM MES缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、2％PEG6000。
以上配制的五种降钙素原检测试剂R1(R1-A、R1-B、R1-C、R1-D、R1-E，各试剂的PH不同)与同一试剂R2配套使用，对待测样本降钙素原含量进行检测。结果如表31所示，两种RF均对PCT的检测有较大干扰，严重影响了对细菌性感染疾病的诊断。通过降低试剂R1pH值，能部分抑制RF的干扰，但在pH5.5-6.0的范围内无法完全消除RF的影响，需要再引入其他能有效抑制RF干扰的方法。
表31降钙素原检测试剂R1不同pH对类风湿因子干扰的抑制比较
(2)蛋白变性剂对降钙素原检测试剂受RF干扰的抑制作用的比较
降钙素原检测试剂R1-A(pH6.0)：100mM MES缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、2％PEG6000。
降钙素原检测试剂R1-B(pH6.0)：100mM MES缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、2％PEG6000、0.01％盐酸胍。
降钙素原检测试剂R1-C(pH6.0)：100mM MES缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、2％PEG6000、0.05％盐酸胍。
降钙素原检测试剂R1-D(pH6.0)：100mM MES缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、2％PEG6000、0.1％盐酸胍。
降钙素原检测试剂R1-E(pH6.0)：100mM MES缓冲液、150mM NaCl、1％BSA、0.1％吐温-20、0.1％叠氮钠、2％PEG6000、0.2％盐酸胍。
以上配制的五种降钙素原检测试剂R1(R1-A、R1-B、R1-C、R1-D、R1-E，各试剂的蛋白变性剂用量不同)与同一试剂R2配套使用，对待测样本降钙素原含量进行检测。结果如表32所示，在降低R1pH值至6的基础上，再加入少量蛋白变性剂盐酸胍，能有效抑制RF的干扰，同时不会影响对目的降钙素原的检出含量。
表32降钙素原检测试剂R1中盐酸胍对类风湿因子干扰的抑制作用
同时，将上述五套配制试剂与进口试剂对20份血清标本进行降钙素原含量的检测，并用类风湿因子检测试剂检测样本中RF含量，进一步确认盐酸胍对血清中RF干扰的抑制作用(表33)。
表33盐酸胍有效抑制RF对降钙素原的干扰
以上蛋白变性剂对降钙素原检测试剂受RF干扰的抑制作用实施方案中，蛋白变性剂还可以用十二烷基硫酸钠或尿素进行同等替换而不超出本发明要求的保护范围。蛋白变性剂在R1中的用量还可以为0.03％、0.07％、0.08％、0.12％、0.15％、0.19％、0.2％以及0.01-0.2％范围
鉴于本发明方案实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适合于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近，故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以前述实施例作为代表说明本发明申请优异之处。
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂，所述胶乳增强免疫比浊试剂包括试剂R1和试剂R2，其中试剂R2包括抗体致敏的胶乳微粒，其特征在于：所述试剂R1的PH值为5.5-6.0。
2.根据权利要求1所述的抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂，其特征在于：所述试剂R1的PH值为5.5-5.7。
3.根据权利要求1所述的抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂，其特征在于：所述试剂R1还包括0.01-0.2％(W/V)的蛋白变性剂。
4.根据权利要求1所述的抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂，其特征在于：所述试剂R1还包括0.01-0.1％(W/V)的蛋白变性剂。
5.根据权利要求3或4所述的抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂，其特征在于：所述蛋白变性剂为十二烷基硫酸钠、尿素、盐酸胍中的任一。
6.根据权利要求1所述的抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂，其特征在于：所述胶乳增强免疫比浊试剂为铁蛋白检测试剂、胃蛋白酶原Ⅰ检测试剂、胃蛋白酶原Ⅱ检测试剂、降钙素原检测试剂、D二聚体检测试剂、肌钙蛋白I检测试剂中任一。
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