CN110237047A - 铁蛋白包载药物的方法及其产物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及铁蛋白包载药物的方法及其产物。具体而言，本发明通过具体探索不同浓度的SDS或盐酸胍或脲、不同的处理温度和/或不同的处理时间对铁蛋白如全人铁蛋白解聚和复聚的影响，研究了利用铁蛋白包载药物如阿霉素的最佳条件。利用本发明所获得的包载条件，可以方便、快捷、高效、足量地利用铁蛋白包载药物。

Description

铁蛋白包载药物的方法及其产物
技术领域
本发明涉及铁蛋白包载药物的方法及其产物。具体而言，本发明涉及利用SDS或盐酸胍或脲解聚、复性铁蛋白如全人铁蛋白并包载药物如阿霉素的方法及产物。
背景技术
铁蛋白(ferritin)是参与和维持铁代谢平衡的重要功能蛋白，它是一类广泛存在于动植物及微生物细胞中含高铁量的蛋白质。从细菌到人类，尽管不同生物的铁蛋白氨基酸序列具有极大的差别，但其结构相似。典型的铁蛋白结构是由蛋白外壳和铁内核两部分构成，其中蛋白外壳是由24个亚基自组装形成的笼状结构(外径12nm，内径8nm)，铁内核的主要成分为水铁矿(5Fe2O3·9H2O)。铁蛋白外壳通常是由两种蛋白亚基(H和L)组成。在机体不同组织和器官中，铁蛋白分子中含有H和L亚基的比例有所不同。
人H铁蛋白(HFn)是指由人铁蛋的H亚基自组装形成的铁蛋白。由人铁蛋白的H亚基可以自组装形成笼状蛋白，所包含的人铁蛋白的H亚基数目通常为24。人H铁蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES(SEQ ID No.1)
人L铁蛋白(LFn)是指由人铁蛋的L亚基自组装形成的铁蛋白。由人铁蛋白的L亚基可以自组装形成笼状蛋白，所包含的人铁蛋白的L亚基数目通常为24。人L铁蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD(SEQ ID No.2)
激烈火球菌铁蛋白(pfFn)是指由激烈火球菌铁蛋白亚基自组装形成的铁蛋白。激烈火球菌铁蛋白亚基可以自组装形成笼状蛋白，所包含的人激烈火球菌铁蛋白的亚基数目通常为24。激烈火球菌铁蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
MLSERMLKALNDQLNRELYSAYLYFAMAAYFEDLGLEGFANWMKAQAEEEIGHALRFYNYIYDRNGRVELDEIPKPPKEWESPLKAFEAAYEHEKFISKSIYELAALAEEEKDYSTRAFLEWFINEQVEEEASVKKILDKLKFAKDSPQILFMLDKELSARAPKLPGLLMQGGE
根据文献报道，不同来源铁蛋白的药物装载，主要依赖于两种方式：1、药物在特定处理条件下，通过铁蛋白上的离子通道或疏水通道，进入蛋白壳内部；2、利用低pH值或高浓度脲，使蛋白壳发生解聚，在随后的复聚过程中加入待包载药物，进而实现药物在蛋白壳内部的装载。上述的包载方法中，尤其以高浓度脲条件下的HFn包载阿霉素效率最高，达到每分子HFn装载33分子阿霉素；该方法的简要步骤为：将人HFn加入终浓度大于6M的脲中，室温下反应30分钟，随后加入适量阿霉素试剂，并避光反应10分钟，然后使用透析的方法，将反应体系中的脲浓度逐级递减至0，从而实现阿霉素在HFn中的包载。相比其他包载方法，虽然高浓度脲法有效地提高了阿霉素在HFn中的装载量，但是距离临床用药需求仍有较大的差距，按照1分子铁蛋白装载33分子的阿霉素计算，临床单次给药所需的蛋白质量就达到了克级水平，显著超出了现有蛋白质药物的最高给药剂量(百毫克级)。为了满足临床用药需求，本领域必须开发载药量更大的HFn药物包载方法。
现有技术中存在大量需要包载的药物。这些药物包载后要么可以避免毒副作用，要么可以避免溶解度低以提高利用率，要么可以避免被降解，等等。例如难溶性药物多西紫杉醇在包载后就可以避免其溶解度低难以施用的确定。
阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效，一般作为第二线药物，即在首选药物耐药时可考虑应用此药。对于恶性淋巴瘤，可作为交替使用的首选药物。其对乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等其他各种癌症都有一定疗效，多与其他抗癌药联合使用。
但是，阿霉素在直接注射使用时，由于随血液全身弥散分布，对机体可产生广泛的生物化学效应，具有强烈的细胞毒性作用。主要的毒性反应有，白细胞和血小板减少，约60％～80％的病人可发生；100％的病人有不同程度的毛发脱落，停药后可以恢复生长；心脏毒性，表现为心律失常，ST-T改变，多出现在停药后的1～6个月；恶心、食欲减退；药物溢出血管外可引起组织溃疡及坏死。另外，用药后尿液可出现红色。
因此，本领域依然存在对铁蛋白高效装载药物如阿霉素的方法及相应产物的需求。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种铁蛋白包载药物的方法，其包括步骤：
1)将铁蛋白在一定温度下在含有一定浓度的变性剂和待包载药物的溶液中解聚一定时间，
2)通过去除溶液中的变性剂使铁蛋白复聚并包载药物，
3)任选地，去除溶液中残余的变性剂和药物，
4)任选地，干燥上述溶液获得包载了药物的铁蛋白固体，
其中变性剂是可以削弱或打破铁蛋白亚基间氢键相互作用，从而使铁蛋白发生解聚的物质，优选的，变性剂是指阴离子型表面活性剂或盐酸胍或脲，优选地，阴离子型表面活性剂选自SDS、硬脂酸和/或十二烷基苯磺酸钠；其中一定浓度在阴离子型表面活性剂的情况下是指重量比约1％～10％，在盐酸胍的情况下是指4M～8M，在脲的情况下是指3～10M；一定时间在阴离子型表面活性剂的情况下是指10～120min，在盐酸胍的情况下是指30min～300min，在脲的情况下是指10～1200min；一定温度在阴离子型表面活性剂的情况下是指30℃～100℃，在盐酸胍的情况下是指25℃～70℃，在脲的情况下是指15℃～75℃。
在一些实施方案中，铁蛋白选自可以形成笼状结构的天然铁蛋白或重组铁蛋白及其变体，优选地，铁蛋白是全人铁蛋白，更优选地，铁蛋白是全人重链铁蛋白。
在一些实施方案中，变性剂选自SDS或盐酸胍。
在一些实施方案中，药物选自抗肿瘤药物或非抗肿瘤药物，优选地，抗肿瘤药物选自肿瘤抗生素、天然来源类抗肿瘤药、金属化合物、放射性同位素、烷化剂、抗代谢类抗肿瘤药，激素类抗肿瘤药，优选地，药物选自肿瘤抗生素、天然来源类抗肿瘤药、放射性同位素或烷化剂，更优选地，药物选自肿瘤抗生素，更优选地，药物选自阿霉素、道诺霉素、胆碱、姜黄素、尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥、氟铁龙、多西氟鸟啶、5-氟尿嘧啶、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨、放线菌素D、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星、伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞滨、紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春酰胺、长春碱、替尼泊苷、依托泊苷、阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂奥沙、米托蒽醌，更优选地，药物选自阿霉素、道诺霉素、胆碱、顺铂、姜黄素、放射性同位素；和/或，优选地，非抗肿瘤药物选自放射性药物、神经递质类药物、多巴胺受体激动剂、神经中枢抗胆碱药、胆碱受体激动剂类药物、γ分泌酶抑制剂、抗氧剂或麻醉剂，更优选地，放射性药物选自64Cu、235U，神经递质类药物选自碳酰胆碱、阿托品、东莨菪碱、多巴胺及其衍生物，多巴胺受体激动剂选自溴隐亭、培高利特、阿扑吗啡等麦角碱类衍生物及非麦角碱类衍生物，神经中枢抗胆碱药选自苯海索、苯扎托品及丙环定，胆碱受体激动剂类药物选自毒蕈碱、毛果芸香碱，γ分泌酶抑制剂选自双氟酮类，抗氧剂选自褪黑激素，麻醉剂选自蒽胺。
在一些实施方案中，去除溶液中的变性剂采用脱盐方式进行，优选地，采用脱盐柱进行。
在一些实施方案中，使用阴离子型表面活性剂的情况下铁蛋白包载药物的质量比为5％-60％，优选地，至少8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高，更优选地，至少20％、25％、30％或35％；使用盐酸胍变性剂的情况下铁蛋白包载的药物的量5％-60％，优选地，至少8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高，更优选地，至少20％、25％、30％或35％；使用脲变性剂的情况下铁蛋白包载的药物的量5％-60％，优选地，至少8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高，更优选地，至少20％、25％、30％或35％。
在一些实施方案中，溶液中铁蛋白含量范围为0.1～100mg/ml，优选地，0.2～10mg/ml，更优选地，0.3～5mg/ml，更优选地，0.5～2mg/ml，更优选地，0.7～1.4mg/ml；和/或，待包载药物的含量范围0.1～50mg/ml，优选地，0.2～10mg/ml，更优选地，0.3～5mg/ml，更优选地，0.5～2mg/ml，更优选地，0.7～1.4mg/ml。
在一些实施方案中，一定浓度在阴离子型表面活性剂的情况下是指重量比约5％～10％，在盐酸胍的情况下是指6M～8M，在盐酸胍的情况下是指5～8M；一定时间在阴离子型表面活性剂的情况下是指10～30min，在盐酸胍的情况下是指30min～120min，在脲的情况下是指20～200min；一定温度在阴离子型表面活性剂的情况下是指65℃～75℃，在盐酸胍的情况下是指40℃～60℃，在脲的情况下是指20℃～50℃。
在一些实施方案中，一定浓度在阴离子型表面活性剂的情况下是指重量比约6.5％～8％，在盐酸胍的情况下是指6.5M～7.5M，在盐酸胍的情况下是指5.5～6.5M；一定时间在阴离子型表面活性剂的情况下是指10～20min，在盐酸胍的情况下是指50min～72min，在盐酸胍的情况下是指25～100min；一定温度在阴离子型表面活性剂的情况下是指68℃～72℃，在盐酸胍的情况下是指45℃～55℃，在盐酸胍的情况下是指22℃～35℃。
在一些实施方案中，溶液中含有促进药物的溶解和/或铁蛋白的聚集的添加剂，优选地，所述添加剂选自DMA、DMF、DMSO或其混合物。
在一些实施方案中，溶液中铁蛋白与包载药物的质量比例为5:1～1:5。
在一些实施方案中，溶液的缓冲体系为Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，缓冲液的pH介于3～10，缓冲液的浓度介于20～500mM。
本发明的第二方面涉及如上述第一方面所述的铁蛋白包载药物的方法获得的包载药物的铁蛋白。
利用本发明的铁蛋白包载药物的方法可以使药物包载量大幅度提高，进而在达到相同治疗效果的前提下，临床给药剂量将会大大减少。
附图说明
图1. 2％SDS、100℃、10min处理后，HFn 100％解聚后的层析出峰位置(流动相含1％SDS)。
图2. 1％SDS、30℃、80min处理后，HFn未解聚的层析出峰位置(流动相含1％SDS)。
图3. 1％SDS、70℃、15min处理后，HFn 30％解聚的层析出峰位置(流动相含1％SDS)。
图4. 2％SDS、100℃、10min处理条件后，HFn 100％解聚后的层析出峰位置(流动相含2％SDS)。
图5. 2％SDS、30℃、120min处理后，HFn未解聚的层析出峰位置(流动相含2％SDS)。
图6. 2％SDS、70℃、30min处理后，HFn 30％解聚的层析出峰位置(流动相含2％SDS)。
图7. 2％SDS、100℃、10min处理条件后，HFn 100％解聚后的层析出峰位置(流动相含5％SDS)。
图8. 5％SDS、30℃、120min处理后，HFn 60％解聚的层析出峰位置(流动相含5％SDS)。
图9. 5％SDS、70℃、15min处理后，HFn 80％解聚的层析出峰位置(流动相含5％SDS)。
图10. 2％SDS、100℃、10min处理条件后，HFn 100％解聚后的层析出峰位置(流动相含7.5％SDS)。
图11. 7.5％SDS、50℃、30min处理后，HFn 80％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5％SDS)。
图12. 7.5％SDS、70℃、30min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5％SDS)。
图13. 2％SDS、100℃、10min处理条件后，HFn 100％解聚后的层析出峰位置(流动相含10％SDS)。
图14. 10％SDS、30℃、30min处理后，HFn 80％解聚的层析出峰位置(流动相含10％SDS)。
图15. 10％SDS、70℃、15min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含10％SDS)。
图16.去除SDS后复聚的HFn层析出峰位置(流动相为20mM PB)。
图17.天然状态HFn层析出峰位置(流动相为20mM PB)。
图18. 4M盐酸胍、25℃、60min处理后，HFn未解聚的层析出峰位置(流动相含4M盐酸胍)。
图19. 4M盐酸胍、25℃、90min处理后，HFn未解聚的层析出峰位置(流动相含4M盐酸胍)。
图20. 4M盐酸胍、25℃、120min处理后，HFn未解聚的层析出峰位置(流动相含4M盐酸胍)。
图21. 5.5M盐酸胍、25℃、60min处理后，HFn 14.2％解聚的层析出峰位置(流动相含5.5M盐酸胍)。
图22. 5.5M盐酸胍、25℃、90min处理后，HFn 17.2％解聚的层析出峰位置(流动相含5.5M盐酸胍)。
图23. 5.5M盐酸胍、25℃、120min处理后，HFn 18.7％解聚的层析出峰位置(流动相含5.5M盐酸胍)。
图24. 6M盐酸胍、25℃、60min处理后，HFn 24.6％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。
图25. 6M盐酸胍、25℃、90min处理后，HFn 33.8％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。
图26. 6M盐酸胍、25℃、120min处理后，HFn 34.3％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。
图27. 6.5M盐酸胍、25℃、60min处理后，HFn 38.1％解聚的层析出峰位置(流动相含6.5M盐酸胍)。
图28. 6.5M盐酸胍、25℃、90min处理后，HFn 40.4％解聚的层析出峰位置(流动相含6.5M盐酸胍)。
图29. 6.5M盐酸胍、25℃、120min处理后，HFn 42.4％解聚的层析出峰位置(流动相含6.5M盐酸胍)。
图30. 7M盐酸胍、25℃、60min处理后，HFn 53.2％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。
图31. 7M盐酸胍、25℃、90min处理后，HFn 57.9％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。
图32. 7M盐酸胍、25℃、120min处理后，HFn 60.9％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。
图33. 7M盐酸胍、25℃、150min处理后，HFn 63.7％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。
图34. 7M盐酸胍、25℃、180min处理后，HFn 65.8％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。
图35. 7M盐酸胍、25℃、210min处理后，HFn 67.9％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。
图36. 7.5M盐酸胍、25℃、60min处理后，HFn 66％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图37. 7.5M盐酸胍、25℃、90min处理后，HFn 74.7％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图38. 7.5M盐酸胍、25℃、120min处理后，HFn 79.8％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图39. 7.5M盐酸胍、25℃、150min处理后，HFn 86.1％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图40. 7.5M盐酸胍、25℃、180min处理后，HFn 88.9％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图41. 7.5M盐酸胍、25℃、210min处理后，HFn 95.8％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图42. 7.5M盐酸胍、25℃、240min处理后，HFn 96.6％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图43. 7.5M盐酸胍、25℃、270min处理后，HFn 97.4％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图44. 7.5M盐酸胍、25℃、300min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图45. 7.5M盐酸胍、25℃、330min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图46. 7.5M盐酸胍、25℃、360min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图47. 8M盐酸胍、25℃、60min处理后，HFn 93.9％解聚的层析出峰位置(流动相含8M盐酸胍)。
图48. 8M盐酸胍、25℃、90min处理后，HFn 98.1％解聚的层析出峰位置(流动相含8M盐酸胍)。
图49. 8M盐酸胍、25℃、120min处理后，HFn 98.6％解聚的层析出峰位置(流动相含8M盐酸胍)。
图50. 8M盐酸胍、25℃、150min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含8M盐酸胍)。
图51. 4M盐酸胍、70℃、30min处理后，HFn 39.5％解聚的层析出峰位置(流动相含4M盐酸胍)。
图52. 4M盐酸胍、70℃、60min处理后，HFn 53.3％解聚的层析出峰位置(流动相含4M盐酸胍)。
图53. 4M盐酸胍、70℃、120min处理后，HFn 82.6％解聚的层析出峰位置(流动相含4M盐酸胍)。
图54. 4M盐酸胍、70℃、180min处理后，HFn 91.8％解聚的层析出峰位置(流动相含4M盐酸胍)。
图55. 5M盐酸胍、70℃、30min处理后，HFn 64.1％解聚的层析出峰位置(流动相含5M盐酸胍)。
图56. 5M盐酸胍、70℃、60min处理后，HFn 92.7％解聚的层析出峰位置(流动相含5M盐酸胍)。
图57. 5M盐酸胍、70℃、120min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含5M盐酸胍)。
图58. 6M盐酸胍、37℃、120min处理后，HFn 41.5％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。
图59. 6M盐酸胍、50℃、30min处理后，HFn 33.45％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。
图60. 6M盐酸胍、50℃、60min处理后，HFn 44.6％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。
图61. 6M盐酸胍、50℃、120min处理后，HFn 61.2％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。
图62. 6M盐酸胍、50℃、180min处理后，HFn 67.8％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。
图63. 6M盐酸胍、70℃、10min处理后，HFn 76.6％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。
图64. 6M盐酸胍、70℃、30min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。
图65. 6M盐酸胍、70℃、60min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。
图66. 7M盐酸胍、37℃、60min处理后，HFn 67.8％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。
图67. 7M盐酸胍、37℃、90min处理后，HFn 71.3％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。
图68. 7M盐酸胍、37℃、120min处理后，HFn 75.4％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。
图69. 7M盐酸胍、37℃、150min处理后，HFn 78.1％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。
图70. 7M盐酸胍、37℃、180min处理后，HFn 72.3％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。
图71. 7M盐酸胍、50℃、60min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。
图72. 7.5M盐酸胍、37℃、60min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图73. 7.5M盐酸胍、37℃、90min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图74. 7.5M盐酸胍、37℃、120min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图75. 7.5M盐酸胍、37℃、150min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。
图76.天然状态HFn层析出峰位置(流动相为50mM Tris)。
图77.去除盐酸胍后复聚的HFn层析出峰位置(流动相为50mM Tris)。
具体实施方式
定义
本发明的铁蛋白是指可以形成笼状结构的任何铁蛋白，其可以是天然来源的铁蛋白，也可以是重组表达的铁蛋白，或其突变体，其可以来源于原核生物、原生生物、真菌、植物或动物，例如来源于细菌、真菌、昆虫、爬行动物、禽类、两栖动物、鱼类、哺乳动物，例如来源于啮齿类动物、反刍动物、非人灵长类动物或人类，例如小鼠、大鼠、豚鼠、犬类、猫、牛、马、羊、猴、大猩猩、人。从细菌到人类，尽管不同生物的铁蛋白氨基酸序列具有极大的差别，但其结构相似，均可以形成蛋白壳结构。在一些实施方案中，本发明的铁蛋白是人铁蛋白，在一些实施方案中，本发明的铁蛋白是基因工程全人重链铁蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。在另一些实施方式中，本发明的铁蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2或3所示。
本发明的变性剂是指使铁蛋白发生解聚作用的物质，为盐酸胍或者以SDS为代表的阴离子型表面活性剂，或者脲。
阴离子型表面活性剂为既含有亲水基团又含有疏水基团的两亲性分子，并可在溶液状态下解离出阴离子，包括例如SDS、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠等。
本发明的解聚是指铁蛋白天然24聚体的紧密闭合球状结构被打开，直观表现为凝胶排阻柱上的出峰时间被显著延迟，从而解聚蛋白峰与未解聚蛋白峰发生分离。在本发明中解聚比例为至少50％，例如至少55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，最高可达到100％。
复聚是指在引起解聚的物质被去除或降低到足够低浓度后，发生解聚的铁蛋白又恢复到天然24聚体的紧密闭合球状结构，直观表现为凝胶排阻柱上的出峰时间减少至与天然铁蛋白相近的出峰时间。在本发明中，复聚比例为至少50％，例如55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，最高可达100％。
本发明的药物或包载药物是指可以包载在铁蛋白中的任何药物，只要所述药物的分子尺寸小于8纳米。在一些实施方案中，本发明的药物或包载药物选自肿瘤抗生素、天然来源类抗肿瘤药、金属化合物、放射性同位素、烷化剂、抗代谢类抗肿瘤药，激素类抗肿瘤药物质。其中抗生素类抗肿瘤药选自阿霉素(盐酸多柔比星)，盐酸佐柔比星，戊柔比星，硫酸博莱霉素，丝裂霉素，盐酸表柔比星，盐酸依达比星，放线菌素D，光辉霉素，柔红霉素，吡柔比星，表阿霉素，依达比星，阿克拉霉素，博来霉素A5，色霉素A3，盐酸博来霉素，棕霉素，盐酸平阳霉素，柔红霉素，盐酸阿柔比星，含氮霉素，匹来霉素，盐酸吡柔比星，放线菌素C；天然来源类抗肿瘤药选自盐酸拓扑替康，10-羟基喜树碱，7-乙基-10-羟基喜树碱，10-羟基喜树碱，鲁比特康，白藜芦醇，喜树碱，紫杉醇，秋水仙素，依托泊甙，多西他赛，硫酸长春碱，斑蝥素，伊立替康，鬼臼毒素，拓扑替康，高三尖杉酯碱，埃博霉素，替尼泊甙，野百合碱，长春新碱，长春瑞宾，硫酸长春地辛，靛玉红，硫酸长春新碱，去甲斑蝥素，去甲斑蝥素，鬼臼毒素，多西他赛，秋水仙碱，三尖杉碱，埃博霉素C，埃博霉素E，华蟾素，硫酸长春地辛，去甲斑蝥酸钠，伊立替康，肿节风，足叶草脂，重酒石酸长春瑞宾，马蔺子素，鸦胆子油，米托肼，三尖杉酯碱，秋裂胺，羟喜树碱，甲基斑蝥胺；金属化合物选自卡铂，顺铂，奈达铂，奥沙利铂等；放射性同位素选自钋，氡，钫，镭，锕，钍，镤，铀，镎，钚，锝，钷，镅，锔，锫，锎，锿，镄，钔，锘，铹，104，105，106，107，108和109号元素；烷化剂选自盐酸苯达莫司汀，咪唑司汀，苯磺酸贝托司汀，白消安，恩比兴，达卡巴嗪，洛莫司汀，苯丁酸氮，芥卡莫司汀，三亚乙基硫代磷酰胺，盐酸尼莫司汀，美法仑尼莫司汀，苯达莫司汀，雌莫司汀，磷酸钠2,3-二溴-1,4-丁烯二醇，雌莫司汀，六甲蜜胺，福莫司汀，尼莫司汀，加莫司汀，泼尼莫司汀，雌莫司汀，磷酸依考莫司汀，他莫司汀，氨莫司汀，雌莫司汀，盐酸苯达莫司汀杂质A，奈莫司汀，波呋莫司汀，盐酸依匹司汀，盐酸苯达莫司汀杂质C，洛莫司汀胶囊，盐酸倍他司汀，盐酸倍它司汀，二硫莫司汀，牛磺莫司汀，依莫司汀，螺莫司汀，盐酸苯达莫司汀杂质B，泼尼莫司汀，司莫司汀，雷莫司汀，卡波醌，甲尿嘧啶氮芥，氮芥，依匹司汀，碱乌拉莫司汀，二溴甘露醇，盐酸氧氮芥，氧氮芥，依匹哌啶，邻脂苯芥，去水卫矛醇，亚胺醌，甲氧芳芥，恩普氨酯，甘磷酰芥，硝卡芥，异芳芥，氮甲，三亚胺醌，甘露醇氮芥，2，4，6-三亚乙基亚胺-1，3，5-三嗪；抗代谢类抗肿瘤药选自甲氨蝶呤，5-氟-2'-脱氧脲核苷，吉西他滨，去氧氟尿苷，阿糖胞苷，6-硫鸟嘌呤，盐酸吉西他滨，磷酸氟达拉滨，酒石酸长春瑞滨，氟达拉宾，替莫唑胺，克罗拉滨，奈拉滨，盐酸环胞苷，替加氟，盐酸阿糖胞苷，6-巯基嘌呤，4-羟基-5-氟嘧啶，氨基蝶呤，米替福新，雷替曲塞，脱氧助间型霉素，卡莫氟，安吖啶，乙嘧替氟，替加氟，环胞啶，甲异靛，氟尿嘧啶，肌苷二醛，1-乙烯基-1-甲基-2,4-二(丙-1-烯-2-基)环己烷，磺巯嘌呤钠，激素类抗肿瘤药选自依西美坦，雷洛昔芬，氟维司群，来曲唑，阿那曲唑，氟他胺，枸橼酸他莫昔芬，屈洛昔芬，艾多昔芬，尼鲁米特，氨鲁米特，福美司坦，他莫昔芬，托瑞米芬，氨鲁米特。不受限于任何理论，本发明的包载药物的铁蛋白可以靶向肿瘤，与肿瘤结合后释放包载的药物，药物从而作用于肿瘤，实现对肿瘤的预防和/或治疗。例如，人铁蛋白可能通过结合其受体转铁蛋白受体(Transferrin Receptor 1,TfR1)特异性靶向人体实体肿瘤和血液恶性癌变细胞，如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、结直肠癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、胸腺癌、T淋巴细胞白血病、红细胞白血病等。
在一些实施方案中，本发明的药物或包载药物选自抗肿瘤药物之外的药物，即，非抗肿瘤药物。例如，这样的药物可以是不需要靶向性的药物，例如全身性施用的药物，例如难溶的、不稳定的和/或易发生相互作用而失效的药物。在一些实施方案中，这样的药物选自两性霉素B、醋酸格拉替雷、复合葡萄糖酸钠铁、雷帕霉素、盐酸司维拉姆硫酸根结合剂、注射用维替泊芬、蔗糖铁、聚乙二醇干扰素α-2a/2b、非诺贝特、培非格司亭、利培非格司亭、阿米卡星、芬太尼、环孢霉素、西替利嗪、辣椒素、神经酰胺等。在一些实施方案中，本发明的非抗肿瘤药物选自放射性药物、神经递质类药物、多巴胺受体激动剂、神经中枢抗胆碱药、胆碱受体激动剂类药物、γ分泌酶抑制剂、抗氧剂或麻醉剂，更优选地，放射性药物选自64Cu、235U，神经递质类药物选自碳酰胆碱、阿托品、东莨菪碱、多巴胺及其衍生物，多巴胺受体激动剂选自溴隐亭、培高利特、阿扑吗啡等麦角碱类衍生物及非麦角碱类衍生物，神经中枢抗胆碱药选自苯海索、苯扎托品及丙环定，胆碱受体激动剂类药物选自毒蕈碱、毛果芸香碱，γ分泌酶抑制剂选自双氟酮类，抗氧剂选自褪黑激素，麻醉剂选自蒽胺。
在一些实施方案中，在将药物包载到铁蛋白中时需要在孵育溶液中加入添加剂，以促进药物的溶解和/或铁蛋白的聚集，从而实现和/或改善药物包载效果。例如，在一些实施方案中，涉及包载铂类药物，此时需要在孵育溶液中加入DMA、DMF、DMSO或其混合物。根据待包载药物的不同，需要添加的添加剂也可能相应不同。
在一些实施方案中，孵育溶液中铁蛋白与包载药物的质量比例为5:1～1:5，例如，5:1～1:2，2:1～1:4，4:1～1:1，8:2.5～8:3.5，1:1～1:3，1:1.5～1：2.5。根据待包载药物的不同，铁蛋白与包载药物的质量比例也可能相应不同。
在一些实施方案中，孵育溶液的缓冲体系为Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，缓冲液的pH介于3～10，例如4-9、5-8.5，缓冲液的浓度介于20～500mM。根据使用的缓冲液的不同，其缓冲能力、pH范围、所需浓度等可能需要进行调整。
本发明中的铁蛋白中包载药物的上限为铁蛋白笼状结构的内部容积所能容纳的药物的最大量，即约268立方纳米的体积内所能容纳的药物的量。在一些实施方案中，以质量比计算，药物包载量为5～60％，优选地，10～50％、20～40％、25～35％，例如至少8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高。在一些实施方案中，每分子铁蛋白包载50-500个阿霉素分子或类似大小的分子，例如60、80、90、100、110、120、130、140、150、170、190、200、220、240、260、280、240、260、280、300、350、400、450、500或更多个。本领域技术人员知晓，随着包载药物分子大小的增加或减少，铁蛋白所能包载的药物的分子数量也会相应地减少或增加，但总的包载质量可以不变。
利用本发明的铁蛋白包载药物的方法可以使药物包载量大幅度提高，进而在达到相同治疗效果的前提下，临床给药剂量将会大大减少。
本发明的包载药物的铁蛋白可以以药物组合物的形式提供，即，除包载药物的铁蛋白外，其还含有药学上可接受的载体。这些药物组合物可以用药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的赋形剂根据常规技术配制，这些常规技术是例如在以下中披露的技术：Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第22版，Gennaro编，MackPublishing Co.，2013。
利用本发明的方法所获得的包载药物的铁蛋白可以用于治疗和/或预防受试者的疾病或状态。本发明的包载药物的铁蛋白所能治疗治疗和/或预防的疾病或状态取决于所包载的药物。例如，当包载阿霉素时，本发明的包载阿霉素的HFn所能治疗治疗和/或预防的疾病或状态取决于所包载的阿霉素，即，现有技术中已知可以由阿霉素治疗和/或预防的疾病或状态均可以由本发明的包载阿霉素的HFn治疗和/或预防。不受限于任何理论，本发明的包载阿霉素的HFn可以靶向肿瘤，从而在施用后在肿瘤部位释放所包载的阿霉素，实现对所述肿瘤的预防和/或治疗。在一些实施方案中，所述疾病或状态选自急性白血病(淋巴细胞性和粒细胞性)、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌(未分化小细胞性和非小细胞性)、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌。或者，当包载铂类药物时，本发明的包载铂类药物的HFn所能治疗治疗和/或预防的疾病或状态取决于所包载的铂类药物，即，例如，现有技术中已知可以由DDP治疗和/或预防的疾病或状态均可以由本发明的包载DDP的HFn治疗和/或预防。不受限于任何理论，本发明的包载铂类药物的HFn可以靶向肿瘤，从而在施用后在肿瘤部位释放所包载的铂类药物，实现对所述肿瘤的预防和/或治疗。在一些实施方案中，所述疾病或状态选自小细胞与非小细胞肺癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、成骨肉瘤、网状细胞肉瘤、精原性细胞瘤、鼻咽癌、食道癌、甲状腺癌、头颈部肿瘤、鳞状上皮癌和恶性淋巴瘤。在包载的药物为CBP的情况下，则现有技术已知可以由CBP治疗和/或预防的疾病或状态均可以由本发明的包装CBP的HFn治疗和/或预防，例如卵巢癌、肺癌、头颈部癌、生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌等。
本发明的药物组合物可以通过任何适合途径和模式给予，包括都不限于静脉内或皮下注射或输注。
本发明的药物组合物还可以与其他药物组合使用，例如与所包载的药物不同的其他抗肿瘤药物，如长春新碱、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶联用，或者与放疗配合使用，例如ABVD、CAF、CAOP、FAM、AC、AOP、ACP、CY-VA-DIC、MACC。本领域技术人员知晓如何具体组合使用这些药物或治疗措施。
以下结合具体的实施案例对本发明做进一步说明，以下实施例仅用于说明本发明而不意欲限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，在本发明范围内所做的任何变更、修改或直接采用实施例中的同等条件而实施的例子，都应理解为在本发明的涵盖范围内。
实施例
实施例1SDS解聚HFn实验
通过使用不同浓度的SDS在不同温度下处理HFn(亚基序列如SEQ ID NO.1所示)(具体条件如表1所示)，通过液相(安捷伦1260HPLC系统，TSKgel G4000凝胶排阻高效液相色谱柱)观察该条件是否将HFn解聚。
1.1 1％SDS
使用1％的SDS处理HFn，液相流动相为1％SDS，pH为7.0，出峰时间如表1和图1-3所示。因为SDS-PAGE凝胶电泳处理样品的时候是在2％SDS溶液里100℃处理10min，可以使蛋白样品解聚，所以这个实验的解聚参照品为HFn在2％SDS溶液里100℃处理10min。
表1. 1％的SDS处理HFn解聚情况液相数据
SDS 温度 处理时间 出峰时间1 出峰时间2 解聚 解聚率
2.0％ 100℃ 10min 18.838 是 100％
1.0％ 30℃ 40min 17.126 否
1.0％ 30℃ 80min 17.131 否
1.0％ 50℃ 30min 17.086 否
1.0％ 50℃ 60min 17.076 否
1.0％ 70℃ 15min 17.090 18.653 是 30％
1.0％ 70℃ 30min 17.093 18.675 是 30％
小结1：
1、2％SDS、100℃、10min处理HFn样品在流动相为1％SDS情况下，出峰时间为18.838min，24.365min分钟的杂峰通过紫外260/280比值得知主成分非蛋白物质。所以说明液相流动相是1％SDS情况下，完全解聚的峰是在18.838min出峰。
2、通过图2可以看到1％SDS、30℃、40min；1％SDS、30℃、80min；1％SDS、50℃、30min；1％SDS、50℃、60min处理HFn并不能将HFn解聚。
3、图3结果表明1％SDS、70℃、15min；1％SDS、70℃、30min处理HFn可以部分解聚HFn。通过与图2对比可以明显看出图3没有HFn聚体峰，说明SDS处理HFn解聚是可行的，假若要将全部HFn打开需要加大SDS浓度。
1.2 2％SDS
使用2％的SDS处理HFn，液相流动相为2％SDS，pH为7.0，出峰时间如表2和图4-6所示。因为SDS-PAGE凝胶电泳处理样品的时候是在2％SDS溶液里100℃处理10min，可以使蛋白样品解聚，所以这个实验的解聚参照品为HFn在2％SDS溶液里100℃处理10min。
表2. 2％的SDS处理HFn解聚情况液相数据
SDS 温度 处理时间 出峰时间 出峰时间2 解聚 解聚率
2.0％ 100℃ 10min 19.663 是 100％
2.0％ 30℃ 60min 18.656 否
2.0％ 30℃ 120min 18.666 否
2.0％ 50℃ 30min 18.698 否
2.0％ 50℃ 60min 18.708 否
2.0％ 70℃ 15min 18.734 19.688 是 30％
2.0％ 70℃ 30min 18.743 19.697 是 30％
小结2：
1、2％SDS、100℃、10min处理HFn样品在流动相为2％SDS情况下，出峰时间为19.663min，25.2min分钟的杂峰通过紫外260/280比值得知主成分非蛋白物质。所以说明液相流动相是2％SDS情况下，完全解聚的峰是在19.663min出峰。
2、通过图5可以看到2％SDS、30℃、60min；2％SDS、30℃、120min；2％SDS、50℃、30min；2％SDS、50℃、60min处理HFn并不能将HFn解聚。
3、图6结果表明2％SDS、70℃、15min；2％SDS、70℃、30min处理HFn可以部分解聚HFn，解聚约30％，说明假若要将全部HFn打开需要继续加大SDS浓度。
1.3 5％SDS
使用5％的SDS处理HFn，液相流动相为5％SDS，pH为7.0，出峰时间如表3和图7-9所示。因为SDS-PAGE凝胶电泳处理样品的时候是在2％SDS溶液里100℃处理10min，可以使蛋白样品解聚，所以这个实验的解聚参照品为HFn在2％SDS溶液里100℃处理10min。
表3. 5％的SDS处理HFn解聚情况液相数据
SDS 温度 处理时间 出峰时间 解聚 解聚率
2.0％ 100℃ 10min 21.213 是 100％
5.0％ 30℃ 60min 20.976 是 60％
5.0％ 30℃ 120min 20.975 是 60％
5.0％ 50℃ 30min 20.989 是 70％
5.0％ 50℃ 60min 20.972 是 70％
5.0％ 70℃ 15min 21.044 是 80％
5.0％ 70℃ 30min 20.975 是 80％
小结3：
1、2％SDS、100℃、10min处理HFn样品在流动相为5％SDS情况下，出峰时间为21.213min，所以说明液相流动相是5％SDS情况下，完全解聚的峰是在21.213min出峰。
2、通过图8、图9可以看到5％SDS、30℃、60min；5％SDS、30℃、120min；5％SDS、50℃、30min；5％SDS、50℃、60min；5％SDS、70℃、15min；5％SDS、70℃、30min处理HFn可以部分解聚HFn，30℃的时候HFn解聚为约60％，70℃时HFn解聚为约80％。说明温度的提高对HFn的解聚作用比时间的作用要强。
1.4 7.5％SDS
使用7.5％的SDS处理HFn，液相流动相为7.5％SDS，pH为7.0，出峰时间如表4和图10-12所示。因为SDS-PAGE凝胶电泳处理样品的时候是在2％SDS溶液里100℃处理10min，可以使蛋白样品解聚，所以这个实验的解聚参照品为HFn在2％SDS溶液里100℃处理10min。
表4. 7.5％的SDS处理HFn解聚情况液相数据
SDS 温度 处理时间 出峰时间 解聚 解聚率
2.0％ 100℃ 10min 21.676 是 100％
7.5％ 30℃ 60min 22.061 是 80％
7.5％ 30℃ 120min 22.065 是 80％
7.5％ 50℃ 30min 22.028 是 80％
7.5％ 50℃ 60min 21.883 是 80％
7.5％ 70℃ 15min 21.837 是 100％
7.5％ 70℃ 30min 21.838 是 100％
小结4：
1、2％SDS、100℃、10min处理HFn样品在流动相为7.5％SDS情况下，出峰时间为21.676min，所以说明液相流动相是7.5％SDS情况下，完全解聚的峰是在21.676min出峰。
2、通过图11可以看到7.5％SDS、30℃、60min；7.5％SDS、30℃、120min；7.5％SDS、50℃、30min；7.5％SDS、50℃、60min处理HFn可以部分解聚HFn，HFn解聚为约80％。
3、由图12可以看到7.5％SDS、70℃、15min；7.5％SDS、70℃、60min处理HFn，基本完全解聚HFn。
1.5 10％SDS
使用10％的SDS处理HFn，液相流动相为10％SDS，pH为7.0，出峰时间如表5和图13-15所示。因为SDS-PAGE凝胶电泳处理样品的时候是在2％SDS溶液里100℃处理10min，可以使蛋白样品解聚，所以这个实验的解聚参照品为HFn在2％SDS溶液里100℃处理10min。
表5. 10％的SDS处理HFn解聚情况液相数据
SDS 温度 处理时间 出峰时间 解聚 解聚率
2.0％ 100℃ 10min 21.924 是 100％
10.0％ 30℃ 30min 22.814 是 80％
10.0％ 30℃ 60min 22.803 是 80％
10.0％ 50℃ 30min 22.83 是 80％
10.0％ 50℃ 60min 22.831 是 80％
10.0％ 70℃ 15min 22.856 是 100％
10.0％ 70℃ 30min 22.854 是 100％
小结5：
1、2％SDS、100℃、10min处理HFn样品在流动相为10％SDS情况下，出峰时间为21.924min，所以说明液相流动相是10％SDS情况下，完全解聚的峰是在21.924min出峰。然而，导致10％SDS处理HFn的样品出峰时间为22.8min左右的原因未知。
2、通过图14可以看到10％SDS、30℃、60min；10％SDS、30℃、120min；10％SDS、50℃、30min；10％SDS、50℃、60min处理HFn可以部分解聚HFn，HFn解聚为约80％。
3、由图15可以看到10％SDS、70℃、15min；10％SDS、50℃、60min；70℃、60min处理HFn，出现两个明显的重叠峰。按照此情况计算，70℃的解聚情况比30℃和50℃的解聚率还低，而在7.5％SDS、70℃处理时已经看到HFn完全解聚。推测该现象的原因可能是由于SDS浓度过高，导致测定的样品出峰时出现异常。
总结：
1、SDS解聚HFn的最佳条件为7.5％SDS、70℃、15min。
2、影响SDS解聚HFn的主要条件是温度和SDS浓度。
实施例2SDS解聚HFn后复聚实验
在7.5％SDS、70℃、15min条件下处理HFn，然后使用G75脱盐柱(或者透析或超滤复聚)对处理的样品进行脱盐，收集脱盐后的样品，使用液相观察其复聚情况，液相流动相为20mM PB(20mM Na2HPO4+20mM NaH2PO4)、pH 7.0。
在液相流动相为20mM PB的时候，以图16和图17对比，由图16的出峰位置可以看出，HFn已经完全复聚。复聚后HFn的单体占96.44％，高于解聚前的95.42％。
总结：SDS解聚HFn后通过脱盐可以复聚HFn。
实施例3SDS解聚HFn后包载DOX实验
通过SDS解聚HFn和SDS解聚HFn后复聚实验的结果，可以看出HFn在7.5％SDS、70℃、15min条件下解聚最好，然后通过G75脱盐可以再良好地复聚。基于这个解聚与复聚原理，可以使用HFn去包载DOX(阿霉素)。
首先将HFn配制成含1mg/mL HFn、7.5％SDS、pH 7.0的溶液，然后在70℃水浴15min，然后加入DOX，使溶液体系为含1mg/mL HFn、1mg/mL DOX、7.5％SDS、pH 7.0，将该溶液于4℃孵育4h后，使用G75柱子将多余的DOX和溶液里的SDS脱除，收集HFn样品。(缓冲液为50mM Tris pH 7.2)
通过测定，DOX：HFn的摩尔比为300:1，质量比为30.20％，与之相比，现有技术包载时DOX:HFn的摩尔比仅为33:1，质量比为3.7％。
实施例4盐酸胍对HFn的解聚作用
分别用不同浓度的盐酸胍室温(25℃)处理HFn，蛋白浓度为1mg/ml。表中百分比数据表示解聚比例。
表6室温下不同浓度盐酸胍解聚HFn的百分比
4M 5.5M 6M 6.5M 7M 7.5M 8M
1h 0％ 14.2％ 24.6％ 38.1％ 53.2％ 66.0％ 93.9％
1.5h 0％ 17.2％ 33.8％ 40.4％ 57.9％ 74.7％ 98.1％
2h 0％ 18.7％ 34.3％ 42.4％ 60.9％ 79.8％ 98.6％
2.5h NA NA NA NA 63.7％ 86.1％ 100％
3h NA NA NA NA 65.8％ 88.9％ NA
3.5h NA NA NA NA 67.9％ 95.8％ NA
4h NA NA NA NA NA 96.6％ NA
4.5h NA NA NA NA NA 97.4％ NA
5h NA NA NA NA NA 100％ NA
5.5h NA NA NA NA NA 100％ NA
6h NA NA NA NA NA 100％ NA
表7 7.5M盐酸胍的升温实验
1h 1.5h 2h 2.5h
37℃ 94.1％ 98.7％ 100％ 100％
表8 7M盐酸胍的升温实验
表9 6M盐酸胍的升温实验
10min 0.5h 1h 2h 3h
37℃ NA NA NA 41.5％ NA
50℃ NA 33.45％ 44.6％ 61.2％ 67.8％
70℃ 76.6％ 100％ 100％ NA NA
表10 5M盐酸胍的升温实验
0.5h 1h 2h 3h
70℃ 64.1％ 92.7％ 100％ NA
表11 4M盐酸胍的升温实验
0.5h 1h 2h 3h
70℃ 39.5％ 53.3％ 82.6％ 91.8％
实施例5不同浓度盐酸胍处理HFn的SEC图谱
5.1 4M盐酸胍处理HFn的SEC图谱
流动相：50mMTris+4M盐酸胍pH7.2，流速0.5ml/min，结果如图18-图20所示。
5.2 5.5M盐酸胍处理HFn的SEC图谱
流动相：50mMTris+5.5M盐酸胍pH7.2，流速0.5ml/min，结果如图21-图23所示。
5.3 6M盐酸胍处理HFn的SEC图谱
流动相：50mMTris+6M盐酸胍pH7.2，流速0.5ml/min，结果如图24-图26所示。
5.4 6.5M盐酸胍处理HFn的SEC图谱
流动相：50mMTris+6.5M盐酸胍pH7.2，流速0.5ml/min，结果如图27-图29所示。
5.5 7M盐酸胍处理HFn的SEC图谱
流动相：50mMTris+7M盐酸胍pH7.2，流速0.5ml/min，结果如图30-图35所示。
5.6 7.5M盐酸胍处理HFn的SEC图谱
流动相：50mMTris+7.5M盐酸胍pH7.2，流速0.5ml/min，结果如图36-图46所示。
5.7 8M盐酸胍处理HFn的SEC图谱
流动相：50mMTris+8M盐酸胍pH7.2，流速0.5ml/min，结果如图47-图50所示。
5.8加速实验：4M盐酸胍70℃处理HFn的SEC图谱
流动相：50mMTris+4M盐酸胍pH7.2，流速0.5ml/min，结果如图51-图54所示。
5.9加速实验：5M盐酸胍70℃处理HFn的SEC图谱
流动相：50mMTris+4M盐酸胍pH7.2，流速0.5ml/min，结果如图55-图57所示。
5.10加速实验：6M盐酸胍升高温度处理HFn的SEC图谱
流动相：50mMTris+6M盐酸胍pH7.2，流速0.5ml/min，结果如图58-图65所示。
5.11加速实验：7M盐酸胍升高温度处理HFn的SEC图谱
流动相：50mMTris+7M盐酸胍pH7.2，流速0.5ml/min，结果如图66-图71所示。
5.12加速实验：7.5M盐酸胍升高温度处理HFn的SEC图谱
流动相：50mMTris+7.5M盐酸胍pH7.2，流速0.5ml/min，结果如图72-图75所示。
总结：基于解聚程度要高、处理时间不宜过久、盐酸胍浓度不宜过高的条件，本发明人选择在50℃、7M盐酸胍条件下，孵育1小时，来解聚HFn。
实施例6去除盐酸胍HFn的复聚
在变性剂盐酸胍存在的情况下HFn被解聚，随后本发明人对解聚后的蛋白进行了脱盐处理，结果表明除去变性剂以后HFn迅速复聚成原始状态，结果如图76和图77所示。
实施例7盐酸胍对HFn的包载作用
在50℃、7M盐酸胍条件下，孵育1小时，解聚HFn，然后将蛋白和7M盐酸胍以及DOX混合在一起，50℃孵育1小时，然后用G75柱子用DOX平衡好的前提下，缓慢通过柱子，让HFn在DOX中间聚合，从而达到包载的目的。最后脱去游离的DOX，计算包载量。
结果表明，包载数目为300个单位的DOX每单位HFn。质量比为30.20％，与之相比，现有技术包载时DOX:HFn的摩尔比仅为33:1，质量比为3.7％。
序列表
<110> 昆山新蕴达生物科技有限公司
<120> 铁蛋白包载药物的方法及其产物
<130> LZ1705969CN01
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 2
<211> 175
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala
1 5 10 15
Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu
20 25 30
Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu
50 55 60
Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln
65 70 75 80
Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala
85 90 95
Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu
100 105 110
Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp
115 120 125
Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys
130 135 140
Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala
145 150 155 160
Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp
165 170 175
<210> 3
<211> 174
<212> PRT
<213> 激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)
<400> 3
Met Leu Ser Glu Arg Met Leu Lys Ala Leu Asn Asp Gln Leu Asn Arg
1 5 10 15
Glu Leu Tyr Ser Ala Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Ala Ala Tyr Phe Glu
20 25 30
Asp Leu Gly Leu Glu Gly Phe Ala Asn Trp Met Lys Ala Gln Ala Glu
35 40 45
Glu Glu Ile Gly His Ala Leu Arg Phe Tyr Asn Tyr Ile Tyr Asp Arg
50 55 60
Asn Gly Arg Val Glu Leu Asp Glu Ile Pro Lys Pro Pro Lys Glu Trp
65 70 75 80
Glu Ser Pro Leu Lys Ala Phe Glu Ala Ala Tyr Glu His Glu Lys Phe
85 90 95
Ile Ser Lys Ser Ile Tyr Glu Leu Ala Ala Leu Ala Glu Glu Glu Lys
100 105 110
Asp Tyr Ser Thr Arg Ala Phe Leu Glu Trp Phe Ile Asn Glu Gln Val
115 120 125
Glu Glu Glu Ala Ser Val Lys Lys Ile Leu Asp Lys Leu Lys Phe Ala
130 135 140
Lys Asp Ser Pro Gln Ile Leu Phe Met Leu Asp Lys Glu Leu Ser Ala
145 150 155 160
Arg Ala Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Met Gln Gly Gly Glu
165 170

Claims (13)

1.一种铁蛋白包载药物的方法，其包括步骤：
1)将铁蛋白在一定温度下在含有一定浓度的变性剂和待包载药物的溶液中解聚一定时间，
2)通过去除溶液中的变性剂使铁蛋白复聚并包载药物，
3)任选地，去除溶液中残余的变性剂和药物，
4)任选地，干燥上述溶液获得包载了药物的铁蛋白固体，
其中变性剂是可以削弱或打破铁蛋白亚基间氢键相互作用，从而使铁蛋白发生解聚的物质，优选的，变性剂是指阴离子型表面活性剂或盐酸胍或脲，优选地，阴离子型表面活性剂选自SDS、硬脂酸和/或十二烷基苯磺酸钠；其中一定浓度在阴离子型表面活性剂的情况下是指重量比约1％～10％，在盐酸胍的情况下是指4M～8M，在脲的情况下是指3～10M；一定时间在阴离子型表面活性剂的情况下是指10～120min，在盐酸胍的情况下是指30min～300min，在脲的情况下是指10～1200min；一定温度在阴离子型表面活性剂的情况下是指30℃～100℃，在盐酸胍的情况下是指25℃～70℃，在脲的情况下是指15℃～75℃。
2.根据权利要求1所述的铁蛋白包载药物的方法，其中铁蛋白选自可以形成笼状结构的天然铁蛋白或重组铁蛋白及其变体，优选地，铁蛋白是全人铁蛋白，更优选地，铁蛋白是全人重链铁蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的铁蛋白包载药物的方法，其中变性剂选自SDS或盐酸胍。
4.根据权利要求1至3任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中药物选自抗肿瘤药物或非抗肿瘤药物，优选地，抗肿瘤药物选自肿瘤抗生素、天然来源类抗肿瘤药、金属化合物、放射性同位素、烷化剂、抗代谢类抗肿瘤药，激素类抗肿瘤药，优选地，药物选自肿瘤抗生素、天然来源类抗肿瘤药、放射性同位素或烷化剂，更优选地，药物选自肿瘤抗生素，更优选地，药物选自阿霉素、道诺霉素、胆碱、姜黄素、尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥、氟铁龙、多西氟鸟啶、5-氟尿嘧啶、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨、放线菌素D、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星、伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞滨、紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春酰胺、长春碱、替尼泊苷、依托泊苷、阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂奥沙、米托蒽醌，更优选地，药物选自阿霉素、道诺霉素、胆碱、顺铂、姜黄素、放射性同位素；和/或，优选地，非抗肿瘤药物选自放射性药物、神经递质类药物、多巴胺受体激动剂、神经中枢抗胆碱药、胆碱受体激动剂类药物、γ分泌酶抑制剂、抗氧剂或麻醉剂，更优选地，放射性药物选自64Cu、235U，神经递质类药物选自碳酰胆碱、阿托品、东莨菪碱、多巴胺及其衍生物，多巴胺受体激动剂选自溴隐亭、培高利特、阿扑吗啡等麦角碱类衍生物及非麦角碱类衍生物，神经中枢抗胆碱药选自苯海索、苯扎托品及丙环定，胆碱受体激动剂类药物选自毒蕈碱、毛果芸香碱，γ分泌酶抑制剂选自双氟酮类，抗氧剂选自褪黑激素，麻醉剂选自蒽胺。
5.根据权利要求1至4任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中去除溶液中的变性剂采用脱盐方式进行，优选地，采用脱盐柱进行。
6.根据权利要求1至5任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中使用阴离子型表面活性剂的情况下铁蛋白包载药物的质量比为5％-60％，优选地，至少8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高，更优选地，至少20％、25％、30％或35％；使用盐酸胍变性剂的情况下铁蛋白包载的药物的量5％-60％，优选地，至少8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高，更优选地，至少20％、25％、30％或35％；使用脲变性剂的情况下铁蛋白包载的药物的量5％-60％，优选地，至少8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高，更优选地，至少20％、25％、30％或35％。
7.根据权利要求1至6任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中溶液中铁蛋白含量范围为0.1～100mg/ml，优选地，0.2～10mg/ml，更优选地，0.3～5mg/ml，更优选地，0.5～2mg/ml，更优选地，0.7～1.4mg/ml；和/或，待包载药物的含量范围0.1～50mg/ml，优选地，0.2～10mg/ml，更优选地，0.3～5mg/ml，更优选地，0.5～2mg/ml，更优选地，0.7～1.4mg/ml。
8.根据权利要求1至7任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中一定浓度在阴离子型表面活性剂的情况下是指重量比约5％～10％，在盐酸胍的情况下是指6M～8M，在盐酸胍的情况下是指5～8M；一定时间在阴离子型表面活性剂的情况下是指10～30min，在盐酸胍的情况下是指30min～120min，在脲的情况下是指20～200min；一定温度在阴离子型表面活性剂的情况下是指65℃～75℃，在盐酸胍的情况下是指40℃～60℃，在脲的情况下是指20℃～50℃。
9.根据权利要求1至8任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中一定浓度在阴离子型表面活性剂的情况下是指重量比约6.5％～8％，在盐酸胍的情况下是指6.5M～7.5M，在盐酸胍的情况下是指5.5～6.5M；一定时间在阴离子型表面活性剂的情况下是指10～20min，在盐酸胍的情况下是指50min～72min，在盐酸胍的情况下是指25～100min；一定温度在阴离子型表面活性剂的情况下是指68℃～72℃，在盐酸胍的情况下是指45℃～55℃，在盐酸胍的情况下是指22℃～35℃。
10.根据权利要求1至9任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中溶液中含有促进药物的溶解和/或铁蛋白的聚集的添加剂，优选地，所述添加剂选自DMA、DMF、DMSO或其混合物。
11.根据权利要求1至10任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中溶液中铁蛋白与包载药物的质量比例为5:1～1:5。
12.根据权利要求1至11任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中溶液的缓冲体系为Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，缓冲液的pH介于3～10，缓冲液的浓度介于20～500mM。
13.利用权利要求1-12任一项所述的铁蛋白包载药物的方法获得的包载药物的铁蛋白。
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